知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-25
(54)【発明の名称】ナノバブル標的療法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/69 20170101AFI20230418BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230418BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20230418BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230418BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230418BHJP
A61K 31/02 20060101ALI20230418BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230418BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20230418BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20230418BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20230418BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20230418BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230418BHJP
A61K 47/62 20170101ALI20230418BHJP
A61K 47/59 20170101ALI20230418BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20230418BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230418BHJP
【ＦＩ】
A61K47/69
A61P35/00
A61P35/04
A61P43/00 121
A61P31/00
A61K31/02
A61K45/00
A61P43/00 105
A61K47/24
A61K47/60
A61K47/10
A61K47/28
A61K39/395 C
A61K39/395 L
A61K47/62
A61K47/59
A61K47/54
A61K47/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022554891
(86)(22)【出願日】2021-03-12
(85)【翻訳文提出日】2022-11-11
(86)【国際出願番号】 US2021022172
(87)【国際公開番号】W WO2021183931
(87)【国際公開日】2021-09-16
(31)【優先権主張番号】62/988,832
(32)【優先日】2020-03-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
(71)【出願人】
【識別番号】597138069
【氏名又は名称】ケース ウエスタン リザーブ ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】エクスナー，アガタ
(72)【発明者】
【氏名】バシリオン，ジェームス
(72)【発明者】
【氏名】コリオス，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】デレオン，アル
(72)【発明者】
【氏名】ペレラ，レシャニ
(72)【発明者】
【氏名】ソジャーフッド，アミン ジャファリ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA65
4C076AA95
4C076CC26
4C076CC27
4C076CC31
4C076CC41
4C076DD37
4C076DD37A
4C076DD38
4C076DD38A
4C076DD63
4C076DD63A
4C076DD70
4C076DD70A
4C076EE23
4C076EE23A
4C076EE59
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB311
4C084ZB312
4C084ZB352
4C084ZC751
4C085AA25
4C085AA26
4C085BB01
4C085EE03
4C206AA01
4C206AA02
4C206BA07
4C206MA02
4C206MA03
4C206MA05
4C206MA58
4C206NA05
4C206NA13
4C206ZB21
4C206ZB26
4C206ZB31
4C206ZC75
(57)【要約】
対象において細胞死を誘導する方法は、標的細胞によって内部移行した複数の細胞標的ナノバブルを対象に投与すること、及び内部移行したナノバブルの慣性キャビテーション並びに標的細胞のアポトーシス及び／又は壊死を促進するのに有効な超音波エネルギーを用いて標的細胞に内部移行したナノバブルを共振させることを含む。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象において細胞死を誘導する方法であって、各ナノバブルが、少なくとも１種のガスを含む少なくとも１つの内部空隙を画定する膜と、前記膜の外表面に連結された標的化部分とを有する複数のナノバブルを前記対象に投与すること、ここで、前記標的部分は、標的細胞の細胞表面分子に結合し、前記ナノバブルは、前記標的化部分の前記細胞表面分子への結合時に、前記標的細胞による前記ナノバブルの内部移行を促進するサイズ及び／又は直径を有し；かつ内部移行したナノバブルの慣性キャビテーション並びに前記標的細胞のアポトーシス及び／又は壊死を促進するのに有効な超音波エネルギーを用いて、前記標的細胞に内部移行した前記ナノバブルを共振させること、
を含む方法。
【請求項2】
前記ナノバブルが、約５０ｎｍ～約４００ｎｍの平均直径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記細胞が癌細胞であり、前記標的化部分が癌細胞表面分子に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記標的化部分が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子、元素化合物、抗体、及び抗体断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記癌細胞表面分子が癌細胞の表面上の癌細胞抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記癌細胞抗原が、５Ｔ４、α２β１インテグリン、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ（ＡＸＬ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ｃ－ＭＥＴ（肝細胞増殖因子受容体）、Ｃ４．４ａ、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）、カドヘリン－６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、癌胚性抗原（ＣＥＡ）、ｃＫｉｔ、コラーゲン受容体、クリプトタンパク質、ＣＳ１、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＬＬ３）、エンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ）、エフリンＡ４（ＥＦＮＡ４）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＰＨ受容体Ａ２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、非転移性糖タンパク質Ｂ（ＧＰＮＭＢ）、グアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）、インテグリンα、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ－１）、ルイスＹ、ＬＩＶ－１、ロイシンリッチリピート含有１５（ＬＲＲＣ１５）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン－４、ＮＭＢ、ＮＯＴＣＨ３、ｐ－カドヘリン（ｐ－ＣＡＤ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プロテインチロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、プロテインチロシンホスファターゼμ（ＰＴＰμ）溶質担体ファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、ＳＬＩＴ様ファミリーメンバー６（ＳＬＩＴＲＫ６）、ＳＴＥＡＰファミリーメンバー１（ＳＴＥＡＰ１）、組織因子（ＴＦ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンタンパク質－１（ＴＩＭ－１）、又は栄養芽細胞表面抗原（ＴＲＯＰ－２）のうちの少なくとも１つを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記標的細胞が前立腺癌細胞であり、前記細胞表面分子がＰＳＭＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記膜が脂質膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記脂質膜が、前記バブル膜のモジュール及び／又は界面張力を変化させるグリセロール、プロピレングリコール、プルロニック（ポロキサマー）、アルコール又はコレステロールのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記ナノバブルが、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌの脂質濃度を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記脂質膜が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジベヘノイルグリセロホスホコリン（ＤＢＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドニルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、又はそれらのＰＥＧ官能化脂質のうちの少なくとも２つの混合物を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記脂質の混合物が、少なくとも約５０重量％のジベヘノイルグリセロホスホコリン（ＤＢＰＣ）と、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドニルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、又はそれらのＰＥＧ官能化リン脂質からなる群から選択される約５０重量％未満の追加のリン脂質の組み合わせを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
ガスが、パーフルオロカーボンガスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記共振が正常な細胞及び組織に悪影響を及ぼすことなく細胞死を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記共振が、約１％～約５０％のデューティーサイクル、約１ＭＨｚ～約１２ＭＨｚの超音波周波数、約０.１Ｗ／ｃｍ２～約３Ｗ／ｃｍ２の強度、約５０ｋＰａ～約１ＭＰａの圧力振幅、及び約１分～約１０分の時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記共振が、前記ナノバブルが投与される組織に送られる異なる圧力振幅のパルスを有する２つの超音波パルスシーケンスを含み、一方のパルスが、他方のパルスよりも大きい圧力振幅を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
一方のパルスが、他方のパルスの少なくとも２倍の圧力振幅を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
１つのパルスが慣性キャビテーションのためのナノバブル圧力閾値を下回り、続くもう１つのパルスが、慣性キャビテーションのための閾値の圧力閾値を上回る、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
前記超音波エネルギーが非集束超音波トランスデューサによって提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記標的細胞が前記対象における広範囲の癌微小転移を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記細胞が微生物の原核細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記ナノバブルが、各ナノバブルの膜内に含有されるか、又は前記膜とコンジュゲートしている少なくとも１つの治療剤をさらに含む、請求項１～２１のいずれかに記載の方法。
【請求項23】
前記治療剤が、少なくとも１つの化学療法剤、抗増殖剤、殺生物剤、制生剤、又は抗菌剤をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
それを必要とする対象における癌を治療する方法であって、各ナノバブルが、少なくとも１種のガスを含む少なくとも１つの内部空隙を画定する膜と、前記膜の外表面に連結された標的化部分とを有する複数のナノバブルを前記対象に投与すること、ここで、前記標的部分は、標的癌細胞の細胞表面分子に結合し、前記ナノバブルは、前記標的化部分の前記細胞表面分子への結合時に、前記標的癌細胞による前記ナノバブルの内部移行を促進するサイズ及び／又は直径を有し；かつ内部移行したナノバブルの慣性キャビテーション並びに前記標的癌細胞のアポトーシス及び／又は壊死を促進するのに有効な超音波エネルギーを用いて、前記標的癌細胞に内部移行した前記ナノバブルを共振させること、
を含む方法。
【請求項25】
前記ナノバブルが、約５０ｎｍ～約４００ｎｍの平均直径を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記標的化部分が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子、元素化合物、抗体、及び抗体断片からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
前記癌細胞表面分子が癌細胞の表面上の癌細胞抗原である、請求項２４に記載の方法。
【請求項28】
前記癌細胞抗原が、５Ｔ４、α２β１インテグリン、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ（ＡＸＬ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ｃ－ＭＥＴ（肝細胞増殖因子受容体）、Ｃ４．４ａ、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）、カドヘリン－６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、癌胚性抗原（ＣＥＡ）、ｃＫｉｔ、コラーゲン受容体、クリプトタンパク質、ＣＳ１、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＬＬ３）、エンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ）、エフリンＡ４（ＥＦＮＡ４）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＰＨ受容体Ａ２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、非転移性糖タンパク質Ｂ（ＧＰＮＭＢ）、グアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）、インテグリンα、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ－１）、ルイスＹ、ＬＩＶ－１、ロイシンリッチリピート含有１５（ＬＲＲＣ１５）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン－４、ＮＭＢ、ＮＯＴＣＨ３、ｐ－カドヘリン（ｐ－ＣＡＤ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プロテインチロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、プロテインチロシンホスファターゼμ（ＰＴＰμ）溶質担体ファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、ＳＬＩＴ様ファミリーメンバー６（ＳＬＩＴＲＫ６）、ＳＴＥＡＰファミリーメンバー１（ＳＴＥＡＰ１）、組織因子（ＴＦ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンタンパク質－１（ＴＩＭ－１）、又は栄養芽細胞表面抗原（ＴＲＯＰ－２）のうちの少なくとも１つを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記標的細胞が前立腺癌細胞であり、前記細胞表面分子がＰＳＭＡである、請求項２４に記載の方法。
【請求項30】
前記膜が脂質膜である、請求項２４に記載の方法。
【請求項31】
前記脂質膜が、前記バブル膜のモジュール及び／又は界面張力を変化させるグリセロール、プロピレングリコール、プルロニック（ポロキサマー）、アルコール又はコレステロールのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記ナノバブルが、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌの脂質濃度を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項33】
前記脂質膜が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジベヘノイルグリセロホスホコリン（ＤＢＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドニルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）又はそれらのＰＥＧ官能化脂質のうちの少なくとも２つの混合物を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記脂質の混合物が、少なくとも約５０重量％のジベヘノイルグリセロホスホコリン（ＤＢＰＣ）と、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドニルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、又はそれらのＰＥＧ官能化リン脂質からなる群から選択される約５０重量％未満の追加のリン脂質の組み合わせを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
ガスが、パーフルオロカーボンガスを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項36】
前記共振が正常な細胞及び組織に悪影響を及ぼすことなく細胞死を誘導する、請求項２４に記載の方法。
【請求項37】
前記共振が、約１％～約５０％のデューティーサイクル、約１ＭＨｚ～約１２ＭＨｚの超音波周波数、約０.１Ｗ／ｃｍ２～約３Ｗ／ｃｍ２の強度、約５０ｋＰａ～約１ＭＰａの圧力振幅、及び約１分～約１０分の時間である、請求項２４に記載の方法。
【請求項38】
前記共振が、前記ナノバブルが投与される組織に送られる異なる圧力振幅のパルスを有する２つの超音波パルスシーケンスを含み、一方のパルスが、他方のパルスよりも大きい圧力振幅を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項39】
一方のパルスが、他方のパルスの少なくとも２倍の圧力振幅を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
１つのパルスが慣性キャビテーションのためのナノバブル圧力閾値を下回り、続くもう１つのパルスが、慣性キャビテーションのための閾値の圧力閾値を上回る、請求項３８に記載の方法。
【請求項41】
前記超音波エネルギーが非集束超音波トランスデューサによって提供される、請求項２４に記載の方法。
【請求項42】
前記標的細胞が前記対象における広範囲の癌微小転移を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項43】
前記細胞が微生物の原核細胞を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項44】
前記ナノバブルが、各ナノバブルの膜内に含有されるか、又は前記膜とコンジュゲートしている少なくとも１つの治療剤をさらに含む、請求項２４～４３のいずれかに記載の方法。
【請求項45】
前記治療剤が、少なくとも１つの化学療法剤、抗増殖剤、殺生物剤、制生剤、又は抗菌剤をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
対象における癌を治療するためのシステムであって、前記対象内の癌細胞に超音波エネルギーを非侵襲的に送達するように構成された超音波源；
各ナノバブルが、少なくとも１種の気体を含む少なくとも１つの内部空隙を画定する膜と、前記膜の外表面に連結された標的化部分とを有する複数のナノバブル、ここで、前記標的部分が、標的癌細胞の細胞表面分子に結合し、前記ナノバブルが、標的化部分が前記細胞表面分子に結合する際に、前記標的癌細胞による前記ナノバブルの内部移行を促進するサイズ及び／又は直径を有し；かつ
共振時間中に癌細胞の共振を引き起こし、前記癌細胞によって内部移行したナノバブルの慣性キャビテーションを促進するように構成された前記超音波源に結合されたコントローラ
を含むシステム。
【請求項47】
前記共振が、約１％～約５０％のデューティーサイクル、約１ＭＨｚ～約１２ＭＨｚの超音波周波数、約０.１Ｗ／ｃｍ２～約３Ｗ／ｃｍ２の強度、約５０ｋＰａ～約１ＭＰａの圧力振幅、及び約１分～約１０分の時間である、請求項４６に記載のシステム。
【請求項48】
前記共振が、前記ナノバブルが投与される組織に送られる異なる圧力振幅のパルスを有する２つの超音波パルスシーケンスを含み、一方のパルスが、他方のパルスよりも大きい圧力振幅を有する、請求項４６に記載のシステム。
【請求項49】
一方のパルスが、他方のパルスの少なくとも２倍の圧力振幅を有する、請求項４８に記載のシステム。
【請求項50】
１つのパルスが、慣性キャビテーションのためのナノバブル圧力閾値を下回り、続くもう１つのパルスは、慣性キャビテーションのための閾値の圧力閾値を上回る、請求項４８に記載のシステム。
【請求項51】
前記超音波エネルギーが非集束超音波トランスデューサによって提供される、請求項４６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は、２０２０年３月１２日出願の米国仮出願第６２／９８８,８３２号の優先権を主張するものであり、その主題は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０２０年３月１２日出願の米国仮出願第６２／９８８,８３２号の優先権を主張するものであり、その主題は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府資金
本発明は、米国立衛生研究所の米国立生物医学画像・生物工学研究所から授与された助成金Ｎｏ．５Ｒ０１ＥＢ０２５７４１－０２及び１－Ｒ０１－ＥＢ０２８１４４－０１Ａ１の下で政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、米国立衛生研究所の米国立生物医学画像・生物工学研究所から授与された助成金Ｎｏ．５Ｒ０１ＥＢ０２５７４１－０２及び１－Ｒ０１－ＥＢ０２８１４４－０１Ａ１の下で政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【0003】
技術分野
本願は、診断及び治療用組成物に関し、より特には、診断用途、治療用途、及びセラノスティック用途のためのナノバブルに関する。
本願は、診断及び治療用組成物に関し、より特には、診断用途、治療用途、及びセラノスティック用途のためのナノバブルに関する。
【背景技術】
【0004】
背景
超音波造影剤(ＵＣＡ)は、ポリマー、タンパク質、又は脂質などの様々な材料から作られた安定化シェルを有する小さなガスが充填されたバブルである。診断超音波イメージングにおけるこれらの薬剤の従来の用途以外に、ＵＣＡは、標的遺伝子及び薬物送達を含む治療用途における関連性を見出した。これらの適応可能な粒子は、現在、保護治療担体として、及びソノポレーションによるペイロードの送達を増強するためのキャビテーション核として探求されている。これらの機能を組み合わせることで、ペイロード循環半減期及び放出プロファイル、並びに組織選択性及び細胞取り込みが改善される。作用機序にかかわらず、特に癌治療において所望の効果を得るために、バブルが血管系から溢出して、細胞標的部位に到達することが有利である。
超音波造影剤(ＵＣＡ)は、ポリマー、タンパク質、又は脂質などの様々な材料から作られた安定化シェルを有する小さなガスが充填されたバブルである。診断超音波イメージングにおけるこれらの薬剤の従来の用途以外に、ＵＣＡは、標的遺伝子及び薬物送達を含む治療用途における関連性を見出した。これらの適応可能な粒子は、現在、保護治療担体として、及びソノポレーションによるペイロードの送達を増強するためのキャビテーション核として探求されている。これらの機能を組み合わせることで、ペイロード循環半減期及び放出プロファイル、並びに組織選択性及び細胞取り込みが改善される。作用機序にかかわらず、特に癌治療において所望の効果を得るために、バブルが血管系から溢出して、細胞標的部位に到達することが有利である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
今日入手可能な市販のＵＣＡは、一般的には、直径１～８μｍの血液プール剤としてのみ機能するように設計されている。バブルサイズを小さくする方法が以前に開発されたが、これらの戦略のほとんどが、重力による又は物理的なろ過若しくは浮遊による勾配分離などの形成後のマイクロバブルの操作を伴う。ナノサイズのバブルの選択には効果的であるが、これらの方法は、労働集約的であることに加えて、試料混入の可能性をもたらし、バブルの収率と安定性を低下させ、ストック材料を浪費する。さらに、担体としての(例えば、癌治療における)マイクロバブルの適用性は、サイズが大きいことによって制限され、一般的にはそれらを血管系に閉じ込める。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本明細書に記載の実施形態は、対象において高度に選択的又は標的化された細胞死を誘導する薬物フリー、低毒性の方法を提供することができるナノバブル標的療法（ＴＮＴ）に関する。いくつかの実施形態では、治療又は方法は、複数の細胞標的ナノバブルを対象に投与することを含み得る。細胞標的ナノバブルの各々は、少なくとも１種の気体を含む少なくとも１つの内部空隙を画定する膜と、膜の外表面に連結された標的化部分とを有することができる。標的化部分は、標的細胞の細胞表面分子に結合することができ、ナノバブルは、標的化部分の細胞表面分子への結合時に標的細胞による細胞標的ナノバブルの内部移行を促進するサイズ、直径、及び／又は組成を有することができる。対象への細胞標的ナノバブルの投与に続いて、標的細胞に内部移行した細胞標的ナノバブルは、内部移行したナノバブルの慣性キャビテーション並びに標的細胞のアポトーシス及び／又は壊死を促進するのに有効な超音波エネルギーと共振することができる。
【発明の効果】
【0007】
いくつかの実施形態では、細胞標的ナノバブルは、約５０ｎｍ～約４００ｎｍの平均直径を有することができ、標的化部分は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子、元素化合物、抗体、及び抗体断片のうちの少なくとも１つを含むことができる。
【0008】
他の実施形態では、標的化細胞は、対象の癌細胞であり得、標的化部分は、癌細胞表面分子に結合することができる。癌細胞表面分子は、癌細胞の表面上の癌細胞抗原であり得る。例えば、癌細胞抗原は、５Ｔ４、α２β１インテグリン、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ（ＡＸＬ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ｃ－ＭＥＴ（肝細胞増殖因子受容体）、Ｃ４．４ａ、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）、カドヘリン－６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、癌胚性抗原（ＣＥＡ）、ｃＫｉｔ、コラーゲン受容体、クリプトタンパク質、ＣＳ１、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＬＬ３）、エンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ）、エフリンＡ４（ＥＦＮＡ４）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＰＨ受容体Ａ２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、非転移性糖タンパク質Ｂ（ＧＰＮＭＢ）、グアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）、インテグリンα、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ－１）、ルイスＹ、ＬＩＶ－１、ロイシンリッチリピート含有１５（ＬＲＲＣ１５）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン－４、ＮＭＢ、ＮＯＴＣＨ３、ｐ－カドヘリン（ｐ－ＣＡＤ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プロテインチロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、プロテインチロシンホスファターゼμ（ＰＴＰμ）溶質担体ファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、ＳＬＩＴ様ファミリーメンバー６（ＳＬＩＴＲＫ６）、ＳＴＥＡＰファミリーメンバー１（ＳＴＥＡＰ１）、組織因子（ＴＦ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンタンパク質－１（ＴＩＭ－１）、又は栄養芽細胞表面抗原（ＴＲＯＰ－２）のうちの少なくとも１つを含むことができる。
【0009】
一例では、標的細胞は前立腺癌細胞であり、細胞表面分子はＰＳＭＡであり、標的化部分はＰＳＭＡリガンドである。
【0010】
いくつかの実施形態では、膜は脂質膜であり得る。細胞標的ナノバブルの脂質膜は、ナノバブル膜のモジュール及び／又は界面張力を変化させるのに有効な量でグリセロール、プロピレングリコール、プルロニック（ポロキサマー）、アルコール又はコレステロールのうちの少なくとも１つをさらに含むことができる。
【0011】
他の実施形態では、脂質膜は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジベヘノイルグリセロホスホコリン（ＤＢＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドニルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）又はそれらのＰＥＧ官能化脂質のうちの少なくとも２つの混合物を含む。例えば、脂質の混合物は、少なくとも約５０重量％のジベヘノイルグリセロホスホコリン（ＤＢＰＣ）と、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドニルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、又はそれらのＰＥＧ官能化リン脂質からなる群から選択される約５０重量％未満の追加のリン脂質の組み合わせを含むことができる。
【0012】
いくつかの実施形態では、細胞標的ナノバブルの内部空隙内のガスは、オクタフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８）などのパーフルオロカーボンガスを含むことができる。
【0013】
他の実施形態では、細胞標的ナノバブルは、各ナノバブルの膜内に含有されるか又は膜とコンジュゲートしている少なくとも１つの治療剤をさらに含むことができる。治療剤は、例えば、少なくとも１つの化学療法剤、抗増殖剤、殺生物剤、制生剤、又は抗菌剤を含むことができる。
【0014】
いくつかの実施形態では、内部移行したナノバブルを共振させることは、対象における正常な細胞及び組織に悪影響を及ぼすことなく標的細胞の死を誘導する。
【0015】
いくつかの実施形態では、共振は、約１％～約５０％のデューティーサイクル、約１ＭＨｚ～約５０ＭＨｚ（例えば、約１ＭＨｚ～約１０ＭＨｚ）の超音波周波数、約０.１Ｗ／ｃｍ２～約３Ｗ／ｃｍ２の強度、約５０ｋＰａ～約１ＭＰａの圧力振幅、及び約１分～約３０分の時間であり得る。
【0016】
他の実施形態では、共振は、ナノバブルが細胞によって内部移行する組織に送られる異なる圧力振幅のパルスを有する２つの超音波パルスシーケンスを含むことができる。いくつかの実施形態では、一方のパルスは、他方のパルスよりも大きい圧力振幅を有することができる。例えば、一方のパルスは、他方のパルスの少なくとも２倍の圧力振幅を有する。
【0017】
いくつかの実施形態では、１つのパルスは慣性キャビテーションのためのナノバブル圧力閾値を下回り、続くもう１つのパルスは、慣性キャビテーションのための閾値の圧力閾値を上回ることができる。例えば、圧力閾値が２００ｋＰａのナノバブルの場合、最初のパルスは１５０ｋＰａで、続くもう１つのパルスが２５０ｋＰａである。別の例では、５００ｋＰａの圧力閾値を有するナノバブルの場合、１つのパルスは３００ｋＰａであり、第２のパルスは６００ｋＰａである。
【0018】
他の実施形態では、最大慣性キャビテーションを誘導するために、全体のパルス長は、典型的なイメージングパルス（３～６サイクル）よりも長く（１０～３０サイクル）てもよい。
【0019】
いくつかの実施形態では、パルスシーケンスは、非集束トランスデューサから提供することができ、これは、薬物送達及びヒストトリプシーなどの超音波治療に使用される典型的な集束超音波トランスデューサとは異なる。
【0020】
さらに他の実施形態では、本方法は、容易に視覚化することができず、集束超音波を使用することができない肝臓又は骨などの広範囲の癌微小転移を含む病変を治療するために使用することができる。
【0021】
さらに他の実施形態では、本方法及び治療は、微生物の原核細胞の死を誘導し、感染症を治療するために使用することができる。
【0022】
本明細書に記載の他の実施形態は、それを必要とする対象における癌を治療する方法に関する。本方法は、複数の癌細胞標的ナノバブルを対象に投与することを含むことができる。癌細胞標的ナノバブルの各々は、少なくとも１種の気体を含む少なくとも１つの内部空隙を画定する膜と、膜の外表面に連結された標的化部分とを有することができる。標的化部分は、標的癌細胞の癌細胞表面分子に結合することができる。癌細胞標的ナノバブルは、標的化部分を癌細胞表面分子に結合する際に、標的癌細胞によるナノバブルの内部移行を促進するサイズ及び／又は直径を有することができる。
【0023】
対象への癌細胞標的ナノバブルの投与及び癌細胞標的ナノバブルの癌細胞内への内部移行後に、内部移行したナノバブルは、内部移行したナノバブルの慣性キャビテーション並びに標的癌細胞のアポトーシス及び／又は壊死を促進するのに有効な超音波エネルギーと共振させることができる。
【0024】
いくつかの実施形態では、癌細胞表面分子は、癌細胞の表面上の癌細胞抗原であり得る。例えば、癌細胞抗原は、５Ｔ４、α２β１インテグリン、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ（ＡＸＬ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ｃ－ＭＥＴ（肝細胞増殖因子受容体）、Ｃ４．４ａ、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）、カドヘリン－６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、癌胚性抗原（ＣＥＡ）、ｃＫｉｔ、コラーゲン受容体、クリプトタンパク質、ＣＳ１、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＬＬ３）、エンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ）、エフリンＡ４（ＥＦＮＡ４）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＰＨ受容体Ａ２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、非転移性糖タンパク質Ｂ（ＧＰＮＭＢ）、グアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）、インテグリンα、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ－１）、ルイスＹ、ＬＩＶ－１、ロイシンリッチリピート含有１５（ＬＲＲＣ１５）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン－４、ＮＭＢ、ＮＯＴＣＨ３、ｐ－カドヘリン（ｐ－ＣＡＤ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プロテインチロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、プロテインチロシンホスファターゼμ（ＰＴＰμ）溶質担体ファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、ＳＬＩＴ様ファミリーメンバー６（ＳＬＩＴＲＫ６）、ＳＴＥＡＰファミリーメンバー１（ＳＴＥＡＰ１）、組織因子（ＴＦ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンタンパク質－１（ＴＩＭ－１）、又は栄養芽細胞表面抗原（ＴＲＯＰ－２）のうちの少なくとも１つを含むことができる。
【0025】
一例では、標的癌細胞は前立腺癌細胞であり、癌細胞表面分子はＰＳＭＡであり、標的化部分はＰＳＭＡリガンドである。
【0026】
さらに他の実施形態は、対象における癌を治療するためのシステムに関する。該システムは、対象内の癌細胞に超音波エネルギーを非侵襲的に送達するように構成された超音波源と、複数の癌細胞標的ナノバブルと、超音波源に結合されたコントローラとを含むことができる。癌細胞標的ナノバブルの各々は、少なくとも１種の気体を含む少なくとも１つの内部空隙を画定する膜と、膜の外表面に連結された標的化部分を有することができる。標的化部分は、標的癌細胞の癌細胞表面分子に結合することができる。癌細胞標的ナノバブルは、標的化部分を癌細胞表面分子に結合する際に、標的癌細胞によるナノバブルの内部移行を促進するサイズ及び／又は直径を有することができる。超音波源に結合されたコントローラは、共振時間中に癌細胞の共振を引き起こし、癌細胞によって内部移行したナノバブルの慣性キャビテーションを促進するように構成することができる。
【0027】
いくつかの実施形態では、共振は、約１％～約５０％のデューティーサイクル、約１ＭＨｚ～約５０ＭＨｚ（例えば、約１ＭＨｚ～約１０ＭＨｚ）の超音波周波数、約０.１Ｗ／ｃｍ２～約３Ｗ／ｃｍ２の強度、約５０ｋＰａ～約１ＭＰａの圧力振幅、及び約１分～約３０分の時間であり得る。
【0028】
他の実施形態では、共振は、ナノバブルが細胞によって内部移行する組織に送られる異なる圧力振幅のパルスを有する２つの超音波パルスシーケンスを含むことができる。いくつかの実施形態では、一方のパルスは、他方のパルスよりも大きい圧力振幅を有することができる。例えば、一方のパルスは、他方のパルスの少なくとも２倍の圧力振幅を有する。
【0029】
いくつかの実施形態では、１つのパルスは慣性キャビテーションのためのナノバブル圧力閾値を下回り、続くもう１つのパルスは、慣性キャビテーションのための閾値の圧力閾値を上回ることができる。例えば、圧力閾値が２００ｋＰａのナノバブルの場合、最初のパルスは１５０ｋＰａで、続くもう１つのパルスが２５０ｋＰａである。別の例では、５００ｋＰａの圧力閾値を有するナノバブルの場合、１つのパルスは３００ｋＰａであり、第２のパルスは６００ｋＰａである。
【0030】
他の実施形態では、最大慣性キャビテーションを誘導するために、全体のパルス長は、典型的なイメージングパルス（３～６サイクル）よりも長く（１０～３０サイクル）てもよい。
【0031】
いくつかの実施形態では、パルスシーケンスは、非集束トランスデューサから提供することができ、これは、薬物送達及びヒストトリプシーなどの超音波治療に使用される典型的な集束超音波トランスデューサとは異なる。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】図１（Ａ～Ｅ）は、Ａ）ＴＮＴアプローチの考え方を示す概略図、Ｂ）有意により低いＮＢ用量での細胞内の効果に匹敵する細胞外のＮＢ＋ＵＳの効果を示すデータ、Ｃ）インビボ及びインビトロでの高解像度での前立腺癌細胞におけるＰＳＭＡ－ＮＢの音響活性保持を示す実現可能性データ（Ｄ、Ｅ）である。細胞内のＮＢは、高い特異性と最小限の付随的損傷で細胞を死滅させるように配置することができる。
【図3】図３（Ｂ～Ｃ）は、（Ｂ）駆動圧力が増加するにつれてシグナルの有意かつ急速な増加を示す、剛性及び可撓性シェルを有するＮＢの代表的な超音波コントラスト画像及び対応する増強（Ｃ）を示す。最大のシグナル増加に隣接する圧力のみが示されている。
【図4】図４（Ａ～Ｅ）は、インビボ非線形コントラストスキャンを示す画像及びプロットを示す。Ａ）バブル注射、非線形及び３Ｄ ＵＳアプリケーションを示すタイムライン。Ｂ）ＰＳＭＡ－ＮＢについて腫瘍縁と腫瘍コアにおける異なる時点でのバブル分布を示す代表的な腫瘍画像。Ｃ）プレーンＮＢ。Ｄ）Ｌｕｍａｓｏｎのマイクロバブル。Ｅ）ＰＳＭＡ－ＮＢ（ｉ）、プレーンＮＢ（ｉｉ）、及びＬｕｍａｓｏｎ ＭＢ（ｉｉｉ）の時間の関数としてプロットした腫瘍の縁及びコアにおける平均シグナル強度。腫瘍を１８ＭＨｚ、５フレーム／秒で３分、１フレーム／秒で、１６分で画像化した。
【図5】図５（Ａ～Ｃ）は、腫瘍全体におけるバブル分布を視覚化するための３Ｄ超音波スキャンを示す概略図及びプロットを示す。Ａ）３Ｄ ＵＳスキャンポイントを示すタイムライン。Ｂ）ピーク時のＰＳＭＡ－ＮＢ、ＮＢ、及びＬｕｍａｓｏｎを示す腫瘍の代表的な３Ｄ ＵＳ画像。Ｃ）ピーク時及びベースライン減算後のｔ＝２５分の時点での３Ｄ ＵＳシグナル強度の定量化。Ｎ＝３、エラーバーは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊Ｐ＜０.０５。
【図6】図６（Ａ～Ｃ）は、腫瘍全体におけるバブル分布を視覚化するための３Ｄ超音波スキャンを示す概略図及びプロットを示す。Ａ）３Ｄ ＵＳスキャンポイントを示すタイムライン。Ｂ）ベースライン、注射後２５分、及び心臓穿刺後におけるＰＳＭＡ－ＮＢ、ＮＢ、及びＬｕｍａｓｏｎを示す腫瘍の代表的な３Ｄ ＵＳ画像。Ｃ）ベースライン減算後のＰＳＭＡ－ＮＢ、プレーンＮｂ、及びＬｕｍａｓｏｎの心臓穿刺前後の３Ｄ ＵＳシグナル強度の定量化。Ｎ＝３、エラーバーは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊Ｐ＜０.０５。
【図7】図７（Ａ～Ｂ）は、心臓穿刺後の切除された腫瘍におけるＣｙ５.５－ＰＳＭＡ－ＮＢの蓄積及び溢出を示す組織診断画像を示す。Ａ）ＰＳＭＡ発現（シアン）、血管系（ＣＤ３１発現、赤色）、及びＰＳＭＡ－ＮＢ又はプレーンＮＢ分布（緑色）を示す腫瘍組織の代表的な画像。Ｂ）バブル、ＰＳＭＡ及び血管のシグナル強度は、腫瘍切片における全細胞蛍光の百分率としての発現である。腫瘍の縁とコアの両方におけるＣｙ５.５－ＰＳＭＡ－ＮＢシグナルは、腫瘍の縁とコアの両方におけるＮＢシグナルのシグナルよりも有意に高かった。Ｎ＝３、エラーバーは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊Ｐ＜０.００１。
【図8】図８（Ａ～Ｂ）は、（Ａ）最初の１時間のＮＢ曝露後、異なる時点でＰＳＭＡ－ＮＢとインキュベートしたＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ｐｉｐ細胞の代表的なＵＳ画像を示す。（Ｂ）処理後異なる時点でのＰＳＭＡ－ＮＢインキュベートＰＣ３ｐｉｐ細胞及びＮＢインキュベートＰＣ３ｐｉｐ細胞並びにＰＳＭＡ陰性ＰＣ３ｆｌｕ細胞の音響活性。ＰＳＭＡ－ＮＢインキュベートＰＣ３ｐｉｐは、他の全てのグループと比較して、ｔ＝０～ｔ＝２４時間の時点で有意に高い音響活性を示す。ｎ＝３、エラーバーは平均±ｓ．ｄ．を表し、＊は各時点における他の全てのグループからの統計的有意差（ｐ＜０.０５）を示す。
【図9(】図９（Ａ～Ｅ）は、（Ａ）ＰＣ３ｐｉｐ細胞におけるＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢ分布の代表的な共焦点画像；１００倍（青－核、赤－ＮＢ、及び緑－後期エンドソーム／リソソーム）を示す。（Ｂ）ＰＳＭＡ－ＮＢ及び（Ｃ）プレーンＮＢインキュベートＰＣ３ｐｉｐ細胞の拡大したマージ画像。（Ｄ）２４時間曝露後のＰＣ３ｐｉｐ細胞（青－核、赤－ＮＢ、緑－エンドソーム）におけるＰＳＭＡ－ＮＢ分布の代表的な共焦点画像。（Ｅ）ＰＳＭＡ－ＮＢ及び（Ｆ）プレーンＮＢインキュベートＰＣ３ｐｉｐ細胞のズームしたマージ画像。ＰＳＭＡ－ＮＢは、後期エンドソーム／リソソーム小胞（黄色）において高い共局在を示す。
【図10】図１０（Ａ～Ｃ）は、（Ａ）ＮＢによって生成されたＣ３Ｆ８ガスのヘッドスペースＧＣ／ＭＳ解析;３.３７分で溶出、（Ｂ）バブルの様々な濃度対Ｃ３Ｆ８ガスに対応するピーク面積についての検量線、（Ｃ）ＰＳＭＡ－ＮＢ及びプレーンＮＢ内部移行ＰＣ３ｐｉｐ細胞懸濁液によって生成されたＣ３Ｆ８ガスのヘッドスペースＧＣ／ＭＳ解析を示すプロットを示す。
【図11】図１１（Ａ～Ｂ）は、（Ａ）標識細胞（ＰＳＭＡ－ＮＢインキュベート細胞）及び非標識細胞を異なる時点で、０.１ＭＩ値で注射した後に得られた皮下組織の代表的なＵＳ画像、（Ｂ）各時点における平均ＵＳシグナル強度を示す。
【図13】図１３（Ａ～Ｃ）は、ＰＳＭＡ標的ＮＢがＬＵＭＡＳＯＮと比較してより大きな腫瘍増強を提供することを示す。（Ａ）ＰＳＭＡ標的ＮＢ及び臨床的に利用可能なＭＢ（ＬＵＭＡＳＯＮ）の注射後のＰＣ３ｐｉｐ同所性腫瘍及び肝臓の代表的な超音波検査画像。第１行目及び第２行目には、ＵＣＡ注射前の腫瘍及び肝臓のＢモード及びＣＨＩモード画像を示した。第３～第５行目には、ＵＣＡ投与後の異なる時点におけるＣＨＩ画像を示した。ＰＳＭＡ標的ＮＢを投与したマウスの腫瘍及び肝臓におけるイメージング強度は、異なる時点でＬＵＭＡＳＯＮを投与した動物のそれよりも明らかに高かった。スケールバーは０.５ｃｍである。（Ｂ１）ＰＳＭＡ標的ＮＢ（ｎ＝１１）及びＬＵＭＡＳＯＮ（ｎ＝３）のｉ．ｖ．投与後のＰＣ３ｐｉｐ同所性腫瘍の時間強度曲線（ＴＩＣ）。（Ｂ２）ＰＳＭＡ標的ＮＢ（ｎ＝４）及びＬＵＭＡＳＯＮ（ｎ＝３）のｉ．ｖ．投与後の肝臓の時間強度曲線（ＴＩＣ）。（Ｃ）腫瘍又は肝臓におけるＰＳＭＡ標的ＮＢとＬＵＭＡＳＯＮとの間のＵＣＡ動態パラメータの比較。平均±標準偏差としてのデータ。＊ｐ＜０.０５、ＰＳＭＡ標的ＮＢグループ対ＬＵＭＡＳＯＮグループ。
【図14】図１４（Ａ～Ｃ）は、ＰＳＭＡ標的ＮＢが非標的ＮＢと比較してより大きな腫瘍増強を提供することを示す画像及びプロットを示す。（Ａ）ＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢの注射後のＰＣ３ｐｉｐ同所性腫瘍の代表的な超音波検査画像（ｎ＝１１）。第１及び第２カラムは、それぞれＵＣＡ注射前の腫瘍のＢモード及びＣＨＩモード画像を示した。第３～第５カラムは、ＵＣＡ投与後の異なる時点におけるＣＨＩ画像を示した。スケールバーは０.５ｃｍである。（Ｂ１）ＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢのｉ．ｖ．投与後のＰＣ３ｐｉｐ同所性腫瘍の時間強度曲線（ＴＩＣ）。（Ｂ２）非標的ＮＢ測定値から得られたＵＳシグナルを使用して、ＰＳＭＡ標的ＮＢからのシグナルを正規化した。正規化したシグナル増強は（強度ＰＳＭＡ標的ＮＢ－強度非標的ＮＢ）を意味する。（Ｃ）腫瘍における標的ＮＢと非標的ＮＢの比較。データは偏差で表される（ｎ＝１１）。＊ｐ＜０.０５ 標的ＮＢ対非標的ＮＢの比較。
【図15】図１５（Ａ～Ｂ）は、ＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢが、大きな腫瘍（グループＢ）におけるそれと比較して、小さな腫瘍（グループＡ）においてより高い腫瘍増強を提供することを示すプロットを示す。（Ａ）グループＡ（ｎ＝７）及びグループＢ（ｎ＝４）におけるＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢのｉ．ｖ．投与後の腫瘍の時間強度曲線（ＴＩＣ）。（Ｂ）グループＡ（ｎ＝７）とグループＢ（ｎ＝４）の間のｔｉｃパラメータ。データを標準偏差として提示する。＊ｐ＜０.０５、グループＡ対グループＢ。
【図16】図１６（Ａ～Ｂ）は、ＰＳＭＡ標的ＮＢが、循環からナノバブルを除去した後に、ＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍において長期にわたるイメージング及びより大きなＵＳシグナルを可能にすることを示す画像及びプロットを示す。（Ａ）最初の行は、注射前の腫瘍及び肝臓のＢモード画像を示した。第２行は、バブル崩壊前の腫瘍及び肝臓のＣＨＩを示した。第３行は、バブル崩壊後の腫瘍及び肝臓のＣＨＩを示した。スケールバーは０.５ｃｍである。（Ｂ）崩壊前後の腫瘍及び肝臓におけるバブルの平均シグナル強度。データは、平均±標準偏差として表され、＊ｐ＜０.０５、標的グループ対非標的グループ、ｎ＝４。
【発明を実施するための形態】
【0033】
詳細な説明
本願で使用される全ての科学用語及び技術用語は、特に断りのない限り、当技術分野において一般的に使用される意味を有する。本明細書に提供される定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするためのものであり、適用の範囲を制限することを意図したものではない。
本願で使用される全ての科学用語及び技術用語は、特に断りのない限り、当技術分野において一般的に使用される意味を有する。本明細書に提供される定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするためのものであり、適用の範囲を制限することを意図したものではない。
【0034】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、及び「その」は、文脈が特に明確に指示をしない限り、複数形の参照を含む。さらに、用語「１つ（ａ）」（又は「１つ（ａｎ）」）、「１以上」及び「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」及び「から構築される」もまた、互換的に使用することができる。
【0035】
用語「安定キャビテーション」は、サイズが増大し、爆発することなく振動する傾向を有するナノバブルのガス空隙を指す。ガス空隙は、圧力場にさらされると振動するが、爆発しない。安定したキャビテーションでは、ナノバブルのガス空隙の集合は、整流拡散を生じさせることができる圧力場が存在する限り、比較的安定した方法で動作する傾向がある。
【0036】
用語「慣性キャビテーション」は、通常、ガス空隙の共振周波数で、印加された圧力場によって誘発されるナノバブルのガス空隙の振動及び激しい崩壊を指す。ガス空隙又はナノバブルが細胞内で爆発すると、それらは細胞に対して集中した高圧力を発揮し、細胞小器官、細胞骨格を破壊し、細胞内のタンパク質を変性させ得る。細胞損傷を引き起こすことに加えて、慣性キャビテーションはまた、フリーラジカルを生成し得る。
【0037】
用語「腫瘍性障害」は、異常に増殖する細胞及び／又は組織が存在する対象における疾患状態を指すことができる。腫瘍性障害には、癌、肉腫、腫瘍、白血病、リンパ腫などが含まれ得るが、これらに限定されない。
【0038】
用語「腫瘍性細胞」は、増加した、制御されない細胞増殖などの異常な細胞増殖を示す細胞を指すことができる。腫瘍性細胞は、過形成細胞、インビトロで増殖させたときに接触阻害の欠如を示す細胞株由来の細胞、腫瘍細胞、又はインビボで転移することができる癌細胞であり得る。あるいは、腫瘍性細胞を「癌細胞」と呼ぶことができる。癌細胞の非限定的な例には、黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肉腫、白血病性網膜芽細胞腫、肝腫、骨髄腫、神経膠腫、中皮腫、癌腫、白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前骨髄球性白血病、リンパ芽腫、胸腺腫、リンパ腫細胞、黒色腫細胞、肉腫細胞、白血病細胞、網膜芽細胞腫細胞、肝腫細胞、骨髄腫細胞、グリオーマ細胞、中皮腫細胞、及び癌腫細胞が含まれ得る。
【0039】
用語「腫瘍」は、悪性か良性かにかかわらず、過剰な細胞分裂から生じる異常な細胞塊又は細胞集団、並びに全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指すことができる。
【0040】
疾患（例えば、腫瘍性障害）の「治療すること」又は「治療」という用語は、少なくとも１つの腫瘍性細胞を根絶するための治療プロトコルを実行することを指すことができる。そのため、「治療すること」又は「治療」は、腫瘍性細胞の完全な根絶を必要としない。
【0041】
用語「ポリマー」は、２以上の化学単位の化学結合によって形成される分子を指すことができる。化学単位は、共有結合によって互いに連結されてもよい。ポリマー中の２以上の結合単位は全て同じであり得、その場合には、ポリマーはホモポリマーと呼ばれることがある。化学単位はまた、異なることができ、そのため、ポリマーは、異なる単位の組み合わせであり得る。そのようなポリマーは、コポリマーと呼ばれることがある。
【0042】
用語「対象」は、特定の処置のレシピエントであるとされるヒト及び非ヒト動物（例えば、げっ歯類、節足動物、昆虫、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ））、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ類、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類など）を含むがこれらに限定されない任意の動物を指すことができる。
【0043】
本明細書に記載の実施形態は、対象において高度に選択的又は標的化された細胞死を誘導する薬物フリー、低毒性アプローチを提供することができるナノバブル標的療法（ＴＮＴ）に関する。ＴＮＴは、標的細胞の細胞表面分子を標的とし、標的細胞に内部移行するナノバブル（ＮＢ）を使用することができる。一旦標的細胞の内部に入るか又は内部移行すると、細胞標的ＮＢを共振させて、ナノバブル特異的超音波パルスを用いて内部移行したＮＢの慣性キャビテーション及び／又は破壊を促進することができる。標的細胞内で超音波と相互作用するＮＢの特有の組み合わせは、高度に選択的又は標的化された細胞死につながり得る。ＴＮＴは、特異的細胞表面分子を発現する細胞にのみナノバブルの特異的標的化を利用し、次いで、超音波で慣性キャビテーションを誘発する。
【0044】
例として、ＮＢは、高度に選択的なリガンドを介してＰＳＭＡに標的化することができる。ＰＳＭＡレベルは、前立腺癌（ＰＣａ）の攻撃性と関連していると報告されているため、ＰＳＭＡを標的とするＮＢは、ＰＳＭＡを発現するか又は攻撃性の腫瘍に対して高度に選択的である（図１）。ＰＳＭＡ標的ＮＢがＰＣａ細胞によって内部移行し、残りのＮＢ（単独で毒性がゼロ）が血流から一掃されると、一連の超音波パルスを使用して、癌細胞内のＮＢを慣性的にキャビテート又は崩壊させることができる。これにより、正常細胞には手つかずの状態のままで、高度に集中的な癌細胞治療がもたらされる。超音波は多くの癌診断及び生検手順で頻繁に利用されるため、すでに技術に精通している医師も同じ機器とワークフローを適用できるため、コストを削減し、臨床解釈を迅速化できる。
【0045】
図２は、本明細書に記載の実施形態に従って死を誘導する治療又は方法１０を示すフローチャートである。癌細胞死又は微生物細胞死などの細胞死を誘導する治療法又は方法１０において、ステップ１２では、標的によって内部移行することができる複数の細胞標的ナノバブルを対象に投与することができる。
【0046】
細胞標的ナノバブルの各々は、少なくとも１種のガスを含む少なくとも１つの内部空隙を画定する脂質膜などの膜と、脂質膜の外表面に連結された標的化部分とを有することができる。標的部分は標的細胞の細胞表面分子に結合することができ、細胞標的ナノバブルは、標的化部分が細胞表面分子に結合する際に、標的細胞によって内部移行することができる。
【0047】
脂質膜は、既知の超音波圧に対する選択的活性化及び／又はキャビテーションを示すことができる。いくつかの実施形態では、脂質膜を、予測可能な圧力でキャビテーション及びナノバブル崩壊を惹起するように特異的に修飾することができる。これにより、他のナノスケールのガス核生成部位の付随的損傷及び活性化を回避することができる。細胞標的ナノバブルを形成するために使用される脂質膜の組成はまた、キャビテーション閾値を有意に低下させることを可能にする。
【0048】
いくつかの実施形態では、脂質膜は、例えば、複数の脂質、膜の脂質と脂質との間に組み込まれ、ナノバブルの柔軟性を高めるエッジ活性化剤、膜の外表面に組み込まれ、膜の引き裂きに対する耐性を高める膜スティフナー、並びにバブルのシェルの係数及び／又は界面張力を変えるプルロニック（ポロキサマー）、アルコール及びコレステロールなどの他の添加剤を含むことができる。
【0049】
他の実施形態では、ナノバブルの各々は、脂質の親水性頭部によって少なくとも部分的に画定される親水性外側ドメインと、脂質の疎水性テールによって少なくとも部分的に画定される疎水性内側ドメインとを含むことができる。プロピレングリコールなどのエッジ活性化剤は、外側ドメインから内側ドメインまで脂質の間を少なくとも部分的に伸長させることができる。グリセロールは、ナノバブルの外側ドメイン上に提供することができ、脂質の親水性ヘッドの間に部分的に延びる。膜によって封入されるガスは、水（例えば、疎水性ガス）に対する低い溶解度を有し、例えば、パーフルオロプロパン又はパーフルオロブタンなどのパーフルオロカーボン、六フッ化硫黄、二酸化炭素、窒素（Ｎ２）、酸素（Ｏ２）、及び空気を含むことができる。
【0050】
いくつかの実施形態では、細胞標的ナノバブルの各々は、標的化部分の細胞表面分子への結合時に、細胞標的ナノバブルの溢出及び標的細胞による細胞標的ナノバブルの内部移行を促進するサイズを有することができる。例えば、ナノバブルの各々は、ナノバブルを形成するために使用される特定の脂質、エッジ活性化剤、及び膜スティフナー並びに方法（以下でより詳細に記載）に応じて、約３０ｎｍ～約６００ｎｍ又は約１００ｎｍ～約５００ｎｍ（例えば、約３００ｎｍ）のサイズ（直径）を有することができる。
【0051】
細胞標的ナノバブルは、ナノバブルのインビボ循環安定性を増強する脂質濃度を有することができる。より高い脂質濃度は、対象への投与時の安定性の増加及びナノバブルのより長い循環と相関することが見出された。いくつかの実施形態では、細胞標的ナノバブルは、少なくとも約２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約７ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約９ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１２ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上の脂質濃度を有することができる。他の実施形態では、細胞標的ナノバブルの脂質濃度は、約５ｍｇ／ｍｌ～約１２ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ～約１２ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ～約１２ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ～約１２ｍｇ／ｍｌ、約９ｍｇ／ｍｌ～約１２ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ～約１２ｍｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌであり得る。
【0052】
膜又はシェルを含む複数の脂質は、一般に両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）又は両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）である（すなわち、親水性成分及び疎水性成分を含む）任意の天然、合成又は半合成（すなわち、修飾された天然の）部分を含むことができる。膜を形成するために使用され得る任意の１つの又は組み合わせた脂質の例には、１－アルキル－２－アセトイル－ｓｎ－グリセロ３－ホスホコリン、及び１－アルキル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ３－ホスホコリンなどのホスホコリン；ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジベヘノイルグリセロホスホコリン（ＤＢＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジアラキドニルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）を含む飽和脂質と不飽和脂質の両方を有するホスファチジルコリン；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）などのホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン；ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）を含むホスファチジルグリセロール；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質；ガングリオシドＧＭ１及びＧＭ２などの糖脂質；グルコ脂質；スルファチド；スフィンゴ糖脂質；ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）及びジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）などのホスファチジン酸；パルミチン酸；ステアリン酸；アラキドン酸；オレイン酸；キチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの脂質含有ポリマー；脂質含有スルホン化モノ－、ジ－、オリゴ－又はポリサッカライド；コレステロール、硫酸コレステロール、及びヘミコハク酸コレステロール；ヘミコハク酸トコフェロール；エーテル及びエステル結合脂肪酸を有する脂質；重合脂質（その多種多様なものは当技術分野において周知である）；ジアセチルリン酸；ジセチルホスフェート；ステアリルアミン；カルジオリピン；約６～約８個の炭素長の短鎖脂肪酸を有するリン脂質；約１０～約１６個の炭素長の中鎖脂肪酸を有するリン脂質；約１８～約２４個の炭素長の長鎖脂肪酸を有するリン脂質；例えば、約６個の炭素の１つのアシル鎖及び約１２個の炭素の別のアシル鎖などの不斉アシル鎖を有する合成リン脂質；セラミド；ポリオキシアルキレン（例えば、ポリオキシエチレン）脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレン（例えば、ポリオキシエチレン）脂肪アルコール、ポリオキシアルキレン（例えば、ポリオキシエチレン）脂肪アルコールエーテル、ポリオキシアルキレン（例えば、ポリオキシエチレン）ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ＴＷＥＥＮ（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥから市販されている）と称される化合物のクラスなどの）、グリセロールポリエチレングリコールオキシステアレート、グリセロールポリエチレングリコールリシノレート、アルキルオキシル化（例えば、エトキシル化）大豆ステロール、アルキルオキシル化（例えば、エトキシル化）ヒマシ油、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンポリマー、及びポリオキシアルキレン（例えば、ポリオキシエチレン）脂肪酸ステアリン酸塩などのニオソームを含む非イオン性リポソーム；硫酸コレステロール、酪酸コレステロール、イソ酪酸コレステロール、パルミチン酸コレステロール、ステアリン酸コレステロール、酢酸ラノステロール、パルミチン酸エルゴステロール、及びｎ－酪酸フィトステロールを含むステロール脂肪酸エステル；コレステロールグルクロニド、ラノステロールグルクロニド、７－デヒドロコレステロールグルクロニド、エルゴステロールグルクロニド、グルコン酸コレステロール、グルコン酸ラノステロール、及びグルコン酸エルゴステロールを含む糖酸のステロールエステル；ラウリルグルクロニド、ステアロイルグルクロニド、ミリストイルグルクロニド、ラウリルグルコン酸、ミリストイルグルコン酸、及びステアロイルグルコン酸を含む糖酸及びアルコールのエステル；スクロースラウレート、フルクトースラウレート、パルミチン酸スクロース、ステアリン酸スクロース、グルクロン酸、グルコン酸及びポリウロン酸を含む糖と脂肪族酸のエステル；サルササポゲニン、スミラゲニン、ヘデラゲニン、オレアノール酸、及びジギトキシゲニンを含むサポニン；グリセリンジラウレート、グリセリントリラウレート、グリセリンジパルミテート、グリセリントリパルミテート、グリセリンジステアレート、グリセリントリステアレート、グリセリンジミリスチン酸、グリセリントリミリステートを含むグリセリンとグリセリンエステル；ｎ－デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、及びｎ－オクタデシルアルコールを含む長鎖アルコール；６－（５－コレステン－３β－イルオキシ）－１－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド；ジガラクトシルジグリセリド；６－（５－コレステン－３β－イルオキシ）ヘキシル－６－アミノ－６－デオキシ－１－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド；６－（５－コレステン－３β－イルオキシ）ヘキシル－６－アミノ－６－デオキシル－１－チオ－α－Ｄ－マンノピラノシド；１２－（（（７’－ジエチルアミノクマリン－３－イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカン酸；Ｎ－［１２－（（（７’－ジエチルアミノクマリン－３－イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカノイル］－２－アミノパルミチン酸；コレステリル（４'－トリメチルアンモニオ）ブタノエート；Ｎ－スクシニルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロール；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－３－スクシニルグリセロール；１，３－ジパルミトイル－２－スクシニルグリセロール；１－ヘキサデシル－２－パルミトイルグリセロホスホエタノールアミン及びパルミトイルホモシステイン；及び／又はそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
【0053】
いくつかの実施形態では、膜を形成するために使用される複数の脂質には、様々なアシル鎖長を有するリン脂質の混合物が含まれ得る。例えば、脂質には、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジベヘノイルグリセロホスホコリン（ＤＢＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドニルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、又はそれらのＰＥＧ官能化脂質のうちの少なくとも２つの混合物が含まれ得る。
【0054】
他の実施形態では、様々なアシル鎖長を有するリン脂質の混合物には、ジベヘノイルグリセロホスホコリン（ＤＢＰＣ）と、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドニルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、又はそれらのＰＥＧ官能化リン脂質からなる群から選択される１以上の追加のリン脂質が含まれ得る。
【0055】
いくつかの実施形態では、リン脂質の混合物には、重量基準で、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は約８０％のジベヘノイルグリセロホスホコリン（ＤＢＰＣ）；重量基準で、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、又は約２０％未満のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドニルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、又はそれらのＰＥＧ官能化リン脂質からなる群から選択される追加のリン脂質の組み合わせが含まれ得る。ＰＥＧは、約１０００～約５０００Ｄａ、例えば、約２０００Ｄａの分子量を有することができる。
【0056】
いくつかの実施形態では、リン脂質の混合物には、重量基準で、約４０％～約８０％、約５０％～約７０％、又は約５５％～約６５％（例えば、約６０％）のジベヘノイルグリセロホスホコリン（ＤＢＰＣ）；及び重量基準で、約２０％～約６０％、約３０％～約５０％、又は約３５％～約４５％（例えば、約４０％）のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドニルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、又はそれらのＰＥＧ官能化リン脂質からなる群から選択される追加のリン脂質の組み合わせが含まれ得る。
【0057】
他の実施形態では、１以上のさらなるリン脂質は、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及びＰＥＧ官能化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）の組み合わせを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。
【0058】
さらに他の実施形態では、リン脂質の混合物は、例えば、重量基準で約６：１：１：１の比率で、ジベヘノイルグリセロホスホコリン（ＤＢＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及びＰＥＧ官能化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）を含むことができる。
【0059】
いくつかの実施形態では、各ナノバブルの膜の脂質間に組み込まれ、ナノバブルの柔軟性を増強するエッジ活性化剤は、リン脂質界面活性剤の有効性を増強するプロピレングリコールなどの共界面活性剤を含むことができる。エッジ活性化剤は、ナノバブルの脂質ドメインの分離を引き起こし、脂質「ドメイン」の引き裂きを引き起こした可能性のある過剰な圧力を吸収する欠陥を形成するのに有効な量で、ナノバブルの各々に提供することができる。プロピレングリコールに置換することができるか、又はプロピレングリコールと組み合わせて使用することができる他のエッジ活性化剤は、コレステロール、コール酸ナトリウム、リモネン、オレイン酸、及び／又はスパン８０を含み得る。
【0060】
いくつかの実施形態では、ナノバブル中に提供されるプロピレングリコールの量は、水和脂質１ｍｌ当たり、約０.０５ｍｌ～約０.５ｍｌ、約０.０６ｍｌ～約０.４ｍｌ、約０.０７ｍｌ～約０.３ｍｌ、約０.０８ｍｌ～約０.２ｍｌ、又は約０.１ｍｌであり得る。
【0061】
他の実施形態では、各ナノバブルの膜の外表面に組み込まれ、引き裂きに対する膜耐性を増強する膜スティフナーは、グリセロールを含む。グリセロールは、膜を硬化させ、脂質「ドメイン」引き裂きに対する膜の耐性を改善するのに有効な量で、ナノバブルの各々の膜上に提供することができる。ナノバブルの膜上に提供されるグリセロールの量は、水和脂質１ｍｌ当たり、約０.０５ｍｌ～約０.５ｍｌ、約０.０６ｍｌ～約０.４ｍｌ、約０.０７ｍｌ～約０.３ｍｌ、約０.０８ｍｌ～約０.２ｍｌ、又は約０.１ｍｌであり得る。
【0062】
ナノバブルを画定する膜は、同心円状又はそれ以外であり、単層構造（すなわち、１つの単層又は二層で構成される）、オリゴラメラ構造（すなわち、約２つ若しくは約３つの単層又は二層で構成される）、又はマルチラメラ構造（すなわち、約４以上の単層又は二層で構成される）を有することができる。膜は、実質的に固体(均一)、多孔性、または半多孔性であり得る。
【0063】
膜によって画定される内部空隙空間は、少なくとも１種の気体を含むことができる。ガスは、水への溶解度が低い場合があり、例えば、パーフルオロプロパン（例えば、オクタフルオロプロパン）又はパーフルオロブタンなどのパーフルオロカーボンであり得る。内部空隙はまた、二酸化炭素、六フッ化硫黄、空気、窒素（Ｎ２）、酸素（Ｏ２）、及びヘリウムなどの他のガスを含むことができる。
【0064】
いくつかの実施形態では、ナノバブルは、標的化部分、及び任意に、治療剤を各ナノバブルの膜に連結するリンカーを含むことができる。リンカーは、任意の適切な長さであり得、任意の適切な数の原子及び／又はサブユニットを含有することができる。リンカーは、化学的及び／若しくは生物学的部分の１つ又は組み合わせを含むことができる。化学部分の例には、アルキル基、メチレン炭素鎖、エーテル、ポリエーテル、アルキルアミドリンカー、アルケニル鎖、アルキニル鎖、ジスルフィド基、及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、官能化ＰＥＧ、ＰＥＧ－キラントポリマー、樹状ポリマー、及びそれらの組み合わせなどのポリマーが含まれ得る。生物学的部分の例には、ペプチド、修飾ペプチド、ストレプトアビジン－ビオチン又はアビジン－ビオチン、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン）、多糖類、グリコサミノグリカン、オリゴヌクレオチド、リン脂質誘導体、及びそれらの組み合わせが含まれ得る。
【0065】
細胞標的ナノバブルはまた、液体、油、生理活性剤、診断剤、治療剤、光音響剤（例えば、スーダンブラック）、及び／又はナノ粒子（例えば、酸化鉄）などの他の材料を含むことができる。材料は、膜によってカプセル化され、かつ／又は膜に連結若しくはコンジュゲートされ得る。
【0066】
標的化部分は、標的細胞及び／又は組織の細胞表面分子に結合し、ナノバブルを興味のある標的細胞及び／若しくは組織に標的化並びに／又は接着させることができる。いくつかの実施形態では、標的化部分は、細胞表面又は細胞外分子若しくは細胞のバイオマーカーと相互作用することができる任意の分子、又は分子の複合体を含むことができる。細胞表面分子は、例えば、細胞プロテアーゼ、キナーゼ、タンパク質、細胞表面受容体、脂質、及び／又は脂肪酸を含むことができる。
【0067】
特定の実施形態では、標的化部分は、標的細胞の細胞表面分子に特異的に結合する。本明細書で使用される場合、第１の分子は、例えば、約１０５Ｍ－１以上の親和性又はＫａ（すなわち、１／Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡結合定数）で第２の分子に結合するか、又は第２の分子と会合する場合に、第２の分子に「特異的に結合する」。特定の実施形態では、第１の分子は、約１０６Ｍ－１、約１０７Ｍ－１、約１０８Ｍ－１、約１０９Ｍ－１、約１０１０Ｍ－１、約１０１１Ｍ－１、約１０１２Ｍ－１、又は約１０１３Ｍ－１以上のＫａで第２の分子に結合する。「高親和性」結合は、少なくとも１０７Ｍ－１、約１０８Ｍ－１、約１０９Ｍ－１、約１０１０Ｍ－１、約１０１１Ｍ－１、約１０１２Ｍ－１、約１０１３Ｍ－１、又はそれ以上のＫａでの結合を指す。あるいは、親和性は、Ｍ（例えば、（例えば、１０－５Ｍ～１０－１３Ｍ、又はそれ以下）の単位での特定の結合相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）として定義され得る。特定の態様では、特異的結合は、約１０－５Ｍ以下、約１０－６Ｍ以下、約１０－７Ｍ以下、約１０－８Ｍ以下、約１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、又は１０－１２Ｍ又はそれ以下のＫＤでの標的分子への結合を意味する。標的に対する第１の分子の結合親和性は、従来の技術を用いて、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、平衡透析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００装置、製造業者によって概説された一般的な手順を使用）によって；ラジオイムノアッセイなどにより容易に決定することができる。
【0068】
いくつかの実施形態では、標的化部分には、合成化合物、天然化合物又は生成物、高分子実体、生体工学分子（例えば、ポリペプチド、脂質、ポリヌクレオチド、抗体、抗体断片）、及び小実体（例えば、小分子、神経伝達物質、基質、リガンド、ホルモン及び元素化合物）が含まれ得るが、これらに限定されない。
【0069】
一例において、標的化部分には、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体及び抗体断片、ヒト化抗体及び抗体断片、並びに前述の多価バージョン；一般的には共有結合しているか又はそうでなければ安定化されている（すなわち、ロイシンジッパー又はヘリックス安定化された）ｓｃＦｖ断片であるジスルフィドＦｖ断片、ｓｃＦｖタンデム（（ｓｃＦｖ）２断片）、ダイアボディ、トリボディ又はテトラボディなどの単一特異的又は二重特異性抗体を含むがそれらに限定されない多価標的化部分；及び所望の標的分子と自然に相互作用する受容体分子を含むが、これらに限定されないモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はヒト化抗体などの抗体が含まれ得る。
【0070】
抗体の調製は、抗体を生成するための任意の数の周知の方法によって達成され得る。これらの方法は、一般的には、動物、一般的にはマウスの所望の免疫原（例えば、所望の標的分子又はその断片）での免疫化の工程を含む。マウスを免疫し、所望の免疫原（複数可）で１回以上ブーストすると、抗体産生ハイブリドーマを調製し、周知の方法に従ってスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体産生の一般的な概要については、例えば、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，ｐｐ．１３１－１３９，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．（１９９７）を参照されたく、その一部は参照により本明細書に組み込まれる。
【0071】
標的化部分は、生物学的供給源に由来する必要はない。標的化部分は、例えば、合成ペプチドのコンビナトリアルライブラリーからスクリーニングされ得る。そのような方法の１つは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５,９４８,６３５号に記載されており、これはＭ１３のｐＩＩＩ遺伝子におけるランダムなアミノ酸挿入を有するファージミドライブラリーの生成を説明している。このファージは、親和性選択によってクローン増幅され得る。
【0072】
所望の特異性を有する標的化部分を調製するために使用される免疫原は、一般に、標的分子、又はその断片若しくは誘導体である。そのような免疫原は、それらが天然に存在する供給源から単離されるか、又は当技術分野で公知の方法を用いて合成されてもよい。例えば、ペプチド鎖は、アミンとカルボキシル基の１－エチル－３－[ジメチルアミノプロプリ]カルボジイミド（ＥＤＣ）触媒縮合によって合成され得る。特定の実施形態では、免疫原は、担体ビーズ又はタンパク質に連結され得る。例えば、担体は、Ｂａｃｈｅｍ，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡから市販されているＳＡＳＲＩＮ樹脂などの官能化ビーズ、又はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）若しくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質であり得る。免疫原は、担体に直接結合してもよく、又は非免疫原性合成リンカー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基、アミノカプロン酸若しくはその誘導体）又はランダム若しくは半ランダムポリペプチドなどのリンカーを介して担体と結合させてもよい。
【0073】
特定の実施形態では、ポリペプチド標的化部分の結合領域を変異させ、変異していない標的化部分と比較して優れた結合特性を有する標的化部分を選択することが望ましい場合がある。これは、エラーを引き起こす条件下でのＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲなど、任意の標準的な変異誘発技術によって達成され得る。このような場合、ＰＣＲプライマーは、変異を引き起こす条件下でファージミドプラスミドのｓｃＦｖコード配列を増幅するために使用することができる。次いで、ＰＣＲ産物をファージミドベクターにクローニングし、上記のように所望の特異性についてスクリーニングしてよい。
【0074】
他の実施形態では、標的化部分は、プロテアーゼによる切断に対してより耐性にさせるように改変され得る。例えば、ポリペプチドを含む標的化部分の安定性は、（Ｌ）配置中の天然に存在するアミノ酸の１以上をＤ－アミノ酸で置換することによって増加させてよい。様々な実施形態では、標的化部分のアミノ酸残基の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、５０％、８０％、９０％又は１００％がＤ配置のものであってよい。Ｌアミノ酸からＤアミノ酸への切り替えは、消化管に見られる多くのユビキタスペプチダーゼの消化能力を中和する。あるいは、ペプチド結合を含む標的化部分の安定性の増強は、従来のペプチド結合の修飾の導入によって達成され得る。例えば、ポリペプチド骨格内に環状環を導入すると、胃又は他の消化器官及び血清中でポリペプチドを消化することが知られている多くのタンパク質分解酵素の効果を回避するために、増強された安定性が付与され得る。さらに他の実施形態では、標的化部分の安定性の増強は、標的化部分のアミノ酸間に１以上の右旋性アミノ酸（右旋性フェニルアラニン又は右旋性トリプトファンなど）をインターカレートすることによって達成され得る。例示的な実施形態では、そのような修飾は、所望の標的分子との相互作用の活性又は特異性に影響を与えることなく、標的化部分のプロテアーゼ耐性を増加させる。
【0075】
特定の実施形態では、抗体又はその変異体は、対象に投与されたときにそれらの免疫原性が低くなるように改変され得る。例えば、対象がヒトである場合、抗体は「ヒト化」されてよく、それは、例えば、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ら（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２－５２５又はＴｅｍｐｅｓｔら（１９９１），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６－２７３に記載されているように、ハイブリドーマ由来抗体の相補性決定領域（複数可）が、ヒトモノクローナル抗体に移植されている。また、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物を用いて、ヒト化抗体を発現させてもよい。そのようなヒト化は、部分的又は完全であり得る。
【0076】
特定の実施形態では、本明細書に記載の標的化部分は、ナノバブルを標的細胞に選択的に導くホーミングペプチドを含んでもよい。標的細胞に対するホーミングペプチドは、当技術分野で周知の様々な方法を用いて同定することができる。多くの研究室で、脳、腎臓、肺、皮膚、膵臓、腸、子宮、副腎、網膜、筋肉、前立腺、又は腫瘍の血管系の細胞に選択的なホーミングペプチドが同定されている。例えば、Ｓａｍｏｙｌｏｖａら，１９９９，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ，２２：４６０；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら，１９９６ Ｎａｔｕｒｅ，３８０：３６４；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：２６５；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら，１９９５，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３０：１１８９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら，１９９６，Ｍｏｌｅ．Ｐｓｙｃｈ．，１：４２１，４２３；Ｒａｊｏｔｔｅら，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２：４３０；Ｒａｊｏｔｔｅら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１１５９３を参照されたい。米国特許第５，６２２，６９９９号；同第６，０６８，８２９号；同第６，１７４，６８７号；同第６，１８０，０８４号；同第６，２３２，２８７号；同第６，２９６，８３２号；同第６，３０３，５７３号；及び同第６，３０６，３６５も参照されたい。
【0077】
ファージディスプレイ技術は、ランダムペプチド又は選択的にランダム化されたペプチドの多様な集団を発現させるための手段を提供する。ファージディスプレイの様々な方法及びペプチドの多様な集団を生成する方法は、当技術分野において周知である。例えば、ファージの表面上の結合ドメインの多様な集団を調製する方法は、米国特許第５,２２３,４０９号に記載されている。特に、ファージディスプレイライブラリーを生成するのに有用なファージベクター、並びに潜在的な結合ドメインを選択し、ランダム又は選択的に変異した結合ドメインを生成する方法も、米国特許第５,２２３,４０９号に提供されている。同様に、ベクターを含むファージペプチドディスプレイライブラリーを生成する方法及び発現させるペプチドの集団を多様化する方法も、Ｓｍｉｔｈら，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７：２２８－２５７，Ｓｃｏｔｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６－３９０，及び２つのＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０７１４１及びＷＯ ９１／０７１４９に記載されている。ファージディスプレイ技術は、例えば、ランダムペプチド又はランダム若しくは望ましく偏ったペプチドを生成するために使用することができるコドンベースの変異誘発法と共に使用される場合、特に強力であり得る（例えば、米国特許第５,２６４,５６３号を参照）。それら又は他の周知の方法を用いて、ファージディスプレイライブラリーを生成することができ、それを、１つ又は少数の選択された組織に進むペプチドを同定するためにインビボファージディスプレイ法に供することができる。
【0078】
ファージライブラリーのインビトロスクリーニングは、抗体又は細胞表面受容体に結合するペプチドを同定するために以前に使用された（例えば、Ｓｍｉｔｈ，ら，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７：２２８－２５７参照）。例えば、ファージペプチドディスプレイライブラリーのインビトロスクリーニングは、インテグリン接着受容体（例えば、Ｋｏｉｖｕｎｅｎら，１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２４：３７３－３８０参照）、及びヒトウロキナーゼ受容体（Ｇｏｏｄｓｏｎら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ９１：７１２９－７１３３）に特異的に結合する新規ペプチドを同定するために使用されている。
【0079】
特定の実施形態では、標的化部分は、例えば、標的細胞の所望の特異的分子を自然に認識する受容体を含む受容体分子を含み得る。そのような受容体分子には、標的分子との相互作用の特異性を高めるように修飾された受容体、受容体によって自然に認識されない所望の標的分子と相互作用するように修飾された受容体、及びそのような受容体の断片が含まれる（例えば、Ｓｋｅｒｒａ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，１３：１６７－１８７参照）。好ましい受容体はケモカイン受容体である。例示的なケモカイン受容体は、例えば、Ｌａｐｉｄｏｔら，２００２，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ，３０：９７３－８１及びＯｎｕｆｆｅｒら，２００２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ，２３：４５９－６７に記載されている。
【0080】
他の実施形態では、標的化部分は、例えば、標的細胞の所望の特異的受容体を自然に認識するリガンドを含むリガンド分子を含み得る。そのようなリガンド分子には、標的受容体との相互作用の特異性を高めるように修飾されたリガンド、リガンドによって自然に認識されない所望の受容体と相互作用するように修飾されたリガンド、及びそのようなリガンドの断片が含まれる。
【0081】
さらに他の実施形態では、標的化部分はアプタマーを含んでよい。アプタマーは、標的細胞の所望の分子構造に特異的に結合するように選択されるオリゴヌクレオチドである。アプタマーは、一般的には、ファージディスプレイの親和性選択（インビトロ分子進化としても知られる）に類似した親和性選択プロセスの産物である。このプロセスでは、例えば、病気の免疫原が結合している固体支持体を使用して、親和性分離のいくつかのタンデム反復を行い、続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行して、免疫原に結合した核酸を増幅することを含む。そのため、アフィニティー分離の各ラウンドは、所望の免疫原に首尾よく結合する分子の核酸集団を富化させる。このようにして、核酸のランダムプールを「教育」して、標的分子に特異的に結合するアプタマーを生じさせてよい。アプタマーは、一般的にはＲＮＡであるが、限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びホスホロチオエート核酸などのＤＮＡ又はその類似体若しくは誘導体であり得る。
【0082】
さらに他の実施形態では、標的化部分は、ペプチド模倣体であってよい。例えば、他のタンパク質の結合に関与するタンパク質のアミノ酸残基をマッピングするためにスキャニング変異誘発を採用することによって、それらの残基を模倣し、相互作用を促進するペプチド模倣化合物を作製することができる。次いで、そのような模倣体は、ナノバブルを標的細胞に送達するための標的化部分として使用してよい。例えば、そのような残基の非加水分解性ペプチド類似体は、ベンゾジアゼピン（例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒら．ペプチド：化学及び生物学（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（編），ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８参照）、アゼピン（例えば、Ｈｕｆｆｍａｎら ペプチド：化学及び生物学（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（編），ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８参照）、置換ガンマラクタム環（Ｇａｒｖｅｙら ペプチド：化学及び生物学（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（編），ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８）、ケトメチレンプソイドペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎら，１９８６，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２９：２９５；及びＥｗｅｎｓｏｎら，ペプチド：構造及び機能（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（第９回アメリカペプチドシンポジウム議事録（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）） Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｉｌｌ．，１９８５）、ｂ－ターンジペプチドコア（Ｎａｇａｉら，１９８５，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２６：６４７；及びＳａｔｏら，１９８６，Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １：１２３１）、並びにβ－アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎら，１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｕｍｍｕｎ １２６：４１９；及びＤａｎｎら，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １３４：７１）を用いて作製することができる。
【0083】
いくつかの実施形態では、標的化部分は、標的細胞上の抗原に結合する。関心のある標的細胞には、細胞死を誘導することが望ましい特定の疾患又は状態に関連する細胞が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態によれば、標的細胞は、癌細胞、免疫細胞、内皮細胞、又は微生物の原核細胞であり得る。
【0084】
そのようなものとして、いくつかの実施形態では、標的細胞は癌細胞である。「癌細胞」とは、例えば、異常な細胞成長、異常な細胞増殖、密度依存的増殖阻害の喪失、足場非依存性増殖能、免疫不全非ヒト動物モデルにおける腫瘍成長及び／若しくは発達を促進する能力、並びに／又は細胞形質転換の任意の適切な指標のうちの１以上によって特徴付けられ得る、腫瘍性細胞表現型を示す細胞を意味する。「癌細胞」は、本明細書では「腫瘍細胞」、「悪性細胞」又は「癌腫細胞」と互換的に使用されてよく、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍などの癌細胞を包含する。特定の態様では、癌細胞は癌腫細胞である。
【0085】
いくつかの実施形態では、癌細胞抗原は、５Ｔ４、α２β１インテグリン、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ（ＡＸＬ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ｃ－ＭＥＴ（肝細胞増殖因子受容体）、Ｃ４．４ａ、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）、カドヘリン－６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、癌胚性抗原（ＣＥＡ）、ｃＫｉｔ、コラーゲン受容体、クリプトタンパク質、ＣＳ１、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＬＬ３）、エンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ）、エフリンＡ４（ＥＦＮＡ４）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＰＨ受容体Ａ２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、非転移性糖タンパク質Ｂ（ＧＰＮＭＢ）、グアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）、インテグリンα、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ－１）、ルイスＹ、ＬＩＶ－１、ロイシンリッチリピート含有１５（ＬＲＲＣ１５）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン－４、ＮＭＢ、ＮＯＴＣＨ３、ｐ－カドヘリン（ｐ－ＣＡＤ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プロテインチロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、プロテインチロシンホスファターゼμ（ＰＴＰμ）溶質担体ファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、ＳＬＩＴ様ファミリーメンバー６（ＳＬＩＴＲＫ６）、ＳＴＥＡＰファミリーメンバー１（ＳＴＥＡＰ１）、組織因子（ＴＦ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンタンパク質－１（ＴＩＭ－１）、又は栄養芽細胞表面抗原（ＴＲＯＰ－２）のうちの少なくとも１つを含むことができる。
【0086】
標的化部分として使用され得る腫瘍抗原に特異的に結合する抗体の非限定的な例には、アデカツムマブ、アスクリンバクマブ、チクスツムマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュルバルマブ、ドゥシギツマブ、エンフォルツマブ、エノチクマブ、フィギツムマブ、ガニツマブ、グレンバツムマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、イクルクマブ、レクサツムマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、ナルナツマブ、ネシツムマブ、ネスバクマブ、オファツムマブ、オララツマブ、パニツムマブ、パトリツマブ、プリツムマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、ロバツムマブ、セリバンツマブ、タレクツマブ、テプロツムマブ、トベツマブ、バンティクツマブ、ベセンクマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、フランボツマブ、アルツモマブ、アナツモマブ、アルチツモマブ（Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）、ベクツモマブ、ブリナツモマブ、デツモマブ、イブリツモマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナプツモマブ、ノフェツモマブ、ペムツモマブ、ピンツモマブ、ラコツモマブ、サツモマブ、ソリトマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、トシツモマブ、トレメリムマブ、アバゴボマブ、イゴボマブ、オレゴボマブ、カプロマブ、エドレコロマブ、ナコロマブ、アマツキシマブ、バビツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、デルロツキシマブ、ジヌツキシマブ、エンシツキシマブ、フツキシマブ、ギレンツキシマブ、インダツキシマブ、イサツキシマブ、マルゲツキシマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、ウブリツキシマブ、エクロメキシマブ、アビツズマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブロンチクツズマブ、カンツズマブ、カンツズマブ、チタツズマブ、クリバツズマブ、ダセツズマブ、デムシズマブ、ダロツズマブ、デニンツズマブ、エロツズマブ、エマクツズマブ、エミベツズマブ、エノブリツズマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、ゲムツズマブ、イムガツズマブ、イノツズマブ、ラベツズマブ、リファスツズマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルムレツズマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ニモツズマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オトレルツズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、パルサツズマブ、ペルツズマブ、ピナツズマブ、ポラツズマブ、シブロツズマブ、シムツズマブ、タカツズマブ、ティガツズマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、バンドルツズマブ、バヌシズマブ、ペルツズマブ、ボルセツズマブ、ソチツズマブ（Ｓｏｔｉｔｕｚｕｍａｂ）、カツマキソマブ、エルツマクソマブ、デパツキシズマブ、オンツキシズマブ、ブロンツベトマブ、タムツベトマブ、又はそれらの腫瘍抗原結合変異体が含まれる。本明細書で使用する「変異体」は、特定の抗原に特異的に結合する（例えば、トラスツズマブに対するＨＥＲ２）が、親抗体より少ない又はより多いアミノ酸を有する（例えば、親抗体の断片（例えば、ｓｃＦｖ）である）抗体、親抗体に対して１以上のアミノ酸置換を有すること抗体、又はそれらの組み合わせを意味する。
【0087】
例として、標的化される細胞が卵巣癌細胞を含む場合、標的化部分は、ヒトＣＡ－１２５Ｒに対する抗体又はペプチドを含むことができる。ＣＡ－１２５の過剰発現は、卵巣癌細胞において意義を有する。あるいは、標的化される細胞が膠芽腫などの悪性癌を含む場合、標的化部分は、細胞外成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、及び／若しくは細胞外切断型ＰＴＰｍｕに対する抗体又はペプチドを含むことができる。ＥＧＦＲ及びＴｆＲの過剰発現並びにＰＴＰｍｕの細胞外切断は、腫瘍細胞の悪性表現型に関与している。
【0088】
他の標的化部分は、インビボでＰＳＭＡ発現腫瘍、癌細胞、及び／又は癌血管新生を選択的に認識することができるＰＳＭＡ標的化部分又はＰＳＭＡリガンドを含むことができる。ＰＳＭＡは、ほとんど全ての前立腺癌（ＰＣ）腫瘍で高度に過剰発現（１００～１０００倍）している膜貫通タンパク質である。原発性ＰＣ病変のわずか５～１０％がＰＳＭＡ陰性であることが示されている。ＰＳＭＡ発現レベルは、腫瘍の病期及び悪性度が高いほど増加する。
【0089】
小分子ＰＳＭＡリガンドは、ＰＳＭＡの細胞外ドメイン内の活性部位に結合し、内部移行され、エンドソームでリサイクルされ、腫瘍の取り込み及び保持の増強並びに高画質をもたらす。ＰＳＭＡリガンドの例は、Ａｆｓｈａｒ－Ｏｒｏｍｉｅｈ Ａ、Ｍａｌｃｈｅｒ Ａ、Ｅｄｅｒ Ｍらの前立腺癌の診断用の[６８Ｇａ]ガリウム標識ＰＳＭＡリガンドを用いたＰＥＴイメージング：ヒトにおける生体分布及び腫瘍の最初の評価（ＰＥＴ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ａ ［６８Ｇａ］ｇａｌｌｉｕｍ―ｌａｂｅｌｌｅｄ ＰＳＭＡ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ：ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｆｉｒｓｔ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ）；Ｗｅｉｎｅｉｓｅｎ Ｍ，Ｓｃｈｏｔｔｅｌｉｕｓ Ｍ，Ｓｉｍｅｃｅｋ Ｊ．ら ６８Ｇａ及び１７７Ｌｕ標識ＰＳＭＡ Ｉ＆Ｔ：ＰＳＭＡ標的化セラノスティック概念の最適化並びに最初の概念実証のヒト研究（６８Ｇａ－ａｎｄ １７７Ｌｕ－Ｌａｂｅｌｅｄ ＰＳＭＡ Ｉ＆Ｔ： Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａ ＰＳＭＡ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｎｃｅｐｔ ａｎｄ Ｆｉｒｓｔ Ｐｒｏｏｆ－ｏｆ－Ｃｏｎｃｅｐｔ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ） Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．２０１５；５６：１１６９－１１７６．ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ．２０１３；４０：４８６－４９５；Ｃｈｏ ＳＹ，Ｇａｇｅ ＫＬ，Ｍｅａｓｅ ＲＣ，ら 前立腺特異的膜抗原の低分子量阻害剤である１８Ｆ－ＤＣＦＢＣの転移性前立腺癌患者における生体分布、腫瘍検出、及び放射線量測定（Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｔｕｍｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ ｏｆ １８Ｆ－ＤＣＦＢＣ，ａ ｌｏｗ－ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｗｅｉｇｈｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ） Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ． ２０１２；５３：１８８３－１８９１；及びＲｏｗｅ ＳＰ，Ｇａｇｅ ＫＬ，Ｆａｒａｊ ＳＦ，ら 原発性前立腺癌のＰＳＭＡベースの検出及び特徴付け用の（１）（８）Ｆ－ＤＣＦＢＣ ＰＥＴ／ＣＴ（（１）（８）Ｆ－ＤＣＦＢＣ ＰＥＴ／ＣＴ ｆｏｒ ＰＳＭＡ－Ｂａｓｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ） Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ． ２０１５；５６：１００３－１０１０に記載されている。
【0090】
ＰＳＭＡリガンドの他の例は、米国特許第６,８７５,８８６号、米国特許第６,９３３,１１４号、及び米国特許第８,６０９,１４２号に記載されており、それらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＰＳＭＡリガンドのさらに他の例は、米国特許出願公開第２０１５／０３６６９６８号、米国特許出願公開第２０１５／０３６６９６８号、同第２０１８／００６４８３１号、同第２０１８／０３６９３８５号及び米国特許第９,８８９,１９９号に開示されており、それらの全ては参照によりその全体が組み込まれる。
【0091】
いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡリガンドは、一般式（Ｉ）：
（式中、
ｎ及びｎ１は、各々独立して１、２、３、又は４であり；
Ｌは、任意に置換された脂肪族又はヘテロ脂肪族連結基であり；
Ｂは、少なくとも１つの負に荷電したアミノ酸を含むペプチドリンカーなどのリンカーであり；
Ｙは、Ｂに直接的若しくは間接的に連結又は結合されたナノバブルの脂質であり、かつ
Ｚは、水素又はＢに直接的若しくは間接的に連結又は結合されている検出可能な部分又は標識又は治療剤のうちの少なくとも１つである）
を有することができる。他の実施形態では、Ｚは、画像化剤、抗癌剤、又はそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。さらに他の実施形態では、Ｚは、ローダミン、ＩＲＤｙｅ７００、ＩＲＤｙｅ８００、Ｃｙ３、Ｃｙ５、及び／又はＣｙ５.５などの蛍光標識である。
【化1】
ｎ及びｎ１は、各々独立して１、２、３、又は４であり；
Ｌは、任意に置換された脂肪族又はヘテロ脂肪族連結基であり；
Ｂは、少なくとも１つの負に荷電したアミノ酸を含むペプチドリンカーなどのリンカーであり；
Ｙは、Ｂに直接的若しくは間接的に連結又は結合されたナノバブルの脂質であり、かつ
Ｚは、水素又はＢに直接的若しくは間接的に連結又は結合されている検出可能な部分又は標識又は治療剤のうちの少なくとも１つである）
を有することができる。他の実施形態では、Ｚは、画像化剤、抗癌剤、又はそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。さらに他の実施形態では、Ｚは、ローダミン、ＩＲＤｙｅ７００、ＩＲＤｙｅ８００、Ｃｙ３、Ｃｙ５、及び／又はＣｙ５.５などの蛍光標識である。
【0092】
任意に、細胞標的ナノバブルは、膜によって封入され、かつ／又は膜に連結された治療剤を含むことができる。治療剤の例には、化学療法剤、生物学的に活性のあるリガンド、小分子、ＤＮＡ断片、ＤＮＡプラスミド、ｓｉＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ分子、オリゴヌクレオチド、及びｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡが含まれ得るが、これらに限定されない。治療剤は、対象における病弊、苦悩、病態、疾患又は傷害の治療（予防、診断、緩和、又は治癒を含む）に使用される任意の治療剤又は予防剤を指すことができる。膜が、追加的に又は任意にタンパク質、炭水化物、ポリマー、界面活性剤、及び／又は他の膜安定化材料を含むことができ、それらの任意の１つ又は組み合わせは、天然、合成、又は半合成であり得ることは理解されよう。
【0093】
いくつかの実施形態では、治療剤は、化学療法剤、抗増殖剤、抗菌剤、殺生物剤、及び／又は制生剤のうちの少なくとも１つであり得る。治療剤は、ナノバブルの膜によって封入及び／又は連結され得る。
【0094】
いくつかの実施形態では、細胞標的ナノバブルは、少なくとも１つの脂質及び標的化部分に連結された脂質をプロピレングリコールに溶解することによって形成することができる。例えば、ＰＳＭＡ標的ナノバブルは、脂質－プロピレングリコール溶液を生成するために、１，２－ジベヘノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ，Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．，Ｐｅｌｈａｍ，ＡＬ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート；ＤＰＰＡ、１，２-ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－蛍光体エタノールアミン；ＤＰＰＥ（Ｃｏｒｄｅｎ Ｐｈａｒｍａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－[メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００]（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ ２０００、Ｌａｙｓａｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｒａｂ，ＡＬ）を、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＰＳＭＡ－１と共にプロピレングリコールに溶解することによって調製することができる。タンパク質、炭水化物、ポリマー、界面活性剤、及び／又は他の膜安定化材料などの他の物質をプロピレングリコールに溶解することができることは理解されよう。
【0095】
脂質プロピレングリコール溶液を生成した後、グリセロール及びリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）溶液を脂質プロピレングリコール溶液に添加することができ、得られた溶液を、例えば超音波処理により混合することができる。混合溶液をバイアルに移すことができる。空気は、水和脂質溶液を含む密封されたバイアルから除去して、バイアルの圧力が均等になるまで、オクタフルオロプロパンなどのガスで置き換えることができる。次いで、得られた溶液は、ナノバブルを形成するのに十分な時間（例えば、約４５秒）、振盪又は撹拌することができる。一例では、プロピレングリコールに溶解したＤＢＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＰＰＥ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＰＳＭＡ－１を含む脂質－プロピレングリコール溶液を、水和ＰＢＳ／グリセロール溶液と接触させ、バイアルに入れ、次いで、約３７℃及び約１２０ｒｐｍでインキュベーターシェーカーに約６０分間入れることができる。いくつかの実施形態では、ナノバブルを含む得られた溶液は、凍結乾燥して、貯蔵及び出荷のために再構成されるか、又は凍結され、使用前に解凍することができる。
【0096】
そのように形成された細胞標的ナノバブルは、静脈内注射などを介して任意の既知の経路を介して対象に投与することができる。例として、複数のオクタフルオロプロパン含有ナノバブルを含む組成物を、腫瘍を有することが知られているか又は疑われる対象に静脈内投与することができる。
【0097】
いくつかの実施形態では、ナノバブルは、固形腫瘍、例えば、固形癌腫、肉腫若しくはリンパ腫、及び／又は腫瘍性細胞の集合体などの腫瘍性疾患を治療するために対象に投与される。腫瘍は、悪性又は良性であり得、癌性細胞と前癌性細胞の両方を含むことができる。
【0098】
細胞標的ナノバブルを含む組成物は、少なくとも１つの腫瘍性障害と診断された対象への投与（例えば、注射）用に製剤化することができる。例えば、細胞標的ナノバブルは、これが前立腺癌細胞上で過剰発現しているＰＳＭＡ抗原に特異的であるＰＳＭＡリガンドをコンジュゲートすることによって前立腺癌細胞に標的化され得る。細胞標的ナノバブルは、ＰＥＧにコンジュゲートされた少なくとも１つの脂質で製剤化することができる。次いで、ナノバブルをＰＳＭＡリガンドと組み合わせることができ、次いで、これは脂質のＰＥＧにコンジュゲートするようになる。
【0099】
ナノバブル組成物が対象に投与される場所（複数可）は、腫瘍性細胞の場所（例えば、腫瘍の位置、腫瘍の大きさ、及び特定の器官上若しくはその近くの腫瘍の場所）などの、対象の個々の必要性に基づいて決定され得る。例えば、該組成物は、対象に静脈内注射され得る。例えば、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内経路を含む他の注射経路が使用され得ることは理解されよう。
【0100】
対象に投与された細胞標的ナノバブルは、対象内を循環し、標的化部分を標的細胞の細胞表面分子と結合及び／又は複合化することによって、標的細胞と結合及び／又は複合体形成することができる。一般的には、細胞標的ナノバブルは、約１０分以内、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、又は約１時間若しくはそれ以内で標的細胞と結合及び／又は複合体形成することができる。
【0101】
細胞標的ナノバブルが標的細胞に結合及び／又は複合化されると、細胞標的ナノバブルのサイズ及び／又は直径は、ナノバブルが、例えばエンドサイトーシス及び／又は貪食作用によって内部移行するか、又は標的細胞に入ることを可能にする。細胞標的ナノバブルは、標的細胞内に蓄積し、長期間、例えば、少なくとも１時間、２時間、３時間、又はそれ以上の間、細胞内にとどまることができる。
【0102】
再び図１及び図２を参照すると、細胞標的ナノバブルの標的細胞への内部移行に続いて、方法１０の工程１４において、内部移行ナノバブルを、所与の周波数の超音波エネルギー、音圧、及び内部移行ナノバブルの激しい周期的変動、振動、及び急速な体積崩壊及び／又は慣性キャビテーションを促進するのに有効な時間共振させ、標的細胞のアポトーシス及び／又は壊死をもたらすことができる。
【0103】
内部移行ナノバブルの共振は、慣性キャビテーションを促進するのに有効な超音波エネルギーを生成する非侵襲的、低侵襲的、及び／又は外部の超音波源を使用することによって達成することができる。印加された超音波シグナルの強度及び周波数、並びに超音波源を活性化するためのデューティーサイクル及びパターンは、所与の用途に合わせて制御可能であり、構成される。ナノバブルのダイナミクスを監視し、慣性崩壊のシグネチャを治療パラメータと相関させることは、作用機序に関するさらなる洞察を得るための戦略と、臨床転帰を改善するための治療内モニタリングを提供する。
【0104】
超音波源は、正常な細胞及び組織を混乱させ、かつ／又は悪影響を及ぼすことなく、ナノバブル崩壊を促進することができる特異的音響シーケンスを提供することができる。これらの配列は、非集束トランスデューサから適用することができ、これは、薬物送達及びヒストトリプシーなどの超音波治療に使用される典型的な集束超音波トランスデューサとは異なる。非集束超音波の使用は、例えば、容易に視覚化することができないため、それ上で集束超音波を使用することができない肝臓又は骨における広範囲の癌微小転移のような病変を治療することを可能にさせる。集束トランスデューサも特定の用途に使用できることは理解されよう。
【0105】
いくつかの実施形態では、共振は、約１％～約５０％、約１％～約４０％、約１％～約３０％、約１％～約２５％、約１％～約２０％、約１％～約１５％、又は約５％～約１５％のデューティーサイクル、約１ＭＨｚ～約５０ＭＨｚ、約１ＭＨｚ～約４０ＭＨｚ、約１ＭＨｚ～約３０ＭＨｚ、約１ＭＨｚ～約２０ＭＨｚ、約１ＭＨｚ～約１５ＭＨｚ、又は約１ＭＨｚ～約１０ＭＨｚの超音波周波数、約０.１Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２、約０.１Ｗ／ｃｍ２～約９Ｗ／ｃｍ２、約０.１Ｗ／ｃｍ２～約８Ｗ／ｃｍ２、約０.１Ｗ／ｃｍ２～約７Ｗ／ｃｍ２、約０.１Ｗ／ｃｍ２～約６Ｗ／ｃｍ２、約０.１Ｗ／ｃｍ２～約５Ｗ／ｃｍ２、約０.１Ｗ／ｃｍ２～約４Ｗ／ｃｍ２、又は約１Ｗ／ｃｍ２～約４Ｗ／ｃｍ２の強度、約５０ｋＰａ～約１ＭＰａ、約５０ｋＰａ～約９００ＫＰａ、約５０ｋＰａ～約８００ＫＰａ、約５０ｋＰａ～約７５０ＫＰａ、約１００ｋＰａ～約７５０ＫＰａ、又は約１５０ｋＰａ～約７５０ＫＰａの圧力振幅、及び約１分～約３０分、約１分～約２５分、約１分～約２０分、約１分～約１５分、約１分～約１０分、又は約１分～約５分の時間であり得る。
【0106】
他の実施形態では、共振は、ナノバブルが投与される組織に送られる異なる圧力振幅のパルスを有する２つの超音波パルスシーケンスを含むことができ、一方のパルスは、他方のパルスよりも大きい圧力振幅を有する。例えば、一方のパルスは、他方のパルスの少なくとも２倍の圧力振幅を有することができる。
【0107】
いくつかの実施形態では、１つのパルスは慣性キャビテーションのためのナノバブル圧力閾値を下回り、続くもう１つのパルスは、慣性キャビテーションのための閾値の圧力閾値を上回る。例えば、圧力閾値が２００ｋＰａのナノバブルの場合、最初のパルスは１５０ｋＰａで、続くもう１つのパルスが２５０ｋＰａである。別の例では、５００ｋＰａの圧力閾値を有するナノバブルの場合、１つのパルスは３００ｋＰａであり、第２のパルスは６００ｋＰａである。
【0108】
他の実施形態では、最大慣性キャビテーションを誘導するために、全体のパルス長は、典型的なイメージングパルス（３～６サイクル）よりも長く（１０～３０サイクル）てもよい。
【0109】
いくつかの実施形態では、超音波源を含むシステムは、超音波源（送信機）と、受動キャビテーション検出及びモニタリング音響センサ（受信機）の両方を備えてもよい。音響センサは、複数の素子のアレイ内のトランスデューサ素子として送信超音波源に一体化されるか、又は超音波源及び標的領域に対して適切に配置されるハイドロフォンなどのスタンドアロンセンサとして実装されてもよい。単に発生源周波数で反射超音波シグナルを検出する代わりに、このシステムは、標的細胞を選択的に蓄積する細胞標的ナノバブルの崩壊から生じる慣性キャビテーションシグナルの検出に依存し得る。
【0110】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療及び／又は方法は、それを必要とする対象における癌を治療するために使用することができる。そのような方法には、複数の癌細胞標的ナノバブルを対象に投与することが含まれる。癌細胞標的ナノバブルの各々は、少なくとも１種のガスを含む少なくとも１つの内部空隙を画定する脂質膜と、脂質膜の外表面に連結された標的化部分とを有することができる。標的化部分は、標的癌細胞の癌細胞表面分子に結合することができる。癌細胞標的ナノバブルは、標的化部分を癌細胞表面分子に結合する際に標的癌細胞によるナノバブルの内部移行を促進するサイズ及び／又は直径を有することができる。対象への癌細胞標的ナノバブルの投与及び癌細胞標的ナノバブルの癌細胞への内部移行に続いて、内部移行ナノバブルは、内部移行ナノバブルの慣性キャビテーション並びに標的癌細胞のアポトーシス及び／又は壊死を促進するのに有効な超音波エネルギーで共振され得る。
【0111】
特定の実施形態では、対象は、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発性腫瘍、転移性腫瘍、液体腫瘍（例えば、白血病又はリンパ腫）などの存在によって特徴付けられる癌を有する。本明細書に記載の方法を用いて治療することができる癌には、成人及び小児の急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、エイズ関連癌、肛門癌、虫垂の癌、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、胆道癌、骨肉腫、線維性組織球腫、脳癌、脳幹グリオーマ、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、膠芽腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視床下部神経膠島、乳癌、男性乳癌、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、出所不明の癌腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性及び骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、消化管間質腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、グリオーマ、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部及び視覚経路グリオーマ、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、腎細胞癌、喉頭癌、唇及び口腔癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、原発性中枢神経系リンパ腫、ウォルデンストローム・マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、髄芽腫、黒色腫、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、扁平上皮癌、多発性内分泌腫瘍性症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、慢性骨髄増殖性障害、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、中咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体癌、形質細胞腫瘍、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、小腸癌、扁平上皮癌、扁平上皮頸部癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、移行上皮癌、栄養膜腫瘍、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、絨毛癌、血液腫瘍、成人Ｔ細胞白血病、リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、間質腫瘍及び生殖細胞腫瘍、又はウィルムス腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、癌は、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、脳及び中枢神経系癌、皮膚癌、卵巣癌、白血病、子宮内膜癌、骨、軟骨及び軟部組織肉腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、腎芽細胞腫、網膜芽細胞腫、又は生殖腺胚細胞腫瘍である。
【0112】
いくつかの実施形態では、対象は、乳癌、膠芽腫、神経芽細胞腫、頭頸部癌、胃癌、卵巣癌、皮膚癌（例えば、基底細胞癌、黒色腫など）、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、神経膠腫、膀胱癌、子宮内膜癌、腎臓癌、白血病（例えば、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）など）、肝癌（例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）、原発性又は再発ＨＣＣなど）、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫など）、膵臓癌、甲状腺癌、それらの任意の組み合わせ、及びそれらの任意のサブタイプから選択される癌を有する。
【0113】
本明細書に記載の癌細胞標的ナノバブルを含む医薬組成物は、治療有効量で対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、癌細胞標的ナノバブルの治療有効量は、１以上の用量で、単独で（例えば、単独療法において）又は１以上の追加の治療剤と組み合わせて（例えば、併用療法）投与された場合に、コンジュゲートによる治療の非存在下での個体における症状と比較して、個体における病理学的状態（例えば、癌）の症状を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又はそれ以上軽減するのに有効な量である。いくつかの実施形態によれば、対象が癌を有する場合、本明細書に記載の方法は、癌細胞標的ナノバブルが有効量で投与された場合に、癌のアポトーシス及び／又は壊死を促進する。
【0114】
投薬は、治療されるべき状態（例えば、癌）の重症度及び応答性に依存する。最適な投薬スケジュールは、個体の体内における薬物蓄積の測定から計算することができる。投与医師は、最適な投与量、投与方法及び繰り返し率を決定することができる。最適投与量は、個々の薬剤の相対効力に応じて変更してよく、一般に、インビトロ及びインビボ動物モデルにおいて有効であることが見出されたＥＣ５０などに基づいて推定することができる。一般に、投与量は、毎日、毎週、毎月、又は毎年１回以上与えられ得る。治療する医師は、測定された滞留時間及び体液又は組織中のコンジュゲートの濃度に基づいて、投薬の繰り返し率を推定することができる。治療の成功後に、疾患状態の再発を予防するための維持療法を対象に受けさせることが望ましい場合があり、その療法では、細胞標的ナノバブルは、維持用量で１日１回以上、数ヶ月に１回、６ヶ月に１回、年に１回、又は他の任意の適切な頻度で投与することができる。
【0115】
いくつかの実施形態では、薬物、及び／又は化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）などの治療剤をナノバブル形成中にナノバブルに装填し、薬物を装填した細胞標的ナノバブルを提供することもできる。薬物を装填した細胞標的ナノバブルは、ナノバブルから治療薬を放出する超音波エネルギーに応答して、ナノバブルを対象に投与することができる。都合の良いことに、化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）などの治療剤の遠隔放出を可能にする細胞標的ナノバブルは、対象への全身投与（例えば、静脈内、血管内、又は動脈内注射）によって腫瘍、癌、及び転移などの対象の特異的細胞若しくは組織を標的とするか又は標的化され、そしてもう一度、対象の標的細胞又は組織（例えば、腫瘍、癌、及び転移）を特異的に治療するために、遠隔放出される細胞又は組織に標的化することができる。標的化、ナノバブルの慣性キャビテーション、及び悪性癌転移に対する化学療法剤の選択的放出は、化学療法剤を用いるそのような転移の治療を可能にし、本明細書に記載のナノバブルを用いて標的化及び遠隔放出されなければ、特に無視できる程度の作用を提供する。
【0116】
細胞標的ナノバブルは、上述の治療剤及び治療法のいずれかの組み合わせが低用量で、すなわち、臨床状況において従来使用されてきた量よりも低い用量での投与を可能にすることができる。
【0117】
対象に投与される併用治療剤及び治療法の用量を低下させる利点は、より高い投与量と関連付けられる有害作用の発生の減少を含む。例えば、ドキソルビシンなどの化学療法剤の投与量を低下させることにより、吐き気及び嘔吐の頻度及び重症度の低下は、より高い投与量で観察されるものと比較したときに生じるであろう。ナノバブルと組み合わせた化合物、組成物、薬剤及び治療法についても同様の利点が企図される。
【0118】
有害作用の発生率を低下させることによって、癌の治療を受けている患者の生活の質の改善が企図される。有害作用の発生率を低下させるさらなる利点には、患者のコンプライアンスの改善、有害作用の治療に必要な入院数の減少、及び有害作用と関連付けられる疼痛を治療するために必要な鎮痛剤の投与の減少が含まれる。
【0119】
本明細書に記載の細胞標的ナノバブル及び方法は、上記の診断、治療、及びセラノスティックな用途以外の他の用途において使用することができることが理解されよう。例えば、細胞標的ナノバブルは、細菌及び真菌などの微生物の細胞を標的とし、ナノバブルの慣性キャビテーションを促進し、対象における感染症、及び特に抗菌剤に耐性のある感染症を治療するために、細胞の内部移行時に共振させることができる。都合の良いことに、細胞標的ナノバブルはまた、微生物を死滅させる殺生物剤及び／又は生物静止剤、並びに単にそれらの成長又は蓄積を阻害する薬剤を送達することができる。
【0120】
以下の実施例は、例示のみを目的としており、本明細書に添付されている特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【0121】
実施例１
この実施例では、腫瘍体積全体にわたる高周波超音波によるＰＳＭＡ標的ＮＢ分布の動態を調査し、腫瘍縁及び腫瘍コアにおける造影剤動態の違いを調べた。この実施例はまた、３次元（３Ｄ）ＵＳイメージングを用いて全腫瘍塊内のＰＳＭＡ－ＮＢの溢出及び蓄積をさらに示す。
この実施例では、腫瘍体積全体にわたる高周波超音波によるＰＳＭＡ標的ＮＢ分布の動態を調査し、腫瘍縁及び腫瘍コアにおける造影剤動態の違いを調べた。この実施例はまた、３次元（３Ｄ）ＵＳイメージングを用いて全腫瘍塊内のＰＳＭＡ－ＮＢの溢出及び蓄積をさらに示す。
【0122】
本発明者らは以前、ＰＳＭＡへの能動的標的化が、保持が延長したインタクトなＰＳＭＡ－ＮＢの腫瘍取り込みを増強し、それが、臨床的非線形超音波で視覚化することができる２５分以上の腫瘍における長期のＵＳシグナル増強をもたらすことを示した。延長した腫瘍増強の１つの仮説は、ＰＳＭＡ標的ＮＢが標的癌細胞に内部移行して、内部移行がオクタフルオロプロパンガス溶解を遅らせることである。
【0123】
これらの実施例はまた、インビトロ細胞モデルを用いて、ＰＳＭＡ－ＮＢの受容体媒介性エンドサイトーシスがそれらの音響活性及び細胞内持続性に及ぼす効果を示す。細胞レベルでのＰＳＭＡ－ＮＢの相互作用のメカニズムを解明することは、ＰＣａの診断及び治療用途におけるＰＳＭＡ－ＮＢの臨床解釈への新しい道を提供することができる。
【0124】
実験の節／方法
ＮＢ製剤と特性評価
ＰＳＭＡ－１リガンドで官能化した脂質殻安定化Ｃ３Ｆ８ ＮＢを、以前に報告されたように製剤化した。簡単に説明すると、ＤＢＰＣ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＡ、ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＰＳＭＡ－１を含む脂質のカクテルをプロピレングリコール、グリセロール及びＰＢＳに溶解した。これに続いて、Ｃ３Ｆ８とのガス交換を行い、機械的撹拌、及び遠心分離を行い、その後ＮＢを分離した。ＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢを、前述のように特徴付けた。
ＮＢ製剤と特性評価
ＰＳＭＡ－１リガンドで官能化した脂質殻安定化Ｃ３Ｆ８ ＮＢを、以前に報告されたように製剤化した。簡単に説明すると、ＤＢＰＣ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＡ、ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＰＳＭＡ－１を含む脂質のカクテルをプロピレングリコール、グリセロール及びＰＢＳに溶解した。これに続いて、Ｃ３Ｆ８とのガス交換を行い、機械的撹拌、及び遠心分離を行い、その後ＮＢを分離した。ＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢを、前述のように特徴付けた。
【0125】
動物モデル
動物を、ケース・ウェスタン・リザーブ大学の施設動物管理・使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って取り扱い、動物の使用に関して適用可能な全てのプロトコル及びガイドラインに従った。雄の胸腺欠損ヌードマウス（４～６週齢）を１Ｌ／分の酸素と共に３％イソフルランの吸入で麻酔し、１００μＬのマトリゲル中１×１０６のＰＳＭＡ陰性ＰＣ３ｆｌｕ及びＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ｐｉｐ細胞を皮下移植した。腫瘍の直径が約８～１０ｍｍに達するまで、動物を１日おきに観察した。
動物を、ケース・ウェスタン・リザーブ大学の施設動物管理・使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って取り扱い、動物の使用に関して適用可能な全てのプロトコル及びガイドラインに従った。雄の胸腺欠損ヌードマウス（４～６週齢）を１Ｌ／分の酸素と共に３％イソフルランの吸入で麻酔し、１００μＬのマトリゲル中１×１０６のＰＳＭＡ陰性ＰＣ３ｆｌｕ及びＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ｐｉｐ細胞を皮下移植した。腫瘍の直径が約８～１０ｍｍに達するまで、動物を１日おきに観察した。
【0126】
バブル動態解析のためのインビボＮＬＣイメージング
インビボ実験を、ＦＵＪＩＦＩＬＭ ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃ Ｖｅｖｏ ３１００を用いて行った。合計９匹の動物を実験に使用した。動物を、ＰＳＭＡ－ＮＢ、ＮＢ及びＬｕｍａｓｏｎ ＭＢグループの３つの群に分けた。インビボバブル分布を、２Ｄ非線形コントラストモードで画像化した。希釈されていないＰＳＭＡ－ＮＢ又はＮＢのいずれかの全量２００μｌを、尾静脈を介して注射した。ウォッシュインバブル動態を取得するために、腫瘍を５ｆｐｓで約３分間スキャンした。スキャンパラメータは、ＭＳ２５０トランスデューサを用いて１８ＭＨｚの周波数、４％の送信電力、３０ｄＢのコントラストゲイン、ミディアムビーム幅、４０ｄＢのダイナミックレンジに設定した。次いで、３Ｄ ＵＳスキャンをピークシグナルで実施し、続いて非線形コントラストイメージングを完了して、イメージングセッション中に上記のパラメータを維持しながら、約１６分間、１ｆｐｓ及び１０００フレームでのウォッシュアウト位相の動態を調べた。
インビボ実験を、ＦＵＪＩＦＩＬＭ ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃ Ｖｅｖｏ ３１００を用いて行った。合計９匹の動物を実験に使用した。動物を、ＰＳＭＡ－ＮＢ、ＮＢ及びＬｕｍａｓｏｎ ＭＢグループの３つの群に分けた。インビボバブル分布を、２Ｄ非線形コントラストモードで画像化した。希釈されていないＰＳＭＡ－ＮＢ又はＮＢのいずれかの全量２００μｌを、尾静脈を介して注射した。ウォッシュインバブル動態を取得するために、腫瘍を５ｆｐｓで約３分間スキャンした。スキャンパラメータは、ＭＳ２５０トランスデューサを用いて１８ＭＨｚの周波数、４％の送信電力、３０ｄＢのコントラストゲイン、ミディアムビーム幅、４０ｄＢのダイナミックレンジに設定した。次いで、３Ｄ ＵＳスキャンをピークシグナルで実施し、続いて非線形コントラストイメージングを完了して、イメージングセッション中に上記のパラメータを維持しながら、約１６分間、１ｆｐｓ及び１０００フレームでのウォッシュアウト位相の動態を調べた。
【0127】
３Ｄ超音波による腫瘍全体のイメージング
超音波３Ｄ腫瘍イメージングを、Ｖｅｖｏ ３１００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ， Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ）スキャナーを用いて行った。トランスデューサを３Ｄモーター上にクリップで留め、腫瘍領域に配置した。プローブのＸ－Ｙ軸位置を調整することにより、イメージングディスプレイとして腫瘍の中心にプローブを配置した。３Ｄセットアップは、３８３フレームで０.０５ｍｍサイズの厚さ２Ｄスライスを作成するように整えた。画像を取得して、腫瘍全体にバブルの分布を達成するための３Ｄ体積を取得するように一緒に構築した。動物を、ＰＳＭＡ－ＮＢ、ＮＢ及びＬｕｍａｓｏｎＭＢグループの３つのグループに分けた。希釈していないＰＳＭＡ－ＮＢ又はＮＢのいずれかの全量２００μｌを、尾静脈を介して注射した。ウォッシュインバブル動態を取得するために、上記と同じパラメータで、５ｆｐｓで約３分間腫瘍をスキャンした。次いで、３Ｄスキャンを適用して、腫瘍全体のバブル分布をピークコントラストシグナルで可視化した。バブルをＵＳスキャンなしで自由に循環させた後、３Ｄスキャンを注射後、再び２５分間行った。腫瘍に溢出及び蓄積したインタクトなバブルを確認するために、３Ｄ崩壊シーケンスを腫瘍全体に適用し、再スキャンして、３Ｄ画像を得た。
超音波３Ｄ腫瘍イメージングを、Ｖｅｖｏ ３１００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ， Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ）スキャナーを用いて行った。トランスデューサを３Ｄモーター上にクリップで留め、腫瘍領域に配置した。プローブのＸ－Ｙ軸位置を調整することにより、イメージングディスプレイとして腫瘍の中心にプローブを配置した。３Ｄセットアップは、３８３フレームで０.０５ｍｍサイズの厚さ２Ｄスライスを作成するように整えた。画像を取得して、腫瘍全体にバブルの分布を達成するための３Ｄ体積を取得するように一緒に構築した。動物を、ＰＳＭＡ－ＮＢ、ＮＢ及びＬｕｍａｓｏｎＭＢグループの３つのグループに分けた。希釈していないＰＳＭＡ－ＮＢ又はＮＢのいずれかの全量２００μｌを、尾静脈を介して注射した。ウォッシュインバブル動態を取得するために、上記と同じパラメータで、５ｆｐｓで約３分間腫瘍をスキャンした。次いで、３Ｄスキャンを適用して、腫瘍全体のバブル分布をピークコントラストシグナルで可視化した。バブルをＵＳスキャンなしで自由に循環させた後、３Ｄスキャンを注射後、再び２５分間行った。腫瘍に溢出及び蓄積したインタクトなバブルを確認するために、３Ｄ崩壊シーケンスを腫瘍全体に適用し、再スキャンして、３Ｄ画像を得た。
【0128】
３Ｄ超音波による腫瘍の溢出研究
血管外試験のために、動物をＰＳＭＡ－ＮＢ、ＮＮＢ、及びＬｕｍａｓｏｎの３つのグループに分け、各グループに３匹の動物（合計ｎ＝９）を使用した。２００μｌの造影剤を、尾静脈を介して注射した。マウスを、前述のように注射後２５分間、３Ｄ ＵＳスキャンに供した。次いで、左心室を介して５０ｍｌのＰＢＳで心臓灌流を行い、３Ｄ ＵＳスキャンを再び完了して、灌流腫瘍に蓄積したインタクトなバブルから生じたＵＳシグナルを検出した。
血管外試験のために、動物をＰＳＭＡ－ＮＢ、ＮＮＢ、及びＬｕｍａｓｏｎの３つのグループに分け、各グループに３匹の動物（合計ｎ＝９）を使用した。２００μｌの造影剤を、尾静脈を介して注射した。マウスを、前述のように注射後２５分間、３Ｄ ＵＳスキャンに供した。次いで、左心室を介して５０ｍｌのＰＢＳで心臓灌流を行い、３Ｄ ＵＳスキャンを再び完了して、灌流腫瘍に蓄積したインタクトなバブルから生じたＵＳシグナルを検出した。
【0129】
組織分析
動物を、Ｃｙ５.５－ＰＳＭＡ－ＮＢ（ｎ＝３）、Ｃｙ５.５－ＮＢ（ｎ＝３）、及び非コントラスト対照の３つのグループに分けた。Ｃｙ５.５標識ＮＢを、脂質溶液にＤＳＰＥ－ＰＥＧ－Ｃｙ５.５（１００μｌ）を混合することによって調製した。マウスに、尾静脈を介して希釈していない２００μｌのＵＣＡ又はＰＢＳのいずれかを投与した。注射後２５分の時点で、ＵＳを用いて動物をスキャンして、シグナルを検出し、次いで、左心室を介して５０ｍｌのＰＢＳでＰＢＳ灌流を行った。次いで、腫瘍を再びスキャンして、インタクト－ＮＢから発生するＵＳシグナルを感知した。腫瘍及び腎臓を摘出し、パラホルムアルデヒドで固定して、最適切断温度化合物（ＯＣＴ Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）に包埋した。組織を８μｍスライスに切断し、ＰＢＳで洗浄（３回）し、０.５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）を含むタンパク質ブロッキング溶液でインキュベートし、１：２５０希釈した一次抗体ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）モノクローナル抗体（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）中で、４℃で２４時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ－５６８タグ付き二次抗体（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）と１時間インキュベートして、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。蛍光画像を取得し、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｖ４．８．１．０，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓソフトウェア（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）を用いて（セグメンテーションと閾値の相互作用関数によって）分析した。ＰＳＭＡ免疫組織化学については、組織をＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング溶液とインキュベートした後、１：１５０希釈したＰＳＭＡ一次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）と４℃で２４時間インキュベートし、ＣＤ３１染色と同様に上記の工程を行った。
動物を、Ｃｙ５.５－ＰＳＭＡ－ＮＢ（ｎ＝３）、Ｃｙ５.５－ＮＢ（ｎ＝３）、及び非コントラスト対照の３つのグループに分けた。Ｃｙ５.５標識ＮＢを、脂質溶液にＤＳＰＥ－ＰＥＧ－Ｃｙ５.５（１００μｌ）を混合することによって調製した。マウスに、尾静脈を介して希釈していない２００μｌのＵＣＡ又はＰＢＳのいずれかを投与した。注射後２５分の時点で、ＵＳを用いて動物をスキャンして、シグナルを検出し、次いで、左心室を介して５０ｍｌのＰＢＳでＰＢＳ灌流を行った。次いで、腫瘍を再びスキャンして、インタクト－ＮＢから発生するＵＳシグナルを感知した。腫瘍及び腎臓を摘出し、パラホルムアルデヒドで固定して、最適切断温度化合物（ＯＣＴ Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）に包埋した。組織を８μｍスライスに切断し、ＰＢＳで洗浄（３回）し、０.５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）を含むタンパク質ブロッキング溶液でインキュベートし、１：２５０希釈した一次抗体ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）モノクローナル抗体（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）中で、４℃で２４時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ－５６８タグ付き二次抗体（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）と１時間インキュベートして、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。蛍光画像を取得し、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｖ４．８．１．０，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓソフトウェア（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）を用いて（セグメンテーションと閾値の相互作用関数によって）分析した。ＰＳＭＡ免疫組織化学については、組織をＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング溶液とインキュベートした後、１：１５０希釈したＰＳＭＡ一次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）と４℃で２４時間インキュベートし、ＣＤ３１染色と同様に上記の工程を行った。
【0130】
造影剤の調製と特性評価
ＮＢの調製及び特性評価は他の場所で報告されている。簡単に説明すると、ＤＢＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．，Ｐｅｌｈａｍ，ＡＬ）、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＡ（Ｃｏｒｄｅｎ Ｐｈａｒｍａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、及びｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ２０００（Ｌａｙｓａｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｒａｂ，ＡＬ）を含む脂質のカクテルをプロピレングリコール（ＰＧ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、グリセロール及びＰＢＳに溶解した。次いで、ガスをＣ３Ｆ８（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎｓ，ＬＬＣ，ＰＡ）と交換し、バイアルを機械的攪拌に供した。ＮＢを遠心分離によって分離した。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＰＳＭＡ－１を脂質カクテル混合物に組み込むことによって、ＰＳＭＡ標的ＮＢを製剤化した。ＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢを前述のように特徴付けた。
ＮＢの調製及び特性評価は他の場所で報告されている。簡単に説明すると、ＤＢＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．，Ｐｅｌｈａｍ，ＡＬ）、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＡ（Ｃｏｒｄｅｎ Ｐｈａｒｍａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、及びｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ２０００（Ｌａｙｓａｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｒａｂ，ＡＬ）を含む脂質のカクテルをプロピレングリコール（ＰＧ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、グリセロール及びＰＢＳに溶解した。次いで、ガスをＣ３Ｆ８（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎｓ，ＬＬＣ，ＰＡ）と交換し、バイアルを機械的攪拌に供した。ＮＢを遠心分離によって分離した。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＰＳＭＡ－１を脂質カクテル混合物に組み込むことによって、ＰＳＭＡ標的ＮＢを製剤化した。ＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢを前述のように特徴付けた。
【0131】
細胞培養研究
レトロウイルス形質転換ＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ｐｉｐ細胞及びＰＣ３ｆｌｕ細胞（トランスフェクション対照）は、もともと、Ｍｉｃｈｅｌ Ｓａｄｅｌａｉｎ博士（Ｍｅｍｏｒｉａｌ－Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から入手した。細胞株をチェックし、ウェスタンブロットにより認証した。完全ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で、３７℃及び５％ＣＯ２環境で細胞を増殖させた。
レトロウイルス形質転換ＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ｐｉｐ細胞及びＰＣ３ｆｌｕ細胞（トランスフェクション対照）は、もともと、Ｍｉｃｈｅｌ Ｓａｄｅｌａｉｎ博士（Ｍｅｍｏｒｉａｌ－Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から入手した。細胞株をチェックし、ウェスタンブロットにより認証した。完全ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で、３７℃及び５％ＣＯ２環境で細胞を増殖させた。
【0132】
細胞取り込み研究
ＰＣ３ｐｉｐとＰＣ３ｆｌｕ細胞の両方（２×１０６細胞／ｍｌ）を、細胞培養ペトリ皿（６０×１５ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に約７０％のコンフルエントで播種した。２４時間後、細胞をＰＳＭＡ－ＮＢ又はプレーンＮＢ（約１０，０００バブル／細胞）と１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄（３回）し、ＵＳスキャン時点まで３７℃のＲＰＭＩで維持した。ＵＳスキャン細胞をトリプシン処理する前に、計数し、１×１０６細胞を用いた。
ＰＣ３ｐｉｐとＰＣ３ｆｌｕ細胞の両方（２×１０６細胞／ｍｌ）を、細胞培養ペトリ皿（６０×１５ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に約７０％のコンフルエントで播種した。２４時間後、細胞をＰＳＭＡ－ＮＢ又はプレーンＮＢ（約１０，０００バブル／細胞）と１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄（３回）し、ＵＳスキャン時点まで３７℃のＲＰＭＩで維持した。ＵＳスキャン細胞をトリプシン処理する前に、計数し、１×１０６細胞を用いた。
【0133】
インビトロでＰＣ３ｐｉｐ細胞に内部移行したＰＳＭＡ標的ＮＢの音響評価
ＮＢ内部移行した細胞のインビトロ音響活性を、臨床ＵＳスキャナー（ＡｐｌｉｏＸＧ ＳＳＡ－７９０Ａ，Ｔｏｓｈｉｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ，現在のＨｉｔａｃｈｉ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ａｍｅｒｉｃａ）を用いて評価した。測定を行うために、細胞（約２×１０６）を洗浄し、トリプシンを用いて剥離した。ＰＢＳ中での剥離及び再懸濁の後、細胞懸濁液をカスタムメイドの１.５％（ｗ／ｖ）アガロースファントムに入れた [３１] 。ファントムを、１２ＭＨｚのリニアアレイトランスデューサに取り付け、０.１メカニカルインデックス（ＭＩ）、６５ダイナミックレンジ、７０ｄＢゲイン、及び０.２フレーム／秒のイメージングフレームレートで、コントラストハーモニックイメージング（ＣＨＩ）を用いて画像を取得した。搭載ソフトウェアを使用して、全ての試料にて関心領域（ＲＯＩ）分析を実施し、各ＲＯＩの平均シグナル強度を測定した。次いで、データをさらに処理するためにマイクロソフトのエクセルにエクスポートした。実験は３連で行った。
ＮＢ内部移行した細胞のインビトロ音響活性を、臨床ＵＳスキャナー（ＡｐｌｉｏＸＧ ＳＳＡ－７９０Ａ，Ｔｏｓｈｉｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ，現在のＨｉｔａｃｈｉ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ａｍｅｒｉｃａ）を用いて評価した。測定を行うために、細胞（約２×１０６）を洗浄し、トリプシンを用いて剥離した。ＰＢＳ中での剥離及び再懸濁の後、細胞懸濁液をカスタムメイドの１.５％（ｗ／ｖ）アガロースファントムに入れた [３１] 。ファントムを、１２ＭＨｚのリニアアレイトランスデューサに取り付け、０.１メカニカルインデックス（ＭＩ）、６５ダイナミックレンジ、７０ｄＢゲイン、及び０.２フレーム／秒のイメージングフレームレートで、コントラストハーモニックイメージング（ＣＨＩ）を用いて画像を取得した。搭載ソフトウェアを使用して、全ての試料にて関心領域（ＲＯＩ）分析を実施し、各ＲＯＩの平均シグナル強度を測定した。次いで、データをさらに処理するためにマイクロソフトのエクセルにエクスポートした。実験は３連で行った。
【0134】
ＰＳＭＡ－ＮＢに内部移行したＰＣ３ｐｉｐ細胞の共焦点イメージング
ＰＣ３ｐｉｐ細胞を、ガラス底ペトリ皿（ＭｅｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）に１０４細胞／ウェルの密度で播種した。ＤＳＰＥ－ローダミン（５０ ｌ）を脂質溶液に混合することによって、ローダミン標識ＮＢを調製した。２４時間後、１：１０希釈したローダミンタグ付きＰＳＭＡ－ＮＢ（２５０μＬ）を細胞に１時間添加した。インキュベーション後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＲＰＭＩ中で、インキュベーターに３時間及び２４時間置いた。３時間の時点を選択したのは、ＰＳＭＡ－ＮＢ内部移行ＰＣ３ｐｉｐ細胞で３時間時点の標準誤差が低く、有意に高い音響活性が以前に観察されたためである。インキュベーション終了の１時間前に、後期エンドソーム及びリソソームのマーカーである５μＭのリソトラッカーレッド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２４μＬを、製造業者の指示に従って細胞に添加した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩマウント培地（Ｖｅｃｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。次いで、適切なフィルターセットを備えた蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ ４０００Ｂ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞を観察した。リソトラッカーレッドは緑色蛍光（励起：５７７ｎｍ、発光：５９０ｎｍ）を示す。
ＰＣ３ｐｉｐ細胞を、ガラス底ペトリ皿（ＭｅｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）に１０４細胞／ウェルの密度で播種した。ＤＳＰＥ－ローダミン（５０ ｌ）を脂質溶液に混合することによって、ローダミン標識ＮＢを調製した。２４時間後、１：１０希釈したローダミンタグ付きＰＳＭＡ－ＮＢ（２５０μＬ）を細胞に１時間添加した。インキュベーション後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＲＰＭＩ中で、インキュベーターに３時間及び２４時間置いた。３時間の時点を選択したのは、ＰＳＭＡ－ＮＢ内部移行ＰＣ３ｐｉｐ細胞で３時間時点の標準誤差が低く、有意に高い音響活性が以前に観察されたためである。インキュベーション終了の１時間前に、後期エンドソーム及びリソソームのマーカーである５μＭのリソトラッカーレッド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２４μＬを、製造業者の指示に従って細胞に添加した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩマウント培地（Ｖｅｃｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。次いで、適切なフィルターセットを備えた蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ ４０００Ｂ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞を観察した。リソトラッカーレッドは緑色蛍光（励起：５７７ｎｍ、発光：５９０ｎｍ）を示す。
【0135】
細胞内に閉じ込められたオクタフルオロプロパンガスのＧＣ／ＭＳを用いた分析
細胞内のオクタフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８）ガスの存在を、前述のようにヘッドスペースガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）によって確認した。これらの実験では、細胞（１×１０７細胞／ｍＬ）を細胞培養フラスコ（７５ｃｍ２サイズ）で２４時間増殖させた。再び、上記のように、細胞を１ｍＬのＰＳＭＡ－ＮＢ又はプレーンＮＢ（約１００００ＮＢ／細胞）のいずれかと１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地中で３時間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳに再懸濁し、１０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。次いで、細胞を３００μＬの培地及び３００μＬの細胞溶解緩衝液を含むＧＣヘッドスペースバイアルに移し、ＰＴＦＥ／シリコンのセプタムで密封し、キャップした（Ｔｈｅｒｍｏｓ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。Ｃ３Ｆ８ガスをヘッドスペースバイアルに放出するために、５０℃で超音波水浴（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）で２０分間バイアルを超音波処理した。ＧＣ／ＭＳ分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ ７８９０ＢガスクロマトグラフＧＣ／ＭＳシステムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ５９７７Ｂ－ＭＳＤ搭載質量分析計を用いて前述のように実施した。ＤＢ５－ＭＳキャピラリーカラム（３０ｍ×０.２５ｍｍ×０.２５μｍ）を１.５ｍＬ／分のヘリウムフローで使用した。１μＬのヘッドスペース試料を１：１０分割で注射した。使用したガスクロマトグラフィー条件は、以下のとおりであった：オーブン温度を６０℃、１分間保持し、１２０℃まで４０℃／分で傾斜をつけ、３.５分間保持した。パーフルオロプロパンを１.２分で溶出した。試料を、電子衝撃イオン化（ＥＩ）を用いて選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）モードで分析した。１６９（Ｍ－１９）のＭ／ｚを、全ての分析で使用した。イオン滞留時間を１０ｍｓに設定した。パーフルオロプロパンを、ＮＩＳＴ ＭＳスペクトルデータベースにより検証した。標準校正プロットを、ＮＢ濃度の関数としてＧＣピークのピーク面積を測定することによって得た（０～１００×１０８ＮＢ／ｍＬ）。
細胞内のオクタフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８）ガスの存在を、前述のようにヘッドスペースガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）によって確認した。これらの実験では、細胞（１×１０７細胞／ｍＬ）を細胞培養フラスコ（７５ｃｍ２サイズ）で２４時間増殖させた。再び、上記のように、細胞を１ｍＬのＰＳＭＡ－ＮＢ又はプレーンＮＢ（約１００００ＮＢ／細胞）のいずれかと１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地中で３時間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳに再懸濁し、１０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。次いで、細胞を３００μＬの培地及び３００μＬの細胞溶解緩衝液を含むＧＣヘッドスペースバイアルに移し、ＰＴＦＥ／シリコンのセプタムで密封し、キャップした（Ｔｈｅｒｍｏｓ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。Ｃ３Ｆ８ガスをヘッドスペースバイアルに放出するために、５０℃で超音波水浴（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）で２０分間バイアルを超音波処理した。ＧＣ／ＭＳ分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ ７８９０ＢガスクロマトグラフＧＣ／ＭＳシステムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ５９７７Ｂ－ＭＳＤ搭載質量分析計を用いて前述のように実施した。ＤＢ５－ＭＳキャピラリーカラム（３０ｍ×０.２５ｍｍ×０.２５μｍ）を１.５ｍＬ／分のヘリウムフローで使用した。１μＬのヘッドスペース試料を１：１０分割で注射した。使用したガスクロマトグラフィー条件は、以下のとおりであった：オーブン温度を６０℃、１分間保持し、１２０℃まで４０℃／分で傾斜をつけ、３.５分間保持した。パーフルオロプロパンを１.２分で溶出した。試料を、電子衝撃イオン化（ＥＩ）を用いて選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）モードで分析した。１６９（Ｍ－１９）のＭ／ｚを、全ての分析で使用した。イオン滞留時間を１０ｍｓに設定した。パーフルオロプロパンを、ＮＩＳＴ ＭＳスペクトルデータベースにより検証した。標準校正プロットを、ＮＢ濃度の関数としてＧＣピークのピーク面積を測定することによって得た（０～１００×１０８ＮＢ／ｍＬ）。
【0136】
内部移行バブルのインビボＵＳイメージング
動物を、ケース・ウェスタン・リザーブ大学の施設動物管理・使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って取り扱い、動物の使用に関して適用可能な全てのプロトコル及びガイドラインに従った。ＰＣ３ｐｉｐ細胞をＰＳＭＡ－ＮＢとインキュベートし、上記のように処理した。マウス（ｎ＝９、体重２０ｇの４～６週齢の胸腺欠損（ＮＣＲ ｎｕ／ｎｕ）マウス）を無作為に３つのグループに分け、１Ｌ／分の酸素と共に３％イソフルランの吸入で麻酔した。ベースラインＵＳシグナルを、０.１及び０.５の機械的指数（ＭＩ）で上記のパラメータを用いて、側腹部領域（永久マーカーでマークした）の左側と右側の両方で得た。ＰＳＭＡ－ＮＢとのインキュベーション後、ＰＣ３ｐｉｐ細胞をマトリゲルとＰＢＳの混合物（１：１のＰＢＳ／マトリゲル）に懸濁し、細胞懸濁液（１００μＬ）をヌードマウスの側腹部に皮下注射した。対照として、ＮＢ曝露のない細胞をＮＢ曝露細胞に隣接して注射した（図７Ａ）。注射部位のＵＳ画像を、注射直後又は３時間、２４時間若しくは８日後にＭＩ＝０.１で上記と同じパラメータを用いて取得した。０.１ ＭＩでのイメージング後、ＭＩ値を０.５に増加させ、全ての時点について領域を再度イメージングした。関心領域（ＲＯＩ）を、皮膚を除く注射した細胞領域の周囲に描画した。次いで、各ＲＯＩの平均シグナル強度をＣＨＩＱソフトウェアから取得した。これらの測定値をエクセルにエクスポートし、各ＲＯＩにおけるシグナル増強からベースライン値（接種前のコントラスト）を差し引いた。
動物を、ケース・ウェスタン・リザーブ大学の施設動物管理・使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って取り扱い、動物の使用に関して適用可能な全てのプロトコル及びガイドラインに従った。ＰＣ３ｐｉｐ細胞をＰＳＭＡ－ＮＢとインキュベートし、上記のように処理した。マウス（ｎ＝９、体重２０ｇの４～６週齢の胸腺欠損（ＮＣＲ ｎｕ／ｎｕ）マウス）を無作為に３つのグループに分け、１Ｌ／分の酸素と共に３％イソフルランの吸入で麻酔した。ベースラインＵＳシグナルを、０.１及び０.５の機械的指数（ＭＩ）で上記のパラメータを用いて、側腹部領域（永久マーカーでマークした）の左側と右側の両方で得た。ＰＳＭＡ－ＮＢとのインキュベーション後、ＰＣ３ｐｉｐ細胞をマトリゲルとＰＢＳの混合物（１：１のＰＢＳ／マトリゲル）に懸濁し、細胞懸濁液（１００μＬ）をヌードマウスの側腹部に皮下注射した。対照として、ＮＢ曝露のない細胞をＮＢ曝露細胞に隣接して注射した（図７Ａ）。注射部位のＵＳ画像を、注射直後又は３時間、２４時間若しくは８日後にＭＩ＝０.１で上記と同じパラメータを用いて取得した。０.１ ＭＩでのイメージング後、ＭＩ値を０.５に増加させ、全ての時点について領域を再度イメージングした。関心領域（ＲＯＩ）を、皮膚を除く注射した細胞領域の周囲に描画した。次いで、各ＲＯＩの平均シグナル強度をＣＨＩＱソフトウェアから取得した。これらの測定値をエクセルにエクスポートし、各ＲＯＩにおけるシグナル増強からベースライン値（接種前のコントラスト）を差し引いた。
【0137】
結果
ナノバブル特性評価
ナノバブル調製物、ＰＳＭＡ－１リガンドによる官能化及び脂質リガンドコンジュゲーションの検証は、以前に報告されている。共鳴質量測定（ＲＭＭ）によって特徴付けられたＮＢ及びＰＳＭＡ－ＮＢの直径は、それぞれ２８１□２ｎｍ及び２７７□１１ｎｍであった。ＮＢ特性評価で使用するためのＲＭＭ分析とその最適化の検証は、以前に記載されている。重要なことに、結果は、平均サイズ及び濃度が官能化後に著しく変化しなかったことを示している（ＮＢ及びＰＳＭＡ－ＮＢの濃度は、それぞれ４Ｅ１１□２.４５Ｅ１０及び３.９Ｅ１１□２.８２Ｅ１０ＮＢ／ｍｌであった）。
ナノバブル特性評価
ナノバブル調製物、ＰＳＭＡ－１リガンドによる官能化及び脂質リガンドコンジュゲーションの検証は、以前に報告されている。共鳴質量測定（ＲＭＭ）によって特徴付けられたＮＢ及びＰＳＭＡ－ＮＢの直径は、それぞれ２８１□２ｎｍ及び２７７□１１ｎｍであった。ＮＢ特性評価で使用するためのＲＭＭ分析とその最適化の検証は、以前に記載されている。重要なことに、結果は、平均サイズ及び濃度が官能化後に著しく変化しなかったことを示している（ＮＢ及びＰＳＭＡ－ＮＢの濃度は、それぞれ４Ｅ１１□２.４５Ｅ１０及び３.９Ｅ１１□２.８２Ｅ１０ＮＢ／ｍｌであった）。
【0138】
腫瘍の縁及びコアにおける超音波シグナル
インビボ実験を、ＦＵＪＩＦＩＬＭ ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃ Ｖｅｖｏ ３１００を用いて行った。合計９匹の腫瘍担持マウスを実験に使用した。動物を、ＰＳＭＡ－ＮＢ、ＮＢ及びＬｕｍａｓｏｎＭＢグループの３つのグループに分けた。希釈していないＰＳＭＡ－ＮＢ又はＮＢのいずれかの全量２００μＬを、尾静脈を介して注射した後に、２Ｄ非線形コントラストモードでインビボバブル分布を画像化した。図４Ａは、超音波スキャンプロセスのタイムラインの模式図を示す。ベースラインスキャンを、バブル注射前に非線形コントラストモードと３Ｄモードの両方で行った。ウォッシュインバブル動態を取得するために、毎秒５フレーム（ｆｐｓ）で約３分間腫瘍をスキャンした。図４Ｂ、Ｃ、Ｄ。図４Ｅは、５ｆｐｓでの最初の１０００フレームと１ｆｐｓでの２回目のスキャンの１０００フレームで取得した腫瘍の縁とコアに対応するＴＩＣ曲線を示す。フレームレートを５ｆｐｓから１ｆｐｓに変更する前に、腫瘍塊全体におけるバブル分布を観察するために３Ｄ ＵＳスキャンを行った。
インビボ実験を、ＦＵＪＩＦＩＬＭ ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃ Ｖｅｖｏ ３１００を用いて行った。合計９匹の腫瘍担持マウスを実験に使用した。動物を、ＰＳＭＡ－ＮＢ、ＮＢ及びＬｕｍａｓｏｎＭＢグループの３つのグループに分けた。希釈していないＰＳＭＡ－ＮＢ又はＮＢのいずれかの全量２００μＬを、尾静脈を介して注射した後に、２Ｄ非線形コントラストモードでインビボバブル分布を画像化した。図４Ａは、超音波スキャンプロセスのタイムラインの模式図を示す。ベースラインスキャンを、バブル注射前に非線形コントラストモードと３Ｄモードの両方で行った。ウォッシュインバブル動態を取得するために、毎秒５フレーム（ｆｐｓ）で約３分間腫瘍をスキャンした。図４Ｂ、Ｃ、Ｄ。図４Ｅは、５ｆｐｓでの最初の１０００フレームと１ｆｐｓでの２回目のスキャンの１０００フレームで取得した腫瘍の縁とコアに対応するＴＩＣ曲線を示す。フレームレートを５ｆｐｓから１ｆｐｓに変更する前に、腫瘍塊全体におけるバブル分布を観察するために３Ｄ ＵＳスキャンを行った。
【0139】
ＰＳＭＡ－ＮＢ又はプレーンＮＢのいずれかで画像化した腫瘍において、迅速なシグナル増強がほぼ観察され、注射後１～２分でピーク強度に達した。ＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢについて腫瘍全体のピーク増強（ＰＥ）に有意差はなく、これは標的バブルと非標的バブルが同様の形態を示す指標であった。バブル動態パラメータの変動性を、腫瘍の縁とコアを別々に分析することによってさらに調査した。腫瘍コアと区別するために、ループＲＯＩを腫瘍縁に別々に描画した（図４）。図４Ｅに示すように、注射直後、ＰＳＭＡ－ＮＢ及びプレーンＮＢは腫瘍縁を急速に満たした。対照的に、ＰＳＭＡ－ＮＢは、腫瘍縁と比較して腫瘍コアへのより遅いウォッシュインを示した。動態パラメータを計算し、表１にまとめた。ＰＳＭＡ－ＮＢの腫瘍コアについてのピークまでの時間（ＴＴＰ）は、プレーンＮＢのそれよりも有意に大きかった（２.４８□０.７１分対１.２１□０.１５分、Ｐ＜０.０５）。しかし、ＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢに対する腫瘍縁についてのピークまでの時間（ＴＴＰ）は著しく異ならなかった。両グループとも、曲線下ウォッシュイン面積（ＷｉＡＵＣ）に有意差はなかった。さらに、ＮＢとＰＳＭＡ－ＮＢの両方を有する腫瘍縁についてのピーク増強（ＰＥ）は著しく異ならなかった。また、ＮＢとＰＳＭＡ－ＮＢの両方を有する腫瘍コアについてのＰＥも著しく異ならなかった。両方のバブルについての比較可能なＷｉＡＵＣ及びＰＥは同様の動態を示した。しかし、腫瘍の縁及びコアについてのＰＥは、両方のＮＢグループについて有意に異なっていた（表１）。
【0140】
表１－時間強度曲線（ＴＩＣ）から得られた腫瘍の縁及びコアの動態パラメータのまとめ
全ての値は、平均 ｓ．ｄ．として表され、＊、＃、＄，各グループにおける統計的有意差；ｐ＜０.０５。
【表1】
【0141】
さらに、ＮＢ蓄積量を、市販のＭＢ造影剤Ｌｕｍａｓｏｎと比較した。コントラストの増強はＬｕｍａｓｏｎで急速に起こり（ＴＴＰは、縁については０.８４□０.０６分、コアについては０.７７□０.１１分）、両方の種類のＮＢのそれとは有意に異なっていた。さらに、ＬｕｍａｓｏｎのＰＥとＷｉＡＵＣは、２つのＮＢグループと比較して有意に低かった。ピーク増強後、ＵＳシグナルは、ＰＳＭＡ－ＮＢグループとＮＢグループの両方で時間とともに減衰した（図４Ｅ）。ＰＳＭＡ－ＮＢを有する腫瘍縁のウォッシュアウトＡＵＣは、ＮＢグループのそれと比較して有意に高かった（表１）。同様に、ＰＳＭＡ－ＮＢとＮＢを用いた腫瘍コアについてのＡＵＣのウォッシュアウトも有意に異なる。さらに、腫瘍の縁及びコアについてのウォッシュアウトＡＵＣは、両グループについて有意に異なっていた。重要なことに、バブル研究に使用した非線形コントラストイメージングパラメータは一定に保たれ、Ｌｕｍａｓｏｎを画像化するために使用した送信周波数は、この薬剤に対して一般的に利用される場合よりも高かった。これにより、検出感度が低下し、その後のシグナル増強が低下する可能性がある。しかし、相対造影剤動態は、比較的影響を受けないはずである。
【0142】
各腫瘍の縁とコアとの間のＮＢ動態で観察される大きな差異は、血管新生に起因する腫瘍の縁とコアにおける血管分布の不一致に起因する可能性がある。血管新生は、腫瘍の発生及び進行における重要な工程の１つであり、既存の血管からの新しい毛細血管の形成に寄与するとともに、必須栄養素及び酸素を腫瘍に供給することによって腫瘍の成長及び転移を促進する。また、腫瘍塊におけるＰＳＭＡバイオマーカー分布も、腫瘍における標的バブル蓄積に重要な役割を果たしている。さらに、ＰＳＭＡ発現が新生血管系内皮細胞に存在することが報告されている。ＴＴＰの違いについての１つの仮定は、造影剤の流れを制御するバイオマーカーの存在である。ＰＳＭＡ標的ＮＢは、腫瘍内のバイオマーカーに結合し、流速を遅くする傾向がある。したがって、ＰＳＭＡ－ＮＢで腫瘍を充填するのに要する時間は、自由に流れるＮＢと比較して遅い。ピークシグナルに達した後、両方の種類のＮＢのコントラストは、腫瘍の縁とコアの両方で減少し始める。しかし、ＰＳＭＡ－ＮＢのウォッシュアウトＡＵＣはＮＢのそれよりも有意に高く、腫瘍における標的ＮＢの保持が高いことを示した。ＮＢシグナルの減少は、おそらく腫瘍間質圧（ＴＩＰ）による腫瘍縁及び腫瘍マトリックスからのＮＢの消失によるものであった。異常な血管形成に加えて、腫瘍組織では正常組織と比較してリンパドレナージの不良が悪化しており、ＴＩＰが薬物及びナノ粒子送達を妨げる。ＰＳＭＡ標的ＮＢのＰＳＭＡバイオマーカーへの結合により、ＴＩＰによる除去は、ＰＳＭＡ－ＮＢについては最小限に抑えられ得る。
【0143】
３Ｄ超音波による腫瘍全体のイメージング
腫瘍塊全体におけるバブル分布をより良く理解するために、３Ｄ非線形コントラストＵＳを、２Ｄイメージングの延長としてＰＳＭＡ－ＮＢ、ＮＢ、及びＬｕｍａｓｏｎＭＢの投与後に実施した。腫瘍の０.０５ｍｍサイズの２Ｄ ＵＳ画像スライスを一緒に構築し、腫瘍全体のバブル分布を得た。非線形コントラストスキャン後に、３Ｄ ＵＳを行い、腫瘍塊全体のピークにおけるコントラストシグナルを得た（図５）。３Ｄ解析は、イメージングボリューム内の非線形シグナルを示すボクセルの割合を計算する。２Ｄスキャンと一致して、３Ｄ解析はＰＳＭＡ－ＮＢとＮＢの両方についてピーク時に同様のシグナルを示した（図５ＢとＣ）。３分で、ＰＳＭＡ－ＮＢとＮＢの両方が腫瘍縁の約９０％をカバーした（それぞれ８６.９±０.８％及び８７.７±６.６％、ｐ＝０.６）。同様に、ＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢは、腫瘍コアの約６０％（それぞれ６４.９±１４.５％及び６２.４±２８.１％）に検出された。腫瘍縁内で検出されたＬｕｍａｓｏｎの薬剤の割合は、ＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢと比較して有意に低かった。３分で、Ｌｕｍａｓｏｎは腫瘍縁の１０％（５.７±２.１％）に検出された。
腫瘍塊全体におけるバブル分布をより良く理解するために、３Ｄ非線形コントラストＵＳを、２Ｄイメージングの延長としてＰＳＭＡ－ＮＢ、ＮＢ、及びＬｕｍａｓｏｎＭＢの投与後に実施した。腫瘍の０.０５ｍｍサイズの２Ｄ ＵＳ画像スライスを一緒に構築し、腫瘍全体のバブル分布を得た。非線形コントラストスキャン後に、３Ｄ ＵＳを行い、腫瘍塊全体のピークにおけるコントラストシグナルを得た（図５）。３Ｄ解析は、イメージングボリューム内の非線形シグナルを示すボクセルの割合を計算する。２Ｄスキャンと一致して、３Ｄ解析はＰＳＭＡ－ＮＢとＮＢの両方についてピーク時に同様のシグナルを示した（図５ＢとＣ）。３分で、ＰＳＭＡ－ＮＢとＮＢの両方が腫瘍縁の約９０％をカバーした（それぞれ８６.９±０.８％及び８７.７±６.６％、ｐ＝０.６）。同様に、ＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢは、腫瘍コアの約６０％（それぞれ６４.９±１４.５％及び６２.４±２８.１％）に検出された。腫瘍縁内で検出されたＬｕｍａｓｏｎの薬剤の割合は、ＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢと比較して有意に低かった。３分で、Ｌｕｍａｓｏｎは腫瘍縁の１０％（５.７±２.１％）に検出された。
【0144】
興味深いことに、腫瘍を連続非線形超音波（３Ｄ取得後１６分間の１ｆｐｓ）で画像化した場合、ＰＳＭＡ－ＮＢグループとＮＢグループとの間に薬剤カバレッジの有意差は認められなかった。また、腫瘍全体におけるＰＳＭＡ－ＮＢとＮＢシグナルの比率は、２Ｄスキャンによる以前の観察と比較して低かった。発明者らは、腫瘍組織内に固定したＮＢのＵＳへの継続的な曝露が、急速なバブル溶解をもたらした可能性があると推測している。この仮説を検証するために、ＮＢ、ＰＳＭＡ－ＮＢ又はＬｕｍａｓｏｎをマウスに注射するが、その後、ＵＳ曝露なしで３０分間循環させたままにする別の一連の実験を行った。これらの実験において、ＰＳＭＡ－ＮＢは、ＮＢとＬｕｍａｓｏｎの両方と比較して、腫瘍コアにおける非線形シグナルの割合が有意に高いことを示した（それぞれ２５.２±１.５％、１３.９±５.１％、及び０.４±０.４％、ｐ＜０.０５）。シグナルの割合は、崩壊シーケンスを適用した後に約１２％に有意に低下し、腫瘍内に蓄積したインタクトなバブルの破壊が確認された（データ示さず）。３Ｄ腫瘍解析によると、ＰＳＭＡ－ＮＢも、ＮＢと比較して腫瘍縁に多く蓄積したが、その差は統計的に有意ではなかった（それぞれ５４.２±４.８％、３８.７±１４.４％）。
【0145】
３Ｄ超音波による腫瘍の溢出研究
インタクトな形態の腫瘍体積全体におけるＮＢの溢出及び蓄積を調べるために、心臓穿刺による全血灌流を注射後２５分の時点で実施し、心臓穿刺前後に３Ｄ ＵＳスキャンを完了した（図６Ａ）。全血灌流は、血管系内の血液を排除し、腫瘍血管系から自由に動くナノバブルを含むあらゆる物質を除去する。灌流後、腫瘍内の３Ｄ ＵＳシグナルは、腫瘍実質全体又は細胞内空間に残っている物質に対応する。灌流前の、注射後２５分の時点で、腫瘍縁におけるＰＳＭＡ－ＮＢの割合はＮＢのそれよりも１.４倍高かった（図６Ｂ、Ｃ；４６.８□２１.３対３３.２□２５.４％、ｐ＝０.２）。腫瘍コアにおけるＰＳＭＡ－ＮＢの割合は、ＮＢのそれよりも４.１倍高かった（３７.７□２０.１％対１８.９□１８.７％）。灌流後、ＵＳシグナルの百分率は両グループで低下した。ＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢの百分率は、ピーク値と比較して、腫瘍縁においてそれぞれ６７％及び９２％低下した（それぞれ１５.０□７.２１％対２.４５□３.４％）。さらに、灌流後、ＰＳＭＡ－ＮＢは、ＮＢのそれと比較して腫瘍コアにおいて有意に低下した（それぞれ１２.２□２.３％及び３.２□２.２％）（ｐ＜０.０５）。ＮＢと比較して腫瘍コアにおけるＰＳＭＡ－ＮＢの有意により高い（約４倍の）３Ｄ ＵＳシグナルは、腫瘍コア環境におけるＰＳＭＡ－ＮＢの比較的高い蓄積及び溢出を示す。心臓灌流後のＵＳコントラストの存在は、腫瘍実質におけるインタクトなＮＢの蓄積及び溢出の証拠を提供した。予想通り、Ｌｕｍａｓｏｎの百分率は、注射後２５分の時点及び灌流後に、腫瘍の縁とコアの両方において無視できるほど小さくなった。
インタクトな形態の腫瘍体積全体におけるＮＢの溢出及び蓄積を調べるために、心臓穿刺による全血灌流を注射後２５分の時点で実施し、心臓穿刺前後に３Ｄ ＵＳスキャンを完了した（図６Ａ）。全血灌流は、血管系内の血液を排除し、腫瘍血管系から自由に動くナノバブルを含むあらゆる物質を除去する。灌流後、腫瘍内の３Ｄ ＵＳシグナルは、腫瘍実質全体又は細胞内空間に残っている物質に対応する。灌流前の、注射後２５分の時点で、腫瘍縁におけるＰＳＭＡ－ＮＢの割合はＮＢのそれよりも１.４倍高かった（図６Ｂ、Ｃ；４６.８□２１.３対３３.２□２５.４％、ｐ＝０.２）。腫瘍コアにおけるＰＳＭＡ－ＮＢの割合は、ＮＢのそれよりも４.１倍高かった（３７.７□２０.１％対１８.９□１８.７％）。灌流後、ＵＳシグナルの百分率は両グループで低下した。ＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢの百分率は、ピーク値と比較して、腫瘍縁においてそれぞれ６７％及び９２％低下した（それぞれ１５.０□７.２１％対２.４５□３.４％）。さらに、灌流後、ＰＳＭＡ－ＮＢは、ＮＢのそれと比較して腫瘍コアにおいて有意に低下した（それぞれ１２.２□２.３％及び３.２□２.２％）（ｐ＜０.０５）。ＮＢと比較して腫瘍コアにおけるＰＳＭＡ－ＮＢの有意により高い（約４倍の）３Ｄ ＵＳシグナルは、腫瘍コア環境におけるＰＳＭＡ－ＮＢの比較的高い蓄積及び溢出を示す。心臓灌流後のＵＳコントラストの存在は、腫瘍実質におけるインタクトなＮＢの蓄積及び溢出の証拠を提供した。予想通り、Ｌｕｍａｓｏｎの百分率は、注射後２５分の時点及び灌流後に、腫瘍の縁とコアの両方において無視できるほど小さくなった。
【0146】
組織学的解析
ＵＳデータを確認するために、Ｃｙ５.５－ＰＳＭＡ－ＮＢ又はＣＹ５.５－ＮＢを腫瘍組織に注射した後に組織学的解析を進めた。ＰＳＭＡ発現、ＣＤ３１発現、及びＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢ分布を腫瘍の縁及びコアにおいて別々に評価した。注射前に、バブルを蛍光色素；Ｃｙ５.５でタグ付けした。溢出研究に記載されるように、注射後２５分の時点で３Ｄ ＵＳスキャンを行い、次いで、動物を心臓穿刺によってＰＢＳで灌流した。灌流後、上述のように腫瘍を３Ｄで再スキャンし、組織学的解析のために腫瘍を摘出した。腫瘍のコア及び縁を別々に画像化し、解析した。血管系を代表するＣＤ３１は、腫瘍コアと比較して腫瘍縁においてより高い百分率を示した。ＰＳＭＡ発現はまた、腫瘍コアと比較して腫瘍縁においても高かったが、有意差はなかった。Ｃｙ５.５－ＰＳＭＡ－ＮＢシグナルは腫瘍内でより均等に分布し、標的ＮＢが血管系から遊走し、腫瘍マトリックスに蓄積した証拠を提供した。組織学的シグナルの定量化は、腫瘍コアと縁の両方におけるＣｙ５.５－ＰＳＭＡ－ＮＢシグナルが、プレーンＮＢのシグナルと比較して有意に高かった（３倍）ことを明らかにする（ｐ＜０.００１）（図７）。造影剤と腫瘍マトリックスの相互作用の増強は、溢出後のＰＳＭＡ－ＮＢの高い蓄積を説明する。
ＵＳデータを確認するために、Ｃｙ５.５－ＰＳＭＡ－ＮＢ又はＣＹ５.５－ＮＢを腫瘍組織に注射した後に組織学的解析を進めた。ＰＳＭＡ発現、ＣＤ３１発現、及びＰＳＭＡ－ＮＢ及びＮＢ分布を腫瘍の縁及びコアにおいて別々に評価した。注射前に、バブルを蛍光色素；Ｃｙ５.５でタグ付けした。溢出研究に記載されるように、注射後２５分の時点で３Ｄ ＵＳスキャンを行い、次いで、動物を心臓穿刺によってＰＢＳで灌流した。灌流後、上述のように腫瘍を３Ｄで再スキャンし、組織学的解析のために腫瘍を摘出した。腫瘍のコア及び縁を別々に画像化し、解析した。血管系を代表するＣＤ３１は、腫瘍コアと比較して腫瘍縁においてより高い百分率を示した。ＰＳＭＡ発現はまた、腫瘍コアと比較して腫瘍縁においても高かったが、有意差はなかった。Ｃｙ５.５－ＰＳＭＡ－ＮＢシグナルは腫瘍内でより均等に分布し、標的ＮＢが血管系から遊走し、腫瘍マトリックスに蓄積した証拠を提供した。組織学的シグナルの定量化は、腫瘍コアと縁の両方におけるＣｙ５.５－ＰＳＭＡ－ＮＢシグナルが、プレーンＮＢのシグナルと比較して有意に高かった（３倍）ことを明らかにする（ｐ＜０.００１）（図７）。造影剤と腫瘍マトリックスの相互作用の増強は、溢出後のＰＳＭＡ－ＮＢの高い蓄積を説明する。
【0147】
インビトロでのＰＣ３ｐｉｐ細胞におけるＰＳＭＡ標的ＮＢの持続性
この研究では、音響活性の持続性に対するナノバブル超音波造影剤の細胞内部移行の影響を調査した。具体的には、ＰＳＭＡ発現ヒト前立腺癌細胞におけるＰＳＭＡ標的ＮＢの受動的細胞取り込み対受容体媒介性エンドサイトーシスの効果を比較した。発明者らはまず、ＰＳＭＡ標的ＮＢ又は非標的ＮＢと１時間インキュベーションした後のＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ｐｉｐとＰＳＭＡ陰性ＰＣ３ｆｌｕ細胞の両方の非線形音響特性の動態を調べた。図８に示すように、１時間のインキュベーション後、ＰＳＭＡ－ＮＢとインキュベートしたＰＣ３ｐｉｐ細胞は、プレーンＮＢインキュベートＰＣ３ｐｉｐ細胞と比較して３.２５倍高い音響活性を示した（図８；Ｐ＜０.０５；それぞれ９.６９±対１.７８ｄＢ対２.１９±１.２２ｄＢ）であり、他の全てのグループ（ＰＣ３ｐｉｐ細胞内のＮＢ、ＰＣ３ｆｌｕ細胞内のＰＳＭＡ－ＮＢ及びＰＣ３ｆｌｕ細胞内のプレーンＮＢ）及び陰性対照（細胞のみ）と比較してより高いシグナル強度を示した。さらに、内部移行したＰＳＭＡ－ＮＢの有意により高い音響活性は、４８時間の時点を除いて試験した全ての時点について持続した（図８）。２４時間後、ＰＳＭＡ－ＮＢに曝露したＰＣ３ｐｉｐ細胞は、他の全てのグループと比較して有意により高いＵＳシグナル強度（４.１１±０.６８ｄＢ；Ｐ＜０.００５）を示した。同じ条件下であるが細胞を含めずにインキュベートしたＰＳＭＡ－ＮＢは、ＰＣ３ｐｉｐ細胞とインキュベートしたＰＳＭＡ－ＮＢに匹敵する初期シグナル強度を示した。しかし、３時間の時点以降、ＰＳＭＡ－ＮＢのみのグループのシグナル強度は、ＰＣ３ｐｉｐ細胞に内部移行したＰＳＭＡ－ＮＢと比較して有意により低く、細胞環境において遊離ＰＳＭＡ－ＮＢよりも内部移行したＰＳＭＡ－ＮＢの高い安定性が示された。
この研究では、音響活性の持続性に対するナノバブル超音波造影剤の細胞内部移行の影響を調査した。具体的には、ＰＳＭＡ発現ヒト前立腺癌細胞におけるＰＳＭＡ標的ＮＢの受動的細胞取り込み対受容体媒介性エンドサイトーシスの効果を比較した。発明者らはまず、ＰＳＭＡ標的ＮＢ又は非標的ＮＢと１時間インキュベーションした後のＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ｐｉｐとＰＳＭＡ陰性ＰＣ３ｆｌｕ細胞の両方の非線形音響特性の動態を調べた。図８に示すように、１時間のインキュベーション後、ＰＳＭＡ－ＮＢとインキュベートしたＰＣ３ｐｉｐ細胞は、プレーンＮＢインキュベートＰＣ３ｐｉｐ細胞と比較して３.２５倍高い音響活性を示した（図８；Ｐ＜０.０５；それぞれ９.６９±対１.７８ｄＢ対２.１９±１.２２ｄＢ）であり、他の全てのグループ（ＰＣ３ｐｉｐ細胞内のＮＢ、ＰＣ３ｆｌｕ細胞内のＰＳＭＡ－ＮＢ及びＰＣ３ｆｌｕ細胞内のプレーンＮＢ）及び陰性対照（細胞のみ）と比較してより高いシグナル強度を示した。さらに、内部移行したＰＳＭＡ－ＮＢの有意により高い音響活性は、４８時間の時点を除いて試験した全ての時点について持続した（図８）。２４時間後、ＰＳＭＡ－ＮＢに曝露したＰＣ３ｐｉｐ細胞は、他の全てのグループと比較して有意により高いＵＳシグナル強度（４.１１±０.６８ｄＢ；Ｐ＜０.００５）を示した。同じ条件下であるが細胞を含めずにインキュベートしたＰＳＭＡ－ＮＢは、ＰＣ３ｐｉｐ細胞とインキュベートしたＰＳＭＡ－ＮＢに匹敵する初期シグナル強度を示した。しかし、３時間の時点以降、ＰＳＭＡ－ＮＢのみのグループのシグナル強度は、ＰＣ３ｐｉｐ細胞に内部移行したＰＳＭＡ－ＮＢと比較して有意により低く、細胞環境において遊離ＰＳＭＡ－ＮＢよりも内部移行したＰＳＭＡ－ＮＢの高い安定性が示された。
【0148】
以前の研究では、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）上の遺伝子操作した細胞表面マーカーへのマイクロバブル（ＭＢ）の標的化を検討し、インビトロでＥＰＣへの選択的結合を実証し、ＣＥＵで画像化することができた。また、内部移行したＭＢ又は膜結合ＭＢのいずれかが、遊離ＭＢと比較して細胞によるはるかに大きな粘性減衰によって保護されることも以前に示されている。これらの知見と一致して、発明者らは、内部移行したＮＢが同じ条件下で遊離ＮＢと比較して長期間にわたって有意により高い後方散乱を示すことも観察した。さらに、後の時点で、ＰＣ３ｐｉｐ細胞におけるＰＳＭＡ－ＮＢは、ＰＣ３ｐｉｐ又はＰＣ３ｆｌｕ細胞のいずれかとインキュベートしたプレーンＮＢ及びＰＳＭＡ－ＮＢ陰性ＰＣ３ｆｌｕ細胞とインキュベートしたＰＳＭＡ－ＮＢよりも高いコントラストを示した。細胞によるＮＢの非特異的取り込みは、ＮＢからのシグナル崩壊速度をわずかに低下させる。しかし、エンドソーム内に局在するＰＳＭＡ－ＮＢについては、はるかにより遅い崩壊が観察された。そのため、発明者らは、細胞におけるＰＳＭＡ－ＮＢの長期生存は、エンドソーム／リソソーム封入による安定化によるものである可能性があると仮定する。
【0149】
ＰＣ３ｐｉｐ細胞におけるＰＳＭＡ－ＮＢ内部移行の共焦点イメージング
ＰＳＭＡは細胞膜受容体として機能し、標的化剤に結合されているペイロードと共にＰＳＭＡ標的化リガンドを内部移行させる。ＰＳＭＡリガンドが細胞膜上のバイオマーカーに結合すると、細胞膜が陥入し、粒子全体が細胞に飲み込まれる。細胞内の内部移行したＰＳＭＡ－ＮＢの局在を、蛍光色素リソトラッカーレッドを用いた共焦点顕微鏡イメージングで調査した。リソトラッカーレッド染色は、後期エンドソーム及びリソソーム構造を染色する。
ＰＳＭＡは細胞膜受容体として機能し、標的化剤に結合されているペイロードと共にＰＳＭＡ標的化リガンドを内部移行させる。ＰＳＭＡリガンドが細胞膜上のバイオマーカーに結合すると、細胞膜が陥入し、粒子全体が細胞に飲み込まれる。細胞内の内部移行したＰＳＭＡ－ＮＢの局在を、蛍光色素リソトラッカーレッドを用いた共焦点顕微鏡イメージングで調査した。リソトラッカーレッド染色は、後期エンドソーム及びリソソーム構造を染色する。
【0150】
発明者らの以前の蛍光イメージングデータは、ＰＳＭＡ標的ＮＢがＰＣ３ｐｉｐ細胞によって選択的に内部移行することを示した。ここでの共焦点イメージング結果は、ＰＣ３ｐｉｐ細胞によるＰＳＭＡ－ＮＢの内部移行、より具体的には受容体媒介性エンドサイトーシスを示す（図９、１００倍、図１８、４０倍）。リソトラッカーレッド（緑）染色した後期エンドソーム／リソソーム及びローダミン標識ＰＳＭＡ－ＮＢ（赤色）の実質的な共局在が、全てのＰＳＭＡ発現細胞において認められた。図９Ａに示すように、プレーンＮＢはＰＣ３ｐｉｐ細胞による非特異的取り込みをいくぶんか示したが、後期エンドソーム／リソソームの共局在化は限られていた。ＰＣ３ｐｉｐ細胞による非標的ＮＢの取り込みは、ＰＳＭＡ－ＮＢの取り込みと比較して実質的により低かった。また、ＰＳＭＡ－ＮＢと後期エンドソーム／リソソーム小胞とのより高い程度の共局在化を図９Ｂ及びＣに示した。
【0151】
バブル曝露後２４時間の時点でのＰＣ３ｐｉｐ細胞のイメージングは、以前の時点と比較してより低い蛍光シグナル量を明らかにした（図８Ｄ）。しかし、これらの画像はまた、後期エンドソーム／リソソーム小胞におけるＰＳＭＡ－ＮＢの高い程度の共局在を示した。２４時間後に、ＮＢインキュベート細胞の細胞質又は後期エンドソーム／リソソーム区画において蛍光シグナルが非常に低いか、又は全く現れなかった。さらに、画像は核付近に黄色の染色を示したことから、ＰＳＭＡ－ＮＢの大部分が後期エンドソーム又はリソソームのいずれかと共局在して、細胞質に輸送されることが示唆された。
【0152】
ＰＣ３ｐｉｐ細胞を標的ＮＢとインキュベートした場合に、非標的ＮＢと比較して、より多量のリソトラッカー染色が観察され、これは、受容体に媒介され、後期エンドソーム／リソソーム経路に入る内部移行のメカニズムと相関する。ＰＳＭＡは特有の内部移行モチーフを有し、２時間でその表面ＰＳＭＡの６０％の堅牢なベースライン内部移行率を有することが報告されている。膜貫通位置と内部移行により、ＰＳＭＡはイメージングと治療に理想的な標的となる。全体として、ＰＳＭＡ媒介性エンドサイトーシスは、ＰＳＭＡ発現前立腺癌ＰＣ３ｐｉｐ細胞におけるＰＳＭＡ標的ナノバブルの内部移行のための主要経路であると思われる。
【0153】
ヘッドスペースＧＣ／ＭＳを用いた細胞内のＣ
３
Ｆ
８
の分析
インタクトなガス含有ナノバブルがＰＣ３ｐｉｐ細胞内に内部移行し、ＰＣ３ｐｉｐ細胞内に留まることを確認するために、ＰＳＭＡ－ＮＢ又はＮＢへの曝露後３時間の時点で細胞を取集し、細胞内のＣ３Ｆ８の存在をヘッドスペースＧＣ／ＭＳを用いて分析した。ＮＢにおけるＣ３Ｆ８ガス濃度を定量するためにヘッドスペースＧＣ／ＭＳを使用することは、以前に報告され、検証された。Ｃ３Ｆ８に対応する１６９の質量電荷比（ｍ／ｚ）で観察されたピークの相対存在量を用いて分析を行った。異なる濃度のＮＢを使用して、ＧＣ／ＭＳによる較正プロットを作成した（図１０Ａ及びＢ）。ピーク面積とバブル数との間に線形関係が観察された。ＧＣ／ＭＳデータは、ＰＳＭＡ－ＮＢインキュベートＰＣ３ｐｉｐ細胞から得たピーク面積が、プレーンＮＢインキュベートＰＣ３ｐｉｐ細胞懸濁液のそれと比較して３.５倍高い値を示したことを示した（図９Ｃ；ＰＳＭＡ－ＮＢ、ＮＢ、及び細胞のピーク面積は、それぞれ１６７７８（ａ．ｕ）、６２７４（ａ．ｕ）、及び２１７２（ａ．ｕ）であった。検量線に基づくと、これは細胞当たり約５００の平均サイズのＰＳＭＡ－ＮＢ対１３８の平均サイズのプレーンＮＢに相当する。発明者らの知る限りでは、これは細胞内のガス小胞の存在を確認するための絶対的に最も直接的な方法である。ピーク面積の比は、図１０に示すように、細胞からの音響活性の差と一致している。それはまた、循環ＮＢのクリアランス後のＰＣ３ｐｉｐ腫瘍におけるＰＳＭＡ－ＮＢ対プレーンＮＢ蓄積から見られる超音波シグナルの差と著しく類似しており、インビボで標的ＮＢが溢出し、インタクトな形態で腫瘍内に保持されることを示すデータを支持する。
インタクトなガス含有ナノバブルがＰＣ３ｐｉｐ細胞内に内部移行し、ＰＣ３ｐｉｐ細胞内に留まることを確認するために、ＰＳＭＡ－ＮＢ又はＮＢへの曝露後３時間の時点で細胞を取集し、細胞内のＣ３Ｆ８の存在をヘッドスペースＧＣ／ＭＳを用いて分析した。ＮＢにおけるＣ３Ｆ８ガス濃度を定量するためにヘッドスペースＧＣ／ＭＳを使用することは、以前に報告され、検証された。Ｃ３Ｆ８に対応する１６９の質量電荷比（ｍ／ｚ）で観察されたピークの相対存在量を用いて分析を行った。異なる濃度のＮＢを使用して、ＧＣ／ＭＳによる較正プロットを作成した（図１０Ａ及びＢ）。ピーク面積とバブル数との間に線形関係が観察された。ＧＣ／ＭＳデータは、ＰＳＭＡ－ＮＢインキュベートＰＣ３ｐｉｐ細胞から得たピーク面積が、プレーンＮＢインキュベートＰＣ３ｐｉｐ細胞懸濁液のそれと比較して３.５倍高い値を示したことを示した（図９Ｃ；ＰＳＭＡ－ＮＢ、ＮＢ、及び細胞のピーク面積は、それぞれ１６７７８（ａ．ｕ）、６２７４（ａ．ｕ）、及び２１７２（ａ．ｕ）であった。検量線に基づくと、これは細胞当たり約５００の平均サイズのＰＳＭＡ－ＮＢ対１３８の平均サイズのプレーンＮＢに相当する。発明者らの知る限りでは、これは細胞内のガス小胞の存在を確認するための絶対的に最も直接的な方法である。ピーク面積の比は、図１０に示すように、細胞からの音響活性の差と一致している。それはまた、循環ＮＢのクリアランス後のＰＣ３ｐｉｐ腫瘍におけるＰＳＭＡ－ＮＢ対プレーンＮＢ蓄積から見られる超音波シグナルの差と著しく類似しており、インビボで標的ＮＢが溢出し、インタクトな形態で腫瘍内に保持されることを示すデータを支持する。
【0154】
ＰＳＭＡ－ＮＢ内部移行した細胞のインビボ適用
細胞内保持の延長がインビボでも可視化できることを確認するために、発明者らは、マウスへの注射時に細胞内の内部移行バブルの音響活性を研究した。ＰＳＭＡ－ＮＢとインキュベートしたＰＣ３ｐｉｐ細胞をヌードマウスの側腹部領域に皮下注射し、１２ＭＨｚで画像化した。対照として、ＮＢに曝露しない細胞を標識細胞注射領域に隣接して注射した。図１１Ａは、細胞注射後０～２４時間及び８日の時点で得たＵＳ画像を示す。ＮＢインキュベート細胞は、注射直後の非標識細胞と比較して有意に高いコントラストを示した（９.７±２.９、５.２±１.５：Ｐ＜０.０５）。対照細胞から見られる初期シグナルは、マトリゲルに閉じ込められた空気バブルの結果である可能性が最も高い。３時間後及び２４時間後に、対照細胞と比較してＮＢインキュベート細胞を有する領域におけるコントラストは依然として有意に高かった（図１１Ｂ）。
細胞内保持の延長がインビボでも可視化できることを確認するために、発明者らは、マウスへの注射時に細胞内の内部移行バブルの音響活性を研究した。ＰＳＭＡ－ＮＢとインキュベートしたＰＣ３ｐｉｐ細胞をヌードマウスの側腹部領域に皮下注射し、１２ＭＨｚで画像化した。対照として、ＮＢに曝露しない細胞を標識細胞注射領域に隣接して注射した。図１１Ａは、細胞注射後０～２４時間及び８日の時点で得たＵＳ画像を示す。ＮＢインキュベート細胞は、注射直後の非標識細胞と比較して有意に高いコントラストを示した（９.７±２.９、５.２±１.５：Ｐ＜０.０５）。対照細胞から見られる初期シグナルは、マトリゲルに閉じ込められた空気バブルの結果である可能性が最も高い。３時間後及び２４時間後に、対照細胞と比較してＮＢインキュベート細胞を有する領域におけるコントラストは依然として有意に高かった（図１１Ｂ）。
【0155】
ＰＣ３ｐｉｐ細胞における内部移行したＰＳＭＡ－ＮＢは、主に細胞内小胞と共局在し、インビトロでのインキュベーション後４８時間、及びインビボで１週間、実質的な後方散乱活性を示した。発明者らの知る限りでは、この研究は、ＰＳＭＡ標的ＮＢの取り込みと癌細胞における長期保持の直接的な証拠を初めて示し、ＮＢ音響活性の安定化におけるエンドソーム／リソソームの重要な役割を実証する。
【0156】
この実施例は、ＰＳＭＡに対するＮＢの能動的標的化が、２Ｄ非線形コントラストモードと３Ｄ ＵＳモードの両方におけるＰＳＭＡ発現腫瘍内での溢出及び蓄積を増加させることを実証した。データは、腫瘍のウォッシュインとＰＳＭＡ－ＮＢの保持の両方が、バイオマーカーの相互作用及び結合により遅延することを示した。腫瘍コアにおけるＰＳＭＡ－ＮＢシグナルのより長い保持はまた、標的化促進型バブル溢出をさらに支持する。さらに、インビトロ研究から、ＰＳＭＡに対するＮＢの能動的標的化が、ＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ｐｉｐ細胞における細胞内部移行を選択的に増強することが示唆された。ＵＳはＰＣ３ｐｉｐ細胞において内部移行したＰＳＭＡ－ＮＢを検出することができ、おそらくエンドソーム小胞への封入により、内部移行したＰＳＭＡ－ＮＢは細胞環境において長期の安定性を示した。ＧＣ／ＭＳ分析はさらに、内部移行後の細胞におけるインタクトなＮＢ持続性を確認する。この研究知見は、バイオマーカー発現腫瘍における標的ナノバブルの長期音響活性を示す先行研究を支持し、超音波を用いた新しい分子イメージング及び標的療法アプローチへの扉を開く。
【0157】
実施例２
この実施例では、ヌードマウスにおけるより臨床的に関連する同所性前立腺腫瘍モデルを用いて、インビボでのＰＣａのＵＳイメージングのためにＰＳＭＡ標的ＮＢを調査する（図１２）。ＮＢ増強超音波の堅牢な性質を考慮して、発明者らはこの技術を用いて、同じモデルにおける腫瘍の進行及びサイズに対するＰＳＭＡ標的化効率の効果も調べた。これは、標的超音波ＮＢに関する関連研究のための方法を提供し得る。
この実施例では、ヌードマウスにおけるより臨床的に関連する同所性前立腺腫瘍モデルを用いて、インビボでのＰＣａのＵＳイメージングのためにＰＳＭＡ標的ＮＢを調査する（図１２）。ＮＢ増強超音波の堅牢な性質を考慮して、発明者らはこの技術を用いて、同じモデルにおける腫瘍の進行及びサイズに対するＰＳＭＡ標的化効率の効果も調べた。これは、標的超音波ＮＢに関する関連研究のための方法を提供し得る。
【0158】
材料と方法
ＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢの調製
ＰＳＭＡ標的ＮＢ（１０ｍｇ／ｍＬ）は、１，２－ジベヘノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ２２、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．，Ｐｅｌｈａｍ，ＡＬ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ＤＰＰＡ、Ｃｏｒｄｅｎ Ｐｈａｒｍａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ、コーデンファーマ、スイス）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００]（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ ２０００、Ｌａｙｓａｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｒａｂ，ＡＬ）を含む脂質の混合物を最初プロピレングリコール（０.１ｍＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）に溶解し、全ての脂質が溶解するまで８０℃で加熱及び超音波処理することによって以前に報告されたとおりに調製した。８０℃に予熱したグリセロール（０.１ｍＬ，Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）とリン酸緩衝生理食塩水（０.８ｍＬ，Ｇｉｂｃｏ，ｐＨ７．４）の混合物を脂質溶液に添加した。生じた溶液を室温で１０分間超音波処理した。ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ－ＰＳＭＡ（１ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ中に２５μＬ）を添加した。溶液を３ｍＬのヘッドスペースバイアルに移し、ゴムセプタム及びアルミニウムシールで蓋をし、バイアルクリンパーで密封した。空気を３０ｍＬのシリンジを用いて手動で除去し、オクタフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎｓ，ＬＬＣ，ＰＡ）ガスを注射することによって置換した。次いで、リン脂質溶液を、４５秒間のＶｉａｌＭｉｘシェーカー（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）による機械的振盪によって活性化した。ＰＳＭＡ標的ＮＢを、ヘッドスペースバイアルを反転させた状態で、５０ｒｃｆで５分間遠心分離することにより、泡とマイクロバブルの混合物から分離し、次いで、２００μＬのＰＳＭＡ標的ＮＢ溶液を、２１Ｇ針で底部から５ｍｍの固定距離から抜き出した。同様の調製を、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ－ＰＳＭＡを添加しなで、非標的ＮＢについて行った。
ＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢの調製
ＰＳＭＡ標的ＮＢ（１０ｍｇ／ｍＬ）は、１，２－ジベヘノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ２２、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．，Ｐｅｌｈａｍ，ＡＬ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ＤＰＰＡ、Ｃｏｒｄｅｎ Ｐｈａｒｍａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ、コーデンファーマ、スイス）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００]（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ ２０００、Ｌａｙｓａｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｒａｂ，ＡＬ）を含む脂質の混合物を最初プロピレングリコール（０.１ｍＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）に溶解し、全ての脂質が溶解するまで８０℃で加熱及び超音波処理することによって以前に報告されたとおりに調製した。８０℃に予熱したグリセロール（０.１ｍＬ，Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）とリン酸緩衝生理食塩水（０.８ｍＬ，Ｇｉｂｃｏ，ｐＨ７．４）の混合物を脂質溶液に添加した。生じた溶液を室温で１０分間超音波処理した。ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ－ＰＳＭＡ（１ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ中に２５μＬ）を添加した。溶液を３ｍＬのヘッドスペースバイアルに移し、ゴムセプタム及びアルミニウムシールで蓋をし、バイアルクリンパーで密封した。空気を３０ｍＬのシリンジを用いて手動で除去し、オクタフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎｓ，ＬＬＣ，ＰＡ）ガスを注射することによって置換した。次いで、リン脂質溶液を、４５秒間のＶｉａｌＭｉｘシェーカー（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）による機械的振盪によって活性化した。ＰＳＭＡ標的ＮＢを、ヘッドスペースバイアルを反転させた状態で、５０ｒｃｆで５分間遠心分離することにより、泡とマイクロバブルの混合物から分離し、次いで、２００μＬのＰＳＭＡ標的ＮＢ溶液を、２１Ｇ針で底部から５ｍｍの固定距離から抜き出した。同様の調製を、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ－ＰＳＭＡを添加しなで、非標的ＮＢについて行った。
【0159】
ＮＢのサイズ、濃度、及び表面電荷
ＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢのサイズ分布及び濃度を、５０～２０００ｎｍの粒径を測定できるナノセンサ搭載の共鳴質量測定（ＡＲＣＨＩＭＥＤＥＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で特徴づけた。許容可能な検出限界（＜０.０１Ｈｚ）を得るために、ＮＢ溶液をＰＢＳ（５００×）で希釈し、２ｐｓｉで１２０秒間ロードし、（５００Ｘ）で分析して、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｌｉｔｅｓｉｚｅｒ ５００で測定した。
ＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢのサイズ分布及び濃度を、５０～２０００ｎｍの粒径を測定できるナノセンサ搭載の共鳴質量測定（ＡＲＣＨＩＭＥＤＥＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で特徴づけた。許容可能な検出限界（＜０.０１Ｈｚ）を得るために、ＮＢ溶液をＰＢＳ（５００×）で希釈し、２ｐｓｉで１２０秒間ロードし、（５００Ｘ）で分析して、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｌｉｔｅｓｉｚｅｒ ５００で測定した。
【0160】
動物モデル
動物を、ケース・ウェスタン・リザーブ大学の施設動物管理・使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って取り扱い、動物の使用に関して適用可能な全てのプロトコル及びガイドラインに従った。４～６週齢の雄の胸腺欠損Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスをケース・ウェスタン・リザーブ大学動物研究センターから購入し、承認済み動物資源センターの小動物イメージングセンターに収容した。全ての動物に標準的なケアをした：食物と水への自由なアクセス；１２／１２の明暗サイクル；種に適切な温度と湿度；可能な限りの環境の豊かさとグループ収容；標準的なケージ消毒；及びソリッドボトムケージ。マウスを、０.５～１Ｌ／分の酸素と共に１～２％イソフルランの吸入で麻酔した。２８ １／２ゲージのインスリン針を腹側前立腺に挿入し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁したＰＳＭＡ（＋）ＰＣ３ｐｉｐ細胞１０μＬを送達した。注射した前立腺葉内の十分に局在化した小疱は、注射が技術的に満足のいくものであった印である。腫瘍が直径約３～５ｍｍに達するまで、動物を１日おきに観察し、次いで、イメージング研究に使用した。
動物を、ケース・ウェスタン・リザーブ大学の施設動物管理・使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って取り扱い、動物の使用に関して適用可能な全てのプロトコル及びガイドラインに従った。４～６週齢の雄の胸腺欠損Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスをケース・ウェスタン・リザーブ大学動物研究センターから購入し、承認済み動物資源センターの小動物イメージングセンターに収容した。全ての動物に標準的なケアをした：食物と水への自由なアクセス；１２／１２の明暗サイクル；種に適切な温度と湿度；可能な限りの環境の豊かさとグループ収容；標準的なケージ消毒；及びソリッドボトムケージ。マウスを、０.５～１Ｌ／分の酸素と共に１～２％イソフルランの吸入で麻酔した。２８ １／２ゲージのインスリン針を腹側前立腺に挿入し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁したＰＳＭＡ（＋）ＰＣ３ｐｉｐ細胞１０μＬを送達した。注射した前立腺葉内の十分に局在化した小疱は、注射が技術的に満足のいくものであった印である。腫瘍が直径約３～５ｍｍに達するまで、動物を１日おきに観察し、次いで、イメージング研究に使用した。
【0161】
薬物動態試験
動物を、腫瘍直径が３～５ｍｍに達した接種後１０日目に研究に使用した。ＮＢの薬物動態は、超音波プローブＰＬＴ－１２０４ＢＴを用いてＡＰＬＩＸＧ ＳＳＡ－７９０Ａ Ｔｏｓｈｉｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｏｔａｗａｒａ－Ｓｈｉ，Ｊａｐａｎ）によって監視した。マウスを０.５～１Ｌ／分の酸素と共に１～２％イソフルランで麻酔した後、各マウスを仰向けに位置付け、超音波プローブ（ＰＬＴ－１２０４ＢＴ）を動物の体の軸に対して縦方向に位置づけ、ＰＣ３ｐｉｐ同所性腫瘍の超音波画像を可視化した。コントラスト増強超音波画像を同じマウスの同じ腫瘍（ｎ＝１１）と比較するために、ＰＳＭＡ標的ＮＢ（３.９±０.２８２Ｘ１０１１／ｍＬ）又は非標的ＮＢ（４.０±０.２４５Ｘ１０１１／ｍＬ）のいずれか２００μＬを、尾静脈を介して投与した。ＮＢ注射前に、５秒間の生データ形式で画像を取得した。ＮＢ注射後に、組織コントラスト密度の変化を画像化するために、コントラストハーモニックイメージング（ＣＨＩ）を使用した（ＣＨＩ、周波数１２.０ ＭＨｚ；ＭＩ，０.１；ダイナミックレンジ、６５ｄＢ；ゲイン、７０ｄＢ；イメージングフレームレート、０.２フレーム／秒）。マウスを３０分間連続して画像化した。残りのＮＢを、フラッシュ補充を繰り返して崩壊させ、次いで３０分後に、同じマウスに非標的ＮＢ又はＰＳＭＡ標的ＮＢを投与した。ＬＵＭＡＳＯＮ（２００μＬ、１～５Ｘ１０８／ｍＬ、六フッ化硫黄脂質型Ａミクロスフェア、Ｂｒａｃｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）を他の３匹のマウスで試験した。ＬＵＭＡＳＯＮを、製造業者によって提供されるプロトコルに従って調製した。生データは、スキャナーの製造元が提供するソフトウェアで処理した。取得した線形生データ画像をＣＨＩ－Ｑ定量ソフトウェア（Ｔｏｓｈｉｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｔａｗａｒａ－Ｓｈｉ，Ｊａｐａｎ）で処理した。関心領域（ＲＯＩ）の腫瘍及び肝臓の領域の輪郭を描いた。時間の関数としての各ＲＯＩのシグナル強度（時間－強度曲線－ＴＩＣ）を計算し、エクセルにエクスポートした。超音波コントラストの減衰を分析するために、ベースラインをＴＩＣから差し引いた。
動物を、腫瘍直径が３～５ｍｍに達した接種後１０日目に研究に使用した。ＮＢの薬物動態は、超音波プローブＰＬＴ－１２０４ＢＴを用いてＡＰＬＩＸＧ ＳＳＡ－７９０Ａ Ｔｏｓｈｉｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｏｔａｗａｒａ－Ｓｈｉ，Ｊａｐａｎ）によって監視した。マウスを０.５～１Ｌ／分の酸素と共に１～２％イソフルランで麻酔した後、各マウスを仰向けに位置付け、超音波プローブ（ＰＬＴ－１２０４ＢＴ）を動物の体の軸に対して縦方向に位置づけ、ＰＣ３ｐｉｐ同所性腫瘍の超音波画像を可視化した。コントラスト増強超音波画像を同じマウスの同じ腫瘍（ｎ＝１１）と比較するために、ＰＳＭＡ標的ＮＢ（３.９±０.２８２Ｘ１０１１／ｍＬ）又は非標的ＮＢ（４.０±０.２４５Ｘ１０１１／ｍＬ）のいずれか２００μＬを、尾静脈を介して投与した。ＮＢ注射前に、５秒間の生データ形式で画像を取得した。ＮＢ注射後に、組織コントラスト密度の変化を画像化するために、コントラストハーモニックイメージング（ＣＨＩ）を使用した（ＣＨＩ、周波数１２.０ ＭＨｚ；ＭＩ，０.１；ダイナミックレンジ、６５ｄＢ；ゲイン、７０ｄＢ；イメージングフレームレート、０.２フレーム／秒）。マウスを３０分間連続して画像化した。残りのＮＢを、フラッシュ補充を繰り返して崩壊させ、次いで３０分後に、同じマウスに非標的ＮＢ又はＰＳＭＡ標的ＮＢを投与した。ＬＵＭＡＳＯＮ（２００μＬ、１～５Ｘ１０８／ｍＬ、六フッ化硫黄脂質型Ａミクロスフェア、Ｂｒａｃｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）を他の３匹のマウスで試験した。ＬＵＭＡＳＯＮを、製造業者によって提供されるプロトコルに従って調製した。生データは、スキャナーの製造元が提供するソフトウェアで処理した。取得した線形生データ画像をＣＨＩ－Ｑ定量ソフトウェア（Ｔｏｓｈｉｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｔａｗａｒａ－Ｓｈｉ，Ｊａｐａｎ）で処理した。関心領域（ＲＯＩ）の腫瘍及び肝臓の領域の輪郭を描いた。時間の関数としての各ＲＯＩのシグナル強度（時間－強度曲線－ＴＩＣ）を計算し、エクセルにエクスポートした。超音波コントラストの減衰を分析するために、ベースラインをＴＩＣから差し引いた。
【0162】
バブル崩壊研究
マウスに、尾静脈注射を介して２００μＬのＮＢ（３.９±０.２８２Ｘ１０１１／ｍＬ）を投与した。造影剤注射の５分後、同じ視野の中の腫瘍と肝臓を含む４つの異なる平面で画像を撮影し、次いで、肝臓平面から心臓面までの異なる位置で２５回フラッシュし、循環中に残っている全てのＮＢを崩壊させた。その後、コントラストモードイメージングを用いて、同じ視野の中の腫瘍と肝臓を含む４つの異なる平面で再び画像を撮影した。平均強度をＩｍａｇｅ Ｊによって分析した。この実験を、ＰＣ３ｐｉｐ同所性腫瘍を担持する４匹のヌードマウスにおいて繰り返した。
マウスに、尾静脈注射を介して２００μＬのＮＢ（３.９±０.２８２Ｘ１０１１／ｍＬ）を投与した。造影剤注射の５分後、同じ視野の中の腫瘍と肝臓を含む４つの異なる平面で画像を撮影し、次いで、肝臓平面から心臓面までの異なる位置で２５回フラッシュし、循環中に残っている全てのＮＢを崩壊させた。その後、コントラストモードイメージングを用いて、同じ視野の中の腫瘍と肝臓を含む４つの異なる平面で再び画像を撮影した。平均強度をＩｍａｇｅ Ｊによって分析した。この実験を、ＰＣ３ｐｉｐ同所性腫瘍を担持する４匹のヌードマウスにおいて繰り返した。
【0163】
組織学的解析
動物を３つのグループ：ＰＳＭＡ－ＮＢ（ｎ＝３）、プレーン－ＮＢ（ｎ＝３）、及び非コントラスト対照（ｎ＝３）に分けた。方法は発明者らの以前の研究と同じであった。マウスに、２００μＬの造影剤又はＰＢＳ単独のいずれかを尾静脈を介して投与した。造影剤注射の１０分後に、左心室を介して５０ｍＬのＰＢＳでＰＢＳ灌流を行った。灌流後、腫瘍及び肝臓を摘出し、最適な切断温度化合物（ＯＣＴ Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）に包埋した。組織を９μｍのスライスに切断し、次いで、ＣＤ３１染色を行い、腫瘍血管を可視化した。簡単に説明すると、組織をＰＢＳで３回洗浄し、０.５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）を含むタンパク質ブロッキング溶液とインキュベートした。次いで、組織を１：２５０希釈したＣＤ３１の一次抗体（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）中で、４℃で２４時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、組織をＡｌｅｘａ ５６８タグ付き二次抗体（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）と１時間インキュベートし、標準的な技術を用いてＤＡＰＩ（Ｖｅｃｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。次いで、蛍光画像をＬｅｉｃａ ＤＭ４０００Ｂ蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）で観察し、次いで、Ｉｍａｇｅ Ｊで解析した。
動物を３つのグループ：ＰＳＭＡ－ＮＢ（ｎ＝３）、プレーン－ＮＢ（ｎ＝３）、及び非コントラスト対照（ｎ＝３）に分けた。方法は発明者らの以前の研究と同じであった。マウスに、２００μＬの造影剤又はＰＢＳ単独のいずれかを尾静脈を介して投与した。造影剤注射の１０分後に、左心室を介して５０ｍＬのＰＢＳでＰＢＳ灌流を行った。灌流後、腫瘍及び肝臓を摘出し、最適な切断温度化合物（ＯＣＴ Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）に包埋した。組織を９μｍのスライスに切断し、次いで、ＣＤ３１染色を行い、腫瘍血管を可視化した。簡単に説明すると、組織をＰＢＳで３回洗浄し、０.５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）を含むタンパク質ブロッキング溶液とインキュベートした。次いで、組織を１：２５０希釈したＣＤ３１の一次抗体（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）中で、４℃で２４時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、組織をＡｌｅｘａ ５６８タグ付き二次抗体（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）と１時間インキュベートし、標準的な技術を用いてＤＡＰＩ（Ｖｅｃｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。次いで、蛍光画像をＬｅｉｃａ ＤＭ４０００Ｂ蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）で観察し、次いで、Ｉｍａｇｅ Ｊで解析した。
【0164】
結果
ＰＳＭＡ標的ＮＢ及びＬＵＭＡＳＯＮを用いた同所性前立腺腫瘍のコントラスト増強超音波イメージング
ＰＳＭＡ標的ＮＢ（２００μＬの３.９±０.２８２Ｘ１０１１／ｍＬのＰＳＭＡ標的ＮＢ）（ｎ＝１１）又はＬＵＭＡＳＯＮ（２００μＬの１～５Ｘ１０８／ｍＬのＬＵＭＡＳＯＮ ＭＢ）（ｎ＝３）の尾静脈注射後に、コントラストハーモニックイメージング（ＣＨＩ）画像を連続的に取得し（受信周波数１２ＭＨｚ）、腫瘍及び肝臓におけるバブルの動態を決定した。使用したＬＵＭＡＳＯＮ用量、ＰＳＭＡ標的ＮＢ用量、及びイメージングパラメータは、以前の研究で最適化した。これらの研究における非線形コントラストイメージングパラメータは、ＬＵＭＡＳＯＮ（３ＭＨｚ）のために臨床的で一般的に使用されるものよりも高い周波数を利用したことは注目に値する。これらは、ＬＵＭＡＳＯＮの動態パラメータには影響しないが、全体的な画質に影響を与える可能性がある。ＣＨＩモードでは、ＰＳＭＡ標的ＮＢ又はＬＵＭＡＳＯＮのいずれかの注射前に腫瘍及び肝臓は見えなかった（図１３Ａ）。急速な増強が、ＮＢ注射の約１５～３０秒後に始まり、最初に肝臓で観察され、続いて腫瘍で観察された。ＵＣＡ動態パラメータ（図１３Ｃ）を、時間強度曲線から得た（ＴＩＣ）（図１３Ｂ１、Ｂ２）。これらには、ピークまでの時間、ピーク強度、ハーフタイム、ウォッシュアウト面積及び曲線下面積（ＡＵＣ）が含まれる。これらのパラメータを、腫瘍と肝臓の両方におけるＰＳＭＡ標的ＮＢとＬＵＭＡＳＯＮとの間で比較した。ＬＵＭＡＳＯＮグループのグループサイズは比較的小さかったが、この試験で用いたイメージングパラメータにおけるＬＵＭＡＳＯＮグループとＰＳＭＡ標的ＮＢグループとの差は大きく、両グループ間で統計的有意差が認められた。これはまた、以前に出版された文献とも一致している。結果から、ピークまでの時間、ピーク強度、ハーフタイム、ウォッシュアウト及びＡＵＣの面積が、腫瘍内のＰＳＭＡ標的ＮＢとＬＵＭＡＳＯＮとで有意に（ｐ＜０.０５）異なり、最後の４つのパラメータは肝臓のＰＳＭＡ標的ＮＢとＬＵＭＡＳＯＮで有意に（ｐ＜０.０５）異なることが示された。上記の全ては、血流中のＬＵＭＡＳＯＮ ＭＢよりも発明者らのＰＳＭＡ標的ＮＢの方がより高い安定性とより長い循環時間を示した。
ＰＳＭＡ標的ＮＢ及びＬＵＭＡＳＯＮを用いた同所性前立腺腫瘍のコントラスト増強超音波イメージング
ＰＳＭＡ標的ＮＢ（２００μＬの３.９±０.２８２Ｘ１０１１／ｍＬのＰＳＭＡ標的ＮＢ）（ｎ＝１１）又はＬＵＭＡＳＯＮ（２００μＬの１～５Ｘ１０８／ｍＬのＬＵＭＡＳＯＮ ＭＢ）（ｎ＝３）の尾静脈注射後に、コントラストハーモニックイメージング（ＣＨＩ）画像を連続的に取得し（受信周波数１２ＭＨｚ）、腫瘍及び肝臓におけるバブルの動態を決定した。使用したＬＵＭＡＳＯＮ用量、ＰＳＭＡ標的ＮＢ用量、及びイメージングパラメータは、以前の研究で最適化した。これらの研究における非線形コントラストイメージングパラメータは、ＬＵＭＡＳＯＮ（３ＭＨｚ）のために臨床的で一般的に使用されるものよりも高い周波数を利用したことは注目に値する。これらは、ＬＵＭＡＳＯＮの動態パラメータには影響しないが、全体的な画質に影響を与える可能性がある。ＣＨＩモードでは、ＰＳＭＡ標的ＮＢ又はＬＵＭＡＳＯＮのいずれかの注射前に腫瘍及び肝臓は見えなかった（図１３Ａ）。急速な増強が、ＮＢ注射の約１５～３０秒後に始まり、最初に肝臓で観察され、続いて腫瘍で観察された。ＵＣＡ動態パラメータ（図１３Ｃ）を、時間強度曲線から得た（ＴＩＣ）（図１３Ｂ１、Ｂ２）。これらには、ピークまでの時間、ピーク強度、ハーフタイム、ウォッシュアウト面積及び曲線下面積（ＡＵＣ）が含まれる。これらのパラメータを、腫瘍と肝臓の両方におけるＰＳＭＡ標的ＮＢとＬＵＭＡＳＯＮとの間で比較した。ＬＵＭＡＳＯＮグループのグループサイズは比較的小さかったが、この試験で用いたイメージングパラメータにおけるＬＵＭＡＳＯＮグループとＰＳＭＡ標的ＮＢグループとの差は大きく、両グループ間で統計的有意差が認められた。これはまた、以前に出版された文献とも一致している。結果から、ピークまでの時間、ピーク強度、ハーフタイム、ウォッシュアウト及びＡＵＣの面積が、腫瘍内のＰＳＭＡ標的ＮＢとＬＵＭＡＳＯＮとで有意に（ｐ＜０.０５）異なり、最後の４つのパラメータは肝臓のＰＳＭＡ標的ＮＢとＬＵＭＡＳＯＮで有意に（ｐ＜０.０５）異なることが示された。上記の全ては、血流中のＬＵＭＡＳＯＮ ＭＢよりも発明者らのＰＳＭＡ標的ＮＢの方がより高い安定性とより長い循環時間を示した。
【0165】
ＬＵＭＡＳＯＮグループにおける腫瘍サイズは、２８０～５２０ｍｍ３であり、ＮＢグループの腫瘍サイズは９０～１１００ｍｍ３であった。ＬＵＭＡＳＯＮとＰＳＭＡ標的ＮＢの差が腫瘍サイズの結果ではないことを確実にするために、発明者らは、ＰＳＭＡ標的ＮＢグループを腫瘍サイズに基づいて２つのグループ：腫瘍体積が９０～６７０ｍｍ３のグループＡ（小さな腫瘍）と、腫瘍体積が６７０～１１００ｍｍ３のグループＢ（大きな腫瘍）に分け、ＬＵＭＡＳＯＮグループをこれら２つのグループと別々に比較した。それにもかかわらず、グループＡとグループＢの両方のパラメータは、ＬＵＭＡＳＯＮグループのパラメータと有意に異なっていた。発明者らの結果から、ＬＵＭＡＳＯＮのより低いピーク増強が腫瘍サイズと関係がないことを確認された。
【0166】
ＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢを用いた造影剤動態及び同所性前立腺腫瘍の比較
前立腺腫瘍に対するＰＳＭＡ標的ＮＢの選択的イメージング能を評価するために、非標的ＮＢを比較として使用した。両方のバブル製剤を用いたＵＳスキャンを同一条件下で実施し、ＰＣ３ｐｉｐ同所性腫瘍を担持する１１匹のヌードマウスの平均結果を報告した。最初に、ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍をＢモードで局在化させ、次いで、コントラストモードに切り替えた。腫瘍は、バブル注射前のコントラストモードでは見えなかった（図１４Ａ）。連続コントラストモードＵＳは、ＰＳＭＡ標的ＮＢ又は非標的ＮＢの静脈注射後の腫瘍におけるバブル動態を監視するために実施した。ピークまでの時間、ピーク強度、ハーフタイム、ウォッシュアウト面積及び曲線下面積（ＡＵＣ）を含む時間強度曲線（ＴＩＣ）から得たバブル動態（図１４Ｂ１）を、ＰＳＭＡ（＋）ＰＣ３ｐｉｐ同所性腫瘍におけるＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢの間で比較した（図１４Ｃ）。ＰＳＭＡ標的ＮＢと非標的ＮＢの間で、ピーク強度（ｐ＝０.０００１）、ハーフタイム（ｐ＝０.００５６）、ウォッシュアウト面積（ｐ＝０.００９２）及び曲線下面積（ｐ＜０.０００１）の有意差を測定した。非標的ＮＢ測定から得たＵＳシグナルを使用して、ＰＳＭＡ標的ＮＢからのシグナルを正規化した。正規化したＴＩＣは、ＰＳＭＡ標的ＮＢからの平均強度が、異なる時点で非標的ＮＢよりも常に高いことを示した（図１４Ｂ２）。この研究で使用した腫瘍サイズは９０～１１００ｍｍ３と様々であったため、発明者らはまた、動物を２つのコホート：グループＡ（小さな腫瘍、９０～６７０ｍｍ３、ｎ＝７）及びグループＢ（大きな腫瘍、６７０～１１００３ｍｍ、ｎ＝４）に分け、ＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢのパラメータを比較した。小さな腫瘍を有するグループＡでは、ピーク強度及び曲線下面積に有意差が認められた。大きな腫瘍を有するグループＢでは、ピーク強度、曲線下面積及びハーフタイムに有意差が見られた。個々のマウスのＴＩＣはまた、１１匹中１０匹のマウスにおいてＰＳＭＡ標的ＮＢと非標的ＮＢとの間で差異を示した。動物間の生存率は観察されたが、２つのグループ間の全体的な結果は類似していた。全体として、発明者らのデータから、血流中の非標的ＮＢのそれよりもＰＳＭＡ標的ＮＢの方が、安定性がより高く、循環時間がより長いことが示された。
前立腺腫瘍に対するＰＳＭＡ標的ＮＢの選択的イメージング能を評価するために、非標的ＮＢを比較として使用した。両方のバブル製剤を用いたＵＳスキャンを同一条件下で実施し、ＰＣ３ｐｉｐ同所性腫瘍を担持する１１匹のヌードマウスの平均結果を報告した。最初に、ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍をＢモードで局在化させ、次いで、コントラストモードに切り替えた。腫瘍は、バブル注射前のコントラストモードでは見えなかった（図１４Ａ）。連続コントラストモードＵＳは、ＰＳＭＡ標的ＮＢ又は非標的ＮＢの静脈注射後の腫瘍におけるバブル動態を監視するために実施した。ピークまでの時間、ピーク強度、ハーフタイム、ウォッシュアウト面積及び曲線下面積（ＡＵＣ）を含む時間強度曲線（ＴＩＣ）から得たバブル動態（図１４Ｂ１）を、ＰＳＭＡ（＋）ＰＣ３ｐｉｐ同所性腫瘍におけるＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢの間で比較した（図１４Ｃ）。ＰＳＭＡ標的ＮＢと非標的ＮＢの間で、ピーク強度（ｐ＝０.０００１）、ハーフタイム（ｐ＝０.００５６）、ウォッシュアウト面積（ｐ＝０.００９２）及び曲線下面積（ｐ＜０.０００１）の有意差を測定した。非標的ＮＢ測定から得たＵＳシグナルを使用して、ＰＳＭＡ標的ＮＢからのシグナルを正規化した。正規化したＴＩＣは、ＰＳＭＡ標的ＮＢからの平均強度が、異なる時点で非標的ＮＢよりも常に高いことを示した（図１４Ｂ２）。この研究で使用した腫瘍サイズは９０～１１００ｍｍ３と様々であったため、発明者らはまた、動物を２つのコホート：グループＡ（小さな腫瘍、９０～６７０ｍｍ３、ｎ＝７）及びグループＢ（大きな腫瘍、６７０～１１００３ｍｍ、ｎ＝４）に分け、ＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢのパラメータを比較した。小さな腫瘍を有するグループＡでは、ピーク強度及び曲線下面積に有意差が認められた。大きな腫瘍を有するグループＢでは、ピーク強度、曲線下面積及びハーフタイムに有意差が見られた。個々のマウスのＴＩＣはまた、１１匹中１０匹のマウスにおいてＰＳＭＡ標的ＮＢと非標的ＮＢとの間で差異を示した。動物間の生存率は観察されたが、２つのグループ間の全体的な結果は類似していた。全体として、発明者らのデータから、血流中の非標的ＮＢのそれよりもＰＳＭＡ標的ＮＢの方が、安定性がより高く、循環時間がより長いことが示された。
【0167】
異なる腫瘍サイズに基づく造影剤の動態と比較
腫瘍の大きさに応じてＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢの動態に明らかな変動性があるため、腫瘍を２つのグループ：腫瘍体積が９０～６７０ｍｍ３のグループＡ（ｎ＝７）、腫瘍体積が６７０～１１００ｍｍ３のグループＢ（ｎ＝４）に分けた。ＵＣＡ動態パラメータ（図１５Ｂ）は、時間強度曲線（ＴＩＣ）から得た（図１５Ａ）。腫瘍サイズが増加するにつれて、ピーク強度、ウォッシュアウト面積、及び曲線下の総面積は、グループＡとグループＢの間で有意に異なっていた（図１５Ｂ）。図１４Ａに示すように、グループＢではバブル注射後に腫瘍の一部が十分に満たされず、Ｂモードではシグナルが不均一であった。グループＡでは、シグナルはＢモードとコントラストモードの両方で比較的均一であった（図１３Ａ）。
腫瘍の大きさに応じてＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢの動態に明らかな変動性があるため、腫瘍を２つのグループ：腫瘍体積が９０～６７０ｍｍ３のグループＡ（ｎ＝７）、腫瘍体積が６７０～１１００ｍｍ３のグループＢ（ｎ＝４）に分けた。ＵＣＡ動態パラメータ（図１５Ｂ）は、時間強度曲線（ＴＩＣ）から得た（図１５Ａ）。腫瘍サイズが増加するにつれて、ピーク強度、ウォッシュアウト面積、及び曲線下の総面積は、グループＡとグループＢの間で有意に異なっていた（図１５Ｂ）。図１４Ａに示すように、グループＢではバブル注射後に腫瘍の一部が十分に満たされず、Ｂモードではシグナルが不均一であった。グループＡでは、シグナルはＢモードとコントラストモードの両方で比較的均一であった（図１３Ａ）。
【0168】
ＰＳＭＡ標的ＮＢは循環からのバブルクリアランス後に同所性前立腺腫瘍に保持される
バブル崩壊研究を、３００～８００ｍｍ３の大きさの同所性ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍を担持する４匹の追加マウスにおいて実施し、平均結果を図１６に報告した。図１６Ａの一連の画像は、肝臓に繰り返し加えられた高強度パルスによって循環中のバブルを崩壊させる前後のＣＨＩ画像を示した。増強の定量分析（図１６Ｂ）は、標的ＮＢを有するＰＣ３ｐｉｐ腫瘍においてクリアランス後のシグナルが４７.９±１８.６％減少したのに対し、腫瘍における非標的ＮＢでは７４.８±８.９％、肝臓では９２.２±２.４％であった。これらのデータは、ＰＳＭＡ標的ＮＢを用いて増強させた腫瘍において、非標的ＮＢと比較して有意に高いピーク増強を示した。最も重要なのは、関連する高強度パルスを介した循環ＮＢのクリアランス後に、ＰＳＭＡ標的ＮＢを用いて増強させた腫瘍におけるシグナル強度は、非標的ＮＢと比較して有意に高いままであった。これは、ＰＳＭＡ発現ＰＣａ細胞における有意なＮＢ保持を示唆している。腫瘍とは対照的に、肝臓におけるシグナル強度は、崩壊前のＰＳＭＡ標的ＮＢと非標的ＮＢの両方と類似しており、両方の薬剤のクリアランス後にほぼ完全に排除された。これらの研究における腫瘍領域は、（ＴＩＣを生成するために使用した腫瘍とは対照的に）一定の共振に曝されず、バブルエコー輝度をより長期間保持したことに留意することが重要である。これが、この実験で見られた標的ＮＢと非標的ＮＢの差を大きくさせた可能性が高い。このデータは、生きたマウスの循環からのＮＢのクリアランス後に、ＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍実質（おそらく腫瘍細胞内）におけるＰＳＭＡ標的ＮＢの有意な血管外保持を初めて示す。
バブル崩壊研究を、３００～８００ｍｍ３の大きさの同所性ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍を担持する４匹の追加マウスにおいて実施し、平均結果を図１６に報告した。図１６Ａの一連の画像は、肝臓に繰り返し加えられた高強度パルスによって循環中のバブルを崩壊させる前後のＣＨＩ画像を示した。増強の定量分析（図１６Ｂ）は、標的ＮＢを有するＰＣ３ｐｉｐ腫瘍においてクリアランス後のシグナルが４７.９±１８.６％減少したのに対し、腫瘍における非標的ＮＢでは７４.８±８.９％、肝臓では９２.２±２.４％であった。これらのデータは、ＰＳＭＡ標的ＮＢを用いて増強させた腫瘍において、非標的ＮＢと比較して有意に高いピーク増強を示した。最も重要なのは、関連する高強度パルスを介した循環ＮＢのクリアランス後に、ＰＳＭＡ標的ＮＢを用いて増強させた腫瘍におけるシグナル強度は、非標的ＮＢと比較して有意に高いままであった。これは、ＰＳＭＡ発現ＰＣａ細胞における有意なＮＢ保持を示唆している。腫瘍とは対照的に、肝臓におけるシグナル強度は、崩壊前のＰＳＭＡ標的ＮＢと非標的ＮＢの両方と類似しており、両方の薬剤のクリアランス後にほぼ完全に排除された。これらの研究における腫瘍領域は、（ＴＩＣを生成するために使用した腫瘍とは対照的に）一定の共振に曝されず、バブルエコー輝度をより長期間保持したことに留意することが重要である。これが、この実験で見られた標的ＮＢと非標的ＮＢの差を大きくさせた可能性が高い。このデータは、生きたマウスの循環からのＮＢのクリアランス後に、ＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍実質（おそらく腫瘍細胞内）におけるＰＳＭＡ標的ＮＢの有意な血管外保持を初めて示す。
【0169】
免疫組織化学分析
ＰＳＭＡ標的ＮＢが腫瘍マトリックスに溢出し得ることをさらに検証するために、バブルを蛍光色素Ｃｙ５.５で標識し、同所性ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍を担持する動物の新しいセットに注射した。注射の１０分後、循環バブル及び腫瘍を除去するために冷ＰＢＳによる心臓フラッシュ灌流手順をマウスに施し、組織分析のために腫瘍を摘出した。ＣＤ３１染色は、腫瘍血管を可視化するために使用した。血管及び細胞における蛍光を、１視野当たりのバブルシグナルを正規化するために使用した。組織像は、ＰＳＭＡ標的ＮＢグループのＣｙ５.５シグナルが腫瘍毛細血管の外側及び実質の深部で見出されたことを示し（図１７Ａ）、これはバブルの溢出及びその後の間質浸透の強力な証拠を提供した。ＰＳＭＡ標的ＮＢグループのＮＢ蛍光比（１視野当たりの全バブル蛍光／血管蛍光及び全バブル蛍光／細胞蛍光からの蛍光比の定量化）は、非標的ＮＢグループのそれよりも有意に高く（図２４Ｂ１、Ｂ２）、ＰＳＭＡ標的ＮＢが腫瘍に溢出できるだけでなく、腫瘍内に捕捉できることが確認された。
ＰＳＭＡ標的ＮＢが腫瘍マトリックスに溢出し得ることをさらに検証するために、バブルを蛍光色素Ｃｙ５.５で標識し、同所性ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍を担持する動物の新しいセットに注射した。注射の１０分後、循環バブル及び腫瘍を除去するために冷ＰＢＳによる心臓フラッシュ灌流手順をマウスに施し、組織分析のために腫瘍を摘出した。ＣＤ３１染色は、腫瘍血管を可視化するために使用した。血管及び細胞における蛍光を、１視野当たりのバブルシグナルを正規化するために使用した。組織像は、ＰＳＭＡ標的ＮＢグループのＣｙ５.５シグナルが腫瘍毛細血管の外側及び実質の深部で見出されたことを示し（図１７Ａ）、これはバブルの溢出及びその後の間質浸透の強力な証拠を提供した。ＰＳＭＡ標的ＮＢグループのＮＢ蛍光比（１視野当たりの全バブル蛍光／血管蛍光及び全バブル蛍光／細胞蛍光からの蛍光比の定量化）は、非標的ＮＢグループのそれよりも有意に高く（図２４Ｂ１、Ｂ２）、ＰＳＭＡ標的ＮＢが腫瘍に溢出できるだけでなく、腫瘍内に捕捉できることが確認された。
【0170】
この実施例の目標は、臨床的に関連する同所性モデルにおいてＰＳＭＡ（＋）ＰＣａを検出するための新規標的化ナノスケール超音波造影剤を製剤化することであった。側腹部腫瘍モデルにおける発明者らの以前の研究は、すでにＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢの動態を調べており、組織学的所見はＰＳＭＡ標的ＮＢがＰＳＭＡ発現を有する腫瘍を特異的に認識できることを確認した。この実施例では、同所性腫瘍のＰＳＭＡ標的ＮＢと非標的ＮＢとの間のピーク強度、ハーフタイム、ウォッシュアウト面積及び曲線下面積に有意差が認められた（図１４）。同所性腫瘍モデルから得られた結果を側腹部腫瘍モデルにおける以前の研究と比較すると、同所性ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍におけるＰＳＭＡ標的ＮＢと非標的ＮＢとの間のシグナル差は、側腹ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍におけるシグナル差よりも明らかではなかった。より具体的には、２つのモデル間のＰＳＭＡ－ＮＢについては総ＡＵＣが同等であったが、非標的ＮＢ ＡＵＣ及び特にウォッシュアウトＡＵＣは同所性モデルで増加した。ウェスタンブロット研究は、側腹部ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍及び同所性ＰＣ３ｐｉｐが同様のレベルのＰＳＭＡ発現を有することを示したので、その差はＰＳＭＡ発現の異なるレベルによるものではない。発明者らは、この差が、１）２つの腫瘍モデルにおける血管密度及び血管透過性の変動、並びに２）全体的な腫瘍量及び３）細胞密度及び中枢壊死の差の３つの要因の結果であり得ると仮定する。側腹部腫瘍と同所性腫瘍との間の腫瘍微小環境の違いは、これらの要因に影響を及ぼすことが知られている。具体的には、同所性ＰＣ３腫瘍は側腹部ＰＣ３腫瘍よりも血管容積及び透過性が高いことが報告されている。同所性腫瘍のより高い血管透過性は、増強した透過性及び保持（ＥＰＲ）効果によって、全てのナノバブルのより多くの溢出を可能にし得る。そのため、透過性の増強は、ＰＳＭＡ標的ＮＢ及び非標的ＮＢの両方の取り込みの増加につながる可能性がある。したがって、ＰＳＭＡ標的ＮＢと非標的ＮＢ蓄積との間の同所性腫瘍におけるＮＢ蓄積の差は、側腹部腫瘍モデルにおけるそれよりも小さい。これはまた、このモデル対側腹部腫瘍で見られる、より高い時間強度曲線下の全体面積（同所性モデルで１９３.７±６４.３８ｄＢ＊分に対して、側腹部モデルでは１３０.４±５０.１１ｄＢ＊分）と、非標的ＮＢのウォッシュアウトＡＵＣ（同所性モデルで１４９.５±５２.１９ｄＢ*分に対して、側腹部モデルでは１１６.５１±２５.６１ｂＢ＊分）によって反映される。壊死及び細胞密度がより高い場合、これはまた、全てのバブルのより大きな保持をもたらし、そのため、標的化されていないバブルのウォッシュアウトを低下させる。一般に、これらのモデルの間には多くの潜在的な差があり、ＴＩＣに特異的変化が生じる可能性がある。これは部分的には、ＮＢコントラスト増強超音波を使用することが腫瘍におけるナノ粒子輸送に関するいくつかの洞察を提供する可能性がある理由である。側腹部腫瘍の平均腫瘍サイズは約１２５ｍｍ３であるが、同所性腫瘍の平均腫瘍サイズは約５００ｍｍ３であった。大小のコホートへの腫瘍の層別化は、ピーク強度、ウォッシュアウト面積及び曲線下面積に有意差を示し（図１５）、腫瘍量も動態に影響を与える要因であることを示している。動物間でのばらつきも動物において観察した。個々の動物に正規化すると（図１４Ｂ２に示すように）、増強の差はより大きくなる。同所性腫瘍は側腹部腫瘍よりも異質である可能性が高いため、平均して差が低下する。
【0171】
この実施例では、バブル崩壊研究を用いて、循環バブルを崩壊させた後の腫瘍内のシグナルを検出し、ＰＳＭＡ標的ＮＢが非標的ＮＢよりも大きい程度に腫瘍内に保持されていることが示された（図１６）。加えて、発明者らのＮＢの動態と腫瘍分布は腫瘍のサイズ／病期によって異なることも発見した。小さな腫瘍と大きな腫瘍の組織学研究から、大きな腫瘍の中心が小さな腫瘍の中心よりも壊死性であることが判明した。
【0172】
標的リガンドのＰＳＭＡ－１は、ペプチドベースの高度に負に荷電したＰＳＭＡリガンドであり、臨床研究に使用でき、また容易に合成することができる。ＰＳＭＡを標的としたＮＢの平均直径は２７７±１１ｎｍであった。発明者らのＮＢのサイズが小さいほど、より大きなサイズのバブルよりも優れた腫瘍浸透を達成するはずである。粒子のサイズが小さいほど、マウス異種移植片腫瘍モデルにおけるナノ粒子の生体分布並びに透過性及び保持効果の増強を改善することが示されている。全体として、現在のデータは、１）ＰＳＭＡに対する高いアフィニティーリガンドで標識したエコー輝度ナノバブルは、インビボでかなり安定であり、臨床ＭＢと非標的ＮＢとの間の動態に大きな差を示すこと；２）ＮＢは、異なるサイズの腫瘍において別個の動態及び保持を有するように見えることを示唆している。これは、同じ薬剤を使用して腫瘍を病期分類し、潜在的に等級付けする手段として、将来の研究の有望な領域であり得る。
【0173】
実施例３
この実施例は、膜及び／又はシェル組成の正確な調整を示し、ナノバブルサイズ及び音響パルスシーケンスは、所与の超音波周波数及び圧力において優れたナノバブル挙動を惹起することができる。サイズ分布範囲が狭いナノバブルの音響応答は、その膜殻構造によって変わり得ることが判明した（図２）。膜組成物を、グリセロール及びプロピレングリコール（ＰＧ）の含有によって調節した。ＰＧは、脂質膜の流動性を増加させることが示されているが、グリセロールはシェルの硬化をもたらす。この実験を行うために、Ｃ３Ｆ８ガスコアを有するＮＢを前述のように製剤化した。簡単に説明すると、ＤＢＰＣ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００及びグリセロールを含む脂質のカクテルをＰＧ及びＰＢＳに溶解し、その後、機械的攪拌によるガス交換及び活性化を行った。多分散性が低いＮＢを、遠心分離による分離、及び４００ｎｍ膜による濾過を介して調製した。ＰＢＳ中のＮＢ溶液の検出可能な非線形応答の開始のシェル依存性及び圧力依存性は、７４ｋＰａ～８５７ｋＰａ（ＭＩ＝０.０３～０.３５）の圧力で、コントラストハーモニックモード（Ｔｏｓｈｉｂａ Ａｐｌｉｏ ＸＧ，１２ＭＨｚ）でＵＳを使用して決定した。図２に示すように、ＰＧで構成されるより柔軟なシェルとリン脂質のカクテルを有するバブルは、活性の開始に必要な有意に低い圧力を示した（イメージング視野内のシグナル強度によって測定される）。これらのバブルは、より低い圧力（１２３ｋＰａ～２４５ｋＰａ）で検出可能な非線形応答の開始を示した。硬いＮＢ分散液のＵＳ画像は、圧力上昇が３４３ｋＰａから４６５ｋＰａに最小で６％のシグナル増加、及び４６５ｋＰａから７１０ｋＰａへの１４６％の大幅な増加を示した。
この実施例は、膜及び／又はシェル組成の正確な調整を示し、ナノバブルサイズ及び音響パルスシーケンスは、所与の超音波周波数及び圧力において優れたナノバブル挙動を惹起することができる。サイズ分布範囲が狭いナノバブルの音響応答は、その膜殻構造によって変わり得ることが判明した（図２）。膜組成物を、グリセロール及びプロピレングリコール（ＰＧ）の含有によって調節した。ＰＧは、脂質膜の流動性を増加させることが示されているが、グリセロールはシェルの硬化をもたらす。この実験を行うために、Ｃ３Ｆ８ガスコアを有するＮＢを前述のように製剤化した。簡単に説明すると、ＤＢＰＣ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００及びグリセロールを含む脂質のカクテルをＰＧ及びＰＢＳに溶解し、その後、機械的攪拌によるガス交換及び活性化を行った。多分散性が低いＮＢを、遠心分離による分離、及び４００ｎｍ膜による濾過を介して調製した。ＰＢＳ中のＮＢ溶液の検出可能な非線形応答の開始のシェル依存性及び圧力依存性は、７４ｋＰａ～８５７ｋＰａ（ＭＩ＝０.０３～０.３５）の圧力で、コントラストハーモニックモード（Ｔｏｓｈｉｂａ Ａｐｌｉｏ ＸＧ，１２ＭＨｚ）でＵＳを使用して決定した。図２に示すように、ＰＧで構成されるより柔軟なシェルとリン脂質のカクテルを有するバブルは、活性の開始に必要な有意に低い圧力を示した（イメージング視野内のシグナル強度によって測定される）。これらのバブルは、より低い圧力（１２３ｋＰａ～２４５ｋＰａ）で検出可能な非線形応答の開始を示した。硬いＮＢ分散液のＵＳ画像は、圧力上昇が３４３ｋＰａから４６５ｋＰａに最小で６％のシグナル増加、及び４６５ｋＰａから７１０ｋＰａへの１４６％の大幅な増加を示した。
【0174】
制御可能な圧力閾値は、バブルの非線形応答に基づくコントラスト増強法に対する潜在的な利点を有する。これらの技術の１つは、圧力振幅の異なる２つのパルスが組織に送られる振幅変調である。一方のパルスは、通常、他方のパルスの２倍の振幅を有する。シグナルは受信時にスケーリングされ、減算される。組織の線形応答のために、組織からのシグナルはキャンセルされ、唯一の残りのシグナルはバブルからのものである。そのため、組織に対するコントラスト（ＣＴＲ）が増す。圧力閾値未満のパルスを送り、増強の閾値を上回るパルスを送ると、ＣＴＲが大幅に増加する。フレキシブルシェルの適用は、増強のためのより小さな圧力を生じさせ、より高い散乱断面をもたらし、そのため、イメージング目的のためにより良い結果をもたらす。より硬いシェルの適用は、圧力をより高い値に歪ませるため、より高い圧力が要求される強化された加熱適用のような治療目的により適している。さらに、プレフォーカルＮＢの振動振幅はごくわずかであり、一部の超音波トランスデューサの急峻な圧力勾配を利用することで、プレフォーカルバブルの減衰を大幅に減らすことができる。そのため、標的の共振ＮＢに十分なエネルギーを送達することは、増強した加熱効果により効率的に寄与する。さらに、オフ標的領域における望ましくない加熱は、オフ共振バブルのために最小限に抑えられる。最後に、このタイプのアプローチは、高強度集束超音波及びヒストトリプシーについて報告されているいわゆる「アブスコパル効果」を介して抗腫瘍誘発免疫を惹起するのにより効果的であることも期待される。
【0175】
要約すると、特異的シェル組成物を有するＴＮＴ適用バブルは、１）一般的な活性化圧力を低下させ、かつ２）必要な調整可能で予見可能な感圧挙動を示し、かつ３）細胞媒介性エンドサイトーシス及び細胞内小胞内での長期滞留を可能にする。これが、従来のマイクロバブル媒介性細胞破壊と比較して、この技術を特有にしている理由である。
【0176】
実施例４
この実施例は、ＰＳＭＡ－１リガンドを有するＮＢを標的とすることが、ＰＳＭＡ発現ＰＣ３ｐｉｐ細胞への結合及びＰＣ３ｐｉｐ腫瘍における高い蓄積を選択的に増加させたことを実証するインビトロ細胞取り込み研究及びインビボ実験の結果を示す。発明者らは、蓄積したＰＳＭＡ標的ＮＢを治療的ＵＳと組み合わせると、細胞内爆発を介してＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍組織を選択的に損傷させると仮定する。
この実施例は、ＰＳＭＡ－１リガンドを有するＮＢを標的とすることが、ＰＳＭＡ発現ＰＣ３ｐｉｐ細胞への結合及びＰＣ３ｐｉｐ腫瘍における高い蓄積を選択的に増加させたことを実証するインビトロ細胞取り込み研究及びインビボ実験の結果を示す。発明者らは、蓄積したＰＳＭＡ標的ＮＢを治療的ＵＳと組み合わせると、細胞内爆発を介してＰＳＭＡ陽性ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍組織を選択的に損傷させると仮定する。
【0177】
ＮＢの調製と特性評価
ナノバブル用の脂質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、プロピレングリコール（ＰＧ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）に６：１：２：１の比率で１，２－ジベヘノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．，Ｐｅｌｈａｍ，ＡＬ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート；ＤＰＰＡ、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－蛍光体エタノールアミン；ＤＰＰＥ（Ｃｏｒｄｅｎ Ｐｈａｒｍａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００]（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ ２０００、Ｌａｙｓａｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｒａｂ，ＡＬ）を溶解させ、８０℃で加熱及び超音波処理することによって調製した。８０℃に予熱したグリセロール（Ｇｌｙ，Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）とリン酸緩衝液（０.８ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ、ｐＨ７.４）の混合物を加え、室温で１０分間超音波処理した。溶液（１ｍＬ）を３ｍＬのヘッドスペースバイアルに移し、ゴムセプタム及びアルミニウムシールで蓋をした。空気をオクタフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎｓ，ＬＬＣ，ＰＡ）ガスに置換し、４５秒間のＶｉａｌＭｉｘシェーカー（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ,ＭＡ）による機械的振盪によって活性化した。ナノバブルを、ヘッドスペースバイアルを反転させた状態で、５０ｒｃｆで５分間遠心分離することによってマイクロバブルから分離し、１００μＬのＮＢ溶液を２１Ｇ針で底部から５ｍｍの固定距離から抜き出した。
ナノバブル用の脂質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、プロピレングリコール（ＰＧ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）に６：１：２：１の比率で１，２－ジベヘノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．，Ｐｅｌｈａｍ，ＡＬ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート；ＤＰＰＡ、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－蛍光体エタノールアミン；ＤＰＰＥ（Ｃｏｒｄｅｎ Ｐｈａｒｍａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００]（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ ２０００、Ｌａｙｓａｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｒａｂ，ＡＬ）を溶解させ、８０℃で加熱及び超音波処理することによって調製した。８０℃に予熱したグリセロール（Ｇｌｙ，Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）とリン酸緩衝液（０.８ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ、ｐＨ７.４）の混合物を加え、室温で１０分間超音波処理した。溶液（１ｍＬ）を３ｍＬのヘッドスペースバイアルに移し、ゴムセプタム及びアルミニウムシールで蓋をした。空気をオクタフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎｓ，ＬＬＣ，ＰＡ）ガスに置換し、４５秒間のＶｉａｌＭｉｘシェーカー（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ,ＭＡ）による機械的振盪によって活性化した。ナノバブルを、ヘッドスペースバイアルを反転させた状態で、５０ｒｃｆで５分間遠心分離することによってマイクロバブルから分離し、１００μＬのＮＢ溶液を２１Ｇ針で底部から５ｍｍの固定距離から抜き出した。
【0178】
ＰＳＭＡ－ＮＢを、初期脂質溶液にＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＰＳＭＡ－１（２５μｇ／ｍｌ）を添加し、上記のプロトコルに従って調製した。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＰＳＭＡ－１を調製するために、ＰＳＭＡ－１（Ｊａｍｅｓ Ｂａｓｉｌｉｏｎ教授の研究室より）を、ｐＨ８.０のＰＢＳ中１：２の比率でＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００－マレイミド]、Ｌａｙｓａｎ Ｂｉｏ，Ａｒａｂ，ＡＬ］と混合した。合わせた後、混合物を十分にボルテックスし、４℃で、バイアル回転板上で４時間反応させた。生成物を凍結乾燥し、得られた粉末をＰＢＳに溶解し、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＰＳＭＡ－１原液を得た。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＰＳＭＡ－１のコンジュゲーションを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びＭＡＬＤＩ ＴＯＦ法によって確認した。ＨＰＬＣを、ＳＰＤ－２０ＡプロミネンスＵＶ／可視検出器を搭載したＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣシステムにて実施し、波長２２０ｎｍで監視した。分析ＨＰＬＣを、流速１.０ｍＬ／分で分析用Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２） １００Ａカラム（２５０ｍｍ×４.６ｍｍ×５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いて実施した。使用した勾配は、２０分間にわたって０.１％ＴＦＡに対して１０％～４０％アセトニトリルであった。
【0179】
ＮＢのサイズ分布及び濃度を、先の１～２に説明したように、共振質量測定（Ａｒｃｈｉｍｅｄｅｓ（登録商標）、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で特徴付けた。１０００個の粒子を測定した後に測定を終了させた。データをＡｒｃｈｉｍｅｄｅｓソフトウェア（バージョン１.２）からエクスポートし、正数と負数について分析した１。希釈したＮＢ溶液（５００Ｘ）の表面電荷をＡｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｌｉｔｅｓｉｚｅｒ ５００で測定した。
【0180】
手順
図１８は、マウスにＰＳＭＡ－ＮＢを投与し、共振させるための手順の概略を示す。手順には以下のものが含まれる。
図１８は、マウスにＰＳＭＡ－ＮＢを投与し、共振させるための手順の概略を示す。手順には以下のものが含まれる。
【0181】
２００μＬの標的ＰＳＭＡ－ＮＢを、マウスＭ１、Ｍ２及びＭ３、Ｍ４）の二重腫瘍マウスに尾静脈を介して注射する。
【0182】
３０分後に、Ｍ１及びＭ３マウスのＰＣ３ｐｉｐ腫瘍に対してＴＵＳを適用する。
【0183】
また、３０分後に、Ｍ２及びＭ４マウスのＰＣ３ｆｌｕ腫瘍に対してＴＵＳを適用する。
【0184】
対照マウスについて、ＰＢＳを注射し、３０分後に、ＰＣ３ｐｉｐとＰＣ３ｆｌｕ腫瘍の両方に対してＴＵＳを適用する。パラメータ：ＴＵＳ治療；５分間、３ＭＨｚ，２.２Ｗ／ｃｍ２／１０ ＤＣ（小型プローブ）。
【0185】
治療の２４時間後に、腫瘍を切除し、組織診断に進む。
【0186】
ＴＵＮＥＬアッセイを用いてアポトーシスを分析する。
【0187】
グループ１－ＰＳＭＡ－ＮＢ注射及び３０分後に、ＰＣ３ｐｉｐ腫瘍（Ｍ１及びＭ３）に対してＴＵＳを適用する。
【0188】
グループ２－ＰＳＭＡ－ＮＢ注射及び３０分後に、ＰＣ３ｆｌｕ腫瘍（Ｍ２及びＭ４）に対してＴＵＳを適用する。
【0189】
グループ３－ＰＢＳ注射及び３０分後に、ＰＣ３ｐｉｐ及びＰＣ３ｆｌｕ腫瘍（Ｍ５）に対してＴＵＳを適用する。
【0190】
図１９は、ＰＳＭＡ発現腫瘍を、１０％デューティーサイクル、３ＭＨｚ、２.２Ｗ／ｃｍ２での５分間の超音波と組み合わせてＰＳＭＡ標的ナノバブルで治療した場合に、治療後２４時間で顕著なアポトーシスが見られたことを示す。同じ治療をＰＳＭＡ陰性腫瘍に適用した場合に、アポトーシスはほとんど又はまったく見られなかった。これは、受容体媒介性エンドサイトーシスを介して腫瘍細胞に内部移行したナノバブルのみが顕著な毒性効果を有していたことを示唆している。
【0191】
図２０は、ＰＳＭＡ陽性又はＰＳＭＡ陰性腫瘍を、１０％デューティーサイクル、３ＭＨｚ、５分間の超音波のみ（バブルなし）で治療した場合に、アポトーシスがほとんど又は全く見られなかったことを示す。これは、超音波と組み合わせたナノバブルのみが毒性作用を有することを示唆している。バブルのみ（超音波なし）でも効果は見られなかった。このデータは示さず。
【0192】
図２１及び図２２は、ＰＳＭＡ－ＮＢで治療したＰＳＭＡ発現腫瘍を示し、ＴＵＳは、他の全てのグループと比較して細胞死で顕著なアポトーシスを示した。アポトーシスは、ＲＯＩ選択のためのＤＡＰＩの約３３（３３.５５±１.１０）％である。
【0193】
本発明の上記の説明から、当業者は、改善、変更、及び修正を認めるであろう。当業者によるそのような改善、変更、及び修正は、添付の特許請求の範囲によってカバーされることが意図される。本願において引用される全ての参考文献、刊行物、及び特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2】
【図3A】
【図3b】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B-9C】
【図9D】
【図9E-F】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【国際調査報告】