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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-17
(54)【発明の名称】生物学的サンプルのＲＮＡ標的の富化または枯渇
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20230410BHJP
C12Q 1/6811 20180101ALI20230410BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230410BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20230410BHJP
G01N 33/532 20060101ALI20230410BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 110Z
C12Q1/6811 Z
C12N15/11 Z
C07K16/00
G01N33/532 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022553079
(86)(22)【出願日】2021-03-05
(85)【翻訳文提出日】2022-11-02
(86)【国際出願番号】 US2021021147
(87)【国際公開番号】W WO2021178842
(87)【国際公開日】2021-09-10
(31)【優先権主張番号】62/986,055
(32)【優先日】2020-03-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520086564
【氏名又は名称】アルトラテック・リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】508285606
【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】オファーレル， ブライアン
(72)【発明者】
【氏名】オコンネル， クレア
(72)【発明者】
【氏名】オシャベン， ケイリン
(72)【発明者】
【氏名】アペラ， ダニエル
【テーマコード（参考）】
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ54
4B063QR82
4B063QS36
4B063QX02
4H045AA50
4H045DA75
4H045EA50
(57)【要約】
分析物を有するサンプルからの標的の富化または枯渇の方法が記載される。プローブは、左巻きのＰＮＡ対および標的化部分のうちの一方を有し、ここで上記左巻きのＰＮＡ対は、キラルでありかつ左巻きのらせん構造を誘導する環状骨格改変を有するＰＮＡの相補的な対である。捕捉表面は、上記左巻きのＰＮＡ対の他方を有する；上記左巻きのＰＮＡ対は、捕捉表面（これは磁性ビーズであり得る）に上記プローブをハイブリダイズするために結合する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中の標的富化の方法であって、前記方法は、捕捉部分に連結された左巻きのＰＮＡ分子を含むプローブを、標的分析物を含むサンプルに導入する工程；
前記捕捉部分で、上記標的分析物を捕捉する工程；および
前記左巻きのＰＮＡ分子を、左巻きのキラル構造を含む相補的ＰＮＡ分子と結合させる工程であって、前記相補的ＰＮＡ分子は、表面に結合され、それによって標的分析物を富化する、工程、
を包含する、方法。
【請求項2】
前記表面は、ビーズを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ビーズは、磁性ビーズである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記表面は、固定された基材を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記左巻きのＰＮＡ分子は、ヌクレオチド配列を含む前記左巻きのＰＮＡ分子の一部を、標的化部分に連結するリンカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記方法は、第２のプローブを前記サンプルへと導入する工程をさらに包含し、前記第２のプローブは、左巻きのＰＮＡ、標的化部分、および検出部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記標的化部分は、右巻きの標的化ＰＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記捕捉部分は、抗体または抗体フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記方法は、左巻きのＰＮＡ対によって提供される複数のリンクを有する鎖を構築する工程を包含し、前記鎖は、標的、抗体、および検出部分のうちのいくつかまたは全てを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記方法は、１８℃～８０℃の範囲の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記方法は、約３７℃の温度で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記標的分析物は、ＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＲＮＡは、１８ｓリボソームＲＮＡを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記表面は、ビーズの表面を含み、前記ビーズは、前記方法の工程を行った後に、さらなるアッセイにおける再使用のための清浄な捕捉表面を提供するために熱融解される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記捕捉部分は、アキラルまたはキラルＰＮＡ、デオキシリボ核酸、リボ核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ロックド核酸、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、またはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー、タンパク質、ペプチド、非天然アミノ酸を有するペプチドもしくはタンパク質、酵素、抗体、単一ドメイン抗体（ナノボディ）、アプタマー、薬物分子、低分子、化合物、細胞、または上記のうちの１もしくはこれより多くの組み合わせ、のうちのいずれか１つもしくはこれより多くを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
検出部分は、前記左巻きのＰＮＡ分子と連結され、前記検出部分は、以下：蛍光標識、発光標識、発色団標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識、または視覚的標識（例えば、金のような金属性標識）、マイクロスフェア、ナノ粒子、ビオチン標識、アビジン標識、ジゴキシゲニン、コレステロール、またはジニトロフェニル標識、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識、または上記のうちの１もしくはこれより多くの組み合わせ、のうちの１またはこれより多くを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記左巻きのＰＮＡ分子は、リンカーを含み、前記リンカーは、１～１２０個の原子の長さを含む、ならびに／または元素：Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、およびＳｉのうちの１個もしくは数個を有する、ならびに／または以下の結合：単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合、およびチオエステル結合のうちの１つのみもしくは組み合わせを含む鎖の中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記ＰＮＡ分子は、多重化を可能にするためにプログラム可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記ＰＮＡ分子は、左巻きのらせん構造を誘導する環状骨格改変で改変される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、生物学的サンプルの標的分子を捕捉するための方法およびデバイスに関する。
本発明は、生物学的サンプルの標的分子を捕捉するための方法およびデバイスに関する。
【背景技術】
【0002】
背景
ＲＮＡ標的化および増幅のための方法はしばしば、酵素による増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を使用する。試薬の適切な貯蔵および取り扱いが、これらの方法では必要である。さらに、酵素の機能性は、増幅プロセスの成功を確実にするために重要である。他の難題は、酵素が温度感受性でありかつ貯蔵寿命が制限されていることである。
ＲＮＡ標的化および増幅のための方法はしばしば、酵素による増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を使用する。試薬の適切な貯蔵および取り扱いが、これらの方法では必要である。さらに、酵素の機能性は、増幅プロセスの成功を確実にするために重要である。他の難題は、酵素が温度感受性でありかつ貯蔵寿命が制限されていることである。
【0003】
配列特異的ＲＮＡ富化または枯渇は、目的の配列に対して相補的な配列を有するビオチン化プローブがストレプトアビジン官能化表面（例えば、マイクロスフェア）上に捕捉されるビオチン－アビジン（または一般には、ストレプトアビジンもしくはニュートラアビジン）親和性反応を使用して達成され得る。
【0004】
ビオチン－アビジンは、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）；免疫組織化学（ＩＨＣ）；ウェスタンブロット法、ノーザンブロット法、およびサザンブロット法；免疫沈降；細胞表面標識；アフィニティー精製；蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）；ならびに電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）のような適用において広範に使用される。特筆される制限は、全てのビオチン化分子が任意のビオチン結合分子に結合し得るので、試薬が多重の実験のために他の検出－プローブシステム（例えば、一次－二次抗体）と組み合わせて使用されなければならないことである。重要なことには、サンプル中の天然に存在するビオチンは、いくつかの試験で偽の結果を引き起こすことが見出されており、検査開発業者に連絡をとって議論をするよう要求したＵＳＦＤＡによる警告の対象となった。ビオチンを含む栄養補助食品は、特に問題である。
【0005】
さらに、ストレプトアビジン試薬の貯蔵および輸送は、冷蔵の必要性に起因して、物流に関する難題を呈する。アジ化ナトリウム（潜在的には、爆発物）は、長期間貯蔵する間の細菌増殖を防止するために一般に使用され、広範な洗浄工程が、使用前に、ビーズおよび生物製剤を調製するために、それを溶液から除去することが必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
要旨
本発明は、生物学的サンプル中の標的分子の捕捉のための方法を提供する。本発明の方法は、標的分子の捕捉および送達のためにペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを利用する。好ましい実施形態において、捕捉部分を含む第１のキラルＰＮＡプローブは、標的分析物を捕捉するために使用され、次いで、固体支持体に結合された相補的な第２のキラルＰＮＡプローブに結合される。好ましい実施形態において、上記ＰＮＡプローブは、左巻きのキラル対である。本発明のＰＮＡプローブは、リンカーを介して結合部分に結合され得る。上記結合部分は、核酸、グリコール、タンパク質（抗体または酵素を含む）、低分子、炭水化物もしくはレクチン、または標的分子に結合され得る任意の他の結合因子であり得る。一例では、固体支持体に結合されるＰＮＡプローブは、ハイブリダイゼーションを介して、別のＰＮＡプローブを捕捉する。その別のＰＮＡプローブは、リンカーを介して、結合部分で終端する別のＰＮＡプローブへと結合される。上記ＰＮＡプローブは、好ましくは、左巻きのキラリティーを有し、その結果、それらは、天然のＲＮＡもしくはＤＮＡとではなく、それらのＰＮＡ相補的結合対とハイブリダイズする。本発明は、このアプローチを利用して、生物学的サンプル中の標的分子を特異的に捕捉する。上記プローブは、上記左巻きのＰＮＡと標的化部分とを連結するリンカーを含み得る。代替の実施形態において、上記捕捉プローブは、右巻きのＰＮＡ分子であり得る。
本発明は、生物学的サンプル中の標的分子の捕捉のための方法を提供する。本発明の方法は、標的分子の捕捉および送達のためにペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを利用する。好ましい実施形態において、捕捉部分を含む第１のキラルＰＮＡプローブは、標的分析物を捕捉するために使用され、次いで、固体支持体に結合された相補的な第２のキラルＰＮＡプローブに結合される。好ましい実施形態において、上記ＰＮＡプローブは、左巻きのキラル対である。本発明のＰＮＡプローブは、リンカーを介して結合部分に結合され得る。上記結合部分は、核酸、グリコール、タンパク質（抗体または酵素を含む）、低分子、炭水化物もしくはレクチン、または標的分子に結合され得る任意の他の結合因子であり得る。一例では、固体支持体に結合されるＰＮＡプローブは、ハイブリダイゼーションを介して、別のＰＮＡプローブを捕捉する。その別のＰＮＡプローブは、リンカーを介して、結合部分で終端する別のＰＮＡプローブへと結合される。上記ＰＮＡプローブは、好ましくは、左巻きのキラリティーを有し、その結果、それらは、天然のＲＮＡもしくはＤＮＡとではなく、それらのＰＮＡ相補的結合対とハイブリダイズする。本発明は、このアプローチを利用して、生物学的サンプル中の標的分子を特異的に捕捉する。上記プローブは、上記左巻きのＰＮＡと標的化部分とを連結するリンカーを含み得る。代替の実施形態において、上記捕捉プローブは、右巻きのＰＮＡ分子であり得る。
【0007】
これら「キーチェーン（ｋｅｙｃｈａｉｎ）」ＰＮＡ分子が結合される固体支持体は、任意の適切な固体支持体であり得る。例えば、上記固体支持体は、ビーズまたは磁性粒子の表面であり得る。よって、ある特定の実施形態において、磁場は、捕捉部分と結合した分析物を操作する（例えば、動かすまたは検出する）ために使用され得る。場合によっては、上記固体支持体は、結合した分析物を感知するために、センサーまたはセンサー表面と関連付けられる。有利なことには、この配置は、分析物のサンプルが、第１のキラルＰＮＡ分子の捕捉部分に結合される分析物を、上記第１のキラルＰＮＡ分子に相補的な第２のキラルＰＮＡ分子を有するセンサー表面を覆うように流すかまたは通過させることによって、迅速に検出されることを可能にする。上記相補的なキラルＰＮＡ分子での上記第１のキラルＰＮＡ分子の捕捉は、分析物検出を提供する。よって、本発明の方法は、マイクロ流体システムとの使用に十分に適している。そして上記キラルＰＮＡ分子は、他の分析物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合しないことから、上記キーチェーンＰＮＡ分子を使用する検出方法は、サンプル中の分析物の信頼性のある測定を提供する。
【0008】
ＰＮＡの特徴は、その安定性および多用途性である。従って、ＰＮＡ分子を使用して分析物をプローブする方法は、従来のＤＮＡおよびＲＮＡ方法を超えるいくつかの明確な利点を提供する。例えば、ＰＮＡ分子は、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼによる分解に耐性であり、酸性環境においてすら安定している。この増強された安定性は、ＰＮＡ分子が最適未満の条件下で（酸性溶液または低塩溶液中で）すら、標的を捕捉することを可能にする。よって、本発明の方法は、ＰＮＡ分子に依拠することによって、分析物を、サンプル（例えば、細胞溶解物）を処理するのが別の方法では困難であるものから捕捉し得る。さらに、ＰＮＡ分子は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはストレプトアビジンに関しては６ヶ月間の貯蔵寿命と比較して、長い貯蔵寿命（数ヶ月から数年間）を有し、それらがヌクレアーゼ分解されにくいことから、冷蔵を必要としない。
【0009】
本発明の方法は、核酸の検出または富化のための酵素を必要としない。よって、本明細書で記載される方法は、酵素が関わる類似の方法と同じ厳密な操作条件によって拘束されない。さらに、大部分の場合には、本明細書で記載される方法において使用される試薬は、冷蔵を必要としない。よって、本発明の方法は、どこででも（例えば、遠隔地でも）、および誰にでも使用できる。例えば、本発明の方法は、広い範囲の温度（例えば、約１８℃～約８０℃の範囲）にわたって行われ得る。しかし、好ましい実施形態において、本発明の方法は、約３７℃で行われる。
【0010】
本発明のＰＮＡプローブは、目的の分析物を結合するために捕捉部分を使用する。場合によっては、上記分析物は、タンパク質または細胞の表面抗原であり得る。捕捉部分は、従って、抗体または抗体フラグメントを含み得る。上記捕捉部分の抗体または抗体フラグメントは、目的の分析物と関連する抗原を捕捉するために使用され得る。上記抗体捕捉部分を有するＰＮＡプローブは、好ましくはキラルである。使用時に、上記抗体連結ＰＮＡプローブに相補的な第２のキラルＰＮＡプローブは、標的分析物と結合した上記抗体連結ＰＮＡプローブを捕捉するために使用され得る。
【0011】
本発明のＰＮＡプローブは、ＰＮＡの鎖の一部であり得る。ＰＮＡの鎖は、任意の数の核酸モノマーを含み得る。有利なことには、ＰＮＡは概して荷電されていないので、ＰＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡの類似のオリゴヌクレオチドより高い結合強度で会合される。よって、ＰＮＡプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡの類似のオリゴヌクレオチドより少ないモノマーで相補的標的を捕捉し得る。いくつかの実施形態において、本発明のＰＮＡプローブは、１５個またはこれより少ない核酸モノマーを含む。さらに、本明細書で記載されるある特定の実施形態において、本発明の方法は、ＰＮＡの電荷を改変することを企図する。好ましくは、上記ＰＮＡは、キラルである。ＰＮＡ分子の電荷を改変すること（例えば、上記ＰＮＡ分子を負に荷電させること）は、他の負に荷電した核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に対する上記ＰＮＡの結合親和性を低減し、それによって、相補的キラルＰＮＡに対する結合特異性を増大させるために有用である。
【0012】
本発明の方法は、多重化のために特に有用である。本発明の左巻きのキラルＰＮＡプローブは、他の左巻きのキラルＰＮＡプローブの相補的配列と特異的に結合する（かつ他の核酸とは結合しない）ことから、上記プローブは、多重反応のために容易にプログラム可能である。例えば、上記左巻きのＰＮＡプローブは、他の相補的プローブに差次的に結合するために、長さおよび／またはモノマー配列が変化し得る。よって、いくつかの方法によれば、複数の異なる左巻きのキラルＰＮＡプローブ（異なる標的分析物と結合される）が、相補的配列を含む相当する左巻きのＰＮＡプローブによって差次的に捕捉および／または検出され得る。
【0013】
いくつかの実施形態において、本発明のＰＮＡプローブは、リンカーを含む。好ましくは、上記リンカーは、上記ＰＮＡプローブを捕捉部分に連結する。上記リンカーは、切断可能な結合を含み得る。例えば、上記リンカーは、プロテアーゼによって切断可能であり、それによって、捕捉された分析物が、下流の処理のためにＰＮＡプローブから分離されることを可能にする結合を含み得る。上記リンカーは、１～１２０個の原子の長さのものであってもよい、および／または元素：Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、およびＳｉのうちのいずれか１個またはこれより多くを含んでいてもよい。上記リンカーは、以下：単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合、およびチオエステル結合のうちの１つまたは組み合わせを含む鎖の中にあり得る。
【0014】
別の局面において、本発明は、本発明の方法を行うための標的富化または枯渇装置に関する。上記装置は、分析物と捕捉部分に連結された左巻きのＰＮＡ分子を含むプローブとを結合させるためのチャンバを含む。上記チャンバは、分析物と結合した相補的な左巻きのＰＮＡプローブを含む表面を提供し得る。上記表面は、１個またはこれより多くのビーズであり得る。上記１個またはこれより多くのビーズは、上記装置の区画から放出可能であり得る。例えば、上記ビーズ（ＰＮＡプローブを有する）は、上記チャンバの区画内部の熱感受性基材（例えば、ワックス）中にパッケージされ得る。上記ビーズは、熱を適用することによって上記プローブが分析物と結合した後に上記チャンバへと放出され得る。好ましくは、上記ＰＮＡは、キラルでありかつ左巻きのらせん構造を誘導する環状骨格改変を有する相補的ＰＮＡの対を含む。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【発明を実施するための形態】
【0031】
詳細な説明
本発明は、生物学的サンプルから標的分子を捕捉するためのアッセイに関する。より詳細には、本発明は、標的分析物を捕捉するための改変されたペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用するアッセイに関する。好ましくは、上記ＰＮＡは、ある特定のモノマー（以下で記載される）を組み込んで、キラリティーを誘導することによって改変される。本発明は、その誘導されたキラリティーを利用して、非ＰＮＡ分子に対する上記ＰＮＡの結合親和性を操作する。特に、本発明の好ましい方法は、ＰＮＡにおいてキラリティーを誘導して、サンプル中のＤＮＡおよび／またはＲＮＡに対するＰＮＡの結合親和性を低減し、それによって、他の改変されたＰＮＡ分子に対するＰＮＡの選択性を増大させる。
本発明は、生物学的サンプルから標的分子を捕捉するためのアッセイに関する。より詳細には、本発明は、標的分析物を捕捉するための改変されたペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用するアッセイに関する。好ましくは、上記ＰＮＡは、ある特定のモノマー（以下で記載される）を組み込んで、キラリティーを誘導することによって改変される。本発明は、その誘導されたキラリティーを利用して、非ＰＮＡ分子に対する上記ＰＮＡの結合親和性を操作する。特に、本発明の好ましい方法は、ＰＮＡにおいてキラリティーを誘導して、サンプル中のＤＮＡおよび／またはＲＮＡに対するＰＮＡの結合親和性を低減し、それによって、他の改変されたＰＮＡ分子に対するＰＮＡの選択性を増大させる。
【0032】
ＰＮＡは、糖－ホスフェート骨格がシュードペプチド骨格によって置き換えられたオリゴヌクレオチドアナログである。ＰＮＡの骨格は一般に、ペプチド結合によって連結されたＮ－（２－アミノエチル）グリシンユニット（ＡＥＧ）の非荷電性の反復を含む。合成骨格は、ＰＮＡに多くの有益な特性（例えば、イオン強度への低依存度、高い化学的安定性、高い配列特異性、ならびにヌクレアーゼおよびプロテアーゼの両方に対する耐性）を提供する。場合によっては、それらは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡに高い特異性および選択性で結合し、その相当する核酸複合体より安定であるＰＮＡ－ＲＮＡおよび／またはＰＮＡ－ＤＮＡハイブリッドをもたらす。ＰＮＡを使用する核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる考察については、Ｒａｔｉｌａｉｎｅｎ， １９９８， Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８， ３７， ３５， １２３３１－１２３４２、およびＷｅｉｌｅｒ， １９９７， Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ （ＰＮＡ） ｏｌｉｇｏｍｅｒ ａｒｒａｙｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ２５， Ｉｓｓｕｅ １４， １ Ｊｕｌｙ １９９７， Ｐａｇｅｓ ２７９２－２７９９（これらの各々は、参考として援用される）を参照のこと。
【0033】
核酸（例えば、ＲＮＡ）に対する上記ＰＮＡの結合親和性および選択性が、不斉立体中心（例えば、Ｄ－Ｌｙｓベースのユニット）を上記ＰＮＡ骨格に導入ことによって改変され得、従って、改変されたＰＮＡを標的捕捉方法の理想的な候補にすることは、本発明の見識である。好ましい実施形態において、本発明の方法は、左巻きのキラリティーを有するように合成された改変ＰＮＡを使用する。
【0034】
ＤＮＡおよびＲＮＡのような天然に存在するヌクレオチドは、右巻きのキラリティーを有し、その中で、アキラルのおよび右巻きのＰＮＡは、これらのヌクレオチドに結合し得、これらを標的化するために使用され得る。しかし、天然で右巻きのオリゴヌクレオチドは、らせん構造の不適合性に起因して、左巻きのキラルＰＮＡに概して結合せず、これは、旧来のＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合が起こることを防止する。従って、左巻きのＰＮＡは、一般に、他の左巻きのＰＮＡまたはアキラルＰＮＡにしか結合できない。従って、キラルＰＮＡは、それらのアキラルアナログより安定性の低いＰＮＡ－ＤＮＡ二重鎖と会合する。この効果は、かさ高い非極性側鎖を有するアミノ酸またはＤＮＡの負に荷電したホスフェート基との反発性の相互作用を引き起こす負に荷電したモノマー（Ｄ－またはＬ－アスパラギン酸およびグルアミン酸に基づく）を含む改変されたＰＮＡ骨格を使用する本発明の方法においてより顕著であり得る。
【0035】
これらの特性は、左巻きのＰＮＡを、捕捉システムにおける使用に理想的な候補にする。その場合、上記捕捉システムの構成要素は、天然に存在するヌクレオチドと相互作用しない。特に、左巻きのＰＮＡは、本発明の方法に従って、プローブの構成要素として使用される。上記プローブはまた、標的化部分および好ましくは、左巻きのＰＮＡを上記標的化部分に連結するリンカーを含む。ある特定の実施形態において、左巻きのＰＮＡはまた、ビーズの構成要素として使用されるか、または上記標的の検出のためのセンサー表面に固定される。
【0036】
図１は、キラリティーを誘導するために有用な２つの改変されたモノマーを示す。特に、（ａ）左巻きの１０３および（ｂ）右巻きの１０５のキラリティーを誘導する、環状ＰＮＡ骨格改変モノマー１０３、１０５の２つのエナンチオマーが示される。ＰＮＡのらせん構造は、上記ＰＮＡ配列内にこれらのモノマーを含めることによって影響され得る。
【0037】
上記ＰＮＡは、例えば、Ｗｕ， ２０１７， Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ ｖｏｌｕｍｅ ３８， ｐａｇｅｓ７９８－８０５（これは参考として援用される）に記載されるように、当該分野で公知の方法によって合成され得る。好ましくは、上記ＰＮＡは、改変されたモノマーのうちの１またはこれより多くを使用して作製される。上記改変されたモノマーのうちの１つもないＰＮＡ配列は、好ましいらせん構造を有さない可能性があり、よって、アキラルであり得る。少なくとも１個の環状骨格改変モノマー１０３、１０５が含まれる場合、その拘束された骨格構造は、上記ＰＮＡにおいて左巻きの（ａ）または右巻きの（ｂ）いずれかのキラリティーを誘導する。１個より多くのモノマーの包含は、ＰＮＡの長さ全体のキラリティー優先性を確実にするために所望され得る。上記ＰＮＡのキラリティーは、当該分野で公知の種々の技術によって評価され得る。例えば、上記モノマーのうちの１個またはこれより多くを含むように合成されたＰＮＡは、核磁気共鳴法によって、またはX線結晶学によって特徴づけられ得る。
【0038】
本発明の方法は、左巻きのＰＮＡの対を形成するために、ＰＮＡへと立体中心を組み込む。上記左巻きの対は、キラルでありかつ左巻きのらせん構造を誘導する少なくとも１個の環状骨格改変モノマーを有するＰＮＡの相補的な対をいう。それらはときおり、本明細書において「左巻きのＰＮＡ対（ｌｅｆｔ－ｈａｎｄｅｄ ＰＮＡ ｐａｉｒ）」といわれる。それらは、γＰＮＡ（これは、異なる骨格化学を有するが、左巻きであり得る）と混同されるべきではない。
【0039】
上記左巻きのＰＮＡは、核酸の標的化部分として使用され得る右巻きの環状改変骨格ＰＮＡに対してエナンチオマーである。しかし、以下で記載されるように、上記標的化部分または捕捉部分は、ＰＮＡに限定されない。
【0040】
左巻きのＰＮＡ対は、アッセイに、生物学的実体（例えば、ＲＮＡ）の標的富化を提供するために種々の様式で使用され、ここでサンプル中の標的分子は、例えば、ビーズ（例えば、磁性ビーズ）にまたはセンサー（例えば、容量型センサー（ｃａｐａｃｉｔｉｖｅ ｓｅｎｓｏｒ））による分析のために表面に結合される。上記左巻きのＰＮＡはまた、さらなる検出または分析のためにより希な標的を残す枯渇タイプのアッセイにおいて比較的存在量の多い標的を除去するために使用され得る。
【0041】
例えば、好ましい実施形態において、捕捉部分と連結された第１のキラルＰＮＡ分子は、標的分子（例えば、ＲＮＡ）を捕捉するために使用される。上記標的分子と上記捕捉部分を介して結合された上記第１のキラルＰＮＡ分子は、次いで、固体支持体に好ましくは結合された相補的キラルＰＮＡ分子で捕捉される。好ましい実施形態において、上記ＰＮＡ分子は、左巻きのキラル対である。本発明のＰＮＡ分子は、リンカーを介して捕捉部分に結合され得る。上記捕捉部分は、上記標的分子と結合する任意の部分であり得、例えば、上記捕捉部分は、核酸、グリコール、タンパク質（例えば、抗体もしくは抗体フラグメント）、低分子、炭水化物もしくはレクチン、または上記標的分子に結合し得る任意の他の分子結合因子であり得る。
【0042】
一例では、固体支持体に結合されたＰＮＡプローブは、ハイブリダイゼーションを介して、別のＰＮＡプローブを捕捉する。その別のＰＮＡプローブは、リンカーを介して、結合部分で終端する別のＰＮＡプローブへと結合される。上記ＰＮＡプローブは、好ましくは、左巻きのキラリティーを有し、従って、相補的キラルＰＮＡ結合パートナーと特異的にハイブリダイズするが、天然のＲＮＡまたはＤＮＡとはハイブリダイズしない。本発明は、このアプローチを利用して、生物学的サンプル中の標的分子を特異的に捕捉する。
【0043】
有利なことには、いくつかの例では、ＰＮＡプローブは、先ず、その標的配列（一例では、１８ｓリボソームＲＮＡ）に、次に、左巻きのＰＮＡ対を使用して上記ビーズにハイブリダイズされる。これは、本明細書において「２工程」アプローチといわれる。このアプローチは、上記プローブがビーズに最初に結合されるアプローチと比較して、遙かに改善された標的富化を達成する。
【0044】
場合によっては、プローブは、センサー表面に結合される。例えば、上記プローブは、ＷＯ ２０１５／０８６６５４； ＷＯ ２０１５／０９１１３９（これらは参考として援用される）に記載されるようにセンサーの表面に結合され得る。結合は一般に、表面に結合された左巻きのＰＮＡ相補体にハイブリダイズする捕捉部分を含む左巻きのＰＮＡを要する。アキラルＰＮＡは、本出願において左巻きのＰＮＡプローブのうちの一方または両方を置き換え得る。アキラルＰＮＡは、相補的なアキラル、右巻きまたは左巻きのＰＮＡに対して類似のハイブリダイゼーション挙動を示す；しかし、ＰＮＡの相補的な対のうちの一方または両方における左巻きを誘導する骨格改変の除去は、プローブ捕捉の非生物的性質を排除し、内因性オリゴヌクレオチドとの潜在的なクロスハイブリダイゼーションを導入し得る。
【0045】
図２は、ビオチン－ストレプトアビジン磁性ビーズを用いる多重化アッセイのためのプロセスを示す。上記プロセスは、本発明との比較として、ビオチン－ストレプトアビジン磁性ビーズシステムを使用する多重化アッセイを提供する。標的１に関するビオチン化プローブ（Ｐ１）は、サンプル中でインキュベートされ（Ｉ）、続いて、ストレプトアビジンコーティング磁性ビーズが添加される（ＩＩ）。捕捉されたプローブおよび標的を有するビーズは、除去される。引き続く標的についてプローブインキュベーションおよびストレプトアビジンコーティング磁性ビーズによる標的除去の同じプロセスが行われる（ＩＩＩ～ＶＩ）。次いで、上記標的－プローブ複合体は、上記ビーズから除去される（ＶＩＩ）。左巻きのＰＮＡシステムとは異なり、捕捉部分が全ての工程においてビオチン－ストレプトアビジンであることに起因して、内因性ビオチン分子からの潜在的な干渉および先の工程から完全には除去されなかったプローブ／標的からのクロスコンタミネーションが存在し得る。左巻きのＰＮＡシステムは、図３に示されるように、内因性または食事性のビオチンによって影響を及ぼされない。
【0046】
図３は、左巻きのＰＮＡを用いる多重化アッセイを示す。図は、左巻きのＰＮＡシステムのプログラム可能性を利用することによって、本発明の多重化アッセイを行う能力を示す。この例では、３個のプローブ－ビーズセットが存在し、各々、異なる標的の（Ｐ１～３）および異なる左巻きのＰＮＡ対（Ｌ１～３、Ｌ１ｃ－３ｃ）を有する。全３個のプローブが、同時にサンプル中でインキュベートされ得る（Ｉ）。相補的な左巻きのＰＮＡでコーティングされた磁性ビーズは、次いで、他のプローブまたは天然の生体分子からのクロスコンタミネーションなしに、上記相補的プローブおよび標的を除去するために逐次的に使用される（ＩＩ～ＩＶ）。上記ビーズ－プローブ－標的複合体は、洗浄され得、上記プローブ－標的は、さらなる分析のために、加熱を介して上記ビーズから分離され得る（Ｖ）。各標的は、特有のプローブ対を使用して捕捉されることから、プローブ間のクロスコンタミネーションは最小限であり、上記ＰＮＡの左巻きのキラリティーが原因で、天然のＤＮＡ／ＲＮＡからの干渉は存在しない。
【0047】
左巻きのＰＮＡを有するプローブは、全てのプローブに同じ左巻きのＰＮＡを有し得るかまたは各プローブに異なる左巻きの配列を有し得るかのいずれかであり、その結果、それらの相補体で官能化したビーズの異なるセットが、特異的標的を捕捉するために使用され得る。よって、本発明の方法は、種々の多重化適用のために高度にカスタマイズされ得る。上記ＰＮＡモノマー配列は、配列の任意の配置に対して改変され得、それらは、例えば、図１５に示されるように、ストリンジェンシーのために加熱して除去される場合に、天然に存在する核酸といかなる相互作用をも有しない。
【0048】
図４は、磁性ビーズに対するプローブ（Ｐ）のハイブリダイゼーションを示す模式図である。特に、２つの例証、すなわち、ＩおよびＩＩが示され、例証Ｉは、システムの構成要素を示し、例証ＩＩは、それら構成要素の相互作用を示す。
【0049】
上記プローブ（Ｐ）上の左巻きのＰＮＡ（Ｌ）は、左巻きのＰＮＡ相補体（Ｌｃ）で官能化した磁性ビーズ（Ｍ）にハイブリダイズし、ここで上記ＰＮＡの相補的な対は、キラルであり、左巻きのらせん構造を誘導する環状骨格改変を有する。いくつかの実施形態において、左巻きのＰＮＡの対は、ハイブリダイズするために使用される。磁性ビーズ（Ｍ）にハイブリダイズするプローブ（Ｐ１）が図示され、これは、本発明の実施形態の多くに共通する。ハイブリダイゼーションは効果的であり、例えば、サンプル中でのビーズの使用ならびに標的および／もしくは検出部分に既に結合された別個のプローブの使用を可能にするか、または代わりに、上記ビーズへのハイブリダイゼーション後に結合され得る。
【0050】
他の例では、固定した基材（すなわち、表面）が、左巻きのＰＮＡ（Ｌｃ）で官能化され、プローブ（例えば、プローブＰ）は、その後の標的の捕捉のために上記表面にハイブリダイズするか、または標的に既に結合しており、上記固定した表面上での捕捉は、感知を可能にする。上記感知は、例えば、上記センサー上で容量型であってもよいし、放射性または非放射性検出によるものであってもよい。
【0051】
図５は、ハイブリダイゼーションによる標的捕捉を示す。具体的には、図５は、（Ｉ）標的化部分（本明細書でときおり捕捉部分といわれる）による標的への第１のプローブＰ１のハイブリダイゼーション、および（ＩＩ）左巻きのＰＮＡ対による磁性ビーズＭへの上記プローブのハイブリダイゼーションを示す。この場合に、上記プローブＰ１は、上記標的に既に結合されており、次いで、上記ビーズへの結合によって、上記標的が、例えば、マイクロ流体の流れの中で運ばれることを可能にする。
【0052】
図６は、標的捕捉のさらなる工程を図示する。特に、図６（これは、図５から進んでいる）は、（ＩＩＩ）上記標的に結合する第２のプローブ（Ｐ２）、および（ＩＶ）左巻きのＰＮＡ対による検出部分への上記第２のプローブのハイブリダイゼーションを示す。これは、当該分野で周知のタイプの蛍光センサーによって感知することを可能にする。上記検出部分は、適用に適した任意の公知のタイプのものであり得る。
【0053】
この例は、アッセイに関与する一連の複数の実体が、左巻きのＰＮＡ対を使用して、この場合には、標的への両方のプローブの間にある連結で、ビーズ－プローブ、およびプローブ－検出部分をどのように一緒に繋がれ得るかを示す。
【0054】
図７は、右巻きの標的化ＰＮＡの使用を図示する。特に、図７は、右巻きの標的化ＰＮＡ、リンカーおよび左巻きのＰＮＡを有するプローブ（Ｐ１）の使用を示し、ここで（Ｉ）上記プローブは、その右巻きの標的化ＰＮＡによって標的核酸配列にハイブリダイズする、および（ＩＩ）上記プローブは、左巻きのＰＮＡ対によって上記ビーズにハイブリダイズする。これは、プローブが、左巻きのＰＮＡ対、リンカー、および任意の適切な結合実体（例えば、この場合には、右巻きの標的化ＰＮＡ Ｒ１）のうちの１つを有し得ることを図示する。
【0055】
図８は、図７に示される方法のさらなる工程を示す。特に、図８は、図７の機序の拡張であり、ここで（ＩＩＩ）プローブ（Ｐ２）は、標的ＮＡに結合する第２の右巻きの標的化ＰＮＡ（Ｒ２）を有する、および（ＩＶ）検出部分は、第２の左巻きのＰＮＡ対によって結合される。
【0056】
図９は、標的化抗体が関わるアッセイを示す。特に、図９は、（Ｉ）プローブＰ１が、標的化抗体、リンカー、および左巻きのＰＮＡを有する、および（ＩＩ）それが、左巻きのＰＮＡによってビーズ（Ｍ）にハイブリダイズするアッセイを示す。
【0057】
図１０は、図９のアッセイの続きである。特に、図１０は、図９からのアッセイの発展を示し、ここで（ＩＩＩ）上記プローブ（Ｐ１）抗体は、検出部分または第２の左巻きのＰＮＡ（Ｌ２）を有する第２のプローブ（Ｐ２）に結合する、（ＩＶ）上記第２のプローブは、検出部分を有する第２の抗体または第２の左巻きのＰＮＡ相補体に結合する。
【0058】
ＰＮＡが結合体化したビーズおよびＲＮＡの富化および蛍光アキラルＰＮＡでの繋留は、種々の例において達成される。左巻きのＰＮＡ対の使用は、長くかつ構造的に複雑なＲＮＡを効率的に捕捉することが示された。上記第１の工程において、溶液中で遊離しているＰＮＡプローブが上記標的ＲＮＡとハイブリダイズする機序から利益を受ける多くのアッセイが存在する。第２の工程において、例えば、マイクロスフェア（例えば「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ」）の形態にあり、上記標的ＲＮＡに結合した左巻きのＰＮＡプローブに相補的な左巻きのＰＮＡで官能化した磁性ビーズが、導入される。
【0059】
１８ｓリボソームＲＮＡは、長くかつ構造的に複雑なＲＮＡであり、これは、インフルエンザに感染した細胞においてすら、その存在量および細胞間での一貫した発現が原因で、多くのＲＴ－ｑＰＣＲ反応の内因性コントロールとして使用される。このことは、１８ｓを、標的配列での正規化に理想的にしている。それ故に、ＰＣＲにおけるその使用と同じ理由から、それはこのアッセイにおいても重要である。上記２工程ハイブリダイゼーションを使用すると、１８ｓリボソームＲＮＡは、上記マイクロスフェアに共有結合された捕捉アキラルまたは右巻きのＰＮＡを用いるより遙かに効率的に全ヒトＲＮＡ単離物から捕捉され得ることが示された。さらに、１８ｓリボソームＲＮＡは、この方法を使用して、異なる生物学的バックグラウンド（血液または唾液のいずれか）から富化され得る。
【0060】
１つの局面において、本発明は、標的富化の方法を提供する。上記方法は、捕捉部分に連結された左巻きのＰＮＡ分子を含むプローブを、標的分析物を含むサンプルに導入する工程を包含する。上記サンプルは、任意の生物学的サンプルであり得る。例えば、上記サンプルは、被験体から採取された流体サンプル（例えば、血液、唾液、または尿）であり得る。標的分析物は、好ましくはＲＮＡを含む。上記ＲＮＡは、病原体のＲＮＡであり得る。例えば、好ましい実施形態において、上記標的ＲＮＡは、１８ＳリボソームＲＮＡ（１８Ｓ ｒＲＮＡと略される）である。好ましくは、上記１８Ｓ ｒＲＮＡは、例えば、Ｈａｄｚｉａｖｄｉｃ， ２０１４， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ １８Ｓ ｒＲＮＡ Ｇｅｎｅ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒｓ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９（２）： ｅ８７６２４（参考として援用される）に記載されるように、生物学的な種を同定および／または特徴づけるにあたって使用するための可変性の核酸配列を含む。
【0061】
本発明のプローブは、捕捉部分を含む左巻きのＰＮＡ分子を含み、上記捕捉部分は、好ましくは、アキラルであるかまたは右巻きのキラリティーを含む。上記左巻きのＰＮＡ分子は、パートナーの左巻きのＰＮＡプローブに相補的な配列を含むＰＮＡの１本鎖配列を含み得る。上記配列は、多くのヌクレオチド塩基（例えば、２個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、またはこれより多くの塩基）を含み得る。
【0062】
上記方法は、上記捕捉部分で上記標的分析物を捕捉する工程を包含する。捕捉する工程は、上記標的分析物への上記捕捉部分の相補的な塩基対合によって結合する工程を包含し得る。上記捕捉部分は、上記分析物に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。上記捕捉部分は、右巻きのＰＮＡを含み得る。上記捕捉部分は、リンカーによって、上記左巻きのＰＮＡ分子に連結され得る。上記リンカーは、１個またはこれより多くの核酸を含み得る。捕捉する工程は、上記捕捉部分プローブ配列が標的分析物のその相補的配列とハイブリダイズすることを可能にする条件下で、標的分析物を有するサンプルとＰＮＡプローブとを接触させる工程を包含し得る。上記プローブは、その結合を可視化することを可能にする、放射性または化学的タグで標識され得る。
【0063】
上記方法は、上記左巻きのＰＮＡ分子を左巻きのキラル構造を含む相補的ＰＮＡ分子と結合させる工程をさらに包含する。上記相補的ＰＮＡ分子は、好ましくは、表面へと結合され、それによって、標的分析物を富化する。上記表面は、ビーズの表面であり得る。上記ビーズは、磁性ビーズ（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによって商品名Ｄｙｎａｂｅａｄの下で販売される磁性ビーズ）であり得る。あるいは、上記表面は、分析物を検出するためにセンサーと関連付けられた表面を含み得る。
【0064】
１つの局面において、本発明は、本発明の方法を行うための標的富化または枯渇装置に関する。上記装置は、分析物を、捕捉部分に連結された左巻きのＰＮＡ分子を含むプローブと結合させるためのチャンバを含む。上記チャンバは、分析物と結合される相補的な左巻きのＰＮＡプローブを含む表面を提供し得る。上記表面は、１個またはこれより多くのビーズ（例えば、磁性ビーズ）であり得る。上記１個またはこれより多くの磁性ビーズは、上記装置の区画から放出可能であり得る。上記区画は、上記装置の蓋における区画であり得る。例えば、上記ビーズ（ＰＮＡプローブを有する）は、上記チャンバの区画内部の熱感受性基材（例えば、ワックス）中にパッケージされ得る。上記ビーズは、上記プローブが、熱を適用することによって分析物と結合した後に、上記装置を加熱することによって上記チャンバへと放出され得る。相補的プローブを含むビーズを放出することは、分析物を上記磁性ビーズへと効果的に繋留する。上記装置と関連付けられた磁石は、上記分析物が結合したビーズを溶融したワックス（これは、冷却することによって再固化され得る）へと引き出すために使用され得る。好ましくは、上記ＰＮＡは、キラルでありかつ左巻きのらせん構造を誘導する環状骨格改変を有する相補的ＰＮＡの対を含む。例えば、上記装置は、ＷＯ／２０１５／０８６６５２または２０１６／０９１８６８（これらの各々は、参考として援用される）に記載されるとおりのサンプル装置であり得る。
【実施例】
【0065】
実施例
１８ｓリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を、標的配列として使用し、ＰＮＡプローブを設計した。その設計したプローブのうちの１つ（これを４５８Ｒと称し、本明細書で４５８Ｒ配列ともいわれる）を、３バージョンで合成した。
１８ｓリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を、標的配列として使用し、ＰＮＡプローブを設計した。その設計したプローブのうちの１つ（これを４５８Ｒと称し、本明細書で４５８Ｒ配列ともいわれる）を、３バージョンで合成した。
【0066】
第１のＰＮＡ、「４５８Ｒ」は、アキラルＰＮＡであった。第２のものは、「４５８Ｒ ＲＨ」、４５８Ｒと同じ配列の右巻きのキラルバージョンであった。第３のものは、一方の末端に４５８Ｒ ＲＨ ＰＮＡを有し、左巻きのキラルＰＮＡに連結したＰＮＡプローブであった（「ＬＨ ＰＮＡ－４５８Ｒ ＲＨ」と称される）。超常磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１μｍ）を、上記４５８Ｒまたは４５８Ｒ ＲＨ ＰＮＡのいずれかで、上記ビーズ上に直接官能化し、「ＬＨ ＰＮＡ－４５８Ｒ ＲＨ」の場合に関しては、上記左巻きのＰＮＡ配列の相補体を、上記ビーズ上に官能化した。
【0067】
結果
蛍光標識した短い合成ＲＮＡ配列（２８塩基）での以前のデータは、５μＭのＰＮＡで官能化したビーズの全セットに関して、５７℃において、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含むＰＢＳ中、上記ＲＮＡのおよそ８０％の捕捉を与えた。次いで、これらのビーズを、全ヒトＲＮＡ単離物に由来する実際の１８ｓリボソームＲＮＡで試験した。１μｇ（またはコントロールウェル中の０μｇ）の全ヒトＲＮＡを、４５８Ｒまたは４５８Ｒ ＲＨで官能化したＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭに１０分間直接的にハイブリダイズするか、または代わりに先ず、「ＬＨ ＰＮＡ－４５８Ｒ ＲＨ」ＰＮＡプローブに１０分間ハイブリダイズし、その後さらに１０分間、左巻きの相補体ビーズに対してインキュベーションするかのいずれかを行った（全て５７℃で、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含むＰＢＳ緩衝液中）。上記ビーズによって特異的に捕捉されたＲＮＡの量を測定するために、Ａｔｔｏ４８８蛍光標識アキラルＰＮＡを、上記捕捉した１８ｓ ｒＲＮＡと、１０分間、５７℃においてハイブリダイズさせた。
蛍光標識した短い合成ＲＮＡ配列（２８塩基）での以前のデータは、５μＭのＰＮＡで官能化したビーズの全セットに関して、５７℃において、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含むＰＢＳ中、上記ＲＮＡのおよそ８０％の捕捉を与えた。次いで、これらのビーズを、全ヒトＲＮＡ単離物に由来する実際の１８ｓリボソームＲＮＡで試験した。１μｇ（またはコントロールウェル中の０μｇ）の全ヒトＲＮＡを、４５８Ｒまたは４５８Ｒ ＲＨで官能化したＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭに１０分間直接的にハイブリダイズするか、または代わりに先ず、「ＬＨ ＰＮＡ－４５８Ｒ ＲＨ」ＰＮＡプローブに１０分間ハイブリダイズし、その後さらに１０分間、左巻きの相補体ビーズに対してインキュベーションするかのいずれかを行った（全て５７℃で、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含むＰＢＳ緩衝液中）。上記ビーズによって特異的に捕捉されたＲＮＡの量を測定するために、Ａｔｔｏ４８８蛍光標識アキラルＰＮＡを、上記捕捉した１８ｓ ｒＲＮＡと、１０分間、５７℃においてハイブリダイズさせた。
【0068】
ビーズを、非特異的に結合したＲＮＡを除去するために洗浄した後、蛍光ＰＮＡをハイブリダイズさせ、上記特異的１８ｓ ＲＮＡをその後、上記磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用してウェルへ移した。上記１８ｓ ｒＲＮＡへの蛍光標識したＰＮＡの繋留の後、上記ビーズを再び洗浄して、非特異的に結合したＰＮＡを除去した。最後に、ハイブリダイズしたＰＮＡを、１０ｍＭ 水酸化カリウム溶液および９５℃で２分間の加熱工程を使用して、上記Ｄｙｎａｂｅａｄｓ上のＲＮＡから溶離した。その溶離したＰＮＡを、プレートリーダーで蛍光測定し、その実験の結果を図１１に示す。これは、異なるＰＮＡ捕捉システムを使用する、全ヒトＲＮＡからの１８ｓ ｒＲＮＡの捕捉および繋留を示す。
【0069】
図１１からのデータは、全ての場合において、蛍光がＲＮＡなしのコントロールウェルより大きかったことから、いくつかの１８ｓ ｒＲＮＡを、ビーズの各セットによって、全ヒトＲＮＡ単離物から捕捉したことを示す。４５８Ｒ ＰＮＡに関しては、上記ＲＮＡとＲＮＡなしのコントロールウェルとの間の差異は、０．１２であり、４５８Ｒ ＲＨ ＰＮＡビーズに関しては、同様であり、０．１３の蛍光単位であった。しかし、最大の差異は、０．４１蛍光単位の差異で、２工程システムに関して認められた。上記４５８Ｒのみが、「ＬＨ ＰＮＡ－４５８Ｒ ＲＨ」セットが捕捉したＲＮＡの量のうちの４０％を捕捉した。
【0070】
蛍光アキラルＰＮＡを使用する繋留を全ての実験において使用して、上記捕捉システムで代わりに使用され得る第２のＰＮＡプローブを模倣した。左巻きのＰＮＡシステムを使用することの１つの利点は、ＲＮＡ富化または枯渇が、生物学的に適合性の温度において等温で行われ得ることである。図１２を参照すると、これを示す実験が行われた。この実験において上記プローブおよび上記Ｄｙｎａｂｅａｄｓのハイブリダイゼーションを、３７℃で行った。
【0071】
図１２は、３７℃での全ヒト単離物からの１８ｓ ｒＲＮＡの捕捉および繋留を示し（Ｎ＝３）、傾向線は、平均値（灰色の点）のものである。
【0072】
線形の傾向は、３７℃（通常の体温）での１８ｓ ｒＲＮＡの繋留に関して観察され、これは、捕捉および繋留が、ＲＮＡへのハイブリダイゼーションのための高温に依拠しないことを示唆する。１μｇおよび０μｇのＲＮＡに関して溶離したＰＮＡの量は、５７℃で行った図１１に示されるように以前に見出されたものに類似であり、これは、高温が、「ＬＨ ＰＮＡ－４５８Ｒ ＲＨ」プローブを使用して標的配列にアクセスするか、または特異性を改善するために必要とされないことを示唆する。これは、結果的に、最小限のハードウェアおよび機器類しか、上記アッセイおよび単純な加熱工程を行うために必要とされないことを意味し、これは、サーマルサイクリングが上記プロセスに必要とされないことから、最終的な機器を単純化する。
【0073】
生物学的マトリクスからの標的富化を、左巻きのＰＮＡ（２工程）システムでの使用に関して調査した。１０％ （ｖ／ｖ） リチウム－ヘパリン収集全血および１０％ 唾液（最終濃度）を、上記アッセイで試験した。これらの生物学的サンプルを、ＲＮａｓｅ阻害のために、２０ｍＭ リボヌクレオシドバナジル複合体（ＲＶＣ）を含むＰＢＳ中の５０％ （ｖ／ｖ）溶液において処理した。上記サンプルを、３７℃で３０分間加熱し、その後０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含むＰＢＳ中での１０％ （ｖ／ｖ）への希釈、ならびに１μｇの全ヒトＲＮＡ（血液サンプル中）または２ピコモルのＣｙ５標識合成２８塩基１８ｓ ｒＲＮＡ（唾液サンプル中）のいずれかおよびＰＮＡプローブの添加を行った。上記ＰＮＡプローブ「ＬＨ ＰＮＡ－ＲＨ ４５８Ｒ」を、３７℃で１０分間加熱することによって、上記ＲＮＡにハイブリダイズさせた。この３０μｇのＬＨｃ官能化Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、ハイブリダイズしたＲＮＡ ＰＮＡを含む溶液に添加した後、３７℃で１０分間のさらなるインキュベーション工程を行って、上記ビーズ上のＬＨ ＰＮＡ相補体を、上記プローブ上のＬＨ ＰＮＡにハイブリダイズさせた。血液サンプルの場合には、上記全ヒトＲＮＡから捕捉した１８ｓ ｒＲＮＡを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ上で、ＰＢＳＴ中で洗浄し、その後、上記ビーズを、Ａｔｔｏ４８８標識アキラルＰＮＡを含むＰＢＳＴ溶液中に置いた。この蛍光アキラルＰＮＡは、上記４５８Ｒ位置に近い１８ｓ ＲＮＡ上の部位に結合するために利用可能である。上記蛍光ＰＮＡを、３７℃で１０分間、上記Ｄｙｎａｂｅａｄｓ上の１８ｓにハイブリダイズさせた。次いで、上記Ｄｙｎａｂｅａｄｓを再び洗浄し、上記ＲＮＡを、１０ｍＭ 水酸化カリウムを含む溶液へと溶離し、９５℃へと２分間加熱した。上記ビーズから溶離した溶液を、上記アッセイを通じて、上記１８ｓ ｒＲＮＡへのハイブリダイゼーションを介して溶離プレートへともたらされたＡｔｔｏ４８８色素に相当する励起波長および発光波長において、分光測定プレートリーダーで読み取った。
【0074】
図１３は、全ヒトＲＮＡからの１８ｓ ＲＮＡの検出のデータを示す。特に、図１３は、全ヒトＲＮＡバックグラウンド、ならびにＡ）全血、およびＢ）唾液の１０％マトリクスからの１８ｓ ＲＮＡの検出からのデータを示す（ここでＮ＝３であり、傾向線は、左巻きのＰＮＡシステムの使用を図示するために平均値（点線）のものである）。左巻きのＰＮＡシステムは、１８ｓ ＲＮＡの直接検出を提供し、上記サンプルから観察された。データは、全ヒトＲＮＡバックグラウンドおよびＡ）全血の１０％マトリクスからの１８ｓ ｒＲＮＡの検出、ならびにＢ）１０％ 唾液のバックグラウンドからの合成１８ｓ ＲＮＡの検出を示す（Ｎ＝３）。傾向線は、平均値のものである（点線）。
【0075】
１８ｓ ｒＲＮＡの捕捉は、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含むリン酸緩衝食塩水の緩衝液を使用し、８ｍＭのＲＮａｓｅインヒビターＲＶＣ（最終濃度）を使用して、１０％（ｖ／ｖ）で両方の生物学的溶液から獲得可能であった。両方のグラフの線形的な傾向は、ＲＮＡ捕捉が、上記アッセイの最終工程において溶液中に溶離したＰＮＡに比例し、上記アッセイが、手元の適用に依存して、異なるサンプルタイプに適用され得ることを示す。これは、上記２工程方法が、ビオチン－ストレプトアビジンの有利な代替の富化方法であることを示す。
【0076】
ビオチン－ストレプトアビジンとの比較
捕捉アッセイを、上記２工程方法において、ビオチン化ＰＮＡプローブ 対 左巻きのＰＮＡプローブの性能を直接測定するために試験した。比較のために、上記「ＬＨ ＰＮＡ－ＲＨ ４５８Ｒ」プローブを、ＲＮＡ標的配列に対して同一の右巻きのＰＮＡを含むビオチン化ＲＨ ４５８Ｒプローブと比較した。Ｃｙ５標識した２８塩基の合成１８ｓ ＲＮＡを、ビオチン化プローブまたは「ＬＨ ＰＮＡ－ＲＨ ４５８Ｒ」プローブとともに最初にインキュベートして、１０分間、３７℃でハイブリダイズし、その後、３０μｇのストレプトアビジンまたは相補的な左巻きのＰＮＡで官能化した１μｍ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで、室温においてさらに１０分間捕捉した。上記捕捉アッセイを、溶液中に残された残留ＲＮＡの蛍光を使用して評価し、プレートリーダーで測定した。上記比較アッセイの結果を、図１４に示す。これは、標準的なビオチン－ストレプトアビジンアプローチと比較して、ＲＮＡの左巻きのＰＮＡ捕捉の非常に類似した性能を示す。上記結果は、類似の捕捉効率が、ＲＮＡ捕捉システムの両方のセットに関して達成されたことを示す。これは、上記２工程ＲＮＡ捕捉方法が、公知のビオチン－ストレプトアビジンシステムと標的富化において匹敵することを示す。
捕捉アッセイを、上記２工程方法において、ビオチン化ＰＮＡプローブ 対 左巻きのＰＮＡプローブの性能を直接測定するために試験した。比較のために、上記「ＬＨ ＰＮＡ－ＲＨ ４５８Ｒ」プローブを、ＲＮＡ標的配列に対して同一の右巻きのＰＮＡを含むビオチン化ＲＨ ４５８Ｒプローブと比較した。Ｃｙ５標識した２８塩基の合成１８ｓ ＲＮＡを、ビオチン化プローブまたは「ＬＨ ＰＮＡ－ＲＨ ４５８Ｒ」プローブとともに最初にインキュベートして、１０分間、３７℃でハイブリダイズし、その後、３０μｇのストレプトアビジンまたは相補的な左巻きのＰＮＡで官能化した１μｍ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで、室温においてさらに１０分間捕捉した。上記捕捉アッセイを、溶液中に残された残留ＲＮＡの蛍光を使用して評価し、プレートリーダーで測定した。上記比較アッセイの結果を、図１４に示す。これは、標準的なビオチン－ストレプトアビジンアプローチと比較して、ＲＮＡの左巻きのＰＮＡ捕捉の非常に類似した性能を示す。上記結果は、類似の捕捉効率が、ＲＮＡ捕捉システムの両方のセットに関して達成されたことを示す。これは、上記２工程ＲＮＡ捕捉方法が、公知のビオチン－ストレプトアビジンシステムと標的富化において匹敵することを示す。
【0077】
核酸を有するＤｙｎａｂｅａｄｓに対する左巻きのＰＮＡの特異性
左巻きのＰＮＡで官能化したＤｙｎａｂｅａｄｓを、相補的なＣｙ３標識した合成ＲＮＡおよび相補的なＦＡＭ標識した左巻きのＰＮＡの両方とともにインキュベートした。上記ＲＮＡの右巻きのキラリティーに起因して、左巻きのＰＮＡのみが、ＲＮＡが同じ配列を有するにもかかわらず、その相補体に結合するはずである。上記ＰＮＡおよびＲＮＡを、除去する前に上記ビーズとともに１０分間、５７℃で一緒にインキュベートし、溶液中に残っている蛍光を、捕捉の効率に関して測定した。この実験を、同じ相補的なＦＡＭ標識したＰＮＡおよびランダムの非相補的なＣｙ３標識したＲＮＡで反復した。捕捉実験の両方のセットを、室温でのビーズの除去とともに反復した。その実験の結果を図１５に示す。ここではビーズを、室温（約２２℃）または５７℃で上記溶液から除去した。
左巻きのＰＮＡで官能化したＤｙｎａｂｅａｄｓを、相補的なＣｙ３標識した合成ＲＮＡおよび相補的なＦＡＭ標識した左巻きのＰＮＡの両方とともにインキュベートした。上記ＲＮＡの右巻きのキラリティーに起因して、左巻きのＰＮＡのみが、ＲＮＡが同じ配列を有するにもかかわらず、その相補体に結合するはずである。上記ＰＮＡおよびＲＮＡを、除去する前に上記ビーズとともに１０分間、５７℃で一緒にインキュベートし、溶液中に残っている蛍光を、捕捉の効率に関して測定した。この実験を、同じ相補的なＦＡＭ標識したＰＮＡおよびランダムの非相補的なＣｙ３標識したＲＮＡで反復した。捕捉実験の両方のセットを、室温でのビーズの除去とともに反復した。その実験の結果を図１５に示す。ここではビーズを、室温（約２２℃）または５７℃で上記溶液から除去した。
【0078】
図１５は、左巻きのおよび右巻きのＰＮＡの捕捉データを示す。特に、図１５は、ビーズ上での相補的な左巻きのＰＮＡでの左巻きのＰＮＡの特異的捕捉を示し、そしてＲＮＡの天然の右巻きのキラリティーに起因して、相補的ＲＮＡの捕捉がほとんどないことを示す。より少ない非特異的ＲＮＡ捕捉が、ＲＮＡ配列がランダム配列である場合に、上記ＰＮＡ配列と比較して観察された。ビーズを５７℃で除去すると、上記ビーズへの同一塩基のＲＮＡ結合が防止される。
【0079】
上記実験から、左巻きのＰＮＡ Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、溶液中の上記ＰＮＡしか特異的に捕捉せず、右巻きのＲＮＡをほとんど全く捕捉しないことが観察され得る。これは、左巻きのＰＮＡシステムの非生物的性質を示す。上記ビーズが室温で除去される場合に、ＲＮＡが左巻きのＰＮＡ配列の正確な適合を有する最悪の場合のシナリオでは、少量の捕捉は存在する。熱を使用すると、図１５に示されるように、非特異的結合は排除され、左巻きのＰＮＡは、捕捉においてごくわずかな減少はあるが、その標的配列を捕捉し得る。上記ＲＮＡが正確な適合でない場合には、それは、室温にあってすら、左巻きのＰＮＡによって捕捉されない。これは、上記システムの非生物的性質を示す。
【0080】
さらなる実施例
全ヒトＲＮＡサンプルを、電気泳動を介して１％ アガロースゲルに対して二連で泳動した。ここで１８ｓリボソームＲＮＡを、図１６に示されるように、異なって官能化したＤｙｎａｂｅａｄｓで枯渇させた。サンプル１は、ＰＢＳＴ中の全ヒトＲＮＡ標準であった。２は、１５０μｇ ４５８Ｒ ＲＨビーズとともにインキュベートしたＲＮＡであった。３は、２１０μｇ ４５８Ｒ ＲＨビーズとともにインキュベートしたＲＮＡであった。４は、先ず「ＬＨ ＰＮＡ－４５８Ｒ ＲＨ」プローブと、続いて１５０μｇのＬＨ ＰＮＡ相補体ビーズとともにインキュベートしたＲＮＡであった。５は、１５０μｇのストレプトアビジンビーズとともにインキュベートしたＲＮＡを有するコントロールであった。６は、先ず、２０「ビオチン化４５８Ｒ ＲＨプローブ」と、続いて１５０μｇのストレプトアビジンビーズとともにインキュベートしたＲＮＡであった。
全ヒトＲＮＡサンプルを、電気泳動を介して１％ アガロースゲルに対して二連で泳動した。ここで１８ｓリボソームＲＮＡを、図１６に示されるように、異なって官能化したＤｙｎａｂｅａｄｓで枯渇させた。サンプル１は、ＰＢＳＴ中の全ヒトＲＮＡ標準であった。２は、１５０μｇ ４５８Ｒ ＲＨビーズとともにインキュベートしたＲＮＡであった。３は、２１０μｇ ４５８Ｒ ＲＨビーズとともにインキュベートしたＲＮＡであった。４は、先ず「ＬＨ ＰＮＡ－４５８Ｒ ＲＨ」プローブと、続いて１５０μｇのＬＨ ＰＮＡ相補体ビーズとともにインキュベートしたＲＮＡであった。５は、１５０μｇのストレプトアビジンビーズとともにインキュベートしたＲＮＡを有するコントロールであった。６は、先ず、２０「ビオチン化４５８Ｒ ＲＨプローブ」と、続いて１５０μｇのストレプトアビジンビーズとともにインキュベートしたＲＮＡであった。
【0081】
全てのサンプルを、０．７５μｇの全ヒトＲＮＡとともに１０分間、６８℃において、ＰＢＳＴ中のビーズ（レーン２および３）またはＰＮＡプローブ（レーン４および６）のいずれかとインキュベートし、３７℃に冷却した。これに続いて、１０分間、４７℃で、ビーズとともにインキュベートした（レーン４、５および６）。Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して、ゲルを分析したところ、グレーの値の線プロフィールは、垂直方向においてゲルの各レーンについて取得された。最初の各レーンを、２８ｓ ｒＲＮＡバンドの曲線下面積を使用することによってレーンにおけるＲＮＡの濃度に対して正規化した。次いで、上記１８ｓ ｒＲＮＡバンドの曲線下面積を測定し、レーン１におけるＲＮＡ標準と比較した。
【0082】
レーン２は、１８ｓバンドにおいておよそ２５％の低減を有し、さらにより大きな低減が、レーン３において３５％で観察された。最も対照的な差異は、レーン４においてＬＨ ＰＮＡシステムで観察された。ここでは溶液から７０％が除去された。レーン５を、ストレプトアビジンビーズに関するコントロールとして使用して、非特異的に結合するＲＮＡが存在するか否かを評価した（そのうちおよそ２０％がそうであった）、レーン６は、ビオチン化４５８Ｒ ＲＨプローブで使用し、ここでＲＮＡのうちの４０％が溶液から除去された。
【0083】
データは、上記ＬＨ ＰＮＡ２工程システムが、１８ｓ ｒＲＮＡを全ヒトＲＮＡ単離物から除去するために、ビオチン－ストレプトアビジン２工程システムより良好に機能することが示された。それはまた、４５８Ｒ ＲＨ ＰＮＡで直接官能化したＤｙｎａｂｅａｄｓよりすぐれており、ここで上記２工程は、より大きな、より構造的なＲＮＡ標的に結合し、それらを溶液から成功裡に動かすために必要であるようである。ゲルはまた、上記ビーズ上のＰＮＡプローブが、それらの１８ｓ標的に対して特異的であることを示した。なぜなら２８ｓ ｒＲＮＡバンドは、全てのレーンにおいて概して変化しないままであり、溶液から同時に除去されなかったからである。
【0084】
利点
アビジンは、生物学的タンパク質でありかつ生物学的サンプル中に天然に存在することから、本発明は、ＲＮＡ標的を富化または枯渇するにあたって使用するためのアビジンに対する非生物的代替物を提供する。この代替物は、内因性ビオチンまたは食事性ビオチンによって引き起こされる、ビオチン－アビジン試験システムを使用する場合に得られる偽陽性結果の低減に寄与するために使用され得る。ＤＮＡ合成において提供されるビオチンタグに対する代替物としては、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、コレステロールおよびジニトロフェニル（ＤＮＰ）が挙げられる。これらは、抗原－抗体ベースの検出の代替物である。他の適用において、タンパク質ベースの結合システムが使用され得る（例えば、マルトース結合タンパク質システムでのマルトースタグ、キチン結合タンパク質でのキチンタグ）。大部分の代替では、生物学的実行可能性を確実にするために、冷蔵庫または冷凍庫の中での的確な貯蔵を必要とする標識または検出プロセスにおいて要求される生物学的実体が存在する。このことは、左巻きのＰＮＡシステムでは必要とされない。なぜならＰＮＡは室温で数年間貯蔵され得ることが示されたからである。
アビジンは、生物学的タンパク質でありかつ生物学的サンプル中に天然に存在することから、本発明は、ＲＮＡ標的を富化または枯渇するにあたって使用するためのアビジンに対する非生物的代替物を提供する。この代替物は、内因性ビオチンまたは食事性ビオチンによって引き起こされる、ビオチン－アビジン試験システムを使用する場合に得られる偽陽性結果の低減に寄与するために使用され得る。ＤＮＡ合成において提供されるビオチンタグに対する代替物としては、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、コレステロールおよびジニトロフェニル（ＤＮＰ）が挙げられる。これらは、抗原－抗体ベースの検出の代替物である。他の適用において、タンパク質ベースの結合システムが使用され得る（例えば、マルトース結合タンパク質システムでのマルトースタグ、キチン結合タンパク質でのキチンタグ）。大部分の代替では、生物学的実行可能性を確実にするために、冷蔵庫または冷凍庫の中での的確な貯蔵を必要とする標識または検出プロセスにおいて要求される生物学的実体が存在する。このことは、左巻きのＰＮＡシステムでは必要とされない。なぜならＰＮＡは室温で数年間貯蔵され得ることが示されたからである。
【0085】
入手可能な、特に市販されている抗原－抗体／タンパク質システムのこれらのタイプは、数も制限されている。３社のＤＮＡ合成会社が、ビオチンに対する３つの代替物を提供したが、ＤＩＧまたはコレステロールタグの選択肢が、ＲＮＡオリゴ標的に関して２社から入手可能であるに過ぎない。このことは、このようなシステムを使用して達成され得る多重化の量を制限する。ＬＨ ＰＮＡシステムを、例えば、１２のモノマーを含むLＨ ＰＮＡとともに使用すると、そのユーザーが、目的の異なる標的のために、ビーズまたは表面上に対応する相補的ＰＮＡとともに潜在的に使用され得る１６，７７７，２１６の異なる左巻きのＰＮＡを設計することが可能である。これらのビーズは、多重化適用に適切である場合、組成物材料および／または官能化に関して異なる物理的特性のものであり得る。ＤＮＡおよびＲＮＡが、キラリティーが原因でこれらのＬＨ ＰＮＡに結合しないことから、ＬＨ ＰＮＡシステムとともに使用される配列は、上記ビーズが、ストリンジェンシーのために上記アッセイにおける温度で除去される限りにおいて、標的核酸がＬＨ ＰＮＡと同じ配列であるとしても干渉しない（図１５を参照のこと）。
【0086】
ＬＨ ＰＮＡプローブシステムを使用することの１つの他の利点は、上記ＬＨ ＰＮＡおよび相補体が、特定の温度範囲において融解温度を有するように設計され得ることである。プログラム可能な融解温度を経る標的放出は、目的のそれらの標的に潜在的に損傷を与えることなく、上記ビーズまたは表面からそれらの標的を集めることを可能にする。これは、ビオチン化核酸を除去するために、６５℃で５分間または９０℃で２分間において９５％ ホルムアミド中での煮沸工程を要求するビオチン－ストレプトアビジン捕捉システムとは異なり、上記ビーズから標的を解離するために非常に過酷な条件の必要性を除去する。この工程は、ビオチン分子を放出するために磁性ビーズに結合体化したストレプトアビジンを変性させ、ストレプトアビジンの変性は、上記ビーズが再使用できないことを意味する。左巻きのＰＮＡでコーティングした磁性ビーズは、両方の適用において使用されるプローブがその同じ左巻きのＰＮＡ配列を有し、以前のプローブが、その新たな適用で使用する前に、十分に熱融解されて上記ビーズから離れていれば、他の適用のために再使用できた。
【0087】
いくつかの例では、上記ＰＮＡ対のうちの一方が左巻きのＰＮＡであり、一方が非キラルＰＮＡである場合がまた、想定される。上記システムは、このようなシナリオにおいてなお実行可能であり得るが、アキラルＰＮＡの賢明な設計は、アキラルＰＮＡがハイブリダイズし得、また上記ＰＮＡの相補的な対に干渉し得る天然に存在する右巻きのオリゴヌクレオチドとの相互作用を回避するために考慮されなければならない。
【0088】
１８ｓ ＲＮＡの捕捉は、ビーズ上で直接官能化されたアキラルまたは右巻きのＰＮＡと比較して、左巻きのＰＮＡ捕捉システムを使用する場合により効率的であることが認識される。１８ｓ ＲＮＡの直接検出は、生物学的サンプル（例えば、血液および唾液）から３７℃において等温で実現可能である。上記左巻きのＰＮＡの富化システムは、ビオチン－ストレプトアビジンベースの抽出システムに対する非生物的代替物であり、将来的にＲＮＡおよびＤＮＡ適用における使用に関して大きな潜在的能力を示す。さらに、左巻きのＰＮＡの配列は、容易に変化され得ることから、上記システムは、対になったビーズ（これは、異なる物理的特性を潜在的に有し得る）によって捕捉される各新たな核酸標的で「プログラム可能」である。これは、これらビーズが、捕捉アレイ、磁性分離、またはさらにフローサイトメトリーのように十分に確立された方法において、選択、標的の枯渇、分析物、抗原、核酸もしくは抗体の検出もしくは多重化のような多くの適用において汎用的ツールとして使用され得ることを示唆する。これは、左巻きのＰＮＡシステムを、非常に多目的な、適応性がありかつ魅力的なシステムにする。
【0089】
ＲＮＡ標的化および増幅は、酵素による増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を介して旧来から行われている。このような増幅に必要とされる試薬（例えば、酵素）の的確な貯蔵および取り扱いは、生物学的な完全性、および従って、増幅プロセスの成功を確実にするために非常に重要である。これらの温度感受性かつ貯蔵寿命が制限された酵素を、ＲＮＡ富化の非生物的代替物で置き換えることが示される。直接比較から、左巻きのＰＮＡの２工程方法が、ビーズ上で直接官能化されたアキラルまたは右巻きのＰＮＡよりほぼ４倍多くの１８ｓ ＲＮＡを全ヒトＲＮＡ単離物から捕捉することを示した。上記方法は、３７℃で等温的に機能することが示され、１８ｓ ＲＮＡの捕捉を妨げることなく、全血または唾液の１０％ 生物学的マトリクス中で使用され得る。上記ＬＨシステムはまた、可視化されるように、アガロースゲル上で、ＲＨ ４５８Ｒ官能化ビーズまたはビオチン－ストレプトアビジン２工程システムより成功裡に、１８ｓ ｒＲＮＡを全ヒトＲＮＡサンプルから除去することが可能であった。この方法は、ビオチン－ストレプトアビジンベースの標的富化に対する有望な非生物的代替物を提示する。
【0090】
本明細書で記載される方法は、以前のアプローチに伴う欠点のうちのいくつかまたは全てを回避し、安定して強いが、可逆的な親和性、多数の標的、特異的なビーズまたは基材の一部に結合するプログラム可能性、および温度条件の一定の範囲において安定でありかつ内因性核酸とのクロストークがほとんどない～全くないものを提供する。従って、本発明者らは、本明細書で記載される方法が、当該分野において変革をもたらす可能性があると考える。
【0091】
代替の実施例
本発明は、記載される実施形態に限定されず、構成および詳細において変動し得る。
本発明は、記載される実施形態に限定されず、構成および詳細において変動し得る。
【0092】
左巻きのＰＮＡおよびリンカーを含む上記第１のまたは第２のプローブ上の標的化部分は、例えば、以下のうちの１またはこれより多くであり得る：ペプチド核酸（アキラルまたはキラルＰＮＡ）；デオキシリボ核酸；リボ核酸；グリコール核酸；トレオース核酸；ロックド核酸；ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド；またはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー；タンパク質；ペプチド；非天然アミノ酸を有するペプチドもしくはタンパク質；酵素；抗体；単一ドメイン抗体（ナノボディ（nanobody））；アプタマー；薬物分子；低分子；化合物；細胞、あるいは上記のうちの１もしくはこれより多くの組み合わせ。
【0093】
上記検出部分は、例えば、以下のうちの１またはこれより多くであり得る：蛍光標識；発光標識；発色団標識；化学発光標識；放射性標識、酵素標識；または視覚的標識（例えば、金属標識（例えば、金））、マイクロスフェア（磁性、蛍光性、シリカなど）；ナノ粒子（カーボンナノチューブ、量子ドットなど）；ビオチン標識；アビジン標識；ジゴキシゲニン、コレステロール、もしくはジニトロフェニル標識；西洋ワサビペルオキシダーゼ標識；あるいは上記のうちの１もしくはこれより多くの組み合わせ。
【0094】
種々の例では、上記リンカーは、長さが１～１２０個の原子のものであり得；元素：Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、およびＳｉのうちの１個または数個を含み得；以下の結合：単結合／二重結合／三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合、およびチオエステル結合のうちの１つのみまたは組み合わせを含む鎖中にあり得る。
【0095】
上記左巻きのＰＮＡ配列は、上記配列が、これらが、表面上の配列特異的相補的ＰＮＡとのみ相互作用し、互いにまたは他の核酸配列と相互作用しないことを確実にするために、長さおよび／またはモノマー配列が変化され得るという点で、多重化を可能にするためにプログラム可能である。
【図1a】
【図1b】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【国際調査報告】