特表 2023-516629 水痘帯状疱疹ウイルス融合タンパク質およびこれを含む免疫原性組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-20

(54)【発明の名称】水痘帯状疱疹ウイルス融合タンパク質およびこれを含む免疫原性組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230413BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230413BHJP

   C12N 15/38 20060101ALI20230413BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20230413BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230413BHJP

   C07K 14/04 20060101ALI20230413BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230413BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20230413BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230413BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230413BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230413BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230413BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230413BHJP

   A61K 39/25 20060101ALI20230413BHJP

   A61P 31/22 20060101ALI20230413BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C12N15/13 ZNA

C12N15/38

C12N15/85

C12P21/02 C

C07K14/04

C12N15/63 Z

C07K16/00

C07K19/00

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/25

A61P31/22

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022551821

(86)(22)【出願日】2021-03-02

(85)【翻訳文提出日】2022-08-26

(86)【国際出願番号】 KR2021002580

(87)【国際公開番号】W WO2021172971

(87)【国際公開日】2021-09-02

(31)【優先権主張番号】10-2020-0025608

(32)【優先日】2020-02-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】515074983

【氏名又は名称】セルトリオン， インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】リュウ、ドン キュン

(72)【発明者】

【氏名】キム、パン キョム

(72)【発明者】

【氏名】ノ、ハン ミ

(72)【発明者】

【氏名】パク、グン ス

(72)【発明者】

【氏名】イ、ス ヤン

(72)【発明者】

【氏名】シム、ウン ヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム、ミン ス

(72)【発明者】

【氏名】ラ、ワン グン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG32

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA45

4C085AA03

4C085AA38

4C085BA79

4C085CC08

4C085CC22

4C085DD62

4C085EE01

4C085FF02

4C085FF12

4C085GG01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA03

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA21

(57)【要約】

本発明は、水痘帯状疱疹ウイルス融合タンパク質およびこれを含む免疫原性組成物に関し、さらに詳しくは、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）の糖タンパク質Ｅ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ｇＥ）および免疫グロブリン分子の不変部を含む融合タンパク質およびこれを含む免疫原性組成物に関する。本発明は、水痘帯状疱疹ウイルス－特異的細胞－媒介免疫反応を著しく増加させるだけでなく、既存のワクチンに比べて免疫反応を迅速かつ強く起こるようにし、長期間持続可能な効果を示すので、水痘帯状疱疹関連の疾患を予防するのに有用に使用できる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）の糖タンパク質Ｅ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ｇＥ）および免疫グロブリン分子の不変部を含む融合タンパク質。

【請求項2】

前記水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅは、Ｃ－末端アンカー領域が除去されるようにトランケート（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）されることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅは、配列番号１の配列を有することを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＡからなる群より選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記免疫グロブリンは、ＩｇＧであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

前記免疫グロブリン分子の不変部は、ＩｇＧ１重鎖の不変部であることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

前記免疫グロブリン分子の不変部は、ＩｇＧ１のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

前記免疫グロブリン分子の不変部は、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを追加的に含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

前記免疫グロブリン分子の不変部は、Ｆｃ部位を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

前記Ｆｃ部位は、Ｆｃ受容体と結合して免疫原性を増進させることを特徴とする請求項１０に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

前記Ｆｃ部位は、Ｆｃ変異体を含むことを特徴とする請求項１０に記載の融合タンパク質。

【請求項13】

前記Ｆｃ変異体は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅから構成された群より選択された１つ以上の変異を含むことを特徴とする請求項１２に記載の融合タンパク質。

【請求項14】

前記Ｆｃ変異体は、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ変異を含むことを特徴とする請求項１２に記載の融合タンパク質。

【請求項15】

前記Ｆｃ部位は、配列番号２または配列番号３の配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の融合タンパク質。

【請求項16】

前記Ｆｃ変異体は、配列番号４または配列番号５の配列を含むことを特徴とする請求項１２に記載の融合タンパク質。

【請求項17】

請求項１～１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質を暗号化する核酸分子。

【請求項18】

請求項１７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。

【請求項19】

請求項１８に記載の発現ベクターが形質転換された宿主細胞。

【請求項20】

ｉ）請求項１８に記載の発現ベクターを動物細胞発現システムに導入するステップ；および
ｉｉ）融合タンパク質の発現を行うステップ
を含む、融合タンパク質を製造する方法。

【請求項21】

請求項１～１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む免疫原性組成物。

【請求項22】

前記融合タンパク質は、モノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）であることを特徴とする請求項２１に記載の免疫原性組成物。

【請求項23】

前記融合タンパク質は、ダイマー（ｄｉｍｅｒ）であることを特徴とする請求項２１に記載の免疫原性組成物。

【請求項24】

前記ダイマーは、２つの融合タンパク質のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域で二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）によって成されることを特徴とする請求項２３に記載の免疫原性組成物。

【請求項25】

アジュバントを追加的に含むことを特徴とする請求項２１に記載の免疫原性組成物。

【請求項26】

前記アジュバントは、ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）作用剤、アルミニウム塩、サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）およびリポソームから構成された群より選択されるいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項２５に記載の免疫原性組成物。

【請求項27】

前記ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）作用剤は、ＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ）および３Ｄ－ＭＰＬから構成された群より選択されるいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項２６に記載の免疫原性組成物。

【請求項28】

前記アルミニウム塩は、アルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、アルミニウムホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびアルミニウムスルフェート（ｓｕｌｐｈａｔｅ）から構成された群より選択されるいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項２６に記載の免疫原性組成物。

【請求項29】

前記サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）は、ＱＳ２１、ＱＳ１７およびＱｕｉｌＡから構成された群より選択されるいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項２６に記載の免疫原性組成物。

【請求項30】

請求項２１～２９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を含むキット。

【請求項31】

請求項２１～２９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を投与して免疫反応を誘導する方法。

【請求項32】

請求項２１～２９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を投与して水痘帯状疱疹または帯状疱疹後神経痛を予防する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、水痘帯状疱疹ウイルス融合タンパク質およびこれを含む免疫原性組成物に関し、さらに詳しくは、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）の糖タンパク質Ｅ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ｇＥ）および免疫グロブリン分子の不変部を含む融合タンパク質およびこれを含む免疫原性組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）は、バリセロウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）属（ｇｅｎｕｓ）のヒトアルファヘルペスウイルス（ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）の一つであり、水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ、ｃｈｉｃｋｅｎｐｏｘ）と帯状疱疹（ｚｏｓｔｅｒ、ｓｈｉｎｇｌｅｓ）の原因になる。水痘帯状疱疹ウイルスの一次感染は上気道粘膜（ｕｐｐｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｍｕｃｏｓａ）の上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）で起こり、１０～２１日の潜伏期を経て全身皮膚に水疱性発疹（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｒａｓｈ）を特徴とする水痘（ｃｈｉｃｋｅｎｐｏｘ）を起こす。初期感染（ｐｒｉｍａｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）中、水痘帯状疱疹ウイルスは、感染した皮膚または血液から軸索輸送（ａｘｏｎａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）によって宿主の神経節（ｇａｎｇｌｉａ）の感覚神経細胞（ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｒｖｅ ｃｅｌｌ）に進入して数年間潜伏感染（ｌａｔｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を起こすことがある。神経節に潜伏した水痘帯状疱疹ウイルスは、宿主の免疫力が低下すると再活性化（ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）されて帯状疱疹疾患を発生させることがある。帯状疱疹は、神経節が分布した皮膚分節（ｄｅｒｍａｔｏｍｅ）に激しい痛みと水疱型皮膚発疹を伴い、適切な治療ができない場合、帯状疱疹後神経痛（ｐｏｓｔ－ｈｅｒｐｅｔｉｃ ｎｅｕｒａｌｇｉａ、ＰＨＮ）など深刻な後遺症を誘発することが知られている。

【0003】

水痘帯状疱疹ウイルス遺伝体（ｇｅｎｏｍｅ）は、線状の二重螺旋のＤＮＡ構造で約１２５，０００ｂｐの長さであり、最低７１個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）とプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）をエンコードする。そのうち、９個はウイルス外被の表面糖タンパク質（ｇＢ、ｇＣ、ｇＥ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＮおよびｇＭ）を構成し、ウイルスの複製および進入に関与することが知られている。

【0004】

現在、帯状疱疹の予防に使用されているワクチンは、大きく、弱毒化生ワクチン（ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ）または免疫増強剤が含まれた組換えタンパク質ワクチンがある。弱毒化生ワクチンは、弱毒化された生きているウイルスを用いる初期の方式であり、免疫増強剤が含まれた組換えタンパク質ワクチンはタンパク質抗原に免疫増強剤を含ませた方式である。

【0005】

免疫増強剤を含む組換えタンパク質ワクチン方式は、既存の弱毒化生ワクチン方式のデメリットを下記のように補うためのものであって、弱毒化生ワクチンの場合、帯状疱疹と帯状疱疹後神経痛の予防に対する効力が比較的低く、年齢の増加とともにその効力が大きく減少するというデメリットがあるが、免疫増強剤が含まれた組換えタンパク質ワクチンは、臨床試験により年齢に関係なく高い効力および防御力を示すことが確認された。また、弱毒化生ワクチンは、ウイルスの病原性を除去したとしても、依然として生きているウイルスを用いて製造するため、免疫力低下者には使用できないというデメリットがあるが、免疫増強剤が含まれた組換えタンパク質ワクチンは免疫力低下者にも使用可能というメリットを有している。

【0006】

このような免疫増強剤が含まれた組換えタンパク質ワクチンは、弱毒化生ワクチンの効力および安全性の面で改善されたワクチンである。しかし、このワクチンの帯状疱疹予防率は約９０％水準であり、サポニン系の免疫増強剤を使用するため、局所的な痛みを誘発する場合がある。これとともに、帯状疱疹および帯状疱疹後神経痛の予防のためには、水痘帯状疱疹ウイルス抗原に対する体液性免疫反応（ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の誘導だけではなく、細胞媒介免疫原性（ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ、ＣＭＩ）の活性化が予防に直接的な役割を果たすことが知られている。

【0007】

したがって、弱毒化生ワクチンとサポニン系の免疫増強剤が含まれた組換えタンパク質ワクチンのデメリットを有さず、より安全かつ細胞媒介免疫原性を選択的に増加させることができる新たな帯状疱疹ワクチン組成物の開発が必要なのが現状である。

【0008】

例えば、現在、全世界で広く接種されている帯状疱疹ワクチンであるゾスタバックス（Ｚｏｓｔａｖａｘ）は代表的な弱毒化生ワクチンで、ＯＫＡというワクチンウイルス株を用いて動物細胞の培養および精製工程を経て製造される。このような形態のワクチンは効力が低く、特に、年齢とともに効力が急激に低下し、免疫低下者に使用できないというデメリットがある。また、広く使用されている帯状疱疹ワクチンであるシングリックス（Ｓｈｉｎｇｒｉｘ）は免疫増強剤が含まれた代表的な組換えタンパク質ワクチンで、ｇＥ糖タンパク質は動物細胞の培養および精製工程で製造され、これにＡＳ０１免疫増強剤（リポソーム、ＭＰＬおよびＱＳ２１を含む）が含まれる。効力は約９０％であり、免疫増強剤による局所的な痛みの副作用などが報告される。

【0009】

上記のような従来のワクチンは効力および安全性の問題があり、予防の効果がやや制限的であり、局所的な痛みを誘発するなどの問題点が存在する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

そこで、本発明者らは、ワクチン投与による副作用を低減しながらも効力を大きく改善した新たなワクチン組成物の効能を確認して、本発明を完成するに至った。

【0011】

したがって、本発明が解決しようとする課題は、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）の糖タンパク質Ｅ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ｇＥ）および免疫グロブリン分子の不変部を含む融合タンパク質を提供することである。

【0012】

また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記融合タンパク質を暗号化する核酸分子を提供することである。

【0013】

また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記核酸分子を含む発現ベクターを提供することである。

【0014】

また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記発現ベクターが形質転換された宿主細胞を提供することである。

【0015】

また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記融合タンパク質を製造する方法を提供することである。

【0016】

また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記融合タンパク質を含む免疫原性組成物を提供することである。

【0017】

また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記免疫原性組成物を含むキットを提供することである。

【0018】

また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記免疫原性組成物を投与して免疫反応を誘導する方法を提供することである。

【0019】

これとともに、本発明が解決しようとするさらに他の課題は、前記免疫原性組成物を投与して水痘帯状疱疹または帯状疱疹後神経痛を予防する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0020】

上記の課題を解決すべく、本発明は、水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）および免疫グロブリン分子の不変部を含む融合タンパク質を提供する。

【0021】

本発明による融合タンパク質において、前記水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅは、Ｃ－末端アンカー領域が除去されるようにトランケート（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）されたものであってもよい。本発明による融合タンパク質の糖タンパク質Ｅは、配列番号１で記載されるものであってもよい。

【0022】

本発明による融合タンパク質において、前記免疫グロブリン分子の不変部（例、Ｆｃ部位）は、Ｆｃ受容体と結合して免疫原性を増進させるものであってもよい。本発明による融合タンパク質の前記免疫グロブリン分子の不変部は、免疫グロブリン重鎖の不変部位であってもよいが、これに限定されるものではない。前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＡからなる群より選択されるいずれか１つであってもよいが、これに限定されるものではない。一具体例において、前記免疫グロブリンは、ＩｇＧであってもよいが、これに限定されるものではない。一具体例において、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択されるいずれか１つであってもよいが、これに限定されるものではない。一具体例において、前記免疫グロブリン分子の不変部は、ＩｇＧ１重鎖の不変部であってもよいが、これに限定されるものではない。一具体例において、前記免疫グロブリン分子の不変部は、ＩｇＧ１のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むことができ、他の具体例において、前記免疫グロブリン分子の不変部は、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを追加的に含むことができるが、これに限定されるものではない。一具体例において、前記免疫グロブリン分子の不変部は、Ｆｃ部位を含むことができる。一具体例において、前記Ｆｃ部位は、Ｆｃ受容体と結合して免疫原性を増進させることができる。

【0023】

一具体例において、前記Ｆｃ部位は、Ｆｃ変異体を含むことができる。一具体例において、前記Ｆｃ変異体は、Ｆｃ受容体との結合力を増進させることができる、１つ以上のＦｃ変異を含むことができる。一具体例において、前記Ｆｃ変異体は、Ｆｃ受容体との結合力を増進させて免疫原性を増進させることができる、１つ以上のＦｃ変異を含むことができる。一具体例において、前記Ｆｃ変異体は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅから構成された群より選択された１つ以上の変異を含むことができる。一具体例において、前記Ｆｃ変異体は、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ変異をすべて含むことができるが、これに限定されるものではない。一具体例において、前記Ｆｃ部位は、配列番号２または配列番号３の配列を含むことができるが、この配列に限定されるものではない。一具体例において、前記Ｆｃ変異体は、配列番号４または配列番号５の配列を含むことができるが、この配列に限定されるものではない。本発明の一実施例において、動物実験のためにマウスのＦｃまたはマウスのＦｃ変異体を使用したが、当業者は目的に応じてヒトＦｃまたはヒトＦｃ変異体に置換して使用することができる。

【0024】

また、本発明は、前記融合タンパク質を暗号化する核酸分子を提供する。

【0025】

また、本発明は、前記核酸分子を含む発現ベクターを提供する。

【0026】

また、本発明は、前記発現ベクターが形質転換された宿主細胞を提供する。

【0027】

また、本発明は、
ｉ）前記発現ベクターを動物細胞発現システムに導入するステップ；および
ｉｉ）融合タンパク質の発現を行うステップ
を含む、融合タンパク質を製造する方法を提供する。

【0028】

本発明の他の課題を解決すべく、本発明は、前記融合タンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。

【0029】

一具体例において、前記融合タンパク質は、モノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）であってもよいが、これに限定されるものではない。他の具体例において、前記融合タンパク質は、ダイマー（ｄｉｍｅｒ）であってもよいが、これに限定されるものではない。ここで、前記ダイマーは、２つの融合タンパク質のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域で二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）によって成されてもよいが、これに限定されるものではない。

【0030】

本発明による免疫原性組成物は、アジュバントを追加的に含むことができ、前記アジュバントは、ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）作用剤、アルミニウム塩、サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）およびリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）から構成された群より選択される１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0031】

前記ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）作用剤は、ＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ）および３Ｄ－ＭＰＬから構成された群より選択されるいずれか１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0032】

前記アルミニウム塩は、アルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、アルミニウムホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびアルミニウムスルフェート（ｓｕｌｐｈａｔｅ）から構成された群より選択されるいずれか１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0033】

前記サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）は、ＱＳ２１、ＱＳ１７およびＱｕｉｌＡから構成された群より選択されるいずれか１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0034】

また、本発明のさらに他の課題を解決すべく、本発明は、前記免疫原性組成物を含むキットを提供する。

【0035】

また、本発明のさらに他の課題を解決すべく、本発明は、前記免疫原性組成物を投与して免疫反応を誘導する方法を提供する。

【0036】

これとともに、本発明のさらに他の課題を解決すべく、本発明は、前記免疫原性組成物を投与して水痘帯状疱疹または帯状疱疹後神経痛を予防する方法を提供する。

【発明の効果】

【0037】

本発明による水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）および免疫グロブリン分子の不変部を含む融合タンパク質およびこれを含む免疫原性組成物は、水痘帯状疱疹ウイルス－特異的細胞－媒介免疫反応を著しく増加させることができる。これにより、本発明による融合タンパク質は、既存のワクチンに比べて免疫反応が迅速かつ強く起こるだけでなく、長期間持続可能な効果を示すので、水痘帯状疱疹関連の疾患を予防するのに有用に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】ｇＥ－Ｆｃ＋ＭＰＬ＋ａｌｕｍの組み合わせの水痘帯状疱疹ウイルス抗原に特異的にインターフェロンガンマを分泌する免疫細胞の数を示す。

【図2】ｇＥ－Ｆｃ＋ＭＰＬ＋ａｌｕｍの組み合わせの水痘帯状疱疹ウイルスの表面糖タンパク質Ｅに特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の生成量を示す。

【図3】ｇＥ－Ｆｃ’＋ＭＰＬ＋ａｌｕｍの組み合わせの水痘帯状疱疹ウイルス抗原に特異的にインターフェロンガンマを分泌する免疫細胞の数を示す。

【図4】ｇＥ－Ｆｃ’＋ＭＰＬ＋ａｌｕｍの組み合わせの水痘帯状疱疹ウイルスの表面糖タンパク質Ｅに特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の生成量を示す。

【発明を実施するための形態】

【0039】

以下、本発明をより具体的に説明する。しかし、本記載は本発明の理解のためのものに過ぎず、ある意味でも本発明の範囲が詳細な説明に記載された事項によって限定されるものではない。

【0040】

本発明の範囲は、以下説明される内容によって制限されず、特に、以下の実施例などに記載された実験条件などによって可変できる一切のものを含むことができる。本発明の範囲は添付した請求項によって制限されるので、単にさらなる理解のために本明細書で使われた用語は、本発明の詳細な実施例を説明する目的のためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれに制限されてはならない。

【0041】

本明細書において他に定義されない限り、本明細書で使われたすべての技術的、そして科学用語は当業界における通常の知識を有する者に一般的に理解される用語と同一の意味で解釈される。本明細書に言及されたすべての参照文献は、これらの公開された全体の内容が本明細書の発明を説明するための参照された内容で、本発明の明細書の内容として統合される。

【0042】

本発明は、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）の糖タンパク質Ｅ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ｇＥ）および免疫グロブリン分子の不変部を含む融合タンパク質に関し、より具体的な例として、水痘帯状疱疹ウイルスの表面糖タンパク質Ｅのカルボキシ末端（Ｃａｒｂｏｘｙｌ ｔｅｒｍｉｎｕｓ）に、免疫グロブリン重鎖の不変部部分（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）のアミノ末端（Ａｍｉｎｏ ｔｅｒｍｉｎｕｓ）がペプチド結合により連結されたＦｃ－融合タンパク質を提供する。

【0043】

前記水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅは、Ｃ－末端アンカー領域が除去されるようにトランケート（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）されたものであってもよい。この時、前記糖タンパク質Ｅは、配列番号１の配列で記載されるものであってもよい。

【0044】

前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＡからなる群より選択されるいずれか１つであってもよいが、これに限定されるものではない。一具体例において、前記免疫グロブリンは、ＩｇＧであってもよいが、これに限定されるものではない。一具体例において、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択されるいずれか１つであってもよいが、これに限定されるものではない。一具体例において、前記免疫グロブリン分子の不変部は、ＩｇＧ１重鎖の不変部であってもよいが、これに限定されるものではない。一具体例において、前記免疫グロブリン分子の不変部は、ＩｇＧ１のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むことができれば、前記免疫グロブリン分子の不変部は、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを追加的に含むことができるが、これに限定されるものではない。一具体例において、前記免疫グロブリン分子の不変部は、Ｆｃ部位を含むことができるが、これに限定されるものではない。一具体例において、前記Ｆｃ部位は、Ｆｃ受容体と結合して免疫原性を増進させることができるが、これに限定されるものではない。一具体例において、前記Ｆｃ部位は、配列番号２または配列番号３の配列を含むことができるが、この配列に限定されるものではない。

【0045】

また、前記Ｆｃ部位は、Ｆｃ変異体を含むことができるが、これに限定されるものではない。前記Ｆｃ変異体は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅから構成された群より選択された１つ以上の変異を含むことができる。前記Ｆｃ変異体は、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ変異をすべて含むことができるが、これに限定されるものではない。前記Ｆｃ変異位置のナンバリング方式は、ＥＵ方式によるが、これに限定されるものではない。一具体例において、前記Ｆｃ変異体は、配列番号４または配列番号５の配列を含むことができるが、この配列に限定されるものではない。

【0046】

また、本発明は、前記融合タンパク質を暗号化する核酸分子を提供する。

【0047】

また、本発明は、前記核酸分子を含む発現ベクターを提供する。

【0048】

また、本発明は、前記発現ベクターが形質転換された宿主細胞を提供する。

【0049】

また、本発明は、
ｉ）前記発現ベクターを動物細胞発現システムに導入するステップ；および
ｉｉ）融合タンパク質の発現を行うステップ
を含む、融合タンパク質を製造する方法を提供する。

【0050】

また、本発明は、前記融合タンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。

【0051】

一具体例において、前記融合タンパク質は、モノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）であってもよいが、これに限定されるものではない。他の具体例において、前記融合タンパク質は、ダイマー（ｄｉｍｅｒ）であってもよいが、これに限定されるものではない。ここで、前記ダイマーは、２つの融合タンパク質のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域で二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）によって成されてもよいが、これに限定されるものではない。

【0052】

本発明による免疫原性組成物は、アジュバントを追加的に含むことができ、前記アジュバントは、ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）作用剤、アルミニウム塩、サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）およびリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）から構成された群より選択される１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0053】

前記ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）作用剤は、ＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ）および３Ｄ－ＭＰＬから構成された群より選択されるいずれか１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0054】

前記アルミニウム塩は、アルミニウムヒドロキシド（Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、アルミニウムホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびアルミニウムスルフェート（ｓｕｌｐｈａｔｅ）から構成された群より選択されるいずれか１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0055】

前記サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）は、植物および海洋動物界に広く分布したトリペルテングリコシド物質であって、当業界にて主に容認されるアジュバントである。本発明の一実施形態によれば、前記サポニンは、ＱＳ２１、ＱＳ１７およびＱｕｉｌＡからなる群より選択されたいずれか１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。本発明の他の実施形態によれば、好ましくは、ＱＳ２１であってもよいが、これに限定されるものではない。ＱＳ２１は、キラヤサポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の皮に由来する抽出物をＨＰＬＣ精製して使用し、アシル化された３，２８－ｂｉｓｄｅｓｍｏｄｉｃ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ（１，３）とも表記される。

【0056】

前記リポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）は、リン脂質二重層で形成された脂質ベースの楕円形構造体であって、通常、ワクチン組成物または薬学的組成物などに含まれて薬物伝達運搬体としての役割を果たす。本発明の一実施形態によれば、前記リポソームは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロール（３β－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，２－ジオレオイルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリエチルアンモニウムプロパン（１，２－ｄｉ－Ｏ－ｏｃｔａｄｅｃｅｎｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジミリストレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１４：１ Ｅｔｙｌｅ ＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１６：０－１８：１ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１８：１ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎ、１８：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１６：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１４：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｌａｕｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎ、１２：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンザミド（Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－［ｄｉ（３－ａｍｉｎｏ－ｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｕｔｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］－３，４－ｄｉ［ｏｌｅｙｌｏｘｙ］－ｂｅｎｚａｍｉｄｅ、ＭＶＬ５）、１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ、１４：０ ＤＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ、１６：０ ＤＡＰ）、１，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ、１８：０ ＤＡＰ）、Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロパン－１－アミニウム（Ｎ－（４－ｃａｒｂｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，３－ｂｉｓ（ｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎ－１－ａｍｉｎｉｕｍ、ＤＯＢＡＱ）、１，２－ステアロイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｓｔｅａｒｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ、１８：０ ＴＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ、１６：０ ＴＡ）、１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ、１４：０ ＴＡＰ）およびＮ４－コレステリル－スペルミン（Ｎ４－Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ－Ｓｐｅｒｍｉｎｅ、ＧＬ６７）からなる群より選択されたいずれか１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0057】

また、前記リポソームは、追加的に、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（［００２０］１，２－Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｓｎｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＤＯＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＳＰＣ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＬＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスホエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスホリックアシッド（ＰＡ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択されるいずれか１つの中性脂質を含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0058】

また、本発明は、前記免疫原性組成物を含むキットを提供する。

【0059】

また、本発明のさらに他の課題を解決すべく、本発明は、前記免疫原性組成物を投与して免疫反応を誘導する方法を提供する。

【0060】

これとともに、本発明のさらに他の課題を解決すべく、本発明は、前記免疫原性組成物を投与して水痘帯状疱疹または帯状疱疹後神経痛を予防する方法を提供する。

【0061】

本願に記載された前記各特徴は組み合わされて使用可能であり、前記各特徴が特許請求の範囲の互いに異なる従属項に記載されるという事実は、これらが組み合わされて使用できないことを示すわけではない。

【0062】

実施例１．ウイルス抗原およびＦｃ部位融合タンパク質の製造方法
まず、下記の方法でｇＥ－Ｆｃ融合タンパク質を製造した。

【0063】

水痘帯状疱疹ウイルスの表面糖タンパク質Ｅ（ｇＥ、抗原）のＤＮＡを合成して、動物細胞発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）であるｐＣＴ１４６ベクターにクローニングした。合成したｇＥ ＤＮＡを２種の制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）、すなわちＮｈｅＩとＰｍｅＩで切断し、ｐＣＴ１４６ベクターも同一の制限酵素で切断した。切断されたｇＥ ＤＮＡとベクターＤＮＡとをＴ４連結酵素（ｌｉｇａｓｅ）を用いて連結した。クローニングされたｐＣＴ１４６ ＤＮＡを大膓菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）し、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を分析してｐＣＴ１４６ベクターにｇＥ遺伝子が挿入されたバクテリアクローン（ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｌｏｎｅ）を選別した。このベクターをｐＣＴ４３０と名付けた。

【0064】

ｇＥ－Ｆｃ融合タンパク質を製造するために、ｐＣＴ４３０のｇＥ遺伝子の終止コドン（ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）を除去するクローニングを先に進行させた。ｐＣＴ４３０ ｖｅｃｔｏｒのｇＥ遺伝子を、ＮｈｅＩ認識配列（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むフォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）と、ＰｍｅＩ認識配列を含みつつ終止コドンが除外されたリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーとを用いて、重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）技術で増幅した。ＮｈｅＩとＰｍｅＩ制限酵素を用いて、終止コドンが除去されたｇＥ ＤＮＡがクローニングされたｐＣＴ４３０ベクターを製造した。

【0065】

ヒトＩｇＧ１のＦｃ遺伝子配列とマウス（鼠）ＩｇＧ２ａのＦｃ遺伝子配列を、それぞれ制限酵素ＰｍｅＩの認識配列を含むフォワード、リバースプライマーを用いて、重合酵素連鎖反応技術でそれぞれ増幅し、制限酵素ＰｍｅＩで切断した。マウス（鼠）ＩｇＧ２ａのＦｃはヒトＩｇＧ１のＦｃと機能的に対応することが、当業界にてよく知られている（Ｆａｌｋ Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８Ｊａｎ；８（１）：３４－４７）。本出願明細書内において、ヒトＩｇＧ１のＦｃアミノ酸配列およびマウスＩｇＧ２ａのＦｃアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２および３で特定した。

【0066】

前記ｇＥ遺伝子の終止コドンが除去されたｐＣＴ４３０ベクターを同一の制限酵素で切断した後、前記のような方法でＤＮＡ連結反応を行って、抗体のＦｃ遺伝子がｇＥ遺伝子のカルボキシル基末端（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｔｅｒｍｉｎａｌ）に挿入されたベクターを確保し、それぞれのベクターをｐＣＴ４８６およびｐＣＴ４８７と名付けた。

【0067】

次に、選別されたコロニーを培養してＤＮＡを精製した。チャイニーズハムスター卵巣細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＣＨＯ）の一つであるＣＨＯ－Ｋ１動物細胞に精製された高純度のＤＮＡを用いて形質転換した。このＣＨＯ－Ｋ１細胞に、選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）であるジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＤＨＦＲ）の阻害剤であるＭＴＸ（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を添加し、継代培養により形質転換された細胞株を選別した。細胞外に排出されるｇＥ－Ｆｃタンパク質をタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーおよびタンパク質の大きさの差を利用したクロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いた精製した。

【0068】

実施例２．ＭＰＬおよびアルミニウムヒドロキシドの用意
次に、本発明の免疫原性組成物実験のために、アジュバント（免疫増強剤）としてＭＰＬおよびアルミニウムヒドロキシドを下記の方法で用意した。

【0069】

ＭＰＬまたはＭＰＬＡとしても知られているモノホスホリル脂質Ａ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ）は、インビボジェン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）社のＭＰＬＡ－ＳＭ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ^ＴＭ（Ｃａｔａｌｏｇ ｃｏｄｅ：ｖａｃ－ｍｐｌａ）製品を、製造会社の方法に従ってジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）で分注した後、零下２０℃で冷凍保管して使用した。

【0070】

ＭＰＬはサルモネラミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ５９５菌株のＲｅ突然変異（Ｒｅ ｍｕｔａｎｔ）から生産された脂質多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）から抽出されるが、脂質Ａ（ｌｉｐｉｄ Ａ）はＬＰＳの内毒素活性（ｅｎｄｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）に主に関与し、脂質Ａから１つのｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐが除去されたものがＭＰＬであって、毒性は減少し、免疫増強効果はそのまま維持された物質を指す（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．７１（５）：２４９８－５０７、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４（１１）：１３２５－３２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１９）：１１８０８－１５、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．７９（９）：３５７６－３５８７）。ＬＰＳと同じく、ＭＰＬはトール様受容体４の作用剤（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４、ＴＬＲ４ ａｇｏｎｉｓｔ）として機能して、Ｔｈ１免疫反応を強く誘導するとも知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６（５８３１）：１６２８－３２，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．７５（１２）：５９３９－４６）。

【0071】

次に、アルミニウムヒドロキシドとしてインビボジェン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）社のアルハイドロゲルアジュバント２％（ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌＲ ａｄｊｕｖａｎｔ ２％、ｃａｔｌｏｇ＃ ｖａｃ－ａｌｕ－２５０）製品を分注して使用した。

【0072】

アルミニウム系のアジュバントは、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ、ＡＰＣｓ）の抗原吸収を増加させ、Ｔｈ２免疫反応を誘導し、Ｔｈ１免疫反応は誘導しないことが知られている（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３３（４）：４９２－５０３）。

【0073】

前記実施例１で用意したｇＥ－Ｆｃ融合タンパク質に、ＭＰＬおよびアルミニウムヒドロキシドをＰＢＳ溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を用いて特定の濃度で混合して、本発明の組成物を製造した。

【0074】

実験例１．ＥＬＩＳＰＯＴ実験
前記実施例２で製造された組成物の効能を評価するために、下記の方法で実験を進行させた。

【0075】

帯状疱疹は、水痘感染により神経節に潜伏していた水痘帯状疱疹ウイルスが主に免疫力の低下した人で再活性化されて発病する病理学的特徴があるので、まず、水痘感染を動物で模倣すべく、生ワクチン（ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ）を熱不活性化（ｈｅａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）した後、ＢＡＬｂ／ｃマウス（鼠）雌に１回皮下注射して感作免疫接種（ｐｒｉｍｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を行った。

【0076】

感作免疫接種から約５週（３６日）後、水痘帯状疱疹ウイルスの表面糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）とマウス（鼠）ＩｇＧ２ａ抗体のＦｃ部位とが結合した融合タンパク質抗原とアジュバントが含まれた多様な条件の組成物を２回４週間隔で筋肉注射（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して免疫接種した。ワクチン組成物による水痘帯状疱疹ウイルス特異的体液性および細胞性免疫原性（ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を測定するために、２次免疫接種から約４週（２８日）後にマウスの後大静脈から全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）を採取し、抹消血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）を分離した。

【0077】

組成物の細胞媒介免疫反応（ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を評価するための実験デザインを下記表１に示した。表１の「ｇＥ－Ｆｃ」は水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）とマウスＩｇＧ２ａ抗体のＦｃとが融合した抗原、「ＭＰＬ」はアジュバント（免疫増強剤）としてのモノホスホリル脂質Ａ、「ａｌｕｍ」はアルミニウムヒドロキシドを意味する（実施例１および２参照）。また、「Ｓｈｉｎｇｒｉｘ（シングリックス）」は組換えられた水痘帯状疱疹用ワクチン（ＧＳＫ社）であって、リポソームベースの水痘帯状疱疹ウイルスの表面糖タンパク質Ｅに、ＭＰＬおよびＱＳ２１が含まれた商業化されたワクチン（ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｂａｓｅｄ ｇＥ＋ＭＰＬ＋ＱＳ２１の組み合わせ）を意味する。また、グループ１～４内の各組成物の最終ボリュームは１００μｌずつ合わせて投与した。

【0078】

【表1】

【0079】

本組成物の細胞性免疫反応を評価するために、２次免疫接種から４週後、分離した抹消血液単核細胞を用いてインターフェロンガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ、ＩＦＮγ）ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）分析を行った。このために、マウスのＰＢＭＣサンプルをＲＢＣ除去溶液（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を用いて残存ＲＢＣを除去し、Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴ ｐｌｕｓ（ＭＡＢＴＥＣＨ、Ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ ３３２１－４ＡＳＴ）を用いて、用意したリンパ球に、水痘帯状疱疹抗原（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｚｏｓｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ、ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、Ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ ＥＬ－０３－０２）またはコンカナバリンＡ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ Ｃ５２７５）を処理して反応させ、リンパ球から分泌したインターフェロンガンマタンパク質を検出して、ｓｐｏｔ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ（ＳＦＣ）を計数（ｃｏｕｎｔ）して評価した。

【0080】

各グループのリンパ球の活性を、陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＰＣ）であるコンカナバリンＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）による細胞－媒介免疫反応（ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の活性で標準化して、帯状疱疹抗原－特異的（ＶＺＶ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）リンパ球の細胞媒介免疫反応（ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を図１に示した。図１のＶＺＶは、水痘帯状疱疹抗原－特異的細胞－媒介免疫反応を意味し、＊または＊＊は、グループ１に対するｐ ｖａｌｕｅが＜０．０５であり、統計的に有意な差を示す。

【0081】

その結果、ｇＥ－Ｆｃ融合タンパク質とＭＰＬ／ａｌｕｍアジュバントが含まれた組成物が、ＰＢＳ（陰性対照群）に比べて、水痘帯状疱疹抗原－特異的細胞－媒介免疫反応を統計的に有意かつ著しい免疫反応を誘導し、シングリックスワクチンと比較した時、最低同等以上の細胞性免疫反応を誘導することを確認した（図１）。

【0082】

図１から確認したように、ｇＥ－Ｆｃ＋ＭＰＬ＋ａｌｕｍの組み合わせは、低濃度（３０μｇ）に比べて、高濃度（９０μｇ）でより高い細胞性免疫反応を示した。

【0083】

実験例２．ＥＬＩＳＡ実験
前記実験例１の組み合わせ（グループ１～４）の組成物の効能を評価するために、下記の方法で追加実験を進行させた。

【0084】

２次免疫接種から約４週後、マウスの血液から分離した血清を用いて、ワクチン組成物によって誘導されたＩｇＧ１抗体とＩｇＧ２ａ抗体の生成量をＥＬＩＳＡ分析法で測定した。

【0085】

ＶＺＶ ｇＥ抗原（２μｇ／ｍｌ）をコーティング溶液（ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、ｃａｒｂｏｎａｔｅ／ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、Ｓｉｇｍａ、ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ Ｃ３０４１－１００ＣＡＰ）を用いて、９６ウェルプレート（９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に４℃の条件で１６～１８時間コーティング（ｃｏａｔｉｎｇ）した。希釈液（Ｄｉｌｕｅｎｔ、Ｔｅｋｎｏｖａ、ｃａｔａｌｏｇ＃ ２Ｄ５１２０－１Ｌ；１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、１Ｘ ＰＢＳから構成される）を用いて３回洗浄し、希釈液を用いてプレートを１時間常温でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。３回洗浄後、用意した血清サンプルをプレートに入れて、１時間３０分から２時間常温で反応させた。３回洗浄後、検出抗体：ｉ）ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１（ＢｉｏＲａｄ、Ｃａｔａｌｏｇ＃ ＳＴＡＲ１３２Ｐ）、またはｉｉ）ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ（ＢｉｏＲａｄ、Ｃａｔａｌｏｇ＃ ＳＴＡＲ１３３Ｐ）を入れて、常温で１時間反応させた。６回洗浄した後、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔａｌｏｇ＃ Ｔ０４４０）をプレートに入れて５分間反応し、硫酸溶液（Ｈ_２ＳＯ_４、Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｔａｌｏｇ＃ １０９０７２）を入れて反応を中止した。プレートリーダー（ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を用いて各サンプルの吸光度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定した。そして、当該試験の結果である水痘帯状疱疹ウイルスの表面糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）すなわち、水痘帯状疱疹ウイルス特異的なＩｇＧ１とＩｇＧ２ａ抗体の生成量を測定して、下記表２、表３および図２に示した。ＩｇＧ１の生成量は、体液性免疫反応の産物を意味し、これに対し、ＩｇＧ２ａの生成量は、細胞性免疫反応の産物を意味する。

【0086】

その結果、表２に示したように、ｇＥ－Ｆｃ＋ＭＰＬ＋ａｌｕｍの組み合わせが、ＰＢＳに比べて、ｇＥ特異的ＩｇＧ２ａ抗体を生成させる効果に優れていることを確認し、これは細胞性免疫反応の増加を示す。また、表３に示したように、ｇＥ－Ｆｃ＋ＭＰＬ＋ａｌｕｍの組み合わせが、ＰＢＳに比べて、ｇＥ特異的ＩｇＧ１抗体を生成させる効果に優れていることを確認し、これは体液性免疫反応の増加を示す（図２）。

【0087】

これとともに、前記図１から確認したように、ｇＥ－Ｆｃ＋ＭＰＬ＋ａｌｕｍの組み合わせは、シングリックスワクチンに比べて、類似するレベルの体液性および細胞性免疫反応の誘導能力を有することを最終的に確認した。

【0088】

これにより、本発明の組成物が、陰性対照群に比べて、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の生成を著しく増加させることを確認し、シングリックスに比べて、類似する程度の細胞性および体液性免疫反応を誘導することを最終的に確認した（表２および表３）。

【0089】

【表2】

【0090】

【表3】

【0091】

実施例３．ウイルス抗原およびＦｃ部位融合変異タンパク質の製造方法
まず、下記の方法でｇＥ－Ｆｃ融合変異タンパク質（ｇＥ－Ｆｃ’）を製造した。

【0092】

水痘帯状疱疹ウイルスの表面糖タンパク質Ｅ（ｇＥ、抗原）とマウス（鼠）ＩｇＧ２ａのＦｃ（Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）部位とが結合した融合タンパク質のＤＮＡを合成して、動物発現細胞発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）であるｐＣＴ１４６ベクターにクローニングした。合成したｇＥ－Ｆｃ’ ＤＮＡを２種の制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）、すなわちＮｈｅＩとＰｍｅＩで切断し、ｐＣＴ１４６ベクターも同一の制限酵素で切断した。切断されたｇＥ－Ｆｃ’ ＤＮＡとベクターＤＮＡとをＴ４連結酵素（ｌｉｇａｓｅ）を用いて連結した。クローニングされたｐＣＴ１４６ ＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）し、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を分析して、ｐＣＴ１４６ベクターにｇＥ－Ｆｃ’遺伝子が挿入されたバクテリアクローン（ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｌｏｎｅ）を選別した。このベクターをｐＣＴ６６４と名付けた。本実施例で使用されたマウスＩｇＧ２ａのＦｃ（Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）変異アミノ酸配列を配列番号５で特定した。そして、本実施例では使用されなかったが、本発明において他の具体例として使用可能なヒトＩｇＧ１のＦｃ（Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）変異アミノ酸配列を配列番号４で特定した。

【0093】

次に、選別されたコロニーを培養してＤＮＡを精製した。チャイニーズハムスター卵巣細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＣＨＯ）の一つであるＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ動物細胞に、精製された高純度のＤＮＡを用いて形質転換（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。このＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞を流加式培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）方法を進行させてｇＥ－Ｆｃ’融合タンパク質を生産した。細胞外に排出されるｇＥ－Ｆｃ’タンパク質はタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて精製した。

【0094】

実験例３．ＥＬＩＳＰＯＴ実験
前記実施例２および実施例３で製造された組成物の効能を評価するために、下記の方法で実験を進行させた。

【0095】

まず、水痘感染を動物で模倣すべく、生ワクチン（ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ）をＣ５７ＢＬ／６マウス（鼠）雌に１回皮下注射して感作免疫接種（ｐｒｉｍｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を行った。

【0096】

感作免疫接種から約５週（３６日）後、水痘帯状疱疹ウイルスの表面糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）とマウス（鼠）ＩｇＧ２ａ抗体のＦｃ部位とが結合した融合タンパク質抗原とアジュバントが含まれた多様な条件の組成物を２回４週間隔で筋肉注射（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して免疫接種した。ワクチン組成物による水痘帯状疱疹ウイルス特異的体液性および細胞性免疫原性（ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を測定するために、２次免疫接種から約４週（２８日）後にマウスの後大静脈から全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）を採取し、抹消血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）を分離した。

【0097】

組成物の細胞媒介免疫反応（ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を評価するための実験デザインを下記表４に示した。表４の「ｇＥ－Ｆｃ」は水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）とマウスＩｇＧ２ａ抗体のＦｃとが融合した抗原、「ＭＰＬ」はアジュバント（免疫増強剤）としてのモノホスホリル脂質Ａ、「ａｌｕｍ」はアルミニウムヒドロキシドを意味する（実施例１、２および３参照）。また、「Ｓｈｉｎｇｒｉｘ（シングリックス）」は組換えられた水痘帯状疱疹用ワクチン（ＧＳＫ社）であって、リポソームベースの水痘帯状疱疹ウイルスの表面糖タンパク質Ｅに、ＭＰＬおよびＱＳ２１が含まれた商業化されたワクチン（ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｂａｓｅｄ ｇＥ＋ＭＰＬ＋ＱＳ２１の組み合わせ）を意味する。また、グループ１～４内の各組成物の最終ボリュームは５０μｌずつ合わせて投与した。

【0098】

【表4】

【0099】

本組成物の細胞性免疫反応を評価するために、２次免疫接種から４週後、分離した抹消血液単核細胞を用いてインターフェロンガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ、ＩＦＮγ）ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）分析を行った。

【0100】

各グループのリンパ球の活性を、陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＰＣ）であるコンカナバリンＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）による細胞－媒介免疫反応（ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の活性で標準化して、帯状疱疹抗原－特異的（ＶＺＶ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）リンパ球の細胞媒介免疫反応（ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を図３に示した。図３のＶＺＶは、水痘帯状疱疹抗原－特異的細胞－媒介免疫反応を示す。

【0101】

その結果、ｇＥ－Ｆｃ融合タンパク質とＭＰＬ／ａｌｕｍアジュバントが含まれた組成物が、ＰＢＳ（陰性対照群）に比べて、著しい水痘帯状疱疹抗原－特異的細胞－媒介免疫誘導し、シングリックスワクチンと比較した時、優れた細胞性免疫反応を誘導することを確認した（図３）。同じく、ｇＥ－Ｆｃ’融合変異タンパク質とＭＰＬ／ａｌｕｍアジュバントが含まれた組成物が、ＰＢＳ（陰性対照群）に比べて、水痘帯状疱疹抗原－特異的細胞－媒介免疫反応で著しい免疫反応を誘導し、シングリックスワクチンと比較した時、類似同等の細胞性免疫反応を誘導することを確認した（図３）。

【0102】

実験例４．ＥＬＩＳＡ実験
前記実験例３の組み合わせ（グループ１～４）の組成物の効能を評価するために、下記の方法で追加実験を進行させた。

【0103】

２次免疫接種から約４週後、マウスの血液から分離した血清を用いてワクチン組成物によって誘導されたＩｇＧ１抗体とＩｇＧ２ａ抗体の生成量をＥＬＩＳＡ分析法で測定した。

【0104】

その結果、表５に示したように、ｇＥ－Ｆｃ＋ＭＰＬ＋ａｌｕｍの組み合わせが、ＰＢＳに比べて、ｇＥ特異的ＩｇＧ２ａ抗体を生成させる効果に優れていることを確認し、これは細胞性免疫反応の増加を示す。また、表６に示したように、ｇＥ－Ｆｃ＋ＭＰＬ＋ａｌｕｍの組み合わせが、ＰＢＳに比べて、ｇＥ特異的ＩｇＧ１抗体を生成させる効果に優れていることを確認し、これは体液性免疫反応の増加を示す。（図４）

【0105】

これとともに、前記図３から確認したように、ｇＥ－Ｆｃ＋ＭＰＬ＋ａｌｕｍの組み合わせは、シングリックスワクチンに比べて、優れたレベルの体液性および細胞性免疫反応の誘導能力を有することを最終的に確認した。

【0106】

また、表５に示したように、ｇＥ－Ｆｃ’＋ＭＰＬ＋ａｌｕｍの組み合わせが、ＰＢＳに比べて、ｇＥ特異的ＩｇＧ２ａ抗体を生成させる効果に優れていることを確認し、これは細胞性免疫反応の増加を示す。さらに、表６に示したように、ｇＥ－Ｆｃ’＋ＭＰＬ＋ａｌｕｍの組み合わせが、ＰＢＳに比べて、ｇＥ特異的ＩｇＧ１抗体を生成させる効果に優れていることを確認し、これは体液性免疫反応の増加を示す。（図４）

【0107】

これとともに、前記図３から確認したように、ｇＥ－Ｆｃ’＋ＭＰＬ＋ａｌｕｍの組み合わせは、シングリックスワクチンに比べて、類似するレベルの体液性および細胞性免疫反応の誘導能力を有することを最終的に確認した。

【0108】

これにより、本発明の組成物が、陰性対照群に比べて、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の生成を著しく増加させることを確認し、シングリックスに比べて、類似する程度の細胞性および体液性免疫反応を誘導することを最終的に確認した。（表５および表６）。

【0109】

【表5】

【0110】

【表6】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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【国際調査報告】