▶ エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーの特許一覧 ▶ ウェスタン デジタル テクノロジーズ インコーポレーテッドの特許一覧
特表2023-516491核酸配列決定のための磁気センサアレイならびにそれらの製造方法および使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-19
(54)【発明の名称】核酸配列決定のための磁気センサアレイならびにそれらの製造方法および使用方法
(51)【国際特許分類】
G01N 27/74 20060101AFI20230412BHJP
H10N 50/10 20230101ALI20230412BHJP
G01R 33/02 20060101ALI20230412BHJP
G01R 33/09 20060101ALI20230412BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230412BHJP
【ＦＩ】
G01N27/74
H10N50/10 Z
H10N50/10 U
G01R33/02 R
G01R33/09
C12Q1/6869 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022554492
(86)(22)【出願日】2021-03-07
(85)【翻訳文提出日】2022-10-24
(86)【国際出願番号】 US2021021274
(87)【国際公開番号】W WO2021183403
(87)【国際公開日】2021-09-16
(31)【優先権主張番号】62/987,831
(32)【優先日】2020-03-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(71)【出願人】
【識別番号】504056130
【氏名又は名称】ウェスタン デジタル テクノロジーズ インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100196243
【弁理士】
【氏名又は名称】運 敬太
(72)【発明者】
【氏名】ブラガンカ，パトリック
(72)【発明者】
【氏名】スミス，ニール
(72)【発明者】
【氏名】トポランチク，ユライ
(72)【発明者】
【氏名】アスティエ，ヤン
【テーマコード（参考）】
2G017
2G053
4B063
5F092
【Ｆターム（参考）】
2G017AA08
2G017AD55
2G017BA15
2G053AA04
2G053AA06
2G053AB01
2G053BA08
2G053BB08
2G053CA06
2G053CB21
2G053DB03
4B063QA13
4B063QQ41
4B063QR08
4B063QR31
4B063QR62
4B063QS28
4B063QX02
5F092AB01
5F092AB10
5F092AC08
5F092AC12
5F092AD23
5F092AD25
5F092BB16
5F092BB22
5F092BB23
5F092BB31
5F092BB35
5F092BB36
5F092BB42
5F092BB43
5F092FA08
(57)【要約】
本明細書では、磁気標識（例えば、磁性粒子）および磁気センサを使用する核酸配列決定のための装置が開示される。また、そのような装置を製造および使用する方法も開示される。核酸配列決定のための装置は、複数の磁気センサと、複数の磁気センサの上方に配置された複数の結合領域であって、結合領域のそれぞれが流体を保持するためのものである、複数の結合領域と、複数の磁気センサのうちの少なくとも第１の磁気センサの特性を検出するための少なくとも１つのラインであって、特性が、第１の磁気センサに関連する第１の結合領域に結合された１つ以上の磁性ナノ粒子の存在または非存在を示す、少なくとも１つのラインと、を備える。
【選択図】図４Ａ
【選択図】図４Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸配列決定のための装置であって、複数の磁気センサと、
前記複数の磁気センサの上方に配置された複数の結合領域であって、前記結合領域のそれぞれが流体を保持するためのものである、複数の結合領域と、
前記複数の磁気センサのうちの少なくとも第１の磁気センサの特性を検出するための少なくとも１つのラインであって、前記特性が、前記第１の磁気センサに関連する第１の結合領域に結合された１つ以上の磁性ナノ粒子の存在または非存在を示す、少なくとも１つのラインと、を備える装置。
【請求項2】
前記第１の磁気センサが磁気抵抗素子を備える、請求項１に記載の装置。
【請求項3】
前記磁気抵抗素子が、固定層と、
自由層と、
前記固定層と前記自由層との間に配置されたバリア層と、を備える、請求項２に記載の装置。
【請求項4】
前記第１の結合領域に結合された前記１つ以上の磁性ナノ粒子の非存在下で、前記固定層の磁気モーメントが前記自由層の磁気モーメントからおよそ９０度である、請求項３に記載の装置。
【請求項5】
前記第１の磁気センサの形状が、実質的に円筒形または実質的に直方体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項6】
前記第１の磁気センサの横方向寸法が、およそ１０ナノメートルからおよそ１マイクロメートルである、請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項7】
前記少なくとも１つのラインを介して前記複数の磁気センサに結合された検知回路をさらに備え、前記検知回路が、前記少なくとも１つのラインに電流を印加して、前記第１の磁気センサの前記特性を検出するように構成されている、請求項１から６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項8】
前記特性が、磁場または抵抗を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項9】
前記特性が、磁場の変化または抵抗の変化を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項10】
前記検知回路が磁気発振器を備え、前記特性が、前記磁気発振器に関連する信号の周波数または前記磁気発振器によって発生される信号の周波数を含む、請求項７から９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項11】
前記特性がノイズレベルを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項12】
前記複数の磁気センサと前記複数の結合領域との間に配置された絶縁材料をさらに備える、請求項１から１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項13】
前記絶縁材料が、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、または窒化ケイ素のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の装置。
【請求項14】
前記絶縁材料が、酸化物または窒化物のうちの少なくとも一方を含む、請求項１２または１３に記載の装置。
【請求項15】
前記第１の磁気センサの上部と前記第１の結合領域との間の前記絶縁材料の厚さが、およそ３ナノメートルからおよそ２０ナノメートルである、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項16】
前記少なくとも１つのラインが、前記第１の磁気センサの上面の上方に配置された第１のラインを含み、前記第１の結合領域が、前記第１のライン内のトレンチ内に位置し、前記トレンチが、前記第１の磁気センサの前記上面の上方にある、請求項１から１５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項17】
前記複数の磁気センサが矩形アレイに配置され、前記少なくとも１つのラインが、少なくとも第１のラインおよび第２のラインを含み、前記第１のラインが前記第１の磁気センサの上方に配置され、前記第２のラインが前記第１の磁気センサの下方に配置される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項18】
前記第１の結合領域が、前記第１のライン内のトレンチ内に位置する、請求項１７に記載の装置。
【請求項19】
前記第１のラインが前記矩形アレイの行に結合され、前記第２のラインが前記矩形アレイの列に結合されるか、またはその逆である、請求項１７または１８に記載の装置。
【請求項20】
前記第１の結合領域が、核酸を前記第１の結合領域に固定するように構成された構造を備える、請求項１から１９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項21】
前記構造が、空洞または隆起部を備える、請求項２０に記載の装置。
【請求項22】
複数の磁気センサと、前記複数の磁気センサの上方に配置された複数の結合領域であって、前記結合領域のそれぞれが流体を保持するためのものである、複数の結合領域と、前記複数の磁気センサのうちの少なくとも第１の磁気センサの特性を検出するための少なくとも１つのラインと、を備える装置を使用して核酸を配列決定する方法であって、（ａ） 少なくとも１つの核酸鎖を第１の結合領域に結合することと、
（ｂ） １回または複数回の付加において、前記第１の結合領域に、伸長可能プライマーおよび核酸ポリメラーゼを付加することと、
（ｃ） 前記第１の結合領域に、第１の開裂可能な磁気標識によって標識された第１のヌクレオチド前駆体を付加することと、
（ｄ） 前記核酸鎖を配列決定することであって、前記核酸鎖を配列決定することが、
前記少なくとも１つのラインを使用して、前記第１の磁気センサの前記特性を検出することであって、前記特性が、前記第１の開裂可能な磁気標識の存在または非存在を示す、検出することを含む、配列決定することと、を含む方法。
【請求項23】
前記少なくとも１つの核酸鎖を増幅することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記少なくとも１つの核酸鎖を前記第１の結合領域に結合した後、前記少なくとも１つの核酸鎖を増幅することをさらに含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項25】
前記増幅の結果として、１つ以上のアンプリコンが前記第１の結合領域に結合される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項26】
前記核酸鎖を配列決定することが、前記特性が前記第１の結合領域に結合された前記１つ以上の磁性ナノ粒子の存在を示すという決定に応答して、前記第１のヌクレオチド前駆体の相補的塩基を前記核酸鎖の核酸配列の記録に記録することをさらに含む、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記第１のヌクレオチド前駆体が前記核酸ポリメラーゼによって伸長不可能であり、前記特性を検出した後、前記第１の開裂可能な磁気標識を除去し、前記第１のヌクレオチド前駆体を前記核酸ポリメラーゼによって伸長可能にすることをさらに含む、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記第１のヌクレオチド前駆体が前記核酸ポリメラーゼによって伸長可能でない、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記第１のヌクレオチド前駆体が化学的開裂によって伸長可能にされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記核酸鎖を配列決定した後、酵素的または化学的開裂によって前記開裂可能な磁気標識を除去することをさらに含む、請求項２２から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
各反復中に異なるヌクレオチド前駆体を用いてステップ（ｃ）および（ｄ）を反復することであって、前記異なるヌクレオチド前駆体のそれぞれが磁気的に標識される、反復することをさらに含む、請求項２２から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
第１のおよび異なるヌクレオチド前駆体のそれぞれが、磁気標識されたアデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはそれらの等価物から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
ステップ（ｃ）の前に前記第１の結合領域を洗浄することをさらに含む、請求項２２から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記第１の開裂可能な磁気標識が第１の磁気特性を有し、前記方法が、前記１回または複数回の付加において、前記第１の結合領域に、第２の磁気特性を有する第２の開裂可能な磁気標識によって標識された第２のヌクレオチド前駆体を付加することをさらに含む、請求項２２から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記１回または複数回の付加において、前記第１の結合領域に、第３の磁気特性を有する第３の開裂可能な磁気標識によって標識された第３のヌクレオチド前駆体、および第４の磁気特性を有する第４の開裂可能な磁気標識によって標識された第４のヌクレオチド前駆体を付加することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記少なくとも１つの核酸鎖を前記第１の結合領域に結合することが、前記少なくとも１つの核酸鎖のそれぞれ１つの末端にアダプタを結合することと、
前記第１の結合領域にオリゴヌクレオチドを結合することであって、前記オリゴヌクレオチドが前記アダプタにハイブリダイズすることができる、結合することと、を含む、請求項２２から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記少なくとも１つの核酸鎖を前記第１の結合領域に結合することが、前記少なくとも１つの核酸鎖のそれぞれを前記第１の結合領域に共有結合することを含む、請求項２２から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記少なくとも１つの核酸鎖を前記第１の結合領域に結合することが、分子間の不可逆的な受動吸着または親和性を介して前記少なくとも１つの核酸鎖を固定化することを含む、請求項２２から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記第１の結合領域が空洞または隆起部を備え、前記少なくとも１つの核酸鎖を前記第１の結合領域に結合することが、ヒドロゲルを前記空洞または前記隆起部に適用することを含む、請求項２２から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
ステップ（ｃ）の後、前記第１の結合領域に、前記核酸ポリメラーゼのさらなる分子を付加することをさらに含む、請求項２２から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記第１の開裂可能な磁気標識が磁性ナノ粒子を含む、請求項２２から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記磁性ナノ粒子が分子である、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記磁性ナノ粒子が超常磁性ナノ粒子である、請求項４１に記載の方法。
【請求項44】
前記磁性ナノ粒子が強磁性ナノ粒子である、請求項４１に記載の方法。
【請求項45】
前記第１のヌクレオチド前駆体が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰまたは等価物のうちの１つを含む、請求項２２から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記核酸ポリメラーゼが、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＢ型ポリメラーゼを含む、請求項２２から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記核酸ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼを含む、請求項２２から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記少なくとも１つのラインを使用することが、前記少なくとも１つのラインに電流を印加することを含む、請求項２２から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記特性が、磁場または抵抗を含む、請求項２２から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記特性が、磁気発振器に関連する信号の周波数または磁気発振器によって発生される信号の周波数を含む、請求項２２から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記特性がノイズレベルを含む、請求項２２から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記特性が、磁場の変化または抵抗の変化を含む、請求項２２から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記特性が、磁場の変化または抵抗の変化から生じる、請求項２２から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
核酸配列決定装置を製造する方法であって、第１のラインを製造することと、
複数の磁気センサを製造することであって、各磁気センサが下面および上面を有し、各下面が前記第１のラインに結合される、複数の磁気センサを製造することと、
前記磁気センサ間に絶縁材料を堆積させることと、
複数の追加のラインを製造することであって、前記複数の追加のラインのそれぞれが、前記複数の磁気センサのうちのそれぞれの磁気センサの前記上面に結合される、複数の追加のラインを製造することと、
複数の結合領域を形成することと、を含む、方法。
【請求項55】
前記第１のラインを製造することが、基板上に金属層を堆積させることと、
前記金属層を前記第１のラインにパターニングすることと、を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記基板上に前記金属層を堆積させることが、物理蒸着またはイオンビーム蒸着を使用して前記金属層を堆積させることを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記金属層を第１のラインにパターニングすることが、フォトリソグラフィ、フライス加工、またはエッチングのうちの１つ以上を使用して前記金属層をパターニングすることを含む、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項58】
前記第１のラインを製造した後、前記複数の磁気センサを製造する前に、前記第１のライン上に絶縁材料を堆積させることと、
前記第１のラインを露出させることと、をさらに含み、
前記複数の磁気センサを製造することが、露出させた前記第１のライン上に前記複数の磁気センサを製造することを含む、請求項５４から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記第１のラインを露出させることが、化学機械研磨（ＣＭＰ）を使用することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
前記複数の磁気センサを製造することが、前記第１のライン上に複数の層を堆積させることと、
前記複数の層をパターニングして前記複数の磁気センサを形成することであって、前記複数の磁気センサのそれぞれが所定の形状を有する、形成することと、を含む、請求項５４から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
前記複数の層を堆積させることが、第１の強磁性層を堆積させることと、
前記第１の強磁性層上に金属または絶縁体層を堆積させることと、
前記金属または絶縁体層上に第２の強磁性層を堆積させることと、を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記複数の層をパターニングして前記複数の磁気センサを形成することが、フォトリソグラフィまたはエッチングのうちの少なくとも一方を実行することを含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項63】
前記所定の形状が、実質的に円筒形または実質的に直方体である、請求項６０から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記複数の磁気センサのそれぞれの横方向寸法が、およそ１０ナノメートルからおよそ１マイクロメートルである、請求項５４から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
前記複数の磁気センサを製造することが、前記複数の磁気センサを矩形アレイに製造することを含み、前記第１のラインが、前記矩形アレイの行に対応し、前記複数の追加のラインのそれぞれが、前記矩形アレイの列に対応する、請求項５４から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記複数の磁気センサを製造することが、前記複数の磁気センサを矩形アレイに製造することを含み、前記第１のラインが、前記矩形アレイの列に対応し、前記複数の追加のラインのそれぞれが、前記矩形アレイの行に対応する、請求項５４から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
前記磁気センサ間に前記絶縁材料を堆積させた後、前記複数の追加のラインを製造する前に、化学機械研磨ステップを実行して、前記複数の磁気センサのそれぞれの前記上面を露出させることを含む、請求項５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
前記複数の追加のラインを製造することが、金属層を堆積させることと、
フォトリソグラフィを実行して前記複数の追加のラインを画定ことと、
前記金属層の一部を除去することと、を含む、請求項５４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
前記複数の結合領域を形成することが、前記複数の結合領域上にマスクを適用することと、
前記マスク上に金属層を堆積させることと、
前記マスクを持ち上げることと、を含む、請求項５４から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記マスクを持ち上げた後に、前記複数の追加のラインおよび前記複数の結合領域上に追加の絶縁材料を堆積させることをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記追加の絶縁材料の厚さが、およそ３ナノメートルからおよそ２０ナノメートルである、請求項７０に記載の方法。
【請求項72】
前記追加の絶縁材料が、酸化物または窒化物を含む、請求項７０または７１に記載の方法。
【請求項73】
前記追加の絶縁材料が、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を含む、請求項７０から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項74】
堆積させることが、原子層堆積を実行することを含む、請求項７０から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項75】
製造することが、堆積させることを含む、請求項５４から７４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本特許出願は、２０２０年３月１０日に出願された「ＭＡＧＮＥＴＩＣ ＳＥＮＳＯＲ ＡＲＲＡＹＳ ＦＯＲ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＭＡＫＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥＭ」と題する米国仮出願第６２／９８７，８３１号（代理人整理番号ＲＯＡ－１００１Ｐ－ＵＳ／Ｐ３５９６７－ＵＳ）の優先権を主張し、その内容全体を参照により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【0002】
合成による配列決定（ＳＢＳ）は、大量のＤＮＡ配列決定データを得るための成功した商業的に実行可能な方法であった。ＳＢＳは、プライマーにハイブリダイズしたテンプレートＤＮＡの結合、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の組み込み、および組み込まれたｄＮＴＰの検出を含む。
【0003】
現在の配列決定システムは、蛍光シグナル検出を使用する。４つの蛍光標識ヌクレオチドが使用されて、数百万のクラスタを並行して配列決定する。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成の連続サイクル中に蛍光標識ｄＮＴＰのＤＮＡテンプレート鎖への取り込みを触媒する。各サイクルの間に、単一の標識ｄＮＴＰが核酸鎖に付加される。ヌクレオチド標識は、重合のための「可逆的ターミネーター」として働く。ｄＮＴＰが組み込まれた後、レーザー励起および撮像によって蛍光色素が識別され、次いで、酵素的に開裂されて次の組み込みを可能にする。塩基は、各サイクル中の信号強度測定値から直接識別される。
【0004】
蛍光シグナル検出に依拠する最先端の配列決定システムは、実行当たり最大２００億リードのスループットを提供することができる。しかしながら、そのような性能を達成することは、塩基検出を成功させるのに十分な蛍光信号を生成するために、大面積フローセル、高精度の自由空間撮像光学系、および高価な高出力レーザーを必要とする。
【0005】
２つの一般的な戦略は、ＳＢＳスループットの漸進的な増加を可能にした（例えば、ランあたりの塩基リードを特徴とする）。第１の手法は、シーケンサ内のフローセルのサイズおよび数を増加させることによる外向きスケーリングであった。この手法は、追加の高出力レーザーおよび高精度ナノポジショナーを必要とするため、試薬のコストと配列決定システムの価格の双方を増加させる。
【0006】
第２の手法は、固定サイズのフローセル内の配列決定されたＤＮＡ鎖の数がより多くなるように個々のＤＮＡ試験部位のサイズを縮小する内向きスケーリングを含む。この第２の手法は、消耗品のコストを同じに保ちながら、追加のコストがより良好な撮像光学系の実装のみを含むため、全体的な配列決定コストを削減するためにより魅力的である。しかしながら、隣接するフルオロフォアからの信号を区別するために、より高い開口数（ＮＡ）のレンズを使用しなければならない。レイリー基準は、分解可能な光源間の距離を０．６１λ／ＮＡにするため、すなわち、高度な光学撮像システムであっても、配列決定された２本のＤＮＡ鎖間の最小距離がおよそ４００ｎｍを超えて縮小されることはできないため、この手法には限界がある。これまで達成された最小ピクセルサイズが１μｍ未満である場合、撮像アレイの上部における直接配列決定に同様の分解能限界が適用される。レイリー基準は、現在、光学ＳＢＳシステムの内向きスケーリングの基本的な制限を表している。これらの制限を克服することは、高度に多重化されたシステムではまだ達成されていない超解像撮像技術を必要となる場合がある。したがって、この段階では、光学ＳＢＳシーケンサのスループットを増加させる唯一の実用的な方法は、より大きなフローセルならびにより高価な光学走査および撮像システムを構築することである。
【0007】
したがって、ＳＢＳを改善する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【0008】
本開示の目的、特徴、および利点は、添付の図面と併せて、特定の実施形態の以下の説明から容易に明らかになるであろう。
【0009】
【図1】いくつかの実施形態にかかる、磁気センサの一部を示している。
【図2A】いくつかの実施形態にかかる磁気抵抗（ＭＲ）センサの抵抗を示している。
【図2B】いくつかの実施形態にかかる磁気抵抗（ＭＲ）センサの抵抗を示している。
【図3A】いくつかの実施形態にかかるスピントルク発振子（ＳＴＯ）センサを使用する概念を示している。
【図3B】いくつかの実施形態にかかる、ＡＣ磁場がＳＴＯを横切って印加されたときの遅延検出回路を通るＳＴＯの実験的応答を示している。
【図3C】いくつかの実施形態にかかる、ＳＴＯがナノスケール磁場検出器としてどのように使用されることができるかを示している。
【図3D】いくつかの実施形態にかかる、ＳＴＯがナノスケール磁場検出器としてどのように使用されることができるかを示している。
【図4A】いくつかの実施形態にかかる配列決定装置の一部の平面図である。
【図5A】いくつかの実施形態にかかる磁気センサを選択するための２つの手法を示している。
【図5B】いくつかの実施形態にかかる磁気センサを選択するための２つの手法を示している。
【図6】いくつかの実施形態にかかる配列決定装置の製造方法を示している。
【図7】いくつかの実施形態にかかる、核酸配列決定のために配列決定装置を使用する方法を示している。
【図8】いくつかの実施形態にかかる、複数のヌクレオチド前駆体が実質的に同時に導入される配列決定装置を使用する方法を示している。
【0010】
理解を容易にするために、可能であれば、図に共通する同一の要素を示すために同一の参照符号が使用されている。一実施形態で開示された要素は、特定の記載なしに他の実施形態で有益に利用されることができることが企図される。
【0011】
さらに、１つの図面の文脈における要素の説明は、その要素を示す他の図面にも適用可能である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書では、磁気標識（例えば、磁性粒子）および磁気センサを使用する核酸配列決定のための装置が開示される。また、そのような装置を製造および使用する方法も開示される。簡単にするために、以下の議論のいくつかは、例としてＤＮＡの配列決定を指す。本明細書の開示は、一般に核酸配列決定に適用されることを理解されたい。
【0013】
本発明者らは、従来技術のＳＢＳにおいて使用される蛍光顕微鏡法およびＣＭＯＳイメージャの分解能限界は、電荷（例えば、シリコンナノワイヤ電界効果トランジスタ（ＦＥＴ））または磁場センサ（例えば、スピンバルブ、磁気トンネル接合部（ＭＴＪ）、スピントルクオシレータ（ＳＴＯ）など）には適用されず、検知素子のサイズは、最先端のＳＢＳシステムよりも一桁小さく、多重化のレベルはかなり高いことを認識した。ＳＢＳにおける磁場検知は、ＤＮＡおよび配列決定試薬が非磁性であり、ＣＭＯＳ構成要素における電子輸送変調に基づく電荷検知スキームと比較して、信号対雑音比（ＳＮＲ）の大幅な改善を可能にするため、特に魅力的である。さらにまた、磁気検知は、組み込まれた基部が接合部と直接接触することを必要としない。小型磁場センサが使用されてナノスケールの磁性ナノ粒子を検出し、ＳＢＳを行うことができる。
【0014】
磁気センサアレイを使用してＳＢＳを実行することは、配列決定システムにおける高出力レーザーおよび高解像度光学系の必要性を排除しながら、例えばおよそ１００倍の追加の内向きスケーリングを提供することによって、スループットを劇的に増加させ、配列決定のコストを削減することができる。
【0015】
この文献は、磁気検出素子のアレイ（例えば、ＭＴＪ、ＳＴＯ、スピンバルブなど）を含む配列決定装置と併せて磁気標識ヌクレオチド前駆体を使用するＳＢＳプロトコルを開示している。装置はまた、（例えば、絶縁体の薄層を使用して）磁気センサを損傷から保護しながら、磁気センサが磁気標識ヌクレオチド前駆体中の磁気標識を検出することを可能にする１つ以上のエッチングされた結合領域を含む。
【0016】
本明細書の開示の中には、核酸配列決定のための装置であって、複数の磁気センサと、複数の磁気センサの上方に配置された複数の結合領域であって、結合領域のそれぞれが流体を保持するためのものである、複数の結合領域と、複数の磁気センサのうちの少なくとも第１の磁気センサの特性を検出するための少なくとも１つのラインであって、特性が、第１の磁気センサに関連する第１の結合領域に結合された１つ以上の磁性ナノ粒子の存在または非存在を示す、少なくとも１つのラインと、を備える、装置の開示がある。いくつかの実施形態では、第１の磁気センサは、磁気抵抗（ＭＲ）装置を備える。ＭＲ装置は、固定層と、自由層と、固定層と自由層との間に配置されたバリア層とを備えることができる。いくつかのそのような実施形態では、第１の結合領域に結合された１つ以上の磁性ナノ粒子が存在しない場合、固定層の磁気モーメントは、自由層の磁気モーメントからおよそ９０度である。
【0017】
第１の結合領域は、核酸を第１の結合領域に固定するように構成された構造（例えば、空洞または隆起部）を含むことができる。
【0018】
いくつかの実施形態では、第１の磁気センサの形状は、実質的に円筒形または実質的に直方体である。いくつかの実施形態では、第１の磁気センサの横方向寸法は、およそ１０ナノメートル（ｎｍ）からおよそ１マイクロメートルである。
【0019】
装置はまた、少なくとも１つのラインを介して複数の磁気センサに結合された検知回路を含むことができる。検知回路は、第１の磁気センサの特性（例えば、磁場、抵抗、磁場の変化、抵抗の変化、ノイズレベルなど）を検出するために少なくとも１つのラインに電流を印加するように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、検知回路は、磁気発振器を備え、特性は、磁気発振器に関連する信号の周波数または磁気発振器によって発生される信号の周波数である。
【0020】
装置は、複数の磁気センサと複数の結合領域との間に配置された絶縁材料（例えば、酸化物（例えば、二酸化ケイ素、酸化アルミニウムなど）、窒化物（例えば、窒化ケイ素など））を有することができる。第１の磁気センサの上部と第１の結合領域との間の絶縁材料の厚さは、例えば、およそ３ｎｍからおよそ２０ｎｍであってもよい。
【0021】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのラインは、第１の磁気センサの上面の上方に配置された第１のラインを含み、第１の結合領域は、第１のライン内のトレンチ内に位置し、トレンチは、第１の磁気センサの上面の上方にある。
【0022】
いくつかの実施形態では、複数の磁気センサは、矩形アレイに配置され、少なくとも１つのラインは、少なくとも第１のラインおよび第２のラインを含み、第１のラインは、第１の磁気センサの上方に配置され、第２のラインは、第１の磁気センサの下方に配置される。１つ以上の結合領域は、第１のラインのトレンチ内に配置されてもよい。いくつかの実施形態では、第１のラインは、矩形アレイの行に結合され、第２のラインは、矩形アレイの列に結合され、またはその逆である。
【0023】
核酸配列決定のための装置を製造する方法も本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、核酸配列決定装置を製造する方法は、第１のラインを製造することと、複数の磁気センサを製造することと、磁気センサ間に絶縁材料を堆積させることと、複数の追加のラインを製造することと、複数の結合領域を形成することと、を含む。いくつかの実施形態では、各磁気センサの下面は、第１のラインに結合され、各磁気センサの上面は、追加のラインのそれぞれ１つに結合される。
【0024】
第１のラインを製造することは、（例えば、物理蒸着、イオンビーム蒸着などを使用して）基板上に金属層を堆積することと、（例えば、フォトリソグラフィ、フライス加工、および／またはエッチングを使用して）金属層を第１のラインにパターニングすることと、を含むことができる。
【0025】
いくつかの実施形態では、第１のラインを製造した後、複数の磁気センサを製造する前に、絶縁材料が第１のライン上に堆積され、次いで第１のラインが（例えば、化学機械研磨（ＣＭＰ）を使用して）被覆されず、複数の磁気センサが被覆されていない第１のライン上に製造される。
【0026】
複数の磁気センサは、第１のライン上に複数の層を堆積させ、（例えば、フォトリソグラフィおよび／またはエッチングを使用して）複数の層をパターニングして複数の磁気センサを形成することによって製造されることができ、複数の磁気センサのそれぞれは、所定の形状（例えば、実質的に円筒形、実質的に直方体など）を有する。複数の層を堆積させることは、第１の強磁性層を堆積させることと、第１の強磁性層上に金属または絶縁体層を堆積させることと、金属または絶縁体層上に第２の強磁性層を堆積させることと、を含むことができる。複数の磁気センサのそれぞれの横方向寸法は、例えば、およそ１０ｎｍからおよそ１マイクロメートルであってもよい。
【0027】
いくつかの実施形態では、複数の磁気センサは、矩形アレイにあり、第１のラインは、矩形アレイの行に対応し、複数の追加のラインのそれぞれは、矩形アレイの列に対応し、またはその逆である。
【0028】
いくつかの実施形態では、磁気センサ間に絶縁材料を堆積させた後、複数の追加のラインを製造する前に、化学機械研磨ステップが実行されて、複数の磁気センサのそれぞれの上面を露出させる。
【0029】
いくつかの実施形態では、複数の追加のラインを製造することは、金属の層を堆積することと、複数の追加のラインを画定するためにフォトリソグラフィを実行することと、金属の層の一部を除去することと、を含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、複数の結合領域を形成することは、複数の結合領域上にマスクを適用することと、（例えば、原子層堆積を使用して）マスク上に金属層を堆積させることと、マスクを持ち上げることと、を含む。次いで、マスクを持ち上げた後に、複数の追加のラインおよび複数の結合領域上に追加の絶縁材料（例えば、およそ３ｎｍからおよそ２０ｎｍの厚さの酸化物（二酸化ケイ素など）または窒化物）が堆積されることができる。
【0031】
開示された核酸配列決定装置を使用して核酸を配列決定する方法も本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）少なくとも１つの核酸鎖を第１の結合領域に結合させることと、（ｂ）１回または複数回の付加において、第１の結合領域に、伸長可能なプライマーおよび核酸ポリメラーゼを付加することと、（ｃ）第１の結合領域に、第１の開裂可能な磁気標識によって標識された第１のヌクレオチド前駆体を付加することと、（ｄ）核酸鎖を配列決定することと、を含む。第１の開裂可能な磁気標識は、磁性ナノ粒子（例えば、分子、超常磁性ナノ粒子、強磁性ナノ粒子など）を含むことができる。第１の結合領域は、ステップ（ｃ）の前に洗浄されてもよい。ステップ（ｃ）の後に、核酸ポリメラーゼのさらなる分子が第１の結合領域に付加されることができる。ステップ（ｃ）および（ｄ）は、各反復中に異なるヌクレオチド前駆体を用いて反復されてもよく、異なるヌクレオチド前駆体のそれぞれは、磁気的に標識される。第１のヌクレオチド前駆体は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、または等価物のうちの１つを含むことができる。第１のヌクレオチド前駆体および異なるヌクレオチド前駆体のそれぞれは、磁気標識アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはそれらの等価物から選択されることができる。
【0032】
核酸鎖の配列決定は、第１の磁気センサの特性を検出するために少なくとも１つのラインを使用することを含むことができ、特性は、第１の開裂可能な磁気標識の存在または非存在を示す。特性は、例えば、磁場または抵抗、磁気発振器に関連する信号の周波数または磁気発振器によって発生される信号の周波数、ノイズレベル、または磁場の変化または抵抗の変化であってもよい。特性は、磁場の変化または抵抗の変化に起因してもよい。
【0033】
本方法はまた、少なくとも１つの核酸鎖を増幅するステップを含むことができる。行われる場合、増幅ステップは、少なくとも１つの核酸鎖を第１の結合領域に結合する前または後に行われることができる。増幅の結果として、１つ以上のアンプリコンが第１の結合領域に結合されることができる。
【0034】
いくつかの実施形態では、特性が第１の結合領域に結合された１つ以上の磁性ナノ粒子の存在を示すという決定に応答して、第１のヌクレオチド前駆体の相補的塩基が核酸鎖の核酸配列の記録に記録される。
【0035】
いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド前駆体は、核酸ポリメラーゼによって伸長不可能であり、本方法は、特性を検出した後、第１の開裂可能な磁気標識を除去し、第１のヌクレオチド前駆体を核酸ポリメラーゼによって伸長可能にすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド前駆体は、核酸ポリメラーゼによって伸長可能ではない。第１のヌクレオチド前駆体は、化学的開裂によって伸長可能にされることができる。
【0036】
核酸鎖を配列決定した後、開裂可能な磁気標識は、酵素的または化学的開裂によって除去されることができる。
【0037】
いくつかの実施形態では、第１の開裂可能な磁気標識は、第１の磁気特性を有し、本方法は、１回または複数回の付加において、第１の結合領域に、第２の磁気特性を有する第２の開裂可能な磁気標識によって標識された第２のヌクレオチド前駆体を付加することをさらに含む。いくつかのそのような実施形態では、本方法は、１回または複数回の付加において、第１の結合領域に、第３の磁気特性を有する第３の開裂可能な磁気標識によって標識された第３のヌクレオチド前駆体、および第４の磁気特性を有する第４の開裂可能な磁気標識によって標識された第４のヌクレオチド前駆体を付加することをさらに含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸鎖を第１の結合領域に結合することは、少なくとも１つの核酸鎖のそれぞれ１つの末端にアダプタを結合することと、第１の結合領域にオリゴヌクレオチドを結合することであって、オリゴヌクレオチドがアダプタにハイブリダイズすることができる、結合することと、を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸鎖を第１の結合領域に結合することは、少なくとも１つの核酸鎖のそれぞれを第１の結合領域に共有結合することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸鎖を第１の結合領域に結合することは、分子間の不可逆的な受動吸着または親和性を介して少なくとも１つの核酸鎖を固定化することを含む。いくつかの実施形態では、第１の結合領域は、空洞または隆起部を備え、少なくとも１つの核酸鎖を第１の結合領域に結合することは、ヒドロゲルを空洞または隆起部に適用することを含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＢ型ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼである。
【0040】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのラインを使用することは、少なくとも１つのラインに電流を印加することを含む。
【0041】
磁気標識
本明細書に記載の核酸配列決定方法は、開裂可能な磁気標識を含む磁気標識ヌクレオチド前駆体の使用に依拠する。これらの開裂可能な磁気標識は、例えば、磁性ナノ粒子、例えば分子、超常磁性ナノ粒子、または強磁性粒子を含むことができる。磁気標識は、高い磁気異方性を有するナノ粒子とすることができる。高い磁気異方性を有するナノ粒子の例は、Ｆｅ３Ｏ４、ＦｅＰｔ、ＦｅＰｄおよびＣｏＰｔを含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドへの化学的結合を促進するために、粒子が合成され、ＳｉＯ２によってコーティングされることができる。例えば、Ｍ．Ａｓｌａｍ，Ｌ．Ｆｕ，Ｓ．Ｌｉ，およびＶ．Ｐ．Ｄｒａｖｉｄ，「Ｓｉｌｉｃａ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＦｅＰｔ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ２９０，Ｉｓｓｕｅ ２，２００５年１０月１５日，ｐｐ．４４４－４４９を参照されたい。このサイズの磁気標識は、永久的な磁気モーメントを有し、その方向は、非常に短い時間スケールでランダムに変動するため、以下にさらに説明するいくつかの実施形態は、磁気標識の存在によって引き起こされる磁場の変動を検出する高感度検知スキームに依拠する。
本明細書に記載の核酸配列決定方法は、開裂可能な磁気標識を含む磁気標識ヌクレオチド前駆体の使用に依拠する。これらの開裂可能な磁気標識は、例えば、磁性ナノ粒子、例えば分子、超常磁性ナノ粒子、または強磁性粒子を含むことができる。磁気標識は、高い磁気異方性を有するナノ粒子とすることができる。高い磁気異方性を有するナノ粒子の例は、Ｆｅ３Ｏ４、ＦｅＰｔ、ＦｅＰｄおよびＣｏＰｔを含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドへの化学的結合を促進するために、粒子が合成され、ＳｉＯ２によってコーティングされることができる。例えば、Ｍ．Ａｓｌａｍ，Ｌ．Ｆｕ，Ｓ．Ｌｉ，およびＶ．Ｐ．Ｄｒａｖｉｄ，「Ｓｉｌｉｃａ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＦｅＰｔ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ２９０，Ｉｓｓｕｅ ２，２００５年１０月１５日，ｐｐ．４４４－４４９を参照されたい。このサイズの磁気標識は、永久的な磁気モーメントを有し、その方向は、非常に短い時間スケールでランダムに変動するため、以下にさらに説明するいくつかの実施形態は、磁気標識の存在によって引き起こされる磁場の変動を検出する高感度検知スキームに依拠する。
【0042】
ヌクレオチド前駆体に磁気標識を結合させ、ヌクレオチド前駆体の組み込み後に磁気標識を開裂する方法はいくつかある。例えば、磁気標識は、塩基に結合されてもよく、その場合、化学的に開裂されてもよい。別の例として、磁気標識は、リン酸に結合されてもよく、その場合、それらはポリメラーゼによって開裂されてもよく、またはリンカーを介して結合されている場合、リンカーを開裂することによって開裂されてもよい。
【0043】
いくつかの実施形態では、磁気標識は、ヌクレオチド前駆体の窒素塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、または誘導体）に連結される。ヌクレオチド前駆体の組み込みおよび配列決定装置（例えば、以下にさらに詳細に説明するように）による検出の後、磁気標識は、組み込まれたヌクレオチドから開裂される。
【0044】
いくつかの実施形態では、磁気標識は、開裂可能なリンカーを介して結合される。開裂可能なリンカーは、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第７，０５７，０２６号明細書、米国特許第７，４１４，１１６号明細書、ならびにそれらの継続および改良に記載されている。いくつかの実施形態では、磁気標識は、アリル基またはアジド基を含むリンカーを介して、ピリミジンの５位またはプリンの７位に結合される。他の実施形態では、リンカーは、ジスルフィド、インドール、またはシーバー基を含む。リンカーは、アルキル（Ｃ１－６）またはアルコキシ（Ｃ１－６）、ニトロ、シアノ、フルオロ基または同様の特性を有する基から選択される１つ以上の置換基をさらに含有してもよい。簡潔に言えば、リンカーを、水溶性ホスフィンまたはホスフィンベースの遷移金属含有触媒によって開裂することができる。他のリンカーおよびリンカー開裂機構は、当該技術分野において公知である。例えば、トリチル、ｐ－アルコキシベンジルエステルおよびｐ－アルコキシベンジルアミドならびにｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基ならびにアセタール系を含むリンカーが、プロトン放出性開裂剤によって酸性条件下で開裂されることができる。チオアセタールまたは他の硫黄含有リンカーは、ニッケル、銀、または水銀などのチオフィリック金属を使用して開裂されることができる。適切なリンカー分子を調製するために、開裂保護基も考慮することができる。エステルおよびジスルフィド含有リンカーは、還元的条件下で開裂されることができる。トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）またはｔ－ブチルジメチルシラン（ＴＢＤＭＳ）を含有するリンカーは、Ｆイオンの存在下で開裂されることができる。反応混合物の他の構成要素に影響を及ぼさない波長によって開裂される光開裂可能なリンカーは、Ｏ－ニトロベンジル基を含むリンカーを含む。ベンジルオキシカルボニル基を含むリンカーは、Ｐｄ系の触媒によって開裂されることができる。
【0045】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド前駆体は、例えば、米国特許第７，４０５，２８１号明細書および米国特許第８，０５８，０３１号明細書に記載されているように、ポリリン酸部分に結合した標識を含む。簡潔に言えば、ヌクレオチド前駆体は、ヌクレオシド部分と、酸素原子の１つ以上が場合により、例えばＳによって置換されている３つ以上のリン酸基の鎖とを含む。標識は、α、β、γ以上のリン酸基（存在する場合）に直接またはリンカーを介して結合されることができる。いくつかの実施形態では、標識は、例えば、米国特許第８，２５２，９１０号明細書に記載されているように、非共有結合リンカーを介してリン酸基に結合している。いくつかの実施形態では、リンカーは、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリル、置換または非置換ヘテロアリル、置換または非置換シクロアルキル、および置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択される炭化水素である。例えば、米国特許第８，３６７，８１３号明細書を参照されたい。リンカーはまた、核酸鎖を含んでもよい。例えば、米国特許第９，４６４，１０７号明細書を参照されたい。
【0046】
磁気標識がリン酸基に連結されている実施形態では、ヌクレオチド前駆体は、検出可能な磁気標識も開裂して放出する核酸ポリメラーゼによって新生鎖に組み込まれる。いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第９，５８７，２７５号明細書に記載されているように、リンカーを開裂することによって磁気標識が除去される。
【0047】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド前駆体は、伸長不可能な「ターミネーター」ヌクレオチド、すなわち、ブロッキング「ターミネーター」基によって次のヌクレオチドの付加からブロックされた３’末端を有するヌクレオチドである。ブロッキング基は、本明細書に記載の鎖合成プロセスを継続するために除去されることができる可逆的ターミネーターである。除去可能なブロッキング基をヌクレオチド前駆体に結合させることは、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第７，５４１，４４４号明細書、米国特許第８，０７１，７３９号明細書、ならびにそれらの継続および改良を参照されたい。簡潔に言えば、ブロッキング基は、水溶液中でホスフィンまたは窒素－ホスフィン配位子の存在下で金属－アリル錯体と反応することによって開裂されることができるアリル基を含むことができる。合成による配列決定に使用される可逆的ターミネーターヌクレオチドの他の例は、２０１９年１２月１６日に出願され、国際公開第２０２０／１３１７５９号として２０２０年６月２５日に公開された「３’－ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６６６７０号に記載されている修飾ヌクレオチドを含み、これは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0048】
磁気センサ
本明細書に開示される実施形態は、例えば上記のように、ヌクレオチド前駆体に結合した磁気標識の存在を検出するために磁気センサを使用する。
本明細書に開示される実施形態は、例えば上記のように、ヌクレオチド前駆体に結合した磁気標識の存在を検出するために磁気センサを使用する。
【0049】
図１は、いくつかの実施形態にかかる磁気センサ１０５の一部を示している。図１の例示的な磁気センサ１０５は、下面１０８および上面１０９を有し、非磁性スペーサ層１０７によって分離された３つの層、例えば２つの強磁性層１０６Ａ、１０６Ｂを含む。非磁性スペーサ層１０７は、例えば、銅または銀などの金属材料であってもよく、その場合、構造はスピンバルブ（ＳＶ）と呼ばれ、または例えば、アルミナまたは酸化マグネシウムなどの絶縁体であってもよく、その場合、構造は磁気トンネル接合（ＭＴＪ）と呼ばれる。強磁性層１０６Ａ、１０６Ｂに使用するのに適した材料は、例えば、Ｃｏ、Ｎｉ、およびＦｅの合金（他の元素と混合されることもある）を含む。いくつかの実施形態では、強磁性層１０６Ａ、１０６Ｂは、それらの磁気モーメントがフィルムの平面内またはフィルムの平面に対して垂直に配向されるように設計される。界面平滑化、テクスチャリング、および装置１００をパターニングするために使用される処理からの保護などの目的を果たすために、図１に示す３つの層１０６Ａ、１０６Ｂ、および１０７の下方および上方の双方に追加の材料が堆積されることができるが、磁気センサ１０５の活性領域は、この三層構造にある。したがって、磁気センサ１０５と接触している構成要素は、３つの層１０６Ａ、１０６Ｂ、または１０７のうちの一方と接触していてもよく、または磁気センサ１０５の別の部分と接触していてもよい。
【0050】
図２Ａおよび図２Ｂに示すように、ＭＲセンサの抵抗は、１－ｃｏｓ（θ）に比例し、θは、図１に示す２つの強磁性層１０６Ａ、１０６Ｂのモーメント間の角度である。磁場によって生成される信号を最大化し、印加された磁場に対する磁気センサ１０５の線形応答を提供するために、磁気センサ１０５は、磁場の非存在下で２つの強磁性層１０６Ａ、１０６Ｂのモーメントが互いに対してπ／２または９０度に配向されるように設計されてもよい。この配向は、当該技術分野において公知の任意の数の方法によって達成されることができる。例えば、１つの解決策は、反強磁性体を使用して交換バイアスと呼ばれる効果によって強磁性層のうちの１つ（「ＦＭ１」と呼ばれる１０６Ａまたは１０６Ｂのいずれか）の磁化方向を「ピン留め」し、次いで絶縁層および永久磁石を有する二重層によってセンサをコーティングすることである。絶縁層は、磁気センサ１０５の電気的短絡を回避し、永久磁石は、ＦＭ１のピン止め方向に垂直な「ハードバイアス」磁場を供給し、その後、第２の強磁性体（「ＦＭ２」と呼ばれる１０６Ｂまたは１０６Ａのいずれか）を回転させ、所望の構成を生成する。次いで、ＦＭ１に平行な磁場は、ＦＭ２をこの９０度の構成の周りで回転させ、抵抗の変化は、磁気センサ１０５に作用する磁場を測定するために較正されることができる電圧信号をもたらす。このように、磁気センサ１０５は、磁場電圧変換器として機能する。
【0051】
直上で論じた例は、それらのモーメントが互いに対して９０度でフィルムの平面内に配向されている強磁性体の使用を説明したが、代替的に、垂直構成は、強磁性層１０６Ａ、１０６Ｂのうちの一方のモーメントをフィルムの平面外に配向することによって達成されることができ、これは、垂直磁気異方性（ＰＭＡ）と呼ばれるものを使用して達成されることができることに留意されたい。
【0052】
いくつかの実施形態では、磁気センサ１０５は、スピントランスファートルクとして知られる量子力学的効果を使用する。そのようなデバイスでは、ＳＶまたはＭＴＪ内の１つの強磁性層１０６Ａ（または１０６Ｂ）を通過する電流は、層のモーメントに平行なスピンを有する電子を優先的に透過させるが、スピン反平行を有する電子は反射される可能性が高い。このようにして、電流は、一方のスピンタイプの電子が他方よりも多くなるようにスピン分極される。次いで、このスピン分極電流は、第２の強磁性層１０６Ｂ（または１０６Ａ）と相互作用し、層のモーメントにトルクを及ぼす。このトルクは、異なる状況では、第２の強磁性層１０６Ｂ（または１０６Ａ）のモーメントを強磁性体に作用する有効磁場の周りで歳差運動させることができるか、またはモーメントを系内で誘導される一軸異方性によって定義される２つの向きの間で可逆的に切り替えさせることができる。得られたスピントルク発振子（ＳＴＯ）は、それらに作用する磁場を変化させることによって周波数調整可能である。したがって、それらは、ＳＴＯセンサを使用する概念を示す図３Ａに示すように、磁場対周波数（または位相）トランスデューサとして作用する能力を有する。図３Ｂは、１ＧＨｚの周波数および５ｍＴのピークツーピーク振幅を有するＡＣ磁場がＳＴＯにわたって印加されたときの遅延検出回路を通るＳＴＯの実験応答を示している。この結果ならびに短いナノ秒の磁場パルスについて図３Ｃおよび図３Ｄに示されている結果は、これらの発振器がナノスケールの磁場検出器としてどのように使用されることができるかを示している。さらなる詳細は、Ｔ．Ｎａｇａｓａｗａ，Ｈ．Ｓｕｔｏ，Ｋ．Ｋｕｄｏ，Ｔ．Ｙａｎｇ，Ｋ．Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，およびＲ．Ｓａｔｏ，「Ｄｅｌａｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｆｒｏｍ ａ ｓｐｉｎ－ｔｏｒｑｕｅ ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ ｕｎｄｅｒ ａ ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ－ｐｕｌｓｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｖｏｌ．ｌｌｌ，０７Ｃ９０８（２０１２）に見出すことができる。
【0053】
核酸配列決定装置
図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃは、いくつかの実施形態にかかる核酸配列決定のための装置１００の一部を示している。図４Ａは、装置の平面図である。図４Ｂは、図４Ａの「４Ｂ」とラベル付けされた一点鎖線の位置における断面図であり、図４Ｃは、図４Ａの「４Ｃ」とラベル付けされた一点鎖線の位置における断面図である。図４Ａに示すように、装置１００は、複数の磁気センサ１０５を含む磁気センサアレイ１１０を備え、アレイ１１０には１６個の磁気センサ１０５が示されている。図面を不明瞭にすることを避けるために、図４Ａでは、磁気センサ１０５のうちの７つ、すなわち磁気センサ１０５Ａ、１０５Ｂ、１０５Ｃ、１０５Ｄ、１０５Ｅ、１０５Ｆ、および１０５Ｇのみがラベル付けされている。（簡単にするために、この文書では、概して磁気センサを参照符号１０５によって参照している。個々の磁気センサには、参照符号１０５の後に文字が付されている。）装置１００はまた、少なくとも１つのライン１２０と、磁気センサ１０５の少なくともいくつかについて、これらの磁気センサ１０５のそれぞれについての結合領域１１５とを含み、これらは双方とも、以下にさらに詳細に説明される。
図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃは、いくつかの実施形態にかかる核酸配列決定のための装置１００の一部を示している。図４Ａは、装置の平面図である。図４Ｂは、図４Ａの「４Ｂ」とラベル付けされた一点鎖線の位置における断面図であり、図４Ｃは、図４Ａの「４Ｃ」とラベル付けされた一点鎖線の位置における断面図である。図４Ａに示すように、装置１００は、複数の磁気センサ１０５を含む磁気センサアレイ１１０を備え、アレイ１１０には１６個の磁気センサ１０５が示されている。図面を不明瞭にすることを避けるために、図４Ａでは、磁気センサ１０５のうちの７つ、すなわち磁気センサ１０５Ａ、１０５Ｂ、１０５Ｃ、１０５Ｄ、１０５Ｅ、１０５Ｆ、および１０５Ｇのみがラベル付けされている。（簡単にするために、この文書では、概して磁気センサを参照符号１０５によって参照している。個々の磁気センサには、参照符号１０５の後に文字が付されている。）装置１００はまた、少なくとも１つのライン１２０と、磁気センサ１０５の少なくともいくつかについて、これらの磁気センサ１０５のそれぞれについての結合領域１１５とを含み、これらは双方とも、以下にさらに詳細に説明される。
【0054】
磁気センサ１０５および磁気センサアレイ１１０内のライン１２０の一部は、装置１００の平面図では見えない可能性があることを示すために破線を使用して示されている。以下にさらに詳細に説明するように、磁気センサ１０５は、装置１００に埋め込まれ、結合領域１１５の内容物から保護される（例えば、絶縁体によって）。したがって、様々な図示された構成要素（例えば、ライン１２０、磁気センサ１０５など）は、装置１００の物理的インスタンス化（例えば、絶縁体などの保護材料に埋め込まれるか、または保護材料によって被覆されてもよい）では見えない可能性があることを理解されたい。
【0055】
いくつかの実施形態では、磁気センサアレイ１１０の磁気センサ１０５のそれぞれは、磁気抵抗（ＭＲ）効果を使用して、以下にさらに詳細に説明する関連する結合領域１１５内の磁気標識を検出する薄膜装置である。以下により詳細に説明するように、各磁気センサ１０５は、検知された磁場の強度および／または方向が変化するにつれて変化する抵抗を有するポテンショメータとして動作することができる。
【0056】
図４Ａの例示的な実施形態における例示的な磁気センサアレイ１１０は矩形アレイであり、磁気センサ１０５は、行および列に配置されている。すなわち、磁気センサアレイ１１０の複数の磁気センサ１０５は、矩形格子パターンで配置されている。図４Ａに示すような格子パターンの磁気センサ１０５の配置は、多くの可能な配置のうちの１つであることを理解されたい。磁気センサ１０５の他の配置も可能であり、本明細書の開示の範囲内であることが当業者には理解されよう。
【0057】
ここで図４Ａに関連して図４Ｂおよび図４Ｃを参照すると、装置１００の例示的な実施形態に示される各磁気センサ１０５は、円筒形状を有する。しかしながら、一般に、磁気センサ１０５は、任意の適切な形状を有することができることを理解されたい。例えば、磁気センサ１０５は、三次元の直方体であってもよい。さらに、異なる磁気センサ１０５は、異なる形状（例えば、一部は直方体であり、他の一部は円筒形などであってもよい）を有することができる。
【0058】
図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃの例示的な実施形態に示すように、結合領域１１５は、各磁気センサ１０５の上方に配置される。例えば、結合領域１１５Ａは、磁気センサ１０５Ａの上方にある。結着領域１１５Ｂは、磁気センサ１０５Ｂの上方にある。結合領域１１５Ｃは、磁気センサ１０５Ｃの上方にある。結合領域１１５Ｄは、磁気センサ１０５Ｄの上方にある。結合領域１１５Ｅは、磁気センサ１０５Ｅの上方にある。結合領域１１５Ｆは、磁気センサ１０５Ｆの上方にある。結着領域１１５Ｇは、磁気センサ１０５Ｇの上方にある。図４Ａに示す他のラベル付けされていない９つの磁気センサ１０５のそれぞれもまた、対応する結合領域１１５（図４Ａにおいてもラベル付けなし）の下方に配置される。
【0059】
結合領域１１５は、流体を保持する。磁気センサ１０５は、結合領域１１５内にある磁気標識（例えば、ナノ粒子）を検出することができる。したがって、いくつかの実施形態では、各結合領域１１５の表面１１６は、磁気センサ１０５が結合領域１１５内にある磁気標識を検出することを依然として可能にしながら、結合領域１１５内にあるいかなる流体からも磁気センサ１０５を保護する特性および特徴を有する。表面１１６（および場合によっては結合領域１１５の残りの部分）の材料は、絶縁体であってもよく、または絶縁体を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、表面１１６は、ポリプロピレン、金、ガラス、またはシリコンを含む。表面１１６は、磁気センサ１０５の上方に存在するライン１２０の上に配置された多層構造の露出面であってもよいことを理解されたい。例えば、表面１１６が導体（例えば、金）を含む実施形態では、絶縁材料の層が使用されて、磁気センサ１０５上のライン１２０から導体を分離することができる。（図４Ｂおよび図４Ｃを参照されたい。）表面１１６の厚さは、磁気センサ１０５が結合領域１１５内の磁気標識を検出することができるように、磁気センサ１０５が結合領域１１５からある距離にあるように選択されることができる。いくつかの実施形態では、表面１１６は、およそ３から２０ｎｍの厚さであるため、磁気センサ１０５の検出層（以下にさらに説明する）は、その対応する結合領域１１５内の磁気標識からおよそ５ｎｍからおよそ４０ｎｍの間にある。
【0060】
いくつかの実施形態では、結合領域１１５の表面１１６は、核酸を表面１１６に固定するように構成された構造（または複数の構造）を有する。例えば、構造（または複数の構造）は、空洞または隆起部を含むことができる。さらにまた、いくつかの実施形態では、表面１１６は、核酸の増幅を促進する特性を有する。例えば、装置１００は、ブリッジ増幅を促進して、各結合領域１１５内の単一核酸鎖のクローンクラスタの生成を促進することができる。
【0061】
図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃの例示的な実施形態に示す各結合領域１１５は、形状が直方体である（例えば、図４Ａに示すように、各結合領域１１５は、上面から見て正方形の形状を有し、断面で見て長方形である）が、結合領域１１５は、他の形状（例えば、円形、楕円形、八角形など）を有することができることを理解されたい。例えば、結合領域の形状は、磁気センサ１０５の形状と同様または同一とすることができる（例えば、磁気センサ１０５が三次元で円筒形である場合、結合領域１１５はまた、磁気センサ１０５の半径よりも大きく、小さく、または同じサイズとすることができる半径を有する円筒形とすることができる。磁気センサ１０５が三次元の直方体である場合、結合領域１１５はまた、磁気センサ１０５などの上部よりも大きい、小さい、または同じサイズの表面１１６を有する直方体とすることができる。）。さらに、異なる結合領域１１５および異なる表面１１６は、異なる形状（例えば、いくつかの表面１１６は円形とすることができ、いくつかは長方形とすることができ、いくつかは正方形とすることができるなど）を有することができる。さらに、図４Ｂおよび図４Ｃは、結合領域１１５が垂直な辺を有することを示しているが、辺が垂直である必要はない。一般に、結合領域１１５およびそれらの表面１１６は、磁気センサ１０５による結合領域１１５内の磁性ナノ粒子の検出を容易にする任意の形状および特性を有することができる。
【0062】
図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃに示す例示的な実施形態などのいくつかの実施形態では、複数の磁気センサ１０５のそれぞれは、少なくとも１つのライン１２０に結合される。（簡単にするために、この文書は、一般に、参照符号１２０によって行を参照する。個々の行には、参照符号１２０とそれに続く文字が与えられている。）図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃに示す例示的な実施形態では、磁気センサアレイ１１０の各磁気センサ１０５は、２つのライン１２０に結合される。例えば、磁気センサ１０５Ａは、ライン１２０Ａおよび１２０Ｈに結合される。磁気センサ１０５Ｂは、ライン１２０Ｂおよび１２０Ｈに結合される。磁気センサ１０５Ｃは、ライン１２０Ｃおよび１２０Ｈに結合される。磁気センサ１０５Ｄは、ライン１２０Ｄおよび１２０Ｈに結合される。磁気センサ１０５Ｅは、ライン１２０Ｄおよび１２０Ｅに結合される。磁気センサ１０５Ｆは、ライン１２０Ｄおよび１２０Ｆに結合される。磁気センサ１０５Ｇは、ライン１２０Ｄおよび１２０Ｇに結合される。図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃの例示的な実施形態では、ライン１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃ、および１２０Ｄは、磁気センサ１０５の下方に存在するように示されており、ライン１２０Ｅ、１２０Ｆ、１２０Ｇ、および１２０Ｈは、磁気センサ１０５の上方に存在するように示されている。
【0063】
図４Ｂは、ライン１２０Ｄおよび１２０Ｅに関連する磁気センサ１０５Ｅ、ライン１２０Ｄおよび１２０Ｆに関連する磁気センサ１０５Ｆ、ライン１２０Ｄおよび１２０Ｇに関連する磁気センサ１０５Ｇ、ならびにライン１２０Ｄおよび１２０Ｈに関連する磁気センサ１０５Ｄを示している。図４Ｃは、ライン１２０Ｄおよび１２０Ｈに関連する磁気センサ１０５Ｄ、ライン１２０Ｃおよび１２０Ｈに関連する磁気センサ１０５Ｃ、ライン１２０Ｂおよび１２０Ｈに関連する磁気センサ１０５Ｂ、ならびにライン１２０Ａおよび１２０Ｈに関連する磁気センサ１０５Ａを示している。
【0064】
図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃの例示的な実施形態におけるライン１２０のそれぞれは、磁気センサアレイ１１０の行または列を識別する。例えば、ライン１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃ、および１２０Ｄのそれぞれは、磁気センサアレイ１１０の異なる行を識別し、ライン１２０Ｅ、１２０Ｆ、１２０Ｇ、および１２０Ｈのそれぞれは、磁気センサアレイ１１０の異なる列を識別する。図４Ｂに示すように、ライン１２０Ｅ、１２０Ｆ、１２０Ｇ、１２０Ｈのそれぞれは、断面に沿って磁気センサ１０５のうちの１つと接触しており（すなわち、ライン１２０Ｅは、磁気センサ１０５Ｅの上部と接触しており、ライン１２０Ｆは、磁気センサ１０５Ｆの上部と接触しており、ライン１２０Ｇは、磁気センサ１０５Ｇの上部と接触しており、ライン１２０Ｈは、磁気センサ１０５Ｄの上部と接触している）、ライン１２０Ｄは、磁気センサ１０５Ｅ、１０５Ｆ、１０５Ｇ、１０５Ｄのそれぞれの下部と接触している。同様に、図４Ｃに示すように、ライン１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃ、１２０Ｄのそれぞれは、断面に沿って磁気センサ１０５のうちの１つの下部と接触しており（すなわち、ライン１２０Ａは、磁気センサ１０５Ａの下部と接触しており、ライン１２０Ｂは、磁気センサ１０５Ｂの下部と接触しており、ライン１２０Ｃは、磁気センサ１０５Ｃの下部と接触しており、ライン１２０Ｄは、磁気センサ１０５Ｄの下部と接触している）、ライン１２０Ｈは、磁気センサ１０５Ｄ、１０５Ｃ、１０５Ｂ、１０５Ａのそれぞれの上部と接触している。
【0065】
いくつかの実施形態では、結合領域１１５の一部または全部は、磁気センサ１０５を通過するライン１２０内のトレンチ内に存在する。例えば、図４Ｃに示すように、ライン１２０Ｈは、磁気センサ１０５の間よりも磁気センサ１０５の上の方が細い。例えば、ライン１２０Ｈは、磁気センサ１０５Ｄの上方の第１の厚さ、磁気センサ１０５Ｄと１０５Ｃとの間の第２のより大きい厚さ、および磁気センサ１０５Ｃの上方の第１の厚さを有する。
【0066】
説明を簡単にするために、図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃは、磁気センサアレイ１１０内に１６個のみの磁気センサ１０５、１６個のみの対応する結合領域１１５、および８本のライン１２０を有する例示的な装置１００を示している。装置１００は、磁気センサアレイ１１０内のより少ないまたはより多くの磁気センサ１０５を有することができ、より多いまたはより少ない結合領域１１５を有することができ、より多いまたはより少ないライン１２０を有することができることを理解されたい。一般に、磁気センサ１０５が結合領域１１５内の磁気標識を検出することを可能にする磁気センサ１０５および結合領域１１５の任意の構成が使用されることができる。同様に、磁気センサ１０５が１つ以上の磁気標識を検知したかどうかの決定を可能にする１つ以上のライン１２０の任意の構成が使用されることができる。
【0067】
図４Ｄは、いくつかの実施形態にかかる装置１００の構成要素を示すブロック図である。図示のように、装置１００は、ライン１２０によって検知回路１３０に結合された磁気センサアレイ１１０を含む。動作中、検知回路１３０は、ライン１２０に電流を印加して、磁気センサアレイ１１０内の複数の磁気センサ１０５のうちの少なくとも１つの特性を検出することができ、特性は、結合領域１１５内の磁気標識ヌクレオチド前駆体の存在または非存在を示す。例えば、いくつかの実施形態では、特性は、磁場もしくは抵抗、または磁場の変化もしくは抵抗の変化である。いくつかの実施形態では、特性は、ノイズレベルである。いくつかの実施形態では、磁気センサは、磁気発振器を備え、特性は、磁気発振器に関連する信号の周波数または磁気発振器によって発生される信号の周波数である。
【0068】
いくつかの実施形態では、検知回路１３０は、磁気センサアレイ１１０内の磁気センサ１０５の一部または全部の磁気環境の偏差または変動を検出する。例えば、磁気標識の非存在下におけるＭＲ型の磁気センサ１０５は、磁気標識からの磁場変動が検知強磁性体のモーメントの変動を引き起こすため、磁気標識の存在下における磁気センサ１０５と比較して、特定の周波数を超える比較的小さいノイズを有するべきである。これらの変動は、ヘテロダイン検出（例えば、雑音電力密度を測定することによって）を使用して、または磁気センサ１０５の電圧を直接測定することによって測定されることができ、結合領域１１５を検知しないダミーセンサ素子と比較するためにコンパレータ回路を使用して評価されることができる。磁気センサ１０５がＳＴＯ素子を含む場合、磁気標識からの変動磁場は、周波数の瞬間的な変化に起因して磁気センサの位相のジャンプを引き起こし、これは位相検出回路を使用して検出されることができる。別の選択肢は、磁気標識の存在が振動をオフにするように、ＳＴＯが小さい磁場範囲内でのみ振動するようにそれを設計することである。上記で提供された例は、単なる例示であることを理解されたい。他の検出方法も考えられ、本開示の範囲内である。
【0069】
いくつかの実施形態では、磁気センサアレイ１１０は、隣接する要素を通過して磁気センサアレイ１１０の性能を低下させる可能性がある「スニーク」電流の可能性を低減するセレクタ要素を含む。図５Ａおよび図５Ｂは、いくつかの実施形態にかかる２つの手法を示している。図５Ａでは、ＣＭＯＳトランジスタは、磁気センサ１０５と直列に結合されている。図５Ａに示される構成についてのより詳細については、Ｂ．Ｎ．Ｅｎｇｅｌ，Ｊ．Aｋｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｒ．Ｗ．Ｄａｖｅ，Ｍ．ＤｅＨｅｒｒｅｒａ，Ｍ．Ｄｕｒｌａｍ，Ｇ．Ｇｒｙｎｋｅｗｉｃｈ，Ｊ．Ｊａｎｅｓｋｙ，Ｓ．Ｖ．Ｐｉｅｔａｍｂａｒａｍ，Ｎ．Ｄ．Ｒｉｚｚｏ，Ｊ．Ｍ．Ｓｌａｕｇｈｔｅｒ，Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｊ．Ｓｕｎ，およびＳ．Ｔｅｈｒａｎｉ，「Ａ ４－Ｍｂ Ｔｏｇｇｌｅ ＭＲＡＭ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｔ ａｎｄ Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ」，ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．４１，１３２（２００５）を参照されたい。
【0070】
図５Ｂでは、ダイオードまたはダイオード様素子が磁性膜とともに堆積され、次いで「クロスポイント」アーキテクチャに配置され、磁気センサアレイ１１０の周辺のＣＭＯＳトランジスタが個々のライン１２０（例えば、ワードラインおよびビットライン）をオンにして、アレイ内の個々の磁気センサ１０５をアドレス指定する。ＣＭＯＳ選択トランジスタの使用は、フロントエンド（例えば、ＣＭＯＳトランジスタおよび下層の回路を構築するための全てのナノ加工）を製造するために利用可能なファウンドリの普及のためにより単純とすることができるが、動作に必要な電流のタイプは、最終的に磁気センサアレイ１１０に必要な密度に到達するためにクロスポイント設計を必要とすることがある。図５Ｂに示される構成に関するさらなる詳細は、Ｃ．Ｃｈａｐｐｅｒｔ，Ａ．Ｆｅｒｔ，およびＦ．Ｎ．Ｖａｎ Ｄａｕｌ，「Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｓｐｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ｉｎ ｄａｔａ ｓｔｏｒａｇｅ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｏｌ．６，８１３（２００７）に見出すことができる。
【0071】
いくつかの実施形態では、装置１００の使用は、例えば、ブリッジ増幅（以下にさらに説明する）を使用するなど、核酸の増幅を可能にする。以下により詳細に説明するような増幅手順によって作成されたクローンクラスタ内の個々の鎖間の距離は、磁気センサアレイ１１０内の磁気センサ１０５のサイズおよび密度を選択するために推定されることができる。例えば、距離を推定するために、多くの核酸配列決定用途の平均鎖長が２００ＢＰであり、二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡより柔軟性が低く、したがって上限を提供するため、選択された２００塩基対（ＢＰ）二本鎖ＤＮＡの輪郭長（例えば、ＤＮＡの直線化された鎖の長さ）と持続長（例えば、ブリッジ増幅手順中に屈曲した後の鎖の平均長さ）の双方を考慮することができる。平均輪郭長は、約６５ｎｍであり、持続長は、およそ３５ｎｍである（例えば、Ｓ．Ｂｒｉｎｋｅｒｓら，「Ｔｈｅ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ｄａｒｋ ｆｉｅｌｄ ｔｅｔｈｅｒｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｍｏｔｉｏｎ」，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．（２００９）１３０：２１５１０５）。ＤＮＡは、ブリッジ増幅プロセス中に屈曲するため、増幅されたクローン間の平均距離は、輪郭長と持続長との間のどこかでなければならない。したがって、その距離は、およそ４０ｎｍと推定されることができる。信号対雑音比（ＳＮＲ）の観点から、元々結合された各標的鎖を配列決定するために数十から数百のコピー鎖を有することが望ましい場合があると仮定すると、磁気センサ１０５は、例えば、およそ１０ｎｍからおよそ１μｍ程度の寸法を有することができる。配列決定は、蛍光ではなく磁性ナノ粒子を使用するため、隣接する磁気センサ１０５間の間隔は、回折効果によって制限される光学系に必要な間隔よりもはるかに小さくすることができることを理解されたい。例えば、本明細書に開示される装置１００の実施形態では、隣接する磁気センサ１０５は、およそ２０ｎｍからおよそ３０ｎｍ離れていてもよい。
【0072】
配列決定装置の製造方法
いくつかの実施形態では、装置１００は、フォトリソグラフィプロセスおよび薄膜堆積を使用して製造される。
いくつかの実施形態では、装置１００は、フォトリソグラフィプロセスおよび薄膜堆積を使用して製造される。
【0073】
図６は、いくつかの実施形態にかかる装置１００を製造する方法１５０を示している。１５２において、本方法が開始する。１５４において、例えば、基板上に金属層を堆積させ、金属層を少なくとも１つのライン１２０にパターニングすることによって、基板上に少なくとも１つのライン１２０（例えば、第１のライン１２０）が製造される。金属層は、例えば、物理蒸着（ＰＶＤ）またはイオンビーム蒸着（ＩＢＤ）を使用して堆積されることができる。少なくとも１つのライン１２０内に金属層をパターニングすることは、フォトリソグラフィ、フライス加工、および／またはエッチングを使用して達成されることができる。
【0074】
任意に、１５６において、少なくとも１つのライン１２０上に絶縁材料が堆積されることができ、次いで、任意に、１５８において、少なくとも１つのライン１２０が露出されることができる。例えば、少なくとも１つのライン１２０は、化学機械研磨（ＣＭＰ）を使用して露出されることができる。
【0075】
１６０において、複数の磁気センサ１０５（例えば、磁気センサアレイ１１０）が少なくとも１つのライン１２０上に製造される。複数の磁気センサ１０５は、例えば、少なくとも１つのライン１２０上に複数の層を堆積し、次いで複数の層をパターニングして複数の磁気センサ１０５を形成することによって製造されることができる。複数の層は、任意の適切な技術を使用して堆積されてもよい。例えば、複数の層は、第１の強磁性層（例えば、図１に示す層１０６Ｂ）を堆積し、第１の強磁性層上に金属または絶縁体層（例えば、図１に示す層１０７）を堆積し、金属または絶縁体層上に第２の強磁性層（例えば、図１に示す層１０６Ａ）を堆積することによって堆積されてもよい。複数の層をパターニングして複数の磁気センサ１０５を形成することは、例えばフォトリソグラフィまたはエッチングなどの任意の適切な技術を使用して達成されることができる。
【0076】
いくつかの実施形態では、磁気センサアレイ１１０の各磁気センサ１０５は、下面１０８および上面１０９を有する。（例えば、図１を参照されたい。）下面１０８は、少なくとも１つのライン１２０のうちの一方に結合される（例えば、下面１０８は、第１のライン１２０に結合される）。いくつかの実施形態では、各磁気センサ１０５の下面１０８は、少なくとも１つのライン１２０のうちの１つ（例えば、第１のライン１２０）と接触している。
【0077】
いくつかの実施形態では、複数の磁気センサ１０５のそれぞれは、所定の形状を有し、これは複数の磁気センサ１０５の全ての磁気センサ１０５について同じであってもよく、または２つ以上の磁気センサ１０５について異なっていてもよい。所定の形状は、例えば、実質的に円筒形または実質的に直方体を含む任意の適切な形状であってもよい。複数の磁気センサ１０５のそれぞれの横方向寸法は、例えば、およそ１０ｎｍからおよそ１μｍであってもよい。本明細書で使用される場合、「横方向寸法」という用語は、例えば装置１００を上面から見たときの、図４Ａに示されるｘ－ｙ平面内の寸法を意味する。例えば、磁気センサ１０５が円筒形である場合、横方向寸法は、円筒の上面１０９の直径である。別の例として、磁気センサ１０５が直方体である場合、その横方向寸法は、その上面の寸法（例えば、その上面１０９の長さ、幅、または対角寸法）を含む。
【0078】
再び図６の方法実施形態を参照すると、１６２において、絶縁材料（例えば、誘電材料）が、磁気センサアレイ１１０の磁気センサ１０５の間に堆積される。絶縁材料は、例えば、酸化物または窒化物などの任意の適切な材料であってもよい。例えば、絶縁材料は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、または窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）を含んでもよい。
【0079】
任意に、１６４において、化学機械研磨ステップが実行されて、複数の磁気センサ１０５のそれぞれの上面１０９を露出させることができる。
【0080】
１６６において、少なくとも１つの追加のライン１２０が、任意の適切な技術を使用して製造される。例えば、少なくとも１つの追加のライン１２０は、金属の層を堆積させ、フォトリソグラフィを実行して少なくとも１つの追加のライン１２０を画定し、金属の層の一部を除去し、それによって少なくとも１つの追加のライン１２０を残すことによって製造されることができる。
【0081】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加のライン１２０のそれぞれは、磁気センサアレイ１１０内の少なくとも１つの磁気センサ１０５の上面１０９に結合される。いくつかの実施形態では、各磁気センサ１０５の上面１０９は、同じライン１２０と接触している。いくつかの実施形態では、磁気センサ１０５の下面１０８は、第１のライン１２０Ａと接触しており、磁気センサ１０５の上面１０９は、第２のライン１２０Ｂと接触している。
【0082】
いくつかの実施形態では、複数の磁気センサ１０５は、矩形磁気センサアレイ１１０内にある。そのような実施形態では、少なくとも１つのライン１２０（例えば、第１のラインまたは下部ライン１２０）は、矩形アレイの１つ以上の行に対応することができ、少なくとも１つの追加のライン１２０（例えば、第２のラインまたは第１のライン１２０）は、矩形アレイの１つ以上の列に対応することができ、その逆も可能である。
【0083】
１６８において、任意の適切な技術を使用して複数の結合領域１１５が形成される。例えば、複数の結合領域１１５は、複数の結合領域１１５に対応する領域上にマスクを適用し、マスク上に金属層を堆積し、マスクを持ち上げることによって形成されることができる。例えば、フォトリソグラフィが実行されて、磁気センサ１０５の直上を除いて、上部ライン１２０と重なるポリマーの窓を有するマスクを画定することができる。その後、磁気センサ１０５から離れるように上部ライン１２０を厚くするために後続の金属堆積および持ち上げが実行されることができ、これは、各磁気センサ１０５の上方に浅いトレンチを形成し、上部ライン１２０の抵抗を低減してノイズ性能を改善する。これらの浅いトレンチは、結合領域１１５を画定することができる。
【0084】
したがって、いくつかの実施形態では、複数の結合領域１１５は、磁気センサ１０５の上部に対応する位置において上部ライン１２０にトレンチを作製し、次いでトレンチ上に絶縁材料を堆積させることによって形成される。例えば、複数の磁気センサ１０５が矩形アレイ１１０に配置され、いくつかのライン１２０（下部ライン１２０）が磁気センサ１０５の下方にあり、他のライン１２０（上部ライン１２０）が磁気センサ１０５の上方にある実施形態では、トレンチは、上部ライン１２０のそれぞれにおいて、それらが磁気センサ１０５を通過する位置においてエッチングされてもよい。次いで、結合領域１１５は、磁気センサ１０５の上方のトレンチによって画定される（例えば、図４Ｃに示すように）。
【0085】
いくつかの実施形態では、結合領域１１５を形成した後（例えば、上述したマスクを持ち上げた後および／またはトレンチを形成した後）、追加の絶縁材料（例えば、ＳｉＯ２などの酸化物または窒化物）の薄層が、（例えば、原子層堆積を使用して）複数の追加のライン１２０および複数の結合領域１１５上に堆積される。追加の絶縁材料の厚さは、例えば、およそ３ｎｍからおよそ２０ｎｍであってもよい。磁気センサ１０５を結合領域１１５内の磁気標識から電気的に絶縁し、結合領域１１５に追加されると予想される流体から磁気センサ１０５を保護する任意の適切な絶縁材料が、この目的のために使用されることができる。例えば、追加の絶縁材料は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、酸化アルミニウム（ＡｌＯｘ）、または窒化ケイ素（ＳｉＮ）などを含むことができる。
【0086】
１７０において、本方法１５０は終了する。
【0087】
配列決定方法
いくつかの実施形態では、核酸は、磁気センサアレイ１１０の磁気センサ１０５の近くで装置１００にテザリングされた固定化核酸鎖（潜在的にクローンクラスタ内）を使用して配列決定される。次いで、４種類の可逆的ターミネーター塩基（ＲＴ塩基）を一緒にまたは一度に１つずつ加えてもよく、組み込まれていないヌクレオチドが洗い流される。次いで、磁気標識は、次の配列決定サイクルが始まる前に、末端３’ブロッカーとともに核酸鎖から化学的に除去されることができる。
いくつかの実施形態では、核酸は、磁気センサアレイ１１０の磁気センサ１０５の近くで装置１００にテザリングされた固定化核酸鎖（潜在的にクローンクラスタ内）を使用して配列決定される。次いで、４種類の可逆的ターミネーター塩基（ＲＴ塩基）を一緒にまたは一度に１つずつ加えてもよく、組み込まれていないヌクレオチドが洗い流される。次いで、磁気標識は、次の配列決定サイクルが始まる前に、末端３’ブロッカーとともに核酸鎖から化学的に除去されることができる。
【0088】
核酸鎖は、任意の適切な方法で調製されることができる。例えば、核酸鎖は、核酸試料のランダム断片化、その後の５’および３’アダプタライゲーションによって調製されることができる。次いで、核酸のこれらの鎖は、結合領域１１５の少なくともいくつかの表面１１６に結合または付着したオリゴ上に捕捉されることができる。配列決定の前に鎖を増幅するために、ブリッジ増幅を含む線形または指数関数的増幅が使用されることができる。
【0089】
ブリッジ増幅および他の増幅技術は、当該技術分野において周知であり、いくつかの実施形態にかかる装置１００とともに使用されることができる。ブリッジ増幅を開始するために、例えばヒドロゲル中に固定化されたアダプタ鎖を使用して、配列決定される核酸が基材に結合されることができる。次いで、ポリメラーゼ、プライマー、およびヌクレオチド前駆体が結合領域１１５に導入されて、一本鎖標的鎖から二本鎖核酸を形成することができる。次に、二本鎖が変性され、それにより、両面核酸鎖を互いに相補的である２つの一本鎖に分離する。ブリッジ形成は、一本鎖を折り畳んで、図示のように基材上に固定化された相補的なアダプタ鎖に結合させる化学反応を含む。再び、ポリメラーゼ、プライマー、およびヌクレオチド前駆体が結合領域１１５に導入されて、個々の一本鎖「ブリッジ」を両側鎖に変換する。このステップに続いて、二本鎖が変性されて相補的な一本鎖を生成し、一方は元の「順方向」鎖であり、他方はコピーされた「逆方向」鎖である。これらのステップを何度も繰り返した後、クローンクラスタが正コピーおよび逆コピーの双方で形成される。次いで、２つのクラスタのうちの一方（例えば、逆鎖）は、残りのクラスタを配列決定する前に（例えば、前鎖）結合領域１１５から開裂されることができる。
【0090】
核酸配列決定のための装置１００に関連する増幅手順の使用は、配列決定プロセスのＳＮＲを改善し、それによって配列決定の精度を改善することができる。ＳＮＲの改善は、結合領域１１５内に配列決定される同じ核酸鎖の多数のコピーの存在が、より多数の磁気標識ヌクレオチド前駆体を結合領域１１５内に組み込むことを可能にするために生じる。多数の磁気標識ヌクレオチド前駆体の組み込みは、その結合領域１１５に関連する磁気センサ１０５が結合領域１１５内の磁気標識の存在を検出する可能性を高める。したがって、配列決定される鎖のより多くのコピーを有することは、磁気センサ１０５が磁気的に標識されたヌクレオチド前駆体の取り込みを逃し、それによって配列決定エラーを引き起こす可能性を低減する。
【0091】
核酸鎖を配列決定するために、以下に記載されるように、磁気標識ヌクレオチド前駆体を一度に１つずつまたは一度に全て導入されることができる。
【0092】
いくつかの実施形態では、磁気標識ヌクレオチド前駆体は、一度に１つずつ導入される。そのような実施形態では、全てのヌクレオチド前駆体に対して同じ磁気標識が使用されることができる。本明細書で使用される場合、「同じ磁気標識」という語句は、単一の磁気標識の同じ物理的インスタンスを指すものではないことを理解されたい（すなわち、物理標識の特定のインスタンスが再使用されることを意味するものではない）。代わりに、それは、磁気標識の複数の物理的インスタンス化を指し、それらの全ては、それらの個々のインスタンスを互いに区別することができないようにする同一の特徴または特性を有する。対照的に、「異なる磁気標識」という語句は、個別にまたは群としてにかかわらず、個別にまたは群として、他の磁気標識と区別されることを可能にする異なる特徴または特性を有する磁気標識を指す。
【0093】
いくつかの実施形態では、核酸鎖は一度に一ヌクレオチドずつ伸長され、磁気センサアレイ１１０は、結合された磁気標識ヌクレオチド前駆体を識別するために使用される。
【0094】
図７は、いくつかの実施形態にかかる、核酸配列決定のために、装置１００、または磁気センサを使用して磁気標識の存在または非存在を検知する別の装置を使用する方法２００を示すフローチャートである。２０２において、本方法が開始する。２０４において、上述したように、配列決定装置１００の１つ以上の結合領域１１５の表面１１６に、１つ以上の核酸鎖が結合される。表面１１６に１本以上の核酸鎖を結合させる方法はいくつかある。例えば、核酸鎖は、核酸鎖の末端にアダプタを結合し、オリゴヌクレオチドを結合領域１１５の表面１１６に結合することによって表面１１６に結合されることができ、オリゴヌクレオチドはアダプタに相補的である。別の例として、核酸鎖は、核酸鎖を表面１１６に共有結合することによって表面１１６に結合されることができる。さらに別の例として、核酸鎖は、分子間の不可逆的な受動吸着または親和性を介して核酸鎖を固定化することによって表面１１６に結合されてもよい。いくつかの実施形態では、表面１１６は、上述したように空洞または隆起部を備え、核酸鎖を近位壁に結合させることは、ヒドロゲルを空洞または隆起部に適用することを含む。
【0095】
任意のステップ２０６において、核酸鎖は、任意の適切な方法を使用して、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または線形増幅を活用することなどによって増幅されることができる。
【0096】
２０８において、伸長可能なプライマーが結合領域１１５に添加される。
【0097】
２１０において、核酸ポリメラーゼが結合領域１１５に添加される。核酸ポリメラーゼは、任意の適切な核酸ポリメラーゼとすることができる。核酸配列決定に使用される核酸ポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼなど）の所望の特性は、以下のうちの１つ以上を含む：核酸テンプレートおよびヌクレオチド前駆体についての速い会合速度、または核酸テンプレートおよびヌクレオチド前駆体についての遅い解離速度（会合および解離速度は、定義された一連の反応条件下での核酸ポリメラーゼの速度論的特徴である）；低いもしくは検出不能な３’－５’エキソヌクレアーゼ（校正）活性または低いもしくは検出不能な５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を含む、高忠実度、低いもしくは検出不能なエキソヌクレアーゼ活性；有効なＤＮＡ鎖置換、高い安定性、高い加工性（長いリード長を含む）、耐塩性および本明細書に記載の前駆体を含む修飾ヌクレオチド前駆体を組み込む能力。
【0098】
適切なポリメラーゼのいくつかの例は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＢファミリー（Ｂ型）ポリメラーゼを含む。
【0099】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼである。熱安定性核酸ポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．Ｚ０５ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａポリメラーゼ、例えばＴＭＡ－２５およびＴＭＡ－３０ポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ Ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶｅｎｔ）などを含む。
【0100】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、検出可能な５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。５’から３’ヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼの例は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片；Ｎ末端２３５アミノ酸を欠くＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）（「Ｓｔｏｆｆｅｌ断片」）を含む。米国特許第５，６１６，４９４号明細書を参照のこと。他の例は、５’－３’ヌクレアーゼ活性を担うドメインを排除または不活性化するのに十分な欠失（例えば、Ｎ末端欠失）、変異または修飾を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む。例えば、米国特許第５，７９５，７６２号明細書を参照されたい。
【0101】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、検出可能な３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｔａｑポリメラーゼおよびその誘導体、ならびに校正ドメインの天然に存在するまたは操作された欠失を有する任意のＢファミリー（Ｂ型）ポリメラーゼを含む。
【0102】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、３’－修飾ヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体の取込みを可能にするかまたは増強するように修飾または操作されている；例えば、米国特許第１０，１５０，４５４号明細書、米国特許第９，６７７，０５７号明細書、および米国特許第９，２７３，３５２号明細書を参照されたい。
【0103】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、５’－リン酸修飾ヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体の取り込みを可能にするかまたは増強するように修飾または操作されている；例えば、米国特許第１０，１６７，４５５号明細書および米国特許第８，９９９，６７６号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態では、そのようなポリメラーゼは、ｐｈｉ２９由来ポリメラーゼである；例えば、米国特許第８，２５７，９５４号明細書および米国特許第８，４２０，３６６号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態では、そのようなポリメラーゼは、ｐｈｉＣＰＶ４由来のポリメラーゼである；例えば、米国特許出願公開第２０１８０２４５１４７号明細書を参照されたい。
【0104】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、所望の修飾ヌクレオチドを首尾よく取り込むために、または所望の精度および加工性でヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を取り込むために選択によって修飾または操作される。そのような修飾ポリメラーゼを選択する方法は、当該技術分野において公知である；例えば、「Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」と題する米国特許出願公開第２０１８０３１２９０４号明細書を参照されたい。
【0105】
ステップ２０８および２１０は、組み合わされてもよく、またはそれらの順序が逆であってもよいことを理解されたい。
【0106】
場合により、ステップ２１４において磁気標識ヌクレオチド前駆体を添加する前に、２１２において結合領域１１５が洗浄されてもよい。
【0107】
２２８において、磁気標識ヌクレオチド前駆体が配列決定サイクルのために選択される。いくつかの実施形態では、磁気標識ヌクレオチド前駆体は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはそれらの等価物から選択される。いくつかの実施形態では、磁気標識ヌクレオチド前駆体は、磁気標識ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、または等価物のうちの１つを含む。磁気標識ヌクレオチド前駆体は、従来の、天然の、非従来の、または類似のヌクレオチドで標識されることができる。ヌクレオチド前駆体に言及する場合の「従来の」または「天然の」という用語は、天然に存在するもの（すなわち、ＤＮＡの場合、これらはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰである）を指す。ヌクレオチド前駆体に言及する場合の「非従来の」または「類似の」という用語は、ヌクレオチド前駆体中の従来の塩基、糖部分、またはヌクレオチド間結合の修飾または類似体を含む。例えば、ｄＩＴＰ、７－デアザ－ｄＧＴＰ、７－デアザ－ｄＡＴＰ、アルキル－ピリミジンヌクレオチド（プロピニルｄＵＴＰを含む）は、非従来の塩基を有するヌクレオチドの例である。いくつかの非従来の糖修飾は、２’位における修飾を含む。例えば、２’－ＯＨ（すなわち、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）を有するリボヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼにとって従来にないヌクレオチドである。他の糖類似体および修飾は、Ｄ－リボシル、２’または３’Ｄ－デオキシリボシル、２’，３’－Ｄ－ジデオキシリボシル、２’，３’－ジデヒドロジデオキシリボシル、２’または３’アルコキシリボシル、２’または３’アミノリボシル、２’または３’メルカプトリボシル、２’または３’アルコキシリボシル、非環式、炭素環式または他の修飾された糖部分を含む。さらなる例は、ターミネーターヌクレオチドである２’－ＰＯ４類似体を含む。（例えば、米国特許第７，９４７，８１７号明細書または本明細書に記載の他の実施例を参照されたい）。非従来の連結ヌクレオチドは、ホスホロチオエートｄＮＴＰ（［α－Ｓ］ｄＮＴＰ）、５’－［α－ボラノ］－ｄＮＴＰおよび［α］－メチル－ホスホネートｄＮＴＰを含む。
【0108】
２１４において、選択された磁気標識ヌクレオチド前駆体が結合領域１１５に添加される。
【0109】
２１６において、選択された磁気標識ヌクレオチド前駆体がポリメラーゼに結合しているか、または伸長可能プライマーに組み込まれているかを決定するために配列決定が行われる。配列決定ステップ２１６は、図７に示すように、複数のサブステップを含むことができる。例えば、サブステップ２１８において、装置１００の１つ以上のライン１２０は、磁気センサアレイ１１０の磁気センサ１０５の特性を検出するために使用される。上述したように、特性は、例えば、抵抗、抵抗の変化、磁界、磁界の変化、周波数、周波数の変化、またはノイズであってもよい。
【0110】
決定点２２０において、検出結果が、磁気標識ヌクレオチド前駆体がポリメラーゼに結合したこと、または伸長可能プライマーに組み込まれたことを示すかどうかが決定される。例えば、決定は、特性の存在または非存在に基づいてもよく、例えば、特性が検出された場合、磁気標識ヌクレオチド前駆体は、ポリメラーゼに結合しているか、または伸長可能プライマーに組み込まれているとみなされ、特性が検出されない場合、磁気標識ヌクレオチド前駆体は、ポリメラーゼに結合していないか、または伸長可能プライマーに組み込まれているとみなされる。別の例として、決定は、特徴の大きさまたは値に基づいてもよく、例えば、大きさまたは値が指定された範囲内にある場合、磁気標識ヌクレオチド前駆体は、ポリメラーゼに結合しているかまたは伸長可能プライマーに組み込まれているとみなされ、大きさまたは値が指定された範囲内にない場合、磁気標識ヌクレオチド前駆体は、ポリメラーゼに結合していないかまたは伸長可能プライマーに組み込まれているとみなされる。
【0111】
検出（サブステップ２１８）および決定（決定点２２０）は、磁気センサアレイ１１０内の磁気センサ１０５の全てまたは全てよりも少ないものを使用するかまたは依拠することができる。特性が存在するか否か、または特性の値（決定点２２０）の決定は、磁気センサアレイ１１０内の磁気センサ１０５の一部または全てからの検出結果（サブステップ２１８）を集約、平均化、または処理することに基づくことができる。
【0112】
決定点２２０において、磁気標識ヌクレオチド前駆体がポリメラーゼに結合した、または伸長可能プライマーに組み込まれたと決定された場合、ステップ２２２において、磁気標識ヌクレオチド前駆体の相補的塩基の表示が核酸鎖の核酸配列の記録に記録される。
【0113】
いくつかの実施形態では、磁気標識ヌクレオチド前駆体は、核酸ポリメラーゼによって伸長不可能であり、したがって、特性を検出した後、磁気標識ヌクレオチド前駆体を核酸ポリメラーゼによって伸長可能にするために磁気標識が除去されなければならない。いくつかの実施形態では、第１の磁気標識ヌクレオチド前駆体の部分は、核酸ポリメラーゼによって伸長可能ではなく、第１の磁気標識ヌクレオチド前駆体の部分は、化学的開裂によって伸長可能にされる。図７に示すように、追加の配列決定サイクルが実行される場合（決定点２２４の「いいえ」経路）、磁気標識は、２２６において、任意の適切な手段（例えば、化学的に、酵素的に、または他の手段によって）を使用して除去される。
【0114】
２２６において磁気標識が除去された後、２２８において別の磁気標識ヌクレオチド前駆体が選択される。次いで、完了したばかりのサイクルで使用されたものと同じであっても異なっていてもよい新たに選択された磁気標識ヌクレオチド前駆体は、ステップ２１４において結合領域１１５に添加され、配列決定ステップ２１６が再び実行されて、新たに選択された磁気標識ヌクレオチド前駆体がポリメラーゼに結合しているか、伸長可能なプライマーに組み込まれているかが決定される。
【0115】
決定点２２０において、磁気標識ヌクレオチド前駆体がポリメラーゼに結合しておらず、伸長可能プライマーに組み込まれていないと決定された場合、本方法は、ステップ２２８に進み、そこで別の磁気標識ヌクレオチド前駆体が選択される。この場合、以前に試行された磁気標識ヌクレオチド前駆体は一致しなかったため、選択された磁気標識ヌクレオチド前駆体は、完了したばかりのサイクルで使用されたものとは異なるべきである。
【0116】
図７は、ステップ２１０と２１４との間に行われる単一の任意の洗浄ステップ２１２を示しているが、追加の洗浄ステップが本方法に含まれてもよいことを理解されたい。例えば、結合領域１１５は、ステップ２２８と２１４との間またはステップ２２６の後に洗浄されてもよい（例えば、先に導入された磁気標識ヌクレオチド前駆体およびステップ２２６において除去された任意の磁気標識を実質的に除去するために）。２３０において、本方法２００は終了する。
【0117】
いくつかの配列決定サイクルの後、ポリメラーゼを補充するために、ステップ２１０を実行して核酸ポリメラーゼのさらなる分子を結合領域１１５に付加することが望ましいかまたは必要であり得ることを理解されたい。
【0118】
上述した図７は、磁気標識ヌクレオチド前駆体が一度に１つずつ導入される実施形態を示している。他の実施形態では、複数のヌクレオチド前駆体（例えば、２個、３個または４個のヌクレオチド前駆体）が実質的に同時に導入される。そのような実施形態では、実質的に同時に導入される異なるヌクレオチド前駆体に対して異なる磁気標識が使用される。導入された前駆体の磁気標識のそれぞれは、磁気センサ１０５が、実質的に同時に導入される異なるヌクレオチド前駆体に使用される異なる磁気標識を区別することを可能にする異なる磁気特性を有する。
【0119】
図８は、複数のヌクレオチド前駆体を装置１００または検出のために磁気センサおよび磁気標識を使用する別の装置に実質的に同時に導入される方法２５０の実施形態を示している。例示目的のために、図８は、実質的に同時に導入された４つのヌクレオチド前駆体を示すが、開示された方法が使用されて４つよりも多いまたは少ないヌクレオチド前駆体を試験することができることを理解されたい。
【0120】
２５２において、本方法２５０が開始する。ステップ２５４、２５６、２５８、２６０および２６２は、図７の文脈で示され説明されたステップ２０４、２０６、２０８、２１０および２１２と同じである。その説明はここでは繰り返さない。
【0121】
ステップ２６４において、最大４つの磁気標識ヌクレオチド前駆体が装置１００の結合領域１１５に添加される。追加された磁気標識ヌクレオチド前駆体のそれぞれは、磁気センサ１０５が異なる磁気標識ヌクレオチド前駆体を区別することができるように、異なる磁気標識によって標識される。具体的には、それぞれの磁気標識は、異なる区別可能な磁気特性を有する（例えば、第１の磁気標識ヌクレオチド前駆体に使用される第１の磁気標識は、第１の磁気特性を有し、第２の磁気標識ヌクレオチド前駆体に使用される第２の磁気標識は、第２の磁気特性を有するなど）。
【0122】
２６６において、添加された磁気標識ヌクレオチド前駆体のどれがポリメラーゼに結合したか、または伸長可能プライマーに組み込まれたかを決定するために配列決定が行われる。配列決定ステップ２６６は、図８に示すように、複数のサブステップを含むことができる。例えば、図８に示す方法２５０では、サブステップ２６８において、装置１００の１つ以上のライン１２０が使用されて、磁気センサアレイ１１０の磁気センサ１０５の特性を検出し、特性は、組み込まれた磁気標識ヌクレオチド前駆体の磁気特性を識別する。上述したように、特性は、例えば、抵抗、抵抗の変化、磁界、磁界の変化、周波数、周波数の変化、またはノイズであってもよい。
【0123】
決定点２７０において、第１の磁気特性が検出されたかどうかが決定され、第１の磁気特性は、第１の磁気標識ヌクレオチド前駆体がポリメラーゼに結合したか、または伸長可能プライマーに組み込まれたことを示す。決定は、例えば、第１の磁気特性の存在または非存在に基づいてもよく、例えば、第１の磁気特性が検出された場合、第１の磁気標識ヌクレオチド前駆体は、ポリメラーゼに結合しているかまたは伸長可能プライマーに組み込まれているとみなされ、第１の磁気特性が検出されない場合、第１の磁気標識ヌクレオチド前駆体は、ポリメラーゼに結合していないかまたは伸長可能プライマーに組み込まれていないとみなされる。別の例として、決定は、第１の磁気特性の大きさまたは値に基づいてもよく、例えば、大きさまたは値が指定された範囲内にある場合、第１の磁気標識ヌクレオチド前駆体は、ポリメラーゼに結合しているかまたは伸長可能プライマーに組み込まれているとみなされ、大きさまたは値が指定された範囲内にない場合、第１の磁気標識ヌクレオチド前駆体は、ポリメラーゼに結合していないかまたは伸長可能プライマーに組み込まれていないとみなされる。
【0124】
決定点２７０において第１の磁気特性が検出されたと決定された場合、本方法は、ステップ２７８に進み、第１の磁気標識ヌクレオチド前駆体に基づく相補体が核酸鎖の核酸配列の記録に記録される。
【0125】
決定点２７０において、第１の磁気特性が検出されなかったと決定された場合、本方法２５０は、決定点２７２に移動し、そこで第２の磁気特性が検出されたかどうかが決定され、第２の磁気特性は、第２の磁気標識ヌクレオチド前駆体がポリメラーゼに結合したか、または伸長可能プライマーに組み込まれたことを示す。決定は、第１の磁気特性の決定について上述した任意の方法で行うことができる。決定点２７２において第２の磁気特性が検出されたと決定された場合、本方法は、ステップ２７８に進み、そこで第２の磁気標識ヌクレオチド前駆体に基づく相補性が核酸鎖の核酸配列の記録に記録される。
【0126】
決定点２７２において、第２の磁気特性が検出されなかったと決定された場合、本方法２５０は、決定点２７４に進み、そこで第３の磁気特性が検出されたかどうかが決定され、第３の磁気特性は、第３の磁気標識ヌクレオチド前駆体がポリメラーゼに結合したか、または伸長可能プライマーに組み込まれたことを示す。決定は、第１の磁気特性の決定について上述した任意の方法で行うことができる。決定点２７４において、第３の磁気特性が検出されたと決定された場合、本方法は、ステップ２７８に進み、ここで、第３の磁気標識ヌクレオチド前駆体に基づく相補体が核酸鎖の核酸配列の記録に記録される。
【0127】
最後に、決定点２７４において、第３の磁気特性が検出されなかったと決定された場合、本方法２５０は、決定点２７６に移動し、そこで第４の磁気特性が検出されたかどうかが決定され、第４の磁気特性は、第４の磁気標識ヌクレオチド前駆体がポリメラーゼに結合したか、または伸長可能プライマーに組み込まれたことを示す。決定は、第１の磁気特性の決定について上述した任意の方法で行うことができる。決定点２７６において第４の磁気特性が検出されたと決定された場合、本方法は、ステップ２７８に進み、そこで第３の磁気標識ヌクレオチド前駆体に基づく相補体が核酸鎖の核酸配列の記録に記録される。決定点２７６において、第４の磁気特性が検出されなかったと決定された場合、本方法２５０は、ステップ２６４に戻る。
【0128】
検出（サブステップ２６８）および決定（決定点２７０、２７２、２７４、２７６）は、磁気センサアレイ１１０内の磁気センサ１０５の全てまたは全てよりも少ないものを使用するかまたは依拠することができる。特定の磁気特性が存在するか否か、または特性の値の決定は、磁気センサアレイ１１０内の磁気センサ１０５の一部または全部からの検出結果（サブステップ２６８）を集約、平均化、または他の方法で処理することに基づくことができる。
【0129】
図８に示す実施形態では、添加された磁気標識ヌクレオチド前駆体のどれがポリメラーゼに結合しているかまたは伸長可能プライマーに組み込まれているかの決定は、候補磁気標識ヌクレオチド前駆体のそれぞれに対する別個の「はい／いいえ」決定の結果である。あるいは、決定は、例えば、検出された特性の値をキーと比較することなどによって、単一のステップで行うことができることを理解されたい。例えば、キーは、磁気センサ１０５によって検出された特性が第１の範囲内の値を有する場合、第１の磁気標識ヌクレオチド前駆体がポリメラーゼに結合しているか、または伸長可能プライマーに組み込まれていること；磁気センサ１０５によって検出された特性が第２の範囲内の値を有する場合、第２の磁気標識ヌクレオチド前駆体がポリメラーゼに結合しているか、または伸長可能プライマーに組み込まれていること；磁気センサ１０５によって検出された特性が第３の範囲内の値を有する場合、第３の磁気標識ヌクレオチド前駆体がポリメラーゼに結合しているか、または伸長可能プライマーに組み込まれていること；および磁気センサ１０５によって検出された特性が第４の範囲内の値を有する場合、第４の磁気標識ヌクレオチド前駆体がポリメラーゼに結合しているか、または伸長可能プライマーに組み込まれていることを示すことができる。特性の値は、磁気センサアレイ１１０内の磁気センサ１０５の一部または全部からの検出結果を集約、平均化、または処理すること（サブステップ２６８）に基づくことができる。
【0130】
上で説明したように、いくつかの実施形態では、磁気標識ヌクレオチド前駆体は、核酸ポリメラーゼによって伸長不可能であり、したがって、特徴を検出した後、磁気標識ヌクレオチド前駆体を核酸ポリメラーゼによって伸長可能にするために磁気標識が除去されなければならない。いくつかの実施形態では、第１の磁気標識ヌクレオチド前駆体の部分は、核酸ポリメラーゼによって伸長可能ではなく、第１の磁気標識ヌクレオチド前駆体の部分は、化学的開裂によって伸長可能にされる。磁気的に標識されたヌクレオチド前駆体が核酸ポリメラーゼによって伸長不可能である実施形態では、核酸鎖の核酸配列の記録がステップ２７８において増強された（または開始された）後、決定点２８０において、追加の配列決定サイクルを実行するかどうかが決定される。そうである場合（決定点２８０の「いいえ」分岐）、組み込まれたヌクレオチド前駆体の磁気標識が除去される。磁気標識は、化学的に、酵素的に、または当該技術分野において公知の他の手段によって除去されてもよく、本方法２５０は、ステップ２６４に進み、最大４つの磁気標識ヌクレオチド前駆体が結合領域１１５に添加される（潜在的に、図示されたステップ２６２と同様または同一の洗浄ステップを行った後）。次いで、配列決定ステップ２６６が再度実行されて、ポリメラーゼに結合する次の磁気標識ヌクレオチド前駆体を識別する。
【0131】
決定点２８０において、追加の配列決定サイクルが実行されるべきでないと決定された場合（決定点２８０の「はい」分岐）、本方法２５０は、２８４において終了する。
【0132】
前述の説明および添付の図面では、開示された実施形態の完全な理解を提供するために特定の用語が記載されている。場合によっては、用語または図面は、本発明を実施するために必要とされない特定の詳細を意味することができる。
【0133】
本開示を不必要に不明瞭にすることを避けるために、周知の構成要素は、ブロック図形式で示され、および／または詳細には説明されず、または場合によっては全く説明されない。
【0134】
本明細書において特に明確に定義されていない限り、全ての用語には、本明細書および図面から暗示される意味、ならびに当業者によって理解される意味、および／または辞書、論文などで定義されている意味を含む、可能な限り最も広い解釈が与えられるべきである。本明細書に明示的に記載されているように、いくつかの用語は、それらの通常または通例の意味と一致しない場合がある。
【0135】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に明記しない限り、複数の指示対象を除外しない。「または」という単語は、特に明記しない限り、包括的であると解釈されるべきである。したがって、「ＡまたはＢ」という句は、以下の全てを意味すると解釈されるべきである：「ＡおよびＢの双方」、「ＡであるがＢではない」、および「ＢであるがＡではない」。本明細書におけるいかなる「および／または」の使用も、「または」という単語が単独で排他性を意味することを意味しない。
【0136】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つ、」、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つ、」、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの１つ以上」、および「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの１つ以上」という形式の語句は交換可能であり、それぞれ以下の意味の全てを包含する：「Ａのみ」、「Ｂのみ」、「Ｃのみ」、「ＡおよびＢであるがＣではない」、「ＡおよびＣであるがＢではない」、「ＢおよびＣであるがＡではない」、および「Ａ、Ｂ、およびＣの全て」。
【0137】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語、およびそれらの変形が詳細な説明または特許請求の範囲において使用される限り、そのような用語は、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様の方法で包括的であること、すなわち、「含むが限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味することを意図している。「例示的な（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」および「実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」という用語は、例を表すために使用され、選好または要件を表すために使用されない。「結合された」という用語は、本明細書では、直接接続／取り付け、および１つ以上の介在要素または構造を介した接続／取り付けを表すために使用される。
【0138】
「上（ｏｖｅｒ）」、「下（ｕｎｄｅｒ）」、「間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」、および「上（ｏｎ）」という用語は、本明細書では、他の特徴に対する１つの特徴の相対位置を指す。例えば、別の特徴の「上」または「下」に配置された１つの特徴は、他の特徴と直接接触してもよく、または介在材料を有してもよい。さらに、２つの特徴「の間」に配置された１つの特徴は、２つの特徴と直接接触してもよく、または１つ以上の介在する特徴または材料を有してもよい。対照的に、第２の特徴「上の」第１の特徴は、その第２の特徴と接触している。
【0139】
「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、大部分またはほぼ述べられているような構造、構成、寸法などを説明するために使用されるが、製造公差などに起因して、実際には、構造、構成、寸法などが常にまたは必ずしも述べられているように正確ではない状況をもたらすことがある。例えば、２つの長さを「実質的に等しい」または「ほぼ等しい」と記述することは、２つの長さが全ての実用的な目的で同じであることを意味するが、十分に小さいスケールで正確に等しくなくてもよい（およびそうである必要がなくてもよい）。別の例として、「実質的に垂直」または「ほぼ垂直」である構造は、水平に対して正確に９０度ではない場合であっても、全ての実用的な目的のために垂直であるとみなされる。
【0140】
図面は必ずしも縮尺通りではなく、特徴の寸法、形状、およびサイズは、図面に示されている方法とは実質的に異なっていてもよい。
【0141】
特定の実施形態が開示されているが、本開示のより広い精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および変形を行うことができることは明らかであろう。例えば、実施形態のいずれかの特徴または態様は、少なくとも実行可能な場合には、実施形態の他のいずれかと組み合わせて、またはその対応する特徴または態様の代わりに適用されることができる。したがって、本明細書および図面は、限定的な意味ではなく例示的な意味でみなされるべきである。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】