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▶ コーデックス ディーエヌエー インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-17
(54)【発明の名称】核酸をアセンブルするための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20230410BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230410BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230410BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20230410BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20230410BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z
C12N15/09 Z
C12N15/11 Z
C12N15/52 Z
C12N15/54
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022553045
(86)(22)【出願日】2021-02-25
(85)【翻訳文提出日】2022-10-21
(86)【国際出願番号】 US2021019656
(87)【国際公開番号】W WO2021178210
(87)【国際公開日】2021-09-10
(31)【優先権主張番号】62/984,670
(32)【優先日】2020-03-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522349856
【氏名又は名称】コーデックス ディーエヌエー インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】ギル ジョン イー．
(72)【発明者】
【氏名】フー リクシア
(72)【発明者】
【氏名】ギブソン ダニエル ジー．
(57)【要約】
本発明は、所望の配列を有するＤＮＡ分子をアセンブルする方法を提供する。方法は、ＤＮＡリガーゼを、アセンブルされる複数の短いオリゴヌクレオチドと接触させることと、リガーゼ連鎖反応を実施して、それによってポリヌクレオチドのセットを生成することとを含む。複数の中のオリゴヌクレオチドは、複数の中の少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドの配列と重複し、かつそれに相補的であり、複数の中のオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％は、６～３０ヌクレオチド長である。ポリヌクレオチドのセットを結合するために、産生されたポリヌクレオチドのセットを混合物中のＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰと接触させ、それによって、ポリメラーゼ連鎖アセンブリによって所望の配列を有するＤＮＡ分子を作る。方法は、所望の配列に対して非常に高い配列忠実度を有する任意の長さのオリゴヌクレオチドの産生を可能にする。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
所望の配列を有するＤＮＡ分子をアセンブルする方法であって、以下を含む、前記方法：ａ）混合物を作るために、ＤＮＡリガーゼを、アセンブルされる前記ＤＮＡ分子の前記所望の配列の少なくとも一部分を構成する複数の短いオリゴヌクレオチドと接触させることであって、
前記複数の中の短いオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分が、前記複数の中の少なくとも１つの他の短いオリゴヌクレオチドの配列の一部分と重複し、かつそれに相補的であり、前記短いオリゴのうちの少なくとも２つが、それらの相補配列に結合したときに互いに隣接し、前記複数の中の短いオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％が、６～３０ヌクレオチド長である、前記接触させることと、
ｂ）前記混合物にリガーゼ連鎖反応を実施して、それによってポリヌクレオチドのセットを生成することと、
ｃ）前記ポリヌクレオチドのセットを結合するために、前記ポリヌクレオチドのセットをＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰと接触させ、それによって、前記所望の配列を有する前記ＤＮＡ分子をアセンブルすること。
【請求項2】
前記ポリヌクレオチドのセットが、ＤＮＡアセンブリ反応によって結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ポリヌクレオチドのセットが、ポリメラーゼサイクリングアセンブリによって結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記短いオリゴヌクレオチドと前記ＤＮＡリガーゼの前記接触前に、またはそれと同時に、前記複数の短いオリゴヌクレオチドをキナーゼと接触させることをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＤＮＡリガーゼが、熱安定性ＤＮＡリガーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＤＮＡリガーゼが、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたはＴａｑリガーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
隣接している前記短いオリゴが、第１の短いオリゴのリン酸化５’末端ヌクレオチド、および第２の短いオリゴの３’末端ヌクレオチド上の３’ヒドロキシルを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、前記所望の配列を有する前記ＤＮＡ分子を増幅させることをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
溶液中で実施される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記所望の配列を有する前記ＤＮＡ分子が、１００ １０，０００塩基対長である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記所望の配列を有する前記ＤＮＡ分子が、１００～５，０００塩基対長である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記所望の配列が、ユニバーサル５’フランキング配列およびユニバーサル３’フランキング配列をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
ポリメラーゼサイクリングアセンブリを介してポリヌクレオチドを結合するために、ポリヌクレオチドの複数のプールを組み合わせることをさらに含む、請求項２～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記所望の配列を有する前記ＤＮＡ分子を増幅させるために、ポリメラーゼ連鎖反応の少なくとも１０回のサイクルをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記複数の短いオリゴヌクレオチドが、少なくとも１０個の短いオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記複数の短いオリゴヌクレオチドが、少なくとも２０個の短いオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記複数の短いオリゴヌクレオチドが、２～２５０個の短いオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記複数の短いオリゴヌクレオチドが、６～１８ヌクレオチド長である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記複数の中の短いオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％が、６～１８ヌクレオチド長である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記複数の中の前記オリゴヌクレオチドの少なくとも７５％が、前記方法の開始時に６～１８ヌクレオチド長である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記複数の中の前記オリゴヌクレオチドの少なくとも７５％が、前記方法の開始時に６～１８ヌクレオチド長である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
制限酵素を使用することなく実施される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
所望の配列のアセンブルされたＤＮＡ分子が、２，０００塩基対当たり１エラー未満のエラー率を有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
所望の配列のアセンブルされたＤＮＡ分子が、１４，０００塩基対当たり１エラー未満のエラー率を有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記エラー率が、エラー訂正酵素を使用することなく前記方法で得られる、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記複数の短いオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの少なくとも１５個のプールを構成する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記アセンブリが、完全にインビトロで行われる、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記オリゴヌクレオチドが、８ｍｅｒまたは１６ｍｅｒである、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記ＤＮＡ分子が、スカーレスアセンブリでアセンブルされる、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記複数の短いオリゴヌクレオチドが、６４個を超える短いオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
リンカー、アダプター、またはスペーサーＤＮＡ分子を使用することなく行われる、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記リガーゼ連鎖反応が、変性、アニーリング、およびライゲーションの少なくとも５回のサイクルを含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記複数の短いオリゴヌクレオチドが、６４個を超える短いオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記混合物中の前記オリゴヌクレオチドの１０％未満が、２０ヌクレオチド長よりも長い、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記混合物中の前記オリゴヌクレオチドの１％未満が、２０ヌクレオチド長よりも長い、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０２０年３月３日に出願された米国特許出願第６２／９８４，６７０号（その全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に対する利益を主張する。
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０２０年３月３日に出願された米国特許出願第６２／９８４，６７０号（その全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に対する利益を主張する。
【0002】
発明の分野
本発明は、低いエラー率を有する核酸を合成および構築する方法に関する。
本発明は、低いエラー率を有する核酸を合成および構築する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
ＤＮＡのアセンブリは、合成生物学および遺伝子工学にとって重要な技術であり、ＤＮＡアセンブリ方法の効率性、忠実度、および単純性の改善に向けた膨大な努力を引き付けてきた。様々なＤＮＡアセンブリ方法が既知であり、特定の利点を有する。ギブソンアセンブリ方法が、ＤＮＡ配列の相補性を利用する一方で（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）、ゴールデンゲートアセンブリは、制限消化およびライゲーション方法に基づいている。ＤＮＡ合成の１つの重要な側面は、ＤＮＡ配列における配列忠実度の達成および維持、すなわち、非常に低いエラー率を有するＤＮＡ分子の産生の重要性である。出発オリゴヌクレオチドの化学合成は、合成された配列にエラーを入れ、これは次いで、所望のＤＮＡ分子がアセンブリングおよび増幅するにつれて増殖する。
ＤＮＡのアセンブリは、合成生物学および遺伝子工学にとって重要な技術であり、ＤＮＡアセンブリ方法の効率性、忠実度、および単純性の改善に向けた膨大な努力を引き付けてきた。様々なＤＮＡアセンブリ方法が既知であり、特定の利点を有する。ギブソンアセンブリ方法が、ＤＮＡ配列の相補性を利用する一方で（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）、ゴールデンゲートアセンブリは、制限消化およびライゲーション方法に基づいている。ＤＮＡ合成の１つの重要な側面は、ＤＮＡ配列における配列忠実度の達成および維持、すなわち、非常に低いエラー率を有するＤＮＡ分子の産生の重要性である。出発オリゴヌクレオチドの化学合成は、合成された配列にエラーを入れ、これは次いで、所望のＤＮＡ分子がアセンブリングおよび増幅するにつれて増殖する。
【0004】
ＤＮＡ合成およびアセンブリの忠実度を高めるという目的は、合成オリゴヌクレオチドから構築される合成ＤＮＡ中のエラーを低減するためのエラー訂正酵素の使用によって取り組まれてきた。エラー訂正酵素の使用は、重要な発展であったが、その使用には不利益もある。さらに、現在の方法は、しばしば、ＤＮＡチップまたは他の固相デバイス上で所望のＤＮＡ分子を合成することに依存し、その方法を、自動合成に実質的にあまり好適ではないものにする。これらの方法はまた、時間がかかり、ＤＮＡ合成においてあまり効率的ではない。合成オリゴヌクレオチドから産生され、非常に高い配列忠実度を有し、エラー訂正酵素の使用を必要としないＤＮＡ分子をアセンブルする新たな方法が、依然として必要である。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、所望の配列を有するＤＮＡ分子をアセンブルする方法を提供する。本方法は、ＤＮＡリガーゼを、アセンブルされる複数の短いオリゴヌクレオチドと接触させることと、リガーゼ連鎖反応を行って、それによってポリヌクレオチドのセットを生成することとを含む。前記複数の中のオリゴヌクレオチドは、前記複数の中の少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドの配列と重複し、かつそれに相補的であり、前記複数の中のオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％は、８～２２ヌクレオチド長である。ポリヌクレオチドのセットを結合するために、産生されたポリヌクレオチドのセットを、任意選択的に、混合物中のＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰと接触させ、それによって、ポリメラーゼ連鎖アセンブリによって所望の配列を有するＤＮＡ分子を作る。ＤＮＡ断片を、任意選択的に、ポリメラーゼ連鎖アセンブリ反応、または別のオリゴヌクレオチドアセンブリ反応（例えば、ＯＳＯＳ）を使用してアセンブルし、任意選択的に、ＰＣＲを通して増幅し得る。
【0006】
第１の態様では、本発明は、所望の配列を有するＤＮＡ分子をアセンブルする方法を提供する。本方法は、混合物を作るために、ＤＮＡリガーゼを、アセンブルされるＤＮＡ分子の所望の配列の少なくとも一部分を有する複数の短いオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。前記複数の中の短いオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、前記複数の中の少なくとも１つの他の短いオリゴヌクレオチドの配列の一部分と重複し、かつそれに相補的であり、短いオリゴのうちの少なくとも２つは、それらの相補配列に結合したときに互いに隣接する。前記複数の中の短いオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％は、８～３０ヌクレオチド長であり得る。本方法はまた、混合物にリガーゼ連鎖反応を実施して、それによって、ポリヌクレオチドのセットを生成することと、ポリヌクレオチドのセットを結合するために、ポリヌクレオチドのセットをＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰと接触させ、それによって所望の配列を有するＤＮＡ分子をアセンブルすることも含む。
【0007】
一実施形態では、ポリヌクレオチドのセットは、ポリメラーゼサイクリングアセンブリによって、および／またはＤＮＡアセンブリ反応（例えば、ＯＳＯＳ反応）によって結合される。一実施形態では、本方法は、短いオリゴヌクレオチドとＤＮＡリガーゼの接触前に、またはそれと同時に、複数の短いオリゴヌクレオチドをキナーゼと接触させることを含む。一実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、熱安定性ＤＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたはＴａｑリガーゼである。隣接している短いオリゴは、第１の短いオリゴのリン酸化５’末端ヌクレオチド、および第２の短いオリゴの３’末端ヌクレオチド上の３’ヒドロキシルを有することができる。本方法は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、所望の配列を有するＤＮＡ分子を増幅させることを含むことができる。一実施形態では、本方法は、溶液中で実施される。様々な実施形態では、所望の配列を有するＤＮＡ分子は、１００～１０，０００塩基対長または１００～５，０００塩基対長であり得る。一実施形態では、所望の配列は、ユニバーサル５’フランキング配列およびユニバーサル３’フランキング配列をさらに含む。本方法はまた、ＰＣＡ（ポリメラーゼサイクリングアセンブリ）を介してポリヌクレオチドを結合するためにポリヌクレオチドのセットの複数のプールを組み合わせることも含むことができる。
【0008】
一実施形態では、所望の配列を有するＤＮＡ分子を増幅させるために、ポリメラーゼ連鎖反応の少なくとも１０回のサイクルが行われ得る。様々な実施形態では、複数の短いオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個の短いオリゴヌクレオチド、または少なくとも２０個の短いオリゴヌクレオチド、または２～２５０個の短いオリゴヌクレオチドを含有することができる。一実施形態では、複数の短いオリゴヌクレオチドは、１０～１８ヌクレオチド長である。前記複数の中の短いオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％は、１０～１８ヌクレオチド長であり得る。別の実施形態では、前記複数の中のオリゴヌクレオチドの少なくとも７５％は、本方法の開始時に６～１８、または１０～１８、または１６～１８ヌクレオチド長である。本方法は、制限酵素を使用することなく実施され得る。本方法によって産生される所望の配列のアセンブルされたＤＮＡ分子は、２０００塩基対当たり１エラー未満、または１４０００塩基対当たり１エラー未満のエラー率を有することができる。エラー率は、エラー訂正酵素を使用することなく本方法で得られ得る。
【0009】
いくつかの実施形態では、複数の短いオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの少なくとも１５個のプールに含まれる。本方法は、完全にインビトロで行われ得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、８ｍｅｒまたは１６ｍｅｒであり得る。ＤＮＡ分子は、本方法でアセンブルすることができ、スカーレスであり得、すなわち、スカーレスアセンブリでアセンブルすることができる。一実施形態では、複数の短いオリゴヌクレオチドは、６４個を超える短いオリゴヌクレオチドを含む。本方法は、リンカー、アダプター、またはスペーサーＤＮＡ分子を使用することなく実施され得る。本方法では、リガーゼ連鎖反応は、変性、アニーリング、およびライゲーションの少なくとも５回のサイクルを有することができる。任意の実施形態では、複数の短いオリゴヌクレオチドは、６４個を超える短いオリゴヌクレオチドを有することができる。様々な実施形態では、混合物中のオリゴヌクレオチドの１０％未満または１％未満は、２０ヌクレオチド長よりも長いか、または３０ヌクレオチド長よりも長い。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】本発明の一実施形態の概略図である。一本鎖オリゴヌクレオチド、アニーリング、ライゲーション、および本方法でリガーゼによって結合された隣接オリゴを含む、本方法の態様が示される。任意選択的なさらなるアセンブリおよび／または増幅も示される。
【図2】２４０ｂｐの産物の形成を示すアガロースゲルの図である。１４×８ｍｅｒの７つの重複するセットから２４０ｂｐの産物をアセンブルした結果が示される。
【図3】１６ｍｅｒプールからのＧＦＰを９０１ｂｐのＧＦＰ配列にアセンブルした結果を示すアガロースゲルの図である。レーン１は、３２×１６ｍｅｒの６つのプールからの合成を示し、次いで、ＰＣＡおよびＰＣＲのためにすべてが１つのプールに入れられる。レーン２は、６４×１６ｍｅｒの２つのサブプールからの合成を示し、次いで、ＬＣＲのために１つのプールに入れる。ＬＣＲに続いて、ＰＣＡおよびＰＣＲを行った（ＬＣＲ－＞ＰＣＡ－＞ＰＣＲ）。
【図4A】図４Ａは、１９２７ｂｐおよび１６０９ｂｐをアセンブルした結果を示すアガロースゲルの図である。３０ｍｅｒおよび４０ｍｅｒプールからのＨＡおよびＮＡ（それぞれ）。レーン１：１６ｍｅｒのサブプールを用いたＬＣＲによるアセンブリであり、各サブプールは、隣りのサブプールと重複する（１２８ｂｐ）６４個の１６ｍｅｒオリゴを含有する。レーン２は、すべての１６ｍｅｒを用いたＬＣＲを示す。レーン３：すべての３０ｍｅｒを用いたＬＣＲ。レーン４：すべての４０ｍｅｒを用いたＬＣＲ。プロトコルは、実施例１に示されるとおりであった。
【図4B】図４Ｂは、ＬＣＲ、続いてＰＣＡおよびＰＣＲを使用した、８つの１６ｍｅｒおよび４つの１６ｍｅｒのプールからのＨＡおよびＮＡのアセンブリの希釈を示すアガロースゲルの図である。ＬＣＲの希釈１～４は、２．５倍、５倍、１０倍、および２０倍である。
【図5】ＬＣＲ、続いてＰＣＡおよびＰＣＲ増幅による、１６ｍｅｒの２６個の重複するプールからアセンブルした１０ｋｂのＤＮＡ産物のアセンブリを示すゲルを示す。
【図6】各々が１つのプールにアセンブルした１６ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、または２２ｍｅｒからの可変ＧＣ含有率の３２個の構築物をアセンブルした結果を示す、アガロースゲルの図である。各ゲルの列１～８は、各ゲル上の列１～８に従ってアセンブルした構築物のサイズを示す：１．２００ｂｐ、２．４００ｂｐ、３．６００ｂｐ、４．８００ｂｐ、５．１０００ｂｐ、６．１２００ｂｐ、７．１５００ｂｐ、８．１８００ｂｐ。実施例１のプロトコルに従って、オリゴをＬＣＲ－ＰＣＡ－ＰＣＲに供した。
【図7】１６ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、および２２ｍｅｒについての、エラー率およびエラーのないアセンブルした構築物のパーセントを示す表および２つの棒グラフである表およびグラフ図である。ＥＲは、エラー率を示し、％ＥＦＣは、得られたエラーのない構築物のパーセントを示す。１１，０００塩基対において１の全エラー率が、１６ｍｅｒで達成され、エラーのない構築物のパーセントは、８８～９７％で変動した。
【発明を実施するための形態】
【0011】
発明の詳細な説明
本発明は、所望の配列を有するＤＮＡ分子をアセンブルする方法を提供する。本方法は、ＤＮＡリガーゼを、アセンブルされるＤＮＡ分子の少なくとも一部分を構成する複数の短いオリゴヌクレオチドと接触させて、それによって、混合物中にポリヌクレオチドまたはＤＮＡ断片のセットを生成することを含む。前記複数の中のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、前記複数の中の少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドの配列と重複し、かつそれに相補的であり、前記複数の中のオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％は、８～２２ヌクレオチド長であり得る。形成された混合物は、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰと接触し、任意選択的に、ＤＮＡ断片のセットを結合するためにＤＮＡアセンブリ反応（例えば、ＯＳＯＳまたはＰＣＡ）に供され、それによって、ポリメラーゼ連鎖アセンブリによって所望の配列を有するＤＮＡ分子を作ることができる。したがって、本方法は、階層的ＤＮＡアセンブリ方法に適用され得る。複数のオリゴヌクレオチドは、リガーゼ連鎖反応を使用して結合され得、ＤＮＡ断片は、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）および／またはＯＳＯＳアセンブリを使用してアセンブルされ、任意選択的に、ＰＣＲまたは別のＤＮＡ増幅手順を使用して増幅されることができる。
本発明は、所望の配列を有するＤＮＡ分子をアセンブルする方法を提供する。本方法は、ＤＮＡリガーゼを、アセンブルされるＤＮＡ分子の少なくとも一部分を構成する複数の短いオリゴヌクレオチドと接触させて、それによって、混合物中にポリヌクレオチドまたはＤＮＡ断片のセットを生成することを含む。前記複数の中のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、前記複数の中の少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドの配列と重複し、かつそれに相補的であり、前記複数の中のオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％は、８～２２ヌクレオチド長であり得る。形成された混合物は、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰと接触し、任意選択的に、ＤＮＡ断片のセットを結合するためにＤＮＡアセンブリ反応（例えば、ＯＳＯＳまたはＰＣＡ）に供され、それによって、ポリメラーゼ連鎖アセンブリによって所望の配列を有するＤＮＡ分子を作ることができる。したがって、本方法は、階層的ＤＮＡアセンブリ方法に適用され得る。複数のオリゴヌクレオチドは、リガーゼ連鎖反応を使用して結合され得、ＤＮＡ断片は、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）および／またはＯＳＯＳアセンブリを使用してアセンブルされ、任意選択的に、ＰＣＲまたは別のＤＮＡ増幅手順を使用して増幅されることができる。
【0012】
より大きいＤＮＡ片を形成し、それによって合成を最適化する能力を最大化するために、ポリヌクレオチドおよびＤＮＡ断片の合成は、合成においてより長いオリゴヌクレオチドを使用することに焦点を当ててきた。より長いオリゴヌクレオチドは、反復領域にわたり、かつＰＣＲおよび他のＤＮＡアセンブリまたは増幅反応におけるより高い融解温度（Ｔｍ）に起因してアセンブリ反応においてより高い特異性をもたらす能力がより高いため、有益であると考えられてきた。次いで、これらのプロセスによって産生されたオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片は、エラー訂正酵素（例えば、ミスマッチエンドヌクレアーゼ）を使用したエラー訂正に供され、エラーを除去し、所望のＤＮＡ配列の精度を高める。エラー訂正後、ＤＮＡ断片は、次いで、ＤＮＡ増幅手順を使用して、アセンブリングおよび／または増幅することができる。
【0013】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、溶液中のオリゴヌクレオチドをアニールするための十分な機会を提供するために、より長いオリゴヌクレオチドを必要とすると考えられてきたが、本発明者らは、リガーゼ連鎖反応が本明細書に開示されるような短いオリゴヌクレオチド上で実施された場合、産物ＤＮＡ配列においてより大きい配列忠実度が得られることを予想外に発見した。配列忠実度の上昇は、驚くべきことに、エラー訂正工程、例えば、エラー訂正酵素を使用して、ミスマッチヌクレオチド対を訂正し、より高い配列忠実度を達成する工程を実施する必要性を排除するほどに十分である。本発明者らはまた、リガーゼ連鎖反応が溶液中の短いオリゴヌクレオチド上で実施された場合、記載された利点が得られ得ることを発見した。任意の実施形態では、本方法は、任意の種類の制限酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）を使用することなく実施され得る。任意の実施形態では、本方法は、完全にインビトロで、すなわち、クローニングを使用することなく、または生きている生物内の核酸をクローニングする必要なく行われ得る。任意の実施形態では、本方法は、溶液中で、すなわち、本方法（またはその任意の工程）におけるオリゴヌクレオチド（もしくは形成ポリヌクレオチドの任意の部分）または反応成分のいずれも、ＤＮＡチップ、ビーズ、表面、または他の固相に結合することもそれらの上に固定化されることもなく、行われ得る。したがって、いくつかの実施形態では、形成されたオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片全体が溶液中にあり、すなわち、出発オリゴヌクレオチドまたはシードオリゴヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド鎖の末端を表す）でさえ、本方法の任意の時点で固体支持体に結合していない。したがって、本方法は、自動合成に非常に好適であり、高い忠実度の産物ＤＮＡの高い収率をもたらす。実施形態のいずれも、反応成分が固相上に固定化されないように行われ得る。
【0014】
ライゲーションは、共有結合においてポリヌクレオチド配列同士を共有結合的に結びつけて単一の配列を形成することを指す。リガーゼは、第１のオリゴの５’－Ｐ末端と第２のオリゴの３’－ＯＨ末端との間の共有ホスホジエステル結合の形成を触媒することができる。第１および第２のオリゴのいずれかまたは両方は、相補鎖にアニールされ得、５’－Ｐおよび３’－ＯＨを有するヌクレオチドは、リガーゼによって作用した場合、互いに隣りに位置することができる。他の実施形態では、ライゲーションは、例えば、化学的手段を使用して、オリゴ同士を共有結合的に結びつける他の手段も包含することができる。オリゴという用語は、本明細書において、オリゴヌクレオチドを示すために使用される。
【0015】
方法
本方法は概して、本明細書に記載される任意の長さの複数の短いオリゴヌクレオチドを含有する１つ以上のプールを提供することを含む。いくつかの実施形態では、短いオリゴヌクレオチドをキナーゼで処理して、５’リン酸基を付加することができるが、５’リン酸基はまた、化学的なオリゴ合成中に、または合成反応（例えば、ＬＣＲ）と同時に付加することもできる。したがって、短いオリゴヌクレオチドは、短いオリゴヌクレオチドとＤＮＡリガーゼの接触の前もしくはそれと同時に、またはＬＣＲの前もしくは後に、キナーゼと接触することができる。いくつかの実施形態では、反応は、任意選択的に、初期オリゴまたは短いオリゴを一緒にライゲーションし、したがって、より大きいオリゴまたはＤＮＡ断片を形成するために、サーマルサイクラー上で行われ得る。一実施形態では、これは、複数の短いオリゴヌクレオチドをリガーゼサイクリング反応（ＬＣＲ）に供することによって行われ得る。次いで、得られたＤＮＡ断片（またはより大きいオリゴ）は、さらなるアセンブリおよび／または増幅反応に供されて、より大きいＤＮＡ分子を構築するか、またはそれらの量を増幅させることができる。ポリヌクレオチドという用語は、ヌクレオチド単位から構成されたポリマーを指す。オリゴヌクレオチドという用語は、最大３０個のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを指す。ＤＮＡ断片は、３０個を超えるヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを指す。
本方法は概して、本明細書に記載される任意の長さの複数の短いオリゴヌクレオチドを含有する１つ以上のプールを提供することを含む。いくつかの実施形態では、短いオリゴヌクレオチドをキナーゼで処理して、５’リン酸基を付加することができるが、５’リン酸基はまた、化学的なオリゴ合成中に、または合成反応（例えば、ＬＣＲ）と同時に付加することもできる。したがって、短いオリゴヌクレオチドは、短いオリゴヌクレオチドとＤＮＡリガーゼの接触の前もしくはそれと同時に、またはＬＣＲの前もしくは後に、キナーゼと接触することができる。いくつかの実施形態では、反応は、任意選択的に、初期オリゴまたは短いオリゴを一緒にライゲーションし、したがって、より大きいオリゴまたはＤＮＡ断片を形成するために、サーマルサイクラー上で行われ得る。一実施形態では、これは、複数の短いオリゴヌクレオチドをリガーゼサイクリング反応（ＬＣＲ）に供することによって行われ得る。次いで、得られたＤＮＡ断片（またはより大きいオリゴ）は、さらなるアセンブリおよび／または増幅反応に供されて、より大きいＤＮＡ分子を構築するか、またはそれらの量を増幅させることができる。ポリヌクレオチドという用語は、ヌクレオチド単位から構成されたポリマーを指す。オリゴヌクレオチドという用語は、最大３０個のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを指す。ＤＮＡ断片は、３０個を超えるヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを指す。
【0016】
短いオリゴは、ＤＮＡ断片またはより長いオリゴヌクレオチドへの合成のために、プールまたはセットで提供され得る。任意の実施形態では、短いオリゴは、化学合成方法を使用して合成され得る。セットは、結合されてより長いオリゴヌクレオチド分子になるオリゴのすべてを含み、より長いオリゴヌクレオチド分子は、次いで、より大きいＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドを作製するためにさらに組み合わされてもよい。セットは、重複オリゴを有する単一のプールに含まれ得るか、またはより長いオリゴヌクレオチドを形成するための方法において組み合わされる２つ以上のプールに含まれ得る。１つ以上のプール中の短いオリゴは、セットを構成することができ、セット中のオリゴは、セット中の少なくとも１つの他のオリゴの少なくとも一部分、またはプールもしくはセット中の２つのオリゴ、またはプールもしくはセット中の２つを超えるオリゴと重複し、かつそれらに相補的であり得る（ワトソン－クリック塩基対形成の観点から）。一実施形態では、オリゴは、複数のセットで提供され得、各セットは、２つのプールに含まれる。異なる実施形態では、オリゴは、単一のプールに、または２つのプールを組み合わせることによってアセンブルすることができる。２つのプールは、組み合わされ、ＬＣＲ、ならびに任意選択的にＰＣＡおよび／またはＯＳＯＳおよび／またはＰＣＲに供され得、それによって、より長いオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片が産生され得る。次いで、オリゴまたはＤＮＡ断片の１つ以上のプールもまた、ＬＣＲ、ならびに任意選択的にＯＳＯＳおよび／またはＰＣＡおよび／またはＰＣＲに供され得る。したがって、階層的アセンブリを実施して、定義され、かつ所望の配列を有する産物ＤＮＡ分子に達することができる。定義されかつ所望の配列は、本方法を開始する前に決定された特定のかつ予め定義された配列であり得、短いオリゴヌクレオチドは、本方法において特定の定義されかつ所望の配列を産生するように設計され得る。
【0017】
短いオリゴは一緒に、アセンブルされかつ所望の配列を有するＤＮＡ分子の配列の少なくとも一部分を構成することができる。本方法は、所望の数のプールを使用して実施され得る。様々な実施形態では、本明細書に記載されるサイズの短いオリゴの１つのプール、または２つのプール、または２つを超えるプール、または４つを超えるプール、または８つを超えるプール、または２０個を超えるプール、または２５個を超えるプールが利用され得る。様々な実施形態では、プールは、少なくとも８つの短いオリゴ、または少なくとも１６個の短いオリゴ、または少なくとも３２個の短いオリゴ、または少なくとも６４個の短いオリゴ、または８～３２個の短いオリゴ、または８～６４個の短いオリゴを含有することができる。様々な実施形態では、ポリエチレングリコール、もしくはグリセロール、もしくはベタイン、もしくはソルビトール、またはそれらのいずれかの組み合わせが、ＬＣＲに供される混合物、またはＰＣＡおよび／もしくはＯＳＯＳおよび／もしくはＰＣＲに供される混合物に添加されて、所望の配列のＤＮＡ分子をアセンブルすることができる。
【0018】
本発明の方法は、所望の配列を有するＤＮＡ分子をスカーレスＤＮＡ分子としてアセンブルすることができる。スカーレスＤＮＡとは、ＤＮＡ合成プロセスによってもしくはそれから導入されたいかなるヌクレオチド（例えば、リンカー分子からの残留ヌクレオチド）も有しないＤＮＡを意味するか、または産物ＤＮＡが、元の短いオリゴヌクレオチドのうちの１つに存在しなかったいかなる存在するヌクレオチドも有しないこと、例えば、産物ＤＮＡが、２つのオリゴヌクレオチドが結合された結合部に存在するいかなるそのようなヌクレオチドも有しないことを意味する。所望の配列のスカーレスＤＮＡ分子は、天然配列、合成配列に対応し得るか、または操作された配列であり得る。本方法はまた、短いオリゴヌクレオチドのすべてが溶液中に存在する反応、すなわち、いくつかの実施形態では、組み合わされるオリゴヌクレオチドのいずれも、固相（例えば、ＤＮＡチップ、ビーズ、またはマイクロアレイ）上に存在しないか、またはそれに付着していない反応において、短いオリゴヌクレオチドを結合することができる。いくつかの実施形態では、リガーゼ連鎖反応は、反応におけるすべてのオリゴヌクレオチドが溶液中に存在するオリゴヌクレオチド、またはアニールする任意の２つのオリゴのいずれも固相もしくは固体支持体上に存在しないか、もしくはそれらに付着していないオリゴヌクレオチドに対して実施される。本方法はまた、所望の配列のオリゴまたはＤＮＡ断片および／またはＤＮＡ分子を同時にアセンブルすることができ、すなわち、単一の反応が、オリゴヌクレオチドをより長いオリゴまたはＤＮＡ断片にアセンブルする。したがって、同時のアセンブリは、オリゴヌクレオチドが順次にアセンブルされる方法、すなわち、オリゴが順次に成長二本鎖または成長鎖の末端に付加されるように、第２のオリゴが第１のオリゴにアニールされ、次いで、第３のオリゴが第２のオリゴにアニールされるなどの方法とは区別される。同時の反応において、より長いオリゴもしくはＤＮＡ断片、または産物ＤＮＡ分子を形成するオリゴのすべてが、同時に溶液中に存在する。また、溶液中に同時に存在する複数のオリゴ（またはすべてのオリゴ）は、反応に関与し、アニールし、リガーゼによって結合される。同時の反応はまた、一段階反応であり得る。任意の実施形態では、本方法は、制限酵素または制限エンドヌクレアーゼを使用することなく実施され得、ＤＮＡ分子が合成され得る。任意の実施形態では、所望の配列のＤＮＡ分子は、環状ＤＮＡではない。任意の実施形態では、所望の配列のＤＮＡ分子は、任意選択的に、ベクターＤＮＡではない。
【0019】
任意の実施形態では、本方法は、リンカーまたはスペーサー配列またはオリゴを使用しない。リンカーまたはアダプターＤＮＡまたは配列は、他のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド分子の末端にライゲーションされ得る短いオリゴヌクレオチドであり得る。リンカー、アダプター、またはスペーサー分子または配列を使用して、固体支持体からのポリヌクレオチドの放出をもたらすか、またはポリヌクレオチドを固体支持体に連結もしくは係留することもできる。これらの分子または配列は、ライゲーションを可能にする粘着末端および／またはオーバーハングを提供することができる。リンカー、アダプター、またはスペーサーＤＮＡ配列はまた、例えば、制限部位、認識部位（例えば、ニッキングエンドヌクレアーゼの場合）、ポリＵ配列を含むことができるか、または１つ以上のウラシル残基を有する配列であり得る。リンカー、アダプター、またはスペーサーＤＮＡまたは配列は、本方法でアセンブルした所望の配列のＤＮＡ分子に見られない任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列である。本方法の任意の実施形態では、本方法で使用されるオリゴヌクレオチドのいずれも、リンカー、アダプター、またはスペーサー配列を含まない。任意の実施形態では、本方法は、リンカー、アダプター、またはスペーサーＤＮＡまたは配列の使用を伴わない。これは、本方法のさらなる利点であり、本方法を自動化により好適なものにする。
【0020】
本方法によってアセンブルされ、かつ所望の配列を有するＤＮＡ分子は、任意のＤＮＡ分子であり得る。様々な実施形態では、所望の配列を有するＤＮＡ分子は、長さが１００～５，０００ｂｐ、または長さが１００～１０，０００ｂｐ、または長さが５，０００～１０，０００ｂｐ、または長さが５，０００～１５，０００ｂｐ、または長さが１０，０００～１５，０００ｂｐ、または長さが１０，０００～２０，０００ｂｐ、または長さが１０，０００～２５，０００ｂｐ、または長さが１ｋｂ超、もしくは２ｋｂ超、もしくは３ｋｂ超、もしくは５ｋｂ超、または長さが１０ｋｂ超、または長さが１５ｋｂ超、または長さが２０ｋｂ超である。
【0021】
エラー率
本発明の方法は、２，０００塩基対当たり１エラー未満、または５，０００塩基対当たり１エラー未満、または７，５００ｂｐ当たり１エラー未満、または１０，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または１１，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または１２，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または１３，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または１４，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または１５，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または１６，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または１７，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または２０，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または２５，０００ｂｐ当たり１エラー未満のエラー率を有する、所望の配列のＤＮＡ分子を産生することができる。任意の実施形態では、本方法は、エラー訂正酵素を使用することなく、本明細書に記載される非常に低いエラー率を有するＤＮＡ分子の産生を可能にする。エラー訂正酵素は、ＤＮＡ合成におけるエラーを訂正するために利用される酵素である。一実施形態では、エラー訂正酵素は、二本鎖ＤＮＡ分子中のミスマッチを特定することができ、ミスマッチの結果として二本鎖切断を開始することができる。二本鎖切断は、ミスマッチの部位またはその付近であり得る。ミスマッチは、同じまたは他の酵素（例えば、エキソヌクレアーゼ）によって切り取られ得、ＤＮＡは、配列エラーなしに、かつ正しい配列で再アセンブルされる。エラー訂正酵素の一例は、当業者に既知のミスマッチエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＥＬ Ｉおよび／またはＣＥＬ ＩＩ）である。エラー訂正酵素の他の（非限定的な）例としては、マングビーンエンドヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、およびエンドヌクレアーゼＶのいずれか１つ以上が挙げられる。
本発明の方法は、２，０００塩基対当たり１エラー未満、または５，０００塩基対当たり１エラー未満、または７，５００ｂｐ当たり１エラー未満、または１０，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または１１，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または１２，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または１３，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または１４，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または１５，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または１６，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または１７，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または２０，０００ｂｐ当たり１エラー未満、または２５，０００ｂｐ当たり１エラー未満のエラー率を有する、所望の配列のＤＮＡ分子を産生することができる。任意の実施形態では、本方法は、エラー訂正酵素を使用することなく、本明細書に記載される非常に低いエラー率を有するＤＮＡ分子の産生を可能にする。エラー訂正酵素は、ＤＮＡ合成におけるエラーを訂正するために利用される酵素である。一実施形態では、エラー訂正酵素は、二本鎖ＤＮＡ分子中のミスマッチを特定することができ、ミスマッチの結果として二本鎖切断を開始することができる。二本鎖切断は、ミスマッチの部位またはその付近であり得る。ミスマッチは、同じまたは他の酵素（例えば、エキソヌクレアーゼ）によって切り取られ得、ＤＮＡは、配列エラーなしに、かつ正しい配列で再アセンブルされる。エラー訂正酵素の一例は、当業者に既知のミスマッチエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＥＬ Ｉおよび／またはＣＥＬ ＩＩ）である。エラー訂正酵素の他の（非限定的な）例としては、マングビーンエンドヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、およびエンドヌクレアーゼＶのいずれか１つ以上が挙げられる。
【0022】
オリゴ
本方法の様々な実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ分子の所望の配列の少なくとも一部分を有する複数の短いオリゴヌクレオチドと接触して、混合物を形成する。本方法で使用される複数の初期オリゴまたは短いオリゴは、２～２５０、または２～１００、または６～３０ヌクレオチド（ｎｔ）長であり得るが、長さが６～１０ｎｔ、または６～１２ｎｔ、または６～１３ｎｔ、または６～１４ｎｔ、または６～１５ｎｔ、または６～１７ｎｔ、または６～１８ｎｔ、または６～１９ｎｔ、または６～２０ｎｔ、または６～２２ｎｔ、または６～２５ｎｔ、または６～３０ｎｔ、または６～３５ｎｔ、または５～１６ｎｔ、または５～１７ｎｔ、または５～１８ｎｔ、または５～１９ｎｔ、または７～１０ｎｔ、または７～１２ｎｔ、または７～１５ｎｔ、または７～１７ｎｔ、または７～１８ｎｔ、または７～１９ｎｔ、または７～２０ｎｔ、または７～２５ｎｔ、または７～３０ｎｔ、または７～３５ｎｔ、または８～１２ｎｔ、または８～１５ｎｔ、または８～１７ｎｔ、または８～１８ｎｔ、または８～１９ｎｔ、または８～２０ｎｔ、または８～２１ｎｔ、または８～２２ｎｔ、または８～２５ｎｔ、または８～３０ｎｔ、または８～３５ｎｔ、または１０～２２ｎｔ、または１６～１８ｎｔ、または１５～１９ｎｔ、または１４～２０ｎｔ、または１８ｎｔ未満、または１７ｎｔ未満、または１６ｎｔ未満、または１５ｎｔ未満、または１２ｎｔ未満でもあり得る。初期オリゴまたは短いオリゴは、１つ以上のオリゴプールに含まれ得る。様々な実施形態では、各オリゴプールもしくはセット中（またはＤＮＡリガーゼと接触している混合物中）の初期オリゴまたは短いオリゴの少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％は、本明細書に記載されるいずれかのサイズ範囲内であり得る。任意の実施形態では、プール中のまたはＤＮＡリガーゼと接触しているオリゴは、例えば、３ｎｔ、または４ｎｔ、または５ｎｔ、または６ｎｔ、または７ｎｔ、または８ｎｔ、または９ｎｔ、または１０ｎｔ、または１０ｎｔ超、またはオリゴの長さの約２分の１（これは、端数を切り上げもしくは切り捨てられ得るか、または任意選択的に、２分の１の長さの１ｎｔ、２ｎｔ、もしくは３ｎｔ以内であり得る）、重複することができる。したがって、いくつかの実施形態では、オリゴは、８ｍｅｒであり、少なくとも部分的に相補的な８ｍｅｒおよび４ｎｔの重複を有するか、またはオリゴは、１６ｍｅｒであり、少なくとも部分的に相補的なオリゴヌクレオチドと８ｎｔの重複を有する。他の実施形態では、複数の短いオリゴヌクレオチド中の短いオリゴは、少なくとも３ｎｔ、または少なくとも４ｎｔ、または少なくとも５ｎｔ、または少なくとも６ｎｔ、または少なくとも７ｎｔ、または少なくとも８ｎｔ、または少なくとも９ｎｔ重複する。別の実施形態では、複数の中の短いオリゴは、重複オリゴのうちのより短い方の長さの約２分の１重複することができ、例えば、１６ｍｅｒは、８ｎｔ重複することができる。異なる長さの短いオリゴが使用される場合、それらは、重複オリゴのうちのより短い方の長さの２分の１重複することができる。任意の実施形態では、ＤＮＡリガーゼおよび初期オリゴもしくは短いオリゴの混合物中（またはリガーゼ連鎖反応を実施するためのプール中）の短いオリゴの１０％未満、または、５％未満、または３％未満、または１％未満は、３０ｎｔ、または２９ｎｔ、または２５ｎｔ、または２２ｎｔ、または２０ｎｔ、または１８ｎｔ、または１７ｎｔ、または１６ｎｔよりも長い。
本方法の様々な実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ分子の所望の配列の少なくとも一部分を有する複数の短いオリゴヌクレオチドと接触して、混合物を形成する。本方法で使用される複数の初期オリゴまたは短いオリゴは、２～２５０、または２～１００、または６～３０ヌクレオチド（ｎｔ）長であり得るが、長さが６～１０ｎｔ、または６～１２ｎｔ、または６～１３ｎｔ、または６～１４ｎｔ、または６～１５ｎｔ、または６～１７ｎｔ、または６～１８ｎｔ、または６～１９ｎｔ、または６～２０ｎｔ、または６～２２ｎｔ、または６～２５ｎｔ、または６～３０ｎｔ、または６～３５ｎｔ、または５～１６ｎｔ、または５～１７ｎｔ、または５～１８ｎｔ、または５～１９ｎｔ、または７～１０ｎｔ、または７～１２ｎｔ、または７～１５ｎｔ、または７～１７ｎｔ、または７～１８ｎｔ、または７～１９ｎｔ、または７～２０ｎｔ、または７～２５ｎｔ、または７～３０ｎｔ、または７～３５ｎｔ、または８～１２ｎｔ、または８～１５ｎｔ、または８～１７ｎｔ、または８～１８ｎｔ、または８～１９ｎｔ、または８～２０ｎｔ、または８～２１ｎｔ、または８～２２ｎｔ、または８～２５ｎｔ、または８～３０ｎｔ、または８～３５ｎｔ、または１０～２２ｎｔ、または１６～１８ｎｔ、または１５～１９ｎｔ、または１４～２０ｎｔ、または１８ｎｔ未満、または１７ｎｔ未満、または１６ｎｔ未満、または１５ｎｔ未満、または１２ｎｔ未満でもあり得る。初期オリゴまたは短いオリゴは、１つ以上のオリゴプールに含まれ得る。様々な実施形態では、各オリゴプールもしくはセット中（またはＤＮＡリガーゼと接触している混合物中）の初期オリゴまたは短いオリゴの少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％は、本明細書に記載されるいずれかのサイズ範囲内であり得る。任意の実施形態では、プール中のまたはＤＮＡリガーゼと接触しているオリゴは、例えば、３ｎｔ、または４ｎｔ、または５ｎｔ、または６ｎｔ、または７ｎｔ、または８ｎｔ、または９ｎｔ、または１０ｎｔ、または１０ｎｔ超、またはオリゴの長さの約２分の１（これは、端数を切り上げもしくは切り捨てられ得るか、または任意選択的に、２分の１の長さの１ｎｔ、２ｎｔ、もしくは３ｎｔ以内であり得る）、重複することができる。したがって、いくつかの実施形態では、オリゴは、８ｍｅｒであり、少なくとも部分的に相補的な８ｍｅｒおよび４ｎｔの重複を有するか、またはオリゴは、１６ｍｅｒであり、少なくとも部分的に相補的なオリゴヌクレオチドと８ｎｔの重複を有する。他の実施形態では、複数の短いオリゴヌクレオチド中の短いオリゴは、少なくとも３ｎｔ、または少なくとも４ｎｔ、または少なくとも５ｎｔ、または少なくとも６ｎｔ、または少なくとも７ｎｔ、または少なくとも８ｎｔ、または少なくとも９ｎｔ重複する。別の実施形態では、複数の中の短いオリゴは、重複オリゴのうちのより短い方の長さの約２分の１重複することができ、例えば、１６ｍｅｒは、８ｎｔ重複することができる。異なる長さの短いオリゴが使用される場合、それらは、重複オリゴのうちのより短い方の長さの２分の１重複することができる。任意の実施形態では、ＤＮＡリガーゼおよび初期オリゴもしくは短いオリゴの混合物中（またはリガーゼ連鎖反応を実施するためのプール中）の短いオリゴの１０％未満、または、５％未満、または３％未満、または１％未満は、３０ｎｔ、または２９ｎｔ、または２５ｎｔ、または２２ｎｔ、または２０ｎｔ、または１８ｎｔ、または１７ｎｔ、または１６ｎｔよりも長い。
【0023】
いくつかの実施形態では、サイズの混合が使用され得る。様々な実施形態では、各プール中のオリゴは、記載されるパーセンテージ量のいずれかで存在する、記載される長さ範囲のいずれかのものであり得る。任意の実施形態では、短いまたは長いオリゴは、５’リン酸化され得る。５’リン酸化はまた、リガーゼ連鎖反応工程の前に行われ得るオリゴと好適なキナーゼとの接触によって達成され得る。オリゴはまた、５’－Ｐで予め合成され得る。しかし、５’リン酸化オリゴヌクレオチドを提供する任意の方法が使用され得る。一実施形態では、キナーゼは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ＰＮＫ）であり得るが、任意の適切なキナーゼが使用され得る。
【0024】
本方法またはＤＮＡアセンブリ反応の任意の実施形態では、ＤＮＡリガーゼおよび複数の短いオリゴヌクレオチドの混合物中に、１６ｎｔよりも長い、もしくは２２ｎｔよりも長い、もしくは２５ｎｔよりも長い、もしくは３０ｎｔよりも長い長さを有する核酸が存在することができないか、または混合物中のオリゴヌクレオチドの１０％未満、もしくは５％未満、もしくは３％未満、もしくは１％未満（モル量またはオリゴ数で）が、２２ｎｔもしくは２５ｎｔもしくは３０ｎｔよりも長い長さを有する。
【0025】
様々な実施形態では、本方法は、１つ以上のプール中のオリゴを利用することができる。様々な実施形態では、プールまたはセットは、２～２５０個、または２～１５０個、または２～１２５個の短いオリゴを含有することができ、これらは、オリゴプールにおいて、またはプールの対において組み合わされ得る。他の実施形態では、８～２５０個、または８～１５０個、または８～１２５個の短いオリゴは、プールまたはセットに含まれ、本方法を開始するために使用され得る。より多くの実施形態では、複数の短いオリゴは、少なくとも１５個のオリゴ、または少なくとも２０個のオリゴ、または少なくとも５０個のオリゴ、または６４個超のオリゴ、または６５個超のオリゴ、または少なくとも７５個のオリゴ、または少なくとも１００個のオリゴ、または１５～２５０個のオリゴ、または２０～２５０個のオリゴ、または３０～２５０個のオリゴ、または４０～２５０個のオリゴ、または５０～２５０個のオリゴ、または２０～２００個のオリゴ、または３０～２００個のオリゴ、または４０～２００個のオリゴ、または５０～２００個のオリゴ、または１５～１５０個のオリゴ、または２０～１５０個のオリゴ、または３０～１５０個のオリゴ、または４０～１５０個のオリゴ、または５０～１５０個のオリゴである１つ以上のプールサイズまたはセットサイズを構成することができる。
【0026】
本方法において、オリゴヌクレオチドは、一緒に存在して混合物を形成することができる。混合物は、好適な緩衝液中にオリゴを含有することができ、オリゴは、混合物中の相補的オリゴにアニールすることができる。いくつかの実施形態では、重複は、オリゴの長さの約２分の１である。したがって、１６ｎｔのオリゴは、混合物中の別のオリゴと８ｎｔ重複することができる。他の実施形態では、重複は、オリゴの長さの２分の１よりも大きくてもまたは小さくてもよく、例えば、重複は、オリゴの長さの２分の１プラスまたはマイナス１、または２、または３、または４、または５ｎｔであり得る。
【0027】
複数の短いオリゴ（またはＤＮＡ断片のセット）は、マッピングされ、互いのすぐそば配置された場合、アセンブルされかつ所望の配列を有する産物ＤＮＡ分子の配列の少なくとも一部分（または配列全体）を構成することができる。いくつかの実施形態では、短いオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、前記複数の中の少なくとも１つの他の短いオリゴヌクレオチドの配列の一部分と重複し、かつそれに相補的である。複数のオリゴは、１つ以上のプールに分割されて、オリゴセットを構成することができる。いくつかの実施形態では、前記複数の中の短いオリゴヌクレオチドは、１つの他の短いオリゴヌクレオチドのみと重複することができる末端（短い）オリゴヌクレオチドを除いて、前記複数の中の２つの他の短いオリゴヌクレオチドと重複する。末端の短いオリゴヌクレオチドは、アセンブルされる産物核酸分子の５’および３’末端を含む（または存在する場合、フランキング配列の５’および３’末端を含む）ものである。任意選択的に、末端の短いオリゴは、任意のフランキング配列の一部ではない。
【0028】
短いオリゴは、本明細書に列挙される任意の長さを有することができるが、様々な実施形態では、短いオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、２つの他の短いオリゴヌクレオチドと重複する。図１に示されるように、短いオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも２つは、それらの相補配列に結合したときに互いに隣接し、隣接しているオリゴは、相補配列に結合しており、第１のオリゴの５’ヌクレオチドは、第２のオリゴの３’ヌクレオチドに結合しているヌクレオチドの隣りの相補配列上のヌクレオチドに結合しているか、またはその逆であり、すなわち、第１および第２のオリゴは、互いに隣接または隣り合っている。任意の実施形態では、結合は、ワトソン－クリック塩基対形成、または塩基対間の水素結合によるものを指すことができる。短いオリゴヌクレオチドが相補配列にアニールされ、互いに隣接する場合、それらは、ＤＮＡリガーゼによって共有結合的にライゲーションされ得る。第１のオリゴの５’－Ｐは、リガーゼによって第２のオリゴの３’－ＯＨにライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、重複は、隣りのオリゴに結合されているオリゴの長さの約半分を構成する（例えば、１６ｍｅｒは、１つまたは２つの隣りのオリゴと８ｂｐの重複を有することができる）。いくつかの実施形態では、短いオリゴヌクレオチドの少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％は、混合物中の相補オリゴ配列に結合することができ、３つのオリゴヌクレオチドのうちの２つは、そのように結合したときに互いに隣接する。
【0029】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、複数の初期オリゴもしくは短いオリゴ（またはＤＮＡ断片のセット）と接触して、混合物を作ることができる。使用され得るＤＮＡリガーゼの例としては、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（バクテリオファージＴ４由来）が挙げられるが、１つのアニールされたオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシル末端および直接的に隣り合うアニールされたオリゴの５’リン酸末端の間の共有ホスホジエステル結合の形成を触媒し、それによって、オリゴヌクレオチドを結合して、共有結合およびより長いオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＤＮＡ断片をもたらす、任意の好適なＤＮＡリガーゼが使用され得る。ＤＮＡリガーゼのさらなる例としては、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、および９°Ｎ（商標）ＤＮＡリガーゼが挙げられる（しかし、これらに限定されない）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、熱安定性ＤＮＡリガーゼであり得、すなわち、７０℃を超える温度で安定し得るが、他の実施形態では、熱安定性リガーゼは、９０℃を超える、または９３℃を超える、または９４℃を超える、または９０～１００℃の温度で、かつ少なくとも３０秒、または少なくとも６０秒、または３０～６０秒から少なくとも３０分～少なくとも６０分から選択される任意の期間、安定し得る。熱安定性ＤＮＡリガーゼはまた、少なくとも７０℃、または８５℃の温度に、２０分、３０分、または１時間曝露した後に活性のままであり得る。様々な実施形態では、接触は、ＡＴＰおよび／もしくはＮＡＤを含むことができるか、または特定のリガーゼについての他の補因子もしくは要件が使用され得る。
【0030】
所望の配列のＤＮＡ分子は、任意の配列を有することができる。任意の実施形態では、本方法は、配列非依存性であり得、これは、本方法が機能し、所望の配列のＤＮＡ分子を産生するために存在しなければならない特定の必要な配列がないことを意味する。様々な実施形態では、本方法で合成される所望の配列のＤＮＡ分子は、少なくとも２０ｂｐ、または少なくとも３０ｂｐ、または少なくとも４０ｂｐ、または少なくとも６０ｂｐ、または４０～６０ｂｐ、または２０～１００ｂｐであり得る。本方法は、階層的アセンブリを適用することができるため、任意のサイズ、例えば、１ｋｂよりも大きい、または１～３ｋｂ、または１０ｋｂよりも大きい、または１～１０ｋｂ、または１～１２ｋｂのうちの１つの所望の配列のＤＮＡ分子が、本方法でアセンブルすることができる。所望の配列のＤＮＡ分子はまた、フランキング配列、例えば、ＵＴＲ、プロモーター、イントロン、またはフランキング相同配列を含むことができる。様々な実施形態では、所望の配列のＤＮＡ分子は、少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または３０～６０％のＧＣ含有率を有することができる。
【0031】
リガーゼ連鎖反応
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（リガーゼサイクリング反応とも呼ばれる）は、ＤＮＡアセンブリの方法であり、任意選択的に、後続のポリヌクレオチドアセンブリ反応（例えば、ＰＣＡ、ＯＳＯＳ、または重複伸長ＰＣＲ（ＯＥ－ＰＣＲ））およびＤＮＡ産物の増幅（例えば、ＰＣＲによる）と組み合わされ得る。ＬＣＲは、変性、アニーリング、および反応工程における隣接しているオリゴヌクレオチドのリガーゼによるライゲーションの工程を含み、これらは、循環し、したがって繰り返され得る。ＬＣＲにおいて、ＤＮＡリガーゼは、第１および第２の隣接オリゴと接触し、第１および第２の隣接オリゴは、第１および第２のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方（または両方）の一部分に相補的でありかつそれに重複する配列を有する第３のオリゴにアニールされる（図１）。第１のオリゴの５’末端のヌクレオチドは、ＤＮＡリガーゼによって、第２のオリゴの３’末端のヌクレオチドにライゲーションされ得る。第１のオリゴの５’末端のヌクレオチドはリン酸化され、第２のオリゴの３’末端のヌクレオチドは３’－ＯＨを有し、それによって、隣接している第１および第２のオリゴ上のリガーゼに５’－Ｐおよび３’－ＯＨ基質を提供することができる。ライゲーションされたオリゴ（ここで、より長いオリゴヌクレオチド）および（相補的な）第３のオリゴは、ここで変性することができ、サイクルは、繰り返され得る。様々な実施形態では、変性、アニーリング、およびライゲーションの少なくとも２回、または少なくとも５回、または少なくとも１０回、または少なくとも１５回のサイクル、または少なくとも２０回のサイクル、または少なくとも２５回のサイクルが、ＬＣＲプロトコルで行われ得る。したがって、ＬＣＲは、ＤＮＡリガーゼを３つ以上のポリヌクレオチドと接触させて混合物を形成することと、第１および第２のポリヌクレオチドが、第１および第２のポリヌクレオチドのうちの一方または両方に相補的な配列を有する第３の（相補的な）ポリヌクレオチドにアニールされながら、互いに隣接するように、ポリヌクレオチドをアニールすることと、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間でライゲーションを実施して、核酸産物をもたらすことと、を含むことができる。次いで、ポリヌクレオチドは、任意選択的に、変性およびアニーリングに供され、プロセスは、任意選択的に繰り返され得る。
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（リガーゼサイクリング反応とも呼ばれる）は、ＤＮＡアセンブリの方法であり、任意選択的に、後続のポリヌクレオチドアセンブリ反応（例えば、ＰＣＡ、ＯＳＯＳ、または重複伸長ＰＣＲ（ＯＥ－ＰＣＲ））およびＤＮＡ産物の増幅（例えば、ＰＣＲによる）と組み合わされ得る。ＬＣＲは、変性、アニーリング、および反応工程における隣接しているオリゴヌクレオチドのリガーゼによるライゲーションの工程を含み、これらは、循環し、したがって繰り返され得る。ＬＣＲにおいて、ＤＮＡリガーゼは、第１および第２の隣接オリゴと接触し、第１および第２の隣接オリゴは、第１および第２のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方（または両方）の一部分に相補的でありかつそれに重複する配列を有する第３のオリゴにアニールされる（図１）。第１のオリゴの５’末端のヌクレオチドは、ＤＮＡリガーゼによって、第２のオリゴの３’末端のヌクレオチドにライゲーションされ得る。第１のオリゴの５’末端のヌクレオチドはリン酸化され、第２のオリゴの３’末端のヌクレオチドは３’－ＯＨを有し、それによって、隣接している第１および第２のオリゴ上のリガーゼに５’－Ｐおよび３’－ＯＨ基質を提供することができる。ライゲーションされたオリゴ（ここで、より長いオリゴヌクレオチド）および（相補的な）第３のオリゴは、ここで変性することができ、サイクルは、繰り返され得る。様々な実施形態では、変性、アニーリング、およびライゲーションの少なくとも２回、または少なくとも５回、または少なくとも１０回、または少なくとも１５回のサイクル、または少なくとも２０回のサイクル、または少なくとも２５回のサイクルが、ＬＣＲプロトコルで行われ得る。したがって、ＬＣＲは、ＤＮＡリガーゼを３つ以上のポリヌクレオチドと接触させて混合物を形成することと、第１および第２のポリヌクレオチドが、第１および第２のポリヌクレオチドのうちの一方または両方に相補的な配列を有する第３の（相補的な）ポリヌクレオチドにアニールされながら、互いに隣接するように、ポリヌクレオチドをアニールすることと、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間でライゲーションを実施して、核酸産物をもたらすことと、を含むことができる。次いで、ポリヌクレオチドは、任意選択的に、変性およびアニーリングに供され、プロセスは、任意選択的に繰り返され得る。
【0032】
ＬＣＲに続いて、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を利用して、成功したライゲーション、例えば、ＰＣＡ、ＯＳＯＳ、ＯＥ－ＰＣＲ、もしくはＰＣＲプロトコル（またはそれらのいずれかの組み合わせおよび変形）から生じるオリゴをアセンブルまたは増幅させる、ＤＮＡアセンブリおよび／または増幅手順が行われ得る。異なる実施形態では、ＬＣＲは、プライマーの有無にかかわらず実施され得る。本発明において、ＬＣＲ、ＰＣＡ、ＯＳＯＳ、またはＯＥ－ＰＣＲは、本明細書に記載される任意のサイズの短いオリゴ、例えば（これらに限定されないが）、長さが３０ヌクレオチド未満、もしくは２２ヌクレオチド未満、もしくは２０ヌクレオチド未満、もしくは１５ヌクレオチド未満、もしくは１２ヌクレオチド未満のオリゴ、または６ヌクレオチドよりも大きい、もしくは１２ヌクレオチドよりも大きい、もしくは１３ヌクレオチドよりも大きい短いオリゴ、または１９ヌクレオチド、もしくは１８ヌクレオチド、もしくは１６ヌクレオチド、もしくは１６ヌクレオチド未満、もしくは８～１８ヌクレオチド、もしくは８～１７ヌクレオチド、もしくは８～１６ヌクレオチド、もしくは８～１５ヌクレオチドのオリゴに対して実施され得る。いくつかの実施形態では、これらの反応のいずれかはまた、より長い相補配列を含むことができ、これは、いくつかの実施形態では、混合物中の短いオリゴの２～４倍の長さであり得る。しかし、本明細書に記載されるオリゴの長さのいずれも、ＬＣＲまたは他のＤＮＡアセンブリおよび／もしくは増幅反応において利用され得る。いくつかの実施形態では、アニーリングおよび／またはライゲーションは、ライゲーション反応に関与するオリゴのうちの一方または両方の融解温度またはその付近で、例えば、１℃、または２℃、または３℃、または５℃以内で実施され得る。様々な実施形態では、ＬＣＲは、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、もしくは少なくとも８つのオリゴ、または少なくとも１６個のオリゴ、または少なくとも３２個のオリゴ、または少なくとも６４個のオリゴ、または８～３２個のオリゴ、または８～６４個のオリゴで行われ得、オリゴは、本明細書に記載される任意の長さを有することができる。ＬＣＲは、リガーゼがドナーの５’－Ｐをアクセプターオリゴの３’－ＯＨと結合することができるように、ドナーオリゴヌクレオチドの５’－Ｐのリン酸化を含む（またはそれに先行する）ことができる。一実施形態では、リン酸化は、オリゴをキナーゼ、例えば、本明細書に記載される任意のキナーゼと接触させることによって実施される。いくつかの実施形態では、本方法は、等温で行われ、すなわち、温度は、オリゴヌクレオチドのアセンブリ順序を決定する勾配で変動しない。いくつかの実施形態では、ＬＣＲは、等温で行われ得る。様々な実施形態では、ＬＣＲ、ＰＣＡ、ＯＳＯＳ、およびＰＣＲのいずれも、エキソヌクレアーゼを使用することなく行われ得る。
【0033】
ＬＣＲ反応を簡単に説明すると、セット中のオリゴの熱分離または変性が生じる。次いで、温度が低下し、オリゴは、オリゴセット中のそれらの相補鎖にアニールする。オリゴは、結合される２つのオリゴが、各オリゴに対する相補配列を有する同じ相補鎖上で、互いに直接隣り合ってアニールし、互いに隣接するように設計される。第１のオリゴは、その５’末端ヌクレオチド上にリン酸基を有し、第２のオリゴは、その３’末端ヌクレオチド上に３’ヒドロキシルを有し、したがって、リガーゼに５’－Ｐおよび３’－ＯＨ基質を提供する。次いで、リガーゼは、隣接しているオリゴ同士を、相補鎖に結合した１つの（ここで、より大きい）ポリヌクレオチドに共有結合する。後続のサイクルにおいて、結合されたポリヌクレオチドは、次いで、熱分離され、再度、直接隣り合うオリゴのそばおよびそれに隣接して再度相補鎖に再アニールされ、リガーゼによって再び結合される。次いで、変性、アニーリング、およびライゲーションの１つ以上のさらなるサイクルが実施され得る。５’ヌクレオチドのリン酸化の工程が、任意選択的に含まれ得る。様々な実施形態では、少なくとも１０回、または少なくとも１５回、または少なくとも１９回、または少なくとも２０回のサイクル、または少なくとも２５回のサイクルが、ＬＣＲプロトコルに含まれ得る。ＬＣＲは通常、二本鎖ＤＮＡを産生する。ＬＣＲプロトコルの一例が、実施例１に提供される。
【0034】
ＯＳＯＳ「ワンステップ－ワンショット」は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および（任意選択的に）クラウディング剤を使用してＤＮＡをアセンブルするためのＰＣＲタイプの反応であり、（任意選択的に）重複オリゴヌクレオチドを増幅させて、核酸産物を形成することを含むことができる。これらの反応に関する詳細は、例えば、２０１４年１０月１６日に公開されたＵＳ２０１４／０３０８７１０に見られ得、これは、参照により、すべての表、図、および特許請求の範囲を含むその全体が本明細書に組み込まれる。一例では、ＯＳＯＳプロトコルは、実施例１に示される。しかしながら、本開示を用いる当業者は、プロトコルが、アセンブルされる特定の核酸に応じて変動および適合することができることを認識するであろう。このプロトコルにおいて、反応は、９回循環するが、他の実施形態では、少なくとも５回、または少なくとも１０回、または少なくとも１２回、または少なくとも１５回、または少なくとも１９回、または少なくとも２０回、または少なくとも２５回循環し得る。ＯＳＯＳは、アニーリング段階、伸長段階、および変性段階の循環を伴う。ＯＳＯＳにおいて、段階の任意の１つ以上は、時間変動段階であり得る。時間変動段階は、サイクル間で変動または変化する期間にわたって行われる段階である。サイクルの時間変動段階（例えば、プロトコルの工程５に示されるような時間変動伸長）は、前のサイクルの同じ段階と比較して、またはサイクルの第１のそのような段階と比較して、または本方法の第１のサイクルの段階と比較して、時間が増加または減少することができる。例えば、一実施形態では、各サイクルの伸長段階は、時間変動段階である。時間の変化は、約１０秒／サイクル、または約１２秒／サイクル、または約１４秒／サイクル、または約１５秒／サイクル、または約１７秒／サイクル、または約２０秒／サイクルの増加であり得る。いくつかの実施形態では、ＯＳＯＳは、反応においてプライマーを用いて実施され、他の実施形態では、ＯＳＯＳは、プライマーなしで実施され、プライマーは、任意選択的に、末端プライマーであり得る。プライマーまたは末端プライマーは、例えば、増幅も望ましい場合、使用され得る。様々な実施形態では、プライマーは、少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または４～６、または４～８、または６～１５ヌクレオチド長であり得る。任意の実施形態では、クラウディング剤は、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ ８０００）であり得、これは、反応緩衝液中で０．０１８８％よりも大きい、または０．０２５％よりも大きい、または０．３７５％よりも大きい濃度で提供され得る。
【0035】
したがって、一実施形態では、ＯＳＯＳ反応は、重複オリゴヌクレオチドのセットから単一工程で核酸分子をアセンブルすることを含むことができる。反応は、アセンブリ混合物を形成するために、反応槽内で少なくとも５つの重複オリゴヌクレオチドのセットを、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰの混合物、および（任意選択的にクラウディング剤）と組み合わせる工程、アセンブリ混合物を少なくとも２５回のサイクルに供する工程（各サイクルは、５０℃～７７℃で実施されるアニーリング段階、５０℃～７７℃で実施される伸長段階、および９０℃を超で実施される変性段階を含む）、ならびにそれによって、単一工程で重複オリゴヌクレオチドのセットから核酸分子をアセンブルする工程、のうちの１つ以上の工程を含むことができる。
【0036】
ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）は、当業者に既知であり、より短い断片からより大きい核酸分子をアセンブルするための方法である。ＰＣＡは、ＬＣＲ反応の産物で実施され得る。ＤＮＡポリメラーゼが鋳型配列全体を埋めることを可能にすることができる順方向プライマーおよび逆方向プライマーがどのように存在するかと同様に、ＰＣＡは、同様の技術を使用するが、複数のオリゴヌクレオチドを用いる。ＰＣＡは、ＤＮＡハイブリダイゼーションおよびアニーリングを利用し、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、相補配列を有する一本鎖オリゴ（またはオーバーハング）に基づいて、ＤＮＡの配列を正確な順序でアセンブルする。ＰＣＡは、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片（任意選択的に、少なくとも３０ヌクレオチドまたは少なくとも６０ヌクレオチドのもの）を、より大きいＤＮＡ分子にアセンブルすることができる。アニーリング、伸長、および変性の段階を含むサイクリング反応を使用して、より大きいＤＮＡ分子がアセンブルされることができる。任意の実施形態では、ＰＣＡ反応は、プライマー（例えば、末端プライマー）なしで行われ得る。しかし、いくつかの実施形態では、そのようなプライマーは、例えば、増幅が望ましい場合、ＰＣＡプロトコルで使用され得る。
【0037】
いくつかの実施形態では、ＬＣＲで使用されるＤＮＡリガーゼは、熱安定性リガーゼである。例えば、熱安定性ＤＮＡリガーゼが使用される場合、それは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたはＴａｑリガーゼであり得る。しかし、他のリガーゼ、例えば、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ、またはその他も使用され得る。一実施形態では、熱安定性リガーゼは、少なくとも１時間、４５℃を超える温度でその活性を維持することができる。いくつかの実施形態では、本方法で使用される熱安定性リガーゼは、任意選択的に少なくとも１時間、約４５～６５℃または４５～８０℃で活性である。いくつかの実施形態では、リガーゼは、６５℃で少なくとも４８時間の半減期、および／または９５℃で１時間を超える半減期を有する。いくつかの実施形態では、リガーゼの活性は、ＮＡＤ依存性であり、そのような場合、ＮＡＤは、反応混合物中に存在する。「活性」とは、酵素を評価するために標準的な反応条件下で行われる反応の活性の少なくとも５０％を意味する。
【0038】
いくつかの実施形態では、本方法で（または本方法で使用され得るＬＣＲ、ＰＣＡ、ＯＳＯＳ、ＯＥ－ＰＣＲ反応で）結合される複数またはセットのオリゴは、溶液中に存在し、すなわち、いくつかの実施形態では、複数またはセット中のオリゴのいずれも、オリゴのうちの１つ以上に結合するマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、ビーズ、もしくは他の固体支持体上に固定化されていないか、もしくはそれらに結合しておらず、いかなる反応成分もまた、固定化されていないか、もしくはそれらに結合していない。一実施形態では、所望の配列のより長いオリゴまたはＤＮＡ断片またはＤＮＡ分子にアセンブルされる短いオリゴのすべてが、溶液中に存在する。本方法は、溶液中のオリゴヌクレオチドを使用して適用され得るため、それらは結果として、自動化に適している。
【0039】
リガーゼ連鎖反応によって産生されるより長いオリゴまたはＤＮＡ断片は、任意のＤＮＡアセンブリ技術、例えば、ＯＳＯＳおよび／またはポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）によってさらにアセンブルすることができる。様々な実施形態では、本明細書に開示されるＬＣＲ反応または本方法は、単一工程または一段階反応として行われ得、これは、反応成分が反応槽内に配置されると、反応が行われ、所望の配列のＤＮＡ分子が、槽を再び開ける必要なくアセンブルされ、任意選択的に、槽は、後続のＤＮＡアセンブリ反応（例えば、ＰＣＡおよび／またはＰＣＲ反応）（使用された場合）の最中に開けられる必要がないことを意味する。任意の実施形態では、ＬＣＲに続いて、ＤＮＡアセンブリ反応（例えば、ＯＳＯＳ）が行われ得る。ＬＣＲに続いて、ＰＣＡ反応も行われ得る。ＬＣＲに続いて、ＰＣＡ反応、および任意選択的にＤＮＡアセンブリ反応も行われ得る。実施形態のいずれにおいても、一連の反応に続いて、増幅のためのＰＣＲが行われ得る。ＰＣＡおよび／またはＰＣＲが使用される場合、短いオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡリガーゼは、混合物を形成することができ、ＬＣＲを実施した後、得られたより長いオリゴまたはＤＮＡ断片は、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰ、ならびに任意の他の必要な成分と接触して、より長いオリゴまたはＤＮＡ断片のセットを結合し、それによって所望の配列を有するＤＮＡ分子をアセンブルすることができる。
【0040】
例示的な実施形態
一実施形態では、所望の配列のＤＮＡ分子は、ＤＮＡリガーゼおよび短いオリゴヌクレオチドの混合物が、８～３０または８～２２ヌクレオチド長の２～２５０個の短いオリゴを含有する方法でアセンブルされる。一実施形態では、ＬＣＲに続いて、ＰＣＡおよびＰＣＲが行われる。他の実施形態では、所望の配列のＤＮＡ分子は、８～３０または８～２２ヌクレオチド長の８～１５０個の短いオリゴからアセンブルされる。短いオリゴは、任意選択的に、混合物中に存在するポリヌクレオチドの少なくとも５０％、または少なくとも７５％、または少なくとも９０％（モル比またはｗ／ｗで）を構成することができる。この実施形態では、本方法は、完全に溶液中で実施され得る。任意選択的に、混合物中に、３０ヌクレオチド長よりも長いオリゴヌクレオチドは存在することができないが、任意選択的に、より長いオリゴヌクレオチドが存在することもでき、ここで、混合物中のオリゴヌクレオチドの１０％未満、または５％未満、または３％未満、または１％未満（モル比で）が、３０ｎｔよりも長い長さを有する。特定の実施形態では、短いオリゴヌクレオチドは、８ｍｅｒもしくは１６ｍｅｒであるか、または８～１６ヌクレオチドの長さを有する。本明細書の任意の実施形態では、アセンブルされたＤＮＡ分子は、１０，０００ヌクレオチド当たり１エラー未満のエラー率を有することができる。実施形態のいずれにおいても、所望の配列のＤＮＡ分子は、少なくとも３０％または３０～６０％のＧＣ含有率を有することができる。
一実施形態では、所望の配列のＤＮＡ分子は、ＤＮＡリガーゼおよび短いオリゴヌクレオチドの混合物が、８～３０または８～２２ヌクレオチド長の２～２５０個の短いオリゴを含有する方法でアセンブルされる。一実施形態では、ＬＣＲに続いて、ＰＣＡおよびＰＣＲが行われる。他の実施形態では、所望の配列のＤＮＡ分子は、８～３０または８～２２ヌクレオチド長の８～１５０個の短いオリゴからアセンブルされる。短いオリゴは、任意選択的に、混合物中に存在するポリヌクレオチドの少なくとも５０％、または少なくとも７５％、または少なくとも９０％（モル比またはｗ／ｗで）を構成することができる。この実施形態では、本方法は、完全に溶液中で実施され得る。任意選択的に、混合物中に、３０ヌクレオチド長よりも長いオリゴヌクレオチドは存在することができないが、任意選択的に、より長いオリゴヌクレオチドが存在することもでき、ここで、混合物中のオリゴヌクレオチドの１０％未満、または５％未満、または３％未満、または１％未満（モル比で）が、３０ｎｔよりも長い長さを有する。特定の実施形態では、短いオリゴヌクレオチドは、８ｍｅｒもしくは１６ｍｅｒであるか、または８～１６ヌクレオチドの長さを有する。本明細書の任意の実施形態では、アセンブルされたＤＮＡ分子は、１０，０００ヌクレオチド当たり１エラー未満のエラー率を有することができる。実施形態のいずれにおいても、所望の配列のＤＮＡ分子は、少なくとも３０％または３０～６０％のＧＣ含有率を有することができる。
【0041】
一実施形態では、本方法は、混合物を形成するために、ＤＮＡリガーゼを８～２２ヌクレオチド長の複数の短いオリゴと接触させることを含む。短いオリゴの少なくとも５０％が、８～２２ヌクレオチド長もしくは１０～２２ヌクレオチド長であり得るか、または任意選択的に、ＤＮＡリガーゼ混合物中の短いオリゴの少なくとも７０％または少なくとも９０％もしくは１００％が、８～２２もしくは１０～２２ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態では、短いオリゴは、８ｍｅｒもしくは１６ｍｅｒ、または８～１６ヌクレオチド長である。この実施形態では、本方法は、完全に溶液中で実施され得る。任意選択的に、２２ヌクレオチド長よりも長いオリゴヌクレオチドは、混合物中に存在しないが、任意選択的に、少量のより長いポリヌクレオチド中に、より長いオリゴヌクレオチドが存在することもでき、例えば、混合物中のオリゴヌクレオチドの１０％未満、または５％未満、または３％未満、または１％未満（オリゴ数で）が、２０ｎｔまたは２２ｎｔよりも長い長さを有する。特定の実施形態では、短いオリゴヌクレオチドは、８ｍｅｒもしくは１６ｍｅｒであるか、または８～１６ヌクレオチドの長さを有する。本明細書の任意の実施形態では、アセンブルされたＤＮＡ分子は、８，０００または１０，０００ヌクレオチド当たり１エラー未満のエラー率を有することができる。
【0042】
別の実施形態では、本方法は、混合物または１６～１８ヌクレオチド長を形成するために、ＤＮＡリガーゼを１４～２０ヌクレオチド長の複数の短いオリゴと接触させることを含む。短いオリゴの少なくとも５０％、または少なくとも７５％、または少なくとも９０％は、１６～１８ヌクレオチド長、または１５～１９ヌクレオチド長、または１４～２０ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態では、短いオリゴは、１６ｍｅｒ、または１７ｍｅｒ、または１８ｍｅｒである。この実施形態では、本方法は、完全に溶液中で実施され得る。任意選択的に、２０ヌクレオチド長よりも長いオリゴヌクレオチドは、混合物中に存在しないが、任意選択的に、少量のより長いポリヌクレオチド中に、より長いオリゴヌクレオチドが存在することもでき、例えば、混合物中のオリゴヌクレオチドの１０％未満、または５％未満、または３％未満、または１％未満（オリゴ数で）が、２０ｎｔよりも長い長さを有する。本明細書の任意の実施形態では、アセンブルされたＤＮＡ分子は、８，０００、または９，０００、または１０，０００ヌクレオチド当たり１エラー未満のエラー率を有することができる。
【0043】
任意の実施形態では、所望の配列のＤＮＡ分子は、１４×８ｍｅｒの重複セットから本方法でアセンブルされることができる。様々な数のセット、例えば、５つ、または７つ、または９つが使用され得る。
【0044】
一実施形態では、所望の配列のＤＮＡ分子は、３２個のオリゴの６つのプール、または６４個のオリゴの２つのプール、または１１１個のオリゴの１つのプールを含有する混合物から、本方法でアセンブルされる。ＬＣＲに続いて、任意選択的に、ＯＳＯＳおよび／またはＰＣＡおよび／またはＰＣＲが行われる。
【0045】
一実施形態では、所望の配列のＤＮＡ分子は、６５個超の短いオリゴヌクレオチドを含有する混合物から、本方法でアセンブルされる。
【0046】
本方法の任意の実施形態では、混合物は、短いオリゴの長さの約２分の１、例えば、長さの１～２ヌクレオチド以内、重複する短いオリゴヌクレオチドを含有することができる。例えば、本方法のいずれかの実施形態では、混合物は、８ｍｅｒであり４ｎｔ重複する、または１６ｍｅｒであり８ｎｔ重複する、または３～５ｎｔ重複する８ｍｅｒ、または７～９ｎｔ重複する１６ｍｅｒである、短いオリゴヌクレオチドを含有することができる。
【0047】
本方法のいずれかの実施形態では、ＬＣＲは、６４個のオリゴ、または６５個超のオリゴ、または６５個超のオリゴで行われる。
【0048】
任意の実施形態では、ＬＣＲに続いて、時間変動段階を有するＤＮＡアセンブリ反応（例えば、ＯＳＯＳ）が行われ得、時間変動段階は、伸長段階であり、伸長段階は、１５秒／サイクル増加する。
【実施例】
【0049】
実施例１
本実施例は、約５０％のＧＣ含有率を有する無作為に生成された合成配列の２４０ｂｐのＤＮＡ断片の合成を示す。４ｂｐの重複を有するオリゴを含有する１４個の８ｍｅｒ（１４×８ｍｅｒ）の７つの重複プールを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションして、６０ｍｅｒの７つのプールを形成し、プールは、隣りのプール中のオリゴと重複する。ＬＣＲ後、これらの６０ｍｅｒの７つのプールを１つのプールに入れ、最終の２４０ｂｐの産物をポリメラーゼ連鎖アセンブリ反応によってアセンブルした。２４０ｂｐの産物は、図２に示される。最終の２４０ｂｐの産物についての９６個のクローンのクローニングおよびサンガー配列決定を、平滑末端ＰＣＲ産物のクローニングのためのＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用した検証のために実施した（表１）。
本実施例は、約５０％のＧＣ含有率を有する無作為に生成された合成配列の２４０ｂｐのＤＮＡ断片の合成を示す。４ｂｐの重複を有するオリゴを含有する１４個の８ｍｅｒ（１４×８ｍｅｒ）の７つの重複プールを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションして、６０ｍｅｒの７つのプールを形成し、プールは、隣りのプール中のオリゴと重複する。ＬＣＲ後、これらの６０ｍｅｒの７つのプールを１つのプールに入れ、最終の２４０ｂｐの産物をポリメラーゼ連鎖アセンブリ反応によってアセンブルした。２４０ｂｐの産物は、図２に示される。最終の２４０ｂｐの産物についての９６個のクローンのクローニングおよびサンガー配列決定を、平滑末端ＰＣＲ産物のクローニングのためのＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用した検証のために実施した（表１）。
【0050】
２つのプールを、流体を分配するための音響液体処理システムを使用して、２５ｎｌの体積で形成し、約３０ｎＭ／オリゴの濃度にするために１６μｌに水を添加した。各１６μｌのプールに、１：１の比率のＴ４ＰＮＫ混合物およびＬＣＲ混合物を含有する１０μｌのマスターミックスを添加し、十分に混合し、リン酸化、変性およびアニーリング、ならびにＬＣＲのために、以下のプロトコルに従ってサーマルサイクラーにおいて約５時間インキュベートした。Ｔ４ＰＮＫ混合物は、２μｌの水、２μｌの１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液、および１μｌのＴ４ＰＮＫを含有した。ＬＣＲ混合物は、１．５μｌの水、２．５μｌの１０×Ｔａｑリガーゼ緩衝液、および１μｌのＴａｑリガーゼを有した。Ｔ４ＰＮＫ－ＬＣＲプロトコルは、以下のとおりであった。
１． ３７℃ ３０分
２． ９８℃ ２分
３． ８５℃ ２分、ランプ１℃／秒
４． ５０℃ ５分、ランプ０．１℃／秒
５． ３７℃ ５分
６． ９５℃ １０秒
７． ８５℃ １分、ランプ１℃／秒
８． ５５℃ １分、ランプ１℃／秒
９． ５０℃ ２分
１０． ４５℃ ５分
１１． ６に移動、９回
１２． ９５℃ １０秒
１３． ６５℃ ５分
１４． ５５℃ １０分
１５． ５０℃ ５分
１６． ４５℃ ５分
１７． １２に移動、１９回
１８． ５０℃ ３０分
１９． １０℃ ０（永久）
１． ３７℃ ３０分
２． ９８℃ ２分
３． ８５℃ ２分、ランプ１℃／秒
４． ５０℃ ５分、ランプ０．１℃／秒
５． ３７℃ ５分
６． ９５℃ １０秒
７． ８５℃ １分、ランプ１℃／秒
８． ５５℃ １分、ランプ１℃／秒
９． ５０℃ ２分
１０． ４５℃ ５分
１１． ６に移動、９回
１２． ９５℃ １０秒
１３． ６５℃ ５分
１４． ５５℃ １０分
１５． ５０℃ ５分
１６． ４５℃ ５分
１７． １２に移動、１９回
１８． ５０℃ ３０分
１９． １０℃ ０（永久）
【0051】
ＰＮＫ－ＬＣＲプロトコル後、２０μｌのＰＣＡミックス（プライマーなしのＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ、Ｖａｎｔａａ，Ｆｉｎｌａｎｄ）と５０ｍＭのＴＭＡＣ（塩化テトラメチルアンモニウム）とのＰＣＲミックス）を、上記のように、６μｌのマスターミックスとともに各ウェルに添加した。以下のプロトコルを使用して、ＯＳＯＳ「ワンステップワンショット」（ＰＣＲタイプのプロトコル）の１０回のサイクルを実施した。
１． ９８℃ １分
２． ９８℃ ３０秒
３． ６８℃ １分
４． ６０℃ １分
５． ５５℃ １分、１５秒／サイクルを追加
６． ５０℃ １分
７． ２に移動、９回
８． ７２℃ ５分
９． １０℃ ０（永久）
１． ９８℃ １分
２． ９８℃ ３０秒
３． ６８℃ １分
４． ６０℃ １分
５． ５５℃ １分、１５秒／サイクルを追加
６． ５０℃ １分
７． ２に移動、９回
８． ７２℃ ５分
９． １０℃ ０（永久）
【0052】
２０μｌのＰＣＲミックス（プライマーを含む）を、ＰＣＡ反応を伴ってウェルの各々に添加した。ＰＣＲを以下のプロトコルを使用して実施した。
１． ９８℃ １分
２． ９８℃ ３０秒
３． ７２℃ ４５秒、１５秒／サイクルを追加
４． ５５℃ １分、１５秒／サイクルを追加
５． ２に移動、９回
６． ９８℃ ３０秒
７． ７２℃ ４分
８． ６５℃ ６分
９． ６に移動、１９回
１０． ７２℃ ５分
１１． １０℃ ０（永久）
１． ９８℃ １分
２． ９８℃ ３０秒
３． ７２℃ ４５秒、１５秒／サイクルを追加
４． ５５℃ １分、１５秒／サイクルを追加
５． ２に移動、９回
６． ９８℃ ３０秒
７． ７２℃ ４分
８． ６５℃ ６分
９． ６に移動、１９回
１０． ７２℃ ５分
１１． １０℃ ０（永久）
【0053】
次いで、図２に示される所望のＤＮＡ分子の形成の確認のために、産物をゲル上に充填した。
【0054】
【表1】
【0055】
表１に示されるように、最終アセンブリのクローニングおよび配列決定確認は、１４，４００ｂｐにおいて１の全エラー率を明らかにした。これは、（エラー訂正の酵素工程に曝露することなく）標準的な４０ｍｅｒを使用して、合成ＤＮＡ構築物中で得られるものよりも約１４倍高い配列忠実度である。これにより、約９５％のエラーのない分子のパーセント（％ＥＦＭ）率がもたらされ、％ＥＦＭは、全体で配列決定された場合にエラーがないと予想される、１クローン当たりのコロニーのパーセントを説明する。
【0056】
実施例２
この実施例は、１６ｍｅｒ、３０ｍｅｒ、および４０ｍｅｒからのＧＦＰ断片の合成を示す。使用されるプロトコルは、実施例１に提供されるものと同じである。最初に、短いオリゴヌクレオチド（１６ｍｅｒ）のプールを使用して、ＧＦＰの９０１ｂｐの配列を構築した。様々な数の１６ｍｅｒを、Ｔａｑリガーゼを用いた様々な希釈で使用した。プールサイズは、３２×１６ｍｅｒの６つのプール、６４×１６ｍｅｒの２つのプール、および１１１×１６ｍｅｒの１つのプールであった。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してオリゴを５’リン酸化し、リガーゼ連鎖反応を使用してアセンブルし、続いてＰＣＡおよびＰＣＲを行って、ＤＮＡ産物をアセンブルおよび増幅させた。図３ａに示されるように、すべてのプールサイズについてアセンブリが成功した。ゲル化を行い、アセンブリの確認が図３ａに提供される。
この実施例は、１６ｍｅｒ、３０ｍｅｒ、および４０ｍｅｒからのＧＦＰ断片の合成を示す。使用されるプロトコルは、実施例１に提供されるものと同じである。最初に、短いオリゴヌクレオチド（１６ｍｅｒ）のプールを使用して、ＧＦＰの９０１ｂｐの配列を構築した。様々な数の１６ｍｅｒを、Ｔａｑリガーゼを用いた様々な希釈で使用した。プールサイズは、３２×１６ｍｅｒの６つのプール、６４×１６ｍｅｒの２つのプール、および１１１×１６ｍｅｒの１つのプールであった。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してオリゴを５’リン酸化し、リガーゼ連鎖反応を使用してアセンブルし、続いてＰＣＡおよびＰＣＲを行って、ＤＮＡ産物をアセンブルおよび増幅させた。図３ａに示されるように、すべてのプールサイズについてアセンブリが成功した。ゲル化を行い、アセンブリの確認が図３ａに提供される。
【0057】
得られたＤＮＡ分子の配列の確認のために、配列決定を実施した。アセンブルしたＤＮＡ分子のサブセットについて、８５００ｂｐ当たり１エラーのエラー率が観察された。したがって、短いオリゴの非常に複雑な混合物が、ＬＣＲおよびＰＣＡ／ＰＣＲを含む方法を使用してアセンブルされることができることが実証された。比較のために、３０ｍｅｒおよび４０ｍｅｒを本方法で合成および使用して、ＬＣＲのために、３０ｍｅｒおよび４０ｍｅｒの単一プールからアセンブルしたＧＦＰをアセンブルおよび増幅させた。ＬＣＲに続いて、ＯＳＯＳおよびＰＣＲを行った。本方法はまた、すべてのプールサイズをうまくアセンブルし、本方法の堅牢性を実証した。［得られたゲルは、図３ｂに示される。］
【0058】
実施例３
本方法がより大きいＤＮＡ分子をアセンブルすることができることを実証するために、ベクター末端を有するインフルエンザＨＡ（１９２７ｂｐ）およびＮＡ（１６０９ｂｐ）核酸を、本方法を使用してアセンブルした。様々なプールシナリオを実施し、５つのサブプールに分割された１６ｍｅｒ（各サブプールは、隣りのサブプールと重複する（１２８ｂｐ）６４個のオリゴを含有する）、単一プールとしての１６ｍｅｒ、単一プールとしての３０ｍｅｒ、および単一プールとしての４０ｍｅｒを含むＤＮＡ分子のアセンブルに成功した。アセンブルした核酸分子の配列決定確認は、ＨＡおよびＮＡの９２％および８９％がエラーのない分子としてアセンブルされたことを示した。これは、ＨＡおよびＮＡ分子の３７％および２９％がエラーのない分子としてアセンブルされた、６０ｍｅｒからの分子のアセンブリと比較された。得られたゲルは、図４ａに示される。
本方法がより大きいＤＮＡ分子をアセンブルすることができることを実証するために、ベクター末端を有するインフルエンザＨＡ（１９２７ｂｐ）およびＮＡ（１６０９ｂｐ）核酸を、本方法を使用してアセンブルした。様々なプールシナリオを実施し、５つのサブプールに分割された１６ｍｅｒ（各サブプールは、隣りのサブプールと重複する（１２８ｂｐ）６４個のオリゴを含有する）、単一プールとしての１６ｍｅｒ、単一プールとしての３０ｍｅｒ、および単一プールとしての４０ｍｅｒを含むＤＮＡ分子のアセンブルに成功した。アセンブルした核酸分子の配列決定確認は、ＨＡおよびＮＡの９２％および８９％がエラーのない分子としてアセンブルされたことを示した。これは、ＨＡおよびＮＡ分子の３７％および２９％がエラーのない分子としてアセンブルされた、６０ｍｅｒからの分子のアセンブリと比較された。得られたゲルは、図４ａに示される。
【0059】
実施例４
この実施例は、８×１６ｍｅｒオリゴおよび４×１６ｍｅｒを含む様々なプールシナリオの下で、１６ｍｅｒを使用した３１００ｂｐのＨＡおよび２８００ｂｐのＮＡ核酸構築物のアセンブリを示し、これらは、ＬＣＲ、および続くポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）の工程、続くＰＣＲの別の工程（すべて、実施例１のプロトコルに従って実施）を含む、開示された方法を使用して、特異的配列の所望のＤＮＡ分子のアセンブルに成功したことがわかった。結果は、図４ｂに示される。
この実施例は、８×１６ｍｅｒオリゴおよび４×１６ｍｅｒを含む様々なプールシナリオの下で、１６ｍｅｒを使用した３１００ｂｐのＨＡおよび２８００ｂｐのＮＡ核酸構築物のアセンブリを示し、これらは、ＬＣＲ、および続くポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）の工程、続くＰＣＲの別の工程（すべて、実施例１のプロトコルに従って実施）を含む、開示された方法を使用して、特異的配列の所望のＤＮＡ分子のアセンブルに成功したことがわかった。結果は、図４ｂに示される。
【0060】
実施例５
この実施例は、実施例１に示されるプロトコルを使用した最終アセンブリについて、ＬＣＲ、続くＰＣＡおよびＰＣＲを使用した１６ｍｅｒの２６個の重複プールを使用した、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノム配列の１０ｋｂ部分のアセンブリを示す。図５は、１０ｋｂの産物の形成を実証する。
この実施例は、実施例１に示されるプロトコルを使用した最終アセンブリについて、ＬＣＲ、続くＰＣＡおよびＰＣＲを使用した１６ｍｅｒの２６個の重複プールを使用した、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノム配列の１０ｋｂ部分のアセンブリを示す。図５は、１０ｋｂの産物の形成を実証する。
【0061】
実施例６
この実施例は、本方法が他の方法よりも著しく高い配列忠実度を達成することを実証する。２００ｂｐ～１８００ｂｐのサイズの範囲であり、様々な程度のＧＣ含有率を有する３２個のＤＮＡ構築物を、１６ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、および２２ｍｅｒからアセンブルした。ＧＣパーセンテージは、３０％、４０％、５０％、または６０％であった（ＧＣ４パネル）。ゲルは、図６に示される。図６に示されるように、アセンブリは、堅牢であり、すべての小さいオリゴサイズおよびすべてのレベルのＧＣ含有率でうまく実施された。図７は、最高の配列忠実度が１６ｍｅｒおよび１８ｍｅｒから始まって得られたことを示す。
この実施例は、本方法が他の方法よりも著しく高い配列忠実度を達成することを実証する。２００ｂｐ～１８００ｂｐのサイズの範囲であり、様々な程度のＧＣ含有率を有する３２個のＤＮＡ構築物を、１６ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、および２２ｍｅｒからアセンブルした。ＧＣパーセンテージは、３０％、４０％、５０％、または６０％であった（ＧＣ４パネル）。ゲルは、図６に示される。図６に示されるように、アセンブリは、堅牢であり、すべての小さいオリゴサイズおよびすべてのレベルのＧＣ含有率でうまく実施された。図７は、最高の配列忠実度が１６ｍｅｒおよび１８ｍｅｒから始まって得られたことを示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】