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特表2023-516431ミトコンドリア機能の改善または機能障害の軽減のための治療
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-19
(54)【発明の名称】ミトコンドリア機能の改善または機能障害の軽減のための治療
(51)【国際特許分類】
A61K 38/08 20190101AFI20230412BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230412BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20230412BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230412BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230412BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20230412BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230412BHJP
【ＦＩ】
A61K38/08
A61P43/00 107
A61P9/04
A61P13/12
A61P17/00
A61P25/02
A61P25/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022553111
(86)(22)【出願日】2021-03-05
(85)【翻訳文提出日】2022-09-13
(86)【国際出願番号】 US2021021171
(87)【国際公開番号】W WO2021178864
(87)【国際公開日】2021-09-10
(31)【優先権主張番号】62/986,361
(32)【優先日】2020-03-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519341234
【氏名又は名称】アレグロ ファーマシューティカルズ エルエルシー
【氏名又は名称原語表記】Ａｌｌｅｇｒｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣ
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】カラジョージアン、ハンパー エル．
(72)【発明者】
【氏名】パーク、ジョン ワイ．
(72)【発明者】
【氏名】カラジョージアン、ビッケン エイチ．
【テーマコード（参考）】
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA17
4C084BA23
4C084CA59
4C084NA14
4C084ZA151
4C084ZA152
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZA811
4C084ZA812
4C084ZA891
4C084ZA892
4C084ZB221
4C084ZB222
(57)【要約】
ミトコンドリア機能の改善または機能障害の軽減のための、ペプチド療法。これらの療法は、神経変性、代謝性疾患、うっ血性心不全、駆出率が低減した慢性心不全、駆出率が保持された慢性心不全、バース症候群、腎動脈狭窄のための経皮腎血管造影に起因する腎臓疾患および腎不全、高齢者の骨格筋機能の機能障害、原発性筋肉ミトコンドリアミオパチーおよびニューロパチー、虚血再灌流損傷および原虫感染症、末梢ニューロパチー、皮膚障害および炎症性痔などのミトコンドリア機能不全を引き起こすか、それによって引き起こされるか、それに貢献するか、またはそれに関連する障害に使用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ミトコンドリア生体エネルギーの改善を必要とするヒトまたは動物の対象において、それを行うための方法であって、前記方法が、ミトコンドリア生体エネルギーの改善を引き起こす治療有効量のペプチドを、前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項2】
前記対象が、ミトコンドリア生体エネルギーの機能障害を引き起こすか、またはそれによって引き起こされる障害を患っており、前記ペプチドの前記投与により、前記障害を引き起こすか、またはそれによって引き起こされたミトコンドリア生体エネルギーの前記機能障害のうちの少なくともいくらかを回復または予防する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記障害が、化学毒性、低酸素性、または虚血性損傷を含むか、またはそれに起因する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記障害が、代謝ストレスを含むか、またはそれに起因する、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記障害が、心不全、腎不全、および腎臓疾患を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記障害が、神経変性疾患を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）の機能および／または構造の進行性変性を引き起こす他の障害から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記障害が、皮膚障害を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項9】
前記皮膚が、発疹、色素沈着異常または先端チアノーゼを引き起こすか、またはそれを伴う、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記皮膚障害が、そう痒症、アトピー性皮膚炎または乾癬を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記障害が、末梢ニューロパチーまたは末梢神経痛を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項12】
前記末梢ニューロパチーまたは末梢神経痛が、ミトコンドリア機能不全、糖尿病、異常なグルコース代謝、酸化ストレス、または化学療法を引き起こすか、またはそれによって引き起こされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記障害が、心不全または心拍出量の低減を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項14】
前記ペプチドが、リステガニブ（Ｒｉｓｕｔｅｇａｎｉｂ）を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ペプチドが、直鎖状または環状形態のグリシニル－アルギニル－グリシニル－システイン酸－トレオニル－プロニン－ＣＯＯＨを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ペプチドが、以下の式を有し、Ｘ１－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－システイン酸－Ｘ
式中、ＸおよびＸｌが、Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｌａ、－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ａｌａ、－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ、－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ、－Ｐｈｅ－Ｖａｌから選択されるか、またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、システイン酸、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、および塩、ならびにそれらの任意のＤ－異性体およびＬ－異性体の任意の組み合わせから選択される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記ペプチドが、以下の一般式を有し、Ｙ－Ｘ－Ｚ
式中、
Ｙ＝Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｃｙｓ（酸）、ＧまたはＤであり、
Ｘ＝Ｇ、Ａ、Ｃｙｓ（酸）、Ｒ、Ｇ、ＤまたはＥであり、
Ｚ＝Ｃｙｓ（酸）、Ｇ、Ｃ、Ｒ、Ｄ、ＮまたはＥである、
請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記ペプチドが、Ｒ－Ｇ－Ｃｙｓ（酸）、Ｒ－Ｒ－Ｃｙｓ、Ｒ－Ｃｙｓ酸）－Ｇ、Ｃｙｓ（酸）－Ｒ－Ｇ、Ｃｙｓ（酸）－Ｇ－Ｒ、Ｒ－Ｇ－Ｄ、Ｒ－Ｇ－Ｃｙｓ（酸）、Ｈ－Ｇ－Ｃｙｓ（酸）、Ｒ－Ｇ－Ｎ、Ｄ－Ｇ－Ｒ、Ｒ－Ｄ－Ｇ、Ｒ－Ａ－Ｅ、Ｋ－Ｇ－Ｄ、Ｒ－Ｇ－Ｃｙｓ（酸）－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｄ－Ｇ、Ｃｙｃｌｏ－｛Ｒ－Ｇ－Ｃｙｓ（酸）－Ｆ－Ｎ－Ｍｅ－Ｖ｝、Ｒ－Ａ－Ｃｙｓ（酸）、Ｒ－Ｇ－Ｃ、Ｋ－Ｇ－Ｄ、Ｃｙｓ（酸）－Ｒ－Ｇ、Ｃｙｓ（酸）－Ｇ－Ｒ、シクロ－｛Ｒ－Ｇ－Ｄ－Ｄ－Ｆ－ＮＭｅ－Ｖ｝、Ｈ－Ｇ－Ｃｙｓ（酸）およびそれらの塩から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
ミトコンドリア生体エネルギーの改善を必要とするヒトまたは動物の対象において、それを行うための組成物または医薬調製物であって、前記組成物または医薬調製物が、請求項１３～１８の少なくとも一項に定義または列挙される少なくとも１つのペプチドを含む、組成物または医薬調製物。
【請求項20】
化学毒性、低酸素性または虚血性損傷、代謝ストレス、心不全、駆出率が低減した慢性心不全、駆出率が保持された慢性心不全、バース症候群、腎臓疾患、腎動脈狭窄のための経皮腎血管造影に起因する腎不全、高齢者の骨格筋機能の機能障害、原発性筋肉ミトコンドリアミオパチーまたはニューロパチー、虚血再灌流損傷、原虫感染症、末梢ニューロパチー、皮膚障害、ニューロネラティブ（ｎｅｕｒｏｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞の機能および／または構造の進行性変性を引き起こす別の障害、皮膚障害、発疹、色素沈着異常または先端チアノーゼ、そう痒症、アトピー性皮膚炎、乾癬、ミトコンドリア機能不全を引き起こすか、それに寄与するか、またはそれによって引き起こされる末梢ニューロパチー、末梢神経痛、または神経痛、糖尿病、異常なグルコース代謝、酸化ストレスまたは化学療法、心不全または心拍出量の低減から選択される障害の治療のためのリステガニブを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本特許出願は、２０２０年３月６日に出願された、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｏｒ Ｌｅｓｓｅｎｉｎｇ Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓと題する米国仮特許出願第６２／９８６，３６１号の優先権を主張するものであり、その開示全体は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
本特許出願は、２０２０年３月６日に出願された、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｏｒ Ｌｅｓｓｅｎｉｎｇ Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓと題する米国仮特許出願第６２／９８６，３６１号の優先権を主張するものであり、その開示全体は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【0002】
本開示は、一般に、化学、生命科学、薬学および医学の分野に関し、より具体的には、医薬調製物および疾患の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
３７ ＣＦＲ １．７１（ｅ）に準拠して、本特許文書は、著作権保護の対象となる材料を含んでおり、本特許文書の所有者は、すべての著作権をいかなるものでも保有する。
リステガニブ（Ｒｉｓｕｔｅｇａｎｉｂ）（本明細書においては、ＲＳＧと称されることもある）は、分子式Ｃ２２－Ｈ３９－Ｎ９－Ｏ１１－Ｓおよび以下の構造式を有する非天然ペプチドである。
リステガニブ（Ｒｉｓｕｔｅｇａｎｉｂ）（本明細書においては、ＲＳＧと称されることもある）は、分子式Ｃ２２－Ｈ３９－Ｎ９－Ｏ１１－Ｓおよび以下の構造式を有する非天然ペプチドである。
【0004】
【化1】
【0005】
リステガニブは、ＡＬＧ－１００１、グリシル－Ｌ－アルギニルグリシル－３－スルホ－Ｌ－アラニル－Ｌ－トレオニル－Ｌプロリン、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ）ＣＯＯＨ、およびＬｕｍｉｎａｔｅ（登録商標）（Ａｌｌｅｇｒｏ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ，ＬＬＣ，Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，ＣＡ）を含む、他の名前、命名法および名称によっても言及されている。リステガニブは、抗インテグリンであり、酸化ストレス経路の上流の多数のインテグリンを標的とすることが示されている。リステガニブは、低酸素症および酸化ストレスと関連するものを含め、複数の血管新生および炎症プロセスを下方調節するように広く作用する。
【0006】
リステガニブの追加の説明およびリステガニブに関する情報は、特許文献１～６ならびに２０１９年４月２２日に出願されたＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｕｓｅａｂｌｅ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｄｒｙ Ｅｙｅと題された同時係属中の米国仮特許出願第６２８３６８５８号および２０１９年７月２６日に出願されたＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｄｒｙ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｅｙｅと題された同第６２／８７９２８１号で提供され、かかる特許および特許出願の各々の全開示内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【0007】
ミトコンドリアは、多くの種類の細胞内に見られるオルガネラである。ミトコンドリアは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成することによってエネルギーを生み出す機能を持ち、体の多くの機能の燃料となっている。筋肉および神経細胞が、高いエネルギー需要を有するため、ミトコンドリア機能不全は、筋肉または神経障害の形態で頻繁に現れる。主に筋肉に影響を及ぼすミトコンドリア障害は、ミトコンドリアミオパチーと呼ばれることがある。主に神経に影響を与えるミトコンドリア障害は、ミトコンドリアニューロパチーまたはミトコンドリア脳筋症と呼ばれることがある。ミトコンドリア機能不全は、神経変性、代謝性疾患、うっ血性心不全、駆出率が低減した慢性心不全、駆出率が保持された慢性心不全、バース症候群、腎動脈狭窄のための経皮腎血管造影に起因する腎臓疾患および腎不全、高齢者の骨格筋機能、原発性筋肉ミトコンドリアミオパチーおよびニューロパチー、虚血再灌流損傷、および原虫感染症などの多種多様な障害に寄与し得る。非特許文献１。ミトコンドリアは、細胞レベルでストレスへの適応を可能にし、直接的に適応するエネルギーおよびシグナルの両方を提供する。したがって、非特許文献２を参照されたい。また、ミトコンドリア機能不全は、自閉症スペクトラム障害の発症の要因として同定されている。非特許文献３～９および非特許文献１０を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】米国特許第９０１８３５２号明細書
【特許文献2】米国特許第９８７２８８６号明細書
【特許文献3】米国特許第９８９６４８０号明細書
【特許文献4】米国特許第１０３０７４６０号明細書
【特許文献5】米国特許出願公開第２０１８／０２０７２２７号明細書
【特許文献6】米国特許出願公開第２０１９／００６２３７１号明細書
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．；Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｓ ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ｃｏｍｍｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ；Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１８ Ｄｅｃ；１７（１２）：８６５－８８６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ．２０１８．１７４．Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｎｏｖ ５
【非特許文献2】Ｐｉｃａｒｄ，Ｍ．他：Ａｎ Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ Ｖｉｅｗ ｏｆ Ｓｔｒｅｓｓ：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｍｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ；Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ４９（２０１８）７２－８５
【非特許文献3】Ｇｉｕｌｉｖｉ他、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｕｔｉｓｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．２０１０；３０４：２３８９－２３９６
【非特許文献4】Ｃｈａｕｈａｎ他、Ｂｒａｉｎ ｒｅｇｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｆｉｃｉｔ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｃｈａｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ａｕｔｉｓｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；１１７：２０９－２２
【非特許文献5】Ｔａｎｇ他、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂｅ ｏｆ ａｕｔｉｓｔｉｃ ｂｒａｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１３；５４：３４９－３６１
【非特許文献6】Ｇｏｈ他、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ａ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｂｔｙｐｅ ｏｆ Ａｕｔｉｓｍ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｂｒａｉｎ ｉｍａｇｉｎｇ．ＪＡＭＡ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１４；７１：６６５－６７１
【非特許文献7】Ｎａｐｏｌｉ他、Ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ａｕｔｉｓｍ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ２０１４；１３３：ｅ１４０５－１０
【非特許文献8】Ｒｏｓｅ他、Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ａｕｔｉｓｍ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎ ａ ｗｅｌｌ－ｍａｔｃｈｅｄ ｃａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｏｈｏｒｔ．ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１４；９：ｅ８５４３６
【非特許文献9】Ｐａｒｉｋｈ他、Ａ Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｐｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００９；１１：４１４－４３０
【非特許文献10】Ｇｅｉｅｒ他、Ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｌｅｖｏｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｔｏ ｔｒｅａｔ ａｕｔｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ ２０１１；１７：ＰＩ１５－２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
ミトコンドリア機能を改善するか、または機能障害を軽減し、それによってミトコンドリア機能不全によって引き起こされるか、またはそれに関連する疾患および障害を治療するための新しい療法の開発の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本開示は、ミトコンドリア機能を改善するための治療、および／またはミトコンドリア機能の減少もしくは機能障害を引き起こすか、それによって引き起こされる、もしくはそれを伴う障害を治療するための治療法を記載する。ペチドは、リステガニブまたは他のペプチドを含んでもよく、その例は、本明細書に記載される。
【0012】
一態様によれば、ミトコンドリア生体エネルギーの改善を必要とするヒトまたは動物対象において、それを行うための方法が提供され、該方法は、ミトコンドリア生体エネルギーの改善を引き起こす治療有効量のペプチドを、対象に投与するステップを含む。いくつかの用途では、対象は、ミトコンドリア生体エネルギーの機能障害を引き起こす、それに寄与する、またはそれによって引き起こされる障害を患っている可能性があり、ペプチドの投与により、例えば、化学毒性、低酸素性または虚血性損傷、代謝ストレス、心不全、駆出率が低減した慢性心不全、駆出率が保持された慢性心不全、バース症候群、腎臓疾患、腎動脈狭窄のための経皮腎血管造影に起因する腎不全、高齢者の骨格筋機能の障害、原発性筋肉ミトコンドリアミオパチーまたはニューロパチー、虚血再灌流損傷、原虫感染症、末梢ニューロパチー、皮膚障害、ニューロネラティブ（ｎｅｕｒｏｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞の機能および／または構造の進行性変性を引き起こす別の障害、皮膚障害、発疹、色素沈着異常または先端チアノーゼ、そう痒症、アトピー性皮膚炎、乾癬、ミトコンドリア機能不全を引き起こすか、それに寄与するか、またはそれによって引き起こされる末梢ニューロパチー、末梢神経痛、または神経痛、糖尿病、異常なグルコース代謝、酸化ストレスまたは化学療法、心不全または心拍出量の低減などのミトコンドリア生体エネルギーのそのような障害のうちの少なくともいくらかを回復または予防する。
【0013】
なお本開示のさらなる態様および詳細は、本明細書で以下に示される詳細な説明および実施例を読むことで理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】対照、ＲＳＧ単独、ＨＱ単独、またはＲＳＱ＋ＨＱ共処理による処理後の死細胞に対する生細胞のパーセンテージを示し、ＲＳＧ共処理が、ＨＱ誘発の細胞生存率低減から細胞を有意に保護したことを示す、棒グラフ。
【図2A】対照、ＲＳＧ単独、ＨＱ単独、またはＲＳＱ＋ＨＱ共処理による処理後にＷＳＴ－１試薬を使用して測定したミトコンドリア脱水素酵素活性によって反映される細胞生存率を示す、棒グラフ。
【図2B】対照、ＲＳＧ単独、ＨＱ単独、またはＲＳＱ＋ＨＱ共処理による処理後のミトコンドリア呼吸パラメータ（すなわち、基礎呼吸、最大ＯＣＲ、ＡＴＰ産生、および予備呼吸能）を示す、棒グラフ。
【図2C】対照、ＲＳＧ単独、ＨＱ単独、またはＲＳＱ＋ＨＱ共処理による処理後の蛍光プレートリーダーを使用して、示した時点で相対蛍光単位（ＲＦＵ）によって測定した、活性酸素種を示す、棒グラフ。
【図2D】対照、ＲＳＧ単独、ＨＱ単独、またはＲＳＱ＋ＨＱ共処理による処理後のＲＰＥ細胞におけるＪＣ－１モノマーおよび凝集体の蛍光によって示した時点で測定されたΔΨｍを示し、ＲＳＧ共処理では、ＨＱ媒介性のΔΨｍの低減を有意に改善したことを示す、棒グラフ。
【図3】対照、ＲＳＧ単独、ＨＱ単独、またはＲＳＱ＋ＨＱ共処理による処理後のＦｉｊｉ Ｉｍａｇｅ－Ｊで定量化したＦ－アクチン凝集体を示し、ＨＱでは対照に対してＲＰＥ Ｆ－アクチン凝集体を有意に誘導したが、ＲＳＧ共処理ではＨＱ誘発の凝集体を有意に減少させたことを示す、棒グラフ。
【図4】対照、ＲＳＧ単独、ＨＱ単独またはＲＳＱ＋ＨＱ共処理による処理後のＲＰＥ細胞におけるＦＤＲおよびｌｏｇ２ＦＣ閾値を通過した発現遺伝子の数を示し、ＲＳＧ単独処理後にはほとんどＤＥ遺伝子が見出されなかったが、ＨＱ単独およびＨＱ＋ＲＳＧ共処理による処理では、大きなトランスクリプトーム変化を誘導したことを示す、棒グラフ。
【図5A】対照、ＲＳＧ単独、ＨＱ単独、またはＲＳＱ＋ＨＱ共処理による処理後のＲＰＥ細胞におけるＲＮＡ－ｓｅｑによって測定したＨＭＯＸ－１遺伝子発現を示す、棒グラフ。
【図5B】対照、ＲＳＧ単独、ＨＱ単独、またはＲＳＱ＋ＨＱ共処理による処理後のＲＰＥ細胞におけるｑＰＣＲによって測定したＨＭＯＸ－１遺伝子発現を示す、棒グラフ。
【図5C】ＲＳＧ単独、ＨＱ単独、またはＲＳＱ＋ＨＱ共処理による処理後のＲＰＥ細胞におけるＧＡＰＤＨに対するＨＯ－１の量を示す、ウェスタンブロット画像。
【図5D】対照、ＲＳＧ単独、ＨＱ単独、またはＲＳＱ＋ＨＱ共処理による処理後のＲＰＥ細胞におけるＧＡＰＤＨに対するＨＱ－１の比率を示し、ＨＱ誘発のＨＯ－１タンパク質レベルの上昇が、ＲＳＧ共処理によってさらに上方制御されたことを示す、棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下の図面は、本特許出願に含まれ、以下の詳細な説明で参照される。これらの図面は、本開示の特定の態様または実施形態を例示することのみを意図しており、本開示の範囲をいかなるようにも限定するものではない。
【0016】
以下の詳細な説明およびそれが参照する添付の図面は、必ずしも本発明のすべての実施例または実施形態を記載する必要はなく、いくつかの実施例または実施形態を記載することが意図される。記載される実施形態は、すべての観点において、単に例示的であり、限定的ではないことが考慮される。本発明の詳細な説明および添付の図面の内容は、本発明の範囲をいかなるようにも限定するものではない。
【0017】
本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、ヒトまたは、ヒト、霊長類、哺乳動物、および脊椎動物などの非ヒト動物を指す。
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療すること」という用語は、ある状態、疾患または障害を予防すること、除外すること、治癒すること、抑止すること、その重症度を低減すること、またはその少なくとも１つの症状を低減することを指す。
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療すること」という用語は、ある状態、疾患または障害を予防すること、除外すること、治癒すること、抑止すること、その重症度を低減すること、またはその少なくとも１つの症状を低減することを指す。
【0018】
本明細書で使用される場合、「有効量」または「に有効な量」という語句は、妥当な利益／リスク比でいくつかの所望の効果を生み出す薬剤の量を指す。特定の実施形態では、この用語は、特定の状態もしくは障害を治療するために必要であるか、または十分な量を指す。有効量は、治療される疾患もしくは状態、投与される特定の組成物、または疾患もしくは状態の重症度などの因子に応じて変化し得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、特定の薬剤の有効量を経験的に決定し得る。
【0019】
本特許出願に記載される治療は、任意の好適な投与経路（複数可）によって、かつ任意の好適な剤形で投与され得る。当該技術分野で既知の可能な投与経路としては、全身、局部、領域、非経口、腸管、吸入、局所、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、髄腔内、膀胱内、経口、内視鏡（例えば、内視鏡、気管支鏡、大腸鏡、Ｓ状結腸鏡、子宮鏡、腹腔鏡、関節鏡、胃鏡、膀胱鏡などを介して）、経尿道、直腸、鼻、経口、気管、気管支、食道、胃、腸管、腹腔、尿道、水疱、尿道、膣、子宮、卵管、頬、舌下、舌下、および粘膜が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。当該技術分野で既知の可能な剤形としては、液体、二相性液体、固体、半固体、蒸気、エアロゾル、溶液、懸濁液、混合物、シロップ、舐剤、ゲル、クリーム、ペースト、軟膏、ローション、塗布薬、コロジオン、エマルジョン、経皮送達パッチ、坐剤、カプセル、錠剤、粉末、顆粒、食用剤、咀嚼剤、滴、スプレー、浣腸、ドローチ、ロゼンジなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【0020】
実施例１
ヒト網膜色素上皮ＲＰＥ細胞におけるヒドロキノン誘発性損傷から保護するリステガニブ（ＲＳＧ）
タバコの喫煙は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の病因に関与している。インテグリンの機能不全は、ＡＭＤと関連している。出願人は、タバコの煙における重要な酸化剤であるヒドロキノン（ＨＱ）によって誘発されるＲＰＥ細胞損傷に対するリステガニブの効果を調査した。
ヒト網膜色素上皮ＲＰＥ細胞におけるヒドロキノン誘発性損傷から保護するリステガニブ（ＲＳＧ）
タバコの喫煙は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の病因に関与している。インテグリンの機能不全は、ＡＭＤと関連している。出願人は、タバコの煙における重要な酸化剤であるヒドロキノン（ＨＱ）によって誘発されるＲＰＥ細胞損傷に対するリステガニブの効果を調査した。
【0021】
培養したヒトＲＰＥ細胞を、ＲＳＧの存在下または不在下でＨＱにより処理した。細胞死は、フローサイトメトリーによって評価した。ミトコンドリア呼吸をＸＦｅ２４アナライザによって測定した。活性酸素種（ＲＯＳ）産生およびミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を、蛍光プレートリーダーによって定量化した。Ｆ－アクチン凝集をファロイジンで可視化した。全トランスクリプトーム解析および遺伝子発現を、それぞれＩｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ配列決定およびｑＰＣＲによって解析した。ヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）タンパク質のレベルを、ウェスタンブロットによって測定した。
【0022】
ＨＱでは、壊死およびアポトーシスを誘発し、ミトコンドリア生体エネルギーを減少させ、ＲＯＳレベルを増加させ、ΔΨｍを低下させ、Ｆ－アクチン凝集体を増加させた。ＲＳＧ共処理では、有意に、ＨＱ誘発の壊死およびアポトーシスから保護され、ＨＱによるミトコンドリア生体エネルギー低減を予防し、ＨＱ誘発のＲＯＳ産生を減少させ、ＨＱにより妨害されたΔΨｍを改善し、ＨＱ誘発のＦ－アクチン凝集体を減少させた。ＲＳＧ単独では、ＲＰＥ細胞トランスクリプトームに最小限の影響を及ぼした。ＨＱでは、実質的なトランスクリプトーム変化を誘導した。ＨＱによって誘導された様々な生物学的プロセスは、ＲＳＧ共処理によって調節された。ＨＯ－１タンパク質レベルは、ＨＱによって有意に上方制御され、ＲＳＧ共処理によってさらに上方制御された。
【0023】
この研究では、ＲＳＧでは、健常なＲＰＥ細胞に検出可能な有害作用を有さず、一方、ＲＳＧ共処理では、ＨＱ誘発の損傷およびミトコンドリア機能不全から保護された。ＲＳＧ共処理は、ＨＱによって誘発される様々な生物学的プロセスを修正し、ＡＭＤなどの網膜疾患を治療するＲＳＧ療法の潜在的な役割を示唆した。
【0024】
ＲＰＥ細胞は、脈絡毛細管と光受容体との間に介在する高度に特化した偏光上皮細胞の単層を形成する。ＲＰＥ細胞は、網膜の恒常性において重要な役割を果たし、光受容体細胞の健康および視覚機能にとって不可欠である。
【0025】
ＲＰＥ細胞の機能不全または死亡は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の重要な一因であると考えられる。ＲＰＥ細胞は、生涯を通じて絶えず酸化体に曝露され、酸化ストレスは、ＡＭＤの病因および進行に大きな役割を果たす。タバコの煙は、高濃度の遊離酸化剤を含有しており、ＡＭＤの主要な環境リスク要因として関与している。タバコの煙および大気汚染物質の両方の主要な酸化体であるヒドロキノン（ＨＱ）は、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を増加させ、酸化ストレスを促進する。５細胞内の他の分子と容易に反応することができる不安定な酸素含有分子のグループであるＲＯＳは、細胞の代謝中にかつ様々な刺激に応答して生成される。細胞では、ＲＯＳ産生の主要な部位は、ミトコンドリア電子輸送鎖であり、ここでは、いくつかの電子が輸送プロセスから漏出し、分子酸素と自然に反応し、スーパーオキシドアニオンを産生する。ＲＯＳは重要な生理機能を有するが、過剰なＲＯＳはＲＰＥ細胞の酸化損傷を引き起こす可能性がある。
【0026】
ミトコンドリアは、細胞内の主な呼吸機構を含む細胞内オルガネラであり、エネルギー産生および細胞の恒常性に不可欠である。光受容体による高いレベルの代謝需要により、ＲＰＥ細胞は、多数のミトコンドリア集団で豊富になり、高エネルギーニーズを満たす。結果として、ＲＰＥミトコンドリア機能不全は、組織損傷をもたらす可能性があり、ＡＭＤの発達に関与している。８ＡＭＤを有する眼のＲＰＥ細胞において、損傷、断片化、および破裂したミトコンドリアが観察されている。ｍｔＤＮＡ変異レベルは、ＡＭＤを有する眼のＲＰＥ細胞においても上昇する。
【0027】
インテグリンは、ヘテロ二量体、非共有結合細胞接着タンパク質のファミリーであり、より大きなαおよびより小さいβサブユニットからなる膜貫通受容体である。インテグリンは、細胞間の架橋として機能し、シグナル伝達経路を介して他の周囲の細胞および細胞外マトリックスとの細胞相互作用を調節する。生理学的に、インテグリンは、細胞接着、増殖、形状、および運動性において重要な役割を果たす。インテグリンαｖβ３、αｖβ５、およびα５β１は、滲出型ＡＭＤを有する眼における脈絡膜血管新生、ならびに糖尿病性網膜症および黄斑浮腫を有する眼における網膜前血管新生と密接に関連している。インテグリンは、様々な生物学的プロセスにおいて、接着分子、メカニズムセンサ、およびシグナル伝達プラットフォームとして機能し、また、多くの疾患状態の病因および病理にとって中心的である。したがって、インテグリンは、網膜疾患を治療するための誘引性標的である。
【0028】
リステガニブは、インテグリン受容体を調節する遺伝子操作されたアルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）クラスの合成ペプチドである。ＲＧＤペプチド処理では、網膜新生血管形成を抑制し、硝子体と網膜との間の細胞接着の放出を促進し、後硝子体脱離を誘導する。以前の研究では、ＲＳＧは、ＲＰＥ細胞で発現されるαｖβ３、αｖβ５、α２β１、およびα５β１を含む、いくつかの疾患関連インテグリンの発現を低減させる。以前の研究では、萎縮型ＡＭＤなどの網膜変性疾患に有益なＲＳＧの潜在的な細胞保護効果も示唆されている。本明細書で、我々は、インビトロ細胞培養システムにおいて、ＨＱ誘発のＲＰＥ細胞損傷に対するＲＳＧの効果を調査した。
【0029】
ＲＳＧは、Ａｌｌｅｇｒｏ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ，ＬＬＣ（Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。ＨＱ、テトラゾリウム塩ＷＳＴ－１（４－［３－（４－ロドフェニル）－２－（４－ニトロフェニル）－２Ｈ－５－テトラゾリオ（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｏ）］－１．３－ベンゼンジスルホネート）、ファロイジン－ＴＲＩＴＣ（カタログ番号Ｐ１９５１）、およびコラーゲンＩ型をＳｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。ＴｒｙｐＬＥ（カタログ番号１２６０４－０１３）、アネキシンＶ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）コンジュゲート（カタログ番号Ａ３５１２２）、アネキシンＶ結合緩衝液（カタログ番号Ｖ１３２４６）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）７－ＡＡＤ生存率染色溶液（カタログ番号００－６９９３－５０）、ＪＣ－１色素および５－（および－６）－クロロメチル－２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、アセチルエステル（ＣＭ－Ｈ２ＤＣＦＤＡ）、ＢＣＡタンパク質アッセイキット、放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）溶解および抽出緩衝液（カタログ番号８９９００）、ならびにＴＵＲＢＯ ＤＮＡ非含有キットをＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）から購入した。細胞ミトストレス試験キット（カタログ番号１０３０１５－１００）、ＸＦベース培地（カタログ番号１０３１９３－１００）、およびＸＦｅ２４ ＦｌｕｘＰａｋ（カタログ番号１０２３４２－１００）をＡｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉおよびＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ＭｉｎｉキットをＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ウサギ抗ヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１、カタログ番号ＡＤＩ－ＯＳＡ－１５０Ｄ）抗体をＥｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）から購入した。マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体をＣｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。
【0030】
ヒトＲＰＥ細胞培養および処理
６２歳の男性ドナーのヒトドナーの眼を、死亡後２４時間以内に、ヒト組織を含む研究のためのヘルシンキ宣言の規定に従って、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｏｒｇａｎ Ｄｏｎｏｒ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｂａｎｋ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｎｓｔｏｎ－Ｓａｌｅｍ，ＮＣ，ＵＳＡ）から得た。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有するＥａｇｌｅの最小必須培地（ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、５％ＣＯ２を含有する加湿環境下、３７℃で増殖させた。ＲＰＥ細胞の同一性を、サイトケラチン－１８およびＺＯ－１染色によって確認した（図示せず）。
６２歳の男性ドナーのヒトドナーの眼を、死亡後２４時間以内に、ヒト組織を含む研究のためのヘルシンキ宣言の規定に従って、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｏｒｇａｎ Ｄｏｎｏｒ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｂａｎｋ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｎｓｔｏｎ－Ｓａｌｅｍ，ＮＣ，ＵＳＡ）から得た。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有するＥａｇｌｅの最小必須培地（ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、５％ＣＯ２を含有する加湿環境下、３７℃で増殖させた。ＲＰＥ細胞の同一性を、サイトケラチン－１８およびＺＯ－１染色によって確認した（図示せず）。
【0031】
ヒトドナーＲＰＥ細胞を、コラーゲンコーティングされた９６ウェルプレート、カバースリップを有するかまたは有しない２４ウェルプレート、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｃｏｓｔａｒ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に播種した。Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイを除き、播種後６日目に、細胞を無血清および無フェノール赤色ＭＥＭ（ＳＦ－ＭＥＭ）で２回洗浄し、ＳＦ－ＭＥＭ中のＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または非存在下で、様々な濃度のＨＱで３７℃で様々な時間処理した。ＲＳＧ共処理は、ＨＱの存在下で細胞をＲＳＧにより処理した状態を指す。対照は、細胞が処理されていない状態を指す。
【0032】
フローサイトメトリー
６ウェルプレートの３反復のウェル中のＲＰＥ細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または不在下で、ＨＱ（１５０μＭ）で１２時間処理した。細胞形態を、光顕微鏡法によって記録し、次いで、細胞を、１倍のＴｒｙｐＬＥで脱離し、３００ｇで５分間遠心分離した。細胞を１００μＬの１倍のアネキシンＶ結合緩衝液で再懸濁し、５μＬのアネキシンＶで１０分間インキュベートし、次いで５μＬの７－ＡＡＤをアネキシンＶ混合物に添加し、さらに５分間インキュベートした。細胞死を、フローサイトメトリーで解析した。
６ウェルプレートの３反復のウェル中のＲＰＥ細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または不在下で、ＨＱ（１５０μＭ）で１２時間処理した。細胞形態を、光顕微鏡法によって記録し、次いで、細胞を、１倍のＴｒｙｐＬＥで脱離し、３００ｇで５分間遠心分離した。細胞を１００μＬの１倍のアネキシンＶ結合緩衝液で再懸濁し、５μＬのアネキシンＶで１０分間インキュベートし、次いで５μＬの７－ＡＡＤをアネキシンＶ混合物に添加し、さらに５分間インキュベートした。細胞死を、フローサイトメトリーで解析した。
【0033】
ＷＳＴアッセイ
９６ウェルプレートの３反復のウェル中のＲＰＥ細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または不在下で、ＨＱ（１５０μＭ）で２．５時間処理した。培地を除去し、細胞をＷＳＴ－１溶液で３０分間、３７℃でインキュベートした。生存細胞におけるミトコンドリア脱水素酵素によるテトラゾリウム塩ＷＳＴ－１の切断に基づいて、比色アッセイを実施した。プレートを、分光光度計で４４０ｎｍおよび参照波長６９０ｎｍで、読み取った。
９６ウェルプレートの３反復のウェル中のＲＰＥ細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または不在下で、ＨＱ（１５０μＭ）で２．５時間処理した。培地を除去し、細胞をＷＳＴ－１溶液で３０分間、３７℃でインキュベートした。生存細胞におけるミトコンドリア脱水素酵素によるテトラゾリウム塩ＷＳＴ－１の切断に基づいて、比色アッセイを実施した。プレートを、分光光度計で４４０ｎｍおよび参照波長６９０ｎｍで、読み取った。
【0034】
Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイ
ＲＰＥ細胞を、コラーゲンコーティングされたＸＦ ２４ウェルプレートの３反復のウェルに播種し、２４時間増殖させた。コンフルエントに達したばかりのＲＰＥ細胞を、ＳＦ－ＭＥＭで洗浄し、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の有無にかかわらず、ＨＱ（１７５μＭ）で１．５時間処理した。培地を除去し、細胞を、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのグルタミン、および８ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４を含有するＸＦベース培地で洗浄した。細胞を、ＣＯ２のないインキュベーター中、３７℃で１時間インキュベートした。酸素消費率（ＯＣＲ）を、基礎条件下でＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ２４フラックスアナライザによって測定し、続いて、１μＭのオリゴマイシン、１μＭのトリフルオロカルボニルシアニドフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、および１μＭのロテノンおよびアンチマイシンＡを順次添加した。最大ＯＣＲは、アンチマイシンＡの注射後のＦＣＣＰ誘導呼吸とＯＣＲとのＯＣＲの差であった。ミトコンドリア予備呼吸能は、最大呼吸と基礎ＯＣＲとの差であった。培地を除去し、総タンパク質を、ＯＣＲ測定後のＢＣＡタンパク質アッセイのために抽出した。ＯＣＲを、総タンパク質含有量に正規化した。
ＲＰＥ細胞を、コラーゲンコーティングされたＸＦ ２４ウェルプレートの３反復のウェルに播種し、２４時間増殖させた。コンフルエントに達したばかりのＲＰＥ細胞を、ＳＦ－ＭＥＭで洗浄し、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の有無にかかわらず、ＨＱ（１７５μＭ）で１．５時間処理した。培地を除去し、細胞を、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのグルタミン、および８ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４を含有するＸＦベース培地で洗浄した。細胞を、ＣＯ２のないインキュベーター中、３７℃で１時間インキュベートした。酸素消費率（ＯＣＲ）を、基礎条件下でＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ２４フラックスアナライザによって測定し、続いて、１μＭのオリゴマイシン、１μＭのトリフルオロカルボニルシアニドフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、および１μＭのロテノンおよびアンチマイシンＡを順次添加した。最大ＯＣＲは、アンチマイシンＡの注射後のＦＣＣＰ誘導呼吸とＯＣＲとのＯＣＲの差であった。ミトコンドリア予備呼吸能は、最大呼吸と基礎ＯＣＲとの差であった。培地を除去し、総タンパク質を、ＯＣＲ測定後のＢＣＡタンパク質アッセイのために抽出した。ＯＣＲを、総タンパク質含有量に正規化した。
【0035】
ＲＯＳの決定
透明な底部を有する９６ウェルプレートの黒色プレートの３反復のウェル中のＲＰＥ細胞をＳＦ－ＭＥＭで洗浄し、ＳＦ－ＭＥＭ中の２０μＭのＣＭ－Ｈ２ＤＣＦＤＡを３７℃で３０分間ロードし、次いで２回洗浄した。次いで、細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または不在下でＨＱ（１６０μＭ）で処理した。蛍光プレートリーダー（４９０ｎｍ励起、５２２ｎｍ発光）を用いて、様々な時間で蛍光を測定した。
透明な底部を有する９６ウェルプレートの黒色プレートの３反復のウェル中のＲＰＥ細胞をＳＦ－ＭＥＭで洗浄し、ＳＦ－ＭＥＭ中の２０μＭのＣＭ－Ｈ２ＤＣＦＤＡを３７℃で３０分間ロードし、次いで２回洗浄した。次いで、細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または不在下でＨＱ（１６０μＭ）で処理した。蛍光プレートリーダー（４９０ｎｍ励起、５２２ｎｍ発光）を用いて、様々な時間で蛍光を測定した。
【0036】
ΔΨｍの決定
透明な底部を有する９６ウェルプレートの黒色プレートの３反復のウェル中のＲＰＥ細胞をＳＦ－ＭＥＭで洗浄し、ＳＦ－ＭＥＭ中の１０μＭのＪＣ－１色素を３７℃で３０分間ロードし、次いで２回洗浄した。次いで、細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の有無にかかわらず、ＨＱ（１６０μＭ）で処理した。蛍光プレートリーダーを使用して、様々な時間で蛍光を測定し、緑色ＪＣ－１モノマー（４９０ｎｍ励起、５２２ｎｍ発光）および赤色ＪＣ－１凝集体（５３５ｎｍ励起、５９０ｎｍ発光）を定量化した。
透明な底部を有する９６ウェルプレートの黒色プレートの３反復のウェル中のＲＰＥ細胞をＳＦ－ＭＥＭで洗浄し、ＳＦ－ＭＥＭ中の１０μＭのＪＣ－１色素を３７℃で３０分間ロードし、次いで２回洗浄した。次いで、細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の有無にかかわらず、ＨＱ（１６０μＭ）で処理した。蛍光プレートリーダーを使用して、様々な時間で蛍光を測定し、緑色ＪＣ－１モノマー（４９０ｎｍ励起、５２２ｎｍ発光）および赤色ＪＣ－１凝集体（５３５ｎｍ励起、５９０ｎｍ発光）を定量化した。
【0037】
Ｆ－アクチン免疫蛍光染色
コラーゲンでコーティングされたカバースリップを含有する２４ウェルプレートの３反復のウェル内のＲＰＥ細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または非存在下で、ＨＱ（１４０μＭ）で６時間処理し、次いで４％パラホルムアルデヒド中で、室温（ＲＴ）で１２分間固定した。細胞を、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１２分間透過させ、０．５％のウシ血清アルブミン／０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ中のファロイジン－ＴＲＩＴＣで室温で１時間インキュベートした。Ｆ－アクチン凝集体のパーセンテージは、遮蔽された観察者によって決定された。簡単に述べると、各試料について、１０～１１枚のＺスタック画像（１μｍのｚステップで１２μｍをカバー、ｘ軸方向に６枚、ｙ軸方向に５枚の非重複フィールド）を、Ｎｉｋｏｎ Ａ１共焦点顕微鏡上の２０倍の対物レンズで、同一の条件下で取り込んだ。最大強度投影画像をＦｉｊｉソフトウェアに取り込み、Ｆｉｊｉのオンライン説明書に従ってＴｒａｉｎａｂｌｅ Ｗｅｋａセグメンテーションプラグインを使用してセグメンテーションした。簡単に述べると、「閾値」の生成のために、凝集体および非凝集体の両方を含有する画像を使用して、セグメンテーション分類子を作成した。凝集体および非凝集体を追跡し、それぞれ別々のグループに追加した。このプロセスは、満足のいく画像セグメンテーションが達成されるまで繰り返された。次いで、分類子は、正確なセグメンテーションを確実にするために、様々な程度の凝集密度を有する３つの画像で試験された。データ解析のため、セグメント化した画像を８ビットバイナリ画像に変換し、Ｆ－アクチン凝集体を粒子分析器関数（０－無限大サイズおよび０～１円状率）を用いてＦｉｊｉで定量化した。
コラーゲンでコーティングされたカバースリップを含有する２４ウェルプレートの３反復のウェル内のＲＰＥ細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または非存在下で、ＨＱ（１４０μＭ）で６時間処理し、次いで４％パラホルムアルデヒド中で、室温（ＲＴ）で１２分間固定した。細胞を、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１２分間透過させ、０．５％のウシ血清アルブミン／０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ中のファロイジン－ＴＲＩＴＣで室温で１時間インキュベートした。Ｆ－アクチン凝集体のパーセンテージは、遮蔽された観察者によって決定された。簡単に述べると、各試料について、１０～１１枚のＺスタック画像（１μｍのｚステップで１２μｍをカバー、ｘ軸方向に６枚、ｙ軸方向に５枚の非重複フィールド）を、Ｎｉｋｏｎ Ａ１共焦点顕微鏡上の２０倍の対物レンズで、同一の条件下で取り込んだ。最大強度投影画像をＦｉｊｉソフトウェアに取り込み、Ｆｉｊｉのオンライン説明書に従ってＴｒａｉｎａｂｌｅ Ｗｅｋａセグメンテーションプラグインを使用してセグメンテーションした。簡単に述べると、「閾値」の生成のために、凝集体および非凝集体の両方を含有する画像を使用して、セグメンテーション分類子を作成した。凝集体および非凝集体を追跡し、それぞれ別々のグループに追加した。このプロセスは、満足のいく画像セグメンテーションが達成されるまで繰り返された。次いで、分類子は、正確なセグメンテーションを確実にするために、様々な程度の凝集密度を有する３つの画像で試験された。データ解析のため、セグメント化した画像を８ビットバイナリ画像に変換し、Ｆ－アクチン凝集体を粒子分析器関数（０－無限大サイズおよび０～１円状率）を用いてＦｉｊｉで定量化した。
【0038】
ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）試料の調製および解析
６ウェルプレートの６重複ウェル中のＲＰＥ細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または不在下で、ＨＱ（２５０μＭまたは３００μＭ）で４時間処理した。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを使用して抽出し、ＤＮＡをＴＵＲＢＯ ＤＮＡ非含有キットで除去した。ＲＮＡ品質を、バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で測定した。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリを、ポリ－Ａ濃縮メッセンジャーＲＮＡから調製し、ＧＥＮＥＷＩＺ（Ｓｏｕｔｈ ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）によって配列決定して、試料あたり約２，０００万～３，０００万のペアエンド、１５０塩基対のリードを生成した。ＲＮＡ－ｓｅｑ ＦＡＳＴＱファイルをＦａｓｔＱＣで品質試験した。ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８．Ｐ１２）およびトランスクリプトーム（ＧＥＮＥＣＯＤＥ ｖ３０）の参照に対して、読み取り物をＳＴＡＲと整列させ、続いて、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓで読み取り定量化した。
６ウェルプレートの６重複ウェル中のＲＰＥ細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または不在下で、ＨＱ（２５０μＭまたは３００μＭ）で４時間処理した。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを使用して抽出し、ＤＮＡをＴＵＲＢＯ ＤＮＡ非含有キットで除去した。ＲＮＡ品質を、バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で測定した。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリを、ポリ－Ａ濃縮メッセンジャーＲＮＡから調製し、ＧＥＮＥＷＩＺ（Ｓｏｕｔｈ ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）によって配列決定して、試料あたり約２，０００万～３，０００万のペアエンド、１５０塩基対のリードを生成した。ＲＮＡ－ｓｅｑ ＦＡＳＴＱファイルをＦａｓｔＱＣで品質試験した。ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８．Ｐ１２）およびトランスクリプトーム（ＧＥＮＥＣＯＤＥ ｖ３０）の参照に対して、読み取り物をＳＴＡＲと整列させ、続いて、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓで読み取り定量化した。
【0039】
主成分分析（ＰＣＡ）を使用して、ＤＥＳｅｑ２のＶＳＴ法によって正規化された、最高の平均カウントを有する上位１５，０００個の遺伝子を使用して、高次元ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを視覚化した。ｅｄｇｅＲ正確性試験を使用して実施された差分発現解析は、データセット内の少なくとも６つの試料において、百万当たりのカウント（ＣＰＭ）が１以上の遺伝子に限定された。差異的に発現された（ＤＥ）遺伝子は、偽発見率（ＦＤＲ）＜０．０５およびｌｏｇ２－ｆｏｌｄ－ｃｈａｎｇｅ（ｌｏｇ２ＦＣ）＞０．２５の絶対値を有すると定義される。ｌｏｇ２ＦＣ＞０．５０の絶対値を有するものとして定義される強く調節されたＤＥ遺伝子を、遺伝子リストに過剰に存在する遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセスおよび京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）生物学的経路の濃縮のためにゴシーク（ｇｏｓｅｑ）に供した。生物学的プロセスおよび経路は、調整されたｐ値＜０．０５で統計的に有意であるとみなされた。濃縮された生物学的プロセスを、Ｕｎｉｐｏｒｔ Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓデータベースによって決定されたショートおよびＧＯタームサイズに設定された類似性メトリックを有するＲＥＶＩＧＯで凝縮および可視化し、生物学的に関連するプロセスを選択し、標識した。遺伝子発現変化の視覚化のために、それらの生物学的関連性およびＨＱとＲＳＧ共処理との間の負の相関関係の強度に基づいて、６つの濃縮ＫＥＧＧ経路を選択した。実証ＲＮＡ－ｓｅｑ試料サイズ分析（ＥＲＳＳＡ）を使用して、この研究で使用される６つの生物学的複製物が、差次的発現発見に十分であるかどうかを確認した。各複製物レベルで０．２５および５０サブサンプルのｌｏｇ２ＦＣカットオフで分析を実施した。
【0040】
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析
１２ウェルプレートの３反復のウェル中のＲＰＥ細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または不在下で、ＨＱ（２５０μＭ）で４時間処理した。前に説明したように、総ＲＮＡを、製造業者の仕様に従ってＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキットを使用して単離し、リアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を実施した。ＨＭＯＸ－１およびリボソームタンパク質、ｌａｒｇｅ、Ｐ０（ＲＰＬＰ０）のプライマー対は、以下の通りであった（５’～３’）：ＨＭＯＸ－１、フォワード：ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＣＡＴ ＧＡ、リバース：ＡＧＣ ＡＡＣ ＴＧＴ ＣＧＣ ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＡ、ＲＰＬＰ０、フォワード：ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＴＴ ＧＣＴ ＧＧＣ ＣＡＡ ＴＡＡ、リバース：ＧＧＧ ＣＣＣ ＧＡＧ ＡＣＣ ＡＧＴ ＧＴＴ。
１２ウェルプレートの３反復のウェル中のＲＰＥ細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または不在下で、ＨＱ（２５０μＭ）で４時間処理した。前に説明したように、総ＲＮＡを、製造業者の仕様に従ってＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキットを使用して単離し、リアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を実施した。ＨＭＯＸ－１およびリボソームタンパク質、ｌａｒｇｅ、Ｐ０（ＲＰＬＰ０）のプライマー対は、以下の通りであった（５’～３’）：ＨＭＯＸ－１、フォワード：ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＣＡＴ ＧＡ、リバース：ＡＧＣ ＡＡＣ ＴＧＴ ＣＧＣ ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＡ、ＲＰＬＰ０、フォワード：ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＴＴ ＧＣＴ ＧＧＣ ＣＡＡ ＴＡＡ、リバース：ＧＧＧ ＣＣＣ ＧＡＧ ＡＣＣ ＡＧＴ ＧＴＴ。
【0041】
ウェスタンブロット
６ウェルプレートの３反復のウェル中のＲＰＥ細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または不在下で、ＨＱ（１７０μＭ）で８時間処理した。前に説明したように、総タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を補充したＲＩＰＡ緩衝液で抽出し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイで定量化し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットに供した。２１
統計解析
データは平均±ＳＤとして表される。フローサイトメトリー、ＷＳＴアッセイ、ＸＦｅ２４フラックスアナライザ、ＲＯＳアッセイ、ＪＣ－１アッセイ、Ｆ－アクチン凝集体解析、ｑＰＣＲ、ウェスタンブロットで測定した処理群間に統計的に有意差があるかどうかをＴｕｋｅｙ多重比較補正付き二元配置分散分析を使用して決定した。Ｐ値の大きさを示すアスタリスク（Ｎ．Ｓ．＝有意ではない、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．０を使用して結果をプロットした。
６ウェルプレートの３反復のウェル中のＲＰＥ細胞を、ＲＳＧ（０．４ｍＭ）の存在下または不在下で、ＨＱ（１７０μＭ）で８時間処理した。前に説明したように、総タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を補充したＲＩＰＡ緩衝液で抽出し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイで定量化し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットに供した。２１
統計解析
データは平均±ＳＤとして表される。フローサイトメトリー、ＷＳＴアッセイ、ＸＦｅ２４フラックスアナライザ、ＲＯＳアッセイ、ＪＣ－１アッセイ、Ｆ－アクチン凝集体解析、ｑＰＣＲ、ウェスタンブロットで測定した処理群間に統計的に有意差があるかどうかをＴｕｋｅｙ多重比較補正付き二元配置分散分析を使用して決定した。Ｐ値の大きさを示すアスタリスク（Ｎ．Ｓ．＝有意ではない、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．０を使用して結果をプロットした。
【0042】
結果
この研究では、ＲＳＧは、ＨＱ媒介性ＲＰＥ細胞死から保護された。ＲＳＧがＨＱ誘発のＲＰＥ細胞死に対して保護されているかどうかを調査するために、フローサイトメトリー解析を、アネキシンＶおよび７－ＡＡＤ染色を用いて実施して、それぞれ、アポトーシスおよび壊死を同定した。初期のアポトーシス細胞は、アネキシンＶ陽性および７－ＡＡＤ陰性である。後期のアポトーシス細胞は、アネキシンＶおよび７－ＡＡＤ二重陽性である。壊死細胞は、７－ＡＡＤ陽性およびアネキシンＶ陰性である。図１Ａに示されるように、ＨＱ（１５０μＭ）では、細胞をシュリベル／脱離させ、一方、ＲＳＧ共処理では、ＨＱ誘発の形態変化を改善した。同様の形態は、処理なしの細胞（対照）と比較した場合、ＲＳＧ単独で処理された細胞においても観察された。図１は、各実験的処理（すなわち、対照、ＲＳＧ単独、ＨＱ単独、ＲＳＱ＋ＨＱ共処理）後の死細胞に対する生細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。ＨＱ単独では、主に壊死性細胞死を誘導し、アポトーシス細胞死ははるかに少なかった。ＲＳＧ共処理では、ＨＱ誘発の壊死およびアポトーシスから細胞を有意に保護した。ＲＳＧ単独は、対照と比較した場合、生細胞および死細胞の数にほとんど影響を及ぼさなかった。
この研究では、ＲＳＧは、ＨＱ媒介性ＲＰＥ細胞死から保護された。ＲＳＧがＨＱ誘発のＲＰＥ細胞死に対して保護されているかどうかを調査するために、フローサイトメトリー解析を、アネキシンＶおよび７－ＡＡＤ染色を用いて実施して、それぞれ、アポトーシスおよび壊死を同定した。初期のアポトーシス細胞は、アネキシンＶ陽性および７－ＡＡＤ陰性である。後期のアポトーシス細胞は、アネキシンＶおよび７－ＡＡＤ二重陽性である。壊死細胞は、７－ＡＡＤ陽性およびアネキシンＶ陰性である。図１Ａに示されるように、ＨＱ（１５０μＭ）では、細胞をシュリベル／脱離させ、一方、ＲＳＧ共処理では、ＨＱ誘発の形態変化を改善した。同様の形態は、処理なしの細胞（対照）と比較した場合、ＲＳＧ単独で処理された細胞においても観察された。図１は、各実験的処理（すなわち、対照、ＲＳＧ単独、ＨＱ単独、ＲＳＱ＋ＨＱ共処理）後の死細胞に対する生細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。ＨＱ単独では、主に壊死性細胞死を誘導し、アポトーシス細胞死ははるかに少なかった。ＲＳＧ共処理では、ＨＱ誘発の壊死およびアポトーシスから細胞を有意に保護した。ＲＳＧ単独は、対照と比較した場合、生細胞および死細胞の数にほとんど影響を及ぼさなかった。
【0043】
ＲＳＧ共処理はまた、ミトコンドリアに対するＨＱの有害な影響から細胞を保護した。ＷＳＴ－１は、細胞性ミトコンドリア脱水素酵素によって切断され、可溶性ホルマザンを形成することができる安定したテトラゾリウム塩である。ミトコンドリア脱水素酵素活性によって生成されるホルマザンの量は、生細胞の数に正比例し、細胞生存率アッセイとして有用である。したがって、ＲＳＧの細胞保護効果をさらに評価するために、ＷＳＴアッセイを実施した。図２Ａは、各実験的処理（すなわち、対照、ＲＳＧ単独、ＨＱ単独、ＲＳＱ＋ＨＱ共処理）後の細胞のＷＳＴ含有量を示す棒グラフである。図２Ａに示されるように、ＨＱは、ミトコンドリア脱水素酵素活性の低下によって反映されるように、細胞生存率を有意に減少させ、一方、ＲＳＧ共処理では、ＨＱ単独と比較した場合、細胞生存率を有意に増加させた。ＲＳＧ単独では、対照と比較した場合、細胞生存率にほとんど影響を及ぼさなかった。
【0044】
ミトコンドリア呼吸は、細胞の生存において重要な役割を果たす。ミトコンドリア機能の調節におけるＲＳＧの役割を評価した。図２Ｂに示されるように、対照と比較した場合、ＨＱは、ミトコンドリア生体エネルギー学的特性を有意に減少させた。対照と比較した場合、ＲＳＧ単独で処理された細胞において、ミトコンドリア生体エネルギーの有意な変化は検出されなかった。ＲＳＧ共処理は、ＨＱで処理した細胞と比較した場合、基礎呼吸、最大呼吸、ＡＴＰ産生、および予備呼吸能を有意に増加させた。
【0045】
ミトコンドリアは、酸化ストレス媒介性細胞死に寄与するＲＯＳ産生の主要な供給源である。ＲＳＧが酸化ストレス媒介性ＲＯＳ産生を低減するかどうかを調べるために、ＲＯＳレベルを測定した。図２Ｃに示されるように、ＲＯＳ産生は、対照と比較した場合、ＨＱ処理細胞において有意に増加したが、ＲＳＧ共処理では、ＨＱ誘発のＲＯＳ産生を有意に減少させた。ＲＳＧ単独では、対照と比較した場合、ＲＯＳレベルは有意に変化しなかった。
【0046】
ΔΨｍは、ＡＴＰを生成する呼吸鎖の生理機能を維持するために重要である。膜透過性ＪＣ－１色素は、ΔΨｍを試験するために広く使用されている。ＨＱ媒介性のΔΨｍの変化に対するＲＳＧの影響を評価するために、凝集体に対するＪＣ－１モノマーの比率を決定した。図２Ｄに示されるように、対照と比較した場合、ΔΨｍは、ＨＱ処理細胞において有意に減少し、一方、ＲＳＧ共処理では、ΔΨｍにおけるＨＱ媒介性の低減を有意に改善した。対照と比較した場合、ＲＳＧ単独では、ΔΨｍにおいて有意な変化を誘導しなかった。
【0047】
本試験では、ＲＳＧ共処理では、ＨＱ誘発のＦ－アクチン凝集体も減少した。Ｆ－アクチンの調節は、細胞死において重要な役割を果たす。ＲＳＧがＦ－アクチン細胞骨格の組織に影響を及ぼすかどうかを決定するために、細胞を、ＲＳＧの有無にかかわらずＨＱで処理し、続いてＦ－アクチン凝集体の定量化を行った。図３のグラフに見られるように、対照と比較した場合、ＨＱはＦ－アクチン凝集体の数を有意に増加させ、一方、ＲＳＧ共処理では、ＨＱ誘発の凝集体の産生を有意に阻害した。ＲＳＧ単独では、Ｆ－アクチン細胞骨格の形態に観察可能な効果はなく、対照と比較した場合、Ｆ－アクチン凝集体の数に有意な変化はなかった。
【0048】
ＲＳＧ共処理はまた、ＨＱ調節トランスクリプトームを調節した。ＨＱおよびＲＳＧに応答する遺伝子発現変化を調べるために、ＲＰＥ細胞を、ＲＳＧの有無にかかわらず２回の投薬（２５０μＭまたは３００μＭ）でＨＱに４時間曝露し、続いてＲＮＡ－ｓｅｑを使用してトランスクリプトーム全体を測定した。すべてのＲＮＡ－ｓｅｑ試料は、優れたＲＮＡ品質（バイオアナライザＲＮＡ完全性数＞９．７０）および配列決定品質を有した。試料のＰＣＡ可視化により、上位二次元がデータセットの合計８１％の分散を取り込み、一次元ではＨＱ処理細胞および非処理細胞、二次元ではＨＱ処理細胞およびＲＳＧ共処理細胞が明確に分離したことを示した。ＲＳＧ単独で処理した細胞と対照との間に観察可能な分離は発見されなかった。
【0049】
図４にグラフによって示されるように、示差発現分析において、約７，０００個の遺伝子が、対照と比較した場合、試験した２つの用量で、ＨＱ処理細胞において変化したが、ＲＳＧ処理単独では、１５個のＤＥ遺伝子のみが変化した。しかしながら、ＨＱ単独で処理された細胞と比較して、ＲＳＧ共処理はまた、数千の遺伝子を調節した。さらなる解析により、ＲＳＧ共処理によって影響を受ける遺伝子の多くが、ＨＱによっても調節され、発現が、ＨＱによって誘導されるものと反対方向に頻繁に変化したことが示された。加えて、すべてのＨＱ調節遺伝子を評価したところ、ＨＱによって調節された発現変化とＲＳＧの共処理によって調節された発現変化との間に負の相関が観察され、ＲＳＧがＨＱ誘発の発現変化を調節することが示された。
【0050】
ＤＥ遺伝子リストの機能分析を実施し、ＨＱ、ＲＳＧ処理単独、またはＲＳＧ共処理によって調節される遺伝子において有意に濃縮される生物学的プロセスおよび経路を同定した。ＲＳＧ処理単独によって調節される１５個のＤＥ遺伝子のうち、プロセスまたは経路は濃縮されなかった。ＨＱまたはＲＳＧ共処理のいずれかによって調節される遺伝子を用いて実施した場合、細胞増殖、細胞死、細胞接着の調節、代謝の調節、炎症反応、および刺激への反応を含む多数のプロセスが濃縮された。特に、多数のプロセスが２つの分析の間で重複し、同じ生物学的プロセスの多くがＨＱおよびＲＳＧ共処理によって調節されることを示した。同様に、濃縮された生物学的経路は、ＨＱとＲＳＧ共処理との間に大きな重複を示した。同じ生物学的に関連する経路の多くは、ＨＱおよびＲＳＧ共処理によって調節されたが、それらの誘導される変化は、負の相関によって示されるように、一般に反対方向であった。全体として、ＲＮＡ－ｓｅｑによって試験したＨＱの２つの用量にわたる遺伝子発現変化は、大きな正の相関によって示されるように、非常に一貫していた。
【0051】
試験した５つの示差発現比較について、ＥＲＳＳＡを使用してＲＮＡ－ｓｅｑ試料サイズ解析を実施した。簡単に述べると、ＥＲＳＳＡは、任意の特定の比較において、ＤＥ遺伝子の大部分を発見するのに十分な生物学的複製が用いられているかどうかを決定する。ＥＲＳＳＡは、試料サイズがｎ＝６に近づくと平均発見傾向が先細りするため、この実験では条件ごとの生物学的複製の数が減少するため、有意な数のＤＥ遺伝子を産生するために、十分な試料が４つの比較で使用されたことを示した。対照に対するＲＳＧの比較において、ＥＲＳＳＡは、追加の複製物が、低い二桁のＤＥ遺伝子数を超えて、発見をさらに改善する可能性が低いことを示した。
【0052】
図５Ａ～５Ｄに示されるように、ＲＳＧ共処理はまた、上方制御ＨＱ誘発のＨＱ－１発現も上方制御する。ＲＮＡ－ｓｅｑデータから、ＨＱ曝露後にＨＯ－１タンパク質をコードする細胞保護ＨＭＯＸ－１遺伝子の有意な上方制御（それぞれ６１８％および４２０％増加、２５０μＭおよび３００μＭのＨＱ）があり、これは、２５０μＭおよび３００μＭ ＨＱ単独で誘導される発現レベルと比較した場合、ＲＳＧ共処理によってさらに増強された（２４１％および３９１％増加）。
【0053】
ＲＮＡ－ｓｅｑ結果を確認するために、ＨＭＯＸ－１遺伝子およびＨＯ－１タンパク質発現を、それぞれｑＰＣＲおよびウェスタンブロットによって調べた。ＨＭＯＸ－１遺伝子およびＨＯ－１タンパク質レベルは、ＨＱによって有意に上方制御され、ＲＳＧ共処理によってさらに上方制御された。
【0054】
上記の要約された結果に基づくと、この研究では、ＲＳＧ処理単独では、健康な細胞に対する検出可能な有害作用はなかったが、ＲＳＧ共処理では、有意に１）ＨＱ誘発のＲＰＥ細胞壊死およびアポトーシスから保護し、２）ＨＱ誘発の細胞生存率低減を改善し、３）ＨＱによるミトコンドリア生体エネルギー低減を予防し、４）ＨＱ誘発のＲＯＳ産生を抑制し、５）ＨＱでは妨害されたΔΨｍを改善し、６）ＨＱ誘発のＦ－アクチン凝集体を緩和した。さらに、ＲＳＧ単独では、ＲＰＥ細胞トランスクリプトームに最小限の影響を及ぼし、一方、ＨＱでは、実質的なトランスクリプトームの変化を誘導した。ＲＳＧ共処理は、カルシウムシグナル伝達、ＴＧＦ－βシグナル伝達、Ｒａｓシグナル伝達、サイトカインおよび受容体相互作用、局所接着、ならびにアクチン細胞骨格を含む、ＨＱ調節生物学的プロセスおよび経路を修正した。ＨＭＯＸ－１ ｍＲＮＡおよびＨＯ－１タンパク質レベルは、ＨＱによって有意に上方制御され、ＲＳＧ共処理によってさらに上方制御された。
【0055】
加齢黄斑変性において、酸化ストレスは、ＲＰＥ細胞の機能不全および死亡を引き起こす重要な役割を果たしていると考えられている。この疾患においてＲＰＥの酸化ストレスがどの機構で死を誘発するかは、依然として議論の的である。ほとんどのインビトロ研究は、酸化ストレスが主にアポトーシス細胞死を誘導することを示すが、いくつかは、壊死がＲＰＥ死の原因であることを示唆する。アポトーシスマーカーとして測定されるカスパーゼ３／７活性は、様々なＨＱ濃度（５０～５００μＭ）での処理後、ＡＲＰＥ－１９細胞において変化しない（Ｗｏｏ ＧＢ，ｅｔ ａｌ．ＩＯＶＳ ２０１２；５３：ＡＲＶＯ Ｅ－ａｂｓｔｒａｃｔ ４２７６）。対照的に、ＨＱは、分化したＡＲＰＥ－１９細胞におけるＨＱ損傷後のアポトーシス関連遺伝子を下方制御する。今回の研究では、ＨＱが主に壊死を誘導し、アポトーシスをはるかに低い程度に誘導したと決定した。ＲＳＧ共処理は、ＨＱによって誘導される壊死およびアポトーシスの両方から有意に保護された。インテグリンは、細胞生存率に深刻な影響を及ぼす様々な細胞シグナル伝達カスケードを引き起こす。インテグリンはまた、細胞の生存を調節するために複雑な役割を果たし、それらの機能不全はアポトーシスを引き起こす可能性がある。これらの結果は、ＲＳＧが、酸化ストレス誘発性インテグリン媒介性ＲＰＥ壊死およびアポトーシスから保護する役割を果たすことを示唆する。
【0056】
アポトーシスは、高度に調節されたプロセスである。しかしながら、壊死性死亡のかなりの部分は、高度に調節された機構を通じても生じる。壊死としては、ミトコンドリア機能不全、ＲＯＳの生成の増強、ＡＴＰ枯渇、および形質膜破壊などの制御されたプロセスの兆候が挙げられ得る。したがって、ミトコンドリア機能不全は、アポトーシスおよび壊死の両方において重要な役割を果たす。ＨＱは、ＡＲＰＥ－１９細胞内のＲＯＳレベルを増加させ、ΔΨｍを減少させる。今回の研究におけるドナーＲＰＥから得られた結果は、ＡＲＰＥ－１９細胞からのデータと一致した。Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイでは、ＨＱがミトコンドリア基礎呼吸、最大呼吸、ＡＴＰ産生、および予備呼吸能を有意に減少させたことが見出された。ＲＳＧ共処理は、ミトコンドリア生体エネルギーに対するＨＱの有害な影響から細胞を有意に保護した。ミトコンドリア保護のこれらの観察は、ヒトミュラー細胞およびＡＲＰＥ－１９細胞におけるＲＳＧの研究と一致する。（Ｋｅｎｎｅｙ ＣＭ，ｅｔ ａｌ．ＩＯＶＳ ２０１８；５９：ＡＲＶＯ Ｅ－Ａｂｓｔｒａｃｔ ７７１）（Ｂｅｌｔｒａｎ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．ＩＯＶＳ ２０１８；５９：ＡＲＶＯ Ｅ－Ａｂｓｔｒａｃｔ １４６５）ミトコンドリアが細胞機能において果たす重要な役割により、インテグリンシグナル伝達は、ミトコンドリアに深刻な影響を及ぼすことができ、その逆もまた同様である。インテグリンは、小さなＧタンパク質と相互作用することによってミトコンドリア機能およびＲＯＳ産生を制御し、インテグリンライゲーションは、ミトコンドリアの代謝／酸化還元機能の変化と異なるオキシダーゼの活性化を促進することによって、ＲＯＳ産生をトリガーする。逆に、阻害剤によるミトコンドリア機能の破壊は、ヒト胃がんＳＣ－Ｍ１細胞におけるＲＯＳ産生を増加させ、インテグリンβ５の発現を上方制御する。我々の結果は、ＲＳＧは、インテグリン調節因子として、ミトコンドリア機能に正の影響を与えることができることを示唆しているが、インテグリン非依存性の効果は排除できない。
【0057】
アクチン細胞骨格は、細胞機能に寄与する機械的、組織的、およびシグナル伝達の役割を果たす。Ｆ－アクチン細胞骨格の調節は、様々な分子機構に依存する。酸化ストレスは、神経変性疾患に関与する多数のタンパク質の凝集を引き起こす主要な機構である。ＨＱは、ＡＲＰＥ－１９細胞におけるｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）／熱ショックタンパク質２７（Ｈｓｐ２７）カスケードのリン酸化を通じてＦ－アクチン凝集を誘導する。今回の研究では、ドナーＲＰＥ細胞においてもＨＱがＦ－アクチン凝集を誘導し、ＲＳＧ共処理ではＨＱ誘発の凝集が減少したことが分かった。アクチン細胞骨格シグナル伝達ネットワークは、インテグリン、キナーゼ、および低分子ＧＴＰａｓｅなどの大きなタンパク質群から構成される。インテグリンは、多数の分子結合を介してアクチン細胞骨格に影響を及ぼすことができ、インテグリンは、アクチンベースの構造を刺激または抑制することができ、インテグリンから細胞骨格につながる様々な経路を示す。我々は、少なくとも部分的に、インテグリン調節Ｆ－アクチンアセンブリに対するＨＱの有害作用を逆転させることによって、ＲＳＧが正常なアクチン細胞骨格に対するＨＱ誘発の損傷を予防すると仮定する。この論文の範囲を超えているが、この仮説を検証するための実験が現在、私たちの研究室で進行中である。
【0058】
ＲＮＡ－ｓｅｑは、ゲノム全体の発現を探索するための強力な定量的ツールである。ＲＳＧの治療作用機序をさらに調べるために、ＲＮＡ－ｓｅｑを不偏な方法として使用して、ＨＱおよびＲＳＧ共処理によって誘発されるトランスクリプトームの変化を評価した。我々は、ＲＳＧ単独が、健常なＲＰＥ細胞に対するその限定された効果と一致して、トランスクリプトームへの影響を最小限に抑えたことを見出した。ＨＱ処理後に、検出可能な発現遺伝子の約半分を伴う大きなトランスクリプトーム変化が見られた。これらの観察は、以下の遺伝子の調節を示した我々の経路分析によって裏付けられている：１）サイトカイン－サイトカイン受容体相互作用、ＪＡＫ－ＳＴＡＴおよびＴＮＦシグナル伝達経路を含む炎症経路、２）アポトーシス、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ、ＭＡＰＫ、ＴＧＦ－βおよびＲａｓシグナル伝達経路などの細胞増殖および死亡経路、３）局所接着およびアクチン細胞骨格調節などの細胞接着および遊走経路、４）カルシウムシグナル伝達経路などの多様なシグナル伝達系において機能する経路。これらの所見は、ＨＱ曝露後の細胞成長、細胞死、細胞外マトリックスおよびストレス応答遺伝子の調節を示す様々な細胞モデルにおける研究と一致している。
【0059】
ＲＳＧ単独では、最小限のトランスクリプトーム変化を誘発したが、ＲＳＧ共処理では、ＨＱストレスに対する細胞遺伝子発現応答を有意に修正した。ＨＱストレス下のＲＳＧ調節遺伝子のかなりの部分は、発現変化が反対方向であることを除いて、ＨＱ処理単独でも調節された。同様に、ＲＳＧ共処理調節遺伝子の機能分析は、それらがＨＱによって調節される生物学的プロセスおよび経路に関与していることを示した。まとめると、これらの観察は、試験した２つのＨＱ用量にわたって一貫していたが、ＲＳＧ共処理では、ＨＱによって誘発された細胞トランスクリプトーム変化を緩和したことを示唆している。
【0060】
ＨＯ－１タンパク質の発現は、酸化ストレス、基質ヘム、紫外線、温熱、重金属、過酸化物、エンドトキシン、およびサイトカインを含む様々なストレス源によって高度に上方制御される。ＨＯ－１誘導は、酸化ストレス毒性に対する枢要な細胞適応および保護応答として認識される。ＨＭＯＸ－１ ｍＲＮＡレベルは、ｔ－ブチルヒドロペルオキシド（ｔＢＨ）および過酸化水素で処理された未分化および分化ＡＲＰＥ－１９細胞において有意に増加し、一方、ＨＯ－１タンパク質発現は、タバコ煙抽出物で処理されたＡＲＰＥ－１９細胞において上方制御される。ＨＯ－１を過剰発現するＡＲＰＥ－１９細胞は、ｔＢＨ誘発の細胞死により耐性があり、ＨＯ－１活性化は、網膜損傷から保護するために重要な役割を果たすことが示されている。本研究では、ＨＭＯＸ－１遺伝子およびＨＯ－１タンパク質発現は、ＨＱによって有意に上方制御され、ＲＳＧ共処理によってさらに増加することが見出された。ＲＳＧ共処理によるＨＯ－１のさらなる上方制御は、ＲＳＧが酸化ストレスに応答して抗酸化酵素の活性化を引き起こすことを示唆する。しかしながら、ＲＳＧ単独では観察可能な細胞ストレスおよびＨＯ－１活性化を誘導しなかったため、ＨＯ－１の活性化は、細胞がＨＱストレス下にある場合にのみ観察された。ＨＱおよびＲＳＧ共処理によって誘導されるＨＯ－１活性化の正確な上流分子調節因子を調査するために、さらなる研究が必要である。
【0061】
結論として、ＲＳＧ共処理は、ＨＱ誘発の損傷からＲＰＥ細胞を保護し、ミトコンドリア機能を回復し、ＨＱによって誘発される様々な生物学的プロセスを修正する。これらの観察のいくつかは、ＲＳＧによるインテグリンの調節によって説明することができるが、ＲＳＧによる細胞生存の促進を支配する正確な分子機構は、完全には解明されていない。私たちは、ＲＳＧ変調生物学的経路を調査し続けており、この情報は、萎縮型ＡＭＤなどの変性網膜疾患を治療するＲＳＧ療法の潜在的な役割の理解を高めると信じられている。
【0062】
実施例２
心筋機能の改善／心不全の治療
正常な心機能は、心筋細胞がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態で十分なエネルギー供給を受けることを必要とする。しかしながら、心筋細胞は、比較的少量のＡＴＰを貯蔵する。したがって、心筋細胞のミトコンドリアは、正常な心機能を維持するためにＡＴＰを継続的に合成しなければならない。少なくともいくつかのタイプの心不全では、心筋細胞のミトコンドリアは、心筋のエネルギー需要を満たすのに十分なＡＴＰを産生することができない。これにより、ミトコンドリア活性酸素種の蓄積および酸化ストレス、続いて心筋細胞の壊死、病理組織の再構築、および左室機能不全をもたらす。したがって、本明細書に開示される有効量のペプチド（複数可）の投与は、心不全によるミトコンドリアＡＴＰ欠損および酸化ストレスを軽減し、それによって心機能の心筋収縮性回復を改善する。
心筋機能の改善／心不全の治療
正常な心機能は、心筋細胞がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態で十分なエネルギー供給を受けることを必要とする。しかしながら、心筋細胞は、比較的少量のＡＴＰを貯蔵する。したがって、心筋細胞のミトコンドリアは、正常な心機能を維持するためにＡＴＰを継続的に合成しなければならない。少なくともいくつかのタイプの心不全では、心筋細胞のミトコンドリアは、心筋のエネルギー需要を満たすのに十分なＡＴＰを産生することができない。これにより、ミトコンドリア活性酸素種の蓄積および酸化ストレス、続いて心筋細胞の壊死、病理組織の再構築、および左室機能不全をもたらす。したがって、本明細書に開示される有効量のペプチド（複数可）の投与は、心不全によるミトコンドリアＡＴＰ欠損および酸化ストレスを軽減し、それによって心機能の心筋収縮性回復を改善する。
【0063】
イヌ心不全モデルにおける１．０ｍｇ／ｋｇおよび５．０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与されたリステガニブの効果を評価するために、初期研究を実施した。対象動物は、Ｓａｂｂａｈ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．；Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ Ｅｌａｍｉｐｒｅｔｉｄｅ（ＭＴＰ－１３１），ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｌｅｆｔ Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｏｇｓ ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ；Ｃｉｒｃ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ．２０１６ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；９（２）：ｅ００２２０６．ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＨＥＡＲＴＦＡＩＬＵＲＥ．１１５．００２２０６に記載したように、冠状の微小塞栓を経験し、心不全を誘導する。
【0064】
３匹のイヌに、２週間ごとに１．０ｍｇ／ｋｇのリステガニブを６週間投与した。約１週間の期間の後、次いで同じ３匹のイヌに、２週間ごとに５．０ｍｇ／ｋｇのリステガニブを６週間追加で投与した。リステガニブの最初の静脈内投与の前に、リステガニブの３回目の隔週静脈内投与１．０ｍｇ・ｋｇの後に、かつ再びリステガニブの３回目の隔週静脈内投与５．０ｍｇ／ｋｇの後に、心室造影および血行動態測定を行った。以下の表１は、本試験で生成された心室造影および血行動態データを示したものである。
【0065】
【表1】
【0066】
これらの予備データは、１．０ｍｇ／ｋｇおよび５．０ｍｇ／ｋｇのリステガニブを静脈内投与した心不全イヌにおいて、心機能が改善したことを確認する。
本特許出願に要約されるデータに基づいて、ＲＳＧを含む本明細書に開示されるペプチド治療は、ミトコンドリア生体エネルギーの障害を改善または予防するために、ヒトまたは非ヒト動物に投与され得る。これは、ミトコンドリア機能の低下もしくはミトコンドリア機能障害に関連するか、またはそれらを特徴とする多数の障害の治療において有益であり得る。ＲＳＧなどの本明細書に開示されるペプチドを使用して治療され得る障害は、上記のように加齢黄斑変性、網膜障害および心不全を含むだけでなく、多種多様な他の障害を含み、それらのいくつかの非限定的な例は以下に記載される。
本特許出願に要約されるデータに基づいて、ＲＳＧを含む本明細書に開示されるペプチド治療は、ミトコンドリア生体エネルギーの障害を改善または予防するために、ヒトまたは非ヒト動物に投与され得る。これは、ミトコンドリア機能の低下もしくはミトコンドリア機能障害に関連するか、またはそれらを特徴とする多数の障害の治療において有益であり得る。ＲＳＧなどの本明細書に開示されるペプチドを使用して治療され得る障害は、上記のように加齢黄斑変性、網膜障害および心不全を含むだけでなく、多種多様な他の障害を含み、それらのいくつかの非限定的な例は以下に記載される。
【0067】
化学的、低酸素性または虚血性損傷によって引き起こされる障害の治療
本明細書に開示されるペプチド治療は、化学的、低酸素または虚血性事象の前、間、または後に投与され得、それによって、結果として生じる細胞損傷、細胞死、アポトーシス、再灌流損傷、二次損傷、またはそのような事象から生じる他の損傷を軽減する。かかる事象は、かかる事象の後の中枢神経系または末梢神経系の神経細胞の保存を含み得る。例えば、出生時またはその前後の乳児の脳に対する低酸素または虚血性の損傷は、脳性麻痺、学習障害、および行動障害などの長期的な神経障害および障害の発現に関与している。ミトコンドリア機能不全は、周産期低酸素性または虚血性損傷後の脳炎症およびアポトーシスの発症に寄与すると考えられている。Ｌｅａｗ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．；Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：Ｎｅｗ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｐｅｒｉｎａｔａｌ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｊｕｒｙ；Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：１９９ ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｎｃｅｌ．２０１７．００１９９。したがって、本明細書に開示されるペプチド処理は、化学毒性、低酸素または虚血性事象に続くミトコンドリア機能不全を軽減する役割を果たし得、それによって、かかる事象に続く神経細胞の生存および機能を改善する。
本明細書に開示されるペプチド治療は、化学的、低酸素または虚血性事象の前、間、または後に投与され得、それによって、結果として生じる細胞損傷、細胞死、アポトーシス、再灌流損傷、二次損傷、またはそのような事象から生じる他の損傷を軽減する。かかる事象は、かかる事象の後の中枢神経系または末梢神経系の神経細胞の保存を含み得る。例えば、出生時またはその前後の乳児の脳に対する低酸素または虚血性の損傷は、脳性麻痺、学習障害、および行動障害などの長期的な神経障害および障害の発現に関与している。ミトコンドリア機能不全は、周産期低酸素性または虚血性損傷後の脳炎症およびアポトーシスの発症に寄与すると考えられている。Ｌｅａｗ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．；Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：Ｎｅｗ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｐｅｒｉｎａｔａｌ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｊｕｒｙ；Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：１９９ ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｎｃｅｌ．２０１７．００１９９。したがって、本明細書に開示されるペプチド処理は、化学毒性、低酸素または虚血性事象に続くミトコンドリア機能不全を軽減する役割を果たし得、それによって、かかる事象に続く神経細胞の生存および機能を改善する。
【0068】
神経変性疾患の治療
アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含むがこれらに限定されない神経変性疾患は、中枢神経系（ＣＮＳ）の機能および構造の進行性変性を特徴とする。ミトコンドリア機能の障害は、神経変性疾患の病因および／または進行に重要な役割を果たすと考えられている。高エネルギー要求性のため、ＣＮＳの神経細胞は、ミトコンドリア機能不全に起因する損傷および死に対して特に脆弱である。また、ミトコンドリア電子輸送鎖（ＥＴＣ）複合体は、少なくともいくつかのタイプの神経変性疾患において、タンパク質凝集のミスフォールディングと関連付けられている。Ｇｏｌｐｉｃｈ，Ｍ，ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；ＣＮＳ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２３（２０１７）５－２２を参照されたい。したがって、本明細書に開示されるペプチド治療は、かかる神経変性疾患の重症度／進行を効果的に治療し、軽減し得る。
アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含むがこれらに限定されない神経変性疾患は、中枢神経系（ＣＮＳ）の機能および構造の進行性変性を特徴とする。ミトコンドリア機能の障害は、神経変性疾患の病因および／または進行に重要な役割を果たすと考えられている。高エネルギー要求性のため、ＣＮＳの神経細胞は、ミトコンドリア機能不全に起因する損傷および死に対して特に脆弱である。また、ミトコンドリア電子輸送鎖（ＥＴＣ）複合体は、少なくともいくつかのタイプの神経変性疾患において、タンパク質凝集のミスフォールディングと関連付けられている。Ｇｏｌｐｉｃｈ，Ｍ，ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；ＣＮＳ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２３（２０１７）５－２２を参照されたい。したがって、本明細書に開示されるペプチド治療は、かかる神経変性疾患の重症度／進行を効果的に治療し、軽減し得る。
【0069】
末梢ニューロパチーの治療
本明細書に開示されるペプチド治療は、特定のがん治療（例えば、シスプラチン投与）および糖尿病性ニューロパチーに起因する末梢神経損傷などの様々なタイプの末梢ニューロパチーおよび末梢神経痛を治療するために使用され得る。末梢神経系の神経細胞および関連する遠位軸索は、エネルギーに高度に依存している。糖尿病などの状態は、結果として生じるミトコンドリア（Ｍｔ）機能不全、末梢神経のエネルギー恒常性機能障害、および長期にわたる神経細胞および軸索への変性および酸化損傷を伴うグルコースおよび脂質エネルギー代謝を妨げることができる。
本明細書に開示されるペプチド治療は、特定のがん治療（例えば、シスプラチン投与）および糖尿病性ニューロパチーに起因する末梢神経損傷などの様々なタイプの末梢ニューロパチーおよび末梢神経痛を治療するために使用され得る。末梢神経系の神経細胞および関連する遠位軸索は、エネルギーに高度に依存している。糖尿病などの状態は、結果として生じるミトコンドリア（Ｍｔ）機能不全、末梢神経のエネルギー恒常性機能障害、および長期にわたる神経細胞および軸索への変性および酸化損傷を伴うグルコースおよび脂質エネルギー代謝を妨げることができる。
【0070】
糖尿病性末梢神経細胞（ＤＰＮ）の病因に関与していると考えられる特定の経路の１つは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）依存性サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）／ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーターα（ＰＧＣ－１α）／Ｍｔ転写因子Ａ（ＴＦＡＭまたはｍｔＴＦＡ）シグナル伝達経路として知られるエネルギー感知経路である。Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋａｒａｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．；Ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ＮＡＤ＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＳＩＲＴ１－ＰＧＣ－１α－ＴＦＡＭ ｐａｔｈｗａｙ；Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２０１９；１４５：１７７－２０９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｂｓ．ｉｒｎ．２０１９．０４．００２．
化学療法誘発の末梢ニューロパチーは、がん治療の有痛性副作用であり得る。ミトコンドリア機能不全および酸化ストレスは、化学療法誘発性末梢ニューロパチーの発症因子として同定されている。Ｃｈｅｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ；Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２３ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｐｈａｒ．２０１５．００２３４．
上述のデータに基づいて、本明細書に記載のペプチド治療は、末梢ニューロパチーおよび末梢神経痛の治療に使用することができる。
化学療法誘発の末梢ニューロパチーは、がん治療の有痛性副作用であり得る。ミトコンドリア機能不全および酸化ストレスは、化学療法誘発性末梢ニューロパチーの発症因子として同定されている。Ｃｈｅｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ；Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２３ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｐｈａｒ．２０１５．００２３４．
上述のデータに基づいて、本明細書に記載のペプチド治療は、末梢ニューロパチーおよび末梢神経痛の治療に使用することができる。
【0071】
皮膚障害の治療
原発性ミトコンドリア障害は、皮膚の症状（例えば、発疹、色素沈着異常、先端チアノーゼ）を引き起こすことがあり、原発性皮膚障害は、ミトコンドリア機能不全に関連付けられることがある。多数の皮膚障害（例えば、そう痒症、アトピー性皮膚炎、乾癬）は、ミトコンドリア機能を改善するために、本明細書に記載されるように、治療から利益を得ることができる。ミトコンドリア機能不全は、皮膚疾患における例外ではなく、どちらかといえば通則として特徴付けられてきた。Ｆｅｉｃｈｔｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．；Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ：ａ ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｓｋｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２３，Ｉｓｓｕｅ ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４（６０７－６１４）；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｅｘｄ．１２４８４
上述のデータに基づいて、本明細書に記載のペプチド治療は、例えば、そう痒症、アトピー性皮膚炎および乾癬を含む様々な皮膚障害を治療するために使用され得る。
原発性ミトコンドリア障害は、皮膚の症状（例えば、発疹、色素沈着異常、先端チアノーゼ）を引き起こすことがあり、原発性皮膚障害は、ミトコンドリア機能不全に関連付けられることがある。多数の皮膚障害（例えば、そう痒症、アトピー性皮膚炎、乾癬）は、ミトコンドリア機能を改善するために、本明細書に記載されるように、治療から利益を得ることができる。ミトコンドリア機能不全は、皮膚疾患における例外ではなく、どちらかといえば通則として特徴付けられてきた。Ｆｅｉｃｈｔｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．；Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ：ａ ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｓｋｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２３，Ｉｓｓｕｅ ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４（６０７－６１４）；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｅｘｄ．１２４８４
上述のデータに基づいて、本明細書に記載のペプチド治療は、例えば、そう痒症、アトピー性皮膚炎および乾癬を含む様々な皮膚障害を治療するために使用され得る。
【0072】
リステガニブ以外の有効なペプチド
本特許出願において言及される作用の効果および機構は、必ずしもリステガニブに限定されるものではない。上記の組み込まれた特許および出願に記載されているものを含む他のペプチドは、本開示に含まれる。例えば、特許文献６（米国特許出願公開第２０１９／００６２３７１号明細書）に記載されているペプチドは、本明細書に記載されている効果および／または作用機序も示すことが合理的に予想され得る。これらの効果または機構のうちのいくつかまたはすべてを示すと考えられる他のペプチドの具体例は、以下の式を有するアミノ酸配列であって、
Ｙ－Ｘ－Ｚ
（式中、Ｙ＝Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｃｙｓ（酸）、ＧまたはＤであり、
Ｘ＝Ｇ、Ａ、Ｃｙｓ（酸）、Ｒ、Ｇ、ＤまたはＥであり、
Ｚ＝Ｃｙｓ（酸）、Ｇ、Ｃ、Ｒ、Ｄ、ＮまたはＥである、アミノ酸配列からなるか、またはそれを含むペプチドを含むが、これらに限定されない。
本特許出願において言及される作用の効果および機構は、必ずしもリステガニブに限定されるものではない。上記の組み込まれた特許および出願に記載されているものを含む他のペプチドは、本開示に含まれる。例えば、特許文献６（米国特許出願公開第２０１９／００６２３７１号明細書）に記載されているペプチドは、本明細書に記載されている効果および／または作用機序も示すことが合理的に予想され得る。これらの効果または機構のうちのいくつかまたはすべてを示すと考えられる他のペプチドの具体例は、以下の式を有するアミノ酸配列であって、
Ｙ－Ｘ－Ｚ
（式中、Ｙ＝Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｃｙｓ（酸）、ＧまたはＤであり、
Ｘ＝Ｇ、Ａ、Ｃｙｓ（酸）、Ｒ、Ｇ、ＤまたはＥであり、
Ｚ＝Ｃｙｓ（酸）、Ｇ、Ｃ、Ｒ、Ｄ、ＮまたはＥである、アミノ酸配列からなるか、またはそれを含むペプチドを含むが、これらに限定されない。
【0073】
かかるペプチドは、アミノ酸配列、Ｒ－Ｇ－Ｃｙｓ（酸）、Ｒ－Ｒ－Ｃｙｓ、Ｒ－Ｃｙｓ酸）－Ｇ、Ｃｙｓ（酸）－Ｒ－Ｇ、Ｃｙｓ（酸）－Ｇ－Ｒ、Ｒ－Ｇ－Ｄ、Ｒ－Ｇ－Ｃｙｓ（酸）、Ｈ－Ｇ－Ｃｙｓ（酸）、Ｒ－Ｇ－Ｎ、Ｄ－Ｇ－Ｒ、Ｒ－Ｄ－Ｇ、Ｒ－Ａ－Ｅ、Ｋ－Ｇ－Ｄ、Ｒ－Ｇ－Ｃｙｓ（酸）－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｄ－Ｇ、Ｃｙｃｌｏ－｛Ｒ－Ｇ－Ｃｙｓ（酸）－Ｆ－Ｎ－Ｍｅ－Ｖ｝、Ｒ－Ａ－Ｃｙｓ（酸）、Ｒ－Ｇ－Ｃ、Ｋ－Ｇ－Ｄ、Ｃｙｓ（酸）－Ｒ－Ｇ、Ｃｙｓ（酸）－Ｇ－Ｒ、シクロ－｛Ｒ－Ｇ－Ｄ－Ｄ－Ｆ－ＮＭｅ－Ｖ｝、Ｈ－Ｇ－Ｃｙｓ（酸）およびそれらの塩を含むか、またはそれらからなり得る。可能な塩は、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩（ＴＦＡ）、および塩酸塩を含むが、これらに限定されない。
【0074】
また、これらの効果または機構のうちのいくつかまたはすべてを示すと考えられる他のペプチドは、直鎖状もしくは環状形態のグリシニル－アルギニル－グリシニル－システイン酸－トレオニル－プロニン－ＣＯＯＨからなるか、もしくはそれを含むもの、または以下の式：
Ｘｌ－Ｒ－Ｇ－システイン酸－Ｘ
（式中、ＸおよびＸｌは、Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｌａ、－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ａｌａ、－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ、－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ、－Ｐｈｅ－Ｖａｌから選択されるか、またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、システイン酸、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、および塩、ならびにそれらの任意のＤ－異性体およびＬ－異性体の任意の組み合わせから選択される）を有するものが挙げられるが、本質的にはこれらに限定されない。
Ｘｌ－Ｒ－Ｇ－システイン酸－Ｘ
（式中、ＸおよびＸｌは、Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｌａ、－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ａｌａ、－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ、－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ、－Ｐｈｅ－Ｖａｌから選択されるか、またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、システイン酸、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、および塩、ならびにそれらの任意のＤ－異性体およびＬ－異性体の任意の組み合わせから選択される）を有するものが挙げられるが、本質的にはこれらに限定されない。
【0075】
本発明は本発明の特定の実施例または実施形態を参照して本明細書で上記のように記載されてきたが、本発明の意図する精神および範囲から逸脱することなく、様々な付加、欠失、改変、および修飾が記載された実施例および実施形態に対してなされてもよいことが理解されるべきである。別に特定されない限り、またはその意図する用途に不適切となる実施形態または実施例を生み出さない限り、例えば、ある実施形態または実施例の任意の要素、ステップ、メンバー、構成要素、組成物、反応物質、部数、または部分は、別の実施形態または実施例に組み込まれてもよく、または別の実施形態または実施例とともに使用されてもよい。また、方法またはプロセスのステップが特定の順序で記載されているか、または列挙されている場合、別に特定されない限り、またはその意図する用途に不適切となる方法またはプロセスを生み出さない限り、そのかかるステップの順序は変更されてもよい。さらに、本明細書で記載された任意の発明または実施例の要素、ステップ、メンバー、構成要素、組成物、反応物質、部数、または部分は、別に注記されない限り、任意選択的に存在してもよく、または任意の他の要素、ステップ、メンバー、構成要素、組成物、反応物質、部数、または部分の不在下、もしくは実質的な不在下で利用されてもよい。すべての合理的な付加、欠失、修飾、および改変は、記載された実施例および実施形態の等価物とみなされ、以下の特許請求の範囲内に含まれる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【国際調査報告】