特表 2023-516800 新規なラパコニチン誘導体及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-20

(54)【発明の名称】新規なラパコニチン誘導体及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C07D 221/22 20060101AFI20230413BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20230413BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230413BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20230413BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20230413BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20230413BHJP

   A61K 31/439 20060101ALI20230413BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230413BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230413BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20230413BHJP

【ＦＩ】

C07D221/22 CSP

A61P19/10

A61P19/02

A61P19/00

A61P19/08

A61P1/02

A61K31/439

A61P29/00 101

A61P43/00 111

A23L33/10

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022554603

(86)(22)【出願日】2021-03-05

(85)【翻訳文提出日】2022-09-08

(86)【国際出願番号】 KR2021002757

(87)【国際公開番号】W WO2021182806

(87)【国際公開日】2021-09-16

(31)【優先権主張番号】10-2020-0028973

(32)【優先日】2020-03-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518355308

【氏名又は名称】キュージェネティクス カンパニー リミテッド

【住所又は居所原語表記】＃５０４， Ｓｅｏｕｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ－Ａｃａｄｅｍｉａ Ｂｉｏ Ｃｅｎｔｅｒ ２３， Ｋｙｕｎｇｈｅｅｄａｅ－ｒｏ， Ｄｏｎｇｄａｅｍｕｎ－ｇｕ Ｓｅｏｕｌ， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ムン・ソグ・チャン

(72)【発明者】

【氏名】テ・ヒ・イ

(72)【発明者】

【氏名】ハ・ヨン・キム

(72)【発明者】

【氏名】ジュン・ビン・ミン

【テーマコード（参考）】

4B018

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B018LE01

4B018LE02

4B018LE03

4B018MD05

4B018MD10

4B018MD18

4B018MD29

4B018MD34

4B018ME05

4B018MF08

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086AA04

4C086BC27

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA52

4C086NA14

4C086ZA67

4C086ZA96

4C086ZA97

4C086ZB15

4C086ZC41

(57)【要約】

本発明は、新規なラパコニチン誘導体、その製造方法及び骨形成促進活性を用いた薬学的用途に関する。前記ラパコニチン誘導体は、幹細胞の造骨細胞への分化を誘導し、骨粗しょう症動物モデルに投与すると、骨密度を増加させ、骨折動物モデルでは骨形成を誘導するので、骨粗しょう症などの骨関連疾患の予防、改善または治療用途に加えて、物理的外傷による非疾患性骨折の治療に有用に使用できる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記化学式１で表される化合物、その立体異性体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬学的に許容可能な塩：

【化1】

前記化学式１において、Ｒ_１及びＲ_２はそれぞれ独立して水素、Ｃ１－Ｃ６アルキル、チオアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアリールアルキル、ジヒドロキシアルキルアリールアルキル、アルコキシアルキル、アシルオキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アルコキシカルボニルアミノアルキル、アシルアミノアルキル、アリールスルホンアミドアルキル、アリル、ジヒドロキシアルキルアリル、ジオキソラニルアリル、カルアルコキシアルキル、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ－ブチル及びフェニルからなる群から選ばれる。

【請求項2】

下記化学式１で表される化合物、その立体異性体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む骨疾患の予防または治療用薬学的組成物：

【化2】

前記化学式１において、Ｒ_１及びＲ_２はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、チオアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアリールアルキル、ジヒドロキシアルキルアリールアルキル、アルコキシアルキル、アシルオキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アルコキシカルボニルアミノアルキル、アシルアミノアルキル、アリールスルホンアミドアルキル、アリル、ジヒドロキシアルキルアリル、ジオキソラニルアリル、カルアルコキシアルキル、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ－ブチル及びフェニルからなる群から選ばれる。

【請求項3】

前記骨疾患は、骨粗しょう症、骨折、関節リウマチ、歯周炎、骨軟化症、骨減少症、骨萎縮、骨関節炎、骨欠損、骨溶解及び骨壊死症からなる群から選ばれる、請求項２に記載の骨疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項4】

前記化学式１で表される化合物は、幹細胞の造骨細胞への分化を促進する、請求項２に記載の骨疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項5】

前記化学式１で表される化合物は、ＲＵＮＸ２（ｒｕｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２）、ＢＭＰ２（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）及びオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）からなる群から選ばれる骨形成マーカーの発現を増加させる、請求項２に記載の骨疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項6】

請求項１に記載の化合物を有効成分として含む骨疾患の予防または改善用食品組成物。

【請求項7】

前記化学式１で表される化合物は、幹細胞の造骨細胞への分化を促進する、請求項６に記載の骨疾患の予防または改善用食品組成物。

【請求項8】

（ａ）ラパコニチンを酸化剤と反応させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）の結果物を塩基の存在下で有機溶媒と反応させる段階と、を含む、請求項１に記載の化合物を合成する方法。

【請求項9】

前記（ａ）の酸化剤は、ヨードベンゼンジアセタート（ＰｈＩ（ＯＡｃ）_２、酢酸鉛（ＩＩ）（Ｐｂ（ＣＨ_３ＣＯ_２）_２）、酢酸鉛（ＩＩ）（Ｐｂ（ＣＨ_３ＣＯ_２）_４）、オゾン及びＨＩＯ_４からなる群から選ばれる化学式１で表される、請求項８に記載の化合物の合成方法。

【請求項10】

前記（ｂ）の塩基は、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム及び水酸化カリウムからなる群から選ばれる化学式１で表される、請求項８に記載の化合物の合成方法。

【請求項11】

前記（ｂ）の有機溶媒は、脂肪族アルコールまたはアルコキシアルコールである化学式１で表される、請求項８に記載の化合物の合成方法。

【請求項12】

請求項２に記載の薬学的組成物を治療を必要とする個体に投与する段階を含む、骨疾患の治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ジテルペノイドアルカロイド（ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ ａｌｋａｌｏｉｄ）系列に属する新規なラパコニチン誘導体、その製造方法及び骨形成促進活性を用いた薬学的用途に関する。

【背景技術】

【0002】

漢方薬剤である付子（Ａｃｏｎｉｔｉ Ｌａｔｅｒａｌｉｓ Ｒａｄｉｘ）の成分のうち一つであるアコニチン（ａｃｏｎｉｔｉｎｅ）は、アルカロイド（ａｌｋａｌｏｉｄ）系列に属する化合物で毒性の強い物質である。しかし、付子を煎じ薬として煎じると毒性が減少する現象と同様に、この化合物に直接熱を加えると、ジアセチレーションやジベンゾイレーションにより毒性の弱いベンゾイルアコニンやアコニンなどの化合物に変わることになる。このような原理に起因して熱処理により毒性が緩和された付子（加工付子または精製付子）は、神経痛患者の炎症と痛みを減らす薬剤として使用されてきた（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ ２００６）。

【0003】

これとは別にアコニチンのようなジテルペノイドアルカロイド（ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ ａｌｋａｌｏｉｄ）系列に属し、似たような化学構造を有するジオキシアコニチン、メサコニチン、ハイパコニチン、ラパコニチンなど数百種の様々なアルカロイド化合物が半合成及び構造確認を通じて研究されており、これらの生理活性についても続々と明らかになっている（Ｔｕｒａｂｅｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００８）。例えば、Ｓｈａａｎｘｉ科学技術大学は、ラパコニチンの４位炭素位置にある２－アセトアミノベンゾイルグループを取り外し、様々なシンナミック誘導体（ｃｉｎｎａｍｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）を取り付けると、抗がん活性を示すという結果を公開し、同じ大学では、４位と８、９位の官能基を変更させて様々な化合物を合成した（梁承 ｅｔ ａｌ．，ＣＮ１０７５４０６８０Ａ、２０１８年１月５日公開）。ロシアのＶｌａｄｉｍｉｒｏｖｉｃｈ博士もラパコニチンの４位に多様な芳香族化合物を取り付けた誘導体の炎症作用を確認した（Ｓ．Ｖ．Ｖｌａｄｉｍｉｒｏｖｉｃｈ、ＷＯ２０１７／２０９６５３ Ａ１）。
多くのアルカロイド化合物の中で、ラパコニチンは、抗不整脈、抗炎、抗酸化、抗がん及び抗てんかんなどの様々な効能を有することが知られている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ．２００９）。本発明者らは、ラパコニチンの新しい薬理活性を研究していたところ、ラパコニチンを加水分解して新しい構造の化合物を製造し、新規化合物が骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）を促進することを見出し、本発明を完成した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】ＷＯ２０１７／２０９６５３ Ａ１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、骨形成促進機能及び骨粗しょう症治療能を有する新規なラパコニチン誘導体、その製造方法及びそれを有効成分として含む骨疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

前記目的を達成するため、本発明の一態様は、下記化学式１で表される化合物、その立体異性体、その水和物、その溶媒和物、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。

【0007】

【化1】

【0008】

本発明の一具体例によれば、前記化学式１において、Ｒ_１及びＲ_２はそれぞれ独立して水素、Ｃ１－Ｃ６アルキル、チオアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアリールアルキル、ジヒドロキシアルキルアリールアルキル、アルコキシアルキル、アシルオキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アルコキシカルボニルアミノアルキル、アシルアミノアルキル、アリールスルホンアミドアルキル、アリル、ジヒドロキシアルキルアリル、ジオキソラニルアリル、カルアルコキシアルキル、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ－ブチル及びフェニルからなる群から選ばれてもよい。ここで、「アルク－」または「アルキル」は、側鎖状または線状として好ましくは、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、ここで、炭素鎖は任意にエーテル（－０－）結合が介入されてもよい。

【0009】

本発明の一具体例によれば、前記化学式１の化合物は、（２ａＲ，２ａ１Ｓ，３Ｓ，４ａＳ，８Ｓ，１１Ｓ，１１ｂＳ，１２Ｓ）－６－エチル－４ａ，８－ジヒドロキシ－３，１１－ジメトキシ－テトラデカヒドロ－８，１１ａ，５－（エピエタン[1，１，２]トリル）サイクロペンタ[７，１]インデノ[５，４－ｂ]アゾシン－１，２－ジオン（化２）である。

【0010】

【化2】

【0011】

本発明において、前記化学式１の化合物は、化学式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩だけでなく、その水和物、溶媒和物、立体異性体及び放射性誘導体を含む。

【0012】

前記「薬学的に許容可能な塩」とは、純粋な医学的判断の範囲内で過度な毒性、刺激、アレルギー反応などを引き起こすことなく、ヒト及び下等動物の組織と接触して使用するのに適しており、親化合物の生物学的活性と物理学化学的性質に悪影響を与えない塩を意味する。前記薬学的に許容される塩は、当分野でよく知られている。例えば、文献（Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ、ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６６、１、１９７７）に詳細に記述されている。塩は、本発明の化合物を最終的に分離及び精製する間に同じ反応系で製造するか、または別途に無機塩基または有機塩基と反応させて製造してもよい。適切な付加塩の形態は、例えば、アンモニウム塩、リチウム、ソジウム、ポタシウム、マグネシウム、カルシウムなどの塩のようなアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩（カルシウム塩など）、有機塩基との塩、例えば、１次、２次及び３次脂肪族及び芳香族アミン、例えばメチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、４つのブチルアミン異性体、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ジ－ｎ－ブチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、キヌクリジン、ピリジン、キノリン及びイソキノリン、ベンザチン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール、ヒドラバミン塩、及びアルギニン、リジンなどのアミノ酸との塩などである。

【0013】

本発明において、前記化学式１の化合物の水和物または溶媒和物は、通常の方法で製造されてもよく、例えば、化学式１の塩基化合物を水、メタノール、エタノール、アセトン、１，４－ジオキサンなどの溶媒に溶かした後、遊離酸または遊離塩基を加えた後に結晶化または再結晶化して製造されてもよい。

【0014】

また、前記化学式１の化合物は、１つまたはそれ以上の非対称の中心を持つことができ、このような化合物の場合、鏡像異性体または部分立体異性体が存在してもよい。したがって、本発明の化合物には、各異性体またはこれらの異性体混合物を含む。また、異なる異性体は、通常の方法により分離されるか、または分解されるか、あるいは任意の異性体は、通常の合成法により、または立体特異的または非対称的合成により得ることができる。また、本発明の化合物は、前記化で表される化合物の放射性誘導体を含み、これらの放射性化合物は、生体研究分野において有用である。

【0015】

本発明において、前記化学式１の化合物は、下記段階を含む方法により製造されてもよい。

【0016】

（ａ）ラパコニチンを酸化剤と反応させる段階、及び
（ｂ）前記（ａ）の結果物を塩基の存在下で有機溶媒と反応させる段階。

【0017】

本発明の一具体例によれば、前記（ａ）のラパコニチンは、ラパコニチン臭化水素であってもよく、この場合、（ａ）段階は、ラパコニチンを酸化剤と反応させる前に臭素化水素を除去する過程をさらに含んでもよい。例えば、ラパコニチン臭化水素から臭化水素を除去する過程は、下記反応式１のように塩基の存在下でジクロロメタン（ＣＨ_２Ｃｌ_２）を使用して行われてもよい。

【0018】

【化3】

【0019】

その後、ラパコニチンは、下記反応式２のように酸化剤と反応して酸化され、ラパコニチン誘導体（ＬＡＤ）を生成しうる。前記酸化剤は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かしたヨードベンゼンジアセタート（ＰｈＩ（ＯＡｃ）_２または酢酸鉛（ＩＩ）（Ｐｂ（ＣＨ_３ＣＯ_２）_２）、酢酸鉛（ＩＩ）（Ｐｂ（ＣＨ_３ＣＯ_２）_４）、オゾン及びＨＩＯ_４からなる群から選ばれてもよい。

【0020】

【化4】

【0021】

本発明において、前記合成されたラパコニチン誘導体（ＬＡＤ）は、塩基の存在下で有機溶媒と反応して前記化学式１の化合物を生成しうる。前記塩基は、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム及び水酸化カリウムからなる群から選ばれてもよく、前記有機溶媒は、脂肪族アルコールまたはアルコキシアルコールであってもよい。

【0022】

前記脂肪族アルコールは、ＣＨ_３（ＣＨ_２）ｎＯＨ（ｎは、０または正の整数である）の一般式で表されるアルコールをいい、アルコキシアルコールは、ＣＨ_３（ＣＨ_２）ｎＯ（ＣＨ_２）ｎＣＨ_３（ｎは、互いに独立して０または正の整数である）の一般式で表されるアルコールをいう。例えば、前記脂肪族アルコールは、具体的には、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノールなどであってもよく、アルコキシアルコールは、メトキシメタノール、メトキシエタノール、エトキシエタノールなどであってもよい。

【0023】

例えば、前記ラパコニチン誘導体（ＬＡＤ）は、下記反応式３のように水酸化ナトリウムの存在下でエタノールと反応して化学式１の化合物（ＱＧ３０３０）を生成しうる。

【0024】

【化5】

【0025】

本発明において、前記方法で合成された化学式１の化合物は、一般的な分離及び精製過程、例えば有機溶媒で希釈及び洗浄した後、有機層を減圧濃縮して分離されてもよく、必要な場合、管クロマトグラフィー及び様々な溶媒を使用した再結晶法で精製されてもよい。

【0026】

本発明者らは、抗炎、抗酸化、抗がんなどの効能を有するラパコニチンの新しい薬理活性を研究していたところ、ラパコニチンを加水分解して前記化学式１の新規化合物を合成し、この化合物が骨形成促進活性を有することを確認した。

【0027】

したがって、本発明の他の態様は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む骨関連疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0028】

前記薬学的組成物において、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、その水和物、溶媒和物、立体異性体及び放射性誘導体を含む。

【0029】

本発明の一具体例によれば、前記化学式１の化合物は、幹細胞の造骨細胞への分化を促進し、ＲＵＮＸ２（ｒｕｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２）、ＢＭＰ２（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）及びオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）からなる群から選ばれる骨形成マーカーの発現を増加させて骨形成を助けることができる。前記幹細胞としては、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞、骨髄幹細胞などが用いられてもよい。

【0030】

本発明において、前記骨疾患は、骨粗しょう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、骨折（ｂｏｎｅ ｆｒａｃｔｕｒｅ）、関節リウマチ、歯周炎、骨軟化症（ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａ）、骨減少症（ｏｓｔｅｏｐｅｎｉａ）、骨萎縮（ｂｏｎｅ ａｔｒｏｐｈｙ）、骨関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、骨欠損、骨溶解（ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ）及び骨壊死症からなる群から選ばれてもよく、好ましくは、骨折及び骨粗しょう症であってもよい。

【0031】

本明細書で使用される用語の「骨折」とは、身体を支える骨が交通事故、転倒、産業災害及びその他の物理的刺激により折れた状態を意味する。

【0032】

本明細書で使用される用語の「骨粗しょう症」は、骨を構成するミネラル（特にカルシウム）と基質が減少して骨組織の微細構造が退化し、結果として骨折のリスクが持続的に増加する状態をいう。骨粗しょう症の種類としては、閉経後の骨粗しょう症及び老人性骨粗しょう症などの１次性骨粗しょう症と骨の形成と減少に影響を及ぼす疾病、薬物、飲酒、喫煙などで発生する２次性骨粗しょう症がある。

【0033】

本発明の薬学的組成物は、有効成分として前記化学式１の化合物を含むことに加えて、薬剤の製造に通常使用される適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含んでもよい。本発明の薬学的組成物に含まれてもよい担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスペイト、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油などがある。

【0034】

本発明の薬学的組成物を製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製される。経口投与用固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれて、このような固形製剤は、本発明の組成物に少なくとも一つ以上の副形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混合して調製される。また、単純な賦形剤に加えて、マグネシウムステアレート、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口用液状製剤としては、懸濁剤、内容液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与用製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、エチルオレートなどの注射可能なエステルなどが用いられてもよい。

【0035】

本発明の薬学的組成物は、経口または非経口で投与されてもよく、本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者により適切に選ばれてもよい。例えば、前記化学式１の化合物の投与量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態及び疾病の程度によって異なり、体重が７０ｋｇの成人患者を基準とすると、一般的に１日に０．０１ｍｇ～５０００ｍｇ投与されてもよい。前記投与量は１日１回ないし数回に分けて投与されてもよく、前記投与量は、いかなる点でも本発明の範囲を限定するものではない。

【0036】

また、本発明は、前記薬学的組成物を治療を必要とする個体に投与する段階を含む骨疾患の治療方法を提供する。骨疾患の種類、薬学的組成物の投与量は、前記骨疾患の予防または治療用薬学的組成物に記載されているものと同じである。

【0037】

本発明において、骨疾患の予防または治療用薬学的組成物を経口投与する場合、経口投与用薬学的組成物は、経口投与用固形製剤、半固形製剤または液状製剤であってもよい。経口投与用固形製剤は、例えば、錠剤、丸剤、硬質または軟質カプセル剤、散剤、細粒、顆粒、溶液または懸濁液再構成用粉末、ロゼンジ、ウェハ、口腔フィルム（ｏｒａｌｓｔｒｉｐ）ドラジェ（ｄｒａｇｅｅ）及びチューインガム（ｃｈｅｗａｂｌｅ ｇｕｍ）などがあるが、これに制限されるものではない。経口投与用液状製剤には、液剤、懸濁剤、エマルジョン、シロップ剤、エリキシル剤、酒精剤、芳香水剤、レモネード剤、エキス剤、沈殿剤、チンキ剤及び薬油剤を含む。

【0038】

本発明において、骨疾患の予防または治療用薬学的組成物を注射剤として使用する場合、骨疾患部位に直接注入されてもよく、注射剤として製剤化するとき、血液と等張の無毒性緩衝溶液を希釈剤として含んでもよく、例えば、ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液などがある。注射剤は、緩衝溶液に加えてその他の希釈剤または添加剤を含んでもよい。

【0039】

また、本発明の一具体例によれば、コラーゲンスポンジなどの賦形剤と前記薬学的組成物を混合した後、骨折部位に移植して個体を治療してもよい。

【0040】

本発明の他の態様は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む骨疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。

【0041】

前記食品組成物において、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、その水和物、溶媒和物及び立体異性体を含む。

【0042】

前記食品組成物は、前記骨疾患の予防または治療用薬学的組成物と同じ成分を使用するので、それらの間で重複する内容は、明細書の過度な記載を避けるために省略する。

【0043】

本発明において、前記食品組成物は、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、シロップ、飲料または丸の形態で提供されてもよく、有効成分である化学式１で表される化合物に加えて、他の食品または食品添加物とともに使用され、通常の方法により適切に使用されてもよい。有効成分の混合量は、その使用目的、例えば、予防、健康または治療的処置により適切に決定されてもよい。

【0044】

前記食品組成物に含まれる有効成分の有効用量は、前記薬学組成物の有効用量に準じて使用できるが、健康及び衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間摂取の場合、前記範囲以下であってもよく、有効成分は、安全性の点で何ら問題がないため、前記範囲以上の量でも使用できることは明らかである。

【0045】

前記食品組成物は、食品製造時に通常添加される成分を含み、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤及び香味剤を含む。上述した炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など、ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など、及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロテキストリンなどの通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。香味剤として天然香味剤及び合成香味剤を使用してもよい。例えば、本発明の食品組成物がドリンク剤として製造される場合には、本発明の有効成分の他にクエン酸、液状果糖、砂糖、ブドウ糖、酢酸、リンゴ酸、果汁などをさらに含んでもよい。

【0046】

本発明のさらに他の態様は、前記化学式１で表される化合物を用いた試験管内の造骨細胞分化誘導用組成物を提供する。

【0047】

本発明の一具体例によれば、前記化学式１で表される化合物を間葉系幹細胞に処理すると、カルシウムとミネラル生成が増加するので、幹細胞の造骨細胞への分化が促進されうる。

【発明の効果】

【0048】

本発明のラパコニチン誘導体は、幹細胞の造骨細胞への分化を誘導し、骨粗しょう症動物モデルに投与すると骨密度を増加させ、骨折動物モデルの骨折部位に注入すると骨形成を促進するために骨折外傷の回復を促進でき、骨形成を誘導するので、骨折及び骨粗しょう症などの骨関連疾患の予防、改善または治療用途に有用に使用されてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】図１は、本発明の一例によるラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）の構造を示す。

【図2a】図２ａは、間葉系幹細胞にラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を処理した後、カルシウム（アリザリンレッド）及びミネラル生成（フォンコサ）のレベルを確認したものである。

【図2b】図２ｂは、図２ａの染色の程度をグラフで表したものである。

【図3a】図３ａは、間葉系幹細胞に様々な濃度のラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を一定時間処理した後、ＲＵＮＸ２の発現変化を確認したものである。

【図3b】図３ｂは、間葉系幹細胞に様々な濃度のラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を一定時間処理した後、ＢＭＰ－２の発現変化を確認したものである。

【図4a】図４ａは、間葉系幹細胞に様々な濃度のラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を一定時間処理した後、オステオカルシンの発現変化を蛍光顕微鏡で確認したものである。

【図4b】図４ｂは、図４ａの蛍光レベルをグラフで表したものである。

【図5a】図５ａは、間葉系幹細胞にラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を処理した後、様々なリン酸化酵素のリン酸化レベルを確認したものである。

【図5b】図５ｂは、図５ａのリン酸化レベルをグラフで表したものである。

【図6】図６は、間葉系幹細胞にラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）と様々なリン酸化酵素阻害剤をともに処理した後のカルシウムレベルを確認したものである。

【図7a】図７ａは、間葉系幹細胞にラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を０～２４時間処理した後、リン酸化されたＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルを確認したものである。

【図7b】図７ｂは、間葉系幹細胞にラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を７日間処理した後、リン酸化されたＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルを確認したものである。

【図7c】図７ｃは、間葉系幹細胞にラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を１４日間処理した後、リン酸化されたＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルを確認したものである。

【図8a】図８ａは、間葉系幹細胞にラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）とＥＲＫ阻害剤（ＰＤ９８０５９）をともに処理した後、ＲＵＮＸ２の発現変化を蛍光顕微鏡で確認したものである。

【図8b】図８ｂは、図８ａの蛍光レベルをグラフで表したものである。

【図8c】図８ｃは、間葉系幹細胞にラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）とＥＲＫ阻害剤（ＰＤ９８０５９）をともに処理した後、リン酸化されたＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルを確認したものである。

【図9a】図９ａは、骨粗しょう症動物モデルにラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を投与した日程と実験群の種類を示す。

【図9b】図９ｂは、骨粗しょう症動物モデルにラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を投与した後、大腿骨の骨断面を確認したものである。

【図9c】図９ｃは、骨粗しょう症動物モデルにラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を投与した後、大腿骨の骨密度を確認したものである。

【図10a】図１０ａは、骨粗しょう症動物モデルにラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を投与した後、骨形成レベルを確認したものである。

【図10b】図１０ｂは、骨粗しょう症動物モデルにラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を投与した後、ＲＵＮＸ２の発現レベルを確認したものである。

【図11】図１１は、骨折動物モデルにラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を投与した方法を概略的に示したものである。

【図12a】図１２ａは、骨折動物モデルにラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を投与した後、ラット腸骨の骨断面を確認した結果である。

【図12b】図１２ｂは、骨折動物モデルにラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を投与した後、ラット腸骨の骨形成度を確認した結果である。

【図13】図１３は、骨折動物モデルにラパコニチン誘導体（ＱＧ３０３０）を投与した後、骨形成レベル（Ａ）及びコラーゲンの発現レベル（Ｂ）を確認した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0050】

以下、１つ以上の具体例を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、１つ以上の具体例を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【0051】

製造例：ＱＧ３０３０の製造
１－１．ラパコニチンの製造
ラパコニチン・臭化水素（１０．０８ｇ、０．０１７ｍｏｌ）にジクロロメタン（５００ｍｌ）、水酸化ナトリウム溶液（ＮａＯＨ１０ｇ＋水１００ｇ）を入れ、分液漏斗を用いて水層と有機層を分離した。分離した有機層を水で数回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、蒸留させて所望のラパコニチンを収率８９％（８．９０ｇ）で得た。

【0052】

^１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）δ１０．９８（ｓ、１Ｈ）、８．６０（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．８６－７．８３（ｍ、１Ｈ）、７．４２（t、１Ｈ）、６．９５（t、１Ｈ）、３．５２－３．３７（ｍ、２Ｈ）、３．３６－３．３５（ｍ、２Ｈ）、３．３６（ｓ、Ｊ＝７．１Ｈz、３Ｈ）、３．２２（ｓ、３Ｈ）、３．１３（ｓ、３Ｈ）、３．１１－３．０９（ｍ、２Ｈ）、２．６０－２．４６（ｍ、１０Ｈ）、２．１５（ｓ、３Ｈ）、２．１４－１．７３（ｍ、６Ｈ）、１．７４－１．６８（ｍ、１Ｈ）、１．７４－１．７０（ｍ、１Ｈ）、１．０６（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）；

【0053】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、１００ＭＨｚ）δ１６９．０２、１６７．３９、１４１．６、１３４．３４、１３１．０７、１２２．３１、１２０．１９、１１５．７６、９０．１０、８４．６２、８４．１３、８２．８９、７８．５７、７５．５６、６１．４８、５７．８９、５６．５２、５６．１０、５５．５０、５０．８５、４９．８６、４８．９７、４８．５１、４７．６１、４４．７６、３６．２８、３１．８３、２６．７７、２６．２０、２５．５３、２４．１２、１３．５３；

【0054】

ＨＲＭＳ（ＥＳ^＋）：ｍ／ｚ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ_３２Ｈ_４４Ｎ_２Ｏ_８：５８５．３０９８[Ｍ＋Ｈ]^＋．
Ｆｏｕｎｄ ５８５．３１７６．

【0055】

１－２．ラパコニチンからラパコニチン誘導体（ＬＡＤ）の製造
ヨードベンゼンジアセタート（ＰｈＩ（ＯＡｃ）_２（１４．０７ｇ、０．０４４ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１５０ｍｌ）に溶かした溶液にラパコニチン（８．９ｇ、０．０１５ｍｏｌ）をゆっくり加えて１０分間撹拌した。反応が完結すると、酢酸エチル（ＥＡ）で溶液を希釈させて飽和したソディウムバイカーボネイト（ＮａＨＣＯ_３）水溶液で抽出した。水で有機層を数回洗浄してジメチルホルムアミドを除去した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥して減圧蒸留した。得られた粗抽出物（ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔ）をカラムクロマトグラフィー（ｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ：ｈｅｘａｎｅ＝３：２：５）を通じて分離し、所望のラパコニチン誘導体（ｌａｐｐａｃｏｎｉｔｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ、ＬＡＤ）である｛（３Ｓ，６Ｓ，７Ｓ，９Ｓ，１１Ｓ，１６Ｓ）－１－エチル－６，９，１１－トリメトキシ－８，１３－ジオキソドデカヒドロ－２Ｈ－３，６ａ，１４－（エピエタン[１，１，２]トリイル）－７，１０－メタノシクロデカ［ｂ］アゾシン－３（４Ｈ）－イル２－アセトアミノベンゾアート｝を収率２５．７％（２．３ｇ）で得た。

【0056】

^１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）δ１０．９９（ｓ、１Ｈ）、８．６２（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．８９（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）７．４７－７．４３（ｍ、１Ｈ）、７．０１－６．９９（ｍ、１Ｈ）、３．８８－３．６４（ｍ、４Ｈ）、３．６５（ｓ、３Ｈ）、３．４１（ｓ、３Ｈ）、３．１８（ｓ、３Ｈ）、２．９０－２．２５（５、４Ｈ）、２．２０（ｓ、３Ｈ）、２．１９－１．８０（ｍ、４Ｈ）、１．１５（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、３Ｈ）；

【0057】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、１００ＭＨｚ）δ２１１．８５、２０４．３１、１６９．１０、１６７．４０、１６２．１８、１４３．７４、１４１．７４、１３４．６１、１３１．０７、１２２．４１、１２０．３０、１１５．４５、８６．９２、８２．７５、８１．４５、７８．２１、７６．２８、６０．７３、５８．１７、５７．３７、５４．３５、５２．９８、５０．１９、４８．７８、４６．０６、４５．９２、３８．４１、３２．０６、２５．５６、２５．３９、２５．３６、１２．７２；

【0058】

ＨＲＭＳ（ＥＳ^＋）：ｍ／ｚ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ_３２Ｈ_４２Ｎ_２Ｏ_８：５８３．３０１８[Ｍ＋Ｈ]^＋．

【0059】

Ｆｏｕｎｄ ５８３．２９４１．

【0060】

１－３．ＬＡＤからＱＧ３０３０の製造
１００ｍｌの３口丸底フラスコにＬＡＤ（２．３ｇ）、水酸化ナトリウム溶液（ＮａＯＨ０．７ｇ＋水５．１ｇ）及びエタノール（５１ｍｌ）を加えて１時間還流させた。反応完結後、エタノールを蒸留させて酢酸エチルで管クロマトグラムを行い、最終化合物であるＱＧ３０３０｛（２ａＲ，２ａ１Ｓ，３Ｓ，４ａＳ，８Ｓ，１１Ｓ，１１ｂＳ，１２Ｓ）－６－エチル－４ａ，８－ジヒドロキシ－３，１１－ジメトキシ－テトラデカヒドロ－８，１１ａ，５－（エピエタン[１，１，２]トリイル）シクロペンタ[７，１]インデノ[５，４－ｂ]アゾシン－１，２－ジオン｝を収率６２．５％（１．４３７５ｇ）で得た。

【0061】

^１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６、４００ＭＨｚ）δ８．８８（ｓ、１Ｈ）、４．６５（ｓ、１Ｈ）、４．３５（ｓ、１Ｈ）、４．２７－４．２０（９ｍ、１Ｈ）、４．１０－４．００（ｍ、１Ｈ）、３．６０（ｓ、１Ｈ）、３．３５（ｓ、３Ｈ）、３．２０（ｓ、３Ｈ）、３．１０－２．９９（ｍ、１Ｈ）、２．８５－２．１９（ｍ、６Ｈ）、１．９９－１．５０（ｍ、７Ｈ）、１．０５（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、３Ｈ）；

【0062】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、１００ＭＨｚ）δ２０１．２０、１４９．８８、１４８．７８、８３．２５、７９．９２、７９．５０、６７．８７、６２．７４、６０．２０、５８．１０、５３．２３、４９．５５、４８．８６、４７．８８、４６．９２、４２．３９、３８．４３、１３．５６；

【0063】

ＨＲＭＳ（ＥＳ^＋）：ｍ／ｚ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ_３２Ｈ_３１ＮＯ_６：４０６．２１５１[Ｍ＋Ｈ]^＋．

【0064】

Ｆｏｕｎｄ ４０６．２２４２；Ｘ－ｒａｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ.

【0065】

１－４．ＱＧ３０３０の構造確認
前記製造例１－４で得られたＱＧ３０３０を水で再結晶させ、Ｘ－線回折（Ｘ－ｒａｙｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ）で適当な結晶を得た後、これを用いてＸ－ｒａｙ構造（Ｘ－ｒａｙ Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、Ｒ－ＡＸＩＳ ＲＡＰＩＤ）を確認した。その結果を図１及び表１に示した。

【0066】

【表1】

【実施例】

【0067】

実験例１：ＱＧ３０３０の効能確認（in vitro）
１－１．ＭＳＣにおいてＱＧ３０３０の骨細胞分化能の確認
骨の生成に関与する造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）は、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）から外部の刺激及び様々な信号伝達に関連する転写因子により分化して生成される（Ｇａｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ．２０１７）。そこで、ＱＧ３０３０がヒトＭＳＣから造骨細胞の分化を誘導できるかどうかを実験した。

【0068】

米国ＡＴＣＣから正常人のＭＳＣを購入し、ＭＳＣ特異培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。培養した細胞をトリプシンで分離して遠心分離した後、２４－ウェルプレートに３×１０４／ウェル濃度で分注した。翌日、ＭＳＣ培養培地を実験用培地であるＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ／ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）と交換し、細胞にＱＧ３０３０単独（０．１μＭ）または陽性対照群であるＯＩＭ（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ；ＳｔｅｍＰｒｏ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を処理した。その後、細胞培養培地を毎日新しいＤＭＥＭ培地に交換し、ＱＧ３０３０またはＯＩＭを処理して３週間培養した。培養終了後、カルシウムを探知するアリザリンレッド（Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ）とミネラル生成を探知するフォンコッサ（Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ）で細胞を染色した。

【0069】

染色の結果、造骨細胞分化陽性対照群であるＯＩＭと同様に、ＱＧ３０３０がヒトＭＳＣにおいてカルシウムとミネラルの生成を引き起こすことが確認できた（図２a及び２ｂ）。この結果は、ＱＧ３０３０が細胞レベルでＭＳＣを造骨細胞に分化させることができることを意味する。

【0070】

１－２．ＭＳＣにおいてＲＵＮＸ２とＢＭＰ２の発現変化の確認
ＲＵＮＸ２（ｒｕｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２；ｃｏｒｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ、Ｃｂｆａ１）は、骨形成の最も重要な転写調節因子で、骨形成の過程で造骨細胞の分化、マトリックス生成及びミネラル化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）に関与することが知られている（Ｂｒｕｄｅｒｅｒ Ｍ、ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｅｒ．２０１４）。また、ＲＵＮＸ２のそのものは、サイトカインの一種であるＢＭＰ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）により調節されてもよい（Ｓｕｎ J， ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｒｅｐ．２０１５）。そこで、ＱＧ３０３０が骨生成関連特異因子の発現を誘導して骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）を誘導するかを確認した。

【0071】

ＭＳＣを２４－ウェルプレートに３×１０４／ウェル濃度で分注して２４時間培養し、翌日からＱＧ３０３０を他の濃度（０.００１μＭ、０.０１μＭ及び０.1μＭ）で７日及び１４日間１日１回ずつ処理した。実験終了後、ＭＳＣをＲＵＮＸ２及びＢＭＰ－２抗体で染色し、蛍光顕微鏡で観察した。

【0072】

その結果、ＱＧ３０３０は低濃度（０．００１μＭ＝１ｎＭ）でもＲＵＮＸ２及びＢＭＰ－２の発現を強く誘導し、このような傾向は濃度が増加するほど強くなることが確認できた（図３ａ及び３ｂ）。この結果は、ＱＧ３０３０がヒトＭＳＣにおいて造骨細胞の分化を誘導し、骨形成に関与できることを分子レベルで示す。

【0073】

１－３．ＭＳＣにおいてオステオカルシン発現変化の確認
オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）は、造骨細胞でのみ発現され（Ｌｅｅｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２００７）、骨形成の有用なバイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）として使用される（Ｂｈａｒａｄｗａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．，２００９）。したがって、ＱＧ３０３０が造骨細胞特異マーカーであるオステオカルシンの発現に及ぼす影響を確認した。

【0074】

前記実験例１－３と同様に実験を行った後、ＭＳＣをオステオカルシン抗体で染色して蛍光顕微鏡で確認した。その結果、ＱＧ３０３０は、低濃度（０．００１μＭ）でも処理７日でオステオカルシンの発現を強く誘導し、これは陽性対照群であるＯＩＭ処理群と似たようなレベルであった（図４ａ及び４ｂ）。

【0075】

１－４．ＭＳＣから造骨細胞への分化機作の確認
ＱＧ３０３０がＭＳＣを造骨細胞に分化させる機作を研究するため、関連信号伝達を調査した。

【0076】

実験用ＤＭＥＭ培養培地で培養したＭＳＣにＱＧ３０３０（１μＭ）または対照群化合物（ＤＭＳＯ）を処理して２４時間培養した。細胞を回収した後、４３種のリン酸化酵素のリン酸化形態を特異的に認識する抗体を含有するｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｒｒａｙ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に明示された方法により実験を行った。その後、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ、ＵＳＡ）プログラムで試料を分析した。

【0077】

分析の結果、対照群であるＤＭＳＯと比較して、ＱＧ３０３０がＥＲＫ、Ａｋｔ、ＷＮＫ１などの信号伝達分子のリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を強く増加させることが確認できた（図５ａ及び５ｂ）。

【0078】

１－５．ＭＳＣから造骨細胞への分化機作の確認
ＱＧ３０３０がＭＳＣを造骨細胞に分化させる機作をさらに研究するため、リン酸化酵素阻害剤を用いた実験を行った。

【0079】

ＭＳＣを培養した後、リン酸化酵素阻害剤（１μＭ）及びＱＧ３０３０（１μＭ）を同時に処理し、翌日、培地を交換した後、再びリン酸化酵素阻害剤及びＱＧ３０３０を同時に処理した。これを３週間繰り返した後、ＭＳＣをアリザリンレッドで染色した。

【0080】

その結果、ＱＧ３０３０単独処理群と比較して、ＥＲＫ、Ｐ３８またはＡｋｔを抑制する阻害剤をともに処理した実験群では、ＱＧ３０３０の造骨細胞分化能が抑制されることが確認できた（図６）。本結果は、ＱＧ３０３０がこれらの酵素の信号伝達を活性化させてＭＳＣの造骨細胞の分化に関与することを意味する。

【0081】

１－６．ＭＳＣにおいてＥＲＫのリン酸化に及ぼす影響の確認
先行研究によると、ＥＲＫとｐ３８を含むＭＡＰ－ｋｉｎａｓｅ信号伝達機作が造骨細胞の分化に重要な役割を果たす（Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＭＢ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２０１３）。先行研究と一致するように、前記実験例１－５の結果は、ＱＧ３０３０がＥＲＫとｐ３８ＭＡＰ－ｋｉｎａｓｅを介してＭＳＣを造骨細胞に分化させる可能性を示す（図６）。また、実験例１～４の結果は、ＱＧ３０３０がｐ３８よりはＥＲＫのリン酸化を通じて造骨細胞の分化を誘導した可能性を示す（図５ａ及び５ｂ）。したがって、ＭＳＣにＱＧ３０３０を処理した後、経過時間によるリン酸化されたＥＲＫのレベルを確認した。

【0082】

その結果、ＱＧ３０３０処理３０分以内にリン酸化されたＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルが有意に増加することが確認でき、特異にＱＧ３０３０処理２４時間後にもリン酸化されたＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルは、増加した（図７ａ）。

【0083】

また、ＱＧ３０３０がＥＲＫのリン酸化を長期間誘導することを確認するため、ＭＳＣに様々な濃度（０．００１、０．０１及び０．１μＭ）のＱＧ３０３０を処理し、７日と１４日後にリン酸化されたＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルを確認した。その結果、ＱＧ３０３０を処理したすべての実験群においてリン酸化されたＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルが著しく増加し、特に低濃度でも陽性対照群であるＯＩＭよりもリン酸化されたＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルをさらに増加させた。このような傾向は、ＱＧ３０３０処理１４日以後まで持続し、ＱＧ３０３０がＥＲＫのリン酸化を長期間増加させることができることを確認した（図７ｂ及び７ｃ）。

【0084】

本結果は、ＱＧ３０３０によるＥＲＫ信号伝達機作の長時間活性化がＱＧ３０３０の造骨細胞分化能の核心機作である可能性を示唆する。

【0085】

１－７．ＱＧ３０３０によるＲＵＮＸ２発現増加にＥＲＫ阻害剤が及ぼす影響の確認
ＥＲＫは、ＲＵＮＸ２のリン酸化を誘導して転写活性を増加させ、安定化（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）に関与してＲＵＮＸ２タンパク質の量を増加させることができる（Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＭＢ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２０１３）。したがって、ＱＧ３０３０によるＥＲＫリン酸化の増加は、ＲＵＮＸ２発現を誘導し、ＭＳＣの造骨細胞分化に関与しうる。これを証明するため、ＭＳＣにＱＧ３０３０（０．１μＭ）とＥＲＫ阻害剤であるＰＤ９８０５９（５０μＭ）をともに処理した後、ＲＵＮＸ２の発現レベルを確認した。

【0086】

確認の結果、ＱＧ３０３０処理１２時間以内にＲＵＮＸ２の発現が有意に増加するが、ＥＲＫ阻害剤であるＰＤ９８０５９のように処理すると、ＲＵＮＸ２の発現が著しく減少することが分かった。このような傾向は、ＱＧ３０３０を２４時間処理した場合でも同じであった（図８ａ及び８ｂ）。

【0087】

また、予想通り、ＱＧ３０３０処理は、ＭＳＣにおいてＥＲＫのリン酸化レベルを増加させ、これはＰＤ９８０５９処理により抑制された（図８ｃ）。

【0088】

前記結果は、ＱＧ３０３０によるＥＲＫの活性化誘導が骨形成活性の主要な機作であることを示す。

【0089】

実験例２：ＱＧ３０３０の効能確認（ｉｎ ｖｉｖｏ）
２－１．骨粗しょう症動物モデルを用いたＱＧ３０３０治療能の確認
骨粗しょう症動物モデルとして一般的に使用される卵巣切除（ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ、ＯＶＸ）マウス動物モデルにおいてＱＧ３０３０の骨粗しょう症治療能を確認した。

【0090】

陽性対照群としては、骨形成促進機作を介して骨粗しょう症治療剤として使用される副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ， ＰＴＨ）系列のフォルテオ（Ｆｏｒｔｅｏ；Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、骨吸収抑制剤であるアレンドロネート（ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ)系列のフォサマックス（Ｆｏｓａｍａｘ；Ｍｅｒｃｋ）を皮下に投与した。陰性対照群には水（Ｈ_２０）を経口投与し、ＱＧ３０３０は５または３０ｍｇ／ｋｇの濃度で経口投与した（図９ａ）。１０週間薬物を毎日投与した後、骨密度（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ，ＢＭＤ）を測定した。

【0091】

測定の結果、陰性対照群と比較してＱＧ３０３０投与群では、骨密度が有意に増加して骨粗しょう症の治療効果を示し、ＱＧ３０３０の効果は、フォサマックスと類似しており、フォルテオよりも顕著に優れていた（図９ｂ及び９ｃ）。

【0092】

また、組織染色の結果、ＱＧ３０３０が卵巣切除マウスの大腿骨で骨形成を誘導することが分かり（図１０ａ）、骨生成に関与する転写因子であるＲＵＮＸ２の発現も有意に増加することが確認できた（図１０ｂ）。下記表２に実験結果をまとめた。表２において、ＢＭＤは骨密度、ＴＶは総体積（ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ）、ＢＶは骨体積（ｂｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅ）、Ｔｂ．Ｔｈは骨梁幅（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）及びＴｂ．Ｎは骨梁数（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｎｕｍｂｅｒ）を意味する。

【0093】

【表2】

【0094】

２－２．骨折動物モデルを用いたＱＧ３０３０治療能の確認
Ｓｐｒａｇｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）Ｒａｔの腸骨に直径２ｍｍのドリリングを通じて骨欠損を誘導し、賦形剤（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｐｏｎｇｅ、ＣｏｌｌａＣｏｔｅ（登録商標））に混合したＱＧ３０３０（６、３０及び１５０μｇ／１０μｌを骨欠損部位内に移植して骨再生効能を評価した（図１１）。このとき、陽性対照群にはＢＭＰ２（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－２）を処理し、陰性対照群にはＤＭＳＯを処理した（表３）。

【0095】

【表3】

【0096】

移植４週間後にＭｉｃｒｏ－ＣＴ写真判読の結果、ＱＧ３０３０は、すべての濃度でＢＭＰ２と類似したレベルの骨再生力を示すことが分かった（図１２a）。

【0097】

ＱＧ３０３０の骨再生力を統計的に数値化するため、骨形成の程度を３次元映像で具現した後、ＲＯＩ（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）を設定して骨体積比（ｂｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅ／ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ）（ＢＶ／ＴＶ、％）、骨梁幅（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）（Ｔｂ．Ｔｈ、ｍｍ）、骨梁数（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｎｕｍｂｅｒ）（Ｔｂ．Ｎ、１／ｍｍ）、骨梁距離（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）（Ｔｂ．Ｓｐ、ｍｍ）パラメータで分析した。

【0098】

その結果、骨形成の指標である骨体積比ＢＶ／ＴＶは、ＤＭＳＯを処理した陰性対照群と比較して、ＢＭＰ２処理群（陽性対照群）とＱＧ３０３０処理群（低、中、高濃度）において同レベルまでに増加することが分かった（図１２ｂ）。

【0099】

また、形成された骨組織の骨質を評価するための骨厚Ｔｂ．Ｔｈ、骨組織数Ｔｂ．Ｎ、骨組織距離Ｔｂ．Ｓｐの分析では、Ｔｂ．Ｔｈを除いたＴｂ．Ｎ、Ｔｂ．ＳｐにおいてＤＭＳＯ処理群に比べてＢＭＰ２処理群（陽性対照群）とＱＧ３０３０処理群（低、中、高濃度）で統計的に有意に良質の骨組織が形成されたことを確認した（図１２ｂ）。興味深い点は、たとえ統計的有意性は大きくはないが、ＢＭＰ２に比べてＱＧ３０３０がより良質の骨を生成しているという事実である。統計的有意性の指標は、＊＜０．０５；＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１である。

【0100】

ＱＧ３０３０による骨再生を組織レベルで証明するため、細胞（Ｈ＆Ｅ、ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ ｅｏｓｉｎ）、コラーゲン（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）、タイプＩコラーゲン及びオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）に対する組織染色を行った。その結果、ＱＧ３０３０（低、中、高濃度）が処理された骨欠損部位（実線で表示）で前記マーカーが発現されることを確認し、その効果はＢＭＰ２に類似していた（図１３）。

【0101】

本実験例の骨再生結果は、ＱＧ３０３ＯがＢＭＰ２と同程度の優れた骨再生力を有していることを証明する。

【0102】

前記結果を通じて本発明のＱＧ３０３０化合物は、ＭＳＣにおいてカルシウムとミネラル生成を誘導し、ＲＵＮＸ２、ＢＭＰ－２及びオステオカルシンの発現を増加させ、ＥＲＫの活性化を誘導して造骨細胞への分化を誘導できることを確認した。また、骨粗しょう症動物モデルに投与時に骨密度を増加させ、骨折動物モデルでは骨形成を誘導するので、ＱＧ３０３０化合物は、骨粗しょう症などの骨関連疾患だけでなく、物理的外傷の非疾患性骨折治療用途として有用に使用されてもよい。

【0103】

製剤例
一方、本発明による新規化合物ＱＧ３０３０は、目的に応じて様々な形態で製剤化が可能である。以下、本発明による新規化合物ＱＧ３０３０を活性成分として含む組成物の製剤化方法を例示したものであり、本発明がこれに限定されるものではない。

【0104】

１．錠剤（直接加圧）
活性成分５．０ｍｇをふるいにかけた後、ラクトース１４．１ｍｇ、クロスポビドンＵＳＮＦ０．８ｍｇ及びマグネシウムステアレート０．１ｍｇと混合し、加圧して錠剤として作製した。

【0105】

２．錠剤（湿式組立）
活性成分５．０ｍｇをふるいにかけた後、ラクトース１６．０ｍｇとデンプン４．０ｍｇを混合した。ポリソルベート８００．３ｍｇを純水に溶かした後、この溶液を前記混合物に適量を添加して微粒化した。乾燥後に微粒を篩い分けした後、コロイダルシリコーンジオキシド２．７ｍｇ及びマグネシウムステアレート２．０ｍｇと混合した。微粒を加圧して錠剤として作製した。

【0106】

３．粉末とカプセル剤
活性成分５．０ｍｇをふるいにかけた後、ラクトース１４．８ｍｇ、ポリビニルピロリドン１０．０ｍｇ、マグネシウムステアレート０．２ｍｇと混合した。混合物を適当な装置を使用して堅いＮｏ．５ゼラチンカプセルに充填した。

【0107】

４．注射剤
蒸留水２９７４ｍｇに活性成分１００ｍｇ、マンニトール１８０ｍｇ及びＮａ２ＨＰＯ４／Ｈ２Ｏ２６ｍｇを溶解して注射剤を製造した。

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図3a】

【図3b】

【図4a】

【図4b】

【図5a】

【図5b】

【図6】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図8a】

【図8b】

【図8c】

【図9a】

【図9b】

【図9c】

【図10a】

【図10b】

【図11】

【図12a】

【図12b】

【図13】

【国際調査報告】