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▶ ダイアメディカ ユーエスエー インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-19
(54)【発明の名称】ウリナスタチンポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230412BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20230412BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230412BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230412BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230412BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230412BHJP
A61K 38/55 20060101ALI20230412BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230412BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230412BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20230412BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20230412BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230412BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230412BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230412BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230412BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230412BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230412BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230412BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230412BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230412BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230412BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230412BHJP
A61P 37/00 20060101ALI20230412BHJP
A61P 39/02 20060101ALI20230412BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230412BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20230412BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230412BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K14/47 ZNA
C07K19/00
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12P21/02 C
A61K38/55
A61P29/00
A61P35/00
A61P1/18
A61P1/00
A61P37/02
A61P25/00
A61P17/00
A61P19/02
A61P13/12
A61P17/02
A61P31/04
A61P9/10
A61P11/00
A61P43/00 105
A61P1/16
A61P37/00
A61P39/02
A61P37/06
A61P35/04
A61P35/02
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022553090
(86)(22)【出願日】2021-03-05
(85)【翻訳文提出日】2022-10-28
(86)【国際出願番号】 US2021021148
(87)【国際公開番号】W WO2021178843
(87)【国際公開日】2021-09-10
(31)【優先権主張番号】62/985,499
(32)【優先日】2020-03-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/021,938
(32)【優先日】2020-05-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/108,773
(32)【優先日】2020-11-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522350483
【氏名又は名称】ダイアメディカ ユーエスエー インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ポールズ， リック
(72)【発明者】
【氏名】ベルドールン， トッド
(72)【発明者】
【氏名】ジョンソン， カール フランク
(72)【発明者】
【氏名】ブレック， グレゴリー トーマス
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA91X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA02
4C084BA22
4C084BA34
4C084CA53
4C084DC32
4C084DC34
4C084NA14
4C084ZA02
4C084ZA36
4C084ZA59
4C084ZA66
4C084ZA75
4C084ZA81
4C084ZA89
4C084ZA96
4C084ZB07
4C084ZB08
4C084ZB11
4C084ZB21
4C084ZB26
4C084ZB27
4C084ZB35
4C084ZC20
4C084ZC37
4H045AA10
4H045AA20
4H045BA41
4H045CA44
4H045EA28
(57)【要約】
ウリナスタチングリコフォーム、ウリナスタチン融合ポリペプチド、ならびに関連する組成物、混合物、ならびにウリナスタチンポリペプチドを組み換え産生する方法および疾患を治療する方法を含む、使用方法が提供される。本開示の実施形態は、（ｉ）Ｏ－結合グリコシル化部位でのグリコシル化を低減する、残基Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号１０）で修飾されたＯ－結合グリコシル化部位、（ｉｉ）残基Ｎ４５の残基でＮ－結合グリカン、および（ｉｉｉ）配列番号２または４によって定義される残基である、残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含む、単離された成熟ウリナスタチンポリペプチドを含み、ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）Ｏ－結合グリコシル化部位でのグリコシル化を低減する、残基Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号１０）での修飾されたＯ－結合グリコシル化部位、（ｉｉ）残基Ｎ４５の残基でＮ－結合グリカン、および（ｉｉｉ）残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含む、単離された成熟ウリナスタチンポリペプチドであって、前記残基は、配列番号２または４によって定義され、前記ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する、単離された成熟ウリナスタチンポリペプチド。
【請求項2】
配列番号２または４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、前記ウリナスタチンポリペプチドは、（ｉ）前記修飾されたＯ－結合グリコシル化部位、（ｉｉ）残基Ｎ４５の残基で前記Ｎ－結合グリカン、および（ｉｉｉ）残基Ｔ１７で前記Ｏ－結合グリカンを含むか、または保持し、前記ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する、請求項１に記載の単離された成熟ウリナスタチンポリペプチド。
【請求項3】
配列番号２と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、前記ウリナスタチンポリペプチドは、（ｉ）配列番号２のＳ１０Ａ置換、（ｉｉ）残基Ｎ４５の残基で前記Ｎ－結合グリカン、および（ｉｉｉ）残基Ｔ１７で前記Ｏ－結合グリカンを含むか、または保持し、前記ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する、請求項２に記載の単離された成熟ウリナスタチンポリペプチド。
【請求項4】
配列番号２を含む、からなる、または本質的にからなり、残基Ｎ４５の残基で前記Ｎ－結合グリカンおよび残基Ｔ１７で前記Ｏ－結合グリカンを含む、請求項２に記載の単離された成熟ウリナスタチンポリペプチド。
【請求項5】
前記少なくとも一つのウリナスタチン活性が、プロテアーゼ阻害活性、抗炎症活性、および抗転移活性の一つまたは複数から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された成熟ウリナスタチンポリペプチド。
【請求項6】
前記ウリナスタチンポリペプチドが、約または少なくとも約１０００～３０００Ｕ／ｍｇ、あるいは約または少なくとも約１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、もしくは３０００Ｕ／ｍｇの特異的活性を有し、１単位（Ｕ）が、２μｇのトリプシンの活性を５０％阻害する前記ウリナスタチンポリペプチドの量である、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された成熟ウリナスタチンポリペプチド。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載の単離された成熟ウリナスタチンポリペプチドおよび医薬的に許容される担体を含む、治療用組成物。
【請求項8】
（ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の単離された成熟ウリナスタチンポリペプチドと、（ｂ）残基Ｎ４５でＮ－結合グリカンを含み、残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含まない、第二の成熟ウリナスタチンポリペプチドとの混合物を含み、（ａ）および（ｂ）が、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する、請求項７に記載の治療用組成物。
【請求項9】
（ｂ）が、前記Ｏ－結合グリコシル化部位でのグリコシル化を低減する、残基Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号１０）で修飾されたＯ－結合グリコシル化部位を含み、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する、請求項８に記載の治療用。
【請求項10】
（ｂ）が、配列番号２または４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、前記修飾されたＯ－結合グリコシル化部位および残基Ｎ４５で前記Ｎ－結合グリカンを含むか、または保持し、残基Ｔ１７で前記Ｏ－結合グリカンを含まず、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する、請求項９に記載の治療用組成物。
【請求項11】
（ｂ）が、配列番号２と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、配列番号２の前記Ｓ１０Ａ置換および残基Ｎ４５で前記Ｎ－結合グリカンを含むか、または保持し、残基Ｔ１７で前記Ｏ－結合グリカンを含まず、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する、請求項１０に記載の治療用組成物。
【請求項12】
（ｂ）が、配列番号２を含む、からなる、または本質的にからなり、残基Ｎ４５で前記Ｎ－結合グリカンを含み、残基Ｔ１７で前記Ｏ－結合グリカンを含まず、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する、請求項１１に記載の治療用組成物。
【請求項13】
（ａ）：（ｂ）が、約２０：１～約１：２０の範囲内にある比、任意選択で、約２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、または１：２０で前記組成物に存在する、請求項７～１２のいずれか一項に記載の治療用組成物。
【請求項14】
ウリナスタチンの他のグリコシル化アイソフォーム（グリコフォーム）を実質的に含まない、請求項７～１３のいずれか一項に記載の治療用組成物。
【請求項15】
約１ＥＵ／ｍｇ未満のタンパク質であるエンドトキシンレベル、約１００ｎｇ／ｍｇ未満の総タンパク質である宿主細胞タンパク質、約１０ｐｇ／ｍｇ未満の総タンパク質である宿主細胞ＤＮＡを有し、および／または凝集物を実質的に含まない、請求項７～１４のいずれか一項に記載の治療用組成物。
【請求項16】
Ｎ末端からＣ末端の向きに、ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチドおよびウリナスタチンポリペプチドを含む、ウリナスタチン融合ポリペプチドであって、任意選択で、前記ウリナスタチンポリペプチドは、Ｏ－結合グリコシル化部位でのグリコシル化を低減する、残基Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号１０）で修飾されたＯ－結合グリコシル化部位を含み、前記ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する、ウリナスタチン融合ポリペプチド。
【請求項17】
前記ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチドが、配列番号５と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列含む、からなる、または本質的にからなる、請求項１６に記載のウリナスタチン融合ポリペプチド。
【請求項18】
前記ウリナスタチンポリペプチドが、配列番号１～４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、前記ウリナスタチンポリペプチドが、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有し、任意選択で、前記ウリナスタチンポリペプチドが、成熟ヒトウリナスタチンの配列によって定義されるＳ１０Ａ置換を有するか、または保持する、請求項１６または１７に記載のウリナスタチン融合ポリペプチド。
【請求項19】
前記ウリナスタチン融合ポリペプチドが、配列番号６または７と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、前記ウリナスタチンポリペプチドが、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有し、任意選択で、前記ウリナスタチンポリペプチドが、成熟ヒトウリナスタチンの配列によって定義されるＳ１０Ａ置換を有するか、または保持する、請求項１６～１８のいずれか一項に記載のウリナスタチン融合ポリペプチド。
【請求項20】
前記ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチドと前記ウリナスタチンポリペプチドの間にペプチドリンカーを含み、任意選択で、前記ペプチドリンカーが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００アミノ酸長である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のウリナスタチン融合ポリペプチド。
【請求項21】
前記ペプチドリンカーが、プロテアーゼ切断部位を含む、請求項２０に記載のウリナスタチン融合ポリペプチド。
【請求項22】
配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなる、請求項１６～２１のいずれか一項に記載のウリナスタチン融合ポリペプチド。
【請求項23】
配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなる、請求項１６～２２のいずれか一項に記載のウリナスタチン融合ポリペプチド。
【請求項24】
前記少なくとも一つのウリナスタチン活性が、プロテアーゼ阻害活性、抗炎症活性、および抗転移活性の一つまたは複数から選択される、請求項１６～２３のいずれか一項に記載のウリナスタチン融合ポリペプチド。
【請求項25】
前記ウリナスタチンポリペプチドが、約または少なくとも約１０００～３０００Ｕ／ｍｇ、あるいは約または少なくとも約１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、もしくは３０００Ｕ／ｍｇの特異的活性を有し、１単位（Ｕ）が、２μｇのトリプシンの活性を５０％阻害する前記ウリナスタチンポリペプチドの量である、請求項１６～２４のいずれか一項に記載のウリナスタチン融合ポリペプチド。
【請求項26】
請求項１６～２５のいずれか一項に記載のウリナスタチン融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項27】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号８または９と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％である核酸配列を含む、からなる、または本質的にからなる、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項28】
プロモーターエレメントに作動可能に連結された、請求項２６または２７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項29】
前記発現ベクターが、５’から３’の向きに、５’末端反復配列（ＬＴＲ）、パッケージング領域、プロモーター領域、前記ウリナスタチン融合ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）、および３’ＬＴＲを含む、からなる、または本質的にからなるレトロウイルスベクターである、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項30】
請求項２６もしくは２７に記載のポリヌクレオチド、または請求項２８もしくは２９に記載の発現ベクターを含む、組み換え哺乳類宿主細胞。
【請求項31】
ＨＥＫ２９３細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、任意選択で、ＧＰＥｘ ＣＨＯ（ＧＣＨＯ）細胞から選択される、請求項３０に記載の組み換え哺乳類宿主細胞。
【請求項32】
前記ＨＥＫ２９３細胞が、ｇａｇ、ｐｒｏ、およびｐｏｌタンパク質（任意選択で、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来）ならびに別々に遺伝子導入されたｅｎｖタンパク質を恒常的に発現し、前記ウリナスタチン融合ポリペプチドをコードする複製無能なレトロウイルス粒子を分泌する、請求項３１に記載の組み換え哺乳類宿主細胞。
【請求項33】
前記ＣＨＯ細胞が、前記ウリナスタチン融合ポリペプチドを発現し、フューリンポリペプチド、任意選択で、外来性フューリンポリペプチドを発現するか、または過剰発現する、請求項３１に記載の哺乳類宿主細胞。
【請求項34】
ウリナスタチンポリペプチドを組み換え産生する方法であって、（ａ）請求項３０～３３のいずれか一項に記載の組み換え哺乳類宿主細胞、任意選択で、ＣＨＯ細胞またはＧＣＨＯにおいて前記ウリナスタチン融合ポリペプチドを発現させること；および
（ｂ）前記ウリナスタチンポリペプチドを前記宿主細胞または前記宿主細胞を含有する培地から単離し、
これにより、前記ウリナスタチン融合ポリペプチドを組み換え産生することを含む、方法。
【請求項35】
前記ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチドを前記ウリナスタチンポリペプチドから切断して、配列番号１～４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなる組み換えウリナスタチンポリペプチドを産生することを含み、前記ウリナスタチンポリペプチドが、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記ウリナスタチンポリペプチドが、請求項１～６のいずれか一項に記載の成熟ウリナスタチンポリペプチドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
生理的条件下で、任意選択で、生理的条件の温度、塩分、および／またはｐＨ下で、前記ウリナスタチンポリペプチドの少なくとも一つのウリナスタチン活性を測定することを含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記ウリナスタチンポリペプチドを含む治療用組成物を調製することを含み、前記組成物が、タンパク質ベースまたは重量対重量ベースで少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の純度を有し、前記組成物が、凝集物を実質的に含まず、エンドトキシンを実質的に含まない、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
それを必要とする対象における疾患の治療において使用するための、請求項７～１５のいずれか一項に記載の治療用組成物、または請求項３８に記載の方法に従い調製される治療用組成物であって、任意選択で、前記疾患が、炎症性疾患または癌である、治療用組成物。
【請求項40】
それを必要とする対象における炎症性疾患または状態を治療する方法であって、前記対象に、請求項７～１５のいずれか一項に記載の治療用組成物、または請求項３８に記載の方法に従い調製される治療用組成物を投与し、これにより、前記対象における前記炎症性疾患または状態を治療することを含む、方法。
【請求項41】
前記炎症性疾患または状態が、膵炎（例えば、急性膵炎、慢性膵炎、内視鏡的逆行性膵胆管造影（ＥＲＣＰ）誘発性膵炎）、全身性炎症、大腸炎、自己免疫性脳脊髄炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、関節炎、腎不全、熱傷、重症敗血症および関連する炎症促進性／続発性状態（例えば、臓器不全）を含む敗血症／敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、川崎病、腎疾患（例えば、急性腎不全、慢性腎疾患）、虚血性状態（例えば、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳における虚血再灌流障害）、肺炎症および炎症性肺状態（例えば、肺感染症、混合性結合組織疾患と関連する感染性間質性肺炎を含む、肺炎、肺の線維症、急性呼吸促迫症候群）、肝炎を含む肝炎症、アナフィラキシー、手術後または術後合併症（例えば、腎機能、心臓手術、肺手術、認知障害、肝臓移植）、リポ多糖（ＬＰＳ）誘発性炎症または組織損傷（例えば、肺、肝臓、脳）、糖尿病に続く炎症または機能不全（例えば、糖尿病誘発性心機能不全）、火傷、熱射病、炎症性または神経障害性疼痛、急性中毒、高脂血症関連炎症、自己免疫関連炎症、同種移植片または輸血関連炎症、神経炎症、ならびに癌関連炎症の一つまたは複数から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記修飾されたウリナスタチンポリペプチドを投与することが、前記対象における、プロテアーゼ活性、内皮活性化／損傷、炎症促進性サイトカインならびにケモカイン産生／放出（任意選択で、ＩＬ－１β、ＭＩＰ－１α、ＭＣＰ－１、および／もしくはＣＸＣＬ１）、フィブリノーゲン合成、器官への好中球の動員、ならびに／または器官損傷の一つまたは複数を低減する、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項43】
それを必要とする対象における癌を治療する方法、癌の症状を回復させる方法、または癌の進行を阻害する方法であって、前記対象に、請求項７～１５のいずれか一項に記載の治療用組成物、または請求項３８に記載の方法に従い調製される治療用組成物を投与し、これにより、それを必要とする前記対象における癌を治療する、癌の症状を回復させる、または癌の進行を阻害することを含む、方法。
【請求項44】
前記癌が、メラノーマ（例えば、転移性黒色腫）、膵臓癌、骨癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、白血病（例えば、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、再発した急性骨髄性白血病）、リンパ腫、肝細胞腫（肝細胞癌）、肉腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、グリオーマ、多形神経膠芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌腫）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、甲状腺癌、および胃癌の一つまたは複数から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記癌が、転移性癌であり、任意選択で、前記修飾されたウリナスタチンポリペプチドの投与が、癌細胞浸潤および／または血管新生を低減する、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項46】
前記転移性癌が、（ａ）骨、肝臓、および／または肺に転移している、膀胱癌；
（ｂ）骨、脳、肝臓、および／または肺に転移している、乳癌；
（ｃ）肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、結腸直腸癌；
（ｄ）副腎、骨、脳、肝臓、および／または肺に転移している、腎臓癌；
（ｅ）副腎、骨、脳、肝臓、および／または他の肺部位に転移している、肺癌；
（ｆ）骨、脳、肝臓、肺、および／または皮膚／筋肉に転移している、メラノーマ；
（ｇ）肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、卵巣癌；
（ｈ）肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、膵臓癌；
（ｉ）副腎、骨、肝臓、および／または肺に転移している、前立腺癌；
（ｊ）肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、胃癌；
（ｌ）骨、肝臓、および／または肺に転移している、甲状腺癌；ならびに
（ｍ）骨、肝臓、肺、膣、および／または腹膜に転移している、子宮癌、の一つまたは複数から選択される、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月５日に出願された米国仮特許出願第６２／９８５，４９９号、２０２０年５月８日に出願された米国仮特許出願第６３／０２１，９３８号、および２０２０年１１月２日に出願された米国仮特許出願第６３／１０８，７７３号に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、その各々は参照によりその全体が組み込まれる。
本出願は、２０２０年３月５日に出願された米国仮特許出願第６２／９８５，４９９号、２０２０年５月８日に出願された米国仮特許出願第６３／０２１，９３８号、および２０２０年１１月２日に出願された米国仮特許出願第６３／１０８，７７３号に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、その各々は参照によりその全体が組み込まれる。
【0002】
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＤＩＡＭ＿０３９＿０３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、約３１ＫＢで、２０２１年３月５日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＤＩＡＭ＿０３９＿０３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、約３１ＫＢで、２０２１年３月５日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【0003】
本開示の実施形態は、ウリナスタチングリコフォーム、ウリナスタチン融合ポリペプチド、および関連する組成物、混合物、ならびにウリナスタチンポリペプチドを組み換え産生する方法および疾患を治療する方法を含む、使用方法を含む。
【背景技術】
【0004】
ウリナスタチン（また、尿トリプシン阻害剤）は、トリプシン、キモトリプシン、乳酸、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、および様々な膵酵素の活性を阻害するヒト尿由来の糖タンパク質プロテアーゼ阻害剤である。高度に精製されたウリナスタチンは、急性膵炎、慢性膵炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、熱傷、敗血症性ショック、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、および他の疾患の治療に臨床的に使用されている。
【0005】
ウリナスタチンは、膵炎を含む様々な状態のためのヒト使用が承認されている。しかしながら、ウリナスタチンは、プロテアーゼの活性部位と不可逆的に反応する強力なプロテアーゼ阻害剤であり、したがって、典型的にはその標的と１：１の化学量論で消費される、セルピンであるので、大量のウリナスタチンが必要である。この特性は、全身投与後に達成される比較的低いインビボ曝露と相まって、天然のウリナスタチンタンパク質から治療薬を生成する際に課題を生じる。
【0006】
したがって、当該技術分野において、その組み換え産生および／または治療有用性に関連する改善された特徴を有するウリナスタチンポリペプチド、ならびに組み換えウリナスタチンポリペプチドを産生する関連する方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本開示の実施形態は、（ｉ）Ｏ－結合グリコシル化部位でのグリコシル化を低減する、残基Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号１０）で修飾されたＯ－結合グリコシル化部位、（ｉｉ）残基Ｎ４５の残基でＮ－結合グリカン、および（ｉｉｉ）配列番号２または４によって定義される残基である、残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含む、単離された成熟ウリナスタチンポリペプチドを含み、ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。
【0008】
一部の実施形態では、単離された成熟ウリナスタチンポリペプチドは、配列番号２または４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、ウリナスタチンポリペプチドは、（ｉ）修飾されたＯ－結合グリコシル化部位、（ｉｉ）残基Ｎ４５の残基でＮ－結合グリカン、および（ｉｉｉ）残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含むか、または保持し、ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。一部の実施形態では、単離された成熟ウリナスタチンポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、ウリナスタチンポリペプチドは、（ｉ）配列番号２のＳ１０Ａ置換、（ｉｉ）残基Ｎ４５の残基でＮ－結合グリカン、および（ｉｉｉ）残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含むか、または保持し、ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。特定の実施形態では、単離された成熟ウリナスタチンポリペプチドは、配列番号２を含む、からなる、または本質的にからなり、残基Ｎ４５の残基でＮ－結合グリカンおよび残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含む。
【0009】
一部の実施形態では、少なくとも一つのウリナスタチン活性は、プロテアーゼ阻害活性、抗炎症活性、および抗転移活性のうちの一つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、ウリナスタチンポリペプチドは、約または少なくとも約１０００～３０００Ｕ／ｍｇ、あるいは約または少なくとも約１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、もしくは３０００Ｕ／ｍｇの特異的活性を有し、１単位（Ｕ）は、２μｇのトリプシンの活性を５０％阻害するウリナスタチンポリペプチドの量である。
【0010】
本明細書に記載される単離された成熟ウリナスタチンポリペプチド、および医薬的に許容される担体を含む治療用組成物もまた含まれる。一部の組成物は、（ａ）本明細書に記載される単離された成熟ウリナスタチンポリペプチドと、（ｂ）残基Ｎ４５にＮ－結合グリカンを含み、残基Ｔ１７にＯ－結合グリカンを含まない、第二の成熟ウリナスタチンポリペプチドの混合物を含み、（ａ）および（ｂ）は、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。一部の実施形態では、（ｂ）の成熟ウリナスタチンポリペプチドは、Ｏ－結合グリコシル化部位でのグリコシル化を低減する、残基Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号１０）に修飾されたＯ－結合グリコシル化部位を含み、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。一部の実施形態では、（ｂ）の成熟ウリナスタチンポリペプチドは、配列番号２または４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、修飾されたＯ－結合グリコシル化部位および残基Ｎ４５でＮ－結合グリカンを含むか、または保持し、残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含まず、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。一部の実施形態では、（ｂ）の成熟ウリナスタチンポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、配列番号２のＳ１０Ａ置換および残基Ｎ４５でＮ－結合グリカンを含むか、または保持し、残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含まず、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。特定の実施形態では、（ｂ）の成熟ウリナスタチンポリペプチドは、配列番号２を含む、からなる、または本質的にからなり、残基Ｎ４５でＮ－結合グリカンを含み、残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含まず、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。
【0011】
一部の実施形態では、（ａ）：（ｂ）の成熟ウリナスタチンポリペプチドは、約２０：１～約１：２０の範囲にある比、任意選択で、約２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、または１：２０で組成物に存在する。
【0012】
ある特定の治療用組成物は、ウリナスタチンのグリコシル化アイソフォーム（グリコフォーム）を実質的に含まない。ある特定の治療用組成物は、約１ＥＵ／ｍｇ未満のタンパク質であるエンドトキシンレベル、約１００ｎｇ／ｍｇ未満の総タンパク質である宿主細胞タンパク質、約１０ｐｇ／ｍｇ未満の総タンパク質である宿主細胞ＤＮＡを有し、および／または実質的に凝集物を含まない。
【0013】
ある特定の実施形態は、Ｎ末端からＣ末端の向きに、ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチドおよびウリナスタチンポリペプチドを含むウリナスタチン融合ポリペプチドを含み、例えば、ウリナスタチンポリペプチドは、Ｏ－結合グリコシル化部位でのグリコシル化を低減する、残基Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号１０）で修飾されたＯ－結合グリコシル化部位を含み、ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。
【0014】
ある特定の実施形態では、ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチドは、配列番号５と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列含む、からなる、または本質的にからなる。ある特定の実施形態では、ウリナスタチンポリペプチドは、配列番号１～４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有し、任意選択で、ウリナスタチンポリペプチドは、成熟ヒトウリナスタチンの配列によって定義されるＳ１０Ａ置換を有するか、または保持する。
【0015】
ある特定の実施形態では、ウリナスタチン融合ポリペプチドは、配列番号６または７と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有し、任意選択で、ウリナスタチンポリペプチドは、成熟ヒトウリナスタチンの配列によって定義されるＳ１０Ａ置換を有するか、または保持する。一部の実施形態は、ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチドとウリナスタチンポリペプチドの間にペプチドリンカーを含み、任意選択で、ペプチドリンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、プロテアーゼ切断部位を含む。
【0016】
一部のウリナスタチン融合ポリペプチドは、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなる。一部のウリナスタチン融合ポリペプチドは、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなる。特定の実施形態では、少なくとも一つのウリナスタチン活性は、プロテアーゼ阻害活性、抗炎症活性、および抗転移活性のうちの一つまたは複数から選択される。ある特定の実施形態では、ウリナスタチンポリペプチドは、約または少なくとも約１０００～３０００Ｕ／ｍｇ、あるいは約または少なくとも約１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、もしくは３０００Ｕ／ｍｇの特異的活性を有し、１単位（Ｕ）は、２μｇのトリプシンの活性を５０％阻害するウリナスタチンポリペプチドの量である。
【0017】
本明細書に記載されるウリナスタチン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた含まれる。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号８または９と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％である核酸配列を含む、からなる、または本質的にからなる。
【0018】
プロモーターエレメントに作動可能に連結された、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターもまた含まれる。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、５’から３’の向きに、以下の：５’末端反復配列（ＬＴＲ）、パッケージング領域、プロモーター領域、ウリナスタチン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）、および３’ＬＴＲを含む、からなる、または本質的にからなる、レトロウイルスベクターである。
【0019】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む組み換え哺乳類宿主細胞もまた含まれる。ある特定の組み換え哺乳類宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えば、ＧＰＥｘ ＣＨＯ（ＧＣＨＯ）細胞から選択される。ある特定の実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞は、ｇａｇ、ｐｒｏ、およびｐｏｌタンパク質（任意選択で、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来）ならびに別々に遺伝子導入されたｅｎｖタンパク質を恒常的に発現し、ウリナスタチン融合ポリペプチドをコードする複製無能なレトロウイルス粒子を分泌する。ある特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞は、ウリナスタチン融合ポリペプチドを発現し、フューリンポリペプチド、任意選択で、外来性フューリンポリペプチドを発現するか、または過剰発現する。
【0020】
一部の実施形態は、ウリナスタチンポリペプチドを組み換え産生する方法であって、
（ａ）本明細書に記載される組み換え哺乳類宿主細胞、任意選択で、ＣＨＯ細胞またはＧＣＨＯにおいてウリナスタチン融合ポリペプチドを発現させること；および
（ｂ）ウリナスタチンポリペプチドを宿主細胞または宿主細胞を含有する培地から単離し、
これにより、ウリナスタチン融合ポリペプチドを組み換え産生することを含む、方法を含む。
（ａ）本明細書に記載される組み換え哺乳類宿主細胞、任意選択で、ＣＨＯ細胞またはＧＣＨＯにおいてウリナスタチン融合ポリペプチドを発現させること；および
（ｂ）ウリナスタチンポリペプチドを宿主細胞または宿主細胞を含有する培地から単離し、
これにより、ウリナスタチン融合ポリペプチドを組み換え産生することを含む、方法を含む。
【0021】
ある特定の実施形態は、ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチドをウリナスタチンポリペプチドから切断して、配列番号１～４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなる組み換えウリナスタチンポリペプチドを産生することを含み、ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。ある場合では、ウリナスタチンポリペプチドは、成熟ヒトウリナスタチンの配列によって定義されるＳ１０Ａ置換を有するか、または保持する。ある場合では、ウリナスタチンポリペプチドは、本明細書に記載される成熟ウリナスタチンポリペプチドである。
【0022】
一部の実施形態は、生理的条件下で、任意選択で、生理的条件の温度、塩分、および／またはｐＨ下で、ウリナスタチンポリペプチドの少なくとも一つのウリナスタチン活性を測定することを含む。一部の実施形態は、ウリナスタチンポリペプチドを含む治療用組成物を調製することを含み、組成物は、タンパク質ベースまたは重量対重量ベースで少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の純度を有し、組成物は、実質的に凝集物を含まず、実質的にエンドトキシンを含まない。
【0023】
上述のように、本明細書に記載される成熟ウリナスタチンポリペプチドを含む、本明細書に記載されるウリナスタチンポリペプチド、その混合物（例えば、異なるウリナスタチングリコフォームを含む混合物）を含む治療用組成物、および本明細書に記載される方法により調製される治療用組成物もまた、含まれる。一部の組成物は、それを必要とする対象における疾患の治療における使用のためのものであり、例えば、疾患は、炎症性疾患または癌である。
【0024】
対象に本明細書に記載される治療用組成物を投与し、これにより、対象における炎症性疾患または状態を治療することを含む、それを必要とする対象における炎症性疾患または状態を治療する方法もまた、含まれる。一部の実施形態では、炎症性疾患または状態は、膵炎（例えば、急性膵炎、慢性膵炎、内視鏡的逆行性膵胆管造影（ＥＲＣＰ）誘発性膵炎）、全身性炎症、大腸炎、自己免疫性脳脊髄炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、関節炎、腎不全、熱傷、重症敗血症を含む敗血症／敗血症性ショックおよび関連する炎症促進性／続発性状態（例えば、臓器不全）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、川崎病、腎疾患（例えば、急性腎不全、慢性腎疾患）、虚血性状態（例えば、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳における虚血再灌流障害）、肺炎症および炎症性肺状態（例えば、肺感染症、混合性結合組織疾患と関連する感染性間質性肺炎を含む、肺炎、肺の線維症、急性呼吸促迫症候群）、肝炎を含む肝炎症、アナフィラキシー、手術後または術後合併症（例えば、腎機能、心臓手術、肺手術、認知障害、肝臓移植）、リポ多糖（ＬＰＳ）誘発性炎症または組織損傷（例えば、肺、肝臓、脳）、糖尿病に続く炎症または機能不全（例えば、糖尿病誘発性心機能不全）、火傷、熱射病、炎症性または神経障害性疼痛、急性中毒、高脂血症関連炎症、自己免疫関連炎症、同種移植片または輸血関連炎症、神経炎症、ならびに癌関連炎症の一つまたは複数から選択される。
【0025】
一部の実施形態では、修飾されたウリナスタチンポリペプチドの投与は、対象におけるプロテアーゼ活性、内皮活性化／損傷、炎症促進性サイトカインおよびケモカイン産生／放出（任意選択で、ＩＬ－１β、ＭＩＰ－１α、ＭＣＰ－１、および／またはＣＸＣＬ１）、フィブリノーゲン合成、器官への好中球の動員、ならびに／または器官損傷の一つまたは複数を低減する。
【0026】
対象に本明細書に記載される治療用組成物を投与し、これにより、それを必要とする対象における癌を治療すること、癌の症状を回復させること、または癌の進行を阻害することを含む、それを必要とする対象における癌を治療する方法、癌の症状を回復させる方法、または癌の進行を阻害する方法もまた、含まれる。一部の実施形態では、癌は、メラノーマ（例えば、転移性黒色腫）、膵臓癌、骨癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、白血病（例えば、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、再発した急性骨髄性白血病）、リンパ腫、肝細胞腫（肝細胞癌）、肉腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、グリオーマ、多形神経膠芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌腫）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、甲状腺癌、および胃癌の一つまたは複数から選択される。
【0027】
一部の実施形態では、癌は、転移性癌であり、任意選択で、修飾されたウリナスタチンポリペプチドの投与は、癌細胞浸潤および／または血管新生を低減する。一部の実施形態では、転移性癌は、
（ａ）骨、肝臓、および／または肺に転移している、膀胱癌；
（ｂ）骨、脳、肝臓、および／または肺に転移している、乳癌；
（ｃ）肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、結腸直腸癌；
（ｄ）副腎、骨、脳、肝臓、および／または肺に転移している、腎臓癌；
（ｅ）副腎、骨、脳、肝臓、および／または他の肺部位に転移している、肺癌；
（ｆ）骨、脳、肝臓、肺、および／または皮膚／筋肉に転移している、メラノーマ；
（ｇ）肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、卵巣癌；
（ｈ）肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、膵臓癌；
（ｉ）副腎、骨、肝臓、および／または肺に転移している、前立腺癌；
（ｊ）肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、胃癌；
（ｌ）骨、肝臓、および／または肺に転移している、甲状腺癌；ならびに
（ｍ）骨、肝臓、肺、膣、および／または腹膜に転移している、子宮癌、の一つまたは複数から選択される。
（ａ）骨、肝臓、および／または肺に転移している、膀胱癌；
（ｂ）骨、脳、肝臓、および／または肺に転移している、乳癌；
（ｃ）肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、結腸直腸癌；
（ｄ）副腎、骨、脳、肝臓、および／または肺に転移している、腎臓癌；
（ｅ）副腎、骨、脳、肝臓、および／または他の肺部位に転移している、肺癌；
（ｆ）骨、脳、肝臓、肺、および／または皮膚／筋肉に転移している、メラノーマ；
（ｇ）肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、卵巣癌；
（ｈ）肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、膵臓癌；
（ｉ）副腎、骨、肝臓、および／または肺に転移している、前立腺癌；
（ｊ）肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、胃癌；
（ｌ）骨、肝臓、および／または肺に転移している、甲状腺癌；ならびに
（ｍ）骨、肝臓、肺、膣、および／または腹膜に転移している、子宮癌、の一つまたは複数から選択される。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】図１は、全長ウリナスタチン融合ポリペプチド；配列番号６（ポリペプチド）；および配列番号８（核酸）をコードする、ｐＦＣＳ－ＤＭ３００ＦＬ－ＷＰＲＥ－ＳＩＮ（新規ｏｒｉ）、ＧＤＤＤＡ０１．０００２のベクターマップを示す。
【図2】図２は、成熟ウリナスタチン融合ポリペプチド；配列番号７（ポリペプチド）；および配列番号９（核酸）をコードする、ｐＦＣＳ－ＤＭ３００ＤＣＳ－ＷＰＲＥ－ＳＩＮ（新規ｏｒｉ）、ＧＤＤＤＡ０２．０００２のベクターマップを示す。
【図3】図３は、発現したウリナスタチン融合ポリペプチドの還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析を示す。レーン４：Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ事前染色標準物質。レーン５：尿由来の対照ウリナスタチン。レーン６：培養４日目の培地（全長ウリナスタチン融合物）。レーン７：培養８日目の培地（全長ウリナスタチン融合物）。レーン８：培養１２日目の培地（全長ウリナスタチン融合物）。レーン９：培養４日目の培地（成熟ウリナスタチン融合物）。レーン１０：培養８日目の培地（成熟ウリナスタチン融合物）。レーン１１：培養１２日目の培地（成熟ウリナスタチン融合物）。
【図4】図４は、発現したウリナスタチン融合ポリペプチドの還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析を示す。レーン１：Ｎｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ事前染色標準物質。レーン２：空。レーン３：尿由来の対照ウリナスタチン。レーン４：尿由来の対照ウリナスタチン（ＰＮＧａｓｅ処理）。レーン５：空。レーン６：全長ウリナスタチン。レーン７：全長ウリナスタチン（ＰＮＧａｓｅ処理）。レーン８：空。レーン９：成熟ウリナスタチン。レーン１０：成熟ウリナスタチン（ＰＮＧａｓｅ処理）。
【図5】図５は、組み換えウリナスタチンポリペプチド（Ｔ１７）が、インビトロでトリプシンを阻害することを示す。トリプシンの完全な阻害は、希釈係数（ＤＦ）２００および４０００で示される。トリプシン阻害活性は、ウリナスタチンの希釈係数が増加するにつれて減少し、これにより、トリプシンに対する特異的な阻害活性が証明された。
【図6B】同上。
【発明を実施するための形態】
【0029】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等または均等な、任意の方法、材料、組成物、試薬、細胞が、本開示の主題の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料が記載される。本明細書に引用される特許および特許出願を含むが、これらに限定されない、全ての刊行物および参考文献は、それぞれの個々の刊行物または参考文献が、完全に記載されるものとして、参照により本明細書に組み込まれることを具体的かつ個別に示されたかのように、その全体が参照により組み込まれる。本出願が優先権を主張する任意の特許出願は、刊行物および参考文献について上で記載された方法で、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0030】
本開示の実施は、反対に具体的に示されない限り、当業者であれば、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組み換えＤＮＡ技術の従来の方法を利用するであろうが、その多くは、例示の目的で以下に記載される。このような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙまたはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００９）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）および他の同様の参考文献を参照のこと。
【0031】
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養ならびに形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のための標準的な技術が使用され得る。酵素反応および精製技術は、製造元の仕様に従い、または当該技術分野で一般的に達成されるか、または本明細書に記載されるように行われ得る。これらおよび関連する技術ならびに手法は、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、また本明細書全体を通して引用および考察される様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載される通り、一般的に行われ得る。特定の定義が提供されない限り、本明細書に記載される分子生物学、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬および医薬化学に関連して利用される命名法、ならびに実験室手法および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。組み換えテクノロジー、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、医薬調製、製剤、および送達、ならびに患者の処置の標準的な技術が、使用され得る。
【0032】
本開示の目的のために、以下の用語が以下に定義される。
【0033】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の対象の一つまたは一つより多く（すなわち、少なくとも一つ）を指すために本明細書において使用される。一例として、「エレメント」は、一つのエレメントまたは一つより多くのエレメントを意味する。
【0034】
「約」とは、参照数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％で変化する、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを意味する。
【0035】
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、天然に生じるアミノ酸と天然に生じないアミノ酸の両方ならびにアミノ酸アナログおよび模倣物を意味することが意図される。天然に生じるアミノ酸は、タンパク質生合成中に利用される２０種の（Ｌ）－アミノ酸、ならびに４－ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、ホモシステイン、シトルリンおよびオルニチンなどの他のものを含む。天然に生じないアミノ酸は、例えば、（Ｄ）－アミノ酸、ノルロイシン、ノルバリン、ｐ－フルオロフェニルアラニン、エチオニンなどを含み、それらは、当業者に公知である。アミノ酸アナログは、天然に生じるおよび天然に生じないアミノ酸の修飾形態を含む。このような修飾は、例えば、アミノ酸上の化学基および部分の置換もしくは置き換え、またはアミノ酸の誘導体化を含み得る。アミノ酸模倣物は、例えば、参照アミノ酸の荷電および荷電スペーシング特徴などの機能的に類似する特性を呈する有機構造を含む。例えば、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）を模倣する有機構造は、類似の分子スペースに位置し、天然に存在するＡｒｇアミノ酸の側鎖のｅ－アミノ基と同じ程度の可動性を有する正に荷電した部分を有する。模倣物はまた、アミノ酸またはアミノ酸官能基の最適なスペーシングおよび荷電相互作用を維持するように、制約された構造を含む。当業者は、どの構造が機能的に均等なアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を構成するかを知っているか、または決定することができる。
【0036】
「生体適合性」は、概して、生物学的機能に有害ではなく、アレルゲン状態および疾患状態を含む、いかなる程度の許容できない毒性ももたらさない材料または化合物を指す。
【0037】
「コード配列」とは、遺伝子のポリペプチド産物のコードに関与する任意の核酸配列を意味する。対照的に、用語「非コード配列」は、遺伝子のポリペプチド産物のコードに直接的には関与しない任意の核酸配列を指す。
【0038】
本開示全体を通して、文脈が別段必要としない限り、用語「含む」、「含む」、および「含むこと」は、指定された工程もしくは構成要素または工程もしくは構成要素の群を含むことを意味するが、任意の他の工程もしくは構成要素または工程もしくは構成要素の群を除外することを意味しないことは理解されるだろう。
【0039】
「からなる」とは、「からなる」という語句に続くものを含み、かつそれらに限定されることを意味する。したがって、語句「からなる」は、列挙された構成要素が、必要とされるか、または必須であり、他の構成要素が存在しない場合があることを示す。「本質的にからなる」とは、語句の後に列挙される任意の構成要素を含み、列挙された構成要素について本開示に明記された活性または作用と干渉または関与しない他の構成要素に限定されることを意味する。したがって、「本質的にからなる」という語句は、列挙された構成要素が、必要とされるか、または必須であるが、他の構成要素が、任意選択であり、列挙された構成要素の活性または作用に実質的に影響を与えるかどうかに応じて、存在してもよいし、存在しなくてもよいことを示す。
【0040】
「エンドトキシンを含まない」または「実質的にエンドトキシンを含まない」という用語は、概して、エンドトキシンの最大微量（例えば、対象に対して臨床的に有害な生理的作用を有さない量）、好ましくは、検出不可能な量のエンドトキシンを含有する組成物、溶媒、および／または血管に関する。エンドトキシンは、細菌、典型的には、グラム陰性細菌などのある特定の微生物に関連する毒素であるが、エンドトキシンは、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）などのグラム陽性細菌において見出され得る。最もよく見られるエンドトキシンは、様々なグラム陰性細菌の外膜に見られるリポ多糖（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）であり、これらの細菌が疾患を引き起こす能力において中心的な病原性特性を表す。ヒトにおける少量のエンドトキシンは、発熱、血圧の低下、および炎症および凝固の活性化、とりわけ他の有害な生理的作用を生じ得る。
【0041】
したがって、医薬品製造では、たとえ少量であっても、ヒトにおいて副作用を引き起こす可能性があるため、しばしば、医薬品および／または薬物容器からエンドトキシンの大部分またはすべての痕跡を取り除くことが望ましい。３００℃を超える温度が、典型的には、大部分のエンドトキシンを分解するために必要とされるため、脱発熱オーブンが、この目的のため使用されてもよい。例えば、シリンジまたはバイアルなどの一次包装材料に基づき、２５０℃のガラス温度と３０分の保持時間の組み合わせが、しばしば、エンドトキシンレベルの３ｌｏｇの低減を達成するのに十分である。例えば、本明細書に記載され、当該技術分野で公知のクロマトグラフィーおよび濾過方法を含む、エンドトキシンを除去する他の方法が、企図されている。
【0042】
エンドトキシンは、当該技術分野で公知の日常的な技術を使用して検出することができる。例えば、リムルス・アメボサイト（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ）可溶化液アッセイは、カブトガニ由来の血液を利用し、エンドトキシンの存在を検出するための非常に高感度のアッセイである。この試験において、非常に低いレベルのＬＰＳは、この反応を増幅する強力な酵素カスケードにより、リムルス可溶化物の検出可能な凝固を引き起こし得る。エンドトキシンは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって定量することもできる。エンドトキシンを実質的に含まないために、エンドトキシンレベルは、約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０８、０．０９、０．１、０．５、１．０、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、または１０ＥＵ／ｍｇ未満の活性な化合物であってもよい。典型的には、１ｎｇのリポ多糖（ＬＰＳ）は、約１～１０ＥＵに相当する。
【0043】
ポリペプチドの「半減期」は、生物の血清もしくは組織への投与時のこのような活性と比較して、または任意の他の定義される時間点と比較して、ポリペプチドが、その薬理学的活性、生理的活性、もしくは他の活性の半分を失うのにかかる時間を指し得る。「半減期」はまた、生物の血清もしくは組織への投与時のこのような量もしくは濃度と比較して、または任意の定義される時間点と比較して、ポリペプチドの量または濃度が、生物の血清または組織に投与される開始量の半分まで低減されるのにかかる時間を指すことができる。半減期は、血清および／または任意の一つまたは複数の選択された組織において測定することができる。
【0044】
用語「調節すること」および「変化させること」は、典型的には、対照と比較して統計的に有意もしくは生理的に有意な量または程度で、「増加すること」、「増強すること」または「刺激すること」ならびに「減少すること」または「低減すること」を含む。「増加した」、「刺激された」または「増強した」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、組成物なし（例えば、薬剤の不存在）または対照組成物によって産生される量の、１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（間の全ての整数および範囲、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である増加を含み得る。「減少した」または「低減した」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、組成物なし（例えば、薬剤の不存在）または対照組成物によって産生される量における１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少（例えば、間の全ての整数および範囲を含む）を含み得る。比較および「統計的に有意な」量の例が、本明細書に記載される。
【0045】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」は、互換的に使用され、任意の特定の長さに限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。用語「酵素」は、ポリペプチドまたはタンパク質触媒を含み、ウリナスタチンに関して、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドと互換的に使用される。用語は、ミリストイル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化およびシグナル配列の付加または欠失を含む。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、一つまたは複数の鎖のアミノ酸を意味し、それぞれの鎖は、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸を含み、前述のポリペプチドまたはタンパク質は、天然のタンパク質、すなわち、天然に生じる細胞および具体的には、組み換えではない細胞、または遺伝子操作もしくは組み換え細胞によって産生されるタンパク質の配列を有する、ペプチド結合によって互いに非共有結合および／または共有結合された、複数の鎖を含み得、天然のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然の配列の一つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換を有する分子を含む。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、具体的には、本明細書に記述されるウリナスタチンタンパク質、またはウリナスタチンタンパク質の一つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換を有する配列を包含する。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、一つまたは複数の組み換えＤＮＡ分子を含む組み換え細胞によって産生され、典型的には、そうでなければ、細胞において見出されない異種ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の組み合わせから作成される、「組み換え」ポリペプチドである。
【0046】
本明細書において言及される、用語「単離された」ポリペプチドまたはンパク質は、対象タンパク質が、（１）典型的には、天然で見出される、少なくとも一部の他のタンパク質を含まず、（２）同じ供給源、例えば、同種由来の他のタンパク質を本質的に含まず、（３）異なる種由来の細胞によって発現され、（４）それが天然で関連する、少なくとも約５０パーセントのポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくは他の材料から分離されており、（５）「単離されたタンパク質」が、天然で関連するタンパク質の一部と関連しない（共有結合もしくは非共有結合性相互作用によって）、（６）それが天然で関連しない、ポリペプチドと作動可能に結合した（共有結合性もしくは非共有結合性相互作用によって）、または（７）天然で生じないことを意味する。このような単離されたタンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡによってコードされ得るか、合成期限のものであってもよく、またはその任意の組み合わせであってもよい。ある特定の実施形態では、単離されたタンパク質は、その使用（治療、診断、予防、研究またはその他）と干渉するであろう、その天然の環境で見出される、タンパク質もしくはポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない。
【0047】
ある特定の実施形態では、組成物中の任意の所定の薬剤（例えば、ウリナスタチンポリペプチド）の「純度」が、具体的に定義されてもよい。例えば、ある特定の組成物は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、化合物を分離し、同定し、定量するために、生化学および分析化学において頻繁に使用される周知の形態のカラムクロマトグラフィーによって測定される、間にある全ての少数および範囲を含む、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％純粋（例えば、タンパク質ベースで）である薬剤を含んでもよい。
【0048】
用語「参照配列」は、概して、別の配列が比較されている核酸コード配列、またはアミノ酸配列を指す。本明細書に記載される全てのポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列は、名称によって記載されるものならびに表および配列表に記載されるものをふくむ、参照配列として含まれている。
【0049】
用語「配列同一性」、または例えば、本明細書で使用される場合、「５０％同一の配列」を含む用語は、配列が、比較ウィンドウにわたってヌクレオチド対ヌクレオチドベースまたはアミノ酸対アミノ酸ベースで同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって二つの最適に整列された配列を比較すること、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が、両方の配列で生じて、一致した位置の数を生じる、位置の数を決定すること、一致した位置の数を、比較ウィンドウの位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割ること、および結果を１００倍して、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算され得る。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡ）のコンピューター実装によって、または選択された様々な方法のいずれかによって生じる、精査および最適な整列（すなわち、コンピューターウィンドウに渡り最高パーセンテージの相同性をもたらす）によって行われてもよい。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９、１９９７によって開示される、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムを参照してもよい。
【0050】
用語「溶解度」は、液体溶媒に溶解するため、均一な溶液を形成するための、本明細書において提供される薬剤（例えば、ウリナスタチンポリペプチド）の特性を指す。溶解度は、典型的には、溶媒の単位体積当たりの溶質の質量（溶媒１ｋｇ当たりの溶質のｇ、溶媒ｄＬ（１００ｍＬ）当たりのｇ、ｍｇ／ｍｌなど）、モル濃度、モル濃度、モル分画または濃度の他の類似の記載のいずれかによって、濃度として表される。溶媒の量当たり溶解できる溶質の最大平衡量は、温度、圧力、ｐＨ、および溶媒の性質を含む、特定された条件下でのその溶媒中のその溶質の溶解度である。ある特定の実施形態では、溶解度は、生理的ｐＨ、または他のｐＨ、例えば、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ７．４、ｐＨ７．６、ｐＨ７．８、もしくはｐＨ８．０（例えば、約ｐＨ５～８）で測定される。ある特定の実施形態では、溶解度は、水あるいはＰＢＳまたはＮａＣｌ（ＮａＰを含むか、もしくは含まない）などの生理的バッファーにおいて測定される。特定の実施形態では、溶解度は、比較的低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）ならびに比較的高い塩（例えば、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＮａＰ）で測定される。ある特定の実施形態では、溶解度は、血液または血清などの生物学的流体（溶媒）において測定される。ある特定の実施形態では、温度は、約室温（例えば、約２０、２１、２２、２３、２４、２５℃）または約体温（３７℃）であり得る。ある特定の実施形態では、薬剤は、室温または３７℃で少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する。
【0051】
「対象」または「それを必要とする対象」または「患者」または「それを必要とする患者」は、ヒト対象などの哺乳類対象を含む。
【0052】
「実質的に」または「本質的に」は、ほぼ完璧または完全に、例えば、ある所定の数量の９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上を意味する。
【0053】
「統計的に有意」とは、結果が、偶然に生じたとは考えられないことを意味する。統計的有意性は、当該技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。一般的に使用される有意性の尺度は、観察される事象が、帰無仮説が真である場合に生じる頻度または確率である、ｐ値を含む。得られたｐ値が、有意性レベルよりも小さい場合、次いで、帰無仮説が棄却される。単純な場合では、有意性レベルは、０．０５以下のｐ値で定義される。
【0054】
「治療応答」は、一つまたは複数の治療用薬剤の投与に基づく症状の改善（持続しているかどうかに関わらず）を意味する。
【0055】
本明細書で使用される場合、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）または細胞の「治療」は、個体または細胞の自然経過を変える試みで使用される任意のタイプの介入である。治療は、医薬組成物の投与を含むが、これに限定されず、予防的に、または病理学的現象の開始もしくは病因物質との接触のいずれかに続いて行われてもよい。また、治療される疾患もしくは状態の進行速度を低減すること、その疾患もしくは状態の発症を遅延させること、またはその発症の重症度を低減することに向けられ得る「予防的」治療もまた、含まれる。「治療」または「予防」は、必ずしも、疾患もしくは状態、またはその関連する症状の完全な根絶、治癒、または予防を示すものではない。
【0056】
用語「野生型」は、集団において最も頻繁に観察され、それゆえに、遺伝子の「正常型」または「野生型」形態と任意で設計される、遺伝子または遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）を指す。
【0057】
本明細書におけるそれぞれの実施形態は、別段明示的に記載されない限り、全ての他の実施形態に必要な変更を適用されるべきである。
【0058】
ウリナスタチングリコフォームおよび融合ポリペプチド
本開示のある特定の実施形態は、概して、その活性または機能的バリアントおよびフラグメントを含む、残基スレオニン１７（Ｔ１７）で予想外のＯ－結合グリカンを有する成熟ヒトウリナスタチンポリペプチドを含む、ヒトウリナスタチンの交互グリコフォームに関する。一部の実施形態は、その活性またはそうでなければ機能的バリアントおよびフラグメントを含む、「ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチド」および「ウリナスタチンポリペプチド」を含む、「ウリナスタチン融合ポリペプチド」に関する。
本開示のある特定の実施形態は、概して、その活性または機能的バリアントおよびフラグメントを含む、残基スレオニン１７（Ｔ１７）で予想外のＯ－結合グリカンを有する成熟ヒトウリナスタチンポリペプチドを含む、ヒトウリナスタチンの交互グリコフォームに関する。一部の実施形態は、その活性またはそうでなければ機能的バリアントおよびフラグメントを含む、「ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチド」および「ウリナスタチンポリペプチド」を含む、「ウリナスタチン融合ポリペプチド」に関する。
【0059】
「ウリナスタチン」（尿トリプシン阻害剤（ＵＴＩ）、ＨＩ－３０、ＡＳＰＩ、またはビクニンとしても言及される）は、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動による約３０ｋＤａの分子量を有する酸性糖タンパク質である。野生型、成熟ヒトウリナスタチンは、ヒト尿および血液で見られる多価のクニッツ型セリンプロテアーゼ阻害剤であり、１４７個のアミノ酸残基から構成されるが、二つのクニッツ型ドメインを含む（表Ｕ１を参照のこと）。それは、ウリナスタチンが、α１－ミクログロブリンに連結されている、全長前駆体（表Ｕ１を参照のこと）として肝細胞によって産生される。肝細胞において、異なるタイプのウリナスタチン含有タンパク質は、コンドロイチン硫酸鎖を介して、三つの進化的に関連する重鎖（ＨＣ）１、ＨＣ２、およびＨＣ３の内の一つまたは二つを有する、ウリナスタチンのアセンブリによって形成され、これらのタンパク質は、ＩαＩ、プレα－阻害剤（ＰαＩ）、インター－α－様阻害剤（ＩαＬＩ）、および遊離ウリナスタチンを含む、インター－α－阻害剤（ＩαＩ）ファミリーメンバーを含む。ＩαＩ、ｐαＩ、およびＩαＬＩは、それぞれ、ＨＣ１＋ＨＣ２＋ＵＴＩ、ＨＣ３＋ＵＴＩ、およびＨＣ２＋ＵＴＩからなる。
【0060】
炎症の間、ウリナスタチンは、末梢循環中または炎症部位での好中球エラスターゼによるタンパク質分解性切断を介してＩαＩファミリータンパク質から切断され、血漿ウリナスタチンレベルおよび遺伝子発現は、重度の炎症状態で変化する。したがって、血漿ウリナスタチンは、急性期反応の一つであると考えられる。さらに、ウリナスタチンは、感染が生じたとき、尿に迅速に放出され、尿抗トリプシン活性の大部分を構成する、優れた炎症性マーカーである。トリプシン、キモトリプシン、カリクレイン、プラスミン、顆粒球エラスターゼ、カテプシン、トロンビン、ならびに第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、および第ＸｌＩａ因子などの様々なセリンプロテアーゼは、ウリナスタチンによって阻害される。さらに、ウリナスタチンは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の阻害を介して、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）発現を抑制することができる。ウリナスタチンは、これらのプロテアーゼの活性を阻害することによって、器官損傷を予防するようである。
【0061】
上述の炎症性プロテアーゼの阻害を超えて、ウリナスタチンは、抗炎症活性を示し、好中球の浸潤、ならびにそれらからのエラスターゼおよび化学メディエーターの放出を抑制する。同様に、ウリナスタチンは、ＬＰＳによって刺激されたヒト単球における腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αおよびインターロイキン（ＩＬ）－１の産生ならびにインビトロでのＨＬ６０細胞または気管支上皮細胞におけるＬＰＳ－または好中球エラスターゼによって刺激されるＩＬ－８遺伝子発現を阻害する。インビトロでの、ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、およびｐ３８などのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路の発現を少なくとも部分的に介して、マクロファージによって、ＬＰＳにより誘導されるＴＮＦ－αならびに続くＩＬ－１βおよびＩＬ－６誘導を阻害することが示されている。ウリナスタチンはまた、インビトロで好中球介在性内皮細胞損傷を阻害し、これは、それが、好中球上で直接的／間接的に作用し、活性化エラスターゼの産生および分泌を抑制することを示唆している。さらに、ウリナスタチンは、インビトロで、敗血症の病態形成に役割を果たす、トロンボキサンＢ２産生などの刺激されたアラキドン酸代謝を下方制御する。
【0062】
特定の実施形態では、ウリナスタチンポリペプチドは、ヒトウリナスタチンポリペプチド、またはそのバリアントもしくはフラグメントである。例示的なヒトウリナスタチンポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の表Ｕ１に提供される。
【表U1】
【0063】
したがって、一部の実施形態では、成熟ウリナスタチンポリペプチドは、配列番号２または４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であり、配列番号２または４によって定義される残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを有するか、または保持するアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。また、ある特定の実施形態では、ウリナスタチン融合ポリペプチドのウリナスタチンポリペプチド部分は、表Ｕ１から選択される配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなる（配列番号１～４）。
【0064】
ある特定のウリナスタチンポリペプチドは、修飾されたＯ－結合グリコシル化部位を有する。ここで、セリン１０は、十分に保存されたＧｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号１０）Ｏ－結合グリコシル化部位で結合されたコンドロイチン硫酸（ＣＳ）鎖を有する。ＣＳ鎖は、１２～１８個の二糖リピート（ＧｌｃＵＡ １，３－ＧａｌＮａｃ１，４－）および従来の結合領域（ＧｌｃＵＡ １－３Ｇａｌ １－３Ｇａｌ １－４Ｘｙｌ １）－Ｏ－Ｓｅｒを有し、比較的短い（Ｍｗｔ約８０００）。通常は、結合領域の近くにあるものである、ＧａｌＮＡｃの約３０％は、Ｃ－４ヒドロキシル基で硫酸化されている。炎症中に合成されたＣＳ鎖は、硫酸化の減少に伴い短くなる。したがって、ある場合では、ウリナスタチンポリペプチドは、成熟ウリナスタチンのＧｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号１０）残基の一つまたは複数での少なくとも一つの置換および／または欠失を含み、それは、Ｏ－結合グリコシル化部位でのグリコシル化を低減する。特定の実施形態では、ウリナスタチンポリペプチドは、成熟ウリナスタチン配列によって定義される、位置Ｓ１０で置換または欠失、例えば、Ｓ１０Ａ置換を含む。また、ある特定の実施形態では、ウリナスタチンポリペプチドは、残基アスパラギン４５（Ｎ４５）で天然に生じるＮ－結合グリカンを有する。
【0065】
したがって、ある特定の実施形態は、（ｉ）Ｏ－結合グリコシル化部位でのグリコシル化を低減する、残基Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号１０）で修飾されたＯ－結合グリコシル化部位、（ｉｉ）残基Ｎ４５の残基でＮ－結合グリカン、および（ｉｉｉ）残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含む、単離された成熟ウリナスタチンポリペプチドを含み、残基は、配列番号２または４によって定義され、ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。一部の実施形態では、成熟ウリナスタチンポリペプチドは、配列番号２または４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、ウリナスタチンポリペプチドは、（ｉ）修飾されたＯ－結合グリコシル化部位、（ｉｉ）残基Ｎ４５の残基でＮ－結合グリカン、および（ｉｉｉ）残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含むか、または保持し、ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。成熟ウリナスタチンポリペプチドの具体的な例は、配列番号２と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、ウリナスタチンポリペプチドは、（ｉ）配列番号２のＳ１０Ａ置換、（ｉｉ）残基Ｎ４５の残基でＮ－結合グリカン、および（ｉｉｉ）残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含むか、または保持し、ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。
【0066】
一部の実施形態では、ウリナスタチンポリペプチドは、少なくとも一つの「ウリナスタチン活性」を有する。用語「ウリナスタチン活性」は、（ａ）トリプシン、キモトリプシン、カリクレイン、プラスミン、顆粒球エラスターゼ、カテプシン、トロンビン、ならびに／または第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、および第ＸｌＩａ因子の一つまたは複数のプロテアーゼ活性を低減することを含む、プロテアーゼ阻害活性；（ｂ）例えば、重篤な炎症に器官損傷を低減するための、炎症および／またはサイトカイン依存性シグナル伝達経路を低減することを含む、抗炎症活性；ならびに（ｃ）例えば、カテプシンＢ活性を低減すること、および／またはＣＤ４４二量体形成を低減することによって、腫瘍浸潤および転移を低減することを含み、少なくとも、その後者は、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達カスケードを抑制し、細胞外基質（ＥＣＭ）分解、腫瘍細胞浸潤、および／または血管新生を低減する、抗転移活性を含む。
【0067】
ある特定の実施形態では、ウリナスタチンポリペプチドは、約または少なくとも約５００～５０００Ｕ／ｍｇ、あるいは約または少なくとも約５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、もしくは５０００Ｕ／ｍｇポリペプチドの「特異的活性」を有し、１単位（Ｕ）は、２μｇのトリプシンの活性を５０％阻害するウリナスタチンポリペプチドの量である。
【0068】
上述のように、本明細書に記載されるウリナスタチン融合ポリペプチドは、ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチド、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む。例示的なシグナルペプチドの配列は、以下の表Ｓ１に提供される。
【表S1】
【0069】
したがって、ある特定の実施形態では、ウリナスタチン融合ポリペプチドのウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチド部分は、配列番号５と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなる。
【0070】
例示的なヒトウリナスタチン融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の表Ｕ２に提供される。
【表U2】
【0071】
したがって、一部の実施形態では、ウリナスタチン融合ポリペプチド、またはそのバリアントもしくはフラグメントは、表Ｕ２から選択される配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、それは、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。ある特定の実施形態では、表Ｕ２の融合ポリペプチドのウリナスタチン部分は、位置Ｓ１０での置換または欠失、例えば、Ｓ１０Ａ置換などの、Ｏ－結合グリコシル化部位でのグリコシル化を低減する、残基Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号１０）で修飾されたＯ－結合グリコシル化部位を含むか、または保持する。
【0072】
「バリアント」配列は、一つまたは複数の置換、欠失（例えば、切断）、付加、および／または挿入で、参照配列と異なるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を指す。したがって、ある特定のバリアントは、本明細書に記載される参照配列のフラグメントを含む。バリアントポリペプチドは、生物学的に活性であり、すなわち、それらは、参照ポリペプチドの酵素活性または結合活性を有し続ける。このようなバリアントは、例えば、遺伝子多型および／またはヒト操作から生じ得る。
【0073】
ある場合では、バリアントは、一つまたは複数の「保存的」変化または置換を含む。「保存的置換」は、ペプチド化学の技術分野の当業者が、実質的に変更されていないポリペプチドの二次構造および疎水性親水性指標性質を予測するように、アミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸に置換されているものである。上記の通り、修飾は、本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造でなされ、依然として、所望の特徴を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を得てもよい。ポリペプチドのアミノ酸配列を変更して、本明細書に記載されるポリペプチドの均等物、または改善されてさえいるバリアントもしくは一部を作製することが所望される場合、当業者は、典型的には、コードＤＮＡ配列のコドンのうちの一つまたは複数を変化させるだろう。
【0074】
例えば、ある特定のアミノ酸は、例えば、基質分子上の抗体の抗原結合領域または結合部位などの、構造との相互作用結合能の顕著な喪失なしに、タンパク質構造における他のアミノ酸に置換されてもよい。それは、そのタンパク質の生物学的機能的活性を定義するタンパク質の相互作用能および性質であるので、ある特定のアミノ酸配列置換を、タンパク質配列、および当然ながら、その根底にあるＤＮＡコード配列で行い、それにもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。したがって、様々な変化が、開示される組成物のペプチド配列、または前述のペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列において、それらの有用性を顕著に損なうことなく、なされ得ることが、企図される。
【0075】
このような変化を行う際に、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮されてもよい。タンパク質への相互作用性の生物学的機能の付与における疎水性親水性指標であるアミノ酸指標の重要性は、当該技術分野で一般的に理解されている（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２、参照により本明細書に組み込まれる）。アミノ酸の相対的疎水性親水性指標特徴が、得られたタンパク質の二次構造に関与し、順に、タンパク質の他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定義することが受け入れられる。それぞれのアミノ酸に、その疎水性および荷電特徴に基づき、疎水性親水性指標が割り当てられている（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。これらの値は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；スレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；およびアルギニン（－４．５）である。ある特定のアミノ酸が、類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換されてもよく、依然として、類似の生物活性を有するタンパク質をもたらす、すなわち、生物学的に機能的に均等なタンパク質を得ることは、当該技術分野で公知である。こうした変化をなす際に、疎水性親水性指標が、±２以内を示すアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の物が、特に好ましく、±０．５の物が、なおより特に好ましい。
【0076】
同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて有効になされ得ることも、当該技術分野で理解される。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大の局所平均親水性が、タンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。米国特許第４，５５４，１０１号で詳述される通り、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。アミノ酸が、類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置換することができ、依然として、生物学的な均等なタンパク質、特に、免疫学的に均等なタンパク質を得ることができることが理解される。こうした変化において、親水性値が、±２以内を示すアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の物が、特に好ましく、±０．５の物が、なおより特に好ましい。
【0077】
上で概説された通り、したがって、アミノ酸置換は、一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。様々な前述の特徴を考慮する例示的な置換は、当業者に周知であり、アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む。
【0078】
アミノ酸置換は、残基の極性、荷電、溶解度、疎水性、親水性および／または、両親媒性性質の類似性に基づきなされてもよい。例えば、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正に荷電したアミノ酸は、リジンおよびアルギニンを含み、類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンを含む。保存的変化を表し得るアミノ酸の他の群は、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓを含む。
【0079】
バリアントはまた、またはあるいは、非保存的変化を含有してもよい。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２つ以下のアミノ酸、またはただ１つのアミノ酸の置換、欠失または付加で、天然または参照配列と異なる。バリアントはまた（またはあるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造、酵素活性、および／または疎水性親水性指標性質に対して最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加で修飾されてもよい。
【0080】
ある特定の実施形態では、ポリペプチド配列は、間の全ての整数を含む、約、少なくとも約、または最大約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、または１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００以上の連続アミノ酸長であり、参照配列の全てまたは一部を含んでもよい（例えば、表Ｕ１、表Ｓ１、表Ｕ２、配列表を参照のこと）。
【0081】
一部の実施形態では、ポリペプチド配列は、間の全ての整数を含む、約または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００もしくはそれより多く未満の連続アミノ酸からなり、参照配列の全てまたは一部を含んでもよい（例えば、表Ｕ１、表Ｓ１、表Ｕ２、配列表を参照のこと）。
【0082】
ある特定の実施形態では、ポリペプチド配列は、間の全ての範囲を含む、約１０～１０００、１０～９００、１０～８００、１０～７００、１０～６００、１０～５００、１０～４００、１０～３００、１０～２００、１０～１００、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２０、２０～１０００、２０～９００、２０～８００、２０～７００、２０～６００、２０～５００、２０～４００、２０～３００、２０～２００、２０～１００、２０～５０、２０～４０、２０～３０、５０～１０００、５０～９００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５００、５０～４００、５０～３００、５０～２００、５０～１００、１００～１０００、１００～９００、１００～８００、１００～７００、１００～６００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、１００～２００、２００～１０００、２００～９００、２００～８００、２００～７００、２００～６００、２００～５００、２００～４００、または２００～３００の連続アミノ酸であり、参照配列の全てまたは一部を含む（例えば、表Ｕ１、表Ｓ１、表Ｕ２、配列表を参照のこと）。ある特定の実施形態では、参照ポリペプチドの結合特性および／または活性を保持する限り、任意の参照ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端領域は、切断されたポリペプチドが、間の全ての整数および範囲（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５）を含む、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００以上のアミノ酸、または約１０～５０、２０～５０、５０～１００もしくはそれより多くのアミノ酸が切断されてもよい（例えば、表Ｕ１、表Ｓ１、表Ｕ２、配列表を参照のこと）。典型的には、生物学的に活性なフラグメントは、それらが由来する生物学的に活性な参照ポリペプチドの活性の約１％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％以上を有する。
【0083】
一般に、バリアントは、参照ポリペプチド配列と少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性または配列同一性または配列相同性を呈するだろう（例えば、表Ｕ１、表Ｕ２、配列表を参照のこと）。さらに、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００のアミノ酸（間の全ての整数および範囲を含む）の付加（例えば、Ｃ末端の付加、Ｎ末端の付加、両方）、欠失、切断、挿入、または置換（例えば、保存的置換）で、天然または親配列と異なるが、親または参照ポリペプチド配列の特性または活性を保持する配列が、企図される（例えば、表Ｕ１、表Ｓ１、表Ｕ２、配列表を参照のこと）。
【0084】
一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、少なくとも一つだが、５０、４０、３０、２０、１５、１０、８、６、５、４、３または２未満のアミノ酸残基（複数可）で参照配列と異なる。ある特定の実施形態では、バリアントポリペプチドは、少なくとも１％だが、２０％、１５％、１０％または５％未満の残基で、参照配列と異なる。（この比較が、アラインメントを必要とする場合、配列は、最大の類似性についてアラインメントされるべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチから「抜け出した」配列は、相違とみなされる。）
【0085】
配列間の配列類似性または配列同一性の計算（用語は、本明細書において互換的に使用される）は、以下のように行われる。二つのアミノ酸配列、または二つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列は、最適な整列のため整列される（例えば、ギャップは、最適な整列のため、第一と第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入されてもよく、非相同配列は、比較目的のため無視されてもよい）。ある特定の実施形態では、比較目的のため整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、６０％、なおより好ましくは、少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較される。第一の配列における位置が、第二の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されるとき、次いで、分子は、その位置で同一である。
【0086】
二つの配列間のパーセント同一性は、二つの配列の最適な整列のため導入される必要がある、ギャップの数、およびそれぞれのギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【0087】
配列の比較および二つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。好ましい実施形態では、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６のレングスウェイトを使用して、ＧＣＧソフトウエアパッケージにおけるＧＡＰプログラムに取り込まれている、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３、１９７０）アルゴリズムを使用して決定される。なお別の好ましい実施形態では、二つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６のレングスウェイトを使用して、ＧＣＧソフトウエアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを使用して決定される。パラメータの特に好ましいセット（および別段特定されない限り、使用されるべきもの）は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ拡大ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティを用いた、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスである。
【0088】
二つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル、１２のギャップレングスペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃａｂｉｏｓ．４：１１－１７、１９８９）のアルゴリズムを使用して決定することができる。
【0089】
本明細書に記載される配列を、「クエリー配列」として使用して、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定するための公開データベースに対する検索を行うことができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２１５：４０３－１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本明細書に記載される核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワードレングス＝１２を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本明細書に記載されるタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いて行うことができる。比較目的のためギャップ整列を得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）において記載される通り、利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の既定のパラメータを使用することができる。
【0090】
一部の実施形態では、上述のように、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、ＢＬＡＳＴ整列ツールを使用して評価することができる。局所アラインメントは、単に、対の配列セグメントからなり、配列のそれぞれの一つが、比較される。Ｓｍｉｔｈ－ＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムまたはＳｅｌｌｅｒｓアルゴリズムの修飾により、スコアが、拡張またはトリミングによって改善されない、高スコアセグメントペア（ＨＳＰ）と呼ばれる、全てのセグメント対が見出されるだろう。ＢＬＡＳＴ整列の結果は、ＢＬＡＳＴスコアが、偶然のみから予想され得る可能性を示すための統計的尺度を含む。
【0091】
素点Ｓは、それぞれの整列された配列と関連するギャップおよび置換の数から計算され、類似性スコアが高いほど、より有意な整列を示す。置換スコアは、ルックアップテーブルによって与えられる（ＰＡＭ、ＢＬＯＳＵＭを参照）。
【0092】
ギャップスコアは、典型的には、Ｇ、ギャップ開通ペナルティ、およびＬ、ギャップ拡張ペナルティの合計として計算される。長さｎのギャップについて、ギャップコストは、Ｇ＋Ｌｎであるだろう。ギャップコスト、ＧおよびＬの選択は経験的であるが、Ｇ（１０～１５）、例えば１１について高い値、およびＬ（１～２）、例えば１について低い値を選択するのが通例である。
【0093】
ビットスコアＳ’は、使用されるスコアリングシステムの統計的特性が考慮された、素整列スコアＳからもたらされる。ビットスコアは、スコアリングシステムに関して正規化され、そのため、それらは、異なる検索からの整列スコアを比較するために使用することができる。用語「ビットスコア」および「類似性スコア」は、互換的に使用される。ビットスコアは、整列がどの程度良いかを示し、スコアが高いほど、整列が良好である。
【0094】
Ｅ値、または期待値は、類似のスコアを有する配列が、偶然、データベースで生じる可能性を記載する。それは、偶然、データベース検索で生じると予想されるＳと同等またはそれより良いスコアを有する異なる整列の数の予測である。Ｅ値が小さいほど、整列がより有意である。例えば、ｅ－１１７のＥ値を有する整列は、類似のスコアを有する配列が、単に偶然、生じることは非常に少ないことを意味する。加えて、ランダムな対のアミノ酸の整列について予測されるスコアは、負であることが必要であり、そうでなければ、長い整列は、整列されたセグメントが、関連していたかどうかに関係なく、高いスコアを有する傾向がある。加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、適切な置換マトリックス、ヌクレオチドまたはアミノ酸を使用し、ギャップ整列は、ギャップ生成および拡張ペナルティを使用する。例えば、ＢＬＡＳＴ整列およびポリペプチド配列の比較は、典型的には、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップ存在ペナルティおよび１のギャップ拡張ペナルティを使用して行われる。
【0095】
一部の実施形態では、配列類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップ存在ペナルティおよび１のギャップ拡張ペナルティを使用して行われたＢＬＡＳＴ分析から報告される。
【0096】
特定のスポロムサでは、本明細書において提供される配列同一性／類似性スコアは、以下のパラメータ：５０のＧＡＰウェイトおよび３のレングスウェイトを使用したヌクレオチド配列についての％同一性および％類似性を使用したＧＡＰバージョン１０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）を使用し、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックス；８のＧＡＰウェイトおよび２のレングスウェイト、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、ＰＮＡＳ ＵＳＡ．８９：１０９１５－１０９１９、１９９２）を使用した、アミノ酸配列についての％同一性および％類似性を使用して得られた値を指す。ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３，１９７０）のアルゴリズムを使用して、一致数を最大にし、ギャップ数を最小にする二つの完全な配列の整列を見出す。
【0097】
特定の実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチド配列（例えば、表Ｕ１、表Ｕ２、配列表を参照のこと）を用いて最適に整列させて、間の全ての整数および配列を含む、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００以上のＢＬＡＳＴビットスコアまたは配列類似性スコアを得ることができる、アミノ酸配列を含み、ＢＬＡＳＴ整列は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップ存在ペナルティ、および１のギャップ拡張ペナルティを使用したものであった。
【0098】
上述のように、参照ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断、付加、および挿入を含む、様々な方法で変更されてもよい。このような操作の方法は、当該技術分野で一般的に公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中の変異によって調製することができる。変異誘導およびヌクレオチド配列変化の方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（ＰＮＡＳ ＵＳＡ．８２：４８８－４９２、１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－３８２、１９８７）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．ら、（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，”Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．、１９８７）およびそこで引用される参考文献を参照のこと。対象のタンパク質の生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見出され得る。
【0099】
このような修飾によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする方法、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法は、当該技術分野で公知である。このような方法は、参照ポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適合可能である。一例として、ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増強する技術である、再帰集合変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ポリペプチドバリアントを同定することができる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ８９：７８１１－７８１５，１９９２；Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．６：３２７－３３１，１９９３）。
【0100】
ある特定の実施形態では、ペプチドリンカー配列を利用して、それぞれのポリペプチドが、その所望される二次および三次構造にフォールディングされたことを確実にし、ならびに／または所望の場合、ウリナスタチンポリペプチドからのシグナルペプチドの切断を促進するのに十分な距離で、ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチド（複数可）とウリナスタチンポリペプチド（複数可）を分けてもよい。このようなペプチドリンカー配列は、当該技術分野で周知の標準的な技術を使用して、融合ポリペプチドに組み込むことができる。
【0101】
ある特定のペプチドリンカー配列は、以下の例示的な要因：（１）可動性に伸長された立体構造に適合するそれらの能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る、二次構造に適合するそれらの能力；（３）それらの生理的安定性；ならびに（４）ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性もしくは荷電した残基の欠如、または他の特性に基づき選択されてもよい。例えば、Ｇｅｏｒｇｅ ａｎｄ Ｈｅｒｉｎｇａ，Ｊ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１５：８７１－８７９、２００２を参照のこと。
【0102】
リンカー配列は、概して、１～約２００アミノ酸長であってもよい。特定のリンカーは、約１～２００のアミノ酸、１～１５０のアミノ酸、１～１００のアミノ酸、１～９０のアミノ酸、１～８０のアミノ酸、１～７０のアミノ酸、１～６０のアミノ酸、１～５０のアミノ酸、１～４０のアミノ酸、１～３０のアミノ酸、１～２０のアミノ酸、１～１０のアミノ酸、１～５のアミノ酸、１～４のアミノ酸、１～３のアミノ酸、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上のアミノ酸の全体的アミノ酸長を有し得る。
【0103】
ペプチドリンカーは、本明細書における他の場所で記載され、当該技術分野で公知の、任意の一つまたは複数の天然に生じるアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸（複数可）、アミノ酸アナログ、および／またはアミノ酸模倣物を利用してもよい。リンカーとして有用に利用され得るある特定のアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ４０：３９－４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．８３：８２５８－８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されているものを含む。特定のペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、および／またはＡｓｎ残基を含有する。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の中性に近いアミノ酸も、所望の場合、ペプチドリンカー配列において利用されてもよい。
【0104】
ある特定の例示的なリンカーは、以下の：［Ｇ］ｘ、［Ｓ］ｘ、［Ｎ］ｘ、［ＧＳ］ｘ、［ＧＧＳ］ｘ、［ＧＳＳ］ｘ、［ＧＳＧＳ］ｘ（配列番号１１）、［ＧＧＳＧ］ｘ（配列番号１０）、［ＧＧＧＳ］ｘ（配列番号１２）、［ＧＧＧＧＳ］ｘ（配列番号１３）、［ＧＮ］ｘ、［ＧＧＮ］ｘ、［ＧＮＮ］ｘ、［ＧＮＧＮ］ｘ（配列番号１４）、［ＧＧＮＧ］ｘ（配列番号１５）、［ＧＧＧＮ］ｘ（配列番号１６）、［ＧＧＧＧＮ］ｘ（配列番号１７）リンかー（式中、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０以上である）である、Ｇｌｙ、Ｓｅｒおよび／またはＡｓｎ含有リンカーを含む。これらおよび関連するアミノ酸の他の組み合わせは、当業者に明らかであろう。
【0105】
リンカーペプチドのさらなる例は、以下のアミノ酸配列：Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－（配列番号１８）；Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－（配列番号１９）；Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－（配列番号２０）；Ａｓｐ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－（配列番号２１）；およびＡｓｎ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－（配列番号２２）を含むが、これらに限定されない。
【0106】
さらに、リンカーペプチドの非限定的な例としては、ＤＧＧＧＳ（配列番号２３）；ＴＧＥＫＰ（配列番号２４）（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ．９４：５５２５－５５３０，１９９７を参照のこと）；ＧＧＲＲ（配列番号２５）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．１９９５）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１３）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ．９３：１１５６－１１６０，１９９６）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号２６）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ．８７：１０６６－１０７０，１９９０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２７）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４２：４２３－４２６，１９８８）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号２８）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号２９）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号３０）；ＬＲＱＫｄ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号３１）が挙げられる。特定の実施形態では、リンカー配列は、三つのグリシン残基を含むＧｌｙ３リンカー配列を含む。特定の実施形態では、可動性リンカーは、ＤＮＡ結合部位とペプチド自体の両方をモデリングすることができるコンピュータープログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ．９０：２２５６－２２６０，１９９３；およびＰＮＡＳ．９１：１１０９９－１１１０３、１９９４）を使用して、またはファージディスプレイ方法によって容易に設計することができる。
【0107】
特定の実施形態では、リンカーペプチドは、自己触媒性または自己切断性ペプチド切断部位を含む。特定の実施形態では、自己切断ペプチドは、ポティウイルスおよびカルジオウイルス２Ａペプチド、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）、ウマ鼻炎Ａウイルス、ソサアシナウイルスおよびブタテスコウイルスから得られたそのポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、自己切断ポリペプチド部位は、２Ａもしくは２Ａ様部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１，２００１）。例示的な２Ａ部位は、以下の配列：ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３２）；ＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３３）；ＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３４）；ＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３５）；ＱＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３６）；ＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３７）；ＶＴＥＬＬＹＲＭＫＲＡＥＴＹＣＰＲＰＬＬＡＩＨＰＴＥＡＲＨＫＱＫＩＶＡＰＶＫＱＴ（配列番号３８）；ＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３９）；ＬＬＡＩＨＰＴＥＡＲＨＫＱＫＩＶＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号４０）；およびＥＡＲＨＫＱＫＩＶＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号４１）を含む。一部の実施形態では、自己触媒性ペプチド切断部位は、例えば、１８のアミノ酸の配列である、アフトウイルス口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ポリタンパク質の２Ａ領域などの翻訳２Ａシグナル配列を含む。使用され得る２Ａ様配列のさらなる例としては、例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．８２：１０２７－１０４１，２００１に記載されるトリパノソーマ属における昆虫ウイルスポリタンパク質、Ｃ型ロタウイルスのＮＳ３４タンパク質、および反復配列が挙げられる。
【0108】
適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断ペプチドは、当業者に公知である（例えば、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６９９－７２２，１９９７；およびＳｃｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：５８９－５９４，２００４を参照のこと）。例示的なプロテアーゼ切断部位は、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルスＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ－２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（ライスツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子およびエンテロキナーゼの切断部位を含むが、これらに限定されない。その高い切断ストリンジェンシーにより、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ切断部位、一部の実施形態では、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号４２）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４３）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号４４）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸を表す（ＴＥＶによる切断が、ＱとＧまたはＱとＳの間で生じる）が含まれる。
【0109】
さらに、特定の実施形態での使用に適当な酵素的に分解可能なリンカーの例としては、トロンビン、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、またはスブチリシンなどのセリンプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列が挙げられるが、これに限定されない。トロンビンで切断可能なアミノ酸配列の説明の例としては、－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－（配列番号４５）、－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－、－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｐｒｏ－（配列番号４６）、－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－（配列番号４７）、－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－（配列番号４８）、－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－、－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－、および－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－が挙げられるが、これらに限定されない。エラスターゼで切断可能なアミノ酸配列の説明の例としては、－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－、－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－（配列番号４９）、－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－（配列番号５０）、－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－（配列番号５１）、－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－（配列番号５２）、および－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－（配列番号５３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0110】
酵素的に分解可能なリンカーはまた、コラゲナーゼ、ストロメライシン、およびゼラチナーゼなどのマトリックスメタロプロテイナーゼによって切断することができるアミノ酸配列を含む。マトリックスメタロプロテイナーゼで切断可能なアミノ酸配列の説明の例としては、－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｚ－（配列番号５４）、－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－、Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｚ－（配列番号５５）、－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｚ－（配列番号５６）、および－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｚ－（配列番号５７）（式中、ＹおよびＺは、アミノ酸である）が挙げられるが、これらに限定されない。コラゲナーゼで切断可能なアミノ酸配列の説明の例としては、－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｚ－（配列番号５８）、－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｚ－（配列番号５９）、－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－（配列番号６０）、－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｍｅ）－Ｈｉｓ－（配列番号６１）、－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ａｌａ－（配列番号６２）、－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ａｒｇ－（配列番号６３）、および－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ａｒｇ－（配列番号６４）（式中、Ｚは、アミノ酸である）として挙げられるが、これらに限定されない。ストロメライシンで切断可能なアミノ酸配列の説明の例は、－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－（配列番号６５）であり、ゼラチナーゼで切断可能なアミノ酸配列の例は、－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－（配列番号６６）である。
【0111】
特定の実施形態の使用に適当な酵素的に分解可能なリンカーは、例えば、－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－、－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－（配列番号６７）、および－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－（配列番号６８）などの、アンギオテンシン変換酵素によって切断することができるアミノ酸配列を含む。
【0112】
特定の実施形態での使用に適当な酵素的に分解可能なリンカーは、例えば、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－（配列番号６９）、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－（配列番号７０）およびＰｈｅ－Ｌｙｓなどの、カテプシンＢによって分解することができるアミノ酸配列を含む。
【0113】
しかしながら、ある特定の実施形態では、任意の一つまたは複数のペプチドリンカーは、任意選択である。例えば、リンカー配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分け、体干渉を防ぐために使用することができる、非必須のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸領域を有するとき、必要とされない。
【0114】
ウリナスタチン融合ポリペプチドは、本明細書に記載される組成物、方法、および／またはキットのいずれかで使用することができる。
【0115】
ポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
ある特定の実施形態は、本明細書に記載されるウリナスタチン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、ある特定の実施形態は、そのバリアントおよび／またはフラグメントを含む、表Ｕ１または表Ｕ２における個々のウリナスタチン融合ポリペプチドの任意の一つまたは複数をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、ある特定のポリヌクレオチドは、表Ｕ１または表Ｕ２から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなるウリナスタチン融合ポリペプチドをコードする。
ある特定の実施形態は、本明細書に記載されるウリナスタチン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、ある特定の実施形態は、そのバリアントおよび／またはフラグメントを含む、表Ｕ１または表Ｕ２における個々のウリナスタチン融合ポリペプチドの任意の一つまたは複数をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、ある特定のポリヌクレオチドは、表Ｕ１または表Ｕ２から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなるウリナスタチン融合ポリペプチドをコードする。
【0116】
例示的な核酸コード配列は、以下の表Ｕ３に提供される。
【表U3-1】
【表U3-2】
【0117】
したがって、ある特定の実施形態は、ウリナスタチン融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、例えば、単離されたポリペプチドを含み、ポリヌクレオチドは、表Ｕ３の核酸配列（例えば、配列番号８または９）と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％である核酸配列を含む、からなる、または本質的にからなる。
【0118】
他の使用の中でも、これらおよび関連する実施形態を利用して、宿主細胞においてウリナスタチンポリペプチドを組み換え産生してもよい。当業者であれば、遺伝コードの縮退の結果として、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることを理解するであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列と最小の相同性を生じてもよい。それにもかかわらず、コドン使用の違いに起因して、変動するポリヌクレオチド、例えば、ヒト、酵母、または細菌のコドン選択に最適化されているポリヌクレオチドが、具体的に企図される。
【0119】
当業者によって認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。ポリヌクレオチドは、天然配列を含んでもよいか、またはバリアント、もしくはこのような配列の生物学的な機能的均等物を含んでもよい。ポリヌクレオチドバリアントは、好ましくは、バリアントポリペプチドの活性が、修飾されていないポリペプチドと比較して、実質的に減少されないように、本明細書に記載される一つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有してもよい。
【0120】
追加のコードまたは非コード配列は、ポリヌクレオチド内に存在し得るが、必須ではなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結されてもよいが、必須ではない。ゆえに、ポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さに関わらず、それらの全体的な長さが、かなり変動し得るように、プロモーター、エンハンスメント、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、他のコードセグメントなどの、他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列と組み合わされてもよい。
【0121】
ポリヌクレオチド配列はまた、混合されたゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、および合成起源のものであってもよい。例えば、リーダーペプチドをコードするゲノムまたはｃＤＮＡ配列は、ポリペプチドをコードするゲノムまたはｃＤＮＡ配列に結合されてもよく、その後、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、周知の手法に従い、相同組み換えのため所望されるアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入すること、または好ましくは、適当なオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによって、所望の配列を生成することによって、部位で修飾されてもよい。一部の実施形態では、シグナル配列は、コード配列前に含まれ得る。この配列は、宿主細胞に伝達して、ポリペプチドを細胞表面に向けるか、またはポリペプチドを培地に分泌させる、コード配列のＮ末端にシグナルペプチドをコードする。典型的には、シグナルペプチドは、タンパク質が細胞を離れる前に、宿主細胞によって切り落とされる。シグナルペプチドは、原核生物および真核生物の様々なタンパク質において見出すことができる。
【0122】
一つまたは複数のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるウリナスタチンポリペプチドをコードすることができる。さらに、ポリヌクレオチド配列は、様々な理由から操作することができる。例としては、様々な生物におけるポリヌクレオチドの発現を増強するための好ましいコドンの組み込みが挙げられるが、これらに限定されない（一般に、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２８：２９２，２０００を参照のこと）。
【0123】
ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびにポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターを含む宿主細胞もまた含まれる。ウリナスタチンポリペプチドは、周知の技術により、適当な宿主細胞において、ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を発現させることによって産生することができる。用語「宿主細胞」は、導入される細胞、または本明細書に記載されるポリペプチドの一つまたは複数をコードする核酸配列であるそれが導入され得る細胞、および任意の本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの、対象であるポリペプチドをさらに発現するか、もしくは発現し得る細胞を指すために使用される。この用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が、元の親と形態学的または遺伝的構成において同一であるかどうかに関わらず、親細胞の子孫を含む。
【0124】
ある場合では、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、追加の非コード配列を含む。例えば、発現ベクターに存在する「調節エレメント」または「制御配列」は、エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域を含む、ベクターの非翻訳領域であり、宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写および翻訳を行う。このようなエレメントは、その強度および特異性において変化し得る。利用されるベクターシステムおよび宿主に応じて、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、任意の数の適切な転写および翻訳エレメントが使用されてもよい。
【0125】
様々な発現ベクター／宿主システムが公知であり、それを利用して、ポリヌクレオチド配列を含有し、発現させてもよい。これは、微生物、例えば、発現ベクター、例えば、組み換えバクテリオファージ、プラスミド、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞システム；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞システム；あるいはウイルス、プラスミド、エピソームまたは組み込み発現ベクターで形質転換された哺乳類細胞を含む動物細胞システムおよびより具体的には、ヒト細胞システムを含むが、これらに限定されない。したがって、ある特定の実施形態は、本明細書に記載されるポリペプチド、例えば、ウリナスタチン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクターを含む。特定の実施形態では、発現ベクターは、例えば、図２～３、および表Ｅ１～Ｅ２において説明される、レトロウイルスベクター（またはレトロベクター）である。
【0126】
ポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターを含む宿主細胞もまた、含まれる。哺乳類宿主細胞において、多数の発現系が、当該技術分野で周知であり、市販されている。例示的な哺乳類宿主細胞およびシステムは、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＧＰＥｘ（登録商標）チャイニーズハムスター卵巣（ＧＣＨＯ）細胞株を含むＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞などを含む。哺乳類発現系は、当該技術分野で公知のものの中でも、例えば、Ｔフラスコ、ローラーボトル、シェーカーフラスコ（例えば、２．８Ｌ）、および／もしくは細胞工場、または懸濁培養物、例えば、１Ｌおよび５Ｌのスピナー、５Ｌ、１４Ｌ、４０Ｌ、１００Ｌおよび２００Ｌの攪拌タンク反応器、または２０／５０Ｌおよび１００／２００ＬのＷＡＶＥ反応器において、接着細胞株を利用することができる。それゆえ、ある特定の実施形態は、本明細書に記載されるウリナスタチン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、組み換え宿主細胞、例えば、哺乳類宿主細胞を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、全長ウリナスタチンを切断して、成熟ウリナスタチンを産生する、プロテアーゼ、例えば、フューリンポリペプチドを発現するか、または過剰発現する。ある特定の宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）を使用して、複製無能な高いタイターのレトロベクター粒子を産生することができ、ある特定の宿主細胞（ＣＨＯ、ＧＣＨＯ）を、レトロベクター粒子で形質導入して、ウリナスタチン発現細胞を産生することができる。
【0127】
本明細書に記載されるウリナスタチンポリペプチド組み換え産生する方法もまた、含まれる。一部の実施形態では、ウリナスタチン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、宿主細胞に直接的に導入され、細胞は、コードされたタンパク質（複数可）の発現を誘導するのに十分な条件下でインキュベートされる。したがって、ある特定の実施形態は、ウリナスタチンポリペプチドを組み換え産生する方法であって、（ａ）本明細書に記載される組み換え哺乳類宿主細胞、任意選択で、ＣＨＯ細胞またはＧＣＨＯにおいてウリナスタチン融合ポリペプチドを発現させること；および（ｂ）ウリナスタチンポリペプチドを宿主細胞または宿主細胞を含有する培地から単離し、これにより、ウリナスタチンポリペプチドを組み換え産生することを含む、方法に関する。宿主細胞におけるウリナスタチンポリペプチドの発現は、ポリヌクレオチドを含有する組み換え宿主細胞を適当な条件下で培養することによって達成され得る（例えば、実施例１を参照のこと）。発現による産生後、ウリナスタチンポリペプチドは、任意の適当な技術を使用して単離され、および／または精製されてもよく、次いで、所望に応じて使用される。また、成熟ウリナスタチン融合ポリペプチドの発現後、ある特定の実施形態は、例えば、プロテアーゼでシグナルペプチドを切断する工程を含む。
【0128】
組み換え宿主細胞によって産生されるウリナスタチンポリペプチドは、当該技術分野で公知の様々な技術に従い、精製し、特徴付けることができる。タンパク質精製を行い、タンパク質純度を分析するための例示的なシステムは、迅速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（例えば、ＡＫＴＡおよびＢｉｏ－Ｒａｄ ＦＰＬＣシステム）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、ＢｅｃｋｍａｎおよびＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ）を含む。精製のための例示的な化学は、当該技術分野で公知のものの中でも、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑ、Ｓ）、サイズ排除クロマトグラフィー、塩勾配、親和性精製（例えば、Ｎｉ、Ｃｏ、ＦＬＡＧ、マルトース、グルタチオン、タンパク質Ａ／Ｇ）、ゲル濾過、逆層、セラミックＨＹＰＥＲＤ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）を含む。実施例も参照のこと。
【0129】
生理的条件下で、任意選択で、生理的条件の温度およびｐＨ下で、産生され、精製されたウリナスタチンポリペプチドの活性を評価するか、または測定する方法もまた含まれ、ウリナスタチンポリペプチドは、生理的条件下で活性を有する。一部の実施形態では、ウリナスタチンポリペプチドは、同等の生理的条件下で、配列番号２のウリナスタチンポリペプチド（成熟ヒトウリナスタチン）と比較して、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００％以上の活性を有する。
【0130】
ある特定の態様は、ウリナスタチンポリペプチドを含む組成物を調製することを含み、例えば、組成物は、タンパク質ベースまたは重量対重量ベースで少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の純度を有し、組成物は、実質的に凝集物を含まず、実質的にエンドトキシンを含まない。
【0131】
組成物および使用方法
ある特定の実施形態は、ウリナスタチンポリペプチド、例えば、本明細書に記載される方法、および様々な疾患の治療のためそれを使用する方法に従い、産生されるウリナスタチンポリペプチドを含む治療用組成物を含む。
ある特定の実施形態は、ウリナスタチンポリペプチド、例えば、本明細書に記載される方法、および様々な疾患の治療のためそれを使用する方法に従い、産生されるウリナスタチンポリペプチドを含む治療用組成物を含む。
【0132】
一部の実施形態は、本明細書に記載される方法に従い調製されるか、または産生されるウリナスタチンポリペプチドを含む、本明細書に記載される成熟ウリナスタチンポリペプチド、および医薬的に許容される担体を含む、組成物、例えば、治療用または医薬組成物を含む。例えば、ある特定の組成物は、（ｉ）Ｏ－結合グリコシル化部位でのグリコシル化を低減する、残基Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号１０）での修飾されたＯ－結合グリコシル化部位、（ｉｉ）残基Ｎ４５の残基でＮ－結合グリカン、および（ｉｉｉ）残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含む、Ｔ１７－Ｏ－結合グリカンを有する成熟ウリナスタチンポリペプチド、ならびに医薬的に許容される担体を含み、残基は、本明細書に記載される、配列番号２または４により定義されている。成熟ウリナスタチンポリペプチド、ならびにその活性なバリアントおよびフラグメントの具体的な例が、本明細書に記載される（例えば、表Ｕ１および関連する開示を参照のこと）。
【0133】
ある特定の組成物は、ウリナスタチングリコフォームの混合物を含む。例えば、ある特定の組成物は、（ａ）本明細書に記載されるＴ１７－Ｏ－結合グリカンを含む第一の成熟ウリナスタチンポリペプチド、および（ｂ）残基Ｎ４５でＮ－結合グリカンを含み、残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含まない、第二の成熟ウリナスタチンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第二の成熟ウリナスタチンポリペプチドは、Ｏ－結合グリコシル化部位でのグリコシル化を低減する、本明細書に記載される、残基Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（配列番号１０）での修飾されたＯ－結合グリコシル化部位、例えば、Ｓ１０Ａ置換を有する。一部の実施形態では、（ｂ）の第二の成熟ウリナスタチンポリペプチドは、配列番号２または４と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、または本質的にからなり、修飾されたＯ－結合グリコシル化部位（例えば、Ｓ１０Ａ置換）および残基Ｎ４５でＮ－結合グリカンを含むか、または保持し、残基Ｔ１７でＯ－結合グリカンを含まず、少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。
【0134】
一部の実施形態では、（ａ）：（ｂ）の成熟ウリナスタチンポリペプチドは、約２０：１～約１：２０の範囲にある比、任意選択で、約２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、または１：２０で組成物に存在する。
【0135】
ある特定の組成物は、タンパク質ベースまたは重量ベースで実質的に純粋である。例えば、上記の通り、ある特定の組成物は、タンパク質ベースまたは重量対重量ベースで少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の純度を有し、凝集物を実質的に含まず、例えば、約１０、９、８、７、６、または５％未満の凝集物である。ある特定の組成物は、本明細書に記載されるエンドトキシンを実質的に含まない。
【0136】
組成物は、医薬分野において周知の方法論によって調製されてもよい。例えば、注射によって投与されることが意図される組成物は、本明細書に記載されるウリナスタチンポリペプチド、および任意選択で、一つまたは複数のバッファーまたは賦形剤を含む組成物を、任意選択で蒸留水と合わせて、溶液を形成することによって、調製することができる。ある特定の組成物は、生理的食塩水溶液（例えば、０．９％の通常の食塩水）あるいはデキストロース（例えば、約１～１０％デキストロース、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０％のデキストロース）を含む。界面活性剤を加えて、均一な溶液または懸濁液の形成を促進することができる。界面活性剤は、水性送達システムにおいてポリペプチドの溶解または均一な懸濁を促進するために、組成物においてウリナスタチンポリペプチドと共有結合性に相互作用しない化合物である。
【0137】
ある特定の組成物は、医薬的に許容されるｐＨである。例えば、ある特定の実施形態では、医薬的に許容されるｐＨは、間の全ての整数および範囲を含む、約５．０～約８．０（±０．０１～±０．１）、または約５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、もしくは８．０（±０．０１～０．１）である。
【0138】
ある特定の実施形態では、ウリナスタチンポリペプチドは、ヒト血液の生理的ｐＨに近いｐＨで少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。したがって、一部の実施形態では、ウリナスタチンポリペプチドは、約４～約１０．８、または約６～約８、または約６．５～約７．５のｐＨで少なくとも一つのウリナスタチン活性を有する。ある特定の実施形態では、ウリナスタチンポリペプチドは、約ｐＨ７．４で有効なウリナスタチン活性を有する。
【0139】
特定の実施形態では、組成物は、約１ＥＵ未満のエンドトキシン／タンパク質ｍｇ、約１００ｎｇ未満の宿主細胞タンパク質／タンパク質ｍｇ、約１０ｐｇ未満の宿主細胞ＤＮＡ／タンパク質ｍｇの一つまたは複数を有し、および／または凝集物を実質的に含まない。
【0140】
それを必要とする対象における、疾患を治療する方法、疾患の症状を回復させる方法、または疾患の進行を阻害する方法であって、対象に、本明細書に記載される方法に従い産生される少なくとも一つのウリナスタチンポリペプチドを含む組成物を投与することを含む、方法もまた、含まれる。
【0141】
本明細書に記載される方法および組成物は、様々な疾患または状態の治療において使用することができる。例えば、ある特定の実施形態は、対象に本明細書に記載される治療用組成物を投与することを含む、それを必要とする対象における炎症性疾患または状態を治療する方法を含む。
【0142】
例示的な炎症性疾患または状態は、膵炎（例えば、急性膵炎、慢性膵炎、内視鏡的逆行性膵胆管造影（ＥＲＣＰ）誘発性膵炎）、全身性炎症、大腸炎、自己免疫性脳脊髄炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、関節炎、腎不全、熱傷、重症敗血症および関連する炎症促進性／続発性状態（例えば、臓器不全）を含む敗血症／敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、川崎病、腎疾患（例えば、急性腎不全、慢性腎疾患）、虚血性状態（例えば、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳における虚血再灌流障害）、肺炎症および炎症性肺状態（例えば、肺感染症、混合性結合組織疾患と関連する感染性間質性肺炎を含む、肺炎、肺の線維症、急性呼吸促迫症候群）、肝炎を含む肝炎症、アナフィラキシー、手術後または術後合併症（例えば、腎機能、心臓手術、肺手術、認知障害、肝臓移植）、リポ多糖（ＬＰＳ）誘発性炎症または組織損傷（例えば、肺、肝臓、脳）、糖尿病に続く炎症または機能不全（例えば、糖尿病誘発性心機能不全）、火傷、熱射病、炎症性または神経障害性疼痛、急性中毒、高脂血症関連炎症、自己免疫関連炎症、同種移植片または輸血関連炎症、ならびに神経炎症を含む。
【0143】
対象に本明細書に記載される治療用組成物を投与することを含む、それを必要とする対象における癌を治療する方法、癌の症状を回復させる方法、または癌の進行を阻害する方法もまた含まれる。本明細書に記載される方法および治療用組成物は、任意の様々な癌または腫瘍の治療において使用することができる。一部の実施形態では、癌は、原発癌、すなわち、腫瘍の進行が開始し、癌性の塊を生じた、解剖学的部位で生じる癌である。一部の実施形態では、癌は、二次性または転移性癌、すなわち、元の原発部位または組織から、一つまたは複数の異なる部位または組織に広がった癌である。一部の実施形態では、対象は、メラノーマ（例えば、転移性黒色腫）、膵臓癌、骨癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、白血病（例えば、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、再発した急性骨髄性白血病）、リンパ腫、肝細胞腫（肝細胞癌）、肉腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、グリオーマ、多形神経膠芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌腫）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、甲状腺癌、および胃癌の一つまたは複数から選択される癌を有する。
【0144】
一部の実施形態では、上述のように、癌または腫瘍は、転移性癌である。上記の癌に加えて、例示的な転移性癌としては、とりわけ、骨、肝臓、および／または肺に転移している、膀胱癌；骨、脳、肝臓、および／または肺に転移している、乳癌；肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、結腸直腸癌；副腎、骨、脳、肝臓、および／または肺に転移している、腎臓癌；副腎、骨、脳、肝臓、および／または他の肺部位に転移している、肺癌；骨、脳、肝臓、肺、および／または皮膚／筋肉に転移している、メラノーマ；肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、卵巣癌；肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、膵臓癌；副腎、骨、肝臓、および／または肺に転移している、前立腺癌；肝臓、肺、および／または腹膜に転移している、胃癌；骨、肝臓、および／または肺に転移している、甲状腺癌；ならびに骨、肝臓、肺、腹膜、および／または膣に転移している、子宮癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【0145】
ある場合では、治療用組成物の投与は、対象における炎症または一つまたは複数の炎症反応を低減する。例えば、ある場合では、治療用組成物の投与は、対象における内皮活性化／損傷、炎症促進性サイトカインならびにケモカイン産生／放出（例えば、ＩＬ－１β、ＭＩＰ－１α、ＭＣＰ－１、およびＣＸＣＬ１）、フィブリノーゲン合成、器官への好中球の動員、ならびに／または器官損傷の一つまたは複数を低減する。
【0146】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法または組成物は、患者の生存期間中央値を、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１５週間、２０週間、２５週間、３０週間、４０週間以上増加させる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法または組成物は、患者の生存期間中央値を、１年、２年、３年以上増加させる。
【0147】
ある特定の実施形態では、例えば、癌の治療において、投与される組成物は、生存腫瘍の量の統計的に有意な減少、例えば、腫瘍質量における少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上の減少によって、または変化した（例えば、統計的有意性を伴って減少した）スキャン寸法によって示される、腫瘍退縮をもたらすのに十分である。ある特定の実施形態では、投与される組成物は、安定な疾患をもたらすのに十分である。ある特定の実施形態では、投与される組成物は、当業者に公知の特定の疾患適応症の症状の安定化または臨床的に相関する低減をもたらすのに十分である。
【0148】
本明細書に記載される疾患または状態の一つまたは複数を有する対象を同定する方法は、当該技術分野において公知である。
【0149】
投与は、様々な異なる経路によって達成され得る。投与方法は、治療または予防されるべき状態の性質に依存する。例えば、組成物は、経口的、鼻腔内、腹腔内、非経口的に、静脈内、リンパ管内、腫瘍内、筋肉内、間質内、カテーテル内、動脈内、皮下、眼内、滑膜内、上皮内、および／または経皮で投与することができる。特定の実施形態は、ＩＶ点滴による投与を含む。
【0150】
正確な投薬量および治療期間は、治療されている疾患の働きであり、公知の試験プロトコールを使用して、または当該技術分野で公知のモデルシステムにおいて組成物を試験すること、およびそれらから推定することによって経験的に決定されてもよい。対照臨床試験がまた、行われてもよい。投薬量はまた、緩和されるべき状態の重症度と共に変動し得る。医薬組成物は、概して、望ましくない副作用を最小限にしながら、治療上有用な作用を発揮するよう製剤化され、投与される。組成物は、一回投与されてもよいか、または時間間隔で投与されるべき多数のより小さな用量に分けられてもよい。任意の特定の対象のため、特定の投薬レジメンは、個々の必要性に応じて経時的に調整され得る。
【0151】
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物の治療上有効量または治療投薬量は、対象における炎症または炎症反応を低減するのに有効である量である。ある場合では、治療は、状況下で最適な効果が達成されるまで、わずかな増加で増加させ得る、少ない投薬量で開始される。
【0152】
一部の実施形態では、投薬量は、一日約一回～二週間または三週間に約一回投与される。例えば、ある特定の実施形態では、投薬量は、１、２、３、４、５、６、もしくは７日に約一回、あるいは一週間に約一回、または一週間に約二回、または一週間に約三回、または二週間もしくは三週間に約一回投与される。
【0153】
ある特定の実施形態は、間の全ての範囲および整数を含む、約１×１０４Ｕ～約１×１０５Ｕ～約１００×１０５Ｕ、または約１×１０４Ｕ、２×１０４Ｕ、３×１０４Ｕ、４×１０４Ｕ、５×１０４Ｕ、６×１０４Ｕ、７×１０４Ｕ、８×１０４Ｕ、９×１０４Ｕ、１×１０５Ｕ、２×１０５Ｕ、３×１０５Ｕ、４×１０５Ｕ、５×１０５Ｕ、６×１０５Ｕ、７×１０５Ｕ、８×１０５Ｕ、９×１０５Ｕ、１０×１０５Ｕ、１１×１０５Ｕ、１２×１０５Ｕ、１５×１０５Ｕ、２０×１０５Ｕ、３０×１０５Ｕ、４０×１０５Ｕ、５０×１０５Ｕ、６０×１０５Ｕ、７０×１０５Ｕ、８０×１０５Ｕ、もしくは１００×１０５Ｕの投薬量（例えば、一日用量）でウリナスタチンポリペプチドを投与することを含む。ある特定の実施形態は、約、少なくとも約、もしくは約未満の、５０，０００Ｕ／ｋｇ、１２５，０００Ｕ／ｋｇ、２５０，０００Ｕ／ｋｇ、５００，０００Ｕ／ｋｇ、７５０，０００Ｕ／ｋｇ、もしくは１，０００，０００Ｕ／ｋｇ；または約５０，０００～１，０００，０００Ｕ／ｋｇ、約１２５，０００～１，０００，０００Ｕ／ｋｇ、約２５０，０００～１，０００，０００Ｕ／ｋｇ、約５００，０００～１，０００，０００Ｕ／ｋｇ、約７５０，０００～１，０００，０００Ｕ／ｋｇ、約５０，０００～７５０，０００Ｕ／ｋｇ、約１２５，０００～７５０，０００Ｕ／ｋｇ、約２５０，０００～７５０，０００Ｕ／ｋｇ、約５００，０００～７５０，０００Ｕ／ｋｇ、約５０，０００～５００，０００Ｕ／ｋｇ、約１２５，０００～５００，０００Ｕ／ｋｇ、約２５０，０００～５００，０００Ｕ／ｋｇ、約５０，０００～２５０，０００Ｕ／ｋｇ、約１２５，０００～２５０，０００Ｕ／ｋｇ、もしくは約５０，０００～１２５，０００Ｕ／ｋｇの範囲にある投薬量（例えば、一日用量）でウリナスタチンポリペプチドを投与することを含む。
【0154】
ある特定の実施形態は、皮下投薬量を投与することを含む。一部の実施形態は、例えば、一日用量を、約１、２、または３時間かけて静脈内注入することによって、静脈内投薬量を投与することを含む。特定の実施形態は、一日用量を、約１、２、または３時間かけて、任意選択で、一日に約１、２、または３回、および任意選択で、連続して約２、３、４、５、６、または７日以上、注入することを含む。
【0155】
本明細書に記載される方法に従い産生される一つまたは複数の組成物またはウリナスタチンポリペプチドを含む患者ケアキットもまた、含まれる。ある特定のキットはまた、水（例えば、無菌水）または食塩水などの、一つまたは複数の医薬的に許容される希釈剤または溶媒を含む。一部の実施形態では、組成物またはウリナスタチンポリペプチドは、バイアル、カートリッジ、デュアルチャンバーシリンジ、および／または充填済み混合システムにおいて保存される。
【0156】
本明細書におけるキットは、一つまたは複数の追加の治療用薬剤または治療されている適応症もしくは所望される診断適用に適当もしくは望ましい他の成分を含んでもよい。本明細書におけるキットはまた、意図される送達モード（例えば、ステント、移植可能なデポーなど）を促進するために必要または望ましい、一つまたは複数のシリンジまたは他の構成要素を含むことができる。
【0157】
本明細書において引用される刊行物、特許出願、および発行された特許は、それぞれの個々の刊行物、特許出願、または発行された特許が、参照により組み込まれるよう具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【0158】
前述の発明は、理解の明瞭さを目的として、例示および実施例によっていくらか詳細に記述されてきたが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の変更および修正がなされ得ることは、本発明の教示に照らして当業者にとって容易に明らかであろう。以下の実施例は、単に説明のために提供され、制限のため提供されるものではない。当業者であれば、本質的に類似する結果をもたらすよう変更または修正され得る様々な非臨界パラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【0159】
実施例１
ウリナスタチン融合ポリペプチドの調製および発現
二つの融合コンストラクトを調製して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における最適なウリナスタチン発現を得た。ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチドを、全長ヒトウリナスタチンのＮ末端、またヒトウリナスタチンの成熟形態に融合させた。ウリナスタチン配列のそれぞれを修飾して、成熟ウリナスタチン配列の残基１０（Ｓ１０Ａ）でセリンからアラニンへの変異を取り込み、その残基でのグリコサミノグリカン結合を防いだ。全長ウリナスタチン融合ポリペプチドは、成熟ウリナスタチン産生するための、ＣＨＯ細胞における酵素切断（フューリン）を必要とする。成熟ウリナスタチン融合ポリペプチドは、成熟ウリナスタチンを産生するためのウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチドの切断のみを必要とする。融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、表Ｕ２に示し、核酸コード配列を、表Ｕ３に示す。ＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
ウリナスタチン融合ポリペプチドの調製および発現
二つの融合コンストラクトを調製して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における最適なウリナスタチン発現を得た。ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチドを、全長ヒトウリナスタチンのＮ末端、またヒトウリナスタチンの成熟形態に融合させた。ウリナスタチン配列のそれぞれを修飾して、成熟ウリナスタチン配列の残基１０（Ｓ１０Ａ）でセリンからアラニンへの変異を取り込み、その残基でのグリコサミノグリカン結合を防いだ。全長ウリナスタチン融合ポリペプチドは、成熟ウリナスタチン産生するための、ＣＨＯ細胞における酵素切断（フューリン）を必要とする。成熟ウリナスタチン融合ポリペプチドは、成熟ウリナスタチンを産生するためのウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチドの切断のみを必要とする。融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、表Ｕ２に示し、核酸コード配列を、表Ｕ３に示す。ＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【0160】
レトロウイルスベクター産生。
上で概説した融合タンパク質コンストラクトを、図２（ＦＬウリナスタチン）および図３（成熟ウリナスタチン）で説明する通り、レトロウイルスベクターに導入した。ベクター成分の詳細を、以下の表Ｅ１および表Ｅ２において提供する。
上で概説した融合タンパク質コンストラクトを、図２（ＦＬウリナスタチン）および図３（成熟ウリナスタチン）で説明する通り、レトロウイルスベクターに導入した。ベクター成分の詳細を、以下の表Ｅ１および表Ｅ２において提供する。
【表E1】
【表E2】
【0161】
レトロベクターを、ＭＬＶ ｇａｇ、ｐｒｏ、およびｐｏｌタンパク質を恒常的に産生するＨＥＫ２９３細胞株に遺伝子導入した。エンベロープ含有発現プラスミドも、二つのレトロベクターコンストラクトのそれぞれと共遺伝子導入した。二つの共遺伝子導入は、二つの遺伝子コンストラクトのそれぞれについて、複製無能な高いタイターのレトロベクターの産生をもたらし、それを、超遠心分離によって濃縮し、細胞形質導入のため使用した（Ｂｌｅｃｋ，Ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ，ｈｉｇｈ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊ．Ｓｅｐｔ／Ｏｃｔ．ｐｐ１－７，２００５；およびＢｌｅｃｋ，ＧＰＥｘ（登録商標）Ａ Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｂｌｅ，Ｈｉｇｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｃｈａｐｔｅｒ４ Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｓ．Ｊ．Ｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（登録商標）２０１０Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ，ＤＯＩ１０．１００７／９７８－０－３８７－７６６４３－０＿４を参照のこと）。
【0162】
それぞれのレトロウイルスコンストラクトのためプールした細胞株を、複製無能な高タイターのレトロベクターを用いたＧＰＥｘ（登録商標）チャイニーズハムスター卵巣（ＧＣＨＯ）親細胞株の３サイクルの細胞形質導入によって産生した。全長ウリナスタチンレトロベクターを、全長分子を消化して、成熟ウリナスタチンを産生する、フューリン酵素を過剰発現するＧＣＨＯ細胞株に形質導入した。成熟ウリナスタチンレトロベクターを、正常ＧＣＨＯ細胞に形質導入した。
【0163】
形質導入後、二つのコンストラクトのそれぞれについてプールした細胞株を、２．８Ｌの攪拌フラスコにおける流加培養研究において産生をスケールアップした。それぞれの攪拌フラスコに、Ｇ１２．１培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中１ｍＬ当たり３００，０００個の生細胞を播種し、８０ｒｐｍでの加湿（７０～８０％）振盪インキュベーターにおいて５％ＣＯ２および３７℃の温度でインキュベートした。二つの異なる栄養補助剤を使用した生成実行中に７回、培養物に影響を加えた。培養温度を、培養の５日目に、３７℃から３４℃に低げた。生存率が≦８０％であったとき、培養を終えた。
【0164】
タンパク質産生の確認を、図３に示す通り、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析によって決定した。尿由来のウリナスタチン対照は、Ｎ－結合グリコシル化とグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）分子の両方を含有する。ＧＡＧ分子のための付着部位を変異させたため、全長および成熟ウリナスタチン融合コンストラクトは、Ｎ－結合グリコシル化のみを有するべきである。全長ウリナスタチン試料は、細胞株において、付加したフューリンによって完全に切断されたように見える。ゲルは、切断したタンパク質の大きなフラグメント（１８６アミノ酸および２つのＮ－結合グリコシル化部位（上部のバンド））と成熟ウリナスタチンフラグメント（１４７のアミノ酸および一つのＮ－結合グリコシル化部位（下部のバンド））の両方を示す。
【0165】
成熟ウリナスタチン試料は、より小さいサイズの成熟ウリナスタチンフラグメントのみを含有する。より小さい分子量の成熟ウリナスタチン産物は、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で泳動したとき、二つのバンドからなるようである。この二重を、全長試料について観察しなかった（レーン６をレーン９と比較する、図３を参照のこと）。
【0166】
図３のレーン９において、成熟ウリナスタチン試料について観察した二つのバンドを調べるために、材料をまず調べて、第二のバンドが、Ｎ－結合グリコシル化に起因したかどうかを決定した。ゆえに、尿由来のウリナスタチン、全長ウリナスタチン、および成熟ウリナスタチン試料をＰＮＧａｓｅで消化して、任意の可能性のあるＮ－結合グリカンを除去し、次いで、ゲル上で電気泳動させた。二重が、Ｎ－結合グリコシル化によって引き起こされた場合、ＰＮＧａｓｅ消化が、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で単一のバンドをもたらすと予想する。しかしながら、図４に示す通り、ＰＮＧａｓｅ消化は、成熟ウリナスタチン試料において観察した二重を変化させなかった（レーン１０を参照のこと）。代わりに、Ｎ－結合グリカンを除去し、これにより、分子量のシフトを生じた（図４におけるレーン９および１０を比較する）が、二重を維持し、これは、追加のＮ－結合グリコシル化が、第二のバンドを生じなかったことを示している。加えて、全長ウリナスタチンのＰＮＧａｓｅ処理は、二重修飾が、全長ウリナスタチン試料ではなく、成熟ウリナスタチン試料において飲み生じることを確かにする。
【0167】
成熟ウリナスタチン試料を、ペプチドマップにして、二重を、バリアントタンパク質配列、またはタンパク質構造への別の修飾によって生じたかどうかを決定した。分析は、成熟ウリナスタチン配列への修飾が存在しなかったことを確認したばかりでなく、驚くべきことに、成熟ウリナスタチン試料における上部のバンドが、スレオニン１７（Ｔ１７）でのそうでなければ非天然のＯ－結合グリコシル化によって引き起こされることを示した。このＯ－結合グリコシル化は、成熟形態のウリナスタチンを産生するためのインサイツ酵素（フューリン）切断後でさえ、全長ウリナスタチン／ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチド融合タンパク質調製物に存在しない。それは、成熟ウリナスタチン／ウシアルファ－ラクトアルブミンシグナルペプチド融合タンパク質調製物でのみ生じる。Ｎ－結合グリコシル化およびＴ１７で予想外のＯ－結合グリコシル化を有する成熟ウリナスタチンを含む材料を試験し、インビトロでトリプシンを阻害することを見出した（図５を参照のこと）。ここで、トリプシン阻害活性を、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（商標）のトリプシン活性キットを使用して分析した。ＤＦ２０００、ＤＦ４０００、ＤＦ８０００、ＤＦ１６０００、およびＤＦ３２０００の希釈係数（ＤＦ）で、約５０００Ｕ／ｍｇの組み換えウリナスタチン（Ｔ１７）を含有する試料を用いて、希釈を行った。
【0168】
実施例２
敗血症のマウスモデルにおける組み換えウリナスタチンの活性
研究を行い、敗血症マウスモデルにおける組み換えウリナスタチンの有効性を評価した（実施例１；Ｔ１７でのＯ－結合グリコシル化を参照のこと）。オスのＣ５７ＢＬ｜６マウスは、腸管穿孔（ＣＬＰ）手術を受けて、軽度から中程度のグレードの敗血症を誘導した。試験スケジュールを、表Ｅ３に示す。
敗血症のマウスモデルにおける組み換えウリナスタチンの活性
研究を行い、敗血症マウスモデルにおける組み換えウリナスタチンの有効性を評価した（実施例１；Ｔ１７でのＯ－結合グリコシル化を参照のこと）。オスのＣ５７ＢＬ｜６マウスは、腸管穿孔（ＣＬＰ）手術を受けて、軽度から中程度のグレードの敗血症を誘導した。試験スケジュールを、表Ｅ３に示す。
【表E3】
【0169】
手術の三十（３０）分後、マウスに、ウリナスタチン試験物品、０日目から４日目に一日一回の静脈内（ｌＶ）注射を介した陰性対照（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）、または０日目ないし４日目に、皮下（ＳＣ）注射を介して一日二回、陽性対照イミペネムを投与した。ＣＬＰ手術の６日後、動物の生存を追跡し、試験物品の有効性を、試験物品と陰性対照の間での生存の比較によって決定した。
【0170】
データを、図６Ａ～６Ｂに示す。一緒に、データは、２２ゲージの針を使用した腸管穿孔が、オスのＣ５７ＢＬ｜６マウスにおいて敗血症感染を引き起こしたことを示す。ＰＢＳビークルＣＬＰ群が、軽度から中程度のグレードの敗血症を発症し、４０％の死亡率を伴い、イミペネムで処置したマウスが、０％の死亡率を有し、それは、従前の研究で観察した範囲内である。組み換えウリナスタチンで処置した群において観察した用量応答が存在し、最低濃度（５０，０００Ｕ／ｋｇ）で５０％の死亡率を有し、試験したより高い濃度（１２５，０００および２５０，０００Ｕ／ｋｇ）は、２０％の死亡率のみを有した。
【0171】
実施例３
急性膵炎のマウスモデルにおける組み換えウリナスタチンの活性
実験を行い、マウスにおけるセルレイン誘導性急性膵炎モデルにおいて三つの用量レベルでの組み換えウリナスタチン（Ｔ１７）の活性を評価した。
急性膵炎のマウスモデルにおける組み換えウリナスタチンの活性
実験を行い、マウスにおけるセルレイン誘導性急性膵炎モデルにおいて三つの用量レベルでの組み換えウリナスタチン（Ｔ１７）の活性を評価した。
【0172】
オスのＩＣＲマウスにおける急性膵炎を、二時間間隔での三回のセルレイン（１００μｇ／ｋｇ）の腹腔内（ＩＰ）注射によって誘導した。試験物品またはビークル（無菌のＰＢＳ）を、それぞれのセルレイン負荷（計３用量）の１時間後に静脈内（ＩＶ）投与した。参照化合物であるデバゼピドを、それぞれのセルレイン負荷の１時間後に経口（ＰＯ）投与した。マウスを、第一のセルレイン負荷の９時間後に屠殺した。血液を収集し、血清α－アミラーゼおよびリパーゼを、自動分析装置（ＴＢＡ－１２０ＦＲ、Ｔｏｓｈｉｂａ、Ｊａｐａｎ）によって検出した。
【0173】
【0174】
急性膵炎の指標である血清α－アミラーゼおよびリパーゼは、正常対照群と比較して、反復セレイン負荷によって有意（ｐ＜０．０５）に増加し、これは、第一のセルレイン注射の９時間後に、ビークル群において急性膵炎の誘導が成功したことを示している。０．１ｍｇ／ｋｇ×３での陽性対照であるデバゼピドの経口投与は、ビークル群と比較したとき、第一のセルレイン注射の９時間後に、血清α－アミラーゼおよびリパーゼのレベルを有意（ｐ＜０．０５）に低減した。
【0175】
経口経管栄養により１６．５ｍｇ／ｋｇ×３（８３，３３３Ｕ／ｋｇ×３＝計２５０，０００Ｕ／ｋｇ）および３３ｍｇ／ｋｇ×３（１６６，６６７Ｕ／ｋｇ×３＝計５００，０００Ｕ／ｋｇ）で付与した試験物品（組み換えウリナスタチン；Ｔ１７）は、ビークル群と比較したとき、第一のセルレイン注射の９時間後に、血清α－アミラーゼレベルの有意（ｐ＜０．０５）な減少を示した。ビークル群と比較して、全３種の用量レベルの組み換えウリナスタチンで、血清リパーゼにおいてわずかな作用が存在した。
【0176】
研究の終わりに、全ての動物の膵試料を、ＲＮＡｌａｔｅｒにおいて回収した。定量的リアルタイムＰＣＲバイオマーカー分析を、膵臓試料において行った。それぞれのアッセイを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム上でトリプリケートで実行し、発現の倍率変化を、内在性対照としてＧＡＰＤＨを、および標準物質として試料「１－１」を用いた、比較ＣＴ方法を使用してもたらした。最終結果を、遺伝子発現におけるｎ倍の相違または相対的数量（ＲＱ）として表し、対照試料のＲＱは、常に１と等しくした。
【0177】
図９に示す通り、炎症の遺伝子マーカー（ＩＬ－６）および酸化ストレス（ＨＭＯＸ１）ｍＲＮＡレベルは、正常の対照群と比較したとき、反復セルレイン負荷によって有意（ｐ＜０．０５）に増加した。０．１ｍｇ／ｋｇ×３でのデバゼピドの経口投与は、ビークル群と比較したとき、ＩＬ－６ｍＲＮＡ発現を中程度に減弱し、ＨＭＯＸ１ｍＲＮＡ発現を有意（ｐ＜０．０５）に減弱した。１６．５ｍｇ／ｋｇ×３ＰＯ（８３，３３３Ｕ／ｋｇ×３＝計２５０，０００Ｕ／ｋｇ）および３３ｍｇ／ｋｇ×３ＰＯ（１６６，６６７Ｕ／ｋｇ×３＝計５００，０００Ｕ／ｋｇ）で与えた組み換えウリナスタチン（Ｔ１７）は、ビークル群と比較したとき、ＩＬ－６ｍＲＮＡ発現を減弱した。３．３ｍｇ／ｋｇ×３ＰＯ（１６，６６７Ｕ／ｋｇ×３＝計５０，０００Ｕ／ｋｇ）、１６．５ｍｇ／ｋｇ×３ＰＯ（８３，３３３Ｕ／ｋｇ×３＝計２５０，０００Ｕ／ｋｇ）および３３ｍｇ／ｋｇ×３ＰＯ（１６６，６６７Ｕ／ｋｇ×３＝計５００，０００Ｕ／ｋｇ）で与えた組み換えウリナスタチンは、ビークル対照と比較したとき、ＨＭＯＸ１ｍＲＮＡ発現の逆の用量応答を示した。コラーゲンＩレベルもまた、組み換えウリナスタチンを用いた処置によって、正常対照レベルに回復した。
【0178】
全体として、１６．５ｍｇ／ｋｇ×３ＰＯ（８３，３３３Ｕ／ｋｇ×３＝計２５０，０００Ｕ／ｋｇ）および３３ｍｇ／ｋｇ×３ＰＯ（１６６，６６７Ｕ／ｋｇ×３＝計５００，０００Ｕ／ｋｇ）で与えた組み換えウリナスタチンは、血清α－アミラーゼレベルを有意に減少し、血清リパーゼレベル、ＩＬ－６ｍＲＮＡ発現に対する著しい作用を有し、マウス急性膵炎モデルにおける第一のセルレイン注射の９時間後に、コラーゲンＩレベルを回復した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】