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特表2023-516748トランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するための組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-20
(54)【発明の名称】トランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7105 20060101AFI20230413BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20230413BHJP
A61K 47/55 20170101ALI20230413BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230413BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230413BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230413BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230413BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230413BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20230413BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7105
A61K31/712
A61K47/55
A61K48/00
A61P25/00
A61P9/00
A61K45/00
A61P43/00 121
C12N15/113 Z ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022553196
(86)(22)【出願日】2021-03-05
(85)【翻訳文提出日】2022-11-04
(86)【国際出願番号】 US2021021049
(87)【国際公開番号】W WO2021178778
(87)【国際公開日】2021-09-10
(31)【優先権主張番号】62/985,950
(32)【優先日】2020-03-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】505369158
【氏名又は名称】アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＮＹＬＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】チャン，エイミー
(72)【発明者】
【氏名】ジャナス，マジャ
(72)【発明者】
【氏名】マクドゥーガル，ロビン ディ
(72)【発明者】
【氏名】ラムスデン，ダイアン
(72)【発明者】
【氏名】シュリーゲル，マーク ケイ
(72)【発明者】
【氏名】サザーランド，ジェシカ イー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076DD67
4C084AA13
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA01
4C084ZA36
4C084ZC751
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA66
4C086NA14
(57)【要約】
本発明は、トランスサイレチン(ＴＴＲ)遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を使用する、ＴＴＲ関連疾患を処置するための組成物および方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤であって、ここで：センス鎖およびアンチセンス鎖の各々は独立して最大３０ヌクレオチド長であり；
センス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；そして
アンチセンス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含み、
ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェートであり；
Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスフェート、２’－フルオロシチジン－３’－ホスフェート、２’－フルオログアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－フルオロウリジン－３’－ホスフェートであり；
(Ｔｇｎ)はチミジン－グリコール核酸(ＧＮＡ)Ｓ－異性体であり；そして
ｓはホスホロチオエートリンカーである、
ＲＮＡｉ剤。
【請求項2】
二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖が少なくとも１個のリガンドにコンジュゲートする、請求項１のＲＮＡｉ剤。
【請求項3】
リガンドが二価または三価分岐リンカーを介して結合する１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項２のＲＮＡｉ剤。
【請求項4】
リガンドが【化1】
【請求項5】
リガンドがセンス鎖の３’末端に結合する、請求項２～４の何れかのＲＮＡｉリガンド。
【請求項6】
二本鎖ＲＮＡｉ剤が次の式で示すとおり、リガンドに結合する：【化2】
、請求項５のＲＮＡｉ剤。
【請求項7】
センス鎖が２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖が２３ヌクレオチド長である、請求項１～６の何れかのＲＮＡｉ剤。
【請求項8】
ＴＴＲ関連疾患を有するヒト対象を処置する方法におけるＲＮＡｉ剤の使用であって、対象に２５mg～１０００mgの固定用量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤を投与することを含み、ここで：センス鎖およびアンチセンス鎖の各々は独立して最大３０ヌクレオチド長であり；
センス鎖は修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；そして
アンチセンス鎖は修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含み、
ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェートであり；
Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスフェート、２’－フルオロシチジン－３’－ホスフェート、２’－フルオログアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－フルオロウリジン－３’－ホスフェートであり；
(Ｔｇｎ)はチミジン－グリコール核酸(ＧＮＡ)Ｓ－異性体であり；そして
ｓはホスホロチオエートリンカーである、
使用。
【請求項9】
ＴＴＲ関連疾患の診断基準を満たさないヒト対象におけるＴＴＲの発現を阻害する方法におけるＲＮＡｉ剤の使用であって、対象に２５mg～１０００mgの固定用量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤を投与することを含み、ここで：各センス鎖およびアンチセンス鎖は独立して最大３０ヌクレオチド長であり；
センス鎖は修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；そして
アンチセンス鎖は修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含み、
ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェートであり；
Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスフェート、２’－フルオロシチジン－３’－ホスフェート、２’－フルオログアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－フルオロウリジン－３’－ホスフェートであり；
(Ｔｇｎ)はチミジン－グリコール核酸(ＧＮＡ)Ｓ－異性体であり；そして
ｓはホスホロチオエートリンカーである、
使用。
【請求項10】
二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖が少なくとも１個のリガンドにコンジュゲートする、請求項８または９の使用。
【請求項11】
リガンドが二価または三価分岐リンカーを介して結合する１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項１０の使用。
【請求項12】
リガンドが【化3】
【請求項13】
リガンドがセンス鎖の３’末端に結合する、請求項９～１２の何れかの使用。
【請求項14】
二本鎖ＲＮＡｉ剤が次の式で示すとおり、リガンドに結合する：【化4】
、請求項１３の使用。
【請求項15】
センス鎖が２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖が２３ヌクレオチド長である、請求項８～１４の何れかの使用。
【請求項16】
方法が神経学的障害、クオリティ・オブ・ライフ、進行中の神経損傷または心血管機能障害の少なくとも１個の指標の改善を含む、請求項８～１５の何れかの使用。
【請求項17】
指標が神経機能障害指標である、請求項１６の使用。
【請求項18】
神経機能障害指標がニューロパチー機能障害(ＮＩＳ)スコア、修飾ＮＩＳ(ｍＮＩＳ＋７)スコア、ＮＩＳ－Ｗスコア、複合自律神経症状スコア(ＣＯＭＰＡＳＳ－３１)、中心性肥満度指数(ｍＢＭＩ)スコア、６分間歩行検査(６ＭＷＴ)スコアおよび１０メートル歩行検査スコアの群から選択される指標におけるベースラインからの変化である、請求項１７の使用。
【請求項19】
指標がクオリティ・オブ・ライフ指標である、請求項１６の使用。
【請求項20】
クオリティ・オブ・ライフ指標がＳＦ－３６(登録商標)健康調査スコア、ノーフォーククオリティ・オブ・ライフ－糖尿病性ニューロパチー(ノーフォークＱＯＬ－ＤＮ)スコアおよびラッシュ構築全体的能力障害スケール(Ｒ－ＯＤＳ)スコアの群から選択される指標におけるベースラインからの変化である、請求項１９の使用。
【請求項21】
指標が進行中の神経損傷である、請求項１６の使用。
【請求項22】
進行中の神経損傷の指標が群神経フィラメント軽鎖(ＮｆＬ)、ＲＳＰＯ３、ＣＣＤＣ８０、ＥＤＡ２Ｒ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰおよびＮ－ＣＤａｓｅから選択される１以上のタンパク質の血漿タンパク質レベルのベースラインからの変化である、請求項２１の使用。
【請求項23】
進行中の神経損傷の指標が血漿レベルの神経フィラメント軽鎖(ＮｆＬ)タンパク質レベルの変化である、請求項２１の使用。
【請求項24】
指標が心血管機能障害指標である、請求項１６の使用。
【請求項25】
心血管機能障害の指標が心血管入院、健康状態が良好であることを示すスコアの増加を伴うカンザスシティ心筋症質問票の全体サマリー(ＫＣＣＱ－ＯＳ)を使用するベースラインからの変化、心エコー評価による平均左室心(ＬＶ)壁厚のベースラインからの変化、心エコー評価による長軸方向のグローバル・ストレインのベースラインからの変化およびＮ末端プロホルモンＢ型ナトリウム利尿ペプチド(ＮＴｐｒｏＢＮＰ)のベースラインからの変化である、請求項２４の使用。
【請求項26】
ヒト対象がＴＴＲ関連疾患の発症と関連するＴＴＲ遺伝子変異を有する、請求項８～２５の何れかの使用。
【請求項27】
ＴＴＲ関連疾患が老人性全身性アミロイドーシス(ＳＳＡ)、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー(ＦＡＰ)、家族性アミロイド心筋症(ＦＡＣ)、軟髄膜／中枢神経系(ＣＮＳ)アミロイドーシス、高サイロキシン血症および心アミロイドーシスからなる群から選択される、請求項８～２６の何れかの使用。
【請求項28】
ヒト対象がトランスサイレチン介在アミロイドーシス(ＡＴＴＲアミロイドーシス)を有し、ＲＮＡｉ剤を使用する方法がヒト対象におけるアミロイドＴＴＲ沈着を減少させる、請求項８～２５の何れかの使用。
【請求項29】
ＡＴＴＲが遺伝性ＡＴＴＲ(ｈ－ＡＴＴＲ)である、請求項２８の使用。
【請求項30】
ＡＴＴＲが非遺伝性ＡＴＴＲ(ｗｔ ＡＴＴＲ)である、請求項２８の使用。
【請求項31】
二本鎖ＲＮＡｉ剤がヒト対象に皮下投与または静脈内投与により投与される、請求項８～３０の何れかの使用。
【請求項32】
皮下投与が自己投与である、請求項３１の使用。
【請求項33】
自己投与がプレフィルドシリンジまたは自動注入器シリンジを介する、請求項３２の使用。
【請求項34】
ヒト対象由来のサンプルにおけるＴＴＲ ｍＲＮＡ発現またはＴＴＲタンパク質発現レベルの評価をさらに含む、請求項８～３３の何れかの使用。
【請求項35】
二本鎖ＲＮＡｉ剤が３カ月に１回～年１回ヒト対象に投与される、請求項８～３４の何れかの使用。
【請求項36】
固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤が約３カ月に１回、６カ月に１回または年１回ヒト対象に投与される、請求項８～３５の何れかの使用。
【請求項37】
固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤が２５mg～３００mgを３カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される、請求項８～３５の何れかの使用。
【請求項38】
固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤が２５mg～２００mgを３カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される、請求項８～３５の何れかの使用。
【請求項39】
固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤が７５mg～２００mgを３カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される、請求項８～３５の何れかの使用。
【請求項40】
固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤が２５mgを３カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される、請求項８～３５の何れかの使用。
【請求項41】
固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤が７５mgを３カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される、請求項８～３５の何れかの使用。
【請求項42】
固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤が１００mgを３カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される、請求項８～３５の何れかの使用。
【請求項43】
固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤が２００mgを３カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される、請求項８～３５の何れかの使用。
【請求項44】
固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤が３００mgを３カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される、請求項８～３５の何れかの使用。
【請求項45】
固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤が４００mg～６００mgを６カ月に１回～１２カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される、請求項８～３５の何れかの使用。
【請求項46】
固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤が４００mg～６００mgを６カ月に１回または１２カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される、請求項８～３５の何れかの使用。
【請求項47】
固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤が４００mgまたは６００mgを６カ月に１回または１２カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される、請求項８～３５の何れかの使用。
【請求項48】
固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤が７００mg～１０００mgを１２カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される、請求項８～３５の何れかの使用。
【請求項49】
固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤が７００mg、８００mg、９００mgまたは１０００mgを１２カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される、請求項８～３５の何れかの使用。
【請求項50】
ヒト対象にさらなる治療剤を投与することをさらに含む、請求項８～４９の何れかの使用。
【請求項51】
さらなる治療剤がＴＴＲ四量体安定化剤または非ステロイド性抗炎症剤である、請求項５０の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、引用により本明細書に内容全体を包含させる２０２０年３月６日出願の米国仮出願６２／９８５,９５０に基づく優先権の利益を主張する。
本出願は、引用により本明細書に内容全体を包含させる２０２０年３月６日出願の米国仮出願６２／９８５,９５０に基づく優先権の利益を主張する。
【0002】
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、引用により全体として本明細書に包含させる配列表を含む。該ASCIIコピーは、２０２１年２月２６日に作成され、121301_12320_SL.txtなる名称であり、４４,４５５バイトサイズである。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、引用により全体として本明細書に包含させる配列表を含む。該ASCIIコピーは、２０２１年２月２６日に作成され、121301_12320_SL.txtなる名称であり、４４,４５５バイトサイズである。
【背景技術】
【0003】
背景
トランスサイレチン(ＴＴＲ)(プレアルブミンとしても知られる)は血清および脳脊髄液(ＣＳＦ)に見られる。ＴＴＲは、レチノール結合タンパク質(ＲＢＰ)およびサイロキシン(Ｔ４)を輸送し、血液およびＣＳＦ中のＲＢＰとの結合を介してレチノール(ビタミンＡ)の担体としても作用する。トランスサイレチン(transthyretin)は、そのサイロキシン(thyroxine)およびレチノール(retinol)の輸送(transport)から名づけられている。ＴＴＲはまたプロテアーゼとしても機能し、ａｐｏＡ－Ｉ(主要ＨＤＬアポリポタンパク質)、アミロイドβ－ペプチドおよび神経ペプチドＹを含むタンパク質を開裂できる。Liz, M.A. et al. (2010) IUBMB Life, 62(6):429-435参照。
トランスサイレチン(ＴＴＲ)(プレアルブミンとしても知られる)は血清および脳脊髄液(ＣＳＦ)に見られる。ＴＴＲは、レチノール結合タンパク質(ＲＢＰ)およびサイロキシン(Ｔ４)を輸送し、血液およびＣＳＦ中のＲＢＰとの結合を介してレチノール(ビタミンＡ)の担体としても作用する。トランスサイレチン(transthyretin)は、そのサイロキシン(thyroxine)およびレチノール(retinol)の輸送(transport)から名づけられている。ＴＴＲはまたプロテアーゼとしても機能し、ａｐｏＡ－Ｉ(主要ＨＤＬアポリポタンパク質)、アミロイドβ－ペプチドおよび神経ペプチドＹを含むタンパク質を開裂できる。Liz, M.A. et al. (2010) IUBMB Life, 62(6):429-435参照。
【0004】
ＴＴＲは、ベータシート構造に富む４個の同一１２７アミノ酸サブユニット(単量体)の四量体である。各単量体は２個の４鎖ベータシートを有し、扁長楕円体の形である。逆平行ベータシート相互作用が単量体を二量体に結合させる。各単量体からの短ループが主二量体－二量体相互作用を形成する。これらループの２個のペアが、二量体の対向する、凸面ベータシートを分け、内部チャネルを形成する。
【0005】
肝臓はＴＴＲ発現の主要な部位である。他の発現の顕著な部位は、脈絡叢、網膜(特に網膜色素上皮)および膵臓を含む。
【0006】
トランスサイレチンは、アミロイド原線維の形成における前駆体タンパク質である少なくとも２７の別個のタイプのタンパク質の一つである。Guan, J. et al. (Nov. 4, 2011) Current perspectives on cardiac amyloidosis, Am J Physiol Heart Circ Physiol, doi:10.1152/ajpheart.00815.2011参照。臓器および組織におけるアミロイド原線維の細胞外沈着はアミロイドーシスの特徴である。アミロイド原線維は、前駆体タンパク質の過剰産生または特定の変異に起因し得る、ミスフォールドタンパク質凝集体からなる。ＴＴＲのアミロイド形成能は、広範なベータシート構造と関係し得る；Ｘ線結晶学による研究は、あるアミロイド形成変異がタンパク質の四量体構造を不安定化することを示す。例えば、Saraiva M.J.M. (2002) Expert Reviews in Molecular Medicine, 4(12):1-11参照。
【0007】
アミロイドーシスは、アミロイド沈着により特徴づけられるアミロイド疾患群の一般的総称である。アミロイド疾患は、前駆体タンパク質により分類される；例えば、名称はアミロイドの「Ａ」で始まり、前駆体タンパク質の略語、例えば、アミロイド形成トランスサイレチンについてＡＴＴＲが続く。Ibid。
【0008】
多数のＴＴＲ関連疾患があり、その大部分はアミロイド疾患である。正常配列ＴＴＲは、高齢者の、老人性全身性アミロイドーシス(ＳＳＡ)(老人性心アミロイドーシス(ＳＣＡ)または心アミロイドーシス)とも称される、心アミロイドーシスと関連する。ＳＳＡはしばしば多くの他の臓器における顕微鏡的沈着物を伴う。ＴＴＲアミロイドーシスは、多様な形態で顕在化する。末梢神経系がより顕著に影響を受けたとき、疾患は家族性アミロイドポリニューロパチー(ＦＡＰ)と称される。心臓が主に関与するが、神経系が関与しないとき、疾患は家族性アミロイド心筋症(ＦＡＣ)と称される。ＴＴＲアミロイドーシスの３番目に多いタイプは、軟髄膜または髄膜脳血管アミロイドーシス、中枢神経系(ＣＮＳ)アミロイドーシスまたはアミロイドーシスVII形態としても知られる、軟髄膜アミロイドーシスである。ＴＴＲの変異はまたアミロイド性硝子体混濁、手根管症候群および、サイロキシンへの親和性が増大した変異体ＴＴＲ分子による、サイロキシンとＴＴＲの結合の増加に二次的であると考えられる非アミロイド性疾患である甲状腺機能正常型高サイロキシン血症も引き起こし得る。例えば、Moses et al. (1982) J. Clin. Invest., 86, 2025-2033参照。
【0009】
異常ＴＴＲアレルは、遺伝性または体細胞変異による獲得のいずれかであり得る。Guan, J. et al. (Nov. 4, 2011) Current perspectives on cardiac amyloidosis, Am J Physiol Heart Circ Physiol, doi:10.1152/ajpheart.00815.2011。トランスサイレチン関連ＡＴＴＲは、遺伝性全身性アミロイドーシスの最も頻繁な形態である。Lobato, L. (2003) J. Nephrol., 16:438-442。ＴＴＲ変異はＴＴＲアミロイド形成過程を加速し、ＡＴＴＲの発症の最も重要なリスク因子である。８５を超えるアミロイド形成的ＴＴＲバリアントが全身性家族性アミロイドーシスを引き起こすことが知られる。ＴＴＲ変異は、通常末梢神経系の特定の関与を伴う全身性アミロイド沈着を起こすが、一部変異は、心筋症または硝子体混濁と関連する。Ibid。
【0010】
Ｖ３０Ｍ変異は、最も一般的なＴＴＲ変異である。例えば、Lobato, L. (2003) J Nephrol, 16:438-442参照。Ｖ１２２Ｉ変異は、アフリカ系アメリカ人集団の３.９％が有し、ＦＡＣの最も一般的な原因である。Jacobson, D.R. et al. (1997) N. Engl. J. Med. 336 (7): 466-73。ＳＳＡは、８０歳を超える集団の２５％超に影響すると推定される。Westermark, P. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (7): 2843-5。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
従って、当分野でＴＴＲ関連疾患に対する有効な処置の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【0012】
発明の概要
本発明は、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングする二本鎖ＲＮＡｉ剤を使用するＴＴＲの発現を阻害するための組成物ならびにヒト対象におけるトランスサイレチン(ＴＴＲ)関連疾患を処置または予防する方法に関する。
本発明は、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングする二本鎖ＲＮＡｉ剤を使用するＴＴＲの発現を阻害するための組成物ならびにヒト対象におけるトランスサイレチン(ＴＴＲ)関連疾患を処置または予防する方法に関する。
【0013】
本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、ここで、：
各センス鎖およびアンチセンス鎖が独立して最大３０ヌクレオチド長であり；
センス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；そして
アンチセンス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含み、
ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェートであり；
Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスフェート、２’－フルオロシチジン－３’－ホスフェート、２’－フルオログアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－フルオロウリジン－３’－ホスフェートであり；
(Ｔｇｎ)はチミジン－グリコール核酸(ＧＮＡ)Ｓ－異性体であり；そして
ｓはホスホロチオエートリンカーである。
各センス鎖およびアンチセンス鎖が独立して最大３０ヌクレオチド長であり；
センス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；そして
アンチセンス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含み、
ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェートであり；
Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスフェート、２’－フルオロシチジン－３’－ホスフェート、２’－フルオログアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－フルオロウリジン－３’－ホスフェートであり；
(Ｔｇｎ)はチミジン－グリコール核酸(ＧＮＡ)Ｓ－異性体であり；そして
ｓはホスホロチオエートリンカーである。
【0014】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は少なくとも１個のリガンドにコンジュゲートする。ある実施態様において、リガンドは、二価または三価分岐リンカーを介して結合する１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。ある実施態様において、リガンドは
である。
【化1】
【0015】
ある実施態様において、リガンドはセンス鎖の３’末端に結合する。
【0016】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、次の式で示すとおり、リガンドに結合する：
〔式中、ＸはＯまたはＳである。〕。
【化2】
【0017】
ある実施態様において、センス鎖は２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は２３ヌクレオチド長である。
【0018】
本発明は、ＴＴＲ関連疾患を有するヒト対象を処置する方法における二本鎖ＲＮＡｉ剤の使用であって、約２５mg～約１０００mgの固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤を投与することを含み、ここで：
各センス鎖およびアンチセンス鎖は独立して最大３０ヌクレオチド長であり；
センス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；そして
アンチセンス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含み、
ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェートであり；
Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスフェート、２’－フルオロシチジン－３’－ホスフェート、２’－フルオログアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－フルオロウリジン－３’－ホスフェートであり；
(Ｔｇｎ)はチミジン－グリコール核酸(ＧＮＡ)Ｓ－異性体であり；そして
ｓはホスホロチオエートリンカーである、
使用を提供する。
各センス鎖およびアンチセンス鎖は独立して最大３０ヌクレオチド長であり；
センス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；そして
アンチセンス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含み、
ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェートであり；
Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスフェート、２’－フルオロシチジン－３’－ホスフェート、２’－フルオログアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－フルオロウリジン－３’－ホスフェートであり；
(Ｔｇｎ)はチミジン－グリコール核酸(ＧＮＡ)Ｓ－異性体であり；そして
ｓはホスホロチオエートリンカーである、
使用を提供する。
【0019】
本発明はまたＴＴＲ関連疾患の診断基準を満たさないヒト対象におけるＴＴＲの発現を阻害する方法における二本鎖ＲＮＡｉ剤の使用であって、約２５mg～約１０００mgの固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤を投与することを含み、ここで：
各センス鎖およびアンチセンス鎖は独立して最大３０ヌクレオチド長であり；
センス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；そして
アンチセンス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含み、
ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェートであり；
Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスフェート、２’－フルオロシチジン－３’－ホスフェート、２’－フルオログアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－フルオロウリジン－３’－ホスフェートであり；
(Ｔｇｎ)はチミジン－グリコール核酸(ＧＮＡ)Ｓ－異性体であり；そして
ｓはホスホロチオエートリンカーである、
使用も提供する。
各センス鎖およびアンチセンス鎖は独立して最大３０ヌクレオチド長であり；
センス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；そして
アンチセンス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含み、
ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェートであり；
Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスフェート、２’－フルオロシチジン－３’－ホスフェート、２’－フルオログアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－フルオロウリジン－３’－ホスフェートであり；
(Ｔｇｎ)はチミジン－グリコール核酸(ＧＮＡ)Ｓ－異性体であり；そして
ｓはホスホロチオエートリンカーである、
使用も提供する。
【0020】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は少なくとも１個のリガンドにコンジュゲートする。ある実施態様において、リガンドは、二価または三価分岐リンカーを介して結合する１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。ある実施態様において、リガンドは
である。
【化3】
【0021】
ある実施態様において、リガンドはセンス鎖の３’末端に結合する。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、次の式で示すとおり、リガンドに結合する：
〔式中、ＸはＯまたはＳである。〕。
【化4】
【0022】
ある実施態様において、センス鎖は２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は２３ヌクレオチド長である。
【0023】
ある実施態様において、本発明の使用は、神経学的障害、クオリティ・オブ・ライフ、神経損傷、心血管症状の少なくとも１つの指標の改善を含む。ある実施態様において、評価される指標は、例えば、ニューロパチー機能障害(ＮＩＳ)スコアまたは修飾ＮＩＳ(ｍＮＩＳ＋７)スコアを使用する、神経機能障害である。ある実施態様において、指標は、例えば、ＳＦ－３６(登録商標)健康調査スコア、ノーフォーククオリティ・オブ・ライフ－糖尿病性ニューロパチー(ノーフォークＱＯＬ－ＤＮ)スコア、ＮＩＳ－Ｗスコア、ラッシュ構築全体的能力障害スケール(Ｒ－ＯＤＳ)スコア、複合自律神経症状スコア(ＣＯＭＰＡＳＳ－３１)、中心性肥満度指数(ｍＢＭＩ)スコア、６分間歩行検査(６ＭＷＴ)スコアおよび１０メートル歩行検査スコアを使用して評価される、クオリティ・オブ・ライフ指標である。ある実施態様において、指標は、例えば、ヒト血液サンプルまたはそれ由来の血清もしくは血漿などの、神経フィラメント軽鎖(ＮｆＬ)、ＲＳＰＯ３、ＣＣＤＣ８０、ＥＤＡ２Ｒ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰおよびＮ－ＣＤａｓｅの群から選択される１以上のタンパク質のレベルの変化により評価される、神経損傷である。ある実施態様において、神経損傷の指標は、神経フィラメント軽鎖(ＮｆＬ)タンパク質レベルのベースラインからの変化である。ある実施態様において、心血管機能障害の指標は、健康状態が良好であることを示すスコアの増加、心エコー評価による平均左室心(ＬＶ)壁厚のベースラインからの変化、心エコー評価による長軸方向のグローバル・ストレインのベースラインからの変化およびＮ末端プロホルモンＢ型ナトリウム利尿ペプチド(ＮＴｐｒｏＢＮＰ)のベースラインからの変化を伴うカンザスシティ心筋症質問票の全体サマリー(ＫＣＣＱ－ＯＳ)を使用する、心血管入院処置である。
【0024】
ある実施態様において、ヒト対象は、ＴＴＲ関連疾患、例えば、老人性全身性アミロイドーシス(ＳＳＡ)、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー(ＦＡＰ)、家族性アミロイド心筋症(ＦＡＣ)、軟髄膜／中枢神経系(ＣＮＳ)アミロイドーシスおよび高サイロキシン血症の発症と関連するＴＴＲ遺伝子変異を有する。
【0025】
ある実施態様において、ヒト対象はトランスサイレチン介在アミロイドーシス(ＡＴＴＲアミロイドーシス)を有し、二本鎖ＲＮＡｉ剤の使用はヒト対象におけるアミロイドＴＴＲ沈着を減少させる。ある実施態様において、ＡＴＴＲアミロイドーシスは遺伝性ＡＴＴＲ(ｈ－ＡＴＴＲ)アミロイドーシスである。ある実施態様において、ＡＴＴＲアミロイドーシスは非遺伝性ＡＴＴＲ(ｗｔ ＡＴＴＲ)アミロイドーシスである。
【0026】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤はヒト対象に皮下または静脈内投与される。ある実施態様において、皮下投与は自己投与である。ある実施態様において、自己投与はプレフィルドシリンジまたは自動注入デバイスを介する。
【0027】
ある実施態様において、使用は、さらにヒト血液サンプルまたはそれ由来の血清もしくは血漿などのヒト対象由来のサンプルにおけるＴＴＲ ｍＲＮＡ発現またはＴＴＲタンパク質発現レベルの評価を含む。
【0028】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、月１回、隔月に１回、３カ月に１回、４カ月に１回、５カ月に１回または６カ月に１回ヒト対象に投与される。ある実施態様において、固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約３カ月に１回ヒト対象に投与される。ある実施態様において、固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約６カ月に１回ヒト対象に投与される。
【0029】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤はヒト対象に慢性的に投与される。
【0030】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約四半期に１回～約１年に１回ヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約四半期に１回、約６カ月に１回または約１年に１回ヒト対象に投与される。
【0031】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２５mg～約３００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２５mg～約２００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約７５mg～約２００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２５mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約５０mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約７５mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約１００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２５mg～約３００mg；約２５mg～約２００mg；約７５mg～約２００mg；約２５mg；約５０mg；約７５mg；約１００mg；約２００mg；または約３００mgを四半期に１回、すなわち、約３カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される。
【0032】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約４００mg～約６００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約４００mgまたは約６００mgを約６カ月に１回～約１年に１回の固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約４００mgまたは約６００mgを約６カ月に１回または約１年に１回の固定用量でヒト対象に投与される。
【0033】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約７００mg～約１０００mgまたは約７００mg～約９００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約７００mg、約８００mg、約９００mgまたは約１０００mgを約１年に１回の固定用量でヒト対象に投与される。
【0034】
ある実施態様において、使用は、さらにヒト対象にさらなる治療剤、例えば、ＴＴＲ四量体安定化剤または非ステロイド性抗炎症剤を投与することを含む。
【0035】
本発明はまた本発明の方法の何れかを実施するためのキットも提供する。キットは、二本鎖ＲＮＡｉ剤；および使用指示を含むラベルを含み得る。
【0036】
本発明をさらに次の詳細な記載および図面により説明する。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】１mg／kg用量の記載する二本鎖ＲＮＡｉ剤を０日目に単回投与後のＶ３０Ｍトランスジェニックマウス(ｎ＝３／群)における相対的血清ＴＴＲタンパク質レベルを示すグラフである。
【0038】
【図2】１mg／kg用量または３mg／kg用量の記載する二本鎖ＲＮＡｉ剤を０日目に単回投与後のカニクイザル(ｎ＝３／群)における相対的血清ＴＴＲタンパク質レベルを示すグラフである。示す結果は、３つの独立した試験からである。
【発明を実施するための形態】
【0039】
発明の詳細な記載
本発明は、ＴＴＲ関連疾患の診断基準を満たさないヒト対象におけるＴＴＲ発現の阻害を含む、ＴＴＲの発現を阻害する方法ならびにトランスサイレチン(ＴＴＲ)関連疾患を有するヒト対象を処置する方法であって、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングする二本鎖ＲＮＡｉ剤の使用を含み、ここで、センス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；およびアンチセンス鎖は修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含む、方法を提供する。
本発明は、ＴＴＲ関連疾患の診断基準を満たさないヒト対象におけるＴＴＲ発現の阻害を含む、ＴＴＲの発現を阻害する方法ならびにトランスサイレチン(ＴＴＲ)関連疾患を有するヒト対象を処置する方法であって、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングする二本鎖ＲＮＡｉ剤の使用を含み、ここで、センス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；およびアンチセンス鎖は修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含む、方法を提供する。
【0040】
次の詳細な記載は、ＴＴＲ遺伝子の発現を選択的に阻害するためのｉＲＮＡ剤を含む組成物をどのように製造および使用するかならびにＴＴＲ遺伝子の発現の阻害または減少により利益が得られる疾患および障害を有する対象の処置のための組成物、使用および方法を記載する。
【0041】
Ｉ. 定義
本発明がより容易に理解され得るために、特定の用語をまず定義する。さらに、パラメータの値または値の範囲が引用されているときは、記載される値および値の間の値も本発明の一部であることが意図されることは留意されるべきである。
本発明がより容易に理解され得るために、特定の用語をまず定義する。さらに、パラメータの値または値の範囲が引用されているときは、記載される値および値の間の値も本発明の一部であることが意図されることは留意されるべきである。
【0042】
単数表現は、ここで、文法的な対象が１または１を超える(すなわち、少なくとも１)ことをいうために使用される。例として、「要素」は１要素または１を超える要素、例えば、複数の要素を意味する。
【0043】
用語「含む」は、用語「含むが、限定されない」を意味するために使用され、相互交換可能に使用される。
【0044】
用語「または」は、文脈から他のことが示されない限り、用語「および／または」を意味するために使用され、相互交換可能に使用される。
【0045】
用語「約」は、当分野における許容誤差の典型的範囲内、例えば、投与間隔の許容される変動、投与量単位量許容される変動を意味するために使用される。例えば、「約」は、平均からの約２標準偏差以内と理解され得る。ある実施態様において、約は＋１０％を意味する。ある実施態様において、約は＋５％を意味する。約が一連の数値または範囲の前にあるとき、「約」は一連の数値または範囲の各々を修飾し得ると理解される。
【0046】
数値または一連の数値の前後の用語「少なくとも」、「下回らない」または「以上」は、用語「少なくとも」に隣接する数値および文脈から明らかな論理的に包含されるべき全てのその後の数値または整数を含むと理解されるべきである。例えば、核酸分子のヌクレオチド数は整数であるべきである。例えば、「２１ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドが、指定される性質を有することを意味する。少なくともが一連の数値または範囲の前にあるとき、「少なくとも」は一連の数値または範囲の各々を修飾し得ると理解される。
【0047】
ここで使用する「以下」または「未満」は、該用語に隣接する値および文脈から明らかな、０までの論理的なそれより小さい値または整数として理解される。例えば、「２以下のヌクレオチド」のオーバーハングを有する二重鎖は、２、１または０ヌクレオチドオーバーハングを有する。「以下」が一連の数値または範囲の後にあるとき、「以下」は一連の数値または範囲の各々を修飾し得ると理解される。
【0048】
ここで使用する検出方法は、存在する検体の量が方法の検出レベル未満であることの決定を含み得る。
【0049】
ここで使用する「トランスサイレチン」(「ＴＴＲ」)は、周知遺伝子およびタンパク質をいう。ＴＴＲはまたプレアルブミン、ＨｓＴ２６５１、ＰＡＬＢおよびＴＢＰＡとしても知られる。ＴＴＲはレチノール結合タンパク質(ＲＢＰ)、サイロキシン(Ｔ４)およびレチノールのトランスポーターとして機能し、プロテアーゼとしても作用する。肝臓はＴＴＲを血液に分泌し、脈絡叢はＴＴＲを脳脊髄液に分泌する。ＴＴＲは膵臓および網膜色素上皮でも発現される。ＴＴＲの最大の臨床的関連は、正常(野生型)および変異体両者のＴＴＲタンパク質が、凝集してアミロイドーシスを引き起こす細胞外沈着物となるアミロイド原線維を形成できることである。例えば、レビューのためにSaraiva M.J.M. (2002) Expert Reviews in Molecular Medicine, 4(12):1-11参照。ラットトランスサイレチンの分子クローニングおよびヌクレオチド配列ならびにｍＲＮＡ発現の分布は、Dickson, P.W. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260(13)8214-8219により検出された。ヒトＴＴＲのＸ線結晶構造はBlake, C.C. et al. (1974) J Mol Biol 88, 1-12に記載される。ヒトＴＴＲ ｍＲＮＡ転写物の配列は、National Center for Biotechnology Information (NCBI) RefSeq accession number NM_000371(例えば、配列番号１および５)に見られ得る。マウスＴＴＲ ｍＲＮＡの配列は、RefSeq accession number NM_013697.2およびラットＴＴＲ ｍＲＮＡの配列はRefSeq accession number NM_012681.1に見られ得る。ＴＴＲ ｍＲＮＡ配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、GenBank、UniProtおよびOMIMを使用して、容易に入手可能である。
【0050】
ここで使用する「ＴＴＲ関連疾患」は、ＴＴＲ遺伝子またはタンパク質と関連するあらゆる疾患を含むことを意図する。このような疾患は、例えば、ＴＴＲタンパク質の過剰生産、ＴＴＲ遺伝子変異、ＴＴＲタンパク質の異常切断、ＴＴＲ四量体の不安定、ＴＴＲと他のタンパク質または他の内因性または外因性物質の異常相互作用により引き起こされ得る。「ＴＴＲ関連疾患」は、ＴＴＲが異常細胞外凝集体またはアミロイド沈着の形成に役割を果たすあらゆるタイプのトランスサイレチン介在アミロイドーシス(ＡＴＴＲアミロイドーシス)、例えば、遺伝性ＡＴＴＲ(ｈ－ＡＴＴＲ)アミロイドーシスまたは非遺伝性ＡＴＴＲ(ＡＴＴＲ)アミロイドーシスを含む。ＴＴＲ関連疾患は、老人性全身性アミロイドーシス(ＳＳＡ)、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー(ＦＡＰ)、家族性アミロイド心筋症(ＦＡＣ)、軟髄膜／中枢神経系(ＣＮＳ)アミロイドーシス、アミロイド性硝子体混濁、手根管症候群および高サイロキシン血症を含む。ＴＴＲアミロイドーシスの症状は、感覚性ニューロパチー(例えば、錯感覚、遠位肢の感覚鈍麻)、自律神経性ニューロパチー(例えば、消化器機能不全、例えば胃潰瘍または起立性低血圧)、運動ニューロパチー、癲癇、認知症、脊髄症、多発ニューロパチー、手根管症候群、自律神経性機能不全、心筋症、硝子体混濁、腎機能不全、腎症、相当減少したｍＢＭＩ(修飾肥満度指数)、脳神経機能不全および格子状角膜変性症を含む。
【0051】
ここで使用する用語「ある配列を含む鎖」は、標準的ヌクレオチド命名法を使用して参照される配列により記載されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドをいう。
【0052】
ここで相互交換可能に使用される用語「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」は、ここで定義するＲＮＡを含み、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)経路を介するＲＮＡ転写物の標的化切断に介在する薬剤をいう。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)として知られる過程を経るｍＲＮＡの配列特異的分解を指示する。ｉＲＮＡは、細胞、例えば、哺乳動物対象などの対象内の細胞におけるＴＴＲ遺伝子発現を調節、例えば、阻害する。
【0053】
本発明の組成物、使用および方法において使用するための、ここで使用する「ｉＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡであり、ここで、「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」または「ｄｓＲＮＡ」と称する。用語「ｄｓＲＮＡ」は、標的ＲＮＡ、すなわち、ＴＴＲ遺伝子に対して「センス」および「アンチセンス」配向を有すると称される２個の逆平行かつ実質的に相補性の核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体をいう。二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ここでＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称される転写後遺伝子サイレンシング機構を介して、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの分解を開始させる。
【0054】
ここで使用する用語「修飾ヌクレオチド」は、独立して、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間結合または修飾核酸塩基を有する、ヌクレオチドをいう。故に、用語修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基の、例えば、官能基または原子の置換、付加または除去を包含する。本発明の薬剤における使用に適する修飾は、ここに開示するまたは当分野で知られる全タイプの修飾を含む。ｓｉＲＮＡタイプ分子で使用されるようなあらゆるこのような修飾は、本明細書および特許請求の範囲の目的で「ＲＮＡｉ剤」に含まれる。
【0055】
二重鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を介する所望の標的ＲＮＡの特定の分解が可能であるどんな長さでもよく、約２１～３６塩基対長、例えば、約２１～３０塩基対長、例えば、約２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２塩基対長の範囲であり得る。ある実施態様において、本発明のＲＮＡｉ剤はｄｓＲＮＡ剤であり、その各鎖は標的ｍＲＮＡの切断を指示するためにＴＴＲ ｍＲＮＡ配列と相互作用する２１～２３ヌクレオチドを含む。理論に拘束されることを意図しないが、細胞に導入される長い二本鎖ＲＮＡは、Dicerとして知られるタイプIIIエンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡに破壊される(Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485)。Dicer、リボヌクレアーゼ－III様酵素は、ｄｓＲＮＡを特徴的２塩基３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対低分子干渉ＲＮＡに処理する(Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363)。次いで、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)に取り込まれ、そこで１以上のヘリカーゼはｓｉＲＮＡ二重鎖をほどき、相補性アンチセンス鎖が標的認識をガイドすることを可能とする(Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309)。適切な標的ｍＲＮＡへの結合後、ＲＩＳＣ内の１以上のエンドヌクレアーゼが標的を開裂して、サイレンシングを誘導する(Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188)。ある実施態様において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡの切断を指示するためにＴＴＲ ｍＲＮＡ配列と相互作用する２４～３０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。
【0056】
ここで使用する用語「ヌクレオチドオーバーハング」は、二重鎖構造のｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡから突き出た少なくとも１個の不対ヌクレオチドをいう。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を超えて伸長するまたはその逆であるとき、ヌクレオチドオーバーハングがある。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１個のヌクレオチドのオーバーハングを含む；あるいは、オーバーハングは、少なくとも２個のヌクレオチド、少なくとも３個のヌクレオチド、少なくとも４個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチドまたはそれ以上含み得る。Ａヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシドアナログを含むまたはそれからなることがある。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖またはそれらの何らかの組み合わせにあり得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖の５’末端、３’末端または両端にあり得る。ｄｓＲＮＡのある実施態様において、少なくとも１個の鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。他の実施態様において、少なくとも１個の鎖は、少なくとも２ヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、８または９ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。他の実施態様において、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１個の鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。ある実施態様において、少なくとも１個の鎖は、少なくとも２ヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、８または９ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。さらに他の実施態様において、ＲＮＡｉ剤の一方の鎖の３’および５’末端両者は、少なくとも１ヌクレオチドのオーバーハングを含む。
【0057】
ある実施態様において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端または５’末端に１～９ヌクレオチド、例えば、０～３、１～３、２～４、２～５、４～９、５～９、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９ヌクレオチドのオーバーハングを有する。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端または５’末端に１～９ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９ヌクレオチドのオーバーハングを有する。他の実施態様において、オーバーハングにおけるヌクレオチドの１以上はヌクレオシドチオホスフェートで置換される。
【0058】
「平滑」または「平滑末端」は、二本鎖ＲＮＡｉ剤のその末端に不対ヌクレオチドがない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端処理」ＲＮＡｉ剤は、その全長にわたり二本鎖である、すなわち、分子の何れかの末端にヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡをいう。本発明のＲＮＡｉ剤は、一端にヌクレオチドオーバーハングを有する(すなわち、１オーバーハングおよび１平滑末端を有する薬剤)または両端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤を含む。
【0059】
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」は、標的配列、例えば、ＴＴＲ ｍＲＮＡに実質的に相補性である領域を含むｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの鎖をいう。ここで使用する用語「相補性である領域」は、ここに定義する配列、例えば標的配列、例えば、ＴＴＲヌクレオチド配列に実質的に相補性である、アンチセンス鎖の領域をいう。相補性である領域が標的配列と完全に相補性でないとき、ミスマッチが分子の内部または末端領域にあり得る。一般に、最も許容されるミスマッチは、末端領域、例えば、ｉＲＮＡの５’または３’末端の５、４、３、２または１ヌクレオチド以内である。ある実施態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖にヌクレオチドミスマッチを含む。他の実施態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖にヌクレオチドミスマッチを含む。ある実施態様において、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端から５、４、３、２または１ヌクレオチド以内である。他の実施態様において、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端ヌクレオチドである。
【0060】
ここで使用する用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」は、ここで定義するアンチセンス鎖の領域と実質的に相補性である領域を含むｉＲＮＡの鎖をいう。
【0061】
ここで使用する用語「切断領域」は、切断部位にすぐ隣接して位置する領域をいう。切断部位は、切断が生じる標的上の部位である。ある実施態様において、切断領域は、切断部位の何れかの末端および隣接して、３塩基含む。ある実施態様において、切断領域は、切断部位の何れかの末端および隣接して２塩基含む。ある実施態様において、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１により結合される部位で特異的に生じ、切断領域はヌクレオチド１１、１２および１３を含む。
【0062】
ここで使用される限りおよび特に断らない限り、用語「相補性」は、第二ヌクレオチド配列に対する第一ヌクレオチド配列を記載するために使用するとき、当業者に理解されるとおり、第一ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、ある条件下で、第二ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二重鎖構造を形成する能力をいう。このような条件は、例えば、「ストリンジェントな条件」であってよく、ここで、ストリンジェントな条件は、４００mM ＮａＣｌ、４０mM ＰＩＰＥＳ ｐＨ６.４、１mM ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間、続く洗浄を含む(例えば、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press参照)。生物の内部で遭遇し得る生理学的に関連する条件などの他の条件を適用できる。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終適用に応じて、２配列の相補性の試験に最も適する条件のセットを決定できる。
【0063】
ここに記載するｉＲＮＡ内、例えば、ｄｓＲＮＡ内の相補性配列は、第一ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと第二ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対形成を含む。このような配列は、ここで互いに関して「完全相補性」といいうる。しかしながら、第一配列がここで第二配列に関して「実質的に相補性」というとき、２配列は完全相補性であっても、インビトロまたはインビボで、最終適用、例えば、遺伝子発現の阻害に最も関連する条件下ハイブリダイズする能力を保持しながら、３０塩基対までの二重鎖のハイブリダイズにより１以上、しかし一般に５、４、３または２を超えないミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかしながら、２個のオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションにより、１以上の一本鎖オーバーハングを形成するよう設計されるとき、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチと見なしてはならない。例えば、２１ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドおよび２３ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡであって、長いほうのオリゴヌクレオチドが短いほうのオリゴヌクレオチドと完全相補性である２１ヌクレオチドの配列を含むとき、ここに記載する目的で、なお「完全相補性」と称し得る。
【0064】
ここで使用する「相補性」配列は、ハイブリダイズする能力について上記要件を満たす限り、非ワトソン・クリック塩基対または非天然および修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含んでよいまたは完全にそれから形成されてよい。このような非ワトソン・クリック塩基対は、Ｇ：Ｕ揺らぎまたはフーグスティーン塩基対形成を含むが、これらに限定されない。
【0065】
ここでの用語「相補性」、「完全相補性」および「実質的に相補性」は、使用される文脈から理解されるとおり、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖間またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖および標的配列などの２個のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド間の塩基整合に関して使用され得る。
【0066】
ここで使用する、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の「少なくとも一部と実質的に相補性」であるポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ(例えば、ＴＴＲ遺伝子をコードするｍＲＮＡ)の連続部分と実質的に相補性であるポリヌクレオチドをいう。例えば、ポリヌクレオチドは、配列がＴＴＲ遺伝子をコードするｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補性であるならば、少なくともＴＴＲ ｍＲＮＡの一部と相補性である。
【0067】
従って、ある実施態様において、ここに開示するアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＴＴＲ配列と完全相補性である。他の実施態様において、ここに開示するアンチセンスポリヌクレオチドは、配列番号８(5’-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’)と完全相補である。ある実施態様において、アンチセンスポリヌクレオチド配列は5’-UCUUGGUUACAUGAAAUCCCAUC-3’(配列番号９)であり、ここで、アンチセンス鎖の７位のＵはＴであり得る。
【0068】
ここで使用する「対照レベル」は、アッセイから得られたレべル、例えば、バイオマーカーレベル、例えば、タンパク質バイオマーカーレベルが比較される、予め決定されたレベルとして理解される。ある実施態様において、対照レベルは、健常集団、例えば、バイオマーカーレベルの変化と関連する疾患または状態を有さず、かつバイオマーカーレベルの変化と関連する疾患または状態に対する素因、例えば、遺伝的素因を有しない集団について決定された対照レベルであり得る。ある実施態様において、集団は、ある基準、例えば、年齢、性別について一致すべきである。ある実施態様において、バイオマーカーの対照レベルは、同じ対象での早い時期、例えば、症候性疾患発症前または処置開始前のレベルである。典型的に、サンプルを、臨床的に関連する間隔、例えば、バイオマーカーの変化が観察されるのに十分に離れた間隔、例えば、少なくとも３カ月間隔、少なくとも６カ月間隔または少なくとも９カ月間隔で対象から得る。２個を超えるサンプルが経時的に対象から得られるならば、先のサンプルの何れかが対照レベルとして役立ち得ることは理解される。
【0069】
ここで使用する「対照レベルと比較した変化」などは、バイオマーカーレベルの統計的または臨床的に有意な変化として理解され、例えば、対照レベルと比較した、タンパク質バイオマーカーレベルの変化は、アッセイ方法の典型的標準偏差より大きい。さらに、変化は臨床的に関連するものでなければならない。対照レベルと比較した変化はパーセント変化として決定され得る。例えば、バイオマーカーＸについて対照レベルが１００pg／mlであり、対象におけるバイオマーカーＸのレベルが１５０pg／mlであるならば、レベルは、((１５０pg／ml－１００pg／ml)／１００pg／ml)×１００％＝５０％により計算して、５０％増加する。対象におけるバイオマーカーＸのレベルが３００pg／mlであるならば、レベルは３００％増加する。対象におけるバイオマーカーＸのレベルが５０pg／mlであるならば、レベルは５０％減少する。ある実施態様において、対照レベルと比較した変化は、少なくとも５０％の増加である。ある実施態様において、対照レベルと比較した変化は、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも３００％の増加である。ある実施態様において、対照レベルと比較した変化は、少なくとも２５％の減少である。ある実施態様において、対照レベルと比較した変化は、少なくとも５０％の減少である。
【0070】
ここで使用する「対象からの生物学的サンプル」または「対象からのサンプル」は、対象から単離した１以上の体液、細胞または組織を含む。生物学的体液の例は、血液、血清、漿液、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ、尿、唾液などを含む。組織サンプルは、組織、臓器または限局性領域からのサンプルを含み得る。例えば、サンプルは、特定の臓器、臓器の一部または臓器内の体液または細胞に由来し得る。ある実施態様において、サンプルは肝臓組織または肝臓に由来し得る。ある実施態様において、「対象からの生物学的サンプル」は、対象からの血液または血液由来血清または血漿をいい得る。ある実施態様において、体液は実質的に無細胞、例えば、無細胞である。
【0071】
ここで使用する「臨床的に関連する差異」は、評価について少なくとも典型的観察者間変動より大きな差異として理解され、ここで、観察者は、ほぼ同じ時期、例えば、１週間以内、例えば、連日、同じ個体で同じ評価を実施する訓練を受けた医療従事者、介護者または患者であり得る。ある患者観察は主観的であり、短期間内に異なる観察者が実施したとき、ほぼ同一であるべきである、例えば、体重、心拍。ｍＮＩＳ＋７(例えば、触圧に対する応答、振動、関節位置および動き)およびノーフォーク－クオリティ・オブ・ライフ(例えば、疼痛レベル、手足の温かさまたは冷たさ、立位時安定)のいくつかの態様などの他の定性的測定値は、日によっておよび観察者によって異なり得る。それ故に、複合スコアを使用して、観察を総計し、臨床的に関連する変化の何らの兆候なく観察者間での大きな変動が予測される。バイオマーカーレベルのアッセイは、サンプル内および間で変動レベルが知られている。臨床的に関連する差異の決定は当業者、例えば、ＴＴＲ関連疾患を有する患者の処置経験がある医療従事者、臨床検査専門家の能力の範囲内である。
【0072】
ここで使用する「慢性的に投与」は、無限の間隔、例えば、対象の生涯にわたって、肝移植までの投与として理解される。
【0073】
ここで使用する「ＴＴＲを安定化する」または「ＴＴＲ四量体を安定化する治療剤」は、ＴＴＲ四量体のサブユニットの、例えば、単量体への解離を減少または防止する薬剤である。ある実施態様において、薬剤は、例えば、ＴＴＲアミロイドプラークを形成するＴＴＲ単量体またはＴＴＲ単量体のタンパク分解性フラグメントのレベルの減少により、ＴＴＲアミロイドプラークの形成を減少させる。このような薬剤は、タファミジス、ジフルニサルおよびＡＧ１０を含むが、これらに限定されない。
【0074】
ここで使用する用語「治療剤を投与」は、治療剤の対象への提供として理解される。ある実施態様において、治療剤は、例えば、治療剤のラベルに提供される、薬剤の適切な投与量および投与経路で提供される。
【0075】
II. ＴＴＲ関連疾患を処置する方法
本発明は、二本鎖ＲＮＡｉ剤およびヒト対象におけるトランスサイレチン介在アミロイドーシス(ＡＴＴＲアミロイドーシス)、例えば、遺伝性ＡＴＴＲ(ｈ－ＡＴＴＲ)アミロイドーシスまたは非遺伝性ＡＴＴＲ(ｗｔ ＡＴＴＲ)アミロイドーシスなどのＴＴＲ関連疾患を処置する；またはＴＴＲ関連疾患の診断基準をまだ満たさないが、ＴＴＲ関連疾患を発症するリスクのある対象、例えば、ＴＴＲアミロイドーシスと関連するＴＴＲ変異を有する対象、ＴＴＲアミロイドーシスの診断基準をまだ満たさない、ＴＴＲアミロイドーシスのある指標を有する対象、ＴＴＲアミロイドーシスと関連するバイオマーカーレベルの改変がある対象におけるＴＴＲの発現を阻害する方法ためのその使用を提供する。方法は、対象に治療有効量の本発明のＲＮＡｉ剤を投与することを含む。
本発明は、二本鎖ＲＮＡｉ剤およびヒト対象におけるトランスサイレチン介在アミロイドーシス(ＡＴＴＲアミロイドーシス)、例えば、遺伝性ＡＴＴＲ(ｈ－ＡＴＴＲ)アミロイドーシスまたは非遺伝性ＡＴＴＲ(ｗｔ ＡＴＴＲ)アミロイドーシスなどのＴＴＲ関連疾患を処置する；またはＴＴＲ関連疾患の診断基準をまだ満たさないが、ＴＴＲ関連疾患を発症するリスクのある対象、例えば、ＴＴＲアミロイドーシスと関連するＴＴＲ変異を有する対象、ＴＴＲアミロイドーシスの診断基準をまだ満たさない、ＴＴＲアミロイドーシスのある指標を有する対象、ＴＴＲアミロイドーシスと関連するバイオマーカーレベルの改変がある対象におけるＴＴＲの発現を阻害する方法ためのその使用を提供する。方法は、対象に治療有効量の本発明のＲＮＡｉ剤を投与することを含む。
【0076】
ある態様において、本発明は、ＴＴＲ関連疾患を有するまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクのあるヒト対象を処置する方法を提供する。方法は、ヒト対象に約２５mg～約１０００mgの固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤を投与することを含み、
ここで、センス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；およびアンチセンス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含み、
ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェートであり；
Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスフェート、２’－フルオロシチジン－３’－ホスフェート、２’－フルオログアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－フルオロウリジン－３’－ホスフェートであり；
(Ｔｇｎ)はチミジン－グリコール核酸(ＧＮＡ)Ｓ－異性体であり；そして
ｓはホスホロチオエートリンカーである。
ここで、センス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；およびアンチセンス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含み、
ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェートであり；
Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスフェート、２’－フルオロシチジン－３’－ホスフェート、２’－フルオログアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－フルオロウリジン－３’－ホスフェートであり；
(Ｔｇｎ)はチミジン－グリコール核酸(ＧＮＡ)Ｓ－異性体であり；そして
ｓはホスホロチオエートリンカーである。
【0077】
他の態様において、本発明は、ＴＴＲ関連疾患を有するまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクのあるヒト対象における、神経学的障害またはクオリティ・オブ・ライフの少なくとも１個の指標を改善する方法を提供する。方法は、ヒト対象に約２５mg～約１０００mgの固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤を投与することを含み、ここで、センス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；およびアンチセンス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含む。
【0078】
他の態様において、本発明は、ＴＴＲ関連疾患を有するまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクのあるヒト対象におけるニューロパチー機能障害スコア(ＮＩＳ)または修飾ＮＩＳ(ｍＮＩＳ＋７)を低減、緩徐化または停止する方法を提供する。方法は、ヒト対象に約２５mg～約１０００mgの固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤を投与することを含み、ここで、センス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；およびアンチセンス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含む。
【0079】
他の態様において、本発明は、ＴＴＲ関連疾患を有するまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクのあるヒト対象における、６分間歩行検査(６ＭＷＴ)を増加する方法を提供する。方法は、ヒト対象に約２５mg～約１０００mgの固定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤を投与することを含み、ここで、センス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3'(配列番号６)を含み；およびアンチセンス鎖が修飾ヌクレオチド配列5'-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3'(配列番号７)を含む。
【0080】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約四半期に１回～約１年に１回ヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約四半期に１回、約６カ月に１回または約１年に１回ヒト対象に投与される。
【0081】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２５mg～約３００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２５mg～約２００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約７５mg～約２００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２５mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約５０mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約７５mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約１００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２５mg～約３００mg；約２５mg～約２００mg；約５０mg～約３００mg；約２５mg；約５０mg；約１００mg；約２００mg；または約３００mgを四半期に１回、すなわち、約３カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される。
【0082】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約４００mg～約６００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約４００mgまたは約６００mgを約６カ月に１回～約１年に１回の固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約４００mgまたは約６００mgを約６カ月に１回または約１年に１回の固定用量でヒト対象に投与される。
【0083】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約７００mg～約１０００mgまたは約７００mg～約９００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約７００mg、約８００mg、約９００mgまたは約１０００mgを約１年に１回の固定用量でヒト対象に投与される。
【0084】
ある実施態様において、対象は、ここに記載する、ＴＴＲ遺伝子発現の減少により利益が得られる疾患、障害または状態について処置または評価されているヒト；ＴＴＲ遺伝子発現の減少により利益が得られる疾患、障害または状態のリスクのあるヒト、例えば、ＴＴＲ関連疾患の診断基準を満たさないが、ＴＴＲ関連疾患の少なくとも１個の徴候または症状を示すまたはＴＴＲ関連疾患を発症する少なくとも１個のリスク因子を有するヒト；ＴＴＲ遺伝子発現の減少により利益が得られる疾患、障害または状態を有するヒト；またはＴＴＲ遺伝子発現の減少により利益が得られる疾患、障害または状態について処置されているヒトである。
【0085】
ある実施態様において、ヒト対象はＴＴＲ関連疾患を有する。他の実施態様において、対象は、ＴＴＲ関連疾患を発症するリスクのある対象、例えば、ＴＴＲ関連疾患の発症と関連するＴＴＲ遺伝子変異を有する対象、ＴＴＲ関連疾患の家族歴のある対象またはＴＴＲ関連疾患の診断基準を満たさずにＴＴＲ関連疾患の発症を示唆する徴候または症状を有する対象である。
【0086】
ここで使用する「ＴＴＲ関連疾患」は、原線維前駆体がバリアントまたは野生型ＴＴＲタンパク質からなる、アミロイド沈着の形成により引き起こされるまたは関連するあらゆる疾患を含む。変異体および野生型ＴＴＲは、種々の形態のアミロイド沈着(アミロイドーシス)を生ずる。アミロイドーシスは、臓器機能を障害させる細胞外沈着をもたらす、ミスフォールドタンパク質の形成および凝集を含む。ＴＴＲ凝集と関連する臨床症候群は、例えば、老人性全身性アミロイドーシス(ＳＳＡ)；全身性家族性アミロイドーシス；家族性アミロイドポリニューロパチー(ＦＡＰ)；家族性アミロイド心筋症(ＦＡＣ)；および軟髄膜または髄膜脳血管アミロイドーシス、中枢神経系(ＣＮＳ)アミロイドーシスまたはアミロイドーシスVII型としても知られる軟髄膜アミロイドーシスを含む。
【0087】
ある実施態様において、本発明のＲＮＡｉ剤は、家族性アミロイド心筋症(ＦＡＣ)を有する対象に投与される。他の実施態様において、本発明のＲＮＡｉ剤は、混合表現型のＦＡＣを有する対象、すなわち、心臓障害および神経学的障害両者を有する対象に投与される。さらに他の実施態様において、本発明のＲＮＡｉ剤は、混合表現型のＦＡＰ、すなわち、神経学機能障害および心機能障害両者を有する対象に投与される。ある実施態様において、本発明のＲＮＡｉ剤は、同所性肝移植(ＯＬＴ)で処置されているＦＡＰを有する対象に投与される。
【0088】
他の実施態様において、本発明のＲＮＡｉ剤は、老人性全身性アミロイドーシス(ＳＳＡ)を有する対象に投与される。本発明の方法の他の実施態様において、本発明のＲＮＡｉ剤は、家族性アミロイド心筋症(ＦＡＣ)および老人性全身性アミロイドーシス(ＳＳＡ)を有する対象に投与される。正常配列ＴＴＲは、高齢者の、老人性全身性アミロイドーシス(ＳＳＡ)(老人性心アミロイドーシス(ＳＣＡ)または心アミロイドーシス)とも称される、心アミロイドーシスと関連する。ＳＳＡはしばしば多くの他の臓器における顕微鏡的沈着を伴う。ＴＴＲ変異はＴＴＲアミロイド形成過程を加速し、ＴＴＲアミロイドーシス(ＡＴＴＲ(アミロイドーシス－トランスサイレチンタイプ)とも称される)の発症の最も重要なリスク因子である。８５を超えるアミロイド形成的ＴＴＲバリアントが全身性家族性アミロイドーシスを引き起こすことが知られる。
【0089】
本発明の方法のある実施態様において、本発明のＲＮＡｉ剤は、トランスサイレチン(ＴＴＲ)関連家族性アミロイドポリニューロパチー(ＦＡＰ)を有する対象に投与される。このような対象は、硝子体混濁および緑内障などの眼徴候を有し得る。網膜色素上皮(ＲＰＥ)により合成されるアミロイド形成的トランスサイレチン(ＡＴＴＲ)が、眼アミロイドーシスの進行に重要な役割を演ずることは当業者に知られる。先の試験は、ＲＰＥ細胞を減少させた汎網膜光凝固が、硝子体におけるアミロイド沈着の進行を予防することを示しており、ＲＰＥにおけるＡＴＴＲ発現の有効な抑制が眼アミロイドーシスの新規治療となり得ることを示す(例えば、Kawaji, T., et al., Ophthalmology. (2010) 117: 552-555参照)。他のＴＴＲ関連疾患は、「異常トランスサイレチン高サイロキシン血症」または「異常プレアルブミン高サイロキシン血症」としても知られる、高サイロキシン血症である。このタイプの高サイロキシン血症は、サイロキシンへの親和性が増大した変異体ＴＴＲ分子による、サイロキシンとＴＴＲの結合の増加に二次的であり得る。例えば、Moses et al. (1982) J. Clin. Invest., 86, 2025-2033参照。
【0090】
本発明のＲＮＡｉ剤は、対象に、皮下、静脈内および筋肉内注射およびそれらの何らかの組み合わせを含むが、これらに限定されない当分野で知られるあらゆる投与方法を使用して投与され得る。
【0091】
ある実施態様において、薬剤は対象に皮下投与される。
【0092】
ある実施態様において、対象は、皮下注射、例えば、腹部、大腿または上腕注射により単回用量のＲＮＡｉ剤を投与される。他の実施態様において、対象は、皮下注射により、分割用量のＲＮＡｉ剤を投与される。ある実施態様において、分割用量のＲＮＡｉ剤は、対象の２か所の異なる解剖学的部位の皮下注射により対象に投与される。例えば、対象は、２５mg～１０００mgの皮下用量を皮下注射され得る。本発明のある実施態様において、皮下投与は、例えば、プレフィルドシリンジまたは自動注入器シリンジによる自己投与である。ある実施態様において、皮下投与用のＲＮＡｉ剤の用量は、１ml以下の体積の、例えば、薬学的に許容される担体に含まれる。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は非発熱原性製剤である。
【0093】
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、対象に対象内の細胞におけるＴＴＲ発現を阻害する有効量で投与される。対象内の細胞におけるＴＴＲ発現を阻害する有効量は、ＴＴＲ ｍＲＮＡ、ＴＴＲタンパク質またはアミロイド沈着などの関連可変値の阻害の評価を含む方法を含む、下記方法を使用して評価され得る。
【0094】
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は治療有効量で対象に投与される。
【0095】
ここで使用する「治療有効量」は、ＴＴＲ関連疾患の処置のために患者に投与したとき、疾患を処置するのに(例えば、適切な対照と比較して既存の疾患の進行の低減、維持または緩徐化；または適切な対照と比較して疾患の１以上の症状の低減、維持または緩徐化により)十分であるＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、薬剤の投与方法、疾患およびその重症度および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、ＴＴＲ発現により介在される病理学的進行の段階、あるならば、先のまたは同時の処置のタイプおよび処置する患者の他の個々の特徴に依存して、変わり得る。ＴＴＲアミロイドーシス、多発神経障害および心筋症の診断基準は、さらに下に記載する。
【0096】
ここで使用する「治療有効量」は、ＴＴＲ関連疾患の診断基準をまだ満たさない対象、例えば、ｈＴＴＲアミロイドーシス多発ニューロパチーとまだ診断されていない対象；ステージ１ ＦＡＰの診断基準を満たさないが、該疾患の素因があり得る対象、例えば、ＴＴＲアミロイドーシスと関連するＴＴＲ変異を有する対象、起立性低血圧、心不全、心臓不整脈、左室心壁厚、心室中隔壁厚、心臓後壁拡張、下痢、便秘、勃起不全、緑内障、硝子体内沈着、スカラップ状瞳孔；手根管症候群、腰部脊髄狭窄および二頭筋腱断裂の１以上を有する対象；対照サンプルと比較して神経フィラメント軽鎖(ＮｆＬ)レベルが上昇した、例えば、血清中少なくとも３７pg／mlのＮｆｌレベルの対象に投与されたとき、疾患または疾患の１以上の症状を予防または軽減するのに十分である、ＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。軽減され得る症状は、感覚性ニューロパチー(例えば、錯感覚、遠位肢の感覚鈍麻)、自律神経性ニューロパチー(例えば、消化器機能不全、例えば胃潰瘍または起立性低血圧)、運動ニューロパチー、癲癇、認知症、脊髄症、多発ニューロパチー、手根管症候群、自律神経性機能不全、心筋症、硝子体混濁、腎機能不全、腎症、相当減少したｍＢＭＩ(修飾肥満度指数)、脳神経機能不全、格子状角膜変性症、心エコー評価により左心室(ＬＶ)壁肥厚、心エコー評価により長軸方向のグローバル・ストレイン増加、Ｎ末端プロホルモンＢ型ナトリウム利尿ペプチド(ＮＴｐｒｏＢＮＰ)増加および心臓事象による入院を含む。疾患の低減は、疾患の経過の緩徐化または後に発症する疾患の重症度の低減を含む。用量は、ＲＮＡｉ剤、薬剤の投与方法、疾患のリスクの程度および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、あるならば、先のまたは同時の処置のタイプおよび処置する患者の他の個々の特徴に依存して変わり得る。
【0097】
「治療有効量」はまた何らかの処置で許容可能な合理的な利益／リスク比で、ある所望の局所または全身性効果を生ずるＲＮＡｉ剤の量も含む。本発明の方法で用いるＲＮＡｉ剤は、このような処置で許容される合理的利益／リスク比を生ずるのに十分な量で投与される。
【0098】
ここで使用する用語「治療有効量」はまたＴＴＲ発現により介在される病理過程または病理過程の症状の処置、予防または管理に利益をもたらす量も含む。ＴＴＲアミロイドーシスの症状は、感覚性ニューロパチー(例えば錯感覚、遠位肢の感覚鈍麻)、自律神経性ニューロパチー(例えば、消化器機能不全、例えば胃潰瘍または起立性低血圧)、運動ニューロパチー、癲癇、認知症、脊髄症、多発ニューロパチー、手根管症候群、自律神経性機能不全、心筋症、硝子体混濁、腎機能不全、腎症、相当減少したｍＢＭＩ(修飾肥満度指数)、脳神経機能不全、格子状角膜変性症、心エコー評価により左心室(ＬＶ)壁肥厚、心エコー評価により長軸方向のグローバル・ストレイン増加、Ｎ末端プロホルモンＢ型ナトリウム利尿ペプチド(ＮＴｐｒｏＢＮＰ)増加および心臓事象による入院を含む。
【0099】
ある実施態様において、例えば、対象がＦＡＰ、混合表現型のＦＡＰ、混合表現型のＦＡＣまたはＦＡＰを有し、かつＯＬＴを有するとき、本発明のｄｓＲＮＡ剤での対象の処置は、ニューロパチーの進行を緩徐化する。他の実施態様において、例えば、対象がＦＡＰ、混合表現型のＦＡＰ、混合表現型のＦＡＣ、ＳＳＡまたはＦＡＰを有し、かつＯＬＴを有するとき、本発明のｄｓＲＮＡ剤での対象の処置は、ニューロパチーおよび心筋症の進行を緩徐化する。他の実施態様において、例えば、対象が心臓合併症を有するとき、本発明の方法は心臓構造および機能を改善する、例えば、方法は平均左室心壁厚および長軸方向ストレインを減少させかつ心臓ストレスバイオマーカー、Ｎ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド(ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ)の発現レベルを減少させる。
【0100】
治療または予防有効量の本発明のＲＮＡｉ剤の投与は、ＴＴＲ関連疾患を有するまたは発症するリスクにある対象の神経機能障害またはクオリティ・オブ・ライフの少なくとも１個の指標を改善する方法にも有用である。
【0101】
例えば、ある実施態様において、本発明の方法は、対象における神経機能障害の少なくとも指標を改善する。対象における「神経機能障害の少なくとも１個の指標の改善」は、本発明の方法が神経機能障害をするまたは神経機能障害と関連する何らかの症状を改善する能力をいう。神経機能障害のあらゆる適当な尺度を使用して、対象の神経機能障害が低減、緩徐化または停止されたかまたは神経機能障害と関連する症状が改善されたかを決定できる。
【0102】
一つの適当な尺度は、ニューロパチー機能障害スコア(ＮＩＳ)である。ＮＩＳは、特に末梢ニューロパチーに関連して、脱力、感覚および反射を測定するスコアリング系である。ＮＩＳスコアは、筋脱力についての標準群(１は２５％弱化、２は５０％弱化、３は７５％弱化、３.２５は重力に逆らう移動、３.５は重力を失くした状態での移動、３.７５は移動なしでの筋肉フリッカーおよび４は麻痺)、筋伸展反射の標準群(０は正常、１は減少、２は無し)および触圧、振動、関節位置および動きおよび針刺し(全て手の人さし指および足の親指で判定：０は正常、１は減少、２はなし)を評価する。評価は、年齢、性別および体力について補正する
【0103】
ある実施態様において、本発明の方法は、投与開始から１８カ月目にＮＩＳを少なくとも５点減少させる。他の実施態様において、本発明の方法は、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から１８カ月目にＮＩＳの安定化をもたらす。他の実施態様において、方法は、疾患の自然経過を示す適切な対照群、例えばAdams et al., N Engl J Med 2018;379:11-21に提供される、例えば、プラセボ対照群と比較して、ＮＩＳスコアの上昇を緩徐化させる。疾患進行速度は、対象の処置開始時の疾患重症度、処置期間、先の処置およびもしあれば、存在する特定のＴＴＲ変異を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に依存する。
【0104】
ヒト対象におけるＮＩＳを決定する方法は当業者に周知であり、例えば、Dyck, PJ et al., (1997) Neurology 1997. 49(1): pgs. 229-239); Dyck PJ. (1988) Muscle Nerve. Jan; l l(l):21-32に見られ得る。
【0105】
神経機能障害の他の適当な測定値は、補正ニューロパチー機能障害スコア(ｍＮＩＳ＋７)である。当業者に知られるとおり、ｍＮＩＳ＋７は、小および大神経線維機能の電気生理的尺度(ＮＣＳおよびＱＳＴ)および自律神経性機能の測定(体位性血圧)と組み合わせた、神経性機能障害(ＮＩＳ)の臨床検査ベースの評価をいう。ｍＮＩＳ＋７スコアは、ＮＩＳ＋７スコア(ＮＩＳ＋７試験を表す)の改訂版である。ＮＩＳ＋７は、筋脱力および筋伸展反射を分析する。７個の検査中５個が神経状態の性状を含む。これらの性状は、腓骨神経複合活動電位振幅、運動神経伝導速度および運動神経遠位潜時(ＭＮＤＬ)、脛骨ＭＮＤＬおよび腓腹感覚神経活動電位振幅である。これらの値を、年齢、性別、身長および体重の変数について補正する。７個の検査中残り２個は、振動検出閾値および深呼吸時の心拍減少である。
【0106】
ｍＮＩＳ＋７スコアは、新規自律神経性評価であり、尺骨、腓骨および脛骨神経の複合筋肉活動電位ならびに尺骨および腓腹神経の感覚神経活動電位を使用する、Smart Somatotopic Quantitative Sensation Testingの使用を考慮する(Suanprasert, N. et al., (2014) J. Neurol. Sci., 344(1-2):pgs. 121-128)。
【0107】
ある実施態様において、本発明の方法は、投与開始から１８カ月目にｍＮＩＳ＋７を少なくとも５点減少させる。他の実施態様において、本発明の方法は、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から１８カ月目にｍＮＩＳ＋７の安定化をもたらす。他の実施態様において、方法は、疾患の自然経過を示す適切な対照群、例えばAdams et al., N Engl J Med 2018;379:11-21に提供される、例えば、プラセボ対照群と比較して、ｍＮＩＳ＋７スコアの増加を緩徐化させる。疾患進行速度は、対象の処置開始時の疾患重症度、処置期間、先の処置およびもしあれば、存在する特定のＴＴＲ変異を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に依存することは理解される。
【0108】
他の実施態様において、本発明の方法は、対象におけるクオリティ・オブ・ライフの少なくとも１個の指標を改善する。対象における「クオリティ・オブ・ライフの少なくとも１個の指標の改善」は、本発明の方法がクオリティ・オブ・ライフ悪化を緩徐化または停止するまたはクオリティ・オブ・ライフを改善する能力をいう。クオリティ・オブ・ライフのあらゆる適当な尺度を使用して、対象のクオリティ・オブ・ライフ悪化が緩徐化または停止しているかまたはクオリティ・オブ・ライフが改善しているか否かを決定できる。
【0109】
例えば、ＳＦ－３６(登録商標)健康調査は、身体機能、身体的健康上の問題による役割制限、体痛、一般的健康状態、活力(エネルギーおよび疲労)、社会的機能、感情面の問題による役割制限および精神的健康(精神的苦痛および精神的充足)の８つの健康パラメータを測定する、自己申告型、多項目スケールである。各スケールを、各質問の重さを等しいと仮定して、０～１００スケールに直接変換する。スコアが低いほど、能力障害が大きい。スコアが高いほど、能力障害が低い、すなわち、０のスコアは最高の能力障害に等しく、１００のスコアは能力障害がないことに等しい。調査は、身体的サマリースコアおよび精神的サマリースコアも提供する。
【0110】
ある実施態様において、本発明の方法は、対象における、ＳＦ－３６身体的健康関連パラメータ(身体的健康、役割－身体、体痛または一般的健康状態)の少なくとも１個またはＳＦ－３６精神的健康関連パラメータ(活力、社会的機能、役割－感情または精神的健康)の少なくとも１個の、ベースラインに対する改善を提供する。このような改善は、投薬開始から９カ月目の、１以上のパラメータの何れかのスケールの、例えば少なくとも２または少なくとも３点の増加の形をとり得る。
【0111】
他の実施態様において、本発明の方法は、投薬開始から９カ月目のＳＦ－３６パラメータスコアの１以上のパラメータの何れかの減少を停止する、例えば、方法は、例えば、ＳＦ－３６評価を実施する個体の観察の変動内の、ＳＦ－３６の臨床的に有意な変化をもたらさない。さらに他の実施態様において、本発明の方法は、投薬開始から９カ月目、ＳＦ－３６スコアが減少する速度、例えば、疾患の自然経過を示す適切な対照群、例えばAdams et al., N Engl J Med 2018;379:11-21に提供される、例えば、プラセボ対照群のＳＦ－３６スコアの減少速度と比較した、本発明のＲＮＡｉ剤で処置される対象のＳＦ－３６スコアの減少速度を減速させる。疾患進行速度は、対象の処置開始時の疾患重症度、処置期間、先の処置およびもしあれば、存在する特定のＴＴＲ変異を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に依存することは理解される。
【0112】
クオリティ・オブ・ライフの他の適当な測定値は、ノーフォーク・クオリティ・オブ・ライフ－糖尿病性ニューロパチー(ノーフォークＱＯＬ－ＤＮ)質問表である。ノーフォークＱＯＬ－ＤＮは、既存の装置で捕捉されない、大線維、小線維および自律神経性ニューロパチーと関連するＤＮの全スペクトルを捕捉するよう設計された検証済包括的質問表である。
【0113】
ある実施態様において、本発明の方法は、対象のノーフォークＱＯＬ－ＤＮスコアをベースラインから改善させる、例えば、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から９カ月目の、約－２.５、－３.０、－３.５、－４.０、－４.５または－５.０の変化である。他の実施態様において、方法は、ノーフォークＱＯＬ－ＤＮスコアの増加を停止させる、例えば、方法は、例えば、ＱＯＬ－ＤＮ評価を実施する個体の観察の変動内の、ノーフォークＱＯＬ－ＤＮスコアの臨床的に有意な変化をもたらさない。さらに他の実施態様において、本発明の方法は、例えば、疾患の自然経過を示す適切な対照群、例えばAdams et al., N Engl J Med 2018;379:11-21に提供される、例えば、プラセボ対照群の増加速度と比較した、本発明のＲＮＡｉ剤で処置される対象のＱＯＬ－ＤＮスコアの増加速度を減速させる。疾患進行速度は、対象の処置開始時の疾患重症度、処置期間、先の処置およびもしあれば、存在する特定のＴＴＲ変異を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に依存することは理解される。
【0114】
クオリティ・オブ・ライフの他の適当な測定値は、例えば、ＮＩＳ－Ｗスコアにより測定される、運動強度である。ＮＩＳ－Ｗスコアは、頭部、体躯および肢筋肉の脱力を合計する複合スコアである。ＮＩＳ(Ｗ)(脱力を測定するスケールの部分を参照)を使用して、筋力を、正常(０)または完全麻痺(４)として、中間グレード；臨床的強度検査により筋肉が２５％弱化と判定される１、５０％弱化である２、７５％弱化である３、重力に逆らう移動である３.２５、重力を失くした状態での移動である３.５０および筋肉フリッカーである３.７５を用いて評価される。
【0115】
ある実施態様において、本発明の方法は、対象にＮＩＳ－Ｗスコアのベースラインに対する改善を提供する。このような改善は、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から１８カ月目の対象のＮＩＳ－Ｗスコアの少なくとも５、６、７、８、９または１０点の減少の形をとり得る。他の実施態様において、方法はＮＩＳ－Ｗスコアの減少を停止する、例えば、方法は、疾患の自然経過を示す適切な対照群、例えばAdams et al., N Engl J Med 2018;379:11-21に提供される、例えば、プラセボ対照群のＮＩＳ－Ｗスコアの増加と比較して、ＮＩＳ－Ｗスコアの臨床的に有意な増加をもたらさないまたは緩徐化をもたらす。疾患進行速度は、対象の処置開始時の疾患重症度、処置期間、先の処置およびもしあれば、存在する特定のＴＴＲ変異を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に依存することは理解される。
【0116】
クオリティ・オブ・ライフのさらに他の適当な指標はラッシュ構築全体的能力障害スケール(Ｒ－ＯＤＳ)であり、これは、患者における活動および社会的関与制限を捕捉するよう設計された患者質問表である。ある実施態様において、本発明の方法は、対象においてＲ－ＯＤＳスコアのベースラインに対する改善を提供する。このような改善は、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から１８カ月目の、対象のＲ－ＯＤＳスコアの少なくとも２、例えば少なくとも２、３、４または５点の増加の形をとり得る。他の実施態様において、方法は、Ｒ－ＯＤＳスコアの減少を停止させる、例えば、方法は、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から１８カ月目、Ｒ－ＯＤＳスコアの臨床的に有意な減少をもたらさない。さらに他の実施態様において、本発明の方法は、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から１８カ月目、Ｒ－ＯＤＳスコアが減少する速度、例えば、疾患の自然経過を示す適切な対照群、例えばAdams et al., N Engl J Med 2018;379:11-21に提供される、例えば、プラセボ対照群のＲ－ＯＤＳスコア減少速度と比較して、本発明のＲＮＡｉ剤で処置される対象におけるＲ－ＯＤＳスコアの減少速度の減少を緩徐化させる。疾患進行速度は、対象の処置開始時の疾患重症度、処置期間、先の処置およびもしあれば、存在する特定のＴＴＲ変異を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に依存することは理解される。
【0117】
０～１００の症状スコアを提供する、自律神経障害の症状を評価する患者質問表である複合自律神経症状スコア(ＣＯＭＰＡＳＳ－３１)は、クオリティ・オブ・ライフの他の適当な指標である。ある実施態様において、本発明の方法は、対象に、ＣＯＭＰＡＳＳ－３１スコアのベースラインに対する改善を提供する。このような改善は、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から１８カ月目、対象のＣＯＭＰＡＳＳ－３１スコアの少なくとも５、例えば少なくとも５、６、７、８、９または１０点の増加の形をとり得る。他の実施態様において、方法は、ＣＯＭＰＡＳＳ－３１スコアの減少を停止させる、例えば、方法は、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から１８カ月目、ＣＯＭＰＡＳＳ－３１スコアの臨床的に関連する変化をもたらさない。さらに他の実施態様において、本発明の方法は、ＣＯＭＰＡＳＳ－３１スコアが減少する速度、例えば、疾患の自然経過を示す適切な対照群、例えば、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から１８カ月目、例えばAdams et al., N Engl J Med 2018;379:11-21に提供されるプラセボ対照群のＣＯＭＰＡＳＳ－３１スコアの減少速度と比較して、本発明のＲＮＡｉ剤で処置される対象のＣＯＭＰＡＳＳ－３１スコアの減少を緩徐化する。疾患進行速度は、対象の処置開始時の疾患重症度、処置期間、先の処置およびもしあれば、存在する特定のＴＴＲ変異を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に依存することは理解される。
【0118】
他のクオリティ・オブ・ライフ指標は、栄養状態(例えば、中心性肥満度指数(ｍＢＭＩ)の変化により評価)を含み得る。ある実施態様において、本発明の方法は、対象にｍＢＭＩのベースラインに対する改善を提供する。このような改善は、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から１８カ月目の、ｍＢＭＩスコアの少なくとも２、３、４、５またはそれ以上のかたちをとり得る。他の実施態様において、方法は、ｍＢＭＩ指数スコアの減少を停止させる、例えば、方法は、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から１８カ月目、ｍＢＭＩスコアの臨床的に有意な変化をもたらさない。さらに他の実施態様において、本発明の方法は、ｍＢＭＩスコアの減少速度、例えば、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から１８カ月目、疾患の自然経過を示す適切な対照群、例えばAdams et al., N Engl J Med 2018;379:11-21に提供される、例えば、プラセボ対照群のｍＢＭＩスコアの減少速度と比較して、本発明のＲＮＡｉ剤で処置される対象におけるｍＢＭＩスコアの減少速度を緩徐化する。疾患進行速度は、対象の処置開始時の疾患重症度、処置期間、先の処置およびもしあれば、存在する特定のＴＴＲ変異を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に依存することは理解される。
【0119】
他のクオリティ・オブ・ライフ指標は、運動許容力の評価である。運動許容力の適当な尺度の一つは、対象が６分間でどの程度歩行できるか、すなわち、６分間歩行距離(６ＭＷＤ)を測定する６分間歩行検査(６ＭＷＴ)である。ある実施態様において、本発明の方法は、対象に、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から１８カ月目、６ＭＷＤの、ベースラインに対する少なくとも１０メートル、例えば、少なくとも１０メートル、１５メートル、２０メートルまたは約３０メートルの改善を提供する。
【0120】
他の適当な尺度は、歩行速度を測定する１０メートル歩行検査である。ある実施態様において、本発明の方法は、対象に、ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始から１８カ月目、１０メートル歩行検査で、ベースラインから少なくとも０.０２５メートル／秒、例えば、少なくとも０.０２５メートル、０.０３メートル、０.０４メートル、０.０５メートル、０.０６メートル、０.０７メートル、０.０８メートル、０.０９メートル、１.０メートル、１.５メートル、２.０メートル、２.５メートル、３.０メートル、３.５メートル、４.０メートル、４.５メートルまたは約５.０メートル／秒の改善を提供する。
【0121】
ある実施態様において、血漿バイオマーカーレベルの変化は、ＡＴＴＲアミロイドーシスにおける、進行中の神経損傷または多発ニューロパチーの進行の減少の指標である。例えば、処置開始時の神経フィラメント軽鎖(ＮｆＬ)レベルと比較した、９カ月目のＮｆＬレベルの減少は、ＡＴＴＲアミロイドーシスにおける進行中の神経損傷または多発ニューロパチーの進行の減少の指標であり得る。ある実施態様において他のタンパク質、特にＲＳＰＯ３、ＣＣＤＣ８０、ＥＤＡ２ＲおよびＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルの、対応する処置開始時のレベルと比較した処置開始９カ月目の、単独またはＮｆＬレベルの減少と組み合わせた、減少は、ＡＴＴＲアミロイドーシスにおける進行中の神経損傷または多発ニューロパチーの進行の減少の指標であり得る。ある実施態様において、Ｎ－ＣＤａｓｅレベルの、対応する処置開始時のレベルと比較した処置開始９カ月目の、単独または上記の他のマーカーと組み合わせた増加は、ＡＴＴＲアミロイドーシスにおける進行中の神経損傷または多発ニューロパチーの進行の減少の指標であり得る。ここに提供するＲＮＡｉ剤での処置開始９カ月目などの、ＡＴＴＲアミロイドーシスにおける神経損傷または多発ニューロパチーの減少の指標として役立ち得るさらなるバイオマーカーを、表１に提供する。ＡＴＴＲアミロイドーシスにおける進行中の神経損傷または多発ニューロパチーの進行の減少は、正のベータ係数を有するタンパク質の減少と相関する。ＡＴＴＲアミロイドーシスにおける進行中の神経損傷または多発ニューロパチーの進行の減少は、負のベータ係数を有するタンパク質の増加と相関する。バイオマーカーレベルの変化は統計的に有意な変化、すなわち、アッセイの固有変動性より大きな変化であることは理解されるべきである。
【0122】
ある実施態様において、本発明の方法は、心血管指標の改善、例えば、カンザスシティ心筋症質問票の全体サマリー(ＫＣＣＱ－ＯＳ)の増加、ベースラインと比較した心エコー評価による左心室(ＬＶ)壁肥厚の減少、ベースラインと比較した心エコー評価による長軸方向のグローバル・ストレインの減少、ベースラインと比較したＮ末端プロホルモンＢ型ナトリウム利尿ペプチド(ＮＴｐｒｏＢＮＰ)の減少および心臓事象による入院の減少を提供する。
【0123】
本発明の方法はまた処置されている患者の予後も改善し得る。例えば、本発明の方法は、対象に、疾患の自然経過を示す適切な対照群、例えばAdams et al., N Engl J Med 2018;379:11-21に提供される、例えば、プラセボ対照群と比較して、処置期間中の臨床的悪化事象の確率の減少または寿命延長または入院減少を提供し得る。ある実施態様において、処置中の臨床的悪化事象の確率の減少は、例えば、Maurer et al., N Engl J Med 2018:379:11-21に提供される、適切な対照群と比較して、例えば、Finkelstein-Schoenfeld方法により評価した、あらゆる原因による死亡率または心血管関連入院率の減少を含み得る。疾患進行速度は、対象の処置開始時の疾患重症度、処置期間、先の処置およびもしあれば、存在する特定のＴＴＲ変異を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に依存することは理解される。
【0124】
対象に投与されるＲＮＡｉ剤の用量は、同時に望ましくない副作用を回避しながら、例えば、所望のＴＴＲ遺伝子発現の阻害レベル(例えば、上記のとおり、ＴＴＲ ｍＲＮＡ発現、ＴＴＲタンパク質発現に基づきまたはアミロイド沈着の減少により評価される)または所望の治療効果を達成するための、特定の用量のリスクと利益のバランスをとるように、調整され得る。
【0125】
ある実施態様において、本発明のｉＲＮＡ剤は、対象に、１用量のｉＲＮＡ剤が、体重などのあらゆる特定の対象関連因子と関係なく、全対象に使用されることを意味する「固定用量」(例えば、mg用量)で投与される。
【0126】
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、約２５mg～約１０００mg、例えば、約２５mg、約５０mg、約１００mg、約２００mg、約３００mg、約４００mg、約５００mg、約６００mg、約７００mg、約８００mg、約９００mgまたは約１０００mgの固定用量で投与される。
【0127】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約四半期に１回～約１年に１回ヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約四半期に１回、約６カ月に１回または約１年に１回ヒト対象に投与される。
【0128】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２５mg～約３００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２５mg～約２００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約７５mg～約２００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２５mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約５０mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約７５mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約１００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約２５mg～約３００mg；約２５mg～約２００mg；約７５mg～約２００mg；約２５mg；約５０mg；約１００mg；約２００mg；または約３００mgを四半期に１回、すなわち、約３カ月に１回の固定用量でヒト対象に投与される。
【0129】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約４００mg～約６００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約４００mgまたは約６００mgを約６カ月に１回～約１年に１回の固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約４００mgまたは約６００mgを約６カ月に１回または約１年に１回の固定用量でヒト対象に投与される。
【0130】
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約７００mg～約１０００mgまたは約７００mg～約９００mgの固定用量でヒト対象に投与される。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約７００mg、約８００mg、約９００mgまたは約１０００mgを約１年に１回の固定用量でヒト対象に投与される。
【0131】
ある実施態様において、投与は、例えば、プレフィルドシリンジまたは自動注入シリンジを介する、皮下投与、例えば、自己投与である。ある実施態様において、皮下投与用のＲＮＡｉ剤の用量は、１ml以下の体積の、例えば、薬学的に許容される担体に含まれる。
【0132】
これらのスケジュールのいずれも、所望により１以上の反復で繰り返し得る。反復数は、所望の効果、例えば、ＴＴＲ遺伝子の抑制、レチノール結合タンパク質レベル、ビタミンＡレベルの達成または治療効果、例えば、アミロイド沈着減少またはＴＴＲ関連疾患症状減少の達成に依存し得る。ある実施態様において、ｉＲＮＡ剤は、慢性的に、無限の期間、例えば、患者の生涯にわたって投与され得る。
【0133】
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、他の治療剤または他の治療レジメンと共に投与され得る。例えば、ＴＴＲ関連疾患処置に適する他の薬剤または他の治療レジメンは、肝移植、心移植、ペースメーカーの埋め込み、体内の単量体ＴＴＲレベルを減少させ得る薬剤；ＴＴＲアミロイド形成に必要な四量体解離を阻止する、ＴＴＲ四量体を動力学的に安定化させるタファミジス(ビンダケル(登録商標)またはVyndamax(登録商標))またはＡＧ１０；非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤＳ)、例えば、ジフルニサルおよび例えば、心臓合併症を伴うＴＴＲアミロイドーシスにおける浮腫を軽減するために用い得る、利尿剤を含み得る。
【0134】
ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤の初期用量および１回以上の維持用量を投与される。１回以上の維持用量は、初期用量と同じかまたは低い、例えば、初期用量の半分であり得る。処置後、患者は、状態の変化についてモニターし得る。
【0135】
本発明の方法のある実施態様において、血清または血漿ＴＴＲレベルにより評価されるＴＴＲ遺伝子の発現は、少なくとも８５％、ある実施態様において少なくとも９０％阻害される。ここに提供するｉＲＮＡ剤を使用するＴＴＲ発現の阻害は、肝臓におけるＴＴＲ発現を阻害し他の組織、例えば、眼におけるＴＴＲ発現を、実質的に阻害しないことは理解される。
【0136】
ここで使用する用語「阻害」は、「減少」、「サイレンシング」、「下方制御」、「抑制」および他の類似用語と相互交換可能に使用され、あらゆるレベルの阻害を含む。ある実施態様において阻害は統計的に有意または臨床的に有意な阻害を含む。
【0137】
用語「ＴＴＲの発現を阻害」は、ＴＴＲ遺伝子のバリアントまたは変異体を含む、あらゆるＴＴＲ遺伝子の発現の阻害をいうことを意図する。故に、ＴＴＲ遺伝子は、野生型ＴＴＲ遺伝子、変異体ＴＴＲ遺伝子(例えばアミロイド沈着を起こす変異体ＴＴＲ遺伝子)であり得る。
【0138】
阻害は、対照レベルと比較した、ＴＴＲ発現と関連する１以上の変数の絶対的または相対的レベルの減少により評価され得る。対照レベルは、当分野で利用されるあらゆるタイプの対照レベル、例えば、投与前ベースラインレベルまたは未処置もしくは対照(例えば、例えば、緩衝液のみ対照または不活性剤対照)で処置された類似の対象、細胞またはサンプルで決定したレベルであり得る。ここで使用するＴＴＲ発現の阻害は、典型的に適切なサンプル(例えば、歴史的対照サンプル、正常サンプルまたは臨床試験で決定したレベル)またはここにまたはＰＣＴ公報ＷＯ２０１００４８２２８、ＷＯ２０１３０７５０３５およびＷＯ２０１７０２３６６０に提供されるようなｉＲＮＡ剤、または他の薬剤、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド剤、ＴＴＲ発現を阻害するｄｉｃｅｒ基質剤(例えば、ＷＯ２０１１１３９９１７およびＷＯ２０１５０８５１５８参照)で対象を処置する前；およびここに提供するｉＲＮＡ剤で処置後、ＴＴＲレベルの決定により、評価され得る。ここに提供するｉＲＮＡ剤は持続性ではあるが、徐放性であることは理解される。それ故に、ノックダウンレベルは、最下点に達するための十分な時間の後、例えば、ヒト対象でｉＲＮＡ剤を最初の投与後少なくとも３週間またはＴＴＲノックダウンの定常状態達成後、例えば、ここに提供するｉＲＮＡ剤の複数投与後、決定される。
【0139】
ＴＴＲ遺伝子の発現の阻害は、ＴＴＲ遺伝子が転写され、ＴＴＲ遺伝子の発現が阻害されるように、処置されている(例えば、１以上の細胞と本発明のＲＮＡｉ剤の接触によりまたは本発明のＲＮＡｉ剤の、細胞が存在するまたは存在した対象への投与により)第一細胞または細胞群(このような細胞は、例えば、対象に由来するサンプルに存在し得る)により発現されるｍＲＮＡ量の、第一細胞または細胞群と実質的に同一であるが、処置されていない第二細胞または細胞群(対照細胞)と比較した、減少により顕在化され得る。ある実施態様において、パーセント阻害は、次の式を使用する、処置細胞におけるｍＲＮＡレベルを、対照細胞におけるｍＲＮＡレベルのパーセンテージとして表すことにより、評価される。
【数1】
【0140】
類似の計算を、例えば、対象から得た血液サンプルの、血清ＴＴＲタンパク質濃度で実施して、発現のパーセント阻害を決定し得る。処置後血清または血漿サンプルでＴＴＲが検出されないならば、存在するＴＴＲの量を、使用するアッセイの検出下限と見なす。
【0141】
ある実施態様において、パーセント阻害を、検証済かつ臨床的に許容される方法を使用して、決定する。
【0142】
あるいは、ＴＴＲ遺伝子の発現の阻害を、ＴＴＲ遺伝子発現と機能的関連するパラメータ、例えば、ＴＴＲタンパク質発現、レチノール結合タンパク質レベル、ビタミンＡレベルまたはＴＴＲを含むアミロイド沈着の存在の減少の点で、評価し得る。ＴＴＲ遺伝子サイレンシングは、構成的にまたはゲノム工学によりＴＴＲを発現するあらゆる細胞で、当分野で知られるあらゆるアッセイにより、決定され得る。肝臓はＴＴＲ遺伝子発現の主要部位である。他の顕著な発現部位は、網膜および脈絡叢である。
【0143】
III. 本発明のｉＲＮＡ
本発明の方法で使用するための適当なｉＲＮＡは、対象、例えば、ＴＴＲ関連疾患を有するヒトなどの哺乳動物内の細胞などの細胞におけるＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)分子を含む。ｄｓＲＮＡは、ＴＴＲ遺伝子の発現により形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補性である、相補性である領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性である領域は、約２１～３０ヌクレオチドまたはそれ未満の長さである(例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２または２１ヌクレオチド長)。ＴＴＲ遺伝子を発現する細胞との接触により、ｉＲＮＡは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞が、ここに提供する方法を使用して、１０nMのｉＲＮＡ剤でトランスフェクトされたとき、例えば、ＷＯ２０１３０７５０３５の実施例４に提供される方法を使用するリアルタイムＰＣＲでアッセイして、ＴＴＲ遺伝子(例えば、ヒト、非ヒト霊長類または非霊長類哺乳動物ＴＴＲ遺伝子)発現を、少なくとも約７０％選択的に阻害する。
本発明の方法で使用するための適当なｉＲＮＡは、対象、例えば、ＴＴＲ関連疾患を有するヒトなどの哺乳動物内の細胞などの細胞におけるＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)分子を含む。ｄｓＲＮＡは、ＴＴＲ遺伝子の発現により形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補性である、相補性である領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性である領域は、約２１～３０ヌクレオチドまたはそれ未満の長さである(例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２または２１ヌクレオチド長)。ＴＴＲ遺伝子を発現する細胞との接触により、ｉＲＮＡは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞が、ここに提供する方法を使用して、１０nMのｉＲＮＡ剤でトランスフェクトされたとき、例えば、ＷＯ２０１３０７５０３５の実施例４に提供される方法を使用するリアルタイムＰＣＲでアッセイして、ＴＴＲ遺伝子(例えば、ヒト、非ヒト霊長類または非霊長類哺乳動物ＴＴＲ遺伝子)発現を、少なくとも約７０％選択的に阻害する。
【0144】
ｄｓＲＮＡは相補性であり、ｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成する、２個のＲＮＡ鎖を含む。ＤｓＲＮＡの一方の鎖(アンチセンス鎖)は、標的配列と実質的に相補性および一般に完全相補性である、相補性である領域を含む。標的配列は、ＴＴＲ遺伝子の発現中形成される、ｍＲＮＡの配列に由来し得る。他の鎖(センス鎖)は、適当な条件で合わせたとき、２個の鎖がハイブリダイズし、二重鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖と相補性である領域を含む。本明細書の他の箇所に記載しかつ当分野で知られるとおり、ｄｓＲＮＡの相補性配列は、別々のオリゴヌクレオチドにあるのとは逆に、単一核酸分子の自己相補性領域として含まれ得る。
【0145】
一般に、二重鎖構造は２１～３０塩基対長である。同様に、標的配列に相補性である領域は、２２および３０ヌクレオチド長である。
【0146】
ｄｓＲＮＡは、さらに下に記載するとおり、当分野で知られる標準法により合成され得る。
【0147】
本発明のｉＲＮＡ化合物は、２工程方法を使用して製造され得る。まず、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖を別々に調製する。次いで、要素鎖をアニールする。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相または固相有機合成または両者を使用して製造され得る。有機合成は、非天然または修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が簡単に製造できる利点がある。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相有機合成または両者を使用して製造され得る。
【0148】
IV. 本発明の修飾ｉＲＮＡ
本発明の方法で使用するｉＲＮＡ剤は、規定された化学修飾をセンスおよびアンチセンス鎖に含む。いずれかの鎖の長さが、２３ヌクレオチドより長いアンチセンス鎖および２１ヌクレオチドより長いセンス鎖を提供するために伸長されるとき、ヌクレオチドは、糖修飾、主鎖修飾および塩基修飾を含むが、これらに限定されない修飾を含み得る。修飾は、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾(リン酸化、コンジュゲーション、逆位結合)または３’末端修飾(コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆位結合など)；塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基またはパートナーの拡大レパートリーと塩基対合する塩基での置換、塩基の除去(脱塩基ヌクレオチド)またはコンジュゲート塩基；糖修飾(例えば、２’位または４’位)または糖の置換；またはホスホジエステル結合の修飾または置換を含む主鎖修飾を含む。ここに記載する実施態様において有用なｉＲＮＡ化合物の特定の例は、修飾主鎖を含むまたは天然ヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡを含むが、これらに限定されない。修飾主鎖を有するＲＮＡは、とりわけ、主鎖にリン原子を有しないものを含む。本明細書の目的でかつ文献に時に言及されるとおり、ヌクレオシド間主鎖にリン原子を有しない修飾ＲＮＡも、オリゴヌクレオシドと見なされ得る。ある実施態様において、修飾ｉＲＮＡは、ヌクレオシド間主鎖にリン原子を有する。
本発明の方法で使用するｉＲＮＡ剤は、規定された化学修飾をセンスおよびアンチセンス鎖に含む。いずれかの鎖の長さが、２３ヌクレオチドより長いアンチセンス鎖および２１ヌクレオチドより長いセンス鎖を提供するために伸長されるとき、ヌクレオチドは、糖修飾、主鎖修飾および塩基修飾を含むが、これらに限定されない修飾を含み得る。修飾は、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾(リン酸化、コンジュゲーション、逆位結合)または３’末端修飾(コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆位結合など)；塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基またはパートナーの拡大レパートリーと塩基対合する塩基での置換、塩基の除去(脱塩基ヌクレオチド)またはコンジュゲート塩基；糖修飾(例えば、２’位または４’位)または糖の置換；またはホスホジエステル結合の修飾または置換を含む主鎖修飾を含む。ここに記載する実施態様において有用なｉＲＮＡ化合物の特定の例は、修飾主鎖を含むまたは天然ヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡを含むが、これらに限定されない。修飾主鎖を有するＲＮＡは、とりわけ、主鎖にリン原子を有しないものを含む。本明細書の目的でかつ文献に時に言及されるとおり、ヌクレオシド間主鎖にリン原子を有しない修飾ＲＮＡも、オリゴヌクレオシドと見なされ得る。ある実施態様において、修飾ｉＲＮＡは、ヌクレオシド間主鎖にリン原子を有する。
【0149】
修飾ＲＮＡ主鎖は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含むメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、３’アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステルおよび正常３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合アナログおよび、ヌクレオシド単位の隣接対が３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’で結合する反転極性を有するものを含む。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
【0150】
リン原子を含まない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合型ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合または１以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成される主鎖を有する。これらは、モルホリノ結合(一部ヌクレオシドの糖部分から形成される)；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；および混合型Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２要素部分を有するその他を有するものを含む。
【0151】
他の実施態様において、適当なＲＮＡ模倣体は、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合、すなわち、主鎖両者が新規群で置換されている、ｉＲＮＡにおける使用が意図される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション性質を有することが示されているＲＮＡ模倣体であるあるこのようなオリゴマー化合物は、ペプチド核酸(ＰＮＡ)と称される。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖主鎖はアミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換される。核酸塩基は維持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。
【0152】
本発明で注目されるある実施態様は、ホスホロチオエート主鎖を有するＲＮＡおよびヘテロ原子主鎖および特に上に引用した米国特許５,４８９,６７７の－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ(ＣＨ３)－－Ｏ－－ＣＨ２－－[メチレン(メチルイミノ)またはＭＭＩ主鎖として知られる]、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ(ＣＨ３)－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ(ＣＨ３)－－Ｎ(ＣＨ３)－－ＣＨ２－－および－－Ｎ(ＣＨ３)－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－および上に引用した米国特許５,６０２,２４０のアミド主鎖を有するオリゴヌクレオシドを含む。ある実施態様において、ここで注目されるＲＮＡは、上に引用した米国特許５,０３４,５０６のモルホリノ主鎖構造を有する。天然ホスホジエステル主鎖は、Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－ＯＣＨ２－として表わし得る。
【0153】
修飾ＲＮＡは、１以上の置換糖部分も含み得る。ここで注目されるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位にＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキル(ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１－Ｃ１０アルキルまたはＣ２－Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルである)の１つを含み得る。適当な修飾の例は、Ｏ[(ＣＨ２)ｎＯ]ｍＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２).ｎＯＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、Ｏ(ＣＨ２)ｎＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＮＨ２およびＯ(ＣＨ２)ｎＯＮ[(ＣＨ２)ｎＣＨ３)]２(ここで、ｎおよびｍは１～約１０である)を含む。他の実施態様において、ｄｓＲＮＡは、２’位にＣ１－Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、ｉＲＮＡの薬物動態性質を改善する基またはｉＲＮＡの薬力学的性質を改善する基および類似の性質を有する他の置換基の１個を含む。ある実施態様において、修飾は２’－メトキシエトキシ(２’－Ｏ－(２－メトキシエチル)または２’－ＭＯＥとしても知られる、２’－Ｏ－－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504)、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基を含む。他の例示的修飾は、下の実施例に記載する２’－ＤＭＡＯＥとしても知られる２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ(ＣＨ２)２ＯＮ(ＣＨ３)２基および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ(２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても当分野で知られる)、すなわち、２’－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｎ(ＣＨ３)２を含む。さらなる例示的修飾は、５’－Ｍｅ－２’－Ｆヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－ＯＭｅヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－デオキシヌクレオチド(これらのファミリーのＲおよびＳ両異性体)；２’－アルコキシアルキル；および２’－ＮＭＡ(Ｎ－メチルアセトアミド)を含む。
【0154】
他の修飾は、２’－メトキシ(２’－ＯＣＨ３)、２’アミノプロポキシ(２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２)および２’－フルオロ(２’－Ｆ)を含む。類似の修飾はまたｉＲＮＡのＲＮＡの他の位置、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’－５’結合ｄｓＲＮＡの糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位になし得る。ｉＲＮＡはまたペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体も有し得る。
【0155】
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡは、核酸塩基(本分野ではしばしば単に「塩基」)修飾または置換も含み得る。ここで使用する「非修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン(Ａ)およびグアニン(Ｇ)およびピリミジン塩基チミン(Ｔ)、シトシン(Ｃ)およびウラシル(Ｕ)を含む。修飾核酸塩基は、デオキシチミジン(ｄＴ)、５－メチルシトシン(５－ｍｅ－Ｃ)、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２アミノアデニン、６－メチルおよびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピルおよびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル(シュードウラシル)、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニンおよび３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどの他の合成および天然核酸塩基を含む。これら核酸塩基のいくつかは、本発明で注目されるオリゴマー化合物の結合親和性増加に特に有用である。これらは、２アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含む、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンおよびＮ－２、Ｎ－６および０～６置換プリンを含む。５－メチルシトシン置換は、０.６～１.２℃核酸二重鎖安定性を増加させることが示されており(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)、さらに特に、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせたとき、例示的塩基置換である。
【0156】
本発明のＲＮＡｉ剤は、１以上の二環式糖部分を含むようにも修飾され得る。「二環式糖」は、隣接または非隣接原子の２個の炭素の架橋により形成される環により修飾されるフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」(「ＢＮＡ」)は、隣接または非隣接の糖環の２個の炭素原子である２個の炭素を接続する架橋を含み、それにより二環式環系が形成される、架橋により形成された環を含む糖部分を有するヌクレオシドである。ある実施態様において、架橋は、所望により、２’－非環式酸素原子を介して、糖環の４’－炭素および２’－炭素を接続する。故に、ある実施態様において、本発明の薬剤は、１以上のロックド核酸(ＬＮＡ)を含み得る。ロックド核酸は、リボース部分が２’および４’炭素を接続する余分の架橋を含む、修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。換言すると、ＬＮＡは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、効率的にリボースを３’エンド立体構造に「ロックする」。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の付加は、血清のｓｉＲＮＡ安定性を増加させ、オフターゲット効果を減少させると考えられる(Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。本発明のポリヌクレオチドにおいて使用するための二環式ヌクレオシドの例は、４’および２’リボシル環原子間の架橋を含むヌクレオシドを含むが、これに限定されない。ある実施態様において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤は、４’→２’架橋を含む、１以上の二環式ヌクレオシドを含む。
【0157】
ロックドヌクレオシドは、構造(立体化学は省略)
により表され、ここでＢは核酸塩基または修飾核酸塩基であり、Ｌはリボース環の２’－炭素を４’－炭素に結合する連結基である。
【化5】
【0158】
このような４’→２’架橋二環式ヌクレオシドの例は、４’－(ＣＨ２)－Ｏ－２’(ＬＮＡ)；４’－(ＣＨ２)－Ｓ－２’；４’－(ＣＨ２)２－Ｏ－２’(ＥＮＡ)；４’－ＣＨ(ＣＨ３)－Ｏ－２’(「拘束エチル」または「ｃＥｔ」とも称される)および４’－ＣＨ(ＣＨ２ＯＣＨ３)－Ｏ－２’(およびそのアナログ；例えば、米国特許７,３９９,８４５参照)；４’－Ｃ(ＣＨ３)(ＣＨ３)－Ｏ－２’(およびそのアナログ；例えば、ＵＳ特許８,２７８,２８３参照)；４’－ＣＨ２－Ｎ(ＯＣＨ３)－２’(およびそのアナログ；例えば、ＵＳ特許８,２７８,４２５参照)；４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ(ＣＨ３)－２’(例えば、米国特許公開２００４／０１７１５７０参照)；４’－ＣＨ２－Ｎ(Ｒ)－Ｏ－２’(ここで、ＲはＨ、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたは窒素保護基である)(例えば、米国特許７,４２７,６７２参照)；４’－ＣＨ２－Ｃ(Ｈ)(ＣＨ３)－２’(例えば、Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134参照)；および４’－ＣＨ２－Ｃ(＝ＣＨ２)－２’(およびそのアナログ；例えば、ＵＳ特許８,２７８,４２６参照)を含むが、これらに限定されない。前記各々の内容全体を引用により本明細書に包含させる。
【0159】
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示するさらなる代表的ＵＳ特許およびＵＳ特許公報は、次のものを含むが、これらに限定されない：ＵＳ特許６,２６８,４９０；６,５２５,１９１；６,６７０,４６１；６,７７０,７４８；６,７９４,４９９；６,９９８,４８４；７,０５３,２０７；７,０３４,１３３；７,０８４,１２５；７,３９９,８４５；７,４２７,６７２；７,５６９,６８６；７,７４１,４５７；８,０２２,１９３；８,０３０,４６７；８,２７８,４２５；８,２７８,４２６；８,２７８,２８３；ＵＳ２００８／００３９６１８；およびＵＳ２００９／００１２２８１(この各々の内容全体を引用により本明細書に包含させる)。
【0160】
前記二環式ヌクレオシドの何れも、例えばα－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースを含む、１以上の立体化学糖配置を有して、調製され得る(ＷＯ９９／１４２２６参照)。
【0161】
本発明のＲＮＡｉ剤は、１以上の拘束エチルヌクレオチドを含むようにも修飾され得る。ここで使用する「拘束エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ(ＣＨ３)－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックド核酸である(すなわち、前述の構造のＬ)。ある実施態様において、拘束エチルヌクレオチドは、ここで「Ｓ－ｃＥｔ」と称するＳ配座である。
【0162】
本発明のｉＲＮＡはまた１以上の「配座制限ヌクレオチド」(「ＣＲＮ」)も含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’およびＣ４’炭素またはリボースのＣ３およびＣ５’炭素を接続するリンカーを備えたヌクレオチドアナログである。ＣＲＮはリボース環を安定な配座にロックし、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を増加させる。リンカーは、リボース環パッカリングの低減をもたらす安定性および親和性のための最適位置に酸素を配置するのに十分な長さである
【0163】
本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの１以上は、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドも含み得る。「ヒドロキシメチル置換ヌクレオチド」は、「アンロックド核酸」(「ＵＮＡ」)修飾とも称される、非環式２’－３’－ｓｅｃｏ－ヌクレオチドである。
【0164】
ＲＮＡ分子の末端への安定化する可能性のある修飾は、Ｎ－(アセチルアミノカプロイル)－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ)、Ｎ－(カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－Ｃ６)、Ｎ－(アセチル－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ)、チミジン－２’－Ｏ－デオキシチミジン(エーテル)、Ｎ－(アミノカプロイル)－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－Ｃ６アミノ)、２－ドコサノイル－ウリジン－３’－ホスフェート、逆位塩基ｄＴ(ｉｄＴ)およびその他を含み得る。この修飾の開示は、ＷＯ２０１１／００５８６１に見ることができる。
【0165】
本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの他の修飾は、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣体、例えば、５’末端ホスフェートまたはホスフェート模倣体である。適当なホスフェート模倣体は、例えばＵＳ特許公開２０１２／０１５７５１１(その内容全体を引用により本明細書に包含させる)に見ることができる。
【0166】
Ｖ. リガンドにコンジュゲートしたｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの他の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する１以上のリガンド、部分またはコンジュゲートのＲＮＡへの化学的連結を含む。このような部分は、脂質部分、例えばコレステロール部分(Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556)、コール酸(Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060)、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54)、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１,２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973)またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237)またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)を含むが、これらに限定されない。
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの他の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する１以上のリガンド、部分またはコンジュゲートのＲＮＡへの化学的連結を含む。このような部分は、脂質部分、例えばコレステロール部分(Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556)、コール酸(Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060)、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54)、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１,２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973)またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237)またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)を含むが、これらに限定されない。
【0167】
ある実施態様において、リガンドは、取り込まれているｉＲＮＡ剤の分布、ターゲティングまたは寿命を変える。ある実施態様において、リガンドは、例えば、このようなリガンドを欠く種と比較して、選択した標的、例えば、分子、細胞または細胞型、区画、例えば、体内の細胞または臓器区画、組織、臓器または領域に対する親和性の増強を提供する。リガンドの例は、二重鎖核酸の二重鎖対形成に参加しない。
【0168】
リガンドはまたターゲティング基、例えば、細胞または組織ターゲティング剤、例えば、腎細胞などの特定の細胞型に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、抗体も含み得る。ターゲティング基は甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、単価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコースアミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチンまたはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。ある実施態様において、リガンドは単価または多価ガラクトースを含む。ある実施態様において、リガンドはコレステロールを含む。
【0169】
本発明のリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドへの連結分子の結合に由来するもののようなペンダント反応性官能基を有するオリゴヌクレオチドを使用して、合成し得る(下記)。この反応性オリゴヌクレオチドを、市販のリガンド、多様な保護基の何れかを有する合成リガンドまたは連結部分が結合したリガンドと直接反応させ得る。
【0170】
本発明のコンジュゲートで使用するオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知技術を介して、便利におよび日常的に製造され得る。当分野で知られるこのような合成のあらゆる他の手段を、これに加えてまたはこれとは別に用い得る。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するための類似の技術の使用も知られる。
【0171】
Ａ. 炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物および方法のある実施態様において、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、さらに炭水化物を含む。炭水化物コンジュゲートｉＲＮＡは、ここに記載するとおり、核酸のインビボ送達およびインビボ治療に適する組成物に有利である。ここで使用する「炭水化物」は、各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子を伴う少なくとも６炭素原子(これは直鎖でも分岐でも環状でもよい)を有する１以上の単糖単位からなる炭水化物自体である化合物；または一部として、各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子を伴う少なくとも６炭素原子(これは直鎖でも分岐でも環状でもよい)を各々有する１以上の単糖単位からなる炭水化物部分を有する化合物をいう。代表的炭水化物は、糖(単糖、二糖、三糖および約４、５、６、７、８または９単糖単位を含むオリゴ糖)ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ガムなどの多糖を含む。特定の単糖は、Ｃ５以上(例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８)の糖を含む；二糖および三糖は、２個または３個の単糖単位(例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８)を有する糖を含む。
本発明の組成物および方法のある実施態様において、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、さらに炭水化物を含む。炭水化物コンジュゲートｉＲＮＡは、ここに記載するとおり、核酸のインビボ送達およびインビボ治療に適する組成物に有利である。ここで使用する「炭水化物」は、各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子を伴う少なくとも６炭素原子(これは直鎖でも分岐でも環状でもよい)を有する１以上の単糖単位からなる炭水化物自体である化合物；または一部として、各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子を伴う少なくとも６炭素原子(これは直鎖でも分岐でも環状でもよい)を各々有する１以上の単糖単位からなる炭水化物部分を有する化合物をいう。代表的炭水化物は、糖(単糖、二糖、三糖および約４、５、６、７、８または９単糖単位を含むオリゴ糖)ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ガムなどの多糖を含む。特定の単糖は、Ｃ５以上(例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８)の糖を含む；二糖および三糖は、２個または３個の単糖単位(例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８)を有する糖を含む。
【0172】
ある実施態様において、本発明の組成物および方法で使用するための炭水化物コンジュゲートは単糖である。他の実施態様において、本発明の組成物および方法で使用するための炭水化物コンジュゲートは、次のものからなる群から選択される。
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【化10】
【0173】
ある実施態様において、単糖は、
などのＮ－アセチルガラクトサミンである。
【化11】
【0174】
ここに記載する実施態様で使用するための他の代表的炭水化物コンジュゲートは、
(式中、ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドであるとき、他方は水素である。)
を含むが、これに限定されない。
【化12】
を含むが、これに限定されない。
【0175】
本発明のある実施態様において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、単価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。ある実施態様において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。本発明のさらに他の実施態様において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。
【0176】
ある実施態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤に結合した１個のＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。他の実施態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、各々独立して複数の単価リンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに結合する、複数(例えば、２個、３個、４個、５個または６個)のＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
【0177】
ある実施態様において、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２個の鎖が、複数の不対ヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する一個の鎖の３’末端と、各他の鎖の５’末端の間のヌクレオチドの非中断鎖により接続される１個の大型分子の一部であり、該ヘアピンループ内の各不対ヌクレオチドは、独立して単価リンカーを介して結合するＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み得る。ヘアピンループはまた二重鎖の一方の鎖の伸長オーバーハングによっても形成され得る。
【0178】
ある実施態様において、炭水化物コンジュゲートは、さらに、ＰＫモジュレーターまたは細胞浸透ペプチドなどの、しかし、これに限定されない上記の１以上のさらなるリガンドを含む。
【0179】
本発明での使用に適するさらなる炭水化物コンジュゲートは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１７９６２０およびＷＯ２０１４／１７９６２７(この各々の内容全体を引用により本明細書に包含させる)に記載のものを含む。
【0180】
Ｂ. リンカー
ある実施態様において、ここに記載するコンジュゲートまたはリガンドは、切断可能または非切断可能であり得る種々のリンカーを用いてｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合させ得る。
ある実施態様において、ここに記載するコンジュゲートまたはリガンドは、切断可能または非切断可能であり得る種々のリンカーを用いてｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合させ得る。
【0181】
用語「リンカー」または「連結基」は、化合物の２か所を接続する、例えば、化合物の２か所を共有結合で結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に直接結合または酸素または硫黄などの原子、単位、例えばＮＲ８、Ｃ(Ｏ)、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨまたは、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール(１以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ(Ｏ)、ＳＯ２、Ｎ(Ｒ８)、Ｃ(Ｏ)、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロ環式で中断または終結していてよい)を含むが、これらに限定されない原子の鎖を含み；ここで、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。ある実施態様において、リンカーは約１～２４原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８原子、７～１７、８～１７、６～１６、７～１６または８～１６原子である。
【0182】
切断可能連結基は、細胞外で十分に安定であるが、標的細胞に入ったとき、切断して、リンカーが一体化させている２個の部分を放出するものである。ある実施態様において、切断可能連結基は、標的細胞または第一対照条件下(例えば、細胞内条件を模倣または表すよう選択され得る)、対象の血液または第二対照条件下(血液または血清で見られる条件を模倣または表すよう選択され得る)より少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍またはそれ以上または少なくとも約１００倍速く開裂される。
【0183】
切断可能連結基は、切断因子、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在に感受性である。一般に、切断因子は、血清または血液より細胞内でより優勢であるかまたは高レベルまたは活性で見られる。このような分解性因子の例は、例えば、酸化または還元酵素または還元により酸化還元切断可能連結基を分解できる、細胞に存在するメルカプタンなどの還元因子を含む、特定の基質について選択されるまたは基質特異性がない酸化還元因子；エステラーゼ；エンドソームまたは例えば、５以下のｐＨをもたらすなど酸性環境を作ることができる因子；一般的酸としての作用により酸切断可能連結基を加水分解または分解できる酵素、ペプチダーゼ(基質特異的であり得る)およびホスファターゼを含む。
【0184】
ジスルフィド結合などの切断可能結合基は、ｐＨに感受性であり得る。ヒト血清のｐＨは７.４であり、一方、平均細胞内ｐＨは、約７.１～７.３の範囲でわずかに低い。エンドソームは５.５～６.０の範囲でより酸性ｐＨであり、リソソームは、約５.０とさらに酸性ｐＨである。一部リンカーは、選択したｐＨで切断され、それにより細胞内でまたは細胞の所望の区画にリガンドからカチオン性脂質を放出する、切断可能連結基を有する。
【0185】
リンカーは、特定の酵素により切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に依存し得る。例えば、肝臓ターゲティングリガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に結合され得る。肝細胞はエステラーゼに富み、それ故にリンカーはエステラーゼリッチではない細胞型より肝細胞より効率的に開裂される。エステラーゼに富む他の細胞型は、肺、腎皮質および精巣の細胞を含む。
【0186】
ペプチド結合を含むリンカーは、ターゲティング細胞型が肝細胞および滑膜細胞などペプチダーゼに富むとき、使用され得る。
【0187】
一般に、候補切断可能連結基の適性は、候補連結基を切断する分解性因子(または条件)の能力の試験により評価され得る。候補切断可能連結基が血中でまたは他の非標的組織と接触したときの切断に耐える能力を試験することも望ましい。故に、第一および第二条件(ここで、第一は標的細胞の切断の指標となるよう選択され、第二は他の組織または体液、例えば、血液または血清中の切断の指標となるよう選択される)の間の切断に対する相対的感受性を決定できる。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養、臓器または組織培養または動物全体で実施できる。無細胞または培養条件で初期評価を行い、さらに動物全体での評価により確認することが有用であり得る。ある実施態様において、有用な候補化合物は、細胞(または細胞内条件を模倣するよう選択したインビトロ条件下)で、血液または血清(または細胞外条件を模倣するよう選択したインビトロ条件下)と比較して、少なくとも約２倍、４倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍または約１００倍速く切断される。
【0188】
ｉ. 酸化還元切断可能連結基
ある実施態様において、切断可能連結基は、還元または酸化により切断される酸化還元切断可能連結基である。還元により切断可能な連結基の例は、ジスルフィド連結基(－Ｓ－Ｓ－)である。候補切断可能連結基が適当な「還元により切断可能な連結基」または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定のターゲティング剤との使用に適するかを決定するために、ここに記載する方法を実施し得る。例えば、候補を、細胞、例えば、標的細胞で観察される切断速度を模倣する、当分野で知られる試薬を使用する、ジチオトレイトール(ＤＴＴ)または他の還元剤とのインキュベーションにより評価し得る。候補はまた血液または血清条件を模倣するよう選択した条件下でも評価され得る。一例で、候補化合物は、血中で多くて約１０％切断される。他の実施態様において、有用な候補化合物は、細胞(または細胞内条件を模倣するよう選択したインビトロ条件下)で、血液(または細胞外条件を模倣するよう選択したインビトロ条件下)と比較して少なくとも約２倍、４倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍または約１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するよう選択した条件下で標準酵素反応動態アッセイを使用して決定し、細胞外媒体を模倣するよう選択した条件と比較し得る。
ある実施態様において、切断可能連結基は、還元または酸化により切断される酸化還元切断可能連結基である。還元により切断可能な連結基の例は、ジスルフィド連結基(－Ｓ－Ｓ－)である。候補切断可能連結基が適当な「還元により切断可能な連結基」または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定のターゲティング剤との使用に適するかを決定するために、ここに記載する方法を実施し得る。例えば、候補を、細胞、例えば、標的細胞で観察される切断速度を模倣する、当分野で知られる試薬を使用する、ジチオトレイトール(ＤＴＴ)または他の還元剤とのインキュベーションにより評価し得る。候補はまた血液または血清条件を模倣するよう選択した条件下でも評価され得る。一例で、候補化合物は、血中で多くて約１０％切断される。他の実施態様において、有用な候補化合物は、細胞(または細胞内条件を模倣するよう選択したインビトロ条件下)で、血液(または細胞外条件を模倣するよう選択したインビトロ条件下)と比較して少なくとも約２倍、４倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍または約１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するよう選択した条件下で標準酵素反応動態アッセイを使用して決定し、細胞外媒体を模倣するよう選択した条件と比較し得る。
【0189】
ii. リン酸ベースの切断可能連結基
ある実施態様において、切断可能リンカーは、リン酸ベースの切断可能連結基を含む。リン酸ベースの切断可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する因子により切断される。細胞でリン酸基を切断する因子の例は、細胞中のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＳＲｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｓ(式中、Ｒｋは各場合、独立して、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ１－Ｃ２０ハロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリールまたはＣ７－Ｃ１２アラルキルである)である。実施態様の例は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＳＨ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｏ、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｓ－および－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｓ－を含む。ある実施態様において、リン酸ベースの連結基は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－である。これらの候補を、上記のものに準ずる方法を使用して、評価し得る。
ある実施態様において、切断可能リンカーは、リン酸ベースの切断可能連結基を含む。リン酸ベースの切断可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する因子により切断される。細胞でリン酸基を切断する因子の例は、細胞中のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＳＲｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｓ(式中、Ｒｋは各場合、独立して、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ１－Ｃ２０ハロアルキル、Ｃ６－Ｃ１０アリールまたはＣ７－Ｃ１２アラルキルである)である。実施態様の例は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＳＨ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｏ、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｓ－および－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｓ－を含む。ある実施態様において、リン酸ベースの連結基は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－である。これらの候補を、上記のものに準ずる方法を使用して、評価し得る。
【0190】
iii. 酸切断可能連結基
ある実施態様において、切断可能リンカーは、酸切断可能連結基を含む。酸切断可能連結基は、酸性条件下切断される連結基である。ある実施態様において、酸切断可能連結基は、約６.５以下のｐＨの酸性環境(例えば、約６.０、５.７５、５.５、５.２５、５.０またはそれ未満)または一般的酸として作用し得る酵素などの因子により切断される。細胞で、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ小器官は、酸切断可能連結基に切断環境を提供できる。酸切断可能連結基の例は、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルを含むが、これらに限定されない。酸切断可能基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ(Ｏ)Ｏまたは－ＯＣ(Ｏ)を有し得る。例示的実施態様は、エステルの酸素(アルコキシ基)に結合した炭素がアリール基、置換アルキル基またはジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルなどの３級アルキル基であるときである。これらの候補を、上記のものに準ずる方法を使用して、評価し得る。
ある実施態様において、切断可能リンカーは、酸切断可能連結基を含む。酸切断可能連結基は、酸性条件下切断される連結基である。ある実施態様において、酸切断可能連結基は、約６.５以下のｐＨの酸性環境(例えば、約６.０、５.７５、５.５、５.２５、５.０またはそれ未満)または一般的酸として作用し得る酵素などの因子により切断される。細胞で、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ小器官は、酸切断可能連結基に切断環境を提供できる。酸切断可能連結基の例は、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルを含むが、これらに限定されない。酸切断可能基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ(Ｏ)Ｏまたは－ＯＣ(Ｏ)を有し得る。例示的実施態様は、エステルの酸素(アルコキシ基)に結合した炭素がアリール基、置換アルキル基またはジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルなどの３級アルキル基であるときである。これらの候補を、上記のものに準ずる方法を使用して、評価し得る。
【0191】
iv. エステルベースの連結基
他の実施態様において、切断可能リンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含む。エステルベースの切断可能連結基は、細胞のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能連結の例は、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルを含むが、これらに限定されない。エステル切断可能連結基は、一般式－Ｃ(Ｏ)Ｏ－または－ＯＣ(Ｏ)－を有する。これらの候補を、上記のものに準ずる方法を使用して、評価し得る。
他の実施態様において、切断可能リンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含む。エステルベースの切断可能連結基は、細胞のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能連結の例は、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルを含むが、これらに限定されない。エステル切断可能連結基は、一般式－Ｃ(Ｏ)Ｏ－または－ＯＣ(Ｏ)－を有する。これらの候補を、上記のものに準ずる方法を使用して、評価し得る。
【0192】
ｖ. ペプチドベースの切断基
さらに他の実施態様において、切断可能リンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含む。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドをもたらすアミノ酸間で形成されるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基は、アミド基(－Ｃ(Ｏ)ＮＨ－)を含まない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質をもたらすアミノ酸間で形成される、特別のタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にペプチドおよびタンパク質をもたらすアミノ酸間で形成されるペプチド結合(すなわち、アミド結合)に限定され、アミド官能基全体を含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ(Ｏ)ＮＨＣＨＲＢＣ(Ｏ)－(式中、ＲＡおよびＲＢは、２個の隣接アミノ酸のＲ基である)を有する。これらの候補を、上記のものに準ずる方法を使用して、評価し得る。
さらに他の実施態様において、切断可能リンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含む。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドをもたらすアミノ酸間で形成されるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基は、アミド基(－Ｃ(Ｏ)ＮＨ－)を含まない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質をもたらすアミノ酸間で形成される、特別のタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にペプチドおよびタンパク質をもたらすアミノ酸間で形成されるペプチド結合(すなわち、アミド結合)に限定され、アミド官能基全体を含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ(Ｏ)ＮＨＣＨＲＢＣ(Ｏ)－(式中、ＲＡおよびＲＢは、２個の隣接アミノ酸のＲ基である)を有する。これらの候補を、上記のものに準ずる方法を使用して、評価し得る。
【0193】
ある実施態様において、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物にコンジュゲートされる。本発明の組成物および方法のリンカーを有するｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートの非限定的例は、次のものを含むが、これらに限定されない。
(式中、ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドであるとき、他方は水素である。)
【化13】
【化14】
【0194】
本発明のある実施態様においての組成物および方法、リガンドは、二価または三価分岐リンカーを介して結合する、１以上の「ＧａｌＮＡｃ」(Ｎ－アセチルガラクトサミン)誘導体である。
【0195】
ある実施態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、式(XXXII)～(XXXV)の何れかに示す構造の基から選択される、二価または三価分岐リンカーにコンジュゲートする：
〔式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、各場合独立して、０～２０であり、ここで、反復単位は同一でも異なってもよく；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各場合独立して非存在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ(Ｏ)、ＮＨＣ(Ｏ)、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各場合独立して、非存在、アルキレン、置換アルキレンであって、ここで、メチレンの１以上は、Ｏ、Ｓ、Ｓ(Ｏ)、ＳＯ２、Ｎ(ＲＮ)、Ｃ(Ｒ’)＝Ｃ(Ｒ’’)、Ｃ≡ＣまたはＣ(Ｏ)の１以上で中断または終結していてよく；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各場合独立して、非存在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ(Ｏ)Ｏ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、ＮＨＣＨ(Ｒａ)Ｃ(Ｏ)、－Ｃ(Ｏ)－ＣＨ(Ｒａ)－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃはリガンドであり；すなわち、各場合独立して、単糖(例えばＧａｌＮＡｃ)、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖または多糖であり；そしてＲａはＨまたはアミノ酸側鎖である。〕。
式(XXXVI)：
〔式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５ＣはＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖である。〕
などの三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、標的遺伝子発現阻害のためのＲＮＡｉ剤で使用するのに特に有用である。
【化15】
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、各場合独立して、０～２０であり、ここで、反復単位は同一でも異なってもよく；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各場合独立して非存在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ(Ｏ)、ＮＨＣ(Ｏ)、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各場合独立して、非存在、アルキレン、置換アルキレンであって、ここで、メチレンの１以上は、Ｏ、Ｓ、Ｓ(Ｏ)、ＳＯ２、Ｎ(ＲＮ)、Ｃ(Ｒ’)＝Ｃ(Ｒ’’)、Ｃ≡ＣまたはＣ(Ｏ)の１以上で中断または終結していてよく；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各場合独立して、非存在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ(Ｏ)Ｏ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、ＮＨＣＨ(Ｒａ)Ｃ(Ｏ)、－Ｃ(Ｏ)－ＣＨ(Ｒａ)－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
【化16】
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃはリガンドであり；すなわち、各場合独立して、単糖(例えばＧａｌＮＡｃ)、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖または多糖であり；そしてＲａはＨまたはアミノ酸側鎖である。〕。
式(XXXVI)：
【化17】
などの三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、標的遺伝子発現阻害のためのＲＮＡｉ剤で使用するのに特に有用である。
【0196】
ＧａｌＮＡｃ誘導体をコンジュゲートする適当な二価および三価分岐リンカー基の例は、式II、VII、XI、ＸおよびXIIIとして上記の構造を含むが、これらに限定されない。
【0197】
ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的米国特許は、米国特許４,８２８,９７９；４,９４８,８８２；５,２１８,１０５；５,５２５,４６５；５,５４１,３１３；５,５４５,７３０；５,５５２,５３８；５,５７８,７１７、５,５８０,７３１；５,５９１,５８４；５,１０９,１２４；５,１１８,８０２；５,１３８,０４５；５,４１４,０７７；５,４８６,６０３；５,５１２,４３９；５,５７８,７１８；５,６０８,０４６；４,５８７,０４４；４,６０５,７３５；４,６６７,０２５；４,７６２,７７９；４,７８９,７３７；４,８２４,９４１；４,８３５,２６３；４,８７６,３３５；４,９０４,５８２；４,９５８,０１３；５,０８２,８３０；５,１１２,９６３；５,２１４,１３６；５,０８２,８３０；５,１１２,９６３；５,２１４,１３６；５,２４５,０２２；５,２５４,４６９；５,２５８,５０６；５,２６２,５３６；５,２７２,２５０；５,２９２,８７３；５,３１７,０９８；５,３７１,２４１、５,３９１,７２３；５,４１６,２０３、５,４５１,４６３；５,５１０,４７５；５,５１２,６６７；５,５１４,７８５；５,５６５,５５２；５,５６７,８１０；５,５７４,１４２；５,５８５,４８１；５,５８７,３７１；５,５９５,７２６；５,５９７,６９６；５,５９９,９２３；５,５９９,９２８および５,６８８,９４１；６,２９４,６６４；６,３２０,０１７；６,５７６,７５２；６,７８３,９３１；６,９００,２９７；７,０３７,６４６；８,１０６,０２２(この各々の内容全体を引用により本明細書に包含させる)を含むが、これらに限定されない。
【0198】
ある化合物の全ての位置が一律に修飾されている必要はなく、実際１を超える上記修飾が一化合物またはｉＲＮＡ内の一ヌクレオシドに組み込まれ得る。本発明はまた、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。
【0199】
VI. 本発明のｉＲＮＡの送達
本発明のｉＲＮＡの細胞、例えば、ヒト対象(例えば、接触活性化経路遺伝子発現と関連する疾患、障害または状態を有する対象などの処置を必要とする対象)内の細胞への送達は、いくつかの異なる方法により達成され得る。例えば、送達は、インビトロまたはインビボでの細胞と本発明のｉＲＮＡの接触により達成される。インビボ送達はまた対象へのｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物の投与により直接的に実施され得る。送達は、例えば、静脈内投与または皮下投与により実施され得る。ある実施態様において、ｉＲＮＡ剤は皮下投与により送達される。ある実施態様において、ｉＲＮＡ剤は、プレフィルドシリンジまたは自動注入デバイスを使用する自己投与により投与される。
本発明のｉＲＮＡの細胞、例えば、ヒト対象(例えば、接触活性化経路遺伝子発現と関連する疾患、障害または状態を有する対象などの処置を必要とする対象)内の細胞への送達は、いくつかの異なる方法により達成され得る。例えば、送達は、インビトロまたはインビボでの細胞と本発明のｉＲＮＡの接触により達成される。インビボ送達はまた対象へのｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物の投与により直接的に実施され得る。送達は、例えば、静脈内投与または皮下投与により実施され得る。ある実施態様において、ｉＲＮＡ剤は皮下投与により送達される。ある実施態様において、ｉＲＮＡ剤は、プレフィルドシリンジまたは自動注入デバイスを使用する自己投与により投与される。
【0200】
一般に、核酸分子を送達するあらゆる方法(インビトロまたはインビボ)を、本発明のｉＲＮＡでの死ようのために適合させ得る(例えば、A全体として引用により本明細書に包含させるkhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144およびＷＯ９４０２５９５参照)。インビボ送達について、ｉＲＮＡ分子送達のために考慮すべき因子は、例えば、送達分子の生物学的安定性、非特異的効果の予防および標的組織における送達分子の蓄積を含む。
【0201】
VII. 本発明の医薬組成物
本発明はまた、本発明の方法で使用するための、ここに記載するｉＲＮＡを含む医薬組成物および製剤も含む。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに記載するｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。ｉＲＮＡを含む医薬組成物は、ＴＴＲ遺伝子の発現または活性と関連する疾患または障害の処置に有用である。このような医薬組成物は、送達方法に基づき製剤化される。一例は、例えば、皮下(ＳＣ)または静脈内(IV)送達による非経腸送達を介する全身性投与のために製剤化された組成物である。本発明の医薬組成物は、ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与され得る。ある実施態様において、本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤は、薬学的に許容される担体中、皮下投与用に製剤化される。
本発明はまた、本発明の方法で使用するための、ここに記載するｉＲＮＡを含む医薬組成物および製剤も含む。ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに記載するｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。ｉＲＮＡを含む医薬組成物は、ＴＴＲ遺伝子の発現または活性と関連する疾患または障害の処置に有用である。このような医薬組成物は、送達方法に基づき製剤化される。一例は、例えば、皮下(ＳＣ)または静脈内(IV)送達による非経腸送達を介する全身性投与のために製剤化された組成物である。本発明の医薬組成物は、ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与され得る。ある実施態様において、本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤は、薬学的に許容される担体中、皮下投与用に製剤化される。
【0202】
他の実施態様において、医薬組成物の１回用量は、その後の投与が１カ月間隔、多くて１カ月、２カ月、３カ月もしくは４カ月間隔または四半期(約３カ月毎)間隔であるよう、持続性であり得る。本発明のある実施態様において、本発明の医薬組成物の１回用量は、月１回投与される。本発明の他の実施態様において、本発明の医薬組成物の１回用量は隔月に１回投与される。他の実施態様において、本発明の医薬組成物の１回用量は四半期、すなわち、約３カ月に１回投与される。他の実施態様において、本発明の医薬組成物の１回用量は４カ月に１回投与される。他の実施態様において、本発明の医薬組成物の１回用量は５カ月に１回投与される。他の実施態様において、本発明の医薬組成物の１回用量は６カ月に１回投与される。他の実施態様において、本発明の医薬組成物の１回用量は１２カ月に１回投与される。
【0203】
VIIＩ. キット
本発明はまた本発明の方法の何れかを実施するためのキットを提供する。このようなキットは、１以上の二本鎖ＲＮＡｉ剤および本発明の方法の何れかに置いて使用するための二本鎖剤の使用のための指示を提供するラベルを含む。キットは、所望によりさらに細胞とＲＮＡｉ剤を接触させる手段(例えば、注射デバイスまたは注入ポンプ)またはＴＴＲ阻害を測定する手段(例えば、ＴＴＲ ｍＲＮＡまたはＴＴＲタンパク質阻害を測定する手段)を含み得る。このようなＴＴＲ阻害を測定する手段は、対象からの、例えば、血漿サンプルなどのサンプルを得る手段を含み得る。本発明のキットは、所望によりさらにＲＮＡｉ剤を対象に投与する手段または治療有効量または予防有効量を決定する手段を含み得る。
本発明はまた本発明の方法の何れかを実施するためのキットを提供する。このようなキットは、１以上の二本鎖ＲＮＡｉ剤および本発明の方法の何れかに置いて使用するための二本鎖剤の使用のための指示を提供するラベルを含む。キットは、所望によりさらに細胞とＲＮＡｉ剤を接触させる手段(例えば、注射デバイスまたは注入ポンプ)またはＴＴＲ阻害を測定する手段(例えば、ＴＴＲ ｍＲＮＡまたはＴＴＲタンパク質阻害を測定する手段)を含み得る。このようなＴＴＲ阻害を測定する手段は、対象からの、例えば、血漿サンプルなどのサンプルを得る手段を含み得る。本発明のキットは、所望によりさらにＲＮＡｉ剤を対象に投与する手段または治療有効量または予防有効量を決定する手段を含み得る。
【0204】
ＲＮＡｉ剤は、無菌水中の溶液または再懸濁および注射のための他の適切な溶液、例えば、ＰＢＳ、生理食塩水、５mMリン酸緩衝液におけるなどの、あらゆる慣用の形態で提供され得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、水または注射用無菌水中の他の適切な溶液と共に、３００mg、２００mg、１００mgまたは５０mgバイアルとして提供され得る。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、投与のための適切な体積の添加物中３００mg、２００mg、１００mgまたは５０mgのＲＮＡｉ剤を含むプレフィルドシリンジまたは自動注入デバイスを含み、所望によりさらに使用指示を含む、自己投与用のキットで提供される。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、ほぼ同じ時間、例えば、１週間以内、１日以内、１時間以内に与えられる複数注射による用量の投与のための複数バイアルまたはデバイスで提供される。
【0205】
IX. ＴＴＲアミロイドーシス多発ニューロパチーの診断および疾患負荷の評価
ＴＴＲアミロイドーシスは、複雑な、多因子疾患である。ＴＴＲ－ＦＡＰ進行のモニターに使用される基準のリストは増え続けている：ニューロパチー機能障害スコア(ＮＩＳ)、ＮＩＳ＋７および修飾ＮＩＳ(ｍＮＩＳ)＋７およびｍＮＩＳ＋７Ｉｏｎｉｓ。これらの診断基準は当分野で周知であり、基準の主要部を下に提供する。ここで使用するＴＴＲ－ＦＡＰの診断基準を満たすは、遺伝性ＴＴＲ－ＦＡＰと関連する変異の存在を伴うまたは伴わないＦＡＰステージ１基準を満たすとして理解される。ニューロパチーの指標の進行は、補正ニューロパチー機能障害スコア(ｍＮＩＳ)＋７の少なくとも２点の増加と考える。
ＴＴＲアミロイドーシスは、複雑な、多因子疾患である。ＴＴＲ－ＦＡＰ進行のモニターに使用される基準のリストは増え続けている：ニューロパチー機能障害スコア(ＮＩＳ)、ＮＩＳ＋７および修飾ＮＩＳ(ｍＮＩＳ)＋７およびｍＮＩＳ＋７Ｉｏｎｉｓ。これらの診断基準は当分野で周知であり、基準の主要部を下に提供する。ここで使用するＴＴＲ－ＦＡＰの診断基準を満たすは、遺伝性ＴＴＲ－ＦＡＰと関連する変異の存在を伴うまたは伴わないＦＡＰステージ１基準を満たすとして理解される。ニューロパチーの指標の進行は、補正ニューロパチー機能障害スコア(ｍＮＩＳ)＋７の少なくとも２点の増加と考える。
【0206】
家族性アミロイド多発ニューロパチー(ＦＡＰ)ステージ
Coutinho et al. は、ｈＡＴＴＲ(以前は家族性アミロイドニューロパチーと称された)のニューロパチー症状の臨床的病期分類システムを開発した。スケールは、次のとおり１～３の範囲である(Ando et al. Orphanet J Rare Dis. 2013;8:31)：
ＦＡＰステージ１：補助なしで歩行、下肢に軽度ニューロパチー(感覚、自律神経および運動)。
ＦＡＰステージ２：補助ありで歩行、下肢、躯幹および上肢に中程度機能障害。
ＦＡＰステージ３：車椅子または寝たきり、重度ニューロパチー。
ニューロパチーがない対象はＦＡＰステージ０と見なされる。
Coutinho et al. は、ｈＡＴＴＲ(以前は家族性アミロイドニューロパチーと称された)のニューロパチー症状の臨床的病期分類システムを開発した。スケールは、次のとおり１～３の範囲である(Ando et al. Orphanet J Rare Dis. 2013;8:31)：
ＦＡＰステージ１：補助なしで歩行、下肢に軽度ニューロパチー(感覚、自律神経および運動)。
ＦＡＰステージ２：補助ありで歩行、下肢、躯幹および上肢に中程度機能障害。
ＦＡＰステージ３：車椅子または寝たきり、重度ニューロパチー。
ニューロパチーがない対象はＦＡＰステージ０と見なされる。
【0207】
ニューロパチー機能障害スコアリング方法
ニューロパチーを評価する方法は、当分野で知られる。例えば、Mayo Clinic Neurologic Examination Sheetおよびまたニューロパチー機能障害スコア(ＮＩＳ)の脱力サブスコアにおいて、脱力(ＮＩＳ－Ｗ)は、１～４点の２５％減少で、体の各側の主要筋肉群と別に採点される(Dyck et al., Quantitating overall neuropathic symptoms, impairments, and outcomes. In: Dyck PJ, Thomas PK, editors. Peripheral neuropathy. 4th ed. Philadelphia: Elsevier; 2005. p. 1031-52)。特に頭側、近位および遠位肢筋肉の広範な群が、ＮＩＳ－Ｗで最高スコア１９２点で採点される。主要５筋肉の伸展反射減少は、通常神経科医により評価され、触圧、振動、関節動作および足および手の針刺し感覚は、Mayo Clinic Neurology Examination Sheetで２５％減少および１～４で採点される。反射(ＮＩＳ－Ｒ)および感覚(ＮＩＳ－Ｓ)の完全ＮＩＳのために、Mayo Clinic記録スコアを、ＮＩＳ点スコアに変換する(すなわち、１または２のMayo Clinicスコアは、ＮＩＳ点スコア１であり、３または４のMayo ClinicスコアはＮＩＳスコア２である)。それ故に、神経科医により評価される通常の反射の最高ＮＩＳスコア(ＮＩＳ－Ｒ)は、５×２×２＝２０点であり、神経科医によりしばしば評価される感覚の４モダリティの最高スコア(ＮＩＳ－Ｓ)は８×２×２＝３２点である。それ故に、最高のＮＩＳスコアは、１９２＋２０＋３２＝２４４点である。ＮＩＳは、先の刊行物に記載されている(Dyck et al. 2005 and Dyck et al., Neurol. 1997;49:229-39)。
ニューロパチーを評価する方法は、当分野で知られる。例えば、Mayo Clinic Neurologic Examination Sheetおよびまたニューロパチー機能障害スコア(ＮＩＳ)の脱力サブスコアにおいて、脱力(ＮＩＳ－Ｗ)は、１～４点の２５％減少で、体の各側の主要筋肉群と別に採点される(Dyck et al., Quantitating overall neuropathic symptoms, impairments, and outcomes. In: Dyck PJ, Thomas PK, editors. Peripheral neuropathy. 4th ed. Philadelphia: Elsevier; 2005. p. 1031-52)。特に頭側、近位および遠位肢筋肉の広範な群が、ＮＩＳ－Ｗで最高スコア１９２点で採点される。主要５筋肉の伸展反射減少は、通常神経科医により評価され、触圧、振動、関節動作および足および手の針刺し感覚は、Mayo Clinic Neurology Examination Sheetで２５％減少および１～４で採点される。反射(ＮＩＳ－Ｒ)および感覚(ＮＩＳ－Ｓ)の完全ＮＩＳのために、Mayo Clinic記録スコアを、ＮＩＳ点スコアに変換する(すなわち、１または２のMayo Clinicスコアは、ＮＩＳ点スコア１であり、３または４のMayo ClinicスコアはＮＩＳスコア２である)。それ故に、神経科医により評価される通常の反射の最高ＮＩＳスコア(ＮＩＳ－Ｒ)は、５×２×２＝２０点であり、神経科医によりしばしば評価される感覚の４モダリティの最高スコア(ＮＩＳ－Ｓ)は８×２×２＝３２点である。それ故に、最高のＮＩＳスコアは、１９２＋２０＋３２＝２４４点である。ＮＩＳは、先の刊行物に記載されている(Dyck et al. 2005 and Dyck et al., Neurol. 1997;49:229-39)。
【0208】
ＮＩＳ＋７は、糖尿病性感覚運動多発ニューロパチー、ＴＴＲ ＦＡＰおよび他の全般的感覚運動多発神経障害の治験で、一次または共主要評価項目尺度として使用されている(N. Suanprasert et al. J Neurol Sci 344 (2014) 121-128)。ＮＩＳ＋７は、反射の最小限の天井効果のみを伴い、筋脱力および筋伸張反射異常の段階的重症度を適切に評価する。ＮＩＳ＋７において、７個の検査中５個が神経状態の性状である － 正規偏差(Ζスコア)または点として表わされる。ＮＩＳ＋７に含まれる性状は、異常が敏感に糖尿病性感覚運動多発ニューロパチーを検出するために選択された(Dyck et al. Muscle Nerve 2003;27(2):202-10)。含まれる性状は、腓骨神経複合活動電位(ＣＭＡＰ)振幅、運動神経伝導速度(ＭＮＣＶ)および運動神経遠位潜時(ＭＮＤＬ)、脛骨ＭＮＤＬおよび腓腹感覚神経活動電位(ＳＮＡＰ)振幅である。それらの測定値を、大健常対象対照コホートの先の試験に基づき、年齢、性別、身長または体重の適応可能な変数を補正して、パーセンタイル値から正規偏差に変換できる。さらに、これらのパーセンタイル値は、得られたパーセンタイル値からＮＩＳ点として表し得る(すなわち、Ｎ５ｔｈ＝０点；≦５ｔｈ－Ｎ １ｓｔ＝１点および≦１ｓｔ＝２点(および同様に異常が正常分布の上側にあるとき)。
【0209】
脱力および反射異常の評価、感覚喪失の評価、自律神経性機能不全および神経生理学的検査異常は、ＴＴＲ ＦＡＰの治験で使用するためのＮＩＳ＋７で適切に評価されないＮＩＳ＋７において、感覚喪失は最適に評価されない：１)感覚喪失の身体分布は適切に考慮されない、２)小線維感覚喪失と比較して、大線維感覚喪失が過度に強調されるおよび３)改善された検査方法および対照値との比較が、臨床的評価のために好ましい。また、自律神経性機能不全は、深呼吸時心拍(ＨＲｄｂ)のみの使用により、適切に評価されない。ＮＩＳ＋７の評価に使用される神経伝導の性状は、ＴＴＲ ＦＡＰの試験に理想的ではない。
【0210】
補正ニューロパチー機能障害スコア＋７(ｍＮＩＳ＋７)およびＮＩＳ＋７のアップデート版は、運動強度、反射、感覚、神経伝導および自律神経性機能を測定する複合スコアである。この複合尺度の２バージョンが、多発ニューロパチーを伴うｈＡＴＴＲアミロイドーシスを良好に反映するようＮＩＳ＋７から適合され、イノテルセンおよびパチシラン臨床試験の主要評価項目として使用されている。これら２バージョンと他のニューロパチースコアリング系の間の重要な差異を下表に要約する(Adams et al., BMC Neurology, volume 17, Article number: 181 (2017)から)。両スケールで、スコアが低いほど、神経性機能が良好であることを示す(例えばスコアの増加は、神経性機能障害の悪化を反映する)。
【0211】
ニューロパチー機能障害スコア基準
【表1】
【0212】
ＴＴＲアミロイドーシス心筋症(ＡＴＴＲ－ＣＭ)の診断および疾患負荷の評価
ｈＡＴＴＲアミロイドーシスおよび心筋症を有する患者は、典型的に心不全(ＨＦ)および心臓不整脈の症状進行を経験し、典型的に診断後２.５～５年で死亡する。ＴＴＲアミロイド原線維による細胞外マトリクスの心臓浸潤は、拡張期機能障害に至る、心室壁厚の進行性増加および心室硬度の顕著な増加に至る。収縮期機能もまた障害され、典型的に、疾患後期まで維持される正常駆出率にも関わらず異常長軸方向ストレインにより反映される。ＡＴＴＲアミロイドーシスおよび軽鎖(ＡＬ)心アミロイドーシスの患者において、長軸方向ストレインおよび脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端プロホルモン(ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ)の両方が、生存の独立予測因子であることが示されている。
ｈＡＴＴＲアミロイドーシスおよび心筋症を有する患者は、典型的に心不全(ＨＦ)および心臓不整脈の症状進行を経験し、典型的に診断後２.５～５年で死亡する。ＴＴＲアミロイド原線維による細胞外マトリクスの心臓浸潤は、拡張期機能障害に至る、心室壁厚の進行性増加および心室硬度の顕著な増加に至る。収縮期機能もまた障害され、典型的に、疾患後期まで維持される正常駆出率にも関わらず異常長軸方向ストレインにより反映される。ＡＴＴＲアミロイドーシスおよび軽鎖(ＡＬ)心アミロイドーシスの患者において、長軸方向ストレインおよび脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端プロホルモン(ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ)の両方が、生存の独立予測因子であることが示されている。
【0213】
心エコー検査は、心臓構造および機能の評価のために日常的に使用されている；統計解析計画書で予め特定されているパラメータは、平均左室心(ＬＶ)壁厚、ＬＶ質量、長軸方向ストレインおよび駆出率を含む。心拍出量、左心房サイズ、ＬＶ末端－拡張期体積(ＬＶＥＤＶ)およびＬＶ末端－収縮期体積(ＬＶＥＳＶ)。心エコー図は、心臓造影のために日常的に使用される。心筋ストレインは、一つのベンダーに限らないソフトウェア(TOMTEC, Munich, Germany)を使用するスペックルトラッキングで評価され得る。ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰおよびトロポニンＩレベルの分析は、例えば、ケミルミネセンスアッセイを使用する、市販の診断検査を使用して、臨床検査で日常的に実施される(ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰについてRoche Diagnostic Cobas, Indianapolis, IN, USA;およびトロポニンＩについてSiemens Centaur XP, Camberley, Surrey, UK)。同様に、臨床的習慣は、日常的に、クレアチニンレベルの測定値および例えば、腎疾患での食事の改良試験式を使用する、クレアチニンレベルに基づく推定糸球体濾過速度(ｅＧＦＲ)を含む。
【0214】
ＡＴＴＲ－ＣＭの存在を示唆する「警告」一覧を含む診断方法および、心エコー検査、心電図記録法、心臓磁気共鳴、下肢から始まり、上向性パターンが続く両側性感覚運動多発ニューロパチー、起立性低血圧、下痢／便秘および勃起不全の形の自律神経障害および緑内障、硝子体内沈着およびスカラップ状瞳孔などの眼合併症；手根管症候群、特に両側性手根管症候群、腰部脊髄狭窄および二頭筋腱断裂を含む、心機能不全を伴う末梢または自律神経系が関与する全身性症状の存在を含むスクリーニング方法の情報を提供する、ＡＴＴＲ－ＣＭのスクリーニングおよび診断方法を提供するレビューが最近Witteles et al., 2019 (JACC: Heart Failure, 2019. 7:709-716)により公開された。他の診断方法は、未知の理由によりＴＴＲ心臓アミロイド沈着に局在化するテクネチウム(Ｔｃ)標識ビスホスホネートでの骨シンチグラフィーを含む。生検も心臓におけるＴＴＲアミロイドーシスの存在の確認に使用される。
【0215】
上に提供する心機能パラメータの評価および分類の方法は、当分野で知られる。ここで使用する心機能の評価または分類の特定の方法は、標準治療が医学的介入、例えば、薬剤投与、手術を含むように、十分に低下した心機能を示すために、臨床的に許容される標準のいずれでもよい。
【0216】
神経損傷およびＴＴＲアミロイドーシス進行の指標としての血清バイオマーカー
上記診断およびモニタリング方法は複雑であり、しばしば主観的である。さらに、ＴＴＲアミロイドーシスが稀であり、上記徴候および症状がいくつかの他の疾患で存在し得るため、臨床的に検証された、非侵襲性血漿バイオマーカーは、早期診断を促し、疾患進行のモニタリングを助け得る。Ticau et al., 2019(www.medrxiv.org/content/10.1101/19011155v2.full.pdf参照)による試験において、１０００を超えるタンパク質の血漿レベルがフェーズ３ ＡＰＯＬＬＯ試験(ＮＣＴ０１９６０３４８)でプラセボまたはパチシランを投与された多発ニューロパチーを伴うｈＡＴＴＲアミロイドーシスを有する患者および健常個体のコホートで測定された。各タンパク質の時間プロファイルでのＴＴＲの肝臓発現を阻害する脂質製剤化ＲＮＡｉ剤パチシランでの処置の影響を、０カ月、９カ月および１８カ月に線形混合型モデルにより決定した。神経フィラメント軽鎖(ＮｆＬ)タンパク質を、直交定量的アプローチを使用してさらに評価した。プラセボに対して、パチシランで６６タンパク質のレベルの顕著な変化が観察され、ニューロン損傷マーカーであるＮｆＬの変化が最も顕著であった。タンパク質レベルの変化の分析は、１８カ月目、パチシラン処置患者の健常個体に向かう傾向の促進を示した。健常対照の血漿ＮｆＬレベルは、多発ニューロパチーを伴うＴＴＲアミロイドーシスを有する患者より４倍低かった(１６.３[ＳＤ １２.０]pg／mL対６９.４[ＳＤ ４２.１]pg／mL、ｐ＜１０－１６)。１８カ月目のＮｆＬレベルはプラセボで増加し(９９.５[ＳＤ ６０.１]pg／mL)、パチシラン処置で減少した(４８.８[ＳＤ ２９.９]pg／mL)。１８カ月目、パチシラン処置患者における補正ニューロパチー機能障害スコア＋７(ｍＮＩＳ＋７)の改善は、ＮｆＬレベルの減少と有意に相関した(Ｒ＝０.４３、ｐ＜１０－７)。パチシラン処置でのｍＮＩＳ＋７改善と相関するＮｆＬ減少は、ＴＴＲアミロイドーシスにおける神経損傷および多発ニューロパチーのバイオマーカーとして役立ち得ることを示唆する。このバイオマーカーは、ｈＡＴＴＲアミロイドーシスを有する患者における多発ニューロパチーの早期診断を可能とし、疾患進行のモニタリングを促進する可能性がある。
上記診断およびモニタリング方法は複雑であり、しばしば主観的である。さらに、ＴＴＲアミロイドーシスが稀であり、上記徴候および症状がいくつかの他の疾患で存在し得るため、臨床的に検証された、非侵襲性血漿バイオマーカーは、早期診断を促し、疾患進行のモニタリングを助け得る。Ticau et al., 2019(www.medrxiv.org/content/10.1101/19011155v2.full.pdf参照)による試験において、１０００を超えるタンパク質の血漿レベルがフェーズ３ ＡＰＯＬＬＯ試験(ＮＣＴ０１９６０３４８)でプラセボまたはパチシランを投与された多発ニューロパチーを伴うｈＡＴＴＲアミロイドーシスを有する患者および健常個体のコホートで測定された。各タンパク質の時間プロファイルでのＴＴＲの肝臓発現を阻害する脂質製剤化ＲＮＡｉ剤パチシランでの処置の影響を、０カ月、９カ月および１８カ月に線形混合型モデルにより決定した。神経フィラメント軽鎖(ＮｆＬ)タンパク質を、直交定量的アプローチを使用してさらに評価した。プラセボに対して、パチシランで６６タンパク質のレベルの顕著な変化が観察され、ニューロン損傷マーカーであるＮｆＬの変化が最も顕著であった。タンパク質レベルの変化の分析は、１８カ月目、パチシラン処置患者の健常個体に向かう傾向の促進を示した。健常対照の血漿ＮｆＬレベルは、多発ニューロパチーを伴うＴＴＲアミロイドーシスを有する患者より４倍低かった(１６.３[ＳＤ １２.０]pg／mL対６９.４[ＳＤ ４２.１]pg／mL、ｐ＜１０－１６)。１８カ月目のＮｆＬレベルはプラセボで増加し(９９.５[ＳＤ ６０.１]pg／mL)、パチシラン処置で減少した(４８.８[ＳＤ ２９.９]pg／mL)。１８カ月目、パチシラン処置患者における補正ニューロパチー機能障害スコア＋７(ｍＮＩＳ＋７)の改善は、ＮｆＬレベルの減少と有意に相関した(Ｒ＝０.４３、ｐ＜１０－７)。パチシラン処置でのｍＮＩＳ＋７改善と相関するＮｆＬ減少は、ＴＴＲアミロイドーシスにおける神経損傷および多発ニューロパチーのバイオマーカーとして役立ち得ることを示唆する。このバイオマーカーは、ｈＡＴＴＲアミロイドーシスを有する患者における多発ニューロパチーの早期診断を可能とし、疾患進行のモニタリングを促進する可能性がある。
【0217】
他のタンパク質、特にＲＳＰＯ３、ＣＣＤＣ８０、ＥＤＡ２ＲおよびＮＴ－ｐｒｏＢＮＰのレベルの減少がｍＮＩＳ＋７改善と相関することが判明し、単独または互いにまたはＮｆｌとの組み合わせで、ＡＴＴＲアミロイドーシスにおける神経損傷および多発ニューロパチーのバイオマーカーとして役立ち得ることが示唆される。Ｎ－ＣＤａｓｅレベルの増加がｍＮＩＳ＋７改善と相関することが判明し、単独でまたは上に挙げた他のマーカーとの組み合わせで、ＡＴＴＲアミロイドーシスにおける神経損傷および多発ニューロパチーのバイオマーカーとして役立ち得ることが示唆される。
【0218】
パチシラン処置に応答して変化が観察された、さらに可能性のあるバイオマーカーを、下表に挙げる。対象の正のベータ係数を有するタンパク質レベルが対照レベルに比して増加するとき、ＡＴＴＲアミロイドーシスの進行の指標であり、対象の負のベータ係数を有するタンパク質レベルが対照レベルに比して減少するとき、ＡＴＴＲアミロイドーシスの進行の指標である。これらマーカーの１以上のレベルの変化は、ＡＴＴＲアミロイドーシスにおける進行中の神経損傷および多発ニューロパチーの進行の改善、安定化または減少の指標であり得る。
【0219】
【表2】
【0220】
本発明を、限定的と解釈してはならない次の実施例により、さらに説明する。本出願をとおして引用する全ての引用文献ならびに公開特許および特許出願ならびに配列表を、引用により本明細書に包含させる。
【実施例】
【0221】
本発明の方法で使用するための二本鎖ＲＮＡｉ剤の例を、下表３に示す。下表２は、核酸配列描記で使用されるヌクレオチド単量体およびリガンドの略語との対照を提供する。これらの単量体は、オリゴヌクレオチドに存在するとき、特に断らない限り、５’－３’－ホスホジエステル結合で互いに結合していることは理解される。
【0222】
【表3】
【0223】
【表4】
【0224】
実施例１：Ｖ３０ＭトランスジェニックマウスにおけるＲＮＡｉ剤によるＴＴＲタンパク質ノックダウン
Ｖ３０Ｍ変異は、ヒトＴＴＲで共通のアミロイド形成的変異である。マウスＴＴＲを欠き、Ｖ３０Ｍ変異を有するヒトＴＴＲを発現するトランスジェニックマウスを試験に使用した。マウス(ｎ＝３／群)に、先にＷＯ２０１８１１２３２０に開示されたＲＮＡｉ剤ＡＤ－６５４９２またはＡＤ－６５４９２の配列および化学に基づき、上の表２に示すとおり、アンチセンス鎖の一か所の化学修飾をＧＮＡ修飾に変化させた他のＲＮＡｉ剤の単回皮下１mg／kg用量を投与した。血液サンプルを０日目(投与前)、３日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目、３５日目および４９日目に採取した。血清を得て、ヒトＴＴＲレベルをＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した(例えば、Coelho, et al. (2013) N Engl J Med 369:819参照)。０日目と比較した相対的ＴＴＲレベルを図１に示す。
アンチセンス鎖の７位または８位へのＧＮＡの取り込みは、忍容性が良好であった(ＡＤ－８７４０４およびＡＤ－８７４０５)。反応動態および最高タンパク質ノックダウンは、親ＲＮＡｉ剤ＡＤ－６５４９２に類似した。ＡＤ－８７４０４によるノックダウンの持続性はＡＤ－６５４９２に類似した。アンチセンス鎖の３～６位へのＧＮＡ取り込みは、忍容性が良好ではなかった。
Ｖ３０Ｍ変異は、ヒトＴＴＲで共通のアミロイド形成的変異である。マウスＴＴＲを欠き、Ｖ３０Ｍ変異を有するヒトＴＴＲを発現するトランスジェニックマウスを試験に使用した。マウス(ｎ＝３／群)に、先にＷＯ２０１８１１２３２０に開示されたＲＮＡｉ剤ＡＤ－６５４９２またはＡＤ－６５４９２の配列および化学に基づき、上の表２に示すとおり、アンチセンス鎖の一か所の化学修飾をＧＮＡ修飾に変化させた他のＲＮＡｉ剤の単回皮下１mg／kg用量を投与した。血液サンプルを０日目(投与前)、３日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目、３５日目および４９日目に採取した。血清を得て、ヒトＴＴＲレベルをＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した(例えば、Coelho, et al. (2013) N Engl J Med 369:819参照)。０日目と比較した相対的ＴＴＲレベルを図１に示す。
アンチセンス鎖の７位または８位へのＧＮＡの取り込みは、忍容性が良好であった(ＡＤ－８７４０４およびＡＤ－８７４０５)。反応動態および最高タンパク質ノックダウンは、親ＲＮＡｉ剤ＡＤ－６５４９２に類似した。ＡＤ－８７４０４によるノックダウンの持続性はＡＤ－６５４９２に類似した。アンチセンス鎖の３～６位へのＧＮＡ取り込みは、忍容性が良好ではなかった。
【0225】
実施例２：非ヒト霊長類におけるＲＮＡｉ剤によるＴＴＲタンパク質ノックダウン
表２におけるｉＲＮＡ剤の配列は、カニクイザルＴＴＲと完全交差反応性であった。ＡＤ－６５４９２(１mg／kg)またはＡＤ－８７４０４(１mg／kgまたは３mg／kg)の単回皮下用量を、３回の別々の試験で０日目にカニクイザル(ｎ＝３／群)に投与した。血液サンプルを、図２に示すとおり、前もって－７日目(投与７日目前)から１１９日目まで採取した。血清を得て、カニクイザルＴＴＲレベルをＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した(例えば、Coelho, et al. (2013) N Engl J Med 369:819参照)。０日目と比較した相対的ＴＴＲレベルを図２に示す。ＴＴＲノックダウンは、１mg／kgのＡＤ－６５４９２および３mg／kgのＡＤ－８７４０４を投与したサルで類似した。
表２におけるｉＲＮＡ剤の配列は、カニクイザルＴＴＲと完全交差反応性であった。ＡＤ－６５４９２(１mg／kg)またはＡＤ－８７４０４(１mg／kgまたは３mg／kg)の単回皮下用量を、３回の別々の試験で０日目にカニクイザル(ｎ＝３／群)に投与した。血液サンプルを、図２に示すとおり、前もって－７日目(投与７日目前)から１１９日目まで採取した。血清を得て、カニクイザルＴＴＲレベルをＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した(例えば、Coelho, et al. (2013) N Engl J Med 369:819参照)。０日目と比較した相対的ＴＴＲレベルを図２に示す。ＴＴＲノックダウンは、１mg／kgのＡＤ－６５４９２および３mg／kgのＡＤ－８７４０４を投与したサルで類似した。
【0226】
実施例３：健常ヒト対象へのＡＤ－８７４０４の単回用量の投与
フェーズＩ、無作為化、二重盲検、プラセボ対照試験において、ＡＤ－８７４０４(センス：5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(配列番号６)、ここで、Ｌ９６リガンドがセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしている)；アンチセンス：5’-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3’(配列番号７))を、健常ヒトボランティアに、２５mg、７５mg、１００mg、２００mgまたは４００mgの単回用量で、可能であれば６００mg、７００mg、９００mgおよび１０００mgの用量群と共に投与する。関連する人口統計特性、例えば、年齢、性別、体重を群間でバランスをとる。
人口統計的に適合した対照対象も、プラセボを単回用量投与する。
血漿サンプルを集め、プラセボ群の対象および全処置群の対象からのサンプルにおけるＴＴＲタンパク質レベルを、予定した間隔、例えば、１日目、２日目、３日目、８日目、１５日目、２２日目、２９日目、４３日目、５７日目、９０日目、次いで、活性処置群対象について、ＴＴＲレベルが処置前レベルの８０％に回復するまで２８日毎(最大投与後約１年まで)、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定する(例えば、Coelho, et al. (2013) N Engl J Med 369:819)。ノックダウンのレベルおよび期間を決定する。
ＡＤ－８７４０４群および対照群両者の対象を、有害事象についてもモニターする。試験でモニターされる有害事象の例は、注射部位紅斑、注射部位疼痛、掻痒、咳嗽、悪心、疲労および腹痛ならびに身体所見、ＥＣＧ、バイタルサインまたは臨床検査パラメータ、例えば、腎機能、血液学的パラメータおよび肝機能(例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ)、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ(ＡＳＴ))における臨床的に有意な変化を含むが、これらに限定されない。
この試験の結果は、ＡＤ－８７４０４の単一皮下用量が、用量依存的様式でＴＴＲタンパク質レベルを強力かつ持続性にノックダウンすることを示す。
複数用量試験および複数上向性用量試験も、血清におけるＴＴＲタンパク質ノックダウンおよび有害事象のモニタリングと共に実行される。
フェーズＩ、無作為化、二重盲検、プラセボ対照試験において、ＡＤ－８７４０４(センス：5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(配列番号６)、ここで、Ｌ９６リガンドがセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしている)；アンチセンス：5’-usCfsuugGf(Tgn)uAfcaugAfaAfucccasusc-3’(配列番号７))を、健常ヒトボランティアに、２５mg、７５mg、１００mg、２００mgまたは４００mgの単回用量で、可能であれば６００mg、７００mg、９００mgおよび１０００mgの用量群と共に投与する。関連する人口統計特性、例えば、年齢、性別、体重を群間でバランスをとる。
人口統計的に適合した対照対象も、プラセボを単回用量投与する。
血漿サンプルを集め、プラセボ群の対象および全処置群の対象からのサンプルにおけるＴＴＲタンパク質レベルを、予定した間隔、例えば、１日目、２日目、３日目、８日目、１５日目、２２日目、２９日目、４３日目、５７日目、９０日目、次いで、活性処置群対象について、ＴＴＲレベルが処置前レベルの８０％に回復するまで２８日毎(最大投与後約１年まで)、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定する(例えば、Coelho, et al. (2013) N Engl J Med 369:819)。ノックダウンのレベルおよび期間を決定する。
ＡＤ－８７４０４群および対照群両者の対象を、有害事象についてもモニターする。試験でモニターされる有害事象の例は、注射部位紅斑、注射部位疼痛、掻痒、咳嗽、悪心、疲労および腹痛ならびに身体所見、ＥＣＧ、バイタルサインまたは臨床検査パラメータ、例えば、腎機能、血液学的パラメータおよび肝機能(例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ)、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ(ＡＳＴ))における臨床的に有意な変化を含むが、これらに限定されない。
この試験の結果は、ＡＤ－８７４０４の単一皮下用量が、用量依存的様式でＴＴＲタンパク質レベルを強力かつ持続性にノックダウンすることを示す。
複数用量試験および複数上向性用量試験も、血清におけるＴＴＲタンパク質ノックダウンおよび有害事象のモニタリングと共に実行される。
【0227】
均等物：
当業者は、ここに記載する特定の実施態様および方法の多くの均等物を認識するかまたは日常的操作を超えない実験を使用して確認できる。このような均等物は、次の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
当業者は、ここに記載する特定の実施態様および方法の多くの均等物を認識するかまたは日常的操作を超えない実験を使用して確認できる。このような均等物は、次の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】