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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-19
(54)【発明の名称】高い限界デキストリナーゼ活性を有する大麦植物
(51)【国際特許分類】
A01H 6/46 20180101AFI20230412BHJP
C12C 7/00 20060101ALI20230412BHJP
C12C 1/00 20060101ALI20230412BHJP
C12C 11/00 20060101ALI20230412BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20230412BHJP
【ＦＩ】
A01H6/46 ZNA
C12C7/00
C12C1/00
C12C11/00 A
C12N15/29
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022552519
(86)(22)【出願日】2021-03-01
(85)【翻訳文提出日】2022-10-03
(86)【国際出願番号】 EP2021055053
(87)【国際公開番号】W WO2021175786
(87)【国際公開日】2021-09-10
(31)【優先権主張番号】20160355.2
(32)【優先日】2020-03-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520229688
【氏名又は名称】カールスバーグ アグシャセルスガーブ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】オルセン，オーレ
(72)【発明者】
【氏名】ロック，フィン
(72)【発明者】
【氏名】クヌーセン，セーレン
(72)【発明者】
【氏名】マリー，ルチア
(72)【発明者】
【氏名】ストリーベック，アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】ペダス，パイ，ロサガー
(72)【発明者】
【氏名】クエスタ－セイジョ，ホセ，アントニオ
(72)【発明者】
【氏名】トムセン，ハンネ
(72)【発明者】
【氏名】ブラウン，カタルジナ，バーチ
【テーマコード（参考）】
2B030
4B128
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030AD09
2B030CA08
4B128CP01
4B128CP21
4B128CP37
(57)【要約】
本発明は、高い限界デキストリナーゼ活性を有する大麦植物、またはその一部を提供する。特に、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物が、提供される。さらに、前記大麦植物、またはその一部から調製される植物生成物が、それを製造する方法と共に記載される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
大麦植物、またはその一部であって、前記大麦植物が、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有し、前記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子が、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、前記変異が、以下の変異の１つである、大麦植物、またはその一部：ａ．変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドの１つまたは複数のループ領域中でプロリンから異なるアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、前記ループ領域が、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異；または
ｂ．変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中で負に帯電しているアミノ酸から負に帯電していないアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、前記アルファヘリックス領域が、配列番号１の位置４５～５５に対応するアミノ酸および位置６３～７６に対応するアミノ酸および位置７９～９０に対応するアミノ酸および位置１１２～１２３に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異。
【請求項2】
前記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドが、指定位置における変異は別にして成熟野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドまたはその天然バリアントと同一である、請求項１に記載の大麦植物またはその一部。
【請求項3】
前記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドが、配列番号３の位置２５～１４２または配列番号３の位置２５～１４７のアミノ酸配列を含むまたはそれらからなるまたは配列番号４の位置２５～１４２または配列番号４の位置２５～１４７のアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載の大麦植物またはその一部。
【請求項4】
前記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドが、配列番号６の位置２５～１４２または配列番号６の位置２５～１４７のアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、請求項１～３のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
【請求項5】
前記大麦植物からの穀粒または発芽穀粒または麦芽が、同じ条件下で栽培されかつ調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の穀粒で測定される遊離ＨｖＬＤ活性と比べて少なくとも２０％高い遊離ＨｖＬＤ活性を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
【請求項6】
前記大麦植物が、前記ＨｖＬＤＩ遺伝子中に下記からなる群より選択される１つまたは複数の変異を有する、大麦植物またはその一部：ｉ．前記ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６６に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異；および
ｉｉ．前記ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６７に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異；および
ｉｉｉ．前記ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６８に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異；および
ｉｖ．前記ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９９０に対応する位置でのＧからＡへの変異。
【請求項7】
前記大麦植物の穀粒が、少なくとも５０グラムなど、少なくとも５５グラムなどの、少なくとも４５グラムの千粒重を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項8】
前記大麦植物の穀粒が、少なくとも５５％など、少なくとも６０％などの、少なくとも５０％のデンプン含量を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項9】
前記大麦植物が、１つまたは複数の追加の遺伝子中に、下記からなる群より選択される変異をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の大麦植物：ａ．機能的ＬＯＸ－１の完全喪失をもたらすＬＯＸ－１コード遺伝子中の変異；
ｂ．機能的ＬＯＸ－２の完全喪失をもたらすＬＯＸ－２コード遺伝子中の変異；
ｃ．機能的ＭＭＴの完全喪失をもたらすＭＭＴコード遺伝子中の変異；
ｄ．ＣｓｌＦ６コード遺伝子中の変異であって、前記変異遺伝子が、低減されたＣｓｌＦ６活性を有する変異体ＣｓｌＦ６タンパク質をコードする、変異；
ｅ．ＨＲＴ機能の喪失をもたらすＨＲＴ遺伝子をコードする遺伝子中の変異；
ｆ．ＨＢＬ機能の喪失をもたらすＨＢＬ１２遺伝子をコードする遺伝子中の変異；
ｇ．ＷＲＫＹ３８機能の喪失をもたらすＷＲＫＹ３８遺伝子をコードする遺伝子中の変異；
ｈ．ａｎｔ変異、例えばＨｖｍｙｂ１０遺伝子中の変異。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部を含む植物生成物。
【請求項11】
前記植物生成物が、下記からなる群より選択される、請求項１０に記載の植物生成物：ａ．前記大麦植物の穀粒から調製された麦芽；
ｂ．前記大麦植物の穀粒からおよび／または前記大麦植物の処理穀粒を含む麦芽から調製された、水性抽出物、例えば麦汁；および
ｃ．前記大麦植物またはその一部から調製された、飲料、例えばビール。
【請求項12】
麦芽の調製方法であって、下記ステップを含む、方法：ａ．請求項１～９のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
ｂ．所定の条件下で前記穀粒を浸麦するおよび発芽させるステップ；
ｃ．任意選択で、前記発芽穀粒を乾燥するステップ。
【請求項13】
前記浸麦することおよび発芽させることが、下記のステップ：ａ．通気下で５～１０時間にわたり水溶液中で請求項１～９のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒をインキュベートするステップ；
ｂ．好ましくは通気下で、前記水溶液を排水するおよび８～１６時間にわたりエアレストに前記穀粒を供するステップ；
ｃ．通気下で２～１０時間にわたり水溶液中で前記穀粒をインキュベートするステップ；および
ｄ．好ましくは２０～２８℃の範囲で温度を維持しながら通気下で、前記水溶液を排水するおよび８～２０時間にわたり第２のエアレストに前記穀粒を供するステップ；
を含み、前記穀粒の含水量が、ステップａ．の後の任意の時点で少なくとも２０％である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記浸麦および発芽ステップが、４８時間～７２時間の範囲にわたり実施されかつ請求項１２に記載のステップｃが、省略される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項15】
水性抽出物を調製する方法であって、下記のステップを含む、方法：ａ．請求項１～９のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒および／または請求項１２～１４のいずれか１項により製造される麦芽を用意するステップ；
ｂ．前記穀粒および／または前記麦芽の水性抽出物、例えば麦汁を調製するステップ。
【請求項16】
前記水性抽出物が、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の水性抽出物に比べて少なくとも１０％多いグルコース、フルクトースおよび／またはマルトトリオースを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
飲料を製造する方法であって、以下のステップを含む、方法：ａ．請求項１～９のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒および／または請求項１２～１４のいずれか１項により製造される麦芽および／または請求項１５または１６に記載の方法により製造される水性抽出物を用意するステップ；
ｂ．飲料へと前記水性抽出物を処理するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、高い遊離限界デキストリナーゼ活性を有する大麦植物を提供する分野に関する。特に、本発明は、高い遊離限界デキストリナーゼ活性を有する穀粒を有する大麦植物に関する。このような植物の穀粒は、増大した量の発酵性糖を含む大麦系液体抽出物、例えば、麦汁の製造のために好都合である。本発明はさらに、大麦系飲料、例えば、ビール、ウイスキー、ウォッカ、マルチナの製造方法、ならびに本発明の大麦植物から調製される生成物に関する。
【背景技術】
【0002】
発芽は、それにより植物が種子から成長する過程の初期部分である。そうするために、穀粒は、極めて多くの酵素の制御を維持する必要がある。いくつかの酵素は、胚乳中のデンプンのマルトースおよびグルコースへの分解に関与し、これらは次に、植物胚芽のためのエネルギー源として機能する。同じ過程は、発芽穀粒または麦芽から抽出され、かつ酵母により醸造中にアルコールを生成するために使用され得る、発酵性糖を生成する。
【0003】
デンプンは、２つの形式のグルコース鎖：主なアミロースおよび分岐アミロペクチンから作られる炭水化物である。アミロースおよびアミロペクチンの直鎖部分は、別の種類のアミラーゼにより発酵性糖に分解され得る。しかし、アミラーゼは通常、その分岐点近傍ではアミロペクチンを分解できない。従って、アミラーゼ活性は、デンプンから発酵性糖の十分な放出を達成するには不十分である。
【0004】
グリコシド加水分解酵素の限界デキストリナーゼ（ＬＤ）は、デンプンの分岐点の加水分解を触媒し、直鎖デンプンフラグメントを生成し、それによりアミラーゼのための基質の利用能を高める。ＬＤは具体的には、例えばアミロペクチンまたは分岐デキストリン中のα－１，６結合の加水分解を触媒する。この酵素の加水分解作用は、直鎖α－１，４－結合グルコース鎖の形成をもたらし、これは広範囲にわたり、α－およびβ－アミラーゼの複合作用によりグルコースおよびマルトースに解重合できる。
【0005】
ＬＤの活性は、その阻害剤、限界デキストリナーゼ阻害剤（ＬＤＩ）により、少なくとも部分的に調節されると考えられている。ＬＤＩは、ＬＤを結合し不活化すると考えられる。
【0006】
低レベルのＬＤ活性は通常、デンプンの少ない分解に繋がり、これは、登熟中には好ましく、穀粒中への十分なレベルのデンプンの蓄積を可能にする。醸造過程では、発芽大麦粒抽出物または麦芽は、酵母発酵の基質として使用され、高レベルの発酵性糖を含む抽出物が、通常望ましい。ＬＤの作用がないと、分岐デキストリンおよびアミロペクチンは、酵母により効率的に発酵させることができない。
【0007】
文献では、大麦植物中のアンチセンスによるＬＤＩの発現低下は、大麦粒の健康に対し大きな影響を有し、この影響は、より低い粒重、大麦粒当りのデンプン粒の数の低減および、高められたアミロース／アミロペクチン比率、アミロペクチンの改変された分岐鎖長（９～１５残基の鎖はより多いが、より少ない３０～６０残基の長鎖）により示されるアミロペクチン構成に対する変化および小さいＢ型デンプン粒のレベルの低減を含む、変えられたデンプン合成により示される（Ｙ．Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．２００４、を参照）。
【0008】
ＬＤとＬＤＩの相互作用は、大麦ＬＤ－ＬＤＩ複合体の結晶構造を用いて調査された。ＬＤＩとＬＤ変異体のインビトロ結合調査が実施され、ＬＤＩ中の４つの異なる位置が変異され、ＫＤにおける中程度～大きな増大を示した（Ｍ Ｍｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５、を参照）が、これらの変異体のいずれも、インビボで試験されず、従って、それは、変異が穀粒の健康に効果を与えるかどうか、またはインビトロの結果が穀粒の発酵性糖レベルに関しインビボでの効果に変換されるかどうかを評価できない。
【発明の概要】
【0009】
本発明の目的は、麦芽製造に供される場合、特に発芽中に、高いＬＤ活性を有する穀粒を含む大麦植物を提供することであり、上記大麦植物は同時に、健康で、例えば、野生型大麦植物と同等の収率と粒重を有する。このような大麦植物は、ビールなどの大麦／麦芽系飲料の生産に極めて有用であろう。
【0010】
高いＬＤ活性を有する穀粒を含む大麦植物は、ビール、ウイスキー、ウォッカ、またはマルチナなどの大麦／麦芽系飲料の生産に有用である。１つの利点は、穀粒から調製される麦汁および／または高いＬＤ活性を有する大麦植物からの麦芽などの水性抽出物が、高い含量の発酵性糖を有することである。従って、本発明の穀粒および／または麦芽を使用することにより、マッシング中の外来性の限界デキストリナーゼまたはプルラナーゼの添加の必要性は、低減されるか、あるいは完全に無くされ得る。さらに、高含量の発酵性糖を含む水性抽出物の発酵は、醸造中に有益である。理由は、それが、使われる穀粒量当たり生産されるビールの量を増大させ、粒重当たりのＡＢＶ％（アルコール体積％）／ヘクトリットルを高めるためである。さらに、増大した遊離Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギの学名）限界デキストリナーゼ（ＨｖＬＤ）活性を有する本発明の大麦植物からの穀粒および／または麦芽は、製麦過程に有用であり、発芽時間は、例えば、ＷＯ２０１８／００１８８２に記載のように短縮される。
【0011】
意外なことに、本発明は、ＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物を提供し、植物は、健康であり、野生型大麦植物と同等の穀粒収率、穀粒サイズおよび穀粒アミロペクチン分岐鎖長を有するが、同時に高いＬＤ活性も有する。このような大麦植物は、高含量の発酵性糖を含む抽出物を調製するための原材料として有用である。
【0012】
特に、本発明は、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ限界デキストリナーゼ阻害剤（ＨｖＬＤＩ）遺伝子中の特定の変異が変異ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、これは、インビトロでＨｖＬＤへの低減された結合を有することを示す。ＨｖＬＤを結合する能力の低減は、遊離ＬＤを増大し、それにより、より高いインビボＬＤ活性をもたらし、これが次に、ＨｖＬＤＩポリペプチド中に本発明の変異を含む大麦植物からの穀粒を用いて調製される水性抽出物中のより高含量の発酵性糖を生じる。重要なことに、同時に、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に本発明の変異を有する大麦植物で、穀粒サイズ、穀粒アミロペクチン分岐鎖長および穀粒収率の差異は観察されなかった。
【0013】
従って、本発明は、大麦植物またはその一部を提供し、上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有し、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は 変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、変異は、次の変異の１つである：
ａ．ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中でプロリンから異なるアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、ループ領域が、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異；または
ｂ．野生型ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中で負に帯電しているアミノ酸から負に帯電していないアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、アルファヘリックス領域が、配列番号１の位置４５～５５に対応するアミノ酸および位置６３～７６に対応するアミノ酸および位置７９～９０に対応するアミノ酸および位置１１２～１２３に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異。
ａ．ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中でプロリンから異なるアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、ループ領域が、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異；または
ｂ．野生型ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中で負に帯電しているアミノ酸から負に帯電していないアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、アルファヘリックス領域が、配列番号１の位置４５～５５に対応するアミノ酸および位置６３～７６に対応するアミノ酸および位置７９～９０に対応するアミノ酸および位置１１２～１２３に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異。
【0014】
本発明はさらに、本発明の大麦植物から調製された、穀粒、麦芽、麦芽汁または飲料などの植物生成物を提供する。
さらに、麦芽の調製方法が開示され、上記方法は、下記ステップを含み得る：
ａ．本発明の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
ｂ．所定の条件下で上記穀粒を浸麦し、発芽させるステップ；
ｃ．任意選択で、上記発芽穀粒を乾燥するステップ。
また、水性抽出物の製造方法も開示され、上記方法は、下記ステップを含み得る：
ａ．本発明の大麦植物の穀粒および／またはこのような大麦植物から調製された麦芽を用意するステップ；
ｂ．上記穀粒および／または上記麦芽の水性抽出物、例えば、麦汁を調製するステップ。
加えて、飲料の製造方法も開示され、上記方法は、下記ステップを含み得る：
ａ．本発明の大麦植物の穀粒および／またはこのような大麦植物から調製された麦芽および／またはこのような大麦植物および／または麦芽から調製された水性抽出物を用意するステップ；
ｂ．例えば、他の飲料成分と発酵または混合することにより、上記水性抽出物を飲料に処理するステップ。
さらに、本発明による麦芽の調製方法が開示され、上記方法は、下記ステップを含む：
ａ．大麦粒を用意するステップ；および
ｂ．上記大麦粒をランダムに変異誘発するステップ；
ｃ．下記変異の１つを有する変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする変異ＨｖＬＤＩ遺伝子を有する大麦粒またはその一部を選択するステップ；
ｉ．ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中でプロリンから異なるアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、ループ領域が、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異；または
ｉｉ．野生型ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中で負に帯電しているアミノ酸から負に帯電していないアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、アルファヘリックス領域が、配列番号１の位置４５～５５に対応するアミノ酸および位置６３～７６に対応するアミノ酸および位置７９～９０に対応するアミノ酸および位置１１２～１２３に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異。
さらに、麦芽の調製方法が開示され、上記方法は、下記ステップを含み得る：
ａ．本発明の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
ｂ．所定の条件下で上記穀粒を浸麦し、発芽させるステップ；
ｃ．任意選択で、上記発芽穀粒を乾燥するステップ。
また、水性抽出物の製造方法も開示され、上記方法は、下記ステップを含み得る：
ａ．本発明の大麦植物の穀粒および／またはこのような大麦植物から調製された麦芽を用意するステップ；
ｂ．上記穀粒および／または上記麦芽の水性抽出物、例えば、麦汁を調製するステップ。
加えて、飲料の製造方法も開示され、上記方法は、下記ステップを含み得る：
ａ．本発明の大麦植物の穀粒および／またはこのような大麦植物から調製された麦芽および／またはこのような大麦植物および／または麦芽から調製された水性抽出物を用意するステップ；
ｂ．例えば、他の飲料成分と発酵または混合することにより、上記水性抽出物を飲料に処理するステップ。
さらに、本発明による麦芽の調製方法が開示され、上記方法は、下記ステップを含む：
ａ．大麦粒を用意するステップ；および
ｂ．上記大麦粒をランダムに変異誘発するステップ；
ｃ．下記変異の１つを有する変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする変異ＨｖＬＤＩ遺伝子を有する大麦粒またはその一部を選択するステップ；
ｉ．ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中でプロリンから異なるアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、ループ領域が、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異；または
ｉｉ．野生型ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中で負に帯電しているアミノ酸から負に帯電していないアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、アルファヘリックス領域が、配列番号１の位置４５～５５に対応するアミノ酸および位置６３～７６に対応するアミノ酸および位置７９～９０に対応するアミノ酸および位置１１２～１２３に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】インビトロアッセイで、野生型ＨｖＬＤ活性を阻害する野生型（ｗｔ）ＨｖＬＤＩまたは変異体ＨｖＬＤＩの能力を示す。Ａ）野生型ＬＤＩ（変異なし）、Ｂ）ＨｖＬＤＩ変異体（Ｐ６０Ｌ）、Ｃ）ＨｖＬＤＩ変異体（Ｐ６０Ｓ）、Ｄ）ＨｖＬＤＩ変異体（Ｖ６６Ｍ）およびＥ）ＨｖＬＤＩ変異体（Ｅ６８Ｋ）。Ｙ軸は、ＨｖＬＤの％活性を示す。Ｘ軸は、インビトロアッセイで使用した野生型または変異ＨｖＬＤＩの量（μＭ）を示す。組換え発現ＨｖＬＤを阻害する野生型ＨｖＬＤＩおよび変異体ＨｖＬＤＩの効力を、アッセイ中に放出された発色団の量により評価した。アッセイ中に放出された発色団の量を、完全活性ＨｖＬＤの放出量と比較し、保持活性を計算するために使用した。活性を、アッセイで使用されたＨｖＬＤＩの濃度に対しプロットし、データを、シグモイド型応答曲線に当てはめた。
【図2】変異体大麦植物ＨＥＮＺ－１６ａ（Ｐ６０Ｓ）およびＨＥＮＺ－１８（Ｖ６６Ｍ）ならびにそれらの対照Ｐａｕｓｔｉａｎ、および変異体大麦植物ＨＥＮＺ－３１（Ｅ６８Ｋ）ならびにその対照Ｐｌａｎｅｔから７２時間にわたり発芽させた穀粒中の加水分解酵素の活性を示す。穀粒は、実施例３に記載のプロトコルに従って発芽された。ＥＢＣ１９は、実験での追加の対照として含められた。Ａ）は、α－アミラーゼの総量を示す。Ｂ）は、β－アミラーゼの総量を示す。Ｃ）は、限界デキストリナーゼおよび遊離限界デキストリナーゼの総量、ならびに遊離限界デキストリナーゼと総限界デキストリナーゼの間の％による比率を示す。
【図3】変異体大麦植物ＨＥＮＺ－１６ａ（Ｐ６０Ｓ）およびその対照Ｐａｕｓｔｉａｎ、および変異体大麦植物ＨＥＮＺ－３１（Ｅ６８Ｋ）ならびにその対照Ｐｌａｎｅｔからフレックスモルト麦芽化穀粒中の加水分解酵素活性を示す。穀粒は、実施例５に記載の方法に従って麦芽化された。Ａ）は、α－アミラーゼの総量を示す。Ｂ）は、β－アミラーゼの総量を示す。Ｃ）は、限界デキストリナーゼおよび遊離限界デキストリナーゼの総量、ならびに遊離限界デキストリナーゼと総限界デキストリナーゼの間の％による比率を示す。
【図4】変異体大麦植物ＨＥＮＺ－１６ａ（Ｐ６０Ｓ）およびその対照ＰａｕｓｔｉａｎからＶＬＢ麦芽化穀粒中の加水分解酵素活性を示す。穀粒は、実施例６に従ってＶＬＢ麦芽化された。ピルスナー麦芽は、実験での追加の対照として含められた。Ａ）は、α－アミラーゼの総量を示す。Ｂ）は、β－アミラーゼの総量を示す。Ｃ）は、限界デキストリナーゼおよび遊離限界デキストリナーゼの総量、ならびに遊離限界デキストリナーゼと総限界デキストリナーゼの間の％による比率を示す。
【図5】フレックスモルト化穀粒での動力学的測定を示す。中実円および三角形は、ＨＥＮＺ－１６ａ（Ｐ６０Ｓ）中の、それぞれ、遊離限界デキストリナーゼおよび限界デキストリナーゼの総量を示す。中空円および三角形は、Ｐａｕｓｔｉａｎ中の、それぞれ、遊離限界デキストリナーゼおよび限界デキストリナーゼの総量を示す。
【図6】フレックスモルト化ＨＥＮＺ－１６ａ（Ｐ６０Ｓ）、ＰａｕｓｔｉａｎおよびＥＢＣ１９からの麦汁中の糖分析を示す。Ａ）は、総発酵性糖（ＴＦＳ）、すなわち、フルクトース、スクロース、グルコース、マルトースおよびマルトトリオースの量（ＰＰＭ）を示す。バーの上部の数字は、ＴＦＳの総量を示す。Ｂ）は、異なる麦汁中の個別の糖の量を示す。バーの上部の数字は、ＨＥＮＺ－１６ａ（Ｐ６０Ｓ）とＰａｕｓｔｉａｎとの間の％差異を示す。
【図7】ＶＬＢ麦芽化ＨＥＮＺ－１６ａ（Ｐ６０Ｓ）、ＰａｕｓｔｉａｎおよびＥＢＣ１９、ならびにピルスナー麦芽からの麦汁中の糖分析を示す。Ａ）は、総発酵性糖（ＴＦＳ）、すなわち、フルクトース、スクロース、グルコース、マルトースおよびマルトトリオースの量（ＰＰＭ）を示す。バーのすぐ上部の数字は、ＴＦＳの総量を示す。ＨＥＮＺ－１６ａ（Ｐ６０Ｓ）からのＶＬＢ麦芽化穀粒の麦汁は、ＰａｕｓｔｉａｎからのＶＬＢ麦芽化穀粒に比べて、７．２％多いＴＦＳを含む。Ｂ）は、ＶＬＢ麦芽化ＨＥＮＺ－１６ａ（Ｐ６０Ｓ）およびＰａｕｓｔｉａｎからの麦汁中の個別の糖の量を示す。バーの上部の数字は、ＨＥＮＺ－１６ａ（Ｐ６０Ｓ）とＰａｕｓｔｉａｎの間の％差異を示す。
【図8】Ａ）およびＣ）は、ＨＥＮＺ－１６ａ（Ｐ６０Ｓ）およびＨＥＮＺ－３１、ＰｌａｎｅｔおよびＰａｕｓｔｉａｎ大麦植物からの穀粒中の鎖長分布分析を示す。Ｂ）およびＤ）は、変異体大麦植物とその対照（デンマーク、２０１７）の間のピーク面積差異を示す。ＨｖＬＤＩ変異体大麦植物および対照植物は、シーズン２０１７にデンマークの隣接区画中で生育された。それらの対照と比べて、ＨｖＬＤＩ変異体大麦植物（ＨＥＮＺ－１６ａおよびＨＥＮＺ－３１）の間でＤＰの優位差は存在しないと結論できる。ＤＰ：重合の度合い。
【図9】Ａ）およびＣ）は、ＨＥＮＺ－１６ａおよびＨＥＮＺ－３１大麦植物からの穀粒中のアミロペクチンの鎖長分布分析を示す。Ｂ）およびＤ）は、変異体大麦植物とその対照（ニュージーランド２０１７～１８）の間のピーク面積差異を示す。ＨｖＬＤＩ変異体大麦植物および対照植物は、シーズン２０１７／２０１８にニュージーランドの隣接区画中で生育された。それらのそれぞれの対照と比べて、ＨｖＬＤＩ変異体大麦植物（ＨＥＮＺ－１６ａおよびＨＥＮＺ－３１）の間でＤＰの優位差は存在しないと結論できる。ＤＰ：重合の度合い。
【発明を実施するための形態】
【0016】
定義
本明細書で使用される場合、「ａ」は、それが使われる文脈に応じて、１つ（１種）または複数を意味し得る。
本明細書で使用される場合、「ａ」は、それが使われる文脈に応じて、１つ（１種）または複数を意味し得る。
【0017】
本明細書で使用される場合、用語「通気」は、所与の物質に酸素、例えば、純粋な酸素または空気を含むガスを供給することを指す。水溶液（例えば、水）の通気は好ましくは、上記ガスに水中を通過させることにより、例えば水溶液を含む容器の底部および／または下部にガスを導入することにより、実施される。通常、ガスは、水溶液を通って拡散し、水溶液の上端から水溶液を出て行く。エアレスト中の大麦粒の通気は、例えば、ガスを大麦粒のベッドを通して誘導するおよび／または上記ガス大麦粒のベッドの表面上を流すことにより、実施され得る。
【0018】
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、タンパク質を構成するアミノ酸を指す。好ましくは、タンパク質を構成するアミノ酸は、標準的遺伝子コードによりコードされる２０個のアミノ酸の１つである。ＩＵＰＡＣの１文字および３文字コードが、アミノ酸を命名するために使用される。
【0019】
数値に関連して本明細書で使用される場合、用語の「約」は、好ましくは±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％を意味する。
【0020】
用語「アミロース」は、α－Ｄ－グルコースのホモポリマーを指す。アミロースは、そのグルコース単位がほぼ例外なく、α－１，４－グリコシド結合により結合されるので、直鎖分子構造を有する。
【0021】
用語「アミロペクチン」は、α－Ｄ－グルコースのホモポリマーを指す。アミロペクチン分子は、α－１，６－グリコシド結合を高頻度に含む。これらは、本来ならα－１，４－結合グルコース鎖を生ずるはずの鎖中に分岐点を導入し、分子軸に沿って規則的な間隔で現れる並行鎖のクラスターを生じる。
【0022】
用語「エアレスト」は、穀粒が水（水溶液）中に浸漬された段階の後の発芽過程中の１段階を指す。エアレスト段階では、水が穀粒から排出され、穀粒は、静置される。好ましくは穀粒の水分は、この段階中で、２０％より高く、より好ましくは３０％より高く、さらにより好ましくは４０％より高く維持される。いくつかの実施形態では、穀粒は、エアレスト中に通気に供される。好ましくは、湿った空気または湿潤酸素が、エアレスト中に穀粒中を通される。温度は、任意の好適な温度であり、好ましくは温度は、２０～２８℃に維持される。
【0023】
ビールなどの大麦系飲料の製造工程、特に、製麦過程を言い表すのに使用される過程に関連する用語の「大麦」は、大麦粒を意味する。他の全ての場合で、別段の指定がない限り、「大麦」は、大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）を意味し、
任意の育種系統または栽培品種または変種を含み、一方、大麦植物の一部は、大麦植物の任意の部分、例えば、任意の組織または細胞であってよい。
任意の育種系統または栽培品種または変種を含み、一方、大麦植物の一部は、大麦植物の任意の部分、例えば、任意の組織または細胞であってよい。
【0024】
用語「異なるアミノ酸」は、標準遺伝子コードによりコードされる２０アミノ酸の１つまたは複数などの、タンパク質を構成するアミノ酸を包含する。
【0025】
本明細書で使用される場合、用語の「ＤＰ」または「重合の度合い」は、アミロペクチン側鎖中のα－１，４－結合グルコース単位の数を示す。
【0026】
本明細書で使用される場合、「発酵性糖」は、微生物が利用できるまたは発酵させることができる任意の糖を指す。特に、発酵性糖は、単糖類、二糖類および短いオリゴ糖類であり、限定されないが、グルコース、フルクトース、マルトース、マルトトリオースおよびスクロースを含み、これらは、微生物、特に酵母またはラクトバクテリアにより発酵され、エタノールまたは乳酸を生成できる。
【0027】
本明細書で使用される場合、「総発酵性糖」または「ＴＦＳ」は、フルクトース、スクロース、グルコース、マルトースおよびマルトトリオースを指す。従って、ＴＦＳの量は、フルクトース、スクロース、グルコース、マルトースおよびマルトトリオースの総量である。
【0028】
本明細書で使用される場合、用語「限界デキストリナーゼ」は、酵素クラスＥＣ３．２．１．１４２に属する糖加水分解酵素を表す。この酵素は、アミロペクチンおよびプルラン中の、アミロペクチンおよびグリコーゲンのα－およびβ－限界デキストリン中の１，６－α－Ｄ－グルコシド結合の加水分解を触媒するデンプン脱分枝酵素である。マッシング過程では、遊離限界デキストラナーゼの利用能は、特にデンプンが高度の分岐を有する場合に、デンプンからの発酵性糖の放出に影響を与えると予測される（例えば、Ｃａｌｕｍ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｊ Ｉｎｓｔ Ｂｒｅｗｉｎｇ １１０（４）：２８４－２９６、を参照）。特に、限界デキストリナーゼは、ユニプロット受入番号Ｑ９ＦＹＹ０で入手可能な配列またはそれらと少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログのポリペプチドであり得る。
【0029】
本明細書で使用される場合、用語「限界デキストリナーゼ阻害剤」または「ＬＤＩ」は、デンプン脱分枝酵素脱分枝酵素限界デキストリナーゼに結合し、その酵素作用を妨げるポリペプチドを表す。例えば、Ｙ Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １７２（３）：４５２－５６１、を参照。
【0030】
本明細書で使われる場合、用語「遊離限界デキストリナーゼ活性」または「遊離ＬＤ活性」は、限界デキストリナーゼ阻害剤により結合されない限界デキストリナーゼを意味する。限界デキストリナーゼおよび限界デキストリナーゼ阻害剤が複合体において一緒に結合されると、限界デキストリナーゼは、その酵素作用を実行できない。一方、限界デキストリナーゼ阻害剤に結合されない限界デキストリナーゼは、遊離状態であり、その酵素作用を実行できる。特に明記されない限り、用語「限界デキストリナーゼ活性」は、遊離限界デキストリナーゼ活性を指す。
【0031】
本明細書で使われる場合、用語「総限界デキストリナーゼ」は、限界デキストリナーゼ阻害剤に結合されていない遊離限界デキストリナーゼと、限界デキストリナーゼ阻害剤に結合されている不活化限界デキストリナーゼの両方を表す。従って、総限界デキストリナーゼは、限界デキストリナーゼの結合型および非結合型両方を指す。
【0032】
本明細書で使用される場合、用語「糊化温度」は、その間にデンプンが熱の影響下にて水中でその半結晶構造を失いゲルを形成する、温度範囲のピーク温度を指す。好ましくは、糊化温度は、下記実施例４で記載のように決定される。特定の糊化温度を有する穀類への言及は、上記糊化温度でデンプンを含む穀類を指す。
【0033】
本明細書で使用される場合、用語「発芽穀粒」は、目視可能な若葉を発生した穀粒を指す。
【0034】
本明細書で使用される場合、用語の「発芽開始」は、１５％未満の含水量を有する大麦粒が十分な水と接触されて発芽を開始する時点を指す。
【0035】
用語「穀粒」は、内部種子とも呼ばれる、穀類穎花を含むと定義される。加えて、穀粒（ｋｅｒｎｅｌ）は、外穎および内穎を含み得る。ほとんどの大麦品種では、外穎および内穎は、穎花に付着し、脱穀後に穀粒の一部である。しかし、裸麦品種も発生する。これらにおいて、穎花は、外穎および内穎を含まず、小麦の場合のように脱穀して自由に取り出せる。用語「穀粒（ｇｒａｉｎ）」および「穀粒（ｋｅｒｎｅｌ）」は本明細書で、同義に使用される。
【0036】
本明細書で使用される場合、用語「製麦」は、制御された環境条件下で起こる、穀物粒（特に、大麦粒）の制御された発芽を指す。いくつかの実施形態では、「製麦」は、例えばキルン乾燥により、上記発芽穀物粒を乾燥するステップをさらに含み得る。製麦過程は、例えばαアミラーゼおよび限界デキストリナーゼの加水分解酵素活性を誘導する。
【0037】
本明細書で使用される場合、用語の「麦芽」は、麦芽化されている穀物粒を指す。
【0038】
「マッシング」は、粉砕麦芽（例えば、緑麦芽またはキルン乾燥麦芽）および／または非発芽穀物粒の水中でのインキュベーションである。マッシングは好ましくは、特定の温度および特定の体積の水中で実施される。この過程は、糖類、オリゴおよびポリサッカライド、タンパク質および麦芽および／または穀粒の他の化合物の抽出を可能にし、ならびに抽出物中のオリゴおよびポリサッカライド（特に、デンプン）の発酵性糖への酵素加水分解を可能にする。
【0039】
本明細書で使用される場合、用語「ミスセンス変異」は、上記ヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド中で、ヌクレオチド配列中のアミノ酸から別のアミノ酸への変化を生ずる変異／複数変異を指す。
【0040】
「変異」は、遺伝子のコードおよび非コード領域中の、欠失、挿入、置換、塩基転換、および点変異を含む。欠失は、全体遺伝子でも、または遺伝子の一部分のみであってもよい。点変異は、１つの塩基対の変化に関し、未成熟停止コドン、フレームシフト変異、スプライス部位の変異またはアミノ酸置換を生じ得る。変異を含む遺伝子は、野生型遺伝子と比較される場合、「変異遺伝子」と呼ばれることもある。本発明では、変異遺伝子は一般に野生型遺伝子とは異なる配列を有するポリペプチドをコードし、上記ポリペプチドは、「変異ポリペプチド」と呼ばれることもある。変異ポリペプチドは、アミノ酸置換を含んでよく、このような置換は、例えば「位置ｎでアミノ酸ＸＸＸが、アミノ酸ＹＹＹに置換された」と記載でき、ＸＸＸは、野生型ポリペプチドの指定位置（ｎ）のアミノ酸を表し、ＹＹＹは、２つの遺伝子が整列される場合、変異ポリペプチド中の同じ位置に存在するアミノ酸を表す。
【0041】
本明細書で使用される場合、用語「非極性アミノ酸」は、疎水性側鎖を有するアミノ酸を指す。好ましくは、非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群より選択される。
【0042】
本明細書で使用される場合、用語の「荷電アミノ酸」は、帯電した側鎖を有するアミノ酸を指す。好ましくは、荷電アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される。負に帯電しているアミノ酸は好ましくは、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される。正に帯電しているアミノ酸は好ましくは、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンからなる群より選択される。
【0043】
本明細書で使用される場合、用語の「負に帯電していないアミノ酸」は、負に帯電していない側鎖を有するアミノ酸を指す。好ましくは、負に帯電していないアミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシンおよびプロリンからなる群より選択される。
【0044】
本明細書で使用される場合、用語「極性アミノ酸」は、極性の非荷電側鎖を有するアミノ酸を指す。好ましくは、極性アミノ酸は、セリン、トレオニン、アスパラギンおよびグルタミンからなる群より選択される。
【0045】
用語「植物生成物」は、植物または植物性物質の処理から得られる生成物を意味する。上記植物生成物は従って、例えば、緑麦芽、キルン乾燥麦芽、麦汁、発酵または非発酵飲料、食品、または飼料製品であり得る。
【0046】
本明細書で使用される場合、用語「子孫」は、その祖先の植物として所与の植物を有する、任意の植物を指す。子孫は、所与の植物の直接の子孫を含むだけではなく、多数の世代後、例えば１００世代まで後の子孫も含む。ある植物が所与の親植物の子孫であるかどうかを、上記植物がＨｖＬＤＩ遺伝子中に上記親植物と同じ変異を有するかどうかを決定することにより、決定し得る。ＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異に加えて、ＨｖＬＤＩ遺伝子の近傍に位置する遺伝子中の追加の多型の存在が、ある植物が所与の親植物の子孫であるかどうかを決定するために使用され得る。同じ多型の存在は、その植物が上記親植物の子孫であることを示す。
【0047】
本明細書で使用される場合、用語「ループ領域」は、配列番号１の位置２５～４４のアミノ酸に対応する、配列番号１の位置５６～６２のアミノ酸に対応する、配列番号１の位置７７～７８のアミノ酸に対応する、配列番号１の位置９１～１１１のアミノ酸に対応する、および／または配列番号１の位置１２４～１４７のアミノ酸に対応する、１種または複数の連続的アミノ酸群を指す。ループ領域は、ループ構造を形成し、これは、本明細書の下記のアルファヘリックス領域に結合する。
【0048】
本明細書で使用される場合、用語「アルファヘリックス領域」は、配列番号１の位置４５～５５のアミノ酸に対応する、配列番号１の位置６３～７６のアミノ酸に対応する、および配列番号１の位置７９～９０のアミノ酸に対応する、および／または配列番号１の位置１１２～１２３のアミノ酸に対応する、１種または複数の連続的アミノ酸群を指す。これらのアルファヘリックス領域は、ヘリカル構造を形成し得る。
【0049】
本明細書で使用される場合、用語「配列同一性」は、２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間、すなわち、候補配列（例えば、変異体配列）と基準配列（例えば、野生型配列）の間のそれらのペアワイズアライメントに基づく関連性を表す。本発明では、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳ ｐａｃｋａｇｅ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７，）、好ましくはバージョン５．０．０またはこれ以降（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／で入手可能）のＮｅｅｄｌｅプログラムに実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏ／．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使って決定される。使用されるパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ延長ペナルティ、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＥＭＢＯＳＳバージョン ３０ ＢＬＯＳＵＭ６２）置換マトリックスである。「最長同一性」と標識されたＮｅｅｄｌｅ出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）が、パーセント同一性として使用され、次のように計算される：
（同一残基ｘ１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）
（同一残基ｘ１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）
【0050】
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムはまた、基準配列以外の配列中の所与のアミノ酸（例えば、配列番号１の天然バリアントまたはハロタイプ）が、配列番号１（基準配列）の所与の位置に対応するかどうかを決定するためにも使用される。例えば、天然バリアントがＮ末端中に２つの追加のアミノ酸を有する場合、天然バリアント中の位置７０は、配列番号１の位置６８に対応する。
【0051】
本発明では、２つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳ ｐａｃｋａｇｅ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７，）、好ましくはバージョン５．０．０またはこれ以降のＮｅｅｄｌｅプログラムに実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、前出）を使って決定される。使用されるパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ延長ペナルティ、およびＤＮＡＦＵＬＬ（ＥＭＢＯＳＳバージョンＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４）置換マトリックスである。「最長同一性」と標識されたＮｅｅｄｌｅ出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）が、パーセント同一性として使用され、次のように計算される：
（同一デオキシリボヌクレオチドｘ１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）。
（同一デオキシリボヌクレオチドｘ１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）。
【0052】
本明細書で使用される場合、用語の「デンプン」は、個別の高分子：アミロースおよびアミロペクチンの片方または両方の組成物を指す。
【0053】
本明細書で使用される場合、用語の「停止コドン」は、ｍＲＮＡ内で遺伝コード中の翻訳を終止させる、三つ組みヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、用語の「停止コドン」はまた、ｍＲＮＡ中で停止コドンをコードする遺伝子内の三つ組みヌクレオチドを指す。ＤＮＡ中の停止コドンは典型的に、次の配列：ＴＡＧ、ＴＡＡまたはＴＧＡの１つを有する。
【0054】
本明細書で使用される場合、用語「野生型ＨｖＬＤＩ」または「ｗｔ ＨｖＬＤＩ」は、野生型大麦限界デキストリナーゼ阻害剤遺伝子または上記遺伝子によりコードされるポリペプチドを指す。天然では、ＨｖＬＤＩのいくつかのハプロタイプが存在し、これは野生型ＬＤＩとみなされる。これらもまた、配列番号１のＨｖＬＤＩ基準配列の天然バリアントとして記載できる。従って、用語「野生型ＨｖＬＤＩ」は、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４により記載されるものを含む、一群の野生型ＨｖＬＤＩを包含する。
【0055】
用語「麦汁」は、粉砕麦芽および／または粉砕穀物粒などの麦芽および／または穀物粒ならびに任意追加の補助剤の液体抽出物を意味する。麦汁は通常、マッシングにより、続いて任意選択で、温水でマッシング後に残留糖および他のビール粕からの化合物を抽出する工程での、「スパージング」により得られる。スパージングは通常、麦芽汁濾過機、マッシュフィルター、または抽出した水のビール粕からの分離を可能にする別の装置で実施される。マッシング後に得られる麦汁は通常、「第一麦汁」と呼ばれ、一方スパージング後に得られる麦汁は通常、「第二麦汁」と呼ばれる。指定されない場合、用語の麦汁は、第一麦汁、第二麦汁、または両者の組み合わせであり得る。従来のビール製造中に、麦汁はホップと一緒に煮沸される。ホップのない麦汁はまた、「甘い麦汁」と呼ばれることもあり、一方ホップと共に煮沸された麦汁は、「煮沸麦汁」または単に麦汁と呼ばれることもある。
【0056】
本明細書で使用される場合、用語「千粒重」は、１千（１０００）個の穀粒の総重量を指す。
【0057】
限界デキストリナーゼ阻害剤（ＬＤＩ）
本発明は、大麦植物またはその一部を提供し、上記大麦植物は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有し、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする。
本発明は、大麦植物またはその一部を提供し、上記大麦植物は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有し、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする。
【0058】
野生型Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ限界デキストリナーゼ阻害剤（ＨｖＬＤＩ）のコーディングヌクレオチド配列は、受入番号ＤＱ２８５５６４．１により入手可能である。ＨｖＬＤＩのコーディングヌクレオチド配列は、本明細書でも配列番号２として提供される。当業者なら、他の野生型大麦植物が配列番号２とは異なる配列を有するＨｖＬＤＩ遺伝子を含むことを理解するであろう。これらもまた、配列番号２のＨｖＬＤＩ基準配列の天然バリアントとして記載できる。
【0059】
ＨｖＬＤＩポリペプチドは、受入番号Ｑ２Ｖ８Ｘ０により入手可能である。本発明の場合における野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１または配列番号１と少なくとも９０％、例えば９３％、例えば９５％、例えば９８％の配列同一性を共有する配列を有するポリペプチドであり、上記配列は、少なくとも配列番号１の位置６０および６８に対応するアミノ酸、すなわち、それぞれ、プロリンおよびグルタミン酸を含む。換言すれば、配列番号１のアミノ酸６０および６８に対応するアミノ酸は、野生型ＨｖＬＤＩで保存される。
【0060】
本発明のポリペプチドに対するアミノ酸の位置の特定は、基準配列としての配列番号１との関係で行われるが、本発明のポリペプチドの配列は、配列番号１のポリペプチド配列とはある程度異なる場合があることは理解されよう（例えば、野生型ＨｖＬＤＩの定義を参照されたい）。従って、上記ポリペプチドと配列番号１の参照ポリペプチドの間で整列後に、あるアミノ酸は、それが同じ位置に整列される場合、配列番号１の位置に対応する。
【0061】
表１Ａ／１Ｂは、配列番号１の所与の位置での天然野生型バリアントを示す。例えば、配列番号１の位置１０８は、Ａｒｇであり、ＷＴ ハロタイプ２は、位置１０８に対応する位置にＴｈｒを有する。
【表1】
【表2】
【0062】
本明細書の上記表１Ａおよび１Ｂに挙げた置換を有する配列番号１のポリペプチドは、本発明の場合には全て、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドと考えられる。
【0063】
本発明の一実施形態では、本発明の変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、位置６０および／または６８でのアミノ酸を除いて、配列番号１と少なくとも９０％同一、例えば９５％同一、例えば９８％同一、例えば１００％同一である。
【0064】
ＬＤＩの提案された構造は、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．２００４ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５、に記載される。ＬＤＩは、シグナルペプチドおよび４つのアルファヘリックス領域からなると考えられ、アルファヘリックス領域はループ領域により接合される。ループ領域は、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸からなる群より選択され得る。アルファヘリックス領域は、配列番号１の位置４５～５５に対応するアミノ酸および位置６３～７６に対応するアミノ酸および位置７９～９０に対応するアミノ酸および位置１１２～１２３に対応するアミノ酸からなる群より選択され得る。シグナルペプチドは、配列番号１の１～２４のアミノ酸に対応する。
【0065】
さらに、シグナルペプチドを含まない成熟ＨｖＬＤＩポリペプチドはまた、配列番号１の位置１～２４に対応するアミノ酸を含まない表１Ａおよび１Ｂ中の全てのポリペプチドを含み、野生型ＨｖＬＤＩとみなされる。特に、配列番号１の位置１～２４のアミノ酸を含まない配列番号１の成熟ポリペプチドは、野生型ＨｖＬＤＩとみなされる。換言すれば、配列番号１の２５～１４７のアミノ酸からなるからなるポリペプチドは、野生型ＨｖＬＤＩとみなされる。
【0066】
シグナルペプチドを含まない成熟ＨｖＬＤＩポリペプチドのアミノ酸は、配列番号１のＨｖＬＤＩのアミノ酸に関連して記載できる。従って、成熟ＨｖＬＤＩポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸位置から２４アミノ酸を差し引くことにより、配列番号１のアミノ酸位置に基づき計算できる。これは例えば、Ｍｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５で使用されるアミノ酸位置を有するケースである。
【0067】
これに関する１例は、配列番号１のＨｖＬＤＩポリペプチドの位置６０のアミノ酸は、成熟ＨｖＬＤＩポリペプチドの位置３６のアミノ酸に対応することである。これに関する別の例は、配列番号１のＨｖＬＤＩポリペプチドの位置６６のアミノ酸は、成熟ＨｖＬＤＩポリペプチドの位置４２のアミノ酸に対応することである。これに関する別の例は、配列番号１のＨｖＬＤＩポリペプチドの位置６８のアミノ酸は、成熟ＨｖＬＤＩポリペプチドの位置４４のアミノ酸に対応することである。
【0068】
野生型ＨｖＬＤＩ遺伝子は、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする遺伝子である。特に、野生型ＨｖＬＤＩ遺伝子は、配列番号２のヌクレオチド配列またはそれらと少なくとも９０％、例えば、少なくとも９３％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的ホモログのヌクレオチド配列であり得る。
【0069】
好ましくは、野生型ＨｖＬＤＩ遺伝子は、配列番号２と少なくとも９０％、例えば９３％、例えば９５％、例えば９８％の配列同一性を共有するＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする遺伝子であり、上記配列は少なくとも、配列番号２の位置９６６および９９０の核酸、すなわちそれぞれＣおよびＧ、を含む。より具体的には、野生型ＨｖＬＤＩ遺伝子によりコードされるポリペプチドは好ましくは、配列番号１のアミノ酸位置６０にプロリンおよび配列番号１のアミノ酸位置６８でグルタミン酸を含む。
【0070】
本発明は、大麦植物またはその一部を提供し、上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有し、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は 変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、変異は、次の変異の１つである：
ａ．ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中でプロリンから異なるアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、ループ領域が、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異；または
ｂ．野生型ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中で負に帯電しているアミノ酸から負に帯電していないアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、アルファヘリックス領域が、配列番号１の位置４５～５５に対応するアミノ酸および位置６３～７６に対応するアミノ酸および位置７９～９０に対応するアミノ酸および位置１１２～１２３に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異。
ａ．ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中でプロリンから異なるアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、ループ領域が、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異；または
ｂ．野生型ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中で負に帯電しているアミノ酸から負に帯電していないアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、アルファヘリックス領域が、配列番号１の位置４５～５５に対応するアミノ酸および位置６３～７６に対応するアミノ酸および位置７９～９０に対応するアミノ酸および位置１１２～１２３に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異。
【0071】
一実施形態では、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、指定位置の変異は別にして、成熟野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドまたはその天然バリアントと同一である。
【0072】
本発明はまた、大麦植物またはその一部を提供し、上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に下記からなる群より選択される１つまたは複数の変異を有する：
ａ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６６に対応する位置で、ヌクレオチドＣからＡへの変異；および
ｂ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６７に対応する位置で、ヌクレオチドＣからＴへの変異；および
ｃ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６８に対応する位置で、ヌクレオチドＣからＴへの変異；および
ｄ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９９０に対応する位置で、ヌクレオチドＧからＡへの変異。
ａ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６６に対応する位置で、ヌクレオチドＣからＡへの変異；および
ｂ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６７に対応する位置で、ヌクレオチドＣからＴへの変異；および
ｃ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６８に対応する位置で、ヌクレオチドＣからＴへの変異；および
ｄ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９９０に対応する位置で、ヌクレオチドＧからＡへの変異。
【0073】
プロリンから異なるアミノ酸への変化を生じるミスセンス変異
本発明のいくつかの実施形態では、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中でプロリンから異なるアミノ酸への置換を含む。プロリンの置換は、極性アミノ酸または非極性アミノ酸への置換であってよい。特に、それは、プロリンのセリンまたはロイシンへの置換であってよい。プロリンの置換は、配列番号１の位置６０に対応するアミノ酸の位置であることが好ましい。
本発明のいくつかの実施形態では、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中でプロリンから異なるアミノ酸への置換を含む。プロリンの置換は、極性アミノ酸または非極性アミノ酸への置換であってよい。特に、それは、プロリンのセリンまたはロイシンへの置換であってよい。プロリンの置換は、配列番号１の位置６０に対応するアミノ酸の位置であることが好ましい。
【0074】
本発明のいくつかの実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中でプロリンから異なるアミノ酸への置換を含み、ループ領域は、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸からなる群より選択される。
【0075】
一実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、ループ領域は、配列番号１の位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸からなる群より選択される。
【0076】
一実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、野生型ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中に、プロリンの極性アミノ酸への置換を含む。
【0077】
一実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の位置６０に対応するアミノ酸の位置でプロリンの異なるアミノ酸への置換を含む。
【0078】
別の実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記ＨｖＬＤＩポリペプチドは、ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中にプロリンのセリンへの置換を含む。
【0079】
一実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の位置６０に対応するアミノ酸の位置でプロリンのセリンへの置換を含む。
【0080】
一実施形態では、本発明の変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号３の位置２５～１４２または配列番号３の位置２５～１４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【0081】
本発明のいくつかの実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、野生型ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中に、プロリンの非極性アミノ酸への置換を含む。
【0082】
一実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中に、プロリンのロイシンへの置換を含む。
【0083】
別の実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の位置６０に対応するアミノ酸の位置でプロリンのロイシンへの置換を含むことが好ましい。
【0084】
一実施形態では、本発明の変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号４の位置２５～１４２または配列番号４の位置２５～１４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【0085】
一実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、配列番号２のＨｖＬＤＩリファレンス遺伝子のヌクレオチド９６６に対応する位置でヌクレオチドＣのＴへの変異を含む。
【0086】
別の実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、配列番号２のＨｖＬＤＩリファレンス遺伝子のヌクレオチド９６７に対応する位置でヌクレオチドＣのＴへの変異を含む。
【0087】
一実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、配列番号２のＨｖＬＤＩリファレンス遺伝子のヌクレオチド９６６および９６７に対応する位置でヌクレオチドＣのＴへの変異を含む。
【0088】
一実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、配列番号２のＨｖＬＤＩリファレンス遺伝子のヌクレオチド９６６および／または９６８に対応する位置でヌクレオチドＣのＴへの変異を含む。
【0089】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号１のＰｒｏ６０Ｓｅｒ変異を有する変異体ＨｖＬＤＩタンパク質をコードする変異体ＨｖＬＤＩ遺伝子を含む。例えば、大麦植物は、配列番号２のＨｖＬＤＩコード配列のヌクレオチド９６６のＣ→Ｔ変異を有する変異体ＨｖＬＤＩ遺伝子を含み得る。上記大麦植物は例えば、ＨＥＮＺ－１６ａまたはその子孫であり得る。ＨＥＮＺ－１６ａはまた、本明細書で「ＨＥＮＺ－１６」と呼ばれることもある。例えば、大麦植物は、実施例１で記載のように特定されたＨＥＮＺ－１６ａ大麦植物またはその子孫であり得る。
【0090】
本特許出願において、「ＨＥＮＺ－１６」と命名された（本明細書では「ＨＥＮＺ－１６ａ」とも称される）大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）の種子は、ブダペスト条約に基づきＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１ ９ＹＡ Ｓｃｏｔｌａｎｄに寄託された。ＨＥＮＺ－１６大麦植物は、２０２０年２月１２日に寄託され、受入番号ＮＣＩＭＢ４３５８１を受けた。
【0091】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、２０２０年２月１２日にＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ４３５８１で寄託され、「ＨＥＮＺ－１６」と呼ばれる大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、またはその子孫である。従って、本発明の大麦植物は、２０２０年２月１２日にＮＣＩＭＢに寄託された受入番号ＮＣＩＭＢ４３５８１を有する大麦植物ＨＥＮＺ－１６またはその任意の子孫大麦植物であり、子孫大麦植物は、配列番号２のＨｖＬＤＩコード配列のヌクレオチド９６６のＣ→Ｔ変異を有し、および／または上記大麦植物のＨｖＬＤＩ遺伝子は、配列番号１のＰｒｏ６０Ｓｅｒ変異を含む変異体ＨｖＬＤＩタンパク質をコードする。
【0092】
負に帯電しているアミノ酸から負に帯電していないアミノ酸への変化を生じるミスセンス変異
本発明のいくつかの実施形態では、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中の、負に帯電しているアミノ酸の負に帯電していないアミノ酸への置換を含む。負に帯電しているアミノ酸の置換は、正に帯電しているアミノ酸への置換であり得る。特に、それは、負に帯電しているアミノ酸のリジンへの置換であり得る。負に帯電しているアミノ酸の置換は、配列番号１の位置６８に対応するアミノ酸の置換であることが好ましい。
本発明のいくつかの実施形態では、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中の、負に帯電しているアミノ酸の負に帯電していないアミノ酸への置換を含む。負に帯電しているアミノ酸の置換は、正に帯電しているアミノ酸への置換であり得る。特に、それは、負に帯電しているアミノ酸のリジンへの置換であり得る。負に帯電しているアミノ酸の置換は、配列番号１の位置６８に対応するアミノ酸の置換であることが好ましい。
【0093】
本発明のいくつかの実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中の負に帯電しているアミノ酸の負に帯電していないアミノ酸への置換を含む。一実施形態では、上記負に帯電しているアミノ酸は、グルタミン酸である。
【0094】
本発明のいくつかの実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中の、負に帯電しているアミノ酸の正に帯電しているアミノ酸への置換を含む。一実施形態では、上記負に帯電しているアミノ酸は、グルタミン酸である。
【0095】
一実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中の負に帯電しているアミノ酸のリジンへの置換を含む。一実施形態では、上記負に帯電しているアミノ酸は、グルタミン酸である。
【0096】
いくつかの実施形態では、アルファヘリックス領域は、配列番号１の位置４５～５５に対応するアミノ酸および位置６３～７６に対応するアミノ酸および位置７９～９０に対応するアミノ酸および位置１１２～１２３に対応するアミノ酸からなる群より選択される。
【0097】
別の実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の位置６８のアミノ酸に対応するグルタミン酸の負に帯電していないアミノ酸への置換を含む。
【0098】
さらに別の実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の位置６８のアミノ酸に対応するグルタミン酸のリジンへの置換を含む。
【0099】
一実施形態では、本発明の変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号６の位置２５～１４２または配列番号６の位置２５～１４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【0100】
一実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、配列番号２のＨｖＬＤＩリファレンス遺伝子のヌクレオチド９９０に対応する位置でヌクレオチドＧのＡへの変異を含む。
【0101】
一実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、配列番号２のＨｖＬＤＩリファレンス遺伝子のヌクレオチド９６６に対応する位置でヌクレオチドＣのＴへの変異、およびヌクレオチド９９０に対応する位置でヌクレオチドＧのＡへの変異を含む。
【0102】
一実施形態では、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、配列番号２のＨｖＬＤＩリファレンス遺伝子のヌクレオチド９６７に対応する位置でヌクレオチドＣのＴへの変異、およびヌクレオチド９９０に対応する位置でヌクレオチドＧのＡへの変異を含む。
【0103】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号１のＧｌｕ６８Ｌｙｓ変異を有する変異体ＨｖＬＤＩタンパク質をコードする変異体ＨｖＬＤＩ遺伝子を含む。例えば、大麦植物は、配列番号２のＨｖＬＤＩコード配列のヌクレオチド９９０のＧ→Ａ変異を有する変異体ＨｖＬＤＩ遺伝子を含み得る。上記大麦植物は例えば、ＨＥＮＺ－３１またはその子孫であり得る。例えば、大麦植物は、実施例１で記載のように特定されたＨＥＮＺ－３１大麦植物またはその子孫であり得る。
【0104】
本特許出願において、「ＨＥＮＺ－３１」と命名された大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）の種子は、ブダペスト条約に基づきＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１ ９ＹＡ Ｓｃｏｔｌａｎｄに寄託された。ＨＥＮＺ－３１大麦植物は、２０２０年２月１２日に寄託され、受入番号ＮＣＩＭＢ４３５８２を受けた。
【0105】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、２０２０年２月１２日にＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ４３５８２で寄託され、「ＨＥＮＺ－３１」と呼ばれる大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、またはその子孫である。従って、本発明の大麦植物は、２０２０年２月１２日にＮＣＩＭＢに寄託された受入番号ＮＣＩＭＢ４３５８２を有する大麦植物ＨＥＮＺ－３１またはその任意の子孫大麦植物であり、子孫大麦植物は、配列番号２のＨｖＬＤＩコード配列のヌクレオチド９９０のＧ→Ａ変異を有し、および／または上記大麦植物のＨｖＬＤＩ遺伝子は、配列番号１のＧｌｕ６８Ｌｙｓ変異を含む変異体ＨｖＬＤＩタンパク質をコードする。
【0106】
ＨｖＬＤＩ活性
本明細書で上記したように、ＨｖＬＤＩは、ＨｖＬＤに結合でき、これによりＨｖＬＤの活性を阻害する。活性ＨｖＬＤは、分岐デキストリン分子中のα－１－６結合を切断できる。
本明細書で上記したように、ＨｖＬＤＩは、ＨｖＬＤに結合でき、これによりＨｖＬＤの活性を阻害する。活性ＨｖＬＤは、分岐デキストリン分子中のα－１－６結合を切断できる。
【0107】
インビトロでＨｖＬＤを阻害するＨｖＬＤＩの能力は、当業者に既知の任意の有用な方法により測定できる。このような方法のために、組換えＨｖＬＤおよびＨｖＬＤＩは、既知の方法により製造でき、または標準的供給業者から購入できる。ＨｖＬＤとＨｖＬＤＩの間の結合親和性を評価するための商業的に入手可能なアッセイは例えば、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄのプルラナーゼ／限界デキストリナーゼアッセイキットである。
ＨｖＬＤＩとＨｖＬＤの間の結合親和性を測定するための好ましいインビトロ法は、実施例２で記載される。本発明による変異を有する変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、実施例２のアッセイにより評価される場合ＨｖＬＤを阻害する低下された能力を有する。
ＨｖＬＤＩとＨｖＬＤの間の結合親和性を測定するための好ましいインビトロ法は、実施例２で記載される。本発明による変異を有する変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、実施例２のアッセイにより評価される場合ＨｖＬＤを阻害する低下された能力を有する。
【0108】
本発明による変異を有する変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは好ましくは、インビトロで測定される場合、ＨｖＬＤを阻害する野生型ＨｖＬＤＩの能力に比べて、ＨｖＬＤを阻害する少なくとも３倍低減された能力などの、ＨｖＬＤを阻害する少なくとも２倍低減された能力を有する。本発明の一実施形態では、変異ＨｖＬＤＩは、インビトロで測定される場合、ＨｖＬＤ活性を完全に阻害できない。
【0109】
本発明の一実施形態では、本発明によるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異は、野生型ＨｖＬＤＩ遺伝子と比較した場合、遊離ＨｖＬＤ活性を増大させる。
【0110】
大麦植物
本発明は、大麦植物、またはその一部、ならびに大麦製品、およびこれらを製造する方法に関する。大麦植物は、任意の育種系統または栽培品種または変種を含む、種Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの任意の植物であり得る。
本発明は、大麦植物、またはその一部、ならびに大麦製品、およびこれらを製造する方法に関する。大麦植物は、任意の育種系統または栽培品種または変種を含む、種Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの任意の植物であり得る。
【0111】
「野生大麦」であるＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ亜種のホルデウム・スポンタネウムは、大麦の今日の栽培品種の祖先と考えられる。栽培植物化されているが、大麦の不均一な混合物は、大麦在来種と呼ばれる。今日では、ほとんどの在来種は、先進農業では純系栽培品種により置き換えられている。在来種と比較して、最近の大麦栽培品種は、多くの改善された特性を有する（Ｎｅｖｏ，１９９２；Ｐｅｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
【0112】
本発明中では、用語「大麦植物」は、大麦在来種または最近の大麦栽培品種などの任意の大麦植物を含む。従って、本発明は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を含む任意の大麦植物に関する。
【0113】
しかし、本発明での使用のために好ましい大麦植物は、最近の大麦栽培品種または純系である。本発明で使用できる大麦栽培品種の非限定例としては、例えば、Ｐａｕｓｔｉａｎ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｑｕｅｎｃｈ、Ｃｅｌｅｓｔｅ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｎｅｒｕｄａ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｋｌａｇｅｓ、Ｍａｎｌｅｙ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｓｔｉｒｌｉｎｇ、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｌｅｎｈｅｉｍ、Ａｒｉｅｌ、Ｌｅｎｋａ、Ｍａｒｅｓｉ、Ｓｔｅｆｆｉ、Ｇｉｍｐｅｌ、Ｃｈｅｒｉ、Ｋｒｏｎａ、Ｃａｍａｒｇｕｅ、Ｃｈａｒｉｏｔ、Ｄｅｒｋａｄｏ、Ｐｒｉｓｍａ、Ｕｎｉｏｎ、Ｂｅｋａ、Ｋｙｍ、Ａｓａｈｉ ５、ＫＯＵ Ａ、Ｓｗａｎ Ｈａｌｓ、Ｋａｎｔｏ Ｎａｋａｔｅ Ｇｏｌｄ、Ｈａｋａｔａ Ｎｏ．２、Ｋｉｒｉｎ－ｃｈｏｋｕ Ｎｏ．１、Ｋａｎｔｏ ｌａｔｅ Ｖａｒｉｅｔｙ Ｇｏｌｄ、Ｆｕｊｉ Ｎｉｊｏ、Ｎｅｗ Ｇｏｌｄｅｎ、Ｓａｔｕｋｉｏ Ｎｉｊｏ、Ｓｅｉｊｏ Ｎｏ．１７、Ａｋａｇｉ Ｎｉｊｏ、Ａｚｕｍａ Ｇｏｌｄｅｎ、Ａｍａｇｉ Ｎｉｊｐｏ、Ｎｉｓｈｉｎｏ Ｇｏｌｄ、Ｍｉｓａｔｏ ｇｏｌｄｅｎ、Ｈａｒｕｎａ Ｎｉｊｏ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ、ＲｏｓａｌｉｎａおよびＪｅｒｓｅｙが挙げられ、好ましくは、Ｈａｒｕｎａ Ｎｉｊｏ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｑｕｅｎｃｈ、Ｃｅｌｅｓｔｅ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、ＮｅｒｕｄａおよびＰｏｗｅｒが挙げられ、好ましくは、Ｐａｕｓｔｉａｎ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｋｌａｇｅｓ、Ｍａｎｌｅｙ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｓｔｉｒｌｉｎｇ、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｌｅｎｈｅｉｍ、Ａｒｉｅｌ、Ｌｅｎｋａ、Ｍａｒｅｓｉ、Ｓｔｅｆｆｉ、Ｇｉｍｐｅｌ、Ｃｈｅｒｉ、Ｋｒｏｎａ、Ｃａｍａｒｇｕｅ、Ｃｈａｒｉｏｔ、Ｄｅｒｋａｄｏ、Ｐｒｉｓｍａ、Ｕｎｉｏｎ、Ｂｅｋａ、Ｋｙｍ、Ａｓａｈｉ ５、ＫＯＵ Ａ、Ｓｗａｎ Ｈａｌｓ、Ｋａｎｔｏ Ｎａｋａｔｅ Ｇｏｌｄ、Ｈａｋａｔａ Ｎｏ．２、Ｋｉｒｉｎ－ｃｈｏｋｕ Ｎｏ．１、Ｋａｎｔｏ ｌａｔｅ Ｖａｒｉｅｔｙ Ｇｏｌｄ、Ｆｕｊｉ Ｎｉｊｏ、Ｎｅｗ Ｇｏｌｄｅｎ、Ｓａｔｕｋｉｏ Ｎｉｊｏ、Ｓｅｉｊｏ Ｎｏ．１７、Ａｋａｇｉ Ｎｉｊｏ、Ａｚｕｍａ Ｇｏｌｄｅｎ、Ａｍａｇｉ Ｎｉｊｐｏ、Ｎｉｓｈｉｎｏ Ｇｏｌｄ、Ｍｉｓａｔｏ ｇｏｌｄｅｎ、Ｈａｒｕｎａ Ｎｉｊｏ、ＳｃａｒｌｅｔｔおよびＪｅｒｓｅｙが挙げられ、好ましくは、Ｐｌａｎｅｔ、Ｐａｕｓｔｉａｎ、Ｈａｒｕｎａ Ｎｉｊｏ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｔａｎｇｅｎｔ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｎｅｒｕｄａ、Ｐｏｗｅｒ、Ｑｕｅｎｃｈ、ＮＦＣ Ｔｉｐｐｌｅ、Ｂａｒｋｅ、Ｃｌａｓｓ、Ｖｉｎｔａｇｅ、Ａｐｐｌａｕｓ、Ｂｏｗｉｅ、Ｂｒｏａｄｗａｙ、Ｃｈａｍｐ、Ｃｈａｎｓｏｎ、Ｃｈａｒｌｅｓ、Ｃｈｉｍｂｏｎ、Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔａｎ、Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｄｒａｇｏｏｎ、Ｅｌｌｉｎｏｒ、Ｅｍｂｒａｃｅ、Ｅｔｏｉｌｅ、Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ、Ｆｌａｉｒ、Ｈｉｇｈｗａｙ、ＫＷＳ Ｂｅｃｋｉｅ、ＫＷＳ Ｃａｎｔｔｏｎ、ＫＷＳ Ｃｏｒａｌｉｅ、ＫＷＳ Ｆａｎｔｅｘ、ＫＷＳ Ｉｒｉｎａ、ＫＷＳ Ｊｏｓｉｅ、ＫＷＳ Ｋｅｌｌｉｅ、ＬＧ Ｄｉａｂｌｏ、ＬＧ Ｆｉｇａｒｏ、ＬＧ Ｎａｂｕｃｏ、ＬＧ Ｔｏｍａｈａｗｋ、Ｌａｕｒｅａｔｅ、Ｌａｕｒｉｋｋａ、Ｌａｕｘａｎａ、Ｌｕｔｈｅｒ、Ｏｄｙｓｓｅｙ、Ｏｖａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＲＧＴ Ｅｌｙｓｉｕｍ、ＲＧＴ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ、ＲＧＴ Ｐｌａｎｅｔ、Ｒｏｔａｔｏｒ、Ｓａｒｂｉ、Ｓｃｈｏｌａｒ、ＳｕｂｗａｙまたはＧｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅが挙げられる。
【0114】
大麦植物は、任意の好適な形態であってよい。例えば、本発明による大麦植物は、生存可能大麦植物、乾燥植物、ホモジナイズした植物、または粉砕大麦粒であり得る。植物は、成熟植物、胚芽、穀粒、発芽穀粒、麦芽化穀粒、粉砕麦芽化穀粒、粉砕穀粒、などであり得る。
【0115】
大麦植物の部分は、穀粒、胚芽、葉、茎、根、花、またはそれらの一部などの任意の好適な部分であり得る。分割量は、例えば、穀粒、胚芽、葉、茎、根、花、の断片であり得る。大麦植物の部分はまた、ホモジネートの一部、または粉砕大麦植物または穀粒の一部であり得る。
【0116】
本発明の一実施形態では、大麦植物の部分は、上記大麦植物の、組織培養物中にインビトロで増殖され得る生存細胞などの、細胞であり得る。他の実施形態では、しかし、大麦植物の部分は、完全な大麦植物に成熟できない生存細胞、すなわち生殖物質ではない細胞であり得る。
【0117】
大麦植物は、基本的に生物学的過程により得られる、またはその子孫であるとは限らない。例えば、大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を含み、上記変異は、アジ化ナトリウムなどの化学的および／または物理的薬剤により誘導されている。
【0118】
従って、大麦植物は、誘導された変異誘発のステップを含む方法により調製されている、または上記大麦植物は、誘導された変異誘発のステップを含む方法により調製された植物の子孫であり得る。上記誘導された変異誘発は例えば、アジ化ナトリウムなどの変異誘発化学薬品での処理であり得る。
【0119】
大麦植物はまた、例えばプラスミドまたは遺伝的組換え技術またはＣｒｉｓｐｅｒ／Ｃａｓ－９技術を用いて、変異ＨｖＬＤＩ遺伝子を宿主ゲノム中に挿入することにより、遺伝子工学技術により調製された大麦植物であってもよい。好ましくは、野生型ＨｖＬＤＩ遺伝子は、このような植物中でノックアウトされている。
【0120】
本発明のいくつかの実施形態では、大麦植物、またはその一部は、本発明によるＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する。
【0121】
ＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異に加えて、大麦植物は、他の変異を含んでもよい。
【0122】
ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物の特性
本発明は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物またはその一部を提供し、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする。
本発明は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物またはその一部を提供し、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする。
【0123】
このような大麦植物の１つの大きな利点は、本発明による上記大麦植物の穀粒が野生型ＨｖＬＤＩ遺伝子を有する大麦植物に比べて、増大した遊離ＨｖＬＤ活性を有することである。さらに、このような大麦粒から調製された麦芽はまた、より高いレベルの遊離ＨｖＬＤ活性を有する。意外にも、増大した遊離ＨｖＬＤ活性は、上記大麦植物の穀粒から調製された麦汁中の発酵性糖の濃度と強く関連し、一方で低い、または通常のレベルの遊離ＨｖＬＤ活性を有する大麦粒から調製された麦汁は一般に、低いまたは通常濃度の発酵性糖を有する。従って、増大した遊離ＨｖＬＤ活性は、大麦麦汁およびビール生産にとって有利な形質である。
【0124】
大麦中の遊離ＨｖＬＤの量は、当業者に既知の任意の有用な方法により測定できる。典型的には、第１のステップは、１つまたは複数の大麦粒を、例えば機械的な手段により粉砕して、大麦粉を得るステップである。これは、任意の有用な手段により、例えば、液圧プレスおよび／または磨砕機の使用および／または粉砕機により実施され得るが、機械的な粉砕の正確な方法は、それほど重要ではない。
【0125】
遊離ＨｖＬＤ活性を測定するための有用な方法の非限定的な一例は、得られた粉末を酸性の水溶液中で、例えば、ｐＨ４．７のマレイン酸中、４０℃で１時間、抽出することであり得る。遊離ＨｖＬＤ活性は、ＭｅｇａｚｙｍｅによるＰｕｌｌＧ６法により分析され得る。
大麦中の遊離ＨｖＬＤ活性を測定する好ましい方法は、実施例７に記載される。
大麦中の遊離ＨｖＬＤ活性を測定する好ましい方法は、実施例７に記載される。
【0126】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する上記大麦植物、またはその一部は、同じ条件下で培養される場合、野生型ＨｖＬＤＩをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するが、それ以外は同じ遺伝子型である、大麦植物、またはその一部に比べて、より高い遊離ＨｖＬＤ活性を有する。
【0127】
本発明の一実施形態では、本発明の大麦植物またはその一部、または本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物の穀粒から調製された発芽穀粒または麦芽は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の麦芽中で測定される遊離ＨｖＬＤ活性に比べて、少なくとも２０％高い遊離ＨｖＬＤ活性を有する。いくつかの実施形態では、上記遊離ＨｖＬＤ活性は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の麦芽で測定される遊離ＨｖＬＤ活性に比べて、少なくとも５０％高い、例えば少なくとも１００％高い、例えば少なくとも１４０％高い。一実施形態では、上記穀粒は、測定の前に、７２時間発芽された。
【0128】
総ＨｖＬＤ活性は、任意の有用な方法により測定され得る。典型的には、このような方法は、ＬＤＩとＬＤの間の結合の破壊とそれに続くＬＤ活性の測定条件下でのインキュベーションを含む。非限定的総ＨｖＬＤ測定方法の一例は、得られた粉末をジチオトレイトールなどのレドックス試薬中で、例えば、ｐＨ４．７下、４０℃で１時間、抽出することであり得る。ＨｖＬＤ活性の量はその後、上述のように分析され得る。レドックス試薬とのインキュベーション後に測定されたＨｖＬＤ活性は、総ＨｖＬＤ活性を反映する。総ＨｖＬＤ活性を測定する好ましい方法は、実施例７に記載される。
【0129】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する上記大麦植物、またはその一部は、同じ条件下で培養される場合、野生型ＨｖＬＤＩをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有し、それ以外は同じ遺伝子型である、大麦植物、またはその一部に比べて、より高い総ＨｖＬＤ活性に対する遊離ＨｖＬＤ活性の比率を有する。総ＨｖＬＤに対する遊離ＨｖＬＤの比率は、遊離／総（％）として提供され得る。
【0130】
本発明の別の実施形態では、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物またはその一部、または発芽穀粒もしくはその麦芽は、同じ条件下で調製される場合、配列番号１のＨｖＬＤＩをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の麦芽で測定される遊離／総％ＨｖＬＤ活性と比較して、少なくとも２０％高い遊離／総％ＨｖＬＤ活性を有する。いくつかの実施形態では、上記遊離／総％ＨｖＬＤ活性は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の麦芽で測定される遊離／総％ＨｖＬＤ活性に比べて、少なくとも３０％高い、例えば、少なくとも４０％高い、例えば、少なくとも５０％高い。
【0131】
本発明の一実施形態では、遊離限界デキストリナーゼと総限界デキストリナーゼの間の比率は、フレックスモルト麦芽化穀粒で少なくとも３５％および従来法麦芽化穀粒（例えば、キルン乾燥麦芽）で少なくとも６０％である。
【0132】
本発明の大麦植物は通常、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有しない大麦植物と同等の物理的外観および穀粒収率を有する。従って、本発明の大麦植物の穀粒はまた一般に、同一条件下で培養された同じ遺伝子型の野生型大麦植物の穀粒と同等の糊化温度、αアミラーゼ活性、βアミラーゼ活性、アミロペクチン鎖長分布、重量、サイズ、タンパク質含量、含水量、およびデンプン含量を有する。
【0133】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有しない大麦植物の穀粒に比べて、実質的に同じ発芽能力を有する。例えば、一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、同じ遺伝子型の、類似のまたは同じ条件下で調製された野生型大麦植物からの穀粒に比べて、実質的に同じ、式１０＊（ｘ＋ｙ＋ｚ）／（ｘ＋２＊ｙ＋３＊ｚ）を用いて３日の期間にわたり計算される発芽インデックスを有する。式中、ｘは、２４時間で計数された発芽穀粒の数であり、ｙは、４８時間で計数された発芽穀粒の数であり、ｚは、７２時間で計数された発芽穀粒の数である。別の実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、同じ遺伝子型の、類似のまたは同じ条件下で調製された野生型大麦植物からの穀粒に比べて、実質的に同じ、２４時間での穀粒の総量に対する２４時間で計数された発芽穀粒の数を用いて、４８時間での穀粒の総量に対する４８時間で計数された発芽穀粒の数を用いて、７２時間での穀粒の総量に対する７２時間で計数された発芽穀粒の数を用いて、計算された２４時間、４８時間および７２時間での発芽パーセンテージを有する。例えば、さらに別の実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、同じ遺伝子型の、類似のまたは同じ条件下で調製された野生型大麦植物からの穀粒の感水性に比べて、実質的に同じ、７２時間の８ｍｌの液体を用いたインキュベーション後の発芽穀粒を、７２時間の４ｍｌの液体を用いたインキュベーション後の発芽穀粒と比較して計数することにより測定される、感水性を有する。
【0134】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有しない大麦植物の穀粒に比べて、実質的に同じ糊化温度（℃）を有する。例えば、一実施形態では、本発明は、大麦植物の穀粒を提供し、上記穀粒のデンプンは、上記変異を含まないが、それ以外は同じであり、かつ類似のまたは同じ条件下で育成された、大麦植物の穀粒のデンプンの平均糊化温度に類似である、平均糊化温度を有する。
【0135】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有しない大麦植物の穀粒に比べて、実質的に同じαアミラーゼ活性を有する。一実施形態では、本発明は、大麦植物の穀粒を提供し、上記穀粒のαアミラーゼ活性は、上記変異を含まないが、それ以外は同じであり、かつ類似のまたは同じ条件下で育成された大麦植物の穀粒のαアミラーゼ活性に類似である。別の実施形態では、本発明は、大麦植物の穀粒から調製される麦芽を提供し、上記麦芽のαアミラーゼ活性は、上記変異を含まないが、それ以外は同じであり、かつ類似のまたは同じ条件下で育成された大麦植物の穀粒から調製された麦芽のαアミラーゼ活性に類似である。
【0136】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有しない大麦植物の穀粒に比べて、実質的に同じβアミラーゼ活性を有する。一実施形態では、本発明は、大麦植物の穀粒を提供し、上記穀粒のβアミラーゼ活性は、上記変異を含まないが、それ以外は同じであり、かつ類似のまたは同じ条件下で育成された大麦植物の穀粒のβアミラーゼ活性に類似である。別の実施形態では、本発明は、大麦植物の穀粒から調製される麦芽を提供し、上記穀粒のβアミラーゼ活性は、上記変異を含まないが、それ以外は同じであり、かつ類似のまたは同じ条件下で育成された大麦植物の穀粒から調製された麦芽のβアミラーゼ活性に類似である。
【0137】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有しない大麦植物の穀粒に比べて、実質的に同じアミロペクチン鎖長分布を有する。例えば、一実施形態では、本発明は、本発明の大麦植物の穀粒は、上記変異を含まないが、それ以外は同じであり、かつ類似のまたは同じ条件下で育成された大麦植物の穀粒のアミロペクチンに比べて、同じアミロペクチン鎖長分布を有するアミロペクチンを含み得る。
【0138】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有しない大麦植物の穀粒に比べて、実質的に同じ重量を有する。特に、本発明の大麦植物の穀粒は、上記変異を含まないが、それ以外は同じであり、かつ類似のまたは同じ条件下で育成された大麦植物の平均粒重に比べて、同じ平均粒重を有し得る。
【0139】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、少なくとも４０グラム、例えば少なくとも４５グラム、例えば少なくとも５０グラム、例えば少なくとも５５グラムの千粒重を有する。
【0140】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、同じ条件下で育成される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するが、その他は同じ遺伝子型である、大麦植物の穀粒の千粒重に比べて、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の千粒重を有する。
【0141】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、少なくとも４０グラム、例えば少なくとも４５グラム、例えば少なくとも５０グラム、例えば少なくとも５５グラムの重量を有する。
【0142】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、同じ条件下で育成される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するが、その他は同じ遺伝子型である、大麦植物からの穀粒に比べて、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の粒重を有する。
【0143】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有しない大麦植物の穀粒に比べて、実質的に同じサイズを有する。好ましくは、本発明の大麦植物の穀粒は、上記変異を含まないが、それ以外は同じであり、かつ類似のまたは同じ条件下で育成された大麦植物の穀粒の粒径に比べて、同じ粒径を有し得る。
【0144】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有しない大麦植物の穀粒に比べて、実質的に同じタンパク質含量を有する。好ましくは、本発明の大麦植物の穀粒は、上記変異を含まないが、それ以外は同じであり、かつ類似のまたは同じ条件下で育成された大麦植物の穀粒のタンパク質含量に比べて、同じタンパク質含量を有し得る。
【0145】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有しない大麦植物の穀粒に比べて、実質的に同じ含水量を有する。一実施形態では、本発明の大麦植物の穀粒は、上記変異を含まないが、それ以外は同じであり、かつ類似のまたは同じ条件下で育成された大麦植物の穀粒の含水量に比べて、同じ含水量を有し得る。
【0146】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有しない大麦植物の穀粒に比べて、実質的に同じデンプン含量を有する。例えば、一実施形態では、本発明の大麦植物の穀粒は、上記変異を含まないが、それ以外は同じであり、かつ類似のまたは同じ条件下で育成された大麦植物の穀粒中のデンプンに同等であるデンプンを含む得る。
【0147】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％、例えば少なくとも６０％のデンプン含量（乾燥重量％）を有する。
【0148】
一実施形態では、本発明による大麦植物の穀粒は、同じ条件下で育成される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するが、その他は同じ遺伝子型である、大麦植物の穀粒に比べて、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％のデンプン含量を有する。
【0149】
一実施形態では、本発明による大麦植物は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有しない大麦植物の穀粒収率と同等である穀粒収率を有する。例えば、本発明の大麦植物は、一実施形態では、上記変異を含まないが、それ以外は同じであり、かつ類似のまたは同じ条件下で育成された大麦植物の穀粒収率に比べて、類似の穀粒収率を含み得る。
【0150】
一実施形態では、本発明による大麦植物は、同じ条件下で育成される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するが、その他は同じ遺伝子型である、大麦植物の穀粒収率に比べて、少なくとも８０％、例えば９０％、例えば９５％の穀粒収率を有する。
【0151】
２つ以上の変異を含む大麦植物
本発明は、大麦植物、またはその一部、ならびに上記大麦植物の生成物およびこれらを製造する方法に関し、大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異、例えば本明細書で記載のＨｖＬＤＩ遺伝子中のいずれかの変異を有する。
本発明は、大麦植物、またはその一部、ならびに上記大麦植物の生成物およびこれらを製造する方法に関し、大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異、例えば本明細書で記載のＨｖＬＤＩ遺伝子中のいずれかの変異を有する。
【0152】
ＨｖＬＤＩ遺伝子中の上記変異に加えて、本発明の大麦植物は、１つまたは複数の追加の遺伝子中に１つまたは複数の追加の変異をさらに含み得る。
【0153】
本明細書で記載のＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異に加えて、本発明の大麦植物はまた、機能的ＬＯＸ－１の完全喪失をもたらす、リポキシゲナーゼ－１（ＬＯＸ－１）（ＷＯ２００５／０８７９３４中の配列番号１またはジェンバンク受入番号ＬＣ０９９００６．１）をコードする遺伝子中の変異も含み得る。上記変異は、例えばＷＯ２００５／０８７９３４に記載のいずれかの変異であり得る。例えば大麦植物は、未成熟停止コドンを含むＬＯＸ－１をコードする遺伝子を含み得、上記コドンは、ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号２の塩基番号３５７２～３５７４またはスプライス部位変異に対応し、上記変異は、ＷＯ２００５／０８７９３４の配列番号２の塩基番号２３１１に対応する。ＬＯＸ－１の機能喪失は、このような大麦植物を用いて製造した飲料中の遊離トランス－２－ノネナール（Ｔ２Ｎ）の量を減少させる。好ましくは、Ｔ２Ｎは、４～６ｐｐｍの範囲の亜硫酸塩の存在下で、３７℃で４週間のインキュベーション後、多くても０．０５ｐｐｂである。
【0154】
本明細書で記載のＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異に加えて、本発明の大麦植物はまた、機能的ＬＯＸ－２の完全喪失をもたらす、リポキシゲナーゼ－２（ＬＯＸ－２）をコードする遺伝子中の変異も含み得る。上記変異は例えば、ＷＯ２０１０／０７５８６０に記載のいずれかの変異であり得る。例えば大麦植物は、未成熟停止コドンの形成をもたらす、ＷＯ２０１０／０７５８６０の配列番号１のヌクレオチド位置２６８９での変異を含むＬＯＸ－２をコードする遺伝子を含み得る。ＬＯＸ－２の機能の喪失は、このような大麦植物を用いて製造した飲料中の遊離トランス－２－ノネナール（Ｔ２Ｎ）の量を減少させ、特に、このような大麦植物を用いて製造された飲料中の潜在的なＴ２Ｎの量を減少させる。
【0155】
本明細書で記載のＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異に加えて、本発明の大麦植物はまた、機能的ＭＭＴの完全喪失をもたらす、メチオニンＳ－メチルトランスフェラーゼ（ＭＭＴ）（ＷＯ２０１０／０６３２８８中の配列番号１またはジェンバンク受入番号ＡＢ０２８８７０）をコードする遺伝子中の変異も含み得る。上記変異は例えば、ＷＯ２０１０／０６３２８８に記載のいずれかの変異であり得る。例えば大麦植物は、ＷＯ２０１０／０６３２８８の配列番号３の塩基番号３０７６のＧ→Ａ変異を含むＭＭＴをコードする遺伝子またはＷＯ２０１０／０６３２８８の配列番号１６の塩基番号１４６２のＧ→Ａ変異を含むＭＭＴをコードする遺伝子を含み得る。ＭＭＴの機能の喪失は、緑麦芽およびキルンドモルトならびにこのような麦芽から作られたジメチルスルフィド（ＤＭＳ）の量を低減させる。好ましくは、ＭＭＴ機能喪失大麦植物から調製される飲料は、３０ｐｐｍ未満のＤＭＳを含む。ＭＭＴの機能喪失はまた、緑麦芽およびキルンドモルトの両方、ならびにこのような麦芽から作られた飲料中のＳ－メチル－Ｌ－メチオニン（ＳＭＭ）の量を低減させる。好ましくは、ＭＭＴ機能喪失大麦植物から調製される飲料は、３０ｐｐｍ未満のＳＭＭを含む。
【0156】
本明細書で記載のＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異に加えて、本発明の大麦植物はまた、セルロースシンターゼ様Ｆ６（ＣｓｌＦ６）（ＷＯ２０１９／１２９７３６中の配列番号１またはジェンバンク受入番号ＥＵ２６７１８１．１）をコードする遺伝子中の変異も含み得、上記変異遺伝子は、低減されたＣｓｌＦ６活性を有する変異体ＣｓｌＦ６タンパク質をコードする。上記変異は例えば、ＷＯ２０１９／１２９７３６に記載のいずれかの変異であり得る。例えば大麦植物は、ＷＯ２０１９／１２９７３６の配列番号１または配列番号３のＧ８４７Ｅ変異またはＧ７４８Ｄ変異またはＴ７０９Ｉ変異を含む変異体ＣｓｌＦ６をコードするＣｓｌＦ６コード遺伝子を含み得る。低減されたＣｓｌＦ６活性を有する大麦粒は、低減された（１，３；１，４）－β－グルカン含量を有する。麦芽中の高い（１，３；１，４）－β－グルカン含量は、醸造所で濾過処理を遅らせる高粘稠水溶液を形成し、最終飲料中の望ましくない濁りの一因となる場合がある。
【0157】
本明細書で記載のＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異に加えて、本発明の大麦植物はまた、ＷＯ２０１９／１２９７３９に記載の増大したαアミラーゼ活性をもたらすいずれかの変異も含み得る。特に、本発明の大麦植物は、ＨＲＴ機能の喪失をもたらすＨｏｒｄｅｕｍ転写リプレッサー（ＨｖＨＲＴ）遺伝子（ＷＯ２０１９／１２９７３９の配列番号１または受入番号ＡＫ３６２７３４．１）中の変異を含み得る。ＨｖＨＲＴ遺伝子中の上記変異は例えば、ＷＯ２０１９／１２９７３９に記載のＨｖＨＲＴ遺伝子中のいずれかの変異であり得る。例えば大麦植物は、未成熟停止コドンを含むＨＲＴをコードする遺伝子を含み得る。ＨｖＨＲＴ遺伝子の上記変異は例えば、ＷＯ２０１９／１２９７３９の配列番号１のＨｖＨＲＴコード配列のヌクレオチド１２９３のＧ→Ａ変異であるか、および／または、それは、上記大麦植物の変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子がＷＯ２０１９／１２９７３９の配列番号２のＷ４３１ｓｔｏｐ変異を含む変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする、変異であり得る。ＨｖＨＲＴ遺伝子の上記変異はまた例えば、ＷＯ２０１９／１２９７３９の配列番号１のＨｖＨＲＴコード配列のヌクレオチド５１０のＧ→Ａ変異であるか、および／または、変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子がＷＯ２０１９／１２９７３９の配列番号２のＷ１７０ｓｔｏｐ変異を有する変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする、変異であり得る。ＨｖＨＲＴ遺伝子の上記変異はまた例えば、ＷＯ２０１９／１２９７３９の配列番号１のＨｖＨＲＴコード配列のヌクレオチド１１１３のＧ→Ａ変異であるか、および／または、それは、上記大麦植物の変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子がＷＯ２０１９／１２９７３９の配列番号２のＷ３７１ｓｔｏｐ変異を含む変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする、変異であり得る。ＨｖＨＲＴの変異は、大麦粒中のαアミラーゼを増大させ得る。麦芽製造における増大したαアミラーゼ活性は、デンプン分解および穀粒中の発酵性糖の利用能を高める。
【0158】
本明細書で記載のＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異に加えて、本発明の大麦植物はまた、ＷＯ２０１９／１２９７３９に記載の増大したαアミラーゼ活性をもたらすいずれかの変異も含み得る。特に、本発明の大麦植物は、ＨＢＬ１２機能の喪失に繋がるＨｖＨＢＬ１２遺伝子（ＷＯ２０１９／１２９７３９の配列番号５および受入番号ＡＫ３７６９５３．１およびＡＫ３６１２１２．１）中の変異を含み得る。ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中の上記変異は例えば、ＷＯ２０１９／１２９７３９に記載のＨｖＨＢＬ１２遺伝子中のいずれかの変異であり得る。例えば大麦植物は、少なくともｉ）ＷＯ２０１９／１２９７３９中の配列番号６のアミノ酸２６～７９；またはｉｉ）ＷＯ２０１９／１２９７３９中の配列番号６のアミノ酸８１～１２２；またはｉｉｉ）ＷＯ２０１９／１２９７３９中の配列番号６のアミノ酸２２８～２５０、を欠く、変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子をコードする遺伝子を含み得る。同じ変異は、ＷＯ２０１９／１２９７３９の配列番号の多型の１つ、すなわち多型Ｎ１４１Ｄ、Ｍ１４２ＶまたはＥ１８４Ｄで起こり得る。あるいは、大麦植物は、ＨｖＨＤＬ１２遺伝子中に未成熟停止コドンを含み得る。特に、上記大麦植物は、ＷＯ２０１９／１２９７３９の配列番号５のＨｖＨＢＬ１２コード配列のヌクレオチド６８４のＧ→Ａ変異または上述のその多型を含み得、これは、ＷＯ２０１９／１２９７３９中の配列番号６のＷ２２８ｓｔｏｐ変異を含む変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする。ＨｖＨＢＬ機能を欠く大麦粒は、より高いαアミラーゼ活性を有することが示された。
【0159】
本明細書で記載のＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異に加えて、本発明の大麦植物はまた、ＷＯ２０１９／１２９７３９に記載の増大したαアミラーゼ活性をもたらすいずれかの変異も含み得る。特に、本発明の大麦植物は、ＷＫＲＹ３８機能の喪失に繋がるＷＫＲＹ３８遺伝子（ＷＯ２０１９／１２９７３９の配列番号１０またはＮＣＢＩ受入番号ＡＪ５３６６６７．１またはＡＫ３６０２６９．１またはＡＹ５４１５８６．１）中の変異を含み得る。ＷＫＲＹ３８遺伝子の上記変異は例えば、ＷＯ２０１９／１２９７３９に記載のＷＫＲＹ３８遺伝子中のいずれかの変異であり得る。特に、上記大麦植物は、ＷＯ２０１９／１２９７３９の配列番号１０のＨｖＷＲＫＹ３８コード配列のヌクレオチド６００のＧ→Ａ変異を含み得る。ＷＫＲＹ３８機能を欠く大麦粒は、より高いαアミラーゼ活性を有することが示された。
【0160】
本明細書で記載のＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異に加えて、本発明の大麦植物はまた、Ｈｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２ ｏｒ Ｊｅｎｄｅ－Ｓｔｒｉｄ，１９９３により記載のいずれかのａｎｔ変異などの、アントシアニンおよびプロアントシアニジン不含変異体（ａｎｔ変異）を含み得る。特に、ａｎｔ変異は、Ｈｖｍｙｂ１０遺伝子（ジェンバンク受入番号ＡＢ６４５８４４）の変異、例えばＨｖｍｙｂ１０の非同義変異、好ましくはａｎｔ２８変異中で見つかるＨｖｍｙｂ１０遺伝子中のいずれかの変異であり得る。従って、ａｎｔ変異は、野生型Ｈｖｍｙｂ１０のヌクレオチド５１のＧ→Ａ変異、またはＨｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２に記載の、野生型Ｈｖｍｙｂ１０のコード領域のヌクレオチド５５８のＧ→Ａ変異であり得る。特に、ａｎｔ２８変異は、穀粒休眠状態の低減されたレベルを有する。
【0161】
本発明の大麦植物はまた、前述の追加の変異の組み合わせも含み得る。遺伝子変異の可能な組み合わせを下表に示す。この表は、異なる大麦植物の８つの例を示し、「Ｍｕｔ」は、示された遺伝子中に本明細書で記載のいずれかの変異を含む植物を示す。
【表3】
【0162】
特に記載されるのは、本発明のＬＤＩ変異およびＬＯＸ－１およびＭＭＴおよびＭｙｂ１０（上記表の第一行に例１として示される）の機能喪失型変異を有する大麦植物、ならびに本発明のＬＤＩ変異およびＬＯＸ－１およびＭＭＴおよびＣｓｌＦ６およびＭｙｂ１０中の機能喪失型変異（上記表の第２行に例２として示される）を有する大麦植物である。
【0163】
２つ以上の変異を含む大麦植物は、任意の有用な方法により製造され得る。例えば、上記１つまたは複数の追加の変異が、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物中に導入され得る、あるいは、本明細書に記載されたＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異が、すでに追加の変異を有する大麦植物中に導入され得る。特定の所望の変異を有する大麦植物が調製され、特定の変異を特定するように設計されたプライマーおよびプローブを用いて基本的にＷＯ２０１８／００１８８４で記載されるように特定され得る。
【0164】
あるいは、上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物を１つまたは複数の追加の変異を有する大麦植物、例えば国際公開第２００５／０８７９３４号、国際公開第２０１０／０７５８６０号、国際公開第２０１０／０６３２８８号，ＷＯ２０１９／１２９７３６もしくはＷＯ２０１９／１２９７３９またはＨｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２に記載の、またはそれらに関連して寄託されたいずれかの、大麦植物と交雑させることにより調製され得る。
【0165】
植物生成物
本発明はまた、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物、例えば本明細書で記載のいずれかの大麦植物、またはその一部から調製された植物生成物も提供する。
植物生成物は、大麦植物から調製された任意の生成物、例えば食品、飼料または飲料であり得る。従って植物生成物は、本明細書の下記セクション「飲料およびその製造方法」で記載のいずれかの飲料であり得る。植物生成物はまた、大麦植物および／または上記大麦植物の麦芽の水性抽出物であり、例えば植物生成物は、麦汁であり得る。上記水性抽出物は例えば、本明細書の下記セクション「水性抽出物およびその製造方法」で記載のように調製され得る。
本発明はまた、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物、例えば本明細書で記載のいずれかの大麦植物、またはその一部から調製された植物生成物も提供する。
植物生成物は、大麦植物から調製された任意の生成物、例えば食品、飼料または飲料であり得る。従って植物生成物は、本明細書の下記セクション「飲料およびその製造方法」で記載のいずれかの飲料であり得る。植物生成物はまた、大麦植物および／または上記大麦植物の麦芽の水性抽出物であり、例えば植物生成物は、麦汁であり得る。上記水性抽出物は例えば、本明細書の下記セクション「水性抽出物およびその製造方法」で記載のように調製され得る。
【0166】
一実施形態では、植物生成物は、麦芽、例えば、本明細書の下記セクション「麦芽およびその製造製方法」で記載のいずれかの麦芽または麦芽系飲料などの、麦芽系生成物であり得る。麦芽の主要用途は飲料製造用であるが、それはまた、他の産業工程で、例えば製パン工業で酵素源として、または食品産業で香味剤および着色剤として、例えば麦芽または麦芽粉末の形態で、または麦芽シロップとして間接的に、等々で利用できる。従って、本発明による植物生成物は、いずれかの上述の生成物であり得る。
【0167】
別の態様では、本発明による植物生成物は、大麦シロップ、または大麦麦芽シロップなどのシロップを含む、あるいはこれからなる。植物生成物はまた、大麦または麦芽の抽出物であり得る。従って、植物生成物は、麦汁であり得る。
【0168】
麦芽およびその製造の方法
本発明はまた、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物、例えば本明細書で記載のいずれかの大麦植物から調製された麦芽も提供する。
本発明はまた、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物、例えば本明細書で記載のいずれかの大麦植物から調製された麦芽も提供する。
【0169】
麦芽は、製麦、すなわち制御された環境条件下で起こる過程における浸漬大麦粒の発芽により調製され得る。発芽は任意選択で、乾燥ステップが続いてよい。上記乾燥ステップは好ましくは、高温での発芽穀粒のキルン乾燥であり得る。
【0170】
従って、本発明による製麦方法は好ましくは、下記ステップを含み得る：
ａ）本発明の大麦植物の穀粒、またはその一部を用意するステップ；
ｂ）所定の条件下で上記穀粒を浸麦し、発芽させるステップ；
ｃ）任意選択で、上記発芽穀粒を乾燥するステップ。
ａ）本発明の大麦植物の穀粒、またはその一部を用意するステップ；
ｂ）所定の条件下で上記穀粒を浸麦し、発芽させるステップ；
ｃ）任意選択で、上記発芽穀粒を乾燥するステップ。
【0171】
本発明の大麦は、緑麦芽工程、すなわち麦芽がマッシング前にキルン乾燥されない工程に特に好適である。本発明の大麦はまた、高い限界デキストリナーゼレベルに起因して、短時間製麦工程、例えば以下に記載の工程に特に好適である。
ａ）一実施形態では、麦芽は、次の工程により調製される：任意選択で清浄化されている大麦粒が、水溶液中（好ましくは水中）で、４～２４時間の範囲、好ましくは５～１５時間、より好ましくは５～１０時間の範囲の期間にわたり浸麦（インキュベーション）される。この期間中、穀粒を含む水溶液は、通気される。通気は、水溶液中の酸素レベルを上昇させ、および／または大麦粒をほぐしおよび／または大麦粒中の乾燥ポケットを回避するのに役立つ。浸麦は、任意の有用な温度で、好ましくは２０～２８℃の範囲の温度で、より好ましくは約２５℃の温度で実施され得る。
ｂ）水溶液を排水し、穀粒を、５～３０時間の範囲の間、好ましくは８～２４時間の範囲の間、より好ましくは８～１６時間の範囲の間エアレストに供する。好ましくは、穀粒は、エアレスト中通気される。好ましくは、２０～２８℃の範囲の一定温度が、例えば通気に使用されるガスの温度を制御することにより、発芽穀粒中に維持される。
ｃ）大麦粒が、例えば、穀粒を混合するために、通気しながら２～２４時間の範囲の間、好ましくは２～１５時間の範囲の間、より好ましくは２～１０時間の範囲の間、水溶液中でインキュベートされる。好ましくは水は、２０～２８℃の範囲の温度、例えば約２５℃で保持される；および
ｄ）水溶液を排水し、穀粒を、５～３０時間の範囲の間、好ましくは８～２０時間の範囲の間エアレスト段階に供する。好ましくは、温度は、例えば通気に使用されるガスの温度を制御することにより、２０～２８℃の範囲の温度で保持される。
ｅ）発芽工程は好ましくは、４８～７２時間以内に、好ましくは４８～６０時間以内に、さらに好ましくは４８～５６時間以内に完了される。好ましくは、発芽穀粒は、ステップａ後の全工程を通して、少なくとも２０％の含水量を有する。発芽穀粒は、以降の工程で、緑麦芽として直接用いられてよい。
ａ）一実施形態では、麦芽は、次の工程により調製される：任意選択で清浄化されている大麦粒が、水溶液中（好ましくは水中）で、４～２４時間の範囲、好ましくは５～１５時間、より好ましくは５～１０時間の範囲の期間にわたり浸麦（インキュベーション）される。この期間中、穀粒を含む水溶液は、通気される。通気は、水溶液中の酸素レベルを上昇させ、および／または大麦粒をほぐしおよび／または大麦粒中の乾燥ポケットを回避するのに役立つ。浸麦は、任意の有用な温度で、好ましくは２０～２８℃の範囲の温度で、より好ましくは約２５℃の温度で実施され得る。
ｂ）水溶液を排水し、穀粒を、５～３０時間の範囲の間、好ましくは８～２４時間の範囲の間、より好ましくは８～１６時間の範囲の間エアレストに供する。好ましくは、穀粒は、エアレスト中通気される。好ましくは、２０～２８℃の範囲の一定温度が、例えば通気に使用されるガスの温度を制御することにより、発芽穀粒中に維持される。
ｃ）大麦粒が、例えば、穀粒を混合するために、通気しながら２～２４時間の範囲の間、好ましくは２～１５時間の範囲の間、より好ましくは２～１０時間の範囲の間、水溶液中でインキュベートされる。好ましくは水は、２０～２８℃の範囲の温度、例えば約２５℃で保持される；および
ｄ）水溶液を排水し、穀粒を、５～３０時間の範囲の間、好ましくは８～２０時間の範囲の間エアレスト段階に供する。好ましくは、温度は、例えば通気に使用されるガスの温度を制御することにより、２０～２８℃の範囲の温度で保持される。
ｅ）発芽工程は好ましくは、４８～７２時間以内に、好ましくは４８～６０時間以内に、さらに好ましくは４８～５６時間以内に完了される。好ましくは、発芽穀粒は、ステップａ後の全工程を通して、少なくとも２０％の含水量を有する。発芽穀粒は、以降の工程で、緑麦芽として直接用いられてよい。
【0172】
一実施形態では、上記麦芽は、通気下の水中で、キルン乾燥なしで穀粒のインキュベーションを伴う方法により調製され得る。このような麦芽は、本明細書では「フレックスモルト」とも呼ばれる。特に、フレックスモルトは、ＷＯ２０１８／００１８８２およびＷＯ２０１９／１２９７２４に記載のように調製され得る。特に、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／００１８８２中のセクション「発芽」ページ１４～ページ２２、「熱処理」ページ２２～ページ２４、および「実施例１」ページ５６～ページ５７、ならびにＷＯ２０１９／１２９７２４中の「発芽」ページ１４～ページ２２、「熱処理」ページ２２～ページ２４、および「実施例１」ページ５６～ページ５７に記載のように調製され得る。
「フレックスモルト」を調整する方法は、本明細書の以下の実施例５に記載される。
「フレックスモルト」を調整する方法は、本明細書の以下の実施例５に記載される。
【0173】
発芽は通常、１５％未満の含水量の大麦粒が発芽を開始するのに十分な水と接触する時点などの、穀粒が水と接触する時点で開始される。
【0174】
一実施形態では、発芽は、穀粒が、その間に穀粒含水量が上昇される異なる時間にわたり種々のレベルの大気で下から通気されると、開始される。
【0175】
本発明の大麦植物の穀粒は、発芽過程が短縮される場合に特に有用であることを示した。従って、本発明の大麦植物の穀粒は実際に、発芽時間が短縮される製麦方法で有用である。一実施形態では、本発明の穀粒の浸麦および発芽のステップは、多くても３日間などの、多くても４日間で実施される。
【0176】
別の実施形態では、麦芽は、従来の製麦により調製され、浸麦過程および発芽過程は、２つの別々のステップで実施される。従って、浸麦は、当業者に既知の任意の従来法により実施され得る。非限定的一例は、乾湿交互条件下、１０～２５℃の範囲の温度での浸麦を含む。浸麦中に、例えば、穀物粒は、３０分～３時間の範囲の間湿潤下で、続いて３０分～３時間の範囲の間乾燥下でインキュベーションされ、任意選択で、２～５時間の範囲で上記インキュベーションスキームを反復し得る。浸麦後の最終含水量は、例えば、４０～５０％の範囲であり得る。穀粒の発芽は、当業者に既知の任意の従来法により実施され得る。非限定的一例は、乾湿交互条件下、１０～２５℃の範囲の温度で、任意選択で１～６日の範囲で温度を変えての発芽を含む。
【0177】
任意選択で、キルン乾燥は、少なくとも７５℃などの従来の温度、８０～８５℃などの、例えば８０～９０℃の範囲の温度で行われ得る。
【0178】
従って、麦芽は、例えば、Ｈｏｕｇｈら（１９８２）により記載のいずれかの方法により製造され得る。しかし、限定されないが、麦芽を焙焼する方法を含む、特殊麦芽の製造のための方法などの、麦芽を製造するための任意の他の好適な方法も、本発明で使用され得る。
【0179】
麦芽は、例えば粉砕により、さらに処理され得る。従って、本発明による植物生成物は、任意の種類の麦芽、例えば、未処理麦芽または粉末などの粉砕麦芽であり得る。粉砕麦芽およびその粉末は、麦芽および再発芽の能力を欠く死細胞の化学成分を含む。
【0180】
粉砕は、乾燥状態で実施され、すなわち麦芽は、乾燥の間に粉砕され得るか、または湿潤状態で実施され、すなわち麦芽は、湿潤の間に粉砕され得る。
【0181】
本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物、またはその一部から調製された麦芽の利点は、上記麦芽が、ＨｖＬＤＩ変異がないが他の点では同じ遺伝子型である野生型大麦植物からの麦芽に比べて、高いレベルの遊離ＨｖＬＤ活性を有することである。高レベルの遊離ＨｖＬＤ活性は、いくつかの理由から、麦芽を好都合にする。増大された遊離ＨｖＬＤ活性は、製麦過程に有用であり、発芽時間が短縮される。特に図３は、本発明の大麦（ＨＥＮＺ－１６ａおよび３１）からの麦芽がフレックスモルト過程で使用されるた場合、限界デキストリナーゼの遊離／総比率がフレックスモルト過程のＨＥＮＺバリアントで６１．６および５６．３％で、従来の過程によるＰａｕｓｔｉａｎの５０％よりさらに改善される点で、従来の製麦過程でのＰａｕｓｔｉａｎなどの野生型大麦（図４）より優れていることを示す。さらに、増大した遊離ＨｖＬＤ活性は、デンプンの発酵性糖への分解の増大をもたらし、従って、上記大麦植物からの穀粒および／または麦芽から調製される麦汁は、より高い含量の発酵性糖を特徴とし得る。従って、本発明の麦芽を使用することにより、マッシング中の外来性の限界デキストリナーゼまたはプルラナーゼの添加の必要性は、低減されるか、あるいは完全に無くされ得る。さらに、高含量の発酵性糖を含む水性抽出物の発酵は、醸造中有益である。理由は、それが、使われる穀粒量当たり生産されるビールの量を増大させ、粒重当たりのＡＢＶ％（アルコール体積％）／ヘクトリットルを高めるためである。
【0182】
水性抽出物およびその製造の方法
本発明は、大麦系飲料ならびにそれを調製する方法を提供し、大麦植物は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する。
本発明は、大麦系飲料ならびにそれを調製する方法を提供し、大麦植物は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する。
【0183】
多くの場合、大麦系飲料を調製するための方法は、本発明の大麦植物の穀粒および／または本発明の大麦植物から調製される麦芽および任意選択の１種または複数の補助剤の水性抽出物を調製するステップを含む。
【0184】
一実施形態では、水性抽出物は、本発明の大麦植物の穀粒および／または本発明の大麦植物から調製される麦芽から調製される。別の実施形態では、水性抽出物は、本発明の大麦植物の穀粒および／または本発明の大麦植物から調製される麦芽および野生型大麦植物の穀粒および／または野生型大麦植物の穀粒から調製される麦芽および任意選択の１種または複数の補助剤の混合物から調製される。いくつかの実施形態では、水性抽出物を調製するために使用される大麦粒および／または麦芽の、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも１００％は、本発明による大麦植物の大麦粒または本発明の大麦植物および任意選択の１種または複数の補助剤から調製される麦芽であり得る。
【0185】
一実施形態では、水性抽出で使用される麦芽は、「麦芽およびその製造方法」セクションで記載の緑麦芽またはフレックスモルトであり、特に緑麦芽は、湿潤状態で粉砕される。特に、緑麦芽／フレックスモルトは決して、粉砕およびマッシングの前に、２０％未満の含水量を持たず、かつ焙燥工程に供されなかった。
【0186】
水性抽出物は通常、水中でまたは水溶液中で大麦粉および／または麦芽粉をインキュベーションすることにより調製され得る。特に、水性抽出物は、マッシングにより調製され得る。
【0187】
一般に、上記水溶液は、水道水などの水であってよく、これに対し１種または複数の追加の薬剤が添加され得る。追加の薬剤は、開始時から水溶液中に存在し得るか、または水性抽出物を調製する過程で添加され得る。上記追加の薬剤は、酵素であってよい。従って、水溶液は、１種または複数の酵素を含み得る。上記酵素は、開始時から水溶液中に加えられるか、または開始後、工程中に添加され得る。
【0188】
上記酵素は、例えば、１種または複数の加水分解酵素であり得る。好適な酵素は、リパーゼ、デンプン分解酵素（例えば、アミラーゼ）、グルカナーゼ［好ましくは（１－４）－および／または（１，３；１，４）－β－グルカナーゼ］、および／またはキシラナーゼ（例えば、アラビノキシラナーゼ）、および／またはプロテアーゼ、または１種または複数の上述の酵素を含む酵素混合物、例えば、Ｃｅｒｅｆｌｏ、Ｕｌｔｒａｆｌｏ、またはＯｎｄｅａ Ｐｒｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）を含む。例えば、水溶液は、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、限界デキストリナーゼ、プルラナーゼ、β－グルカナーゼ（例えば、エンド－（１，３；１，４）－β－グルカナーゼまたはエンド－１，４－β－グルカナーゼ）、キシラナーゼ（例えば、エンド－またはエキソ－１，４－キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼまたはフェルラ酸エステラーゼ）、グルコアミラーゼおよびプロテアーゼからなる群より選択される１種または複数の加水分解酵素を含み得る。
【0189】
本発明の大麦植物の１つの利点は、上記大麦植物の穀粒中または上記大麦植物から調製された麦芽中の高遊離ＨｖＬＤ活性の量である。ときには、大麦粒および／または麦芽をマッシングする場合、限界デキストリナーゼまたはα－１，６結合の加水分解を触媒できる他の酵素、例えばプルラナーゼを、アミロペクチン由来分岐デキストリンから直鎖デキストリンを放出することによりデンプンの加水分解を進行させるために、添加することもある。従って、外来性の限界デキストリナーゼまたはプルラナーゼの必要性が少なくなり、あるいは無くなり、かつ抽出物中の適切なレベルの発酵性糖を依然として得ることができることは、本発明の利点の１つである。本発明のいくつかの実施形態では、外来性の限界デキストリナーゼまたはプルラナーゼの添加なしに水性抽出物を調製することも可能である。
【0190】
好ましくは食品等級品質の、上記追加の薬剤は、塩、例えばＣａＣｌ２または酸、例えばＨ３ＰＯ４であってよい。
【0191】
水性抽出物は通常、１種または複数の所定温度での水溶液中の大麦粉および／または麦芽粉のインキュベーションにより調製される。上記所定の温度は、本明細書では「マッシング温度」とも呼ばれ得る。上記マッシング温度は例えば、マッシングに使用される従来の温度であってよい。マッシング温度は通常、一定に保持される（等温マッシング）か、または徐々に、例えば順次に段階的に高められる。いずれの場合でも、大麦粒および／または麦芽中の可溶性物質は、上記マッシング溶液中に放出され、それにより水性抽出物を形成する。
【0192】
マッシング温度は通常、４０～８５℃の範囲などの、３０～９０℃の範囲、例えば５０～８５℃の範囲の温度である。特に、比較的低い仕込み開始温度、例えば５０～６０℃の範囲の温度が、使用され得る。
【0193】
例えばマッシング容器の水溶液中のインキュベーションの後で、水溶液は、別の容器、例えば麦芽汁濾過機に移され、高温で追加の時間インキュベーションされ得る。
【0194】
有用なマッシングプロトコルの非限定的例は、醸造の文献、例えば、Ｈｏｕｇｈら（前出）で見つけることができる。
【0195】
マッシング（すなわち、水溶液中の大麦粉および／または麦芽粉のインキュベーション）は、補助剤の存在下で起こり、これは、麦芽以外の任意の炭水化物源、例えば限定されないが、大麦、大麦シロップ、またはトウモロコシ、または米を、全粒または粗挽き穀物粉、シロップまたはデンプンなどの処理生成物として含むと理解される。すべての上述の補助剤は主として、追加の抽出物源として使用され得る（シロップは通常、麦汁加熱中に加えられる）。醸造所での補助剤の処理のための要件は、使われる補助剤の状態とタイプ、特にデンプン糊化または液化温度に依存する。
【0196】
水溶液中でインキュベーション後に、水性抽出物は通常、例えば濾過により水性抽出物と残留非溶解固体粒子とに分離され、後者は「ビール粕」とも表記され得る。濾過は例えば、麦芽汁濾過機中で実施され得る。あるいは、濾過は、マッシュフィルターを通す濾過であり得る。こうして得られた水性抽出物は、「第一麦汁」とも表記される。水などの追加の液体を、スパージングとも表記される工程中にビール粕に加え得る。スパージングおよび濾過の後で、「第二麦汁」が得られ得る。さらなる麦汁は、この手順の反復により調製され得る。従って、水性抽出物は、麦汁、例えば第一麦汁、第二麦汁、さらなる麦汁またはこれらの組み合わせであり得る。
【0197】
本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物から調製された水性抽出物の１つの利点は、それらが高レベルの発酵性糖を含むことであり得る。
【0198】
一実施形態では、本発明による大麦植物の殻粒および／または麦芽から調製された上記水性抽出物は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の水性抽出物に比べて、増大した濃度の総発酵性糖を有する。
【0199】
別の実施形態では、本発明による大麦植物から調製された麦芽から調製された上記水性抽出物は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の水性抽出物に比べて、少なくとも５％多い総発酵性糖、例えば少なくとも６％多い総発酵性糖、例えば少なくとも７％多い総発酵性糖を有する。
【0200】
別の実施形態では、本発明による大麦植物から調製された麦芽から調製された上記水性抽出物は、同一条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の水性抽出物に比べて、少なくとも１０％多いグルコース、フルクトースおよび／またはマルトトリオースを有する。
【0201】
飲料およびその製造の方法
本発明はまた、大麦系飲料およびこのような飲料を製造する方法を提供し、大麦植物は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する。
本発明はまた、大麦系飲料およびこのような飲料を製造する方法を提供し、大麦植物は、本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する。
【0202】
上記飲料は、アルコール性大麦系飲料または非アルコール性大麦系飲料であり得る。アルコール性大麦系飲料は例えば、ビールまたは醸造アルコールであり得る。
【0203】
上記ビールは、任意の種類のビール、例えばラガーまたはエールであり得る。従って、ビールは例えば、アルトビール、アンバーエール、バーレイワイン、ベルリーナー・ヴァイセ、ビエールドギャルド、ビター、ブロンドエール、ボック、ブラウン・エール、カリフォルニアコモン、クリーム・エール、ドルトムンダーエクスポート、ドッペルボック、デュンケル、デュンケルバイツェン、アイスボック、フルーツランビック、ゴールデンエール、ゴーゼ、グーズ、ヘーフェヴァイツェン、ヘレス、インディア・ペールエール、ケルシュ、ランビック、ライトエール、マイボック、モルト・リカー、マイルド、メルツェンビア、オールドエール、オード・ブライン、ペールエール、ピルスナー、ポーター、レッドエール、ロッゲンビア、セゾン、スコッチエール、スチームビール、スタウト、シュヴァルツビール、ラガー、ウィットビア、ヴァイスビアおよびヴァイツェンボックからなる群より選択され得る。ビールはまた、低アルコールまたは非アルコール性ビール（「ノンアルコールビール」またはａｆｂとしても知られる）である。
【0204】
上記醸造アルコールは、任意の種類の醸造アルコールであってよい。特に、醸造アルコールは、穀類、例えば麦芽化穀類、例えば大麦麦芽ベースであり得る。このような醸造アルコールの非限定的例は、ウイスキーおよびウォッカを含む。
【0205】
飲料は、非アルコール性飲料、例えば非アルコール性大麦系飲料、例えば非アルコール性ビールまたはマルチナまたはｎｏｕｓｓｙなどの、非アルコール性麦芽飲料であり得る。
飲料は例えば、次のステップを含む方法により調製され得る：
ａ．本発明による大麦植物の穀粒および／または本発明による大麦植物の穀粒から調製された麦芽および／または本発明による大麦植物の穀粒および／または麦芽から調製された水性抽出物を用意するステップ；
ｂ．上記水性抽出物を飲料に処理するステップ。
飲料は例えば、次のステップを含む方法により調製され得る：
ａ．本発明による大麦植物の穀粒および／または本発明による大麦植物の穀粒から調製された麦芽および／または本発明による大麦植物の穀粒および／または麦芽から調製された水性抽出物を用意するステップ；
ｂ．上記水性抽出物を飲料に処理するステップ。
【0206】
水性抽出物は、ホップを含有して含有せずに煮沸され得、これはその後、煮沸麦汁と呼ばれることもある。第一の、第二のおよびさらなる麦汁を組み合わせ、その後、煮沸に供し得る。水性抽出物は、任意の好適な時間、例えば６０分～１２０分の範囲で煮沸され得る。
【0207】
ステップ（ａ）は特に、例えば麦汁の発酵による、上記水性抽出物の発酵を含む。従って、飲料は、酵母を用いた水性抽出物の発酵により調製され得る。
【0208】
水性抽出物が調製されると、それは、従来の醸造方法を含む任意の方法により、ビールへと処理され得る。好適な醸造方法の例の非限定的記載は、例えば、Ｈｏｕｇｈら（１９８２）による報告で見つけることができる。多くの定期的に更新される大麦生成物およびビール生成物の分析方法は、例えば、限定されないが、米国穀物化学者学会（１９９５）、米国醸造化学者学会（１９９２）、欧州醸造学会（１９９８）、および英国醸造協会（１９９７）から入手できる。多くの特定の手順が、特定の醸造所に採用され、現地の消費者の好みにより最も大きく変化することがわかっている。いずれかのこのようなビール製造方法を、本発明で用い得る。
【0209】
水性抽出物からのビール製造の第１のステップは好ましくは、本明細書で上記したように上記水性抽出物を煮沸すること、それに続く冷却段階および任意選択のワールプールレストを含む。１種または複数の追加の化合物、例えば下記セクション「追加の化合物」に記載の１種または複数の追加の化合物を、水性抽出物に加えてもよい。冷却後、水性抽出物を、酵母、ビール酵母または出芽酵母などの、例えば醸造酵母を含む発酵タンクに移し得る。水性抽出物は、任意の好適な期間、１～１０日間などの、通常は１～２０日間にわたり発酵され得る。発酵は、任意の有用な温度、例えば１０～２０℃の範囲の温度で実施される。方法はまた、１種または複数の酵素の添加を含み得、例えば１種または複数の酵素が、発酵の前にまたは発酵中に麦汁に添加され得る。特に、上記酵素は、プロリン特異的エンドプロテアーゼであり得る。プロリン特異的エンドプロテアーゼの非限定的例は、ＤＳＭから入手可能な「Ｂｒｅｗｅｒ’ｓ Ｃｌａｒｅｘ」である。他の実施形態では、外来性の酵素は、これらの方法中に添加されない。
【0210】
数日間の長さの発酵工程中、糖は、アルコールおよびＣＯ２に同時に転換され、いくつかの香味物質が発生する。発酵は、任意の望ましい時間に、例えば％Ｐのさらなる低下が観察されなくなると、終了され得る。
【0211】
その後、ビールは、さらに処理され、例えば冷却され得る。それはまた、濾過されおよび／またはラガーにするため貯蔵される－この工程は心地よい香りおよびそれほど酵母様でない風味を発生させる。添加物もまた、添加されてよい。さらに、ＣＯ２が添加され得る。最終的に、ビールは、低温殺菌されおよび／または濾過され、その後包装され得る（例えば、容器またはビア樽に移される、瓶詰、または缶詰にされる）。ビールはまた、標準的な方法で低温殺菌され得る。
【0212】
追加の化合物
本発明の方法は、１種または複数の追加の化合物を加えるステップを含み得る。上記追加の化合物は例えば、風味化合物、保存剤、機能性成分、着色料、甘味剤、ｐＨ調整剤または塩であり得る。ｐＨ調整剤は例えば、緩衝剤またはリン酸などの酸であり得る。
本発明の方法は、１種または複数の追加の化合物を加えるステップを含み得る。上記追加の化合物は例えば、風味化合物、保存剤、機能性成分、着色料、甘味剤、ｐＨ調整剤または塩であり得る。ｐＨ調整剤は例えば、緩衝剤またはリン酸などの酸であり得る。
【0213】
機能性成分は、所与の機能を得るために添加される任意の成分であり得る。好ましくは、機能性成分は、飲料をより健康によいものにする。機能性成分の非限定例としては、ビタミンまたはミネラルが挙げられる。
【0214】
保存剤は、任意の食品等級保存剤であり、例えばそれは、安息香酸、ソルビン酸、ソルビン酸塩（例えば、ソルビン酸カリウム）、亜硫酸および／またはその塩であり得る。
【0215】
追加の化合物はまた、ＣＯ２であり得る。特に、ＣＯ２は、炭酸飲料を得るために添加され得る。
【0216】
本発明で使用される香味化合物は、任意の有用な香味化合物であり得る。香味化合物は例えば、芳香剤、植物抽出物、植物濃縮物、植物部分およびハーブ浸剤からなる群より選択され得る。特に、風味化合物は、ホップであり得る。
【0217】
本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物を調製する方法
本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物は、任意の有用な方法で調製され得る。
例えば、このような大麦植物は、次のステップを含む方法により調製できる：
ａ．大麦粒を用意するステップ；および
ｂ．上記大麦粒をランダム変異誘発に供するステップ；
ｃ．下記変異の１つを有する変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする変異ＨｖＬＤＩ遺伝子を有する大麦粒またはその一部を選択するステップ；
ｉ．ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中でＰｒｏから異なるアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、ループ領域が、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸に対応する、ミスセンス変異；または
ｉｉ．野生型ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中で酸性アミノ酸から非酸性アミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、アルファヘリックス領域が、配列番号１のアミノ酸４５～５５およびアミノ酸６３～７６およびアミノ酸７９～９０およびアミノ酸１１２～１２３に対応する、ミスセンス変異。
本発明のＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物は、任意の有用な方法で調製され得る。
例えば、このような大麦植物は、次のステップを含む方法により調製できる：
ａ．大麦粒を用意するステップ；および
ｂ．上記大麦粒をランダム変異誘発に供するステップ；
ｃ．下記変異の１つを有する変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする変異ＨｖＬＤＩ遺伝子を有する大麦粒またはその一部を選択するステップ；
ｉ．ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中でＰｒｏから異なるアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、ループ領域が、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸に対応する、ミスセンス変異；または
ｉｉ．野生型ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中で酸性アミノ酸から非酸性アミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、アルファヘリックス領域が、配列番号１のアミノ酸４５～５５およびアミノ酸６３～７６およびアミノ酸７９～９０およびアミノ酸１１２～１２３に対応する、ミスセンス変異。
【0218】
このような方法はまた、それぞれ上記変異を含む複数の大麦植物／穀粒を得るために、上記大麦植物／大麦粒を複製する１つまたは複数のステップも含み得る。
特に、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に特定の変異を有する大麦植物が調製され、ＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を特定するように設計されたプライマーおよびプローブを用いて、ＷＯ２０１８／００１８８４で記載されるように基本的に特定され得る。ＨｖＬＤＩの遺伝子配列は、配列番号２のコード配列を用いて、公開データベースからｂｌａｓｔ探索により検索できる、またはそれは、ジェンバンク受入番号ＤＱ２８５５６４．１で見つけ得る。
特に、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に特定の変異を有する大麦植物が調製され、ＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を特定するように設計されたプライマーおよびプローブを用いて、ＷＯ２０１８／００１８８４で記載されるように基本的に特定され得る。ＨｖＬＤＩの遺伝子配列は、配列番号２のコード配列を用いて、公開データベースからｂｌａｓｔ探索により検索できる、またはそれは、ジェンバンク受入番号ＤＱ２８５５６４．１で見つけ得る。
【0219】
ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物もまた、種々の部位特異的変異誘発法を用いて調製され、これは例えば、配列番号２のコード配列の配列に基づいて設計できる。一実施形態では、大麦植物は、ＷＯ２０１７／１３８９８６に記載されるようにＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ、およびＤＮＡ切断抗生物質のいずれか１つを用いて調製される。一実施形態では、大麦植物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使って、例えばＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使って調製される。これは、シングルガイドＲＮＡ配列がＨｖＬＤＩの遺伝子配列に基づき設計されること以外は、Ｌａｗｒｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）１６：２５８；ＤＯＩ １０．１１８６／ｓ１３０５９－０１５－０８２６－７に記載のようにして実施され得る。一実施形態では、大麦植物は、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９両方の技術の組み合わせを使って、例えばＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使って調製される。これは、ＴＡＬＥＮおよびシングルガイドＲＮＡ配列が本明細書で提供される遺伝子配列に基づき設計されること以外は、Ｈｏｌｍｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７に記載のようにして実施し得る。
【0220】
一実施形態では、大麦植物は、ＤＮＡ切断ヌクレアーゼとドナーＤＮＡフラグメントの組み合わせである、相同組み換え修復を用いて調製される。これは、ＤＮＡ切断ヌクレアーゼが本明細書で提供される遺伝子配列に基づいて設計されかつドナーＤＮＡフラグメントが本明細書で提供される変異大麦バリアントのコード配列に基づき設計されること以外は、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６に記載のようにして実施され得る。
【0221】
本発明の一実施形態では、目的は、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する農学的に有用な大麦植物を提供することである。ＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異に加えて、商業的大麦変種生成の技術分野において、製麦および／または醸造にとって、および／または飲料のための基礎として有用であると考えられ得る追加の因子、例えば穀粒収率およびサイズ、ならびに製麦性能または醸造性能に関連する他のパラメーターが存在する。全てではないにしても多くの関連形質は遺伝的制御下にあることが示されているので、本発明はまた、本報告で開示される大麦植物との交雑により調製され得る、最新のホモ接合高収率製麦栽培品種を提供する。熟練大麦品種改良家は、他の大麦植物と交雑後、優れた栽培品種を生ずる大麦植物を選択し、発生させることができる。あるいは、品種改良家は、本発明の植物を、ＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異に加えて追加の変異を有する新規栽培品種を生成するためのさらなる変異誘発のために利用し得る。
【0222】
本発明はまた、自家受粉、戻し交雑、集団に対する交雑、などの方法を含む植物育種法により調製された、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有する大麦植物も含む。戻し交雑法は、ＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を別の栽培品種に導入するために、本発明で使用できる。
【0223】
植物育種の工程を加速する方法は、組織培養物および再生技術の適用による生成変異体の初期増殖を含む。従って、本発明の別の態様は、成長および分化時に、ＨｖＬＤＩ遺伝子の変異を有する大麦植物を生成する細胞を提供することである。例えば、育種は、従来の交雑、稔性葯由来植物の調製または小胞子培養の使用を含み得る。
【0224】
項目
本発明は、下記の項目によりさらに規定され得る。
１．ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有し、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異は、次の変異の１つである、大麦植物またはその一部：
ａ．変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドの１つまたは複数のループ領域中でプロリンから異なるアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、ループ領域が、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異；または
ｂ．変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中で負に帯電しているアミノ酸から負に帯電していないアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、アルファヘリックス領域が、配列番号１の位置４５～５５に対応するアミノ酸および位置６３～７６に対応するアミノ酸および位置７９～９０に対応するアミノ酸および位置１１２～１２３に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異。
２．上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の成熟野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドと少なくとも９０％同一である、項目１に記載の大麦植物またはその一部。
３．上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、表１Ａおよび１Ｂに記載の成熟野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドまたはその天然バリアントと９８％同一である、項目１または２に記載の大麦植物またはその一部。
４．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、ループ領域は、配列番号１の位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸からなる群より選択される、項目１～３のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
５．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、野生型ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中のプロリンの極性アミノ酸への置換を含む、項目１～４のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
６．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中のプロリンのセリンへの置換を含む、項目１～５のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
７．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の位置６０に対応するアミノ酸の位置でプロリンの異なるアミノ酸への置換を含む、項目１～６のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
８．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の位置６０のプロリンの異なるアミノ酸への置換を有する配列番号１のＬＤＩからなる、項目１～７のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
９．プロリンが、セリンで置換される、項目７または８に記載の大麦植物またはその一部。
１０．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸位置６０でプロリンのセリンへの置換を含む、項目１～９のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１１．変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号３の位置２５～１４２のアミノ酸配列または配列番号３の位置２５～１４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、項目１～１０のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１２．変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号４の位置２５～１４２のアミノ酸配列または配列番号４の位置２５～１４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、項目１～１１のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１３．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、ＨｖＬＤＩの１種または複数のアルファヘリックス領域で、負に帯電しているアミノ酸の正に帯電しているアミノ酸への置換を含む変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする、項目１～１２のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１４．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、ＨｖＬＤＩの１種または複数のアルファヘリックス領域中の負に帯電しているアミノ酸のリジンへの置換を含む、項目１～１３のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１５．上記負に帯電しているアミノ酸は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）である、項目１３または１４に記載の大麦植物またはその一部。
１６．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の位置６８に対応する位置でグルタミン酸の負に帯電していないアミノ酸への置換を含む、項目１～１５のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１７．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の位置６８のグルタミン酸の負に帯電していないアミノ酸への置換を有する配列番号１のＬＤＩからなる、項目１～１６のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１８．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸位置６８でグルタミン酸のリジンへの置換を含む、項目１～１７のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１９．変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号６の位置２５～１４２のアミノ酸配列または配列番号６の位置２５～１４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、項目１～１８のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２０．上記大麦植物の穀粒は、同じ条件下で培養される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の穀粒で測定される遊離ＨｖＬＤ活性と比べて、少なくとも２０％高い遊離ＨｖＬＤ活性を有する、項目１～１９のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２１．上記発芽穀粒は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の発芽穀粒で測定される遊離ＨｖＬＤ活性と比べて、少なくとも２０％高い遊離ＨｖＬＤ活性を有する、項目１～２０のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２２．上記大麦植物から調製された麦芽は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の麦芽で測定される遊離ＨｖＬＤ活性と比べて、少なくとも２０％高い遊離ＨｖＬＤ活性を有する、項目１～２１のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２３．上記遊離ＨｖＬＤ活性は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の麦芽で測定される遊離ＨｖＬＤ活性と比べて、少なくとも５０％高い、例えば少なくとも１００％高い、好ましくは少なくとも１４０％高い、項目１～２２のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２４．穀粒または発芽穀粒または上記大麦植物からの麦芽は、同じ条件下で培養および調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の、穀粒または発芽穀粒または麦芽でそれぞれ測定される遊離／総％ＨｖＬＤ活性に比べて、少なくとも２０％高い遊離／総％ＨｖＬＤ活性を有する、項目１～２３のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２５．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に下記からなる群より選択される１つまたは複数の変異を有する、項目１～２４のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部：
ｉ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６６に対応する位置での、ヌクレオチドＣからＴへの変異；および
ｉｉ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６７に対応する位置での、ヌクレオチドＣからＴへの変異；および
ｉｉｉ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６８に対応する位置での、ヌクレオチドＣからＴへの変異；および
ｉｖ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９９０に対応する位置での、ＧからＡへの変異。
２６．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６６に対応する位置で、ヌクレオチドＣからＴへの変異からなるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を有する、項目１～２５のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２７．大麦植物は、受入番号ＮＣＩＭＢ４３５８１でＮＣＩＭＢに寄託された大麦植物またはその子孫である、項目１～２６のいずれか１項に記載の大麦植物。
２８．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６７に対応する位置で、ヌクレオチドＣからＴへの変異からなるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を有する、項目１～２５のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２９．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９９０に対応する位置で、ヌクレオチドＧからＡへの変異からなるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を有する、項目１～２５のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
３０．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６６に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異およびヌクレオチド９６７に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異からなるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を有する、項目１～２４のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
３１．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６６に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異およびヌクレオチド９６８に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異からなるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を有する、項目１～２５のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
３２．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６７に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異およびヌクレオチド９９０に対応する位置でのヌクレオチドＧからＡへの変異からなるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を有する、項目１～２４のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
３３．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６６に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異およびヌクレオチド９９０に対応する位置でのヌクレオチドＧからＡへの変異からなるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を有する、項目１～２４のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
３４．大麦植物は、受入番号ＮＣＩＭＢ４３５８２でＮＣＩＭＢに寄託された大麦植物またはその子孫である、項目１～３３のいずれか１項に記載の大麦植物。
３５．上記大麦植物の穀粒は、少なくとも４５グラム、例えば少なくとも５０グラム、例えば少なくとも５５グラムの千粒重を有する、項目１～３４のいずれか１項に記載の大麦植物。
３６．上記大麦植物の穀粒は、同じ条件下で育成される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがその他は同じ遺伝子型である大麦植物の穀粒に比べて、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の千粒重を有する、項目１～３５のいずれか１項に記載の大麦植物。
３７．上記大麦植物の穀粒は、少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％、例えば少なくとも６０％の千粒重を有する、項目１～３６のいずれか１項に記載の大麦植物。
３８．上記大麦植物の穀粒は、同じ条件下で育成される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがその他は同じ遺伝子型である大麦植物の穀粒に比べて、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％のデンプン含量を有する、項目１～３７のいずれか１項に記載の大麦植物。
３９．大麦植物は、１つまたは複数の追加の遺伝子中に変異、例えば１つまたは複数の以下の変異をさらに含む、項目１～３８のいずれか１項に記載の大麦植物：
ａ．機能的ＬＯＸ－１の完全喪失をもたらすＬＯＸ－１コード遺伝子中の変異；
ｂ．機能的ＬＯＸ－２の完全喪失をもたらすＬＯＸ－２コード遺伝子中の変異；
ｃ．機能的ＭＭＴの完全喪失をもたらすＭＭＴコード遺伝子中の変異；
ｄ．ＣｓｌＦ６をコードする遺伝子中の変異であって、上記変異遺伝子が、低減されたＣｓｌＦ６活性を有する変異体ＣｓｌＦ６タンパク質をコードする、変異；
ｅ．ＨＲＴ機能の喪失をもたらすＨＲＴ遺伝子をコードする遺伝子中の変異；
ｆ．ＨＢＬ機能の喪失をもたらすＨＢＬ１２遺伝子をコードする遺伝子中の変異；
ｇ．ＷＲＫＹ３８機能の喪失をもたらすＷＲＫＹ３８遺伝子をコードする遺伝子中の変異；
ｈ．ａｎｔ変異、例えばＨｖｍｙｂ１０遺伝子中の変異。
４０．項目１～３９のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部を含む植物生成物。
４１．下記からなる群より選択される、項目４０に記載の植物生成物：
ａ．上記大麦植物の穀粒から調製された麦芽；
ｂ．上記大麦植物の穀粒から、および／または上記大麦植物の処理穀粒を含む麦芽から調製された、水性抽出物、例えば麦汁；および
ｃ．上記大麦植物またはその一部から調製された飲料、例えばビール。
４２．麦芽の調製方法であって、下記ステップを含む方法：
ａ．項目１～３８のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
ｂ．所定の条件下で上記穀粒を浸麦し、発芽させるステップ；
ｃ．任意選択で、上記発芽穀粒を乾燥するステップ。
４３．浸麦および発芽が、下記のステップ：
ａ．項目１～３８のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を、酸素を含むガス（例えば、純酸素または空気）による通気下にて水溶液中で５～１０時間にわたりインキュベートするステップ；
ｂ．水溶液を排水し、好ましくは通気下で、穀粒を８～１６時間にわたりエアレストに供するステップ；
ｃ．穀粒を、酸素を含むガスによる通気下にて２～１０時間にわたり水溶液中でインキュベートするステップ；および
ｄ．水溶液を排水し、好ましくは通気下で、穀粒を８～２０時間にわたり第２のエアレストに供するステップ；
を含み、穀粒の含水量が、項目４２のステップａ．の後の任意の時点で少なくとも２０％であり、項目４２のステップｃ．が、実施されない、項目４２に記載の方法。
４４．上記浸麦および発芽ステップは、多くても４日間、例えば多くても３日間、好ましくは４８時間～７２時間の範囲で実施される、項目４２または４３に記載の方法。
４５．水性抽出物の調製方法であって、下記ステップを含む、方法：
ａ．項目１～３９のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒および／または項目４２～４４のいずれか１項に記載の方法により製造された麦芽を用意するステップ；
ｂ．上記穀粒および／または上記麦芽の水性抽出物、例えば麦汁を調製するステップ。
４６．上記麦芽は、それが製造されてから水性抽出物の調製のための使用まで、少なくとも２０％の含水量を維持している、項目４５に記載の方法。
４７．上記水性抽出物は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の水性抽出物に比べて、少なくとも５％多い発酵性糖を有する、項目４５または４６に記載の方法。
４８．上記水性抽出物は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の水性抽出物に比べて、少なくとも１０％多いグルコース、フルクトース、および／またはマルトトリオースを有する、項目４５～４７のいずれか１項に記載の方法。
４９．飲料を製造する方法であって、以下のステップを含む、方法：
ａ．項目１～３９のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒および／または項目４２～４４のいずれか１項に記載の方法により製造された麦芽を用意するステップ；および
ｂ．上記穀粒および／または麦芽から水性抽出物を調製するステップ；または
ｃ．上記水性抽出物を飲料に処理するステップ。
５０．ステップｂ．は、項目４５～４８のいずれか１項に記載の方法により実施される、項目４９に記載の方法。
５１．大麦植物を調製する方法であって、以下のステップを含む、方法。
ａ．大麦粒を用意するステップ；および
ｂ．上記大麦粒をランダム変異誘発に供するステップ；
ｃ．下記変異の１つを有する変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする変異ＨｖＬＤＩ遺伝子を有する大麦粒またはその一部を選択するステップ；
ｉ．ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中でプロリンから異なるアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、ループ領域が、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異；または
ｉｉ．野生型ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中で負に帯電しているアミノ酸から負に帯電していないアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、アルファヘリックス領域が、配列番号１の位置４５～５５に対応するアミノ酸および位置６３～７６に対応するアミノ酸および位置７９～９０に対応するアミノ酸および位置１１２～１２３に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異。
本発明は、下記の項目によりさらに規定され得る。
１．ＨｖＬＤＩ遺伝子中に変異を有し、上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異は、次の変異の１つである、大麦植物またはその一部：
ａ．変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドの１つまたは複数のループ領域中でプロリンから異なるアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、ループ領域が、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異；または
ｂ．変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中で負に帯電しているアミノ酸から負に帯電していないアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、アルファヘリックス領域が、配列番号１の位置４５～５５に対応するアミノ酸および位置６３～７６に対応するアミノ酸および位置７９～９０に対応するアミノ酸および位置１１２～１２３に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異。
２．上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の成熟野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドと少なくとも９０％同一である、項目１に記載の大麦植物またはその一部。
３．上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、表１Ａおよび１Ｂに記載の成熟野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドまたはその天然バリアントと９８％同一である、項目１または２に記載の大麦植物またはその一部。
４．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、ループ領域は、配列番号１の位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸からなる群より選択される、項目１～３のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
５．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、野生型ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中のプロリンの極性アミノ酸への置換を含む、項目１～４のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
６．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中のプロリンのセリンへの置換を含む、項目１～５のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
７．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の位置６０に対応するアミノ酸の位置でプロリンの異なるアミノ酸への置換を含む、項目１～６のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
８．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の位置６０のプロリンの異なるアミノ酸への置換を有する配列番号１のＬＤＩからなる、項目１～７のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
９．プロリンが、セリンで置換される、項目７または８に記載の大麦植物またはその一部。
１０．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸位置６０でプロリンのセリンへの置換を含む、項目１～９のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１１．変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号３の位置２５～１４２のアミノ酸配列または配列番号３の位置２５～１４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、項目１～１０のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１２．変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号４の位置２５～１４２のアミノ酸配列または配列番号４の位置２５～１４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、項目１～１１のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１３．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、ＨｖＬＤＩの１種または複数のアルファヘリックス領域で、負に帯電しているアミノ酸の正に帯電しているアミノ酸への置換を含む変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする、項目１～１２のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１４．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、ＨｖＬＤＩの１種または複数のアルファヘリックス領域中の負に帯電しているアミノ酸のリジンへの置換を含む、項目１～１３のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１５．上記負に帯電しているアミノ酸は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）である、項目１３または１４に記載の大麦植物またはその一部。
１６．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の位置６８に対応する位置でグルタミン酸の負に帯電していないアミノ酸への置換を含む、項目１～１５のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１７．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１の位置６８のグルタミン酸の負に帯電していないアミノ酸への置換を有する配列番号１のＬＤＩからなる、項目１～１６のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１８．上記変異ＨｖＬＤＩ遺伝子は、変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードし、上記変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸位置６８でグルタミン酸のリジンへの置換を含む、項目１～１７のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
１９．変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドは、配列番号６の位置２５～１４２のアミノ酸配列または配列番号６の位置２５～１４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、項目１～１８のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２０．上記大麦植物の穀粒は、同じ条件下で培養される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の穀粒で測定される遊離ＨｖＬＤ活性と比べて、少なくとも２０％高い遊離ＨｖＬＤ活性を有する、項目１～１９のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２１．上記発芽穀粒は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の発芽穀粒で測定される遊離ＨｖＬＤ活性と比べて、少なくとも２０％高い遊離ＨｖＬＤ活性を有する、項目１～２０のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２２．上記大麦植物から調製された麦芽は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の麦芽で測定される遊離ＨｖＬＤ活性と比べて、少なくとも２０％高い遊離ＨｖＬＤ活性を有する、項目１～２１のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２３．上記遊離ＨｖＬＤ活性は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の麦芽で測定される遊離ＨｖＬＤ活性と比べて、少なくとも５０％高い、例えば少なくとも１００％高い、好ましくは少なくとも１４０％高い、項目１～２２のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２４．穀粒または発芽穀粒または上記大麦植物からの麦芽は、同じ条件下で培養および調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の、穀粒または発芽穀粒または麦芽でそれぞれ測定される遊離／総％ＨｖＬＤ活性に比べて、少なくとも２０％高い遊離／総％ＨｖＬＤ活性を有する、項目１～２３のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２５．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子中に下記からなる群より選択される１つまたは複数の変異を有する、項目１～２４のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部：
ｉ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６６に対応する位置での、ヌクレオチドＣからＴへの変異；および
ｉｉ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６７に対応する位置での、ヌクレオチドＣからＴへの変異；および
ｉｉｉ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６８に対応する位置での、ヌクレオチドＣからＴへの変異；および
ｉｖ．ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９９０に対応する位置での、ＧからＡへの変異。
２６．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６６に対応する位置で、ヌクレオチドＣからＴへの変異からなるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を有する、項目１～２５のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２７．大麦植物は、受入番号ＮＣＩＭＢ４３５８１でＮＣＩＭＢに寄託された大麦植物またはその子孫である、項目１～２６のいずれか１項に記載の大麦植物。
２８．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６７に対応する位置で、ヌクレオチドＣからＴへの変異からなるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を有する、項目１～２５のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
２９．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９９０に対応する位置で、ヌクレオチドＧからＡへの変異からなるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を有する、項目１～２５のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
３０．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６６に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異およびヌクレオチド９６７に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異からなるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を有する、項目１～２４のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
３１．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６６に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異およびヌクレオチド９６８に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異からなるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を有する、項目１～２５のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
３２．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６７に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異およびヌクレオチド９９０に対応する位置でのヌクレオチドＧからＡへの変異からなるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を有する、項目１～２４のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
３３．上記大麦植物は、ＨｖＬＤＩ遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド９６６に対応する位置でのヌクレオチドＣからＴへの変異およびヌクレオチド９９０に対応する位置でのヌクレオチドＧからＡへの変異からなるＨｖＬＤＩ遺伝子中の変異を有する、項目１～２４のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部。
３４．大麦植物は、受入番号ＮＣＩＭＢ４３５８２でＮＣＩＭＢに寄託された大麦植物またはその子孫である、項目１～３３のいずれか１項に記載の大麦植物。
３５．上記大麦植物の穀粒は、少なくとも４５グラム、例えば少なくとも５０グラム、例えば少なくとも５５グラムの千粒重を有する、項目１～３４のいずれか１項に記載の大麦植物。
３６．上記大麦植物の穀粒は、同じ条件下で育成される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがその他は同じ遺伝子型である大麦植物の穀粒に比べて、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の千粒重を有する、項目１～３５のいずれか１項に記載の大麦植物。
３７．上記大麦植物の穀粒は、少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％、例えば少なくとも６０％の千粒重を有する、項目１～３６のいずれか１項に記載の大麦植物。
３８．上記大麦植物の穀粒は、同じ条件下で育成される場合、野生型ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがその他は同じ遺伝子型である大麦植物の穀粒に比べて、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％のデンプン含量を有する、項目１～３７のいずれか１項に記載の大麦植物。
３９．大麦植物は、１つまたは複数の追加の遺伝子中に変異、例えば１つまたは複数の以下の変異をさらに含む、項目１～３８のいずれか１項に記載の大麦植物：
ａ．機能的ＬＯＸ－１の完全喪失をもたらすＬＯＸ－１コード遺伝子中の変異；
ｂ．機能的ＬＯＸ－２の完全喪失をもたらすＬＯＸ－２コード遺伝子中の変異；
ｃ．機能的ＭＭＴの完全喪失をもたらすＭＭＴコード遺伝子中の変異；
ｄ．ＣｓｌＦ６をコードする遺伝子中の変異であって、上記変異遺伝子が、低減されたＣｓｌＦ６活性を有する変異体ＣｓｌＦ６タンパク質をコードする、変異；
ｅ．ＨＲＴ機能の喪失をもたらすＨＲＴ遺伝子をコードする遺伝子中の変異；
ｆ．ＨＢＬ機能の喪失をもたらすＨＢＬ１２遺伝子をコードする遺伝子中の変異；
ｇ．ＷＲＫＹ３８機能の喪失をもたらすＷＲＫＹ３８遺伝子をコードする遺伝子中の変異；
ｈ．ａｎｔ変異、例えばＨｖｍｙｂ１０遺伝子中の変異。
４０．項目１～３９のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部を含む植物生成物。
４１．下記からなる群より選択される、項目４０に記載の植物生成物：
ａ．上記大麦植物の穀粒から調製された麦芽；
ｂ．上記大麦植物の穀粒から、および／または上記大麦植物の処理穀粒を含む麦芽から調製された、水性抽出物、例えば麦汁；および
ｃ．上記大麦植物またはその一部から調製された飲料、例えばビール。
４２．麦芽の調製方法であって、下記ステップを含む方法：
ａ．項目１～３８のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
ｂ．所定の条件下で上記穀粒を浸麦し、発芽させるステップ；
ｃ．任意選択で、上記発芽穀粒を乾燥するステップ。
４３．浸麦および発芽が、下記のステップ：
ａ．項目１～３８のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を、酸素を含むガス（例えば、純酸素または空気）による通気下にて水溶液中で５～１０時間にわたりインキュベートするステップ；
ｂ．水溶液を排水し、好ましくは通気下で、穀粒を８～１６時間にわたりエアレストに供するステップ；
ｃ．穀粒を、酸素を含むガスによる通気下にて２～１０時間にわたり水溶液中でインキュベートするステップ；および
ｄ．水溶液を排水し、好ましくは通気下で、穀粒を８～２０時間にわたり第２のエアレストに供するステップ；
を含み、穀粒の含水量が、項目４２のステップａ．の後の任意の時点で少なくとも２０％であり、項目４２のステップｃ．が、実施されない、項目４２に記載の方法。
４４．上記浸麦および発芽ステップは、多くても４日間、例えば多くても３日間、好ましくは４８時間～７２時間の範囲で実施される、項目４２または４３に記載の方法。
４５．水性抽出物の調製方法であって、下記ステップを含む、方法：
ａ．項目１～３９のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒および／または項目４２～４４のいずれか１項に記載の方法により製造された麦芽を用意するステップ；
ｂ．上記穀粒および／または上記麦芽の水性抽出物、例えば麦汁を調製するステップ。
４６．上記麦芽は、それが製造されてから水性抽出物の調製のための使用まで、少なくとも２０％の含水量を維持している、項目４５に記載の方法。
４７．上記水性抽出物は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の水性抽出物に比べて、少なくとも５％多い発酵性糖を有する、項目４５または４６に記載の方法。
４８．上記水性抽出物は、同じ条件下で調製される場合、野生型ＨｖＬＤＩをコードするＨｖＬＤＩ遺伝子を有するがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の水性抽出物に比べて、少なくとも１０％多いグルコース、フルクトース、および／またはマルトトリオースを有する、項目４５～４７のいずれか１項に記載の方法。
４９．飲料を製造する方法であって、以下のステップを含む、方法：
ａ．項目１～３９のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒および／または項目４２～４４のいずれか１項に記載の方法により製造された麦芽を用意するステップ；および
ｂ．上記穀粒および／または麦芽から水性抽出物を調製するステップ；または
ｃ．上記水性抽出物を飲料に処理するステップ。
５０．ステップｂ．は、項目４５～４８のいずれか１項に記載の方法により実施される、項目４９に記載の方法。
５１．大麦植物を調製する方法であって、以下のステップを含む、方法。
ａ．大麦粒を用意するステップ；および
ｂ．上記大麦粒をランダム変異誘発に供するステップ；
ｃ．下記変異の１つを有する変異体ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする変異ＨｖＬＤＩ遺伝子を有する大麦粒またはその一部を選択するステップ；
ｉ．ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のループ領域中でプロリンから異なるアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、ループ領域が、配列番号１の位置２５～４４に対応するアミノ酸および位置５６～６２に対応するアミノ酸および位置７７～７８に対応するアミノ酸および位置９１～１１１に対応するアミノ酸および位置１２４～１４７に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異；または
ｉｉ．野生型ＨｖＬＤＩの１つまたは複数のアルファヘリックス領域中で負に帯電しているアミノ酸から負に帯電していないアミノ酸への変化を生ずるミスセンス変異であって、アルファヘリックス領域が、配列番号１の位置４５～５５に対応するアミノ酸および位置６３～７６に対応するアミノ酸および位置７９～９０に対応するアミノ酸および位置１１２～１２３に対応するアミノ酸からなる群より選択される、ミスセンス変異。
【0225】
配列
配列番号１
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの野生型ＨｖＬＤＩのアミノ酸配列。ユニプロット受入番号Ｑ２Ｖ８Ｘ０。
ＭＡＳＤＨＲＲＦＶＬＳＧＡＶＬＬＳＶＬＡＶＡＡＡＴＬＥＳＶＫＤＥＣＱＰＧＶＤＦＰＨＮＰＬＡＴＣＨＴＹＶＩＫＲＶＣＧＲＧＰＳＲＰＭＬＶＫＥＲＣＣＲＥＬＡＡＶＰＤＨＣＲＣＥＡＬＲＩＬＭＤＧＶＲＴＰＥＧＲＶＶＥＧＲＬＧＤＲＲＤＣＰＲＥＥＱＲＡＦＡＡＴＬＶＴＡＡＥＣＮＬＳＳＶＱＥＰＧＶＲＬＶＬＬＡＤＧ
配列番号２
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの野生型ＨｖＬＤＩの全コード領域のＤＮＡ配列 ＤＱ２８５５６４．１
太字で示したＡＴＧは、配列番号１をコードするための開始コドンを表す。下線のコドンは、本発明により変異導入されるコドンに対応する。
配列番号３
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの変異体Ｐ６０Ｓ ＨｖＬＤＩのアミノ酸配列（ＨＥＮＺ－１６ａ）。
ＭＡＳＤＨＲＲＦＶＬＳＧＡＶＬＬＳＶＬＡＶＡＡＡＴＬＥＳＶＫＤＥＣＱＰＧＶＤＦＰＨＮＰＬＡＴＣＨＴＹＶＩＫＲＶＣＧＲＧＳＳＲＰＭＬＶＫＥＲＣＣＲＥＬＡＡＶＰＤＨＣＲＣＥＡＬＲＩＬＭＤＧＶＲＴＰＥＧＲＶＶＥＧＲＬＧＤＲＲＤＣＰＲＥＥＱＲＡＦＡＡＴＬＶＴＡＡＥＣＮＬＳＳＶＱＥＰＧＶＲＬＶＬＬＡＤＧ
配列番号４
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの変異体Ｐ６０Ｌ ＨｖＬＤＩのアミノ酸配列（ＨＥＮＺ－１６ｂ）。
ＭＡＳＤＨＲＲＦＶＬＳＧＡＶＬＬＳＶＬＡＶＡＡＡＴＬＥＳＶＫＤＥＣＱＰＧＶＤＦＰＨＮＰＬＡＴＣＨＴＹＶＩＫＲＶＣＧＲＧＬＳＲＰＭＬＶＫＥＲＣＣＲＥＬＡＡＶＰＤＨＣＲＣＥＡＬＲＩＬＭＤＧＶＲＴＰＥＧＲＶＶＥＧＲＬＧＤＲＲＤＣＰＲＥＥＱＲＡＦＡＡＴＬＶＴＡＡＥＣＮＬＳＳＶＱＥＰＧＶＲＬＶＬＬＡＤＧ
配列番号５
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの変異体Ｖ６６Ｍ ＨｖＬＤＩのアミノ酸配列（ＨＥＮＺ－１８）。
ＭＡＳＤＨＲＲＦＶＬＳＧＡＶＬＬＳＶＬＡＶＡＡＡＴＬＥＳＶＫＤＥＣＱＰＧＶＤＦＰＨＮＰＬＡＴＣＨＴＹＶＩＫＲＶＣＧＲＧＰＳＲＰＭＬＭＫＥＲＣＣＲＥＬＡＡＶＰＤＨＣＲＣＥＡＬＲＩＬＭＤＧＶＲＴＰＥＧＲＶＶＥＧＲＬＧＤＲＲＤＣＰＲＥＥＱＲＡＦＡＡＴＬＶＴＡＡＥＣＮＬＳＳＶＱＥＰＧＶＲＬＶＬＬＡＤＧ
配列番号６
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの変異体Ｅ６８Ｋ ＨｖＬＤＩのアミノ酸配列（ＨＥＮＺ－３１）。
ＭＡＳＤＨＲＲＦＶＬＳＧＡＶＬＬＳＶＬＡＶＡＡＡＴＬＥＳＶＫＤＥＣＱＰＧＶＤＦＰＨＮＰＬＡＴＣＨＴＹＶＩＫＲＶＣＧＲＧＰＳＲＰＭＬＶＫＫＲＣＣＲＥＬＡＡＶＰＤＨＣＲＣＥＡＬＲＩＬＭＤＧＶＲＴＰＥＧＲＶＶＥＧＲＬＧＤＲＲＤＣＰＲＥＥＱＲＡＦＡＡＴＬＶＴＡＡＥＣＮＬＳＳＶＱＥＰＧＶＲＬＶＬＬＡＤＧ
配列番号７
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの野生型ＨｖＬＤのアミノ酸配列。ユニプロット受入番号Ｑ９ＦＹＹ０。
ＭＡＶＧＥＴＧＡＳＶＳＡＡＥＡＥＡＥＡＴＱＡＦＭＰＤＡＲＡＹＷＶＴＳＤＬＩＡＷＮＶＧＥＬＥＡＱＳＶＣＬＹＡＳＲＡＡＡＭＳＬＳＰＳＮＧＧＩＱＧＹＤＳＫＶＥＬＱＰＥＳＡＧＬＰＥＴＶＴＱＫＦＰＦＩＳＳＹＲＡＦＫＶＰＳＳＶＤＶＡＳＬＶＫＣＱＬＶＶＡＳＦＧＡＤＧＫＨＶＤＶＴＧＬＱＬＰＧＶＬＤＤＭＦＡＹＴＧＰＬＧＡＶＦＳＥＤＳＶＳＬＨＬＷＡＰＴＡＱＧＶＳＶＣＦＦＤＧＰＡＧＰＡＬＥＴＶＱＬＫＥＳＮＧＶＷＳＶＴＧＰＲＥＷＥＮＲＹＹＬＹＥＶＤＶＹＨＰＴＫＡＱＶＬＫＣＬＡＧＤＰＹＴＲＳＬＳＡＮＧＡＲＴＷＬＶＤＩＮＮＥＴＬＫＰＡＳＷＤＥＬＡＤＥＫＰＫＬＤＳＦＳＤＩＴＩＹＥＬＨＩＲＤＦＳＡＨＤＧＴＶＤＳＤＳＲＧＧＦＲＡＦＡＹＱＡＳＡＧＭＥＨＬＲＫＬＳＤＡＧＬＴＨＶＨＬＬＰＳＦＨＦＡＧＶＤＤＩＫＳＮＷＫＦＶＤＥＣＥＬＡＴＦＰＰＧＳＤＭＱＱＡＡＶＶＡＩＱＥＥＤＰＹＮＷＧＹＮＰＶＬＷＧＶＰＫＧＳＹＡＳＤＰＤＧＰＳＲＩＩＥＹＲＱＭＶＱＡＬＮＲＩＧＬＣＶＶＭＤＶＶＹＮＨＬＤＳＳＧＰＣＧＩＳＳＶＬＤＫＩＶＰＧＹＹＶＲＲＤＴＮＧＱＩＥＮＳＡＡＭＮＮＴＡＳＥＨＦＭＶＤＲＬＩＶＤＤＬＬＮＷＡＶＮＹＫＶＤＧＦＲＦＤＬＭＧＨＩＭＫＲＴＭＭＲＡＫＳＡＬＱＳＬＴＴＤＡＨＧＶＤＧＳＫＩＹＬＹＧＥＧＷＤＦＡＥＶＡＲＮＱＲＧＩＮＧＳＱＬＮＭＳＧＴＧＩＧＳＦＮＤＲＩＲＤＡＩＮＧＧＮＰＦＧＮＰＬＱＱＧＦＮＴＧＬＦＬＥＰＮＧＦＹＱＧＮＥＡＤＴＲＲＳＬＡＴＹＡＤＱＩＱＩＧＬＡＧＮＬＲＤＹＶＬＩＳＨＴＧＥＡＫＫＧＳＥＩＨＴＦＤＧＬＰＶＧＹＴＡＳＰＩＥＴＩＮＹＶＳＡＨＤＮＥＴＬＦＤＶＩＳＶＫＴＰＭＩＬＳＶＤＥＲＣＲＩＮＨＬＡＳＳＭＭＡＬＳＱＧＩＰＦＦＨＡＧＤＥＩＬＲＳＫＳＩＤＲＤＳＹＮＳＧＤＷＦＮＫＬＤＦＴＹＥＴＮＮＷＧＶＧＬＰＰＳＥＫＮＥＤＮＷＰＬＭＫＰＲＬＥＮＰＳＦＫＰＡＫＧＨＩＬＡＡＬＤＳＦＶＤＩＬＫＩＲＹＳＳＰＬＦＲＬＳＴＡＮＤＩＫＱＲＶＲＦＨＮＴＧＰＳＬＶＰＧＶＩＶＭＧＩＥＤＡＲＧＥＳＰＥＭＡＱＬＤＴＮＦＳＹＶＶＴＶＦＮＶＣＰＨＥＶＳＭＤＩＰＡＬＡＳＭＧＦＥＬＨＰＶＱＶＮＳＳＤＴＬＶＲＫＳＡＹＥＡＡＴＧＲＦＴＶＰＧＲＴＶＳＶＦＶＥＰＲＣ
配列番号８
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの野生型ＨｖＬＤのヌクレオチド配列。ジェンバンク受入番号ＡＦ２５２６３５．１
ＡＴＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＣＧＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧＡＣＧＣＣＡＧＧＧＣＧＴＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＧＡＧＣＧＡＣＣＴＣＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＧＴＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＡＧＴＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧＴＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＧＡＴＧＡＧＣＣＴＣＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＡＴＧＧＣＧＧＣＡＴＣＣＡＡＧＧＣＴＡＣＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＣＴＣＣＣＧＧＡＡＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣＴＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＡＣＡＧＡＧＣＡＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＣＧＡＧＣＴＣＴＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＣＣＡＧＣＣＴＴＧＴＧＡＡＡＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＴＣＧＴＣＧＣＴＴＣＴＴＴＣＧＧＣＧＣＴＧＡＣＧＧＧＡＡＡＣＡＣＧＴＡＧＡＴＧＴＴＡＣＴＧＧＡＣＴＧＣＡＡＴＴＡＣＣＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＴＡＴＧＴＴＣＧＣＡＴＡＣＡＣＧＧＧＡＣＣＧＣＴＣＧＧＴＧＣＧＧＴＴＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＡＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＣＧＴＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＡＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＧＣＴＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＧＧＡＧＴＣＡＡＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＡＧＴＧＴＣＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＧＧＴＡＣＴＡＴＴＴＧＴＡＴＧＡＡＧＴＣＧＡＣＧＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＡＡＣＴＡＡＧＧＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＣＴＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＣＧＣＧＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＧＴＴＧＡＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＡＧＡＣＡＴＴＧＡＡＧＣＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＴＧＡＴＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＴＡＡＣＣＡＴＣＴＡＴＧＡＡＴＴＧＣＡＣＡＴＴＣＧＴＧＡＴＴＴＴＡＧＣＧＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＴＧＡＣＴＣＴＣＧＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＣＡＧＧＣＣＴＣＧＧＣＡＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡＡＡＴＴＡＴＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＴＧＴＧＣＡＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＧＡＣＧＡＣＡＴＴＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＡＡＣＴＡＧＣＡＡＣＡＴＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＴＡＴＧＣＡＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧＣＴＡＴＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＴＴＧＧＧＧＧＴＡＴＡＡＣＣＣＴＧＴＧＣＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＴＣＣＡＡＡＡＧＧＡＡＧＣＴＡＴＧＣＡＡＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＧＡＧＴＣＧＡＡＴＴＡＴＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＣＡＧＡＴＧＧＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＧＣＡＴＡＧＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＴＡＣＡＡＴＣＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＡＧＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＧＴＧＣＴＴＧＡＣＡＡＧＡＴＴＧＴＴＣＣＴＧＧＧＴＡＣＴＡＴＧＴＴＡＧＡＡＧＧＧＡＴＡＣＴＡＡＴＧＧＣＣＡＧＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＣＡＧＣＴＡＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＡＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＴＧＡＴＡＧＧＴＴＡＡＴＣＧＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＡＣＧＧＧＴＴＣＡＧＡＴＴＴＧＡＴＣＴＴＡＴＧＧＧＣＣＡＴＡＴＣＡＴＧＡＡＡＣＧＣＡＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＧＣＡＡＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣＣＴＴＡＣＡＡＣＡＧＡＴＧＣＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＧＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＴＴＧＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＴＧＧＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＧＣＡＡＴＣＡＡＣＧＴＧＧＡＡＴＡＡＡＴＧＧＧＴＣＣＣＡＧＣＴＴＡＡＴＡＴＧＡＧＴＧＧＡＡＣＧＧＧＧＡＴＴＧＧＴＡＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＧＡＡＴＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＡＴＴＡＡＴＧＧＧＧＧＴＡＡＴＣＣＣＴＴＴＧＧＴＡＡＴＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＡＡＴＡＣＴＧＧＴＣＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＧＴＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＡＣＴＴＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＡＴＡＣＡＧＡＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＡＧＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＣＴＡＡＴＡＴＣＴＣＡＴＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＧＡＴＣＡＧＡＡＡＴＴＣＡＣＡＣＴＴＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＡＧＴＡＧＧＣＴＡＴＡＣＴＧＣＧＴＣＣＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＧＡＴＡＡＡＣＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＣＴＣＴＡＴＴＴＧＡＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＴＧＡＴＣＣＴＴＴＣＡＧＴＴＧＡＴＧＡＧＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＧＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＡＴＣＣＣＡＧＧＧＡＡＴＡＣＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡＣＧＡＧＡＴＡＣＴＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＴＣＣＡＴＣＧＡＣＣＧＡＧＡＴＴＣＡＴＡＴＡＡＣＴＣＴＧＧＴＧＡＴＴＧＧＴＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＴＴＧＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＡＧＡＴＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＧＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＣＣＧＴＣＴＴＴＴＡＡＡＣＣＴＧＣＡＡＡＡＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＣＴＡＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＡＴＡＣＴＣＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＧＣＡＡＡＧＧＧＴＡＣＧＣＴＴＴＣＡＣＡＡＣＡＣＡＧＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴＴＡＴＴＧＴＣＡＴＧＧＧＣＡＴＴＧＡＡＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＴＧＡＧＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＡＴＴＡＧＡＣＡＣＧＡＡＣＴＴＣＴＣＴＴＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＣＴＴＣＡＡＴＧＴＧＴＧＴＣＣＧＣＡＣＧＡＡＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＣＣＣＧＣＴＣＴＣＧＣＴＴＣＧＡＴＧＧＧＧＴＴＴＧＡＡＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＡＴＡＣＴＴＴＧＧＴＧＡＧＧＡＡＡＴＣＧＧＣＧＴＡＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＡＣＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣＧＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＴＧＴＣＧＡＡＣＣＴＣＧＧＴＧＴＴＧＡ
配列番号１
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの野生型ＨｖＬＤＩのアミノ酸配列。ユニプロット受入番号Ｑ２Ｖ８Ｘ０。
ＭＡＳＤＨＲＲＦＶＬＳＧＡＶＬＬＳＶＬＡＶＡＡＡＴＬＥＳＶＫＤＥＣＱＰＧＶＤＦＰＨＮＰＬＡＴＣＨＴＹＶＩＫＲＶＣＧＲＧＰＳＲＰＭＬＶＫＥＲＣＣＲＥＬＡＡＶＰＤＨＣＲＣＥＡＬＲＩＬＭＤＧＶＲＴＰＥＧＲＶＶＥＧＲＬＧＤＲＲＤＣＰＲＥＥＱＲＡＦＡＡＴＬＶＴＡＡＥＣＮＬＳＳＶＱＥＰＧＶＲＬＶＬＬＡＤＧ
配列番号２
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの野生型ＨｖＬＤＩの全コード領域のＤＮＡ配列 ＤＱ２８５５６４．１
【化1】
配列番号３
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの変異体Ｐ６０Ｓ ＨｖＬＤＩのアミノ酸配列（ＨＥＮＺ－１６ａ）。
ＭＡＳＤＨＲＲＦＶＬＳＧＡＶＬＬＳＶＬＡＶＡＡＡＴＬＥＳＶＫＤＥＣＱＰＧＶＤＦＰＨＮＰＬＡＴＣＨＴＹＶＩＫＲＶＣＧＲＧＳＳＲＰＭＬＶＫＥＲＣＣＲＥＬＡＡＶＰＤＨＣＲＣＥＡＬＲＩＬＭＤＧＶＲＴＰＥＧＲＶＶＥＧＲＬＧＤＲＲＤＣＰＲＥＥＱＲＡＦＡＡＴＬＶＴＡＡＥＣＮＬＳＳＶＱＥＰＧＶＲＬＶＬＬＡＤＧ
配列番号４
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの変異体Ｐ６０Ｌ ＨｖＬＤＩのアミノ酸配列（ＨＥＮＺ－１６ｂ）。
ＭＡＳＤＨＲＲＦＶＬＳＧＡＶＬＬＳＶＬＡＶＡＡＡＴＬＥＳＶＫＤＥＣＱＰＧＶＤＦＰＨＮＰＬＡＴＣＨＴＹＶＩＫＲＶＣＧＲＧＬＳＲＰＭＬＶＫＥＲＣＣＲＥＬＡＡＶＰＤＨＣＲＣＥＡＬＲＩＬＭＤＧＶＲＴＰＥＧＲＶＶＥＧＲＬＧＤＲＲＤＣＰＲＥＥＱＲＡＦＡＡＴＬＶＴＡＡＥＣＮＬＳＳＶＱＥＰＧＶＲＬＶＬＬＡＤＧ
配列番号５
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの変異体Ｖ６６Ｍ ＨｖＬＤＩのアミノ酸配列（ＨＥＮＺ－１８）。
ＭＡＳＤＨＲＲＦＶＬＳＧＡＶＬＬＳＶＬＡＶＡＡＡＴＬＥＳＶＫＤＥＣＱＰＧＶＤＦＰＨＮＰＬＡＴＣＨＴＹＶＩＫＲＶＣＧＲＧＰＳＲＰＭＬＭＫＥＲＣＣＲＥＬＡＡＶＰＤＨＣＲＣＥＡＬＲＩＬＭＤＧＶＲＴＰＥＧＲＶＶＥＧＲＬＧＤＲＲＤＣＰＲＥＥＱＲＡＦＡＡＴＬＶＴＡＡＥＣＮＬＳＳＶＱＥＰＧＶＲＬＶＬＬＡＤＧ
配列番号６
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの変異体Ｅ６８Ｋ ＨｖＬＤＩのアミノ酸配列（ＨＥＮＺ－３１）。
ＭＡＳＤＨＲＲＦＶＬＳＧＡＶＬＬＳＶＬＡＶＡＡＡＴＬＥＳＶＫＤＥＣＱＰＧＶＤＦＰＨＮＰＬＡＴＣＨＴＹＶＩＫＲＶＣＧＲＧＰＳＲＰＭＬＶＫＫＲＣＣＲＥＬＡＡＶＰＤＨＣＲＣＥＡＬＲＩＬＭＤＧＶＲＴＰＥＧＲＶＶＥＧＲＬＧＤＲＲＤＣＰＲＥＥＱＲＡＦＡＡＴＬＶＴＡＡＥＣＮＬＳＳＶＱＥＰＧＶＲＬＶＬＬＡＤＧ
配列番号７
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの野生型ＨｖＬＤのアミノ酸配列。ユニプロット受入番号Ｑ９ＦＹＹ０。
ＭＡＶＧＥＴＧＡＳＶＳＡＡＥＡＥＡＥＡＴＱＡＦＭＰＤＡＲＡＹＷＶＴＳＤＬＩＡＷＮＶＧＥＬＥＡＱＳＶＣＬＹＡＳＲＡＡＡＭＳＬＳＰＳＮＧＧＩＱＧＹＤＳＫＶＥＬＱＰＥＳＡＧＬＰＥＴＶＴＱＫＦＰＦＩＳＳＹＲＡＦＫＶＰＳＳＶＤＶＡＳＬＶＫＣＱＬＶＶＡＳＦＧＡＤＧＫＨＶＤＶＴＧＬＱＬＰＧＶＬＤＤＭＦＡＹＴＧＰＬＧＡＶＦＳＥＤＳＶＳＬＨＬＷＡＰＴＡＱＧＶＳＶＣＦＦＤＧＰＡＧＰＡＬＥＴＶＱＬＫＥＳＮＧＶＷＳＶＴＧＰＲＥＷＥＮＲＹＹＬＹＥＶＤＶＹＨＰＴＫＡＱＶＬＫＣＬＡＧＤＰＹＴＲＳＬＳＡＮＧＡＲＴＷＬＶＤＩＮＮＥＴＬＫＰＡＳＷＤＥＬＡＤＥＫＰＫＬＤＳＦＳＤＩＴＩＹＥＬＨＩＲＤＦＳＡＨＤＧＴＶＤＳＤＳＲＧＧＦＲＡＦＡＹＱＡＳＡＧＭＥＨＬＲＫＬＳＤＡＧＬＴＨＶＨＬＬＰＳＦＨＦＡＧＶＤＤＩＫＳＮＷＫＦＶＤＥＣＥＬＡＴＦＰＰＧＳＤＭＱＱＡＡＶＶＡＩＱＥＥＤＰＹＮＷＧＹＮＰＶＬＷＧＶＰＫＧＳＹＡＳＤＰＤＧＰＳＲＩＩＥＹＲＱＭＶＱＡＬＮＲＩＧＬＣＶＶＭＤＶＶＹＮＨＬＤＳＳＧＰＣＧＩＳＳＶＬＤＫＩＶＰＧＹＹＶＲＲＤＴＮＧＱＩＥＮＳＡＡＭＮＮＴＡＳＥＨＦＭＶＤＲＬＩＶＤＤＬＬＮＷＡＶＮＹＫＶＤＧＦＲＦＤＬＭＧＨＩＭＫＲＴＭＭＲＡＫＳＡＬＱＳＬＴＴＤＡＨＧＶＤＧＳＫＩＹＬＹＧＥＧＷＤＦＡＥＶＡＲＮＱＲＧＩＮＧＳＱＬＮＭＳＧＴＧＩＧＳＦＮＤＲＩＲＤＡＩＮＧＧＮＰＦＧＮＰＬＱＱＧＦＮＴＧＬＦＬＥＰＮＧＦＹＱＧＮＥＡＤＴＲＲＳＬＡＴＹＡＤＱＩＱＩＧＬＡＧＮＬＲＤＹＶＬＩＳＨＴＧＥＡＫＫＧＳＥＩＨＴＦＤＧＬＰＶＧＹＴＡＳＰＩＥＴＩＮＹＶＳＡＨＤＮＥＴＬＦＤＶＩＳＶＫＴＰＭＩＬＳＶＤＥＲＣＲＩＮＨＬＡＳＳＭＭＡＬＳＱＧＩＰＦＦＨＡＧＤＥＩＬＲＳＫＳＩＤＲＤＳＹＮＳＧＤＷＦＮＫＬＤＦＴＹＥＴＮＮＷＧＶＧＬＰＰＳＥＫＮＥＤＮＷＰＬＭＫＰＲＬＥＮＰＳＦＫＰＡＫＧＨＩＬＡＡＬＤＳＦＶＤＩＬＫＩＲＹＳＳＰＬＦＲＬＳＴＡＮＤＩＫＱＲＶＲＦＨＮＴＧＰＳＬＶＰＧＶＩＶＭＧＩＥＤＡＲＧＥＳＰＥＭＡＱＬＤＴＮＦＳＹＶＶＴＶＦＮＶＣＰＨＥＶＳＭＤＩＰＡＬＡＳＭＧＦＥＬＨＰＶＱＶＮＳＳＤＴＬＶＲＫＳＡＹＥＡＡＴＧＲＦＴＶＰＧＲＴＶＳＶＦＶＥＰＲＣ
配列番号８
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの野生型ＨｖＬＤのヌクレオチド配列。ジェンバンク受入番号ＡＦ２５２６３５．１
ＡＴＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＣＧＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧＡＣＧＣＣＡＧＧＧＣＧＴＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＧＡＧＣＧＡＣＣＴＣＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＧＴＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＡＧＴＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧＴＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＧＡＴＧＡＧＣＣＴＣＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＡＴＧＧＣＧＧＣＡＴＣＣＡＡＧＧＣＴＡＣＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＣＴＣＣＣＧＧＡＡＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣＴＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＡＣＡＧＡＧＣＡＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＣＧＡＧＣＴＣＴＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＣＣＡＧＣＣＴＴＧＴＧＡＡＡＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＴＣＧＴＣＧＣＴＴＣＴＴＴＣＧＧＣＧＣＴＧＡＣＧＧＧＡＡＡＣＡＣＧＴＡＧＡＴＧＴＴＡＣＴＧＧＡＣＴＧＣＡＡＴＴＡＣＣＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＴＡＴＧＴＴＣＧＣＡＴＡＣＡＣＧＧＧＡＣＣＧＣＴＣＧＧＴＧＣＧＧＴＴＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＡＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＣＧＴＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＡＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＧＣＴＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＧＧＡＧＴＣＡＡＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＡＧＴＧＴＣＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＧＧＴＡＣＴＡＴＴＴＧＴＡＴＧＡＡＧＴＣＧＡＣＧＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＡＡＣＴＡＡＧＧＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＣＴＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＣＧＣＧＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＧＴＴＧＡＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＡＧＡＣＡＴＴＧＡＡＧＣＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＴＧＡＴＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＴＡＡＣＣＡＴＣＴＡＴＧＡＡＴＴＧＣＡＣＡＴＴＣＧＴＧＡＴＴＴＴＡＧＣＧＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＴＧＡＣＴＣＴＣＧＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＣＡＧＧＣＣＴＣＧＧＣＡＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡＡＡＴＴＡＴＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＴＧＴＧＣＡＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＧＡＣＧＡＣＡＴＴＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＡＡＣＴＡＧＣＡＡＣＡＴＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＴＡＴＧＣＡＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧＣＴＡＴＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＴＴＧＧＧＧＧＴＡＴＡＡＣＣＣＴＧＴＧＣＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＴＣＣＡＡＡＡＧＧＡＡＧＣＴＡＴＧＣＡＡＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＧＡＧＴＣＧＡＡＴＴＡＴＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＣＡＧＡＴＧＧＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＧＣＡＴＡＧＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＴＡＣＡＡＴＣＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＡＧＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＧＴＧＣＴＴＧＡＣＡＡＧＡＴＴＧＴＴＣＣＴＧＧＧＴＡＣＴＡＴＧＴＴＡＧＡＡＧＧＧＡＴＡＣＴＡＡＴＧＧＣＣＡＧＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＣＡＧＣＴＡＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＡＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＴＧＡＴＡＧＧＴＴＡＡＴＣＧＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＡＣＧＧＧＴＴＣＡＧＡＴＴＴＧＡＴＣＴＴＡＴＧＧＧＣＣＡＴＡＴＣＡＴＧＡＡＡＣＧＣＡＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＧＣＡＡＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣＣＴＴＡＣＡＡＣＡＧＡＴＧＣＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＧＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＴＴＧＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＴＧＧＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＧＣＡＡＴＣＡＡＣＧＴＧＧＡＡＴＡＡＡＴＧＧＧＴＣＣＣＡＧＣＴＴＡＡＴＡＴＧＡＧＴＧＧＡＡＣＧＧＧＧＡＴＴＧＧＴＡＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＧＡＡＴＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＡＴＴＡＡＴＧＧＧＧＧＴＡＡＴＣＣＣＴＴＴＧＧＴＡＡＴＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＡＡＴＡＣＴＧＧＴＣＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＧＴＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＣＡＡＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＡＣＴＴＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＡＴＡＣＡＧＡＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＡＧＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＣＴＡＡＴＡＴＣＴＣＡＴＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＧＡＴＣＡＧＡＡＡＴＴＣＡＣＡＣＴＴＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＡＧＴＡＧＧＣＴＡＴＡＣＴＧＣＧＴＣＣＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＧＡＴＡＡＡＣＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＣＴＣＴＡＴＴＴＧＡＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＴＧＡＴＣＣＴＴＴＣＡＧＴＴＧＡＴＧＡＧＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＧＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＡＴＣＣＣＡＧＧＧＡＡＴＡＣＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡＣＧＡＧＡＴＡＣＴＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＴＣＣＡＴＣＧＡＣＣＧＡＧＡＴＴＣＡＴＡＴＡＡＣＴＣＴＧＧＴＧＡＴＴＧＧＴＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＴＴＧＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＡＧＡＴＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＧＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＣＣＧＴＣＴＴＴＴＡＡＡＣＣＴＧＣＡＡＡＡＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＣＴＡＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＡＴＡＣＴＣＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＧＣＡＡＡＧＧＧＴＡＣＧＣＴＴＴＣＡＣＡＡＣＡＣＡＧＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴＴＡＴＴＧＴＣＡＴＧＧＧＣＡＴＴＧＡＡＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＴＧＡＧＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＡＴＴＡＧＡＣＡＣＧＡＡＣＴＴＣＴＣＴＴＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＣＴＴＣＡＡＴＧＴＧＴＧＴＣＣＧＣＡＣＧＡＡＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＣＣＣＧＣＴＣＴＣＧＣＴＴＣＧＡＴＧＧＧＧＴＴＴＧＡＡＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＡＴＡＣＴＴＴＧＧＴＧＡＧＧＡＡＡＴＣＧＧＣＧＴＡＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＡＣＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣＧＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＴＧＴＣＧＡＡＣＣＴＣＧＧＴＧＴＴＧＡ
【0226】
参考文献
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【0227】
実施例
実施例１．ＬＤＩの遺伝子中に特定の変異を有する大麦変異体（Ｈｖ）のスクリーニング
最初に、ＬＤＩ中のアミノ酸残基の置換をもたらす特定の変異を有する４種のＨｖＬＤＩを調製した（表２）。
次に、ＨＥＮＺ－１６ａ、ＨＥＮＺ－１８、ＨＥＮＺ－３１大麦植物変異体を、ランダム変異誘発により調製し、続いてＷＯ２０１８／００１８８４で記載のように基本的に実施されるｄｄＰＣＲ系方法により特定した。より具体的には、ランダムに変異誘発させた大麦粒のプール（親変種ＰａｕｓｔｉａｎおよびＰｌａｎｅｔ）を、調製し、続いてＷＯ２０１８／００１８８４のｐ．６６～６９のＷＳ１およびＷＳ２ならびに実施例１～２（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、順序付きライブラリーを調製した。
実施例１．ＬＤＩの遺伝子中に特定の変異を有する大麦変異体（Ｈｖ）のスクリーニング
最初に、ＬＤＩ中のアミノ酸残基の置換をもたらす特定の変異を有する４種のＨｖＬＤＩを調製した（表２）。
【表4】
【0228】
配列番号１のＨｖＬＤＩをコードする野生型ＨｖＬＤＩ遺伝子（ユニプロット受入番号Ｑ２Ｖ８Ｘ０）を、野生型ＨｖＬＤＩのためのリファレンス遺伝子として使用した。
【0229】
ＨＥＮＺ－１６ａ、ＨＥＮＺ－１６ｂ、ＨＥＮＺ－１８、ＨＥＮＺ－３１大麦植物変異体を、下表３で指定したプライマーおよびプローブを用いて、ＷＯ２０１８／００１８８４のｐ．６７～７２のＷＳ３およびＷＳ４ならびに実施例３～１５に記載のように特定し選択した。
【0230】
ＨＥＮＺ－１６ａ、ＨＥＮＺ－１６ｂおよびＨＥＮＺ－１８の背景、すなわち親植物は、Ｐａｕｓｔｉａｎであり、ＨＥＮＺ－３１の背景は、Ｐｌａｎｅｔである。ＰａｕｓｔｉａｎおよびＰｌａｎｅｔ大麦植物は、ＨｖＬＤＩポリペプチドをコードする野生型ＨｖＬＤＩ遺伝子を含む。Ｐａｕｓｔｉａｎは、Ｓｅｊｅｔ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｎｏｒｒｅｍａｒｋｓｖｅｊ ６７，８７００ Ｈｏｒｓｅｎｓ ＤＫから入手可能である。Ｐｌａｎｅｔは、ＲＡＧＴ Ｓｅｍｅｎｃｅｓ，Ｒｕｅ Ｅｍｉｌｅ Ｓｉｎｇｌａ，１２０００ Ｒｏｄｅｚ，Ｆｒａｎｃｅから入手可能である。
【表5】
【0231】
実施例２．インビトロ結合試験
方法
商業的に入手可能なインビトロアッセイ（プルラナーゼ／限界デキストリナーゼアッセイキットＰｕｌｌＧ６法、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を製造業者の説明書に従って使用して、組換えＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ限界デキストリナーゼ（ＨｖＬＤ）の活性を阻害する組換え発現ＨｖＬＤＩポリペプチドの能力を評価した。
方法
商業的に入手可能なインビトロアッセイ（プルラナーゼ／限界デキストリナーゼアッセイキットＰｕｌｌＧ６法、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を製造業者の説明書に従って使用して、組換えＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ限界デキストリナーゼ（ＨｖＬＤ）の活性を阻害する組換え発現ＨｖＬＤＩポリペプチドの能力を評価した。
【0232】
限界デキストリナーゼ活性を測定するためのＰｕｌｌＧ６法は、補助酵素α－グルコシダーゼおよびβ－グルコシダーゼと結合された、水溶性特定酵素基質、すなわち４，６－Ｏ－ベンジリデン－４－ニトロフェニル－６３－α－Ｄ－マルトトリオシルマルトトリオース（ＢＰＮＰＧ３Ｇ３）に基づく。
【0233】
基質中の１，６－α－結合の限界デキストリナーゼによる特有の加水分解に、α－グルコシダーゼおよびβ－グルコシダーゼ酵素によるグルコースおよび４－ニトロフェノールへのさらなる加水分解が続き、反応をアルカリ溶液の添加により終える。４００ｎｍでの吸光度は、限界デキストリナーゼ活性と直接相関され得る。
【0234】
高レベルの可溶性、組換えＨｖＬＤＩの合成のために、対応する遺伝子（ＮＳ０３）を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＳｏｌ－ＳＵＭＯ（Ｌｕｃｉｇｅｎ，ＵＳＡ）に挿入した。
ｐＳｏｌ－ＳＵＭＯ中の野生型またはヌクレオチド変異を含むＨｖＬＤＩで形質転換された、化学的にコンピテントなＥ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇ細胞を、異種発現のために使用した。タンパク質精製を、５ｍｌの固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）ｃｒｕｄｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）を用いて達成し、Ｎ末端タグを、ＴＥＶプロテアーゼ切断により除去した。
富化され、切断されおよび濃縮されたＨｖＬＤＩのタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いて測定し、その後インビトロ阻害アッセイを実施した。
ｐＳｏｌ－ＳＵＭＯ中の野生型またはヌクレオチド変異を含むＨｖＬＤＩで形質転換された、化学的にコンピテントなＥ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇ細胞を、異種発現のために使用した。タンパク質精製を、５ｍｌの固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）ｃｒｕｄｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）を用いて達成し、Ｎ末端タグを、ＴＥＶプロテアーゼ切断により除去した。
富化され、切断されおよび濃縮されたＨｖＬＤＩのタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いて測定し、その後インビトロ阻害アッセイを実施した。
【0235】
組換え野生型ＨｖＬＤの場合、対応する遺伝子（配列番号７）を、ｐＥＴ２８ａ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）（現在、Ｍｅｒｃｋ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に挿入した。発現は、ＢＬ２１（ＤＥ３）発現細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，ＵＳＡ）で実施した。タンパク質を、ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ金属親和性クロマトグラフィーカラム（ＧＥ Ｈｅａｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）で精製し、ＰＢＳバッファーに交換し、アッセイ中でのその利用の前に、４．６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【0236】
アッセイを、２５μＬの総反応体積で実施するために縮小した。予備実験では、１．５μＭのＨｖＬＤの最終濃度は、阻害を検出するが活性化も必要に応じ検出する能力を有する標準的反応条件下で良好なシグナルを生成した。精製された組換え変異体または野生型のＨｖＬＤＩの系列希釈を、反応バッファー（１００ｍＭのマレイン酸ナトリウム，ｐＨ５．５）中で実施し、１０μＬの各希釈液を、同じバッファー中で６μＭの組換えＨｖＬＤの１０μＬと混合した。混合物を、室温で５分間インキュベートした。反応を、同じ体積のＰ６試薬への１２．５μＬのＨｖＬＤ／ＨｖＬＤＩの添加により開始した。反応を、４０℃で３０分間進行させ、１８７．５μＬの停止試薬［２％（ｗ／ｖ）トリスベース溶液、ｐＨ９．０］の添加により停止した。それぞれ停止された反応液の５０μＬの分取量を、ハーフエリアの平底９６ウェルマイクロプレートの個別のウェルに移した。Ａ４００ｎｍを、体積のわずかな相違を考慮するために光路補正を用いて、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ３８４マイクロプレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）の底部から測定した。データを出力し、バックグラウンド（ＨｖＬＤは同じ体積の反応バッファーで置き換えられた）を減算し、吸光度をアッセイにおけるＨｖＬＤＩの濃度に対しプロットした。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン４、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＵＳＡ）を用いて決定した。遊離ＨｖＬＤ活性については図１を参照されたい。
【0237】
結果
精製した組換え野生型および変異体ＨｖＬＤＩを、商業的に入手できる酵素アッセイで使用して、遊離ＨｖＬＤ活性を検出した。野生型ＨｖＬＤＩおよび変異体ＨｖＬＤＩの組換え発現ＨｖＬＤを阻害する効力を、アッセイ中に放出された発色団の量により評価した。全ての試験した変異体では、顕著なより高い濃度が、野生型に比較して抑制効果を見るために必要であった（図１および表４参照）。
精製した組換え野生型および変異体ＨｖＬＤＩを、商業的に入手できる酵素アッセイで使用して、遊離ＨｖＬＤ活性を検出した。野生型ＨｖＬＤＩおよび変異体ＨｖＬＤＩの組換え発現ＨｖＬＤを阻害する効力を、アッセイ中に放出された発色団の量により評価した。全ての試験した変異体では、顕著なより高い濃度が、野生型に比較して抑制効果を見るために必要であった（図１および表４参照）。
【0238】
変異Ｐ６０、Ｖ６６ＭおよびＥ６８Ｋは、ＨｖＬＤを阻害する能力において大きな低下を示した。ＨｖＬＤＩ－Ｐ６０Ｌは、試験した最高の濃度であっても、ＨｖＬＤを完全には阻害しない。大幅にさらに高い濃度のＨｖＬＤＩ－Ｐ６０Ｌ、ＨｖＬＤＩ－Ｐ６０Ｓ、ＨｖＬＤＩ－Ｖ６６ＭおよびＨｖＬＤＩ Ｅ６８Ｋが、野生型ＬＤＩ大麦植物に比べて、ＨｖＬＤ％活性の阻害を達成するために必要である。
【表6】
【0239】
実施例３．発芽試験
次の大麦植物ＨＥＮＺ－１６、ＨＥＮＺ－１８、ＨＥＮＺ－３１、ＰａｕｓｔｉａｎおよびＰｌａｎｅｔを、標準条件下でシーズン２０１７／２０１８にニュージーランドの圃場で生育させ、穀粒が成熟に達すると収穫した。
次の大麦植物ＨＥＮＺ－１６、ＨＥＮＺ－１８、ＨＥＮＺ－３１、ＰａｕｓｔｉａｎおよびＰｌａｎｅｔを、標準条件下でシーズン２０１７／２０１８にニュージーランドの圃場で生育させ、穀粒が成熟に達すると収穫した。
【0240】
全ての大麦粒試料を、パラメーター発芽インデックス（Ｇインデックス）、発芽エネルギーおよび感水性について評価した。データは、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ－ＥＢＣ Ｍｅｔｈｏｄ ３．６．２ 大麦の発芽エネルギー：ＢＲＦ法、２００４に準拠して、４ｍＬの発芽試験については１００個の穀粒、および８ｍＬの発芽試験については１００個の大麦粒の２種の試料サイズに基づいた。
【0241】
発芽穀粒を、２０℃の加湿ボックス中にて２枚の濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ定性濾紙、グレード１、８５ｍｍ、カタログ番号１００１－０８５）および４ｍｌのミリＱ水を含むペトリ皿上で２４、４８および７２時間のインキュベーション後に計数した。
【0242】
Ｇインデックス
Ｇインデックスは、３日の期間にわたる発芽の指標であり、次の式：１０＊（ｘ＋ｙ＋ｚ）／（ｘ＋２＊ｙ＋３＊ｚ）で表され、式中、ｘは、２４時間で計数された発芽穀粒の数であり、ｙは、４８時間で計数された発芽穀粒の数であり、ｚは、７２時間で計数された発芽穀粒の数である。
Ｇインデックスは、３日の期間にわたる発芽の指標であり、次の式：１０＊（ｘ＋ｙ＋ｚ）／（ｘ＋２＊ｙ＋３＊ｚ）で表され、式中、ｘは、２４時間で計数された発芽穀粒の数であり、ｙは、４８時間で計数された発芽穀粒の数であり、ｚは、７２時間で計数された発芽穀粒の数である。
【0243】
発芽エネルギー
発芽エネルギーは、発芽試験中の総穀粒の内の発芽穀粒のパーセンテージを表す。発芽エネルギーは、２４時間毎の発芽穀粒の３日間の計数値に基づいて計算される。
発芽エネルギーは、発芽試験中の総穀粒の内の発芽穀粒のパーセンテージを表す。発芽エネルギーは、２４時間毎の発芽穀粒の３日間の計数値に基づいて計算される。
【0244】
感水性
感水性は、８ｍｌのミリＱ水を含むペトリ皿上で７２時間のインキュベーション後に発芽穀粒を計数すること、および４ｍｌと比較することにより測定される：Ｇエネルギー、４ｍｌ－Ｇエネルギー、８ｍｌ。
感水性は、８ｍｌのミリＱ水を含むペトリ皿上で７２時間のインキュベーション後に発芽穀粒を計数すること、および４ｍｌと比較することにより測定される：Ｇエネルギー、４ｍｌ－Ｇエネルギー、８ｍｌ。
【0245】
結果
発芽インデックス（Ｇインデックス）、発芽エネルギーおよび感水性における有意差は、野生型大麦植物からの穀粒に比べて、ＨｖＬＤＩ変異体大麦植物からの穀粒について観察されなかった。
【表7】
【0246】
実施例４．糊化温度
次の大麦植物ＨＥＮＺ－１６ａ、ＨＥＮＺ－３１、ＰａｕｓｔｉａｎおよびＰｌａｎｅｔを、標準条件下にてデンマーク２０１７で生育させ、穀粒が成熟に達すると収穫した。
大麦粒試料を、実験室Ｒｅｔｓｃｈボールミルを用いて微粉に粉砕した。約１１５ｍｇの大麦粉を、その重量の３倍の水と混合し、２５ｕＬの懸濁液をピペット操作でアルミニウムパンに入れた。パンを、密閉状態でシールした。糊化温度を、１０℃／分の加熱速度で４０から９０℃に示差走査熱量計（ＤＳＣ－１ ＳＴＡＲｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ）中でパンを加熱することにより測定した。空のパンを、基準として使用した。
結果:
糊化温度における有意差は、観察されなかった。
次の大麦植物ＨＥＮＺ－１６ａ、ＨＥＮＺ－３１、ＰａｕｓｔｉａｎおよびＰｌａｎｅｔを、標準条件下にてデンマーク２０１７で生育させ、穀粒が成熟に達すると収穫した。
大麦粒試料を、実験室Ｒｅｔｓｃｈボールミルを用いて微粉に粉砕した。約１１５ｍｇの大麦粉を、その重量の３倍の水と混合し、２５ｕＬの懸濁液をピペット操作でアルミニウムパンに入れた。パンを、密閉状態でシールした。糊化温度を、１０℃／分の加熱速度で４０から９０℃に示差走査熱量計（ＤＳＣ－１ ＳＴＡＲｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ）中でパンを加熱することにより測定した。空のパンを、基準として使用した。
結果:
【表8】
【0247】
実施例５．フレックスモルト製麦工程
栽培品種ＰａｕｓｔｉａｎまたはＰｌａｎｅｔの野生型穀粒、および実施例１に記載のようにＨｖＬＤＩ中に変異を有する大麦植物の穀粒を、浸麦の前に約３～４％の外皮を取り除くために、注文製作の装置を用いて１分間の加速摩耗に供した。
栽培品種ＰａｕｓｔｉａｎまたはＰｌａｎｅｔの野生型穀粒、および実施例１に記載のようにＨｖＬＤＩ中に変異を有する大麦植物の穀粒を、浸麦の前に約３～４％の外皮を取り除くために、注文製作の装置を用いて１分間の加速摩耗に供した。
【0248】
穀粒を、プレキシガラスシリンダ中の水溶液中に置き、穀粒のカラムの下から大気を用いて常に通気した。空気流を、ＳｍａｒｔＴｒａｋ（登録商標）５０質量流量計およびコントローラー（Ｓｉｅｒｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて設定し、温度を、Ｔｅｓｔｏ７３５精密温度計（Ｔｅｓｔｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。
【0249】
野生型および変異大麦粒を、１μＭのジベレリン酸（ＧＡ３、Ｇ７６４５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０１％のＡｎｔｉｆｏａｍ－２０４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．０１％Ｈ２Ｏ２（Ａｐｏｔｅｋｅｔ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に調節した水中で２４時間インキュベートした、インキュベーションは、２３℃で実施され、穀粒は、９０Ｌ／時間の大気により通気された。排液後に、穀粒は、９０Ｌ／時間の大気により２４時間にわたり通気された。
【0250】
ジベレリン酸（ＧＡ）は、発芽大麦中のアリューロン層を活性化する植物ホルモンである。多くの麦芽製造業者は、製麦工程中に低濃度でＧＡを添加する。ここでは、ＧＡを、工程の開始時に、穀粒のインキュベーション用の水に補充した。ＧＡ３溶液を、無水エタノール中でジベレリン酸（Ｇ７６４５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から調製し、水に加えた。
【0251】
全インキュベーション中に、空気が、タンクの底部から湿潤穀物粒を通して導入される。製麦工程では、穀粒は、キルン乾燥されないが、いかなる乾燥ステップもなしに粉砕され糖化される。
【0252】
実施例６．ＶＬＢ製麦工程
ＨＥＮＺ－１６ａおよびＰａｕｓｔｉａｎ大麦植物からの２５ｋｇの大麦粒を、ＶＬＢ，Ｂｅｒｌｉｎで麦芽化した。浸麦を１８℃で、および発芽を１４．５℃で５日間実施した。穀粒の目標含水量は、穀粒がキルン乾燥される前で４３％であった。
ＨＥＮＺ－１６ａおよびＰａｕｓｔｉａｎ大麦植物からの２５ｋｇの大麦粒を、ＶＬＢ，Ｂｅｒｌｉｎで麦芽化した。浸麦を１８℃で、および発芽を１４．５℃で５日間実施した。穀粒の目標含水量は、穀粒がキルン乾燥される前で４３％であった。
【0253】
実施例７．加水分解酵素活性を測定する方法
発芽中、大麦粒は、α－アミラーゼ、限界デキストリナーゼおよび（１，３；１，４）－β－グルカナーゼなどの一連の加水分解酵素を分泌し始める。通常、これらの酵素作用は、時間的に協調した様式で検出できる。
発芽中、大麦粒は、α－アミラーゼ、限界デキストリナーゼおよび（１，３；１，４）－β－グルカナーゼなどの一連の加水分解酵素を分泌し始める。通常、これらの酵素作用は、時間的に協調した様式で検出できる。
【0254】
試料調製
ＨＥＮＺ－１６、ＨＥＮＺ－１８、ＨＥＮＺ－３１、ＰａｕｓｔｉａｎおよびＰｌａｎｅｔからの７２時間発芽穀粒試料を、２０℃で加湿ボックス中にて、２枚の濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ、グレード１、８５ｍｍ、カタログ番号１００１－０８５）および４ｍｌのミリＱ水を含むペトリ皿上で７２時間にわたり１００個の穀粒を発芽させることにより、調製した。欧州醸造会議標準ＥＢＣ１９に従って調製されたＥＢＣ１９麦芽は、実験での対照として含められた。
ＨＥＮＺ－１６、ＨＥＮＺ－１８、ＨＥＮＺ－３１、ＰａｕｓｔｉａｎおよびＰｌａｎｅｔからの７２時間発芽穀粒試料を、２０℃で加湿ボックス中にて、２枚の濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ、グレード１、８５ｍｍ、カタログ番号１００１－０８５）および４ｍｌのミリＱ水を含むペトリ皿上で７２時間にわたり１００個の穀粒を発芽させることにより、調製した。欧州醸造会議標準ＥＢＣ１９に従って調製されたＥＢＣ１９麦芽は、実験での対照として含められた。
【0255】
ＨＥＮＺ－１６ａ、ＨＥＮＺ－３１、ＰａｕｓｔｉａｎおよびＰｌａｎｅｔからのフレックスモルト化穀粒試料を、実施例５に記載の方法に従って調製した。
【0256】
ＨＥＮＺ－１６ａおよびＰａｕｓｔｉａｎからのＶＬＢ麦芽化穀粒試料を、実施例６に記載の方法に従って調製した。
全ての７２時間発芽穀粒およびフレックスモルト化試料を、凍結乾燥機（ＳｃａｎＶａｃ ＣｏｏｌＳａｆｅ ４Ｌ，ＬａｂｏＧｅｎｅ）中で７２時間水を蒸発させることにより凍結し乾燥した。
酵素活性分析の前に、全ての試料を、標準Ｃｙｃｌｏｔｅｃｈ粉砕機（ＦＯＳＳ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて粉砕して、粉末を生成する。発芽大麦粒の酵素活性の全ての測定は、試料の粉砕の４８時間後以内に行われた。
全ての７２時間発芽穀粒およびフレックスモルト化試料を、凍結乾燥機（ＳｃａｎＶａｃ ＣｏｏｌＳａｆｅ ４Ｌ，ＬａｂｏＧｅｎｅ）中で７２時間水を蒸発させることにより凍結し乾燥した。
酵素活性分析の前に、全ての試料を、標準Ｃｙｃｌｏｔｅｃｈ粉砕機（ＦＯＳＳ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて粉砕して、粉末を生成する。発芽大麦粒の酵素活性の全ての測定は、試料の粉砕の４８時間後以内に行われた。
【0257】
α－アミラーゼ活性
α－アミラーゼ活性を、２５０ｍｇの粉末から出発する、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ（Ｋ－ＣＥＲＡ）によるＣｅｒａｌｐｈａ法の規模縮小バージョンにより測定した。
結果
同等のαアミラーゼ活性［Ｕ］／［ｇ］が、ＨｖＬＤＩ大麦植物変異体および対照大麦植物からの発芽穀粒、フレックスモルト化穀粒およびＶＬＢ麦芽化穀粒において、明らかになった。図２Ａ、３Ａ、および４Ａを参照。
α－アミラーゼ活性を、２５０ｍｇの粉末から出発する、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ（Ｋ－ＣＥＲＡ）によるＣｅｒａｌｐｈａ法の規模縮小バージョンにより測定した。
結果
同等のαアミラーゼ活性［Ｕ］／［ｇ］が、ＨｖＬＤＩ大麦植物変異体および対照大麦植物からの発芽穀粒、フレックスモルト化穀粒およびＶＬＢ麦芽化穀粒において、明らかになった。図２Ａ、３Ａ、および４Ａを参照。
【0258】
β－アミラーゼ活性
β－アミラーゼ活性を、２５０ｍｇの粉末から出発する、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ（Ｋ－ＢＥＴＡ３）によるＢｅｔａｍｙｌ－３法の規模縮小バージョンにより測定した。
結果
同等のβ－アミラーゼ活性［Ｕ］／［ｇ］が、ＨｖＬＤＩ大麦植物変異体および対照大麦植物からの発芽穀粒、フレックスモルト麦芽化穀粒およびＶＬＢ麦芽化穀粒において、明らかになった。図２Ｂ、３Ｂ、および４Ｂを参照。
β－アミラーゼ活性を、２５０ｍｇの粉末から出発する、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ（Ｋ－ＢＥＴＡ３）によるＢｅｔａｍｙｌ－３法の規模縮小バージョンにより測定した。
結果
同等のβ－アミラーゼ活性［Ｕ］／［ｇ］が、ＨｖＬＤＩ大麦植物変異体および対照大麦植物からの発芽穀粒、フレックスモルト麦芽化穀粒およびＶＬＢ麦芽化穀粒において、明らかになった。図２Ｂ、３Ｂ、および４Ｂを参照。
【0259】
遊離および総限界デキストリナーゼ活性
限界デキストリナーゼ活性を、２５０ｍｇの粉末から出発する、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｋ－ＰｕｌｌＧ６）によるＰｕｌｌＧ６法の規模縮小バージョンにより測定した。遊離限界デキストリナーゼ活性は、１５分毎に定期的に撹拌しながら、４０℃で１時間２．５ｍｌの０．１Ｍマレイン酸ｐＨ４．７中への粉末の抽出後に測定され、一方、総限界デキストリナーゼ活性は、１５分毎に定期的に撹拌しながら、４０℃で１時間２５ｍＭのジチオトレイトール含有の２．５ｍｌの０．１Ｍマレイン酸ｐＨ４．７中への粉末の抽出後に測定される。抽出後に、試料を卓上型遠心分離機（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｐｉｃｏ１７ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））により１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を５００ｕｌの試料カップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））に移した。アッセイは、Ｇａｌｌｅｒｙ（商標）Ｐｌｕｓ Ｂｅｅｒｍａｓｔｅｒ Ｄｉｓｃｒｅｔｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））で特注のアッセイを用いて実施される。２４ｕｌの上清を、２４ｕｌのＰｕｌｌＧ６基質とインキュベートし、反応を、３７℃で１時間進行させる。反応を、２４０ｕｌのＴｒｉｚｍａ ２％の添加により停止し、４００ｎｍでの吸光度を、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｋ－ＰｕｌｌＧ６，Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）によるＰｕｌｌＧ６法に従って、反応ブランクの減算後に測定する。
限界デキストリナーゼ活性を、２５０ｍｇの粉末から出発する、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｋ－ＰｕｌｌＧ６）によるＰｕｌｌＧ６法の規模縮小バージョンにより測定した。遊離限界デキストリナーゼ活性は、１５分毎に定期的に撹拌しながら、４０℃で１時間２．５ｍｌの０．１Ｍマレイン酸ｐＨ４．７中への粉末の抽出後に測定され、一方、総限界デキストリナーゼ活性は、１５分毎に定期的に撹拌しながら、４０℃で１時間２５ｍＭのジチオトレイトール含有の２．５ｍｌの０．１Ｍマレイン酸ｐＨ４．７中への粉末の抽出後に測定される。抽出後に、試料を卓上型遠心分離機（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｐｉｃｏ１７ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））により１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を５００ｕｌの試料カップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））に移した。アッセイは、Ｇａｌｌｅｒｙ（商標）Ｐｌｕｓ Ｂｅｅｒｍａｓｔｅｒ Ｄｉｓｃｒｅｔｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））で特注のアッセイを用いて実施される。２４ｕｌの上清を、２４ｕｌのＰｕｌｌＧ６基質とインキュベートし、反応を、３７℃で１時間進行させる。反応を、２４０ｕｌのＴｒｉｚｍａ ２％の添加により停止し、４００ｎｍでの吸光度を、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｋ－ＰｕｌｌＧ６，Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）によるＰｕｌｌＧ６法に従って、反応ブランクの減算後に測定する。
【0260】
結果
総限界デキストリナーゼの結果
ＨｖＬＤＩ大麦植物変異体からの７２時間発芽穀粒およびフレックスモルト化穀粒は、対照大麦植物に比べて、同等の総限界デキストリナーゼ活性［ｍＵ］／［ｇ］を有することが明らかになった。図２Ｃおよび３Ｃを参照。ＶＬＢ麦芽化穀粒中の総限界デキストリナーゼ活性は、ピルスナー麦芽化穀粒中の総限界デキストリナーゼ活性と同等であった。ＶＬＢ麦芽化穀粒に使用された製麦条件のため、総限界デキストリナーゼレベルは、標準ピルスナー麦芽に比較して、ＶＬＢ麦芽化穀粒からの穀粒中で、より少なかった。図４Ｃを参照されたい。
総限界デキストリナーゼの結果
ＨｖＬＤＩ大麦植物変異体からの７２時間発芽穀粒およびフレックスモルト化穀粒は、対照大麦植物に比べて、同等の総限界デキストリナーゼ活性［ｍＵ］／［ｇ］を有することが明らかになった。図２Ｃおよび３Ｃを参照。ＶＬＢ麦芽化穀粒中の総限界デキストリナーゼ活性は、ピルスナー麦芽化穀粒中の総限界デキストリナーゼ活性と同等であった。ＶＬＢ麦芽化穀粒に使用された製麦条件のため、総限界デキストリナーゼレベルは、標準ピルスナー麦芽に比較して、ＶＬＢ麦芽化穀粒からの穀粒中で、より少なかった。図４Ｃを参照されたい。
【0261】
遊離および遊離／総限界デキストリナーゼの結果
遊離限界デキストリナーゼ活性、および遊離／総限界デキストリナーゼの比率は、２種の対照大麦植物ＰａｕｓｔｉａｎおよびＰｌａｎｅｔ、ならびにＨＥＮＺ－１８およびＥＢＣ１９に比べて、ＨＥＮＺ－１６ａおよびＨＥＮＺ－３１大麦変異体からの発芽穀粒中でより高かった（図２Ｃ）。
遊離限界デキストリナーゼ活性、および遊離／総限界デキストリナーゼの比率は、２種の対照大麦植物ＰａｕｓｔｉａｎおよびＰｌａｎｅｔに比べて、ＨＥＮＺ－１６ａおよびＨＥＮＺ－３１大麦変異体からのフレックスモルト化穀粒中でより高かった（図３Ｃ）。
遊離限界デキストリナーゼ活性、および遊離／総限界デキストリナーゼの比率は、対照大麦植物Ｐａｕｓｔｉａｎならびにピルスナー麦芽に比べて、ＨＥＮＺ－１６ａ大麦変異体からのＶＬＢ麦芽化穀粒中でより高かった（図４Ｃ）。
遊離限界デキストリナーゼ活性、および遊離／総限界デキストリナーゼの比率は、２種の対照大麦植物ＰａｕｓｔｉａｎおよびＰｌａｎｅｔ、ならびにＨＥＮＺ－１８およびＥＢＣ１９に比べて、ＨＥＮＺ－１６ａおよびＨＥＮＺ－３１大麦変異体からの発芽穀粒中でより高かった（図２Ｃ）。
遊離限界デキストリナーゼ活性、および遊離／総限界デキストリナーゼの比率は、２種の対照大麦植物ＰａｕｓｔｉａｎおよびＰｌａｎｅｔに比べて、ＨＥＮＺ－１６ａおよびＨＥＮＺ－３１大麦変異体からのフレックスモルト化穀粒中でより高かった（図３Ｃ）。
遊離限界デキストリナーゼ活性、および遊離／総限界デキストリナーゼの比率は、対照大麦植物Ｐａｕｓｔｉａｎならびにピルスナー麦芽に比べて、ＨＥＮＺ－１６ａ大麦変異体からのＶＬＢ麦芽化穀粒中でより高かった（図４Ｃ）。
【0262】
動力学的測定結果
動力学的測定を、フレックスモルト化穀粒に対し追加で実施した。
基質動力学は、４０℃で１時間０．１Ｍマレイン酸ｐＨ４．７中へのフレックスモルト化粉末の抽出後に遊離限界デキストリナーゼについて、および４０℃で１時間２５ｍＭのジチオトレイトール含有の０．１Ｍマレイン酸ｐＨ４．７中への粉末の抽出後に総限界デキストリナーゼについて、測定される。抽出は、ＭｅｇａｚｙｍｅからのＰｕｌｌＧ６法と同様に実施された。
５０ｕｌの抽出物を、４０℃で３０分間０～３ｍＭの最終濃度の５０ｕｌのＰｕｌｌＧ６基質とアッセイチューブ中でインキュベートした。次に反応を、７５０ｕｌのＴｒｉｚｍａ ２％で停止し、４００ｍｍでの吸光度を、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｋ－ＰｕｌｌＧ６，Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）からのＰｕｌｌＧ６法に従って、反応ブランクの減算後にＧｅｎｅｓｙｓ １０Ｓ ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））で測定した。データを、公的に入手可能なウェブサイト、ｉｃ５０．ｔｋを用いて、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ関数にフィットさせ、Ｋｍを、反応がＶｍａｘの半分に達したときの基質の濃度として決定した。
遊離ＨｖＬＤのＫｍは、２種の対照大麦植物のＰｌａｎｅｔおよびＰａｕｓｔｉａｎに比べて、ＨＥＮＺ－１６ａおよびＨＥＮＺ－３１について低かった。表７参照。
総ＨｖＬＤＩに対する類似のＫｍが、ＨＥＮＺ－１６ａ、ＨＥＮＺ－３１、ＰｌａｎｅｔおよびＰａｕｓｔｉａｎについて観察された（表７）。
遊離限界デキストリナーゼ活性は、Ｐａｕｓｔｉａｎに比べて、ＨＥＮＺ－１６ａで高かった。図５も参照されたい。
動力学的測定を、フレックスモルト化穀粒に対し追加で実施した。
基質動力学は、４０℃で１時間０．１Ｍマレイン酸ｐＨ４．７中へのフレックスモルト化粉末の抽出後に遊離限界デキストリナーゼについて、および４０℃で１時間２５ｍＭのジチオトレイトール含有の０．１Ｍマレイン酸ｐＨ４．７中への粉末の抽出後に総限界デキストリナーゼについて、測定される。抽出は、ＭｅｇａｚｙｍｅからのＰｕｌｌＧ６法と同様に実施された。
５０ｕｌの抽出物を、４０℃で３０分間０～３ｍＭの最終濃度の５０ｕｌのＰｕｌｌＧ６基質とアッセイチューブ中でインキュベートした。次に反応を、７５０ｕｌのＴｒｉｚｍａ ２％で停止し、４００ｍｍでの吸光度を、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｋ－ＰｕｌｌＧ６，Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）からのＰｕｌｌＧ６法に従って、反応ブランクの減算後にＧｅｎｅｓｙｓ １０Ｓ ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））で測定した。データを、公的に入手可能なウェブサイト、ｉｃ５０．ｔｋを用いて、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ関数にフィットさせ、Ｋｍを、反応がＶｍａｘの半分に達したときの基質の濃度として決定した。
【表9】
総ＨｖＬＤＩに対する類似のＫｍが、ＨＥＮＺ－１６ａ、ＨＥＮＺ－３１、ＰｌａｎｅｔおよびＰａｕｓｔｉａｎについて観察された（表７）。
遊離限界デキストリナーゼ活性は、Ｐａｕｓｔｉａｎに比べて、ＨＥＮＺ－１６ａで高かった。図５も参照されたい。
【0263】
実施例８：マッシングおよび麦汁中の糖分析
ＶＬＢ麦芽および乾燥フレックスモルトを、標準Ｃｙｃｌｏｔｅｃｈ粉砕機（ＦＯＳＳ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて粉末に粉砕した。欧州醸造会議標準ＥＢＣ１９に従って調製されたＥＢＣ１９麦芽は、実験での対照として含められた。
ＶＬＢ麦芽および乾燥フレックスモルトを、標準Ｃｙｃｌｏｔｅｃｈ粉砕機（ＦＯＳＳ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて粉末に粉砕した。欧州醸造会議標準ＥＢＣ１９に従って調製されたＥＢＣ１９麦芽は、実験での対照として含められた。
【0264】
乾燥フレックスモルトのマッシング
７０ｇの乾燥物を、５：１の水：醸造用麦芽比で混合し、次のマッシングプログラムに従って、Ｌｏｃｈｎｅｒマッシング装置ですりつぶされた：５２℃で１０分、６５℃で５０分および７８℃で５分とし、温度の昇降温傾斜１℃／分により間隔をあける。この工程は、「マッシング」とも呼ばれ得る。
７０ｇの乾燥物を、５：１の水：醸造用麦芽比で混合し、次のマッシングプログラムに従って、Ｌｏｃｈｎｅｒマッシング装置ですりつぶされた：５２℃で１０分、６５℃で５０分および７８℃で５分とし、温度の昇降温傾斜１℃／分により間隔をあける。この工程は、「マッシング」とも呼ばれ得る。
【0265】
ＶＬＢモルトのマッシング
１５ｇの乾燥物を４：１の水：醸造用麦芽比で混合し、次のマッシングプログラムに従って、マッシングロボット装置（Ｚｉｎｓｓｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で糖化した：５２℃で１５分、６５℃で４５分および７２℃で１５分および７８℃で５分、温度の昇降温傾斜１℃／分により間隔をあける。この工程は、「マッシング」とも呼ばれ得る。
１５ｇの乾燥物を４：１の水：醸造用麦芽比で混合し、次のマッシングプログラムに従って、マッシングロボット装置（Ｚｉｎｓｓｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で糖化した：５２℃で１５分、６５℃で４５分および７２℃で１５分および７８℃で５分、温度の昇降温傾斜１℃／分により間隔をあける。この工程は、「マッシング」とも呼ばれ得る。
【0266】
フルクトース、スクロース、グルコース、マルトースおよびマルトトリオースなどの発酵性糖類ならびに他の糖類のレベルを、麦汁中で測定した。分析を、０．１ＭのＮａＯＨ中で中和した濾過麦汁に対し実施した。可溶性糖類を、パルス電気化学検出と組み合わせた高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）により測定した。
【0267】
乾燥フレックスモルトから調製された麦汁中の糖分析
結果を、図６に示す。図６Ａの結果は、ＨＥＮＺ－１６ａ大麦変異体の穀粒から調製した麦汁は、Ｐａｕｓｔｉａｎの穀粒から調製した麦汁に比べて、８．２％多い発酵性糖を含むことを示す。
結果を、図６に示す。図６Ａの結果は、ＨＥＮＺ－１６ａ大麦変異体の穀粒から調製した麦汁は、Ｐａｕｓｔｉａｎの穀粒から調製した麦汁に比べて、８．２％多い発酵性糖を含むことを示す。
【0268】
より具体的には、ＨＥＮＺ－１６ａから調製された麦汁中のグルコース、フルクトース、イソマルトース、イソマルトトリオース、マルトース、パノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースおよびマルトアクタオースのレベルは、Ｐａｕｓｔｉａｎから調製された麦汁中のこれらの糖類のレベルに比べて、より高い（図６Ｂ）。
【0269】
乾燥ＶＬＢモルトから調製された麦汁中の糖分析
結果を、図７に示す。
図７Ａの結果は、ＨＥＮＺ－１６ａ大麦変異体の穀粒から調製された麦汁は、Ｐａｕｓｔｉａｎの穀粒から調製された麦汁に比べて、７．２％多い発酵性糖を含むことを示す（図７Ａ）。
より具体的には、ＨＥＮＺ－１６ａから調製された麦汁中のグルコース、フルクトース、イソマルトース、イソマルトトリオース、マルトース、パノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトヘプタオースおよびマルトアクタオースのレベルは、Ｐａｕｓｔｉａｎから調製された麦汁中のこれらの糖類のレベルに比べて、より高い（図７Ｂ）。
結果を、図７に示す。
図７Ａの結果は、ＨＥＮＺ－１６ａ大麦変異体の穀粒から調製された麦汁は、Ｐａｕｓｔｉａｎの穀粒から調製された麦汁に比べて、７．２％多い発酵性糖を含むことを示す（図７Ａ）。
より具体的には、ＨＥＮＺ－１６ａから調製された麦汁中のグルコース、フルクトース、イソマルトース、イソマルトトリオース、マルトース、パノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトヘプタオースおよびマルトアクタオースのレベルは、Ｐａｕｓｔｉａｎから調製された麦汁中のこれらの糖類のレベルに比べて、より高い（図７Ｂ）。
【0270】
実施例９．アミロペクチン鎖長分布分析／重合度
デンマークシーズン２０１７
ＨＥＮＺ－１６ａ、ＨＥＮＺ－１８およびＨＥＮＺ－３１、ＰｌａｎｅｔおよびＰａｕｓｔｉａｎ大麦植物は、シーズン２０１７にデンマークの隣接区画中で生育された。
デンマークシーズン２０１７
ＨＥＮＺ－１６ａ、ＨＥＮＺ－１８およびＨＥＮＺ－３１、ＰｌａｎｅｔおよびＰａｕｓｔｉａｎ大麦植物は、シーズン２０１７にデンマークの隣接区画中で生育された。
【0271】
ニュージーランドシーズン２０１７／２０１８
ＨＥＮＺ－１６ａ、ＨＥＮＺ－１８およびＨＥＮＺ－３１、ＰｌａｎｅｔおよびＰａｕｓｔｉａｎ大麦植物は、シーズン２０１７／２０１８にニュージーランドの隣接区画中で生育された。収穫穀粒を後述のように分析した。
ＨＥＮＺ－１６ａ、ＨＥＮＺ－１８およびＨＥＮＺ－３１、ＰｌａｎｅｔおよびＰａｕｓｔｉａｎ大麦植物は、シーズン２０１７／２０１８にニュージーランドの隣接区画中で生育された。収穫穀粒を後述のように分析した。
【0272】
デンプンを、Ｓｈａｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）に従って粉末（２ｍｇ）から単離した。デンプンを、シュードモナス・スフェロイデスイソアミラーゼおよびバチルス・リケニフォルミスプルラナーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を用いて脱分岐し、Ｂｌｅｎｎｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９８）に従って、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１００分析カラムを用いてＩＣＳ－３０００クロマトグラフィーシステム（Ｄｉｏｎｅｘ）で分析した。
重合度および鎖長分布結果を、図８および９に示す。
変異体（ＨＥＮＺ－８、ＨＥＮＺ－９、ＨＥＮＺ－１６、ＨＥＮＺ－１８およびＨＥＮＺ－３１）のアミロペクチンの鎖長分布プロファイルは、２種の対照大麦植物のＰｌａｎｅｔおよびＰａｕｓｔｉａｎと基本的に同一であった。鎖長のわずかな差異は、標準的技術の変化の結果である。
重合度および鎖長分布結果を、図８および９に示す。
変異体（ＨＥＮＺ－８、ＨＥＮＺ－９、ＨＥＮＺ－１６、ＨＥＮＺ－１８およびＨＥＮＺ－３１）のアミロペクチンの鎖長分布プロファイルは、２種の対照大麦植物のＰｌａｎｅｔおよびＰａｕｓｔｉａｎと基本的に同一であった。鎖長のわずかな差異は、標準的技術の変化の結果である。
【0273】
実施例１０．収率および穀粒分析
収率
大麦植物を、デンマーク２０１８（２回反復）およびニュージーランド２０１７／２０１８（３～８回反復）に育種し、大麦植物の収率を測定した。実験結果を表８にまとめる。
有意差は、変異大麦植物と対照の間で観察されなかった。
粒重を、ニュージーランド２０１７／２０１８での育種大麦植物から分析した。実験結果を表９にまとめる。
収率
大麦植物を、デンマーク２０１８（２回反復）およびニュージーランド２０１７／２０１８（３～８回反復）に育種し、大麦植物の収率を測定した。実験結果を表８にまとめる。
【表10】
粒重を、ニュージーランド２０１７／２０１８での育種大麦植物から分析した。実験結果を表９にまとめる。
【表11】
【0274】
タンパク質、水およびデンプン含量
穀粒のタンパク質、水およびデンプン含量を、測定器の供給業者により提供されたこれらの成分のための較正曲線を適用して、製造業者の説明書に従いＦＯＳＳ Ｉｎｆｒａｔｅｃ（商標）ＮＯＶＡ測定器を用いて測定した。結果を下表１０に示す。
結果は、ＨＥＮＺ－１６、ＨＥＮＺ－１８、Ｐａｕｓｔｉａｎ、ＨＥＮＺ－３１およびＰｌａｎｅｔの間で、タンパク質含量、含水量、およびデンプン含量の有意差は存在しないことを示す。
穀粒のタンパク質、水およびデンプン含量を、測定器の供給業者により提供されたこれらの成分のための較正曲線を適用して、製造業者の説明書に従いＦＯＳＳ Ｉｎｆｒａｔｅｃ（商標）ＮＯＶＡ測定器を用いて測定した。結果を下表１０に示す。
【表12】
【図1A-E】
【図2A-C】
【図3A-C】
【図4A-C】
【図5】
【図6A-B】
【図7A-B】
【図8A-B】
【図8C-D】
【図9A-B】
【図9C-D】
【手続補正書】
【提出日】2022-11-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】