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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-19
(54)【発明の名称】ベバシズマブを含む薬物製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20230412BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230412BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20230412BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20230412BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20230412BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230412BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230412BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 M
A61K9/08
A61K9/19
A61K47/12
A61K47/18
A61K47/26
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022552775
(86)(22)【出願日】2021-03-01
(85)【翻訳文提出日】2022-09-02
(86)【国際出願番号】 CN2021078395
(87)【国際公開番号】W WO2021175175
(87)【国際公開日】2021-09-10
(31)【優先権主張番号】202010143839.6
(32)【優先日】2020-03-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522033726
【氏名又は名称】上海復宏漢霖生物技術股▲フン▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＨＥＮＬＩＵＳ ＢＩＯＴＥＣＨ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ３３０， Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｎｏ．２２２ Ｋａｎｇｎａｎ Ｒｏａｄ， Ｃｈｉｎａ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ， Ｐｕｄｏｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２１０， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(74)【代理人】
【識別番号】100103230
【弁理士】
【氏名又は名称】高山 裕貢
(72)【発明者】
【氏名】劉 慕君
(72)【発明者】
【氏名】方 源
(72)【発明者】
【氏名】韓 冬梅
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076AA30
4C076BB13
4C076BB24
4C076CC50
4C076DD09F
4C076DD38Q
4C076DD41Z
4C076DD51Z
4C076DD60Z
4C076DD67Q
4C076EE23F
4C076FF16
4C076FF36
4C076FF43
4C076FF61
4C076FF65
4C085AA14
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG10
(57)【要約】
１０－８０ｍｇ／ｍｌのベバシズマブを含む薬物製剤を提供し、前記薬物製剤の緩衝系は、好ましくは、１０－３０ｍＭの塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝液であり、安定剤としての２５－５０ｍｇ／ｍＬのスクロース又はソルビトール及び界面活性剤のツイーン８０を含み、ｐＨが５．０－５．６であり、前記製剤は、繰り返し凍結融解及び４０℃の高温加速条件でテストし、タンパク質安定性が良好であり、他の同類製剤処方より優れている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ベバシズマブを含む薬物製剤であって、前記薬物製剤は、ベバシズマブと、緩衝液と、安定剤と、界面活性剤とを含み、前記緩衝液は、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン、酢酸－酢酸ナトリウム、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム系のうちの一つ又は複数から選択され、
前記安定剤は、スクロース、トレハロース、ソルビトールのうちの一つ又は複数から選択され、
前記界面活性剤は、ツイーン８０又はツイーン２０である、ことを特徴とするベバシズマブを含む薬物製剤。
【請求項2】
前記緩衝液は、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝液であり、その濃度が１０－３０ｍＭである、ことを特徴とする請求項１に記載の薬物製剤。
【請求項3】
前記緩衝液は、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝液であり、その濃度が１０ｍＭである、ことを特徴とする請求項２に記載の薬物製剤。
【請求項4】
前記安定剤は、ソルビトール又はスクロースであり、その含有量が２０－１００ｍｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項１に記載の薬物製剤。
【請求項5】
前記界面活性剤は、ツイーン８０であり、その含有量が０．１ｍｇ／ｍＬ－０．５ｍｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項１に記載の薬物製剤。
【請求項6】
前記薬物製剤のｐＨ値は、５．０－５．６である、ことを特徴とする請求項１に記載の薬物製剤。
【請求項7】
前記ベバシズマブのタンパク質濃度は、１０－１００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、１０－８０ｍｇ／ｍＬであり、又は前記ベバシズマブのタンパク質濃度は、１０－５０ｍｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項１に記載の薬物製剤。
【請求項8】
前記製剤は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝液と、４５ｍｇ／ｍＬのソルビトールと、０．２ｍｇ／ｍＬのツイーン８０とを含み、ｐＨ５．３である、ことを特徴とする請求項１～７のいずれか一項に記載の薬物製剤。
【請求項9】
前記製剤は、１０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ又は８０ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを含む、ことを特徴とする請求項８に記載の薬物製剤。
【請求項10】
注射用の液体製剤又は凍結乾燥製剤である、ことを特徴とする請求項１のいずれか一項に記載の薬物製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬技術分野に属し、具体的には、ベバシズマブを含む薬物製剤に関する。
【背景技術】
【0002】
高特異性で、有効で安全なタンパク質（抗体）系薬物、特に治療性抗体薬物は、現在の世界中の薬物開発のホットスポットになっている。ベバシズマブ（別称Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、中国語商品名：安維汀、英語商品名：Ａｖａｓｔｉｎ）は、ロシュ社によって開発され、２００４年に初めて米国ＦＤＡの承認を受けて発売され、様々な悪性腫瘍、例えば、転移性結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、卵巣癌、子宮頸癌、膠芽腫などの治療に幅広く適用される。ベバシズマブは、ヒト化モノクローナルＩｇＧ１抗体であり、血管内皮細胞成長因子と特異的に結合することができ、それによってその内皮細胞表面の受容体（Ｆｌｔ－１とＫＤＲ）との結合を遮断し、その後の一連のカスケード反応を回避し、異常血管の新生を抑制し、さらに腫瘍の成長と拡散を防止し、最終的に腫瘍を消滅する目的を達成する。なお、ベバシズマブは、特異性が強く、ＶＥＧＦ経路を遮断するとともに、通常、他のターゲットを妨害しない。ベバシズマブは、異常血管を破壊し、且つ成熟血管を正常化することができるため、通常、併用化学療法に用いられ、即ち他の薬物と共同で腫瘍組織に作用する。このような治療手段において、ベバシズマブは、他の薬物の治療効果を効果的に補助し且つ強化することができる（Ｐｒｅｓｔａ Ｌ Ｇ，Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｏ＼’Ｃｏｎｎｏｒ Ｓ Ｊ，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ Ｖ，Ｍｅｎｇ ＹＧ，Ｋｒｕｍｍｅｎ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９７；５７：４５９３－９．）。
【0003】
モノクローナル系薬物の研究において、薬物製剤の研究は重要な役割を果たしている。ＩｇＧ１モノクローナルは主に注射用の液体製剤を採用しているが、液体製剤において、タンパク質は重合体又は粒子を形成しやすく、安定性に影響を与える。モノクローナル液体製剤の貯蔵期間での良好な物理的安定性、化学的安定性と生物的安定性をどのように維持するかは、無視できない問題になり、製薬産業の需要を満たす、安定したタンパク質製剤の開発は急務になっている。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、ベバシズマブを含む薬物製剤を提供することを目的とする。
【0005】
本発明は、選別と処方最適化により、ベバシズマブ（ＨＬＸ０４タンパク質）を研究対象として、緩衝液系を考察し、単一要素実験を設計することにより、高温加速条件で、緩衝系における異なるイオン強度、ｐＨ値及び安定剤種類、界面活性剤種類及び含有量などがタンパク質安定性に対する影響を考察する。そして、実験によって製剤における各成分含有量の配合比率範囲を決定した。
【0006】
本発明において、この製剤のタンパク質の高温加速条件での安定性を評価する検出項目は、外観、タンパク質濃度（Ａ２８０）、浸透圧、純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ、ＣＥ－ＳＤＳ）、タンパク質平均粒径及びＰｄＩ（ＤＬＳ）、サブヴィザブル粒子数（ＦｌｏｗＣａｍ）を含む。
【0007】
本発明の好適な薬物製剤は、ベバシズマブと、緩衝液と、安定剤と、界面活性剤とを含み、ここでは、前記ベバシズマブは、組換えヒトのモノクローナル抗体であり、その含有量は、望ましくは、１０－１００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは１０－８０ｍｇ／ｍＬであり、又は１０－５０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは、１０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬである。
【0008】
好ましくは、本発明の前記緩衝液は、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン、酢酸－酢酸ナトリウム、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム系のうちの一つを含み、より好ましくは、酢酸－酢酸ナトリウム、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝系であり、最も好ましくは、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝液系である。
【0009】
ここでは、前記薬物製剤のｐＨ値は、望ましくは、ｐＨ５．０－５．６であり、好ましくは、ｐＨ５．３である。
【0010】
この緩衝液系において、前記ヒスチジン－塩酸ヒスチジン、酢酸－酢酸ナトリウム、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝液の濃度は、望ましくは、１０－３０ｍＭであり、ここでは、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝液は、好ましくは、１０ｍＭである。
【0011】
本発明の製剤には、タンパク質薬物の安定性を保護し、タンパク質薬物の機能が条件の変化（例えば、凍結、凍結乾燥又は他の調製条件の変化）の影響を受けないように保護するための安定剤がさらに含まれる。安定剤は、望ましくは、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール又はグリシンのうちの一つ又は複数から選択され、好ましくは、スクロース、トレハロース、ソルビトールであり、より好ましくは、スクロースとソルビトールである。前記安定剤の含有量は、望ましくは、２０－１００ｍｇ／ｍＬであり、より望ましくは、２５－５０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、４５ｍｇ／ｍＬである。
【0012】
ここでは、前記界面活性剤は、当分野における従来の界面活性剤であり、望ましくは、非イオン性界面活性剤である。本明細書における界面活性剤の例は、望ましくは、ポリソルベートである。ここでは、より望ましくは、ツイーン８０である。前記界面活性剤の含有量は、望ましくは、０．１－０．５ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、０．２ｍｇ／ｍＬである。
【0013】
前記薬物製剤の剤型は、当分野における従来の剤型であり、望ましくは、注射用の液体製剤又は凍結乾燥製剤などを含む。前記注射用の液体製剤は、望ましくは、皮下注射製剤、静脈内注射製剤、腹腔内投与製剤、筋肉内注射製剤、静脈内／皮下注射製剤または硝子体内注射製剤などを含む。前記注射用の液体製剤は、望ましくは、液体注射製剤、液体プレフィルド注射製剤などを含み、好ましくは液体注射製剤であり、この液体注射製剤は、静脈内注射又は硝子体内注射に用いられてもよい。
【0014】
単一要素研究の結果に基づいて、ベバシズマブの好適な製剤処方を決定しており、その組成は、２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３、４５ｍｇ／ｍＬのソルビトール、０．２ｍｇ／ｍＬのツイーン８０である。上記配合比率に基づいて、完成品を調製し、加速安定性研究と繰り返し凍結融解安定性研究により、本発明の製剤処方の安定性を検証する。そして、異なる製剤処方との安定性テスト比較によって、高温加速試験の分子異性体、電荷異性体及びサブヴィザブル粒子の結果分析から、本発明処方の製剤におけるベバシズマブの安定性は他の処方より明らかに優れていることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】表５に示される処方の緩衝系におけるＨＬＸ０４タンパク質の物理化学的性質の考察であり、ここでは、（Ａ）は０週目のＴａｇｇ温度であり、（Ｂ）は０週目のＫＤ値であり、（Ｃ）は緩衝系におけるＨＬＸ０４タンパク質の０週目及び４０℃で４週間静置したタンパク質平均粒径と分散指数ＰＤＩであり、（Ｄ）は緩衝系におけるＨＬＸ０４タンパク質の０週目及び４０℃で４週間静置したＰｋ １ Ａｒｅａ含有率であり、（Ｅ）は４０℃条件でのＳＥＣ重合体含有量の変化傾向であり、（Ｆ）は４０℃条件でのＣＥＸメインピーク含有量の変化傾向である。
【図2】表８に示される処方の緩衝系におけるＨＬＸ０４タンパク質の物理化学的性質の考察であり、ここでは、（Ａ）は熱力学的安定性比較図であり、（Ｂ）は４０℃条件でのタンパク質平均粒径の変化傾向であり、（Ｃ）は４０℃条件でのＳＥＣ重合体含有量の変化傾向であり、（Ｄ）は４０℃条件でのＣＥＸメインピーク含有量の変化傾向であり、（Ｅ）は４０℃条件でのＦｌｏｗＣａｍサブヴィザブル粒子数の変化傾向である。
【図3】表１１に示される処方の緩衝系におけるＨＬＸ０４タンパク質の物理化学的性質の考察であり、ここでは、（Ａ）は熱力学的安定性比較図であり、（Ｂ）は４０℃条件でのタンパク質平均粒径の変化傾向であり、（Ｃ）は４０℃条件でのＳＥＣ重合体含有量の変化傾向であり、（Ｄ）は４０℃条件でのＣＥＸメインピーク含有量の変化傾向であり、（Ｅ）は４０℃条件でのＦｌｏｗＣａｍサブヴィザブル粒子数の変化傾向である。
【図4】表１４に示される処方の緩衝系におけるＨＬＸ０４タンパク質の物理化学的性質の考察であり、ここでは、図（Ａ）は熱力学的安定性比較図であり、（Ｂ）は４０℃条件でのＤＬＳ平均流体力学的粒径とＰｄＩの変化傾向であり、（Ｃ）は４０℃条件でのＳＥＣ重合体含有量の変化傾向であり、（Ｄ）は４０℃条件でのＣＥＸメインピーク含有量の変化傾向であり、（Ｅ）は４０℃条件でのＦｌｏｗＣａｍサブヴィザブル粒子数の変化傾向である。
【図5】表２０に示される処方の緩衝系におけるＨＬＸ０４タンパク質の物理化学的性質の考察であり、ここでは、（Ａ）は熱力学的安定性比較図であり、（Ｂ）は４０℃条件でのＤＬＳ平均流体力学的粒径とＰｄＩの変化傾向であり、（Ｃ）は４０℃条件でのＳＥＣ重合体含有量の変化傾向であり、（Ｄ）は４０℃条件でのＣＥＸメインピーク含有量の変化傾向であり、（Ｅ）は４０℃条件でのＦｌｏｗＣａｍサブヴィザブル粒子の変化傾向であり、（Ｆ）は－２０℃から室温までの条件でのＤＬＳ平均流体力学的粒径とＰｄＩの変化傾向であり、（Ｇ）は－２０℃から室温までの条件でのＳＥＣ重合体含有量の変化傾向であり、（Ｈ）は－２０℃から室温までの条件でのＣＥＸメインピーク含有量の変化傾向であり、（Ｉ）は－２０℃から室温までの条件でのＦｌｏｗＣａｍサブヴィザブル粒子数の変化傾向である。
【図6】（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）ＪＭＰソフトウェアが取得した満足度ディスクリプタモデル図である。
【図7】表２６に示される処方の緩衝系におけるＨＬＸ０４タンパク質の物理化学的性質の考察であり、（Ａ）は熱力学的安定性比較図であり、（Ｂ）は４０℃条件でのＤＬＳ平均タンパク質粒径の変化傾向であり、（Ｃ）は４０℃条件でのＳＥＣメインピーク含有量の変化傾向であり、（Ｄ）は４０℃条件でのＣＥＸメインピーク含有量の変化傾向であり、（Ｅ）は４０℃条件でのＦｌｏｗＣａｍサブヴィザブル粒子数の変化傾向である。
【図8】異なるタンパク質濃度安定性の比較図であり、（Ａ）はＳＥＣ重合体含有量の変化傾向であり、（Ｂ）はＳＥＣフラグメント含有量の変化傾向であり、（Ｃ）はＩｇＧ含有量（ＣＥ－ＳＤＳ非還元）含有量の変化傾向であり、（Ｄ）はＣＥＸメインピーク含有量の変化傾向である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下の実施例は、どのように本発明を実施及び使用するかについての完全な開示と記述を当業者に提供するために用いられ、本発明の範囲を限定するものではなく、以下の実験が実施される全ての実験であるとともに全ての実施可能な実験であることを意味するものでもない。
【0017】
実施例に使用される化学試薬は、いずれも市販の分析用の純粋な試薬であり、組換えモノクローナルは、現在知られているいずれかの方法で調製したモノクローナルであってもよく、以下の例示的な抗体調製方法は、上海複宏漢霖バイオテック株式会社（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈｅｎｌｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）により提供され、この例示的な方法は本発明を限定するものではない。
【0018】
本研究に使用される抗体タンパク質はＨＬＸ０４（ベバシズマブ）であり、従来技術における通常の方法で抗体を調製し、その軽重鎖配列は以下のとおりである。
【0019】
軽鎖
【0020】
重鎖
【0021】
実施例１．検出方法
１．１．外観及び可視異物
目視検査法を採用して外観検出を行う。サンプルボルトをきれいに拭き、暗室において上海黄海薬品検査ＳＣ－４０００Ａ型透明度検出器の下に置き、照度を１０００～１５００ Ｌｕｘに調整し、サンプルを遮光板の縁部（２５ｃｍ）に置き、供試品ペニシリンボトルのネック部を手持ちし、それぞれ黒色と白色の背景で、色、透明度と可視異物などを目視で検査する。
１．１．外観及び可視異物
目視検査法を採用して外観検出を行う。サンプルボルトをきれいに拭き、暗室において上海黄海薬品検査ＳＣ－４０００Ａ型透明度検出器の下に置き、照度を１０００～１５００ Ｌｕｘに調整し、サンプルを遮光板の縁部（２５ｃｍ）に置き、供試品ペニシリンボトルのネック部を手持ちし、それぞれ黒色と白色の背景で、色、透明度と可視異物などを目視で検査する。
【0022】
１．２．タンパク質含有量
Ｔｒｉｎｅａｎ Ｄｒｏｐｓｅｎｓｅ１６型タンパク質濃度測定器を使用して、２８０ｎｍ波長におけるサンプルの吸光度を検出し、且つ濃度を計算する。消光係数は１．６０ｍＬ＊ｍｇ－１＊ｃｍ－１である。
Ｔｒｉｎｅａｎ Ｄｒｏｐｓｅｎｓｅ１６型タンパク質濃度測定器を使用して、２８０ｎｍ波長におけるサンプルの吸光度を検出し、且つ濃度を計算する。消光係数は１．６０ｍＬ＊ｍｇ－１＊ｃｍ－１である。
【0023】
１．３．ｐＨ値
Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ型多機能パラメータ計を採用し、３つの標準液で校正し（ｐＨ値はそれぞれ４．０１、７．００と９．２１である）、電極傾きを９５％～１０５％の範囲内にし、２５μＬのサンプルを取ってｐＨ値を測定する。
Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ型多機能パラメータ計を採用し、３つの標準液で校正し（ｐＨ値はそれぞれ４．０１、７．００と９．２１である）、電極傾きを９５％～１０５％の範囲内にし、２５μＬのサンプルを取ってｐＨ値を測定する。
【0024】
１．４．浸透圧モル濃度
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｓｍｏ ＰＲＯ型浸透圧計を採用し、『中国薬典』（２０１５年版）通則０６３２「浸透圧モル濃度測定法」に準拠して測定し、２０μＬのサンプル及び２９０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧標準品２部を取り、氷点法でサンプル及び標準品の浸透圧値を測定する。
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｓｍｏ ＰＲＯ型浸透圧計を採用し、『中国薬典』（２０１５年版）通則０６３２「浸透圧モル濃度測定法」に準拠して測定し、２０μＬのサンプル及び２９０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧標準品２部を取り、氷点法でサンプル及び標準品の浸透圧値を測定する。
【0025】
１．５．粘度
ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ ＤＶ２Ｔ型粘度計を採用してサンプルの粘度を測定する。外付けの水浴鍋のスイッチをオンにし、温度を２５℃に設定し、０．５ｍＬのサンプルを吸引してサンプルカップの中心に滴下し、測定トルクが４０～６０％になるようにローター回転数を設定し、サンプルの粘度を測定する。
ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ ＤＶ２Ｔ型粘度計を採用してサンプルの粘度を測定する。外付けの水浴鍋のスイッチをオンにし、温度を２５℃に設定し、０．５ｍＬのサンプルを吸引してサンプルカップの中心に滴下し、測定トルクが４０～６０％になるようにローター回転数を設定し、サンプルの粘度を測定する。
【0026】
１．６．ＤＬＳ
ＤｙｎａＰｒｏ ＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ－ＩＩＩ型ハイスループット動静的光散乱計を採用して、サンプルの粒径と粒度分布を測定する。クリーンベンチ内で２５μＬのサンプルを取って３８４オリフィスプレートの細孔に入れ、サンプルを入れた後、被膜し、被膜された３８４オリフィスプレートを冷凍遠心機に入れ、遠心してサンプル細孔内の気泡を除去する。計器の具体的なパラメータ設定は、表１に示されるとおりである。
ＤｙｎａＰｒｏ ＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ－ＩＩＩ型ハイスループット動静的光散乱計を採用して、サンプルの粒径と粒度分布を測定する。クリーンベンチ内で２５μＬのサンプルを取って３８４オリフィスプレートの細孔に入れ、サンプルを入れた後、被膜し、被膜された３８４オリフィスプレートを冷凍遠心機に入れ、遠心してサンプル細孔内の気泡を除去する。計器の具体的なパラメータ設定は、表１に示されるとおりである。
【0027】
【表1】
【0028】
１．７．Ｔａｇｇ温度
ＤｙｎａＰｒｏ ＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ－ＩＩＩ型ハイスループット動静的光散乱計を採用して、サンプルの凝集温度を測定する。クリーンベンチ内で２５μＬのサンプルを取って３８４オリフィスプレートの細孔に入れ、サンプルを入れた後、膜を被覆し、膜を被覆した後の３８４オリフィスプレートを冷凍遠心機に入れ、遠心してサンプル細孔内の気泡を除去する。計器の具体的なパラメータ設定は、表２に示されるとおりである。
ＤｙｎａＰｒｏ ＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ－ＩＩＩ型ハイスループット動静的光散乱計を採用して、サンプルの凝集温度を測定する。クリーンベンチ内で２５μＬのサンプルを取って３８４オリフィスプレートの細孔に入れ、サンプルを入れた後、膜を被覆し、膜を被覆した後の３８４オリフィスプレートを冷凍遠心機に入れ、遠心してサンプル細孔内の気泡を除去する。計器の具体的なパラメータ設定は、表２に示されるとおりである。
【0029】
【表2】
【0030】
１．８．ＤＳＣ
ＴＡ Ｎａｎｏ ＤＳＣ示差走査熱量計を採用して、タンパク質立体配座に関する熱力学的パラメータＴｍ ｏｎｓｅｔ、Ｔｍ１及びＴｍ２値を測定する。プラセボを使用してタンパク質サンプル濃度を１ｍｇ／ｍＬに希釈し、希釈されたタンパク質サンプルと対応するプラセボをそれぞれ９６孔のサンプルプレートに入れ、脱気処理後、３００±５０Ｋｐａの圧力条件に置き、前平衡化時間を６００ｓ、温度範囲を２５～１００℃、走査速度を１℃／ｍｉｎに設定し、タンパク質サンプルとプラセボのＤＳＣ曲線をそれぞれ採取し、ここでは、プラセボを３回走査し、タンパク質サンプルを１回走査する。Ｔｗｏ Ｓｔａｔｅ Ｓｃａｌｅｄモデルを選択してデータフィッティングを行う。
ＴＡ Ｎａｎｏ ＤＳＣ示差走査熱量計を採用して、タンパク質立体配座に関する熱力学的パラメータＴｍ ｏｎｓｅｔ、Ｔｍ１及びＴｍ２値を測定する。プラセボを使用してタンパク質サンプル濃度を１ｍｇ／ｍＬに希釈し、希釈されたタンパク質サンプルと対応するプラセボをそれぞれ９６孔のサンプルプレートに入れ、脱気処理後、３００±５０Ｋｐａの圧力条件に置き、前平衡化時間を６００ｓ、温度範囲を２５～１００℃、走査速度を１℃／ｍｉｎに設定し、タンパク質サンプルとプラセボのＤＳＣ曲線をそれぞれ採取し、ここでは、プラセボを３回走査し、タンパク質サンプルを１回走査する。Ｔｗｏ Ｓｔａｔｅ Ｓｃａｌｅｄモデルを選択してデータフィッティングを行う。
【0031】
１．９．ＳＥＣ－ＨＰＬＣ
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０高速液体クロマトグラフィ、ＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００クロマトグラフカラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ、５μｍ）を採用し、カラム温度は室温であり（温度制御なし）、サンプル投入ディスクの温度は２～８℃であり、移動相組成は、１００ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、０．５％の塩化ナトリウムであり、ｐＨ値は６．８であり、定組成溶離を行い、溶離時間は３０ｍｉｎであり、流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎである。検出波長は２８０ｎｍであり、サンプル濃度を１ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプル投入量は５０μＬである。
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０高速液体クロマトグラフィ、ＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００クロマトグラフカラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ、５μｍ）を採用し、カラム温度は室温であり（温度制御なし）、サンプル投入ディスクの温度は２～８℃であり、移動相組成は、１００ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、０．５％の塩化ナトリウムであり、ｐＨ値は６．８であり、定組成溶離を行い、溶離時間は３０ｍｉｎであり、流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎである。検出波長は２８０ｎｍであり、サンプル濃度を１ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプル投入量は５０μＬである。
【0032】
１．１０．ＣＥＸ－ＨＰＬＣ
ＣＥＸ－ＨＰＬＣ検出は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０高速液体クロマトグラフィ、Ｔｈｅｒｍｏ ＰｒｏＰａｃＴＭＷＣＸ－１０クロマトグラフカラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ、１０μｍ）を採用し、カラム温度は３５℃であり、サンプル投入ディスクの温度は２～８℃であり、移動相Ａの組成は５０ｍＭのリン酸塩緩衝液であり、ｐＨ値は６．１０であり、移動相Ｂの組成は５０ｍＭのリン酸塩緩衝液、３００ｍＭの塩化ナトリウムであり、ｐＨ値は６．１０であり、勾配溶離を行い、溶離勾配は表３に示されるとおりであり、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎである。検出波長は２８０ｎｍであり、サンプル濃度を１ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプル投入量は５０μＬである。
ＣＥＸ－ＨＰＬＣ検出は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０高速液体クロマトグラフィ、Ｔｈｅｒｍｏ ＰｒｏＰａｃＴＭＷＣＸ－１０クロマトグラフカラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ、１０μｍ）を採用し、カラム温度は３５℃であり、サンプル投入ディスクの温度は２～８℃であり、移動相Ａの組成は５０ｍＭのリン酸塩緩衝液であり、ｐＨ値は６．１０であり、移動相Ｂの組成は５０ｍＭのリン酸塩緩衝液、３００ｍＭの塩化ナトリウムであり、ｐＨ値は６．１０であり、勾配溶離を行い、溶離勾配は表３に示されるとおりであり、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎである。検出波長は２８０ｎｍであり、サンプル濃度を１ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプル投入量は５０μＬである。
【0033】
【表3】
【0034】
１．１１．ＣＥ－ＳＤＳ
『中国薬典』（２０１５年版）通則３１２７「モノクローナル分子サイズ変異測定法（ＣＥ－ＳＤＳ法）」に準拠して測定する。非還元型と還元型ＣＥ－ＳＤＳを採用して検出し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰＡ８００ ｐｌｕｓ型キャピラリー電気泳動装置を採用し、全長が６７ｃｍであり、内径が５０μｍである非被覆キャピラリーを使用し、５ＫＶでサンプルを２０．０ｓ投入し、１５ＫＶで３５．０ｍｉｎ分離し、ＰＤＡ検出器を使用し、波長が２２０ｎｍである位置で検出し、面積正規化法で計算する。
『中国薬典』（２０１５年版）通則３１２７「モノクローナル分子サイズ変異測定法（ＣＥ－ＳＤＳ法）」に準拠して測定する。非還元型と還元型ＣＥ－ＳＤＳを採用して検出し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰＡ８００ ｐｌｕｓ型キャピラリー電気泳動装置を採用し、全長が６７ｃｍであり、内径が５０μｍである非被覆キャピラリーを使用し、５ＫＶでサンプルを２０．０ｓ投入し、１５ＫＶで３５．０ｍｉｎ分離し、ＰＤＡ検出器を使用し、波長が２２０ｎｍである位置で検出し、面積正規化法で計算する。
【0035】
１．１２．ＦｌｏｗＣａｍ
ＦｌｏｗＣａｍ ８１００粒子分析検出器を採用して、サンプルにおけるサブヴィザブル粒子の形態及び数量を測定する。計器の具体的なパラメータ設定は表４に示されるとおりである。
ＦｌｏｗＣａｍ ８１００粒子分析検出器を採用して、サンプルにおけるサブヴィザブル粒子の形態及び数量を測定する。計器の具体的なパラメータ設定は表４に示されるとおりである。
【0036】
【表4】
【0037】
実施例２ 緩衝系及びそのｐＨ値の選別研究
緩衝系／ｐＨ値の研究に対して、合計２回の実験を行い、単一要素試験の設計によって緩衝系の種類とｐＨ値範囲を選別する。
緩衝系／ｐＨ値の研究に対して、合計２回の実験を行い、単一要素試験の設計によって緩衝系の種類とｐＨ値範囲を選別する。
【0038】
２．１緩衝系／ｐＨ値の選別研究－Ｉ
２．１．１ 研究案
２．１．１ 研究案
【表5】
【0039】
この研究は、陽イオンクロマトグラフィーによりツイーン２０を除去した後のＨＬＸ０４タンパク質原液（ロット番号：ＡＳ２０１８０１）を採用し、限外濾過による液体交換、タンパク質濃度の調整を行った後、タンパク質最終濃度が約２５．０ｍｇ／ｍＬである代替処方（表５）として調製する。生物安全キャビネット内で０．２２μｍ使い捨て無菌フィルターを用いてサンプルを濾過し、そして１ｍＬのタンパク質溶液を２ｍＬのペニシリンボトルに無菌的に分け、１３ｍｍのゴム栓を加え、１３ｍｍのアルミニウムプラスチック組み合わせ蓋を圧延する。分けられたサンプルを４０℃の恒温恒湿ボックスに入れて保存し、表６の設計要求に基づいてサンプリングと検出を行う。
【0040】
【表6】
【0041】
２．１．１研究結果
０週では、タンパク質は、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン、酢酸－酢酸ナトリウム、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム系において、タンパク質のＴａｇｇ温度が比較的高く（図１Ａ）、ＫＤ値が正の値（図１Ｂ）であるとともに、タンパク質平均粒径が比較的小さく（図１Ｃ）、この三つの緩衝系におけるタンパク質の立体配座安定性とコロイド安定性が比較的良いことが表明された。
０週では、タンパク質は、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン、酢酸－酢酸ナトリウム、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム系において、タンパク質のＴａｇｇ温度が比較的高く（図１Ａ）、ＫＤ値が正の値（図１Ｂ）であるとともに、タンパク質平均粒径が比較的小さく（図１Ｃ）、この三つの緩衝系におけるタンパク質の立体配座安定性とコロイド安定性が比較的良いことが表明された。
【0042】
４０℃で４週間静置した後、タンパク質濃度、ｐＨ値結果により、有意差がない（表７）ことが示された。ＳＥＣ結果により、各緩衝系におけるタンパク質のメインピーク含有量がいずれも低下傾向を呈し（図１Ｅ）、クエン酸－クエン酸ナトリウム、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン、酢酸－酢酸ナトリウムの三つの緩衝系において、いずれもｐＨ値が低いほど、安定性が比較的良くなり、優劣順位がＣ５５＞Ａ５０＞Ｈ５５＞ＨＡ５５＞Ｃ６０≒Ａ５５＞Ｈ６０（図１Ｅ）であることが示された。ＤＬＳ結果により、タンパク質は、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン、リン酸二水素ナトリウム－リン酸水素二ナトリウム緩衝系において、分散指数ＰｄＩが大きくなり（図１Ｃ）、Ｐｋ １ Ａｒｅａ Ｉｎｔの含有率が小さくなる（図１Ｄ）ことが示され、１μｍより低い可溶性高重合体が生成したことが表明された。ＣＥＸ結果により、各緩衝系におけるタンパク質のメインピーク含有量がいずれも低下傾向を呈し（図１Ｆ）、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝系におけるタンパク質の安定性が他の緩衝系より明らかに優れていることが示された。
【0043】
【表7】
【0044】
２．２緩衝系／ｐＨ値の選別研究－II
２．２．１研究案
緩衝系／ｐＨ値の選別研究－Iの結果により、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン、酢酸－酢酸ナトリウム、クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝系において、いずれもｐＨが低いほど、ＳＥＣメインピーク含有量が高くなり、安定剤と界面活性剤を含まない処方において、４０℃の考察条件でタンパク質を１週間放置し、各処方では、いずれも目で見える粒子があることが示された。そのため、本実験では、比較的低いｐＨ５．０、スクロースとツイーン８０を添加する処方において、緩衝系をさらに選別する。
２．２．１研究案
緩衝系／ｐＨ値の選別研究－Iの結果により、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン、酢酸－酢酸ナトリウム、クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝系において、いずれもｐＨが低いほど、ＳＥＣメインピーク含有量が高くなり、安定剤と界面活性剤を含まない処方において、４０℃の考察条件でタンパク質を１週間放置し、各処方では、いずれも目で見える粒子があることが示された。そのため、本実験では、比較的低いｐＨ５．０、スクロースとツイーン８０を添加する処方において、緩衝系をさらに選別する。
【0045】
【表8】
【0046】
この研究は、ＨＬＸ０４タンパク質（ロット番号：ＡＳ２０１９０１－ＰＴ）を採用し、限外濾過による液体交換、補助材料の添加、タンパク質濃度の調整を行った後、タンパク質最終濃度が約２５．０ｍｇ／ｍＬである代替処方（表８）として調製する。生物安全キャビネット内で０．２２μｍ使い捨て無菌フィルターを用いてサンプルを濾過し、そして１ｍＬのタンパク質溶液を２ｍＬのペニシリンボトルに無菌的に分け、１３ｍｍのゴム栓を加え、１３ｍｍのアルミニウムプラスチック組み合わせ蓋を圧延する。分けられたサンプルを４０℃の恒温恒湿ボックスに入れて保存し、表９の設計要求に基づいてサンプリングと検出を行う。
【0047】
【表9】
【0048】
２．２．２研究結果
０週では、各緩衝系におけるタンパク質の基本的な物理化学的検出結果により、有意差がなく（表１０）、Ｔａｇｇ凝集温度の優劣順位がＡ５０≒ＨＡ５０＞Ｈ５０＞Ｃ５０（図２Ａ）であり、タンパク質平均粒径の優劣順位がＡ５０≒ＨＡ５０≒Ｈ５０＞Ｃ５０（図２Ｂ）であることが示された。酢酸－酢酸ナトリウム、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝系におけるタンパク質の立体配座安定性とコロイド安定性が比較的良いことが表明された。
０週では、各緩衝系におけるタンパク質の基本的な物理化学的検出結果により、有意差がなく（表１０）、Ｔａｇｇ凝集温度の優劣順位がＡ５０≒ＨＡ５０＞Ｈ５０＞Ｃ５０（図２Ａ）であり、タンパク質平均粒径の優劣順位がＡ５０≒ＨＡ５０≒Ｈ５０＞Ｃ５０（図２Ｂ）であることが示された。酢酸－酢酸ナトリウム、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝系におけるタンパク質の立体配座安定性とコロイド安定性が比較的良いことが表明された。
【0049】
４０℃で４週間静置した後、基本的な物理化学的検出結果により、有意差がない（表１０）ことが示された。ＳＥＣ結果により、各緩衝系におけるタンパク質のメインピーク含有量がいずれも低下傾向を呈し、優劣順位がＡ５０≒Ｈ５０≒ＨＡ５０＞Ｃ５０（図２Ｃ）であることが示された。ＣＥＸ結果により、各緩衝系におけるタンパク質のメインピーク含有量がいずれも低下傾向を呈し、優劣順位がＨ５０≒ＨＡ５０＞Ａ５０＞Ｃ５０（図２Ｄ）であることが示された。ＦｌｏｗＣａｍサブヴィザブル粒子の優劣順位はＡ５０＞Ｈ５０≒ＨＡ５０＞Ｃ５０（図２Ｅ）である。
【0050】
【表10】
【0051】
２．２．３研究結論
本研究結果により、酢酸－酢酸ナトリウム、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝系におけるタンパク質の立体配座安定性とコロイド安定性が比較的良いことが示された。ヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝系におけるタンパク質の電荷異性体の結果が比較的良く、総合的に考慮して、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウムをタンパク質の緩衝系として選択する。
本研究結果により、酢酸－酢酸ナトリウム、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝系におけるタンパク質の立体配座安定性とコロイド安定性が比較的良いことが示された。ヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝系におけるタンパク質の電荷異性体の結果が比較的良く、総合的に考慮して、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウムをタンパク質の緩衝系として選択する。
【0052】
実施例３ イオン強度の選別
３．１研究案
３．１研究案
【表11】
【0053】
この研究は、ＨＬＸ０４タンパク質（ロット番号：ＡＳ２０１９０１－ＰＴ）を採用し、限外濾過による液体交換、補助材料の添加、タンパク質濃度の調整を行った後、タンパク質最終濃度が約２５．０ｍｇ／ｍＬである代替処方（表１１）として調製する。生物安全キャビネット内で０．２２μｍ使い捨て無菌フィルターを用いてサンプルを濾過し、そして１ｍＬのタンパク質溶液を２ｍＬのペニシリンボトルに無菌的に分け、１３ｍｍのゴム栓を加え、１３ｍｍのアルミニウムプラスチック組み合わせ蓋を圧延する。分けられたサンプルを４０℃の恒温恒湿ボックスに入れて保存し、表１２の設計要求に基づいてサンプリングと検出を行う。
【0054】
【表12】
【0055】
３．２研究結果
０週では、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム系におけるタンパク質のＴａｇｇ凝集温度（図３Ａ）とタンパク質平均粒径（図３Ｂ）の優劣順位はＨＡ－１０＞ＨＡ－２０＞ＨＡ－３０であり、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝系におけるタンパク質の立体配座安定性とコロイド安定性が比較的良いことが表明された。
０週では、塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム系におけるタンパク質のＴａｇｇ凝集温度（図３Ａ）とタンパク質平均粒径（図３Ｂ）の優劣順位はＨＡ－１０＞ＨＡ－２０＞ＨＡ－３０であり、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝系におけるタンパク質の立体配座安定性とコロイド安定性が比較的良いことが表明された。
【0056】
４０℃で４週間静置した後、基本的な物理化学的検出結果により、有意差がない（表１３）ことが示された。ＳＥＣ結果により、各緩衝系におけるタンパク質のメインピーク含有量がいずれも低下傾向を呈し（図３Ｃ）、優劣順位がＨＡ－１０＞ＨＡ－２０≒ＨＡ－３０であることが示された。ＣＥＸ結果により、各緩衝系におけるタンパク質のメインピーク含有量がいずれも低下傾向を呈し、且つ低下傾向に有意差がない（図３Ｄ）ことが示された。ＦｌｏｗＣａｍサブヴィザブル粒子の優劣順位はＨＡ－１０＞ＨＡ－２０≒ＨＡ－３０（図３Ｅ）である。
【0057】
【表13】
【0058】
３．３研究結論
本研究の結果により、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝系におけるタンパク質の立体配座安定性とコロイド安定性が比較的良いことが示された。ＳＥＣメインピーク含有量の低下傾向は比較的緩やかである。ＦｌｏｗＣａｍサブヴィザブル粒子は比較的少ない。
本研究の結果により、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝系におけるタンパク質の立体配座安定性とコロイド安定性が比較的良いことが示された。ＳＥＣメインピーク含有量の低下傾向は比較的緩やかである。ＦｌｏｗＣａｍサブヴィザブル粒子は比較的少ない。
【0059】
実施例４ ｐＨ値範囲の選別
４．１研究案
４．１研究案
【表14】
【0060】
この研究は、ＨＬＸ０４タンパク質（ロット番号：ＡＳ２０１９０１－ＰＴ）を採用し、限外濾過による液体交換、補助材料の添加、タンパク質濃度の調整を行った後、タンパク質最終濃度が約２５．０ｍｇ／ｍＬである代替処方（表１４）として調製する。生物安全キャビネット内で０．２２μｍ使い捨て無菌フィルターを用いてサンプルを濾過し、そして１ｍＬのタンパク質溶液を２ｍＬのペニシリンボトルに無菌的に分け、１３ｍｍのゴム栓を加え、１３ｍｍのアルミニウムプラスチック組み合わせ蓋を圧延する。分けられたサンプルを４０℃の恒温恒湿ボックスに入れて保存し、表１５の設計要求に基づいてサンプリングと検出を行う。
【0061】
【表15】
【0062】
４．２研究結果
タンパク質を１０ｍＭの塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム系で４週間保存し、ｐＨ５．０－５．６範囲内でタンパク質の物理化学的性質には有意差がない（表１６、図４）。そのため、最終製剤処方のｐＨ値範囲は５．０－５．６である。
タンパク質を１０ｍＭの塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム系で４週間保存し、ｐＨ５．０－５．６範囲内でタンパク質の物理化学的性質には有意差がない（表１６、図４）。そのため、最終製剤処方のｐＨ値範囲は５．０－５．６である。
【0063】
【表16】
【0064】
実施例５ 安定剤種類の選別
５．１研究案
５．１研究案
【表17】
【0065】
この研究は、ＨＬＸ０４タンパク質（ロット番号：ＡＳ２０１９０１－ＰＴ）を採用し、限外濾過による液体交換、補助材料の添加、タンパク質濃度の調整を行った後、タンパク質最終濃度が約２５．０ｍｇ／ｍＬである代替処方（表１７）として調製する。生物安全キャビネット内で０．２２μｍ使い捨て無菌フィルターを用いてサンプルを濾過し、そして１ｍＬのタンパク質溶液を２ｍＬのペニシリンボトルに無菌的に分け、１３ｍｍのゴム栓を加え、１３ｍｍのアルミニウムプラスチック組み合わせ蓋を圧延する。分けられたサンプルに対して、表１８の設計要求に基づいて考察と検出を行う。
【0066】
【表18】
【0067】
５．２研究結果
０週では、タンパク質は、安定剤を含む各処方において、Ｔａｇｇ温度優劣順位がスクロース＞トレハロース＞ソルビトール≒マンニトール＞グリシンであり、Ｔｍ ｏｎｓｅｔ安定性優劣順位がグリシン＞マンニトール≒スクロース≒トレハロース≒ソルビトール（図５Ａ）である。
０週では、タンパク質は、安定剤を含む各処方において、Ｔａｇｇ温度優劣順位がスクロース＞トレハロース＞ソルビトール≒マンニトール＞グリシンであり、Ｔｍ ｏｎｓｅｔ安定性優劣順位がグリシン＞マンニトール≒スクロース≒トレハロース≒ソルビトール（図５Ａ）である。
【0068】
４０℃で４週間静置した後、ＳＥＣ結果により、安定剤を含む各処方におけるタンパク質のメインピーク含有量がいずれも低下傾向を呈し、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）サンプルの低下傾向が明らかで比較的に速い（図５Ｃ）ことが示された。ＤＬＳ結果の優劣順位は、ソルビトール≒マンニトール＞グリシン＞スクロース≒トレハロース（図５Ｂ）である。ＣＥＸ結果により、各安定剤を含む各処方におけるタンパク質のメインピーク含有量がいずれも低下傾向を呈し、グリシン含有サンプルの低下傾向が明らかで比較的に速い（図５Ｄ）ことが示された。ＦｌｏｗＣａｍ結果により、サブヴィザブル粒子の優劣順位がソルビトール≒スクロース≒トレハロース≒マンニトール＞グリシン（図５Ｅ）であることが示された。
【0069】
繰り返し凍結融解で１０回サイクルした後、ＳＥＣ結果により、スクロース、トレハロース、ソルビトールを含む処方におけるタンパク質のメインピーク含有量が０週と比べて変化せず、マンニトール又はグリシンを含む処方におけるメインピーク含有量の低下傾向が明らかで比較的に速い（図５Ｇ）ことが示された。ＤＬＳ結果の優劣順位は、ソルビトール＞スクロース≒トレハロース＞グリシン≒マンニトール（図５Ｆ）である。ＣＥＸ結果により、スクロース、トレハロース、ソルビトールを含む処方におけるタンパク質のメインピーク含有量が０週と比べて変化せず、マンニトールとグリシンとを含む処方におけるメインピーク含有量の低下傾向が明らかで比較的に速い（図５Ｈ）ことが示された。ＦｌｏｗＣａｍ結果により、サブヴィザブル粒子の優劣順位がソルビトール≒スクロース≒トレハロース＞マンニトール≒グリシン（図５Ｉ及び表１９）であることが示された。
【0070】
本研究の結果により、４０℃での高温静置と繰り返し凍結融解条件で、ｐＨ５．３である１０ｍＭの塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝系において、スクロース又はソルビトール安定剤を添加した処方は、タンパク質安定性が比較的良いことが示された。
【0071】
【表19】
【0072】
実施例６ 安定剤と界面活性剤の選別
６．１研究案
本研究は、ＪＭＰ １５ソフトウェアを利用し、安定剤種類、安定剤含有量及びツイーン８０含有量の３つの要素を選択し、Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ応答曲面法を採用して１０個の試験グループ（表２０）を設計し、凍結融解、振盪、光照射、高温などの加速条件によって、安定剤と界面活性剤の濃度（表２１）を決定する。
６．１研究案
本研究は、ＪＭＰ １５ソフトウェアを利用し、安定剤種類、安定剤含有量及びツイーン８０含有量の３つの要素を選択し、Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ応答曲面法を採用して１０個の試験グループ（表２０）を設計し、凍結融解、振盪、光照射、高温などの加速条件によって、安定剤と界面活性剤の濃度（表２１）を決定する。
【0073】
【表20】
【0074】
この研究は、ＨＬＸ０４タンパク質（ロット番号：ＡＳ２０１９０１－ＰＴ）を採用し、限外濾過による液体交換、補助材料の添加、タンパク質濃度の調整を行った後、タンパク質最終濃度が約２５．０ｍｇ／ｍＬである代替処方（今回の研究はＪＭＰソフトウェアを利用して、安定剤種類、安定剤含有量及びツイーン８０の含有量という３つの要素を選択し、Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ応答曲面法を採用して１０個の試験グループ（表２０）を設計し、凍結融解、振盪、光照射、高温などの加速条件によって、安定剤と界面活性剤の濃度（表２１）を決定する。生物安全キャビネット内で０．２２μｍ使い捨て無菌フィルターを用いてサンプルを濾過し、そして１ｍＬのタンパク質溶液を２ｍＬのペニシリンボトルに無菌的に分け、１３ｍｍのゴム栓を加え、１３ｍｍのアルミニウムプラスチック組み合わせ蓋を圧延する。分けられたサンプルに対して、表の設計要求に基づいて考察と検出を行う。
【0075】
【表21】
【0076】
６．２研究結果
検出データをＪＭＰ １５ソフトウェアに導入し、最小二乗法を利用して、各要素（従属変数）に対して多重線形回帰と二項方程式フィッティングを行い、統計学的に有意（Ｐ値＜０．１）なモデル（表２２）を得て、その補正決定係数（Ｒ２）は、いずれも０．９５より大きく、モデルと実際とのフィッティング性が良く、方程式が応答値に対して比較的良い正確性と信頼性を有し、実際の試験点の代わりに、この回帰モデルで実験結果に対して分析と予測を行うことができることが表明された。
検出データをＪＭＰ １５ソフトウェアに導入し、最小二乗法を利用して、各要素（従属変数）に対して多重線形回帰と二項方程式フィッティングを行い、統計学的に有意（Ｐ値＜０．１）なモデル（表２２）を得て、その補正決定係数（Ｒ２）は、いずれも０．９５より大きく、モデルと実際とのフィッティング性が良く、方程式が応答値に対して比較的良い正確性と信頼性を有し、実際の試験点の代わりに、この回帰モデルで実験結果に対して分析と予測を行うことができることが表明された。
【0077】
ＪＭＰ １５ソフトウェアを適用し、表２２における分析結果に基づいて、最大化満足度モデルを採用して最適な製剤処方を予測する。ソルビトールを安定剤として選択する場合、処方の満足度は比較的高く、ソルビトール含有量が４．５％である場合、処方満足度は最大であり、ポリソルベート８０含有量が増加し、処方満足度は低下傾向を呈し、ポリソルベート８０含有量が０．０１～０．０３％範囲内にある場合、処方満足度は比較的大きく、中点０．０２％を選択する（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃを参照）。
【0078】
緩衝系／ｐＨ値選別研究、イオン強度選別研究、界面活性剤種類選別研究、安定剤種類選別研究、安定剤と界面活性剤選別研究により、最終的な製剤処方組成は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム緩衝系、ｐＨ５．３、４５ｍｇ／ｍＬのソルビトール、０．２ｍｇ／ｍＬのツイーン８０である。
【0079】
【表22】
【0080】
実施例７ 選定処方と他の処方との比較
７．１ 研究案
７．１ 研究案
【表23】
【0081】
この研究は、ＨＬＸ０４タンパク質（ロット番号：ＡＳ２０１９０１－ＰＴ）を採用し、限外濾過による液体交換、補助材料の添加、タンパク質濃度の調整を行った後、タンパク質最終濃度が約２５．０ｍｇ／ｍＬである代替処方（表２３）として調製する。生物安全キャビネット内で０．２２μｍ使い捨て無菌フィルターを用いてサンプルを濾過し、そして１ｍＬのタンパク質溶液を２ｍＬのペニシリンボトルに無菌的に分け、１３ｍｍのゴム栓を加え、１３ｍｍのアルミニウムプラスチック組み合わせ蓋を圧延する。分けられたサンプルを４０℃の恒温恒湿ボックスに入れて保存し、表２４の設計要求に基づいてサンプリングと検出を行う。
【0082】
【表24】
【0083】
７．２研究結果
０週では、タンパク質は、３つの処方における外観がいずれも無色で微乳光がある液体であり、明らかな可視異物がない。Ｔａｇｇ凝集温度の優劣順位はＨＡ５３＞ＰＢ６２＞Ｃ５０（図７Ａ）であり、タンパク質平均粒径の優劣順位はＨＡ５３＞Ｃ５０＞ＰＢ６２（図７Ｂ）であり、ＨＡ５３処方におけるタンパク質の立体配座安定性とコロイド安定性が比較的良いことが表明された。
０週では、タンパク質は、３つの処方における外観がいずれも無色で微乳光がある液体であり、明らかな可視異物がない。Ｔａｇｇ凝集温度の優劣順位はＨＡ５３＞ＰＢ６２＞Ｃ５０（図７Ａ）であり、タンパク質平均粒径の優劣順位はＨＡ５３＞Ｃ５０＞ＰＢ６２（図７Ｂ）であり、ＨＡ５３処方におけるタンパク質の立体配座安定性とコロイド安定性が比較的良いことが表明された。
【0084】
４０℃で４週間静置した後、タンパク質は、３つの処方において、いずれも一定の安定性を維持することができ、タンパク質の基礎物理化学的検出には有意な変化がない（表２５）。ＳＥＣ結果により、各処方におけるタンパク質のメインピーク含有量がいずれも低下傾向を呈し（図７Ｃ）、優劣順位がＨＡ５３＞Ｃ５０＞ＰＢ６２であることが示された。ＣＥＸ結果により、各処方におけるタンパク質のメインピーク含有量がいずれも低下傾向を呈し（図７Ｄ）、優劣順位がＨＡ５３＞Ｃ５０＞ＰＢ６２であることが示された。ＦｌｏｗＣａｍサブヴィザブル粒子の優劣順位はＨＡ５３＞ＰＢ６２＞Ｃ５０（図７Ｅ）である。
【0085】
【表25】
【0086】
高温加速試験の分子異性体、電荷異性体及びサブヴィザブル粒子の結果によると、本出願に選定された処方におけるベバシズマブの安定性は、従来のベバシズマブに使用される処方（ＰＢ６２）及び他の類似処方より明らかに優れている。
【0087】
実施例８ 異なるタンパク質濃度安定性の比較
８．１研究案
８．１研究案
【表26】
【0088】
処方選別研究によって、ＨＬＸ０４製剤処方が１０ｍＭの塩酸ヒスチジン－酢酸ナトリウム、４５ｍｇ／ｍＬのソルビトール、０．２ｍｇ／ｍＬのツイーン８０、ｐＨ５．３であることが決定された。本研究では、４０℃の高温加速条件を採用し、ＨＬＸ０４製剤処方において、１０～８０ｍｇ／ｍＬ濃度範囲内のサンプルとＡｖａｓｔｉｎ(登録商標)との安定性差異を比較する。ＨＬＸ０４ ＰＴタンパク質（ロット番号：ＡＳ２０１９０１－ＰＴ）を採用し、限外濾過による液体交換、補助材料の添加、タンパク質濃度の調整を行った後、各代替処方（表２６）として調製する。生物安全キャビネット内で０．２２μｍ使い捨て無菌フィルターを用いてサンプルを濾過し、そして０．５ｍＬのタンパク質溶液を２ｍＬのペニシリンボトルに無菌的に分け、１３ｍｍのゴム栓を加え、１３ｍｍのアルミニウムプラスチック組み合わせ蓋を圧延する。分けられたサンプルと先発医薬品（ロット番号：Ｈ０１５４Ｂ１４、符号：Ａｖａｓｔｉｎ）を４０℃の恒温恒湿ボックスに入れて保存し、表２７の設計要求に基づいてサンプリングと検出を行う。
【0089】
【表27】
【0090】
８．２研究結果
本研究は、高温（４０℃）加速試験によって、ＨＬＸ０４製剤処方において、１０～８０ｍｇ／ｍＬ濃度範囲内のサンプルとＡｖａｓｔｉｎ(登録商標)との安定性差異を比較する。研究結果（表２８）により、０週では、ＨＬＸ０４製剤処方において、１０～８０ｍｇ／ｍＬ濃度範囲内のサンプルの重合体含有量が２．０～２．７％であり、Ａｖａｓｔｉｎの重合体含有量（３．６％）より少ないことが示された。４０℃で４週間静置した後、ＨＬＸ０４製剤処方において、１０～８０ｍｇ／ｍＬ濃度範囲内のサンプルの凝集速度（図８Ａ）、分解速度（図８Ｂ、Ｃ）及び電荷異性体変化傾向（図８Ｄ）は、いずれもＡｖａｓｔｉｎより著しく遅い。
本研究は、高温（４０℃）加速試験によって、ＨＬＸ０４製剤処方において、１０～８０ｍｇ／ｍＬ濃度範囲内のサンプルとＡｖａｓｔｉｎ(登録商標)との安定性差異を比較する。研究結果（表２８）により、０週では、ＨＬＸ０４製剤処方において、１０～８０ｍｇ／ｍＬ濃度範囲内のサンプルの重合体含有量が２．０～２．７％であり、Ａｖａｓｔｉｎの重合体含有量（３．６％）より少ないことが示された。４０℃で４週間静置した後、ＨＬＸ０４製剤処方において、１０～８０ｍｇ／ｍＬ濃度範囲内のサンプルの凝集速度（図８Ａ）、分解速度（図８Ｂ、Ｃ）及び電荷異性体変化傾向（図８Ｄ）は、いずれもＡｖａｓｔｉｎより著しく遅い。
【0091】
以上のように、先発医薬品Ａｖａｓｔｉｎ（６０ｍｇ／ｍＬ）に比べて、１０～８０ｍｇ／ｍＬ濃度範囲内のＨＬＸ０４製剤処方は安定性がより優れている。
【0092】
【表28】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図5I】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【国際調査報告】