特表 2023-516682 ステロイドのヒドロキシ化方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-20

(54)【発明の名称】ステロイドのヒドロキシ化方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 33/06 20060101AFI20230413BHJP

   C12N 9/06 20060101ALI20230413BHJP

   C12N 9/04 20060101ALI20230413BHJP

【ＦＩ】

C12P33/06 A ZNA

C12N9/06 Z

C12N9/04 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022552804

(86)(22)【出願日】2021-03-05

(85)【翻訳文提出日】2022-11-01

(86)【国際出願番号】 EP2021055615

(87)【国際公開番号】W WO2021176066

(87)【国際公開日】2021-09-10

(31)【優先権主張番号】20161537.4

(32)【優先日】2020-03-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522348675

【氏名又は名称】アンニッキ ゲーエムベーハー

(71)【出願人】

【識別番号】508304332

【氏名又は名称】ファーマツェル・ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】シュタウニッヒ、ニコール

(72)【発明者】

【氏名】ドンスバッハ、カイ オリビエ

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD02

4B050KK03

4B050LL05

4B064AH07

4B064BJ15

4B064CA21

4B064CB12

4B064CC24

4B064DA01

(57)【要約】

本発明は、少なくとも１つの酸化還元パートナー系、及び酸化還元パートナー系を再生するための系の存在下で７－デオキシステロイドをチトクロムＰ４５０酵素又はその機能的変異体で変換する工程を含む、ステロイドを調製する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

一般式（Ｉ）を有するステロイドを調製する方法であって、

【化1】

式中、
Ｘ_１及びＸ_２は、独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ_３、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基、ＯＨ、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ基、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｎ（Ｒ_６）_２、エポキシ基、ＣＨＯ又はＣＯ_２Ｒ_６基であり、式中、
Ｒ_６は、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_３）_３、－Ｃ（Ｏ）Ｐｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｐｈであり、
Ｒ_１及びＲ_２は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ_７又はＯであり、式中、
Ｒ_７は、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_３）_３、－Ｃ（Ｏ）Ｐｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｐｈであり、
Ｒ_３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ_８、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_１～Ｃ_１０アルケニル基、－ＣＨＯ、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_３）、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２ＯＨ）、－ＣＨ（ＣＨ_３）Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－ＣＨ（ＣＨ_３）（（ＣＨ_２）_２ＣＯ_２Ｒ_９）又は－ＣＨ（ＣＨ_３）（（ＣＨ_２）_２ＣＯＮＨＲ_９）であり、式中、
Ｒ_８は、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_３）_３、－Ｃ（Ｏ）Ｐｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｐｈであり、
Ｒ_９は、－ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＣＯＯＨ、－ＣＨ_２ＣＨ_３、－ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_２ＳＯ_３Ｈ、Ｃ（ＣＨ_３）_３、－（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、アリール基又はアルキルアリール基であり、
Ｒ_４は、Ｈ、ＯＨ又は－ＯＲ_１０であり、式中、
Ｒ_１０は、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_３）_３、－Ｃ（Ｏ）Ｐｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｐｈであり、
Ｒ_５は、Ｈ、ＣＦ_３、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_１～Ｃ_６アルケニル基、ＯＨ、Ｏ又はＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基であり、式中、破線は任意の二重結合を示し、但し、Ａ環がＣ４～Ｃ５二重結合を有する場合、Ｂ環は二重結合を有さず、Ｘ_１及びＸ_２がエポキシ基を形成する場合、Ｃ環は二重結合を有さず、
一般式（ＩＩ）を有する７－デオキシステロイドを

【化2】

少なくとも１つの酸化還元パートナー系及び酸化還元パートナー系を再生するための系の存在下でチトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼ又はその機能的変異体で変換する工程を含み、前記チトクロムＰ４５０酵素は、配列番号１又は２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む、方法。

【請求項2】

Ｘ_１、Ｘ_２、Ｒ_４及びＲ_５は、Ｈであり、
Ｒ_１及びＲ_２は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ_８又はＯであり、式中、
Ｒ_８は、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_３）_３、－Ｃ（Ｏ）Ｐｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｐｈであり、
Ｒ_３は、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン基、－ＣＨ（ＣＨ_３）（（ＣＨ_２）_２ＣＯ_２Ｒ_９）又は－ＣＨ（ＣＨ_３）（（ＣＨ_２）_２ＣＯＮＨＲ_９）であり、式中、
Ｒ_９は、－ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＣＯＯＨ、－ＣＨ_２ＣＨ_３、－ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_２ＳＯ_３Ｈ、Ｃ（ＣＨ_３）_３、－（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、アリール基又はアルキルアリール基であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記アリール基が、フェニル基、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ_２又はＣＨ_３で置換されたフェニル基及びヘテロアリールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記アルキルアリール基が、ベンジル基、ハロゲンがＦ、Ｃｌ又はＢｒであるハロゲン化ベンジル基、及びＮＯ_２で置換されたベンジル基からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

Ｒ_１は、ＯＨであり、Ｒ_２は、Ｏ又はＯＨであり、Ｒ_３は、ＣＨ（ＣＨ_３）（（ＣＨ_２）_２ＣＯ_２Ｒ_５）であり、Ｒ_４は、Ｈであり、Ｒ_５は、Ｈであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記一般式（Ｉ）を有するステロイドが、７β，１２α－ジヒドロキシ－３－ケト－５β－コラン－２４－酸、３α，７β－ジヒドロキシ－１２－ケト－５β－コラン－２４－酸、７β－ヒドロキシ－３，１２－ジケト－５β－コラン－２４－酸、３α，７β－ジヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸及び３β，７β－ジヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記７－デオキシステロイドが、３α，１２α－ジヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸、３α，１２β－ジヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸、３β，１２α－ジヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸、３β，１２β－ジヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸、３β－ヒドロキシ－１２－ケト－５β－コラン－２４－酸、３－ケト，１２β－ヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸、３－ケト，１２α－ヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸、３α－ヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸、３－ケト－５β－コラン－２４－酸、３β－ヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸及びそれぞれの酸のエステルからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記チトクロムＰ４５０酵素が、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％、特に１００％同一の核酸によってコードされることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記少なくとも１つの酸化還元パートナー系が、
（ｉ）フェレドキシン、フェレドキシンレダクターゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、
（ｉｉ）チトクロムＰ４５０レダクターゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又は
（ｉｉｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
を含むことを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記フェレドキシンが、アドレノドキシン、プチダレドキシン及びフラボドキシンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記少なくとも１つのフェレドキシンレダクターゼが、フラボドキシンレダクターゼ及びプチダレドキシンレダクターゼの群から選択されることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。

【請求項12】

前記酸化還元パートナー系を再生するための系が、少なくとも１つの酸化還元酵素、及び前記少なくとも１つの酸化還元酵素の少なくとも１つの基質を含むことを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記少なくとも１つの酸化還元酵素が、酸化還元酵素（ＥＣ：１．１．１）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１）、アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．４．１）、フラビンレダクターゼ（ＥＣ：１．５．１）、トランスヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．６．１）、亜硝酸レダクターゼ（ＥＣ：１．７．１）及びホスホナートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２０．１）からなる群から選択され、好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ及び糖デヒドロゲナーゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記少なくとも１つの酸化還元酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、アラビノースデヒドロゲナーゼ、キシロースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、１２α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、７α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、２０α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、１７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、１７α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、３α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、３β－ヒドロキシ－δ５デヒドロゲナーゼ、１１β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項15】

前記少なくとも１つの酸化還元酵素の前記少なくとも１つの基質が、アラビノース、キシロース、グルコース、ソルビトール、キシリトール、コラン－２４－酸、３α，１２α－ジヒドロキシコラン－２４－酸－２，３－ブタンジオール、アセトイン、２－プロパノール、グルタマート、エタノール、ホスホナート、ホスフィット、ニトリット、４－メチル－２－ペンタノール、２－ブタノール、２－オクタノール、シクロヘキサノール、エタンジオール、１，２－プロパンジオール、１－プロパノール、１－ブタノール、ホルマート及び３－ヒドロキシブタノアートからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

少なくとも１つの有機溶媒の存在下で行われることを特徴とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記少なくとも１つの有機溶媒が、プロトン性又は非プロトン性溶媒、好ましくは非プロトン性溶媒であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記少なくとも１つの有機溶媒が、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６又は１７のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ステロイドのヒドロキシル化のための手段及び方法に関する。

【背景技術】

【0002】

３，７，１２－トリヒドロキシル化胆汁酸、例えばコール酸（３α，７α，１２α－トリヒドロキシ－５β－コラン酸）又はウルソコール酸（３α，７β，１２α－トリヒドロキシ－５β－コラン酸）は、とりわけウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）を製造するための出発材料として、工業的に重要な化学物質である。ウルソデオキシコール酸は、とりわけ、軽微なＸ線陰性胆石を溶解するため、並びに肝疾患の原発性毛様体（ｃｉｌｉａｒｙ）肝硬変及び原発性硬化性胆管炎を治療するための医薬品として使用される。

【0003】

３，７，１２－トリヒドロキシル化胆汁酸の工業的に最も重要な供給源は、肉生産において屠殺場廃棄物として蓄積する胆嚢からの胆汁液である。他の動物種に加えて、ウシの胆汁が使用されることが多い。３，７，１２－トリヒドロキシル化胆汁酸の工業的に関連する全合成はない。胆汁酸の産生は別の製品（肉）に関連しているため、需要の増加に対する応答は非常に限られる可能性がある。このため、原料胆汁をできるだけ効率的に使用することは非常に興味深い。

【0004】

胆汁は胆汁酸、脂質、コレステロール及び他の物質の水性混合物であるので、胆汁酸の抽出中の成分の分離は特に重要である。胆汁酸はまた、その成分がヒドロキシル基の数及び位置が異なる混合物を構成する。コール酸に加えて、ウシ胆汁はまた、有意な割合のデオキシコール酸を含有し、これは、７位にＯＨ基が欠損しているという点でコール酸とは異なる（３α，１２α－ジヒドロキシ－５β－コラン酸）。デオキシコール酸は、３，７，１２－トリヒドロキシル化胆汁酸よりも商業的価値がはるかに低い。したがって、７位にヒドロキシル基を選択的に導入することによって、デオキシコール酸を３，７，１２－トリヒドロキシル化胆汁酸に変換することに工業的関心がある。

【0005】

ヒドロキシル化中、酸素原子は、酸化反応において（非活性化）Ｃ－Ｈ結合に正式に導入される。有機化学では、これらは実行が非常に困難な反応である。ＯＨ基は、例えばＣ＝Ｃ二重結合に水を添加することによって、迂回路を通して導入されることが多い。いくつかの化学的に（ほぼ）等価なＣ－Ｈ結合が存在するため、複合分子（例えば、胆汁酸など）の特定の位置での選択的ヒドロキシル化は問題がある。

【0006】

７β－ヒドロキシラーゼを使用してリトコール酸をウルソデオキシコール酸に酵素的に変換する方法は、国際公開第２０１８／２２７９４０号に開示されている。

【0007】

Ｓｃｈｍｉｔｚら（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ １３（１）：１－１３（２０１４））は、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを用いた変換によるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）又はプレグネノロン（ＰＲＥＧ）の７－ヒドロキシル誘導体の産生を記載している。

【0008】

中国特許第１０２００２５１８号は、ヒドロキシラーゼによる３－β－コレステロールアセタートの７－β－ヒドロキシル－３－β－コレステロールアセタートへの変換を開示している。

【0009】

国際公開第２０２０／１０９７７６号には、とりわけステロイドであるプレグネノロンからの種々の有機化合物をチトクロムＰ４５０でヒドロキシル化又は脱アルキル化する方法が開示されている。

【0010】

本発明の目的は、特にこの時点で、７位に水素を有しヒドロキシル基を有さない、胆汁酸及びその誘導体などのステロイドをヒドロキシル化する手段及び方法を提供することである。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明による目的は、一般式（Ｉ）を有するステロイドを調製する方法により達成され、

【化1】

式中、
Ｘ_１及びＸ_２は、独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ_３、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基、ＯＨ、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ基、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｎ（Ｒ_６）_２、エポキシ基、ＣＨＯ又はＣＯ_２Ｒ_６基であり、式中、
Ｒ_６は、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_３）_３、－Ｃ（Ｏ）Ｐｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｐｈであり、
Ｒ_１及びＲ_２は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ_７又はＯであり、式中、
Ｒ_７は、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_３）_３、－Ｃ（Ｏ）Ｐｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｐｈであり、
Ｒ_３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ_８、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_１～Ｃ_１０アルケニル基、－ＣＨＯ、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_３）、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２ＯＨ）、－ＣＨ（ＣＨ_３）Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－ＣＨ（ＣＨ_３）（（ＣＨ_２）_２ＣＯ_２Ｒ_９）又は－ＣＨ（ＣＨ_３）（（ＣＨ_２）_２ＣＯＮＨＲ_９）であり、式中、
Ｒ_８は、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_３）_３、－Ｃ（Ｏ）Ｐｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｐｈであり、
Ｒ_９は、－ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＣＯＯＨ、－ＣＨ_２ＣＨ_３、－ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_２ＳＯ_３Ｈ、Ｃ（ＣＨ_３）_３、－（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、アリール基又はアルキルアリール基であり、
Ｒ_４は、Ｈ、ＯＨ又は－ＯＲ_１０であり、式中、
Ｒ_１０は、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_３）_３、－Ｃ（Ｏ）Ｐｈ又は－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｐｈであり、
Ｒ_５は、Ｈ、ＣＦ_３、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_１～Ｃ_６アルケニル基、ＯＨ、Ｏ又はＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基であり、式中、破線は任意の二重結合を示し、但し、Ａ環がＣ４～Ｃ５二重結合を有する場合、Ｂ環は二重結合を有さず、Ｘ_１及びＸ_２がエポキシ基を形成する場合、Ｃ環は二重結合を有さず、
一般式（ＩＩ）を有する７－デオキシステロイドを

【化2】

少なくとも１つの酸化還元パートナー系及び酸化還元パートナー系を再生するための系の存在下でチトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼ又はその機能的変異体で変換する工程を含み、チトクロムＰ４５０酵素は、配列番号１又は２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0012】

驚くべきことに、チトクロムＰ４５０及びその機能的断片は、コール酸などのステロイド、及びそれぞれ、７位に式（Ｉ）を有するその誘導体をヒドロキシル化することができることが示されている。この反応を少なくとも１つの酸化還元パートナー系及び酸化還元パートナー系を再生するための系とカップリングさせることによって、反応の平衡を最終生成物に向かってシフトさせることができ、したがってその収率を有意に増加させることができる。この場合、酸化還元パートナー系の再生は、好ましくは少なくとも１つの酸化還元酵素及び少なくとも１つの酸化還元酵素の少なくとも１つの基質を含む第２の系（再生系）の存在下で起こり得る。

【発明を実施するための形態】

【0013】

還元等価物ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化を必要とするチトクロムＰ４５０及びその機能的変異体は、驚くべきことに、例えば７－デオキシコール酸などの７－デオキシステロイド及び７位のその誘導体を選択的にヒドロキシル化することができる。

【0014】

本発明によれば、チトクロムＰ４５０酵素は、配列番号１又は２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、特に１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0015】

チトクロムＰ４５０は、多数の内因性及び外因性基質のモノオキシゲナーゼ反応を触媒する。それらは、とりわけ、ステロイド、エイコサノイド、脂肪酸及び胆汁酸、並びに薬物、殺虫剤及び化学的発癌物質などの外因性基質の代謝に関与している。

【0016】

本発明によるチトクロムＰ４５０は、例えば、アクチノバクテリアなどの細菌から、特に例えばストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属から使用することができる。この場合、配列は、例えば、公知の技術を用いてゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。

【0017】

本発明によるチトクロムＰ４５０及びそれらの機能的変異体は、それらの元の生物に存在してもよいか、又はそれらから単離されてもよいか、又はそれらは組換え発現されるか、又は合成的に産生される。組換え発現ポリペプチドを本発明に従って使用することが好ましい。

【0018】

例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの様々な確立された微生物を、本発明による酵素の組換え発現に使用することができる。この点に関する適切なプロトコルは、関連する専門文献に詳細に記載されているか、又は当業者に公知である。

【0019】

本発明によれば、酵素／ポリペプチドは、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で組換え過剰発現されたタンパク質として使用され、対応する細胞溶解物は、好ましくは、更なる処理／精製なしで、又は比較的単純な処理工程（例えば、遠心分離、沈殿、濃縮又は凍結乾燥）の後に使用される。使用される酵素の組換え過剰発現後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、代替的に、細胞崩壊なしに、又は例えば凍結／解凍サイクル後に直接反応に使用することもできる。適切な発現プラスミドは当業者に公知であり、商業的に購入することができることが多い。

【0020】

チトクロムＰ４５０の「機能的変異体」は、チトクロムＰ４５０の断片又は変異変異変異体であってもよく、ここで、チトクロムＰ４５０の断片は「機能的断片」とも呼ぶことができる。チトクロムＰ４５０の「機能的変異体」は、変異体が由来するタンパク質と同じ反応を触媒することができる。変異体が機能的であるかどうか、すなわち変異体が由来するタンパク質と同じ反応を触媒するかどうかは、変異体が同じ反応を触媒することを確立することによって決定することができる。この目的のために、従来技術又は本明細書に記載されている方法がそれぞれ確立されている。本発明による機能的変異体による基質の変換率は、変異体が由来するチトクロムＰ４５０の変換率から逸脱する可能性がある。

【0021】

「７－デオキシステロイドの誘導体」は、７－デオキシステロイドに由来し、上で定義したような多種多様な修飾を有する化合物を含む。

【0022】

本発明の好ましい実施形態によれば、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｒ_４及びＲ_５は、Ｈであり、
Ｒ_１及びＲ_２は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ_８又はＯであり、式中、
Ｒ_８は、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_３）_３、－Ｃ（Ｏ）Ｐｈ、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｐｈであり、
Ｒ_３は、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン基、－ＣＨ（ＣＨ_３）（（ＣＨ_２）_２ＣＯ_２Ｒ_９）又は－ＣＨ（ＣＨ_３）（（ＣＨ_２）_２ＣＯＮＨＲ_９）であり、式中、
Ｒ_９は、－ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＣＯＯＨ、－ＣＨ_２ＣＨ_３、－ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_２ＳＯ_３Ｈ、Ｃ（ＣＨ_３）_３、－（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、－ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、アリール基又はアルキルアリール基である。

【0023】

本発明の更に好ましい実施形態によれば、アリール基は、フェニル基、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ_２又はＣＨ_３で置換されたフェニル基及びヘテロアリールからなる群から選択される。

【0024】

本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、アルキルアリール基は、ベンジル基、ハロゲンがＦ、Ｃｌ又はＢｒであるハロゲン化ベンジル基、及びＮＯ_２で置換されたベンジル基からなる群から選択される。

【0025】

本発明の好ましい実施形態によれば、Ｒ_１はＯＨであり、Ｒ_２はＯ又はＯＨであり、Ｒ_３はＣＨ（ＣＨ_３）（（ＣＨ_２）_２ＣＯ_２Ｒ_５）であり、Ｒ_４はＨであり、Ｒ_５はＨである。

【0026】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、一般式（ＩＩ）を有する７－デオキシステロイドは、３α，１２α－ジヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸、３α，１２β－ジヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸、３β，１２α－ジヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸、３β，１２β－ジヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸、３β－ヒドロキシ－１２－ケト－５β－コラン－２４－酸、３－ケト，１２β－ヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸、３－ケト，１２α－ヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸、３α－ヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸、３－ケト－５β－コラン－２４－酸、３β－ヒドロキシ－５β－コラン－２４－酸及びそれぞれの酸のエステルからなる群から選択される。

【0027】

一般式（ＩＩ）を有する７－デオキシステロイド及びその誘導体の、一般式（Ｉ）を有するステロイド又はその誘導体へのヒドロキシル化のために本発明に従って使用されるチトクロムＰ４５０酵素は、配列番号１又は２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
配列番号１：

【化3】

配列番号２：

【化4】

【0028】

配列番号１及び２のアミノ酸配列は、好ましくは配列番号３及び４の核酸配列によってコードされ、配列番号５及び６の核酸配列は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化されている。
配列番号３：

【化5】

配列番号４：

【化6】

配列番号５：

【化7】

配列番号６：

【化8】

【0029】

本明細書において「同一」とは、重ね合わせた場合、２つ以上のアミノ酸配列が互いに一定の「同一性」（同一位置の一致するアミノ酸残基）を有し得ることを意味する。「同一性」は、本発明では、開始配列のアミノ酸と同一である適格なアミノ酸配列のアミノ酸の割合として、すなわち、「タンパク質ＢＬＡＳＴ」プログラム（ｂｌａｓｔｐ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）２１５：４０３－４１０、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ、本明細書では一般に「ＢＬＡＳＴ」と呼ばれる）によって生成される最大パーセントの配列同一性を達成するために、必要に応じて、２つの配列のアラインメント及びギャップの導入後に、全ての可変パラメータをデフォルト値に設定した状態で定義される。ここで、アルゴリズム「ｂｌａｓｔｐ（タンパク質－タンパク質－ＢＬＡＳＴ）」は、以下のパラメータである「ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」：０．０５、「ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ」：６、ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２、「ｇａｐ ｃｏｓｔ」：「Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ」１１、「Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ」１、条件付き合成スコア行列調整、フィルタなし及びマスクなしで使用した。アミノ酸配列同一性のパーセント（％）値は、一致する同一のヌクレオチドの数を、同一性をパーセントで記録した配列長で割ることによって決定される。

【0030】

本発明による方法を使用して、配列番号１又は２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むチトクロムＰ４５０酵素を用いて、一般式（ＩＩ）を有する７－デオキシステロイド又はそれぞれのその誘導体を、チトクロムＰ４５０又はその機能的変異体を用いて、一般式（Ｉ）を有するステロイド又はそれぞれのその誘導体に変換することができる。この変換は、酸化還元パートナー又はヒドロキシル化反応のための電子を提供することができる酸化還元パートナー系の存在下で起こる。

【0031】

本発明の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの酸化還元パートナー系は、
（ｉ）フェレドキシン、フェレドキシンレダクターゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、
（ｉｉ）チトクロムＰ４５０レダクターゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又は
（ｉｉｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
を含む。

【0032】

本発明に従って使用される酸化還元パートナー系は、フェレドキシン、フェレドキシンレダクターゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、チトクロムＰ４５０レダクターゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ単独を含むことができ、フェレドキシン、フェレドキシンレダクターゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含む酸化還元パートナー系が特に好ましい。

【0033】

したがって、本発明によるチトクロムＰ４５０又はそれぞれのその機能的変異体の酸化還元反応を行うために、本発明による方法において少なくとも酸化還元補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを使用することが有利である。これに関連して、ＮＡＤ＋はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化型を示し、ＮＡＤＨは還元型を示し、ＮＡＤＰ＋はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の酸化型を示し、ＮＡＤＰＨは還元型を示す。

【0034】

反応混合物中の酸化還元補因子ＮＡＤ（Ｐ）＋及び／又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの濃度は、好ましくは０．００１ｍＭ～１０ｍＭ、より好ましくは０．０５ｍＭ～１ｍＭである。

【0035】

特に好ましくは、フェレドキシンが酸化還元パートナーとして使用され、これはＮＡＤ（Ｐ）＋及び少なくとも１つのフェレドキシンレダクターゼの存在下で再生することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つのフェレドキシンは、アドレノドキシン、プチダレドキシン及びフラボドキシンからなる群から選択され、場合により、それらの組み合わせも同様に使用することができる。

【0036】

酸化還元パートナーの可能な対は、好ましくは、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のプチダレドキシン及びプチダレドキシンレダクターゼを含む。更に、当業者は、本発明によるチトクロムＰ４５０の潜在的な酸化還元パートナーである更なるフェレドキシンタンパク質及びフェレドキシンレダクターゼを同定することができる。酸化還元パートナーとしての適合性は、例えば例３～５に記載されているように、機能アッセイで検証することができる。これらの例で使用されるプチダレドキシン及び／又はそこで使用されるプチダレドキシンレダクターゼは、それぞれ可能な代替タンパク質又は酵素で置き換えることができる。所望の生成物（例えば、ウルソコール酸）の十分な形成が観察される場合、試験した酸化還元パートナーは、プチダレドキシン及び／又はプチダレドキシンレダクターゼの機能的代替物と見なすことができる。

【0037】

本発明の特に好ましい実施形態によれば、本発明による方法で使用されるフェレドキシンは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含み、Ｘはメチオニン残基であるか、又はアミノ酸ではない。
配列番号７：

【化9】

【0038】

本発明の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つのフェレドキシンレダクターゼは、フラボドキシンレダクターゼ及びプチダレドキシンレダクターゼの群から選択される。

【0039】

本発明によるヒドロキシル化反応の過程で酸化されたフェレドキシンは、フェレドキシンレダクターゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの助けを借りて還元することができる。結果として、還元されたフェレドキシンが再び提供されるか、又はそれぞれ、本発明による基質の更なるヒドロキシル化反応のためにＮＡＤ（Ｐ）Ｈを消費しながら再生される。フェレドキシンレダクターゼは、フラボドキシンレダクターゼ及び／又はプチダレドキシンレダクターゼであってもよい。

【0040】

本発明の更に好ましい実施形態によれば、本発明による方法で使用されるフェレドキシンレダクターゼは、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
配列番号８：

【化10】

【0041】

配列番号７及び８のアミノ酸配列は、好ましくは、それぞれ配列番号９及び１０の核酸配列によってコードされ、配列番号１１及び１２の核酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化されている。
配列番号９：
（ＡＴＧ）_０又は１

【化11】

配列番号１０：

【化12】

配列番号１１：
（ＡＴＧ）_０又は１

【化13】

配列番号１２：

【化14】

【0042】

細菌、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における本発明によるチトクロムＰ４５０並びにフェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼの発現は、配列番号５、配列番号６、配列番号１１及び／又は配列番号１２の核酸配列を有する核酸を使用する場合に特に有利である。したがって、本発明の更なる態様は、配列番号５、配列番号６、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される核酸配列を有する核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）並びにそれらの配列の少なくとも１つを含むベクター及び／又は細胞、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に関する。

【0043】

上述のフェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼが産生株（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株）においてチトクロムＰ４５０と共に発現（共発現）されると、有利であることが示されている。フェレドキシン、フェレドキシンレダクターゼ及びチトクロムＰ４５０はまた、互いに別々に発現することができる。フェレドキシン及びチトクロムＰ４５０又はフェレドキシンレダクターゼ及びチトクロムＰ４５０を共発現することも有利である。理想的には同じプロモータの下での３つのタンパク質又はそれぞれの酵素の共発現により、酵素間の理想的なバランスを確立することができ、これは基質の酵素的変換に特に有利な効果を有する。

【0044】

本発明の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの酸化還元酵素は、酸化還元酵素（ＥＣ：１．１．１）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２．１）、アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．４．１）、フラビンレダクターゼ（ＥＣ：１．５．１）、トランスヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．６．１）、亜硝酸レダクターゼ（ＥＣ：１．７．１）及びホスホナートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．２０．１）からなる群から選択され、好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ及び糖デヒドロゲナーゼからなる群から選択される。

【0045】

本発明による方法で使用される酸化還元パートナー系、特にプロセスで使用される補因子（ＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋及び／又はＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ^＋）を再生するために、一般式（Ｉ）を有するステロイドを一般式（ＩＩ）を有する７－デオキシステロイドに変換する間に、変換反応が生成物に向かって進むように、酸化還元パートナー系、有利には酸化還元酵素を再生するための系を反応混合物に添加することが有利である。酸化還元酵素は、還元及び酸化によって基質を変換し、これらの反応の過程で、ＮＡＤＨがＮＡＤ^＋に酸化され、ＮＡＤＰＨがＮＡＤＰ^＋に酸化されるか、又はそれぞれＮＡＤ＋がＮＡＤＨに還元され、ＮＡＤＰ^＋がＮＡＤＰＨに還元される。したがって、酸化還元パートナー系を再生するための系は、好ましくは、少なくとも１つの酸化還元酵素、及び少なくとも１つの酸化還元酵素の少なくとも１つの基質を含む。

【0046】

本発明による方法で使用される酸化還元酵素は、好ましくはアルコール及び／又は糖デヒドロゲナーゼである。

【0047】

本発明の更に好ましい実施形態によれば、酸化還元酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、アラビノースデヒドロゲナーゼ、キシロースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、１２α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、７α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、２０α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、１７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、１７α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、３α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、３β－ヒドロキシ－δ５デヒドロゲナーゼ、１１β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される。

【0048】

上述の酸化還元酵素の１つ又はいくつかの使用は、変換反応に使用される補因子を再利用するのに特に有利である。

【0049】

基質の生成物への高い変換を達成するために、アラビノースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ及び／又はキシリトールデヒドロゲナーゼを反応混合物に添加することが特に有利であることが示されている。

【0050】

反応混合物は、少なくとも１つの酸化還元酵素及び１つのヒドロキシラーゼを含むことができる。２つ又は３つ以上の酸化還元酵素の組み合わせを反応混合物に添加することが特に有利であり、１２α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼと７α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの組み合わせ、又はそれぞれ１２α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、７α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、又はそれぞれＮＡＤＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼとヒドロキシラーゼ、又はそれぞれＮＡＤＰＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼとヒドロキシラーゼが、基質混合物、例えばコール酸の天然に存在する混合物の同時酸化及びヒドロキシル化に特によく適している。

【0051】

本発明による方法の反応混合物中の補因子の酸化又はそれぞれ還元反応を触媒するために、その中に存在する酸化還元酵素のための少なくとも１つの基質を提供することが必要である。したがって、反応混合物は、アラビノース、キシロース、グルコース、ソルビトール、キシリトール、コラン－２４－酸、３α，１２α－ジヒドロキシコラン－２４－酸－２，３－ブタンジオール、アセトイン、２－プロパノール、グルタマート、エタノール、ホスホナート、ホスフィット、ニトリット、４－メチル－２－ペンタノール、２－ブタノール、２－オクタノール、シクロヘキサノール、エタンジオール、１，２－プロパンジオール、１－プロパノール、１－ブタノール、３－ヒドロキシブタノアート及びホルマートからなる群から選択される少なくとも１つの酸化還元酵素の少なくとも１つの基質を含む。本発明の好ましい実施形態によれば、本発明による方法は、１０℃～４０℃、好ましくは１５℃～３８℃、より好ましくは２０℃～３０℃、より好ましくは２２℃～２６℃の温度で行われる。本発明によれば、本発明による反応のためのチトクロムＰ４５０の酵素活性がこの領域で特に高いことが示されている。

【0052】

本発明の更に好ましい実施形態によれば、本発明による方法は、６．５～８．５、好ましくは７～８、より好ましくは７．２～７．８のｐＨで行われる。このｐＨ値では、基質の適切な変換を可能にするためにチトクロムＰ４５０の酵素活性が最も高い。

【0053】

デオキシステロイド又はそれぞれデオキシステロイド誘導体のヒドロキシル化は、ステロイド骨格の７位で位置選択的に行うことができる。このようにして、特に、例えば、ウルソコール酸及び／又はウルソコール酸誘導体を生成することができるように、７β－ヒドロキシル基を立体選択的に導入することができる。

【0054】

好ましい実施形態では、本発明による方法は、少なくとも１つの有機溶媒の存在下で行われる。好ましくは、単相系が提供されるように、単一の有機溶媒が使用される。本発明によれば、単相系が提供されるように、互いに混和性である２つ以上の有機溶媒の混合物を使用することも可能である。有機溶媒はプロトン性又は非プロトン性であってもよく、非プロトン性溶媒が好ましい。

【0055】

驚くべきことに、有機溶媒、特に非プロトン性有機溶媒の存在は、本発明による方法により、一般式（ＩＩ）の７－デオキシステロイドの一般式（Ｉ）のステロイドへの変換を有意に増加させ得ることが見出された。更に、有機溶媒の存在下での本発明による方法の実施は、驚くべきことに、酸化還元パートナー系の再生を可能にする。

【0056】

例えば、アルコール、エーテル、エステル、グリコール、ケトン、アミド、スルホキシド、有機酸、シクロアルカン、芳香族及び塩素化炭化水素を有機溶媒として使用することができる。適切な有機溶媒の例は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、２－ブタノール、４－メチル－２－ペンタノール（メチルイソブチルアルコール、ＭＩＢＡ）、ジエチルエーテル（Ｅｔ_２Ｏ）、ジイソプロピルエーテル（ｉＰｒ_２Ｏ）、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、２－メチルテトラヒドロフラン（Ｍｅ－ＴＨＦ）、酢酸エチル、エチレングリコール、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、２－ブタノン、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、シクロヘキサン、トルエン、トリクロロメタン（ＣＨＣｌ_３）、ジクロロメタン（ＣＨ_２Ｃｌ_２）、ヘキサン又はそれらの混合物である。適切な混合物は、例えば、ヘキサン及び酢酸エチル又はイソプロパノールの混合物、並びにトリクロロメタン及びフェノールの混合物である。本発明は、上記の例示的な溶媒のリストに限定されない。

【0057】

有機溶媒としては、非プロトン性有機溶媒が好ましく、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）からなる群より選ばれる溶媒が特に好ましい。

【0058】

本発明によれば、有機溶媒の量は、一般式（ＩＩ）の化合物が完全に溶解し、酵素活性が保存されるように選択される。好ましくは、式（ＩＩ）の化合物、例えばリトコール酸は、溶解限界まで有機溶媒に溶解される。好ましい実施形態では、酵素の基質は有機溶媒中に入れられる。

【0059】

本発明による方法では、生成物の単離を異なる方法で行うことができる。例えば、生成物は、適切な有機溶媒によって反応混合物から抽出することができる。基材に応じて、そのような溶媒は文献に記載されている。本発明によれば、コール酸及びその誘導体は、場合により反応混合物を例えばＨＣｌで酸性化した後に、例えば酢酸エチルとの反応混合物から単離することができる。胆汁酸が塩、例えばナトリウム塩の形態で水溶液中に存在する方法は、特別な場合を構成する。

【0060】

この場合、生成物の沈殿は、反応混合物を酸性化することによって行うことができる。この目的のために、例えば、ＨＣｌ又は希ＨＣｌを十分な量で反応混合物に添加することができる。例えば、１～４、好ましくは２～３のｐＨ値がプロセスにおいて達成される場合、生成物は主に懸濁液の形態で存在する。次いで、生成物を、例えば濾過又は遠心分離などの一般的な方法によって反応混合物から除去することができる。例えばアフィニティークロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法は、例えば生成物の単離に使用することができる別の代替法である。更には、例えば、反応溶媒を蒸発させることにより生成物を得ることができる。

【0061】

或いは、本発明による方法では、生成物はまた、例えば、更に多くの反応を行い、場合によりそれらの反応の完了時に最終生成物を単離するために、反応後に反応混合物中に残っていてもよい。本発明による方法のための１つ又は複数の基質は、以前の反応又は並行して行われる反応によって同じ反応バッチで製造されることも考えられる。

【0062】

本発明の更なる態様は、フェレドキシン、フェレドキシンレダクターゼ及び酸化還元酵素からなる群から選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子が直接又はスペーサを介して結合している３’末端及び／又は５’末端に上で定義したチトクロムＰ４５０酵素をコードする核酸分子を含む核酸構築物に関する。

【0063】

本発明による核酸構築物は、最初に定義されたステロイドの産生に特に適している。チトクロムＰ４５０酵素と、フェレドキシン、フェレドキシンレダクターゼ及び酸化還元酵素からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質とを、核酸構築物から出発して発現させることによって、これらの酵素又はそれぞれのタンパク質を、本発明による方法の効率的な実施に必要な量で産生することが可能になる。これらのタンパク質の全てが、本発明による核酸構築物上の同じプロモータの制御下で発現される場合、特に有利である。本発明の更なる態様は、本発明による核酸構築物を含むベクターである。

【0064】

チトクロムＰ４５０酵素をコードする核酸分子は、本発明による方法で使用することができる酵素又はそれぞれタンパク質をコードする更なる核酸分子に直接又はスペーサ若しくはそれぞれスペーサ配列を介して結合することができる。そのような構築物の利点は、そのような構築物が、本発明による方法で使用される酵素及びタンパク質、特にチトクロムＰ４５０並びにフェレドキシン及び／又はフェレドキシンレダクターゼを同程度の量で発現させることを可能にすることである。

【0065】

本明細書で使用される「スペーサ」又はそれぞれ「スペーサ配列」は、終止コドンも他の機能モチーフも有さない核酸配列である。スペーサ又はそれぞれスペーサ配列は、必要に応じて、これらのＯＲＦの転写を改善するために、２つのＯＲＦ間の距離ホルダーとして働く。

【0066】

本発明の好ましい実施形態によれば、チトクロムＰ４５０酵素は、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％、特に１００％同一の核酸によってコードされる。

【0067】

本発明の更に好ましい実施形態によれば、フェレドキシンは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。

【0068】

本発明の特に好ましい実施形態によれば、フェレドキシンレダクターゼは、アドレノドキシンレダクターゼ、好ましくはプチダレドキシンレダクターゼである。

【0069】

フェレドキシンレダクターゼは、好ましくは配列番号８のアミノ酸配列を含む。

【0070】

本発明の別の態様は、本発明による核酸構築物を含むベクターに関する。

【0071】

本発明によるベクターは、クローニング又は発現ベクターであってもよく、ベクターが導入される生物に応じて、例えばＯＲＦの転写を可能にするために適切な部分を有することができる。

【0072】

本発明の更に別の態様は、本発明による核酸構築物を含む宿主細胞に関する。

【0073】

本発明による宿主細胞は、組換え的に導入され、核酸構築物上に位置するＯＲＦをクローニング又は発現するために使用することができる。

【0074】

そのような宿主細胞の溶解物は、宿主細胞が本発明による方法で必要とされる酵素又はそれぞれのタンパク質の少なくとも１つを細胞内又は細胞外に発現することを条件として、本発明による方法で使用することができる。一般式（ＩＩ）を有する７－デオキシステロイド又はその誘導体は、それによって、本発明による宿主細胞の培養上清及び／又は溶解物中の細胞懸濁液又は細胞と接触させることが好ましい。したがって、本発明の好ましい実施形態によれば、一般式（ＩＩ）を有する７－デオキシステロイド又はその誘導体を、少なくとも１つのフェレドキシン、少なくとも１つのフェレドキシンレダクターゼ及び／又は少なくとも１つの酸化還元酵素を発現することができる少なくとも１つの宿主細胞の少なくとも１つの培養上清及び／又は溶解物と接触させる。

【0075】

例
以下の例を使用して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

【0076】

例１：細菌株の試験
微生物及び細胞培養のドイツ菌株コレクション（ＤＳＭＺ［Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓｔａｍｍｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ］）から、以下の菌株であるサッカロスリクス・ロンギスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ ｌｏｎｇｉｓｐｏｒａ）（ＤＳＭ－４３７４９）、カテラトスポラ・シトラエ（Ｃａｔｅｌｌａｔｏｓｐｏｒａ ｃｉｔｒａｅ）（ＤＳＭ－４４０９７）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス亜種ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）（ＤＳＭ－４０５７８）及びアサノア・フェッルギネア（Ａｓａｎｏａ ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ）（ＤＳＭ－４４０９９）を得た。株を、ＤＳＭＺによって推奨される標準的な条件下で培養した。培養物の増殖が目に見える濁りに達したらすぐに、デオキシコール酸（０．５ｍＭ）を添加し、更に最大７２時間培養した。遠心分離工程後、培養物の上清を酢酸エチルで抽出し、ＨＰＬＣ及びＧＣ／ＭＳによって分析した。ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）との反応のＨＰＬＣクロマトグラムでは、その保持時間がウルソコール酸の保持時間に対応するピークが認められた。ＧＣ／ＭＳ分析により、潜在的なウルソコール酸ピークが３個のヒドロキシル基を有する胆汁酸に由来することが示された。他の株の検査では、デオキシコール酸の７－ヒドロキシル化生成物は示されなかった。

【0077】

例２：Ｐ４５０遺伝子のゲノム配列決定及びアノテーション
ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス亜種ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）（ＤＳＭ－４０５７８）をＤＳＭＺの規定に従って培養したところ、この株のゲノムＤＮＡが単離された（Ｋｉｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｎｏｒｗｉｃｈ：Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ））。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用してゲノム配列決定を行い、公知のストレプトマイセス・ラパミシニカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｐａｍｙｃｉｎｉｃｕｓ）のゲノムに基づくアセンブリを行った（スイスのＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＧｍｂＨ）。相同性比較によって４２個のＰ４５０遺伝子を同定することができた。

【0078】

例３：発現系のクローニング
制限酵素ＸｈｏＩを使用して、プチダレドキシンレダクターゼ（ＰｔＲ）及びプチダレドキシン（Ｐｔｘ）のコード領域を含む以下の構築物をプラスミドｐＪ４１１（ＤＮＡ２．０）にクローニングした。

【0079】

合成ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）：５’、ＸｈｏＩ界面、ＨｉｎｄＩＩＩ界面、約５０ｂｐのスペーサＤＮＡ、リボソーム結合部位（ｒｂｓ）、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）プチダレドキシンレダクターゼ（ＰｔＲ）、約５０ｂｐのスペーサＤＮＡ、ｒｂｓ、ＯＲＦプチダレドキシン（Ｐｔｘ）、ＸｈｏＩ界面、３’。

【0080】

クローニング工程の結果を、制限酵素消化及びＤＮＡ配列決定によって確認した。

【0081】

続いて、制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用して、例２で同定したＰ４５０酵素をコードするＯＲＦを上記合成ＤＮＡ及びプラスミドにそれぞれ１つクローニングした（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。この結果を再度、制限酵素消化及びＤＮＡ配列決定によって検証した。この例で使用される発現ベクター及び使用される酸化還元パートナーは、本発明によるチトクロムＰ４５０酵素を発現させる１つの方法のみを構成し、その方法は一例として選択されている。

【0082】

同定されたＰ４５０候補を用いて産生された発現プラスミド（例２を参照）は、それぞれのＰ４５０タンパク質をプチダレドキシンレダクターゼ及びプチダレドキシンと一緒に共同で発現させるために使用することができる。それぞれの発現プラスミドの３つのＯＲＦは、共通のｍＲＮＡ上のＴ７プロモータの制御下で発現されるが、別個のポリペプチドとして発現される。

【0083】

例４：Ｐ４５０／Ｐｔｘ／ＰｔＲの発現
ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス亜種ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のゲノム配列決定後、可能性のあるデオキシコール酸－７－ヒドロキシラーゼの候補として４２個のＰ４５０配列が検討された。探している酵素を同定するために、候補のＯＲＦを例３に記載の発現系にクローニングし、プチダレドキシンレダクターゼ（ＰｔＲ）及びプチダレドキシン（Ｐｔｘ）のコード領域なしでｐＪ４１１（ＤＮＡ２．０）発現ベクターにクローニングした。発現には以下のプロトコルを使用した。

【0084】

ＴＢ－Ｐ４５０発現培地：
Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地
＋５０μｇ／ｍｌカナマイシン
＋０．５ｍＭ ５－アミノレブリン酸（１００×親溶液から）
＋１ｍＭチアミン（１００×親溶液から）
＋１ｍＭ ＭｇＣｌ_２＋２．５ｍＭ硫酸アンモニウム＋５０μＭ ＦｅＣｌ_３（１００×親溶液から）
＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧ（１Ｍ親溶液から）
（添加剤はそれぞれ０．２μｍ滅菌濾過した）
Ｐ４５０溶解緩衝液：
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５
２０％（ｖ／ｖ）グリセリン
１ｍｇ／ｍｌリゾチーム

【0085】

試験するＰ４５０候補の構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。一晩培養物を単一コロニー（ＬＢ（溶原性ブロス）＋カナマイシン）から播種した。翌日、１：１００発現培養物にこれを播種し（１５０ｍｌのＴＢ（ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）－Ｐ４５０発現培地）、最初にバッフル付フラスコ（１Ｌ）中３７℃で３時間振盪した。その後、温度を２４℃に下げ、更に２２時間振盪した。培養物を５０００ｇで１０分間の遠心分離によって回収し、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで１回洗浄し、ペレットを－８０℃で凍結させた。細胞ペレットを解凍し、秤量し、等量のＰ４５０溶解緩衝液で再懸濁し、氷上で１時間インキュベートし、次いで超音波処理装置を使用して消化した。遠心分離（３０分、２１０００ｇ）し、上清を試験反応に使用した。

【0086】

例５：ＤＡヒドロキシル化のためのＰ４５０候補の試験
反応混合物：
１０～８０μｌの１００ｍＭ ＮＡＤＨ（酸化還元補因子）
２５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５
１７．５μｌのグリセリン（５０％）
１００μｌの５０ｍＭデオキシコール酸溶液ｐＨ８．５（最終１０ｍＭ）
５０μｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物Ｐ４５０／ＰｔＲ／Ｐｔｘ（例４参照）
１７．５－８７．５ μｌ ｄＨ_２Ｏ

【0087】

反応物を１．５ｍｌのスクリュートップ瓶に入れ、アルミニウム箔で蓋をした。箔の数カ所に穴を開けた。これを２４℃で１８時間穏やかに振盪した。２００μｌの反応バッチを６００μｌのアセトニトリル／５μｌのＨ_３ＰＯ_４（５０％）で希釈し、５５℃で１５分間インキュベートした。その後、サンプルを２０８１７ｒｃｆで５分間遠心分離し、ＨＰＬＣ／ＤＡＤ（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ、カラム：メルク社製Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ ＳＴＡＲ ＲＰ－１８ｅ １２５×４ｍｍ、５μｍ、
流速：１．５ｍｌ／分、勾配Ｈ_２Ｏ＋Ｈ_３ＰＯ_４（ｐＨ＝２．６）／アセトニトリル）を使用して分析した。調べた候補の１つ（「Ｐ４５０＿ｃ８６６」は、デオキシコール酸をウルソコール酸にヒドロキシル化することができた。使用したデオキシコール酸は、このプロセスで変換された（以下の表を参照）。生成物ウルソコール酸の同一性をＧＣ／ＭＳ分析及び２Ｄ ＮＭＲによって検証した。

【表1】

【0088】

この例では、酸化還元補因子（ＮＡＤＨ）がＰ４５０／Ｐｔｘ／ＰｔＲ反応によって酸化される。

【0089】

例６：アラビノースデヒドロゲナーゼの補因子リサイクルによるＤＡヒドロキシル化のためのＰ４５０候補の試験
反応混合物：
６５μｌの１００ｍＭ ＮＡＤＨ（最終０．５ｍＭ）
１ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５＋２０％（ｖ／ｖ）グリセリン
１３０μｌの５０ｍＭデオキシコール酸溶液ｐＨ８．５（最終０．５ｍＭ）
６．５μｌのクロラムフェニコール溶液（最終２０μｇ／ｍｌ）
１００μｌのＬ－アラビノースデヒドロゲナーゼ
（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で組換え発現されたバークホルデリア・ビエトナミエンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ）から、４００Ｕ／ｍｌ）
９８ｍｇのＬ－アラビノース（最終５０ｍＭ）
２．０ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物Ｐ４５０／ＰｔＲ／Ｐｔｘ（例４参照）
９．６ｍｌのｄＨ_２Ｏ

【0090】

５０ｍｌのバッフルのない三角フラスコに反応物を入れ、アルミニウム箔で密封した。フィルムの数カ所に穴を開けた。これを２４℃で１６時間穏やかに振盪した。上清中に存在する物質を酢酸エチルで抽出し、蒸発させた。これをより少量のＨＰＬＣ溶離液（メタノール／アセトニトリル／Ｈ_２Ｏ＋Ｈ_３ＰＯ_４（ｐＨ＝３．０）、４０：３０：３３）に溶解した。続いて、ＨＰＬＣ／ＲＩＤ（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ、カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８ ４．６×１５０ｍｍ、５μｍ、流速：０．８ｍｌ／分）を使用してサンプルを分析した。調べた候補の１つ（「Ｐ４５０＿ｃ８６６」は、デオキシコール酸をウルソコール酸にヒドロキシル化することができた。使用したデオキシコール酸は、このプロセスでほぼ完全に変換された（９５％超）。生成物ウルソコール酸の同一性をＧＣ／ＭＳ分析及び２Ｄ ＮＭＲによって検証した（データは示さず）。

【0091】

この例では、酸化還元補因子（ＮＡＤＨ）がＰ４５０／Ｐｔｘ／ＰｔＲ反応によって酸化される。酸化還元補因子は、補因子再生（この場合、例えば、糖デヒドロゲナーゼアラビノースデヒドロゲナーゼを使用すること）によって元の状態に還元される（この場合、アラビノースはアラビノラクトン／アラボン酸に酸化される）。これにより、準化学量論量の酸化還元補因子の使用が可能になる。

【0092】

例７：例：補因子リサイクルによる補因子濃度変換に依存する変換
反応混合物：
１０μｌの１０ｍＭ ＮＡＤ＋
２５０μｌの１００ｍＭ ＴＥＡ ｐＨ８．２
２５μｌのグリセリン（５０％）
１００μｌの５０ｍＭデオキシコール酸溶液ｐＨ８．０（最終１０ｍＭ）
１００ｍＭ ＴＥＡ ｐＨ８．０及び２５％グリセリン中の２２．５％懸濁液としての６．７５ｍｇの細胞（ｗＷ）
５μｌカタラーゼ（ウシ、Ｓｉｇｍａ社４ｍｇ／ｍｌ）
１．７ユニットのキシリトール／ソルビトールデヒドロゲナーゼ
２５μｌの２Ｍソルビトール（最終１００ｍＭ）
７０．８ μｌ ｄＨ_２Ｏ

【0093】

反応物を１．５ｍｌのスクリュートップ瓶に入れ、アルミニウム箔で蓋をした。箔の数カ所に穴を開けた。これを２４℃で１８時間穏やかに振盪した。

【0094】

ＮＡＤＨの回収は、ソルビトール及びＮＡＤ^＋の存在下でソルビトール又はそれぞれキシリトールデヒドロゲナーゼによって行った。

【0095】

２００μｌの反応バッチを６００μｌのアセトニトリル／５μｌのＨ_３ＰＯ_４（５０％）で希釈し、５５℃で１５分間インキュベートした。その後、サンプルを２０８１７ｒｃｆで５分間遠心分離し、ＨＰＬＣ／ＤＡＤ（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ、カラム：メルク社製Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ ＳＴＡＲ ＲＰ－１８ｅ １２５×４ｍｍ又はＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＸＤＢ－Ｃ８ｍｍ １５０×４．６ｍｍ、３．５μｍ、５μｍ、流速：１．５ｍｌ／分、勾配Ｈ_２Ｏ＋Ｈ_３ＰＯ_４（ｐＨ＝２．６）／アセトニトリル）を使用して分析した。

【0096】

使用したデオキシコール酸は、上記の条件下で定量的に（１００％変換）ウルソコール酸に変換された。生成物ウルソコール酸の同一性をＧＣ／ＭＳ分析及び２Ｄ ＮＭＲによって検証した。

【0097】

本例では、補因子リサイクル系ソルビトール／キシリトールデヒドロゲナーゼ／ソルビトール／ＮＡＤ^＋によって得られた酸化還元補因子（ＮＡＤＨ）をヒドロキシル化反応に使用する。しかし、補因子リサイクルのための他の系も使用することができる（以下の表を参照）。

【表2】

【0098】

例８：定量的ＬＣＡ（リトコール酸）変換
反応混合物：
１０μｌの１０ｍＭ ＮＡＤ＋
２５０μｌの１００ｍＭ ＴＥＡ ｐＨ８．２
１０ｍＭ（最終）リトコール酸
１００ｍＭ ＴＥＡ ｐＨ８．０及び２５％グリセリン中の２２．５％懸濁液としての９．２ｍｇの細胞（ｗＷ）
５μｌカタラーゼ（ウシ、Ｓｉｇｍａ社４ｍｇ／ｍｌ）
１．７ユニットのキシリトール／ソルビトールデヒドロゲナーゼ
２５μｌの２Ｍソルビトール（最終１００ｍＭ）
１７６ μｌ ｄＨ_２Ｏ

【0099】

反応物を１．５ｍｌのスクリュートップ瓶に入れ、アルミニウム箔で蓋をした。箔の数カ所に穴を開けた。これを２４℃で１８時間穏やかに振盪した。

【0100】

ＮＡＤＨの回収は、ソルビトール及びＮＡＤ^＋の存在下でソルビトール又はそれぞれキシリトールデヒドロゲナーゼによって行った。

【0101】

２００μｌの反応バッチを６００μｌのアセトニトリル／５μｌのＨ_３ＰＯ_４（５０％）で希釈し、５５℃で１５分間インキュベートした。その後、サンプルを２０８１７ｒｃｆで５分間遠心分離し、ＨＰＬＣ／ＤＡＤ（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ、カラム：メルク社製Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ ＳＴＡＲ ＲＰ－１８ｅ １２５×４ｍｍ又はＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＸＤＢ－Ｃ８ｍｍ １５０×４．６ｍｍ、３．５μｍ、５μｍ、流速：１．５ｍｌ／分、勾配Ｈ_２Ｏ＋Ｈ_３ＰＯ_４（ｐＨ＝２．６）／アセトニトリル）を使用して分析した。

【0102】

上記の条件下では、変換後にウルソデオキシコール酸のみが検出された。

【0103】

例９：有機溶媒の存在下でのＬＣＡ（リトコール酸）のウルソデオキシコール酸への変換
まず、ＬＣＡ及びＵＤＣＡの各種有機溶媒に対する溶解限界を測定した。この目的のために、それぞれ１０ｍｇ又は１００ｍｇのＬＣＡ又はＵＤＣＡを１５ｍＬフラスコに入れた。有機溶媒を１００μＬずつ添加し、混合物をボルテックスシェーカ及び場合により超音波浴中で振盪することによって処理した。透明な溶液が存在するかどうかについて視覚的に評価した。

【0104】

以下の表は、分析された溶媒について決定された溶解限界をまとめたものである。

【表3】

【0105】

溶媒の存在下でのＬＣＡのＵＤＣＡへの変換を以下の表に示すように測定した。

【表4】

【0106】

例１０：非プロトン性溶媒の存在下で基質濃度を増加させたリトコール酸のウルソデオキシコール酸への変換
反応混合物：
１０μｌの１０ｍＭ ＮＡＤ＋
１０．８％グリセリンを含む２５０μｌの２００ｍＭ ＴＥＡ ｐＨ８．４
ＤＭＦ中の２５μｌの５００ｍＭリトコール酸
１００ｍＭ ＴＥＡ ｐＨ９．０中の３０％懸濁液として３０ｍｇの細胞（ｗＷ）
５μｌカタラーゼ（ウシ、Ｓｉｇｍａ社４ｍｇ／ｍｌ）
１．７ユニットのキシリトール／ソルビトールデヒドロゲナーゼ
２５μｌの２Ｍソルビトール（最終１００ｍＭ）
７３ μｌ ｄＨ_２Ｏ

【0107】

反応物を１．５ｍｌのスクリュートップ瓶に入れ、アルミニウム箔で蓋をした。箔の数カ所に穴を開けた。これを２４℃で１８時間穏やかに振盪した。

【0108】

ＮＡＤＨの回収は、ソルビトール及びＮＡＤ^＋の存在下でソルビトール又はそれぞれキシリトールデヒドロゲナーゼによって行った。

【0109】

反応バッチを空気流中で完全に蒸発させ、１．１ｍｌのＩＰＡ＋０．５％ＴＦＡで再溶解した。その後、サンプルを２０８１７ｒｃｆで５分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣ／ＲＩＤ（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ １００Å、２５０×４．６ｍｍ、５μｍ、流速：１．０ｍｌ／分、ｎ－ヘキサン／ＩＰＡ ４：１＋０．０５％ ＴＦＡ均一濃度）で分析した。

【0110】

上記の条件下では、変換後に７０％のウルソデオキシコール酸が検出された。

【配列表フリーテキスト】

【0111】

配列表５ ＜２２３＞Ｅ．ｃｏｌｉ コドンが最適化された配列番号３
配列表６ ＜２２３＞Ｅ．ｃｏｌｉ コドンが最適化された配列番号４
配列表７ ＜２２３＞Ｘａａはメチオニンまたはアミノ酸無し
配列表９ ＜２２３＞ｎはＡまたはヌクレオチド無し
配列表９ ＜２２３＞ｎはＴまたはヌクレオチド無し
配列表９ ＜２２３＞ｎはＧまたはヌクレオチド無し
配列表１１ ＜２２３＞Ｅ．ｃｏｌｉ コドンが最適化された配列番号９
配列表１１ ＜２２３＞ｎはＡまたはヌクレオチド無し
配列表１１ ＜２２３＞ｎはＴまたはヌクレオチド無し
配列表１１ ＜２２３＞ｎはＧまたはヌクレオチド無し
配列表１２ ＜２２３＞Ｅ．ｃｏｌｉ コドンが最適化された配列番号１０

【配列表】

2023516682000001.app

【国際調査報告】