特表 2023-517053 ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-21

(54)【発明の名称】ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20230414BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230414BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z ZNA

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022553632

(86)(22)【出願日】2021-03-03

(85)【翻訳文提出日】2022-11-02

(86)【国際出願番号】 US2021020664

(87)【国際公開番号】W WO2021178534

(87)【国際公開日】2021-09-10

(31)【優先権主張番号】62/985,602

(32)【優先日】2020-03-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】17/100,289

(32)【優先日】2020-11-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/989,967

(32)【優先日】2020-03-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522352823

【氏名又は名称】ハッケンサック・メリディアン・ヘルス，インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＨＡＣＫＥＮＳＡＣＫ ＭＥＲＩＤＩＡＮ ＨＥＡＬＴＨ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(72)【発明者】

【氏名】ヂァオ，イェンアン

(72)【発明者】

【氏名】パーリン，デイヴィッド・エス．

(72)【発明者】

【氏名】パーク，スティーブン

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ10

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QX02

(57)【要約】

ＳＡＲＳ様コロナウイルスおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの汎用的検出のための検出パネルならびに検出パネルを使用するための方法を提供する。検出パネルは、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ（「ＣＤＩ」）検出パネル（ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査）としても知られることがあり、対照試料および臨床検体中のヒトＲＮａｓｅＰ遺伝子（ＲＰ）を検出するために、検出パネルにさらなるプライマー／プローブセットをも含み得る。検出パネルは、Ｅ遺伝子（エンベロープ）検出アッセイを使用するＳＡＲＳ様コロナウイルスの汎用的検出、およびＮ２（ヌクレオカプシド）検出アッセイを使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特異的検出の両方のために設計する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）新規コロナウイルスを含むことが疑われる試料を採取するステップと、
ｂ）Ｎ２アッセイを使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子における一領域について前記試料の少なくとも第１の部分を分析するステップと、
ｃ）（Ｅ）アッセイを使用してＳＡＲＳコロナウイルスエンベロープ（Ｅ）遺伝子の汎用的検出について前記試料の少なくとも第２の部分を分析するステップと、
ｄ）ヒトＲＰＰ３０アデノウイルス（Ｈ－ＲＰＰ３０またはＲＰ）アッセイを使用してヒトＲＮａｓｅＰ（ＲＰ）を検出するために、前記試料の少なくとも第３の部分を分析するステップと、
ｅ）前記Ｎ２、ＥおよびＲＰアッセイの結果を複合および評価し、前記新規コロナウイルスの存在または非存在を判定するステップと
を含む、前記試料中の新規コロナウイルスである重度急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣＯＶＩＤ－１９）を検出するための方法。

【請求項2】

前記Ｎ２アッセイが、新規コロナウイルス（「ｎＣｏＶ」）特異的である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記Ｅアッセイが、すべての重度急性呼吸器症候群（「ＳＡＲＳ」）関連コロナウイルスに対して汎用化されている、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ＲＰアッセイが内部対照である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記試料を、鼻咽頭もしくは中咽頭もしくは前鼻もしくは中鼻甲介もしくは上気道の検体、または血液、尿もしくは便、の少なくとも１つから採取する、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

複数のアッセイのそれぞれのためのマスターミックスを調製するステップと、ここで、前記複数のアッセイが、新規コロナウイルス（「ｎＣｏＶ」）特異的である第１のアッセイ、重度急性呼吸器症候群（「ＳＡＲＳ」）関連コロナウイルスに対して汎用化されている第２のアッセイ、および内部対照である第３のアッセイを含み、
前記マスターミックス１５μＬを複数のウェルのそれぞれに添加するステップと、ここで、前記ウェルがプレートマップにより定義され、
前記プレートマップに定義されるようにリボ核酸（「ＲＮＡ」）５μＬを各ウェルに加えるステップと、
前記試料をｍｉｃ ｑＰＣＲサイクラーに移すステップと、
前記ｍｉｃサイクラーを実行するステップと
を含む、前記試料中の新規コロナウイルス、重度急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣＯＶＩＤ－１９）を検出するための方法。

【請求項7】

前記第１、第２および第３のアッセイが、それぞれＮ２アッセイおよびＥアッセイおよびＲＰアッセイである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＲＰアッセイおよびＮ２アッセイのためのマスターミックスが、（１）２×ワンステップＲＴ－ＰＣＲバッファーＩＩＩ、（２）ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ＨＳ（５Ｕ／μｌ）、（３）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ酵素ミックスＩＩ、（４）ＲＮａｓｅフリーｄＨ２Ｏ、および（５）混合したプライマー／プローブミックスを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ＲＰアッセイおよび前記Ｎ２アッセイのためのマスターミックスが、２×ワンステップＲＴ－ＰＣＲバッファーＩＩＩを１０μＬ／反応、ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ＨＳ（５Ｕ／μｌ）を０．４μＬ／反応、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ酵素ミックスＩＩを０．４μＬ／反応、ＲＮａｓｅフリーｄＨ２Ｏを３μＬ／反応、および混合したプライマー／プローブミックスを１．２μＬ／反応を少なくとも含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記Ｅアッセイのためのマスターミックスが、（１）２×ワンステップＲＴ－ＰＣＲバッファーＩＩＩ、（２）ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ＨＳ（５Ｕ／μｌ）、（３）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ酵素ミックスＩＩ、（４）ＲＮａｓｅフリーｄＨ２Ｏ、および（５）Ｅプローブミックスを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記Ｅアッセイのためのマスターミックスが、２×ワンステップＲＴ－ＰＣＲバッファーＩＩＩを１０μＬ／反応、ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ＨＳ（５Ｕ／μｌ）を０．４μＬ／反応、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ酵素ミックスＩＩを０．４μＬ／反応、ＲＮａｓｅフリーｄＨ２Ｏを１．８μＬ／反応、およびＥプローブミックスを２．４μＬ／反応を少なくとも含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記プレートマップが、以下の表

【表1】

に従い、表中、Ｎ２、ＥおよびＲＰが、前記複数のアッセイであり、
Ａ～Ｈが、ウェルの垂直方向の位置設定であり、
１～６が、ウェルの水平方向の位置設定であり、
Ｐ１～Ｐ１２が、混合したプライマー／プローブミックスであり、
ＨＳＣが、ヒトＲＮＡ抽出物であり、
ＮＥＣが、陰性抽出対照であり、
ＰＣが、陽性対照であり、
ＮＴＣが、鋳型なし対照である、請求項６に記載の方法。

【請求項13】

ＣＤＩ－ＣＯＶＩＤ１９アッセイを使用して新たな実行を創出するステップと、
試料の種類を選択するステップと、ここで、前記試料の種類が（１）不明、（２）ＮＴＣまたは（３）陽性対照であり、
群を前記試料に割り当てるステップと、ここで、前記群が（１）Ｎ２、（２）Ｅまたは（３）ＲＰであり、
ｍｉｃサイクルを実行するステップと
をさらに含む、請求項６に記載の方法。

【請求項14】

前記ＣＤＩ－ＣＯＶＩＤ－１９アッセイが熱サイクル条件を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記熱サイクル条件が第１の段階および第２の段階を含み、前記第１の段階が、４２℃で５分間を１サイクルの実行であり、前記第２の段階が、９５℃で５秒間および５８℃で２０秒間を４５サイクルの実行である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）検査を使用するステップと、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド遺伝子（Ｎ２）における１つの領域を検出するためのプライマーおよびプローブの１つのセットを使用するステップと、
ＳＡＲＳ様コロナウイルス（Ｅ）の汎用的検出のためのプライマーおよびプローブの１つのセットを使用するステップと、
臨床試料中のヒトＲＮａｓｅＰ（ＲＰ）を検出するためのプライマーおよびプローブの１つのセットを使用するステップと
を含む、ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査を提供するステップを含む、新規コロナウイルス、重度急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣＯＶＩＤ－１９）を検出するための方法。

【請求項17】

前記ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査が、抽出物およびアッセイ試薬の夾雑を確認する鋳型なし陰性対照（ＮＴＣ）をさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査が、適切なアッセイ設定およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試薬完全性を検証する２つの陽性対照をさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記２つの陽性対照が、ｒＲＴ－ＰＣＲ Ｎ２アッセイおよびＥアッセイの陽性対照のためのウイルスゲノムＲＮＡ、ならびにＲＰアッセイの陽性対照（ＲＰＰＣ）のためのＤＮＡ陽性対照である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査が、１プレートあたり陽性１つ、陰性１つおよび抽出対照１つを含む単一リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）検査において実行され、前記臨床試料のそれぞれが内部抽出対照を含む、請求項１６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２０年３月５日出願の米国特許仮出願第６２／９８５，６０２号および２０２０年３月１６日出願の第６２／９８９，９６７号の優先権を主張する、２０２０年１１月２０日出願の米国特許出願第１７／１００，２８９号に関し、その優先権を主張し、これらの開示は、参照により本明細書の一部をなすものとする。

【0002】

本出願は、ＳＡＲＳ様コロナウイルスおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの汎用的検出のための検出パネルならびに検出パネルを使用するための方法に関する。本出願の検出パネルは、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ（「ＣＤＩ」）検出パネル（ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査）としても知られることがあり、対照試料および臨床検体中のヒトＲＮａｓｅＰ遺伝子（ＲＰ）を検出するために、検出パネルにさらなるプライマー／プローブセットをも含み得る。検出パネルは、Ｅ遺伝子（エンベロープ）検出アッセイを使用するＳＡＲＳ様コロナウイルスの汎用的検出、およびＮ２（ヌクレオカプシド）検出アッセイを使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特異的検出の両方のために設計される。

【背景技術】

【0003】

中国湖北省武漢市において新規のコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）により引き起こされた肺炎のアウトブレイクは、２０１９年１２月３１日に世界保健機構（ＷＨＯ）に最初に報告された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の発生および世界中の多数の地域への急速な伝播は、研究室だけでなく医療および一般社会の他の分野における準備および対応を必要とした。ウイルスの検出に特異的かつ高感度なアッセイが利用可能であることは、症例の的確な診断、アウトブレイクの程度の評価、介入戦略の監視および調査研究に必要不可欠である。ウイルスの検出に使用されるアッセイは、ヒト核酸と交差反応するＮ３（ヌクレオカプシド）検出アッセイ、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的であると考えられるＮ１（ヌクレオカプシド）検出アッセイを含む。しかし、Ｎ１アッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとわずかに交差反応し、不的確な結果を生じることが判明した。

【発明の概要】

【0004】

試料中の新規コロナウイルス、重度急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣＯＶＩＤ－１９）を検出するための方法を提供する。方法は、新規コロナウイルスを含むことが疑われる試料を採取するステップと、Ｎ２アッセイを使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子における一領域について試料の少なくとも第１の部分を分析するステップと、Ｅアッセイを使用してＳＡＲＳコロナウイルス（Ｅ）の汎用的検出について試料の少なくとも第２の部分を分析するステップと、ヒトＲＰＰ３０（Ｈ－ＲＰＰ３０またはＲＰ）アッセイを使用してヒトＲＮａｓｅＰ（ＲＰ）を検出するために、試料の少なくとも第３の部分を分析するステップとを含む。また、方法は、Ｎ２、ＥおよびＲＰアッセイの結果を複合および評価し、新規コロナウイルスの存在または非存在を判定するステップを含む。Ｎ２アッセイは、新規コロナウイルス（「ｎＣｏＶ」）特異的であり、Ｅアッセイは、すべての重度急性呼吸器症候群（「ＳＡＲＳ」）関連コロナウイルスに対して汎用化されており、ＲＰアッセイは、内部対照である。試料は、鼻咽頭、中咽頭、前鼻、中鼻甲介、上気道検体または血液、尿もしくは便の少なくとも１つから採取する。

【0005】

本出願の別の実施形態では、試料中の新規コロナウイルス、重度急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣＯＶＩＤ－１９）を検出するための方法は、新規コロナウイルス（「ｎＣｏＶ」）特異的である第１のアッセイ、重度急性呼吸器症候群（「ＳＡＲＳ」）関連コロナウイルスに対して汎用化されている第２のアッセイ、および内部対照である第３のアッセイを含む複数のアッセイのそれぞれのためのマスターミックスを調製するステップを含む。好ましい実施形態では、上記方法はまた、一定量のマスターミックス（例えば、１５μＬ）を複数のウェルのそれぞれに添加するステップと、ここで、ウェルがプレートマップにより定義され；プレートマップに定義するように一定量のリボ核酸（「ＲＮＡ」）（例えば、５μＬ）を各ウェルに加えるステップとを含む。また、上記方法は、磁気誘導サイクラー（「ｍｉｃ」）、例えば、Ｍｉｃ ｑＰＣＲサイクラー（ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍｓ社により販売）に試料を移すステップと、ｍｉｃサイクラーを実行するステップとを含む。第１、第２および第３のアッセイは、それぞれＮ２アッセイおよびＥアッセイおよびＲＰアッセイである。ＲＰアッセイおよびＮ２アッセイのためのマスターミックスは、（１）２×ワンステップＲＴ－ＰＣＲバッファーＩＩＩ、（２）ＴａｋａＲａ ＥｘＴａｑ ＨＳ（５Ｕ／μｌ）、（３）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ酵素ミックスＩＩ、（４）ＲＮａｓｅフリーｄＨ２Ｏおよび（５）混合したプライマー／プローブミックスを含み得る。また、ＲＰアッセイおよびＮ２アッセイのためのマスターミックスは、２×ワンステップＲＴ－ＰＣＲバッファーＩＩＩを１０μＬ／反応、ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ＨＳ（５Ｕ／μｌ）を０．４μＬ／反応、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ酵素ミックスＩＩを０．４μＬ／反応、ＲＮａｓｅフリーｄＨ２Ｏを３μＬ／反応および混合したプライマー／プローブミックスを１．２μＬ／反応を少なくとも含み得る。Ｅアッセイのためのマスターミックスは、（１）２×ワンステップＲＴ－ＰＣＲバッファーＩＩＩ、（２）ＴａｋａＲａ ＥｘＴａｑ ＨＳ（５Ｕ／μｌ）、（３）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ酵素ミックスＩＩ、（４）ＲＮａｓｅフリーｄＨ２Ｏおよび（５）Ｅプローブミックスを含み得る。また、Ｅアッセイのためのマスターミックスは、少なくとも２×ワンステップＲＴ－ＰＣＲバッファーＩＩＩを１０μＬ／反応、ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ＨＳ（５Ｕ／μｌ）を０．４μＬ／反応、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ酵素ミックスＩＩを０．４μＬ／反応、ＲＮａｓｅフリーｄＨ２Ｏを１．８μＬ／反応およびＥプローブミックスを２．４μＬ／反応を含み得る。

【0006】

また、方法は、ＣＤＩ－ＣＯＶＩＤ１９アッセイを使用して新たなランを創出するステップと、試料の種類を選択するステップであって、試料の種類が（１）不明、（２）ＮＴＣまたは（３）陽性対照である、ステップと、群を試料に割り当てるステップであって、群が（１）Ｎ２、（２）Ｅまたは（３）ＲＰである、ステップ、およびｍｉｃサイクルを実行するステップとを含み得る。ＣＤＩ－ＣＯＶＩＤ１９アッセイは、熱サイクル条件を含み得る。熱サイクル条件は、第１段階および第２段階を含んでもよく、第１の段階は、４２℃で５分間を１サイクル実行し、第２の段階は、９５℃で５秒間および５８℃で２０秒間を４５サイクル実行する。

【0007】

本出願の別の実施形態では、新規コロナウイルスである重度急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣＯＶＩＤ－１９）を検出するための方法は、ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査を提供するステップを含む。ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査は、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）検査を使用するステップと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子における１つの領域を検出するためのプライマーおよびプローブの第１のセット、ＳＡＲＳ様コロナウイルス（Ｅ）の汎用的検出のためのプライマーおよびプローブの第２のセット、ならびに臨床試料中のヒトＲＮａｓｅＰ（ＲＰ）を検出するためのプライマーおよびプローブの第３のセットを使用するステップとを含み得る。検査は、シングルプレックス形式で実行するか、または単一反応および増幅設定に多重化し得る。また、ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査は、抽出物およびアッセイ試薬の夾雑を確認する鋳型なし陰性対照（ＮＴＣ）を含み得る。ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査は、適切なアッセイ設定およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試薬完全性を検証する２つの陽性対照を含み得る。２つの陽性対照は、例えば、ｒＲＴ－ＰＣＲ Ｎ２アッセイおよびＥアッセイの陽性対照のためのウイルスゲノムＲＮＡ、ならびにＲＰアッセイの陽性対照（ＲＰＰＣ）のためのＤＮＡ陽性対照であり得る。ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査は、１プレートあたり陽性１つ、陰性１つおよび抽出対照１つを含む単一リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）検査において実行してもよく、臨床試料のそれぞれは、内部対照を含む。

【発明を実施するための形態】

【0008】

「試料」の用語は、本明細書において使用する場合、対象（例えば、ヒト、例えば、感染が疑われる人）から採取する任意の試料を指し、目的の１つまたは複数の核酸を含む。「核酸」の用語は、本明細書において使用する場合、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）の両方を含む全核酸を指す。「反応」の用語は、本明細書において使用する場合、目的の核酸の存在または非存在を示す化学的、酵素的または物理的作用を含む任意のプロセスを指す。「反応」の例は、増幅反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。「ウェル」の用語は、本明細書において使用する場合、限局した構造内の所定の位置、例えば、ウェル形のバイアル、セルまたはＰＣＲアレイ内のチャンバーにおける反応を指す。

【0009】

本明細書において使用する場合、「検出パネル」の用語は、目的の特定の核酸の存在または非存在を検出するための少なくとも２つのアッセイを含むパネルを指す。「検体」の用語は、本明細書において使用する場合、試料に使用する対象の鼻洗浄液、吸引物または汎用培地もしくはウイルス輸送培地のスワブから得られる。「ｍｉｃサイクラー」の用語は、本明細書において使用する場合、当業者が理解しているようなｍｉｃ ｑＰＣＲサイクラーを指す。

【0010】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイまたはＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査としても知られる本出願の検出パネルは、リアルタイム転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）検査である。検出パネルは、ＣＯＶＩＤ－１９が疑われる個人の上気道検体（例えば、鼻咽頭もしくは中咽頭スワブ、痰、下気道吸引物、気管支肺胞洗浄液および鼻咽頭洗浄液／吸引物または鼻吸引物）、唾液、血清、尿および便試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の核酸の推定的な定量的検出のために使用し得る。検出パネルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを含み得る。特には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーおよびプローブのセットは、公共保健機関のガイドラインによる検査の推奨を受けて、患者の上気道検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＲＮＡを検出するように設計し得る。一実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、ウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子およびエンベロープタンパク質（Ｅ）遺伝子の領域から選択され得る。したがって、パネルは、Ｎ２アッセイおよびＥアッセイを含み得る。検出パネルでは、ＥアッセイによりＳＡＲＳ様コロナウイルスを検出してもよく、一方、Ｎ２アッセイによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的に検出し得る。また、検出パネルは、ヒトＲＮａｓｅＰ遺伝子を標的とする内部対照ＲＮａｓｅＰ遺伝子（ＲＰ）アッセイを含み得る。

【0011】

本出願のパネルのための試料において使用する上気道検体は、鼻洗浄液、吸引物または汎用培地もしくはウイルス輸送培地のスワブから得られ得る。特には、上気道検体は、鼻咽頭洗浄液／吸引物、鼻吸引物、鼻咽頭スワブ、中咽頭スワブ、前鼻スワブ、中鼻甲介鼻スワブまたは気管吸引物から得られ得るが、これらに限定されない。また、他の検体、例えば、便、唾液または尿は、ウイルスの検出に適する供給源として考えられ得る。

【0012】

検出パネルの結果は、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡの推定的検出および同定のためのものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡは、感染の初期および急性期の呼吸器検体において一般に検出可能であるが、疾患増悪のすべての段階で検出することができる。陽性結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による活動性感染を示すが、細菌感染または他のウイルスとの同時感染を除外しない可能性を有する。検出された病原体は、呼吸器疾患の唯一の原因ではない可能性を有する。

【0013】

パネルの陰性結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が排除されない可能性を有し、患者管理における判断の唯一の根拠として使用するべきではない。陰性結果は、臨床所見、患者病歴および疫学情報と複合して患者管理を決定するべきである。

【0014】

パネルは、分子診断学の開発における経験を有するＣＬＩＡ認定高複雑度研究室による使用のためのものであってもよく、食品医薬品局の緊急使用許可下における使用に限定されるものである。

【0015】

ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査は、ｍｉｃＰＣＲソフトウェアｖ２．８．０または最新バージョンとともにＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍｓ社Ｍｉｃ ｑＰＣＲサイクラーを用いて使用し得るが、他の検査装置もＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査の利用に適し得る。

【0016】

表１では、検出パネルにおけるアッセイおよびそれぞれが有する目的を記載する。また、表１は、各アッセイに含まれるプライマーおよびプローブならびにこれらのそれぞれの機能を含む。各プライマーおよびプローブの配列は、配列番号１～９で表す。

【0017】

【表1】

【0018】

また、検出パネルを使用するための方法を提供する。本発明の検出パネルによる検査を実行するために、試料の核酸抽出を実施し得る。一実施形態では、核酸抽出は、ＲＮＡ抽出機器、例えば、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ２４システム（Ｒｏｃｈｅ社）により達成してもよく、ここで、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む全核酸を試料、例えば、上気道検体から単離および精製し得る。ＲＮＡ試料を上気道検体から抽出した後、これらは使用まで－８０℃で保存すべきである。

【0019】

検出パネルにおいて使用するアッセイは、次の説明に従って準備し得る。検出パネルでは、ＲＮＡ試料は、３つのワンステップＲＴ－ＰＣＲアッセイにおいて検査し得る。３つのワンステップＲＴ－ＰＣＲアッセイは、１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的Ｎ２アッセイと、２）総ＳＡＲＳ関連コロナウイルス保存的Ｅアッセイと、３）ヒトＲＮａｓｅＰ遺伝子を標的とする内部対照ＲＰアッセイとを含み得る。本出願の発明者らは、３つすべてのアッセイを含むことにより、試料中のウイルスの存在の検出が向上することを見出した。アッセイおよびプレート設定は、さらに詳細に以下に記載する。

【0020】

ＲＴ－ＰＣＲは、ソフトウェアｍｉｃＰＣＲｖ２．８．０とともにｍｉｃｑＰＣＲサイクラー（ｂｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍｓ社）上で実行する。ソフトウェアの新たなバージョンは、下位互換性を有する。他のリアルタイムプラットフォームも検出に使用することができる。ＲＴ－ＰＣＲを実行する場合、プローブを、フォワードおよびリバースプライマー間に位置する特異的標的配列にアニーリングし得る。ＰＣＲサイクルの伸長段階において、Ｔａｑポリメラーゼの５‘ヌクレアーゼ活性によりプローブが分解されて、レポーター色素が消光色素から分離することにより、蛍光シグナルが生成される。各サイクルにより、さらなるレポーター色素分子がそれぞれのプローブから切断されて、蛍光強度が上昇する。ｍｉｃｑＰＣＲサイクラーにおいて使用するソフトウェアにより、各ＰＣＲサイクルにおける蛍光強度を監視し得る。

【0021】

陽性対照（ｎＣｏＶＰＣ）は、診断パネルに含まれ得る。陽性対照（ｎＣｏＶＰＣ）は、ウイルスゲノムＲＮＡであってもよく、例えば、ＢＥＩリソースから入手してもよく（Ｃａｔ＃ＮＲ－５２２８５）、ｒＲＴ－ＰＣＲ Ｎ２およびＥアッセイに使用し得る。また、ウイルスゲノムＲＮＡは、検出限界（ＬｏＤ）評価において使用し得る。ウイルスゲノムＲＮＡ対照は、１反応あたり１００コピーで使用し得る。また、パネルの陽性対照は、ＲＰアッセイのためのＤＮＡ陽性対照、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ社から購入するＣＤＣ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２診断パネル（Ｃａｔ＃７０３８－Ｐｏｓ）を含み得る。鋳型なし対照（ＮＴＣ）もパネルに含まれ得る。ＮＴＣは、滅菌ヌクレアーゼフリー水を含み得るが、これに限定されない。ＮＴＣは、少量のアリコートとして調製してもよく、例えば、各アリコートは、約１ｍｌであってもよく、少なくとも５０のアリコートを調製することができる。また、ＮＴＣは、検体抽出またはプレート設定中に生じ得る夾雑を調べるために含まれ得る。陽性対照およびＮＴＣの両方は、各実行(ラン（ｒｕｎ））において含まなければならない。

【0022】

ヒト検体抽出対照（ＨＳＣ）も、パネルに含まれ得る。ＨＳＣは、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ社から購入可能な非感染試料のヒトＲＮＡ抽出物（Ｃａｔ＃７０３８－Ｈｓｃ）であり得る。ＨＳＣは、各抽出バッチにおいて抽出対照として使用し得る。

【0023】

核酸は、標的試料、ヒト検体対照および陰性抽出対照についての各実行（ラン）において、ＲＮＡ抽出機器を使用して抽出すべきである。ＲＮＡ抽出機器は、例えば、Ｒｏｃｈｅ社により販売されているＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ２４であり得る。ＱＩＡＧＥＮ社により販売されているＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌＲＮＡ ＭｉｎｉＫｉｔ、ＥＺ１ＶｉｒｕｓＭｉｎｉＫｉｔおよびＱＩＡｃｕｂｅまたはＮｕｃｌｉＳＥＮＳ社により販売されているｅａｓｙＭＡＧを含む、さらなるＲＮＡ抽出機器を使用し得る。次いで、試料、ヒト検体対照および陰性抽出対照から抽出したＲＮＡは、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）キットにおいて使用する。任意のＲＴ－ＰＣＲキットを使用して抽出を実行することができる。

【0024】

診断パネルにおける使用に好ましい材料は、以下の表２～５に記載する。表２では、パネルにおけるプライマーおよびプローブとしての使用のための材料を提供する。表３では、パネルにおける対照としての使用のための材料を提供する。表４では、パネルのためのリアルタイムＰＣＲマスターミックスを提供する。表５では、ＲＮＡ抽出のための材料を提供する。診断パネルに含まれる各対照の予想性能は、表６に示す。

【0025】

【表2】

【0026】

【表3】

【0027】

【表4】

【0028】

【表5】

【0029】

【表6】

【0030】

また、内部対照であるＲＮａｓｅＰを検査において検出し得る。すべての臨床試料は、ＲＮａｓｅＰ反応において蛍光増加曲線を示すはずであり、これは、４０．００サイクル以内（＜４０．００Ｃｔ）で閾値線と交差し、これにより、ヒトＲＮａｓｅＰ遺伝子の存在を示す。任意の臨床検体中のＲＮａｓｅＰ検出の失敗は、
－ ＲＮＡおよび／またはＲＮＡ分解の減少を生じる、臨床材料からの核酸の不適切な抽出
－ 不十分な採取または検体完全性の欠損により、ヒト細胞材料の存在が不十分であること
－ 不適切なアッセイ設定および実行（ラン）
－ 試薬または装置の機能不良
を示し得る。

【0031】

ＲＰアッセイがヒト臨床検体に対して陽性結果をもたらさない場合、結果は、次のように解釈するべきである。
－ 陽性ＲＰの非存在下であってもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＥおよびＮ２が陽性である場合、結果は、有効であると考えるべきである。一部の試料では、元々の臨床試料における細胞数が少ないため、ＲＮａｓｅＰ増加曲線の提示に失敗し得る可能性を有する。陰性ＲＰシグナルは、臨床検体中のＣＤＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡの存在を排除しない。
－ すべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２マーカーおよびＲＮａｓｅＰが検体に対して陰性である場合、結果は、検体に対して無効であると考えるべきである。残余検体が利用可能である場合、抽出手順を反復し、検査を反復する。再検査後にすべてのマーカーが陰性のままであった場合、結果を無効として報告し、可能であれば、新たな検体を採取すべきである。

【0032】

また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２マーカーであるＥおよびＮ２を本出願のパネルにおいて検出する。すべての対照が予想性能を示す場合、２０１９－ｎＣｏｖマーカーであるＥおよびＮ２の両方のサイクル閾値増加曲線が４０．００サイクル以内（＜４０．００Ｃｔ）で閾値線と交差せず、ＲＮａｓｅＰ増加曲線が４０．００サイクル以内（＜４０．００Ｃｔ）で閾値線と交差すれば、検体は、陰性であると考えられる。すべての対照が予想性能を示す場合、ＥおよびＮ２の両マーカーのサイクル閾値増加曲線が４０．００サイクル以内（＜４０．００Ｃｔ）で閾値線と交差すれば、検体は、ＣＤＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して推定的に陽性であると考えられる。この実施形態では、ＲＮａｓｅＰマーカーは、上記のように、陽性であり得るか、または陽性でない場合があるが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の結果は、なお有効である。

【0033】

対照が予想性能を示し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２マーカーＥおよびＮ２ならびにＲＮａｓｅＰマーカーの増加曲線が４０．００サイクル以内（＜４０．００Ｃｔ）でサイクル閾値増加曲線と交差しない場合、結果は無効である。検体から抽出したＲＮＡを再検査すべきである。残余ＲＮＡが利用可能でない場合、残余検体からＲＮＡを再抽出し、再検査する。再検査した試料がすべてのマーカーおよびＲＮａｓｅＰに対して陰性である場合、結果は無効であり、検体の患者からの新たな採取を検討するべきである。

【0034】

すべての対照が予想性能を示し、ＥではなくＮ２のみのサイクル閾値増加曲線が４０．００サイクル以内（＜４０．００Ｃｔ）で閾値線と交差する場合、結果は陽性である。

【0035】

すべての対照が予想性能を示し、Ｎ２ではなくＥのみのサイクル閾値増加曲線が４０．００サイクル以内（＜４０．００Ｃｔ）で閾値線と交差する場合、結果は不確定となる。抽出およびｒＲＴ－ＰＣＲを反復する。

【0036】

ＨＳＣがＥまたはＮ２に対して陽性である場合、抽出または試料処理中に夾雑が生じている可能性を有する。検体およびＨＳＣを再抽出し、再検査する。

【0037】

表７では、本出願のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒＲＴ－ＰＣＲ診断パネル（ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査）の予想結果を列挙する。

【0038】

【表7】

【0039】

特定の実施形態では、上記のように、すべての対照が予想性能を示す場合、ＳＡＲＳ－ｎＣｏＶ－２の両マーカーＥおよびＮ２がサイクル閾値増加曲線と交差せず、すなわち、増加曲線が約４０．０サイクル後に閾値曲線未満であれば、検体は、ＳＡＲＳ－ｎＣｏＶ－２ウイルスに対して陰性であると考えられ、約４０．０未満サイクル後にＲＮａｓｅＰ増加曲線がサイクル閾値と交差すれば、検体は、陰性であると考えられる。別の実施形態では、上記のように、すべての対照が予想性能を示す場合、ＳＡＲＳ－ｎＣｏＶ－２の両マーカーＥおよびＮ２が、４０．０サイクル以内で閾値線と交差するサイクル閾値増加曲線を有すれば、検体は、ＳＡＲＳ－ｎＣｏＶ－２に対して陽性であると考えられる。ＲＮａｓｅＰは、上記のように、陽性であり得るか、または陽性でない場合があるが、パネルの結果は、なお有効であり得る。

【0040】

検出パネルにより陰性結果がもたらされる場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）ＲＮＡは、アッセイにおいて検出されない。陰性結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を除外しない場合があり、治療または他の患者管理活動の唯一の根拠として使用するべきではない。最適な試料の種類およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により生じた感染中のピークウイルスレベルのタイミングは、未だ決定されていない。他の試料の種類としては、胃腸、組織生検、ＣＮＳおよび尿が挙げられ、患者集団によって異なる。患者の最近の暴露または臨床症状によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の可能性を有することが示唆され、他の病因（すなわち、他の呼吸器疾患）に対する診断検査が陰性である場合、偽陰性結果の可能性が考えられ得る。したがって、陰性結果は、臨床所見、患者病歴および疫学情報と複合しなければならない。さらなる情報の再調査後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染がなお疑われる場合、感染対策または他の感染症専門家と相談して、再検査を検討するべきである。

【0041】

検出パネルにより推定陽性結果がもたらされる場合、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による活動性感染を示し得るが、細菌感染および／または他のウイルスとの同時感染を除外しない。検出された病原体は、疾患の明確な原因ではない可能性を有する。推定陽性結果は、臨床所見、患者病歴および疫学情報と複合して患者管理を判断するべきである。検体は、州および／または連邦機関の要求に応じて確認検査に送られる。

【0042】

また、検出パネルにより、不確定な結果がもたらされ得る。不確定な結果では、提出された検体からの必要とされる成分すべての増幅が不整合であるため、検体に対する結果を確実に判定することができない。臨床所見が、検体が感染している可能性を有することを示す場合、検体のさらなる試料を提出して検査するべきである。

【0043】

また、検証試験をアッセイ展開中に実施し得る。検証試験は、検出限界および交差反応性を含み得るが、これらに限定されない。

【0044】

＜検出限界試験＞
検出限界試験を実施するために、ＲＮＡまたは不活化ウイルスを、人工または実際の臨床マトリックス（例えば、ＢＡＬ液、痰、鼻咽頭スワブまたは中咽頭スワブ等）中に添加し得る。２～３倍希釈の一連の抽出複製物を１濃度あたり３つ検査してもよく、最終濃度は、複製物２０種により確認し得る。食品医薬品局（ＦＤＡ）は、検出限界を、複製物の１９／２０種が陽性である場合の最も低い濃度として定義している。

【0045】

検出限界（ＬｏＤ）試験により、全体（真陽性）のおよそ９５％が検査陽性を複製する場合のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出可能な最も低い濃度を決定する。ＬｏＤは、特性決定されている試料を使用する限界希釈試験により決定した。既知濃度のウイルスＲＮＡを有する特性決定されている試料を調製した。本出願の診断パネルに含まれるｒＲＴ－ＰＣＲアッセイの分析感度は、検出限界試験において決定した。既知力価（ＲＮＡコピー／μＬ）のウイルスゲノムＲＮＡ（ＳＡＲＳ関連コロナウイルス２、単離物ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０）をＢＥＩリソースから入手し（Ｃａｔ＃ＮＲ－５２２８５）、汎用輸送培地に懸濁した鼻スワブからなる希釈物中に添加した。試料は、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ２４機器を使用して抽出した。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲアッセイは、ワンステップＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ－ＰＣＲキット（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（Ｔａｋａｒａ社）（ｃａｔ＃ＲＲ０６４Ｂ）、およびＢｉｏｌｉｎｅＳｅｎｓｉＦＡＳＴプローブＮｏ－ＲＯＸワンステップキットをＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍｓ ｍｉｃ ｑＰＣＲサイクラー上でＣＤＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ診断パネルの使用説明書に従って使用して実施した。

【0046】

ＥおよびＮ２アッセイに対する予備検出限界は、３倍段階希釈のウイルスゲノムＲＮＡ（Ｃａｔ＃ＮＲ－５２２８５）の三つ組の試料を検査して決定した。ＬｏＤの確認は、複製物２０種においてウイルスＲＮＡを１反応あたり１０および２０コピー使用して判定した。ＬｏＤは、９５％以上の複製物（１９／２０）が陽性である場合の最も低い濃度として決定した。検出限界検査の結果は、表８～１２に示す。

【0047】

【表8】

【0048】

【表9】

【0049】

【表10】

【0050】

【表11】

【0051】

【表12】

【0052】

＜包括性試験＞
包括性試験を実施して、提唱する分子アッセイにより検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の株を実証し得る。アッセイプライマーおよびプローブを使用する公開されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列のインシリコでの分析を使用し得る。ＦＤＡは、公開されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列の１００％が、選択されたプライマーおよびプローブにより検出可能であることを予測している。

【0053】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ２アッセイのインシリコでの検査は、疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によってこれまでに実施されている。本出願のインシリコでの検査は、類似の方法で実施した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒＲＴ－ＰＣＲ Ｎ２アッセイのフォワードプライマー配列は、コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスに対する高い配列相同性を示した。リバースプライマーおよびプローブ配列は、ヒトゲノム、他のコロナウイルスまたはヒト微生物叢との顕著な相同性は示さなかった。したがって、プライマーおよびプローブを混合する場合、潜在的な擬陽性ｒＲＴ－ＰＣＲ結果の予測は存在しない。

【0054】

また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｅアッセイのインシリコでの検査を実施した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒＲＴ－ＰＣＲ Ｅアッセイのフォワードおよびリバースプライマーならびにプローブ配列の分析では、ヒトＳＡＲＳコロナウイルスおよびコウモリＳＡＲＳコロナウイルスのみに対して顕著な相同性を示した。潜在的擬陽性ｒＲＴ－ＰＣＲ結果を予測する、ヒトゲノム、他のコロナウイルスまたはヒト微生物叢との顕著な相同性は観察されなかった。

【0055】

まとめると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特異的検出のために設計したＣＤＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒＲＴ－ＰＣＲ Ｎ２アッセイでは、潜在的擬陽性ｒＲＴ－ＰＣＲ結果を予測する、ヒトゲノム、他のコロナウイルスまたはヒト微生物叢との顕著な複合的相同性は示さなかった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒＲＴ－ＰＣＲ Ｅアッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ヒトＳＡＲＳコロナウイルスまたはコウモリＳＡＲＳコロナウイルスの汎用的検出のために設計した。ＣＤＩ増強ＣＯＶＩＤ－１９検査の一部としてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒＲＴ－ＰＣＲ Ｅアッセイでは、潜在的擬陽性ｒＲＴ－ＰＣＲ結果を予測する、ヒトゲノム、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス以外の他のヒトコロナウイルスまたはヒト微生物叢との顕著な複合的相同性は示さなかった。

【0056】

＜交差反応性＞
表１３に列挙する一般的気道細菌叢および他のウイルス病原体と比較したアッセイプライマーおよびプローブのインシリコでの分析を実施し得る。ＦＤＡは、インシリコでの交差反応性を、プライマー／プローブのうちの１つおよび標的微生物に存在する任意の配列の間の相同性が８０％を超えるものとして定義する。

【0057】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒＲＴ－ＰＣＲアッセイプライマーおよびプローブのＢＬＡＳＴｎ分析クエリをパブリックドメインのヌクレオチド配列に対して実施した。データベース検索パラメータは、次のとおりであった。１）ヌクレオチドコレクションは、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＲｅｆＳｅｑ配列からなるが、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、ＷＧＳ、ＴＳＡは除外する。２）データベースは、非冗長である。同一配列は、１つのエントリに統合しているが、各エントリのａｃｃｅｓｓｉｏｎ、ＧＩ、表題および分類情報は保存する。３）分析は、０３／１０／２０２０付で実施した。４）検索パラメータは、短入力配列で自動的に調整され、予想閾値は、１０００である。５）適合および不適合スコアは、それぞれ１および－３である。６）アラインメントにおいてギャップを生成および伸長するペナルティは、それぞれ５および２である。

【0058】

Ｎ２アッセイプローブ配列は、ＳＡＲＳコロナウイルスに対する７８．３％未満の相同性を有し、以下の表１４に列挙する他の生物との顕著な類似性は、見出されなかった。Ｅアッセイプローブは、ヒトＳＡＲＳ－ＣｏＶとの８８～１００％の相同性およびコウモリＳＡＲＳコロナウイルスとの８４～１００％の相同性を有するが、表１４に列挙する他のすべての生物との顕著な類似性は、有しなかった。

【0059】

【表13】

【0060】

【表14】

【0061】

＜臨床評価＞
検査に利用可能な既知の陽性試料の非存在下では、一連の作為的臨床検体を用いて、最低限の作為的反応性検体３０種および非反応性検体３０種をランダム化した盲検による方法で検査することにより、アッセイの性能を確認し得る。作為的反応性検体は、ＲＮＡまたは不活化ウイルスを、ユニークな患者を代表する個々の残余臨床検体中に添加することにより生成してもよく、このような検体の大多数は、残余呼吸器検体、例えば、ＮＰスワブ、痰等であり得る。作為的臨床検体の２０種は、１×～２×ＬｏＤの濃度で添加し、残りの検体は、アッセイ検査範囲に及ぶべきである。ＦＤＡは、性能に対する許容基準を、１×～２×ＬｏＤで９５％の一致、ならびに他のすべての濃度および陰性検体に対して１００％の一致として定義している。

【0062】

臨床評価では、非反応性鼻咽頭スワブ検体３０種を使用した。別の作為的検体３０種にウイルスゲノムＲＮＡ（Ｃａｔ＃ＮＲ－５２２８５）を添加して、２×ＬｏＤで２０（または２１）、３×ＬｏＤで５および４×ＬｏＤで５（または４）のウイルス量を生成した。このような試料６０種を盲検化し、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ２４システム上で抽出した。結果は、表１５および１６に列挙する。

【0063】

【表15】

【0064】

【表16】

【0065】

また、検出パネルにおけるアッセイを準備するための方法を提供する。検出パネルにおける使用のためのアッセイを、マスターミックス中に準備する。マスターミックスは、各アッセイについて、表１７～２０に従って調製し得る。マスターミックス調製は、検査に使用するＲＴ－ＰＣＲキットに依存する。特には、発明者らは、Ｔａｋａｒａ社により販売されているワンステップＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ－ＰＣＲキットおよびＢｉｏｌｉｎｅ社により販売されているＳｅｎｓｉＦＡＳＴ（商標）プローブＮｏ－ＲＯＸワンステップキットが、本出願のマスターミックスとともに使用する場合、最も有効であることを見出した。

【0066】

マスターミックスを調製したら、ＲＴ－ＰＣＲキットを調製し得る。ワンステップＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ－ＰＣＲキットを使用する場合、キットは、記載のように、表１７および１８のアッセイを使用して調製するべきである。ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ（商標）プローブＮｏ－ＲＯＸワンステップキットを使用する場合、キットは、記載のように、表１９および２０のアッセイを使用して調製するべきである。
ａ．ワンステップＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ－ＰＣＲキット（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）では、各成分および割り当てられたチューブ番号を１、２、３、４、５、６として標識した。チューブ５および６は、アッセイ設定には使用しない。
ｂ．各反応の総量は、２０μＬ（マスターミックス１５μｌ＋ＲＮＡ５μｌ）である。
ｃ．１６反応（「ｒｘｎ」）に十分なマスターミックスを調製するために、以下の表に示すマスターミックス中の各成分を１７倍する。

【0067】

【表17】

【0068】

【表18】

【0069】

【表19】

【0070】

【表20】

【0071】

使用するそれぞれのＲＴ－ＰＣＲキットのためにマスターミックスを調製したら、診断プレートを次のように設定し得る。プレート設定は、ＲＴ－ＰＣＲキットに非依存的であり、これは、プレート設定が、ワンステップＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ－ＰＣＲキットおよびＳｅｎｓｉＦＡＳＴ（商標）プローブＮｏ－ＲＯＸワンステップキットの両方に適合することを意味する。
ｄ．マスターミックス１５μｌをプレートマップに定義するようにウェルに添加する。
ｅ．リボ核酸（「ＲＮＡ」）５μｌをプレートマップに定義するように各ウェルに加える。
ｆ．キャップで蓋をして試料をｍｉｃサイクラー上に移す。

【0072】

【表21】

【0073】

次いで、プレートをｍｉｃ ｑＰＣＲサイクラーに移して分析し、ｒＲＴ－ＰＣＲを実行する。熱サイクル条件は、使用するＲＴ－ＰＣＲキットに基づいて設定し得る。ワンステップＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ－ＰＣＲキットを使用する場合、表２１の熱サイクル条件をアッセイに使用し得る。ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ（商標）プローブＮｏ－ＲＯＸワンステップキットを使用する場合、表２２の熱サイクル条件をアッセイに使用し得る。
ｇ．ｍｉｃサイクラーおよびコンピュータをオンにする。
ｈ．ｍｉｃＰＣＲソフトウェアを開いて、コンピュータに機器が認識されていることを確かめる。
ｉ．「ＣＤＩ－ＣＯＶＩＤ１９」（Ｔａｋａｒａ社のキットに基づく）または「Ｂｉｏｌｉｎｅ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２」（Ｂｉｏｌｉｎｅ社のキットに基づく）のアッセイを使用して新たなランを創出する。
ｊ．試料の名称を入力し、試料の種類を「不明」、「ＮＴＣ」または「陽性対照」として適宜選択する。
ｋ．群（Ｎ２、Ｅ、ＲＰ）を各試料に割り当てる。
ｌ．実行（ラン）を開始する。

【0074】

【表22】

【0075】

【表23】

【0076】

前述の例および説明は、例示目的のみのためのものであること、ならびに本開示を考慮すれば、本発明の種々の変更形態は当業者に自明であり、本出願の趣旨および範囲ならびに特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることが理解される。

【配列表】

2023517053000001.app

【国際調査報告】