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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-25
(54)【発明の名称】レバウジオシドＭ甘味料組成物
(51)【国際特許分類】
A23L 27/24 20160101AFI20230418BHJP
A23L 27/00 20160101ALI20230418BHJP
A23L 27/20 20160101ALI20230418BHJP
C12N 15/81 20060101ALN20230418BHJP
C12P 19/56 20060101ALN20230418BHJP
【ＦＩ】
A23L27/24
A23L27/00 101A
A23L27/00 F
A23L27/20 D
C12N15/81 Z ZNA
C12P19/56
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022554399
(86)(22)【出願日】2021-03-12
(85)【翻訳文提出日】2022-11-04
(86)【国際出願番号】 US2021022055
(87)【国際公開番号】W WO2021183848
(87)【国際公開日】2021-09-16
(31)【優先権主張番号】62/989,034
(32)【優先日】2020-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511289736
【氏名又は名称】アミリス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハーマン スタンレイ ダブリュ．
(72)【発明者】
【氏名】バッタチャルジー ビニータ
(72)【発明者】
【氏名】ジェンキンス ロドリ
(72)【発明者】
【氏名】イップ ブライアン
(72)【発明者】
【氏名】ウー アレックス
【テーマコード（参考）】
4B047
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B047LB07
4B047LB08
4B047LB09
4B047LE06
4B047LG09
4B047LG25
4B047LG26
4B047LG28
4B047LG32
4B047LG56
4B047LP01
4B047LP07
4B047LP19
4B064AF48
4B064CA06
4B064CC22
4B064CC24
4B064CE06
4B064CE16
4B064DA10
(57)【要約】
本明細書は、サトウキビシロップを発酵させたときに高純度のレバウジオシドＭを生成するように操作されたSaccharomyces cerevisiae株によって生成されたレバウジオシドＭを少なくとも９５％含有する高効力甘味料を提供する。加えて、菌体を除去した発酵ブロスから高効力甘味料を精製する方法を提供する。高効力甘味料を含有する砂糖代替物、およびそれらの製造方法も提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも９５重量％のレバウジオシドＭを含み、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＢ、およびレバウジオシドＡの合計量が２０，０００ｐｐｍ未満である、精製高強度甘味料。
【請求項2】
５０００ｐｐｍ未満のレバウジオシドＤ、４０００ｐｐｍ未満のレバウジオシドＢ、および２０００ｐｐｍ未満のレバウジオシドＡを含む、請求項１に記載の精製高強度甘味料。
【請求項3】
レバウジオシドＤが３２００ｐｐｍ未満であり、レバウジオシドＢが２０００ｐｐｍ未満であり、レバウジオシドＡが１０００ｐｐｍ未満である、請求項１または２に記載の精製高強度甘味料。
【請求項4】
レバウジオシドＭを定量化するとき、前記レバウジオシドＤ、レバウジオシドＢ、およびレバウジオシドＡの量が、定量限界（ＬＯＱ）を下回る、請求項１～３のいずれか１項に記載の精製高強度甘味料。
【請求項5】
レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＢ、およびレバウジオシドＡの量が、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して測定されたものである、請求項１～４のいずれか１項に記載の精製高強度甘味料。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の精製高強度甘味料を含む、卓上甘味料。
【請求項7】
増量剤をさらに含む、請求項６に記載の卓上甘味料。
【請求項8】
前記増量剤が、エリスリトール、デキストリン、イヌリン、ポリデキストロース、およびマルトデキストリンから選択される、請求項７に記載の卓上甘味料。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか１項に記載の精製高強度甘味料を含む糖代替物。
【請求項10】
１つ以上の増量剤をさらに含む、請求項９に記載の糖代替物。
【請求項11】
前記増量剤が、エリスリトール、可溶性繊維、デキストリン、イヌリン、ポリデキストロース、およびマルトデキストリンから選択される、請求項１０に記載の糖代替物。
【請求項12】
前記糖代替物の重量当たりの甘味がスクロースと同レベルである、請求項９～１１のいずれか１項に記載の糖代替物。
【請求項13】
約８５重量％～約９０重量％のエリスリトールと、約９重量％～約１５重量％の可溶性繊維と、約０．１重量％～約１．０重量％の請求項１～４のいずれか１項に記載の精製高強度甘味料とを含む、請求項９～１２のいずれか１項に記載の糖代替物。
【請求項14】
約９０重量％のエリスリトールと、約９．５重量％の可溶性繊維と、約０．５重量％の請求項１～４のいずれか１項に記載の精製高強度甘味料とを含む、請求項１３に記載の糖代替物。
【請求項15】
前記可溶性繊維が、β－グルカン、グルコマンナン、ペクチン、グアーガム、イヌリン、フルクトオリゴ糖、難消化性デキストリン、およびポリデキストロースから選択される、請求項１３または１４に記載の糖代替物。
【請求項16】
前記難消化性デキストリンが、ＮＵＴＲＩＯＳＥ ＦＭ１０である、請求項１５に記載の糖代替物。
【請求項17】
前記高強度甘味料が前記１つ以上の増量剤と凝集している、請求項９～１６のいずれか１項に記載の糖代替物。
【請求項18】
レバウジオシドＭを含む、菌体を除去した発酵ブロスを得る工程と、前記菌体を除去した発酵ブロスを限外濾過器で濾過して限外濾過浸透液を生成する工程と、
前記限外濾過浸透液をナノフィルターで濾過して、ナノ濾過フロースルーを生成する工程と、
前記ナノろ過フロースルーを洗浄する工程と、
洗浄された前記ナノ濾過フロースルーを噴霧乾燥させて、請求項１～５のいずれか１項に記載の精製高強度甘味料を得る工程と
を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の精製高強度甘味料の調製方法。
【請求項19】
前記限外ろ過器が、約２ｋＤａ～約１００ｋＤａの限外濾過カットオフ値を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記限外ろ過器の限外濾過カットオフ値が約２０ｋＤａである、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ナノフィルターのナノ濾過カットオフ値が、約２００Ｄａ～約１０００Ｄａである、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記ナノフィルターのナノ濾過カットオフ値が、約３００Ｄａ～約５００Ｄａである、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
前記菌体を除去した発酵ブロスのｐＨをｐＨ７超に調整する、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記菌体を除去した発酵ブロスのｐＨが、約ｐＨ１０である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記ナノ濾過フロースルーを酸性溶液で酸性化した後に洗浄する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項26】
前記酸溶液がクエン酸を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
第１の増量剤をミキサーに添加する工程と前記ミキサーを前記第１の増量剤で予めコーティングする工程と、
第２の増量剤および請求項１～５のいずれか一項に記載の精製高強度甘味料を添加する工程と、
前記第１の増量剤、前記第２の増量剤、および前記高効力甘味料を混合する工程と、
混合物に水を添加する工程と、
前記第１の増量剤、前記第２の増量剤、前記高効力甘味料、および前記水を混合する工程と、
混合物を乾燥させる工程と
を含む、請求項９～１７のいずれか１項に記載の糖代替物を作製する方法。
【請求項28】
前記第１の増量剤がエリスリトールである、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記第２の増量剤が可溶性繊維である、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
前記可溶性繊維が、難消化性デキストリンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記難消化性デキストリンが、ＮＵＴＲＩＯＳＥ ＦＭ１０である、請求項３０に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、高純度レバウジオシドＭを含有する甘味料組成物および甘味料組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
天然源に由来する低カロリー甘味料は、高糖摂取の健康への影響を制限するために所望される。ステビア植物（Stevia rebaudiana Bertoni）は、ステビオールグリコシドと呼ばれる甘味のある様々なグリコシル化ジテルペンを生産する。全ての既知のステビオールグリコシドの中で、レバウジオシドＭは、最も高い効能（スクロースの約３００倍の甘味）を有し、最も魅力的な風味プロファイルを有する。しかしながら、レバウジオシドＭは、ステビア植物によってわずかな量しか産生されず、総ステビオールグリコシド含有量はごく一部（１．０％未満）であり、ステビア葉からのレバウジオシドＭの単離は実用的ではない。レバウジオシドＭを得るための代替的な方法が必要である。そのようなアプローチの１つは、持続可能な原料源から大量のレバウジオシドＭを産生する微生物（例えば、酵母）を設計するための合成生物学の適用である。また、レバウジオシドＭの高強度甘味を考慮すると、オフフレーバーを導入せずに高強度甘味を希釈した、レバウジオシドＭを含有する卓上甘味料や糖代替品などの使用可能な甘味料が必要となる。
【発明の概要】
【0003】
９５％を超えるレバウジオシドＭを含有する高強度甘味料、高強度甘味料の製造方法、および高強度甘味料および１つ以上の増量剤を含有する糖代替物が本明細書によって提供される。
【0004】
一態様において、本発明は、少なくとも９５重量％のレバウジオシドＭ、ならびに５０００ｐｐｍ未満のレバウジオシドＤ、４０００ｐｐｍ未満のレバウジオシドＢ、および２０００ｐｐｍ未満のレバウジオシドＡを含有する精製高強度甘味料を提供する。
【0005】
一実施形態では、レバウジオシドＤは３２００ｐｐｍ未満であり、レバウジオシドＢは２０００ｐｐｍ未満であり、レバウジオシドＡは１０００ｐｐｍ未満である。別の実施形態では、レバウジオシドＭを定量化するとき、前記レバウジオシドＤ、レバウジオシドＢ、およびレバウジオシドＡの量が、定量限界（ＬＯＱ）を下回る。さらなる実施形態では、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＢ、およびレバウジオシドＡの量は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して測定されたものである。
【0006】
別の態様において、本発明は、本願によって提供される精製高強度甘味料を含有する卓上甘味料を提供する。一実施形態では、卓上甘味料は、増量剤を含有する。別の実施形態では、増量剤は、エリスリトール、デキストリン、イヌリン、ポリデキストロース、およびマルトデキストリンから選択される。
【0007】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の精製高強度甘味料を含む糖代替物を提供する。一実施形態では、糖代替物は、１つ以上の増量剤を含有する。別の実施形態では、増量剤は、エリスリトール、可溶性繊維、デキストリン、イヌリン、ポリデキストロース、およびマルトデキストリンから選択される。さらに別の実施形態では、糖代替物の重量当たりの甘味がスクロースと同レベルである。一実施形態において、糖代替物は、約８５重量％～約９０重量％のエリスリトール、約９重量％～約１５重量％の可溶性繊維、および約０．１重量％～約１．０重量％の本明細書に記載の精製高強度甘味料を含有する。別の実施形態では、糖代替物は、約９０重量％のエリスリトール、約９．５重量％の可溶性繊維、および約０．５％の本明細書に記載の精製高強度甘味料を含有する。別の実施形態では、可溶性繊維は、β－グルカン、グルコマンナン、ペクチン、グアーガム、イヌリン、フルクト－オリゴ糖、難消化性デキストリン、およびポリデキストロースから選択される。好ましい実施形態では、難消化性デキストリンは、ＮＵＴＲＩＯＳＥ ＦＭ１０である。追加の実施形態では、高強度甘味料は、１つ以上の増量剤と凝集している。
【0008】
さらに別の態様において、本発明は、レバウジオシドＭを含む透明な発酵ブロスを得るステップと、透明な発酵ブロスを限外濾過フィルターで濾過して限外濾過浸透物を生成するステップと、限外濾過浸透物をナノフィルターで濾過してナノ濾過フロースルーを生成するステップと、ナノ濾過フロースルーを洗浄するステップと、洗浄されたナノ濾過フロースルーを噴霧乾燥させて、本明細書に記載の精製高強度甘味料を得るステップとを含む、精製高強度甘味料を調製する方法を提供する。一実施形態では、限外ろ過器は、約２ｋＤａ～約１００ｋＤａの限外濾過カットオフ値を有する。別の実施形態では、限外ろ過器は、約２０ｋＤａの限外濾過カットオフ値を有する。さらに別の実施形態では、ナノフィルターは、約２００Ｄａ～約１０００Ｄａのナノ濾過カットオフ値を有する。さらなる実施形態では、ナノフィルターは、約３００Ｄａ～約５００Ｄａのナノ濾過カットオフ値を有する。追加の実施形態では、菌体を除去した発酵ブロスのｐＨをｐＨ７超に調整する。別の実施形態では、菌体を除去した発酵ブロスのｐＨは、約ｐＨ１０である。さらなる実施形態では、ナノ濾過フロースルーは、酸性溶液で酸性化した後に洗浄する。一実施形態では、酸溶液はクエン酸を含む。
【0009】
さらなる態様では、本発明は、ミキサーに第１の増量剤を添加するステップと、ミキサーに第１の増量剤を予めコーティングするステップと、第２の増量剤、および本明細書に記載の精製高強度甘味料を添加するステップと、第１の増量剤、第２の増量剤、および高効力甘味料を混合するステップと、混合物に水を添加するステップと、第１の増量剤、第２の増量剤、高効力甘味料、および水を混合するステップと、混合物を乾燥させるステップと、を含む糖代替物物を作製する方法を提供する。一実施形態では、第１の増量剤はエリスリトールである。別の実施形態では、第２の増量剤は、可溶性繊維である。さらなる実施形態では、可溶性繊維は、難消化性デキストリンである。さらに別の実施形態では、難消化性デキストリンは、ＮＵＴＲＩＯＳＥ ＦＭ１０である。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】前駆体ファルネシルピロリン酸塩（ＦＰＰ）からステビオールへの生化学的経路を示す図である。
【図2】前駆体イソプレノイド骨格ステビオールから、レバウジオシドＭを含む既知のステビオールグリコシドの多くへの生化学的経路を示す図である。
【図3】レバウジオシドＭの製造のための発酵プロセスのスケールアップを示す図である。
【図4】レバウジオシドＭを含む高強度甘味料を製造するために使用される精製プロセスのフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書で使用される場合、「高強度甘味料」は、重量当たりのスクロースよりも少なくとも数倍甘いスクロース代替物を指す。さらに、高強度甘味料は低カロリーまたはゼロカロリーであり、血糖値に影響を与えません。高強度甘味料の例示的な例としては、植物Stevia rebaudianaによって産生されるステビオールグリコシドが挙げられる。好ましい高強度甘味料は、主にステビオールグリコシドレバウジオシドＭを含む甘味料である。
【0012】
本明細書で使用される場合、「糖代替物」とは、スクロースのような甘味をもたらすが、スクロースよりも重量当たりのカロリーが有意に少ない食品添加物を指す。
【0013】
本明細書で使用される場合、「卓上甘味料」は、飲料および食品を直接甘味するために消費者によって使用するために製剤化される高強度甘味料を含む組成物を指す。
【0014】
本明細書で使用される場合、「増量剤」は、甘味剤製剤に追加の体積または質量を提供するために、高強度甘味剤と組み合わせて甘味剤製剤に添加される任意の化合物を指す。増量剤の主な機能は、高強度甘味料を希釈して、甘味剤製剤にスクロースと同様の体積あたりの甘味を与えることである。多数の増量剤のいずれかを、高強度甘味料と組み合わせて使用してよい。好ましい実施形態では、ポリオール、またはエリスリトール等の糖アルコールを、アセスルファムカリウムと共に増量剤として使用する。エリスリトールはカロリーが非常に低いので好ましい。また、エリスリトールは下腸で急速に吸収されるため、消化耐性が高い。また、エリスリトールは血糖値やインスリン値に影響を与えない糖アルコールであるため、糖尿病患者にとっては安全である。
【0015】
さらなる潜在的な増量剤としては、２つの二糖アルコールの混合物が使用される。二糖アルコールは、グルコ－マンニトールとグルコ－ソルビトールである。好ましくは、使用される二糖アルコールは容易に入手可能であり、低カロリー値である。さらに、二糖アルコールは、甘味料が虫歯を引き起こしにくく、血糖値に影響を及ぼしにくいように、非カリウム性であり、低い血糖値であることが好ましい。また、増量剤は白色であり、結晶性であり、無臭であることが好ましいため、得られる甘味料はできるだけ現実的な糖の代替物を提供する。
【0016】
本明細書で使用される場合、「可溶性繊維」および「可溶性トウモロコシ繊維」ならびに「可溶性小麦繊維」および「難消化性デキストリン」は、小腸内の消化に耐性であり、糖代替物の成分として添加されると、糖代替物が特定の料理用途、例えばベーキングにおいて糖のように振る舞うことを指す。例示的な可溶性繊維としては、β－グルカン、グルコマンナン、ペクチン、グアーガム、イヌリン、フルクト－オリゴ糖、難消化性デキストリン、およびポリデキストロースが挙げられる。好ましい可溶性繊維は、難消化性デキストリン（ＮＵＴＲＩＯＳＥ ＦＭ１０（Ｒｏｋｋｅｔ））であり、（１，２）－および（１，３）－グリコシド結合に加えて（１，４）－および（１，６）－グリコシド結合を有する点でデンプンとは異なるグルコースポリマーである。
【0017】
本明細書で使用される場合、「培地」という用語は、培養培地および／または発酵培地を指す。
【0018】
本明細書で使用される場合、「産生」という用語は、一般に、本願によって提供される遺伝子改変宿主細胞によって産生されるステビオールグリコシドの量を指す。いくつかの実施形態では、産生は、宿主細胞によるステビオールグリコシドの産生として表される。他の実施形態において、産生は、ステビオールグリコシドを産生する宿主細胞の生産性として表される。
【0019】
本明細書で使用される場合、用語「カウレン酸」は、カウレン酸の任意の立体異性体を含む化合物カウレン酸を指す。好ましい実施形態では、この用語は、エントカウレン酸として当該技術分野で既知であり、以下の構造を有するエナンチオマーを指す。
【0020】
【化1】
【0021】
本明細書で使用される場合、用語「ステビオール」は、ステビオールの任意の立体異性体を含む化合物ステビオールを指す。好ましい実施形態では、この用語は、以下の構造を有する化合物を指す。
【0022】
【化2】
【0023】
本明細書で使用される場合、「ステビオールグリコシド」という用語は、１９－グリコシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ダルコシドＢ、ダルコシドＡ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、レバウジオシドＤ２、およびレバウジオシドＭ２を含むが、これらに限定されない、ステビオールのグリコシドを指す。
【0024】
本明細書で使用される場合、「レバウジオシドＭ」または「ＲｅｂＭ」という用語は、以下の構造を有するステビオールグリコシドを指す。
【0025】
【化3】
【0026】
高強度甘味料は、ステビオールグリコシドを発現するように操作された宿主細胞の発酵によって生成される。本発明の宿主細胞は、サトウキビシロップによって提供される炭素をレバウジオシドＭに変換するために必要な酵素経路を発現するように操作されている。酵素および酵素をコードする有用な核酸は、当業者に既知である。特に有用な酵素および核酸を後述し、例えば、ＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１、ＵＳ２０１４／０３５７５８８Ａ１、ＵＳ２０１５／０１５９１８８、ＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２、およびＵＳ２０１６／０１９８７４８Ａ１にも記載されている。
【0027】
さらなる実施形態において、宿主細胞は、炭素源からゲラニルゲラニル二リン酸を作製することができる１つ以上の酵素をさらに含む。これらには、ＤＸＰ経路の酵素およびＭｅＶ経路の酵素が含まれる。有用な酵素および酵素をコードする核酸は、当業者に既知である。各経路の例示的な酵素は、以下に記載され、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、ＵＳ２０１６／０１７７３４１Ａ１にさらに記載される。
【0028】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、下記からなる群より選択される１つ以上のイソプレノイド経路酵素を含む。（ａ）アセチル－補酵素Ａの２つの分子を縮合してアセトアセチル－ＣｏＡ（例えば、アセチル－ＣｏＡチオラーゼ）を形成する酵素、（ｂ）アセチル－ＣｏＡの別の分子とアセトアセチル－ＣｏＡを縮合して３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ（例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ）を形成する酵素、（ｃ）ＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素（例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ）、（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５－リン酸に変換する酵素（例えば、メバロン酸キナーゼ）、（ｅ）メバロン酸５－リン酸をメバロン酸５－ピロリン酸に変換する酵素（例えば、ホスホメバロン酸キナーゼ）、（ｆ）メバロン酸５－ピロリン酸をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）に変換する酵素（例えばメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ）；（ｇ）ＩＰＰをジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換する酵素（例えばＩＰＰイソメラーゼ）；（ｈ）ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合して、５個以上の炭素を含有するポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシンターゼ；（ｉ）ＩＰＰとＤＭＡＰＰを縮合して、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）を形成する酵素（例えばＧＰＰシンターゼ）；（Ｊ）２分子のＩＰＰを１分子のＤＭＡＰと縮合する酵素（例えばＦＰＰシンターゼ）；（ｋ）ＩＰＰとＧＰＰを縮合させてファルネシルピロリン酸（ＦＰ）を形成する酵素（例えばＦＰＰ）；（ｌ）ＩＰＰとＤＭＡＰＰを縮合させてゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を形成する酵素；および（ｍ）ＩＰＰとＦＰＰを縮合させてＧＧＰＰを形成する酵素。
【0029】
ある特定の実施形態において、追加の酵素は、本来（ｎａｔｉｖｅ）のものである。有利な実施形態において、追加の酵素は、異種である。ある特定の実施形態において、２つ以上の酵素を１つのポリペプチドに組み合わせてもよい。
【0030】
細胞株
本願で提供する本発明の宿主細胞は、古細菌、原核生物、および真核生物細胞を含む。
本願で提供する本発明の宿主細胞は、古細菌、原核生物、および真核生物細胞を含む。
【0031】
好適な原核宿主細胞としては、グラム陽性、グラン陰性、およびグラム可変細菌のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。例としては、以下の属に属する細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない：Agrobacterium、Alicyclobacillus、Anabaena、Anacystis、Arhrobacter、Azobacter、Bacillus、Brevibacterium、Chromatium、Clostridium、Corynebacterium、Enterobacter、Erwinia、Escherichia、Lactobacillus、Lactococcus、Mesorhizobium、Methylobacterium、Microbacterium、Phormidium、Pseudomonas、Rhodobacter、Rhodopseudomonas、Rhodospirillum、Rhodococcus、Salmonella、Scenedesmun、Serratia、Shigella、Staphlococcus、Strepromyces、Synnecoccus,およびZymomonas。原核宿主細胞種としては以下が挙げられるが、これらに限定されるものではない：Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum、Clostridium beigerinckii、Enterobacter sakazakii、Escherichia coli、Lactococcus lactis、Mesorhizobium loti、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas mevalonii、Pseudomonas pudica、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroides、Rhodospirillum rubrum、Salmonella enterica、Salmonella typhi、Salmonella typhimurium、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella sonnei、およびStaphylococcus aureus。特定の実施形態では、宿主細胞は、Escherichia coli細胞である。
【0032】
好適な古細菌宿主としては、以下の属に属する細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない：Aeropyrum、Archaeglobus、Halobacterium、Methanococcus、Methanobacterium、Pyrococcus、Sulfolobus、およびThermoplasma。古細菌種としては以下が挙げられるが、これらに限定されるものではない：Archaeoglobus fulgidus、Halobacterium sp.、Methanococcus jannaschii、Methanobacterium thermoautotrophicum、Thermoplasma acidophilum、Thermoplasma volcanium、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、およびAeropyrum pernix。
【0033】
好適な真核生物宿主としては、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本方法に有用な酵母には、微生物寄託機関（例えば、ＩＦＯ、ＡＴＣＣなど）に寄託された酵母であって、以下の属に属する酵母が含まれる：Aciculoconidium、Ambrosiozyma、Arthroascus、Arxiozyma、Ashbya、Babjevia、Bensingtonia、Botryoascus、Botryozyma、Brettanomyces、Bullera、Bulleromyces、Candida、Citeromyces、Clavispora、Cryptococcus、Cystofilobasidium、Debaryomyces、Dekkara、Dipodascopsis、Dipodascus、Eeniella、Endomycopsella、Eremascus、Eremothecium、Erythrobasidium、Fellomyces、Filobasidium、Galactomyces、Geotrichum、Guilliermondella、Hanseniaspora、Hansenula、Hasegawaea、Holtermannia、Hormoascus、Hyphopichia、Issatchenkia、Kloeckera、Kloeckeraspora、Kluyveromyces、Kondoa、Kuraishia、Kurtzmanomyces、Leucosporidium、Lipomyces、Lodderomyces、Malasserzia、Metschnikowia、Mrakia、Myxozyma、Nadsonia、Nakazawaea、Nematospora、Ogataea、Oosporidium、Pachysolen、Phachytichospora、Phaffia、Pichia、Rhodosporidium、Rhodotorula、Saccharomyces、Saccharomycodes、Saccharomycopsis、Saitoella、Sakaguchia、Saturnospora、Schizoblastoporion、Schizosaccharomyces、Schwanniomyces、Sporidiobolus、Sporobolomyces、Sporopachydermia、Stephanoascus、Sterigmatomyces、Sterigmatosporidium、Symbiotaphrina、Sympodiomyces、Sympodiomycopsis、Torulaspora、Trichosporiella、Trichosporon、Trigonopsis、Tsuchiyaea、Udeniomyces、Waltomyces、Wickerhamia、Wickerhamiella、Williopsis、Yamadazyma、Yarrowia、Zygoascus、Zygosaccharomyces、Zygowilliopsis、およびZygozyma.
【0034】
いくつかの実施形態では、宿主微生物は、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Schizosaccharomyces pombe、Dekkera bruxellensis、Kluyveromyces lactis (previously called Saccharomyces lactis)、Kluveromyces marxianus、Arxula adeninivorans、またはHansenula polymorpha（別名Pichia angusta）である。いくつかの実施形態では、宿主微生物は、Candida lipolytica、Candida guilliermondii、Candida krusei、Candida pseudotropicalis、またはCandida utilsなどのCandida属である。
【0035】
好ましい実施形態では、宿主微生物は、Saccharomyces cerevisiaeである。いくつかの実施形態では、宿主は、下記から選ばれるSaccharomyces cerevisiaeの株である：パン酵母、ＣＥＮ．ＰＫ２、ＣＢＳ ７９５９、ＣＢＳ ７９６０、ＣＢＳ ７９６１、ＣＢＳ ７９６２、ＣＢＳ ７９６３、ＣＢＳ ７９６４、ＩＺ－１９０４、ＴＡ、ＢＧ－１、ＣＲ－１、ＳＡ－１、Ｍ－２６、Ｙ－９０４、ＰＥ－２、ＰＥ－５、ＶＲ－１ ＢＲ－１、ＢＲ－２、ＭＥ－２、ＶＲ－２、ＭＡ－３、ＭＡ－４、ＣＡＴ－１、ＣＢ－１、ＮＲ－１、ＢＴ－１、およびＡＬ－１。いくつかの実施形態では、宿主微生物は、Saccharomyces cerevisiae ＰＥ－２、ＣＡＴ－１、ＶＲ－１、ＢＧ－１、ＣＲ－１、ＳＡ－１から選択される。特定の実施形態では、Saccharomyces cerevisiaeの株は、ＰＥ－２である。別の特定の実施形態では、Saccharomyces cerevisiaeの株は、ＣＡＴ－１である。
【0036】
ステビオールグリコシド生合成経路
いくつかの実施形態において、レバウジオシドＭ生合成経路は、ステビオールグリコシドの生合成を触媒することができる酵素をコードするポリヌクレオチドを発現するように細胞を操作することによって、遺伝子改変宿主細胞において活性化される。
いくつかの実施形態において、レバウジオシドＭ生合成経路は、ステビオールグリコシドの生合成を触媒することができる酵素をコードするポリヌクレオチドを発現するように細胞を操作することによって、遺伝子改変宿主細胞において活性化される。
【0037】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）をコードする異種ポリヌクレオチド、コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）をコードする異種ポリヌクレオチド、カウレンシンターゼ（ＫＳ）をコードする異種ポリヌクレオチド、カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＯ）をコードする異種ポリヌクレオチド、カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）をコードする異種ポリヌクレオチド、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）をコードする異種ポリヌクレオチド、ＵＤＰ－グルコース転移酵素をコードする異種ポリヌクレオチド、ＵＧＴ７４Ｇ１をコードする異種ポリヌクレオチド、ＵＧＴ７６Ｇ１をコードする異種ポリヌクレオチド、ＵＧＴ８Ｇ５Ｃ２をコードする異種ポリヌクレオチド、ＵＧＴ９Ｄをコードする異種ポリヌクレオチド、ＵＧＴ１１をコードする異種ポリヌクレオチド、またはＵＧＴ４０７をコードする異種ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、ＧＧＰＰＳ、ＣＤＰＳ、ＫＳ、ＫＯ、ＫＡＨ、ＣＰＲ、ＵＤＰ－グルコーストランスフェラーゼ、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ９１Ｄ、ＥＵＧＴ１１、またはＵＧＴ４００８７のバリアントをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する。ある特定の実施形態において、変異酵素は、参照酵素と比較して、１～２０個のアミノ酸置換を有し得る。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドのコード配列は、特定の宿主細胞に対してコドン最適化される。
【0038】
ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素(EC 2.5.1.29)は、ファルネシルピロリン酸のゲラニルゲラニル二リン酸への変換を触媒する。ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の例としては、Stevia rebaudiana（受託番号ＡＢＤ９２９２６）、Gibberella fujikuroi（受託番号ＣＡＡ７５５６８）、Mus musculus（受託番号ＡＡＨ６９９１３）、Thalassiosira pseudonana（受託番号ＸＰ＿００２２８８３３９）、Streptomyces clavuligerus（受託番号ＺＰ－０５００４５７０）、Sulfulobus acidocaldarius（受託番号ＢＡＡ４３２００）、Synechococcus sp.（受託番号ＡＢＣ９８５９６）、Arabidopsis thaliana（受託番号ＭＰ＿１９５３９９）およびBlakeslea trispora（受託番号ＡＦＣ９２７９８．１）に由来のもの、およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１に記載のものが挙げられる。
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素(EC 2.5.1.29)は、ファルネシルピロリン酸のゲラニルゲラニル二リン酸への変換を触媒する。ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の例としては、Stevia rebaudiana（受託番号ＡＢＤ９２９２６）、Gibberella fujikuroi（受託番号ＣＡＡ７５５６８）、Mus musculus（受託番号ＡＡＨ６９９１３）、Thalassiosira pseudonana（受託番号ＸＰ＿００２２８８３３９）、Streptomyces clavuligerus（受託番号ＺＰ－０５００４５７０）、Sulfulobus acidocaldarius（受託番号ＢＡＡ４３２００）、Synechococcus sp.（受託番号ＡＢＣ９８５９６）、Arabidopsis thaliana（受託番号ＭＰ＿１９５３９９）およびBlakeslea trispora（受託番号ＡＦＣ９２７９８．１）に由来のもの、およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１に記載のものが挙げられる。
【0039】
コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰ）
コパリル二リン酸合成酵素（ＥＣ５．５．１．１３）は、ゲラニルゲラニル二リン酸のコパリル二リン酸への変換を触媒する。コパリル二リン酸合成酵素の例としては、Stevia rebaudiana（受託番号ＡＡＢ８７０９１）、Streptomyces clavuligerus（受託番号ＥＤＹ５１６６７）、Bradyrhizobioum japonicum（受託番号ＡＡＣ２８８９５．１）、Zea mays（受託番号ＡＹ５６２４９０）、Arabidopsis thaliana（受託番号ＮＭ＿１１６５１２）およびOryza sativa（受託番号Ｑ５ＭＱ８５．１）に由来のもの、およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１に記載のものが挙げられる。
コパリル二リン酸合成酵素（ＥＣ５．５．１．１３）は、ゲラニルゲラニル二リン酸のコパリル二リン酸への変換を触媒する。コパリル二リン酸合成酵素の例としては、Stevia rebaudiana（受託番号ＡＡＢ８７０９１）、Streptomyces clavuligerus（受託番号ＥＤＹ５１６６７）、Bradyrhizobioum japonicum（受託番号ＡＡＣ２８８９５．１）、Zea mays（受託番号ＡＹ５６２４９０）、Arabidopsis thaliana（受託番号ＮＭ＿１１６５１２）およびOryza sativa（受託番号Ｑ５ＭＱ８５．１）に由来のもの、およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１に記載のものが挙げられる。
【0040】
カウレン合成酵素（ＫＳ）
カウレン合成酵素（ＥＣ４．２．３．１９）は、コパリル二リン酸塩のカウレンおよび二リン酸塩への変換を触媒する。酵素の例としては、Bradyrhizobium japonicum（受託番号ＡＡＣ２８８９５．１）、Arabidopsis thaliana（受託番号Ｑ９ＳＡＫ２）およびPicea glauca（受託番号ＡＤＢ５５７１１．１）に由来のもの、およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１に記載のものが挙げられる。
カウレン合成酵素（ＥＣ４．２．３．１９）は、コパリル二リン酸塩のカウレンおよび二リン酸塩への変換を触媒する。酵素の例としては、Bradyrhizobium japonicum（受託番号ＡＡＣ２８８９５．１）、Arabidopsis thaliana（受託番号Ｑ９ＳＡＫ２）およびPicea glauca（受託番号ＡＤＢ５５７１１．１）に由来のもの、およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１に記載のものが挙げられる。
【0041】
二官能性コパリル二リン酸合成酵素（ＣＤＰ）およびカウレン合成酵素（ＫＳ）
ＣＤＰＳ－ＫＳ二官能性酵素（ＥＣ５．５．１．１３およびＥＣ４．２．３．１９）もまた、本発明の宿主細胞において使用され得る。例としては、Phomopsis amygdali（受託番号ＢＡＧ３０９６２）、Phaeosphaeria sp.（受託番号Ｏ１３２８４）、Physcomitrella patens（受託番号ＢＡＦ６１１３５）およびGibberella fujikuroi（受託番号Ｑ９ＵＶＹ５．１）に由来のもの、およびＵＳ２０１４／０３２９２８Ａ１、ＵＳ２０１４／０３５７５８８Ａ１、ＵＳ２０１５／０１５９１８８およびＷＯ２０１６／０３８０９５に記載のものが挙げられる。
ＣＤＰＳ－ＫＳ二官能性酵素（ＥＣ５．５．１．１３およびＥＣ４．２．３．１９）もまた、本発明の宿主細胞において使用され得る。例としては、Phomopsis amygdali（受託番号ＢＡＧ３０９６２）、Phaeosphaeria sp.（受託番号Ｏ１３２８４）、Physcomitrella patens（受託番号ＢＡＦ６１１３５）およびGibberella fujikuroi（受託番号Ｑ９ＵＶＹ５．１）に由来のもの、およびＵＳ２０１４／０３２９２８Ａ１、ＵＳ２０１４／０３５７５８８Ａ１、ＵＳ２０１５／０１５９１８８およびＷＯ２０１６／０３８０９５に記載のものが挙げられる。
【0042】
エントカウレンオキシダーゼ （ＫＯ）
本明細書でカウレン酸化酵素とも称されるエントカウレンオキシダーゼ（ＥＣ１．１４．１３．８８）は、カウレンのカウレン酸への変換を触媒する。酵素の例示的な例としては、Oryza sativa（受託番号Ｑ５Ｚ５Ｒ４）、Gibberella fujikuroi（受託番号Ｏ９４１４２）、Arabidopsis thaliana（受託番号Ｑ９３ＺＢ２）、Stevia rebaudiana（受託番号ＡＡＱ６３４６４．１）およびPisum sativum（ユニプロット番号Ｑ６ＸＡＦ４）に由来のもの、およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１、ＵＳ２０１４／０３５７５８８Ａ１、ＵＳ２０１５／０１５９１８８およびＷＯ２０１６／０３８０９５に記載のものが挙げられる。
本明細書でカウレン酸化酵素とも称されるエントカウレンオキシダーゼ（ＥＣ１．１４．１３．８８）は、カウレンのカウレン酸への変換を触媒する。酵素の例示的な例としては、Oryza sativa（受託番号Ｑ５Ｚ５Ｒ４）、Gibberella fujikuroi（受託番号Ｏ９４１４２）、Arabidopsis thaliana（受託番号Ｑ９３ＺＢ２）、Stevia rebaudiana（受託番号ＡＡＱ６３４６４．１）およびPisum sativum（ユニプロット番号Ｑ６ＸＡＦ４）に由来のもの、およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１、ＵＳ２０１４／０３５７５８８Ａ１、ＵＳ２０１５／０１５９１８８およびＷＯ２０１６／０３８０９５に記載のものが挙げられる。
【0043】
カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）
カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＥＣ１．１４．１３）は、ステビオールシンターゼとも称され、カウレン酸のステビオールへの変換を触媒する。酵素の例としては、Stevia rebaudiana（受託番号ACD93722), Arabidopsis thaliana（受託番号NP_197872), Vitis vinifera（受託番号XP_002282091) およびMedicago trunculata（受託番号ABC59076) に由来のもの、およびＵＳ２０１４／０３２９２８１，ＵＳ２０１４／０３５７５８８，ＵＳ２０１５／０１５９１８８およびＷＯ２０１６／０３８０９５に記載のものが挙げられる。
カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＥＣ１．１４．１３）は、ステビオールシンターゼとも称され、カウレン酸のステビオールへの変換を触媒する。酵素の例としては、Stevia rebaudiana（受託番号ACD93722), Arabidopsis thaliana（受託番号NP_197872), Vitis vinifera（受託番号XP_002282091) およびMedicago trunculata（受託番号ABC59076) に由来のもの、およびＵＳ２０１４／０３２９２８１，ＵＳ２０１４／０３５７５８８，ＵＳ２０１５／０１５９１８８およびＷＯ２０１６／０３８０９５に記載のものが挙げられる。
【0044】
ＮＡＤＰＨ－シトクロムレダクターゼ
シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＥＣ１．６．２．４）は、上記のＫＯおよび／またはＫＡＨの活性に必要である。酵素の例としては、Stevia rebaudiana（受託番号ABB88839）、Arabidopsis thaliana（受託番号NP_194183)）、Gibberella fujikuroi（受託番号CAE09055) およびArtemisia annua（受託番号ABC47946.1)に由来のもの、およびＵＳ２０１４／０３２９２８１，ＵＳ２０１４／０３５７５８８，ＵＳ２０１５／０１５９１８８およびＷＯ２０１６／０３８０９５に記載のものが挙げられる。
シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＥＣ１．６．２．４）は、上記のＫＯおよび／またはＫＡＨの活性に必要である。酵素の例としては、Stevia rebaudiana（受託番号ABB88839）、Arabidopsis thaliana（受託番号NP_194183)）、Gibberella fujikuroi（受託番号CAE09055) およびArtemisia annua（受託番号ABC47946.1)に由来のもの、およびＵＳ２０１４／０３２９２８１，ＵＳ２０１４／０３５７５８８，ＵＳ２０１５／０１５９１８８およびＷＯ２０１６／０３８０９５に記載のものが挙げられる。
【0045】
ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ７４Ｇ１（ＵＧＴ７４Ｇ１）
ＵＧＴ７４Ｇ１は、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール１９－ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして、およびウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール－１３－Ｏ－グルコシド１９－ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして機能することができる。したがって、ＵＧＴ７４Ｇ１は、ステビオールを１９－グリコシドに変換すること、ステビオールを１９－グリコシドに変換すること、ステビオールモノシドをルブソシドに変換すること、およびステビオビオシドをステビオシドに変換することができる。ＵＧＴ７４Ｇ１は、Richman et al., 2005, Plant J., vol. 41, pp. 56-67、ＵＳ２０１４／０３２９２８１、ＷＯ２０１６／０３８０９５に記載され、受託番号はＡＡＲ０６９２０．１である。
ＵＧＴ７４Ｇ１は、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール１９－ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして、およびウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール－１３－Ｏ－グルコシド１９－ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして機能することができる。したがって、ＵＧＴ７４Ｇ１は、ステビオールを１９－グリコシドに変換すること、ステビオールを１９－グリコシドに変換すること、ステビオールモノシドをルブソシドに変換すること、およびステビオビオシドをステビオシドに変換することができる。ＵＧＴ７４Ｇ１は、Richman et al., 2005, Plant J., vol. 41, pp. 56-67、ＵＳ２０１４／０３２９２８１、ＷＯ２０１６／０３８０９５に記載され、受託番号はＡＡＲ０６９２０．１である。
【0046】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ７６Ｇ１（ＵＧＴ７６Ｇ１）
ＵＧＴ７６Ｇ１は、グルコース部分を、ステビオールグリコシド（グリコシド＝Ｇｌｃｂ（１→２）Ｇｌｃ）を介してアクセプター分子のＣ－３’位に移すことができる。この化学反応は、アクセプター分子のＣ－１３－Ｏ結合グルコース、またはＣ－１９－Ｏ結合グルコースアクセプター分子のいずれかで起こり得る。したがって、ＵＧＴ７６Ｇ１は、（１）ＲｅｂＢを形成するβ結合におけるステビオシド上の１３－Ｏ結合グルコースのＣ－３’位、（２）ＲｅｂＡを形成するβ結合におけるステビオシド上の１９－Ｏ結合グルコースのＣ－３’位、および（３）ＲｅｂＭ． ＵＧＴ７６Ｇ１を形成するβ結合におけるＲｅｂＤ上の１９－Ｏ結合グルコースのＣ－３’位に対するウリジン５’－ジホスホグルコシルトランスフェラーゼとして機能することができ、Richman et al., 2005, Plant J., vol. 41, pp. 56-67、ＵＳ２０１４／０３２９２８１、ＷＯ２０１６／０３８０９５に記載され、受託番号はＡＡＲ０６９１２．１である。
ＵＧＴ７６Ｇ１は、グルコース部分を、ステビオールグリコシド（グリコシド＝Ｇｌｃｂ（１→２）Ｇｌｃ）を介してアクセプター分子のＣ－３’位に移すことができる。この化学反応は、アクセプター分子のＣ－１３－Ｏ結合グルコース、またはＣ－１９－Ｏ結合グルコースアクセプター分子のいずれかで起こり得る。したがって、ＵＧＴ７６Ｇ１は、（１）ＲｅｂＢを形成するβ結合におけるステビオシド上の１３－Ｏ結合グルコースのＣ－３’位、（２）ＲｅｂＡを形成するβ結合におけるステビオシド上の１９－Ｏ結合グルコースのＣ－３’位、および（３）ＲｅｂＭ． ＵＧＴ７６Ｇ１を形成するβ結合におけるＲｅｂＤ上の１９－Ｏ結合グルコースのＣ－３’位に対するウリジン５’－ジホスホグルコシルトランスフェラーゼとして機能することができ、Richman et al., 2005, Plant J., vol. 41, pp. 56-67、ＵＳ２０１４／０３２９２８１、ＷＯ２０１６／０３８０９５に記載され、受託番号はＡＡＲ０６９１２．１である。
【0047】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ８５Ｃ２（ＵＧＴ８５Ｃ２）
ＵＧＴ８５Ｃ２は、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール１３－ＯＨトランスフェラーゼ、およびウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール－１９－Ｏ－グルコシド１３－ＯＨトランスフェラーゼとして機能することができる。ＵＧＴ８５Ｃ２は、ステビオールをステビオールモノシドに変換することができ、１９－グリコシドをルブソシドに変換することもできる。ＵＧＴ８５Ｃ２酵素の例としては、Stevia rebaudiana（Richman et al., (2005), Plant J., vol. 41, pp. 56-67、ＵＳ２０１４／０３２９２８１、ＷＯ２０１６／０３８０９５に記載、受託番号ＡＡＲ０６９１６．１）が挙げられる。
ＵＧＴ８５Ｃ２は、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール１３－ＯＨトランスフェラーゼ、およびウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール－１９－Ｏ－グルコシド１３－ＯＨトランスフェラーゼとして機能することができる。ＵＧＴ８５Ｃ２は、ステビオールをステビオールモノシドに変換することができ、１９－グリコシドをルブソシドに変換することもできる。ＵＧＴ８５Ｃ２酵素の例としては、Stevia rebaudiana（Richman et al., (2005), Plant J., vol. 41, pp. 56-67、ＵＳ２０１４／０３２９２８１、ＷＯ２０１６／０３８０９５に記載、受託番号ＡＡＲ０６９１６．１）が挙げられる。
【0048】
ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ９１Ｄ（ＵＧＴ９１Ｄ）
ＵＧＴ９１Ｄは、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール－１３－Ｏ－グルコシドトランスフェラーゼとして機能し、グルコース部分をアクセプター分子であるステビオール－１３－Ｏ－グルコシド（ステビオールモノシド）の１３－Ｏ－グルコースのＣ－２’に移して、ステビオールビオシドを生成することができる。ＵＧＴ９１Ｄはまた、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ルブソシドトランスフェラーゼとして機能し、グルコース部分をアクセプター分子であるルブソシドの１３－Ｏ－グルコースのＣ－２’に移し、ステビオシドを提供することができる。ＵＧＴ９１Ｄは、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、またはＵＧＴ９１Ｄ様３とも称される。ＵＧＴ９１Ｄ酵素の例としては、Stevia rebaudiana（例えば、受託番号ＡＣＥ８７８５５．１、ＵＳ２０１４／０３２９２８１およびＷＯ２０１６／０３８０９５参照）が挙げられる。
ＵＧＴ９１Ｄは、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール－１３－Ｏ－グルコシドトランスフェラーゼとして機能し、グルコース部分をアクセプター分子であるステビオール－１３－Ｏ－グルコシド（ステビオールモノシド）の１３－Ｏ－グルコースのＣ－２’に移して、ステビオールビオシドを生成することができる。ＵＧＴ９１Ｄはまた、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ルブソシドトランスフェラーゼとして機能し、グルコース部分をアクセプター分子であるルブソシドの１３－Ｏ－グルコースのＣ－２’に移し、ステビオシドを提供することができる。ＵＧＴ９１Ｄは、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、またはＵＧＴ９１Ｄ様３とも称される。ＵＧＴ９１Ｄ酵素の例としては、Stevia rebaudiana（例えば、受託番号ＡＣＥ８７８５５．１、ＵＳ２０１４／０３２９２８１およびＷＯ２０１６／０３８０９５参照）が挙げられる。
【0049】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ４００８７（ＵＧＴ４００８７）
ＵＧＴ４００８７は、グルコース部分をＲｅｂＡの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位に移してＲｅｂＤを生成することができる。ＵＧＴ４００８７は、グルコース部分をステビオシドの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位に移してＲｅｂＥを生成することもできる。ＵＧＴ４００８７の例としては、受託番号ＸＰ＿００４９８２０５９．１およびＷＯ２０１８／０３１９５５を参照されたい。
ＵＧＴ４００８７は、グルコース部分をＲｅｂＡの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位に移してＲｅｂＤを生成することができる。ＵＧＴ４００８７は、グルコース部分をステビオシドの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位に移してＲｅｂＥを生成することもできる。ＵＧＴ４００８７の例としては、受託番号ＸＰ＿００４９８２０５９．１およびＷＯ２０１８／０３１９５５を参照されたい。
【0050】
ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することができる、追加のウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ
ＵＧＴ４００８７に加えて、他のＵＧＴＡＤは、グルコース部分をＲｅｂＡの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位に移してＲｅｂＤを生成することができ、ＵＧＴＡＤは、グルコース部分をステビオシドの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位に移してＲｅｂＥを生成することも可能である。ＵＧＴＡＤの例としては、Oryza sativa（ＥＵＧＴ１１とも称する（ＷＯ２０１３／０２２９８９および受託番号ＸＰ＿０１５２９１４１．１参照））、Solanum lycopersicum由来のＳ１＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１（ＵＧＴＳＬ２とも称する（ＷＯ２０１４／１９３８８８および受託番号ＸＰ＿００４２５０４８５１参照））、ｓｒ．ＵＧＴ＿９２５７７８、Ｂｄ＿ＵＧＴ０８４０（受託番号ＸＰ＿００３５６０６６９．１参照）、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１（受託番号ＢＡＪ９４０５５．１参照）、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０（受託番号ＸＰ＿０１０２３０８７１．１参照）、ならびにＯＢ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅ（受託番号ＸＰ＿００６６５０４５５１参照）。
ＵＧＴ４００８７に加えて、他のＵＧＴＡＤは、グルコース部分をＲｅｂＡの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位に移してＲｅｂＤを生成することができ、ＵＧＴＡＤは、グルコース部分をステビオシドの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位に移してＲｅｂＥを生成することも可能である。ＵＧＴＡＤの例としては、Oryza sativa（ＥＵＧＴ１１とも称する（ＷＯ２０１３／０２２９８９および受託番号ＸＰ＿０１５２９１４１．１参照））、Solanum lycopersicum由来のＳ１＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１（ＵＧＴＳＬ２とも称する（ＷＯ２０１４／１９３８８８および受託番号ＸＰ＿００４２５０４８５１参照））、ｓｒ．ＵＧＴ＿９２５７７８、Ｂｄ＿ＵＧＴ０８４０（受託番号ＸＰ＿００３５６０６６９．１参照）、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１（受託番号ＢＡＪ９４０５５．１参照）、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０（受託番号ＸＰ＿０１０２３０８７１．１参照）、ならびにＯＢ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅ（受託番号ＸＰ＿００６６５０４５５１参照）。
【0051】
ＭＥＶ経路ＦＰＰおよび／またはＧＧＰＰ生産
いくつかの実施形態において、本願で提供する遺伝子改変宿主細胞は、ＦＰＰおよび／またはＧＧＰＰの形成に有用な、ＭｅＶ経路の１つ以上の異種酵素を含む。ＭｅＶ経路の１つ以上の酵素は、アセチル－ＣｏＡをマロニル－ＣｏＡと縮合させてアセトアセチル－ＣｏＡを形成する酵素、２分子のアセチル－ＣｏＡを縮合させてアセトアセチル－ＣｏＡを形成する酵素、アセチル－ＣｏＡをアセチル－ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ－ＣｏＡを形成する酵素、またはＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸塩に変換する酵素を含み得る。加えて、遺伝子改変宿主細胞は、メバロン酸をメバロン酸５－リン酸にリン酸化するＭｅＶ経路酵素、メバロン酸５－リン酸をメバロン酸５－ピロリン酸に変換するＭｅＶ経路酵素、メバロン酸５－ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換するＭｅＶ経路酵素、またはイソペンテニルピロリン酸をジメチルアリル二リン酸に変換するＭｅＶ経路酵素を含み得る。特に、ＭｅＶ経路の１つ以上の酵素は、アセチル－ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル－ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ－ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびイソペンチル二リン酸：ジメチルアリル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩまたはＩＰＰイソメラーゼ）から選択される。本発明の遺伝子組み換え宿主細胞は、１つ以上のＭｅＶ経路酵素のコード配列を含む１つ以上の異種ヌクレオチド配列から、ＭｅＶの異種酵素のうちの１つ以上を発現してよい。
いくつかの実施形態において、本願で提供する遺伝子改変宿主細胞は、ＦＰＰおよび／またはＧＧＰＰの形成に有用な、ＭｅＶ経路の１つ以上の異種酵素を含む。ＭｅＶ経路の１つ以上の酵素は、アセチル－ＣｏＡをマロニル－ＣｏＡと縮合させてアセトアセチル－ＣｏＡを形成する酵素、２分子のアセチル－ＣｏＡを縮合させてアセトアセチル－ＣｏＡを形成する酵素、アセチル－ＣｏＡをアセチル－ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ－ＣｏＡを形成する酵素、またはＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸塩に変換する酵素を含み得る。加えて、遺伝子改変宿主細胞は、メバロン酸をメバロン酸５－リン酸にリン酸化するＭｅＶ経路酵素、メバロン酸５－リン酸をメバロン酸５－ピロリン酸に変換するＭｅＶ経路酵素、メバロン酸５－ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換するＭｅＶ経路酵素、またはイソペンテニルピロリン酸をジメチルアリル二リン酸に変換するＭｅＶ経路酵素を含み得る。特に、ＭｅＶ経路の１つ以上の酵素は、アセチル－ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル－ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ－ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびイソペンチル二リン酸：ジメチルアリル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩまたはＩＰＰイソメラーゼ）から選択される。本発明の遺伝子組み換え宿主細胞は、１つ以上のＭｅＶ経路酵素のコード配列を含む１つ以上の異種ヌクレオチド配列から、ＭｅＶの異種酵素のうちの１つ以上を発現してよい。
【0052】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換することができる酵素をコードする異種核酸を含む。加えて、宿主細胞は、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合してポリプレニル化合物を形成し得る酵素をコードする異種核酸を含有してもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾して、ＦＰＰなどのイソプレノイド化合物を形成し得る酵素をコードする異種核酸をさらに含有する。
【0053】
アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの変換
遺伝子改変宿主細胞は、アセチルコエンザイムＡの２分子を縮合してアセトアセチル－ＣｏＡ（アセチル－ＣｏＡチオラーゼ）を形成し得る酵素をコードする異種核酸を含んでよい。アセチルＣｏＡチオラーゼをコードするヌクレオチド配列の例としては、（受託番号ＮＣ＿０００９１３領域：２３２１３１．２３２５３１５（Escherichia coli））、（Ｄ４９３６２（Paracoccus denitrificans））、および（Ｌ２０４２８（Saccharomyces cerevisiae））。
遺伝子改変宿主細胞は、アセチルコエンザイムＡの２分子を縮合してアセトアセチル－ＣｏＡ（アセチル－ＣｏＡチオラーゼ）を形成し得る酵素をコードする異種核酸を含んでよい。アセチルＣｏＡチオラーゼをコードするヌクレオチド配列の例としては、（受託番号ＮＣ＿０００９１３領域：２３２１３１．２３２５３１５（Escherichia coli））、（Ｄ４９３６２（Paracoccus denitrificans））、および（Ｌ２０４２８（Saccharomyces cerevisiae））。
【0054】
アセチル－ＣｏＡチオラーゼは、２分子のアセチル－ＣｏＡの可逆的縮合を触媒してアセトアセチル－ＣｏＡを得るが、この反応は熱力学的に好ましくなく、アセトアセチル－ＣｏＡチオリシスは、アセトアセチル－ＣｏＡ合成よりも好ましい。アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＡＡＣＳ）（アセチルＣｏＡ：ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、ＥＣ２．３．１．１９４とも呼ばれる）は、アセチルＣｏＡをマロニルＣｏＡと縮合させ、アセトアセチルＣｏＡを形成する。アセチル－ＣｏＡチオラーゼとは対照的に、ＡＡＣＳ触媒によるアセトアセチル－ＣｏＡ合成は、マロニル－ＣｏＡの関連する脱炭酸により、本質的にエネルギーを好む反応である。加えて、ＡＡＣＳはアセトアセチル－ＣｏＡに対してチオリシス活性を示さないため、反応は不可逆的である。
【0055】
アセチルＣｏＡチオラーゼおよび異種ＡＤＡおよび／またはホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）を発現する細胞において、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼによって触媒される可逆的反応は、アセチルＣｏＡチオリシスを好み、大きなアセチルＣｏＡプールをもたらし得る。ＡＤＡの可逆的活性に鑑みて、このアセチル－ＣｏＡプールは、次いで、アセチル－ＣｏＡをアセトアルデヒドに変換する逆反応にＡＤＡを駆動し、それによって、アセチル－ＣｏＡ生成に向けてＡＤＡによって提供される利益を減少させ得る。同様に、ＰＴＡの活性は可逆的であり、したがって、大きなアセチル－ＣｏＡプールは、ＰＴＡを、アセチル－ＣｏＡをアセチルリン酸に変換する逆反応に向かって駆動し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＡＤＡおよびＰＴＡの前方反応を駆動するためのアセチル－ＣｏＡへの強力なプルを提供するために、本願によって提供される遺伝子改変宿主細胞のＭｅＶ経路は、アセトアセチル－ＣｏＡシンターゼを利用して、アセチル－ＣｏＡおよびマロニル－ＣｏＡからアセトアセチル－ＣｏＡを形成する。
【0056】
ＡＡＣＳは、Streptomyces sp. CL190株由来のものを使用してもよい（Okamura et al., (2010), PNAS, vol.107, pp.11265-11270を参照されたい）。Streptomyces sp.CL190株は、受託番号ＡＢ５４０１３１．１の配列を含み、対応するＡＡＣＳタンパク質配列は、受託番号Ｄ７ＵＲＶ０およびＢＡＪ１００４８の配列を含む。本発明に有用な他のアセトアセチルＣｏＡシンターゼとしては、Streptomyces sp.（受託番号ＡＢ１８３７５０、ＫＯ－３９８８ＢＡＤ８６８０６、ＫＯ－３９８８ＡＢ２１２６２４、およびＫＯ－２９８８ＢＡＥ７８９８３を参照）、S. anulatus 9663株（受託番号ＦＮ１７８４９８およびＣＡＸ４８６６２を参照）、Actinoplanes sp. A40644（受託番号ＡＢ１１３５６８およびＢＡＤ０７３８１を参照）、Streptomyces sp. C（受託番号ＮＺ＿ＡＣＥＷ０１００００６４０およびＺＰ＿０５５１１７０２を参照）、Nocardiopsis dassonvilei DSM43111（受託番号ＮＺ＿ＡＢＵＩ０１００００２３およびＺＰ＿０４３５２８８を参照）、Mycobactium ulserans Agy99（受託番号ＮＣ＿００８６１１およびＹＰ＿９０７１５２を参照）、Mycobactium marinum（受託番号ＮＣ＿０１０６１２およびＹＰ＿００１８５１５０２を参照）、Streptomyces sp. Mg1（受託番号ＮＺ＿ＤＳ５７０５０１およびＺＰ＿０５００２６２６を参照）、Streptomyces sp. AA4（受託番号ＮＺ＿ＡＣＥＶ０１００００３７およびＺＰ＿０５４７８９９２を参照）、S. roseosporus NRRL15998（アクセッション番号ＮＺ＿ＡＢＹＢ０１００２９５およびＺＰ＿０４６９６７６３を参照）、Streptomyces sp. ACTE（アクセッション番号ＮＺ＿ＡＤＦＤ０１００００３０およびＺＰ＿０６２７５８３４を参照）、S. viridochromogenes DSM40736（受託番号ＮＺ＿ＡＣＥＺ０１０００３１およびＺＰ＿０５５２９６９１を参照）、Frankia sp. CcI3（受託番号ＮＣ＿００７７７７およびＹＰ＿４８０１０１を参照）、Nocardia brasiliensis（アクセッション番号ＮＣ＿０１８６８１およびＹＰ＿００６８１２４４０．１を参照）、およびAustwickia chelonae（受託番号ＮＺ＿ＢＡＧＺ０１０００００５およびＺＰ＿１０９５０４９３．１を参照）。さらなる好適なアセトアセチルＣｏＡシンターゼとしては、米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号および第２０１１／０２８１３１５号明細書に記載されているものが挙げられる。
【0057】
本明細書で提供される組成物および方法においても有用なアセトアセチル－ＣｏＡシンターゼには、本明細書で説明されるアセトアセチル－ＣｏＡシンターゼのいずれかの「誘導体」であると言われる分子が含まれる。かかる「誘導体」は、以下の特徴を有する。（１）本明細書に記載のアセトアセチル－ＣｏＡシンターゼのいずれかと実質的な相同性を共有する、および（２）アセチル－ＣｏＡとマロニル－ＣｏＡとの不可逆的な縮合を触媒してアセトアセチル－ＣｏＡを形成することができる。アセトアセチルＣｏＡシンターゼの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が、アセトアセチルＣｏＡシンターゼのものと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である場合、アセトアセチルＣｏＡシンターゼと「実質的な相同性」を共有すると言われている。
【0058】
アセトアセチルＣｏＡからＨＭＧ－ＣｏＡへの変換
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡを別の分子のアセチル－ＣｏＡと縮合して、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）、例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼを形成することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例としては、（ＮＣ＿００１１４５． ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ １９０６１．２０５３６、Saccharomyces cerevisiae）、（Ｘ９６６１７、Saccharomyces cerevisiae）、（Ｘ８３８２、Arabidopsis thaliana）、（ＡＢ０３７９０７、Kitasatospora griseola）、（ＢＴ００７３０２、Homo sapiens）、および（ＮＣ＿００２７５８，Ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＳＡＶ２５４６， ＧｅｎｅＩＤ１１２２５７１、Staphylococcus aureus）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡを別の分子のアセチル－ＣｏＡと縮合して、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）、例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼを形成することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例としては、（ＮＣ＿００１１４５． ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ １９０６１．２０５３６、Saccharomyces cerevisiae）、（Ｘ９６６１７、Saccharomyces cerevisiae）、（Ｘ８３８２、Arabidopsis thaliana）、（ＡＢ０３７９０７、Kitasatospora griseola）、（ＢＴ００７３０２、Homo sapiens）、および（ＮＣ＿００２７５８，Ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＳＡＶ２５４６， ＧｅｎｅＩＤ１１２２５７１、Staphylococcus aureus）が挙げられる。
【0059】
ＨＭＧ－ＣｏＡのメバロン酸への変換
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸塩、例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼに変換することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨを使用するヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼであり得る。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１．３４、ＥＣ１．１．１．８８）は、（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡの（Ｒ）－メバロン酸への還元的脱アシル化を触媒し、クラスＩおよびクラスＩＩのＨＭＧｒの２つのクラスに分類することができる。クラスＩには、真核生物およびほとんどの古細菌由来の酵素が含まれ、クラスＩＩには、特定の原核生物および古細菌のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼが含まれる。配列の乖離に加えて、２つのクラスの酵素は、それらの補因子特異性に関しても異なる。ＮＡＤＰＨのみを利用するクラスＩ酵素とは異なり、クラスＩＩＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨを識別する能力が異なる（例えば、Hedl et al., (2004) Journal of Bacteriology, vol. 186, pp. 1927-1932を参照）。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸塩、例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼに変換することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨを使用するヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼであり得る。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１．３４、ＥＣ１．１．１．８８）は、（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡの（Ｒ）－メバロン酸への還元的脱アシル化を触媒し、クラスＩおよびクラスＩＩのＨＭＧｒの２つのクラスに分類することができる。クラスＩには、真核生物およびほとんどの古細菌由来の酵素が含まれ、クラスＩＩには、特定の原核生物および古細菌のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼが含まれる。配列の乖離に加えて、２つのクラスの酵素は、それらの補因子特異性に関しても異なる。ＮＡＤＰＨのみを利用するクラスＩ酵素とは異なり、クラスＩＩＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨを識別する能力が異なる（例えば、Hedl et al., (2004) Journal of Bacteriology, vol. 186, pp. 1927-1932を参照）。
【0060】
本発明に有用なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼとしては、補助因子としてＮＡＤＨを利用することができるＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、例えば、P. mevalonii、A. fulgidusまたはS. aureus由来のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼが挙げられる。特定の実施形態では、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、補因子としてＮＡＤＨのみを利用することができるＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、例えば、P. mevalonii、S. pomeroyiまたはD. acidovorans由来のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼである。
【0061】
いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、Pseudomonas mevaloniiに由来する。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．８８）をコードする、Pseudomonas mevaloniiの野生型ｍｖａＡ遺伝子の配列は既に報告されている（Beach and Rodwell, (1989), J. Bacteriol., vol. 171, pp. 2994-3001を参照）。Pseudomonas mevaloniiの代表的なｍｖａＡヌクレオチド配列としては、受託番号Ｍ ２４０１５が挙げられる。
【0062】
一部の実施形態では、ＮＡＤＨ利用ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、Silicibacter pomeroyi由来である。Silicibacter pomeroyiの代表的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列としては、受託番号ＮＣ＿００６５６９．１が挙げられる。Silicibacter pomeroyiの代表的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列は、受託番号ＹＰ＿１６４９９４を含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、Delftia acidovoransに由来する。デルフチアアシドボランの代表的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列は、ＮＣ＿０１０００２ ＲＥＧＩＯＮ： ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ （３１９９８０．．３２１２６９）である。Delftia acidovoransの代表的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列は、受託番号ＹＰ＿００１５６１３１８を含む。
【0064】
いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、Solanum tuberosumに由来する（Crane et al., (2002), J. Plant Physiol., vol.159, pp. 1301-1307を参照）。
【0065】
本発明の実施に有用なＮＡＤＨ使用ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼには、本明細書に記載のＮＡＤＨ使用ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのいずれかの「誘導体」であると言われる分子、例えば、P. mevalonii、S. pomeroyiおよびD. acidovorans由来のもの含まれる。かかる「誘導体」は、以下の特徴を有する：（１）本明細書に記載されるＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのいずれかと実質的な相同性を共有する、および（２）ＮＡＤＨを優先的に補因子として使用しながら、（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡの（Ｒ）－メバロン酸への還元的脱アシル化を触媒することができる。ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列がＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのものと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同じである場合、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼと「実質的な相同性」を共有すると言われる。
【0066】
本明細書で使用される場合、「ＮＡＤＨを使用する」という語句は、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼが、補助因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨに対して選択的であることを意味し、例えば、ＮＡＤＨに対してはＮＡＤＰＨよりも高い特異的活性を示すことによってである。補因子としてのＮＡＤＨの選択性は、ｋｃａｔ
（ＮＡＤＨ）／ｋｃａｔ
（ＮＡＤＰＨ））比で表される。本発明のＮＡＤＨ利用ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ｋｃａｔ
（ＮＡＤＨ）／ｋｃａｔ
（ＮＡＤＰＨ）ｋ比が少なくとも５、１０、１５、２０、２５または２５超である。ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨのみを使用してもよい。例えば、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで単独の補因子として供給されるＮＡＤＨと共にいくつかの活性を排他的に示し、ＮＡＤＰＨが単独の補因子として供給されるときには検出可能な活性を示さない。当技術分野で知られている補因子特異性を決定するための任意の方法を利用して、補因子としてＮＡＤＨを優先するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼを同定することができる（例えば、（Kim et al., (2000), Protein Science, vol. 9, pp. 1226-1234）および（Wilding et al., (2000), J. Bacteriol., vol. 182, pp. 5147-5152）を参照）。
【0067】
一部の場合において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、例えば、補因子結合ポケットの部位特異的変異誘発を通じて、ＮＡＰＤＨよりもＮＡＤＨに対して選択的であるように操作される。ＮＡＤＨ選択性を操作するための方法は、Watanabe et al., (2007), Microbiology, vol. 153, pp. 3044-3054に記載されており、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの補因子特異性を決定するための方法は、Kim et al., (2000), Protein Sci., vol. 9, pp. 1226-1234に記載されている。
【0068】
ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、メバロン酸分解経路を天然に含む宿主種、例えば、メバロン酸をその唯一の炭素源として異化する宿主種に由来し得る。これらの場合において、通常、その天然宿主細胞内で内在化（Ｒ）－メバロン酸塩の（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡへの酸化アシル化を触媒する、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、逆反応、すなわち、メバロン酸塩生合成経路を含む遺伝子改変宿主細胞内での（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡの（Ｒ）－メバロン酸塩への還元的脱アシル化を触媒するために利用される。単独の炭素源としてメバロン酸塩を用いて成長することができる原核生物は、（Anderson et al., (1989), J. Bacteriol, vol. 171, pp. 6468-6472）、（Beach et al., (1989), J. Bacteriol., vol. 171, pp. 2994-3001）、（Bensch et al., J. Biol. Chem., vol. 245, pp. 3755-3762）、（Fimongnari et al., (1965), Biochemistry, vol. 4, pp. 2086-2090）、（Siddiqi et al., (1962), Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 8, pp. 110-113）、（Siddiqi et al., (1967), J. Bacteriol., vol. 93, pp. 207-214）、および（Takatsuji et al., (1983), Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 110, pp. 187-193）に記載されている。
【0069】
宿主細胞は、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧｒおよびＮＡＤＰＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの両方を含有し得る。ＮＡＤＰＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼをコードするヌクレオチド配列の例としては、（ＮＭ＿２０６５４８、Drosophila melanogaster）、（ＮＣ＿００２７５８、遺伝子座タグＳＡＶ２５４５、ＧｅｎｅＩＤ １１２２５７０、Staphylococcus aureus）、（ＡＢ０１５６２７、Streptomyces sp. KO 3988）、（切断されたＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼをコードする配列を提供するＡＸ１２８２１３、Saccharomyces cerevisiae）、および（ＮＣ＿００１１４５： ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ （１１５７３４．１１８８９８、Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。
【0070】
メバロン酸塩からメバロン酸－５－リン酸塩への変換
宿主細胞は、メバロン酸塩をメバロン酸５－リン酸塩、例えば、メバロン酸キナーゼに変換することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含んでもよい。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例としては、（Ｌ７７６８８、Arabidopsis thaliana）および（Ｘ５５８７５、Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。
宿主細胞は、メバロン酸塩をメバロン酸５－リン酸塩、例えば、メバロン酸キナーゼに変換することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含んでもよい。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例としては、（Ｌ７７６８８、Arabidopsis thaliana）および（Ｘ５５８７５、Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。
【0071】
メバロン酸－５－リン酸からメバロン酸－５－ピロリン酸への変換
宿主細胞は、メバロン酸５－リン酸をメバロン酸５－ピロリン酸、例えば、ホスホメバロン酸キナーゼに変換することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含んでもよい。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例としては、（ＡＦ４２９３８５、Hevea brasiliensis）、（ＮＭ＿００６５５６、Homo sapienｓ）、および（ＮＣ＿００１１４５． ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ７１２３１５．７１３６７０、Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。
宿主細胞は、メバロン酸５－リン酸をメバロン酸５－ピロリン酸、例えば、ホスホメバロン酸キナーゼに変換することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含んでもよい。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例としては、（ＡＦ４２９３８５、Hevea brasiliensis）、（ＮＭ＿００６５５６、Homo sapienｓ）、および（ＮＣ＿００１１４５． ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ７１２３１５．７１３６７０、Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。
【0072】
メバロン酸－５－ピロリン酸塩のＩＰＰへの変換
宿主細胞は、メバロン酸５－ピロリン酸をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、例えば、メバロン酸ピロリン酸脱炭酸酵素に変換することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含んでもよい。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例としては、（Ｘ９７５５７、Saccharomyces cerevisiae）、（ＡＦ２９００９５、Enterococcus faecium）、および（Ｕ４９２６０、Homo sapiens）が挙げられる。
宿主細胞は、メバロン酸５－ピロリン酸をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、例えば、メバロン酸ピロリン酸脱炭酸酵素に変換することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含んでもよい。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の例示的な例としては、（Ｘ９７５５７、Saccharomyces cerevisiae）、（ＡＦ２９００９５、Enterococcus faecium）、および（Ｕ４９２６０、Homo sapiens）が挙げられる。
【0073】
ＩＰＰからＤＭＡＰＰへの変換
宿主細胞は、ＭＥＶ経路を介して生成されたＩＰＰをジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）、例えばＩＰＰイソメラーゼに変換することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含んでもよい。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列の具体例にとしては、（ＮＣ＿０００９１３、３０３１０８７．３０３１６３５、Escherichia coli）、および（ＡＦ０８２３２６、Haematococcus pluvialis）が挙げられる。
宿主細胞は、ＭＥＶ経路を介して生成されたＩＰＰをジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）、例えばＩＰＰイソメラーゼに変換することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含んでもよい。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列の具体例にとしては、（ＮＣ＿０００９１３、３０３１０８７．３０３１６３５、Escherichia coli）、および（ＡＦ０８２３２６、Haematococcus pluvialis）が挙げられる。
【0074】
ポリプレニルシンターゼ
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合して、５個を超える炭素を含有するポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合して、５個を超える炭素を含有するポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【0075】
宿主細胞は、１つの分子のＩＰＰを１つの分子のＤＭＡＰＰと縮合させて、１つの分子のゲラニルピロリン酸（「ＧＰＰ」）、例えば、ＧＰＰ合成酵素を形成することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含んでよい。そのような酵素をコードするヌクレオチド配列の非限定的な例としては、（ＡＦ５１３１１１、Abies grandis）、（ＡＦ５１３１１２、Abies grandis）、（ＡＦ５１３１１３、Abies grandis）、（ＡＹ５３４６８６、Antirrhinum majus）、（ＡＹ５３４６８７、Antirrhinum majus）、（Ｙ１７３７６、Arabidopsis thaliana）、（ＡＥ０１６８７７、遺伝子座ＡＰ１１０９２、Bacillus cereus、ＡＴＣＣ １４５７９）、（ＡＪ２４３７３９、ｐ Citrus sinensis）、（ＡＹ５３４７４５、Clarkia breweri）、（ＡＹ９５３５０８、Ips pini）、（ＤＱ２８６９３０、Lycopersicon esculentum）、（ＡＦ１８２８２８、Mentha x piperita）、（ＡＦ１８２８２７、Mentha x piperita）、（ＭＰＩ２４９４５３、Mentha x piperita）、（ＰＺＥ４３１６９７、遺伝子座ＣＡＤ２４４２５、Paracoccus zeaxanthinifaciens）、（ＡＹ８６６４９８、Picrorhiza kurrooa）、（ＡＹ３５１８６２、Vitis vinifera）および（ＡＦ２０３８８１、遺伝子座ＡＡＦ１２８４３、Zymomonas mobilis）が挙げられる。
【0076】
宿主細胞は、２つの分子のＩＰＰを１つの分子のＤＭＡＰＰと縮合させるか、またはＧＰＰの分子にＩＰＰの分子を添加して、ファルネシルピロリン酸（「ＦＰＰ」）の分子を形成することができる酵素、例えば、ＦＰＰ合成酵素、をコードする異種ヌクレオチド配列を含有してよい。ＦＰＰ合成酵素をコードするヌクレオチド配列の非限定的な例としては、以下が挙げられる。（ＡＴＵ８０６０５、Arabidopsis thaliana）、（ＡＴＨＦＰＳ２Ｒ、Arabidopsis thaliana）、（ＡＡＵ３６３７６、Artemisia annua）、（ＡＦ４６１０５０、Bos taurus）、（Ｄ００６９４、Escherichia coli K-12）、（ＡＥ００９９５１、遺伝子座ＡＡＬ９５５２３、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、ＡＴＣＣ ２５５８６）、（ＧＦＦＰＰＳＧＥＮ、Gibberella fujikuroi)、（ＣＰ０００００９、遺伝子座ＡＡＷ６００３４、Gluconobacter oxydans 621H）、（ＡＦ０１９８９２、Helianthus annuus）、（ＨＵＭＦＡＰＳ、Homo sapiens）、（ＫＬＰＦＰＳＱＣＲ、Kluyveromyces lactis）、（ＬＡＵ１５７７７、Lupinus albus）、（ＬＡＵ２０７７１、Lupinus albus）、（ＡＦ３０９５０８、Mus musculus）、（ＮＣＦＰＰＳＧＥＮ、Neurospora crassa）、（ＰＡＦＰＳ１、Parthenium argentatum）、（ＰＡＦＰＳ２、Parthenium argentatum）、（ＲＡＴＦＡＰＳ、Rattus norvegicus）、（ＹＳＣＦＰＰ、Saccharomyces cerevisiae）、（Ｄ８９１０４、Schizosaccharomyces pombe）、（ＣＰ０００００３、遺伝子座ＡＡＴ８７３８６、Streptococcus pyogenes）、（ＣＰ００００１７、遺伝子座ＡＡＺ５１８４９、Streptococcus pyogenes）、（ＮＣ＿００８０２２、遺伝子座ＹＰ＿５９８８５６、Streptococcus pyogenes MGAS10270）、（ＮＣ＿００８０２３、遺伝子座ＹＰ＿６００８４５、Streptococcus pyogenes MGAS2096）、（ＮＣ＿００８０２４、遺伝子座ＹＰ＿６０２８３２、Streptococcus pyogenes MGAS10750）、（ＭＺＥＦＰＳ、Zea mays）、（ＡＥ０００６５７、遺伝子座ＡＡＣ０６９１３、Aquifex aeolicus VF5）、（ＮＭ＿２０２８３６、Arabidopsis thaliana）、（Ｄ８４４３２、遺伝子座ＢＡＡ１２５７５、Bacillus subtilis）、（Ｕ１２６７８、遺伝子座ＡＡＣ２８８９４、Bradyrhizobium japonicum USDA 110）、（ＢＡＣＦＤＰＳ、Geobacillus stearothermophilus）、（ＮＣ＿００２９４０、遺伝子座ＮＰ＿８７３７５４、Haemophilus ducreyi 35000HP）、（Ｌ４２０２３、遺伝子座ＡＡＣ２３０８７、Haemophilus influenzae Rd KW20）、（Ｊ０５２６２、Homo sapiens）、（ＹＰ＿３９５２９４、Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K）、（ＮＣ＿００５８２３、遺伝子座ＹＰ＿０００２７３、Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz L1-130）、（ＡＢ００３１８７、Micrococcus luteus）、（ＮＣ＿００２９４６、遺伝子座ＹＰ＿２０８７６８、Neisseria gonorrhoeae FA 1090）、（Ｕ０００９０、遺伝子座ＡＡＢ９１７５２、Rhizobium sp. NGR234）、（Ｊ０５０９１、Saccharomyces cerevisae）、（ＣＰ００００３１、遺伝子座ＡＡＶ９３５６８、Silicibacter pomeroyi DSS-3）、（ＡＥ００８４８１、遺伝子座ＡＡＫ９９８９０、Streptococcus pneumoniae R6）、ａｎｄ （ＮＣ＿００４５５６、遺伝子座ＮＰ ７７９７０６、Xylella fastidiosa Temecula1).
【0077】
加えて、宿主細胞は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰ、またはＩＰＰとＦＰＰを組み合わせてゲラニルゲラニルピロリン酸（「ＧＧＰＰ」）を形成することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含有してもよい。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の非限定的な例としては、以下が挙げられる。（ＡＴＨＧＥＲＰＹＲＳ、Arabidopsis thaliana）、（ＢＴ００５３２８、Arabidopsis thaliana）、（ＮＭ＿１１９８４５、Arabidopsis thaliana）、（ＮＺ＿ＡＡＪＭ０１０００３８０、遺伝子座ＺＰ＿００７４３０５２、Bacillus thuringiensis serovar israelensis、ＡＴＣＣ ３５６４６ ｓｑ１５６３）、（ＣＲＧＧＰＰＳ、Catharanthus roseus）、（ＮＺ＿ＡＡＢＦ０２００００７４、遺伝子座ＺＰ＿００１４４５０９、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、ＡＴＣＣ ４９２５６）、（ＧＦＧＧＰＰＳＧＮ、Gibberella fujikuroi）、（ＡＹ３７１３２１、Ginkgo biloba）、（ＡＢ０５５４９６、Hevea brasiliensis）、（ＡＢ０１７９７１、Homo sapiens）、（ＭＣＩ２７６１２９、Mucor circinelloides f. lusitanicus）、（ＡＢ０１６０４４、Mus musculus）、（ＡＡＢＸ０１０００２９８、遺伝子座ＮＣＵ０１４２７、Ｎeurospora crassa）、（ＮＣＵ２０９４０、Neurospora crassa）、（ＮＺ＿ＡＡＫＬ０１０００００８、遺伝子座ＺＰ＿００９４３５６６、Ralstonia solanacearum UW551）、（ＡＢ１１８２３８、Rattus norvegicus）、（ＳＣＵ３１６３２、Saccharomyces cerevisiae）、（ＡＢ０１６０９５、Synechococcus elongates）、（ＳＡＧＧＰＳ、Sinapis alba）、（ＳＳＯＧＤＳ、Sulfolobus acidocaldarius）、（ＮＣ＿００７７５９、遺伝子座ＹＰ＿４６１８３２、Syntrophus aciditrophicus SB）、（ＮＣ＿００６８４０、遺伝子座ＹＰ＿２０４０９５、Vibrio fischeri ES114）、（ＮＭ＿１１２３１５、Arabidopsis thaliana）、（ＥＲＷＣＲＴＥ、Pantoea agglomerans）、（Ｄ９００８７、遺伝子座ＢＡＡ１４１２４、Pantoea ananatis）、（Ｘ５２２９１、遺伝子座ＣＡＡ３６５３８、Rhodobacter capsulatus）、（ＡＦ１９５１２２、遺伝子座ＡＡＦ２４２９４、Rhodobacter sphaeroides）、および（ＮＣ＿００４３５０、遺伝子座ＮＰ＿７２１０１５、Streptococcus mutans UA159）。
【0078】
メバロン酸経路の酵素の例が上記に記載されているが、ある特定の実施形態において、ＤＸＰ経路の酵素は、本明細書に記載の宿主細胞、組成物、および方法においてＤＭＡＰＰおよびＩＰＰを産生するための代替または追加の経路として使用することができる。ＤＸＰ経路の酵素をコードする酵素および核酸は、当該技術分野において周知であり、かつ特徴付けられている、例えば、ＷＯ２０１２／１３５５９１を参照。
【0079】
レバウジオシドＭの製造方法
本発明は、（ａ）レバウジオシドＭを作製するのに好適な条件下で、炭素源を有する培地中でレバウジオシドＭを作製することができる、本明細書に記載の遺伝子改変宿主細胞のいずれかの集団を培養すること、および（ｂ）９５％を超える純度で培地からレバウジオシドＭを回収することを含む、９５％を超えるレバウジオシドＭを含む高強度甘味料の作製を提供する。
本発明は、（ａ）レバウジオシドＭを作製するのに好適な条件下で、炭素源を有する培地中でレバウジオシドＭを作製することができる、本明細書に記載の遺伝子改変宿主細胞のいずれかの集団を培養すること、および（ｂ）９５％を超える純度で培地からレバウジオシドＭを回収することを含む、９５％を超えるレバウジオシドＭを含む高強度甘味料の作製を提供する。
【0080】
遺伝子組み換え宿主細胞は、遺伝子組み換えを有しない親細胞、または遺伝子組み換えの一部のみを有するが、それ以外の部分は遺伝的に同一である親細胞と比較して、増加した量のレバウジオシドＭを産生する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発酵培地１リットル当たり約１グラムを超える上昇したレベルのレバウジオシドＭを産生し得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発酵培地１リットル当たり約５グラムを超える上昇したレベルのレバウジオシドＭを産生する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発酵培地１リットル当たり約１０グラムを超える上昇したレベルのレバウジオシドＭを産生する。いくつかの実施形態では、レバウジオシドＭは、細胞培養１リットル当たり約１０～約５０グラム、約１０～約１５グラム、約１５グラム超、約２０グラム超、約２５グラム超、または約４０グラム超の量で産生される。
【0081】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、乾燥細胞重量１グラム当たり約５０ｍｇを超える上昇したレベルのレバウジオシドＭを産生する。いくつかのかかる実施形態では、レバウジオシドＭは、乾燥細胞重量１グラム当たり約５０～約１５００ミリグラム、約１００ミリグラム超、約１５０ミリグラム超、約２００ミリグラム超、約２５０ミリグラム超、約５００ミリグラム超、約７５０ミリグラム超、または約１０００ミリグラム超の量で産生される。
【0082】
ほとんどの実施形態において、宿主細胞による上昇したレベルのレバウジオシドＭの産生は、誘導化合物の存在によって誘導可能である。かかる宿主細胞は、誘導化合物の非存在下で容易に操作することができる。次いで、誘導化合物を添加して、宿主細胞による上昇したレベルのレバウジオシドＭの産生を誘導する。他の実施形態において、宿主細胞によるステビオールグリコシドの上昇したレベルの産生は、例えば、増殖温度、培地成分等の培養条件を変化させることによって誘導可能である。
培地と条件
培地と条件
【0083】
微生物培養物の維持および増殖のための材料および方法は、微生物学または発酵科学の当業者に周知である（例えば、Bailey et al., Biochemical Engineering Fundamentals, second edition, McGraw Hill, New York, 1986）。宿主細胞の特定の要件、発酵、およびプロセスに応じて、適切な培養培地、ｐＨ、温度、および好気、微好気、または嫌気条件の要件を考慮しなければならない。
【0084】
本願で提供するレバウジオシドＭの製造方法は、細胞培養プレート、マイクロタイタープレート、フラスコ、または発酵槽を含むが、これらに限定されない、好適な容器内の好適な培養培地（例えば、パントテン酸塩補充の有無にかかわらず）で実施してよい。さらに、本方法は、微生物製品の工業的生産を支持するために当該技術分野で既知の任意の発酵スケールで実施することができる。攪拌タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、気泡発酵槽、またはこれらの任意の組み合わせを含む、任意の好適な発酵槽を使用してよい。Saccharomyces cerevisiaeを宿主細胞として利用する特定の実施形態では、細胞株は、in Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Sixth Edition, vol. 12, pp. 398-473, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KDaA, Weinheim, Germany内のKosaric, et al.に記載の発酵槽で培養することができる。
【0085】
いくつかの実施形態では、培地は、レバウジオシドＭを産生することができる遺伝子改変微生物が存在し得る任意の培地である。培地は、同化可能な炭素、窒素およびリン酸塩源を含む水性培地であってよい。かかる培地はまた、適切な塩、鉱物、金属、および他の栄養素を含むことができる。炭素源および必須細胞栄養素の各々は、発酵培地に増分または連続的に添加され得、各必要な栄養素は、例えば、炭素源をバイオマスに変換する細胞の代謝機能または呼吸機能に基づく所定の細胞成長曲線に従って、増殖細胞による効率的な同化に必要な基本的な最小レベルに維持され得る。
【0086】
微生物を培養するための好適な条件および好適な培地は、当該技術分野において周知である。例えば、好適な培地は、例えば、誘導剤（例えば、遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合）、リプレッサー（例えば、遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列が抑制性プロモーターの制御下にある場合）、または選択剤（例えば、遺伝子組み換えを含む微生物を選択するための抗生物質）などの１つ以上の追加の薬剤で補充され得る。
【0087】
炭素源は、単糖（単糖）、二糖、多糖、非発酵性炭素源、またはそれらの１つ以上の組み合わせであってよい。好適な単糖類の非限定的な例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、キシロース、リボース、およびそれらの組み合わせが挙げられる。二糖類の非限定的な例には、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、およびそれらの組み合わせが含まれる。好適な多糖類の非限定的な例としては、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。好適な非発酵性炭素源の非限定的な例としては、酢酸塩およびグリセロールが挙げられる。
【0088】
培地中のグルコース等の炭素源の濃度は、細胞成長を促進するのに十分であり得るが、使用される微生物の成長を抑制するほど高くはない。典型的には、培養物は、所望のレベルの成長およびバイオマスを達成するために、グルコースなどの炭素源がレベルで添加された状態で実行される。培地中のグルコース等の炭素源の濃度は、約１ｇ／Ｌ超、好ましくは約２ｇ／Ｌ超、およびより好ましくは約５ｇ／Ｌ超であり得る。加えて、培地中のグルコース等の炭素源の濃度は、典型的には、約１００ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｇ／Ｌ未満、およびより好ましくは約２０ｇ／Ｌ未満である。なお、培養成分濃度への言及は、初期および／または継続中の成分濃度の両方を指すことができる。場合によっては、培養中に培地が炭素源から枯渇することを可能にすることが望ましい場合がある。
【0089】
好適な培地で使用することができる同化性窒素源としては、単純窒素源、有機窒素源および複雑窒素源が挙げられる。そのような窒素源としては、無水アンモニア、アンモニウム塩、および動物、植物および／または微生物起源の物質が挙げられる。好適な窒素源としては、タンパク質加水分解物、微生物バイオマス加水分解物、ペプトン、酵母抽出物、硫酸アンモニウム、尿素、およびアミノ酸が挙げられる。典型的には、培地中の窒素源の濃度は、約０．１ｇ／Ｌ超、好ましくは約０．２５ｇ／Ｌ超、より好ましくは約１．０ｇ／Ｌ超である。しかしながら、ある濃度を超えると、培地中に窒素源を添加することは、微生物の増殖に有利ではない。その結果、培地中の窒素源の濃度は、約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約５ｇ／Ｌ未満である。さらに、場合によっては、培養中に培地が窒素源から枯渇することを可能にすることが望ましい場合がある。
【0090】
有効な培地は、無機塩、ビタミン、微量金属、または成長促進剤などの他の化合物を含有し得る。かかる他の化合物はまた、有効な培地中の炭素、窒素、または鉱物源中に存在してもよく、または培地に特異的に添加されてもよい。
【0091】
培地はまた、好適なリン酸塩源を含有してもよい。かかるリン酸塩源としては、無機リン酸塩源および有機リン酸塩源の両方が挙げられる。好ましいリン酸塩源としては、モノまたは二塩基性ナトリウムおよびリン酸カリウム等のリン酸塩、リン酸アンモニウムおよびこれらの混合物が挙げられる。典型的には、培地中のリン酸塩の濃度は、約１．０ｇ／Ｌより大きく、好ましくは約２．０ｇ／Ｌより大きく、より好ましくは約５．０ｇ／Ｌより大きい。しかしながら、特定の濃度を超えると、培地中にリン酸塩を添加することは、微生物の増殖に有利ではない。したがって、培地中のリン酸塩の濃度は、典型的には、約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満である。
【0092】
好適な培地はまた、好ましくは、生理学的に許容される塩の形態のマグネシウム源、例えば、硫酸マグネシウム七水和物を含むことができるが、同様の量のマグネシウムに寄与する濃度の他のマグネシウム源を使用することができる。典型的には、培地中の窒素源の濃度は、約０．１ｇ／Ｌ超、好ましくは約０．２５ｇ／Ｌ超、より好ましくは約１．０ｇ／Ｌ超である。しかしながら、ある濃度を超えると、培地中に窒素源を添加することは、微生物の増殖に有利ではない。したがって、培地中のマグネシウムの濃度は、典型的には、約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約３ｇ／Ｌ未満である。さらに、いくつかの事例では、培養中に培地がマグネシウム源の枯渇になることを可能にすることが望ましい場合がある。
【0093】
培地はまた、クエン酸三ナトリウムの二水和物などの生物学的に許容されるキレート剤を含むことができる。このような場合、培地中のキレート剤の濃度は、約０．２ｇ／Ｌ超、好ましくは約０．５ｇ／Ｌ超、より好ましくは約１ｇ／Ｌ超である。しかしながら、ある濃度を超えると、培地中にキレート剤を添加することは、微生物の増殖に有利ではない。したがって、培地中のキレート剤の濃度は、典型的には約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約２ｇ／Ｌ未満である。
【0094】
培地はまた、最初に、培地の所望のｐＨを維持するための生物学的に許容される酸または塩基を含んでもよい。生物学的に許容される酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的に許容される塩基としては、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、使用される塩基は、水酸化アンモニウムである。
【0095】
培地はまた、塩化カルシウムを含むが、これらに限定されない、生物学的に許容されるカルシウム源を含んでもよい。典型的には、培地中の塩化カルシウム、二水和物等のカルシウム源の濃度は、約５ｍｇ／Ｌ～約２０００ｍｇ／Ｌの範囲内、好ましくは約２０ｍｇ／Ｌ～約１００００ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは約５０ｍｇ／Ｌ～約５００ｍｇ／Ｌの範囲内である。
【0096】
培地はまた、塩化ナトリウムを含んでもよい。典型的には、培地中の塩化ナトリウムの濃度は、約０．１ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌの範囲内であり、好ましくは、約１ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌの範囲内であり、より好ましくは、約２ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌの範囲内である。
【0097】
培地はまた、微量金属を含んでもよい。このような微量金属は、便宜上、残りの培地とは別に調製することができる原液として培地に添加することができる。典型的には、培地に添加されるかかる微量金属溶液の量は、約１ｍＬ／Ｌより大きく、好ましくは約５ｍＬ／Ｌより大きく、より好ましくは約１０ｍＬ／Ｌより大きい。しかしながら、特定の濃度を超えて、培地に微量金属を添加することは、微生物の増殖に有利ではない。したがって、培地に添加されるかかるトレース金属溶液の量は、典型的には、約１００ｍＬ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｍＬ／Ｌ未満、およびより好ましくは約３０ｍＬ／Ｌ未満である。なお、ストック溶液にトレース金属を添加することに加えて、個々の構成要素を別々に添加することができ、各構成要素は、上記のトレース金属溶液の範囲によって指示される構成要素の量に独立して対応する範囲内である。
【0098】
培地は、パントテン酸塩、ビオチン、カルシウム、パントテン酸塩、イノシトール、ピリドキシン－ＨＣｌ、およびチアミン－ＨＣｌ等の他のビタミンを含んでよい。このような微量金属は、便宜上、残りの培地とは別に調製することができる原液として培地に添加することができる。しかしながら、一定の濃度を超えると、培地にビタミンを添加することは、微生物の増殖には有利ではない。
【0099】
本明細書に記載の発酵方法は、バッチ、飼料バッチ、細胞リサイクル、連続および半連続を含むが、これらに限定されない、従来の培養モードで行うことができる。いくつかの実施形態では、発酵は、供給バッチモードで実行される。このような場合、培地の成分の一部は、発酵の製造段階でパントテン酸塩を含む培養中に枯渇する。いくつかの実施形態では、培養物は、例えば、生成段階の開始時に、そのような成分の比較的高い濃度で補充されてもよく、その結果、付加が必要とされる前に、成長および／またはステビオールグリコシド産生が一定期間支持される。これらの成分の好ましい範囲は、レベルが培養物によって枯渇するにつれて追加することによって、培養物全体にわたって維持される。培地中の成分のレベルは、例えば、定期的に培地をサンプリングし、濃度をアッセイすることによって監視することができる。あるいは、標準的な培養手順が開発されると、添加は、培養物全体の特定の時点での既知のレベルに対応する時間間隔で行われ得る。当業者に認識されるように、培地の細胞密度が増加するにつれて、培養中の栄養素の消費速度が増加する。また、培地への外来微生物の導入を避けるために、当技術分野で公知のように無菌添加法を用いて添加を行う。加えて、発泡防止剤を培養中に添加してもよい。
【0100】
培地の温度は、遺伝子改変細胞の増殖および／またはステビオールグリコシドの産生に好適な任意の温度であり得る。例えば、培地に接種する前に、培地を約２０℃～約４５℃の範囲、好ましくは約２５℃～約４０℃の範囲、より好ましくは約２８℃～約３２℃の範囲の温度に維持することができる。培地のｐＨは、培地に酸または塩基を添加することによって制御することができる。このような場合において、水酸化アンモニウムを用いてｐＨを制御する場合には、好都合に培地中の窒素源としての役割も果たす。好ましくは、ｐＨは、約３．０～約８．０、より好ましくは約３．５～約７．０、最も好ましくは約４．０～約６．５に維持される。
【0101】
培地のグルコース濃度等の炭素源濃度を培養中にモニタリングする。培地のグルコース濃度は、例えば、グルコースオキシダーゼ酵素試験または高圧液体クロマトグラフィーの使用などの既知の技術を使用して監視することができ、これを使用して、上清、例えば、培地の無細胞成分中のグルコース濃度を監視することができる。炭素源濃度は、典型的には、細胞成長阻害が生じるレベル未満に維持される。このような濃度は生物によって異なる場合があるが、炭素源としてのグルコースについては、約６０ｇ／Ｌを超えるグルコース濃度で細胞成長阻害が起こり、試験によって容易に決定することができる。したがって、グルコースを炭素源として使用する場合、グルコースは好ましくは発酵槽に供給され、検出限界以下に維持される。あるいは、培地中のグルコース濃度は、約１ｇ／Ｌ～約１００ｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは約２ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの範囲内、さらにより好ましくは約５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌの範囲内に維持される。炭素源濃度は、例えば、実質的に純粋なグルコース溶液を添加することによって、所望のレベル内に維持することができるが、元の培地のアリコートを添加することによって、培地の炭素源濃度を維持することが許容され、好ましい場合がある。培地中の他の栄養素（例えば、窒素源およびリン酸源）の濃度を同時に維持することができるため、元の培地のアリコートの使用が望ましい場合がある。同様に、微量金属濃度は、微量金属溶液のアリコートを添加することによって培地中で維持することができる。
【0102】
他の好適な発酵培地および方法は、例えば、国際公開第２０１６／１９６３２１号に記載されている。
【0103】
ステビオールグリコシドの回収
ステビオールグリコシドが宿主細胞によって産生されると、当該技術分野で既知の任意の好適な分離および精製方法を使用して、その後の使用のために回収または単離され得る。例えば、ステビオールグリコシドを含有する明瞭化水相は、遠心分離によって発酵から分離され得る。あるいは、ステビオールグリコシドを含有する明瞭化水相は、発酵反応に脱乳化剤を添加することによって発酵から分離されてよい。脱乳化剤の例としては、凝固剤および凝固剤が挙げられる。
ステビオールグリコシドが宿主細胞によって産生されると、当該技術分野で既知の任意の好適な分離および精製方法を使用して、その後の使用のために回収または単離され得る。例えば、ステビオールグリコシドを含有する明瞭化水相は、遠心分離によって発酵から分離され得る。あるいは、ステビオールグリコシドを含有する明瞭化水相は、発酵反応に脱乳化剤を添加することによって発酵から分離されてよい。脱乳化剤の例としては、凝固剤および凝固剤が挙げられる。
【0104】
宿主細胞内で産生されるステビオールグリコシドは、培養上清中に存在してもよく、および／または宿主細胞と会合してもよい。ステビオールグリコシドのいくつかが宿主細胞と会合している場合、ステビオールグリコシドの回収は、細胞からのステビオールグリコシドの放出を改善する方法を含み得る。これは、界面活性剤の有無にかかわらず、および緩衝液または塩の添加の有無にかかわらず、熱水または緩衝液処理で細胞を洗浄する形態をとることができる。温度は、ステビオールグリコシドを放出するのに適していると考えられる任意の温度であってよい。例えば、温度は、４０～９５℃、または６０～９０℃、または７５～８５℃の範囲であり得る。あるいは、温度は、４０、４５、５０、５５、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５℃であってもよい。物理的または化学的な細胞破壊は、宿主細胞からのステビオールグリコシドの放出を増強するために使用され得る。あるいは、および／またはその後、培地中のステビオールグリコシドは、溶媒抽出、膜澄清、膜濃度、吸着、クロマトグラフィー、蒸発、化学誘導体化、結晶化、および乾燥を含む単離単位操作を使用して回収され得る。
【0105】
好ましい実施形態において、レバウジオシドＭは、発酵実行中に宿主細胞によって産生される。発酵が完了したら、発酵ブロスを遠心分離して宿主細胞および他の密集した破片を除去する。次いで、クリアしたブロスを水で希釈し、ＮａＯＨを添加することによりｐＨをｐＨ１０に調節する。次いで、クリアしたブロスを２０ｋＤａカットオフ値で限外濾過し、より大きな溶質をより小さいステビオールグリコシドから分離する。濾液をクエン酸でｐＨ調整し、３００～５００Ｄａフィルターでナノ濾過する。ナノ濾過は、レバウジオシドＭを濃縮し、その後、溶液から結晶化して酸性スラリーを形成する。次いで、酸性スラリーを第１のフィルタープレスに通し、酸洗浄で洗浄する。酸洗浄物を第２のフィルタープレスに通し、水中に再懸濁し、噴霧乾燥させて、最終精製したレバウジオシドＭを形成する。
【実施例】
【0106】
実施例１： レバウジオシドＭを産生することができる酵母菌株
高レベルのレバウジオシドＭを産生する酵母菌株を作製した。ファルネセン生産株は、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモーターの制御下でメバロン酸経路の遺伝子を発現させることにより、野生型Saccharomyces cerevisiae株（ＣＥＮ．ＰＫ２）から作製した。この株は、染色体に組み込まれた、S. cerevisiae由来の以下のメバロン酸経路の遺伝子を含む：アセチル－ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰ：ＤＭＡＰＰイソメラーゼ。加えて、この株は、同じくＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモーターのいずれかの制御下にある、Artemisi aannua由来のファルネセン合成酵素の複数のコピーを含有した。本明細書に記載のすべての異種遺伝子を、公開されている利用可能なまたは他の好適なアルゴリズムを使用してコドン最適化した。株はまた、ＧＡＬ８０遺伝子の欠失を有し、スクアレンシンターゼをコードするＥＲＧ９遺伝子は、天然プロモーターを酵母遺伝子ＭＥＴ３のプロモーターに置き換えることによって下方制御された（Westfall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(3), 2012, pp. E111-E118）。イソプレノイドに対する高いフラックスを有するS. cerevisiae株を作製する方法の例は、それらの全体が本明細書に援用される、米国特許第８，４１５，１３６号明細書および米国特許第８，２３６，５１２号明細書に記載されている。
高レベルのレバウジオシドＭを産生する酵母菌株を作製した。ファルネセン生産株は、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモーターの制御下でメバロン酸経路の遺伝子を発現させることにより、野生型Saccharomyces cerevisiae株（ＣＥＮ．ＰＫ２）から作製した。この株は、染色体に組み込まれた、S. cerevisiae由来の以下のメバロン酸経路の遺伝子を含む：アセチル－ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰ：ＤＭＡＰＰイソメラーゼ。加えて、この株は、同じくＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモーターのいずれかの制御下にある、Artemisi aannua由来のファルネセン合成酵素の複数のコピーを含有した。本明細書に記載のすべての異種遺伝子を、公開されている利用可能なまたは他の好適なアルゴリズムを使用してコドン最適化した。株はまた、ＧＡＬ８０遺伝子の欠失を有し、スクアレンシンターゼをコードするＥＲＧ９遺伝子は、天然プロモーターを酵母遺伝子ＭＥＴ３のプロモーターに置き換えることによって下方制御された（Westfall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(3), 2012, pp. E111-E118）。イソプレノイドに対する高いフラックスを有するS. cerevisiae株を作製する方法の例は、それらの全体が本明細書に援用される、米国特許第８，４１５，１３６号明細書および米国特許第８，２３６，５１２号明細書に記載されている。
【0107】
図１は、ＦＰＰからステビオールへの例示的な生合成経路を示す。図２は、ステビオールからグリコシドＲｅｂＭへの例示的な生合成経路を示す。上述のファルネセンに基づく株をＣ２０イソプレノイドカウレンに対し、高いフラックスを有する株に変換するために、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）の４つのコピーをゲノムに組み込み、続いてコパリル二リン酸合成酵素の２つのコピーおよびカウレン合成酵素の単一のコピーを組み込んだ。この時点で、ファルネセンシンターゼの全てのコピーを株から除去した。新たな株がエントカウレンを作製することが確認されると、エントカウレンをＲｅｂＭに変換するための残りの遺伝子をゲノムに挿入した。表１は、ＦＰＰをＲｅｂＭに変換するために使用される全ての遺伝子およびプロモーターを列挙する。カウレンシンターゼの後の各遺伝子は、２つの遺伝子コピーが統合されたＳｒ．ＫＡＨ酵素を除き、単一のコピーとして統合された。表１に記載される全ての遺伝子を含有する株は、主にＲｅｂＭを産生した。
【0108】
【表1】
【0109】
実施例２： レバウジオシドＭ発酵プロセス
ＲｅｂＭを含有するブロスを得るための発酵プロセスは、図３に示されるステップで構成される。各工程は、酵母の増殖および産生のためのｐＨ、温度、通気および栄養素の適切な条件を与える。主な条件は、各ステップについて表２に要約され、以下により詳細に説明される。
ＲｅｂＭを含有するブロスを得るための発酵プロセスは、図３に示されるステップで構成される。各工程は、酵母の増殖および産生のためのｐＨ、温度、通気および栄養素の適切な条件を与える。主な条件は、各ステップについて表２に要約され、以下により詳細に説明される。
【0110】
このプロセスは、－７０℃で保存されたグリセロール溶液中の酵母のストックから開始した。生産発酵槽に接種するのに十分なバイオマスを蓄積するために、フラスコ内で培養する２つの工程と、タンク内で培養する２つの工程があった。すべての発酵槽を培地（栄養素の溶液）で開始し、前工程からの培養液を接種した。サトウキビ由来の糖の濃縮飼料溶液を、酵母が成長および／またはＲｅｂＭを産生することを可能にするために、バッチ培養または流加培養で提供した。主発酵槽（ＭＦ）中の飼料は、発酵糖を制限したままにするように設計されていたが、製造段階（８日間）の工程の長さのため、飼料をパルスで送達し、８日目の最終収穫単位を溶存酸素のスパイクでチェックし、タンクにほぼ連続的に飼料が供給され、体積が増加し、部分抽出が行われた。部分抽出物および収穫物から収集したすべてのブロスを、分離および精製ユニットを通じて処理して、最終的に精製されたＲｅｂＭを生成した。
【0111】
【表2】
【0112】
実施例３： レバウジオシドＭの精製プロセス
全体的なＲｅｂＭ精製スキームは、図４および表３に概説されている。精製プロセスは、発酵ブロスに水を添加した後、７５℃まで８０℃に加熱してＲｅｂＭを完全に可溶化することから開始した。次に、希釈した発酵ブロスを遠心分離して、バイオマスおよび固体を、ＲｅｂＭ含有上清相から分離した（菌体を除去した発酵ブロス）。遠心分離後、菌体を除去した発酵ブロスを、２０ｋＤａのカットオフ値を有するフィルターを使用して限外濾過した。限外濾過は、浸透液を含有するＲｅｂＭから、より大きく、より溶解性の低い基質を除去した。次いで、３００～５００Ｄａのカットオフ値を有するフィルターシステムでナノ濾過によって透過物を処理した。ナノ濾過工程は、水および一価の塩を除去することを可能にしながら、ＲｅｂＭを保持し、濃縮した。ナノ濾過中に、ＲｅｂＭを濃縮したスラリーを作製した。スラリーを第１のフィルタープレスによって収集した。次いで、収集したスラリーを、洗浄液を含有するクエン酸（ｐＨ３～４）の添加、続いて第２のフィルタープレスによって洗浄し、固体ＲｅｂＭを酸性洗浄液から除去した。第１および第２のフィルタープレスの両方からのウェットケーキを噴霧乾燥させて粉末を製造した。精製されたＲｅｂＭ粉末の３つの別個のサンプルをＨＰＬＣおよび質量分析計によって分析し、表４に示されるようにそのステビオールグリコシド不純物プロファイルを決定した。特に、２つの試料を、単一のフィルタープレス（カラム１ａＦＰ－５および１ａＦＰ－６）の後に得、第３の試料を、第２のフィルタープレス（２ａＦＰ－１）の後に得た。示されるように、３つの試料は全て、乾燥物質の９５重量％を超えるレバウジオシドＭ、および総ステビオールグリコシド含有量（ＴＳＧ）によって測定した９９％を超えるレバウジオシドＭを含有した。
全体的なＲｅｂＭ精製スキームは、図４および表３に概説されている。精製プロセスは、発酵ブロスに水を添加した後、７５℃まで８０℃に加熱してＲｅｂＭを完全に可溶化することから開始した。次に、希釈した発酵ブロスを遠心分離して、バイオマスおよび固体を、ＲｅｂＭ含有上清相から分離した（菌体を除去した発酵ブロス）。遠心分離後、菌体を除去した発酵ブロスを、２０ｋＤａのカットオフ値を有するフィルターを使用して限外濾過した。限外濾過は、浸透液を含有するＲｅｂＭから、より大きく、より溶解性の低い基質を除去した。次いで、３００～５００Ｄａのカットオフ値を有するフィルターシステムでナノ濾過によって透過物を処理した。ナノ濾過工程は、水および一価の塩を除去することを可能にしながら、ＲｅｂＭを保持し、濃縮した。ナノ濾過中に、ＲｅｂＭを濃縮したスラリーを作製した。スラリーを第１のフィルタープレスによって収集した。次いで、収集したスラリーを、洗浄液を含有するクエン酸（ｐＨ３～４）の添加、続いて第２のフィルタープレスによって洗浄し、固体ＲｅｂＭを酸性洗浄液から除去した。第１および第２のフィルタープレスの両方からのウェットケーキを噴霧乾燥させて粉末を製造した。精製されたＲｅｂＭ粉末の３つの別個のサンプルをＨＰＬＣおよび質量分析計によって分析し、表４に示されるようにそのステビオールグリコシド不純物プロファイルを決定した。特に、２つの試料を、単一のフィルタープレス（カラム１ａＦＰ－５および１ａＦＰ－６）の後に得、第３の試料を、第２のフィルタープレス（２ａＦＰ－１）の後に得た。示されるように、３つの試料は全て、乾燥物質の９５重量％を超えるレバウジオシドＭ、および総ステビオールグリコシド含有量（ＴＳＧ）によって測定した９９％を超えるレバウジオシドＭを含有した。
【0113】
【表3】
【0114】
【表4】
【0115】
実施例４： 砂糖代替物
９０％のエリスリトール、９．５％の可溶性繊維（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ ＮＵＴＲＩＯＳＥ ＦＭ１０）、および０．５％の精製レバウジオシドＭを含む砂糖代替品を調製した。まとめると、１１０ポンドのエリスリトール、１１．６ポンドの可溶性繊維（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ ＮＵＴＲＩＯＳＥ ＦＭ１０）、および０．７９ポンドの９５％以上のレバウジオシドＭを得た。５５ポンドのエリスリトールを容量１５０ポンドのミキサー（Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ 水平スクリューミキサー）に入れ、ミキサーを運転速度（plow speed）３０で２分間運転して、ミキサーをコーティングした。１１．６ポンドの可溶性繊維、０．７９ポンドの純度＞９５％のレバウジオシドＭ、および５５ポンドのエリスリトールをミキサーに順次添加した。運転速度を３０に設定し、６分間混合した。次いでチョッパーを運転速度３０に設定し、２分間混合した。１０オンスの蒸留水をスプレー器に添加し、運転速度を３０に設定し、さらに５分間混合した。チョッパーの運転速度を３０に設定し、真空下（－５Ｈｇまたは－０．２ＢＡＲ）で３分間乾燥させた。次いで、混合物を、バッガーに取り付けられたホッパーに袋詰めのために積み込んだ。
９０％のエリスリトール、９．５％の可溶性繊維（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ ＮＵＴＲＩＯＳＥ ＦＭ１０）、および０．５％の精製レバウジオシドＭを含む砂糖代替品を調製した。まとめると、１１０ポンドのエリスリトール、１１．６ポンドの可溶性繊維（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ ＮＵＴＲＩＯＳＥ ＦＭ１０）、および０．７９ポンドの９５％以上のレバウジオシドＭを得た。５５ポンドのエリスリトールを容量１５０ポンドのミキサー（Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ 水平スクリューミキサー）に入れ、ミキサーを運転速度（plow speed）３０で２分間運転して、ミキサーをコーティングした。１１．６ポンドの可溶性繊維、０．７９ポンドの純度＞９５％のレバウジオシドＭ、および５５ポンドのエリスリトールをミキサーに順次添加した。運転速度を３０に設定し、６分間混合した。次いでチョッパーを運転速度３０に設定し、２分間混合した。１０オンスの蒸留水をスプレー器に添加し、運転速度を３０に設定し、さらに５分間混合した。チョッパーの運転速度を３０に設定し、真空下（－５Ｈｇまたは－０．２ＢＡＲ）で３分間乾燥させた。次いで、混合物を、バッガーに取り付けられたホッパーに袋詰めのために積み込んだ。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】