特表2023-516560ヒトＣＤ４７を標的化するシングルドメイン抗体及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-20
(54)【発明の名称】ヒトＣＤ４７を標的化するシングルドメイン抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230413BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230413BHJP
C07K 1/13 20060101ALI20230413BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230413BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230413BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230413BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230413BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230413BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20230413BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230413BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20230413BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20230413BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230413BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230413BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230413BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230413BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230413BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20230413BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230413BHJP
A61K 51/10 20060101ALI20230413BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20230413BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230413BHJP
G01N 33/536 20060101ALI20230413BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K19/00
C07K1/13
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/21
C12N1/15
C12N1/19
C07K16/30
C12P21/08
C12M1/34 F
C07K16/46
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K39/395 L
A61P35/00
A61P43/00 121
A61P37/04
A61K45/00
A61K38/19
A61K47/68
A61K51/10 200
A61K49/00
A61K51/10 100
G01N33/53 D
G01N33/536 B
G01N33/536 D
G01N33/536 E
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022548805
(86)(22)【出願日】2021-02-10
(85)【翻訳文提出日】2022-10-11
(86)【国際出願番号】 CN2021076479
(87)【国際公開番号】W WO2021160153
(87)【国際公開日】2021-08-19
(31)【優先権主張番号】202010088990.4
(32)【優先日】2020-02-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522318966
【氏名又は名称】上海詩健生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＥＳＣＵＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ７１０，Ｎｏ．７８１ Ｃａｉｌｕｎ Ｒｄ，Ｃｈｉｎａ（Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２０３，ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】何向宇
(72)【発明者】
【氏名】粘偉紅
(72)【発明者】
【氏名】許伝営
(72)【発明者】
【氏名】鄭欣桐
(72)【発明者】
【氏名】張新敏
(72)【発明者】
【氏名】肖▲靖▼
(72)【発明者】
【氏名】何峰
(72)【発明者】
【氏名】周清
【テーマコード（参考）】
4B029
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB15
4B029BB17
4B029FA12
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA05
4B065AA26X
4B065AA90Y
4B065AA93X
4B065AA94Y
4B065AA98X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA03
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC07
4C076CC27
4C076CC29
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA12
4C084AA19
4C084DA01
4C084MA02
4C084NA05
4C084ZB092
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC411
4C084ZC412
4C084ZC75
4C085AA14
4C085AA21
4C085BB11
4C085BB36
4C085BB42
4C085CC01
4C085CC07
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE03
4C085HH03
4C085HH11
4C085HH13
4C085KA04
4C085KA27
4C085KA29
4C085KA30
4C085KB07
4C085LL18
4H045AA11
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA51
4H045BA71
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA50
4H045FA74
4H045GA01
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、抗ＣＤ４７シングルドメイン抗体及びその使用、並びに該抗体の調製方法に関する。前記シングルドメイン抗体は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又は（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３から選択されるＣＤＲを含む。
【選択図】図２１
【選択図】図２１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）であって、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３から選択されるＣＤＲを含む、抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体。
【請求項2】
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む、請求項１に記載のシングルドメイン抗体。
【請求項3】
ヒト化したものである、請求項１又は２に記載のシングルドメイン抗体。
【請求項4】
前記ＦＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記ＦＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記ＦＲ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のシングルドメイン抗体。
【請求項5】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体。
【請求項6】
重鎖Ｆｃ領域として、ヒンジ領域、ＣＨ２、及びＣＨ３から選択される領域をさらに含む、請求項５に記載のシングルドメイン抗体。
【請求項7】
前記重鎖はＩｇＧ１又はＩｇＧ４である、請求項６に記載のシングルドメイン抗体。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含むコンジュゲート。
【請求項9】
前記シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片は、薬物、毒素、細胞毒性剤、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素に結合する、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項10】
請求項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む融合タンパク質。
【請求項11】
前記シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片と診断・治療分子とが融合した請求項１０的融合タンパク質。
【請求項12】
請求項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項13】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項14】
ファージ、細菌又は酵母である、請求項１３に記載のベクター。
【請求項15】
請求項１２に記載のポリヌクレオチド又は請求項１３～１４のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項16】
原核又は真核生物宿主細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項17】
大腸菌である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項18】
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体の生産方法であって、請求項１６に記載の宿主細胞を培養するステップ（ａ）と、培養物から抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体を単離するステップ（ｂ）とを少なくとも含む生産方法。
【請求項19】
請求項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、請求項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、請求項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質の、腫瘍治療薬の調製における使用。
【請求項20】
診断マーカー付き請求項１～７のいずれか１項に記載のＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体。
【請求項21】
前記診断マーカーは、同位体、コロイド金マーカー、着色マーカー又は蛍光マーカーから選択される、請求項２０に記載のシングルドメイン抗体。
【請求項22】
請求項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、請求項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、請求項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項23】
請求項１～７、２０～２１のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む、ＣＤ４７タンパク質を検出する製品又はキット。
【請求項24】
請求項１～７、２０～２１のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片の、ＣＤ４７タンパク質を検出する製品又はキットの調製における使用。
【請求項25】
請求項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、請求項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、請求項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質の有効量を被検者に投与することを含む、癌治療方法。
【請求項26】
前記シングルドメイン抗体、コンジュゲート又は融合タンパク質を他の１種又は複数種の抗体又は薬物と併用する、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記他の１種又は複数種の抗体はチェックポイント抗体である、請求項２６に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、モノクローナル抗体の分野に属し、具体的には、ヒトＣＤ４７を標的化するシングルドメイン抗体、及び疾患の診断・治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＤ４７は、インテグリン、トロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ－１、ＴＳＰ－１）及びＳＩＲＰファミリータンパク質（Ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰβ及びＳＩＲＰγを含む）に結合する免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞膜表面タンパク質であり、したがって、インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ：Ｉｎｔｅｒｇｒｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）とも呼ばれる。ＣＤ４７タンパク質は５回膜貫通構造を有し、その細胞外セグメントはＩｇ－様（Ｉｇ－ｌｉｋｅ）ドメイン（ＮＨ２末端）であり、ＳＩＲＰαと相互作用することができる。ＣＤ４７は大脳皮質、小脳、膀胱、前立腺、卵管、扁桃体、唾液腺、直腸、精巣、精巣上体、乳腺、子宮頸部、胎盤、胸腺、虫垂、骨髄、リンパ節、脾臓、心筋、骨格筋、気管支、胆嚢、膵臓、口腔粘膜、食道、胃、小腸、腎臓、子宮内膜、卵巣、軟組織、皮膚、赤血球、血小板などを含む各種類の正常組織に広く発現している。ＣＤ４７は様々な腫瘍組織にも発現しており、また、正常組織での発現レベルに比べて、急性骨髄性白血病ＡＭＬ、慢性骨髄性白血病ＣＭＬ、急性リンパ性白血病ＡＬＬ、非ホジキンリンパ腫ＮＨＬ、胃癌、多発性骨髄腫、前立腺癌などの多くの腫瘍細胞で発現レベルが有意に上昇しており、腫瘍患者の予後の負の相関因子とする可能性がある(Annu. Rev. Immunol. 2014. 32: 25-50)。ＣＤ４７の多種の組織に亘る広範な発現に比べ、ＳＩＲＰαの発現は限られており、単球、マクロファージ、顆粒球、樹状細胞、骨髄前駆細胞及び一部のニューロン細胞のみに発現し、しかもその発現レベルは多種の免疫状態で安定である。
【0003】
ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用は生体の免疫識別の重要なプロセスであり、生体の「自己」の識別、免疫定常状態の実現に重要な役割を果たす。免疫系は一連の細胞表面の受容体分子を通じて「自己」と「異種」物質を識別して区別し、「自己」物質に対して免疫寛容を産生し、「異種」物質に対して対応する免疫応答反応を行う。固有免疫系において、ＳＩＲＰαはマクロファージの表面に発現する阻害受容体であり、そのリガンドＣＤ４７がＳＩＲＰαに結合すると、ＳＩＲＰαは活性化されて、その細胞内セグメントのＩＴＩＭを介して下流に“don’t eat me（食べないでください）」という阻害シグナルが伝達され、それによってマクロファージによるＣＤ４７発現細胞の貪食機能が阻害される(CurrOpin Immunol. 2009. 21: 37-52)。そのため、その表面にＣＤ４７分子が高いレベルで存在するため、腫瘍細胞はマクロファージによって「自己」と識別され、固有免疫系によって識別・除去されない。また、マクロファージは抗体提示機能を有するため、腫瘍細胞表面のＣＤ４７もマクロファージからＴ細胞への腫瘍関連抗原の提示を阻害し、適応免疫系による腫瘍細胞の識別に間接的に影響する。モノクローナル抗体や融合タンパク質でＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を遮断することは、固有免疫系を活性化する治療法として、マクロファージが腫瘍細胞を再識別して除去することを可能とする。
【0004】
現在、ＴＴＩ－６２１、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４（ヒトネズミキメラ抗体５Ｆ９をヒト化したもの）、ＣＣ９０００２、ＳＲＦ－２３１、ＳＨＲ－１６０３、ＩＢＩ１８８など、ＣＤ４７を標的化する多くのモノクローナル抗体やＳＩＲＰα融合タンパク質は、臨床試験段階に入っている。しかし、ＣＤ４７は同様に赤血球や血小板に発現するため、多くのＣＤ４７モノクローナル抗体やＳＩＲＰα融合タンパク質も赤血球や血小板に結合する特徴を持ち、臨床試験で薬物の安全性上の問題を引き起こす。ＴＴＩ－６２１は、ＳＩＲＰαのＣＤ４７結合ドメインとヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ領域とが融合したＳＩＲＰα（ＩｇＧ１ Ｆｃ）融合タンパク質である。第１期臨床研究では、被験者に投与量依存性血小板減少が見られた(N Engl J Med. 2018. 379: 1711-1721)。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４はＣＤ４７を標的化するヒト化モノクローナル抗体であり、第１期臨床研究では、被験者に１～２度の貧血、３度の高ビリルビン血症が見られた(J Clin Oncol. 2019. 12: 946-953)。したがって、臨床で見られる上記の副作用を改善するために次世代ＣＤ４７抗体の開発が必要である。
【0005】
１９９３年、哺乳類ラクダ科動物（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）の体液免疫系から、相対分子質量約９２ｋＤａのＩｇＧ２及び約９０ｋＤａのＩｇＧ３がが発見された。いずれも重鎖のホモダイマー（ｈｏｍｏ－ｄｉｍｅｒｉｃ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ）である。天然に軽鎖が欠損したこの抗体は、重鎖抗体（ＨＣＡｂ：ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）とも呼ばれる。１９９５年以降、軽鎖や他のタンパク質分子を伴わないＨＣＡｂに似たコモリザメ新抗原受容体（ＮＡＲ：ｎｅｗ ｏｒ ｎｕｒｓｅ ｓｈａｒｋ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が、コモリザメ（Ｇｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ ｃｉｒｒａｔｕｍ）、クモハダオオセ（Ｏｒｅｃｔｏｌｏｂｕｓ ｍａｃｕｌａｔｕｓ）、ギンザメ、エイなどの軟骨魚で相次いで発見されている。ＮＡＲ分子はＩｇサブタイプと膜貫通や分泌形態などのいくつかの機能的特徴が類似していることから、免疫グロブリン新抗原受容体（ＩｇＮＡＲ：Ｉｇ ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）とも呼ばれる。抗原結合活性を保持するＨＣＡｂ又はＩｇＮＡＲは遺伝子工学的技術で得られ得、総称してシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ：ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、）と呼ばれ、ナノ抗体（Ｎｂ：ｎａｎｏｂｏｄｙ、ドメイン抗体（ｄＡｂ：ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）やユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）とも呼ばれる。
【0006】
遺伝子工学的方法で得られたｓｄＡｂは主に３種類あり、１つ目はラクダ科動物から得られたＨＣＡｂであり、完全な抗原結合活性を保持し、最小の天然抗体断片である。ＨＣＡｂのうち重鎖可変領域結合抗原のシングルドメインで構成されるような抗体は、シングルドメイン重鎖抗体（ＶＨＨ：ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と呼ばれる。２つ目はサメなどの軟骨魚から得られたＩｇＮＡＲであり、ＶＮＡＲで表される。３つ目はヒト由来やネズミ由来のモノクローナル抗体から得られた重鎖又は軽鎖可変領域であり、抗原結合特異性を保持しているが、親和性と可溶性は大幅に低下し、治療のニーズを満たすことができない。
【0007】
アルパカでは、ＨＣＡｂはＨ鎖ＣＨ１エクソン／イントロンの接合部に１つの終止コドンと１つのフレームシフト変異が存在するため、機能性ＣＨ１の翻訳が阻止され、ＣＨ１エクソンがヒンジ領域のエクソンとスプライシングできなくなり、結果として、重鎖可変領域とヒンジ領域の間のＣＨ１の欠損を招く。したがって、ラクダ科動物のＨＣＡｂは、単一の可変領域、１つのヒンジ領域、及び２つの定常領域（ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。ラクダ科動物ＶＨＨのＦＲ２中の荷電／極性を有する親水性アミノ酸残基が、ＶＨ中の疎水性アミノ酸残基を置換している。このような置換は、ＶＨＨの凝集傾向を部分的に解消する。ＣＨ１の欠損と親水性置換により重鎖と軽鎖との間に疎水性相互作用が形成できず、対になって二量体化ができないため、ＨＣＡｂは唯一の抗原結合ドメインＶＨＨのみを有し、コンパクトな構造になる。
【0008】
ＣＤ４７シングルドメイン抗体は、構造が簡単で、分子量が小さく、組織透過性が良く、免疫原性が弱く、安定性が強いなどの特徴により注目されている。良好な特異性、親和性を有しながら、赤血球凝集や溶血の副作用がなく、血小板に対する結合が弱いＣＤ４７シングルドメイン抗体が期待される。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、ヒト赤血球に結合せず、インビボ又はインビトロでＣＤ４７－ＳＩＲＰα経路遮断薬として機能するＣＤ４７シングルドメイン抗体を提供する。本発明のＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体は、高い特異性と強い親和性の特徴を有するだけでなく、赤血球に結合せず、赤血球の凝集や溶血の副作用を回避し、血小板との結合が極めて弱く、血小板低下の副作用を軽減するのにも有利である。このため、ＣＤ４７関連癌疾患の治療に有効で副作用が大幅に低減された薬物の開発が期待されている。
【0010】
本発明は、具体的には、以下に関する。
【0011】
１．抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）であって、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３から選択されるＣＤＲを含む、抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）。
いくつかの実施形態では、前記抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３から選択されるＣＤＲと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
２． ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む項１に記載のシングルドメイン抗体。いくつかの実施形態では、 ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４はヒト免疫グロブリンＶＨ可変配列サブグループＩＩＩのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４コンセンサス配列である。
３． ヒト化したものである、項１又は２に記載のシングルドメイン抗体。
４． 前記ＦＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４から選択されるアミノ酸配列を含む、項３に記載のシングルドメイン抗体。
５． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるアミノ酸配列のいずれかを含む項１～４のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体。
いくつかの実施形態では、前記シングルドメイン抗体は、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記シングルドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるいずれかのアミノ酸配列の保存的変異アミノ酸配列を含む。
６． 重鎖Ｆｃ領域として、ヒンジ領域、ＣＨ２、及びＣＨ３から選択される領域をさらに含む項５に記載のシングルドメイン抗体。
７． 前記重鎖はＩｇＧ１又はＩｇＧ４である、項６に記載のシングルドメイン抗体。
いくつかの実施形態では、本願のシングルドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるいずれかのアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９から選択されるいずれかのアミノ酸配列とを含む。
いくつかの実施形態では、本願のシングルドメイン抗体は二価ＶＨＨ－Ｆｃ融合抗体である。
８．項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含むコンジュゲート。
上記のいくつかの形態では、前記シングルドメイン抗体の抗原結合断片は、そのＶＨＨ領域を含むか、又はそのＶＨＨ領域からなる。
９．前記シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片は薬物、毒素、細胞毒性剤、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素に結合している、項８に記載のコンジュゲート。
１０．項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む融合タンパク質。
１１．前記シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片と診断・治療分子とが融合した項１０に記載の融合タンパク質。
１２．項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
１３．項１２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
１４．ファージ、細菌又は酵母である、項１３に記載のベクター。
１５． 項１２に記載のポリヌクレオチド又は項１３～１４のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
１６． 原核又は真核生物宿主細胞である、項１５に記載の宿主細胞、。
１７． 大腸菌である、項１６に記載の宿主細胞。
１８． 項１～７のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体の生産方法であって、項１６に記載の宿主細胞（例えば大腸菌）を培養するステップ（ａ）と、培養物から抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体を単離するステップ（ｂ）とを少なくとも含む、生産方法。
１９． 項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質の、腫瘍治療薬の調製における使用。
２０． 診断マーカー付き項１～７のいずれか１項に記載のＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体。
２１． 前記診断マーカーは、同位体、コロイド金マーカー、着色マーカー又は蛍光マーカーから選択される、項２０に記載のシングルドメイン抗体。
２２． 項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
２３． ＣＤ４７タンパク質を検出する製品又はキットであって、項１～７、２０～２１のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む、製品又はキット。
２４． 項１～７、２０～２１のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片の、ＣＤ４７タンパク質を検出する製品又はキットの調製における使用。
２５． 項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質の有効量を被検者に投与することを含む、癌治療方法。
２６． 前記シングルドメイン抗体、コンジュゲート又は融合タンパク質は他の１種又は複数種の抗体又は薬物と併用する、項２５に記載の方法。
２７． 前記他の１種又は複数種の抗体はチェックポイント抗体である、項２６に記載の方法。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３から選択されるＣＤＲを含む、抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）。
いくつかの実施形態では、前記抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３から選択されるＣＤＲと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
２． ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む項１に記載のシングルドメイン抗体。いくつかの実施形態では、 ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４はヒト免疫グロブリンＶＨ可変配列サブグループＩＩＩのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４コンセンサス配列である。
３． ヒト化したものである、項１又は２に記載のシングルドメイン抗体。
４． 前記ＦＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４から選択されるアミノ酸配列を含む、項３に記載のシングルドメイン抗体。
５． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるアミノ酸配列のいずれかを含む項１～４のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体。
いくつかの実施形態では、前記シングルドメイン抗体は、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記シングルドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるいずれかのアミノ酸配列の保存的変異アミノ酸配列を含む。
６． 重鎖Ｆｃ領域として、ヒンジ領域、ＣＨ２、及びＣＨ３から選択される領域をさらに含む項５に記載のシングルドメイン抗体。
７． 前記重鎖はＩｇＧ１又はＩｇＧ４である、項６に記載のシングルドメイン抗体。
いくつかの実施形態では、本願のシングルドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるいずれかのアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９から選択されるいずれかのアミノ酸配列とを含む。
いくつかの実施形態では、本願のシングルドメイン抗体は二価ＶＨＨ－Ｆｃ融合抗体である。
８．項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含むコンジュゲート。
上記のいくつかの形態では、前記シングルドメイン抗体の抗原結合断片は、そのＶＨＨ領域を含むか、又はそのＶＨＨ領域からなる。
９．前記シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片は薬物、毒素、細胞毒性剤、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素に結合している、項８に記載のコンジュゲート。
１０．項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む融合タンパク質。
１１．前記シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片と診断・治療分子とが融合した項１０に記載の融合タンパク質。
１２．項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
１３．項１２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
１４．ファージ、細菌又は酵母である、項１３に記載のベクター。
１５． 項１２に記載のポリヌクレオチド又は項１３～１４のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
１６． 原核又は真核生物宿主細胞である、項１５に記載の宿主細胞、。
１７． 大腸菌である、項１６に記載の宿主細胞。
１８． 項１～７のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体の生産方法であって、項１６に記載の宿主細胞（例えば大腸菌）を培養するステップ（ａ）と、培養物から抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体を単離するステップ（ｂ）とを少なくとも含む、生産方法。
１９． 項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質の、腫瘍治療薬の調製における使用。
２０． 診断マーカー付き項１～７のいずれか１項に記載のＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体。
２１． 前記診断マーカーは、同位体、コロイド金マーカー、着色マーカー又は蛍光マーカーから選択される、項２０に記載のシングルドメイン抗体。
２２． 項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
２３． ＣＤ４７タンパク質を検出する製品又はキットであって、項１～７、２０～２１のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む、製品又はキット。
２４． 項１～７、２０～２１のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片の、ＣＤ４７タンパク質を検出する製品又はキットの調製における使用。
２５． 項１～７のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質の有効量を被検者に投与することを含む、癌治療方法。
２６． 前記シングルドメイン抗体、コンジュゲート又は融合タンパク質は他の１種又は複数種の抗体又は薬物と併用する、項２５に記載の方法。
２７． 前記他の１種又は複数種の抗体はチェックポイント抗体である、項２６に記載の方法。
【0012】
また、本願は、以下に関する。
１． ＣＤ４７に結合する構築体又は抗体ポリペプチドであって、重鎖シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）を含み、該重鎖シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３から選択されるＣＤＲを含む、構築体又は抗体ポリペプチド。
いくつかの実施形態では、前記ＣＤ４７に結合する構築体又は抗体ポリペプチドは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３から選択されるＣＤＲと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
２． 抗体重鎖可変領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４アミノ酸配列を含む、項１に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
３． ヒト免疫グロブリンＶＨ可変配列サブグループＩＩＩのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４コンセンサス配列を含む、項１又は２に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
４． 前記ＦＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４から選択されるアミノ酸配列を含む、項３に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
５． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、項１～４のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
いくつかの実施形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記シングルドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるいずれかのアミノ酸配列の保存的変異アミノ酸配列を含む。
６． 重鎖Ｆｃ領域として、ヒンジ領域、ＣＨ２、及びＣＨ３から選択される領域をさらに含む、項５に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
７． 前記重鎖はＩｇＧ１又はＩｇＧ４である、項６に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
いくつかの実施形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるいずれかのアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９から選択されるいずれかのアミノ酸配列とを含む。
いくつかの実施形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドは二価ＶＨＨ－Ｆｃ融合抗体である。
いくつかの実施形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドは、ＶＨＨ－Ｆｃ融合構築体若しくは抗体ポリペプチド、又は二価ＶＨＨ－Ｆｃ融合構築体若しくは抗体ポリペプチドである。
８． 項１～７のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片を含む、コンジュゲート。
上記のいくつかの形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドの抗原結合断片は、そのＶＨＨ領域を含むか、又はそのＶＨＨ領域からなる。
９． 前記構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片は、薬物、毒素、細胞毒性剤、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素に結合する、項８に記載のコンジュゲート。
１０． 項１～７のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片を含む融合タンパク質。
１１． 前記構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片と診断・治療分子とが融合した項１０に記載の融合タンパク質。
１２． 項１～７のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
１３． 項１２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
１４． ファージ、細菌又は酵母である、項１３に記載のベクター。
１５． 項１２に記載のポリヌクレオチド又は項１３～１４のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
１６． 原核又は真核生物宿主細胞である、項１５に記載の宿主細胞。
１７． 大腸菌である、項１６に記載の宿主細胞。
１８． 項１～７のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７重鎖構築体又は抗体ポリペプチドの生産方法であって、項１６に記載の宿主細胞（例えば大腸菌）を培養するステップ（ａ）と、培養物から抗ＣＤ４７重鎖構築体又は抗体ポリペプチドを単離するステップ（ｂ）とを少なくとも含む、生産方法。
１９． 項１～７のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド、項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質の、腫瘍治療薬の調製における使用。
２０． 診断マーカー付き項１～７のいずれか１項に記載のＣＤ４７重鎖構築体又は抗体ポリペプチド。
２１． 前記診断マーカーは、同位体、コロイド金マーカー、着色マーカー又は蛍光マーカーから選択される、項２０に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
２２． 項１～７のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド、項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
２３． ＣＤ４７タンパク質を検出する製品又はキットであって、項１～７、２０～２１のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片を含む、製品又はキット。
２４． 項１～７、２０～２１のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片の、ＣＤ４７タンパク質を検出する製品又はキットの調製における使用。
２５． 項１～７のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド、項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質の有効量を被検者に投与することを含む、癌治療方法。
２６． 前記構築体又は抗体ポリペプチド、コンジュゲート又は融合タンパク質は、他の１種又は複数種の抗体又は薬物と併用する項２５に記載の方法。
２７． 前記他の１種又は複数種の抗体はチェックポイント抗体である、項２６に記載の方法。
１． ＣＤ４７に結合する構築体又は抗体ポリペプチドであって、重鎖シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）を含み、該重鎖シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３から選択されるＣＤＲを含む、構築体又は抗体ポリペプチド。
いくつかの実施形態では、前記ＣＤ４７に結合する構築体又は抗体ポリペプチドは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３から選択されるＣＤＲと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
２． 抗体重鎖可変領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４アミノ酸配列を含む、項１に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
３． ヒト免疫グロブリンＶＨ可変配列サブグループＩＩＩのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４コンセンサス配列を含む、項１又は２に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
４． 前記ＦＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４から選択されるアミノ酸配列を含む、項３に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
５． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、項１～４のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
いくつかの実施形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記シングルドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるいずれかのアミノ酸配列の保存的変異アミノ酸配列を含む。
６． 重鎖Ｆｃ領域として、ヒンジ領域、ＣＨ２、及びＣＨ３から選択される領域をさらに含む、項５に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
７． 前記重鎖はＩｇＧ１又はＩｇＧ４である、項６に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
いくつかの実施形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるいずれかのアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９から選択されるいずれかのアミノ酸配列とを含む。
いくつかの実施形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドは二価ＶＨＨ－Ｆｃ融合抗体である。
いくつかの実施形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドは、ＶＨＨ－Ｆｃ融合構築体若しくは抗体ポリペプチド、又は二価ＶＨＨ－Ｆｃ融合構築体若しくは抗体ポリペプチドである。
８． 項１～７のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片を含む、コンジュゲート。
上記のいくつかの形態では、前記構築体又は抗体ポリペプチドの抗原結合断片は、そのＶＨＨ領域を含むか、又はそのＶＨＨ領域からなる。
９． 前記構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片は、薬物、毒素、細胞毒性剤、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素に結合する、項８に記載のコンジュゲート。
１０． 項１～７のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片を含む融合タンパク質。
１１． 前記構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片と診断・治療分子とが融合した項１０に記載の融合タンパク質。
１２． 項１～７のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
１３． 項１２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
１４． ファージ、細菌又は酵母である、項１３に記載のベクター。
１５． 項１２に記載のポリヌクレオチド又は項１３～１４のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
１６． 原核又は真核生物宿主細胞である、項１５に記載の宿主細胞。
１７． 大腸菌である、項１６に記載の宿主細胞。
１８． 項１～７のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７重鎖構築体又は抗体ポリペプチドの生産方法であって、項１６に記載の宿主細胞（例えば大腸菌）を培養するステップ（ａ）と、培養物から抗ＣＤ４７重鎖構築体又は抗体ポリペプチドを単離するステップ（ｂ）とを少なくとも含む、生産方法。
１９． 項１～７のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド、項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質の、腫瘍治療薬の調製における使用。
２０． 診断マーカー付き項１～７のいずれか１項に記載のＣＤ４７重鎖構築体又は抗体ポリペプチド。
２１． 前記診断マーカーは、同位体、コロイド金マーカー、着色マーカー又は蛍光マーカーから選択される、項２０に記載の構築体又は抗体ポリペプチド。
２２． 項１～７のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド、項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
２３． ＣＤ４７タンパク質を検出する製品又はキットであって、項１～７、２０～２１のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片を含む、製品又はキット。
２４． 項１～７、２０～２１のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド若しくはその抗原結合断片の、ＣＤ４７タンパク質を検出する製品又はキットの調製における使用。
２５． 項１～７のいずれか１項に記載の構築体又は抗体ポリペプチド、項８～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート、項１０～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質の有効量を被検者に投与することを含む、癌治療方法。
２６． 前記構築体又は抗体ポリペプチド、コンジュゲート又は融合タンパク質は、他の１種又は複数種の抗体又は薬物と併用する項２５に記載の方法。
２７． 前記他の１種又は複数種の抗体はチェックポイント抗体である、項２６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1-1】アルパカＡ、アルパカＢの免疫前（ｐｒｅ－Ａ／ｐｒｅ－Ｂ）、免疫後（１６日目ｐｏｓｔ－Ａ１／ｐｏｓｔ－Ｂ１、３２日目ｐｏｓｔ－Ａ２／ｐｏｓｔ－Ｂ２）の血清及び抗原の免疫反応性（血清抗体力価）である。免疫前に、２頭のアルパカの血清はいずれも抗原に対する免疫反応性がなく、免疫３２日後に、血清は１：１２,５００倍希釈した後も強い免疫反応性がある。
【図1-2】アルパカＡ、アルパカＢの免疫前（ｐｒｅ－Ａ／ｐｒｅ－Ｂ）、免疫後（１６日目ｐｏｓｔ－Ａ１／ｐｏｓｔ－Ｂ１、３２日目ｐｏｓｔ－Ａ２／ｐｏｓｔ－Ｂ２）の血清及び抗原の免疫反応性（血清抗体力価）である。免疫前に、２頭のアルパカの血清はいずれも抗原に対する免疫反応性がなく、免疫３２日後に、血清は１：１２,５００倍希釈した後も強い免疫反応性がある。
【図2】３回の抗原選別（Ｂｉｏ－ｐａｎｎｉｎｇ）後、濃縮されたファージライブラリと抗原ｈｕＣＤ４７－Ｈｉｓ、ｃｙＣＤ４７－Ｈｉｓとの結合シグナルが１回ごとに高まる。
【図3】精製されたＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる同定であり、標的産物は一本鎖分子量３７ｋＤ～３９ｋＤの対称二本鎖抗体である。
【図4】インビトロ赤血球凝集実験の結果である。対照抗体５Ｆ９は１μｇ／ｍＬ以上の濃度範囲で深刻な赤血球凝集を起こし（クラスター状に凝集してウェルの底部に散布）、ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体は０．１～１００μｇ／ｍＬの濃度範囲に亘って赤血球凝集を起こさない（重力の作用によりＵ字形ウェルの底部に自然沈降し、底部の中心にドットを形成した）。
【図5】フローサイトメトリーによるヒト赤血球に結合しないＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体のスクリーニングである。測定対象となる２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体のうち、ＤＸ－３６６９８及びＤＸ－３６６９９は、ヒト赤血球への結合シグナルが最も弱い。
【図6】ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体、５Ｆ９抗体とヒト赤血球との結合のフローサイトメトリー検出である。５Ｆ９はヒト赤血球と濃度依存的に結合し、ＤＸ－３６６９９（ＩｇＧ１サブタイプ及びＩｇＧ４サブタイプ）は０．０１８～３００ｎＭの濃度範囲で赤血球に微弱にしか結合しない。
【図7】ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体、５Ｆ９抗体とヒト血小板との結合のフローサイトメトリー検出である。５Ｆ９は０．０００６４～１０μｇ／ｍＬの濃度範囲でヒト血小板に濃度依存的に結合する。ＤＸ－３６６９９（ＩｇＧ１サブタイプ及びＩｇＧ４サブタイプ）は０．００６４～１００μｇ／ｍＬの濃度で血小板との結合が５Ｆ９より弱い。
【図8-1】ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体とｈｕＣＤ４７組換えタンパク質との結合活性のＥＬＩＳＡ検出である。０．１～５０ｎｇ／ｍＬの濃度で２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体はいずれもｈｕＣＤ４７に濃度依存的に結合し、同濃度では５Ｆ９抗体より強い結合シグナルを示す。
【図8-2】ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体とｈｕＣＤ４７組換えタンパク質との結合活性のＥＬＩＳＡ検出である。０．１～５０ｎｇ／ｍＬの濃度で２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体はいずれもｈｕＣＤ４７に濃度依存的に結合し、同濃度では５Ｆ９抗体より強い結合シグナルを示す。
【図9】ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体と胃癌細胞ＮＵＧＣ－４（ＣＤ４７陽性）との結合のフローサイトメトリー検出である。０．０５～５ｎＭの濃度範囲では、ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体は全てＮＵＧＣ－４細胞に濃度依存的に結合する。アイソタイプ対照抗体はＮＵＧＣ－４細胞に結合しない。
【図10-1】ＣＤ４７組換えタンパク質とＳＩＲＰα組換えタンパク質との相互作用に対するＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体の遮断活性のＥＬＩＳＡ法検出である。０．１～２５００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲では、２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体は全てＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を濃度依存的に阻害する。アイソタイプ対照抗体はＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用に影響を与えない。
【図10-2】ＣＤ４７組換えタンパク質とＳＩＲＰα組換えタンパク質との相互作用に対するＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体の遮断活性のＥＬＩＳＡ法検出である。０．１～２５００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲では、２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体は全てＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を濃度依存的に阻害する。アイソタイプ対照抗体はＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用に影響を与えない。
【図11-1】ＣＤ４７組換えタンパク質とＳＩＲＰα陽性細胞ＨＥＫ２９３－ＳＩＲＰαとの相互作用に対するＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体の遮断活性のフローサイトメトリー検出である。０．４～５０ｎＭの濃度範囲では、２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体は全てＣＤ４７組換えタンパク質とＨＥＫ２９３－ＳＩＲＰα細胞との結合を濃度依存的に遮断する。アイソタイプ対照抗体はＣＤ４７組換えタンパク質とＨＥＫ２９３－ＳＩＲＰα細胞との相互作用に影響を与えない。
【図11-2】ＣＤ４７組換えタンパク質とＳＩＲＰα陽性細胞ＨＥＫ２９３－ＳＩＲＰαとの相互作用に対するＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体の遮断活性のフローサイトメトリー検出である。０．４～５０ｎＭの濃度範囲では、２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体は全てＣＤ４７組換えタンパク質とＨＥＫ２９３－ＳＩＲＰα細胞との結合を濃度依存的に遮断する。アイソタイプ対照抗体はＣＤ４７組換えタンパク質とＨＥＫ２９３－ＳＩＲＰα細胞との相互作用に影響を与えない。
【図12-1】ＳＩＲＰα組換えタンパク質とＣＤ４７陽性細胞Ｊｕｒｋａｔとの相互作用に対するＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体の遮断活性のフローサイトメトリー検出である。０．１２５～８ｎＭの濃度範囲では、２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体は全てＳＩＲＰαとＪｕｒｋａｔ細胞との相互作用を濃度依存的に遮断する。アイソタイプ対照抗体はＳＩＲＰαとＪｕｒｋａｔ細胞との相互作用に影響を与えない。
【図12-2】ＳＩＲＰα組換えタンパク質とＣＤ４７陽性細胞Ｊｕｒｋａｔとの相互作用に対するＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体の遮断活性のフローサイトメトリー検出である。０．１２５～８ｎＭの濃度範囲では、２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体は全てＳＩＲＰαとＪｕｒｋａｔ細胞との相互作用を濃度依存的に遮断する。アイソタイプ対照抗体はＳＩＲＰαとＪｕｒｋａｔ細胞との相互作用に影響を与えない。
【図13】ＤＸ－３６６９９抗体はＭ１マクロファージの標的細胞Ｊｕｒｋａｔへの貪食を媒介し、０．４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬの濃度でＤＸ－３６６９９はＭ１マクロファージのＪｕｒｋａｔ細胞への貪食を増強する。
【図14】ＤＸ－３６６９９抗体及び対照抗体５Ｆ９投与後のマウス腫瘍体積の変化を示すグラフである。ＰＢＳ群に比べ、投与後５Ｆ９群及びＤＸ－３６６９９群はいずれも腫瘍体積の増加を明らかに阻害でき、ＤＸ－３６６９９と５Ｆ９の阻害活性は類似しており、異なるサブタイプのＤＸ－３６６９９の活性はこのモデルでは有意差は認められない。
【図15】ＤＸ－３６６９９抗体及び対照抗体５Ｆ９投与後のマウス腫瘍重量の変化を示すグラフである。ＰＢＳ群に比べ、投与後５Ｆ９群及びＤＸ－３６６９９群はいずれも腫瘍重量の増加を明らかに阻害でき、ＤＸ－３６６９９と５Ｆ９の阻害活性は類似しており、異なるサブタイプのＤＸ－３６６９９の活性はこのモデルでは有意差が認められない。
【図16】精製されたヒト化ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体（ＩｇＧ４サブタイプ）の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる同定であり、標的産物は、一本鎖分子量３７ｋＤ～３９ｋＤの対称二本鎖抗体である。
【図17】インビトロ赤血球凝集実験の結果である。２つの異なる個体のヒト赤血球において、対照抗体５Ｆ９は０．０９６ｎＭ以上の濃度で深刻な赤血球凝集を起こし（クラスター状に凝集してウェルの底部に散布）、４つのヒト化抗体及びＤＸ－３６６９９は３００ｎＭと高い濃度で赤血球凝集を起こさない（重力の作用によりＵ字形ウェルの底部に自然に沈降し、底部の中心にドットを形成した）。
【図18】ヒト化前後のＤＸ－３６６９９及び５Ｆ９抗体とヒト赤血球との結合のフローサイトメトリー検出である（図１８ａ及び図１８ｂは２つの異なる個体の赤血球を示している）。５Ｆ９はヒト赤血球に濃度依存的に結合し、ＤＸ－３６６９９及び４つのヒト化抗体は０．０３２～１００μｇ／ｍＬの濃度範囲で赤血球に微弱にしか結合しない。
【図19】ヒト化前後のＤＸ－３６６９９及び５Ｆ９抗体とヒト血小板との結合のフローサイトメトリー検出である。５Ｆ９はヒト血小板に濃度依存的に結合し、ＤＸ－３６６９９及び４つのヒト化抗体は０．０３２～１００μｇ／ｍＬの濃度範囲で血小板に微弱にしか結合しない。
【図20】フローサイトメトリーによって、４つのヒト化抗体とＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ４７陽性）との結合を検出し、元の抗体ＤＸ－３６６９９と比較する。０．００１２８～２０ｎＭの濃度範囲では、４つのヒト化抗体はいずれもＪｕｒｋａｔ細胞に濃度依存的に結合する。
【図21】フローサイトメトリーによって、ＳＩＲＰα組換えタンパク質とＣＤ４７陽性細胞Ｊｕｒｋａｔとの相互作用に対する４つのヒト化抗体の遮断活性を検出し、元の抗体ＤＸ－３６６９９と比較する。０．００４８８～２０ｎＭの濃度範囲では、４つのヒト化抗体はいずれもＳＩＲＰαとＪｕｒｋａｔ細胞との相互作用を濃度依存的に遮断する。
【図22】ヒト化抗体ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０及び５Ｆ９抗体と４つの異なる個体のカニクイザルの赤血球との結合のフローサイトメトリー検出である。５Ｆ９は、カニクイザルの赤血球との結合が濃度依存性を示し、結合活性がＤＸ－３６６９９－Ｈ２０の同一カニクイザル個体への結合より顕著に高い。ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０はカニクイザルの赤血球と相対的に弱い結合を有する。
【図23】ヒト化抗体ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０及び５Ｆ９抗体と４つの異なる個体のカニクイザルの血小板との結合のフローサイトメトリー検出である。５Ｆ９はカニクイザルの血小板に濃度依存的に結合し、ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０は、検出濃度範囲では、カニクイザルの血小板との結合はほとんど認められない。
【図24】カニクイザルのＤＸ－３６６９９－Ｈ２０又は５Ｆ９の静脈注射前後の各時点における赤血球に関連する各パラメータの変化を血液ルーチンメータで検出する。５Ｆ９静脈注射後のカニクイザルの赤血球数、ヘモグロビン濃度及びヘマトクリットはいずれも低下したが、網状赤血球の数及び割合は上昇し、投与後２～３週間で投与前のレベルに回復した。ＤＸ－３６ ６９９－Ｈ２０は全ての検出指標に影響を与えない。
【発明を実施するための形態】
【0014】
なお、明細書及び特許請求の範囲では、特定の構成要素を記載するためにいくつかの用語が使用されている。当業者にとって明らかなように、同じ構成要素を異なる用語で呼ぶことがある。本明細書及び特許請求の範囲では、用語の差異を構成要素の区別の方式とするのではなく、構成要素の機能上の差異を区別の基準とする。明細書及び特許請求の範囲全体で言及されている「含む」又は「包含」はオープンな用語であるため、「含むが、限定されない」と解釈すべきである。明細書の以下の記載は、本発明のより良い実施形態であるが、記載は明細書の一般原則を目的としたものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。本発明の特許範囲は、添付の特許請求の範囲によって定められるものに準ずるものとする。
【0015】
出願人は、鋭意研究及び大量のスクリーニングを経て、ＣＤ４７に効果的に結合しつつ、溶血の副作用を回避できるＣＤ４７シングルドメイン重鎖抗体を取得したに至った。したがって、本願は、ＣＤ４７分子に結合するシングルドメイン重鎖抗体、前記ｓｄＡｂを含むタンパク質及びポリペプチド、ならびに前記シングルドメイン抗体、タンパク質及びポリペプチドをコードする核酸、ベクター、宿主細胞、ｓｄＡｂを含む組成物、それらの使用に関する。
【0016】
Ｉ．ＣＤ４７シングルドメイン重鎖抗体
本願の一態様は、抗ＣＤ４７のシングルドメイン重鎖抗体（ＶＨＨ）、又は単にＣＤ４７シングルドメイン重鎖抗体（ＶＨＨ）に関する。
本願の一態様は、抗ＣＤ４７のシングルドメイン重鎖抗体（ＶＨＨ）、又は単にＣＤ４７シングルドメイン重鎖抗体（ＶＨＨ）に関する。
【0017】
「シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ：ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「シングルドメイン重鎖抗体（ＶＨＨ：ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、一般に、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４で表される、３つの相補性決定領域によって中断された４つのフレームワーク領域からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド又はタンパク質と定義される。Ｋａｂａｔら（「Sequence of proteins of immunological interest,」US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,出版番号91）によって与えられたＶＨドメインの一般的な番号付け方式によれば、ｓｄＡｂのＦＲ１は１～３０番目のアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＣＤＲ１は３１～３６番目アミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＦＲ２は３６～４９番目のアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＣＤＲ２は５０～６５位アミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＦＲ３は６６～９４位アミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＣＤＲ３は９５～１０２番目のアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＦＲ４は１０３～１１３番目のアミノ酸を含む。本願のｓｄＡｂはまた、ｓｄＡｂのアミノ酸配列を含むポリペプチド又はタンパク質を包含する。例えば、本願のｓｄＡｂは、重鎖のＣＨ１以外のヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（本願では、ＶＨＨ－Ｆｃ融合抗体又はポリペプチドと呼ばれる）も含んでもよい。ｓｄＡｂは、２本の重鎖からなる二価組換え抗体（本願では、ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体又は二価ＶＨＨ－Ｆｃ融合抗体と呼ばれる）、すなわち、ＶＨＨ－Ｆｃ融合抗体又はポリペプチドが鎖間ジスルフィド結合を介して形成された二価組換え抗体であってもよい。本願のｓｄＡｂが、ｓｄＡｂアミノ酸配列を含むポリペプチド又はタンパク質である場合、前記ｓｄＡｂのアミノ酸配列は、ＶＨＨドメインであり、前記ポリペプチド又はタンパク質の機能性抗原結合断片又は機能性抗原結合ドメインである。
【0018】
本願において、「シングルドメイン重鎖抗体」、「重鎖シングルドメイン抗体」、「ＶＨＨシングルドメイン抗体」、「ＶＨＨ」、「ｓｄＡｂ」及び「シングルドメイン抗体」は、同一の意味を表し、交換して使用することができる。ｓｄＡｂは多くの独特な構造的特徴及び機能的特性を持っており、機能性抗原結合ドメインやタンパク質として使用するのに非常に有利である。ｓｄＡｂは、軽鎖可変領域の存在なしに抗原に機能的に結合し、単一の小さな機能性抗原結合構造単位、領域又はタンパク質として機能することができる。これにより、ｓｄＡｂは、従来の抗体の単位、領域から区分され、前記従来の抗体は、それ自体が抗原結合タンパク質や領域として使用されず、抗原に結合するにはＦａｂ断片やｓｃＦｖ断片などの従来の抗体断片と組み合わせる必要がある。
【0019】
通常、ｓｄＡｂは、ラマなどのラクダ科で生産されるが、当分野で周知の技術を用いて合成することもできる。例えば、ｓｄＡｂを得るための方法は、ラクダ科動物を１つ又は複数の抗原で免疫するステップ（ａ）と、免疫されたラクダ科動物から末梢リンパ球を単離し、総ＲＮＡを取得し、対応するｃＤＮＡを合成するステップ（ｂ）と、ＶＨＨドメインをコードするｃＤＮＡ断片のライブラリを構築するステップ（ｃ）と、ＰＣＲを用いて、（ｃ）ステップで得られたＶＨＨドメインをコードするｃＤＮＡをｍＲＮＡに転写し、ｍＲＮＡをリボソームディスプレイ形態に変換し、リボソームディスプレイによりＶＨＨドメインを選択するステップ（ｄ）と、適切なベクターでＶＨＨを発現させ、必要に応じて発現させたＶＨＨを精製するステップ（ｅ）とを含む。
【0020】
本発明のｓｄＡｂを得るための別の方法は、ｓｄＡｂをコードする核酸を、核酸合成のための技術を用いて調製した後、インビボ又はインビトロで発現させることである。他の選択肢として、本発明のｓｄＡｂ、ポリペプチド及びタンパク質は、タンパク質、ポリペプチド又は他のアミノ酸配列を調製するための合成又は半合成技術を用いて調製することができる。
【0021】
ｓｄＡｂは他の分子、例えばアルブミンや他の大分子に結合することができる。また、本願のｓｄＡｂを用いて、２つ以上の異なる標的に対するエピトープを有するように、多価抗体分子又はポリペプチド及びタンパク質分子を調製することもできる。このような抗体分子又はポリペプチド及びタンパク質分子において、タンパク質又はポリペプチドは、例えば、同じエピトープ、実質的に等価なエピトープ、又は異なるエピトープを対象としてもよい。異なるエピトープは、同じ標的に配置されていてもよいし、２つ以上の異なる標的に配置されていてもよい。
【0022】
本発明の１つ又は複数のｓｄＡｂの配列は、１つ又は複数のリンカー配列に連結又は接合することも期待される。リンカーは、例えば、セリン、グリシン及びアラニンの組み合わせを含有するタンパク質配列であってもよい。
【0023】
本発明のｓｄＡｂを適用する部分、断片、アナログ、突然変異体、バリアント、アレル、及び／又は誘導体も、それらが本発明の適用に適している限り、本発明の範囲内である。
【0024】
本願のいくつかの実施形態では、ＣＤ４７シングルドメイン重鎖抗体（ＶＨＨ）は、
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又は
２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３以下から選択されるＣＤＲを含む。
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又は
２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３以下から選択されるＣＤＲを含む。
【0025】
本願のいくつかの実施形態では、ＣＤ４７シングルドメイン重鎖抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は９で示されるような重鎖可変領域を含む。
【0026】
本明細書で使用される場合、「可変」という用語は、抗体の可変領域の一部では配列が異なることを意味し、それは、その特定の抗原に対する種々の特定の抗体の結合及び特異性につながる。しかし、可変性は抗体可変領域全体に一様に分布するわけではない。それは、軽鎖と重鎖の可変領域のうち、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と呼ばれる３つの断片に集中している。可変領域では、より保存的な部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変領域には、それぞれ４つのＦＲ領域が含まれ、これらのＦＲ領域は、実質的には連結リングを形成する３つのＣＤＲによって連結されたβシートコンフォメーションを呈し、場合によっては部分的なβシート構造を形成することもある。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域を介して密接に連結されて、他の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位を形成する(Kabatら,NIH Publ.No.91-3242,巻I,647-669頁(1991)参照)。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体に依存する細胞毒性に関与するなど、異なるエフェクター機能を示す。
【0027】
本明細書で使用される場合、「重鎖可変領域」という用語は「ＶＨ」と交換して使用されてもよい。
【0028】
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、「相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」と交換して使用されてもよい。
【0029】
一般に、抗体の抗原結合特性は、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれる重鎖可変領域に位置する３つの特定の領域によって記述することができ、このセグメントは４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に仕切られ、４つのＦＲのアミノ酸配列は比較的保存的であり、結合反応に直接関与しない。これらのＣＤＲは環状構造を形成し、その間のＦＲによるβシートを介して空間構造上で互いに近接し、重鎖のＣＤＲと対応する軽鎖のＣＤＲは抗体の抗原結合部位を構成する。どのアミノ酸がＦＲ又はＣＤＲ領域を構成しているかは、同じタイプの抗体のアミノ酸配列を比較することにより決定されてもよい。
【0030】
いくつかの実施形態では、本願のＣＤ４７シングルドメイン重鎖抗体は、上記ＣＤＲ配列又は可変領域配列と９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を有する配列を含む。
【0031】
いくつかの実施形態では、本願のシングルドメイン抗体は、フレームワーク領域（ＦＲ）配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、本願のシングルドメイン抗体はヒト化されている。「ヒト化」とは、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体をいう。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般に２つの実質的に全可変領域を含み、ここで、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応しており、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応している。必要に応じて、ヒト化抗体は、ヒト抗体から誘導される抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化形態」は、ヒト化された抗体を指す。
【0032】
いくつかの実施形態では、本願のシングルドメイン抗体は、ヒト共通フレームワークを含む。「ヒト共通フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列を選択する際に最もよく存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は、Kabatら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5 版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD (1991),第1-3巻に記載の可変配列サブグループから選択される。いくつかの実施形態では、ＶＨの場合、前記サブグループは、Ｋａｂａｔら（上同）が説明したようなサブグループＩＩＩである。 いくつかの実施形態では、本願のシングルドメイン抗体は、表４に示されるＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含む。
【0033】
本願はまた、本願のシングルドメイン抗体の全ヒト抗体形態に関する。「全ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されたアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に排除する。ヒト抗体は、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991)； Marksら,J. Mol. Biol., 222:581 (1991)；Coleら,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,第77頁(1985)；Boernerら,J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)に記載されている技術のようなファージディスプレイライブラリ技術を含む、当業者に知られている種々の技術を使用して調製することができる。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答するように修飾されてこのような抗体を産生させるが、その内因性遺伝子座が能力を失った遺伝子改変動物（例えば免疫異種マウス）へ抗原を投与することにより調製されてもよい（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術については、例えば米国特許第６,０７５,１８１号及び第６,１５０,５８４号を参照）。
【0034】
いくつかの実施形態では、本願のシングルドメイン抗体は、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域のアミノ酸配列など、抗体重鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列も含む。抗体重鎖の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つのクラスがあり、これらのうちのいくつかは、さらに、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２などのサブクラス（アイソタイプ）に分類されてもよい。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖の定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。本願のいくつかの実施形態では、前記抗体重鎖はＩｇＧ１又はＩｇＧ４である。
【0035】
本願は、シングルドメイン抗体を含む複合体（又はコンジュゲート）及び融合タンパク質をカバーする。
【0036】
「複合体（又はコンジュゲートと呼ばれる）」とは、抗体と１つ又は複数の異種分子（細胞毒性剤を含むが、これに限定されない）との複合体（コンジュゲート）をいう。
【0037】
上記のいくつかの態様において、本願はまた、本願の上記ＣＤ４７シングルドメイン重鎖抗体又はその断片に結合するコンジュゲート及び融合発現産物に関する。前記ＣＤ４７シングルドメイン重鎖抗体又はその断片は、薬物、毒素、細胞毒性剤、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種、酵素、及び他の診断又は治療分子とのコンジュゲート及び融合発現産物を形成してもよい。
【0038】
本明細書で使用される用語「細胞毒性剤」とは、細胞機能を阻害又は予防する、及び／又は細胞死亡又は破壊を引き起こす物質である。細胞毒性剤は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学治療剤又は薬物（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；毒素、例えば細菌、真菌、植物又は動物由来の小分子毒素や酵素活性毒素、例えばその断片及び／又はバリアント；本分野で公知の各種の抗腫瘍薬又は抗癌剤を含むが、これらに限定されるものではない。
【0039】
インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ：ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ）受容体アゴニストは、ＳＴＩＮＧ依存性シグナル経路を活性化することでＩ型インターフェロンの分泌や抗ウイルス免疫及び抗腫瘍免疫に関連するタンパク質の発現を促進し、ウイルスコピーを遮断し、癌細胞への免疫反応を促進する分子である。このような分子は、例えば環状ジヌクレオチド類、アミノベンズイミダゾール類、キサントン類やアクリドン類、ベンゾチオフェン類及びベンゾジオキソール類などの構造タイプのＳＴＩＮＧアゴニストである。
【0040】
本願はまた、抗ＣＤ４７シングルドメイン重鎖抗体の断片、誘導体、及びアナログを含む。
本明細書で使用される場合、「断片」、「誘導体」及び「アナログ」という用語は、本発明の抗体と実質的に同一の生物学的機能又は活性を維持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド断片、誘導体又はアナログは、（ｉ）１つ又は複数の保存的又は非保存のアミノ酸残基（好ましくは保存のアミノ酸残基）が置換されたポリペプチドであって、このような置換アミノ酸残基は遺伝コードでコードされていても、コードされなくてもよいもの、又は（ｉｉ）１つ又は複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、又は（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと他の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を延長する化合物、例えば、ポリエチレングリコール）との融合によって形成されたポリペプチド、又は（ｉｖ）このポリペプチド配列に付加的なアミノ酸配列が融合して形成されたポリペプチド（例えば、リーダー配列若しくは分泌配列、このポリペプチドを精製するために使用された配列若しくはプロタンパク質配列、又は６Ｈｉｓタグによって形成された融合タンパク質）であってもい。本明細書の教示によれば、これらの断片、誘導体及びアナログは、当業者に周知の範囲に属する。
本明細書で使用される場合、「断片」、「誘導体」及び「アナログ」という用語は、本発明の抗体と実質的に同一の生物学的機能又は活性を維持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド断片、誘導体又はアナログは、（ｉ）１つ又は複数の保存的又は非保存のアミノ酸残基（好ましくは保存のアミノ酸残基）が置換されたポリペプチドであって、このような置換アミノ酸残基は遺伝コードでコードされていても、コードされなくてもよいもの、又は（ｉｉ）１つ又は複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、又は（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと他の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を延長する化合物、例えば、ポリエチレングリコール）との融合によって形成されたポリペプチド、又は（ｉｖ）このポリペプチド配列に付加的なアミノ酸配列が融合して形成されたポリペプチド（例えば、リーダー配列若しくは分泌配列、このポリペプチドを精製するために使用された配列若しくはプロタンパク質配列、又は６Ｈｉｓタグによって形成された融合タンパク質）であってもい。本明細書の教示によれば、これらの断片、誘導体及びアナログは、当業者に周知の範囲に属する。
【0041】
本願のＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体は、ＣＤ４７タンパク質結合活性を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドを包含する。本願のＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体はまた、本発明の抗体と同じ機能を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドの変異形態を含む。これらの変異形態には、１つ又は複数のアミノ酸の欠損、挿入、及び／又は置換（通常は１～５０個、好ましくは１～３０個、好ましくは１～２０個、好ましくは１～１０個）、及び／又はＣ末端及び／又はＮ末端への１つ又は複数（通常は２０個以内、好ましくは１０個以内、好ましくは５個以内）のアミノ酸の付加が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、当分野では、類似又は類似の性能を有するアミノ酸で置換する場合、通常、タンパク質の機能は変化しない。また、例えば、Ｃ末端及び／又はＮ末端に１つ又は複数のアミノ酸を付加しても、通常はタンパク質の機能は変化しない。この用語はまた、本発明の抗体の活性断片及び活性誘導体を含む。
【0042】
該ポリペプチドの変異形態は、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体（allelc variant）、天然突然変異体、誘導突然変異体、高ストリンジェンシー又は低ストリンジェンシーな条件で本発明の抗体をコードするＤＮＡとハイブリダイズすることができるＤＮＡによってコードされるタンパク質、及び本発明の抗体に対する抗血清を利用して得られるポリペプチド又はタンパク質を含む。
【0043】
本発明はまた、シングルドメイン抗体又はその断片を含む融合タンパク質を提供する。本発明は、ほぼ全長のポリペプチドに加えて、本発明のシングルドメイン抗体の断片を含む。通常、該断片は、本発明の抗体の少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００個の連続したアミノ酸を有する。
【0044】
本発明において、「本発明の抗体の保存的変異体」とは、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較して、１０個まで、好ましくは８個まで、より好ましくは５個まで、最も好ましくは３個までのアミノ酸が、似ている又は類似の性質を有するアミノ酸で置換されてポリペプチドを形成することを意味する。
【0045】
本発明はまた、上記抗体若しくはその断片、又はそれらの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態でもＲＮＡ形態でもよい。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又は人工的に合成されたＤＮＡを含む。ＤＮＡは一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡは、コード化鎖又は非コード化鎖であってもよい。
【0046】
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード化配列及び種々の追加コード化配列；成熟ポリペプチドのコード化配列（及び必要に応じて追加コード化配列）及び非コード化配列を含む。
【0047】
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよく、追加コード化配列及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。
【0048】
本発明はまた、上記の配列とハイブリダイズし、２つの配列の間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、ストリンジェントな条件で本発明の前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、（１）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃のような、低いイオン強度及び高い温度でのハイブリダイゼーション及び溶出；又は（２）５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％仔牛血清／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、４２℃などの変性剤を加えてハイブリダイゼーションすること、又は（３）ハイブリダイゼーションは、２つの配列間の相同性が少なくとも９０％以上、より好ましくは９５％以上である場合にのみ発生することである。また、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能及び活性を有する。
【0049】
本発明の抗体のヌクレオチド全長配列又はその断片は、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法又は人工合成法を用いて得ることができる。実行可能な方法の１つは、特に断片の長さが短い場合に、人工合成方法で関連する配列を合成することである。通常、複数の小さな断片を合成してから連結させ、配列の長い断片を得ることができる。さらに、重鎖のコード配列と発現タグ（例えば６Ｈｉｓ）とを融合して融合タンパク質を形成することもできる。
【0050】
関連する配列が取得されると、組換え法を用いて、関連する配列を大量に取得することができる。通常、これをベクターにクローニングし、細胞に導入した後、通常の方法で増殖後の宿主細胞から分離して関連配列を得る。本発明に係る生体分子（核酸、タンパク質など）は、単離された形態で存在する生体分子を含む。
【0051】
現在、本発明のタンパク質（又はその断片、又はその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、完全に化学合成により得られる。次いで、このＤＮＡ配列は、当技術分野で知られている種々の既存のＤＮＡ分子（又はベクターなど）及び細胞に導入することができる。さらに、本発明のタンパク質配列に化学合成により突然変異を導入することも可能である。
【0052】
本発明はまた、上記の適切なＤＮＡ配列及び適切なプロモーター又は制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現することができるように、適切な宿主細胞を形質転換するために使用することができる。
【0053】
宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞；下等真核細胞、例えば酵母細胞；高等真核細胞、例えば哺乳類細胞であってもよい。代表例としては、大腸菌、ストレプトミセス属、サルモネラ菌の細菌細胞；酵母などの真菌細胞；ショウジョウバエＳ２又はＳｆ９の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ７、２９３細胞の動物細胞などがある。
【0054】
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者によく知られている従来技術で行われてもよい。宿主が大腸菌のような原核生物の場合、ＤＮＡを吸収し得るコンピテント細胞は指数成長期後に採取し、ＣａＣｌ２法で処理され、使用されるステップは当業者に周知のとおりである。もう１つの方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。必要に応じて、形質転換はエレクトロポレーションによって行われてもよい。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈殿法、マイクロインジェクションなどの一般的な機械的方法、エレクトロポレーション、リポソーム包装などのＤＮＡトランスフェクション方法が利用可能である。
【0055】
得られた形質転換体は、通常の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現することができる。使用される宿主細胞に応じて、培養に使用される培地は、種々の通常の培地から選択されてもよい。培養は、宿主細胞の成長に適した条件下で行われる。宿主細胞が適切な細胞密度に成長した後、選択されたプロモーターを適切な方法（例えば温度変換又は化学的誘導）で誘導し、細胞をさらに一定期間培養する。
【0056】
上記方法における組換えポリペプチドは、細胞内で、又は細胞膜上で発現してもよいし、細胞外に分泌されてもよい。必要に応じて、組換えタンパク質は、その物理的、化学的、及び他の特性を利用して、種々の分離方法によって分離、精製され得る。これらの方法は当業者によく知られている。これらの方法の例には、従来の再生（renaturation）処理、タンパク質沈殿剤での処理（塩析法）、遠心分離、浸透破壊、超音波処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や他の様々な液体クロマトグラフィー技術、及びこれらの方法の組み合わせが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0057】
本発明の抗体は、単独で使用されてもよく、検出可能なマーカー（診断目的のため）、治療剤、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分、又はこれらの物質の任意の組み合わせに結合又はコンジュゲートされてもよい。
【0058】
診断目的で検出可能なマーカーには、蛍光又は発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）又はＣＴ（電子計算機Ｘ線断層撮影法）造影剤、又は検出可能な産物を生成する酵素が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0059】
本発明の抗体に結合又はコンジュゲートされ得る治療剤は、１．放射性核種；２．生物毒；３．ＩＬ－２などのサイトカイン；４．金ナノ粒子／ナノロッド；５．ウイルス粒子；６．リポソーム；７．ナノ磁性粒子；８．薬物活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）又はビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質（ＢＰＨＬ））；９．治療剤（例えば、シスプラチン）、又は任意の形態のナノ粒子などを含むが、これらに限定されるものではない。
【0060】
ＩＩ．ＶＨＨシングルドメイン抗体の調製
１．免疫方法
通常、標準的な免疫プロセス（完全及び不完全フロイントアジュバントと免疫原を混合して動物を免疫する）を用いてラクダ科動物を免疫し、優れた力価を有する特異的シングルドメイン重鎖抗体を得る。例えば、１ｍｌの免疫血清から約０．１ｍｇのポリクローナルＨＣＡｂを得ることができる。黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼを用いて可変領域とＣＨ２の間の短いヒンジ領域からＨＣＡｂを切断し、ブドウ球菌プロテインＡクロマトグラフィーによりＦｃセグメントを吸着し、流出した重鎖可変領域を収集すると、ＶＨＨを得る。
１．免疫方法
通常、標準的な免疫プロセス（完全及び不完全フロイントアジュバントと免疫原を混合して動物を免疫する）を用いてラクダ科動物を免疫し、優れた力価を有する特異的シングルドメイン重鎖抗体を得る。例えば、１ｍｌの免疫血清から約０．１ｍｇのポリクローナルＨＣＡｂを得ることができる。黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼを用いて可変領域とＣＨ２の間の短いヒンジ領域からＨＣＡｂを切断し、ブドウ球菌プロテインＡクロマトグラフィーによりＦｃセグメントを吸着し、流出した重鎖可変領域を収集すると、ＶＨＨを得る。
【0061】
２．バクテリアディスプレイ技術に基づくスクリーニング
抗体ディスプレイのためのベクターとして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いることができる。抗体断片は、通常、大腸菌の内膜にディスプレイされ、抗体のＦｃセグメントを介して膜上のリポタンパク質に結合し、このディスプレイ及び発現の方式は固定化ペリプラズム発現（ＡＰＥｘ：Ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）と呼ばれる。しかし、大腸菌の細胞壁と外膜が存在するため、抗原と結合するには、この細菌は原形質球の形態に透徹処理されなけばならない。外膜を用いた抗体ディスプレイ技術も報告されており、例えばＳａｌｅｍａらは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２細菌で発現・ディスプレイ可能な、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）細菌の外膜に由来する自己輸送タンパク質（ＥｈａＡ ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）又はインティミン（Ｉｎｔｉｍｉｎ）上に抗体断片をディスプレイする。抗体ディスプレイには、グラム陽性菌のうち、ブドウ球菌カルノサスＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓが使用されてもよく、この方法は、ブドウ球菌カルノサスのタンパク質Ａ上の細胞壁アンカー領域（Ｃｅｌｌ－ｗａｌｌ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を介して抗体断片を細胞膜内から膜外に輸送し、細胞壁にアンカーするものである。
抗体ディスプレイのためのベクターとして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いることができる。抗体断片は、通常、大腸菌の内膜にディスプレイされ、抗体のＦｃセグメントを介して膜上のリポタンパク質に結合し、このディスプレイ及び発現の方式は固定化ペリプラズム発現（ＡＰＥｘ：Ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）と呼ばれる。しかし、大腸菌の細胞壁と外膜が存在するため、抗原と結合するには、この細菌は原形質球の形態に透徹処理されなけばならない。外膜を用いた抗体ディスプレイ技術も報告されており、例えばＳａｌｅｍａらは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２細菌で発現・ディスプレイ可能な、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）細菌の外膜に由来する自己輸送タンパク質（ＥｈａＡ ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）又はインティミン（Ｉｎｔｉｍｉｎ）上に抗体断片をディスプレイする。抗体ディスプレイには、グラム陽性菌のうち、ブドウ球菌カルノサスＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓが使用されてもよく、この方法は、ブドウ球菌カルノサスのタンパク質Ａ上の細胞壁アンカー領域（Ｃｅｌｌ－ｗａｌｌ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を介して抗体断片を細胞膜内から膜外に輸送し、細胞壁にアンカーするものである。
【0062】
３．ファージ表面ディスプレイ技術に基づくスクリーニング
ファージ表面ディスプレイ技術の核心は、目的遺伝子を遺伝子工学的手法によりファージコートタンパク質遺伝子に融合発現させ、これをファージ表面にディスプレイさせ、特異的な濃縮スクリーニングにより標的タンパク質／ポリペプチドを担持したファージを得、クローニング及びシーケンシングを行い、最終的に標的タンパク質／ポリペプチドのＤＮＡコード配列を得ることである。この技術は、ファージの高い増幅性により、遺伝子型と機能表現型（結合活性）とを組み合わせた、非常に効率的なスクリーニングシステムである。従来の抗体の軽重鎖マッチングの問題が存在しないため、シングルドメイン抗体はファージディスプレイライブラリ技術を用いてスクリーニングするのにより適している。
ファージ表面ディスプレイ技術の核心は、目的遺伝子を遺伝子工学的手法によりファージコートタンパク質遺伝子に融合発現させ、これをファージ表面にディスプレイさせ、特異的な濃縮スクリーニングにより標的タンパク質／ポリペプチドを担持したファージを得、クローニング及びシーケンシングを行い、最終的に標的タンパク質／ポリペプチドのＤＮＡコード配列を得ることである。この技術は、ファージの高い増幅性により、遺伝子型と機能表現型（結合活性）とを組み合わせた、非常に効率的なスクリーニングシステムである。従来の抗体の軽重鎖マッチングの問題が存在しないため、シングルドメイン抗体はファージディスプレイライブラリ技術を用いてスクリーニングするのにより適している。
【0063】
ファージシングルドメイン抗体ライブラリは、一般的に、免疫ライブラリ、天然ライブラリ及び全合成ライブラリの３つの種類に分けられる。免疫ライブラリとは、あらかじめ免疫された動物（例えばアルパカなど）の体内から、標的抗原に特異的なＢ細胞遺伝子を特異的に濃縮し、増幅して重鎖抗体ＶＨ遺伝子を得ることによって構築されたシングルドメイン抗体発現ライブラリであり、通常は、少ないライブラリ容量で高親和性抗体をスクリーニングすることができる。免疫ライブラリの制限要素は免疫原の特徴にあり、異なる免疫原の動物における体液免疫応答の強弱とエピトープの差異は最終的に取得した抗体の品質や多様性に影響し、最終的にスクリーニングされた抗体の同種特異性（例えば識別したエピトープが同じなど）の程度は高い。
【0064】
ファージディスプレイ技術による抗体スクリーニングの流れは一般的に以下を含む。１）抗体遺伝子断片を取得する。アルパカ又はサメの末梢血を採取し、リンパ球分離液を用いてリンパ球を分離し、リンパ球の総ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲによりｃＤＮＡに逆転写し、ネストＰＣＲ２段階法によりＶＨＨ遺伝子を増幅し、最後にＶＨＨ遺伝子をファージベクターにクローニングする。２）目的遺伝子をパンニングする。まず、ファージライブラリを目的抗原不含の封入液とともに共インキュベートし、ネガティブスクリーニングを行い、非特異的反応を減少させ、抗体パンニングの効率を高める。さらに抗原を固相担体（ポリスチレンプレート又は磁気ビーズ）に固定化してパンニングする。パンニングは一般的に複数回行われ、明らかな濃縮効果を検出できるまで、パンニングごとにＰｈａｇｅ－ＥＬＩＳＡ検出を行ってもよい。３）抗体の発現精製。目的抗体遺伝子配列を発現ベクターにクローニングし、原核発現系又は真核発現系により発現させてもよい。
【0065】
４．酵母表面ディスプレイ技術に基づくスクリーニング
抗体ディスプレイ技術のスクリーニングは、サッカロミセス・セレビシエを用いて行ってもよい。サッカロミセス・セレビシエは約２００ｎｍの厚さの細胞壁を有し、出芽した酵母細胞壁の表面には、相対交配型の酵母上のＡｇａ２ｐタンパク質と結合し得るレクチンタンパク質が存在し、シングルドメイン抗体は融合タンパク質としてＡｇａ２ｐタンパク質と融合して発現し、酵母細胞表面にディスプレイしている。酵母ディスプレイ抗体ライブラリのスクリーニング方法は一般的に磁気ビーズによる細胞選別（ＭＡＣＳ）及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を採用しており、ＭＡＣＳの主要な役割は非特異的結合を減少させるためであり、通常はＭＡＣＳスクリーニングをした上で複数回のＦＡＣＳスクリーニングを行う。ファージディスプレイ技術に比べて、酵母ディスプレイ技術には利点と欠点がある。一方、酵母は真核細胞に属し、抗体の翻訳後修飾は哺乳動物細胞と類似しており、グリコシル化後の抗体の安定性は高く、また、哺乳動物の発現系に存在し得る未知の状況を回避する。次に、酵母のディスプレイ技術は蛍光活性化セルソーティング方法を採用し、スクリーニング過程全体の制御性が高い。ただし、酵母抗体ライブラリのライブラリ容量は一般にファージ抗体ライブラリより小さい。さらに、酵母ディスプレイ技術はオリゴマーの抗原をスクリーニングする場合に効果が理想的ではない可能性があるため、一つの酵母細胞が同時に複数の抗原を共有結合する可能性があり、これによりスクリーニングされた抗体の親和性が期待に及ばない可能性がある。
抗体ディスプレイ技術のスクリーニングは、サッカロミセス・セレビシエを用いて行ってもよい。サッカロミセス・セレビシエは約２００ｎｍの厚さの細胞壁を有し、出芽した酵母細胞壁の表面には、相対交配型の酵母上のＡｇａ２ｐタンパク質と結合し得るレクチンタンパク質が存在し、シングルドメイン抗体は融合タンパク質としてＡｇａ２ｐタンパク質と融合して発現し、酵母細胞表面にディスプレイしている。酵母ディスプレイ抗体ライブラリのスクリーニング方法は一般的に磁気ビーズによる細胞選別（ＭＡＣＳ）及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を採用しており、ＭＡＣＳの主要な役割は非特異的結合を減少させるためであり、通常はＭＡＣＳスクリーニングをした上で複数回のＦＡＣＳスクリーニングを行う。ファージディスプレイ技術に比べて、酵母ディスプレイ技術には利点と欠点がある。一方、酵母は真核細胞に属し、抗体の翻訳後修飾は哺乳動物細胞と類似しており、グリコシル化後の抗体の安定性は高く、また、哺乳動物の発現系に存在し得る未知の状況を回避する。次に、酵母のディスプレイ技術は蛍光活性化セルソーティング方法を採用し、スクリーニング過程全体の制御性が高い。ただし、酵母抗体ライブラリのライブラリ容量は一般にファージ抗体ライブラリより小さい。さらに、酵母ディスプレイ技術はオリゴマーの抗原をスクリーニングする場合に効果が理想的ではない可能性があるため、一つの酵母細胞が同時に複数の抗原を共有結合する可能性があり、これによりスクリーニングされた抗体の親和性が期待に及ばない可能性がある。
【0066】
ＩＩＩ．医薬組成物及びキット
本発明はまた、組成物を提供する。好ましくは、前記組成物は、上記の抗体又はその活性断片若しくはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。通常、これらの物質は、毒性のない、不活性で、薬学的に許容される水性担体媒体にて調製することができ、ここで、ｐＨは、配合される物質の性質及び治療される病症にもよるが、通常、約５～８であり、好ましくは約６～８である。調製された医薬組成物は、腫瘍内、腹膜内、静脈内、又は局所投与を含む（ただし、これらに限定されるものではない）通常の経路を介して投与され得る。
本発明はまた、組成物を提供する。好ましくは、前記組成物は、上記の抗体又はその活性断片若しくはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。通常、これらの物質は、毒性のない、不活性で、薬学的に許容される水性担体媒体にて調製することができ、ここで、ｐＨは、配合される物質の性質及び治療される病症にもよるが、通常、約５～８であり、好ましくは約６～８である。調製された医薬組成物は、腫瘍内、腹膜内、静脈内、又は局所投与を含む（ただし、これらに限定されるものではない）通常の経路を介して投与され得る。
【0067】
本発明の医薬組成物は、ＣＤ４７タンパク質分子に結合するために直接使用することができ、したがって、腫瘍の治療に有用である。さらに、他の治療薬を併用することも可能である。
【0068】
本発明の医薬組成物は、安全有効量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは０．１～８０ｗｔ％）の本発明に係る上記のシングルドメイン抗体（又はそのコンジュゲート）と、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む。このような担体には、塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、及びこれらの組合せが含まれる（ただし、これらに限定されるものではない）。薬物製剤は、投与方法に適合していなければならない。本発明の医薬組成物は、例えば、生理食塩水又はグルコース及び他の補助剤を含有する水溶液を用いて、従来の方法で調製されるような注射剤の形態にしてもよい。注射剤、溶液などの医薬組成物は、無菌条件下で調製することが好ましい。有効成分の投与量は、例えば１日あたり約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重の治療有効量である。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療剤と併用してもよい。
【0069】
本発明の医薬組成物を使用する際には、安全有効量の免疫コンジュゲートを哺乳動物に投与し、ここで、この安全有効量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、多くの場合、約５０μｇ／ｋｇ体重を超えず、好ましくは、この投与量は、約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０μｇ／ｋｇ体重である。もちろん、具体的な投与量は投与経路、患者の健康状態などの要素も考慮すべきであり、これらは全て熟練医師の技能の範囲内のものである。
【0070】
本発明はまた、本発明の重鎖シングルドメイン抗体（又はその断片）を含むキットを提供する。本発明のいくつかの実施形態では、前記キットはさらに、容器、取扱説明書、緩衝剤などを含む。本発明はまた、ＣＤ４７タンパク質を識別する特許を有する抗体又はその断片を含む、ＣＤ４７レベルを検出するための検出キットを提供する。いくつかの実施形態では、サンプルを溶解するための分解媒体、検出に必要な汎用試薬や、種々の緩衝液、検出マーカー、検出基質などの緩衝液も含まれる。
【0071】
ＩＶ．ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体の使用
本発明のＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体は、癌疾患の診断・治療、具体的には、ＣＤ４７に対する臨床診断及び標的治療に有用である。
本発明のＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体は、癌疾患の診断・治療、具体的には、ＣＤ４７に対する臨床診断及び標的治療に有用である。
【0072】
本発明のＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体は、高い特異性と強い親和性を有するだけでなく、赤血球に結合せず、赤血球の凝集及び溶血の副作用を回避し、血小板との結合が極めて弱く、血小板低下の副作用を軽減するのにも有利である。このため、ＣＤ４７関連癌疾患の臨床治療に有用である。
【0073】
一方、本願はまた、標識ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体を提供する。検出可能なマーカーを有するＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体では、前記マーカーは、同位体、コロイド金マーカー、着色マーカー又は蛍光マーカーからなる群から選択される。金コロイド標識は、当業者に知られている方法で行うことができる。本発明の好ましい態様では、抗ＣＤ４７シングルドメイン抗体を金コロイドで標識し、金コロイド標識シングルドメイン抗体を得る。
【0074】
ＣＤ４７タンパク質は、標識ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体を用いて検出されてもよい。したがって、本発明はまた、ＣＤ４７タンパク質の検出方法を提供する。この方法のステップは、概して以下の通りである。細胞及び／又は組織サンプルを取得し、サンプルを媒体に溶解し、溶解したサンプル中のＣＤ４７タンパク質のレベルを検出する。本発明の検出方法において、使用するサンプルは特に限定されず、代表的な例として細胞保存液中に存在する細胞含有サンプルである。
【0075】
以下、具体的な実施例を参照して本発明をさらに説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではない。以下の実施例では、具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、Ｓａｍｂｒｏｏｋら,分子クローニング：実験室マニュアル(New York:ColdSpring HarborLaboratory Press,1989)に記載されている条件、又はメーカーが推奨する条件のような通常の条件に従う。特に断らない限り、パーセントと部数は重量パーセントと重量部である。
【0076】
実施例
以下図面を参照して本発明の具体的な実施例について詳細に説明する。図面においては本発明の具体的な実施例が示されているが、本発明は、ここでの実施例により限制されることなく、さまざまな形態で実現されてもよいことが理解される。むしろ、これらの実施例は本発明をより完全に理解できるようにし、本発明の範囲を完全に当業者に伝えるために提供されるのである。
以下図面を参照して本発明の具体的な実施例について詳細に説明する。図面においては本発明の具体的な実施例が示されているが、本発明は、ここでの実施例により限制されることなく、さまざまな形態で実現されてもよいことが理解される。むしろ、これらの実施例は本発明をより完全に理解できるようにし、本発明の範囲を完全に当業者に伝えるために提供されるのである。
【0077】
実施例１．アルパカ免疫及び血清力価検出
ヒトＣＤ４７組換えタンパク質（Ｈｕｍａｎ ＣＤ４７Ｈｉｓ Ｔａｇ、ｈｕＣＤ４７－Ｈｉｓ、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２２７）及びサルＣＤ４７組換えタンパク質（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ＣＤ４７ Ｈｉｓ Ｔａｇ、ｃｙＣＤ４７－Ｈｉｓ、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号ＣＤ７－Ｃ５２Ｈ１）を免疫原として、アルパカ２頭を選び、４０日間の免疫プログラムにしたがって、毎週１回、計６回免疫した。１日目、８日目、１５日目、２２日目にそれぞれｈｕＣＤ４７－Ｈｉｓで免疫し、２９日目、３６日目にｈｕＣＤ４７－Ｈｉｓ、ｃｙＣＤ４７－Ｈｉｓを混合して免疫した。
アルパカの免疫原に対する免疫応答を酵素結合免疫吸着法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）で検出した。免疫前（１日目）、免疫後（１６日目、３２日目）にそれぞれ動物の全血を採取し、通常の方法で血清を分離した。９６ウェルマイクロタイタープレートに１ウェル当たりｈｕＣＤ７－Ｈｉｓ又はｃｙＣＤ４７－Ｈｉｓ（５ｇ／ｍＬ）抗原１００μｌを加え、４℃で一晩被覆し、ＰＢＳＴ ２５０μｌで４回洗浄した後、希釈したアルパカ血清（１：１００～１：１２,５００希釈）１００μｌを加えて室温で１ｈインキュベートし、ＰＢＳＴ ２５０μｌを４回洗浄した後、１：５０００希釈した検出抗体ａｎｔｉ－ｌｌａｍａ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍから購入、カタログ番号ａｂ１１２７８４）を加えて室温で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴ ２５０μｌで４回洗浄した後、ＴＭＢ発色液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入、カタログ番号７００４）を加えて室温で１０ｍｉｎ遮光、発色し、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４反応を停止し、マイクロプレートリーダーを用いてＯＤ４９０の吸光値を測定した。
力価検出結果を図１に示す。免疫前の動物Ａ及び動物Ｂの血清抗体力価は全て陰性（Ｐｒｅ－Ａ、Ｐｒｅ－Ｂ）であり、免疫後の動物の血清抗体力価は陽性であり、３２日目（ｐｏｓｔ－Ａ２、ｐｏｓｔ－Ｂ２）に１２,５００倍希釈した血清抗体力価は陽性であった。６回目の免疫が終わった後（４１日目）、アルパカＡ、アルパカＢからそれぞれ末梢血３００ｍＬを採取して混合した。リンパ球分離液Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅから購入、カタログ番号４５－００１－７５１）の取扱説明書にしたがってＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、末梢血単核球）を分離した。
ヒトＣＤ４７組換えタンパク質（Ｈｕｍａｎ ＣＤ４７Ｈｉｓ Ｔａｇ、ｈｕＣＤ４７－Ｈｉｓ、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２２７）及びサルＣＤ４７組換えタンパク質（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ＣＤ４７ Ｈｉｓ Ｔａｇ、ｃｙＣＤ４７－Ｈｉｓ、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号ＣＤ７－Ｃ５２Ｈ１）を免疫原として、アルパカ２頭を選び、４０日間の免疫プログラムにしたがって、毎週１回、計６回免疫した。１日目、８日目、１５日目、２２日目にそれぞれｈｕＣＤ４７－Ｈｉｓで免疫し、２９日目、３６日目にｈｕＣＤ４７－Ｈｉｓ、ｃｙＣＤ４７－Ｈｉｓを混合して免疫した。
アルパカの免疫原に対する免疫応答を酵素結合免疫吸着法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）で検出した。免疫前（１日目）、免疫後（１６日目、３２日目）にそれぞれ動物の全血を採取し、通常の方法で血清を分離した。９６ウェルマイクロタイタープレートに１ウェル当たりｈｕＣＤ７－Ｈｉｓ又はｃｙＣＤ４７－Ｈｉｓ（５ｇ／ｍＬ）抗原１００μｌを加え、４℃で一晩被覆し、ＰＢＳＴ ２５０μｌで４回洗浄した後、希釈したアルパカ血清（１：１００～１：１２,５００希釈）１００μｌを加えて室温で１ｈインキュベートし、ＰＢＳＴ ２５０μｌを４回洗浄した後、１：５０００希釈した検出抗体ａｎｔｉ－ｌｌａｍａ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍから購入、カタログ番号ａｂ１１２７８４）を加えて室温で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴ ２５０μｌで４回洗浄した後、ＴＭＢ発色液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入、カタログ番号７００４）を加えて室温で１０ｍｉｎ遮光、発色し、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４反応を停止し、マイクロプレートリーダーを用いてＯＤ４９０の吸光値を測定した。
力価検出結果を図１に示す。免疫前の動物Ａ及び動物Ｂの血清抗体力価は全て陰性（Ｐｒｅ－Ａ、Ｐｒｅ－Ｂ）であり、免疫後の動物の血清抗体力価は陽性であり、３２日目（ｐｏｓｔ－Ａ２、ｐｏｓｔ－Ｂ２）に１２,５００倍希釈した血清抗体力価は陽性であった。６回目の免疫が終わった後（４１日目）、アルパカＡ、アルパカＢからそれぞれ末梢血３００ｍＬを採取して混合した。リンパ球分離液Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅから購入、カタログ番号４５－００１－７５１）の取扱説明書にしたがってＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、末梢血単核球）を分離した。
【0078】
実施例２．ファージディスプレイライブラリの構築
上記分離により得られたＰＢＭＣを、ＴＲＩｚｏｌＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、カタログ番号１５５９６０１８）使用ガイドラインにしたがって総ＲＮＡを抽出し、さらにＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６２１０Ｂ）にしたがってｏｌｉｇｏｄＴプライマーとランダム６量体プライマーを用いて総ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成した。ポリメラーゼ連鎖反応を用いてアルパカ重鎖抗体可変領域（ＶＨＨ）断片を増幅し、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により同定し、ゲルを回収して精製した後、ファージ粒子ベクターに連結し、ＴＧ１コンピテント大腸菌にエレクトロポレーションした。ライブラリ容量３×１０８ＣＦＵ以上のファージライブラリから、２６個のクローンを無作為に抽出してコロニーＰＣＲ及びシーケンシングを行い、コロニーＰＣＲの結果から、ファージベクター中のＶＨＨ配列の挿入率が１００％（２６／２６）であり、シーケンシングの結果は繰り返し配列がないことを示した。
上記分離により得られたＰＢＭＣを、ＴＲＩｚｏｌＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、カタログ番号１５５９６０１８）使用ガイドラインにしたがって総ＲＮＡを抽出し、さらにＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６２１０Ｂ）にしたがってｏｌｉｇｏｄＴプライマーとランダム６量体プライマーを用いて総ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成した。ポリメラーゼ連鎖反応を用いてアルパカ重鎖抗体可変領域（ＶＨＨ）断片を増幅し、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により同定し、ゲルを回収して精製した後、ファージ粒子ベクターに連結し、ＴＧ１コンピテント大腸菌にエレクトロポレーションした。ライブラリ容量３×１０８ＣＦＵ以上のファージライブラリから、２６個のクローンを無作為に抽出してコロニーＰＣＲ及びシーケンシングを行い、コロニーＰＣＲの結果から、ファージベクター中のＶＨＨ配列の挿入率が１００％（２６／２６）であり、シーケンシングの結果は繰り返し配列がないことを示した。
【0079】
実施例３．ファージディスプレイライブラリパンニング
ｈｕＣＤ４７を抗原としてディープウェルチューブに被覆し、ファージライブラリーを選別した（Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）。１回目の選別時、マイクロプレートリーダーに２μｇ／ｍＬのｈｕＣＤ４７－Ｈｉｓ組換えタンパク質を一晩被覆し、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ウシ血清アルブミン）でブロッキングした後、ファージを加えて室温で２ｈインキュベートし、ＰＢＳＴで１０回洗浄した後、０．１Ｍ Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅで結合したファージを溶出した。溶出したファージについて力価を測定した後、大腸菌ＴＧ１に感染し、次の選別に進んだ。選別は計３回行い、最終回の選別が終了した後、ＥＬＩＳＡにより単位ファージと抗原との結合シグナル強度を測定した。各パンニングの結合シグナル（濃縮度）を図２に示す。
ｈｕＣＤ４７を抗原としてディープウェルチューブに被覆し、ファージライブラリーを選別した（Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）。１回目の選別時、マイクロプレートリーダーに２μｇ／ｍＬのｈｕＣＤ４７－Ｈｉｓ組換えタンパク質を一晩被覆し、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ウシ血清アルブミン）でブロッキングした後、ファージを加えて室温で２ｈインキュベートし、ＰＢＳＴで１０回洗浄した後、０．１Ｍ Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅで結合したファージを溶出した。溶出したファージについて力価を測定した後、大腸菌ＴＧ１に感染し、次の選別に進んだ。選別は計３回行い、最終回の選別が終了した後、ＥＬＩＳＡにより単位ファージと抗原との結合シグナル強度を測定した。各パンニングの結合シグナル（濃縮度）を図２に示す。
【0080】
実施例４．ＨＵＣＤ４７、ｃｙＣＤ４７結合活性を有するクローンのＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング
ＶＨＨファージと抗原との結合特異性をＥＬＩＳＡ法により検出した。２×ＹＴプレートから大腸菌モノクローナルを選び、９６ウェルプレートに入れて３ｈ培養した後、ヘルパーファージを加えて菌体を分解した後、マイクロプレートリーダーにそれぞれ１００μｌのｈｕＣＤ４７、ｃｙＣＤ４７、マウスＣＤ４７（ｍｏＣＤ４７）又はＢＳＡ（５μｇ／ｍＬ）を被覆し、５％脱脂粉乳を含むＰＢＳでブロッキングした後、１００μｌの分解液上清を加え、室温で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを４回洗浄した後、ａｎｔｉ－Ｍ１３ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＨＲＰ（１：１０００希釈、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから購入、カタログ番号１１９７３－ＭＭ０５Ｔ－Ｈ）１００μｌを加えて１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでプレーを４回洗浄し、ＴＭＢを加えて１０ｍｉｎ発色させ、２Ｍ Ｈ２Ｓ４Ｏで終了後、ＯＤ４５０吸光値をマイクロプレートリーダーで読み取った。
本研究では、７４４個のクローンの中から、ｈｕＣＤ４７に特異的に結合しないもの及びＢＳＡに非特異的に結合するものを除去し、ｈｕＣＤ４７に特異的に結合するモノクローン９３個をスクリーニングした。これらのクローンはｃｙＣＤ４７と種交差反応を示したが、マウスＣＤ４７と交差反応を示すクローンはスクリーニングされなかった。
ＶＨＨファージと抗原との結合特異性をＥＬＩＳＡ法により検出した。２×ＹＴプレートから大腸菌モノクローナルを選び、９６ウェルプレートに入れて３ｈ培養した後、ヘルパーファージを加えて菌体を分解した後、マイクロプレートリーダーにそれぞれ１００μｌのｈｕＣＤ４７、ｃｙＣＤ４７、マウスＣＤ４７（ｍｏＣＤ４７）又はＢＳＡ（５μｇ／ｍＬ）を被覆し、５％脱脂粉乳を含むＰＢＳでブロッキングした後、１００μｌの分解液上清を加え、室温で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを４回洗浄した後、ａｎｔｉ－Ｍ１３ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＨＲＰ（１：１０００希釈、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから購入、カタログ番号１１９７３－ＭＭ０５Ｔ－Ｈ）１００μｌを加えて１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでプレーを４回洗浄し、ＴＭＢを加えて１０ｍｉｎ発色させ、２Ｍ Ｈ２Ｓ４Ｏで終了後、ＯＤ４５０吸光値をマイクロプレートリーダーで読み取った。
本研究では、７４４個のクローンの中から、ｈｕＣＤ４７に特異的に結合しないもの及びＢＳＡに非特異的に結合するものを除去し、ｈｕＣＤ４７に特異的に結合するモノクローン９３個をスクリーニングした。これらのクローンはｃｙＣＤ４７と種交差反応を示したが、マウスＣＤ４７と交差反応を示すクローンはスクリーニングされなかった。
【0081】
実施例５．ＨｕＣＤ４７結合活性を有するシングルドメイン抗体の大腸菌ペリプラズム空間からの抽出・精製
上記スクリーニングにより得られたｈｕＣＤ４７に特異的に結合するＶＨＨクローンを大腸菌で発現させた。ＶＨＨプラスミドを形質転換したＴＧ１大腸菌クローンを２ＹＴ培地（クロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬ、ブドウ糖２％添加）にて２５℃で一晩培養し、その後、２ＹＴ培地（クロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬ、ブドウ糖０．１％添加）にて３７℃で１：１００の割合で拡大培養した。培地にアラビノースを最終濃度０．２％まで添加し、２５℃で５時間誘導した後、遠心分離して沈殿を収集した。菌体を細胞分解緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％ショ糖、ｐＨ７．５）で分解した後、ＮｉＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎから購入、カタログ番号３０２１０）で精製し、３．５ｋＤａ ｍｉｄｉ透析カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入、カタログ番号７１５０６）で透析した。精製産物についてＮａｎｏｄｒｏｐで濃度を測定した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりタンパク質純度を検出し、精製して得られたＶＨＨシングルドメイン抗体をその後の活性測定実験に用いた。
上記スクリーニングにより得られたｈｕＣＤ４７に特異的に結合するＶＨＨクローンを大腸菌で発現させた。ＶＨＨプラスミドを形質転換したＴＧ１大腸菌クローンを２ＹＴ培地（クロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬ、ブドウ糖２％添加）にて２５℃で一晩培養し、その後、２ＹＴ培地（クロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬ、ブドウ糖０．１％添加）にて３７℃で１：１００の割合で拡大培養した。培地にアラビノースを最終濃度０．２％まで添加し、２５℃で５時間誘導した後、遠心分離して沈殿を収集した。菌体を細胞分解緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％ショ糖、ｐＨ７．５）で分解した後、ＮｉＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎから購入、カタログ番号３０２１０）で精製し、３．５ｋＤａ ｍｉｄｉ透析カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入、カタログ番号７１５０６）で透析した。精製産物についてＮａｎｏｄｒｏｐで濃度を測定した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりタンパク質純度を検出し、精製して得られたＶＨＨシングルドメイン抗体をその後の活性測定実験に用いた。
【0082】
実施例６．細胞膜表面のｈｕＣＤ４７に結合可能なシングルドメイン抗体のＦＡＣＳによるスクリーニング
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いてＣＤ４７陽性細胞に結合可能な抗体をスクリーニングした。ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓリンパ腫細胞Ｒａｊｉ（中国科学院細胞バンクから購入、カタログ番号ＴＣＨｕ ４４）を１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号１００９９１４１）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号１１８７５－０９３）を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
８００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離してＲａｊｉ細胞を収集し、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで細胞を１回リンスし、再懸濁させてカウントした。９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０５個のＲａｊｉ細胞を加え、その後、ＶＨＨの最終濃度がそれぞれ５、０．５、０．０５μｇ／ｍＬとなるまで、勾配希釈したＶＨＨ（精製後）サンプルを加え、均一に混合した後、室温でＲａｊｉ細胞と１ｈインキュベートした。１４００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離してＲａｊｉ細胞を収集し、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回洗浄した後、ＶＨＨサンプルウェルに１：５００希釈したａｎｔｉ－ｃ－ｍｙｃ抗体（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１６６７１４９００１）を加え、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、１：３００希釈した検出抗体であるアロフィコシアニンロバ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５－１３６－１５０）をそれぞれ加え、４℃、避光下で３０ｍｉｎインキュベートした。細胞をＰＢＳ＋１％ＦＢＳにより２回洗浄した後、ｉＱｕｅＰｌｕｓフローサイトメーターで分析した。
蛍光二次抗体のみを加えた対照ウェルの平均蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をバックグラウンド値平均蛍光強度とし、サンプル平均蛍光強度とバックグラウンド値平均蛍光強度の倍数でＶＨＨシングルドメイン抗体とＲａｊｉ細胞との結合強度を評価した。
平均蛍光強度の倍数＝サンプルの平均蛍光強度÷バックグラウンド値－平均蛍光強度
本実験では、Ｒａｊｉ細胞に結合可能なＶＨＨシングルドメイン抗体４３個をスクリーニングし、そのうち２８個は、最低濃度（０．０５μｇ／ｍＬ）でＲａｊｉ細胞に結合する平均蛍光強度の倍数が５を超え、強い細胞結合活性を示した。具体的には、次の表１に示す。
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いてＣＤ４７陽性細胞に結合可能な抗体をスクリーニングした。ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓリンパ腫細胞Ｒａｊｉ（中国科学院細胞バンクから購入、カタログ番号ＴＣＨｕ ４４）を１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号１００９９１４１）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号１１８７５－０９３）を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
８００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離してＲａｊｉ細胞を収集し、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで細胞を１回リンスし、再懸濁させてカウントした。９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０５個のＲａｊｉ細胞を加え、その後、ＶＨＨの最終濃度がそれぞれ５、０．５、０．０５μｇ／ｍＬとなるまで、勾配希釈したＶＨＨ（精製後）サンプルを加え、均一に混合した後、室温でＲａｊｉ細胞と１ｈインキュベートした。１４００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離してＲａｊｉ細胞を収集し、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回洗浄した後、ＶＨＨサンプルウェルに１：５００希釈したａｎｔｉ－ｃ－ｍｙｃ抗体（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１６６７１４９００１）を加え、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、１：３００希釈した検出抗体であるアロフィコシアニンロバ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５－１３６－１５０）をそれぞれ加え、４℃、避光下で３０ｍｉｎインキュベートした。細胞をＰＢＳ＋１％ＦＢＳにより２回洗浄した後、ｉＱｕｅＰｌｕｓフローサイトメーターで分析した。
蛍光二次抗体のみを加えた対照ウェルの平均蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をバックグラウンド値平均蛍光強度とし、サンプル平均蛍光強度とバックグラウンド値平均蛍光強度の倍数でＶＨＨシングルドメイン抗体とＲａｊｉ細胞との結合強度を評価した。
平均蛍光強度の倍数＝サンプルの平均蛍光強度÷バックグラウンド値－平均蛍光強度
本実験では、Ｒａｊｉ細胞に結合可能なＶＨＨシングルドメイン抗体４３個をスクリーニングし、そのうち２８個は、最低濃度（０．０５μｇ／ｍＬ）でＲａｊｉ細胞に結合する平均蛍光強度の倍数が５を超え、強い細胞結合活性を示した。具体的には、次の表１に示す。
【0083】
【表1】
【0084】
実施例７．ＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用を遮断するシングルドメイン抗体のＥＬＩＳＡによるスクリーニング
Ｒａｊｉ細胞に結合可能な上記のＶＨＨシングルドメイン抗体についてＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断活性をスクリーニングした。
９６ウェルプレートに１μｇ／ｍＬのｈｕＣＤ４７－Ｈｉｓ抗原（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２２７）１００μｌを加え、４℃で一晩被覆し、ＰＢＳＴ ２５０μｌでプレートを３回洗浄した後、最終濃度がそれぞれ５００、５０、５、０．５ｎＭとなるように１ウェルあたり精製されたＶＨＨ １００μｌを加え、室温で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴ ２５０μｌでプレートを３回洗浄した後、５ｎＭ ＳＩＲＰα－ｍＩｇＧ１（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号ＳＩＡ－Ｈ５２Ａ８）を加えて１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、１：５０００希釈したヤギ抗マウスＨＲＰ－コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、カタログ番号３１４３０）を加えて４５ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳＴ ２５０μｌでプレートを３回洗浄した後、ＴＭＢ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入、カタログ番号７００４）発色基質を加えて１０ｍｉｎ発色させた。０．５Ｍ ＨＣｌで反応を停止した後、マイクロプレートリーダーで値を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５の非線形回帰式を用いてＩＣ５０を計算し、結果を表２に示す。ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断活性を有するＶＨＨシングルドメイン抗体を計３１個スクリーニングした。
Ｒａｊｉ細胞に結合可能な上記のＶＨＨシングルドメイン抗体についてＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断活性をスクリーニングした。
９６ウェルプレートに１μｇ／ｍＬのｈｕＣＤ４７－Ｈｉｓ抗原（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２２７）１００μｌを加え、４℃で一晩被覆し、ＰＢＳＴ ２５０μｌでプレートを３回洗浄した後、最終濃度がそれぞれ５００、５０、５、０．５ｎＭとなるように１ウェルあたり精製されたＶＨＨ １００μｌを加え、室温で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴ ２５０μｌでプレートを３回洗浄した後、５ｎＭ ＳＩＲＰα－ｍＩｇＧ１（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号ＳＩＡ－Ｈ５２Ａ８）を加えて１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、１：５０００希釈したヤギ抗マウスＨＲＰ－コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、カタログ番号３１４３０）を加えて４５ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳＴ ２５０μｌでプレートを３回洗浄した後、ＴＭＢ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入、カタログ番号７００４）発色基質を加えて１０ｍｉｎ発色させた。０．５Ｍ ＨＣｌで反応を停止した後、マイクロプレートリーダーで値を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５の非線形回帰式を用いてＩＣ５０を計算し、結果を表２に示す。ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断活性を有するＶＨＨシングルドメイン抗体を計３１個スクリーニングした。
【0085】
【表2】
【0086】
実施例８．Ｅｘｐｉ２９３Ｆ真核発現系によるＣＤ４７組換え抗体の製造
ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断活性を有する上記３１個のＶＨＨシングルドメイン抗体を用いて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現系により、Ｆｃ融合二価組換え抗体（ＶＨＨ－Ｆｃ）を製造した。具体的には、シグナルペプチドアミノ酸配列（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３：ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）、ＶＨＨ抗体アミノ酸配列、ヒトＩｇＧ１抗体（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースより、配列Ｐ０１８５７）の重鎖ヒンジ領域からＣＨ３ドメインまでのアミノ酸配列（SEQ ID NO.14(EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK））をＮ末端からＣ末端に向かって「シグナルペプチド－ＶＨＨ－定常領域」の順にスプライシングした。アミノ酸配列をコドン最適化した後、全遺伝子合成方式（金唯智生物科技有限公司、蘇州）でＤＮＡを合成し、ＸｂａＩとＥｃｏＲＶ酵素切断部位を通じてｐｃＤＮＡ３．４発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、カタログ番号Ａ１４６９７）に連結した。一般的な方法でコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換し、エンドトキシンフリープラスミドを調製した。
Ｎ末端からＣ末端に向かって「シグナルペプチド－可変領域－定常領域」の順に、シグナルペプチドアミノ酸配列、対照抗体５Ｆ９重鎖可変領域アミノ酸配列(PLoS ONE. 2015. 10(9): e0137345, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137345)即ちSEQ ID NO.35（QVQLQQPGAELVKPGASVMMSCKASGYTFTNYNMHWVKQTPGQGLEWIGTIYPGNDDTSYNQKFKDKATLTADKSSSAAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGYRAMDYWGQTSVTVSS)、及びヒトＩｇＧ４抗体（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースより、配列Ｐ１８６１、Ｓ２２８Ｐ突然変異含有）重鎖定常領域のアミノ酸配列（SEQ ID NO.36（ASTKGPSVFPLAPCSRSTSE STAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK））をスプライシングした。シグナルペプチド、５Ｆ９軽鎖可変領域のアミノ酸配列（PLoS ONE. 2015.10(9): e0137345,PLoS ONE. 2015. 10(9): e0137345, https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0137345）、すなわちSEQ ID NO.37（DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYHCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK）と軽鎖定常領域（ＵｎｉＰｒｏｔデータベース、配列Ｐ０１８３４）のアミノ酸配列、すなわちSEQ ID NO.38（RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC）とをスプライシングした。上記配列をコドン最適化した後、ＤＮＡを全遺伝子合成し、ＸｂａＩとＥｃｏＲＶ酵素切断部位を通じてＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに連結した。一般的な方法でコンピテントＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、エンドトキシンフリープラスミドを製造した。
６×１０７個のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号Ａ１４５２７）をＥｘｐｉ２９３Ｆ発現培地３０ｍＬ（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号Ａ１４３５１－０１）に接種し、３７℃、８％ＣＯ２のシェーカーにて１２５ｒｐｍで２４ｈ培養した後、細胞密度及び活性を測定した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３トランスフェクションキット（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号Ａ１４５２４）の取扱説明書にしたがって、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬８０μｌをＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地１４２０μｌ（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号３１９８５０６２）と均一に混合し、室温で５ｍｉｎ静置し、その後、ｐｃＤＮＡ３．４発現プラスミド３０μｇ、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地と均一に混合し、室温で２０ｍｉｎ静置した。上記トランスフェクション試薬をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養液に添加し、２０ｈ培養後、予め均一に混合したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３トランスフェクションエンハンサーを加え、３７℃、８％ＣＯ２シェーカーにて、１２５ｒｐｍで５～７日間培養した。
細胞培養液を１２００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞ペレットを除去し、上清を収集し、ＡｍＭａｇＴＭ磁気ビーズ精製システム（ジェンスクリプト・バイオテクノロジー社から購入、カタログ番号Ｌ００６９５）の説明にしたがってＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体を精製し、マイクロプレートリーダーでＯＤ２８０を測定してタンパク質定量を行い、組換え抗体３μｇを還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで同定して、目標抗体の単量体分子量は３７ｋＤ～３９ｋＤであった。上記３１個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体のうち２８個は発現に成功し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける大きさ及び純度の結果を図３に示す。
ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断活性を有する上記３１個のＶＨＨシングルドメイン抗体を用いて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現系により、Ｆｃ融合二価組換え抗体（ＶＨＨ－Ｆｃ）を製造した。具体的には、シグナルペプチドアミノ酸配列（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３：ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）、ＶＨＨ抗体アミノ酸配列、ヒトＩｇＧ１抗体（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースより、配列Ｐ０１８５７）の重鎖ヒンジ領域からＣＨ３ドメインまでのアミノ酸配列（SEQ ID NO.14(EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK））をＮ末端からＣ末端に向かって「シグナルペプチド－ＶＨＨ－定常領域」の順にスプライシングした。アミノ酸配列をコドン最適化した後、全遺伝子合成方式（金唯智生物科技有限公司、蘇州）でＤＮＡを合成し、ＸｂａＩとＥｃｏＲＶ酵素切断部位を通じてｐｃＤＮＡ３．４発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、カタログ番号Ａ１４６９７）に連結した。一般的な方法でコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換し、エンドトキシンフリープラスミドを調製した。
Ｎ末端からＣ末端に向かって「シグナルペプチド－可変領域－定常領域」の順に、シグナルペプチドアミノ酸配列、対照抗体５Ｆ９重鎖可変領域アミノ酸配列(PLoS ONE. 2015. 10(9): e0137345, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137345)即ちSEQ ID NO.35（QVQLQQPGAELVKPGASVMMSCKASGYTFTNYNMHWVKQTPGQGLEWIGTIYPGNDDTSYNQKFKDKATLTADKSSSAAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGYRAMDYWGQTSVTVSS)、及びヒトＩｇＧ４抗体（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースより、配列Ｐ１８６１、Ｓ２２８Ｐ突然変異含有）重鎖定常領域のアミノ酸配列（SEQ ID NO.36（ASTKGPSVFPLAPCSRSTSE STAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK））をスプライシングした。シグナルペプチド、５Ｆ９軽鎖可変領域のアミノ酸配列（PLoS ONE. 2015.10(9): e0137345,PLoS ONE. 2015. 10(9): e0137345, https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0137345）、すなわちSEQ ID NO.37（DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYHCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK）と軽鎖定常領域（ＵｎｉＰｒｏｔデータベース、配列Ｐ０１８３４）のアミノ酸配列、すなわちSEQ ID NO.38（RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC）とをスプライシングした。上記配列をコドン最適化した後、ＤＮＡを全遺伝子合成し、ＸｂａＩとＥｃｏＲＶ酵素切断部位を通じてＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに連結した。一般的な方法でコンピテントＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、エンドトキシンフリープラスミドを製造した。
６×１０７個のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号Ａ１４５２７）をＥｘｐｉ２９３Ｆ発現培地３０ｍＬ（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号Ａ１４３５１－０１）に接種し、３７℃、８％ＣＯ２のシェーカーにて１２５ｒｐｍで２４ｈ培養した後、細胞密度及び活性を測定した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３トランスフェクションキット（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号Ａ１４５２４）の取扱説明書にしたがって、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬８０μｌをＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地１４２０μｌ（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号３１９８５０６２）と均一に混合し、室温で５ｍｉｎ静置し、その後、ｐｃＤＮＡ３．４発現プラスミド３０μｇ、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地と均一に混合し、室温で２０ｍｉｎ静置した。上記トランスフェクション試薬をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養液に添加し、２０ｈ培養後、予め均一に混合したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３トランスフェクションエンハンサーを加え、３７℃、８％ＣＯ２シェーカーにて、１２５ｒｐｍで５～７日間培養した。
細胞培養液を１２００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞ペレットを除去し、上清を収集し、ＡｍＭａｇＴＭ磁気ビーズ精製システム（ジェンスクリプト・バイオテクノロジー社から購入、カタログ番号Ｌ００６９５）の説明にしたがってＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体を精製し、マイクロプレートリーダーでＯＤ２８０を測定してタンパク質定量を行い、組換え抗体３μｇを還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで同定して、目標抗体の単量体分子量は３７ｋＤ～３９ｋＤであった。上記３１個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体のうち２８個は発現に成功し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける大きさ及び純度の結果を図３に示す。
【0087】
実施例９．赤血球凝集実験
前述精製により得られた２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体について赤血球凝集スクリーニングを行い、その中から赤血球凝集を起こさない分子を選別した。ヒト赤血球は賽笠生物科技有限公司（上海）に由来する。ＰＢＳ １０ｍＬでヒト赤血球を１回リンスし、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集し、リンスを２回繰り返した後、赤血球をＰＢＳに再懸濁させ、血球カウントプレートでカウントし、細胞密度を４×１０７個／ｍＬに調整した。９６ウェルＵ字形プレートに１ウェルあたり１００μｌ（４×１０６個）の赤血球を加え、次に、勾配希釈したＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体又は５Ｆ９対照抗体（抗体最終濃度はそれぞれ１００、１０、１、０．１μｇ／ｍＬ）を１００μｌ加え、空白対照ウェルにＰＢＳを１００μｌ加えた。均一に混合した後、９６ウェルＵ字形プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータに入れて２ｈ静置した後、９６ウェルプレートを取り出して白い背景プレートで撮影した。結果を図４に示す。
５Ｆ９抗体は１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの濃度範囲で深刻な赤血球凝集反応を起こした。ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体はいずれの濃度でも赤血球凝集を起こさなかった。
前述精製により得られた２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体について赤血球凝集スクリーニングを行い、その中から赤血球凝集を起こさない分子を選別した。ヒト赤血球は賽笠生物科技有限公司（上海）に由来する。ＰＢＳ １０ｍＬでヒト赤血球を１回リンスし、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集し、リンスを２回繰り返した後、赤血球をＰＢＳに再懸濁させ、血球カウントプレートでカウントし、細胞密度を４×１０７個／ｍＬに調整した。９６ウェルＵ字形プレートに１ウェルあたり１００μｌ（４×１０６個）の赤血球を加え、次に、勾配希釈したＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体又は５Ｆ９対照抗体（抗体最終濃度はそれぞれ１００、１０、１、０．１μｇ／ｍＬ）を１００μｌ加え、空白対照ウェルにＰＢＳを１００μｌ加えた。均一に混合した後、９６ウェルＵ字形プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータに入れて２ｈ静置した後、９６ウェルプレートを取り出して白い背景プレートで撮影した。結果を図４に示す。
５Ｆ９抗体は１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの濃度範囲で深刻な赤血球凝集反応を起こした。ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体はいずれの濃度でも赤血球凝集を起こさなかった。
【0088】
実施例１０．ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体とヒト赤血球との結合のＦＡＣＳ検出
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いてＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体とヒト赤血球との結合を検出し、その中からヒト赤血球に結合しない又は弱結合の分子を選んだ。ヒト赤血球をＰＢＳで３回リンスした後、血球カウントプレートでカウントし、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで再懸濁させ、細胞密度を１×１０７個／ｍＬに調整し、９６ウェルＵ字形プレートに１ウェルあたり１００μｌ（１×１０６個）を加えた。ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体、５Ｆ９抗体をＰＢＳ＋１％ＦＢＳで勾配希釈し、１ウェルあたり１００μｌ（最終濃度はそれぞれ０．２５、５、１００μｇ／ｍＬ、又は０．０１８～３００ｎＭ）を加え、４℃で１ｈインキュベートした。細胞を１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１回リンスし、１ウェル当たり１：１０００希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、カタログ番号Ａ１１０１３）を１００μｌ加え、４℃で４５ｍｉｎインキュベートした。細胞を１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回リンスし、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳに２００μｌ再懸濁させ、フローサイトメーターのフローチューブに移して装置にて検出した。データをＦｌｏｗＪｏ＿Ｖ１０ソフトウェアで処理し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５でプロットし、結果を図５に示す。
２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体のうち、ＤＸ－３６６９８及びＤＸ－３６６９９は赤血球との結合が極めて弱く、中でもＤＸ－３６６９９は赤血球との結合が最も弱かった。同じモル濃度では、ＤＸ－３６６９９とヒト赤血球との結合は５Ｆ９よりもはるかに弱く、結果を図６に示す。
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いてＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体とヒト赤血球との結合を検出し、その中からヒト赤血球に結合しない又は弱結合の分子を選んだ。ヒト赤血球をＰＢＳで３回リンスした後、血球カウントプレートでカウントし、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで再懸濁させ、細胞密度を１×１０７個／ｍＬに調整し、９６ウェルＵ字形プレートに１ウェルあたり１００μｌ（１×１０６個）を加えた。ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体、５Ｆ９抗体をＰＢＳ＋１％ＦＢＳで勾配希釈し、１ウェルあたり１００μｌ（最終濃度はそれぞれ０．２５、５、１００μｇ／ｍＬ、又は０．０１８～３００ｎＭ）を加え、４℃で１ｈインキュベートした。細胞を１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１回リンスし、１ウェル当たり１：１０００希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、カタログ番号Ａ１１０１３）を１００μｌ加え、４℃で４５ｍｉｎインキュベートした。細胞を１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回リンスし、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳに２００μｌ再懸濁させ、フローサイトメーターのフローチューブに移して装置にて検出した。データをＦｌｏｗＪｏ＿Ｖ１０ソフトウェアで処理し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５でプロットし、結果を図５に示す。
２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体のうち、ＤＸ－３６６９８及びＤＸ－３６６９９は赤血球との結合が極めて弱く、中でもＤＸ－３６６９９は赤血球との結合が最も弱かった。同じモル濃度では、ＤＸ－３６６９９とヒト赤血球との結合は５Ｆ９よりもはるかに弱く、結果を図６に示す。
【0089】
実施例１１．ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体とヒト血小板との結合
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）方法を用いてＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体ＤＸ－３６６９９、対照抗体５Ｆ９とヒト血小板（ＡＬＬＣＥＬＬＳ生物技術（上海）有限公司から購入）との結合を検出した。血小板を血球計でカウントした後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで濃度を１．５×１０７個／ｍＬに調整し、１ウェルあたり１００μＬで９６ウェルＵ字形プレートに加えた。その後、勾配希釈したＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体又は５Ｆ９対照抗体（ＤＸ－３６６９９の最終濃度０．００６４～１００μｇ／ｍＬ、５Ｆ９の最終濃度０．０００６４～１０μｇ／ｍＬ、いずれも５倍勾配希釈）を１００μｌ添加し、アイソタイプ対照抗体の最終濃度を１００μｇ／ｍＬとした。４℃で１ｈインキュベートした後、サンプルを１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１回リンスした。１ウェル当たり１：１０００希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、カタログ番号Ａ１１０１３）を１００μｌ加え、４℃で４５ｍｉｎインキュベートした。サンプルは１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回リンスし、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳに２００μｌ再懸濁させ、フローチューブに移して装置にて検出した。データをＦｌｏｗＪｏ＿Ｖ１０ソフトウェアで処理し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５でプロットし、結果を図７に示す。
対照抗体５Ｆ９は０．０８μｇ／ｍＬ及びこれ以上の濃度に亘って、ヒト血小板に結合する平均蛍光強度が６００を超えた。一方、ＤＸ－３６６９９（ＩｇＧ１及びＩｇＧ４のサブタイプ）は、全ての濃度で、ヒト血小板に結合する平均蛍光強度が４００未満であり、この抗体のヒト血小板への結合は５Ｆ９よりもはるかに弱いことを示している。
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）方法を用いてＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体ＤＸ－３６６９９、対照抗体５Ｆ９とヒト血小板（ＡＬＬＣＥＬＬＳ生物技術（上海）有限公司から購入）との結合を検出した。血小板を血球計でカウントした後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで濃度を１．５×１０７個／ｍＬに調整し、１ウェルあたり１００μＬで９６ウェルＵ字形プレートに加えた。その後、勾配希釈したＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体又は５Ｆ９対照抗体（ＤＸ－３６６９９の最終濃度０．００６４～１００μｇ／ｍＬ、５Ｆ９の最終濃度０．０００６４～１０μｇ／ｍＬ、いずれも５倍勾配希釈）を１００μｌ添加し、アイソタイプ対照抗体の最終濃度を１００μｇ／ｍＬとした。４℃で１ｈインキュベートした後、サンプルを１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１回リンスした。１ウェル当たり１：１０００希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、カタログ番号Ａ１１０１３）を１００μｌ加え、４℃で４５ｍｉｎインキュベートした。サンプルは１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回リンスし、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳに２００μｌ再懸濁させ、フローチューブに移して装置にて検出した。データをＦｌｏｗＪｏ＿Ｖ１０ソフトウェアで処理し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５でプロットし、結果を図７に示す。
対照抗体５Ｆ９は０．０８μｇ／ｍＬ及びこれ以上の濃度に亘って、ヒト血小板に結合する平均蛍光強度が６００を超えた。一方、ＤＸ－３６６９９（ＩｇＧ１及びＩｇＧ４のサブタイプ）は、全ての濃度で、ヒト血小板に結合する平均蛍光強度が４００未満であり、この抗体のヒト血小板への結合は５Ｆ９よりもはるかに弱いことを示している。
【0090】
実施例１２．ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体とＣＤ４７との結合
上記２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体とヒトＣＤ４７組換えタンパク質との結合をＥＬＩＳＡ法により検出した。９６ウェルマイクロタイタープレートに１ウェル当たり濃度１μｇ／ｍＬのｈｕＣＤ４７－ｍＦｃ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２Ａ５）抗原１００μｌを加え、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴ ２５０μｌで４回リンスした後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを２００μｌ加え、室温で１ｈブロッキングした。ＰＢＳＴ ２５０μｌで４回リンスした後、勾配希釈したＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体（最終濃度０．１～５０ｎｇ／ｍＬ）を加え、室温で１ｈインキュベートした。９６ウェルプレートをＰＢＳＴ ２５０μｌで４回リンスした後、１ウェル当たり１：１００００希釈したヤギ抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入、カタログ番号１０９－０３５－０９８）１００μｌを加え、室温で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴ ２５０μｌで４回リンスした後、１ウェル当たりＴＭＢ基質（Ｃｅｌｌ ＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入、カタログ番号７００４）１００μｌを加えて発色させ、１０ｍｉｎ後、１ウェル当たり２Ｍ Ｈ2SO4 ５０μｌを加えて発色を終了し、マイクロプレートリーダーで吸光値（ＯＤ４５０）を読み取った。データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５非線形回帰式で処理してプロットした結果、図８に示すように、２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体はいずれもヒトＣＤ４７組換えタンパク質に濃度依存的に結合した。
フローサイトメトリーを用いてＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体とＣＤ４７陽性細胞との結合を検出した。胃癌細胞ＮＵＧＣ－４（南京科佰生物科学技術有限公司から購入、カタログ番号ＣＢＰ６０４９３）を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で培養し、細胞をＰＢＳでリンス、パンクレアチン（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号１２６０５－０２８）で消化した後、８００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集し、ＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁させた。細胞をカウントした後、密度を１．５×１０６１個／ｍＬに調整し、９６ウェルＵ字形プレートに１ウェルあたり１．５×１０個５ＮＵＧＣ－４細胞とした。ＰＢＳ＋１％ＦＢＳでＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体、５Ｆ９抗体を勾配希釈し、１ウェル当たり抗体１００μｌを加えて、最終濃度をそれぞれ０．０５、０．５、５ｎＭとし、均一に混合した後、４℃で１ｈインキュベートした。１０００ｒｐｍで遠心分離して細胞を収集した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで細胞を１回リンスした。１ウェル当たり１：１０００希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－Ａｌｅｘａ４８８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、カタログ番号Ａ１１０１３）１００μｌを加え、４℃で１ｈインキュベートした。１０００ｒｐｍで遠心分離して細胞を収集した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回リンスした。ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ ２００μｌで細胞を再懸濁させた後、フローチューブに移して装置にて検出した。データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５非線形回帰式で処理してプロットし、結果を図９に示す。図９は、０．５ｎＭ、５ｎＭの抗体濃度では、上記２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体が全てＮＵＧＣ－４細胞に濃度依存的に結合できることを示している。
上記２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体とヒトＣＤ４７組換えタンパク質との結合をＥＬＩＳＡ法により検出した。９６ウェルマイクロタイタープレートに１ウェル当たり濃度１μｇ／ｍＬのｈｕＣＤ４７－ｍＦｃ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２Ａ５）抗原１００μｌを加え、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴ ２５０μｌで４回リンスした後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを２００μｌ加え、室温で１ｈブロッキングした。ＰＢＳＴ ２５０μｌで４回リンスした後、勾配希釈したＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体（最終濃度０．１～５０ｎｇ／ｍＬ）を加え、室温で１ｈインキュベートした。９６ウェルプレートをＰＢＳＴ ２５０μｌで４回リンスした後、１ウェル当たり１：１００００希釈したヤギ抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入、カタログ番号１０９－０３５－０９８）１００μｌを加え、室温で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴ ２５０μｌで４回リンスした後、１ウェル当たりＴＭＢ基質（Ｃｅｌｌ ＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入、カタログ番号７００４）１００μｌを加えて発色させ、１０ｍｉｎ後、１ウェル当たり２Ｍ Ｈ2SO4 ５０μｌを加えて発色を終了し、マイクロプレートリーダーで吸光値（ＯＤ４５０）を読み取った。データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５非線形回帰式で処理してプロットした結果、図８に示すように、２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体はいずれもヒトＣＤ４７組換えタンパク質に濃度依存的に結合した。
フローサイトメトリーを用いてＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体とＣＤ４７陽性細胞との結合を検出した。胃癌細胞ＮＵＧＣ－４（南京科佰生物科学技術有限公司から購入、カタログ番号ＣＢＰ６０４９３）を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で培養し、細胞をＰＢＳでリンス、パンクレアチン（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号１２６０５－０２８）で消化した後、８００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集し、ＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁させた。細胞をカウントした後、密度を１．５×１０６１個／ｍＬに調整し、９６ウェルＵ字形プレートに１ウェルあたり１．５×１０個５ＮＵＧＣ－４細胞とした。ＰＢＳ＋１％ＦＢＳでＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体、５Ｆ９抗体を勾配希釈し、１ウェル当たり抗体１００μｌを加えて、最終濃度をそれぞれ０．０５、０．５、５ｎＭとし、均一に混合した後、４℃で１ｈインキュベートした。１０００ｒｐｍで遠心分離して細胞を収集した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで細胞を１回リンスした。１ウェル当たり１：１０００希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－Ａｌｅｘａ４８８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、カタログ番号Ａ１１０１３）１００μｌを加え、４℃で１ｈインキュベートした。１０００ｒｐｍで遠心分離して細胞を収集した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回リンスした。ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ ２００μｌで細胞を再懸濁させた後、フローチューブに移して装置にて検出した。データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５非線形回帰式で処理してプロットし、結果を図９に示す。図９は、０．５ｎＭ、５ｎＭの抗体濃度では、上記２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体が全てＮＵＧＣ－４細胞に濃度依存的に結合できることを示している。
【0091】
実施例１３．ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体によるＣＤ４７－ＳＩＲＰαの結合の遮断
３種の実験方法を用いてＣＤ４７とＳＩＲＰα間の相互作用に対するＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体の中和活性を評価した。（１）ＥＬＩＳＡ方法を用いてＣＤ４７組換えタンパク質とＳＩＲＰα組換えタンパク質との相互作用に対する抗体の遮断活性を検出した。（２）フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４７組換えタンパク質とＨＥＫ２９３－ＳＩＲＰα細胞（膜型ＳＩＲＰα発現）との相互作用に対する抗体の遮断活性を評価した。（３）フローサイトメトリーを用いてＳＩＲＰα組換えタンパク質とＪｕｒｋａｔ細胞（膜型ＣＤ４７発現）との相互作用に対する抗体の遮断活性を評価した。
（１）ＣＤ４７組換えタンパク質とＳＩＲＰα組換えタンパク質との相互作用のＥＬＩＳＡ検出
９６ウェルプレートに１ウェルあたり１μｇ／ｍＬ ＳＩＲＰα－Ｈｉｓ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号ＳＩＡ－Ｈ５２２５）１００μｌを加え、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴで４回リンスした後、１ウェルあたりＰＢＳ＋１％ＢＳＡを２００μｌ加え、室温で１ｈブロッキングし、ＰＢＳＴで４回リンスした。抗体を４０ｎｇ／ｍＬ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ＣＤ４７（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃ＣＤ７－Ｈ８２Ｅ９）溶液で勾配希釈し、９６ウェルプレートに１ウェル当たり希釈抗体１００μｌを加え、室温で１ｈインキュベートした。９６ウェルプレートをＰＢＳＴで４回リンスし、１ウェルあたり１：２５００希釈したＳｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃４３４３２３）１００μｌを加え、室温で１ｈインキュベートした。９６ウェルプレートをＰＢＳＴで４回リンスした後、１ウェル当たりＴＭＢ基質（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号７００４）１００μｌを加え、室温で１０ｍｉｎ発色させた後、停止液５０μｌを加えて反応を停止した。マイクロプレートリーダーでデータを読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５で解析し、結果を図１０に示す。図１０は、０．１～２５００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲では、２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体が全てＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を濃度依存的に遮断できることを示している。
（２）ＣＤ４７組換えタンパク質とＳＩＲＰα陽性細胞ＨＥＫ２９３－ＳＩＲＰとの相互作用のフローサイトメトリー検出
ＳＩＲＰαを発現する遺伝子操作細胞ＨＥＫ２９３－ＳＩＲＰαを１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入、カタログ番号１０６８７０１０）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号１０５６９０４４）で培養し、パンクレアチンで消化した後に細胞をカウントし、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳに再懸濁させた。９６ウェルＵ字形プレートに１ウェルあたり細胞（１．５×１０５個）１００μｌを加え、抗体を勾配希釈した後、５０μｌを９６ウェルＵ字形プレートに加え、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ＣＤ４７（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、ＣＤ７－Ｈ８２Ｅ９）５０μｌを最終濃度６０ｎｇ／ｍＬまで加え、均一に混合した後、４℃で１ｈインキュベートした。１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１回リンスし、その後１：１００希釈したＡｎｔｉ－ｂｉｏｔｉｎ ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入、カタログ番号１２－９８９５－８２）１００μｌを加え、４℃で４５ｍｉｎインキュベートした。１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回リンスし、細胞をＰＢＳ＋１％ＦＢＳ ２００μｌに再懸濁させ、フローチューブに移してＰＥの蛍光シグナルを検出した。平均蛍光強度ＭＦＩデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５で解析し、結果を図１１に示す。
（３）ＳＩＲＰα組換えタンパク質とＣＤ４７陽性細胞Ｊｕｒｋａｔとの相互作用のフローサイトメトリー検出
ヒトＴリンパ性白血病細胞Ｊｕｒｋａｔ（中国科学院細胞バンクから購入、カタログ番号ＳＣＳＰ－５１３）をＲＰＭＩ－１６４０培地で培養し、細胞をカウントした後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳに再懸濁させた。９６ウェルＵ字形プレートに１ウェルあたりＪｕｒｋａｔ細胞（２×１０５個）１００μｌを加え、勾配希釈した抗体（最終濃度はそれぞれ８、２、０．５、０．１２５ｎＭ）５０μｌとＳＩＲＰα組換えタンパク質５０μｌ（Ｈｉｓ－ｔａｇ、最終濃度２μｇ／ｍＬ）を加え、４℃で１ｈインキュベートした。１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ ２００μｌで細胞を１回洗浄し、１：２０希釈した検出抗体ＰＥ ａｎｔｉ－Ｈｉｓ Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入、カタログ番号３６２６０３）を加え、４℃、避光下で１ｈインキュベートした。１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回リンスし、細胞をＰＢＳ＋１％ＦＢＳ ２００μｌに再懸濁させ、フローチューブに移して装置にて検出した。平均蛍光強度ＭＦＩデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５で解析し、結果を図１２に示す。
３種の試験方法の結果から、上記の２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体は全てＣＤ４７組換えタンパク質とＳＩＲＰα組換えタンパク質との相互作用を遮断でき、ＣＤ４７組換えタンパク質とＳＩＲＰα陽性細胞ＨＥＫ２９３－ＳＩＲＰとの相互作用を遮断でき、そして、ＳＩＲＰα組換えタンパク質とＣＤ４７陽性細胞Ｊｕｒｋａｔとの相互作用を遮断できる。
３種の実験方法を用いてＣＤ４７とＳＩＲＰα間の相互作用に対するＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体の中和活性を評価した。（１）ＥＬＩＳＡ方法を用いてＣＤ４７組換えタンパク質とＳＩＲＰα組換えタンパク質との相互作用に対する抗体の遮断活性を検出した。（２）フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４７組換えタンパク質とＨＥＫ２９３－ＳＩＲＰα細胞（膜型ＳＩＲＰα発現）との相互作用に対する抗体の遮断活性を評価した。（３）フローサイトメトリーを用いてＳＩＲＰα組換えタンパク質とＪｕｒｋａｔ細胞（膜型ＣＤ４７発現）との相互作用に対する抗体の遮断活性を評価した。
（１）ＣＤ４７組換えタンパク質とＳＩＲＰα組換えタンパク質との相互作用のＥＬＩＳＡ検出
９６ウェルプレートに１ウェルあたり１μｇ／ｍＬ ＳＩＲＰα－Ｈｉｓ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号ＳＩＡ－Ｈ５２２５）１００μｌを加え、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴで４回リンスした後、１ウェルあたりＰＢＳ＋１％ＢＳＡを２００μｌ加え、室温で１ｈブロッキングし、ＰＢＳＴで４回リンスした。抗体を４０ｎｇ／ｍＬ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ＣＤ４７（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃ＣＤ７－Ｈ８２Ｅ９）溶液で勾配希釈し、９６ウェルプレートに１ウェル当たり希釈抗体１００μｌを加え、室温で１ｈインキュベートした。９６ウェルプレートをＰＢＳＴで４回リンスし、１ウェルあたり１：２５００希釈したＳｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃４３４３２３）１００μｌを加え、室温で１ｈインキュベートした。９６ウェルプレートをＰＢＳＴで４回リンスした後、１ウェル当たりＴＭＢ基質（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号７００４）１００μｌを加え、室温で１０ｍｉｎ発色させた後、停止液５０μｌを加えて反応を停止した。マイクロプレートリーダーでデータを読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５で解析し、結果を図１０に示す。図１０は、０．１～２５００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲では、２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体が全てＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を濃度依存的に遮断できることを示している。
（２）ＣＤ４７組換えタンパク質とＳＩＲＰα陽性細胞ＨＥＫ２９３－ＳＩＲＰとの相互作用のフローサイトメトリー検出
ＳＩＲＰαを発現する遺伝子操作細胞ＨＥＫ２９３－ＳＩＲＰαを１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入、カタログ番号１０６８７０１０）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏから購入、カタログ番号１０５６９０４４）で培養し、パンクレアチンで消化した後に細胞をカウントし、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳに再懸濁させた。９６ウェルＵ字形プレートに１ウェルあたり細胞（１．５×１０５個）１００μｌを加え、抗体を勾配希釈した後、５０μｌを９６ウェルＵ字形プレートに加え、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ＣＤ４７（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、ＣＤ７－Ｈ８２Ｅ９）５０μｌを最終濃度６０ｎｇ／ｍＬまで加え、均一に混合した後、４℃で１ｈインキュベートした。１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１回リンスし、その後１：１００希釈したＡｎｔｉ－ｂｉｏｔｉｎ ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入、カタログ番号１２－９８９５－８２）１００μｌを加え、４℃で４５ｍｉｎインキュベートした。１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回リンスし、細胞をＰＢＳ＋１％ＦＢＳ ２００μｌに再懸濁させ、フローチューブに移してＰＥの蛍光シグナルを検出した。平均蛍光強度ＭＦＩデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５で解析し、結果を図１１に示す。
（３）ＳＩＲＰα組換えタンパク質とＣＤ４７陽性細胞Ｊｕｒｋａｔとの相互作用のフローサイトメトリー検出
ヒトＴリンパ性白血病細胞Ｊｕｒｋａｔ（中国科学院細胞バンクから購入、カタログ番号ＳＣＳＰ－５１３）をＲＰＭＩ－１６４０培地で培養し、細胞をカウントした後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳに再懸濁させた。９６ウェルＵ字形プレートに１ウェルあたりＪｕｒｋａｔ細胞（２×１０５個）１００μｌを加え、勾配希釈した抗体（最終濃度はそれぞれ８、２、０．５、０．１２５ｎＭ）５０μｌとＳＩＲＰα組換えタンパク質５０μｌ（Ｈｉｓ－ｔａｇ、最終濃度２μｇ／ｍＬ）を加え、４℃で１ｈインキュベートした。１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ ２００μｌで細胞を１回洗浄し、１：２０希釈した検出抗体ＰＥ ａｎｔｉ－Ｈｉｓ Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入、カタログ番号３６２６０３）を加え、４℃、避光下で１ｈインキュベートした。１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集した後、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回リンスし、細胞をＰＢＳ＋１％ＦＢＳ ２００μｌに再懸濁させ、フローチューブに移して装置にて検出した。平均蛍光強度ＭＦＩデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５で解析し、結果を図１２に示す。
３種の試験方法の結果から、上記の２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体は全てＣＤ４７組換えタンパク質とＳＩＲＰα組換えタンパク質との相互作用を遮断でき、ＣＤ４７組換えタンパク質とＳＩＲＰα陽性細胞ＨＥＫ２９３－ＳＩＲＰとの相互作用を遮断でき、そして、ＳＩＲＰα組換えタンパク質とＣＤ４７陽性細胞Ｊｕｒｋａｔとの相互作用を遮断できる。
【0092】
実施例１４．抗体親和性の測定
上記２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体の中から、赤血球に結合する分子、結合しない分子を２つずつ選び、抗体とｈｕＣＤ４７との親和性をＢＩＡｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）装置で検出した。アミノカップリング法によってＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎＩｇＧＦｃモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号Ｇ－１０２－Ｃ）を捕獲分子としてＣＭ５センサチップ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅから購入、カタログ番号ＢＲ―１００５－３０）に連結し、ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体又は５Ｆ９抗体を、抗体捕獲量２５０～５００ＲＵでＣＭ５チップに捕獲した。注入緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅから購入、カタログ番号ＢＲ１００６６９）でＨｕＣＤ４７組換えタンパク質を勾配希釈し（濃度範囲１．５６ｎＭ～１００ｎＭ）、ＣＭ５チップ上の抗体に３０μｌ／ｍｉｎの流速で流し、ＨｕＣＤ４７と抗体の結合時間を１８０ｓ、解離時間を９００ｓ、反応温度を２５℃とした。ＢＩＡｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１：１結合モデルに従い、ＦｉｔＧｌｏｂａｌを用いて結合定数ｋａ、解離定数ｋｄ及び親和性ＫＤを計算した。表３に示す結果のとおり、４つのＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体は、ｈｕＣＤ４７との結合の親和性がいずれも対照抗体５Ｆ９より高く、その中でも、ＤＸ－３６６９９の親和性は５Ｆ９より遥かに高く、前者の親和性は後者の１７倍であった。
上記２８個のＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体の中から、赤血球に結合する分子、結合しない分子を２つずつ選び、抗体とｈｕＣＤ４７との親和性をＢＩＡｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）装置で検出した。アミノカップリング法によってＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎＩｇＧＦｃモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号Ｇ－１０２－Ｃ）を捕獲分子としてＣＭ５センサチップ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅから購入、カタログ番号ＢＲ―１００５－３０）に連結し、ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体又は５Ｆ９抗体を、抗体捕獲量２５０～５００ＲＵでＣＭ５チップに捕獲した。注入緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅから購入、カタログ番号ＢＲ１００６６９）でＨｕＣＤ４７組換えタンパク質を勾配希釈し（濃度範囲１．５６ｎＭ～１００ｎＭ）、ＣＭ５チップ上の抗体に３０μｌ／ｍｉｎの流速で流し、ＨｕＣＤ４７と抗体の結合時間を１８０ｓ、解離時間を９００ｓ、反応温度を２５℃とした。ＢＩＡｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１：１結合モデルに従い、ＦｉｔＧｌｏｂａｌを用いて結合定数ｋａ、解離定数ｋｄ及び親和性ＫＤを計算した。表３に示す結果のとおり、４つのＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体は、ｈｕＣＤ４７との結合の親和性がいずれも対照抗体５Ｆ９より高く、その中でも、ＤＸ－３６６９９の親和性は５Ｆ９より遥かに高く、前者の親和性は後者の１７倍であった。
【0093】
【表3】
【0094】
実施例１５．ＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体によるＪｕｒｋａｔ腫瘍細胞へのマクロファージの貪食増強
ヒトＰＢＭＣからＣＤ１４＋単球を単離し、インビトロで貪食機能を有するＭ１マクロファージに分化誘導し、ＣＤ４７を発現するヒトＴリンパ性白血病細胞Ｊｕｒｋａｔを標的細胞として抗体依存性細胞貪食効果（ＡＤＣＰ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を評価した。
妙通生物科技有限公司（上海）から購入したヒトＰＢＭＣを蘇生させた後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで４～６ｈ培養し、ＭａｇｎｉＳｏｒｔヒトＣＤ１４陽性スクリーニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、カタログ番号８８０２－６８３４）の操作ガイドラインにしたがってＣＤ１４＋単球を分離した。得られたＣＤ１４＋単球を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で培養し、最終濃度２５ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍから購入、カタログ番号２１６－ＭＣ－１００）を添加して６日間誘導し、その後、最終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍから購入、カタログ番号２８５－ＩＦ－１００）を添加して２４ｈ誘導し、Ｍ１マクロファージを得た。Ｍ１マクロファージを９６ウェルプレートに１ウェルあたり２０００個接種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。
ヒトＴリンパ性白血病細胞Ｊｕｒｋａｔ（中国科学院細胞バンクから購入、カタログ番号ＳＣＳＰ－５１３）を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で培養し、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集し、ＰＢＳで１回洗浄した。最終濃度１μＭのＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、カタログ番号６５－０８５０－８４）を用いてＪｕｒｋａｔ細胞を１０ｍｉｎ染色し、ＰＢＳで細胞を２回リンスし、ＰＢＳに再懸濁させた。ＣＦＳＥ標識Ｊｕｒｋａｔ細胞とＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体とを混合した後、Ｍ１マクロファージを含む９６ウェルプレートに加え、抗体最終濃度をそれぞれ０．４、２μｇ／ｍＬとした。３７℃、５％ＣＯ２条件下で２ｈインキュベートした後、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、培地に懸濁させたＪｕｒｋａｔ細胞を除去した。壁に付着したＭ１マクロファージの緑色蛍光シグナル、すなわち貪食されたＪｕｒｋａｔ細胞を蛍光顕微鏡で検出した。結果を図１３に示す。
ヒトＰＢＭＣからＣＤ１４＋単球を単離し、インビトロで貪食機能を有するＭ１マクロファージに分化誘導し、ＣＤ４７を発現するヒトＴリンパ性白血病細胞Ｊｕｒｋａｔを標的細胞として抗体依存性細胞貪食効果（ＡＤＣＰ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を評価した。
妙通生物科技有限公司（上海）から購入したヒトＰＢＭＣを蘇生させた後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで４～６ｈ培養し、ＭａｇｎｉＳｏｒｔヒトＣＤ１４陽性スクリーニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、カタログ番号８８０２－６８３４）の操作ガイドラインにしたがってＣＤ１４＋単球を分離した。得られたＣＤ１４＋単球を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で培養し、最終濃度２５ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍから購入、カタログ番号２１６－ＭＣ－１００）を添加して６日間誘導し、その後、最終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍから購入、カタログ番号２８５－ＩＦ－１００）を添加して２４ｈ誘導し、Ｍ１マクロファージを得た。Ｍ１マクロファージを９６ウェルプレートに１ウェルあたり２０００個接種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。
ヒトＴリンパ性白血病細胞Ｊｕｒｋａｔ（中国科学院細胞バンクから購入、カタログ番号ＳＣＳＰ－５１３）を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で培養し、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞を収集し、ＰＢＳで１回洗浄した。最終濃度１μＭのＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、カタログ番号６５－０８５０－８４）を用いてＪｕｒｋａｔ細胞を１０ｍｉｎ染色し、ＰＢＳで細胞を２回リンスし、ＰＢＳに再懸濁させた。ＣＦＳＥ標識Ｊｕｒｋａｔ細胞とＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体とを混合した後、Ｍ１マクロファージを含む９６ウェルプレートに加え、抗体最終濃度をそれぞれ０．４、２μｇ／ｍＬとした。３７℃、５％ＣＯ２条件下で２ｈインキュベートした後、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、培地に懸濁させたＪｕｒｋａｔ細胞を除去した。壁に付着したＭ１マクロファージの緑色蛍光シグナル、すなわち貪食されたＪｕｒｋａｔ細胞を蛍光顕微鏡で検出した。結果を図１３に示す。
【0095】
実施例１６．ＤＸ－３６６９９抗体のインビボ抗腫瘍活性
Ｍ－ＮＳＧマウス（メス、６週齢、上海南方模式生物科技股フェン有限公司）にＲａｊｉ腫瘍細胞（右側に５×１０６個／匹皮下接種）を皮下移植し、Ｒａｊｉ移植腫モデルを作成した。接種後８日目に、腫瘍の平均体積は約１２３ｍｍ３であり、ランダムブロック法を用いて担癌マウスを６群に分け、第１群 ＰＢＳ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第２群 ５Ｆ９、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第３群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ１、２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第４群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ１、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第５群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４、２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；および第６群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群を６匹ずつとした。各群は１０ｍＬ／Ｋｇ投与した。
結果：初回投与１７日後、対照群の平均腫瘍体積は１５６３．１５±６３．０２ｍｍ３であった。受験サンプルとして第２群 ５Ｆ９、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第３群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ１、２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第４群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ１、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第５群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４、２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；および第６群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群の腫瘍体積を対照群と比較した結果、極めて有意差があり（Ｐ＜０．０１）、結果を図１４に示す。腫瘍阻害率（ＴＧＩ）はそれぞれ５９．７７％、５１．５０％、６５．３４％、６１．３９％、及び６７．７２％であった。
試験終了時、動物を安楽死させ、腫瘍塊を剥がして重量を測定したところ、対照群の平均腫瘍重量は１．０６１２±０．０２５２ｇであり、受験サンプルとして第２群 ５Ｆ９、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第３群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ１、２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第４群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ１、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第５群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４、２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；及び第６群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群の腫瘍重量と対照群の平均腫瘍重量では、極めて有意差があり（Ｐ＜０．０１）、腫重阻害率はそれぞれ５９．５７％、５０．１７％、５９．７６％、５７．０１％、及び６４．５６％であった。腫瘍重量の統計結果を図１５に示す。
Ｍ－ＮＳＧマウス（メス、６週齢、上海南方模式生物科技股フェン有限公司）にＲａｊｉ腫瘍細胞（右側に５×１０６個／匹皮下接種）を皮下移植し、Ｒａｊｉ移植腫モデルを作成した。接種後８日目に、腫瘍の平均体積は約１２３ｍｍ３であり、ランダムブロック法を用いて担癌マウスを６群に分け、第１群 ＰＢＳ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第２群 ５Ｆ９、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第３群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ１、２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第４群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ１、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第５群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４、２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；および第６群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群を６匹ずつとした。各群は１０ｍＬ／Ｋｇ投与した。
結果：初回投与１７日後、対照群の平均腫瘍体積は１５６３．１５±６３．０２ｍｍ３であった。受験サンプルとして第２群 ５Ｆ９、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第３群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ１、２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第４群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ１、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第５群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４、２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；および第６群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群の腫瘍体積を対照群と比較した結果、極めて有意差があり（Ｐ＜０．０１）、結果を図１４に示す。腫瘍阻害率（ＴＧＩ）はそれぞれ５９．７７％、５１．５０％、６５．３４％、６１．３９％、及び６７．７２％であった。
試験終了時、動物を安楽死させ、腫瘍塊を剥がして重量を測定したところ、対照群の平均腫瘍重量は１．０６１２±０．０２５２ｇであり、受験サンプルとして第２群 ５Ｆ９、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第３群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ１、２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第４群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ１、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；第５群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４、２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群；及び第６群 ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４、５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ、ＱＤ×１１群の腫瘍重量と対照群の平均腫瘍重量では、極めて有意差があり（Ｐ＜０．０１）、腫重阻害率はそれぞれ５９．５７％、５０．１７％、５９．７６％、５７．０１％、及び６４．５６％であった。腫瘍重量の統計結果を図１５に示す。
【0096】
実施例１７．ＤＸ－３６６９９抗体のヒト化配列の設計
ＤＸ－３６６９９抗体（ＶＨＨ）の配列情報に基づき、まず、モデル作成によりこの抗体の相同モデルを取得し、ＣＤＲのコンホメーションや抗原結合活性に影響を及ぼす、ＣＤＲｓから５A範囲にあるフレームワークアミノ酸及び希少アミノ酸をａｂｙｓｉｓソフトウェアと組み合わせて解析した。次に、ＩＭＧＴ解析によりヒト由来の生殖細胞系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）を取得し、選択されたヒト由来の生殖細胞系列のフレームワークを抗体のＣＤＲｓとスプライシングした後、設計して得られたヒト化抗体と元の抗体のフレームワーク領域配列を比較し、両者のフレームワーク領域配列に差異が存在するアミノ酸部位を探し出し、親抗体の相同モデリング結果を分析することにより、差異が存在するこれらのアミノ酸部位がＣＤＲのコンホメーションや抗原結合活性に影響するかどうかを判定した。抗体活性を維持し、異種性の減少を考慮した上で、ヒト抗体の表面残基と類似するアミノ酸と置換し、抗体のヒト化配列を設計した。４つのヒト化抗体配列を得て、これらの番号はそれぞれＤＸ－３６６９９－Ｈ７、ＤＸ－３６６９９－Ｈ１９、ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０、及びＤＸ－３６６９９－Ｈ２１であった。具体的な配列情報を表４に示す。
ＤＸ－３６６９９抗体（ＶＨＨ）の配列情報に基づき、まず、モデル作成によりこの抗体の相同モデルを取得し、ＣＤＲのコンホメーションや抗原結合活性に影響を及ぼす、ＣＤＲｓから５A範囲にあるフレームワークアミノ酸及び希少アミノ酸をａｂｙｓｉｓソフトウェアと組み合わせて解析した。次に、ＩＭＧＴ解析によりヒト由来の生殖細胞系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）を取得し、選択されたヒト由来の生殖細胞系列のフレームワークを抗体のＣＤＲｓとスプライシングした後、設計して得られたヒト化抗体と元の抗体のフレームワーク領域配列を比較し、両者のフレームワーク領域配列に差異が存在するアミノ酸部位を探し出し、親抗体の相同モデリング結果を分析することにより、差異が存在するこれらのアミノ酸部位がＣＤＲのコンホメーションや抗原結合活性に影響するかどうかを判定した。抗体活性を維持し、異種性の減少を考慮した上で、ヒト抗体の表面残基と類似するアミノ酸と置換し、抗体のヒト化配列を設計した。４つのヒト化抗体配列を得て、これらの番号はそれぞれＤＸ－３６６９９－Ｈ７、ＤＸ－３６６９９－Ｈ１９、ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０、及びＤＸ－３６６９９－Ｈ２１であった。具体的な配列情報を表４に示す。
【0097】
【表4】
【0098】
実施例１８ Ｅｘｐｉ２９３Ｆ真核発現系によるＤＸ－３６６９９及びヒト化抗体の製造
上記４つのヒト化ＶＨＨシングルドメイン抗体を用いて、２９３Ｆ発現系によりＦｃ融合二価組換え抗体（ＶＨＨ－Ｆｃ）を製造した。具体的には、Ｎ端からＣ端に向かって、「シグナルペプチド－可変領域－定常領域」の順に、シグナルペプチドアミノ酸配列（MGWSCIILFLVATATGVHS（SEQ ID NO.13））、ＤＸ－３６６９９－Ｈ７、ＤＸ－３６６９９－Ｈ１９、ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０、及びＤＸ－３６６９９－Ｈ２１アミノ酸配列（表４）をコドン最適化した後、ＤＮＡ（南京金斯瑞生物科技有限公司、南京）を全遺伝子合成し、次に、ヒトＩｇＧ４抗体（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースより、配列Ｐ１８６１、Ｓ２２８Ｐ突然変異含有）の重鎖ヒンジ領域～ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列、すなわちSEQ ID NO.39(ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK)を含むｐｃＤＮＡ３．４ベクターにタンデムにサブクローンした。シーケンシングした結果、ベクターが正しい場合、一般的な方法でコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換し、Ｑｉａｇｅｎプラスミドマックスキット（カタログ番号：１２３６２）を用いてエンドトキシンフリープラスミドを製造した。
ＬＶＴｒａｎｓｍトランスフェクション試薬（ｉＣａｒＴａｂから購入、カタログ番号ＬＶＴｒａｎ１００）の取扱書にしたがって、冷蔵庫からＬＶＴｒａｎｓｍトランスフェクション試薬及び抗体発現ベクターを取り出し、室温で解凍した後、ピペットマンで上下にピペッティングして均一に混合した。ＰＢＳ緩衝液を取り出し、室温まで加熱した。ＰＢＳ ２ｍＬを６ウェルプレートの１ウェルに取り、それぞれプラスミド１３０μｇを加え、ピペットマンで上下にピペッティングして均一に混合した後、ＬＶＴｒａｎｓｍを４００μＬ加えた直後、ピペットで上下にピペッティングして均一に混合し、室温で１０ｍｉｎ静置した。上記のＤＮＡ／ＬＶＴｒａｎｓｍ複合体を２９３Ｆ細胞培養液１２０ｍＬに加え、軽く振って十分に混合した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れて、１３０ｒｐｍで６～８ｈ培養した後、新しい培地５０ｍＬを加えて、さらに７日間培養した。
細胞培養液を１２００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞ペレットを除去し、上清を収集し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ親和精製カラム（蘇州博進生物技術有限公司、カタログ番号：１３－００１０－０２）を用いてＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体を精製し、マイクロプレートリーダでＯＤ２８０を測定してタンパク質定量を行い、適量の組換え抗体を取って還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで同定し、目標抗体の単量体分子量は３７ｋＤ～３９ｋＤであった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、そのサイズ及び純度の結果を図１６に示す。
上記４つのヒト化ＶＨＨシングルドメイン抗体を用いて、２９３Ｆ発現系によりＦｃ融合二価組換え抗体（ＶＨＨ－Ｆｃ）を製造した。具体的には、Ｎ端からＣ端に向かって、「シグナルペプチド－可変領域－定常領域」の順に、シグナルペプチドアミノ酸配列（MGWSCIILFLVATATGVHS（SEQ ID NO.13））、ＤＸ－３６６９９－Ｈ７、ＤＸ－３６６９９－Ｈ１９、ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０、及びＤＸ－３６６９９－Ｈ２１アミノ酸配列（表４）をコドン最適化した後、ＤＮＡ（南京金斯瑞生物科技有限公司、南京）を全遺伝子合成し、次に、ヒトＩｇＧ４抗体（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースより、配列Ｐ１８６１、Ｓ２２８Ｐ突然変異含有）の重鎖ヒンジ領域～ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列、すなわちSEQ ID NO.39(ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK)を含むｐｃＤＮＡ３．４ベクターにタンデムにサブクローンした。シーケンシングした結果、ベクターが正しい場合、一般的な方法でコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換し、Ｑｉａｇｅｎプラスミドマックスキット（カタログ番号：１２３６２）を用いてエンドトキシンフリープラスミドを製造した。
ＬＶＴｒａｎｓｍトランスフェクション試薬（ｉＣａｒＴａｂから購入、カタログ番号ＬＶＴｒａｎ１００）の取扱書にしたがって、冷蔵庫からＬＶＴｒａｎｓｍトランスフェクション試薬及び抗体発現ベクターを取り出し、室温で解凍した後、ピペットマンで上下にピペッティングして均一に混合した。ＰＢＳ緩衝液を取り出し、室温まで加熱した。ＰＢＳ ２ｍＬを６ウェルプレートの１ウェルに取り、それぞれプラスミド１３０μｇを加え、ピペットマンで上下にピペッティングして均一に混合した後、ＬＶＴｒａｎｓｍを４００μＬ加えた直後、ピペットで上下にピペッティングして均一に混合し、室温で１０ｍｉｎ静置した。上記のＤＮＡ／ＬＶＴｒａｎｓｍ複合体を２９３Ｆ細胞培養液１２０ｍＬに加え、軽く振って十分に混合した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れて、１３０ｒｐｍで６～８ｈ培養した後、新しい培地５０ｍＬを加えて、さらに７日間培養した。
細胞培養液を１２００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して細胞ペレットを除去し、上清を収集し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ親和精製カラム（蘇州博進生物技術有限公司、カタログ番号：１３－００１０－０２）を用いてＶＨＨ－Ｆｃ融合二価組換え抗体を精製し、マイクロプレートリーダでＯＤ２８０を測定してタンパク質定量を行い、適量の組換え抗体を取って還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで同定し、目標抗体の単量体分子量は３７ｋＤ～３９ｋＤであった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、そのサイズ及び純度の結果を図１６に示す。
【0099】
実施例１９ ヒト化抗体の赤血球凝集実験
精製により得られた４つのヒト化分子を、元の抗体ＤＸ－３６６９９ＩｇＧ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３９のスプライシング）と５Ｆ９を対照として赤血球凝集検出を行った。ヒト赤血球はＡＬＬＣＥＬＬＳ生物技術（上海）有限公司に由来する。具体的な実施方法は実施例９と同じであった。結果を図１７に示す。
４つのヒト化分子は、元の抗体の特性と一致し、測定した各濃度では、赤血球凝集を起こさなかった。５Ｆ９抗体は０．０９６ｎＭより高い濃度になると深刻な赤血球凝集反応を引き起こした。
精製により得られた４つのヒト化分子を、元の抗体ＤＸ－３６６９９ＩｇＧ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３９のスプライシング）と５Ｆ９を対照として赤血球凝集検出を行った。ヒト赤血球はＡＬＬＣＥＬＬＳ生物技術（上海）有限公司に由来する。具体的な実施方法は実施例９と同じであった。結果を図１７に示す。
４つのヒト化分子は、元の抗体の特性と一致し、測定した各濃度では、赤血球凝集を起こさなかった。５Ｆ９抗体は０．０９６ｎＭより高い濃度になると深刻な赤血球凝集反応を引き起こした。
【0100】
実施例２０ ヒト化抗体とヒト赤血球との結合のＦＡＣＳ検出
ＦＡＣＳを用いてヒト化抗体とヒト赤血球との結合を検出し、元の抗体ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４及び５Ｆ９を対照とした。ヒト赤血球はＡＬＬＣＥＬＬＳ生物技術（上海）有限公司に由来する。具体的な実施方法は実施例１０と同じであった。結果を図１８に示す。
４つのヒト化分子は、元の抗体の特性と一致し、赤血球との結合が極めて弱く、同濃度では５Ｆ９よりはるかに弱かった。
ＦＡＣＳを用いてヒト化抗体とヒト赤血球との結合を検出し、元の抗体ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４及び５Ｆ９を対照とした。ヒト赤血球はＡＬＬＣＥＬＬＳ生物技術（上海）有限公司に由来する。具体的な実施方法は実施例１０と同じであった。結果を図１８に示す。
４つのヒト化分子は、元の抗体の特性と一致し、赤血球との結合が極めて弱く、同濃度では５Ｆ９よりはるかに弱かった。
【0101】
実施例２１ ヒト化抗体とヒト血小板との結合のＦＡＣＳ検出
ＦＡＣＳ方法を用いてヒト化抗体とヒト血小板との結合を検出し、元の抗体ＤＸ－３６６９９ＩｇＧ４及び５Ｆ９を対照とした。具体的な実施方法は実施例１１と同じであった。結果を図１９に示す。
４つのヒト化分子は、元の抗体の特性と一致し、ヒト血小板との結合が極めて弱く、同濃度では５Ｆ９よりもはるかに弱かった。
ＦＡＣＳ方法を用いてヒト化抗体とヒト血小板との結合を検出し、元の抗体ＤＸ－３６６９９ＩｇＧ４及び５Ｆ９を対照とした。具体的な実施方法は実施例１１と同じであった。結果を図１９に示す。
４つのヒト化分子は、元の抗体の特性と一致し、ヒト血小板との結合が極めて弱く、同濃度では５Ｆ９よりもはるかに弱かった。
【0102】
実施例２２ ヒト化抗体とＣＤ４７との結合のＦＡＣＳ検出
ＦＡＣＳ方法を用いてヒト化抗体と細胞表面ＣＤ４７との結合を検出し、元の抗体ＤＸ３６６９９－ＩｇＧ４を対照とした。検出に用いた細胞はＣＤ４７陽性のＪｕｒｋａｔ細胞（中国科学院細胞バンク、カタログ番号ＳＣＳＰ－５１３）であった。具体的な実施方法は実施例１２（ＮＵＧＣ－４細胞をＪｕｒｋａｔ細胞に変更した以外、残りの条件は変更しない）とした。結果を図２０に示す。
４つのヒト化分子は細胞表面ＣＤ４７に濃度依存的に結合し、その結合活性は元の抗体ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４と一致した。
ＦＡＣＳ方法を用いてヒト化抗体と細胞表面ＣＤ４７との結合を検出し、元の抗体ＤＸ３６６９９－ＩｇＧ４を対照とした。検出に用いた細胞はＣＤ４７陽性のＪｕｒｋａｔ細胞（中国科学院細胞バンク、カタログ番号ＳＣＳＰ－５１３）であった。具体的な実施方法は実施例１２（ＮＵＧＣ－４細胞をＪｕｒｋａｔ細胞に変更した以外、残りの条件は変更しない）とした。結果を図２０に示す。
４つのヒト化分子は細胞表面ＣＤ４７に濃度依存的に結合し、その結合活性は元の抗体ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４と一致した。
【0103】
実施例２３ ヒト化抗体のＣＤ４７－ＳＩＲＰαの結合遮断のＦＡＣＳ検出
ＦＡＣＳ方法を用いて、ＳＩＲＰα組換えタンパク質とＪｕｒｋａｔ細胞（膜型ＣＤ４７発現）との相互作用に対するヒト化抗体の遮断活性を検出し、元の抗体ＤＸ－３６６９９ＩｇＧ４を対照とした。具体的な実施方法は実施例１３と同じであった。結果を図２１に示す。
４つのヒト化分子は全てＳＩＲＰα組換えタンパク質とＣＤ４７陽性細胞Ｊｕｒｋａｔとの相互作用を濃度依存的に遮断でき、その遮断活性は元の抗体ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４と一致した。
ＦＡＣＳ方法を用いて、ＳＩＲＰα組換えタンパク質とＪｕｒｋａｔ細胞（膜型ＣＤ４７発現）との相互作用に対するヒト化抗体の遮断活性を検出し、元の抗体ＤＸ－３６６９９ＩｇＧ４を対照とした。具体的な実施方法は実施例１３と同じであった。結果を図２１に示す。
４つのヒト化分子は全てＳＩＲＰα組換えタンパク質とＣＤ４７陽性細胞Ｊｕｒｋａｔとの相互作用を濃度依存的に遮断でき、その遮断活性は元の抗体ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４と一致した。
【0104】
実施例２４ ヒト化抗体の親和性のＢｉａｃｏｒｅ検出
ヒト化抗体ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０を選択し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｈｕＣＤ４７との親和性を検出し、元の抗体ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４と比較した。具体的な実施方法は、実施例１４と同じであった。その結果、表５に示すように、ヒト化抗体ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０の親和性は元の抗体ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４と一致した。
ヒト化抗体ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０を選択し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｈｕＣＤ４７との親和性を検出し、元の抗体ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４と比較した。具体的な実施方法は、実施例１４と同じであった。その結果、表５に示すように、ヒト化抗体ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０の親和性は元の抗体ＤＸ－３６６９９－ＩｇＧ４と一致した。
【0105】
【表5】
【0106】
実施例２５ ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０とカニクイザルの赤血球との結合
ＦＡＣＳを用いてヒト化抗体ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０とカニクイザルの赤血球との結合を検出し、５Ｆ９を対照とした。カニクイザルの赤血球は上海益諾思生物技術有限公司に由来し、４つの赤血球の番号はそれぞれ１８６＃、１８８＃、１９４＃、及び５６７＃である。具体的な実施方法は実施例１０と同じであった。結果を図２２に示す。
５Ｆ９は４つのカニクイザルの赤血球の全てに濃度依存的に結合し、強い結合活性を有し、最大結合５０％に達したときの５Ｆ９抗体の濃度は０．０１～０．０３μｇ／ｍＬであった。同じ実験条件では、ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０はカニクイザルの赤血球と弱い結合しかなかった。
ＦＡＣＳを用いてヒト化抗体ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０とカニクイザルの赤血球との結合を検出し、５Ｆ９を対照とした。カニクイザルの赤血球は上海益諾思生物技術有限公司に由来し、４つの赤血球の番号はそれぞれ１８６＃、１８８＃、１９４＃、及び５６７＃である。具体的な実施方法は実施例１０と同じであった。結果を図２２に示す。
５Ｆ９は４つのカニクイザルの赤血球の全てに濃度依存的に結合し、強い結合活性を有し、最大結合５０％に達したときの５Ｆ９抗体の濃度は０．０１～０．０３μｇ／ｍＬであった。同じ実験条件では、ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０はカニクイザルの赤血球と弱い結合しかなかった。
【0107】
実施例２６ ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０とカニクイザルの血小板との結合
ＦＡＣＳを用いてヒト化抗体ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０とカニクイザルの赤血球との結合を検出し、５Ｆ９を対照とした。カニクイザルの血小板は上海益諾思生物技術有限公司に由来し、４つの血小板の番号はそれぞれ１８６＃、１８８＃、１９４＃、及び５６７＃である。具体的な実施方法は実施例１１と同じであった。結果を図２３に示す。
５Ｆ９は、４つのカニクイザルの全ての血小板に濃度依存性に結合し、５Ｆ９濃度が０．１μｇ／ｍＬより大きい場合には明らかな結合活性が測定された。同じ実験条件では、測定した濃度範囲（０．００１～１０μｇ／ｍＬ）では、ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０とカニクイザルの血小板では、測定可能な結合シグナルは認められなかった。
ＦＡＣＳを用いてヒト化抗体ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０とカニクイザルの赤血球との結合を検出し、５Ｆ９を対照とした。カニクイザルの血小板は上海益諾思生物技術有限公司に由来し、４つの血小板の番号はそれぞれ１８６＃、１８８＃、１９４＃、及び５６７＃である。具体的な実施方法は実施例１１と同じであった。結果を図２３に示す。
５Ｆ９は、４つのカニクイザルの全ての血小板に濃度依存性に結合し、５Ｆ９濃度が０．１μｇ／ｍＬより大きい場合には明らかな結合活性が測定された。同じ実験条件では、測定した濃度範囲（０．００１～１０μｇ／ｍＬ）では、ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０とカニクイザルの血小板では、測定可能な結合シグナルは認められなかった。
【0108】
実施例２７ ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０のカニクイザルにおける毒物学研究
ＣＤ４７抗原は赤血球で高発現しており、ＣＤ４７抗原に対して開発された第１世代抗体は５Ｆ９抗体を含むが、赤血球と結合し赤血球凝集、溶血及びマクロファージ貪食を誘導するため、重篤な貧血は主要な副作用の一つである。
カニクイザル４頭（雌２＋雄２、番号はそれぞれ２＃、３＃、４＃及び５＃）を２群に分け、それぞれ５Ｆ９とＤＸ－３６６９９－Ｈ２０を１回静脈点滴し、投与量はいずれも１５ｍｇ／ｋｇとした。投与前８日目、投与前２日目及び投与後３、５、９、１３、２１日目にカニクイザル非投与肢静脈から０．５ｍＬ採血し、血液サンプルをしゅう採取した後、サンプル番号が付けられたＥＤＴＡ－Ｋ２抗凝固管に入れ、アイスボックスに入れ、採取後２ｈ以内に血液ルーチンメータにより赤血球数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、網状赤血球の数と割合、赤血球体積分布幅、平均ヘモグロビン量と濃度、及び赤血球平均体積を検査した。その結果、図２４に示すように、５Ｆ９静脈点滴後３日目から貧血が認められ、赤血球カウント、ヘマトクリッ及びとヘモグロビン濃度が低下し、低下傾向は９日目まで持続し、２１日目には基本的に投薬前のレベルに回復し、末梢赤血球減少による貧血は骨髄の網状赤血球（未成熟赤血球）の代償性上昇による末梢赤血球レベル補充を伴い、網状赤血球は末梢赤血球減少性貧血の敏感な指標とすることができる。５Ｆ９静脈点滴後３日目から網状赤血球数及び割合では、明らかな代償性増加が現れ、１３日目まで持続し、２１日目には基本的に投薬前のレベルに回復し、ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０の静脈点滴は測定した赤血球関連の各指標に影響がなく、動物では、貧血はなかった。
この結果は、インビトロでの５Ｆ９及びＤＸ－３６６９９－Ｈ２０と赤血球との結合及び赤血球凝集実験の結果と一致しており、このことから、ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０は赤血球凝集を起こさず、赤血球との結合が極めて弱いため、カニクイザルの体内に１５ｍｇ／ｋｇのＤＸ－３６６９９－Ｈ２０を投与しても貧血の副作用は認められないことが示唆された。ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０は、カニクイザルでは、５Ｆ９より安全性の優位性を示し、第１世代ＣＤ４７抗体の臨床使用による貧血の副作用の問題を解決する潜在力を持っている。
ＣＤ４７抗原は赤血球で高発現しており、ＣＤ４７抗原に対して開発された第１世代抗体は５Ｆ９抗体を含むが、赤血球と結合し赤血球凝集、溶血及びマクロファージ貪食を誘導するため、重篤な貧血は主要な副作用の一つである。
カニクイザル４頭（雌２＋雄２、番号はそれぞれ２＃、３＃、４＃及び５＃）を２群に分け、それぞれ５Ｆ９とＤＸ－３６６９９－Ｈ２０を１回静脈点滴し、投与量はいずれも１５ｍｇ／ｋｇとした。投与前８日目、投与前２日目及び投与後３、５、９、１３、２１日目にカニクイザル非投与肢静脈から０．５ｍＬ採血し、血液サンプルをしゅう採取した後、サンプル番号が付けられたＥＤＴＡ－Ｋ２抗凝固管に入れ、アイスボックスに入れ、採取後２ｈ以内に血液ルーチンメータにより赤血球数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、網状赤血球の数と割合、赤血球体積分布幅、平均ヘモグロビン量と濃度、及び赤血球平均体積を検査した。その結果、図２４に示すように、５Ｆ９静脈点滴後３日目から貧血が認められ、赤血球カウント、ヘマトクリッ及びとヘモグロビン濃度が低下し、低下傾向は９日目まで持続し、２１日目には基本的に投薬前のレベルに回復し、末梢赤血球減少による貧血は骨髄の網状赤血球（未成熟赤血球）の代償性上昇による末梢赤血球レベル補充を伴い、網状赤血球は末梢赤血球減少性貧血の敏感な指標とすることができる。５Ｆ９静脈点滴後３日目から網状赤血球数及び割合では、明らかな代償性増加が現れ、１３日目まで持続し、２１日目には基本的に投薬前のレベルに回復し、ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０の静脈点滴は測定した赤血球関連の各指標に影響がなく、動物では、貧血はなかった。
この結果は、インビトロでの５Ｆ９及びＤＸ－３６６９９－Ｈ２０と赤血球との結合及び赤血球凝集実験の結果と一致しており、このことから、ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０は赤血球凝集を起こさず、赤血球との結合が極めて弱いため、カニクイザルの体内に１５ｍｇ／ｋｇのＤＸ－３６６９９－Ｈ２０を投与しても貧血の副作用は認められないことが示唆された。ＤＸ－３６６９９－Ｈ２０は、カニクイザルでは、５Ｆ９より安全性の優位性を示し、第１世代ＣＤ４７抗体の臨床使用による貧血の副作用の問題を解決する潜在力を持っている。
【0109】
【表6-1】
【0110】
【表6-2】
【0111】
以上、図面を参照して本発明の実施形態を参照したが、本発明は、上記の具体的な実施形態及び応用の分野に限定されるものではなく、上記の具体的な実施形態は、単に例示的且つ指導的であり、限定的なものではない。当業者は、本明細書に基づいて、本発明の請求項によって保護される範囲から逸脱することなく様々な形態を行うことができ、これらは全て本発明の特許範囲に含まれるものとする。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-12-21
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）であって、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３から選択されるＣＤＲを含む、抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体。
【請求項2】
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含み、好ましく、
前記ＦＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記ＦＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記ＦＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記ＦＲ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４から選択されるアミノ酸配列を含み、
更に好ましく、抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシングルドメイン抗体。
【請求項3】
ヒト化したものである、請求項１又は２に記載のシングルドメイン抗体。
【請求項4】
重鎖Ｆｃ領域として、ヒンジ領域、ＣＨ２、及びＣＨ３から選択される領域をさらに含み、好ましく、前記重鎖はＩｇＧ１又はＩｇＧ４である、請求項２に記載のシングルドメイン抗体。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含み、好ましく、前記シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片は、薬物、毒素、細胞毒性剤、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素に結合する、コンジュゲート。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含み、好ましく、前記シングルドメイン抗体又はその抗原結合断片と診断・治療分子とが融合した、融合タンパク質。
【請求項7】
請求項１～４のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項8】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、好ましく、ファージ、細菌又は酵母である、ベクター。
【請求項9】
請求項７に記載のポリヌクレオチド又は請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましく、原核又は真核生物宿主細胞であり、更に好ましく、大腸菌である、宿主細胞。
【請求項10】
請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体の生産方法であって、請求項９に記載の宿主細胞を培養するステップ（ａ）と、培養物から抗ＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体を単離するステップ（ｂ）とを少なくとも含む生産方法。
【請求項11】
診断マーカー付き請求項１～４のいずれか１項に記載のＣＤ４７重鎖シングルドメイン抗体であって、好ましく、前記診断マーカーは、同位体、コロイド金マーカー、着色マーカー又は蛍光マーカーから選択される、シングルドメイン抗体。
【請求項12】
請求項１～４のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、請求項５に記載のコンジュゲート、請求項６に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項13】
請求項１～４と１２に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片を含む、ＣＤ４７タンパク質を検出する製品又はキット。
【請求項14】
請求項１～４と１２に記載のシングルドメイン抗体又はその抗原結合断片の、ＣＤ４７タンパク質の検出における使用。
【請求項15】
請求項１～４のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、請求項５に記載のコンジュゲート、請求項６に記載の融合タンパク質の癌治療における使用であって、好ましく、前記シングルドメイン抗体、コンジュゲート又は融合タンパク質を他の１種又は複数種の抗体又は薬物と併用し、更に好ましく、前記他の１種又は複数種の抗体はチェックポイント抗体である、使用。
【国際調査報告】