▶ ユーエムセー・ユトレヒト・ホールディング・ベー・フェーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-21
(54)【発明の名称】タンパク質分解を標的とする膜ユビキチンリガーゼ
(51)【国際特許分類】
C07K 16/40 20060101AFI20230414BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230414BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230414BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230414BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230414BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230414BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230414BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20230414BHJP
C40B 40/10 20060101ALN20230414BHJP
【ＦＩ】
C07K16/40
C12Q1/02
C07K16/28
A61K39/395 C
A61K39/395 D
A61K39/395 L
A61K39/395 N
A61P35/00
A61K47/68
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C40B40/10 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022552730
(86)(22)【出願日】2021-03-05
(85)【翻訳文提出日】2022-11-01
(86)【国際出願番号】 EP2021055551
(87)【国際公開番号】W WO2021176034
(87)【国際公開日】2021-09-10
(31)【優先権主張番号】20161084.7
(32)【優先日】2020-03-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20180740.1
(32)【優先日】2020-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】514116305
【氏名又は名称】ユーエムセー・ユトレヒト・ホールディング・ベー・フェー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】モーリス，マデロン マリア
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045CB02
2G045FB03
2G045GC15
4B063QA20
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR77
4B063QS33
4C076AA95
4C076CC41
4C076EE59
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB11
4C085BB41
4C085BB43
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、第１および第２の結合ドメインを含むヘテロ二官能性分子に関し、ｉ）第１の結合ドメインは膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができ；ｉｉ）第２の結合ドメインは膜貫通タンパク質に特異的に結合することができ、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、膜貫通タンパク質のユビキチン化および内在化をもたらす。本発明は、さらに、疾患の処置に使用するためのヘテロ二官能性分子に関し、好ましくは、疾患は、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患および遺伝性疾患のうちの少なくとも１つである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１および第２の結合ドメインを含むヘテロ二官能性分子であって、ｉ）前記第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができ；
ｉｉ）前記第２の結合ドメインは、膜貫通タンパク質に特異的に結合することができ、前記膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび前記膜貫通タンパク質への前記ヘテロ二官能性分子の同時結合は、好ましくは、前記膜貫通タンパク質のユビキチン化と内在化をもたらす、ヘテロ二官能性分子。
【請求項2】
前記分子が、前記膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外部分および前記膜貫通タンパク質の細胞外部分に結合する、請求項１に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項3】
前記膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび前記膜貫通タンパク質への前記分子の同時結合が、前記膜貫通タンパク質の分解、好ましくは、リソソーム分解をもたらす、請求項１または２に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項4】
前記膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、モノユビキチン、マルチユビキチン、Ｌｙｓ４８連結またはＬｙｓ６３連結ポリユビキチン鎖により前記膜貫通タンパク質をユビキチン化する、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項5】
前記膜貫通タンパク質が、受容体、好ましくは、がんに関与する受容体である、請求項１～４のいずれか一項に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項6】
前記膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ１６７、ＺＮＲＦ３、ＲＮＦ１３、ＡＭＦＲ、ＭＡＲＣＨ１、ＭＡＲＣＨ２、ＭＡＲＣＨ４、ＭＡＲＣＨ８、ＭＡＲＣＨ９、ＲＮＦ１４９、ＲＮＦ１４５、ＲＮＦＴ１、ＲＮＦ１３０およびＲＮＦ１２８からなる群から選択され、ならびに／または前記膜貫通タンパク質が、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項7】
前記膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼがＲＮＦ４３であり、前記膜貫通タンパク質がＰＤ－Ｌ１、ＦＺＤ７、ＦＬＴ３、ＴＧＦβＲ２およびＥＧＦＲからなる群から選択される、請求項６に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項8】
前記膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼがＲＮＦ１６７であり、前記膜貫通タンパク質がＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＦＬＴ３、ＴＧＦβＲ２およびＥＧＦＲからなる群から選択される、請求項６に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項9】
前記膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼがＲＮＦ１２８であり、前記膜貫通タンパク質がＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＦＬＴ３のうちの少なくとも１つである、請求項６に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項10】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼがＲＮＦ１３０であり、前記膜貫通タンパク質がＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１のうちの少なくとも１つである、請求項６に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項11】
前記分子が、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインの間にリンカーを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項12】
前記第１のドメインおよび前記第２のドメインのうちの少なくとも１つが、有機小分子またはタンパク性分子であり、好ましくは、前記ヘテロ二官能性分子が二環性ペプチドである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項13】
前記第１のドメインおよび前記第２のドメインのうちの少なくとも１つが抗体またはその機能性断片であり、好ましくは、前記機能性断片がナノボディである、請求項１～１２のいずれか一項に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項14】
前記ヘテロ二官能性分子が、二重特異性抗体、好ましくは、二重特異性ナノボディである、請求項１３に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項15】
前記第１のドメインおよび前記第２のドメインのうちの少なくとも１つがアプタマーである、請求項１～１４のいずれか一項に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項16】
医薬として使用するための、請求項１～１５のいずれか一項に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項17】
がんの処置に使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のヘテロ二官能性分子であって、前記がんは、好ましくは、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、胃がん、前立腺がん、肺がん、黒色腫、白血病、膵臓がんおよび膀胱がんからなる群から選択される、ヘテロ二官能性分子。
【請求項18】
前記膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質が、ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を、その細胞表面に発現する細胞を用意するステップであって、
－ 前記膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、前記細胞外部分に第１の非天然エピトープタグを含み；
－ 前記膜結合タンパク質は、前記細胞外部分に第２の非天然エピトープタグを含む、ステップと；
ｂ）前記細胞をヘテロ二官能性分子に曝露するステップであって、前記ヘテロ二官能性分子は、
－ 前記第１の非天然エピトープタグに特異的に結合することができる第１の結合ドメイン；および
－ 前記第２の非天然エピトープタグに結合することができる第２の結合ドメイン
を含む、ステップと；
ｃ）前記細胞の前記膜結合タンパク質の表面レベルを決定するステップと；
ｄ）前記膜結合タンパク質の表面レベルが、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または約１００％減少した場合に、前記膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび前記膜結合タンパク質を選択するステップであって、前記減少は、ステップｂ）の前の、前記細胞の前記膜結合タンパク質の表面レベルと比較した減少である、ステップと
を含む選択方法を用いて選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載のヘテロ二官能性分子。
【請求項19】
がん治療用の標的として膜貫通タンパク質を同定するための方法であって、前記方法は、ｉ）細胞をヘテロ二官能性分子のライブラリーのうちの１つ以上のメンバーに曝露するステップであって、前記ヘテロ二官能性分子は、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み、前記第１の結合ドメインは膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合することができ、前記第２のドメインはスクランブル配列を含む、ステップと；
ｉｉ）前記曝露された細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力のうちの少なくとも１つを決定するステップと；
ｉｉｉ）前記曝露された細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力のうちの少なくとも１つを、対照細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力のうちの少なくとも１つと比較するステップと；
ｉｖ）前記対照細胞と比較して、前記曝露された細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力のうちの少なくとも１つを低減または増加させる前記ヘテロ二官能性分子を同定するステップと；
ｖ）ステップｉｖ）において同定された前記ヘテロ二官能性分子が結合することができる前記膜貫通タンパク質を同定するステップと
を含み、
好ましくは、前記ヘテロ二官能性分子は二重特異性抗体であり、好ましくは、二重特異性ナノボディである、方法。
【請求項20】
前記細胞が、患者由来の組織、好ましくは、培養した患者由来の組織の一部であるかまたはそれに由来し、好ましくは、前記細胞は、生検もしくはオルガノイド、好ましくは、腫瘍オルガノイドの一部であるかまたはそれに由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
細胞の膜結合タンパク質の表面レベルを減少させるための方法であって、前記方法は、ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび前記膜結合タンパク質を、その細胞表面に発現する細胞を用意するステップと；
ｂ）前記細胞をヘテロ二官能性分子に曝露するステップであって、前記ヘテロ二官能性分子は、
ｉ）前記膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外部分に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン；および
ｉｉ）前記膜結合タンパク質の細胞外部分に特異的に結合することができる第２の結合ドメイン
を含む、ステップと；
ｃ）必要に応じて、前記細胞の前記膜結合タンパク質の表面レベルを決定するステップと
を含み、
前記減少は、ステップｂ）の前の、前記細胞の前記膜結合タンパク質の表面レベルと比較した減少である、方法。
【請求項22】
－ 前記膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、前記細胞外部分に第１の非天然エピトープタグを含み、前記ヘテロ二官能性分子の前記第１の結合ドメインが、前記第１の非天然エピトープタグに結合する；ならびに－ 前記膜結合タンパク質が、前記細胞外部分に第２の非天然エピトープタグを含み、前記ヘテロ二官能性分子の前記第２の結合ドメインが、前記第２の非天然エピトープタグに結合する
のうちの少なくとも１つである、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、分子細胞生物学の分野、特にがん細胞生物学の分野に関する。本発明は、膜貫通ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質に同時に結合して、膜貫通タンパク質の内在化を媒介することができるヘテロ二官能性分子の使用に関する。
本発明は、分子細胞生物学の分野、特にがん細胞生物学の分野に関する。本発明は、膜貫通ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質に同時に結合して、膜貫通タンパク質の内在化を媒介することができるヘテロ二官能性分子の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
細胞は、外部化学シグナルを捕捉し、細胞内シグナル伝達カスケードを開始して細胞応答を駆動する、細胞膜に埋め込まれた受容体の活性により、細胞の周囲とコミュニケーションをとる。細胞表面での受容体の利用可能性は、シグナル特異性および感度の重要な決定因子であり、これらの事象の誤った調節は、しばしば、がんの発生と治療耐性に連結している。
細胞は、外部化学シグナルを捕捉し、細胞内シグナル伝達カスケードを開始して細胞応答を駆動する、細胞膜に埋め込まれた受容体の活性により、細胞の周囲とコミュニケーションをとる。細胞表面での受容体の利用可能性は、シグナル特異性および感度の重要な決定因子であり、これらの事象の誤った調節は、しばしば、がんの発生と治療耐性に連結している。
【0003】
実際、受容体の変異活性化または過剰発現は、多数の組織における主要なものであり、広く認識されているがん促進メカニズムである（例えば、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦβＲ、ＩＧＦＲ１、ＧＨＲ、ＦＺＤ、ＬＲＰ６）。がん細胞の異常受容体活性への依存性は、種々の中和抗体および低分子阻害剤の開発を誘発した。しかしながら、受容体活性の中和に成功するためには、毒性を誘発することなく、高い有効性を示すのに十分な血漿濃度に達する強力な結合剤の生成が必要であり、非共有結合性相互作用物質の場合には困難であると判明することがある。さらに、代償性受容体の安定化または上方制御は、耐性の主要な経路である。
【0004】
膜結合受容体のサイトゾル領域がユビキチンで翻訳後修飾されると、誘導されたエンドサイトーシスを介して細胞表面から受容体の急速な除去が誘導される。内在化受容体は、その後、リソソーム分解に供されることがある。健常な幹細胞では、高レベルのＷｎｔシグナル伝達は、細胞表面からの、Ｗｎｔの受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）のユビキチン化および除去を媒介することが公知である、２つの相同な膜結合ユビキチンリガーゼであるＲＮＦ４３およびＺＮＲＦ３の発現を誘導する（Koo et al, Nature 2012, 488(7413):665-9）。したがって、この負のフィードバックループは、細胞表面上のＦｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）受容体の実効数を制御することにより、Ｗｎｔに対する幹細胞の感度を調節するのに役立つ。ＦＺＤに対するＲＮＦ４３／ＺＮＲＦ３の活性は、ＬＧＲ４／５受容体およびＲＮＦ４３／ＺＮＲＦ３と複合体を形成する分泌型タンパク質Ｒ－スポンジン（ＲＳＰＯ）によって幹細胞ニッチにおいて中和される（Hao et al, Nature 2012, 485(7397):195-200）。次に、この三量体ＲＳＰＯ－ＬＧＲ４／５－ＲＮＦ４３／ＺＮＲＦ３複合体は、細胞表面から除去され、ＦＺＤ受容体発現の安定化およびＷｎｔシグナル伝達のレベルの増加をもたらす。Ｗｎｔシグナル伝達は、しばしば、がんにおいて誤って調節される。このようながんは、ＲＮＦ４３およびＺＮＲＦ３を含むＷｎｔ標的遺伝子の発現増加を示す。
【0005】
Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ユビキチンをタンパク質基質にロードしており、ユビキチンのタンパク質基質への転移を助ける、または直接触媒する、Ｅ２ユビキチンをコンジュゲートする酵素を動員する。
【0006】
膜貫通ユビキチンＥ３リガーゼによって媒介される受容体のユビキチン化は、エンドサイトーシスおよびそれに続くユビキチン化基質の分解をもたらすことが公知である。このような分解が、好ましくは、リソソーム内で行われることは、当該技術分野において公知である。リソソーム分解には、モノユビキチン、マルチユビキチン、Ｌｙｓ４８またはＬｙｓ６３連結ポリユビキチン鎖の、膜結合受容体へのライゲーションが必要である。これは、主にプロテアソーム分解経路を利用する、すなわち、Ｌｙｓ４８連結ポリユビキチン鎖の、サイトゾル標的タンパク質へのカップリングによって、主にプロテアソーム分解経路を利用するサイトゾルユビキチンリガーゼの活性とは対照的である。
【0007】
したがって、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、Ｅ２酵素ファミリーの異なるメンバーと相互作用して、膜結合基質を選択的に標的とする可能性がある。ユビキチン化された基質は内在化され、その後、リソソーム分解を介して分解され得る。
【0008】
膜貫通受容体、特に、疾患の発生または進行に関与する膜貫通受容体を効果的に標的とし、その活性を阻害することは、当該技術分野において依然として強く必要とされる。がんの発生に関与する膜貫通受容体を効果的に標的とし、その活性を阻害することは、当該技術分野において特に強く必要とされる。
【発明の概要】
【0009】
発明の要旨
本発明は、以下の実施形態に要約される。
実施形態１．第１および第２の結合ドメインを含むヘテロ二官能性分子であって、
ｉ）第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができ；
ｉｉ）第２の結合ドメインは、膜貫通タンパク質に特異的に結合することができ、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、好ましくは、膜貫通タンパク質のユビキチン化と内在化（internalisation）をもたらす、ヘテロ二官能性分子。
本発明は、以下の実施形態に要約される。
実施形態１．第１および第２の結合ドメインを含むヘテロ二官能性分子であって、
ｉ）第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができ；
ｉｉ）第２の結合ドメインは、膜貫通タンパク質に特異的に結合することができ、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、好ましくは、膜貫通タンパク質のユビキチン化と内在化（internalisation）をもたらす、ヘテロ二官能性分子。
【0010】
実施形態２．分子が、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外部分および膜貫通タンパク質の細胞外部分に結合する、実施形態１に記載のヘテロ二官能性分子。
【0011】
実施形態３．膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質への分子の同時結合が、膜貫通タンパク質の分解、好ましくは、リソソーム分解をもたらす、実施形態１または２に記載のヘテロ二官能性分子。
【0012】
実施形態４．膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、モノユビキチン、マルチユビキチン、Ｌｙｓ４８連結またはＬｙｓ６３連結ポリユビキチン鎖により膜貫通タンパク質をユビキチン化する、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二官能性分子。
【0013】
実施形態５．膜貫通タンパク質が、受容体、好ましくは、がんに関与する受容体である、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二官能性分子。
【0014】
実施形態６．膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ１６７、ＺＮＲＦ３、ＲＮＦ１３、ＡＭＦＲ、ＭＡＲＣＨ１、ＭＡＲＣＨ２、ＭＡＲＣＨ４、ＭＡＲＣＨ８、ＭＡＲＣＨ９、ＲＮＦ１４９、ＲＮＦ１４５、ＲＮＦＴ１、ＲＮＦ１３０およびＲＮＦ１２８からなる群から選択される、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二官能性分子。
【0015】
実施形態７．膜貫通タンパク質が、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二官能性分子。
【0016】
実施形態８．分子が、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインの間にリンカーを含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二官能性分子。
【0017】
実施形態９．第１のドメインおよび第２のドメインのうちの少なくとも１つ（at leastone the first domain and the second domain）が、有機小分子またはタンパク性分子である、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二官能性分子。
【0018】
実施形態１０．ヘテロ二官能性分子が二環性ペプチドである、実施形態９に記載のヘテロ二官能性分子。
【0019】
実施形態１１．第１のドメインおよび第２のドメインのうちの少なくとも１つが抗体またはその機能性断片であり、好ましくは、機能性断片がナノボディである、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二官能性分子。
【0020】
実施形態１２．ヘテロ二官能性分子が、二重特異性抗体、好ましくは、二重特異性ナノボディである、実施形態１１に記載のヘテロ二官能性分子。
【0021】
実施形態１３．第１のドメインおよび第２のドメインのうちの少なくとも１つがアプタマーである、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二官能性分子。
【0022】
実施形態１４．医薬として使用するための、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二官能性分子。
【0023】
実施形態１５．がんの処置に使用するための、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二官能性分子であって、がんは、好ましくは、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、胃がん、前立腺がん、肺がん、黒色腫、白血病、膵臓がんおよび膀胱がんからなる群から選択される、ヘテロ二官能性分子。
【0024】
実施形態１６．がん治療用の標的として膜貫通タンパク質を同定するための方法であって、該方法は、
ｉ）細胞をヘテロ二官能性分子のライブラリーのうちの１つ以上のメンバーに曝露するステップであって、ヘテロ二官能性分子は、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み、
第１の結合ドメインは膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合することができ、第２のドメインはスクランブル配列（scrambled sequence）を含む、ステップと；
ｉｉ）曝露された細胞の生存率（viability）、分化能力（differentiation capacity）、幹細胞性（stemness）および増殖能力（proliferation capacity）のうちの少なくとも１つを決定するステップと；
ｉｉｉ）曝露された細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力のうちの少なくとも１つを、対照細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力のうちの少なくとも１つと比較するステップと；
ｉｖ）対照細胞と比較して、曝露された細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力のうちの少なくとも１つを低減または増加させるヘテロ二官能性分子を同定するステップと；
ｖ）ステップｉｖ）において同定されたヘテロ二官能性分子が結合することができる膜貫通タンパク質を同定するステップ
とを含む、方法。
ｉ）細胞をヘテロ二官能性分子のライブラリーのうちの１つ以上のメンバーに曝露するステップであって、ヘテロ二官能性分子は、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み、
第１の結合ドメインは膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合することができ、第２のドメインはスクランブル配列（scrambled sequence）を含む、ステップと；
ｉｉ）曝露された細胞の生存率（viability）、分化能力（differentiation capacity）、幹細胞性（stemness）および増殖能力（proliferation capacity）のうちの少なくとも１つを決定するステップと；
ｉｉｉ）曝露された細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力のうちの少なくとも１つを、対照細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力のうちの少なくとも１つと比較するステップと；
ｉｖ）対照細胞と比較して、曝露された細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力のうちの少なくとも１つを低減または増加させるヘテロ二官能性分子を同定するステップと；
ｖ）ステップｉｖ）において同定されたヘテロ二官能性分子が結合することができる膜貫通タンパク質を同定するステップ
とを含む、方法。
【0025】
実施形態１７．ヘテロ二官能性分子が、二重特異性抗体、好ましくは、二重特異性ナノボディである、実施形態１６に記載の方法。
【0026】
実施例１８．細胞が、患者由来の組織、好ましくは、培養した患者由来の組織の一部であるかまたはそれに由来し、好ましくは、細胞は、生検もしくはオルガノイド、好ましくは、腫瘍オルガノイドの一部であるかまたはそれに由来する、実施形態１６または１７に記載の方法。
【0027】
実施形態１９．細胞の膜結合タンパク質の表面レベルを減少させるための方法であって、該方法は、
ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を、その細胞表面に発現する細胞を用意するステップと；
ｂ）細胞をヘテロ二官能性分子に曝露するステップであって、ヘテロ二官能性分子は、
ｉ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外部分に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン；および
ｉｉ）膜結合タンパク質の細胞外部分に特異的に結合することができる第２の結合ドメイン
を含む、ステップと；
ｃ）必要に応じて、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルを決定するステップ
とを含み、
表面レベルにおける減少は、ステップｂ）の前の、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルと比較した減少である、方法。
ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を、その細胞表面に発現する細胞を用意するステップと；
ｂ）細胞をヘテロ二官能性分子に曝露するステップであって、ヘテロ二官能性分子は、
ｉ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外部分に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン；および
ｉｉ）膜結合タンパク質の細胞外部分に特異的に結合することができる第２の結合ドメイン
を含む、ステップと；
ｃ）必要に応じて、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルを決定するステップ
とを含み、
表面レベルにおける減少は、ステップｂ）の前の、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルと比較した減少である、方法。
【0028】
実施形態２０．膜結合タンパク質が膜貫通タンパク質である、実施形態１９に記載の方法。
【0029】
実施形態２１．
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、細胞外部分に第１の非天然エピトープタグを含み、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインが、第１の非天然エピトープタグに結合する；ならびに
－ 膜結合タンパク質が、細胞外部分に第２の非天然エピトープタグを含み、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインが、第２の非天然エピトープタグに結合する
のうちの少なくとも１つである、実施形態１９または２０に記載の方法。
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、細胞外部分に第１の非天然エピトープタグを含み、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインが、第１の非天然エピトープタグに結合する；ならびに
－ 膜結合タンパク質が、細胞外部分に第２の非天然エピトープタグを含み、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインが、第２の非天然エピトープタグに結合する
のうちの少なくとも１つである、実施形態１９または２０に記載の方法。
【0030】
実施形態２２．第１および第２の非天然エピトープタグが異なるタグである、実施形態２１に記載の方法。
【0031】
実施形態２３．第１の非天然エピトープタグが、アルファタグおよびＥ６タグのうちの少なくとも１つであり、ならびに／または第２の非天然エピトープタグが、アルファタグおよびＥ６タグのうちの少なくとも１つである、実施形態２１または２２に記載の方法。
【0032】
実施形態２４．第１および第２の非天然エピトープタグが、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質のそれぞれのＮ末端に位置する、実施形態１９～２３のいずれか１つに記載の方法。
【0033】
実施形態２５．ヘテロ二官能性分子が、二重特異性抗体、好ましくは、二重特異性ナノボディである、実施形態１９～２４のいずれか１つに記載の方法。
【0034】
実施形態２６．ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインが抗アルファＶＨＨであり、第２の結合ドメインが抗Ｅ６ ＶＨＨであり、またはヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインが抗Ｅ６ ＶＨＨであり、第２の結合ドメインが抗アルファＶＨＨである、実施形態２５に記載の方法。
【0035】
実施形態２７．膜結合タンパク質が第３の非天然エピトープタグを含む、および／または膜貫通ユビキチンＥ３リガーゼが第４の非天然エピトープタグを含み、好ましくは第３および／または第４のエピトープタグがＨｉｓ－タグ、ＦＬＡＧ－タグおよびｍｙｃ－タグのうちの少なくとも１つである、実施形態１９～２６のいずれか１つに記載の方法。
【0036】
実施形態２８．ステップｃ）における膜結合タンパク質の細胞表面レベルが、細胞表面上のタンパク質を検出することによって、好ましくは免疫蛍光によって決定される、実施形態１９～２７のいずれか１つに記載の方法。
【0037】
実施形態２９．膜結合タンパク質の細胞表面レベルが、ステップｂ）の前の、膜結合タンパク質の細胞表面レベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または少なくとも約６０％減少する、実施形態１９～２８のいずれか１つに記載の方法。
【0038】
実施形態３０．膜結合タンパク質の表面レベルの減少が、細胞内の膜結合タンパク質の総量の減少により、好ましくは生化学的分析により決定される、実施形態１９～２９のいずれか１つに記載の方法。
【0039】
実施形態３１．ステップａ）において用意される細胞が、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を過剰発現し、必要に応じて永久的に（permanently）過剰発現する、実施形態１９～３０のいずれか１つに記載の方法。
【0040】
実施形態３２．ステップａ）において用意される細胞が、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を内因性レベルで発現する、実施形態１９～３０のいずれか１つに記載の方法。
【0041】
実施形態３３．ステップａ）において用意される細胞において、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードするゲノム配列が、第１の、および必要に応じた第４の非天然エピトープタグをコードする配列を組み込むように改変されている、実施形態３２に記載の方法。
【0042】
実施形態３４．ステップａ）において用意される細胞において、膜結合タンパク質をコードするゲノム配列が、第２の、および必要に応じた第３の非天然エピトープタグをコードする配列を組み込むように改変されている、実施形態３２および３３に記載の方法。
【0043】
実施形態３５．ヘテロ二官能性分子が、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインの間にペプチドリンカーを含み、好ましくはペプチドリンカーが（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎは好ましくは１、２、３、４、５、６または７であり、好ましくはｎは３または５である、実施形態１９～３４のいずれか１つに記載の方法。
【0044】
実施形態３６．膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質が、
ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を、その細胞表面に発現する細胞を用意するステップであって、
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、細胞外部分に第１の非天然エピトープタグを含み；
－ 膜結合タンパク質は、細胞外部分に第２の非天然エピトープタグを含む、ステップと；
ｂ）細胞をヘテロ二官能性分子に曝露するステップであって、ヘテロ二官能性分子は、
－ 第１の非天然エピトープタグに特異的に結合することができる第１の結合ドメイン；および
－ 第２の非天然エピトープタグに結合することができる第２の結合ドメイン
を含む、ステップと；
ｃ）細胞の膜結合タンパク質の表面レベルを決定するステップと；
ｄ）膜結合タンパク質の表面レベルが、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または約１００％減少した場合に、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を選択するステップであって、該減少は、ステップｂ）の前の、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルと比較した減少である、ステップ
とを含む選択方法を用いて選択される、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のヘテロ二官能性分子。
ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を、その細胞表面に発現する細胞を用意するステップであって、
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、細胞外部分に第１の非天然エピトープタグを含み；
－ 膜結合タンパク質は、細胞外部分に第２の非天然エピトープタグを含む、ステップと；
ｂ）細胞をヘテロ二官能性分子に曝露するステップであって、ヘテロ二官能性分子は、
－ 第１の非天然エピトープタグに特異的に結合することができる第１の結合ドメイン；および
－ 第２の非天然エピトープタグに結合することができる第２の結合ドメイン
を含む、ステップと；
ｃ）細胞の膜結合タンパク質の表面レベルを決定するステップと；
ｄ）膜結合タンパク質の表面レベルが、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または約１００％減少した場合に、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を選択するステップであって、該減少は、ステップｂ）の前の、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルと比較した減少である、ステップ
とを含む選択方法を用いて選択される、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のヘテロ二官能性分子。
【0045】
定義
本発明の方法、組成物、製剤、使用および他の態様に関する種々の用語が、本明細書および特許請求の範囲を通して使用される。このような用語は、別段の指示がない限り、発明が属する当該技術分野における通常の意味を与えられるものとする。他の具体的に定義された用語は、本明細書において提供される定義と一致する方法で解釈されるべきである。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の試験のための実施において使用することができるが、好ましい材料および方法を本明細書に記載する。
本発明の方法、組成物、製剤、使用および他の態様に関する種々の用語が、本明細書および特許請求の範囲を通して使用される。このような用語は、別段の指示がない限り、発明が属する当該技術分野における通常の意味を与えられるものとする。他の具体的に定義された用語は、本明細書において提供される定義と一致する方法で解釈されるべきである。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の試験のための実施において使用することができるが、好ましい材料および方法を本明細書に記載する。
【0046】
本発明の方法において使用される従来技術を実施する方法は、当業者には明らかである。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、配列決定および関連分野における従来技術の実践は、当業者に周知であり、例えば、以下の参考文献：Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987、および定期的な更新；ならびにそのシリーズであるMethods in Enzymology, Academic Press, San Diegoにおいて検討される。
【0047】
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」：これらの単数形の用語は、内容が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示参照を含む。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。したがって、例えば、「細胞」への言及は、２つ以上の細胞の組合せなどを含む。
【0048】
「約」および「およそ」：これらの用語は、量、持続時間などの測定可能な値に言及する場合、このような変動が開示された方法を行うのに適しているように、指定された値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味する。加えて、量、比、および他の数値は、本明細書において、範囲形式で提示されることがある。このような範囲フォーマットは、便宜上簡潔に使用され、範囲の限界として明示的に指定された数値を含むように柔軟に理解されるべきであるが、また、個々の数値およびサブ範囲が明示的に指定されるように、その範囲内に包含されるすべての個々の数値またはサブ範囲を含むように理解されるべきである。例えば、約１～約２００の範囲の比は、約１および約２００の明示的に記載された限界を含むと理解されるべきであるが、また、約２、約３および約４などの個々の比、ならびに約１０～約５０、約２０～約１００などのサブ範囲を含むと理解されるべきである。
【0049】
「および／または」：用語「および／または」は、記載されたケースの１つ以上が、単独で、または記載されたケースの少なくとも１つと組み合わせて、記載されたケースの最大すべてとともに発生し得る状況を指す。
【0050】
「含んでいる」：この用語は、包括的およびオープンエンドであり、排他的ではないと解釈される。具体的には、この用語およびその変形は、特定された特徴、ステップまたは構成要素を含むことを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップまたは構成要素の存在を除外すると解釈されるべきではない。
【0051】
「例示的」：この用語は、「例、場合または例示として機能すること」を意味し、本明細書に開示される他の構成を除外すると解釈されるべきではない。
【0052】
用語「ヘテロ二官能性分子」は、本明細書において、２つの異なる機能性結合ドメインを含む分子として定義される。特に、本発明のヘテロ二官能性分子は、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合するための第１の機能性結合ドメインと、第２の分子に結合するための別の第２の機能性結合ドメインとを有する。「ヘテロ二官能性」という名称がすでに示すように、第２の機能性結合ドメインは、第２の分子に結合し、第２の分子は、第１の機能性結合ドメインに結合することができる同一の分子ではない、すなわち、同一の膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼではない。好ましくは、第２の機能性結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合しない。
【0053】
用語「タンパク質」または「ポリペプチド」とは、特定の作用様式、大きさ、３次元構造または起源を参照することなく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。したがって、タンパク質の「断片」または「部分」は、なおも「タンパク質」と称され得る。本明細書において定義され、本明細書において定義される任意の方法で使用されるタンパク質は、単離されたタンパク質であり得る。「単離されたタンパク質」は、もはや天然界にはない、例えば、インビトロまたは組換え細菌もしくは植物宿主細胞にはない、タンパク質を言及するために使用される。好ましくは、タンパク質は５０を超えるアミノ酸残基を含む。
【0054】
用語「タンパク性分子」は、本明細書では、ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸単量体の短鎖を含む分子として理解される。アミノ酸単量体の短鎖は、２つ以上のアミノ酸残基を含む。好ましくは、アミノ酸の鎖は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個のアミノ酸残基を有する。好ましくは、１００個以下のアミノ酸残基が存在する。好ましくは、タンパク性分子中に５０個以下のアミノ酸残基が存在する。好ましくは、タンパク性分子は、約２～１００、３～５０、４～４０、または５～３０個、または６～２０個のアミノ酸残基を有する。好ましくは、タンパク性分子は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸残基を有する。必要に応じて、タンパク性分子は、環状タンパク性分子を生成するために、限定されないが、連結部分などの１つ以上のさらなる有機部分を含む。
【0055】
「アプタマー」は、好ましくは、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子である。アプタマーは、任意の適切な数のヌクレオチドを含むことができる。アプタマーは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含むか、またはリボヌクレオチド残基とデオキシリボヌクレオチド残基の両方を含むことができる。アプタマーは、一本鎖、二本鎖であるか、または二本鎖もしくは三本鎖領域を含有することができる。さらに、アプタマーは、例えば、その安定性を向上させるために、化学修飾された残基を含むことができる。
【0056】
アプタマーは、典型的には、約１０～約３００ヌクレオチドの長さである。より一般的には、アプタマーは、長さが約３０～約１００ヌクレオチドである。
【0057】
所定の標的（すなわち、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼまたはさらなる膜貫通タンパク質）に対するアプタマーは、（ａ）候補混合物を標的と接触させるステップであって、候補混合物中の他の核酸と比較して、標的に対する増大した親和性を有する核酸が、候補混合物の残りから分離され得るステップ；（ｂ）増大した親和性核酸を候補混合物の残りから分離するステップ；および（ｃ）増大した親和性核酸を増幅して核酸の濃縮された混合物を生じさせ、それによって標的分子のアプタマーが同定されるステップを含む方法を使用して、核酸の候補混合物から同定され得る核酸を含む。
【0058】
親和性相互作用は程度の問題であることが認識されているが、この文脈では、その標的に対するアプタマーの「特異的結合親和性」は、アプタマーが、一般的には、混合物または試料中の他の非標的成分に結合するよりもはるかに高い程度の親和性でその標的に結合することを意味する。
【0059】
アプタマーは、同じ環境中の他の物質が核酸に複合体化されない環境下で意図された標的分子と複合体を形成することができる特異的結合領域を有する。結合の特異性は、そのリガンドに対するアプタマーの比較解離定数（Ｋｄ）を、環境中の他の材料または全般的に無関係な分子に対するアプタマーの解離定数と比較する点から定義することができる。典型的には、そのリガンドに関するアプタマーのＫｄは、環境中の無関係な材料または付随する材料を有するアプタマーのＫｄよりも少なくとも約１０倍小さい。さらにより好ましくは、Ｋｄは、少なくとも約５０倍小さく、より好ましくは少なくとも約１００倍小さく、最も好ましくは少なくとも約２００倍小さい。
【0060】
ある実施形態では、膜貫通タンパク質に結合するアプタマーは、１ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある実施形態では、抗膜貫通タンパク質抗体は、異なる種間で保存されるエピトープに結合する。
【0061】
ある実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合するアプタマーは、１ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある実施形態では、抗膜貫通タンパク質抗体は、異なる種間で保存されたエピトープに結合する。
【0062】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的および／または免疫学的活性を示す限り、例えば、モノクローナル抗体、例えばアゴニストおよびアンタゴニスト、中和抗体、完全長または無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、一本鎖抗体および抗体の機能性断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、重鎖抗体、ナノボディをカバーする。
【0063】
用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書においては抗体と交換可能に使用される。抗体は、ヒトおよび／またはヒト化され得る。
【0064】
用語「抗膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ抗体」は、具体的には、所望の生物学的および／または免疫学的活性を示す限り、例えば、単一抗膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼモノクローナル抗体、例えばアゴニストおよびアンタゴニスト、好ましくはアゴニスト、中和抗体、完全長または無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、裸の抗体、多価抗体、一本鎖抗膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ抗体および抗膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ抗体の断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、重鎖抗体およびナノボディをカバーする。好ましい抗体はナノボディであり得る。好ましくは、抗膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ抗体は、本明細書において下記に定義されるＥ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合する。
【0065】
用語「抗膜貫通タンパク質抗体」は、具体的には、所望の生物学的および／または免疫学的活性を示す限り、例えば、単一抗膜貫通タンパク質モノクローナル抗体、例えばアゴニストおよびアンタゴニスト、好ましくはアンタゴニスト、中和抗体、完全長または無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、裸の抗体、多価抗体、一本鎖抗膜貫通タンパク質抗体および抗膜貫通タンパク質抗体の断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、重鎖抗体およびナノボディをカバーする。好ましい抗体はナノボディであり得る。好ましくは、抗膜貫通タンパク質抗体は、本明細書において下記に定義される膜貫通タンパク質に特異的に結合する。
【0066】
用語「抗膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ抗体」または「膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合する抗体」とは、抗体が本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインとして有用であるように、十分な親和性で膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合することができる抗体を指す。好ましくは、非関連タンパク質に対する抗膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはＥＬＩＳＡによって測定した場合、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する抗体の結合の約１０％未満である。ある実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合する抗体は、１ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある実施形態では、抗膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ抗体は、異なる種間で保存されたエピトープに結合する。
【0067】
用語「抗膜貫通タンパク質抗体」または「膜貫通タンパク質に結合する抗体」とは、抗体が本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインとして有用であるように、十分な親和性で特異的または選択された膜貫通タンパク質に結合することができる抗体を指す。好ましくは、無関係なタンパク質に対する抗膜貫通タンパク質抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはＥＬＩＳＡによって測定した場合、膜貫通タンパク質に対する抗体の結合の約１０％未満である。ある実施形態では、膜貫通タンパク質に結合する抗体は、１ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある実施形態では、抗膜貫通タンパク質抗体は、異なる種間で保存されたエピトープに結合する。
【0068】
目的の抗原、すなわち、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼまたは目的のさらなる膜貫通タンパク質に「結合する」抗体は、抗体が本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインとしてそれぞれ有用であるように、十分な親和性で前記抗原に結合する抗体である。
【0069】
ヘテロ二官能性分子中の第１の結合ドメインとしてまたは第２の結合ドメインとして作用する抗体は、基本的４鎖抗体であり得る。このような基本的４鎖抗体単位は、好ましくは、２つの同一の軽鎖（Ｌ）および２つの同一の重鎖（Ｈ）で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドとともに５つの基本的なヘテロ四量体単位からなり、したがって、１０個の抗原結合部位を含有し、一方、分泌型ＩｇＡ抗体は、重合して、Ｊ鎖とともに２～５個の基本的４鎖単位を含む多価集合体を形成することができる）。
【0070】
ＩｇＧの場合、４鎖単位は、一般的に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は１つの共有結合ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結されるが、一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプによって１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。各Ｈ鎖とＬ鎖はまた、規則的に離れた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖はＮ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて、αおよびγ鎖の各々に対して３つの定常ドメイン（ＣＨ）、μおよびεアイソタイプに対して４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖はＮ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、続いて、他の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖（ＣＨ１）の第１の定常ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられる。ＶＨとＶＬの対合はともに、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造および性質については、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6を参照されたい。
【0071】
任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパとラムダと呼ばれる２つの明確に区別されるタイプのうちの１つに割り当てることができる。重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つのクラスの免疫グロブリンが存在し、それぞれα、δ、ε、γおよびμと称される重鎖を有する。γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能における比較的小さな差異に基づいてサブクラスにさらに分けられ、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を発現する。
【0072】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称され得る。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称され得る。これらのドメインは、一般的に、抗体の最も可変的な部分であり、抗原結合部位を含有する。
【0073】
用語「可変」とは、可変ドメインのあるセグメントが抗体間で配列が大きく異なることを指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変ドメインの１１０アミノ酸スパンにわたって、可変性は均一に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる１５～３０アミノ酸の比較的不変なストレッチからなり、各９～１２アミノ酸長の「超可変領域」（ＨＶＲ）と呼ばれる極端に可変性であるより短い領域で区切られている。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々４つのＦＲを含み、主にβシート構造を採用し、３つの超可変領域によって接続され、これらは、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成するループを形成する。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによって近接して一緒に保持され、他の鎖からの超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照されたい）。定常ドメインは抗原に対する抗体の結合に直接的には関与しないが、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【0074】
「無傷（インタクト（intact））」抗体は、抗原結合部位ならびにＣＬおよび少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む抗体である。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそれらのアミノ酸配列バリアントであり得る。
【0075】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは、少なくとも無傷抗体の抗原結合および／または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；トリアボディ；線形抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書、Ｅｘａｍｐｌｅ２； Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]を参照されたい）；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。一実施形態では、抗体断片は、無傷抗体の抗原結合部位を含み、したがって、抗原に結合する能力を保持する。
【0076】
用語「ナノボディ」は、当該技術分野において周知である。ナノボディは、重鎖のみの抗体のＶＨＨドメインを含むかまたはそれからなる抗体断片である。好ましいナノボディは、ラクダ科から誘導可能であり、好ましくはラマから誘導可能である。
【0077】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合性断片、および容易に結晶化する能力を反映する名称である、残りの「Ｆｃ」断片を生成する。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖（ＶＨ）の可変領域ドメインとともにＬ鎖全体、および１つの重鎖（ＣＨ１）の第１の定常ドメインからなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。
【0078】
抗体のペプシン処置は単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片を生じ、これは二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片にほぼ対応し、なおも抗原を架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にさらなる少数の残基を有することによって、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的カップリングもまた公知である。
【0079】
Ｆｃ断片は、ジスルフィドによってともに保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列によって決定され、この領域はまた、あるタイプの細胞に見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分である。
【0080】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体断片である。この断片は、しっかりとして非共有結合的に会合した、１つの重鎖および１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が、２本鎖Ｆｖ種におけるものと類似した「二量体」構造で会合することができるように、可撓性ペプチドリンカーによって共有結合的に連結され得る。これら２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖およびＬ鎖からの各々３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識および結合する能力を有するが、結合部位全体よりも低い親和性である。
【0081】
「一本鎖Ｆｖ」はまた、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略されるが、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶＨとＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。
【0082】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る、可能な天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、異なる決定基（エピトープ）へと方向づけられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、単一の抗原部位へと方向づけられる。モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成され得るという点で有利である。修飾語句「モノクローナル」は、いかなる特定の方法によっても抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明のヘテロ二官能性分子中の第１または第２の結合ドメインとして有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ方法論によって調製することができるか、または細菌、真核生物動物もしくは植物の細胞において組換えＤＮＡ法を用いて作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【0083】
本明細書にけるモノクローナル抗体は、所望の生物活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、一方、鎖（複数可）の残りは、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびにこのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)を参照されたい）。本明細書における目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、旧世界猿、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列、およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。
【0084】
非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の抗体特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基で置換される。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンの少数のフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中に見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能をさらに改良するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、典型的には、２つの可変ドメインを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む。詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。また、以下の概説記事およびそこに引用されている参考文献を参照されたい：Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol., 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech., 5:428-433 (1994)。
【0085】
用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」は、本明細書で使用される場合、配列において超可変である、および／または抗原結合に関与する構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は、６つの超可変領域；ＶＨ中に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、およびＶＬ中に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。多数の超可変領域の輪郭が使用されており、本明細書に包含される。超可変領域は、一般的に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けした場合、ＶＬ中のほぼ約残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）および８９－９７（Ｌ３）、ならびにＶＨ中のほぼ約３１－３５（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）および９５－１０２（Ｈ３）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）および／または「超可変ループ」由来のそれらの残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムに従って番号付けした場合、ＶＬ中の残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）および８９－９７（Ｌ３）、ならびにＶＨ中の２６－３２（Ｈ１）、５２－５６（Ｈ２）および９５－１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；および／または「超可変ループ」／ＣＤＲからのそれらの残基（例えば、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従って番号付けした場合、ＶＬ中の残基２７－３８（Ｌ１）、５６－６５（Ｌ２）および１０５－１２０（Ｌ３）、ならびにＶＨ中の２７－３８（Ｈ１）、５６－６５（Ｈ２）および１０５－１２０（Ｈ３）；Lefranc, M. P. et al. Nucl. Acids Res. 27:209-212 (1999), Ruiz, M. et al. Nucl. Acids Res. 28:219-221 (2000)）を含む。必要に応じて、抗体は、Honneger, A. and Plunkthun, A. J. (Mol. Biol. 309:657-670 (2001))に従って番号付けした場合、以下の点：ＶＬ中の２８、３６（Ｌ１）、６３、７４－７５（Ｌ２）および１２３（Ｌ３）、ならびにＶＨ中の２８、３６（Ｈ１）、６３、７４－７５（Ｈ２）および１２３（Ｈ３）のうちの１つ以上で対称的挿入を有する。本発明の抗体の超可変領域／ＣＤＲは、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従って定義され、番号付けされることが好ましい。
【0086】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【0087】
「ブロッキング」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物活性を阻害または低減させるものである。好ましいブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的にまたは完全に阻害する。
【0088】
「アゴニスト抗体」は、本明細書で使用される場合、目的のポリペプチドの機能性活性のうちの少なくとも１つを模倣する抗体である。
【0089】
「結合親和性」とは、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する内因性結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含め、当該技術分野において公知である一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般的にゆっくりと抗原に結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般的により速く抗原に結合し、より長く結合し続ける傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当該技術分野において公知であり、そのいずれも本発明の目的のために使用することができる。具体的な例示的実施形態を以下に記載する。
【0090】
「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、約１０～５０応答単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを用いることによって測定することができる。簡単に説明すると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）は、供給者の使用説明書に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原をｐＨ４．８の１０ｍＭ酢酸ナトリウムで５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、５μｌ／分の流速で注射し、カップリングしたタンパク質の約１０応答単位（ＲＵ）を達成する。抗原の注射後、１Ｍエタノールアミンを注射して、未反応基をブロックする。動力学測定のために、抗体またはＦａｂ（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）の２倍系列希釈物を、２５℃にて約２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に注射する。会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を、会合と解離センサグラムを同時に適合させることにより、簡単な１対１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウエア バージョン３．２）を用いて計算した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算した。例えば、Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照されたい。上記表面プラズモン共鳴アッセイによりオンレートが１０６Ｍ－１Ｓ－１を超える場合、オンレートは、ストップフロー付き分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌レッドキュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ－Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定した場合、増加した濃度の抗原の存在下、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中の２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃で蛍光発光強度の増減（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）を測定する蛍光消光技術を用いることによって決定することができる。
【0091】
また、本発明による「オンレート」または「会合の速度」または「会合速度」または「ｋｏｎ」は、上述のように、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて上述の同じ表面プラズモン共鳴技術で決定することができる。
【0092】
好ましくは、第１または第２の結合ドメインとしてヘテロ二官能性分子に使用するための抗体は、他のタンパク質と有意に交差反応しない。
【0093】
本発明のヘテロ二官能性分子の用語「抗原結合タンパク質」および「結合ドメイン」は、本明細書において互換的に使用することができる。
【0094】
用語「エピトープ」は、本発明のヘテロ二官能性分子の第１または第２の結合ドメインによってそれぞれ結合される分子の一部である。この用語は、抗原結合タンパク質に特異的に結合することができ、例えば、本明細書において以下に定義されるヘテロ二官能性分子の第１または第２のドメインに特異的に結合することができる任意の決定基を含む。エピトープは、連続的または非連続的であり得る（例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列において互いに連続していないが、分子の文脈内にあるアミノ酸残基は、抗原結合タンパク質によって結合される）。エピトープは、好ましくは、本明細書において定義される膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ上に、または本明細書において定義される目的のさらなる膜貫通タンパク質上に存在する。
【0095】
エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、スルホニルまたは硫酸基などの分子の化学的に活性な表面基群（surface groupings）を含み得、特異的な三次元構造特性、および／または特異的な電荷特性を有し得る。一般的に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複合体混合物中の標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
【0096】
本明細書中の用語「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は異なることがあるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基、またはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸長するものと定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リシン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の製造もしくは精製中に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組換え的に操作することによって除去することができる。
【0097】
用語「Ｆｃ領域を含む抗体」とは、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リシン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の精製中に、または抗体をコードする核酸を組換え的に操作することによって除去することができる。したがって、本発明によるＦｃ領域を有する抗体を含むヘテロ二官能性分子は、Ｋ４４７を有するかまたはＫ４４７が除去された抗体を含むことができる。
【0098】
「アミノ酸配列」：これは、タンパク質の、またはタンパク質内のアミノ酸残基の順序を指す。換言すると、タンパク質中のアミノ酸の任意の順序はアミノ酸配列と称され得る。
【0099】
「ヌクレオチド配列」：これは、核酸の、または核酸内のヌクレオチドの順序を指す。換言すれば、核酸中のヌクレオチドの任意の順序はヌクレオチド配列と称され得る。
【0100】
用語「相同性」、「配列同一性」などは、本明細書において互換的に使用される。配列同一性は、本明細書において、配列を比較することによって決定した場合、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列間または２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関連として定義される。当該技術分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、このような配列のストリング間の一致によって決定した場合、アミノ酸配列間または核酸配列間の配列関連性の程度を意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。
【0101】
用語「相補性」は、本明細書では、完全に相補的な鎖（例えば、第２の鎖または逆鎖）に対するヌクレオチド配列の配列同一性として定義される。例えば、１００％相補的（または完全に相補的）である配列は、本明細書では、相補的な鎖と１００％の配列同一性を有すると理解され、例えば、本明細書では、８０％相補的な配列は、（完全に）相補的な鎖と８０％の配列同一性を有すると理解される。
【0102】
「同一性」および「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができる。「配列同一性」および「配列類似性」は、２つの配列の長さに依存して、全体的または局所的アラインメントアルゴリズムを用いて、２つのペプチド配列または２つのヌクレオチド配列を整列させることによって決定することができる。同様の長さの配列は、好ましくは、全長にわたって配列を最適に整列させるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ）を使用して整列され、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用して整列される。次に、配列は、（例えば、既定のパラメーターを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列された場合に）配列同一性（以下に定義される）の少なくともある最小パーセンテージを共有する場合、「実質的に同一」または「本質的に類似」と称され得る。ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、全長（完全長）にわたって２つの配列を整列し、マッチの数を最大化し、ギャップ数を最小化する。グローバルアラインメントは、２つの配列が類似した長さを有する場合、配列同一性を決定するために適切に使用される。一般的に、ＧＡＰデフォルトパラメーターを使用し、ギャップ生成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）およびギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチドについては、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質については、デフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919）。配列アラインメントおよび配列同一性パーセンテージのスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２１－３７５２ ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータプログラムを用いて、または上記のＧＡＰと同じパラメーターを使用して、ＥｍｂｏｓｓＷＩＮ バージョン２．１０．０のプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ アルゴリズムを使用する）もしくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ アルゴリズムを使用する）などのオープンソースソフトウェアを使用して、またはデフォルト設定（「ｎｅｅｄｌｅ」と「ｗａｔｅｒ」の両方、およびタンパク質とＤＮＡアラインメントの両方について、デフォルトギャップオープンペナルティは １０．０であり、デフォルトギャップ拡張ペナルティは０．５であり；デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質の場合はＢｌｏｓｕｍ６２、ＤＮＡの場合はＤＮＡＦｕｌｌである）を使用して決定され得る。配列が実質的に異なる全長を有する場合、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するものなどのローカルアラインメントが好ましい。
【0103】
代わりに、パーセンテージ類似性または同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して、公開データベースに対して検索することによって決定することができる。したがって、本発明の核酸およびタンパク質配列は、さらに、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、公開データベースに対して検索を行うための「クエリー配列」として用いることができる。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行うことができる。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402に記載されるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘおよびＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/で国立バイオテクノロジー情報センターのホームページを参照されたい。
【0104】
本明細書で使用される場合、用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」とは、疾患、好ましくは本明細書において以下に定義される疾患の再発、開始、発症もしくは進行の予防または低減、または疾患もしくはその１つ以上の症状の重症度および／もしくは期間の予防または低減を指す。
【0105】
本明細書で使用される場合、用語「治療」および「治療」とは、疾患、好ましくは本明細書において以下に定義される疾患、またはその１つ以上の症状の予防、処置、管理または改善において使用することができる任意のプロトコール（複数可）、方法（複数可）および／または薬剤（複数可）を指すことができる。
【0106】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置すること」および「処置」とは、疾患、好ましくは本明細書において以下に定義される疾患の進行、重症度、および／もしくは期間の低減または改善を指し、ならびに／あるいは疾患の１つ以上の症状を低減または改善する。
【0107】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」とは、疾患の重症度および／もしくは期間を低減し、その１つ以上の症状を改善し、疾患の進展を予防し、または疾患の退行を引き起こすのに十分であるか、あるいは疾患またはその１つ以上の症状の発症、再発、開始もしくは進行の予防をもたらし、または別の治療（例えば、別の治療剤）の予防効果および／または治療効果を増強もしくは向上させるのに十分である治療、例えば、予防剤または治療剤、好ましくは本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子の量を指す。好ましくは、疾患は、本明細書において以下に定義される疾患である。
【発明を実施するための形態】
【0108】
詳細な説明
本発明は、膜結合タンパク質の標的化された内在化およびその後の分解のために、ヘテロ二官能性分子を採用する本発明の概念に関する。本発明のヘテロ二官能性分子は、膜貫通ユビキチンリガーゼと、がん促進受容体などの膜結合タンパク質に同時に結合することができる。所望の標的膜貫通タンパク質とのユビキチンリガーゼの誘導された近接は、標的のユビキチン化をもたらし、続いて細胞表面からの除去とその後の分解をもたらす。例えば、結果として、がん細胞の増殖が損なわれる。本発明の例示的実施形態の概略図は、図１に提供される。
本発明は、膜結合タンパク質の標的化された内在化およびその後の分解のために、ヘテロ二官能性分子を採用する本発明の概念に関する。本発明のヘテロ二官能性分子は、膜貫通ユビキチンリガーゼと、がん促進受容体などの膜結合タンパク質に同時に結合することができる。所望の標的膜貫通タンパク質とのユビキチンリガーゼの誘導された近接は、標的のユビキチン化をもたらし、続いて細胞表面からの除去とその後の分解をもたらす。例えば、結果として、がん細胞の増殖が損なわれる。本発明の例示的実施形態の概略図は、図１に提供される。
【0109】
このアプローチの利点は、少なくとも以下を含む：
ｉ）本発明のヘテロ二官能性分子は、従来の「占有ベースの（occupancy-based）」治療法と比較した場合、標的分子と比較して化学量論量以下の量の分子のみを必要とする、強力な効力の増加を可能にする。
ｉｉ）２種のタンパク質、すなわち，膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼならびに膜貫通タンパク質の特異的結合が必要とされることもまた、潜在的なオフ標的毒性を低減させる。好ましくは、細胞膜に局在化し、がん細胞において増加した発現を示すユビキチンリガーゼが採用される。
ｉｉｉ）標的タンパク質分解は、十分な量の新しい膜貫通タンパク質を合成するのに時間が必要とされるため、長期の薬力学的作用をもたらす。
ｉｖ）ヘテロ二官能性分子は細胞外タンパク質部分に結合し、したがって、細胞膜を通過する必要はない。
ｖ）がん細胞は、自己再生特性を有するがん細胞におけるＲＮＦ４３およびＺＮＲＦ３などのいくつかのタイプの膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼを豊富に発現することが公知である。この例では、４つの対立遺伝子が、ユビキチン化活性を示すタンパク質を産生し、変異による不活性化および耐性の可能性を低下させる。
ｉ）本発明のヘテロ二官能性分子は、従来の「占有ベースの（occupancy-based）」治療法と比較した場合、標的分子と比較して化学量論量以下の量の分子のみを必要とする、強力な効力の増加を可能にする。
ｉｉ）２種のタンパク質、すなわち，膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼならびに膜貫通タンパク質の特異的結合が必要とされることもまた、潜在的なオフ標的毒性を低減させる。好ましくは、細胞膜に局在化し、がん細胞において増加した発現を示すユビキチンリガーゼが採用される。
ｉｉｉ）標的タンパク質分解は、十分な量の新しい膜貫通タンパク質を合成するのに時間が必要とされるため、長期の薬力学的作用をもたらす。
ｉｖ）ヘテロ二官能性分子は細胞外タンパク質部分に結合し、したがって、細胞膜を通過する必要はない。
ｖ）がん細胞は、自己再生特性を有するがん細胞におけるＲＮＦ４３およびＺＮＲＦ３などのいくつかのタイプの膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼを豊富に発現することが公知である。この例では、４つの対立遺伝子が、ユビキチン化活性を示すタンパク質を産生し、変異による不活性化および耐性の可能性を低下させる。
【0110】
さらに、本発明者らは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質の効果的な組合せ、例えば、膜貫通ユビキチンＥ３リガーゼと膜結合タンパク質の誘導された近接が膜結合タンパク質の細胞表面除去をもたらす組合せについてスクリーニングするための効率的な方法を発見した。この簡単な方法を用いて、効果的なヘテロ二官能性分子が構築され、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質の効果的な組合せを標的とすることができる。
【0111】
したがって、第１の態様では、本発明は、第１および第２の結合ドメインを含むヘテロ二官能性分子に関する。第１の結合ドメインは膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができ、第２の結合ドメインは特異的な膜結合タンパク質に結合することができる。
【0112】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質の同時結合は、これら２つの分子を互いに近接するようにする。結果として、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、その後、膜結合タンパク質をユビキチン化することができる。
【0113】
したがって、好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、膜結合タンパク質のユビキチン化をもたらす。
【0114】
ユビキチン化は、ユビキチン化タンパク質の分解をもたらすことが公知である。したがって、さらに、好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、膜結合タンパク質の分解をもたらす。
【0115】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質の同時結合は、これら２つの分子を互いに近接するようにする。結果として、膜結合タンパク質は内在化され、好ましくはその後分解され得る。
【0116】
第１の結合ドメインに結合した膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ
ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼへの特異的結合を可能にする。膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、膜結合タンパク質のユビキチン化およびエンドサイトーシスを媒介し得る、すなわち、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインによって結合されたタンパク質のユビキチン化およびエンドサイトーシスを媒介し得る。
ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼへの特異的結合を可能にする。膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、膜結合タンパク質のユビキチン化およびエンドサイトーシスを媒介し得る、すなわち、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインによって結合されたタンパク質のユビキチン化およびエンドサイトーシスを媒介し得る。
【0117】
基質のユビキチン化およびエンドサイトーシスは、好ましくは、細胞表面から基質を除去する。内在化された基質はその後分解され得る。したがって、好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ユビキチン化、細胞表面除去および膜結合タンパク質の分解を媒介し得る、すなわち、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインによって結合されたタンパク質のユビキチン化、細胞表面除去および分解を媒介し得る。
【0118】
したがって、好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、膜結合タンパク質の内在化をもたらし、それによって、膜結合タンパク質を細胞表面から除去する。
【0119】
好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、膜結合タンパク質の内在化と分解をもたらす。したがって、好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質は、同じ細胞において発現される。必要に応じて、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質のうちの少なくとも１つが、細胞において過剰発現され得る。
【0120】
ユビキチン化および分解は、当該技術分野において公知である任意の適切な方法を用いて評価することができる。非限定的な例として、ユビキチン化および分解は、参照により本明細書に組み込まれるKoo et al, Nature (2012)（前掲）に記載されるように評価することができる。
【0121】
基質タンパク質は、ユビキチンで荷電したＥ２酵素を動員するＥ３リガーゼタンパク質との相互作用を介してユビキチンによるリシン残基の修飾のために選択される（Clague MJ and Urbe S (2010), Cell; 43(5):682-5）。これは、基質への単一のユビキチン分子の移動（モノユビキチン化）、または、例えば、前のユビキチン分子に存在するリシン残基を介して、さらなるユビキチン分子の前のユビキチン分子へのカップリングをもたらし、鎖を形成することができる。ユビキチンの７つのリシンは、異なる三次元構造をとる異なるイソペプチド鎖連結の形成を提供し、これらはすべて真核細胞に存在する（Xu et al. (2009), Cell 137, 133-145）。基質に動員されたＥ２とＥ３酵素の特異的な組合せが、鎖連結タイプを決定する。
【0122】
特に、リソソーム分解は、プロテアソーム分解とは異なったユビキチン化パターンの基質タンパク質を必要とすることがある。例えば、リシン４８（Ｌｙｓ４８）連結ポリユビキチン鎖で標識された基質は、しばしばプロテアソーム標的をもたらす。代わりに、モノユビキチン、マルチユビキチン、Ｌｙｓ４８連結またはＬｙｓ６３連結ポリユビキチンのいずれかで標識された基質がリソソームへと方向づけられる。
【0123】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼによって媒介される分解は、リソソーム分解およびプロテアソーム分解のうちの少なくとも１つであり得る。好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼによって媒介される分解は、少なくともリソソーム分解である。
【0124】
したがって、好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、膜結合タンパク質の内在化をもたらす。好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、膜結合タンパク質の内在化、ならびにプロテアソームおよびリソソーム分解のうちの少なくとも１つをもたらす。好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、膜結合タンパク質の内在化およびリソソーム分解をもたらす。
【0125】
好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、膜貫通タンパク質をモノユビキチン、マルチユビキチン、Ｌｙｓ６３連結ポリユビキチン、またはＬｙｓ４８連結ポリユビキチン鎖でユビキチン化する。好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、膜貫通タンパク質をモノユビキチン、マルチユビキチン、またはＬｙｓ６３連結ポリユビキチン鎖でポリユビキチン化する。好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、膜貫通タンパク質をＬｙｓ６３連結およびＬｙｓ４８連結ポリユビキチン鎖のうちの少なくとも１つでポリユビキチン化する。好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、膜貫通タンパク質をＬｙｓ６３連結ポリユビキチン鎖でポリユビキチン化する。
【0126】
多くの膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、組織特異的発現を示すか、または１つ以上のがんタイプにおいて過剰発現を示す。したがって、好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子に結合することができる膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、選択的組織において発現される膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼである。非限定的な例として、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼＲＮＦ４３およびＺＮＲＦ３は、限定されないが、腸などの複数の組織の成体幹細胞集団において選択的に発現される。さらに限定されない例として、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼＭＡＲＣＨ１およびＭＡＲＣＨ９は、免疫細胞において増加した発現を示す。
【0127】
好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、限定されないが、がん組織などの選択的組織においてのみ発現される。
【0128】
代わりに、またはさらに、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子に結合することができる膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、がんの１つ以上のタイプにおいて、発現、好ましくは過剰発現を示す膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼである。
【0129】
好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ１６７、ＺＮＲＦ３、ＲＮＦ１３、ＡＭＦＲ、ＭＡＲＣＨ１、ＭＡＲＣＨ２、ＭＡＲＣＨ４、ＭＡＲＣＨ８、ＭＡＲＣＨ９、ＲＮＦ１４９、ＲＮＦ１４５、ＲＮＦＴ１、ＲＮＦ１３０およびＲＮＦ１２８からなる群から選択される。好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ１６７、ＺＮＲＦ３、ＲＮＦ１３、ＡＭＦＲ、ＭＡＲＣＨ１、ＭＡＲＣＨ２、ＭＡＲＣＨ４、ＭＡＲＣＨ８、ＭＡＲＣＨ９、ＲＮＦ１４５、ＲＮＦＴ１、ＲＮＦ１３０およびＲＮＦ１２８からなる群から選択される。好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ１６７、ＲＮＦ１２８およびＲＮＦ１３０のうちの少なくとも１つである。好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＮＦ４３およびＲＮＦ１６７のうちの少なくとも１つである。
【0130】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは過剰発現され得る。非限定的な例として、ＲＮＦ４３、ＺＮＲＦ３、ＲＮＦ１３、ＡＭＦＲ、ＭＡＲＣＨ１、ＭＡＲＣＨ２、ＭＡＲＣＨ４、ＭＡＲＣＨ８、ＭＡＲＣＨ９、ＲＮＦ１４９、ＲＮＦ１４５、ＲＮＦＴ１、ＲＮＦ１６７、ＲＮＦ１３０およびＲＮＦ１２８は、がんにおいて増加した発現を示すことが、当該技術分野において公知である。
【0131】
非限定的な例：
－ ＲＮＦ４３は、肺がんおよび結腸直腸がん（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ遺伝子発現アトラス）において過剰発現される；
－ ＺＮＲＦ３は肝細胞癌腫および（転移性）結腸直腸がん（遺伝子発現アトラス）において過剰発現される；
－ ＲＮＦ１３は、骨肉腫（遺伝子発現アトラス）および膵臓がん（Zhang Q, et al, Cell Res. 2009;19(3):348-57）において過剰発現される；
－ ＡＭＦＲは、限定されないが、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、皮膚がん、乳がんおよび膀胱がんを含む多くのがんにおいて過剰発現され、その上昇した発現は、これらのがんにおいて不良な予後および転移と相関することが見出された（Chiu CG et al, Expert Rev Anticancer Ther. 2008;8(2):207-17; B. Huang and A. Raz, Cell Res. 1995; 5(2):221-234；遺伝子発現アトラス）；
－ ＭＡＲＣＨ１は、乳がんおよび卵巣がんにおいて過剰発現される（Meng Y et al, Oncol Rep. 2016; 36(5): 2463-2470；遺伝子発現アトラス）；
－ ＭＡＲＣＨ２は多くの異なった腫瘍タイプにおいて高度に発現される（ヒトタンパク質アトラス）；
－ ＭＡＲＣＨ４は食道がんおよび甲状腺がんにおいて過剰発現される（遺伝子発現アトラス）；
－ ＭＡＲＣＨ８は食道がんおよび肺がんにおいて過剰発現される（Singh S et al, Cancer Cell Int. 2017;17:116; Fan J et al, Oncotarget. 2017; 8(64): 108238-108248）；
－ ＭＡＲＣＨ９は肺がんにおいて過剰発現される（Fan J、前掲）；
－ ＲＮＦ１４９は骨肉腫（遺伝子発現アトラス）において過剰発現される；
－ ＲＮＦ１４５は骨肉腫（遺伝子発現アトラス）において過剰発現される；
－ ＲＮＦＴ１は神経膠芽腫（遺伝子発現アトラス）において過剰発現される；
－ ＲＮＦ１６７は扁平上皮がん（遺伝子発現アトラス）において過剰発現される；
－ ＲＮＦ１３０は食道がんおよび前立腺がん（遺伝子発現アトラス）において過剰発現される；ならびに
－ ＲＮＦ１２８は腸がん（遺伝子発現アトラス）において過剰発現される。
－ ＲＮＦ４３は、肺がんおよび結腸直腸がん（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ遺伝子発現アトラス）において過剰発現される；
－ ＺＮＲＦ３は肝細胞癌腫および（転移性）結腸直腸がん（遺伝子発現アトラス）において過剰発現される；
－ ＲＮＦ１３は、骨肉腫（遺伝子発現アトラス）および膵臓がん（Zhang Q, et al, Cell Res. 2009;19(3):348-57）において過剰発現される；
－ ＡＭＦＲは、限定されないが、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、皮膚がん、乳がんおよび膀胱がんを含む多くのがんにおいて過剰発現され、その上昇した発現は、これらのがんにおいて不良な予後および転移と相関することが見出された（Chiu CG et al, Expert Rev Anticancer Ther. 2008;8(2):207-17; B. Huang and A. Raz, Cell Res. 1995; 5(2):221-234；遺伝子発現アトラス）；
－ ＭＡＲＣＨ１は、乳がんおよび卵巣がんにおいて過剰発現される（Meng Y et al, Oncol Rep. 2016; 36(5): 2463-2470；遺伝子発現アトラス）；
－ ＭＡＲＣＨ２は多くの異なった腫瘍タイプにおいて高度に発現される（ヒトタンパク質アトラス）；
－ ＭＡＲＣＨ４は食道がんおよび甲状腺がんにおいて過剰発現される（遺伝子発現アトラス）；
－ ＭＡＲＣＨ８は食道がんおよび肺がんにおいて過剰発現される（Singh S et al, Cancer Cell Int. 2017;17:116; Fan J et al, Oncotarget. 2017; 8(64): 108238-108248）；
－ ＭＡＲＣＨ９は肺がんにおいて過剰発現される（Fan J、前掲）；
－ ＲＮＦ１４９は骨肉腫（遺伝子発現アトラス）において過剰発現される；
－ ＲＮＦ１４５は骨肉腫（遺伝子発現アトラス）において過剰発現される；
－ ＲＮＦＴ１は神経膠芽腫（遺伝子発現アトラス）において過剰発現される；
－ ＲＮＦ１６７は扁平上皮がん（遺伝子発現アトラス）において過剰発現される；
－ ＲＮＦ１３０は食道がんおよび前立腺がん（遺伝子発現アトラス）において過剰発現される；ならびに
－ ＲＮＦ１２８は腸がん（遺伝子発現アトラス）において過剰発現される。
【0132】
さらに、遺伝子増幅は、多くのがん（ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ）において、乳がんにおけるＲＮＦＴ１に対して、およびＲＮＦ１３に対して一般的に見出される。遺伝子増幅は一般的にタンパク質発現の増加をもたらす。
【0133】
さらに、ＭＡＲＣＨファミリーのいくつかのメンバーは、ＭＡＲＣＨ１およびＭＡＲＣＨ９（Wang X et al, Semin Cancer Biol. 2008; 18(6): 441-450）を含む免疫細胞において高度に発現される。
【0134】
一実施形態では、ヘテロ二官能性分子は、第１および第２の結合ドメインを含み、
ｉ）第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができ、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、がん組織において発現され、好ましくは選択的に発現され、または過剰発現され；
ｉｉ）第２の結合ドメインは、膜貫通タンパク質に特異的に結合することができ、膜貫通タンパク質は、前記がん組織に関与することが公知であるか、または関与することが予想され、
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、好ましくは、膜貫通タンパク質のユビキチン化および内在化をもたらす。
ｉ）第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができ、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、がん組織において発現され、好ましくは選択的に発現され、または過剰発現され；
ｉｉ）第２の結合ドメインは、膜貫通タンパク質に特異的に結合することができ、膜貫通タンパク質は、前記がん組織に関与することが公知であるか、または関与することが予想され、
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、好ましくは、膜貫通タンパク質のユビキチン化および内在化をもたらす。
【0135】
好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質は、同じ細胞内で発現され、好ましくは、同じがん性細胞内で発現される。
【0136】
好ましくは、Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜貫通タンパク質はともに、肺がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、骨肉腫、膵臓がん、胃がん、肝臓がん、皮膚がん、乳がん、膀胱がん、卵巣がん、食道がん、甲状腺がん、子宮頸がん、神経膠芽腫、扁平上皮がん、前立腺がん（遺伝子発現アトラス）および腸がんおよび／またはそれらの転移からなる群から選択されるがん性細胞において発現される。
【0137】
一実施形態では、ヘテロ二官能性分子は、第１および第２の結合ドメインを含み、
ｉ）第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができ、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、免疫細胞において発現され、好ましくは選択的に発現され、または過剰発現され；
ｉｉ）第２の結合ドメインは、膜貫通タンパク質に特異的に結合することができ、膜貫通タンパク質は、同じ免疫細胞において発現され；
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、好ましくは膜貫通タンパク質のユビキチン化および内在化をもたらす。
ｉ）第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができ、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、免疫細胞において発現され、好ましくは選択的に発現され、または過剰発現され；
ｉｉ）第２の結合ドメインは、膜貫通タンパク質に特異的に結合することができ、膜貫通タンパク質は、同じ免疫細胞において発現され；
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、好ましくは膜貫通タンパク質のユビキチン化および内在化をもたらす。
【0138】
好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９からなる群から選択される配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0139】
好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０からなる群から選択される配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0140】
好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＲＮＦ４３およびＺＮＲＦ３のうちの少なくとも１つである。タンパク質ＲＮＦ４３およびＺＮＲＦ３は、好ましくは、それぞれ配列番号１および３と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＲＮＦ４３およびＺＮＲＦ３タンパク質は、それぞれ配列番号２および４と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0141】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＲＮＦ４３である。好ましくは、ＲＮＦ４３タンパク質は、配列番号１と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＲＮＦ４３タンパク質は、配列番号２と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＲＮＦ４３に結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６およびＣＭＴＭ４、ならびにＷＬＳからなる群から選択される。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３およびＦＺＤ７、ならびにＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される。
【0142】
好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ４３に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＴＧＦβＲ２に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0143】
好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ４３に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＥＧＦＲに特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0144】
好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ４３に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＦＬＴ３に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0145】
好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ４３に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＦＺＤ７に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0146】
好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ４３に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0147】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＺＮＲＦ３である。好ましくは、ＺＮＲＦ３タンパク質は、配列番号３と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＺＮＲＦ３タンパク質は、配列番号４と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＺＮＲＦ３に結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。
【0148】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＲＮＦ１３である。好ましくは、ＲＮＦ１３タンパク質は、配列番号５と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＲＮＦ１３タンパク質は、配列番号６と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＲＮＦ１３に結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。
【0149】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＡＭＦＲである。好ましくは、ＡＭＦＲタンパク質は、配列番号７または配列番号５１と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＡＭＦＲタンパク質は、配列番号８または配列番号５２と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＡＭＦＲに結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。
【0150】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＭＡＲＣＨ１である。好ましくは、ＭＡＲＣＨ１タンパク質は、配列番号９と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＭＡＲＣＨ１タンパク質は、配列番号１０と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＭＡＲＣＨ１に結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。
【0151】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＭＡＲＣＨ４である。好ましくは、ＭＡＲＣＨ４タンパク質は、配列番号１１と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＭＡＲＣＨ４タンパク質は、配列番号１２と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＭＡＲＣＨ４に結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。
【0152】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＭＡＲＣＨ２である。好ましくは、ＭＡＲＣＨ２タンパク質は、配列番号１３と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＭＡＲＣＨ２タンパク質は、配列番号１４と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＭＡＲＣＨ２に結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。
【0153】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＭＡＲＣＨ８である。好ましくは、ＭＡＲＣＨ８タンパク質は、配列番号１５と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＭＡＲＣＨ８タンパク質は、配列番号１６と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＭＡＲＣＨ８に結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。
【0154】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＭＡＲＣＨ９である。好ましくは、ＭＡＲＣＨ９タンパク質は、配列番号１７と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＭＡＲＣＨ９タンパク質は、配列番号１８と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＭＡＲＣＨ９に結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。
【0155】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＲＮＦ１４９である。好ましくは、ＲＮＦ１４９タンパク質は、配列番号１９と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＲＮＦ１４９タンパク質は、配列番号２０と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＲＮＦ１４９に結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。
【0156】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＲＮＦ１４５である。好ましくは、ＲＮＦ１４５タンパク質は、配列番号２１と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＲＮＦ１４５タンパク質は、配列番号２２と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＲＮＦ１４５に結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。
【0157】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＲＮＦＴ１である。好ましくは、ＲＮＦＴ１タンパク質は、配列番号２３と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＲＮＦＴ１タンパク質は、配列番号２４と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＲＮＦＴ１に結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。
【0158】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＲＮＦ１６７である。好ましくは、ＲＮＦ１６７タンパク質は、配列番号２５と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＲＮＦ１６７タンパク質は、配列番号２６と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＲＮＦ１６７に結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ４からなる群から選択される。
【0159】
好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ１６７に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＴＧＦβＲ２に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0160】
好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ１６７に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＥＧＦＲに特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0161】
好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ１６７に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＦＬＴ３に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0162】
好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ１６７に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＰＤ－１に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0163】
好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ１６７に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＣＴＬＡ４に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0164】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＲＮＦ１３０である。好ましくは、ＲＮＦ１３０タンパク質は、配列番号２７と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＲＮＦ１３０タンパク質は、配列番号２８と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＲＮＦ１３０に結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１のうちの少なくとも１つである。好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ１３０に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＰＤ－１に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ１３０に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0165】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＲＮＦ１２８である。好ましくは、ＲＮＦ１２８タンパク質は、配列番号２９と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＲＮＦ１２８タンパク質は、配列番号３０と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインはＲＮＦ１２８に結合し、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメインに結合したタンパク質」のセクションにおいて本明細書の以下に定義される膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＦＬＴ３、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される。
【0166】
好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ１２８に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＦＬＴ３に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0167】
好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ１２８に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＰＤ－１に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0168】
好ましくは、本明細書において定義されるヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ１２８に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン、およびＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0169】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外部分に結合する。したがって、好ましくは、ヘテロ二官能性分子は、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合するために細胞膜を通過する必要はない。
【0170】
第２の結合ドメインに結合したタンパク質
本明細書において詳述するように、本発明のヘテロ二官能性分子は、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ、好ましくは、本明細書において上記で定義される膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと結合することができる第１の結合ドメインを有する。
本明細書において詳述するように、本発明のヘテロ二官能性分子は、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ、好ましくは、本明細書において上記で定義される膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと結合することができる第１の結合ドメインを有する。
【0171】
本発明のヘテロ二官能性分子は、第２の結合ドメインをさらに含み、第２の結合ドメインは、膜結合タンパク質と結合することができる。
【0172】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができるタンパク質は、少なくとも部分的に細胞の外部に曝露されるタンパク質である。タンパク質は、一方の側から細胞膜に付着することができるか、または膜の全体にわたっていることができ、すなわち、膜貫通タンパク質である。好ましくは、第２の結合ドメインは、膜貫通タンパク質に特異的に結合することができる。
【0173】
用語「ヘテロ二官能性」がすでに示唆しているように、第２の結合ドメインに結合し得る膜貫通タンパク質は、第１の結合ドメインに結合し得る膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼとは異なる。好ましくは、第２の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的におよび／または効果的に結合しない。
【0174】
好ましくは、膜結合タンパク質は膜貫通タンパク質、好ましくは細胞表面受容体である。したがって、好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、膜貫通受容体に特異的に結合することができる。好ましくは、受容体は、イオンチャネル連結受容体、酵素連結受容体、Ｇタンパク質結合受容体およびＦｃ受容体のうちの少なくとも１つである。
【0175】
ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、受容体の単量体形態および／または二量体化形態に結合し得る。さらに、または代わりに、第２の結合ドメインは、受容体の不活性および／または活性コンホメーションに結合し得る。
【0176】
膜結合タンパク質は、疾患の発症、進行または重症度に関連または関与していてもよい。膜結合タンパク質は、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患、および／または遺伝性疾患に関与することが公知であるかまたは予想されていてもよい。
【0177】
好ましくは、膜結合タンパク質は、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５およびＬＧＲ６のうちの少なくとも１つではない。
【0178】
好ましい実施形態では、膜貫通受容体は、がんに関与することが公知であるかまたは予想されていてもよい。「がんに関与する受容体」は、本明細書では、がんの悪性腫瘍に直接的または間接的に影響し得る膜貫通受容体として理解される。
【0179】
一実施形態では、がんに関与する膜貫通受容体は、活性化または増加した活性により、細胞に悪性特性を誘導または増大させる受容体であり得る。例えば、限定されないが、膜貫通受容体の活性化は、細胞の幹細胞性、分化能力、生存率および増殖能力のうちの少なくとも１つに影響を与え得る。本明細書で使用される場合、受容体の活性は、限定されないが、１つ以上の活性化変異を有する受容体、ならびに／または受容体リガンドの増加した発現および／もしくは増加した利用可能性を有する受容体、ならびに／または減少した代謝回転を有する受容体を含み、例えば、細胞膜上で安定化される。
【0180】
さらに、または代わりに、がんに関与することが公知であるかまたは予想される膜貫通受容体は、例えば、免疫細胞および／または間質細胞上に存在する受容体であり得る。非限定的な例として、免疫細胞上に存在する受容体を阻害することは、腫瘍細胞を標的とするための免疫細胞の活性化をもたらすことができ、間質細胞上に存在する受容体の阻害は、腫瘍血管新生の低減をもたらすことができる。
【0181】
したがって、がんに関与する受容体は、腫瘍細胞上に存在する膜貫通受容体、および／または腫瘍細胞に直接的もしくは間接的な影響を有する細胞上に存在する膜貫通受容体であり得ることが本明細書において理解される。
【0182】
「がんに関連するかまたは関与する受容体」という語句は、限定されないが、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病などの前がん性状態を含む。
【0183】
一実施形態では、本明細書に記載される膜貫通受容体の活性化または増加した活性に関連するがんは、血液学的がんである。一実施形態では、本明細書に記載される膜貫通受容体の活性化または増加した活性に関連するがんは、固形がんである。本明細書に記載される膜貫通受容体の活性化または増加した活性に関連するさらなる疾患には、限定されないが、本明細書に記載される、例えば、非定型および／または非古典的がん、悪性腫瘍、前がん性状態、または膜貫通受容体の活性化に関連する増殖性疾患が含まれる。本明細書に記載される膜貫通受容体の活性化または増加した活性に関連する非がん関連の適応症には、限定されないが、例えば、自己免疫疾患（例えば、ループス）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息）ならびに移植が含まれる。
【0184】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２のドメインが結合し得る受容体は、がんに関与する受容体であり、好ましくは、受容体は、増加した活性、例えば、増加した下流シグナル伝達を有する。下流のシグナル伝達は、好ましくは、膜貫通受容体の活性化または増加した活性を有さない他の点で同一の細胞と比較して増加する。増加した活性は、限定されないが、受容体の変異活性化、受容体の上方制御、受容体の増大した安定化、および／または受容体リガンドの増大した利用可能性に起因し得る。
【0185】
受容体は、ある特定の種のがんに関与していてもよい。代わりに、受容体は多くの異なったがんタイプに関与していてもよい（the receptor may play be involved in many different cancer types）。例えば、受容体は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または以上のがんのタイプに関与していてもよい。代わりに、またはさらに、受容体は、がん血管新生を関与していてもよい。
【0186】
受容体は、固形がんまたは血液がんに関与していてもよい。受容体は固形がんに関与していてもよい。好ましくは、固形がんは、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌腫、肝臓がん、肺の非小細胞がん、小腸のがん、食道のがん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸の癌腫、膣の癌腫、外陰の癌腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児期の固形腫瘍、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発性がん、前記がんの組合せ、および前記がんの転移病変からなる群から選択される。
【0187】
受容体は、固形がんまたは血液がんに関与していてもよい。好ましくは、血液がんは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、または前白血病のうちの１つ以上から選択される。
【0188】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインが結合することができる膜貫通タンパク質は、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、胃がん、前立腺がん、肺がん、黒色腫、白血病、膵臓がんおよび膀胱がんからなる群から選択されるがんに関連する。
【0189】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、結腸直腸がんにおいて活性化される、または増加した活性を有する。好ましくは、膜貫通タンパク質は、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴおよびＥＲＢＢ２のうちの少なくとも１つである。
【0190】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、乳がんにおいて活性化される、または増加した活性を有する。好ましくは、膜貫通タンパク質は、ＥＧＦＲまたはＥＲＢＢ２である。
【0191】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、食道がんにおいて活性化される、または増加した活性を有する。好ましくは、膜貫通タンパク質は、ＥＲＢＢ２またはＶＥＧＦＲ２である。
【0192】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、胃がんにおいて活性化される、または増加した活性を有する。好ましくは、膜貫通タンパク質は、ＥＲＢＢ２またはＶＥＧＦＲ２である。
【0193】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、白血病において活性化される、または増加した活性を有する。好ましくは、膜貫通タンパク質は、ＦＬＴ３である。
【0194】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、黒色腫において活性化される、または増加した活性を有する。好ましくは、膜貫通タンパク質は、ＫＩＴである。
【0195】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、非小細胞肺がんにおいて活性化される、または増加した活性を有する。好ましくは、膜貫通タンパク質は、ＥＧＦＲまたはＭＥＴである。
【0196】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、卵巣がんにおいて活性化される、または増加した活性を有する。好ましくは、膜貫通タンパク質は、ＥＧＦＲである。
【0197】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、膵臓がんにおいて活性化される、または増加した活性を有する。好ましくは、膜貫通タンパク質は、ＥＧＦＲである。
【0198】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＨＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。
【0199】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８４、８６、８８、９０、９２および９４からなる群から選択される配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0200】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８５、８７、８９、９１、９３および９５からなる群から選択される配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0201】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２である。
【0202】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ１である。好ましくは、ＴＧＦβＲ１タンパク質は、配列番号３１と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＴＧＦβＲ１タンパク質は、配列番号３２と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0203】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＴＧＦβＲ２である。好ましくは、ＴＧＦβＲ２タンパク質は、配列番号３３と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＴＧＦβＲ２タンパク質は、配列番号３４と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＴＧＦβＲ２に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ４３およびＲＮＦ１６７のうちの少なくとも１つに特異的に結合することができる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＴＧＦβＲ２に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ４３に特異的に結合することができる。
【0204】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＴＧＦβＲ２に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ１６７に特異的に結合することができる。
【0205】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＥＧＦＲである。好ましくは、ＥＧＦＲタンパク質は、配列番号３５と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＥＧＦＲタンパク質は、配列番号３６と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＥＧＦＲに特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ４３およびＲＮＦ１６７のうちの少なくとも１つに特異的に結合することができる。
【0206】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＥＧＦＲに特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ１６７に特異的に結合することができる。
【0207】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＥＲＢＢ２またはＥＲＢＢ３である。
【0208】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＥＲＢＢ２である。好ましくは、ＥＲＢＢ２タンパク質は、配列番号３７と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＥＲＢＢ２タンパク質は、配列番号３８と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0209】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＥＲＢＢ３である。好ましくは、ＥＲＢＢ３タンパク質は、配列番号３９と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＥＲＢＢ３タンパク質は、配列番号４０と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0210】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＩＧＦ１Ｒである。好ましくは、ＩＧＦ１Ｒタンパク質は、配列番号４１と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＩＧＦ１Ｒタンパク質は、配列番号４２と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0211】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＭＥＴである。好ましくは、ＭＥＴタンパク質は、配列番号４３と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＭＥＴタンパク質は、配列番号４４と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0212】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＶＥＧＦＲ２である。好ましくは、ＶＥＧＦＲ２タンパク質は、配列番号４５と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＶＥＧＦＲ２タンパク質は、配列番号４６と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0213】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＫＩＴである。好ましくは、ＫＩＴタンパク質は、配列番号４７と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＫＩＴタンパク質は、配列番号４８と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0214】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＦＬＴ３である。好ましくは、ＦＬＴ３タンパク質は、配列番号４９と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＦＬＴ３タンパク質は、配列番号５０と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＦＬＴ３に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ１６７およびＲＮＦ１２８のうちの少なくとも１つに特異的に結合することができる。
【0215】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＦＬＴ３に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ４３に特異的に結合することができる。
【0216】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＦＬＴ３に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ１６７に特異的に結合することができる。
【0217】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＦＬＴ３に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ１２８に特異的に結合することができる。
【0218】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＰＤＧＦＲＡである。好ましくは、ＰＤＧＦＲＡタンパク質は、配列番号５３と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＰＤＧＦＲＡタンパク質は、配列番号５４と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0219】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＰＤＧＦＲＢである。好ましくは、ＰＤＧＦＲＢタンパク質は、配列番号５５と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＰＤＧＦＲＢタンパク質は、配列番号５６と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0220】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９およびＦＺＤ１０からなる群から選択される。
【0221】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＦＺＤ１である。好ましくは、ＦＺＤ１タンパク質は、配列番号５７と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＦＺＤ１タンパク質は、配列番号５８と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0222】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＦＺＤ２である。好ましくは、ＦＺＤ２タンパク質は、配列番号５９と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＦＺＤ２タンパク質は、配列番号６０と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0223】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＦＺＤ３である。好ましくは、ＦＺＤ３タンパク質は、配列番号６１と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＦＺＤ３タンパク質は、配列番号６２と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0224】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＦＺＤ４である。好ましくは、ＦＺＤ４タンパク質は、配列番号６３と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＦＺＤ４タンパク質は、配列番号６４と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0225】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＦＺＤ５である。好ましくは、ＦＺＤ５タンパク質は、配列番号６５と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＦＺＤ５タンパク質は、配列番号６６と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0226】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＦＺＤ６である。好ましくは、ＦＺＤ６タンパク質は、配列番号６７と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＦＺＤ６タンパク質は、配列番号６８と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0227】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＦＺＤ７である。好ましくは、ＦＺＤ７タンパク質は、配列番号６９と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＦＺＤ７タンパク質は、配列番号７０と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＦＺＤ７に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ４３に特異的に結合することができる。
【0228】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＦＺＤ８である。好ましくは、ＦＺＤ８タンパク質は、配列番号７１と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＦＺＤ８タンパク質は、配列番号７２と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0229】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＦＺＤ９である。好ましくは、ＦＺＤ９タンパク質は、配列番号７３と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＦＺＤ９タンパク質は、配列番号７４と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0230】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＦＺＤ１０である。好ましくは、ＦＺＤ１０タンパク質は、配列番号７５と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＦＺＤ１０タンパク質は、配列番号７６と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0231】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６である。
【0232】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＬＲＰ５である。好ましくは、ＬＲＰ５タンパク質は、配列番号７７と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＬＲＰ５タンパク質は、配列番号７８と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0233】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＬＲＰ６である。好ましくは、ＬＲＰ６タンパク質は、配列番号７９と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＬＲＰ６タンパク質は、配列番号８０と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0234】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、増殖ホルモン受容体（ＧＨＲ）である。好ましくは、ＧＨＲタンパク質は、配列番号８４と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＧＨＲタンパク質は、配列番号８５と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0235】
好ましい実施形態では、膜貫通タンパク質は、免疫チェックポイント阻害剤として機能する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ４およびＷＬＳからなる群から選択される。
【0236】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質はＰＤ－１である。好ましくは、ＰＤ－１タンパク質は、配列番号８６と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＰＤ－１タンパク質は、配列番号８７と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインはＰＤ－１に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインはＲＮＦ１６７、ＲＮＦ１２８およびＲＮＦ１３０からなる群から選択される膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができる。
【0237】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインはＰＤ－１に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインはＲＮＦ１６７に特異的に結合することができる。
【0238】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインはＰＤ－１に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインはＲＮＦ１２８に特異的に結合することができる。
【0239】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインはＰＤ－１に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ１３０に特異的に結合することができる。
【0240】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１である。好ましくは、ＰＤ－Ｌ１タンパク質は、配列番号８８と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＰＤ１Ｌ１タンパク質は、配列番号８９と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0241】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ１２８およびＲＮＦ１３０からなる群から選択される膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができる。
【0242】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ４３に特異的に結合することができる。
【0243】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ１２８に特異的に結合することができる。
【0244】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ１３０に特異的に結合することができる。
【0245】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＣＴＬＡ４である。好ましくは、ＣＴＬＡ４タンパク質は、配列番号９０と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＣＴＬＡ４タンパク質は、配列番号９１と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、ＣＴＬＡ４に特異的に結合することができ、第１の結合ドメインは、ＲＮＦ１６７に特異的に結合することができる。
【0246】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＣＭＴＭ６である。好ましくは、ＣＭＴＭ６タンパク質は、配列番号９２と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＣＭＴＭ６タンパク質は、配列番号９３と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0247】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＣＭＴＭ４である。好ましくは、ＣＭＴＭ４タンパク質は、配列番号９４と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＣＭＴＭ４タンパク質は、配列番号９５と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0248】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインに結合することができる膜貫通タンパク質は、ＷＬＳ／ＧＰＲ１７７である。好ましくは、ＷＬＳタンパク質は、配列番号１００と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ＷＬＳタンパク質は、配列番号１０１と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
【0249】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、膜結合タンパク質の細胞外部分に結合する。したがって、好ましくは、ヘテロ二官能性分子は、膜結合タンパク質と結合するために細胞膜を通過する必要がない。
【0250】
好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１および第２の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質のそれぞれの細胞外部分に結合する。好ましくは、ヘテロ二官能性分子は細胞外で結合する。
【0251】
第１の結合ドメイン
本発明のヘテロ二官能性分子は、少なくとも第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含む。第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができる。好ましくは、第１の結合ドメインは、上記「第１の結合ドメインが結合するタンパク質」の項で規定した膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができる。
本発明のヘテロ二官能性分子は、少なくとも第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含む。第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができる。好ましくは、第１の結合ドメインは、上記「第１の結合ドメインが結合するタンパク質」の項で規定した膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができる。
【0252】
ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができる任意のドメインであり得る。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外部分に結合する。
【0253】
当業者は、例えば、化合物ライブラリーのスクリーニング、免疫化研究、および／または抗体もしくはその機能性断片を生成するハイブリドーマ技術によって、本発明のヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインを生成する方法を理解する。好ましい機能性抗体断片は、ナノボディである。これらの技術の詳細は、例えば（Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., Cold Spring Harbor Publications, p. 726,1988）に記載され、または（Campbell, A.M. "Monoclonal Antibody Technology Techniques in Biochemistry and Molecular Biology," Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1984）によって、または（St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35:1-21, 1980）によって記載される。天然エピトープに対するＶＨＨ／ナノボディの生成の詳細は、例えば、Pardon et al, Nature Protocols 2014に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【0254】
好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合することができる分子は、抗体である。したがって、好ましくは、抗体は、本発明のヘテロ二官能性分子における第１の結合ドメインとして機能する場合がある。
【0255】
好ましくは、抗体は、抗体断片である。好ましくは、抗体断片は、ナノボディである。したがって、好ましい実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合することができる分子は、ナノボディである。したがって、好ましくは、ナノボディは、本発明のヘテロ二官能性分子における第１の結合ドメインとして機能する場合がある。
【0256】
好ましい実施形態では、第１の結合ドメインは、有機小分子である。
【0257】
好ましい実施形態では、第１の結合ドメインは、アプタマーである。
【0258】
好ましい実施形態では、第１の結合ドメインは、タンパク性分子である。タンパク性分子は環状化されていてもよく、したがって、好ましくは、タンパク性分子は環状ペプチドである。ペプチドは、２つのアミノ酸残基の間の直接的な共有結合によって、または架橋部分を使用することによって環状化されてもよい。そのような架橋部分は、当技術分野でよく知られており、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０５７６２４号に記載される架橋部分が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク性分子は、当技術分野で従来から知られているタンパク性分子であり得る。
【0259】
したがって、本発明は、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合するために当技術分野で既知の分子にまでおよび、この分子は、本発明のヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインとして機能することができる。このような既知の分子としては、既知の抗体、タンパク性分子、アプタマーまたは既知の有機小分子の少なくとも１つが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体、タンパク性分子、アプタマーまた有機小分子は、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外部分に結合するために当技術分野で知られている。
【0260】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合する抗体は当技術分野で知られており、当業者であれば、そのような抗体を取得することは困難ではないだろう。膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合できる、好ましくは膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外部分に特異的に結合できる、任意の既知の抗体は、本発明のヘテロ二官能性分子における第１の結合ドメインとして使用するのに適しているであろう。
【0261】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合することができる好ましい既知の分子は、ナノボディである。したがって、好ましくは、ナノボディは、本発明のヘテロ二官能性分子における第１の結合ドメインとして機能する場合がある。
【0262】
好ましい実施形態では、第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの天然リガンド、またはその機能性断片、すなわち膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと結合できる状態である天然リガンドの断片である。
【0263】
非限定的な例として、ＲＮＦ４３およびＺＮＲＦ３のための天然リガンドは、Ｒｓｐｏｎｄｉｎ（ＲＳＰＯ）－１、－２、－３および－４である。したがって一実施形態では、ヘテロ二官能性分子は、ＲＮＦ４３に結合することができる第１の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインはＲｓｐｏｎｄｉｎ １、Ｒｓｐｏｎｄｉｎ ２、Ｒｓｐｏｎｄｉｎ ３およびＲｓｐｏｎｄｉｎ ４またはその機能性断片からなる群から選択される。代わりに、ヘテロ二官能性分子は、ＺＮＲＦ３に結合することができる第１の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインはＲｓｐｏｎｄｉｎ １、Ｒｓｐｏｎｄｉｎ ２、Ｒｓｐｏｎｄｉｎ ３およびＲｓｐｏｎｄｉｎ ４またはその機能性断片からなる群から選択される。
【0264】
第２の結合ドメイン
本発明のヘテロ二官能性分子は、少なくとも第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含む。第２のドメインは、膜結合タンパク質、好ましくは膜貫通タンパク質に特異的に結合することができる。好ましくは、第２の結合ドメインは、上記「第２の結合ドメインが結合するタンパク質」の項で規定した膜貫通タンパク質に特異的に結合することができる。
本発明のヘテロ二官能性分子は、少なくとも第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含む。第２のドメインは、膜結合タンパク質、好ましくは膜貫通タンパク質に特異的に結合することができる。好ましくは、第２の結合ドメインは、上記「第２の結合ドメインが結合するタンパク質」の項で規定した膜貫通タンパク質に特異的に結合することができる。
【0265】
ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、膜結合タンパク質、好ましくは膜貫通膜タンパク質に特異的に結合することができる任意のドメインであり得る。好ましくは、ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、膜結合タンパク質の細胞外部分に結合する。
【0266】
第２の結合ドメインは、抗体、ペプチド、アプタマー、有機小分子であり得る。
【0267】
当業者は、例えば、化合物ライブラリーのスクリーニング、免疫化研究、および／または抗体もしくはその機能性断片を生成するハイブリドーマ技術によって、本発明のヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインを生成する方法を理解する。好ましい機能性抗体断片は、ナノボディである。これらの技術の詳細は、例えば（Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., Cold Spring Harbor Publications, p. 726,1988）に記載され、または（Campbell, A.M. "Monoclonal Antibody Technology Techniques in Biochemistry and Molecular Biology," Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1984）によって、または（St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35:1-21, 1980）によって記載される。
【0268】
好ましい実施形態では、膜結合タンパク質に結合することができる分子は抗体である。したがって、好ましくは、抗体は、本発明のヘテロ二官能性分子における第２の結合ドメインとして機能する場合がある。
【0269】
好ましくは、抗体は、抗体断片である。好ましくは、抗体断片は、ナノボディである。したがって、好ましい実施形態では、膜結合タンパク質に結合することができる分子は、ナノボディである。したがって、好ましくは、ナノボディは、本発明のヘテロ二官能性分子における第２の結合ドメインとして機能する場合がある。
【0270】
好ましい実施形態では、第１の結合ドメインは、有機小分子である。
【0271】
好ましい実施形態では、第１の結合ドメインは、アプタマーである。
【0272】
好ましい実施形態では、第２の結合ドメインは、タンパク性分子である。タンパク性分子は環状化されていてもよく、したがって、好ましくは、タンパク性分子は環状ペプチドである。ペプチドは、２つのアミノ酸残基の間の直接的な共有結合によって、または架橋部分を使用することによって環状化されてもよい。そのような架橋部分は、当技術分野でよく知られており、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０５７６２４号に記載される架橋部分が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク性分子は、当技術分野で従来から知られているタンパク性分子であり得る。
【0273】
したがって、本発明は、膜結合タンパク質、好ましくは本明細書で上に定義される膜結合タンパク質に特異的に結合するために当技術分野で既知の分子にまでおよぶ。そのような分子は、本発明のヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインとして機能することができる。
【0274】
このような既知の分子としては、既知の抗体、タンパク性分子、アプタマーまたは既知の有機小分子の少なくとも１つが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体、タンパク性分子、アプタマーまた有機小分子は、本明細書で定義される膜結合タンパク質の細胞外部分に結合するために当技術分野で知られている。
【0275】
膜結合タンパク質、好ましくは本明細書で上に定義される膜貫通タンパク質に結合する抗体は当技術分野で知られており、当業者であれば、そのような抗体を取得することは困難ではないであろう。本明細書で定義される膜貫通タンパク質に特異的に結合することができる、好ましくは本明細書で定義される膜貫通タンパク質の細胞外部分に特異的に結合することができる任意の既知の抗体は、本発明のヘテロ二官能性分子における第２の結合ドメインとして使用するのに適しているであろう。
【0276】
膜貫通タンパク質に結合することができる好ましい既知の分子は、ナノボディである。したがって、好ましくは、ナノボディは、本発明のヘテロ二官能性分子における第２の結合ドメインとして機能する場合がある。
【0277】
好ましい実施形態では、第２の結合ドメインは、膜貫通タンパク質の天然リガンド、好ましくは、本明細書で定義される膜貫通タンパク質である。好ましくは、天然リガンドは、膜貫通タンパク質のアンタゴニストである。
【0278】
ヘテロ二官能性分子
第１の結合ドメインと第２の結合ドメインは、それぞれ膜貫通タンパク質または膜結合タンパク質、すなわち標的タンパク質と特異的に結合することができる。
第１の結合ドメインと第２の結合ドメインは、それぞれ膜貫通タンパク質または膜結合タンパク質、すなわち標的タンパク質と特異的に結合することができる。
【0279】
特異的結合は、本明細書では、「非標的」タンパク質のドメインの結合の程度が、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）解析または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって決定されるその特定の標的タンパク質へのドメインの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％より小さくなるだろうとして理解されている。ドメインの標的タンパク質への結合に関して、「特異的結合」または「特異的に結合する」または特定のポリペプチドもしくは特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的」であるという用語は、非特異的相互作用と測定可能に異なっている結合を意味する。特異的結合は、例えば、標的タンパク質の結合を、一般に結合活性を有しない類似構造のタンパク質である対照タンパク質の結合と比較して決定することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、過剰な非標識標的など、標的に類似した対照タンパク質との競合によって決定することができる。この場合、標識標的のプローブとの結合が、過剰な非標識標的によって競合的に阻害される場合、特異的結合が示唆される。
【0280】
本明細書で使用される「特異的結合」または「特異的に結合する」または特定のポリペプチドもしくは特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的」であるという用語は、例えば、少なくとも約１０－４Ｍ、あるいは少なくとも約１０－５Ｍ、あるいは少なくとも約１０－６Ｍ、あるいは少なくとも約１０－７Ｍ、あるいは少なくとも約１０－８Ｍ、あるいは少なくとも約１０－９Ｍ、あるいは少なくとも約１０－１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０－１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０－１２Ｍ、またはそれ以上の標的に対するＫｄ（これは上記のように決定されてよい）を有する結合ドメインによって示され得る。一実施形態では、「特異的結合」という用語は、結合ドメインが、他の任意のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合せずに、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合を指す。
【0281】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、膜貫通タンパク質のユビキチン化および分解をもたらす。好ましくは、膜結合タンパク質は膜貫通タンパク質である。したがって好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質へのヘテロ二官能性分子の同時結合は、膜貫通タンパク質のユビキチン化および分解をもたらす。好ましくは、分解は、プロテアソーム分解およびリソソーム分解の少なくとも１つである。好ましくは、分解はリソソーム分解である。
【0282】
本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子は、したがって、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼを標的、すなわち膜結合タンパク質に近づけることによって、細胞膜上の膜結合タンパク質の存在をノックダウンまたはノックアウトする場合がある。言い換えれば、膜結合タンパク質の定常状態レベルが減少することになる。
【0283】
定常状態レベルは、本明細書では、細胞あたりのタンパク質の存在量として定義される場合がある。基準細胞と比較して、膜結合タンパク質の定常状態レベルは、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％減少する場合があり、または約１００％減少する場合があり、すなわち、ヘテロ二官能性分子の結合により膜結合タンパク質が完全に存在しないことになる。
【0284】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、例えば、Wu X and Demarest SJ, Methods. (2019)154:3-9、に記載されている。したがって、好ましくは、第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ、好ましくは、上記「第１の結合ドメインが結合する膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ」の項で規定した膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができる抗体である。好ましくは、第２の結合ドメインもまた抗体であり、この抗体は、膜結合タンパク質、好ましくは膜貫通タンパク質、好ましくは上記「第２の結合ドメインが結合するタンパク質」の項で規定した膜貫通タンパク質に特異的に結合することができる。２つの抗体（すなわち、第１および第２の結合ドメイン）は、互いに直接結合することができ、または２つの抗体の間にリンカーが存在することができ、好ましくは本明細書に規定するようなリンカーが存在することができる。
【0285】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子は、二重特異性ナノボディである。二重特異性ナノボディは、例えば、国際公開第２０１５／０４４３８６号およびConrath et al (Camel Single-domain Antibodies as Modular Building Units in Bispecific and Bivalent Antibody Constructs, JBC, 2001）に開示されている。好ましくは、第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ、好ましくは、上記「第１の結合ドメインが結合する膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ」の項で規定した膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合できるナノボディである。好ましくは、第２の結合ドメインもまたナノボディあり、このナノボディは、膜結合タンパク質、好ましくは膜貫通タンパク質、好ましくは上記「第２の結合ドメインが結合するタンパク質」の項で規定した膜貫通タンパク質に特異的に結合することができる。２つのナノボディ（すなわち、第１および第２の結合ドメイン）は、互いに直接結合することができ、または２つのナノボディの間にリンカーが存在することができ、好ましくは本明細書に規定するようなリンカーが存在することができる。
【0286】
好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子は、二環性ペプチドである。好ましくは、第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ、好ましくは、上記「第１の結合ドメインが結合する膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ」の項で規定した膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができる環状ペプチドである。好ましくは、第２の結合ドメインもまた環状ペプチドであり、この環状ペプチドは、膜結合タンパク質、好ましくは膜貫通タンパク質、好ましくは上記「第２の結合ドメインが結合するタンパク質」の項で規定した膜貫通タンパク質に特異的に結合することができる。２つの環状ペプチド（すなわち、第１および第２の結合ドメイン）は、例えば、同じ架橋部分を使用することによって、互いに直接結合することができ、または２つの環状ペプチドの間にリンカーが存在することができ、好ましくは本明細書に規定するようなリンカーが存在することができる。
【0287】
本発明のヘテロ二官能性分子は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間にリンカーを含んでいてもよい。リンカーは、当技術分野で知られている任意の適切なリンカーであってもよい。好ましくは、リンカーは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ配列である。当業者は、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインに依存して、リンカーを選択する方法を知っている。リンカーは、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、および（Ｇ）ｎの形の非常に柔軟なリンカーから、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、（ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ）ｎ（配列番号８１）、または（ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ）ｎ（配列番号８２）、または（ＫＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ）ｎ（配列番号８３）、またはそれらの任意のバリアントの形のより硬直なリンカーであってもよく、ここでｎは好ましくは１から７の間、すなわち１、２、３、４、５、６、または７である。
【0288】
リンカーは、好ましくは、２～３０アミノ酸の間、または３～２３アミノ酸の間、または３～１８アミノ酸の間の長さを有する。
【0289】
治療的使用
本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子は、膜貫通ユビキチンＥ３リガーゼと選択された膜結合タンパク質の同時結合によって、任意の選択された膜結合タンパク質のレベルを減少させるために使用することができる。
本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子は、膜貫通ユビキチンＥ３リガーゼと選択された膜結合タンパク質の同時結合によって、任意の選択された膜結合タンパク質のレベルを減少させるために使用することができる。
【0290】
一態様では、本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子は、医薬として使用するためのものである。本明細書に記載される医学的使用は、有効量のヘテロ二官能性分子の投与による明記された疾患（複数可）の処置のための医薬として使用するために、本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子として製剤化されるが、本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子を使用する、明記された疾患（複数可）の処置の方法であって、対象に有効量のヘテロ二官能性分子、明記された疾患（複数可）を処置するための医薬の調製に使用するための本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子を投与するステップ、ここでヘテロ二官能性分子は有効量で投与され、および有効量を投与することによる明記された疾患（複数可）の処置のための本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子の使用を含む方法として同様に製剤化することが可能である。このような医学的使用は、すべて本発明によって想定される。
【0291】
当業者は、疾患の開始、重症度、または持続期間に関与する任意の膜結合タンパク質の活性の増加が、本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子の好適な標的であり得ることを理解する。したがって、ヘテロ二官能性分子は、いかなる特定の膜結合タンパク質またはいかなる特定の疾患にも限定されない。好ましくは、疾患は、膜結合タンパク質、好ましくは受容体の活性が増加することを特徴とし、膜結合受容体の活性の増加は、好ましくは疾患の開始、重症度または持続期間に影響を与えるか、またはそれを規定するものである。
【0292】
非限定的な例として、ヘテロ二官能性分子は、がん、認知症、心臓病および感染症の少なくとも１つの処置に使用される場合がある。
【0293】
膜結合受容体の活性の増加は、例えば、がんの開始、重症度または持続期間において重要な役割を果たすことが当技術分野でよく知られている。したがって、一実施形態では、ヘテロ二官能性分子は、がんに関連する症状の処置、予防、軽減、または抑制のために使用される。
【0294】
好ましくは、がんは、本明細書の上記「第２の結合ドメインが結合するタンパク質」の項で定義されるがんである。
【0295】
好ましくは、がんは、固形がんまたは血液がんである。代わりに、またはさらに、受容体は、がんの血管新生に関与していてもよい。
【0296】
好ましくは、固形がんは、本明細書の上記「第２の結合ドメインが結合するタンパク質」の項で定義される固形がんである。
【0297】
好ましくは、血液がんは、本明細書の上記「第２の結合ドメインが結合するタンパク質」の項で定義される血液がんである。
【0298】
一態様において、本発明は、本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子を含む組成物に関係する。組成物は、細胞培養、好ましくは動物細胞培養、より好ましくは哺乳動物細胞培養における使用に適している場合がある。さらに、または代わりに、組成物は、好ましくは、医薬組成物または化粧品組成物である。
【0299】
組成物は、１種類のヘテロ二官能性分子を含んでいてもよく、例えば、２つまたはそれ以上の異なる膜結合タンパク質の存在をノックダウンまたはノックアウトするために、少なくとも２種類の異なるヘテロ二官能性分子を含んでいてもよい。組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるタイプのヘテロ二官能性分子を含んでいてもよい。
【0300】
上記のようなヘテロ二官能性分子を含む組成物は、医薬組成物もしくは化粧品組成物として、または医療用食品および栄養補助食品を含むヒトもしくは動物用の食品など、他の様々な媒体で調製され得る。
【0301】
「医療用食品（medical food）」とは、特有の栄養要求が存在する疾患や状態の特定の食事管理を目的とした製品である。例えば、医療用食品には、栄養チューブを通して供給されるビタミンおよびミネラル製剤（経腸投与と呼ばれる）が含まれるが、これに限定されるものではない。
【0302】
「栄養補助食品（dietary supplement）」とは、ヒトの食事を補うことを意図した製品であり、通常、丸剤、カプセル剤、および錠剤等の製剤の形態で提供されるものを意味するものとする。例えば、これに限定されないが、栄養補助食品は、以下の成分の１つ以上を含むことができる：ビタミン、ミネラル、ハーブ、植物性薬品；アミノ酸、総食事摂取量を増やすことによって食事を補うことを意図した食事物質、および前述のいずれかの濃縮物、代謝物、成分、抽出物またはその組合せ。栄養補助食品は、食品バー、飲料、粉末、シリアル、調理済み食品、食品添加物、キャンディを含むがこれらに限定されない食品に組み込まれてもよい。
【0303】
したがって、対象組成物は、食品を含むがこれに限定されない摂取可能な他の生理学的に許容される材料と複合化されてもよい。さらに、または代わりに、本明細書に記載される使用のための組成物は、食品の（個別の）投与と組み合わせて経口投与されてもよい。
【0304】
組成物は、単独でまたは他の医薬品または化粧品剤と組み合わせて投与してもよく、その生理的に許容される担体と組み合わせることができる。特に、本明細書に記載のヘテロ二官能性分子は、薬学的または生理学的に許容される賦形剤、担体、およびビヒクル等の添加物を用いて製剤化することにより、医薬組成物または化粧品組成物として製剤化することができる。
【0305】
適切な薬学的または生理学的に許容される賦形剤、担体およびビヒクルには、加工剤および薬物送達修飾剤および増強剤、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、単糖類、二糖類、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストロース、ヒドロキシプロピル－Ｐ－シクロデキストリン、ポリビニルピロリジノン、低融点ワックス、イオン交換樹脂など、ならびにそれらの任意の２つ以上の組合せが挙げられる。その他の薬学的に許容される賦形剤については、"Remington's Pharmaceutical Sciences, " Mack Pub. Co., New Jersey (1991)、および"Remington: The Science and Practice of Pharmacy, " Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 20th edition (2003), 21st edition (2005) and 22nd edition (2012)、に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
【0306】
本発明に記載の使用のためのヘテロ二官能性分子を含む医薬組成物または化粧品組成物は、例えば、溶液、懸濁液、またはエマルジョンを含む、意図された投与方法に適した任意の形態であってもよい。好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性分子は、固体形態または液体形態で投与される。
【0307】
経口投与のための固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末、および顆粒を含む場合がある。そのような固体剤形では、ヘテロ二官能性分子は、スクロース、ラクトース、またはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混和されてもよい。そのような剤形は、不活性希釈剤以外の追加物質、例えばステアリン酸マグネシウムのような平滑剤も含んでいてもよい。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形はまた、緩衝剤を含んでいてもよい。錠剤および丸剤は、腸溶性コーティングを使用してさらに調製することができる。
【0308】
経口投与のための液体剤形は、水または生理食塩水などの当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含む薬学的に許容されるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤を含む場合がある。このような組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、シクロデキストリンなどのアジュバント、ならびに甘味料、香味料、および香料を含んでいてもよい。
【0309】
液体担体は、通常、溶液、懸濁液、およびエマルジョンの調製に使用される。好ましい実施形態では、本発明の実施における使用が企図される液体担体／液体剤形は、例えば、水、生理食塩水、薬学的に許容される有機溶媒（複数可）、薬学的に許容される油または脂肪等、およびそれらの２つ以上の混合物等を含む。好ましい実施形態では、本明細書で定義される本発明のヘテロ二官能性分子は、投与前に水溶液と混和される。水溶液は、投与に適していることが好ましく、そのような水溶液は当技術分野でよく知られている。水溶液の投与の適性は、投与経路に依存する場合があることが当技術分野でさらに知られている。
【0310】
好ましい実施形態では、水溶液は、等張性水溶液である。等張性水溶液は、好ましくは、血漿に対してほぼ（または完全に）等張である。さらに好ましい実施形態では、等張性水溶液は、生理食塩水である。
【0311】
液体担体は、可溶化剤、乳化剤、栄養剤、緩衝剤、保存剤、懸濁剤、増粘剤、粘度調整剤、安定剤、香味剤等の他の適切な薬学的に許容される添加物を含んでもよい。好ましい香味剤は、単糖類および／または二糖類のような甘味料である。好適な有機溶媒としては、例えば、エタノールなどの一価アルコール、およびグリコールなどの多価アルコールが挙げられる。好適な油としては、例えば、大豆油、ヤシ油、オリーブ油、サフラワー油、綿実油等が挙げられる。
【0312】
非経口投与の場合、担体は、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル等の油性エステルでもあり得る。本発明で使用するための組成物は、微粒子、マイクロカプセル、リポソームカプセル等、ならびにそれらの任意の２つ以上の組合せの形態であってもよい。
【0313】
時間放出、持続放出または制御放出送達システムは、例えば、Lee, "Diffusion-Controlled Matrix Systems", pp. 155-198およびRon and Langer, "Erodible Systems", pp. 199-224, in "Treatise on Controlled Drug Delivery", A. Kydonieus Ed. , Marcel Dekker, Inc. , New York 1992に記載されているように、拡散制御マトリックスシステムまたは侵食性システムを使用してもよい。マトリックスは、例えば、加水分解または酵素切断、例えば、プロテアーゼによって、ｉｎ ｓｉｔｕおよびｉｎ ｖｉｖｏで自然に分解することができる生分解性材料であってもよい。送達システムは、例えば、天然に存在するまたは合成のポリマーまたはコポリマーであってもよく、例えばヒドロゲルの形態である。開裂可能な結合を有する例示的なポリマーには、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリ無水物、多糖類、ポリ（ホスホエステル）、ポリアミド、ポリウレタン、ポリ（イミドカーボネート）およびポリ（ホスファゼン）等が挙げられる。
【0314】
本発明のヘテロ二官能性分子はまた、リポソームの形態で投与することができる。当技術分野において知られているように、リポソームは一般にリン脂質または他の脂質物質から得られる。リポソームは、水性媒体中に分散された単層または多層水和液体結晶によって形成される。リポソームを形成することができる、非毒性で、生理学的に許容され、代謝可能な任意の脂質を使用することができる。リポソーム形態の本発明の組成物は、本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子に加えて、安定剤、保存剤、賦形剤等を含むことができる。好ましい脂質は、天然および合成のリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成する方法は、当技術分野で知られている。例えば、Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N. Y., p. 33 et seq (1976)を参照されたい。
【0315】
医薬組成物または化粧品組成物は、単位用量製剤を含むことができ、単位用量は、本明細書で定義される障害または状態の治療効果または抑制効果を有するのに十分な用量、および／または膜結合タンパク質の発現を低減する、またはノックアウトするために有効な量である。単位用量は、本明細書で定義される障害または状態の治療効果または抑制効果および／または標的膜結合タンパク質の発現を低減するのに有効な量を有する単回投与で十分である場合がある。代わりに、単位用量は、本明細書で定義される障害または状態の処置または抑制の経過において定期的に投与される用量であってもよい。処置の経過の間、対象組成物の濃度は、所望のレベルが維持されることを保証するために監視されてもよい。
【0316】
本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子またはヘテロ二官能性分子を含む組成物は、経腸、経口、非経口、舌下、吸入（例えば、ミストまたはスプレーとして）、直腸、または局所的に投与されてもよく、所望に応じて従来の非毒性薬学的または生理的に許容できる担体、アジュバント、およびビヒクルを含む投与単位製剤で好ましくは投与されてもよい。例えば、好適な投与様式としては、経口、皮下、経皮、経粘膜、イオントフォレーシス、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、鼻内（例えば、鼻粘膜経由）、硬膜下、直腸、胃腸等、および特定のまたは影響を受ける臓器または組織、例えばがん組織への直接の投与が挙げられる。中枢神経系への投与には、脊髄投与、硬膜外投与、脳室への投与等を使用することができる。局所投与には、経皮パッチやイオントフォレーシス装置等の経皮投与の使用を伴う場合もある。本明細書で使用される非経口的という用語は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、または点滴技術を含む。
【0317】
ヘテロ二官能性分子は、所望の投与経路に適した薬学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルと混合することができる。本発明のヘテロ二官能性分子は、胃管または経皮管を介した補充によって投与される場合がある。
【0318】
好ましい実施形態では、本発明は、有効な総１日用量の投与による、がんに関連する症状の処置、予防、または抑制における使用のための、本明細書で上に定義されるヘテロ二官能性分子に関係する。
【0319】
経口投与のための剤形は、固形経口剤形であり得る。固体経口剤形のクラスは、主に錠剤およびカプセル剤からなるが、他の形態も当技術分野で知られており、同様に好適であり得る。固体経口剤形として使用する場合、本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子は、例えば、即時放出錠剤（またはカプセル剤等）または徐放性錠剤（またはカプセル剤等）の形態で投与してもよい。当業者にとって明らかであろうように、任意の適切な即時放出または徐放性固体剤形を本発明の文脈で使用することができる。
【0320】
本明細書に記載の使用のための記載されたヘテロ二官能性分子は、固体形態、液体形態、エアロゾル形態、または錠剤、丸剤、粉末混合物、カプセル剤、顆粒、注射剤、クリーム、溶液、座薬、浣腸、結腸洗浄、エマルジョン、分散液、食品プレミックス、および他の適切な形態で投与することができる。ｃのヘテロ二官能性分子はまた、リポソーム製剤で投与することができる。化合物はまた、プロドラッグとして投与することができ、ここで、プロドラッグは、治療的に有効である形態に、処置された対象において変換を受ける。追加の投与方法は、当技術分野で知られている。
【0321】
注射可能調製物、例えば、無菌注射用水性または油性懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して既知の技術に従って製剤化することができる。無菌注射可能調製物はまた、例えばプロピレングリコール中の溶液のように、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射可能溶液または懸濁液であってもよい。採用されてもよい許容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。さらに、溶媒または懸濁媒体として、無菌の固定油が従来から採用されている。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意のブランドの固定油を採用してもよい。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は、注射剤の調製に使用される。
【0322】
ヘテロ二官能性分子の直腸投与用の坐薬は、ヘテロ二官能性分子をココアバターやポリエチレングリコールなどの室温では固体だが直腸温度では液体で、したがって直腸で溶けてヘテロ二官能性分子を放出する適切な非刺激性の賦形剤と混合することによって調製され得る。
【0323】
本明細書に記載の使用のためのヘテロ二官能性分子は、単独の活性医薬品（または化粧品）剤として投与することができるが、それらはまた、疾患または障害の処置または抑制に使用される１つ以上の他の薬剤と組み合わせて使用することができる。疾患または障害に関連する症状の処置、予防または抑制のために本発明のヘテロ二官能性分子と組み合わせて有用な代表的薬剤としては、コエンザイムＱ、ビタミンＥ、イデベノン、ＭｉｔｏＱ、ＥＰＩ－７４３、ビタミンＫおよびその類似体、ナフトキノンおよびその誘導体、他のビタミン、抗酸化化合物が挙げられるが、それらに限定されない。
【0324】
本発明のヘテロ二官能性分子と組み合わせて追加の活性剤を使用する場合、追加の活性剤は、一般に、参照により本明細書に組み込まれるPhysicians' Desk Reference (PDR) 53rd Edition (1999)に示される治療量、または当業者に知られるような治療上有用な量を採用してもよい。本発明のヘテロ二官能性分子および他の治療上活性な薬剤または薬剤（複数）は、推奨される最大臨床用量で、またはより低い用量で投与され得る。本発明の組成物中の活性化合物の用量レベルは、投与経路、疾患の重症度、および患者の応答に依存して、所望の治療応答を得るように変化させてもよい。他の治療剤と組み合わせて投与する場合、治療剤は、同時または異なる時間に投与される別々の組成物として製剤化することができ、または治療剤は、単一の組成物として投与することができる。
【0325】
さらなる態様
さらに、または代わりに、本発明に記載のヘテロ二官能性分子は、研究目的に使用される場合がある。
さらに、または代わりに、本発明に記載のヘテロ二官能性分子は、研究目的に使用される場合がある。
【0326】
したがって、一態様では、本発明は、膜結合タンパク質、好ましくは膜貫通タンパク質を、治療、好ましくはがん治療の標的として同定するための方法に関する。好ましくは、がんは、上記で規定されるようながんのタイプである。
【0327】
好ましくは、方法は、ヘテロ二官能性分子のライブラリーの１つ以上のメンバーに細胞を曝露するステップを含む。ヘテロ二官能性分子は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含む。
【0328】
第１の結合ドメインは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ、好ましくは、「第１の結合ドメインが結合する膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ」の項で規定した膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合することができる。好ましくは、第１の結合ドメインは、「第１の結合ドメイン」の項で規定した結合ドメインである。好ましくは、第１の結合ドメインは、抗体、好ましくはナノボディである。好ましくは、ライブラリー中のヘテロ二官能性分子は、同一またはほぼ同一の第１の結合ドメインを含む。
【0329】
好ましくは、第２の結合ドメインは、「第２の結合ドメイン」の項で規定した結合ドメインである。好ましくは、第２の結合ドメインは、抗体、好ましくはナノボディである。ヘテロ二官能性分子の第２の結合ドメインは、好ましくは、スクランブル配列を含み、例えば、少なくとも未知のアミノ酸残基（Ｘ）を含む。好ましくは、第２の結合ドメインは、例えば、（Ｘ）ｎとして注釈され、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の数である、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の未知のアミノ酸残基を有するスクランブル配列を含んでもよい。第２の結合ドメインは、１つ以上のスクランブル配列、例えば、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上のスクランブル配列を含んでもよい。
【0330】
第２の結合ドメイン中のスクランブル配列は、好ましくは、第２の結合ドメインの膜結合タンパク質への結合親和性に影響を与える。第２の結合ドメインにおけるスクランブル配列の配列を変更することにより、第２の結合ドメインは、好ましくは、異なる膜結合タンパク質に結合する。好ましくは、ライブラリー中のヘテロ二官能性分子は固有またはほぼ固有の第２の結合ドメインを含む。
【0331】
好ましくは、ライブラリー中のヘテロ二官能性分子は二重特異性抗体であり、好ましくは、二重特異性ナノボディである。
【0332】
好ましくは、細胞を適切な条件下でヘテロ二官能性分子のライブラリーに曝露して、細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力の少なくとも１つを決定することができる。当業者は、細胞の生存率、分化能力、幹細胞性、および増殖能力を評価する方法を知っている。
【0333】
本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子のライブラリーのうちの１つ以上のメンバーに曝露された細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力は、好ましくは対照細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力とそれぞれ比較される。好ましくは、対照細胞、または基準細胞は、ヘテロ二官能性分子のライブラリーのうちの１つ以上のメンバーに曝露された細胞と同一または実質的に同一の遺伝的背景を有する細胞である。対照細胞は、好ましくは、曝露された細胞と同じ、または本質的に同じ条件下で培養される。方法は、培養プレートのそれぞれのウェルがヘテロ二官能性分子のライブラリーのうちの１つ以上のメンバーに曝露された細胞を含むハイスループットアッセイで実施されてもよい。
【0334】
好ましくは、この方法は、対照細胞と比較して、曝露された細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力の少なくとも１つを低減または増加させるヘテロ二官能性分子を同定するステップをさらに含む。
【0335】
低減は、対照細胞と比較されてもよく、例えば、曝露された細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力の少なくとも１つの低減は、対照細胞と比較して、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％低減してもよく、または約１００％低減してもよい。
【0336】
さらに、または代わりに、生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力の少なくとも１つの増加は、対照細胞と比較されてもよく、例えば曝露された細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力の少なくとも１つの増加は、対照細胞と比較して、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１５０％、２００％または５００％増加してもよい。
【0337】
方法は、好ましくは、対照細胞と比較して、曝露された細胞の生存率、分化能力、幹細胞性および増殖能力の少なくとも１つを低減または増加させるヘテロ二官能性分子を同定するステップを含む。当業者は、ヘテロ二官能性分子を同定するために、任意の従来の手段を使用してもよい。非限定的な例として、ヘテロ二官能性分子は、ＤＮＡバーコードによってコンジュゲートされてもよく、ＤＮＡ配列決定によって機能的に関連するヘテロ二官能性分子を迅速に同定および検証できる（例えば、Franzini et al, Angewandte Chemie, 2015; Zimmerman and Neri, Drug Discovery Today, 2016）。別の非限定的な例では、ヘテロ二官能性分子は、検出および単離に使用されるタンパク質タグを含んでいてもよい。精製された分子は、その後、質量分析を使用して分析されてもよい。
【0338】
ヘテロ二官能性分子の同定に続いて、標的とする膜結合タンパク質は、当技術分野における任意の従来の手段を使用して同定され得る。非限定的な例として、膜結合タンパク質は、細胞表面のビオチン化、および質量分析に基づく同定を使用して同定され得る。未処置細胞と処置細胞の細胞表面プロテオームを比較することで、どの標的が細胞表面から除去されたかが明らかになる。このような方法は十分に確立されており、例えば、ＲＮＦ４３の内因性基質を同定するために当技術分野で以前に使用されている（Koo et al, Nature 2012）。別の非限定的な例では、ヘテロ二官能性分子は、相互作用する細胞表面タンパク質の免疫沈降法を行うために採用される。沈殿した分子は、その後、質量分析を使用して分析されてもよい。
【0339】
本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子のライブラリーのうちの１つ以上のメンバーに曝露される細胞は、細胞培養、細胞系、生検、およびオルガノイドであり得るか、またはその一部であり得る。
【0340】
好ましくは、細胞は患者由来の組織、好ましくは培養した患者由来の組織の一部であるか、またはそれに由来する。好ましくは、細胞は生検またはオルガノイド、好ましくは腫瘍オルガノイドの一部であるか、またはそれに由来する。
【0341】
生検は、切除生検、切開生検、またはコア生検であり得る。オルガノイドは、好ましくは、がんオルガノイドである。オルガノイドは、好ましくは患者由来のオルガノイドであり、好ましくは腫瘍オルガノイドである。
【0342】
ヘテロ二官能性分子の製造
一態様では、本発明は、本発明のヘテロ二官能性分子を製造するための方法であって、
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質を選択するステップと；
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができる第１の結合ドメインを構築するステップと；
－ 膜結合タンパク質に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを構築するステップと；および
－ 第１の結合ドメインを第２の結合ドメインに結合するステップであって、好ましくは、結合は、直接結合またはリンカー、好ましくは本明細書で定義されるリンカーを介する、ステップ
を含む方法に関係する。
一態様では、本発明は、本発明のヘテロ二官能性分子を製造するための方法であって、
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質を選択するステップと；
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合することができる第１の結合ドメインを構築するステップと；
－ 膜結合タンパク質に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを構築するステップと；および
－ 第１の結合ドメインを第２の結合ドメインに結合するステップであって、好ましくは、結合は、直接結合またはリンカー、好ましくは本明細書で定義されるリンカーを介する、ステップ
を含む方法に関係する。
【0343】
本明細書では、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを構築するステップは、当技術分野における任意の従来の手段を使用して実施され得ることが理解される。非限定的な例として、第１および第２の結合ドメインのうちの少なくとも１つは、当技術分野において従来から知られている結合ドメイン、例えば、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼへの特異的結合について当技術分野において知られている抗体、または膜結合タンパク質への特異的結合について当技術分野において知られている抗体である。
【0344】
代わりに、第１および第２の結合ドメインのうちの少なくとも一方は、デノボ結合ドメインであり、例えば、免疫研究によって発見された抗体またはナノボディ結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【0345】
ヘテロ二官能性分子を構築する前に、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質の組合せを選択することができる。膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質を選択するステップは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼを膜結合タンパク質へと標的化する能力を評価するために、まず当技術分野で知られている任意のヘテロ二量体化システム、例えばＴａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡのＡ／Ｃ二量体化システムなど使用して実施されてもよいが、これに限定されない。能力は、Ｅ３ユビキチンリガーゼがどの程度膜結合タンパク質をユビキチン化および内在化することができるかを決定することによって評価されてもよい。さらに、または代わりに、ヘテロ二量体化システムを使用してＥ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質とを強制的に相互作用させた後、膜結合タンパク質の細胞表面レベルおよび／または総タンパク質レベルがどの程度減少するかを決定することによって能力は評価されてもよい。この目的のために、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼはＦＫＢＰまたはＦＲＢドメインと融合されていてもよい。同様に、膜結合タンパク質はＦＲＢドメインまたはＦＫＢＰドメインとそれぞれ融合されてもよい。このシステムでは、好ましい二量体化化合物は、Ａ／Ｃ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒである。このシステムは、特定の膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質に結合するヘテロ二量体分子の効果を評価するための簡単なアプローチを提供する。
【0346】
代わりに、またはさらに、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質を選択するステップは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに第１の非天然エピトープタグを組み込み、膜結合タンパク質に第２の非天然エピトープタグを組み込むことによって達成されてもよい。細胞内で発現すると、第１および第２のエピトープタグは、好ましくは、それぞれの細胞外ドメインに提示される、すなわち細胞外に提示される。第１のエピトープタグに結合することができる第１の結合ドメインおよび第２のエピトープタグに結合することができる第２の結合ドメインを有するヘテロ二官能性分子は、その後、膜結合タンパク質へと膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼを標的化する能力を評価するために使用されてもよい。ヘテロ二官能性分子を使用してＥ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質とを強制的に相互作用させた後、膜結合タンパク質のユビキチン化および内在化を膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼがどの程度できるかを決定することによって効力は評価されてもよい。さらに、または代わりに、この選択システムを使用してＥ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質を強制的に相互作用させた後、膜結合タンパク質の細胞表面レベルおよび／または総タンパク質レベルがどの程度減少するかを決定することによって能力は評価されてもよい。また、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質を選択するステップは、以下に本明細書で詳述するように、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルを減少させる方法と考えられてもよい。
【0347】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質の有効な組合せを選択した後、（天然）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外部分に特異的に結合することができる第１の結合ドメインと（天然）膜結合タンパク質の細胞外部分に特異的に結合することができる第２の結合ドメインを含むヘテロ二官能性分子を構築してもよい。
【0348】
ユビキチン化／スクリーニング法
本発明者らは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質との適切な組合せ、例えば、本明細書で定義するヘテロ二官能性分子によって効果的に標的化できる組合せを効果的にスクリーニングする方法を開発した。
本発明者らは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質との適切な組合せ、例えば、本明細書で定義するヘテロ二官能性分子によって効果的に標的化できる組合せを効果的にスクリーニングする方法を開発した。
【0349】
一態様では、したがって、本発明は、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルを減少させる方法に関係する。方法は、好ましくは、
ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を、その細胞表面に発現する細胞を用意するステップと；ならびに
ｂ）細胞を本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子に曝露するステップであって、ヘテロ二官能性分子は、
ｉ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外部分に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン；および
ｉｉ）膜結合タンパク質の細胞外部分に特異的に結合することができる第２の結合ドメイン
を含む、ステップと
を含む。
ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を、その細胞表面に発現する細胞を用意するステップと；ならびに
ｂ）細胞を本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子に曝露するステップであって、ヘテロ二官能性分子は、
ｉ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外部分に特異的に結合することができる第１の結合ドメイン；および
ｉｉ）膜結合タンパク質の細胞外部分に特異的に結合することができる第２の結合ドメイン
を含む、ステップと
を含む。
【0350】
方法は、好ましくは、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルを決定するステップｃ）をさらに含む。減少は、好ましくは、ステップｂ）の前の、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルと比較した減少である。好ましくは、タンパク質レベルの減少は、ヘテロ二官能性分子に曝露されていない同一または類似の細胞の膜結合タンパク質のタンパク質レベルと比較した場合の減少、例えば、本発明の方法のステップａ）において提供される細胞の膜結合タンパク質のタンパク質レベルと比較した場合の減少である。
【0351】
細胞をヘテロ二官能性分子に曝露するステップｂ）は、ヘテロ二官能性分子が膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜貫通タンパク質に同時に結合できる条件下であることが好ましい。
【0352】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、好ましくは、本明細書に記載の膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼである。
【0353】
膜結合タンパク質は、好ましくは、膜貫通タンパク質である。膜貫通タンパク質は、本明細書に記載の膜貫通タンパク質であってもよい。
【0354】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質の少なくとも一方は、野生型タンパク質、例えば、提供された細胞内に天然に存在するタンパク質であってもよい。膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質は、好ましくは、同じ細胞内で発現される。必要に応じて、野生型タンパク質の少なくとも１つが、提供される細胞において過剰に発現される。本発明の方法において使用するためのヘテロ二官能性分子は、好ましくは、野生型膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに存在するエピトープに結合することができる第１の結合ドメインを含み、および／または野生型膜貫通タンパク質に天然に存在するエピトープに結合することができる第２の結合ドメインを含む。
【0355】
好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、第１の非天然エピトープタグを含む。好ましくは、第１の非天然エピトープタグは、ユビキチンリガーゼの細胞外部分に位置する。したがって好ましくは、第１の非天然エピトープタグは、提供された細胞の細胞表面上に露出する。好ましくは、第１の非天然エピトープタグは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼのＮ末端に位置する。膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが第１の非天然エピトープタグを含む場合、ヘテロ二官能性分子は、好ましくは、第１の非天然エピトープタグに選択的に結合する第１の結合ドメインを含む。
【0356】
好ましくは、膜結合タンパク質は、第２の非天然エピトープタグを含む。好ましくは、第２の非天然エピトープタグは、膜結合タンパク質の細胞外部分に位置する。したがって好ましくは、第２の非天然エピトープタグは、提供された細胞の細胞表面上に露出する。好ましくは、第２の非天然エピトープタグは、膜結合タンパク質のＮ末端に位置する。膜結合タンパク質が第２の非天然エピトープタグを含む場合、ヘテロ二官能性分子は、好ましくは、第２の非天然エピトープタグに選択的に結合する第２の結合ドメインを含む。
【0357】
「非天然エピトープタグ」は、本明細書では、野生型タンパク質、天然に存在するタンパク質、に通常存在しないエピトープとして理解される。「エピトープ」および「エピトープタグ」という用語は、本明細書では互換的に使用されてもよい。
【0358】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質それぞれへの非天然エピトープタグの組み込みは、当技術分野で知られている任意の従来の分子生物学的手法を使用して行うことができる。第１および第２のエピトープタグは、任意の適切なタグであり得る。好ましくは、タグは短いアミノ酸配列である。好ましくは、タグは、抗体、または抗体断片、好ましくはＶＨＨに対して、当業者に知られている任意の従来の手段を使用して産生させることができるアミノ酸配列である。非天然エピトープタグは、公的に利用可能なタグまたは新たに発見された配列であり得る。第１および第２のエピトープタグは、同じタグであってもよいし、異なるタグであってもよい。好ましくは、第１および第２のエピトープタグは、異なるタグである。非天然エピトープタグは、Ａｌｐｈａタグ、Ｅ６タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、ＧＦＰタンパク質およびＲＦＰタンパク質からなる群から選択されてもよい。
【0359】
第１のエピトープタグは、好ましくは、Goetzke et al (2019, Nature Communications, 10(1), 1-12)に記載のＡｌｐｈａタグであってもよい。代わりに、第１のエピトープタグは、Ling et al.(2019, Molecular Immunology, 114(July), 513-523)に記載のＵＢＣ６ｅタグ（Ｅ６タグ）であってもよい。第２のエピトープタグは、好ましくは、Goetzke et al（前掲）に記載のＡｌｐｈａタグであってもよい。代わりに、第２のエピトープタグは、Ling et al.（前掲）に記載のＵＢＣ６ｅタグ（Ｅ６タグ）であってもよい。好ましくは、第１のタグはＡｌｐｈａタグであってもよく、第２のタグはＥ６タグであってもよい。代わりに、第１のタグはＥ６タグであってもよく、第２のタグはＡｌｐｈａタグであってもよい。
【0360】
エピトープタグと、前記エピトープを認識する対応する抗体または抗体断片の任意の適切な組合せが、本明細書で定義される方法で使用されてもよい。好ましい抗体断片は、ナノボディ（ＶＨＨ）である。したがって、エピトープと、前記エピトープを認識する対応するナノボディ（ＶＨＨ）の任意の適切な組合せが、本明細書で定義される方法で使用されてもよい。
【0361】
当業者は、任意の適切なエピトープ－抗体または抗体断片の組合せを選択することができる。例えば、当業者は、当技術分野で知られている適切なエピトープ－抗体または抗体断片の組合せを選択してもよい。代わりに、またはさらに、エピトープ－抗体または抗体断片は、新たに発見された組合せであってもよく、本明細書で定義される方法において使用されてもよい。
【0362】
抗体または抗体断片は、第１または第２のエピトープタグに特異的に結合する任意の適切な抗体または抗体断片であってもよい。好ましい抗体断片は、ナノボディである。好ましくは、本発明の方法において使用するためのヘテロ二官能性分子は、二重特異性抗体、好ましくは二重特異性ナノボディである。
【0363】
好ましくは、第１のエピトープタグがＡｌｐｈａタグであり、第２のエピトープタグがＥ６タグである場合、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインは抗Ａｌｐｈａ ＶＨＨであってもよく、第２の結合ドメインは抗Ｅ６ ＶＨＨであってもよい。好ましくは、第１のエピトープタグがＥ６タグであり、第２のエピトープタグがＡｌｐｈａタグである場合、ヘテロ二官能性分子の第１の結合ドメインは抗Ｅ６ ＶＨＨであってもよく（Ling et al、前掲）、第２の結合ドメインは抗Ａｌｐｈａ ＶＨＨであってもよい（Goetzke et al、前掲）。したがって、好ましいエピトープタグ－結合ドメインの組合せは、
ｉ）Ａｌｐｈａタグ－抗Ａｌｐｈａ ＶＨＨ（Goetzke et al、（前掲））；および
ｉｉ）Ｅ６タグ－抗Ｅ６ ＶＨＨ（Ling et al、前掲）
のうちの少なくとも１つである。
ｉ）Ａｌｐｈａタグ－抗Ａｌｐｈａ ＶＨＨ（Goetzke et al、（前掲））；および
ｉｉ）Ｅ６タグ－抗Ｅ６ ＶＨＨ（Ling et al、前掲）
のうちの少なくとも１つである。
【0364】
好ましいＡｌｐｈａタグは、配列番号９６と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。好ましいＥ６タグは、配列番号９７と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。好ましい抗Ａｌｐｈａ ＶＨＨは、配列番号９８と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。好ましい抗Ｅ６ ＶＨＨのＣＤＲ３配列は、配列番号９９と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【0365】
好ましくは、膜結合タンパク質の細胞表面レベルは、ヘテロ二官能性分子に曝露されていない同じ細胞、例えば、本発明の方法のステップａ）で提供された細胞、の膜結合タンパク質の細胞表面レベルと比較して減少している。
【0366】
「（タンパク質）レベル」および「（タンパク質）量」という用語は、本明細書では互換的に使用されてもよい。好ましくは、細胞表面レベルは、本発明の方法のステップｂ）の前の膜結合タンパク質の細胞表面レベルと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％減少され、または約１００％減少される。本明細書では、１００％の減少は、膜貫通タンパク質が細胞表面でもはや検出されないことを示すと理解される。細胞表面タンパク質レベルの減少は、ヘテロ二官能性分子に曝露した後に細胞表面上に残っているタンパク質のレベル、または量を直接決定することによって決定されてもよい。
【0367】
ユビキチン化は、好ましくは、ユビキチン化された膜結合タンパク質の内在化および分解をもたらす。したがって、代わりに、またはさらに、膜結合タンパク質の表面レベルの減少は、ヘテロ二官能性分子に曝露した後、例えばステップｂ）の後に、膜結合タンパク質の細胞の総タンパク質レベル、または量を決定することによって決定されてもよい。細胞の総タンパク質レベルは、好ましくは、本発明の方法のステップｂ）の前の膜結合タンパク質の細胞の総タンパク質レベルと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％減少され、または約１００％減少される。本明細書では、１００％の減少は、膜貫通タンパク質が細胞内でもはや検出されないことを示すと理解される。
【0368】
代わりに、またはさらに、膜結合タンパク質の細胞表面レベルの減少は、膜結合タンパク質の細胞内局在の増加、好ましくは膜結合タンパク質のエンドソーム局在の増加を決定することによって決定されてもよい。膜結合タンパク質のユビキチン化は、好ましくは、膜結合タンパク質の内在化をもたらす。内在化されたタンパク質は、その後、分解されてもよく、好ましくはリソソームで分解される。タンパク質の細胞内タンパク質局在の増加を決定するために、方法は、膜結合タンパク質の細胞内局在の増加を決定するステップの前に、例えば、これに限定されないが、細胞をバフィロマイシンで処理することによって、リソソームのターンオーバーを阻害するステップを含んでいてもよい。好ましくは、膜結合タンパク質の細胞内局在は、本発明の方法のステップｂ）の前の膜結合タンパク質の細胞内局在と比較して、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６倍またはそれ以上に増加する。
【0369】
膜結合タンパク質は、第３の非天然エピトープタグを含んでいてもよい。第３の非天然エピトープタグは、膜結合タンパク質のタンパク質レベルを決定するため、好ましくは膜結合タンパク質のタンパク質細胞表面レベル、総タンパク質レベルおよび細胞内レベルのうちの少なくとも１つを決定するために使用されてもよい。第３の非天然エピトープタグは、好ましくは、膜結合タンパク質の細胞外部分に位置する。したがって好ましくは、第３の非天然エピトープタグは、提供された細胞の細胞表面上に露出する。好ましくは、第３の非天然エピトープタグは、膜結合タンパク質のＮ末端と第２の非天然エピトープタグとの間に位置する。
【0370】
膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、第４の非天然エピトープタグを含んでいてもよい。第４の非天然エピトープタグは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼのタンパク質レベルを決定するために使用されてもよい。第４の非天然エピトープタグは、好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼの細胞外部分に位置する。したがって好ましくは、第４の非天然エピトープタグは、提供された細胞の細胞表面上に露出する。好ましくは、第４の非天然エピトープタグは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼのＮ末端と第１の非天然エピトープタグとの間に位置する。
【0371】
したがって、一実施形態では、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、第１および第４の非天然エピトープタグを含んでいてもよく、膜結合タンパク質は、第２および第３の非天然エピトープタグを含んでいてもよい。第３および／または第４の非天然エピトープタグは、タンパク質検出のために当業者に知られている任意の従来のタグ、例えば、ｍｙｃ、ｈｉｓ、ＦＬＡＧタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰまたはＲＦＰであってもよいが、これらに限定されない。
【0372】
第１および第４のタグの好ましい組合せは、ｍｙｃタグとＡｌｐｈａタグ、またはＦＬＡＧタグとＥ６タグである。第２および第３のタグの好ましい組合せはＦｌａｇタグとＥ６タグ、または、ｍｙｃタグとＡｌｐｈａタグである。
【0373】
膜結合タンパク質のレベル、または量は、当業者に知られている任意の従来の手段を使用して決定されてもよい。そのような手段には、免疫蛍光法、ウエスタンブロッティング、必要に応じて定量的免疫蛍光法および／または定量的ウエスタンブロッティング、細胞表面ビオチン化、ＦＡＣＳ解析および定量的質量分析が含まれるが、これらに限定されない。
【0374】
膜結合タンパク質の絶対量またはレベルは、例えば、ヘテロ二官能性分子に曝露する前または後の膜結合タンパク質レベルとの直接比較、例えば、曝露前後の細胞表面における蛍光強度の決定によって決定されてもよい。代わりに、またはさらに、膜結合タンパク質の相対的なレベルまたは量は、例えば、曝露前後のハウスホールド（household）タンパク質または総細胞タンパク質レベルとの比較によって決定されてもよい。
【0375】
非天然エピトープを含む膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと非天然エピトープを含む膜結合タンパク質は、好ましくは同じ細胞で発現される。膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質の発現に適した任意の細胞は、本発明の方法に使用されてもよい。好ましい細胞は、不死化細胞、好ましくは細胞系、好ましくはヒト細胞系、好ましくはヒトがん細胞系であり、好ましくは、細胞はＨＥＫ２３９Ｔ細胞である。
【0376】
細胞系は、野生型または「天然」膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび野生型膜結合タンパク質の少なくとも１つを発現していてもよい。野生型膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび野生型膜結合タンパク質の少なくとも１つは、細胞内で過剰発現していてもよい。必要に応じて、野生型膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび野生型膜結合タンパク質の少なくとも１つは、細胞内で恒常的に過剰発現していてもよい。
【0377】
代わりに、細胞は、操作された膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび操作された膜結合タンパク質の少なくとも１つを発現してもよい。膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、第１の、および必要に応じて第４の非天然エピトープタグを含むように操作される。同様に、膜結合タンパク質は、第２の、および必要に応じて第３の非天然エピトープタグを含むように操作される。細胞は、操作された膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび操作された膜結合タンパク質の少なくとも１つを一過性に過剰発現してもよい。必要に応じて、細胞は、操作された膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび操作された膜結合タンパク質の少なくとも１つを恒常的に過剰発現してもよい。恒常的発現は、例えば、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質の少なくとも１つを発現する発現カセットを細胞のゲノムに組み込むことによって達成される場合がある。
【0378】
操作された膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび操作された膜結合タンパク質の少なくとも１つの発現、必要に応じて恒常的発現は、当業者によって当技術分野で知られている任意の従来の手段を使用して達成することができる。
【0379】
（必要に応じて非天然エピトープを含む）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび（必要に応じて非天然エピトープ（複数可）を含む）膜結合タンパク質の少なくとも１つをコードする配列は、一過性または恒常的発現のために細胞内に導入され得る。必要に応じて、コード配列（複数可）は、細胞に導入される発現カセットの一部である。発現カセットは、発現ベクターの一部であってもよい。好ましい発現ベクターは、裸のＤＮＡ、ＤＮＡ複合体またはウイルスベクターである。好ましい裸のＤＮＡは、直鎖状または環状の核酸分子であり、例えば、プラスミドである。プラスミドは、標準的な分子クローニング手法などによって、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。ＤＮＡ複合体は、ＤＮＡを細胞内に送達するのに適した任意の担体に結合したＤＮＡ分子であり得る。好ましい担体は、リポプレックス、リポソーム、ポリマソーム、ポリプレックス、ウイルスベクター、デンドリマー、無機ナノ粒子、ビロソームおよび細胞貫通ペプチドからなる群から選択される。
【0380】
細胞は、非天然エピトープタグ（複数可）を含む膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび非天然エピトープタグ（複数可）を含む膜結合タンパク質を内因性レベルで発現するように改変されてもよい。非限定的な例として、第１の、および必要に応じて第２の非天然エピトープタグをコードする配列は、提供された細胞のゲノム配列に組み込まれてもよい。さらに同じ細胞において、第２の、および必要に応じて第３の非天然エピトープタグをコードする配列は、提供された細胞のゲノム配列に組み込まれてもよい。
【0381】
したがって、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードする提供された細胞のゲノム配列は、第１の、および必要に応じて第４の非天然エピトープタグをコードする配列を組み込むように改変され得る。改変されたゲノム配列は、好ましくは、本明細書で定義される第１の、および必要に応じて第４の非天然エピトープタグを含む膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードし発現する。好ましくは、同じ細胞において、膜結合タンパク質をコードする提供された細胞のゲノム配列は、第２の、および必要に応じて第３の非天然エピトープタグをコードする配列を組み込むように改変され得る。改変されたゲノム配列は、好ましくは、本明細書で定義される第２の、および必要に応じて第３の非天然エピトープタグを含む膜結合タンパク質をコードし発現する。
【0382】
第１、第２、ならびに必要に応じて第３および第４の非天然エピトープタグをコードする配列を組み込むための標的ゲノム改変の方法は当業者によく知られており、第１、および必要に応じて第４の非天然エピトープタグをコードする配列を組み込むために、または第２、および必要に応じて第３の非天然エピトープタグをコードする配列を組み込むために、ゲノムの位置に二本鎖切断を生成する部位特異的エンドヌクレアーゼを含むがこれに限定されない。好ましい部位特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。
【0383】
したがって、第１、および必要に応じて第４の非天然エピトープタグは、ｉ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードする配列中の二本鎖切断を生成する部位特異的ヌクレアーゼ、およびｉｉ）第１、および必要に応じて第４のタグをコードする配列を含むオリゴヌクレオチドまたはドナープラスミドを細胞に導入するステップによって細胞のゲノムに導入されてもよい。二本鎖切断は、好ましくは、成熟膜貫通タンパク質がＮ末端に第１および必要に応じて第４のタグを含むような位置にあり、好ましくは、二本鎖切断は、第１および必要に応じて第４のタグが、成熟膜貫通ユビキチンＥ３リガーゼのシグナルペプチドとＮ末端との間に配置されるような位置にある。好ましくは、同じ細胞内で、第２および必要に応じて第３の非天然エピトープタグは、ｉ）膜結合タンパク質をコードする配列中の二本鎖切断を生成する部位特異的ヌクレアーゼ、およびｉｉ）第２および必要に応じて第３のタグをコードする配列を含むオリゴヌクレオチドまたはドナープラスミドを細胞に導入するステップによって、細胞のゲノムに導入されてもよい。二本鎖切断は、好ましくは成熟膜結合タンパク質がＮ末端に第２および必要に応じて第３のタグを含むような位置に位置する。
【0384】
オリゴヌクレオチドまたはドナープラスミドは、好ましくは、相同配列依存的修復（homology-directed repair）を促進するための配列を含む。
【0385】
代わりに、またはさらに、第１、第２、ならびに必要に応じて第３および第４の非天然エピトープタグは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプライム編集技術を使用して導入されてもよい。
【0386】
本明細書で上に定義される方法はまた、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質との組合せを選択するための方法と考えられてもよい。好ましくは、本明細書で定義される方法は、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質との有効な組合せを選択するための方法である。好ましくは、組合せは、両者が近接したときに、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが、膜結合タンパク質をユビキチン化することができる場合に有効な組合せである。膜結合タンパク質のユビキチン化は、好ましくは、前記タンパク質の内在化をもたらす。好ましくは、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質は、本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子への同時結合によって近接する。
【0387】
本明細書で上に定義される本発明の方法はまた、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルを減少させるためのヘテロ二官能性分子、好ましくは本明細書で定義したヘテロ二官能性分子の効率を決定する方法と考えられてもよい。好ましくは、方法は、上記で概説したようなステップを含む。好ましくは、方法は、
ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を、その細胞表面に発現する細胞を用意するステップと；ならびに
ｂ）細胞をヘテロ二官能性分子、好ましくは本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子に曝露するステップ
を含む。
ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を、その細胞表面に発現する細胞を用意するステップと；ならびに
ｂ）細胞をヘテロ二官能性分子、好ましくは本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子に曝露するステップ
を含む。
【0388】
方法は、好ましくは、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルを決定するステップｃ）をさらに含む。減少は、好ましくは、ステップｂ）の前の、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルと比較した減少である。
【0389】
本明細書で定義される方法は、また、
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜貫通タンパク質の有効な組合せを選択する方法であって、ステップｃ）の後に膜貫通タンパク質のタンパク質レベルが減少している場合に、その組合せを選択する方法、
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜貫通タンパク質の有効な組合せをスクリーニングする方法；
－ 定義されたヘテロ二官能性分子を製造するための方法であって、ヘテロ二官能性分子が膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜貫通タンパク質の選択された組合せに選択的に結合する方法；
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが膜結合タンパク質をユビキチン化する能力を決定する方法であって、ステップｃ）の後に膜貫通タンパク質のタンパク質レベルが減少している場合、膜貫通Ｅ３リガーゼが膜結合タンパク質をユビキチン化することができる方法；
－ ヘテロ二官能性分子による分解のために膜結合タンパク質を標的とするための方法；および
－ 膜結合タンパク質のユビキチン化を決定する方法であって、膜結合タンパク質の表面レベルの減少が膜結合タンパク質のユビキチン化を示し、その減少が好ましくは、ステップｂ）の前の細胞の膜結合タンパク質の表面レベルと比較した減少である、方法
の少なくとも１つと考えられてもよい。
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜貫通タンパク質の有効な組合せを選択する方法であって、ステップｃ）の後に膜貫通タンパク質のタンパク質レベルが減少している場合に、その組合せを選択する方法、
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜貫通タンパク質の有効な組合せをスクリーニングする方法；
－ 定義されたヘテロ二官能性分子を製造するための方法であって、ヘテロ二官能性分子が膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜貫通タンパク質の選択された組合せに選択的に結合する方法；
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼが膜結合タンパク質をユビキチン化する能力を決定する方法であって、ステップｃ）の後に膜貫通タンパク質のタンパク質レベルが減少している場合、膜貫通Ｅ３リガーゼが膜結合タンパク質をユビキチン化することができる方法；
－ ヘテロ二官能性分子による分解のために膜結合タンパク質を標的とするための方法；および
－ 膜結合タンパク質のユビキチン化を決定する方法であって、膜結合タンパク質の表面レベルの減少が膜結合タンパク質のユビキチン化を示し、その減少が好ましくは、ステップｂ）の前の細胞の膜結合タンパク質の表面レベルと比較した減少である、方法
の少なくとも１つと考えられてもよい。
【0390】
本明細書で上に示したように、本明細書で定義される方法は、有効なヘテロ二官能性分子、例えば膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜結合タンパク質との有効な組合せを標的とするヘテロ二官能性分子を構築するために使用される場合がある。したがって、本発明はまた、ヘテロ二官能性分子、好ましくは本明細書で定義されるヘテロ二官能性分子に関係し、前記ヘテロ二官能性分子が選択的に結合する膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質は、本明細書で上に定義する選択方法を使用して選択される。したがって、選択方法は、好ましくは、以下のステップ、
ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を、その細胞表面に発現する細胞を用意するステップであって、
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、細胞外部分に第１の非天然エピトープタグを含み；
－ 膜結合タンパク質は、細胞外部分に第２の非天然エピトープタグを含む、ステップと；
ｂ）細胞をヘテロ二官能性分子に曝露するステップであって、ヘテロ二官能性分子は、
－ 第１の非天然エピトープタグに特異的に結合することができる第１の結合ドメイン；および
－ 第２の非天然エピトープタグに結合することができる第２の結合ドメイン
を含む、ステップと；
ｃ）細胞の膜結合タンパク質の表面レベルを決定するステップと；
ｄ）膜結合タンパク質の表面レベルが、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または約１００％減少した場合に、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質を選択するステップであって、減少は、ステップｂ）の前の、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルと比較した減少である、ステップと
を含む。
ａ）膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜結合タンパク質を、その細胞表面に発現する細胞を用意するステップであって、
－ 膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼは、細胞外部分に第１の非天然エピトープタグを含み；
－ 膜結合タンパク質は、細胞外部分に第２の非天然エピトープタグを含む、ステップと；
ｂ）細胞をヘテロ二官能性分子に曝露するステップであって、ヘテロ二官能性分子は、
－ 第１の非天然エピトープタグに特異的に結合することができる第１の結合ドメイン；および
－ 第２の非天然エピトープタグに結合することができる第２の結合ドメイン
を含む、ステップと；
ｃ）細胞の膜結合タンパク質の表面レベルを決定するステップと；
ｄ）膜結合タンパク質の表面レベルが、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または約１００％減少した場合に、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび膜貫通タンパク質を選択するステップであって、減少は、ステップｂ）の前の、細胞の膜結合タンパク質の表面レベルと比較した減少である、ステップと
を含む。
【0391】
一態様では、本発明は、本明細書で定義される、第１の、および必要に応じて第４の非天然エピトープタグを含む膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに関係する。
【0392】
別の態様では、本発明は、本明細書で定義される、第２の、および必要に応じて第３の非天然エピトープタグを含む膜結合タンパク質に関係する。
【0393】
一態様では、本発明は、
－ 本明細書で定義される、第１の、および必要に応じて第４の非天然エピトープタグを含む膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ；ならびに
－ 本明細書で定義される、第２の、および必要に応じて第３の非天然エピトープタグを含む膜結合タンパク質、
の組合せに関係する。
－ 本明細書で定義される、第１の、および必要に応じて第４の非天然エピトープタグを含む膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼ；ならびに
－ 本明細書で定義される、第２の、および必要に応じて第３の非天然エピトープタグを含む膜結合タンパク質、
の組合せに関係する。
【図面の簡単な説明】
【0394】
【図1】本発明の例示的な実施形態の概略図である。本発明のヘテロ二官能性分子は、膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼと膜貫通タンパク質に同時に結合する。その結果、膜貫通タンパク質はユビキチン化され、内在化され、分解されることになる。
【図2】Ａ／Ｃ二量体化剤（dimerizer）の機能評価の図である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＲＮＦ４３－ＦＫＢＰおよびＴβＲＩＩ－Ｆｌａｇ－ＦＲＢをトランスフェクトし、Ａ／Ｃ二量体化剤または同体積の１００％エタノールで一晩処置した。Ｆｌａｇ－Ｍ２ビーズを使用して、細胞溶解物からＴβＲＩＩ構築物を免疫沈降させた。ＩＰ試料と全細胞溶解物をＳＤＳ－ｐａｇｅで分離し、ブロットしてＦｌａｇとＲＮＦ４３を染色し、２つの構築物の間の結合を検出した。
【図3】ＲＮＦ４３とＴβＲＩＩの強制的な二量体化により、両タンパク質の核周辺リソソームへの再局在が誘導される図である。（ａ）ＴβＲＩＩ－Ｆｌａｇ－ＦＲＢをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の共焦点画像。（Ｂ）ＲＮＦ４３－ＦＫＢＰおよびＴβＲＩＩ－Ｆｌａｇ－ＦＲＢをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の共焦点画像。細胞をＡ／Ｃ二量体化剤または同体積の１００％エタノールで一晩処置した。ＴβＲＩＩおよびＲＮＦ４３を、それぞれＦｌａｇおよびＲＮＦ４３染色によって可視化した。（Ｃ）ＣＤ６３－ＧＦＰ、ＲＮＦ４３－ＦＫＢＰおよびＴβＲＩＩ－Ｆｌａｇ－ＦＲＢをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の共焦点画像。細胞をＡ／Ｃ二量体化剤で一晩処置し、ＴβＲＩＩ－Ｆｌａｇ－ＦＲＢをＦｌａｇ染色により可視化した。矢印は核周辺リソソームを示す。
【図4】ＲＮＦ４３とＴβＲＩＩの強制的な二量体化によりＴβＲＩＩが分解される図である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＲＮＦ４３－ＦＫＢＰおよびＴβＲＩＩ－Ｆｌａｇ－ＦＲＢをトランスフェクトし、Ａ／Ｃ二量体化剤または同体積の１００％エタノールで一晩処置した。細胞溶解物をＳＤＳ－ｐａｇｅで分離し、ブロットしてＦｌａｇとＲＮＦ４３を染色し、タンパク質レベルを可視化した。
【図5】ＲＮＦ４３またはＲＮＦ１６７と受容体ＴβＲＩＩまたはＥＧＦＲのＶＨＨが媒介する二量体化は、受容体の内在化と核周辺部での共クラスター化を誘導する図である。細胞を固定する前に１００ｎＭのｂｉ－ＶＨＨで５時間処置した。Ｅ３リガーゼはＭｙｃ染色で、受容体はＦｌａｇ染色で可視化した。（Ａ）Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＴβＲＩＩとＡｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ４３、（Ｂ）Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＴβＲＩＩとＡｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１６７、（Ｃ）Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＥＧＦＲとＡｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ４３および（Ｄ）Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＥＧＦＲとＡｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１６７をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の共焦点画像。矢印は、核周辺領域におけるＥ３リガーゼと受容体の共クラスター化を示す。
【図6】二官能性ＶＨＨ処置は、膜結合Ｅ３リガーゼが媒介する細胞表面からの膜貫通受容体の内在化を促進する図である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＥ３リガーゼＲＮＦ４３、ＲＮＦ１２８、ＲＮＦ１３０、ＲＮＦ１６７のいずれか１つと受容体ＣＴＬＡ－４、ＦＬＴ－３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１をトランスフェクトした。細胞は未処置のままか、固定前に５０ｎＭのｂｉ－ＶＨＨで一晩処置した。細胞表面に存在するレセプターは、未透過性細胞のＦｌａｇ染色により可視化した。（Ａ）Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＣＴＬＡ－４とＡｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ４３またはＡｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１６７、（Ｂ）Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＦＬＴ－３とＭｙｃ－ＲＮＦ４３、Ａｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１２８またはＡｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１６７、（Ｃ）Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＰＤ－１とＡｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ４３、Ａｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１２８、Ａｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１３０またはＡｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１６７、および（Ｄ）Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＰＤ－Ｌ１とＡｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ４３、Ａｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１２８、Ａｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１３０またはＡｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１６７をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の共焦点画像を示す。
【図7-1】Ｅ３リガーゼと標的の組合せに対するｂｉ－ＶＨＨの効果を内因性レベルで検証する図である。（Ａ）内因性タグ付きタンパク質を生成するための戦略。（Ｂ）Ｅ３リガーゼと標的の組合せの内因性タグ付きバージョンを使用したｂｉ－ＶＨＨによる標的の細胞表面除去のアプローチの概略図。
【図7-2】Ｅ３リガーゼと標的の組合せに対するｂｉ－ＶＨＨの効果を内因性レベルで検証する図である。（Ａ）内因性タグ付きタンパク質を生成するための戦略。（Ｂ）Ｅ３リガーゼと標的の組合せの内因性タグ付きバージョンを使用したｂｉ－ＶＨＨによる標的の細胞表面除去のアプローチの概略図。
【実施例】
【0395】
[実施例１]
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２ｍＭ ＵｌｔｒａＧｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ）、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２で培養した。トランスフェクションは、顕微鏡観察の場合は製造業者のプロトコールにしたがってＦｕＧＥＮＥ ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生化学の場合はＰＥＩを使用して、実施した。Ａ／Ｃ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、＃ ６３５０５６）は１μＭで、３７℃で一晩使用し、対照条件は等量の１００％エタノールで処置した。ＴＧＦβは１，５ｎｇ／ｍＬで４５分間使用した。
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２ｍＭ ＵｌｔｒａＧｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ）、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２で培養した。トランスフェクションは、顕微鏡観察の場合は製造業者のプロトコールにしたがってＦｕＧＥＮＥ ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生化学の場合はＰＥＩを使用して、実施した。Ａ／Ｃ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、＃ ６３５０５６）は１μＭで、３７℃で一晩使用し、対照条件は等量の１００％エタノールで処置した。ＴＧＦβは１，５ｎｇ／ｍＬで４５分間使用した。
【0396】
構築物および抗体
ＴＧＦ－βＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体（ＴβＲＩＩ）－Ｆｌａｇ－ＦＫＢＰおよび－Ｆｌａｇ－ＦＲＢはＰｅｔｅｒ ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ（ＬＵＭＣ、Ｌｅｉｄｅｎ）から提供された。ＲＮＦ４３－ＦＫＢＰおよび－ＦＲＢは、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用して、ヒトＲＮＦ４３のＣ末尾にそれぞれＦＫＢＰ３６ＶまたはＦＲＢのコード配列を挿入することによって得られた。すべての構築物は配列が確認された。ＣＤ６３－ＧＦＰはＪ．Ｋｌｕｍｐｅｒｍａｎ（ＵＭＣＵ、Ｕｔｒｅｃｈｔ）から贈呈された。免疫ブロット法（ＩＢ）、免疫蛍光法（ＩＦ）、免疫沈降法（ＩＰ）には以下の一次抗体を使用した：ウサギ抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ラット抗ＨＡ（Ｒｏｃｈｅ）、マウス抗ＦＬＡＧ（Ｍ２；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、マウス抗Ａｃｔｉｎ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）およびウサギ抗ＲＮＦ４３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。一次抗体は製造業者の使用説明書に従い希釈した。ＩＢまたはＩＦに使用した二次抗体は、それぞれ１：８０００または１：３００で、ＲｏｃｋｌａｎｄまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのいずれかから入手したものを使用した。
ＴＧＦ－βＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体（ＴβＲＩＩ）－Ｆｌａｇ－ＦＫＢＰおよび－Ｆｌａｇ－ＦＲＢはＰｅｔｅｒ ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ（ＬＵＭＣ、Ｌｅｉｄｅｎ）から提供された。ＲＮＦ４３－ＦＫＢＰおよび－ＦＲＢは、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用して、ヒトＲＮＦ４３のＣ末尾にそれぞれＦＫＢＰ３６ＶまたはＦＲＢのコード配列を挿入することによって得られた。すべての構築物は配列が確認された。ＣＤ６３－ＧＦＰはＪ．Ｋｌｕｍｐｅｒｍａｎ（ＵＭＣＵ、Ｕｔｒｅｃｈｔ）から贈呈された。免疫ブロット法（ＩＢ）、免疫蛍光法（ＩＦ）、免疫沈降法（ＩＰ）には以下の一次抗体を使用した：ウサギ抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ラット抗ＨＡ（Ｒｏｃｈｅ）、マウス抗ＦＬＡＧ（Ｍ２；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、マウス抗Ａｃｔｉｎ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）およびウサギ抗ＲＮＦ４３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。一次抗体は製造業者の使用説明書に従い希釈した。ＩＢまたはＩＦに使用した二次抗体は、それぞれ１：８０００または１：３００で、ＲｏｃｋｌａｎｄまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのいずれかから入手したものを使用した。
【0397】
免疫蛍光法および共焦点顕微鏡
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、２４ウェルプレートでラミニン（Ｓｉｇｍａ）をコートしたガラスカバースリップ上で増殖させた。一晩のトランスフェクションの後、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をＰＢＳ中に２％ＢＳＡと０．１％サポニンを含む緩衝剤で、室温（ＲＴ）で３０分間ブロックした。その後、細胞を一次抗体および二次抗体とともにブロッキング緩衝剤中、室温で１時間インキュベートした。細胞をＰｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にマウントし、ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡で画像を取得した。画像はＩｍａｇｅＪで解析および処理した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、２４ウェルプレートでラミニン（Ｓｉｇｍａ）をコートしたガラスカバースリップ上で増殖させた。一晩のトランスフェクションの後、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をＰＢＳ中に２％ＢＳＡと０．１％サポニンを含む緩衝剤で、室温（ＲＴ）で３０分間ブロックした。その後、細胞を一次抗体および二次抗体とともにブロッキング緩衝剤中、室温で１時間インキュベートした。細胞をＰｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にマウントし、ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡で画像を取得した。画像はＩｍａｇｅＪで解析および処理した。
【0398】
免疫沈降法およびウエスタンブロッティング
トランスフェクション後、細胞を１０ｃｍディッシュで８０％コンフルエントになるまで増殖させた。ＰＢＳで細胞を洗浄後、細胞を掻き取り、１００ｍＭ ＮａＣＬ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１０％グリセロール、５０ｍＭ ＮａＦ、１０ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０μＭロイペプチン、１０μＭアプロチニンおよび１ｍＭ ＰＭＳＦを含む細胞溶解緩衝剤で溶解した。溶解物は、１６．０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離することにより清澄化した。溶解物をＳＤＳ試料緩衝剤に取り、３７℃で１時間加熱した。免疫沈降法のために、溶解物を２５μｌの予め結合したＦｌａｇ－Ｍ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ビーズを試料緩衝剤で溶出し、３７℃で１時間加熱した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、タンパク質をウエスタンブロッティングによりＩｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＦＬ ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）に転写した。Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝剤（ＬＩ－ＣＯＲ）でブロッキングした後、タンパク質を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を使用してヤギ抗マウス／ウサギＡｌｅｘａ ６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ロバ抗ラットＡｌｅｘａ ６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはヤギ抗マウス／ウサギＩＲＤｙｅ ８００（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）で検出される指定された一次抗体で標識した。
トランスフェクション後、細胞を１０ｃｍディッシュで８０％コンフルエントになるまで増殖させた。ＰＢＳで細胞を洗浄後、細胞を掻き取り、１００ｍＭ ＮａＣＬ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１０％グリセロール、５０ｍＭ ＮａＦ、１０ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０μＭロイペプチン、１０μＭアプロチニンおよび１ｍＭ ＰＭＳＦを含む細胞溶解緩衝剤で溶解した。溶解物は、１６．０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離することにより清澄化した。溶解物をＳＤＳ試料緩衝剤に取り、３７℃で１時間加熱した。免疫沈降法のために、溶解物を２５μｌの予め結合したＦｌａｇ－Ｍ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ビーズを試料緩衝剤で溶出し、３７℃で１時間加熱した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、タンパク質をウエスタンブロッティングによりＩｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＦＬ ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）に転写した。Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝剤（ＬＩ－ＣＯＲ）でブロッキングした後、タンパク質を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を使用してヤギ抗マウス／ウサギＡｌｅｘａ ６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ロバ抗ラットＡｌｅｘａ ６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはヤギ抗マウス／ウサギＩＲＤｙｅ ８００（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）で検出される指定された一次抗体で標識した。
【0399】
結果および考察
ＲＮＦ４３とＴＧＦ－βＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体（ＴβＲＩＩ）の強制的な二量体化により、ＴβＲＩＩのリソソーム局在と分解が誘導される
選択された細胞表面タンパク質を内在化およびリソソーム分解へと標的化するように膜貫通Ｅ３リガーゼを再方向づけするという概念の証明を示すために、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化システムを使用した。ＴβＲＩＩとＲＮＦ４３の両方のＣ末端にＦＫＢＰドメインとＦＲＢドメインのいずれかを融合させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で共発現させると、これらのタンパク質は相互作用しない（図２）。しかし、Ａ／Ｃ二量体化剤を添加すると、ＲＮＦ４３とＴβＲＩＩの共免疫沈降が誘導される（図２）。二量体化剤自体はＴβＲＩＩやＲＮＦ４３の安定性を阻害しない（図２、全細胞溶解物）。次に、ＲＮＦ４３とＴβＲＩＩとの強制的な相互作用が、ＴβＲＩＩの細胞内局在を変化させるかどうかを検討した。二量体化剤がない場合、ＴβＲＩＩはＲＮＦ４３の非存在時（図３Ａ）およびＲＮＦ４３の共発現時（図３Ｂ）のいずれにおいても、主に細胞膜に局在した。しかし、二量体化剤を添加すると、ＴβＲＩＩとＲＮＦ４３の両方の、リソソームマーカーＣＤ６３について陽性の核周辺の小胞群への再局在が強く誘導された（図３Ｃ）。これらの知見は、ＲＮＦ４３とＴβＲＩＩの強制的な二量体化が、増加したレベルのＴβＲＩＩをリソソームへ誘導することを示す。
ＲＮＦ４３とＴＧＦ－βＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体（ＴβＲＩＩ）の強制的な二量体化により、ＴβＲＩＩのリソソーム局在と分解が誘導される
選択された細胞表面タンパク質を内在化およびリソソーム分解へと標的化するように膜貫通Ｅ３リガーゼを再方向づけするという概念の証明を示すために、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化システムを使用した。ＴβＲＩＩとＲＮＦ４３の両方のＣ末端にＦＫＢＰドメインとＦＲＢドメインのいずれかを融合させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で共発現させると、これらのタンパク質は相互作用しない（図２）。しかし、Ａ／Ｃ二量体化剤を添加すると、ＲＮＦ４３とＴβＲＩＩの共免疫沈降が誘導される（図２）。二量体化剤自体はＴβＲＩＩやＲＮＦ４３の安定性を阻害しない（図２、全細胞溶解物）。次に、ＲＮＦ４３とＴβＲＩＩとの強制的な相互作用が、ＴβＲＩＩの細胞内局在を変化させるかどうかを検討した。二量体化剤がない場合、ＴβＲＩＩはＲＮＦ４３の非存在時（図３Ａ）およびＲＮＦ４３の共発現時（図３Ｂ）のいずれにおいても、主に細胞膜に局在した。しかし、二量体化剤を添加すると、ＴβＲＩＩとＲＮＦ４３の両方の、リソソームマーカーＣＤ６３について陽性の核周辺の小胞群への再局在が強く誘導された（図３Ｃ）。これらの知見は、ＲＮＦ４３とＴβＲＩＩの強制的な二量体化が、増加したレベルのＴβＲＩＩをリソソームへ誘導することを示す。
【0400】
ＴβＲＩＩのリソソーム局在が促進された結果、機能的なＴβＲＩＩの量が減少したかどうかを決定するために、ウエスタンブロットを使用してタンパク質レベルを分析した。ＲＮＦ４３の発現自体はＴβＲＩＩの安定性に影響を与えないが、ＲＮＦ４３とＴβＲＩＩの二量体化が誘導されると、明らかにＴβＲＩＩのタンパク質量が低下した（図４）。これらの結果はともに、膜貫通Ｅ３リガーゼＲＮＦ４３と通常は無関係な膜貫通受容体ＴβＲＩＩの強制的な二量体化が、ＴβＲＩＩをリソソーム分解へと標的化することを示している。
【0401】
[実施例２]
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２ｍＭ ＵｌｔｒａＧｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ）、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２で培養した。トランスフェクションは、製造業者のプロトコールにしたがってＦｕＧＥＮＥ ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して実施した。
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２ｍＭ ＵｌｔｒａＧｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ）、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２で培養した。トランスフェクションは、製造業者のプロトコールにしたがってＦｕＧＥＮＥ ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して実施した。
【0402】
構築物および抗体
Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＴＧＦ－βＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体（ＴβＲＩＩ）および－Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ならびにＡｌｐｈａ－ｍｙｃ－ＲＮＦ４３およびＲＮＦ１６７はＱ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用したサブクローニングにより得た。すべての構築物は配列が確認された。免疫蛍光法（ＩＦ）には、以下の一次抗体を使用した：ウサギ抗Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびマウス抗Ｍｙｃ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ９Ｅ１０）。一次抗体は製造業者の使用説明書に従い希釈した。ＩＦに使用した二次抗体は１：３００で使用した（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＴＧＦ－βＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体（ＴβＲＩＩ）および－Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ならびにＡｌｐｈａ－ｍｙｃ－ＲＮＦ４３およびＲＮＦ１６７はＱ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用したサブクローニングにより得た。すべての構築物は配列が確認された。免疫蛍光法（ＩＦ）には、以下の一次抗体を使用した：ウサギ抗Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびマウス抗Ｍｙｃ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ９Ｅ１０）。一次抗体は製造業者の使用説明書に従い希釈した。ＩＦに使用した二次抗体は１：３００で使用した（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【0403】
免疫蛍光法および共焦点顕微鏡
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、２４ウェルプレートでラミニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をコートしたガラスカバースリップ上で増殖させた。一晩のトランスフェクション後、細胞を、１００ｎＭのｂｉ－ＶＨＨ（ＶＨＨ Ａｌｐｈａ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨＨ Ｅ６）での５時間の処置の前、およびその間（before and during a 5h treatment）、２０ｎＭ Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１時間インキュベートした。処置後、細胞を加温した培地で２回洗浄し、０．０５Ｍリン酸緩衝剤ｐＨ７．４中の４％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をＰＢＳ中に２％ＢＳＡと０．１％サポニンを含む緩衝剤で、室温（ＲＴ）で３０分間ブロックした。その後、細胞をブロッキング緩衝剤中で、ＦｌａｇまたはＭｙｃのいずれかに対する一次抗体とともに室温で１時間インキュベートし、続いて二次抗体とともに、室温で１時間インキュベートした。細胞をＰｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にマウントし、ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡で画像を取得した。画像はＩｍａｇｅＪで解析および処理した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、２４ウェルプレートでラミニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をコートしたガラスカバースリップ上で増殖させた。一晩のトランスフェクション後、細胞を、１００ｎＭのｂｉ－ＶＨＨ（ＶＨＨ Ａｌｐｈａ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨＨ Ｅ６）での５時間の処置の前、およびその間（before and during a 5h treatment）、２０ｎＭ Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１時間インキュベートした。処置後、細胞を加温した培地で２回洗浄し、０．０５Ｍリン酸緩衝剤ｐＨ７．４中の４％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をＰＢＳ中に２％ＢＳＡと０．１％サポニンを含む緩衝剤で、室温（ＲＴ）で３０分間ブロックした。その後、細胞をブロッキング緩衝剤中で、ＦｌａｇまたはＭｙｃのいずれかに対する一次抗体とともに室温で１時間インキュベートし、続いて二次抗体とともに、室温で１時間インキュベートした。細胞をＰｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にマウントし、ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡で画像を取得した。画像はＩｍａｇｅＪで解析および処理した。
【0404】
結果および考察
ＲＮＦ４３とＲＮＦ１６７は、二重特異性ＶＨＨを使用した強制的な二量体化により、ＴβＲＩＩとＥＧＦＲの細胞表面での除去を誘導する。
本発明のヘテロ二官能性分子の機能性をさらに確認するために、細胞外領域のＶＨＨが媒介する二量体化により、選択した受容体をＥ３リガーゼで標的化した。この目的のために、エピトープタグを標的（Ｅ６タグ）とＥ３リガーゼ（Ａｌｐｈａタグ）の両方の細胞外ドメインに融合させた。これらのエピトープタグをＶＨＨが認識するように選択し（Goetzke et al., 2019, Nature Communications, 10(1), 1-12; Ling et al., 2019, Molecular Immunology, 114(July), 513-523）、この２つのエピトープに対する二重特異性ＶＨＨ（ｂｉ－ＶＨＨ）を作製し、ＶＨＨが媒介する二量体化を可能にした。また、タンパク質の局在の変化を決定するために、Ｅ３リガーゼにはＭｙｃエピトープタグを、受容体にはＦｌａｇエピトープタグを組み込んだ。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で共発現させたところ、どの受容体もＥ３リガーゼのいずれとも共局在しなかった。Ｅ３リガーゼは主に細胞内コンパートメントに、受容体は主に細胞膜に局在した（データは示していない）。しかし、ｂｉ－ＶＨＨで５時間処置すると、ＲＮＦ４３とＲＮＦ１６７は、いずれも、ＴβＲＩＩおよびＥＧＦＲの細胞膜からの除去を誘導した。さらに、リソソームのターンオーバーを阻害するバフィロマイシン処置細胞では、内在化したタンパク質が核周辺領域に共クラスター化しており、Ｅ３リガーゼとその標的が後期エンドソーム／リソソーム構造に蓄積していることが示された（図５Ａ～Ｄ）。これらの知見は、ｂｉ－ＶＨＨのようなヘテロ二官能性分子を使用して、膜貫通Ｅ３リガーゼを、選択した膜貫通受容体と意図的に二量体化させ、それによって細胞表面からの受容体除去を誘導することができることを示している。
ＲＮＦ４３とＲＮＦ１６７は、二重特異性ＶＨＨを使用した強制的な二量体化により、ＴβＲＩＩとＥＧＦＲの細胞表面での除去を誘導する。
本発明のヘテロ二官能性分子の機能性をさらに確認するために、細胞外領域のＶＨＨが媒介する二量体化により、選択した受容体をＥ３リガーゼで標的化した。この目的のために、エピトープタグを標的（Ｅ６タグ）とＥ３リガーゼ（Ａｌｐｈａタグ）の両方の細胞外ドメインに融合させた。これらのエピトープタグをＶＨＨが認識するように選択し（Goetzke et al., 2019, Nature Communications, 10(1), 1-12; Ling et al., 2019, Molecular Immunology, 114(July), 513-523）、この２つのエピトープに対する二重特異性ＶＨＨ（ｂｉ－ＶＨＨ）を作製し、ＶＨＨが媒介する二量体化を可能にした。また、タンパク質の局在の変化を決定するために、Ｅ３リガーゼにはＭｙｃエピトープタグを、受容体にはＦｌａｇエピトープタグを組み込んだ。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で共発現させたところ、どの受容体もＥ３リガーゼのいずれとも共局在しなかった。Ｅ３リガーゼは主に細胞内コンパートメントに、受容体は主に細胞膜に局在した（データは示していない）。しかし、ｂｉ－ＶＨＨで５時間処置すると、ＲＮＦ４３とＲＮＦ１６７は、いずれも、ＴβＲＩＩおよびＥＧＦＲの細胞膜からの除去を誘導した。さらに、リソソームのターンオーバーを阻害するバフィロマイシン処置細胞では、内在化したタンパク質が核周辺領域に共クラスター化しており、Ｅ３リガーゼとその標的が後期エンドソーム／リソソーム構造に蓄積していることが示された（図５Ａ～Ｄ）。これらの知見は、ｂｉ－ＶＨＨのようなヘテロ二官能性分子を使用して、膜貫通Ｅ３リガーゼを、選択した膜貫通受容体と意図的に二量体化させ、それによって細胞表面からの受容体除去を誘導することができることを示している。
【0405】
[実施例３]
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２ｍＭ ＵｌｔｒａＧｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ）、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２で培養した。トランスフェクションは、製造業者のプロトコールにしたがってＦｕＧＥＮＥ ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施した。
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２ｍＭ ＵｌｔｒａＧｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ）、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２で培養した。トランスフェクションは、製造業者のプロトコールにしたがってＦｕＧＥＮＥ ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施した。
【0406】
構築物および抗体
Ｅ６－Ｆｌａｇ－細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）、受容体型チロシン－タンパク質キナーゼＦＬＴ３（ＦＬＴ－３）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）およびプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）ならびにＡｌｐｈａ－ｍｙｃ－ＲＮＦ４３、ＲＮＦ１２８、ＲＮＦ１３０およびＲＮＦ１６７はＱ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用したサブクローニングにより得た。すべての構築物は配列が確認された。免疫蛍光法（ＩＦ）には、以下の一次抗体を使用した：ウサギ抗Ｆｌａｇまたはマウス抗Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。一次抗体は製造業者の使用説明書に従い希釈した。ＩＦに使用した二次抗体は１：３００で使用した（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
Ｅ６－Ｆｌａｇ－細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）、受容体型チロシン－タンパク質キナーゼＦＬＴ３（ＦＬＴ－３）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）およびプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）ならびにＡｌｐｈａ－ｍｙｃ－ＲＮＦ４３、ＲＮＦ１２８、ＲＮＦ１３０およびＲＮＦ１６７はＱ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用したサブクローニングにより得た。すべての構築物は配列が確認された。免疫蛍光法（ＩＦ）には、以下の一次抗体を使用した：ウサギ抗Ｆｌａｇまたはマウス抗Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。一次抗体は製造業者の使用説明書に従い希釈した。ＩＦに使用した二次抗体は１：３００で使用した（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【0407】
免疫蛍光法および共焦点顕微鏡
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、２４ウェルプレートでラミニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をコートしたガラスカバースリップ上で増殖させた。トランスフェクションの６時間後、細胞を５０ｎＭのｂｉ－ＶＨＨ（ＶＨＨ Ａｌｐｈａ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨＨ Ｅ６）とともに一晩インキュベートした。処置後、細胞を加温した培地で２回洗浄し、０．０５Ｍリン酸緩衝剤ｐＨ７．４中の４％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をＰＢＳ中に２％ＢＳＡを含む緩衝剤で、室温（ＲＴ）で３０分間ブロックした。その後、細胞をブロッキング緩衝剤中で、Ｆｌａｇに対する一次抗体とともに室温で１時間、次いで二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。細胞はＰｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にマウントし、５倍対物レンズを使用したＬＳＭ７００共焦点顕微鏡、または２０倍対物レンズを使用したＥＶＯＳ－Ｍ５０００顕微鏡で画像を取得した。画像はＩｍａｇｅＪで解析および処理した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、２４ウェルプレートでラミニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をコートしたガラスカバースリップ上で増殖させた。トランスフェクションの６時間後、細胞を５０ｎＭのｂｉ－ＶＨＨ（ＶＨＨ Ａｌｐｈａ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨＨ Ｅ６）とともに一晩インキュベートした。処置後、細胞を加温した培地で２回洗浄し、０．０５Ｍリン酸緩衝剤ｐＨ７．４中の４％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をＰＢＳ中に２％ＢＳＡを含む緩衝剤で、室温（ＲＴ）で３０分間ブロックした。その後、細胞をブロッキング緩衝剤中で、Ｆｌａｇに対する一次抗体とともに室温で１時間、次いで二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。細胞はＰｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にマウントし、５倍対物レンズを使用したＬＳＭ７００共焦点顕微鏡、または２０倍対物レンズを使用したＥＶＯＳ－Ｍ５０００顕微鏡で画像を取得した。画像はＩｍａｇｅＪで解析および処理した。
【0408】
結果および考察
Ｅ３リガーゼと標的の特異的な組合せにより、二重特異性ＶＨＨを使用した強制的な二量体化により、標的の表面除去が可能となる。
Ｅ３リガーゼと受容体の組合せのさらなる候補をスクリーニングするために、以前に作製した構築物に加えて、Ａｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１２８、Ａｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１３０、Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＣＴＬＡ－４、Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＦＬＴ－３、Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＰＤ－１およびＥ６－Ｆｌａｇ－ＰＤ－Ｌ１を作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で共発現させると、ＣＴＬＡ－４、ＦＬＴ－３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１のすべてが細胞表面に局在した。ｂｉ－ＶＨＨで一晩処置すると、以下のＥ３－標的の組合せで表面の標的が除去されるようになる：ＣＴＬＡ－４とＲＮＦ１６７；ＦＬＴ－３とＲＮＦ４３、ＲＮＦ１２８またはＲＮＦ１６７、ＰＤ－１とＲＮＦ１２８、ＲＮＦ１３０またはＲＮＦ１６７、およびＰＤ－Ｌ１とＲＮＦ４３、ＲＮＦ１２８またはＲＮＦ１３０（図６Ａ～Ｄ）。これらの知見は、様々な膜貫通Ｅ３リガーゼを、選択した膜貫通受容体と意図的に二量体化させ、それによって細胞表面からこれらの受容体の除去を誘導するための、ｂｉ－ＶＨＨのようなヘテロ二官能性分子の使用の範囲を拡大するものである。また、これらの知見は、すべての組合せが有効であるとは限らないことを強調している。
Ｅ３リガーゼと標的の特異的な組合せにより、二重特異性ＶＨＨを使用した強制的な二量体化により、標的の表面除去が可能となる。
Ｅ３リガーゼと受容体の組合せのさらなる候補をスクリーニングするために、以前に作製した構築物に加えて、Ａｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１２８、Ａｌｐｈａ－Ｍｙｃ－ＲＮＦ１３０、Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＣＴＬＡ－４、Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＦＬＴ－３、Ｅ６－Ｆｌａｇ－ＰＤ－１およびＥ６－Ｆｌａｇ－ＰＤ－Ｌ１を作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で共発現させると、ＣＴＬＡ－４、ＦＬＴ－３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１のすべてが細胞表面に局在した。ｂｉ－ＶＨＨで一晩処置すると、以下のＥ３－標的の組合せで表面の標的が除去されるようになる：ＣＴＬＡ－４とＲＮＦ１６７；ＦＬＴ－３とＲＮＦ４３、ＲＮＦ１２８またはＲＮＦ１６７、ＰＤ－１とＲＮＦ１２８、ＲＮＦ１３０またはＲＮＦ１６７、およびＰＤ－Ｌ１とＲＮＦ４３、ＲＮＦ１２８またはＲＮＦ１３０（図６Ａ～Ｄ）。これらの知見は、様々な膜貫通Ｅ３リガーゼを、選択した膜貫通受容体と意図的に二量体化させ、それによって細胞表面からこれらの受容体の除去を誘導するための、ｂｉ－ＶＨＨのようなヘテロ二官能性分子の使用の範囲を拡大するものである。また、これらの知見は、すべての組合せが有効であるとは限らないことを強調している。
【0409】
[実施例４]
上記のスクリーニングから得られた有望な組合せを生理的な状況で検証するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、内因性タグ付きＥ３リガーゼおよび標的を発現するがん細胞系を作製する。本発明者らはガイドＲＮＡとＡｌｐｈａ－ＭｙｃまたはＥ６－ＦｌａｇタグのドナーＤＮＡとを組み合わせて使用し、Ｅ３リガーゼまたは標的の内因性遺伝子座のシグナルペプチド（ＳＰ）と最初の成熟アミノ酸のコード配列との間にこれらのタグを挿入することを促進する（図７Ａ）。これらの細胞系を使用して、ｂｉ－ＶＨＨとの強制的な二量体化による細胞表面からの内因性標的の除去を顕微鏡法またはウエスタンブロッティングのいずれかで評価する（図７Ｂ）。
上記のスクリーニングから得られた有望な組合せを生理的な状況で検証するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、内因性タグ付きＥ３リガーゼおよび標的を発現するがん細胞系を作製する。本発明者らはガイドＲＮＡとＡｌｐｈａ－ＭｙｃまたはＥ６－ＦｌａｇタグのドナーＤＮＡとを組み合わせて使用し、Ｅ３リガーゼまたは標的の内因性遺伝子座のシグナルペプチド（ＳＰ）と最初の成熟アミノ酸のコード配列との間にこれらのタグを挿入することを促進する（図７Ａ）。これらの細胞系を使用して、ｂｉ－ＶＨＨとの強制的な二量体化による細胞表面からの内因性標的の除去を顕微鏡法またはウエスタンブロッティングのいずれかで評価する（図７Ｂ）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【配列表】
【国際調査報告】