特表 2023-516774 筋萎縮性側索硬化症の治療のための低用量ヒトインターロイキン－２

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-20

(54)【発明の名称】筋萎縮性側索硬化症の治療のための低用量ヒトインターロイキン－２

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/20 20060101AFI20230413BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230413BHJP

   A61K 31/428 20060101ALI20230413BHJP

【ＦＩ】

A61K38/20

A61P21/00

A61K31/428

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022553666

(86)(22)【出願日】2021-03-05

(85)【翻訳文提出日】2022-11-02

(86)【国際出願番号】 EP2021055570

(87)【国際公開番号】W WO2021176044

(87)【国際公開日】2021-09-10

(31)【優先権主張番号】20305241.0

(32)【優先日】2020-03-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522351918

【氏名又は名称】サントル、オスピタリエ、ユニヴェルシテール、ド、ニーム

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＨＯＳＰＩＴＡＬＩＥＲ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥ ＤＥ ＮＩＭＥＳ

(71)【出願人】

【識別番号】522351929

【氏名又は名称】ウマニタス、ミラソーレ、ソチエタ、ペル、アツィオーニ

【氏名又は名称原語表記】ＨＵＭＡＮＩＴＡＳ ＭＩＲＡＳＯＬＥ ＳＰＡ

(71)【出願人】

【識別番号】504324671

【氏名又は名称】ジ・ユニバーシティ・オブ・サセックス

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＳＵＳＳＥＸ

(71)【出願人】

【識別番号】500545366

【氏名又は名称】キングス カレッジ ロンドン

【住所又は居所原語表記】Ｓｔｒａｎｄ， Ｌｏｎｄｏｎ ＷＣ２Ｒ ２ＬＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ

(71)【出願人】

【識別番号】515200272

【氏名又は名称】クイーン メアリー ユニバーシティ オブ ロンドン

(71)【出願人】

【識別番号】518059934

【氏名又は名称】ソルボンヌ・ユニヴェルシテ

【氏名又は名称原語表記】ＳＯＲＢＯＮＮＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ

(71)【出願人】

【識別番号】591140123

【氏名又は名称】アシスタンス ピュブリク－オピトー ドゥ パリ

【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ － ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＰＡＲＩＳ

(71)【出願人】

【識別番号】509129129

【氏名又は名称】ザ、ユニバーシティー、オブ、シェフィールド

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＳＨＥＦＦＩＬＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】110003421

【氏名又は名称】弁理士法人フィールズ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ギルバート、ベンシモン

(72)【発明者】

【氏名】ピーター、ナイジェル、リー

(72)【発明者】

【氏名】ティモシー、トゥリー

(72)【発明者】

【氏名】チェチーリア、ガルレンダ

(72)【発明者】

【氏名】マッシモ、ロカティ

(72)【発明者】

【氏名】ジャニーン、カービー

(72)【発明者】

【氏名】パメラ、ショー

(72)【発明者】

【氏名】アンドレア、マラスピナ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084BA44

4C084CA53

4C084DA14

4C084MA02

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA941

4C084ZA942

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC84

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA52

4C086NA05

4C086ZA94

(57)【要約】

本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の分野にあり、ヒト対象において筋萎縮性側索硬化症の治療に使用するためのヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）に関し、その対象に投与されるヒトＩＬ－２の各用量は、０．１×１０^６～３×１０^６国際単位（ＩＵ）である。ヒトＩＬ－２は、好ましくは、０．１×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２の３～７日の１日１回皮下投与のサイクルで投与される。この治療は、好ましくは、リルゾール治療下にもある対象への制御性Ｔ細胞の投与を含まない。投与されるヒトＩＬ－２は、好ましくは、抗ｈＩＬ－２抗体と複合体を形成せず、この治療はまた好ましくは、対象へのラパマイシンもエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の他のいずれの抑制剤の投与も含まない。この治療は、血漿ＣＣＬ２濃度を低下させ、血中マクロファージの分極をＭ１炎症性表現型から組織修復に関与する抗炎症性Ｍ２表現型に変化させることを可能にする。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト対象において筋萎縮性側索硬化症の治療に使用するためのヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）であって、前記対象に投与されるヒトＩＬ－２の各用量は０．１×１０^６～３×１０^６国際単位（ＩＵ）であり、前記治療が前記対象への制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の投与を含まない、ヒトＩＬ－２。

【請求項2】

ヒトＩＬ－２が０．１×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２の反復注射として投与される、請求項１に記載の使用のためのヒトＩＬ－２。

【請求項3】

０．１×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２の連続３～７日の１日１回皮下注射の反復サイクルが前記対象に投与され、好ましくは、各サイクルは０．１×１０^６～３×１０^６ＩＵのＩＬ－２、より好ましくは１×１０^６～３×１０^６ＩＵのＩＬ－２、最も好ましくは２×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２の連続５日の１日１回皮下投与からなる、請求項２に記載の使用のためのヒトＩＬ－２。

【請求項4】

前記サイクルが２～６週間毎、好ましくは２～５週間毎、より好ましくは２～４週間毎、特に２、３または４週間毎に投与される、請求項３に記載の使用のためのヒトＩＬ－２。

【請求項5】

メトロノームスケジュールに従って連続的に投与される、請求項２に記載の使用のためのヒトＩＬ－２。

【請求項6】

前記治療が前記対象の生涯にわたって、または許容できない薬物関連の重大な有害事象まで投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のためのヒトＩＬ－２。

【請求項7】

ヒトＩＬ－２が皮下または静脈内経路、好ましくは皮下経路により投与される、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のためのヒトＩＬ－２。

【請求項8】

前記患者に投与されるヒトＩＬ－２が抗ヒトＩＬ－２抗体と複合体を形成しない、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のためのヒトＩＬ－２。

【請求項9】

前記治療が前記対象へのラパマイシンもエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の他のいずの抑制剤の投与も含まない、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のためのヒトＩＬ－２。

【請求項10】

前記治療が前記対象にリルゾールを投与することをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のためのヒトＩＬ－２。

【請求項11】

リルゾールが５０ｍｇ～１００ｍｇの１日用量で経口投与され、約１２時間間隔で２５ｍｇ～５０ｍｇの２回の等用量で摂取される、請求項１０に記載の使用のためのヒトＩＬ－２。

【請求項12】

前記ヒトＩＬ－２が組換え型のヒトＩＬ－２、好ましくは、アルデスロイキンである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用のためのヒトＩＬ－２。

【請求項13】

前記治療が
ａ）Ｔｒｅｇ数の増加およびＴｒｅｇ免疫抑制機能の改善；
ｂ）ＣＣＬ２血漿、血清または脳脊髄液（ＣＳＦ）濃度の減少；
ｃ）血中または中枢神経系（ＣＮＳ）における単球分極の、好ましくはＣＣＬ１７および／またはＣＣＬ１８血漿または血清またはＣＳＦ濃度の増加を証拠とする修復機能に関連したＭ２表現型への移行、および／または
ｄ）生存の増大および機能低下速度の低下
を誘導する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の使用のためのヒトＩＬ－２。

【請求項14】

前記治療が
ａ）前記対象の生物学的サンプルからのベースライン（すなわち、低用量ヒトＩＬ－２治療の開始日）において、
ｉ）Ｔｒｅｇの数または頻度（血中）および／またはＴｒｅｇの免疫抑制機能、
ｉｉ）ＣＣＬ２の血清または血漿またはＣＳＦ濃度、および／または
ｉｉｉ）ＣＣＬ１７および／またはＣＣＬ１８の血清、血漿またはＣＳＦ濃度
を測定すること、
ｂ）ヒトＩＬ－２投与の反復分離サイクルまたは連続的メトロノームヒトＩＬ－２投与を含む、本発明による第１の投与スキームに従って前記対象にヒトＩＬ－２を投与すること、
ｃ）薬物関連有害事象を監視し、治療サイクル終了の１～３日後または連続的メトロノームヒトＩＬ－２投与の少なくとも７日後に採取した対象の生物学的サンプルからのベースライン時と同じパラメーターを測定すること、ならびに
ｄ）結果が許容できる場合には第１の投与スキームを継続すること、または工程ｃ）の結果に応じて第２の投与スキームを計画すること
を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の使用のためのヒトＩＬ－２。

【請求項15】

工程ａ）がＣＣＬ２の血清または血漿またはＣＳＦ濃度、好ましくは、ＣＣＬ２の血清または血漿濃度を測定することを含む、請求項１４に記載の使用のためのヒトＩＬ－２。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の属する技術分野
本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の分野にある。本発明は、ヒト対象において筋萎縮性側索硬化症の治療に使用するためのヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）に関し、その対象に投与されるヒトＩＬ－２の各用量は、０．１×１０^６～３×１０^６国際単位（ＩＵ）である。ヒトＩＬ－２は、好ましくは、０．１×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２の皮下注射として投与される。この治療は、好ましくは、リルゾール治療下にもある対象への制御性Ｔ細胞の投与を含まない。投与されるヒトＩＬ－２は、好ましくは、抗ｈＩＬ－２抗体と複合体を形成せず、この治療は好ましくはまた、対象へのラパマイシンまたはエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の他のいずれの抑制剤の投与を含まない。ＡＬＳ対象における低用量ＩＬ２治療は、（ｉ）Ｔｅｆｆよりも制御性Ｔ細胞抑制的制御を増大させること、（ｉｉ）血漿ＣＣＬ２濃度を低下させること、（ｉｉｉ）血中マクロファージの分極をＭ１炎症性表現型から組織修復に関与する抗炎症性Ｍ２表現型へ変化させること、および（ｉｖ）全体的なＡＬＳ関連の細胞変性活性を低下させることを可能とする。

【背景技術】

【0002】

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、致命的な神経筋疾患であり、容赦なく進行する衰弱、筋肉の消耗、および運動機能の喪失を臨床的特徴とする。２０年前にリルゾールが導入されたにもかかわらず(Bensimon G et al N Engl J Med 1994; 330: 585-91)、その後の治験では、より効果的な疾患修飾療法を提供できなかった。

【0003】

ＡＬＳにおける多くの創薬の失敗は、主にＡＬＳが複雑な疾患であり、検証済みの予測動物モデルがないという事実に関連している。特に、トランスジェニック変異体ＳＯＤ１（ｍＳＯＤ１）マウスがＡＬＳ動物モデルとしてよく使用されるが、このモデルで得られた肯定的な結果は全て、ＡＬＳのヒト対象に対する効率的な治療法にはならなかった(DiBernardo AB et al. Biochimica et Biophysica Acta 1762 (2006) 1139-1149; van den Berg LH et al. Neurology 2019;92:e1610-e1623)。

【0004】

神経炎症プロセスは、ＡＬＳ対象の顕著な病理学的特徴である。ミクログリア細胞の活性化は、全ての病期におけるＡＬＳの病理で(Troost D et al. Neuropathol Appl Neurobiol 1990; 16: 401-10; Kawamata T et al. Am J Pathol 1992; 140: 691; Engelhardt JI et al. Arch Neurol 1993; 50: 30-6; Thonhoff JR et al. Curr Opin Neurol 2018; 31: 635-9)、またトランスジェニックＳＯＤ１ ＡＬＳマウスで(Engelhardt JI et al. Arch Neurol 1993; 50: 30-6; McGeer PL et al. Muscle Nerve 2002; 26: 459-70; Hall ED, Oostveen JA, Gurney ME. Glia 1998; 23: 249-56)証明されており、マクロファージに典型的なサイトカインの発現が臨床症状に先行する(Alexianu ME et al. Neurology 2001; 57: 1282-9; Hensley K et al. J Neurochem 2002; 82: 365-74)。さらに、神経炎症のバイオマーカーはＡＬＳ患者で上昇しており、疾患の重症度と相関があり、疾患の進行を予測することが示されている(Gille B et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2019 Dec;90(12):1338-1346; Tateishi T et al. J Neuroimmunol. 2010 May;222(1-2):76-81)。

【0005】

ＡＬＳ病因への神経炎症の寄与の証拠には説得力があるが(Evans MC et al. Mol Cell Neurosci 2013; 53: 34-41; Zhao W et al. J Neuroimmune Pharmacol Off J Soc NeuroImmune Pharmacol 2013; 8: 888-99)、現在まで、ＡＬＳの臨床状況における神経炎症反応を修正する治療の試みは全て失敗した(Appel SH et al. Arch Neurol 1988; 45: 381; Drachman DB et al. Ann Neurol 1994; 35: 142-50; Tan E et al. Arch Neurol 1994; 51: 194; Beghi E et al. Neurology 2000; 54: 469-469; Cudkowicz ME et al. Ann Neurol 2006; 60: 22-31; Gordon PH et al. Lancet Neurol 2007; 6: 1045-53; Stommel EW et al. Amyotroph Lateral Scler 2009; 10: 393-404)。しかしながら、これらの治験のほとんどは、神経炎症の非特異的抑制を対象とするものであった。このようなアプローチは、まず第一に、毒性が有益な薬物効果を容易に上回る可能性のあるＡＬＳ患者に害を及ぼすリスクが高い。

【0006】

これに関連して、全ての免疫を抑制することなく、神経免疫炎症系内の生理学的寛容原性の優位性を強化する新しいアプローチが必要である。

【0007】

ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は免疫応答を生理的に調節し、寛容の誘導と維持に寄与し、ひいては自己免疫疾患および炎症性疾患の発症を防ぐ(Sakaguchi S et al. Cell 2008; 133: 775-87)。

【0008】

従前の研究では、ＡＬＳ患者では、Ｔｒｅｇレベルの低下が疾患の重症度の増大と相関し、疾患の進行と生存を予測することが示された(Mantovani S et al. J Neuroimmunol 2009; 210: 73-9; Rentzos M et al. Acta Neurol Scand 2012; 125: 260-4; Henkel JS et al. EMBO Mol Med 2013; 5: 64-79)。レベルの低下に加え、ＡＬＳ患者のＴｒｅｇはＦＯＸＰ３の発現レベルが低く(Henkel JS et al. EMBO Mol Med 2013; 5: 64-79)、機能不全であり、それらの機能不全は疾患の重症度の増大と相関することが示された(Beers DR et al. JCI Insight. 2017;2(5):e89530; Thonhoff JR et al. Curr Opin Neurol 2018; 31: 635-9)。従って、ＡＬＳ患者では、Ｔｒｅｇは数が減少するばかりか、ＦＯＸＰ３の発現レベルの障害と相関する重大な機能不全も示し、それらの機能不全は疾患の重症度および進行と相関し、Ｔｒｅｇの抑制機能が臨床状態の意味のある指標である可能性があることを示唆している(Thonhoff JR et al. Curr Opin Neurol 2018; 31: 635-9)。

【0009】

Ｔｒｅｇは、その生成、活性化および生存をもっぱらサイトカインであるインターロイキン２（ＩＬ－２）に依存している(Malek TR, Bayer AL. Nat Rev Immunol 2004; 4: 665-74)。さらに、ヒトエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）とは対照的に、ヒトＴｒｅｇは高レベルのＣＤ２５を構成的に発現し、ＩＬ－２に対する高親和性受容体を形成するため、Ｔｅｆｆを刺激するには不十分な低濃度のＩＬ－２に応答する(Dupont G. et al. Cytokine. 2014 Sep;69(1):146-9)。これに基づいて、低用量（ｌｄ）のＩＬ－２投与が試験され、マウスおよびヒトにおいて健康なボランティアまたは１型糖尿病の状況で、Ｔｒｅｇの選択的増幅を誘導することが示された(Hartemann A et al. Lancet Diabetes Endocrinol 2013; 1: 295-305 Ito S et al. Mol Ther J Am Soc Gene Ther 2014. 22: 1388-95)。

【0010】

これに基づいて、様々な自己免疫および炎症状態の治療におけるｌｄ－ＩＬ－２の使用が提案され（ＷＯ２０１２１２３３８１Ａ１、ＷＯ２０１４０２３７５２Ａ１、ＷＯ２０１６０２５３８５Ａ１、ＷＯ２０１６１６４９３７Ａ２）、現在、移植片対宿主病(Koreth J et al. N Engl J Med 2011; 365: 2055-66)、ＨＣＶ誘発血管炎(Saadoun D et al. N Engl J Med 2011; 365: 2067-77)、１型糖尿病(Hartemann A et al. Lancet Diabetes Endocrinol 2013; 1: 295-305)、円形脱毛症(Castela E et al. JAMA Dermatol 2014; 150: 748-51)におけるｌｄ－ＩＬ－２の治療可能性を調べるいくつかの臨床試験が報告されている。

【0011】

ＡＬＳ動物モデルに関しては、マウスＩｌ－２の免疫複合体（ＩＬ２と抗ＩＬ－２抗体の複合体）とラパマイシンの組合せをトランスジェニックＳＯＤ１ ＡＬＳマウスに投与すると、生存時間の延長を伴う疾病進行の有意な遅延がもたらされることが示された(Sheean RK et al. JAMA Neurol. 2018;75(6):681-689)。しかしながら、上記に説明したように、ビタミンＥ(Desnuelle C. et al, Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 2 (2001) 9-18)、ガバペンチン(Miller R.G., et al, Neurology 56 (2001) 843-848)、トピラメート(Cudkowicz M., et al, Neurology 61 (2003) 456-464)、セレコキシブ(Cudkowicz M., 15th International Symposium on ALS/MND, Philadelphia, 2004)、およびクレアチン(Shefner J. et al, Neurology 63 (2004) 1656-1661)を含め、新しい候補薬を使用してこのモデルで得られた多くの肯定的な結果は、ヒトＡＬＳ患者の効率的な治療法とはなり得なかった(DiBernardo AB et al. Biochimica et Biophysica Acta 1762 (2006) 1139-1149; van den Berg LH et al. Neurology 2019;92:e1610-e1623)。

【0012】

さらに、ヒトＡＬＳ患者のＴｒｅｇはＩＬ－２に対する内因的応答性が損なわれていると主張されており(Thonhoff JR et al. Neurol Neuroimmunol Neuroinflammation 2018; 5: e465)、ｌｄ ＩＬ－２治療に応答しなくなる可能性があり、これは同じ戦略がＡＬＳ患者では効果的でないことがあるということを意味する。特に、５人のＡＬＳ患者における最初のパイロット研究（未発表データ）に基づいて、Ｔｈｏｎｈｏｆｆらは、ｌｄＩＬ－２が臨床転帰を変化させたり、内因性のＴｒｅｇの数を増加させたりすることが見られなかったことを示した（Thonhoff JR et al. Neurol Neuroimmunol Neuroinflammation 2018; 5: e465のDiscussion §2を参照）。これに基づいて、ＡＬＳ患者３人のみであるが、ｌｄＩＬ－２投与とともに、ＡＬＳ患者のＴｒｅｇのエクス・ビボ（ｅｘ－ｖｉｖｏ）単離とその後のＩＬ－２とラパマイシンの両方を使用した患者のＴｒｅｇのエクス・ビボ増幅、およびその増幅したＴｒｅｇの患者への再注入からなる代替の自己細胞療法処置が機能低下の速度を減じるために提案され、有効であるとされた(Thonhoff JR et al. Neurol Neuroimmunol Neuroinflammation 2018; 5: e465)。

【0013】

しかしながら、３人の患者のみの非盲検非プラセボ対照試験で観察された結果は、ＡＬＳの治療効果を示すには明らかに不十分である。さらに、患者のＴｒｅｇを単離し、それらを患者に再注入する前にイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で増幅する必要があるため、そのような治療は非常に高価になり、多くの病院で実施することは不可能である。従って、依然として代替のＡＬＳ治療の必要があり、これは、効率的であるだけでなく、プロトコールがはるかに単純であるため、ほとんどのＡＬＳ患者にとって安価で利用しやすいものとなる。

【発明の概要】

【0014】

本発明に関して、本発明者らは意外にも、Ｔｒｅｇの単離およびエクス・ビボ増幅の必要なく、低用量ヒトインターロイキン２（ｌｄＩＬ－２）を注射するだけで、Ｔｒｅｇ数だけでなく、最も重要なことにはそれらの抑制機能においても有意な改善を誘導するのに十分であることを見出した（実施例１参照）。さらに、本発明者らは、ｌｄＩＬ－２がＴｒｅｇの数および機能を増加させるだけでなく、ＭＣＰ１としても知られるＣ－Ｃサブファミリーに属する小さなケモカインである炎症性ケモカインＣＣＬ２（実施例１を参照）の血漿濃度に有意な低下をもたらすことも見出し、これはケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）を介してシグナルを伝達し、循環白血球を神経炎症の部位に誘導する。重要なことに、ＣＣＬ２血漿またはＣＳＦレベルは、ＡＬＳ疾患スコアと(Nagata T, et al. Neurol Res. 2007 Dec;29(8):772-6)、何よりもＡＬＳ患者の生存率と(Gille B et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2019 Dec;90(12):1338-1346)相関し、これによりこれはＡＬＳ疾患活動性の有用なバイオマーカーとなる。本発明者らはまた、ｌｄ ＩＬ－２がケモカイン（ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８）の発現をさらに上方調節することができることも見出し、このことはマクロファージの表現型のＭ１炎症性分極から組織修復に関与する抗炎症性Ｍ２表現型への変化を示している（Mantovani A et al. J Pathol 2013; 229: 176-85; Mammana S et al. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(3), 831、実施例１参照)。

【0015】

最後に、本発明者らは、細胞変性プロセスの全体的な減少が、軸索損傷の非特異的マーカーであるＮＦＬの血漿蓄積の減少をもたらすことを見出した。従って、非常に少数の（５人のみの対象）およびおそらく代表的でない数の対象に基づくＴｈｏｎｈｏｆｆらの結論とは対照的に、発明者らは、３６人（３つの治療群のそれぞれに１２人）の対象を含むプラセボ対照並行臨床試験での２用量のｌｄＩＬ－２の３群無作為化（１：１：１）二重盲検一施設試験において、ＡＬＳ患者へのｌｄＩＬ－２注射が（ｉ）安全で十分忍容され、（ｉｉ）Ｔｅｆｆｓを超えるＴｒｅｇの数および抑制機能の上方調節と（ｉｉｉ）疾患進行の炎症性マーカー（ＣＣＬ２）の下方調節を可能とし、（ｉｖ）単球分極をＭ１炎症誘発性表現型からＭ２抗炎症性および組織修復表現型に移行し、かつ、（ｖ）軸索損傷の減少の指標となる、治療に対する血漿ＮＦＬ応答によって証明されるように、全体的なＡＬＳ関連の細胞変性活性を低下させることを示した。

【0016】

よって、第１の側面において、本発明は、ヒト対象において筋萎縮性側索硬化症の治療に使用するためのヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）に関し、前記対象に投与されるヒトＩＬ－２の各用量は、０．１×１０^６～３×１０^６国際単位（ＩＵ）であり、前記治療は前記対象への制御性Ｔ細胞の投与を含まない。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】試験プロフィール。ＡＬＳＦＲＳ－Ｒ：筋萎縮性側索硬化症機能評価スコア－改訂；ＢＴ：定期的血液検査；Ｃｙｔ：新鮮血サイトメトリー；ＳＶＣ：緩徐肺活量；ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞；Ｉｎｊ：皮下注射；Ｄ：日；ＥＣＧ：心電図；ＩＴＴ：治療意図。^＊時間枠は通院時間に相当する。

【図2】Ｔｒｅｇの数および頻度に対するＩＬ－２治療の効果。Ａ～Ｄ ３群（白四角、プラセボ；黒三角、１ＭＩＵのＩＬ２；白丸、２ＭＩＵのＩＬ２）全ての試験でのＴｒｅｇの頻度（Ａ～Ｂ）および絶対数（Ｃ～Ｄ）の変動。ＡおよびＣデータ点は、それらの関連するＳＥＭの平均値とエラーバーを示す。ＢおよびＤ ベースラインと１回の治療サイクル（ｄ８）または３回の治療サイクル（ｄ６４）の最終注射の３日後との間での、Ｔｒｅｇの数および頻度の変化。データ点は、Ｔｒｅｇ頻度（Ｂ）と数（Ｄ）の患者ごとの変化を表す。Ｅ～Ｆ 試験中のＴｒｅｇのトラフレベルのｉＡＵＣ。データ点は、Ｔｒｅｇ数（Ｅ）と頻度（Ｆ）の関連するＳＥＭの平均値とエラーバーを示す。

【図3】ベースライン時（ｄ１）および３回の治療サイクル完了の３日後（ｄ６４）に測定されたＴｒｅｇ頻度およびエフェクターＴ細胞表現型に対するＩＬ－２治療の効果。Ａ～Ｃ （Ａ）２ＭＩＵ、（Ｂ）１ＭＩＵ、および（Ｃ）プラセボで治療された個人の抑制アッセイに使用するための、凍結保存されたＰＢＭＣから単離されたＴｒｅｇの頻度。Ｄ～Ｆ エフェクターＴ細胞でのＣＤ２５発現（Ｄ）２ＭＩＵ、（Ｅ）１ＭＩＵ、および（Ｆ）プラセボ。Ｇ～Ｉ （Ｇ）２ＭＩＵ、（Ｈ）１ＭＩＵ、および（Ｉ）プラセボで治療した個体におけるＴｒｅｇ不存在下でのエフェクターＴ細胞の増殖。

【図4】Ｔｒｅｇ表現型および抑制機能に対するＩＬ－２治療の効果。Ａ～Ｃ ベースライン時（ｄ１）と３つの試験群：（Ａ）２ＭＩＵ、（Ｂ）１ＭＩＵ、および（Ｃ）プラセボの全てにおける３回の治療サイクル完了の３日後（ｄ６４）の、ＴｒｅｇでのＣＤ２５発現。Ｄ～Ｆ ベースライン時（ｄ１）と、（Ｄ）２ＭＩＵ、（Ｅ）１ＭＩＵ、および（Ｆ）プラセボで治療された個人における３回の治療サイクルの完了の３日後（ｄ６４）に測定されたイン・ビトロ共培養アッセイによって測定されたＴｒｅｇの自己抑制機能。（Ｇ）３群全てのベースラインレベルに対する３サイクルの治療後のＴｒｅｇの抑制機能の変化。バーは平均値を表し、エラーバーはそれらの関連するＳＥＭを表す。（Ｈ～Ｉ）３サイクルの治療後の臨床サイトメトリー（ｘ軸）およびＴｒｅｇ抑制機能（Ｙ軸）によって測定されたＴｒｅｇ頻度（Ｈ）およびＴｒｅｇ ＣＤ３５ ｍｆｉ（Ｉ）の相対的変化の間の関係（ｄ１での値に対するｄ６４での値）。白四角はプラセボ、黒三角は１ＭＩＵのＩＬ２、白丸は２ＭＩＵのＩＬ２を投与した個体を示す。

【図5】Ｄ６４でのＴｒｅｇ活性化マーカーＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ４、ＩＫＺＦ２およびＩＬ２ＲＡ（ＣＤ２５）のトランスクリプトーム解析。このプロットは、プラセボと比較して、１ＭＩＵおよび２ＭＩＵ ｌｄＩＬ－２を投与された患者におけるＴｒｅｇ活性化マーカーＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ４、ＩＫＺＦ２およびＩＬ２ＲＡの遺伝子発現の増加を示す。各ボックスは、各治療群間の発現値の分布を表す（分布の最大値、最小値および中央値が各ボックスに示され、３本の水平線として視認できる）。サンプル群間の有意差を特定するために複数のｔ検定を実行した。凡例：^＊＝ｐ値＜０．０５、^＊＊＝ｐ値＜０．０１、^＊＊＊＝ｐ値＜０．００１、^＊＊＊＊＝ｐ値＜０．０００１。

【図6】血漿サイトカイン濃度に対するＩＬ－２治療の効果。Ａ～Ｃ ＣＣＬ２（Ａ）、ＣＣＬ１７（Ｂ）およびＣＣＬ１８（Ｃ）の試験中の血漿サイトカインレベルの変動。濃度は各個人のベースライン値に対するパーセンテージとして表され、ポイントは平均値とエラーバー、それらに関連するＳＥＭを示す。白四角はプラセボ、黒三角は１ＭＩＵのＩＬ２、白丸は２ＭＩＵのＩＬ２を投与された個体を示す。

【図7】治療によるＤ８５時の血漿ＮＦＬレベルのベースラインからの変化率。バーは、ベースラインからの変化率の平均±ｓｅｍである。灰色の塗りつぶし＝プラセボ；ドット＝１ＭＩＵ ＩＬ－２；白＝２ＭＩＵ ＩＬ－２。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明に関して、発明者らは意外にも、エクス・ビボでＴｒｅｇの選択と増幅の必要なく、低用量のヒトインターロイキン２（ｌｄＩＬ－２）を注射するだけで、Ｔｒｅｇ数だけでなく、最も重要なことにはそれらの抑制機能においても有意な改善を誘導するのに十分であることを見出した。さらに、本発明者らはまた、ｌｄＩＬ－２がＴｒｅｇの数および機能を増加させるだけでなく、ＭＣＰ１としても知られるＣ－Ｃサブファミリーに属する小さなケモカインである炎症性ケモカインＣＣＬ２の血漿濃度に有意な低下をもたらすことも見出し、これはケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）を介してシグナルを伝達し、循環白血球を神経炎症の部位に誘導し、ＡＬＳ疾患スコアと(Nagata T, et al. Neurol Res. 2007 Dec;29(8):772-6)、また、ＡＬＳ患者の生存率と(Gille B et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2019 Dec;90(12):1338-1346)相関することが示され、これによりこれはＡＬＳ疾患活動性の有用なバイオマーカーとなる。本発明者らはまた、ｌｄ ＩＬ－２がケモカイン（ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８）の発現をさらに上方調節することができることも見出し、このことはマクロファージの表現型のＭ１炎症性分極から組織修復に関与する抗炎症性Ｍ２表現型への変化を示している(Mantovani A et al. J Pathol 2013; 229: 176-85; Mammana S et al. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(3), 831)。さらに、これら全ての変化は、プラセボ群で観察されたものとは対照的に、治療群では、ＮＦＬ血漿増加の持続的な停止と治療群で並行しており、このことは全体的な細胞変性ＡＬＳ関連活性に対する持続的なプラスの効果を示している。従って、非常に少数の（５人のみの対象）およびおそらく代表的でない数の患者に基づくＴｈｏｎｈｏｆｆらの結論とは対照的に、発明者らは、３６人（３つの治療群のそれぞれに１２人）の対象を含むプラセボ対照並行臨床試験での２用量のｌｄＩＬ－２の３群無作為化（１：１：１）二重盲検一施設試験において、ＡＬＳ患者へのｌｄＩＬ－２注射が安全で十分忍容され、（ｉ）Ｔｒｅｇの数および抑制機能の上方調節を可能とし、（ｉｉ）単球分極の抗炎症性表現型への移行を可能とし、（ｉｉｉ）疾患進行のマーカー（ＣＣＬ２、ＮＦＬ）の下方調節を可能とする。

【0019】

ヒト対象の筋萎縮性側索硬化症の治療における低用量ヒトＩＬ－２の使用
よって、本発明は、ヒト対象において筋萎縮性側索硬化症の治療に使用するためのヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）に関し、前記対象に投与されるヒトＩＬ－２の各用量は、０．１×１０^６～３×１０^６国際単位（ＩＵ）であり、前記治療は前記対象への制御性Ｔ細胞の投与を含まない。

【0020】

本発明はまた、ヒト対象において筋萎縮性側索硬化症の治療に使用するための薬物の製造のためのヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）の使用に関し、前記治療中に前記対象に投与されるヒトＩＬ－２の各用量は、０．１×１０^６～３×１０^６国際単位（ＩＵ）であり、前記治療は、前記対象への制御性Ｔ細胞の投与を含まない。

【0021】

本発明はまた、ヒト対象の筋萎縮性側索硬化症の治療におけるヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）の使用に関し、前記対象に投与されるヒトＩＬ－２の各用量は、０．１×１０^６～３×１０^６国際単位（ＩＵ）であり、前記治療は、前記対象への制御性Ｔ細胞の投与を含まない。

【0022】

本発明はまた、ヒト対象において筋萎縮性側索硬化症の治療に使用するためのヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）を含む医薬組成物に関し、前記対象に投与されるヒトＩＬ－２の各用量は、０．１×１０^６～３×１０^６国際単位（ＩＵ）であり、前記治療は前記対象への制御性Ｔ細胞の投与を含まない。

【0023】

本発明はまた、必要とするヒト対象において筋萎縮性側索硬化症を治療するための方法であって、前記ヒト対象にヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）を投与することを含む方法に関し、前記対象に投与されるヒトＩＬ－２の各用量は、０．１×１０^６～３×１０^６国際単位（ＩＵ）であり、前記治療は前記対象への制御性Ｔ細胞の投与を含まない。

【0024】

ヒトＩＬ－２
特許請求する治療は、ヒトＡＬＳ患者への低用量のヒトＩＬ－２の投与に頼るものである。

【0025】

本明細書において、「ヒトインターロイキン２」または「ヒトＩＬ－２」は、天然ヒトＩＬ－２または微生物宿主により産生される組換えＩＬ－２ポリペプチドを含む組換えまたは合成技術によって得られるヒトＩＬ－２を含む、ヒトＩＬ－２のいずれの供給源も表す。天然ヒトＩＬ－２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、Ｐｕｂｍｅｄ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ３５５８のヒトＩＬ－２遺伝子の説明に開示されている。天然ヒトＩＬ－２タンパク質の参照配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＰ＿０００５７７．２（２０２０年１月５日更新版）に見出すことができ、天然ヒトＩＬ－２ ｍＲＮＡの参照配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＭ＿０００５８６．４（２０２０年１月５日更新版）に見出すことができる。

【0026】

ヒトＩＬ－２は、天然ヒトＩＬ－２ポリペプチド配列からなり得る、または含み得る、または天然ヒトＩＬ－２ポリペプチドの活性変異体であり得る。好ましくは、組換えヒトＩＬ－２、特に、微生物宿主によって産生される組換えヒトＩＬ－２が使用される。

【0027】

ＩＬ－２の活性変異体は、文献に開示されている。天然ＩＬ－２の変異体は、その断片、類似体、および誘導体であってもよい。「断片」とは、完全なポリペプチド配列の一部のみを含むポリペプチドが意図される。「類似体」は、１以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する天然ポリペプチド配列を含むポリペプチドを表す。変異タンパク質および疑似ペプチドは、類似体の特定の例である。「誘導体」は、任意の修飾天然ＩＬ－２ポリペプチドまたはその断片または類似体、例えば、ＩＬ－２の特性（例えば、安定性、特異性など）を改善するためにグリコシル化された、リン酸化された、別のポリペプチドまたは分子に融合された、ポリマー化されたものなど、または化学的または酵素的修飾または付加によるものを含む。天然ヒトＩＬ－２ポリペプチドの活性変異体は一般に、天然ヒトＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。変異体ＩＬ－２ポリペプチドに活性があるかどうかを決定するための方法は当技術分野で利用可能であり、ＩＬ－２変異体の例は例えば、ＥＰ１０９７４８、ＥＰ１３６４８９、ＵＳ４，７５２，５８５；ＥＰ２００２８０、またはＥＰ１１８６１７に開示され、これらは参照により本明細書に援用される。活性変異体は、最も好ましくは、Ｔｒｅｇを活性化する変異体である。

【0028】

好ましくは、組換えヒトＩＬ－２、すなわち、組換えＤＮＡ技術により作製されたヒトＩＬ－２が使用される。ヒトＩＬ－２をコードする組換えＤＮＡを発現させるために使用される宿主生物は、原核生物（大腸菌などの細菌）または真核生物（例えば、酵母、真菌、植物または哺乳動物細胞）であり得る。組換えＩＬ－２を生産するためのプロセスは、例えば、ＵＳ４，６５６，１３２；ＵＳ４，７４８，２３４；ＵＳ４，５３０，７８７；またはＵＳ４，７４８，２３４に記載されており、これらは参照により本明細書に援用される。

【0029】

本発明において使用するためのヒトＩＬ－２は、薬学上許容される形態、特に、本質的に純粋な形態、例えば、９５％以上の純度、さらに好ましくは９６、９７、９８または９９％の純度でなければならない。

【0030】

ヒトＩＬ－２は、医薬用途のものを含めて市販されており、ヒト対象での使用が許可されている。例えば、アルデスロイキン（商標Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））は、癌の治療においてＦＤＡにより承認されている遺伝子操作大腸菌株を用いる組換えＤＮＡ技術によって生産されたヒトインターロイキン－２遺伝子の類似体である。アルデスロイキンは、以下の点で天然ヒトインターロイキン－２と異なる：
ａ）アルデスロイキンは、大腸菌から誘導されるので、グリコシル化されていない；
ｂ）この分子はＮ末端アラニンを有さず；このアミノ酸のコドンは、遺伝子工学的手順の間に欠失された；
ｃ）この分子は、１２５番のアミノ酸においてシステインに替えてセリン置換を有する。

【0031】

アルデスロイキンは、本発明において好ましくは使用される。

【0032】

しかしながら、
・ヒトＩＬ－２の遺伝子を含む酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の細胞から単離および精製された組換えヒトＩＬ－２の医薬形態であるＲｏｎｃｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）；
・Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｎｅｐｔｕｎｕｓにより販売されている残基１２５にセリンを有する組換えＩＬ－２であるＩｎｔｅｒｋｉｎｇ；
・組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）に遺伝的に融合された組換えヒトインターロイキン－２（ｒＩＬ－２）であるＡｌｂｕｌｅｕｋｉｎ
などの他の組換えヒトＩＬ－２も利用可能である。

【0033】

ヒトＩＬ－２用量および投与スキームおよび経路
上記で説明したように、ヒトＴｒｅｇは、高レベルのＣＤ２５を構成的に発現し、休止中のＴｅｆｆに存在しないＩＬ－２に対する高親和性受容体を形成し、従って、Ｔｅｆｆを刺激するには不十分な低濃度のＩＬ－２に応答する。特許請求されている治療は、Ｔｒｅｇの数および機能を拡大することを意図しているが、Ｔｅｆｆを拡大または刺激することは意図せず、ＡＬＳ患者に投与されるヒトＩＬ－２の各用量は、０．１×１０^６～３×１０^６国際単位（ＩＵ）と低く維持されている。さらに、１型糖尿病の場合、３×１０^６ＩＵまでの用量は安全であることが示されているが、３×１０^６ＩＵという最高用量では、より重篤でない有害事象が発生した(Hartemann A et al. Lancet Diabetes Endocrinol 2013; 1: 295-305)。ヒトＩＬ－２の各投与量も、潜在的毒性を制限するために、最大で３×１０^６ＩＵに維持する必要がある。

【0034】

上記で説明したように、Ｔｒｅｇは、それらの生成、活性化および生存をもっぱらＩＬ－２に依存している(Malek TR, Bayer AL. Nat Rev Immunol 2004; 4: 665-74)。さらに、ヒト患者に投与されるアルデスロイキンの半減期は一般に、約２～３時間である（例えば、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）ラベルを参照）。従って、Ｔｒｅｇ数と免疫抑制機能の持続的な拡大を得るために、ヒトＩＬ－２は一般に、ＡＬＳ対象に反復投与される。

【0035】

好ましい態様では、ヒトＩＬ－２は、０．１×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、好ましくは０．２×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．３×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．４×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、より好ましくは０．５×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．６×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．７×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．８×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．９×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、１×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、１×１０^６～２×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、特に、０．５×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、１×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、または２×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２の反復される、好ましくは、皮下注射として投与される。

【0036】

注射は、
・ヒトＩＬ－２注射を行わない期間を挟んだヒトＩＬ－２の１日１回または１日数回の注射の反復サイクルに基づく投与スキーム；および
・連続的メトロノーム投与、すなわち、ヒトＩＬ－２の１日１回または１日数回の注射
を含む様々な投与スキームに従って行うことができる。

【0037】

ＩＭＯＤＡＬＳ臨床試験（実施例１参照）に関して、Ｔｈｏｎｈｏｆｆらが示唆したこと(Thonhoff JR et al. Neurol Neuroimmunol Neuroinflammation 2018; 5: e465)とは対照的に、Ｄ１（サイクル１）の１×１０^６または２×１０^６ＩＵ／日のヒトＩＬ－２を１日１回皮下投与で開始する最初の５日間のサイクルは、Ｄ２９までＴｒｅｇの数および機能を有意に増加させるのに十分であった（図２参照）。さらに、第５週（サイクル２、Ｄ２９に開始）および第９週（サイクル３、Ｄ５７に開始）における同一の５日サイクルが投与され（図１参照）、サイクル３中のＴｒｅｇの数と頻度のピークはサイクル１中に観察されたものよりも高く、連続した治療サイクルには累積する可能性のある残留効果があることが示唆される。この示唆は、プラセボと比較して、ＩＬ２群のｉＡＵＣトラフＴｒｅｇレベル（新しいサイクルを開始する前に残存するＴｒｅｇの変化を測定）が有意に高いことによってさらに裏付けられる（図２Ｅ～Ｆ、上記の表３および４）。

【0038】

よって、０．１×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、好ましくは、０．２×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．３×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．４×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、より好ましくは、０．５×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．６×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．７×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．８×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．９×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、１×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．５×１０^６～２×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、１×１０^６～２×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、特に、０．５×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、１×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、または２×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２の連続３～７日の１日１回皮下投与のサイクルは、そのサイクル中およびさらに少なくとも最大３週間、Ｔｒｅｇ数を有意に増加させると思われる。

【0039】

よって、本発明による治療的使用または方法において、０．１×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、好ましくは、０．２×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．３×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．４×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、より好ましくは、０．５×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．６×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．７×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．８×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．９×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、１×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．５×１０^６～２×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、１×１０^６～２×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、特に、０．５×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、１×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、または２×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２の連続３～７日の１日１回皮下投与の数サイクルが対象に好ましくは投与される。より好ましくは、各サイクルは、０．１×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、好ましくは、０．２×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．３×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．４×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、より好ましくは、０．５×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．６×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．７×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．８×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．９×１０^６～３×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、０．５×１０^６～２×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、１×１０^６～２×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、特に、０．５×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２、１×１０^６～３×１０^６ＩＵのＩＬ－２、または２×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２の連続５日の１日１回皮下投与からなる。

【0040】

各サイクルは、そのサイクル中およびさらに少なくとも約３週間、Ｔｒｅｇの数および機能を有意に増大させると思われるので、そのサイクルは好ましくは、２～６週間毎、好ましくは２～５週間毎、より好ましくは２～４週間毎、特に、２、３または４週間毎に投与される。

【0041】

しかしながら、上記の投与スキームは好ましいが、許容できない毒性なくＴｒｅｇの数および機能を有意に増大させることができる他の投与スキームも、当業者であれば、他の状況でのヒトにおける低用量ＩＬ－２投与に関する知識に基づいて定義することができる。

【0042】

実際に、ＡＬＳ患者が機能不全のＴｒｅｇを有していたことを示唆する教示が当技術分野にはあり(Beers DR et al. JCI Insight. 2017;2(5):e89530; Thonhoff JR et al. Curr Opin Neurol 2018; 31: 635-9)、他のヒト患者とは対照的に低用量ＩＬ－２投与には応答しなかった(Thonhoff JR et al. Neurol Neuroimmunol Neuroinflammation 2018; 5: e465)が、今般、プラセボ対照並行、２用量のｌｄＩＬ－２の３群無作為化（１：１：１）二重盲検一施設試験で、ＡＬＳ患者が実際にｌｄ－ＩＬ－２に有利に応答でき、Ｔｒｅｇの数と機能の有意な増大、および何よりもＡＬＳ疾患活動のマーカーであるＣＣＬ２血漿濃度の減少をもたらすことが示された。本発明者らのこの予想外の発見に基づいて、他のヒト対象における低用量ＩＬ－２の効果に関する知識は、他の適切な投与スキームを設計するために今般使用され得る。

【0043】

例えば、ＩＭＯＤＡＬＳ臨床試験では皮下投与が使用されているが、ＩＬ－２を静脈内投与すると、Ｔｒｅｇ数が有意に増加することがヒト癌患者で示されている(Ahmadzadeh M, Rosenberg SA. Blood 2006;107:2409-14）。従って、本発明による治療的使用および方法において、ヒトＩＬ－２は好ましくは皮下または静脈内経路を介して投与される。皮下投与はより容易でより良い忍容性で、ＩＭＯＤＡＬＳ臨床試験で効率的であることが示されているため、皮下投与はなお好ましい。

【0044】

用量に関して、潜在的毒性を制限するために、各単回用量が３×１０^６ＩＵを超えないようにする必要があるが、ＩＭＯＤＡＬＳ臨床試験で得られた結果は、ＡＬＳ患者のＴｒｅｇの数および機能に対する低用量のヒトＩＬ－２の効果が用量依存的であり、５日の各サイクルで、１日１回、２×１０^６ＩＵのヒトＩＬ－２という最高用量で最高の効果が得られる。従って、低用量ヒトＩＬ－２投与の反復および分離サイクルを含む投与スキームを使用する場合、サイクル中、１×１０^６ＩＵ～２×１０^６ＩＵ、好ましくは２×１０^６ＩＵの１日用量が好ましい。しかしながら、１日用量は、１日１回の投与または数回に分けた低用量のいずれかで投与することができる。例えば、２×１０^６ＩＵの１日用量を達成するために、２×１０^６ＩＵの単回用量を１日１回投与するか、またはこの２×１０^６ＩＵの１日用量を２回以上の低用量に、例えば、２用量の１×１０^６ＩＵ（例えば、朝に１回と夕方に１回）、３用量の０．６７×１０^６ＩＵ（例えば、朝に１回、日中に１回、夕方に３回目）、または４用量の０．５×１０^６ＩＵに分割することができる。１日用量のこのような分割は、２～３×１０^６ＩＵの単回１日用量を１回投与した場合に、有害事象に罹患しているＡＬＳ患者において特に使用され得る。

【0045】

さらに、ＩＭＯＤＡＬＳ臨床試験に使用される投与スキームは４週間毎の５日サイクルに基づくが、他の投与スキームも企図され得る。例えば、代替の投与スキームは、
・２サイクルの間がより長期間であるより長期のサイクル；
・２サイクルの間がより短期間であるより短期のサイクル；
・低用量ヒトＩＬ－２の連続的投与（サイクル無し）
に基づき得る。

【0046】

例えば、投与サイクルを使用する場合、各サイクルは３日～７日の間で著しく異なり得るが、より短い（２日など）またはより長い（８、９、１０、１１、１２、１３、１４日、さらには３または４週間など）^＊サイクルが使用可能である。より短いサイクル（２日など）を使用する場合、３週間毎、２週間毎、１０日毎、または毎週など、ＩＭＯＤＡＬＳで使用される４週間毎のスケジュールよりも高頻度にサイクルを繰り返すことが好ましい。より長いサイクル（８、９、１０、１１、１２、１３、１４日、さらには３または４週間など）を使用する場合、ＩＭＯＤＡＬＳで使用する４週間毎のスケジュールと同じか、やや低頻度、例えば、４週間毎、５週間毎、６週間毎でサイクルを繰り返すことが好ましい。ただし、ヒトＩＬ－２の効果の持続時間は比較的短いため、サイクル間の期間をあまり長くするべきではない。

【0047】

また、低用量ヒトＩＬ－２の連続的メトロノーム投与（サイクル無し）も企図され得る。低用量ヒトＩＬ－２の反復サイクルに基づく投与スキームは、癌治療から導き出された以前の知識に基づいてＩＭＯＤＡＬＳおよび他の自己免疫疾患で、対象者のための商品として使用されているが、特に、低用量ヒトＩＬ－２の連続投与を可能にするポンプ（糖尿病患者にインスリンを送達するために使用されるものと同様）が使用される場合には、低用量ヒトＩＬ－２の連続的メトロノーム投与がなお考慮され得る。この場合、ＩＭＯＤＡＬＳで見られたように、３サイクル後にＴｒｅｇが蓄積する傾向があることを考慮すると（実施例１および図２参照）、０．１×１０^６～２×１０^６ＩＵ、好ましくは０．１×１０^６～１．５×１０^６ＩＵ、０．１×１０^６～１×１０^６ＩＵ、またはさらには０．１×１０^６～０．５×１０^６ＩＵなど、ヒトＩＬ－２のより低い累積１日用量が企図され得る。このタイプの治療は、より高い１日用量のヒトＩＬ－２の悪影響を示すＡＬＳ患者において特に企図され得る。

【0048】

より一般には、各単回用量は０．１×１０^６～３×１０^６ＩＵの間に含まれるべきであるが、臨床医は許容されない毒性なく効率を観察するために投与スキームを適応させる方法を知っている。特に、所与の投与スキーム（ＩＭＯＤＡＬＳおよびＭＩＲＯＣＡＬＳ 臨床試験で選択されたスキームの１つなど）から開始して、臨床医は、ベネフィット／リスク比を最適化するために、Ｔｒｅｇの数または頻度、それらの免疫抑制機能、および／またはＣＣＬ２および／またはＣＣＬ１７および／またはＣＣＬ１８の血清濃度、血漿濃度または脳脊髄液（ＣＳＦ）濃度、および潜在的有害事象、および投与スキームを監視することができる（Ｔｒｅｇの数または頻度、それらの免疫抑制機能、および／またはＣＣＬ２マーカーおよび／またはＣＣＬ１７および／またはＣＣＬ１８の血清濃度、血漿濃度または脳脊髄液（ＣＳＦ）濃度に基づいて効率を改善し、および／または薬物関連有害事象を制限する）。

【0049】

これに関して、本発明の一態様では、治療は、
ａ）対象の生物学的サンプルからのベースライン時（すなわち、低用量ヒトＩＬ－２治療の開始日）Ｔｒｅｇの数または頻度（血中）、および／またはＴｒｅｇの免疫抑制機能、および／またはＣＣＬ２の血清濃度または血漿濃度またはＣＳＦ濃度、および／またはＣＣＬ１７および／またはＣＣＬ１８の血清濃度、血漿濃度またはＣＳＦ濃度を測定すること、
ｂ）ヒトＩＬ－２投与の反復分離サイクルまたは連続的メトロノームヒトＩＬ－２投与のいずれかを含む本発明による第１の投与スキームに従って前記対象にヒトＩＬ－２を投与すること、
ｃ）薬物関連有害事象を監視し、治療サイクル終了の１～３日後または連続的メトロノームヒトＩＬ－２投与の少なくとも７日後に採取した対象の生物学的サンプルからのベースライン時と同じパラメーターを測定すること、ならびに
ｄ）結果が許容できる場合には第１の投与スキームを継続すること、または工程ｃ）の結果に応じて第２の投与スキームを計画すること
を含む。

【0050】

工程ｄ）において、ＡＬＳ患者がコンプライアンスの問題を伴う忍容性の低い有害事象を受けた場合、サイクルまたは連続的１日用量は、例えば、低減するか、いくつかのより低い単回用量に分割する（１日１回の用量の代わりに）ことができる。第１および第２の投与スキームの両方がサイクルに基づいており、サイクル中のヒトＩＬ－２の１日用量が低減されれば、補償するために各サイクルの期間を延長することができる。あるいは、サイクルではなく連続投与を使用する場合は、より低い１日用量で十分であると予想されるので、第２の投与スキームは、サイクルではなく連続投与に基づき得る。

【0051】

逆に、ＡＬＳ患者が許容されない毒性を受けていないが、Ｔｒｅｇ数、頻度または免疫抑制機能（疾患進行と負の相関があるマーカー）またはＣＣＬ２、ＣＣＬ１７および／またはＣＣＬ１８の血漿またはＣＳＦ濃度（ＣＣＬ２は疾患進行と正の相関があり、ＣＣＬ１７および／またはＣＣＬ１８は、炎症誘発性Ｍ１表現型から抗炎症性Ｍ２表現型へのマクロファージ分極の指標となる）を使用して測定されるように、治療効果が十分でない場合には、ＡＬＳ患者が治療に応答する可能性を高めるために、サイクルの１日用量または連続投与用量を、対象に投与される各単回用量が最大３×１０^６ＩＵであることを条件に増加させることができる。Ｔｒｅｇの数、頻度または免疫抑制機能、およびＣＣＬ２血漿濃度またはＣＳＦ濃度は、特に疾患の進行と相関しているため、これらのマーカーの少なくとも１つを使用することが好ましい。血漿または血清ＣＣＬ２の方が、測定が容易で信頼性が高いため、ＣＣＬ２の血漿または血清濃度がさらに好ましい。

【0052】

ＣＣＬ２濃度は、血漿、血清またはＣＳＦで測定可能である。測定は、新鮮または凍結（－２０℃）血漿または血清またはＣＳＦサンプルで行うことができる。ＣＣＬ２濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法（ＭＩＲＯＣＡＬＳ試験で行われる通り）またはサイトメトリービーズアッセイ（ＩＭＯＤＡＬＳ試験で行われる通り）などの固相免疫アッセイを使用して、新鮮または凍結血漿または血清またはＣＳＦで測定される。ＩＬ２単位用量の増加は、ＣＣＬ２濃度が治療前のベースライン濃度の８０％を超える（すなわち、治療時に２０％未満の減少を示す）場合に考慮される。

【0053】

選択された投与スキーム（上記で説明したように、治療中に変更可能）が何であれ、治療は、好ましくは、対象の生涯にわたって、または許容されない薬物関連の重大な有害事象まで行われる。

【0054】

ヒト対象に投与されない他の治療
本発明の治療的使用および方法において、治療は、対象への制御性Ｔ細胞の投与を含まない。実際に、Thonhoff et al. (Thonhoff JR et al. Neurol Neuroimmunol Neuroinflammation 2018; 5: e465)によって示唆されたこととは対照的に、本発明者らは意外にも、再注射前のＴｒｅｇの単離およびエクス・ビボ増幅の必要なく、低用量ヒトインターロイキン２（ｌｄＩＬ－２）の注射だけで、Ｔｒｅｇ数だけでなく、最も重要なことに、全てのＡＬＳ患者の抑制機能においても有意な改善を誘導するのに十分であることを見出した。よって、エクス・ビボでのＴｒｅｇの選択、増幅および再注入を必要としない、特許請求される治療法ははるかに簡単であるため、はるかに安価であり、従って、より多くのＡＬＳ患者に利用可能である。

【0055】

「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」は、免疫抑制活性を有するＴリンパ球である。天然Ｔｒｅｇは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋表現型によって特徴付けられる。Ｔｒｅｇはまた、Ｔエフェクター細胞の増殖を阻害する機能的能力によっても特徴付けられる。

【0056】

ヒトＩＬ－２は、別の治療と組み合わせてＡＬＳ患者に投与されてもよいが（下記参照）、Ｔｒｅｇとの併用治療がないことに加えて、特許請求される治療はまた、以下の治療の１以上と組み合わせないことが好ましい。

【0057】

第１の態様では、Ｔｒｅｇとの併用治療がないことに加えて、対象に投与されるヒトＩＬ－２は、抗ヒトＩＬ－２抗体と複合体を形成しない。

【0058】

ＩＬ－２／ＩＬ－２モノクローナル抗体複合体は、ＩＬ－２の生物活性を高めると考えられたため、また、選択された抗ＩＬ－２モノクローナル抗体クローンは、低親和性のβγ ＩＬ－２Ｒを発現する細胞（メモリーＣＤ８＋細胞またはナチュラルキラー細胞）よりも高親和性αβγ ＩＬ－２Ｒを発現する細胞（ＣＤ２５ｈｉＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇおよび活性化エフェクターＴ細胞）に特異性を付与することを可能にした(Sheean RK et al. JAMA Neurol. 2018;75(6):681-689、方法、“Data Collection From Animal Participants”の節、段落３を参照)ために、ＳｈｅｅａｎらによりトランスジェニックＳＯＤ１ ＡＬＳマウスにおいて精製したＩＬ－２ではなく、ＩＬ－２と抗ＩＬ－２抗体の複合体が使用された。

【0059】

しかしながら、本発明者らは、今般、ＡＬＳ患者における低用量の非複合体形成ヒトＩＬ－２の投与で、Ｔｒｅｇの数、割合および抑制機能を特異的に増大させるのに十分であることを示した（実施例１参照）。

【0060】

結果として、本発明に関して、対象に投与されるヒトＩＬ－２は、抗ヒトＩＬ－２抗体と複合体を形成しないことが好ましい。

【0061】

第２の態様では、Ｔｒｅｇとの併用治療がないことに加えて、特許請求される治療は、好ましくは、ラパマイシンともエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を抑制する任意の他の薬剤とも併用されない。

【0062】

トランスジェニックＳＯＤ１ ＡＬＳマウスでは、Ｓｈｅｅａｎらは抗ＩＬ－２抗体と複合体を形成したＩＬ－２を使用しただけでなく、複合体を形成したＩＬ－２とラパマイシン治療を組み合わせた。ラパマイシンは、特にエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の拡大を抑制することが知られている免疫抑制薬であり、Ｓｈｅｅａｎらによって、活性化された表現型を有するＴｒｅｇ細胞を特異的に拡大するため、および免疫抑制機能を発揮するために、ＩＬ－２／抗ＩＬ－２複合体と組み合わせて使用され、この組合せは、Ｔエフェクター細胞の増殖を阻害してＴｒｅｇの選択的増幅を可能にすることから、不可欠であると考えられる(Sheean RK et al. JAMA Neurol. 2018;75(6):681-689、方法、Data Collection From Animal Participants”の節、段落３を参照)。

【0063】

しかしながら、本発明者らは、今般、ラパマイシンなどのＴｅｆｆの免疫抑制剤の併用投与なく、ＡＬＳ患者に低用量の複合体を形成していないヒトＩＬ－２を投与するだけで、Ｔｒｅｇの数、割合および機能を特異的に増大させるのに十分であることを示した（実施例１参照）。

【0064】

結果として、本発明に関して、Ｔｒｅｇとの併用治療がないことに加えて、特許請求される治療は、好ましくは、ラパマイシンともエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を抑制する任意の他の薬剤とも併用されない。

【0065】

「エフェクターＴ細胞」または「Ｔｅｆｆ」は、Ｔｒｅｇ以外の全てのＣＤ４細胞を含む。特に、Ｔｅｆｆは、ＦＯＸＰ３を構成的に発現しない。

【0066】

好ましい態様では、Ｔｒｅｇとの併用治療がないことに加えて、対象に投与されるヒトＩＬ－２は抗ヒトＩＬ－２抗体と複合体を形成せず、特許請求される治療は、ラパマイシンともＴｅｆｆを抑制する任意の他の薬剤とも組み合わせられない（上記に開示される通り）。

【0067】

ヒト対象に好ましく投与される他の治療
現在、ＡＬＳの治療に利用可能な唯一の治療薬は、リルゾール（２－アミノ－６－（トリフルオロメトキシ）ベンゾチアゾール、ＣＡＳナンバー１７４４－２２－５、商標Ｒｉｌｕｔｅｋ（登録商標））、すなわち、下式の化合物である。

【化1】

【0068】

１９９５年にＦＤＡによってＡＬＳの治療薬として承認されたリルゾールは、１年生存率の９％の絶対増加に相当する２～３か月という短い中央値の生存利益と関連していることが示されている(Miller RG, et al. Cochrane Database of Systematic Reviews 2012, Issue 3. Art. No.: CD001447)。

【0069】

この短い生存利点は満足のいくものではないが、やはり治療を受けないよりは良く、従って、ほとんどのＡＬＳ患者はリルゾールによって治療される。

【0070】

よって、本発明の好ましい態様では、低用量ヒトＩＬ－２を用いる本発明の治療は、好ましくは、前記対象にリルゾールを投与することをさらに含む。

【0071】

ＡＬＳでは、リルゾールは一般に、１００ｍｇ／日の１日用量経口経路で使用され、約１２時間間隔で５０ｍｇの２回の等用量で摂取される。毒性がある場合には、約１２時間間隔で２５ｍｇの２回の等用量で摂取される経口経路による５０ｍｇ／日の１日用量などより低い１日用量を使用することができる。

【0072】

従って、本発明の治療がリルゾール治療と組み合わされる場合、リルゾールは、好ましくは、約１２時間間隔で２５ｍｇ～５０ｍｇの２回の等用量で摂取される、５０ｍｇ～１００ｍｇの１日用量で経口投与される。

【0073】

抗鬱薬（ＡＬＳ患者が抑鬱症状に苦しんでいる場合）、鎮痛薬（痛みを制限するため）、抗コリン作動薬（唾液過多症の場合）、および抗生物質（細菌感染の場合）を含む、ＡＬＳ患者に通常投与されるさらなる任意の治療を、本発明に関してＡＬＳ患者にさらに投与することができる。

【0074】

治療の生物学的効果
実施例１に示すように、本発明者らは、今般、ヒトＡＬＳ患者において低用量ヒトＩＬ－２を投与するたけで、
・Ｔｒｅｇの数／頻度を拡大すること、およびそれらの抑制機能を改善すること（特に、図２～５および表４と５を参照）、ならびに
・マクロファージの分極を炎症誘発性Ｍ１表現型から抗炎症性Ｍ２表現型へ変化セルこと
ができる。

【0075】

特に、ＩＭＯＤＡＬＳ臨床試験は、ヒトＡＬＳ患者において低用量ヒトＩＬ－２を投与するだけで、以下の両方が可能である。
・炎症性ケモカインＣＣＬ２の血漿濃度を低下させること（特に、図６Ａ参照）
ＣＣＬ２は、ＭＣＰ１としても知られるＣ－Ｃサブファミリーに属す小さな炎症性ケモカインであり、これはケモカイン受容体－２（ＣＣＲ２）を介してシグナルを伝達し、循環白血球を神経炎症の部位へ誘導し、疾患スコアと(Nagata T, et al. Neurol Res. 2007 Dec;29(8):772-6)、また、生存率と(Gille B et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2019 Dec;90(12):1338-1346)相関することが示されている。
よって、ＣＣＬ２濃度はＡＬＳ患者の疾病進行に対する効果の指標となる。
・ＣＣＬ１７および／またはＣＣＬ１８の血漿濃度を上昇させること（特に、図６Ａおよび図６Ｂ参照）。
ＣＣＬ１７およびＣＣＬ１８は、主として抗炎症性Ｍ２分極マクロファージによって発現されるケモカインである(Katakura T, et al. J Immunol. 2004 Feb 1;172(3):1407-13; Schraufstatter IU, et al. Immunology. 2012 Apr;135(4):287-98)。よって、ＣＣＬ１７および／またはＣＣＬ１８濃度の上昇は、マクロファージ分極の炎症誘発性Ｍ１表現型から抗炎症性Ｍ２表現型への変化の指標となる。

【0076】

従って、本発明に関して、治療は、好ましくは、以下のことを目的に行われる：
・Ｔｒｅｇの数の増加を誘導し、Ｔｒｅｇの免疫抑制機能を改善する；
・ＣＣＬ２血漿または血清または脳脊髄液（ＣＳＦ）濃度の低下を誘導する；および／または
・好ましくはＣＣＬ１７および／またはＣＣＬ１８血漿または血清またはＣＳＦ濃度の上昇を証拠とする、血液または中枢神経系（ＣＮＳ）における単球分極の、修復機能に関与するＭ２表現型へのシフトを誘導する。

【0077】

このことは以下によって達成され得る：
・上記の生物学的効果のうち少なくとも１つが得られる限り治療を継続すること、
・上記の生物学的効果のうち少なくとも１つを維持するためにヒトＩＬ－２の投与スキームを適合させること（本発明の全てにおいて使用される低用量スキーム内で）（用量および投与スキームに関する上記の節を参照）、および／または
・低用量ヒトＩＬ－２の投与（本発明の全てにおいて使用される低用量スキーム内で）が上記の生物学的効果のうち少なくとも１つをもたらすＡＬＳ患者を治療するために選択すること。

【0078】

この場合、Ｔｒｅｇの数および／または免疫抑制機能、またはＣＣＬ２、ＣＣＬ１７、またはＣＣＬ１８の血漿またはＣＳＦ濃度またはそれらの任意の組合せが、低用量ヒトＩＬ－２治療から利益を得るＡＬＳ患者を選択するためのバイオマーカーとして使用され、次にそれらを低用量ヒトＩＬ－２で治療する。

【0079】

以下の実施例は本発明を説明することを意図するにすぎない。

【実施例】

【0080】

実施例１：筋萎縮性側索硬化症における免疫調節－低用量インターロイキン－２の安全性および活性に関する第ＩＩ相試験（ＩＭＯＤＡＬＳ）
低用量ヒトＩＬ－２は、ＩＭＯＤＡＬＳ第２相臨床試験（ｃｌｉｎｉｃａｌｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ０２０５９７５９）においてＡＬＳ患者で試験された。

【0081】

患者および方法
試験計画および参加者
このプラセボ対象並行、２用量のｌｄ－ＩＬ－２の３群無作為化（１：１：１）二重盲検一施設試験は、３６人のＡＬＳ患者を含んだ。試験プロトコールは独立した倫理委員(Le Comite de Protection des Personnes Sud Mediterranee III; reference number: 2014.09.01 ter)により承認され、ｃｌｉｎｉｃａｌｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ０２０５９７５９で宣言され、Ｅｌ Ｅｓｃｏｒｉａｌ改訂版ＡＬＳ診断基準(Brooks BR, et al. Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord 2000; 1: 293-9)によって定義されるように可能性大、可能性大であり検査所見で裏づけられる、または確実なＡＬＳを有する７５歳未満の成人向けに計画された。主要選択基準は、疾患期間が５年未満で、リルゾール治療で３か月以上安定しており、肺活量が正常の７０％以上であることからなった。重度の心臓または肺疾患、癌、その他の生命を脅かす疾患、呼吸器または摂食補助、感染の臨床的徴候、陽性血清学（サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、またはヒト免疫不全ウイルス）、自己免疫疾患（無症候性橋本甲状腺炎を除く）の患者、臨床的に重大な検査異常（コレステロール、トリグリセリド、ブドウ糖を除く）、または機能評価を妨げる他の疾患は除外され、最初の試験的投与の８週間前にワクチン接種を受けた患者も除外した。全ての患者は、研究に参加する前に署名済みのインフォームドコンセントを提出した。

【0082】

無作為化およびマスキング
割り当ては、Ｗｅｂベースの包含および無作為化（ブロッキングを伴う）アプリケーションを介して行い、盲検化が保証された（それ以外の場合は試験に関与していない統計学者が無作為化リストを作成した）。ブロック（３）のサイズは、盲検を解除するまで、すべての参加者に公開されなかった。臨床治療ユニット（ＣＴＵ）の準備とラベル付けは、唯一の非盲検試験参加者である薬剤師によって行われた。全ての研究室アッセイが完全に盲検化された。サンプルは、データを作成する研究室には知らされていない無作為化番号、試験の時間（サンプリング時点の数＝７）、または治療群（プラセボ、１ＭＩＵ ＩＬ－２、２ＭＩＵ ＩＬ－２）に対応するバーコードによってのみ識別された。

【0083】

手順
調査医が選択すると、ベースライン評価が実施され、ルーチンの血液学および生化学、緩徐肺活量、改訂ＡＬＳ機能評価尺度（ＡＬＳＦＲＳ－Ｒ）、胸部Ｘ線、心電図（ＥＣＧ）および甲状腺機能を含んだ（図１）。無作為化後（１日目の最初の投与の２週間前まで）、患者は５日サイクルの１日１回の皮下注射を開始し、５日サイクルを５週目と９週目の２回繰り返し、患者ごとに合計３サイクルの治療とした（図１）。最後の治療サイクルの後、全ての患者は安全性モニタリングのためにさらに３か月追跡調査した。

【0084】

Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（アルデスロイキン）２２ＭＩＵバイアルは、Ｎｏｖａｒｔｉｓ－ｐｈａｒｍａ Ｆｒａｎｃｅから購入した。臨床試験ユニットの医薬製剤は、無作為化に従って０．５ｍｌのプラセボ（注射製剤用ブドウ糖Ｄ５％溶液）または１ＭＩＵまたは２ＭＩＵのＩＬ－２を含有する、視覚的に区別できない１ｍｌポリプロピレン注射器からなった。

【0085】

６か月の試験期間中に実施された評価を図１に示す。バイタルサイン、併用薬および有害事象は、各訪問時に評価した。緩徐肺活量は、現行の推奨事項に従って評価した(https://www.encals.eu/outcome-measures)。

【0086】

臨床的免疫表現型分析
臨床フローサイトメトリーは、採血の２時間以内に新鮮な血液で実施した。末梢血をＥＤＴＡチューブに採取し、モノクローナル抗体の２つのパネルで染色して、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ；ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^{ｌｏｗ／－}ＦｏｘＰ３^＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ１６／５６^＋）、Ｂリンパ球（ＣＤ１９^＋）および単球（ＣＤ１４^＋）を識別した。Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＣＤ３^＋Ｔ細胞は、全リンパ球に対するパーセンテージとして表し、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＣＤ３^＋細胞のパーセンテージとして表す。ＴｒｅｇおよびエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）（ＣＤ４^＋およびＴｒｅｇの差として計算）は、ＣＤ４^＋細胞に対するパーセンテージとして表す。単球は、ＣＤ４５＋白血球のパーセンテージとして表す。

【0087】

機械的免疫表現型分析
各試験訪問時に、２０ｍｌの血液をヘパリンナトリウムチューブに採取し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、凍結保存した。Ｔｒｅｇ機能の分析のために、凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、モノクローナル抗体のカクテル（下記参照）で染色し、５００個の選別されたＣＤ４^＋ＣＤ２５^－／ｌｏＣＤ１２７^＋エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）をＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉｇｈＣＤ１２７^ｌｏｗ Ｔｒｅｇの存在下または不在下、様々な比率（Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆ ０：１、１：２および１：１）で１×１０^３個のＣＤ１９^＋Ｂ細胞と共培養することによってＶ底９６ウェルプレートで抑制アッセイを確立した。細胞をＰＨＡ（４μｇ／ｍｌ；Ａｌｅｒｅ）で刺激し、３７℃、５％ＣＯ_２で６日間インキュベートした。増殖は、共培養の最後の２０時間に０．５μＣｉ／ウェルの［^３Ｈ］チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を添加することによって評価した。条件を６回反復して実施し、増殖測定値（１分あたりのカウント［ＣＰＭ］）の平均を取った。Ｔｅｆｆウェルのみからの平均増殖が３，０００ＣＰＭ未満のサンプルはいずれも除外した。各培養における抑制率は、下式を使用して計算した：抑制率＝１００－［（Ｔｒｅｇの存在下でのＣＰＭ÷Ｔｒｅｇの不在下でのＣＰＭ）×１００］。個人からの全ての時点を同時に分析した。

【0088】

臨床的免疫表現型分析および機械的免疫表現型分析に使用したフローサイトメトリー抗体の詳細
臨床的免疫表現型分析および機械的免疫表現型分析に使用した抗体は下表１に記載の通り。

【0089】

【表1】

【0090】

白血球におけるＴｒｅｇ活性化マーカーのトランスクリプトーム分析
ＬｅｕｋｏＬＯＣＫ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、患者の血液からＲＮＡを単離した。全血をＬｅｕｋｏＬＯＣＫフィルターで濾過して白血球を捕捉し、これらをＲＮＡｌａｔｅｒで凍結保存した（－８０℃）。次に、これらの細胞からＲＮＡを抽出し、質と量を測定した。続いて、標準プロトコールに従って、ＲＮＡを一本鎖ＤＮＡに変換し、Ｃｌａｒｉｏｍ Ｄマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に適用した。全てのアレイを正規化し、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｌｅ（ＴＡＣ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して転写レベル（遺伝子発現レベル）の変化を決定した。処理されたサンプルの転写産物は、倍数変化が１．２以上およびｐ値＝＜０．０５で増加または減少した場合、プラセボと有意に差次的に発現したと定義した。差次的に発現する遺伝子のいくつかは、Ｔｒｅｇの調節と発生に関連していた。

【0091】

血漿サイトカインの決定
血漿サイトカイン分析を－８０℃の凍結血漿サンプルで実施した。ＣＣＬ２およびＣＣＬ１７血漿サイトカインレベルをＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｈｕｍａｎ ＨＳ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｐａｎｅｌ－Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、ＣＣＬ１８をＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（ＤＣＬ１８０Ｂ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））により測定した。

【0092】

血漿ＮｆＬの決定
ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）の血漿濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して評価した。より正確には、ヒト血清中のＮＦ－ｌｉｇｈｔの定量的測定は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）によって行った。ＭＳＤ ＧＯＬＤプレート（Ｌ４５ＳＡ－１－ＭＳＤ）を、０．０５Ｍ炭酸バッファー、ｐＨ９．５（ｗ／ｖ、２／１００００）中、４℃で一晩、３０μｌの補足抗体（２７０１６－ＵｍａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、１：８８０希釈）でコーティングした。これらのプレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０／１×ＴＢＳ洗浄バッファーで３回すすぎ、１００μｌの３％Ｍｉｌｋ／１×ＴＢＳで室温（ＲＴ）にて１時間ブロッキングした。ロード前に、標準とサンプルをＨｅｔｅｒｏｂｌｏｃｋと混合した（それぞれ１：３４ ＳＤ３００および１：１７ ＳＤ ６００）。２５μｌの全てのサンプルを洗浄した後、標準および品質対照を２反復でロードした。次いでプレートをシェーカー上で１時間（ＲＴ）インキュベートした。洗浄（３×５分）後、２５μｌの検出抗体（２７０１７－ＵｍａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、１％ミルク洗浄バッファーで希釈した１：１２８２希釈液）を各ウェルに加え、シェーカー（ＲＴ）上で１時間インキュベートした。次に、ウェルあたり２５μｌのストレプトアビジンＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（Ｒ３２ＡＤ－５、ＭＳＤ）をシェーカー（ＲＴ）上で１時間インキュベートする前にプレートを洗浄した（３×５分）。洗浄（３×５分）後、１５０μｌの２倍リードバッファーを各ウェルに加えた。このプレートをＭＳＤ機で読み取った。各プレートにはキャリブレーター（０～１０００ｐｇ／ｍＬ）および品質対照を含んだ。アッセイ間分散係数はほとんど１０％未満であり、平均アッセイ内分散係数は１０％未満であった。

【0093】

血漿ＮＦＬもシモア法を用いて分析した。血漿中のＮｆＬ濃度は、従前に詳細に記載されているように(Gisslen M, et al. EBioMedicine. 2015 Nov 22;3:135-140)、単一分子アレイ プラットフォーム（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ、レキシントン、ＭＡ）で所内ＥＬＩＳＡを使用して測定した。サンプルは４倍希釈を用いて１回で実施し、これを最終結果の出力に対して補正した。各実施の最初と最後に２つのＱＣサンプルを２反復で実施した。濃度１０．９ｐｇ／ｍＬのＱＣサンプルの場合、再現性は３．７％であり、中間精度は５．４％であった。濃度１６８ｐｇ／ｍＬのＱＣサンプルの場合、再現性は２．９％であり、中間精度は３．４％であった。測定は、臨床データを知らされていない委員会認定の検査技師によって実施された。

【0094】

転帰
主要な薬力学的転帰は、臨床フローサイトメトリーによって測定された８日目のＣＤ４ ^＋Ｔリンパ球のパーセンテージとしてのＴｒｅｇの変化であった。二次的な薬力学は、全ての時点でのＴｒｅｇの数とパーセンテージであり、増加する曲線下面積（ｉＡＵＣ）としての表現、および疾患活動性のマーカーとしてのＣＣＬ２およびニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）の血漿レベルが含まれる。探索的分析には、フローサイトメトリーによる白血球集団の数と頻度の測定、ならびにＴｒｅｇ細胞機能検査が含まれた。ケモカイン産生プロファイル（ＣＣＬ１７およびＣＣＬ１８）の分析を通じて、治療に応答した単球分極を調査した。安全性は、所定の事象（注射部位反応、インフルエンザ様症状、倦怠感、胃腸症状、アレルギー反応）、異常なバイタルサイン、ＥＣＧ結果、胸部Ｘ線、臨床検査、および試験中に報告された全ての有害事象の体系的なチェックを通じて評価した。副次的な臨床転帰として、試験を通じて臨床機能（ＡＬＳＦＲＳ－Ｒおよび緩徐肺活量－ＳＶＣ）の経時変化を評価した。

【0095】

サンプルサイズ
従前のデータ(Thonhoff JR et al. Neurol Neuroimmunol Neuroinflammation 2018; 5: e465)は、各群６人の患者がｐα＝０．０５でＴｒｅｇの６０％増加を検出するために８８％の検出力を達成したことを示した（マン・ホイットニー検定）。疾患活動性への影響も主な関心事であるため、この数値が血漿ＮＦＬへの影響を観察するのに十分であり得ることを示唆する従前のＡＬＳ試験に基づき(Gaiottino J, et al. PloS One 2013; 8: e75091)、３か月および６か月で血漿ＮＦＬの４０％の減少を検出するために、ｐα（両側）＝０．０５で８０％の検出力を達成するために、各群１２人の患者を保持した（マン・ホイットニー検定）。

【0096】

暫定的な安全性データは、最初の１２人の患者が含まれ、最初の治療サイクルが完了し、その後８日目に評価された後に１回評価した（一次有効性）。この報告は、試験の終了まで非公開で維持された。

【0097】

統計分析
カテゴリー変数は、絶対頻度および相対頻度として記述される。量的変数は、平均、中央値、標準偏差および範囲によって要約される。フローサイトメトリーのパラメーターは、Ｄ８（一次基準）およびＤ６４でのベースラインからの変化として分析し、すなわち、各時点とベースラインＤ１の間の絶対差であり、最初のサイクル（Ｄ１、Ｄ８、Ｄ２９）および３番目のサイクル（Ｄ５７、Ｄ６４、Ｄ８５）の経時的測定の免疫細胞の全体的な変化は、増分時間正規化曲線下面積（ｉＡＵＣ、台形法を使用）からそれぞれＤ１値またはＤ５７値を差し引いたものとして要約し、トラフ値のｉＡＵＣｔは、Ｄ１、Ｄ２９、Ｄ５７およびＤ８５において測定された値からＤ１を差し引いたものを使用して計算した。好酸球数は、サイトメトリーパラメーターと同じ方法で分析した。ＡＬＳＦＲＳ－Ｒ測定値は、Ｄ１からＤ８５までの回帰勾配によって要約した。ＳＶＣとＮＦＬについては、Ｄ８５とベースラインＤ１の間の絶対差を分析した。ＣＣＬ２、ＣＣＬ１７およびＣＣＬ１８については、Ｄ６４でのベースライン正規化値を分析した。

【0098】

クラスカル・ウォリス検定を使用して、３つの試験群間の差を検定した。ｐ＜０．０５で有意差が検出された場合は、検出された差を特定するためのペアワイズ比較にマン・ホイットニー検定を使用した。

【0099】

転帰変数の変化が用量レベル全体で常に増加しているかどうかを評価する一元配置分散分析を使用して、要約尺度（summary measure）の用量反応関係を分析した（線形傾向検定）。

【0100】

結果
試験の実施
２０１５年９月２１日から１２月４日に、３９人の患者がスクリーニングされた。そのうち３人は除外され、３６人が無作為化された（図１）。１２人の選択と１サイクルの治療の後、独立したデータ安全監視委員会は安全上の懸念を認めず、選択を続けた。１例の例外を除いて（図１参照）、無作為化された全患者は、３か月にわたって３サイクルの治療を完全に終え、治療後３か月の追跡調査を行った。無作為化された３６人の患者全員が、治療目的集団と安全集団に含まれていた（図１）。試験の主要／副次転帰の臨床測定および検査測定で可能な最大２５２の評価のうち、１つを除いて全てが分析に利用可能であった（図１）。

【0101】

患者の特徴と病歴
ベースラインの差は統計的に有意ではなかったが、２ＭＩＵ群の患者は男性に対する女性の比率が高く、疾患の特徴がやや重度であった（臨床パラメーターに関しては以下の表２、ベースライン時の絶対数として表される免疫細胞パラメーターについては表４（Ｄ１列）、頻度として表される免疫細胞パラメーターについては表５、およびニューロフィラメントについては表６を参照）。結果に影響を与える明らかな不均衡は群間でやはり確認されなかった。

【0102】

【表2】

【0103】

安全性および忍容性
臨床的忍容性は、ＩＬ－２の両用量で満足のいくものであった。全追跡調査中（Ｄ１～Ｄ１６９）、薬物関連の重篤な有害事象（ＳＡＥ）は発生せず、ほとんどの薬物関連の非重篤な有害事象（ＮＳＡＥ）は一過性で軽度～中等度であった（下表３参照）。

【0104】

【表3】

【0105】

治療期間中（Ｄ１～Ｄ８５）、サイクル中にＮＳＡＥを呈する患者の頻度は、プラセボのｎ＝３（２５．０％）と比較してＩＬ－２群で高く、１および２ＭＩＵ／日用量でそれぞれｎ＝１１（９１．７％）およびｎ＝１２（１００％）であった（表３）。注射部位の局所反応（紅斑、疼痛）は、２つの実薬治療群（注射部位反応を呈した１人を除く全て患者）で同程度の頻度の最も一般的なＮＳＡＥであったが、プラセボ群では１人の患者のみがそのような事象を報告した。Ｉｌ－２治療の特徴であるインフルエンザ様症状(筋肉痛、悪寒、発熱、関節痛を含む)(Hartemann A et al. Lancet Diabetes Endocrinol 2013; 1: 295-305)が２ＭＩＵ／日の用量でのみ報告された（２５％）。２ＭＩＵ／日群の１人の患者は、矯正治療に応答しない重度のインフルエンザ様症状のため、３サイクル目の２日間の治療後に治療を中止した（図１参照）。

【0106】

治療サイクル外では、悪心／嘔吐の１例のみが、他のＡＥの中でも治療に起因していた。前立腺腺腫の既往のある１人の患者（１ＭＩＵ／日群）は、最終投与の１０日後に重度の尿閉を発症し、前立腺手術のために入院を必要とした。その他の事象は、ＡＬＳ疾患またはその他の既存の状態に関連していた。

【0107】

２ＭＩＵ／日の群でインフルエンザ様症状を呈する１人の患者で８日目にＣＲＰが上昇し、また別の患者でウイルス感染に関連してＤ５７にＣＲＰが上昇したことを除いて、通常の検査パラメーターに異常は見られなかった。血液学パラメーターに関しては、２ＭＩＵ／日群のＤ８およびＤ６４でプラセボと比較して有意に増加した好酸球数を除いて、有意な変化は見られず（下表４および５参照）、１ＭＩＵ／日でより程度の低い変化が見られ、Ｄ６４でのみ有意であった。２ＭＩＵ／日群では、３人の患者が１．５×１０^９／ｌを超える好酸球の増加を示したが、無症候性のままであり、全てのカウントはＤ１６９のベースライン値に近く（群間で有意差はない）、全て通常の範囲内であった。

【0108】

【表4】

【0109】

【表5】

【0110】

末梢血単核細胞に対するＬｄ ＩＬ－２効果
８日目のＣＤ４＋Ｔリンパ球のパーセンテージとしてのＴｒｅｇの頻度の増加の先験的に定義された主要な薬力学的転帰は、２ＭＩＵ群と１ＭＩＵ群の両方で有意性が高かった（マン・ホイットニーのＵ検定によりｐ＜０．０００１）（プラセボ（平均［ＳＤ］：－０．５％［１．２］）と比較した場合、２ＭＩＵ：平均［ＳＤ］：＋６．２％［２．２］；１ＭＩＵ：平均［ＳＤ］：＋３．９％［１．２］、上記の表４および図２Ａ～Ｂを参照）。両ＩＬ－２群の効果サイズは大きかった：２ＭＩＵ ＥＳ＝３．７（ＩＣ９５％：２．３～４．９）；１ＭＩＵ ＥＳ＝３．５（ＩＣ９５％：２．１～４．６）。さらに、ベースラインからのＴｒｅｇ頻度の変化を調べると、全てのＩＬ－２レシピエントで明確な違いが見られ（増加範囲２３～１３９％）、プラセボ群（変化範囲－５１～９％）との重複はなかった（図２Ｂ）。Ｔｒｅｇの副次転帰は、その後の治療サイクル中にベースラインおよびプラセボと比較して頻度および絶対数が有意に増加したことを明らかにした（図２Ａ～Ｄ、上記の表４および５）。さらに、サイクル３中のピークは、サイクル１中に見られたものよりも高く、連続的治療サイクルには累積的であり得る残留効果があることを示唆する。この示唆は、プラセボと比較して、ＩＬ２群のｉＡＵＣトラフＴｒｅｇレベル（新しいサイクルを開始する前に残存Ｔｒｅｇ変化を測定）が有意に高いことによってさらに裏付けられる（図２Ｅ～Ｆ、上記の表４および５）。一般に、２ＭＩＵ群では、１ＭＩＵ群よりもＴｒｅｇピークおよびトラフのレベルが高くなった。Ｌｄ ＩＬ２はまた、両ＩＬ－２群でＮＫ細胞の頻度および数に適度の増加（２ＭＩＵ群ではＤ６４で数が最大１．７倍増加）、両ＩＬ－２群ＣＤ８ Ｔ細胞数の増加（２ＭＩＵ群ではＤ６４で数が最大１．４倍増加）、両ＩＬ－２群のＣＤ４ Ｔｅｆｆの数の増加（２ＭＩＵ群ではＤ６４で数が最大１．６倍増加）およびｄ６４での２ＭＩＵ群で単球頻度の減少をもたらした（データは全て上記表４および５に示される）。

【0111】

Ｔｒｅｇの表現型および機能の探索的分析は、凍結保存されたＰＢＭＣを使用して行われ、主としてベースライン時と３サイクルの治療後（１日目と６４日目）の応答に焦点を当てた。本発明者らは、臨床サイトメトリーによって血液において定義されたＴｒｅｇの頻度と、凍結保存されたＰＢＭＣからＴｒｅｇを選別した場合との間に良好な相関関係を認めた（Ｒ^２＝０．９１、ｐ＜０．０００１）。新鮮な血液での結果と同様に、凍結保存されたＰＢＭＣの分析により、３サイクルのＩＬ－２治療後にＴｒｅｇの頻度が有意に増加することが明らかになった（図３Ａ～Ｃ）。さらに、同じ日の単一の個人からの全時点のバッチ分析により、治療前後のＣＤ２５発現の直接比較が可能になり、治療に応答したＴｒｅｇ上の発現の用量依存的な増加が明らかになった（Ｄ１対Ｄ６４のＣＤ２５ ＭＦＩ中央値および範囲）：２ＭＩＵ＝４６５１、範囲２８９２～５８８６と、９０１５、範囲４２２０～１４４４６、ｐ＝０．００２；１ＭＩＵ＝４２３０、範囲３３８８～５４２３と、７７７８、範囲５５６４～９０３７、ｐ＝０．００１；プラセボ＝４１０５、範囲２９９２～５６５６と、３８６７、範囲１９２３～５６６９、ｐ＝０．８３；図４Ａ～Ｃ）。ＣＤ２５発現の小さいがなお有意な増加が、エフェクターＴ細胞でも認められた（Ｄ１対Ｄ６４のＣＤ２５ ＭＦＩ中央値および範囲：２ＭＩＵ＝４２６、範囲１１６～８９７対、５２８、範囲１２２～９４８、ｐ＝０．０２；１ＭＩＵ＝３３６、範囲１３２～４７８対、３６２、範囲１２４～５７７、ｐ＝０．００１；プラセボ＝２５１、範囲１９５～９１９対、２６３、範囲１５８～８８１、ｐ＝０．２４、図３Ｄ～Ｆ）。Ｔｒｅｇ機能は、応答細胞として対応する時点からのエフェクターＴ細胞を使用したイン・ビトロ共培養アッセイによって評価された。Ｔｒｅｇを欠く培養では、応答Ｔ細胞の増殖に対するＩＬ－２投与の効果は見られなかった（図３Ｇ～Ｉ）。しかしながら、本発明者らは、３サイクルのＩＬ－２治療後にＴｒｅｇの抑制機能の増大を認め、１ＭＩＵ用量で統計的有意性に達した（Ｄ１対Ｄ６４の抑制率％中央値、範囲：２ＭＩＵ＝５３％、範囲１８～８８％対、７６％、範囲１９～９１％、ｐ＝０．０６；１ＭＩＵ＝６５％、範囲２３～８４対、８０％、範囲３６～９７％ ｐ＝０．００１；図４Ｄ～Ｅ）。対照的に、プラセボ群ではＴｒｅｇ機能のわずかな減少が見られた（ｄ０対ｄ６４の抑制率％の中央値、範囲：プラセボ＝７３％ 範囲５３～９５％対、５９％ 範囲３２～９７％；ｐ＝０．０７；図４Ｆ）。治療期間にわたるＴｒｅｇ抑制機能のパーセント変化を比較すると（ベースライン時の抑制と比較）、プラセボと比較した場合、ＩＬ－２で治療した両群間に有意差が認められた（２ＭＩＵ対プラセボ、ｐ＝０．００８；１ＭＩＵ対プラセボ、ｐ＝０．００５；図４Ｇ）。また、本発明者らは、各個人の治療に応じたＴｒｅｇ頻度およびＣＤ２５発現の変化とＴｒｅｇ抑制機能の変化との関係を評価した。本発明者らは、これらの測定値と、治療群に基づく個人のクラスタリングとの間に極めて有意な相関関係を認めた（Ｔｒｅｇ頻度、ｐ＝０．０００１、Ｒ^２＝０．４２；Ｔｒｅｇ ＣＤ２５ ｍｆｉ、ｐ＝０．００１、Ｒ^２＝０．３３、図４Ｈ～Ｉ）。

【0112】

白血球トランスクリプトームに対するＬｄ ＩＬ－２効果
Ｄ６４に白血球で得られたトランスクリプトームデータを図５に示し、白血球で次のＴｒｅｇ活性化マーカー（ＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ４、ＩＫＺＦ２およびＩＬ２ＲＡ）の遺伝子発現が増加していることを示す。患者が１ＭＩＵまたは２ＭＩＵで治療された場合、６５日目に低用量ＩＬ－２治療を３サイクル行った後、非治療（プラセボ）群と比較して、これらの各遺伝子の発現の用量依存的増加が見られた。

【0113】

血漿サイトカイン濃度に対するＬｄ ＩＬ－２の効果
本発明者らは、以前にＡＬＳ（ＣＣＬ２）またはマクロファージ／ミクログリア分極に関連するもの（ＣＣＬ１７およびＣＣＬ１８）を有する個人で上昇することが報告されたサイトカイン／ケモカインの血漿レベルを評価した。３回目の治療サイクル（Ｄ６４）の後、本発明者らは、ＣＣＬ２の血漿レベルにおいて３群の間で差を認め（ｐ＝０．００５、図６Ａ）、両有効用量群ともＣＣＬ２レベルの用量依存的変化を示し、これは２ＭＩＵ用量ではプラセボと比較して有意に減少したが（ｐ＝０．００５）、１ＭＩＵ用量では統計学的有意性に達しなかった（ｐ＝０．０６）。本発明者らはまた、ＣＣＬ１７およびＣＣＬ１８においてＤ６４で治療群間に差を認め（それぞれｐ＝０．００００１と０．００２８、図６Ｂ～Ｃ）、プラセボと比較して両治療群で増加が見られた（ＣＣＬ１７：２ＭＩＵ ｐ＝０．０００１および１ＭＩＵ ｐ＝０．０１３８；ＣＣＬ１８：２ＭＩＵ ｐ ＝０．００１２および１ＭＩＵ ｐ＝０．００９４）。これらの結果は、ｌｄ ＩＬ－２治療が、ＡＬＳに関連する炎症マーカーＣＣＬ２の減少と、それに伴う単球のＭ２表現型への移行と関連していたことを示唆する。

【0114】

ＡＬＳＦＲＳ－Ｒ、緩徐肺活量および血漿ＮＦＬの経時的変化（Ｄ１～Ｄ８５）によって評価される疾患進行に対するＬｄ ＩＬ－２の効果
ＡＬＳＦＲＳ－Ｒスコア（クラスカル・ウォリス＝４．２５、ｐ＝ＮＳ）、緩徐肺活量（クラスカル・ウォリス＝１．０７、ｐ＝ＮＳ）、または血漿ＮＦＬレベル（クラスカル・ウォリス＝０．３４、ｐ＝ＮＳ）の経時的変化に関して３群に有意差はなかった。ＮＦＬの場合、ＳＩＭＯＡアプローチを使用した血漿サンプルの再分析によっても同様の結果が得られた（クラスカル・ウォリス＝２．４４、ｐ＝ＮＳ）。しかしながら、集団全体では、これらのパラメーターに３か月の治療期間にわたって統計学的に有意な変化を示すものはなかった－ＡＬＳＦＲＳ－Ｒ（ポイント／月）平均勾配［９５％ＣＩ］＝－０．８［－２．４，＋０．８］；ＳＶＣ（予測パーセント）ｄ８５におけるｄ１からの平均変化［９５％ＣＩ］＝－２．２［－２３．４，＋１９．０］；ｄ８５におけるｄ１からのＮＦＬ－Ｅｌｉｓａ変化、（ｐｇ／ｍｌ）平均変化［９５％ＣＩ］＝＋０．６３［－６２．５，＋６３．７］；ｄ８５におけるｄ１からのＮＦＬ－ＳＩＭＯＡ変化、（ｐｇ／ｍｌ）平均変化［９５％ＣＩ］＝－１．６４［－２６．２５、＋２２．９７］－これらのパラメーターは、３か月の期間にわたる変化に対する感受性は低かった。

【0115】

さらに、血漿ＮＦＬレベルに関して、全ての治療群におけるベースラインレベルの変動が大きいことは（下表６参照）、選択されたサンプルサイズに関する有意な観察を妨げると思われる。

【0116】

【表6】

【0117】

有意な観察がなされないにもかかわらず、Ｄ８５での血漿レベルの変化には傾向があり、血漿ＮＦＬレベルはプラセボ群で増加する傾向があるが（何らかの疾患の進行を示唆する）が、１または２ＭＩＵ用量で治療したＡＬＳ患者ではそうではなかったことが示唆される（図７参照）。

【0118】

結論
まず、本発明者らの結果は、２用量のｌｄ ＩＬ－２が３サイクルにわたってＡＬＳ患者に臨床的に十分忍容され、治療中止後にそれ以上の安全性問題は検知されなかったことを示す。従前の報告に沿って(Koreth J et al. N Engl J Med 2011; 365: 2055-66; Saadoun D et al. N Engl J Med 2011; 365: 2067-77; Hartemann A et al. Lancet Diabetes Endocrinol 2013; 1: 295-305; Castela E et al. JAMA Dermatol 2014; 150: 748-51)、本発明者らの所見は、治療毒性に対して特に脆弱なＡＬＳ患者がｌｄ ＩＬ－２による反復治療サイクルに耐え得ることを明確に示している。ｌｄ ＩＬ－２の安全性は、全ての群間、およびプラセボを含む群内で、治療期間にわたってＡＬＳＦＲＳ－ＲまたはＳＶＣに有意な悪化がないことによってさらに裏付けられる。

【0119】

第二に、本発明者らは、２ＭＩＵ群と１ＭＩＵ群の両方で、Ｔｒｅｇの絶対数と相対頻度の両方で有意な用量依存的増加を認めた。これらの結果を１型糖尿病患者における二重盲検無作為化臨床試験で得られた結果と比較し（Ｔ１Ｄ；Hartemann A et al. Lancet Diabetes Endocrinol 2013; 1: 295-305）、本発明者らは、ｌｄ ＩＬ－２に対するＴｒｅｇの応答の大きさは同程度であることを見出し、１ＭＩＵで５日間治療した後のＣＤ４細胞のＴｒｅｇパーセンテージ（Ｔｒｅｇ頻度）は、１．５倍前後の増加であった。

【0120】

注目すべきは、積極的治療中の両群の全ての個人が、Ｔｒｅｇの数と頻度の増加を示したことである。従って、ＡＬＳ患者のＴｒｅｇはＩＬ－２に対する内因性応答性を損なっている可能性があることが示唆され(Thonhoff JR et al. Neurol Neuroimmunol Neuroinflammation 2018)、それらをｌｄ ＩＬ－２治療に不応答とする可能性があるが、このＡＬＳ患者のコホートでは、本発明者らは、ｌｄ ＩＬ－２ に対するＴｒｅｇの応答性に本質的な障害があるという証拠を認めなかった。これは、Ｔｈｏｎｈｏｆｆらによって示唆されていたこととは対照的に、患者のＴｒｅｇの事前の単離、エクス・ビボ増幅および患者への再注入を必要とせずに、ｌｄＩＬ－２を投与するだけでＡＬＳ患者のＴｒｅｇを有意に拡大できることを意味することから極めて重要である。その簡単さとはるかに低いコストのために、ｌｄＩＬ－２の簡単な投与に基づく提案された治療がはるかに多くのＡＬＳ患者に利用可能とすることができる。

【0121】

第三に、本発明者らは、Ｔｒｅｇ応答の増加が５日間の治療サイクルの後に４週間にわたって持続したことを示した。最適な臨床効果にはおそらくＴｒｅｇレベルの持続的な増加が必要になるので、これは重要である。本発明者らは、Ｔ１Ｄの研究(Hartemann A et al. Lancet Diabetes Endocrinol 2013; 1: 295-305)に基づいて治療スケジュールを選択し、本研究では、Ｔｒｅｇの数と頻度がトラフレベル（すなわち、次の治療サイクルの開始前）で大幅に増幅し、また、この増幅がサイクルを繰り返すと増加することを確認している。しかしながら、本発明者らの治療スケジュールがＡＬＳの神経炎症を制御するのに最も効果的であるかどうか、または異なる治療スケジュール（例えば、ｌｄ ＩＬ－２のより頻繁な投与）が治療的により有用であるかどうかはまだ分からない。

【0122】

まとめると、本発明者らの所見は、このＡＬＳコホートでは、反復投与によるｌｄ ＩＬ－２に対する感受性の喪失がなかったことを示唆する。これと一致し、他の報告(Todd JA, et al. PLoS Med. 2016 Oct 11;13(10):e1002139; Hirakawa M, et al. JCI Insight. 2016 Nov 3;1(18):e89278)と一致して、ｌｄ ＩＬ－２がＴｒｅｇ上でのＣＤ２５発現の優先的増加をもたらすことを認めた。これにより投与されたＩＬ－２と内因性のＩＬ－２の両方に対するＴｒｅｇ細胞の感受性が高まり、治療効果が増強され持続する可能性がある。

【0123】

Ｔｒｅｇ数の変化と治療効果との関連を理解するために、本発明者らはｌｄ ＩＬ－２投与前後のＴｒｅｇ機能を評価した。実際、ＡＬＳ患者では、Ｔｒｅｇは数が減少するだけでなく、ＦＯＸＰ３の発現レベルも低下し(Henkel JS et al. EMBO Mol Med 2013; 5: 64-79)、機能不全になる(免疫抑制の低下、Beers DR et al. JCI Insight. 2017;2(5):e89530)ことが示され、ＦＯＸＰ３レベルの低下と免疫抑制機能の低下の両方が疾患進行と相関している(Beers DR et al. JCI Insight. 2017;2 (5):e89530; Thonhoff JR et al. Curr Opin Neurol 2018; 31: 635-9)。本発明者らは、自家共培養アッセイを使用して、ＦＡＣＳで単離されたＴｒｅｇがＣＤ４エフェクターＴ細胞の増殖を抑制する能力を測定した。私たちの結果は、全体として、ｌｄ ＩＬ－２による治療がＴｒｅｇ頻度とＴｒｅｇ抑制機能の両方に増加をもたらすことを示す。Ｔｒｅｇ機能のこの改善は、１ＭＩＵ群で有意性が高く、全ての個人が機能の増大を示す。２ＭＩＵ群では、個人間の応答の変動が増加したため、有意傾向（ｐ＝０．０６）のみが認められた（図４）。ｌｄ ＩＬ－２の二重の有効性は、Ｔｒｅｇ頻度の増加と機能との間の有意性の高い相関によって示されるが、本発明者らはまた治療応答に個々の変動も認め、治療を受けた個人にはＴｒｅｇ頻度またはＴｒｅｇ機能のいずれかにより有意な変化を示した者と、両方に増加を示す者がいた。逆に、プラセボ群の個人は、同じ時間枠でＴｒｅｇの頻度または機能のいずれかを喪失する傾向があった。

【0124】

さらに、Ｄ６４の白血球で得られたトランスクリプトームデータは、白血球で次のＴｒｅｇ活性化マーカー（ＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ４、ＩＫＺＦ２およびＩＬ２ＲＡ）の遺伝子発現にＩＬ－２用量依存的な増加があることを示す。これらの結果は、ＡＬＳ患者におけるｌｄ ＩＬ２投与がＴｒｅｇ免疫抑制機能を増強するという本発明者らの所見をさらに強化する。さらに、ＴｒｅｇのＦＯＸＰ３発現レベルは疾患進行と相関することが示されているため(Beers DR et al. JCI Insight. 2017;2(5):e89530; Thonhoff JR et al. Curr Opin Neurol 2018; 31: 635-9)、これらの結果は、ＡＬＳ患者における低用量ヒトＩＬ－２投与の治療効果をさらに裏付ける。

【0125】

ＡＬＳ疾患活動性の血液マーカーに対するｌｄ ＩＬ－２の効果に関して、ＣＣＬ２の血漿濃度の有意かつ用量依存的な低下を見出し、このＣＣＬ２は、ケモカイン受容体－２（ＣＣＲ２）を介してシグナルを伝達し、循環白血球を神経炎症部位に誘導するＣ－Ｃサブファミリーに属する小さなケモカインである。ＣＣＬ２ノックアウトマウスは、自己免疫および炎症のモデルにおいて、神経炎症への循環白血球の浸潤の低下および疾患抵抗性を示し、この経路が病因を促進する役割を果たしていることを示唆する。さらに、ＡＬＳ患者の神経組織ではＣＣＬ２発現レベルの上昇が認められており、発現はマクロファージとミクログリアの浸潤と活性化に関連している(Henkel JS, et al. Ann Neurol. 2004 Feb;55(2):221-35; Baron P, et al. Muscle Nerve. 2005 Oct;32(4):541-4)。体液中のＣＣＬ２レベルは、ＡＬＳ患者でも上昇し(Martinez HR, et al. Neurologia. 2017 Oct 10. pii: S0213-4853(17)30280-3; Gille B et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2019 Dec; 90(12):1338-1346, Gupta PK, et al. J Neuroinflammation. 2011 May 13;8:47; Kuhle J, et al. Eur J Neurol. 2009 Jun;16(6):771-4; Baron P , et al. Muscle Nerve. 2005 Oct;32(4):541-4)、疾患スコア(Nagata T, et al. Neurol Res. 2007 Dec;29(8):772-6)および生存(Gille B et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2019 Dec;90(12):1338-1346)と相関することが示され、ＣＣＬ２が疾患活動性の有用なバイオマーカーであることを示している。従って、ＩＭＯＤＡＬＳにおけるＣＣＬ２の血漿濃度の有意かつ用量依存的な減少の所見は、ＡＬＳ患者における低用量ヒトＩＬ－２投与の治療効果をさらに裏付ける。

【0126】

興味深いことに、ｌｄ ＩＬ－２治療はまた、マクロファージ／ミクログリア分極の抗炎症性Ｍ２様表現型への変化に合わせて、ＣＣＬ１７およびＣＣＬ１８の血漿レベルの有意な増加とも関連していた(Katakura T, et al. J Immunol. 2004 Feb 1;172(3):1407-13; Schraufstatter IU, et al. Immunology. 2012 Apr;135(4):287-98)。全体として、マクロファージの活性化炎症性バイオマーカーと分極の変化は、ＡＬＳの進行に関連する細胞変性ミクログリアの活性化の制御におけるｌｄ ＩＬ－２の役割と一致している。

【0127】

Ｔｒｅｇは、マクロファージの活性化と分極に影響を与えることが知られており（主としてＭ２様の表現型へ）(Tiemessen MM, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Dec 4;104(49):19446-51)、これらの変化は、ｌｄ ＩＬ－２療法によって誘発されたＴｒｅｇの数または機能的能力の増大の直接的な結果である可能性が浮上している。しかしながら、単球－マクロファージ系列の細胞は機能的なＩＬ－２受容体を発現する(Ohashi Y, et al. J Immunol. 1989 Dec 1;143(11):3548-55; Wahl SM, et al. J Immunol. 1987 Aug 15 ;139(4):1342-7)、およびＣＤ２５（ＩＬ２ＲＡ）の発現は炎症状態で増加し(Espinoza-Delgado I, et al. J Immunol. 1992 Nov 1;149(9):2961-8; Dendrou CA , et al. Nat Genet. 2009 Sep;41(9):1011-5)、マクロファージ／ミクログリア分極はこれらの細胞に直接作用するｌｄ ＩＬ－２の直接的な結果としても起こり得る可能性が浮上している。

【0128】

最後に、治療による血漿ニューロフィラメント軽鎖レベル（ＮＦＬ）の統計学的に有意な変化は認めることができなかった。従前に公開されているデータに基づき(Gaiottino J, et al. PloS One 2013; 8: e75091)、本発明者らは各群比較的少数の患者で治療効果を検出できるはずであると推定した。しかしながら、この無作為化（かつ厳密な盲検）試験に関して、事後検出力分析は、これが大幅に過小評価されており、ＮＦＬ血漿レベルで見られた変化を実証するためには、特に、ベースライン時に全ての治療群でＮＦＬ血漿レベルに大きな変動がある場合には、はるかに大きなサンプルが必要であったことを示唆している（上記の表６）。しかしながら、統計学的有意性がないにもかかわらず、プラセボ群では血漿ＮＦＬが経時的に増加しているのに対し、治療群では増加していないことを示唆する明確な傾向があり、これはｌｄ ＩＬ２治療に関連した疾患活動性の低下と一致している。

【0129】

結論として、本試験は、ｌｄ－ＩＬ－２がＡＬＳ患者において３か月サイクルにわたって安全であることを示す。さらに、本発明者らは、ｌｄ ＩＬ－２によるＴｒｅｇの数、頻度および機能のｉｎ ｖｉｖｏ増幅の明確な証拠を提供する。Ｔｒｅｇ機能は疾患の進行と相関しているため(Beers DR et al. JCI Insight. 2017;2(5):e89530; Thonhoff JR et al. Curr Opin Neurol 2018; 31: 635-9)、これらの結果は、ＡＬＳ患者におけるｌｄ ＩＬ－２の治療効果を裏付ける。重要なこととして、ＡＬＳ患者の血漿およびＣＳＦにおける上昇したＣＣＬ２および疾患スコア(Nagata T, et al. Neurol Res. 2007 Dec;29(8):772-6)および生存率(Gille B et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2019 Dec;90(12):1338-1346)との相関に関する従前の所見を鑑みれば、血漿ＣＣＬ２がｌｄ ＩＬ－２治療に対して用量依存的に減少するという本発明者らの所見は、ＡＬＳ患者におけるｌｄ ＩＬ－２の治療効果をさらに裏付ける。結果として、これらの所見に基づく第２／３相試験が進行中である（ＭＩＲＯＣＡＬＳ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ０３０３９６７３、実施例２参照）。

【0130】

実施例２：ＭＩＲＯＣＡＬＳ：免疫応答の修飾およびＡＬＳの転帰（ＭＩＲＯＣＡＬＳ）
ＩＭＯＤＡＬＳ試験で得られた極めて肯定的なデータ、特に疾患進行のマーカーであるＣＣＬ２の血漿濃度の有意な低下、およびマクロファージの分極の炎症性Ｍ１表現型から抗炎症および修復表現型Ｍ２への変化に関するものに従い、ＡＬＳに対する低用量ヒトＩＬ－２のプラスの効果を確認するために「ＭＩＲＯＣＡＬＳ」と呼ばれる新規の第ＩＩ相試験が開始された。

【0131】

患者および方法
「Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ＯｕｔＣｏｍｅｓ ｉｎ ＡＬＳ」プロジェクト（ＭＩＲＯＣＡＬＳ）は、ｌｄ ＩＬ－２治療がＣＳＦニューロフィラメントおよびＣＣＬ２レベルの早期変化によって測定されるようなＡＬＳ患者のニューロン損傷率の低下をもたらす、また、この早期変化は、１８か月の治療期間にわたる生存によって評価されるような長期臨床効果を予測するという仮説を概念実証／メカニズム証明（ＰｏＣ／ＰｏＭ）試験で検証する。

【0132】

デザイン：これは、低用量ＩＬ－２を２ＭＩＵ／日で４週間毎に５日間、１８か月間の、二重盲検、無作為化、層別化（発症の国および施設での）プラセボ対照、並行群試験である。試験の前には、リルゾール治療の安全性と安定性を確立するための３か月の導入期間がある。

【0133】

治療：注射用の０．６ｍｌの２ＭＩＵアルデスロイキン溶液または０．６ｍｌの５％ブドウ糖水のいずれかを含有する５本の１ｍｌ充填済みポリプロピレン注射器で構成されるすべての治療パッケージは、無菌および温度管理された条件の中央薬局で調製、ラベル付け、包装される。忍容性が低い場合、ＰＩは、患者のコンプライアンスを管理するために、１ＭＩＵ（０．３ｍｌ）または０．５ＭＩＵ（０．１５ｍｌ）の柔軟な用量減を処方することが許容される。

【0134】

主要評価項目：１８か月の治療期間にわたる長期生存、ＣＳＦ－ｐＮＦＨおよびＣＣＬ２レベルの早期変化（４か月の治療）。

【0135】

副次評価項目：８か月の治療にわたるｌｄ ＩＬ－２療法の長期安全性、機能低下に対する有効性（ＡＬＳＦＲＳ、肺活量）、免疫炎症のケモカインマーカー（ＣＳＦおよび血液）、免疫細胞測定法（血液））、およびｐＮＦＨレベル（ＣＳＦおよび血液)。

【0136】

補助試験：ｌｄ ＩＬ－２応答患者および非応答患者のゲノミクスおよびトランスクリプトミクスプロファイリングによる薬物介入のための新しい生体分子標的。

【0137】

測定：主要な検査室測定（ＣＳＦおよび血中のｐＮＦＨおよびＣＣＬ２、ならびに血液免疫細胞測定法）は、ＧＣＬＰ条件下の中央検査室で実施される。追加の支持免疫炎症マーカーおよびオミクス調査は学術研究所で実施される。

【0138】

患者の選択基準：導入期間の選択：Ｅｌ Ｅｓｃｏｒｉａｌによるデ・ノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）患者、可能性大、または可能性大であり検査所見で裏づけられる、または確実なＡＬＳ、疾患期間≦２４か月、肺活量≧正常の７０％、以前または現在のリルゾール治療がないこと、署名済みのインフォームドコンセント。

【0139】

ＲＣＴ期間：疾患期間≦２７か月、「以前または現在のリルゾール治療なし」を「３か月間リルゾール治療で安定」に置き換えたことを除いて同じ基準。

【0140】

患者除外基準：腰椎穿刺；その他の生命を脅かす疾患；機能評価を妨げる他の疾患；過去５年以内の癌（安定した非転移性基底細胞皮膚癌または子宮頸部の上皮内癌を除く）；重度の心疾患または肺疾患；無症候性橋本甲状腺炎を除く、文書化された自己免疫障害、避妊をしていない、または妊娠または授乳中の妊娠可能年齢の女性；臨床的に重大な検査異常（コレステロール、トリグリセリド、グルコースを除く）に対しては禁忌。

【0141】

統計分析：一次有効性分析では、（ｉ）層別ログランク検定を使用し、および（ｉｉ）年齢、肺活量、およびＡＬＳＦＲＳスコアを含む予後因子候補の調整（Ｃｏｘモデル分析）に従って生存率について治療群を比較する。無作為化からＭ４へのｐＮＦＨおよびＣＣＬ２の変化、および免疫細胞測定パラメーターは、分散／共分散分析（ＡＮＯＶＡ／ＡＮＣＯＶＡ）を使用して分析される。関数（ＡＬＳＦＲＳおよびＳＶＣ）の反復測定の分析は、有益な打ち切りデータの共同ランク分析法を使用して実施する。

【0142】

患者数：ｐα（両側）＝０．０５で検出力＞０．８０となるように、全体で２１６人の患者を各群１０８人の患者で無作為化し、１８か月で１７％の死亡率の絶対差を検出する（プラセボ予想生存率：ｌｄ ＩＬ－２群で０．６５対０．８２）、これは死亡リスクの５４％の減少を表す（ＲＲ ｌｄ ＩＬ－２／ＰＬＡ＝０．４６）。適格な選択から無作為化までの１０％の減少率を考えると、約２４０人の患者がスクリーニングされるべきである。

【0143】

期待される患者または公衆衛生上の利益
ＩＭＯＤＡＬＳで得られた結果、特に疾患活動性マーカーの血漿濃度におけるｌｄＩＬ２のプラスの影響（すなわち、ＣＣＬ２およびＮＦＬの減少）、ならびに改善されたＴｒｅｇ抑制機能およびマクロファージ分極の炎症性のＭ１表現型から抗炎症性および修復表現型Ｍ２への移行を含む免疫炎症パラメーターの変化に基づけば、低用量ヒトＩＬ－２皮下注射の反復サイクルを含む治療からＡＬＳ患者の生存率の有意な改善と機能低下速度の低下が期待される。

【0144】

ＡＬＳの病因に関する知識が乏しく、予測的前臨床モデルが存在しないため、ＡＬＳ の薬物試験では、（ｉ）臨床効果の試験、および（ｉｉ）薬物評価を正当化する病原性の仮説の検定の２つの目的が追求されている。しかしながら、「標準的な」試験では、薬剤の失敗が誤った仮説によるものか、標的経路への薬物関与が不十分なのか、用量が効果的でないかを知る手段はない。薬物に対する薬力学および疾患活動性応答の両方を定量化するバイオマーカーを設計に含め、ハードな臨床評価項目の生存率でそれらの代替項目を調べることにより、ｌｄ ＩＬ－２の臨床的有効性に関する高レベルの証拠、裏付けとなるＰｏＣ／ＰｏＭ証拠の追加が達成されるべきである。従って、ＧＣＰ／ＧＣＬＰの高い品質設定と合わせて、本試験は臨床結果に関して規制当局の最適な承認を提供するはずである。さらに、この設計は、試験されている病原性仮説の証拠の強さを決定するが、オミクスアプローチは、薬物効果、関与する経路、および疾患プロセスとの相互作用の深い理解を提供し、最終的には新薬開発、さらには治療の進歩への道を開く。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】