(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-25
(54)【発明の名称】肝硬変の治療のための銅クラスター及び組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 33/34 20060101AFI20230418BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230418BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20230418BHJP
A61K 47/61 20170101ALI20230418BHJP
A61K 47/62 20170101ALI20230418BHJP
【ＦＩ】
A61K33/34
A61P1/16
A61K47/54
A61K47/61
A61K47/62
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022555679
(86)(22)【出願日】2020-11-19
(85)【翻訳文提出日】2022-11-14
(86)【国際出願番号】 CN2020130028
(87)【国際公開番号】W WO2021184807
(87)【国際公開日】2021-09-23
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/079505
(32)【優先日】2020-03-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521313935
【氏名又は名称】武漢広行科学研究有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＷＵＨＡＮ ＶＡＳＴ ＣＯＮＤＵＣＴ ＳＣＩＥＮＣＥ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ５０６， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １， Ｏｐｔｉｃｓ Ｖａｌｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ， Ｎｏ． ３８８ Ｇａｏｘｉｎ ２ｎｄ Ｒｏａｄ， Ｄｏｎｇｈｕ Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ Ｗｕｈａｎ， Ｈｕｂｅｉ ４３００７０ （ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】スゥン、タオレイ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076AA16
4C076BB11
4C076CC21
4C076CC41
4C076DD56
4C076DD60
4C076EE37
4C076EE41
4C076EE59
4C086AA01
4C086AA02
4C086HA01
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA16
4C086MA21
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA75
(57)【要約】
本発明は、対象における肝硬変を治療するためのリガンド結合銅クラスター（ＣｕＣ）および前記リガンド結合ＣｕＣを含む組成物の使用を提供する。本発明は、さらに対象における肝硬変を治療するための医薬の製造のためのリガンド結合銅クラスター（ＣｕＣ）の使用を提供する。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
肝硬変を有する対象を治療するためのリガンド結合銅クラスター（ＣｕＣ）の使用であって、前記リガンド結合ＣｕＣが、銅コアと、
前記銅コアに結合して前記リガンド結合銅クラスター（ＣｕＣ）を形成するリガンドと、
を含む、使用。
【請求項2】
前記銅コアは、直径が０．５～５ｎｍである、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記銅コアは、直径が０．５～３ｎｍである、請求項１に記載の使用。
【請求項4】
前記リガンドが、チミン、チミン修飾ヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである、請求項１に記載の使用。
【請求項5】
前記Ｌ－システインとその誘導体は、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして前記Ｄ－システインとその誘導体は、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる、請求項４に記載の使用。
【請求項6】
前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド、またはシステイン含有テトラペプチドである、請求項４に記載の使用。
【請求項7】
前記システイン含有ジペプチドは、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
前記システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－リシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる、請求項６に記載の使用。
【請求項9】
前記システイン含有テトラペプチドは、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる、請求項６に記載の使用。
【請求項10】
前記その他のチオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、およびドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる、請求項４に記載の使用。
【請求項11】
対象における肝硬変を治療するための医薬の製造におけるリガンド結合銅クラスター（ＣｕＣ）の使用であって、前記リガンド結合ＣｕＣが、銅コアと、
前記銅コアに結合して前記リガンド結合銅クラスター（ＣｕＣ）を形成するリガンドと、
を含む、使用。
【請求項12】
前記銅コアは、直径が０．５～５ｎｍである、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
前記銅コアは、直径が０．５～３ｎｍである、請求項１１に記載の使用。
【請求項14】
前記リガンドは、チミン、チミン修飾ヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである、請求項１１に記載の使用。
【請求項15】
前記Ｌ－システインとその誘導体は、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして前記Ｄ－システインとその誘導体は、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる、請求項１４に記載の使用。
【請求項16】
前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド、またはシステイン含有テトラペプチドである、請求項１４に記載の使用。
【請求項17】
前記システイン含有ジペプチドは、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる、請求項１６に記載の使用。
【請求項18】
前記システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－リシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる、請求項１６に記載の使用。
【請求項19】
前記システイン含有テトラペプチドは、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる、請求項１６に記載の使用。
【請求項20】
前記その他のチオール含有化合物が、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、およびドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、リガンド結合銅クラスター（ＣｕＣｓ）、リガンド結合ＣｕＣｓを含む組成物、およびそれらの肝硬変の治療のための使用に関する。本発明は、さらに、肝硬変の治療のためのリガンド結合ＣｕＣｓおよび組成物の使用方法に関する。
【背景技術】
【0002】
肝臓は、ヒト体内の最大の固形臓器であり、凝固、酸素輸送、および免疫系を補助する血液タンパク質の製造、過剰の栄養素の貯蔵および一部の栄養素の血流への返送、食品を消化するための胆汁の製造、グリコーゲンとしての糖（グルコース）の体における蓄積の補助、薬物およびアルコールを含む血流中の有害物質からの生体保護、および飽和脂肪の分解とコレステロールの生成、を含む多くの重要な機能を実行する。
【0003】
肝硬変は、肝臓に対する長期間の連続的損傷により長年にわたって進行していく、緩徐進行性疾患である。肝硬変の進行と共に、健康な肝臓組織は徐々に破壊され、瘢痕組織に置き換われる。瘢痕組織は、肝臓を通過する血液の流れを遮断し、栄養、ホルモン、薬物および天然毒素を処理する肝臓の能力を低下させる。また、肝臓によって作られたタンパク質および他の物質の生成を減少させる。肝硬変は、最終的に、肝臓移植が必要とする肝不全および／または肝臓癌につながる可能性がある。
【0004】
肝硬変の初期段階では、肝臓補償機能が強いため、明らかな症状はない。後期において、症状は、肝臓機能障害、門脈圧亢進、上部消化管出血、肝性脳症、二次感染、脾臓機能亢進、腹水、癌化および他の合併症を含む。肝硬変は、漸進的な肝臓の変形および硬化から生じる。組織病理学的には、肝硬変は、広範な肝細胞壊死、残留肝細胞の結節状再生、結合組織の過形成および線維性中隔の生成を特徴とし、肝小葉構造の破壊および偽小葉の形成をもたらす。
【0005】
肝硬変にはさまざまな原因がある。肝硬変を有する一部の人々の肝臓損傷は１つ以上の原因によるものである。肝硬変の一般的な原因は、長期間のアルコール乱用、Ｂ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルスの重複感染、脂肪性肝疾患、毒性金属、遺伝子疾患、栄養障害、工業性毒物、麻薬、循環障害、代謝障害、胆汁うつ滞、住血吸虫症などを含む。
【0006】
肝硬変は、多くの検査／技術により診断することができる。例えば、血液検査において、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を含む肝臓酵素及びビリルビンのレベルが増加し、血液タンパク質のレベルが減少する場合、肝硬変を示唆し得る。
【0007】
現在、治療は、その原因に対処することによって肝硬変の進行を遅延させることができるが、肝硬変のための特定の処置は存在しない。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、肝硬変を有する対象の治療のためのリガンド結合銅クラスター（ＣｕＣ）の使用であって、前記リガンド結合ＣｕＣが、銅コアと、前記銅コアに結合して前記リガンド結合銅クラスター（ＣｕＣ）を形成するリガンドと、を含む、使用を提供する。
【0009】
前記治療用途の特定の実施形態では、前記銅コアは、直径が０．５～５ｎｍである。特定の実施形態では、前記銅コアは、直径が０．５～３ｎｍである。
【0010】
前記治療用途の特定の実施形態では、前記リガンドは、チミン、チミン修飾ヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである。
【0011】
前記治療用途の特定の実施形態では、前記Ｌ－システインとその誘導体は、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして前記Ｄ－システインとその誘導体は、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる。
【0012】
前記治療用途の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド、またはシステイン含有テトラペプチドである。
【0013】
前記治療用途の特定の実施形態では、前記システイン含有ジペプチドは、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－（Ｄ）Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる。
【0014】
前記治療用途の特定の実施形態では、前記システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－リシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる。
【0015】
前記治療用途の特定の実施形態では、前記システイン含有テトラペプチドは、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる。
【0016】
前記治療用途の特定の実施形態では、前記その他のチオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、およびドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる。
【0017】
本発明は、また、対象における肝硬変を治療するための医薬の製造におけるリガンド結合銅クラスター（ＣｕＣ）の使用であって、前記リガンド結合ＣｕＣが、銅コアと、前記銅コアに結合して前記リガンド結合銅クラスター（ＣｕＣ）を形成するリガンドと、を含む、使用を提供する。
【0018】
前記製造用途の特定の実施形態では、前記銅コアは、直径が０．５～５ｎｍである。特定の実施形態では、前記銅コアは、直径が０．５～３ｎｍである。
【0019】
前記製造用途の特定の実施形態では、前記リガンドは、チミン、チミン修飾ヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである。
【0020】
前記製造用途の特定の実施形態では、前記Ｌ－システインとその誘導体は、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして前記Ｄ－システインとその誘導体が、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる。
【0021】
前記製造用途の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド、またはシステイン含有テトラペプチドである。
【0022】
前記製造用途の特定の実施形態では、前記システイン含有ジペプチドは、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる。
【0023】
前記製造用途の特定の実施形態では、前記システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－リシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる。
【0024】
前記製造用途の特定の実施形態では、前記システイン含有テトラペプチドは、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる。
【0025】
前記製造用途の特定の実施形態では、前記その他のチオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、およびドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる。
【0026】
本発明の目的および利点は、添付の図面に関連するその好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0027】
次に、本発明による好ましい実施形態を、同様の参照番号が同様の要素を示す図を参照して説明する。
【0028】
【図1】Ｌ－ＧＳＨ－ＣｕＣの同定データを示す。（Ａ）ＧＳＨ－ＣｕＣの典型的な透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。（Ｂ）ＴＥＭ画像から算出されたＧＳＨ－ＣｕＣのサイズ分布である。（Ｃ）ＧＳＨ－ＣｕＣにおけるＣｕ（０）の２ｐ３／２および２ｐ１／２電子のＸ線光電子分光（ＸＰＳ）スペクトルである。（Ｄ）ＧＳＨ－ＣｕＣ（上）とＧＳＨ（下）とのフーリエ変換赤外線（ＦＴ－ＩＲ）分光の比較である。（Ｅ）ＧＳＨ－ＣｕＣの蛍光励起（左）および発光スペクトル（右）である。
【0029】
【図2】１）空白対照群、２）モデル群、３）ソラフェニブで治療した陽性群、４）Ｃｕ－１低用量群、５）Ｃｕ－１高用量群、６）Ｃｕ－２低用量群、および７）Ｃｕ－２高用量群を示す、肝硬変モデルマウスにおける血清中の（Ａ）ＡＬＴ、（Ｂ）ＡＳＴ、（Ｃ）ＴＢＩＬ、（Ｄ）ＭＡＯおよび（Ｅ）ＡＬＢレベルに対する様々な用量のＢ－０１およびＢ－０２の効果を示す棒グラフである。
【0030】
【図3】（Ａ）空白対照群、（Ｂ）モデル群、（Ｃ）陽性対照群、（Ｄ）Ｃｕ－１低用量群、（Ｅ）Ｃｕ－１高用量群のＨＥ染色画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明は、以下の本発明の特定の実施形態に対する詳細な説明を参照することによって、より容易に理解することができる。
【0032】
本出願全体において、刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が適用する技術の現状をより十分に説明するために、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
【0033】
リガンド結合銅クラスターは、二つから数百の銅原子からなる銅コアと、リガンドとから構成される。前記リガンドは、前記リガンド結合銅クラスター分子の一部として、銅コアに結合し、溶液において安定的なリガンド結合銅クラスターを形成する。銅原子の低いコントラストのため、ＴＥＭにより極めて正確な銅コアのサイズを提供することが困難である。一般的には、ＴＥＭにより測定されたリガンド結合銅クラスターにおける銅コアのサイズが、０．５～５ｎｍの範囲にあると思われる。
【0034】
本発明は、一つまたは複数のリガンドが銅コアに結合した、リガンド結合銅クラスター（ＣｕＣｓ）を提供する。前記リガンドと銅コアとの結合とは、リガンドが、共有結合、水素結合、静電気力、疎水性力（hydrophobic force）、ファンデルワールス力等を介して銅コアと溶液中で安定している複合体を形成することを意味する。特定の実施形態では、前記銅コアの直径が、０．５～５ ｎｍであり、好ましくは０．５～３ ｎｍの範囲にあり、より好ましくは０．５～２．５ｎｍの範囲にある。
【0035】
特定の実施形態では、前記リガンドは、チミン、チミン修飾ヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、及び、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン等のその他のシステイン誘導体；システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体（Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等の、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない）；及び１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン及びドデシルメルカプタンのうちの一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物を含むが、これらに限定されない。
【0036】
異なるサイズを有するリガンド結合ＣｕＣｓは、文献に記載の方法により製造されることができる（Ｄｅｎｇ ２０１８、Ｊｉａ ２０１３；Ｗａｎｇ ２０１３）。
【0037】
本発明は、肝硬変を有する対象を治療するための組成物を提供する。特定の実施形態では、前記組成物は、リガンド結合銅クラスター（ＣｕＣｓ）と、薬理学的に許容される賦形剤と、を含む。特定の実施形態では、前記賦形剤は、リン酸緩衝液、または、生理食塩水である。特定の実施形態では、前記対象は、人である。特定の実施形態では、前記対象は、犬のようなペット動物である。
【0038】
本発明は、対象における肝硬変の治療のための医薬の製造における上文で開示されたリガンド結合ＣｕＣｓの使用を提供する。
【0039】
本発明は、対象における肝硬変の治療のための上文で開示されたリガンド結合ＣｕＣｓの使用、または上文で開示されたリガンド結合ＣｕＣｓを使用して対象における肝硬変を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、前記治療方法は、前記対象に薬学的に有効な量のリガンド結合ＣｕＣｓを投与することを含む。前記薬学的に有効な量は、通常の体内研究によって確認することができる。
【0040】
以下の実施例は、本発明の原理を説明することのみを目的として提供されている。それらは、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【0041】
実施形態
【0042】
実施形態１． ＴＭＨＡを有するＴＭＨＡ修飾ＣｕＣｓの合成
【0043】
１０ｍＬのＴＭＨＡ（ＤＳが１０．５%）溶液（０．１ｍＭ、ｐＨ７．０）を徐々に３７℃まで加熱して、ＴＭＨＡを溶解した。２ｍＬのＣｕＳＯ４（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）溶液を滴下し、遮光しながらさらに３７℃で２０分間反応させた。ＵＶ光照射（３６５ｎｍ）で、明るいオレンジ色の発光がはっきりと見られ、発光ＴＭＨＡ修飾ＣｕＣｓの合成に成功したことを示した。最後に、使用まで、得られた溶液を４℃で遮光保存した。球形ＴＭＨＡ修飾ＣｕＣｓの銅コアは、直径が０．５～３ｎｍの範囲にあり、平均直径が１．６４±０．４８ｎｍであった。
【0044】
実施形態２． 異なるリガンドを有するリガンド結合ＣｕＣｓの合成および同定
【0045】
２．１ Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）結合銅クラスター（Ｌ－ＧＳＨ－ＣｕＣｓ）の合成
【0046】
５０ｍＬの水にグルタチオン（ＧＳＨ）５００ｍｇを加え、ゆっくり攪拌しながら５ｍＭのＣｕ（ＮＯ３）２溶液２０ｍＬをＧＳＨ溶液に加え、速やかに白色懸濁液が形成された。混合液を５０～６０℃に徐々に加熱し、２０分間加熱し続け、溶液が淡黄色で透明になるまで１ＭのＮａＯＨ溶液を滴下した。生成物を室温まで冷却し、数倍の体積のエタノールを加えることで生成物を沈殿させ、３回繰り返した。
【0047】
２．２ Ｌ－システイン結合銅クラスターの合成
【0048】
５０ｍＬの１０ｍＭのＣｕＣｌ２を、新鮮に調製したＬ－システイン（５０ｍＬ、１０ｍＭ）溶液に、激しく撹拌しながら、１滴ずつ徐々に加えた。約３０分後、０．５ｍＬのＮａＯＨ（１Ｍ）を１滴ずつ徐々に上記溶液に加えた。２時間反応を続けた。生成物は８０００ｒｐｍで２０分間遠心され、上澄み液を採取して４℃で遮光保存した。
【0049】
２．３ ＰＥＧ結合銅クラスターの合成
【0050】
室温で２．５ｇのＰＥＧ－ＳＨ（分子量２０００または５０００）を１００ｍｌの超純水に溶解させ、激しく攪拌しながら、４ｍＬの０．５ＭのＣｕ（ＮＯ３）２溶液を１滴ずつ滴下して加えた。混合液を色が引いて徐々に乳白色になるまで室温で一時攪拌した。上記ゲルを徐々に８０℃に加熱し、１５分間保持した。溶液が透明になるまで３ＭのＮａＯＨ溶液を滴下した。生成物を８０００ｒｐｍで２０分間遠心され、最終的に得られた生成物を凍結乾燥機で凍結乾燥して固体サンプルを得た。
【0051】
２．４ その他のリガンドを有するリガンド結合銅クラスターの合成
【0052】
その他のリガンドを有するリガンド結合銅クラスターも、上記方法により合成されることができ、その具体的な合成方法は、いくつかの溶媒と操作を少し変更する必要がある。その他のリガンドは、チミン、Ｌ（Ｄ）－システイン、及び、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン等のその他のシステイン誘導体；システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体（Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等の、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない）；及び１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン及びドデシルメルカプタンのうちの一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物を含むが、これらに限定されない。
【0053】
２．５ リガンド結合銅クラスターの同定
【0054】
以下、Ｌ－ＧＳＨ－ＣｕＣｓの同定データを例として示す。
【0055】
１）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるモーフォロジーの観察
【0056】
試験粉末（ＧＳＨ－ＣｕＣｓサンプル）を超純水に２ｍｇ／Ｌになるまで溶解してサンプルとし、そして懸滴法により試験サンプルを製造した。より具体的に、５μＬのサンプルを銅メッシュに滴下し、水滴がなくなるまで自然蒸発させ、そしてＪＥＭ－２１００Ｆ ＳＴＥＭ／ＥＤＳ電界放出形高分解能ＴＥＭによりサンプルのモーフォロジーを観察した。
【0057】
図１のパネルＡとパネルＢはＧＳＨ－ＣｕＣｓの典型的なＳＥＭ画像を示し、異なるＴＥＭ画像からそれらのサイズ分布を算出した。その結果、ＧＳＨ－ＣｕＣｓは良好な分散性を有し、そのサイズは０．５～５．０ｎｍの範囲にあった。
【0058】
２）Ｘ線光電子分光法
【0059】
ＥＳＣＡＬＡＢ ２５０Ｘｉ Ｘ線光電子分光器でＸ線光電子分光（ＸＰＳ）を測定した。両面導電接着テープ（３ｍｍ×３ｍｍ）をアルミ箔に貼り付け、試験粉末を両面テープに均一に塗布し、アルミ箔で覆った。サンプルは圧力８ＭＰａで１分間保持した。表面の残留粉末を除去した後、中心サンプル（１ｍｍ×１ｍｍ）を切り出してＸＰＳテストを行った。
【0060】
図１のパネルＣは、ＧＳＨ－ＣｕＣｓ中の銅元素のＸＰＳスペクトルである。二つのピークはそれぞれ９３１．９８ｅＶと９５１．８８ｅＶに現れ、これは銅の２ｐ３／２と２ｐ１／２電子の結合エネルギーに起因する。９４２．０ｅＶ付近にＣｕの２ｐ３／２サテライトピークがなかったため、Ｃｕ（ＩＩ）電子が存在しないことが証明された。Ｃｕ（０）の結合エネルギーとＣｕ（Ｉ）の結合エネルギーとの差は０．１ｅＶしかないため、Ｃｕ（Ｉ）の形成を排除することはできず、また、得られたＧＳＨ－ＣｕＣｓでは銅の価数が０と+１の間にある可能性が高い。
【0061】
３） フーリエ変換赤外線（ＦＴ－ＩＲ）分光法
【0062】
ＰｅｒｋｉｎＥｌｅｍｅｒ ＬＳ ５５蛍光分光器でＦＴ－ＩＲスペクトルを測定した。試験粉末を超純水に溶解し、室温で測定した。スキャン範囲は２００－８００ｎｍで、サンプルセルは標準石英試験管で、光路は１ｃｍであった。
【0063】
図１のパネルＤはＧＳＨ－ＣｕＣｓ（上）とＧＳＨ（下）のＦＴ－ＩＲスペクトルの比較を示している。ＧＳＨはＣＯＯＨ－（１３９０と１５００ｃｍ－１）、ＮＨ２基のＮ－Ｈ伸縮（３４１０ｃｍ－１）、Ｎ－Ｈ屈曲（１６１０ｃｍ－１）という複数の特徴的な赤外波長域を示す。２５０３ｃｍ－１で観察されたピークはＳ－Ｈ伸縮振動モードに帰属できる。Ｓ－Ｈ伸縮振動帯（２５０３ｃｍ－１）を除いて、ＧＳＨ－ＣｕＣｓはすべて対応する赤外特性を持っている。その結果から、Ｓ－Ｈ結合が切断され、ＧＳＨ分子はＣｕ－Ｓ結合の形成によって銅コアの表面に結合することが分かった。
【0064】
４）蛍光分光法
【0065】
試験粉末を超純水に溶解し、室温で蛍光分光法により測定した。
【0066】
図１のＥ図に示すように、３６５ｎｍでの励起ピーク下で、ＧＳＨ－ＣｕＣは、５９５ｎｍでピークがあり、対応する半値全幅（ＦＷＨＭ）が約８０ｎｍである赤色発光を示した。なお、凝集誘起発光が増強されるため、エタノールを溶液に加えるとＧＳＨ－ＣｕＣｓのＦＬ強度が著しく向上した。また、大きなストークス変位（２３０ｎｍ）は蛍光プローブ及びバイオグラフィーのための良好な見込みを示した。
【0067】
実施形態３
【0068】
３．１ 材料および動物
【0069】
３．１．１ 試験サンプル
【0070】
Ｃｕ－０１： ＧＳＨ修飾銅クラスター（Ｌ－ＧＳＨ－ＣｕＣｓ）、０．５～５ｎｍである。
【0071】
Ｃｕ－０２： システイン修飾銅クラスター（Ｌ－Ｃｙｓ－ＣｕＣｓ）、０．５～５ｎｍである。
【0072】
全ての試験サンプルは、上記の方法に従って調製されたがわずかな変更を加えた。それらの品質は上記の方法を使用して特徴づけられた。
【0073】
３．１．２ 陽性対照サンプル
【0074】
ソラフェニブ（Sorafenib）。
【0075】
３．１．３ 実験用動物および群分け
【0076】
７０匹の、６～８週齢で、体重１６～２０ｇのＳＰＦ雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスは、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｈｕａｆｕｋａｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（Ｊｉｎｇ）２０１９－０００８）から購入された。体重によって、それらを７の群（ｎ＝１０）（空白対照群、モデル群、陽性対照群、Ｃｕ－１低用量群、Ｃｕ－１高用量群、Ｃｕ－２低用量群、Ｃｕ－２高用量群）にランダムに分けた。
【0077】
３．２ モデリング・プロトコル
【0078】
空白対照群を除いて、その他の群におけるマウスの肝硬変モデルは、四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘導処理の方法により製造された。モデリング・プロトコルは、以下の通りであった。（１）それぞれのマウスは、週２回、合計８週間で、体重１ｇあたり７μＬの１０％ ＣＣｌ４（オリーブ油で希釈したもの）を腹腔内注射し、空白対照群のマウスは、同じ量のオリーブ油溶媒を腹腔内注射した。（２）６週目から、２匹のマウスを選択し、そして毎週の最後の注射４８時間後に処刑した。肝臓の外観を観察した。外観が肝硬変の特性と一致した後（８週目）、肝臓組織をホルマリンで固定した。ＨＥ染色およびマッソン染色（Masson staining）を使用して、肝硬変のモデルを評価した。
【0079】
３．３ 投与
【0080】
モデリングが成功した後、陽性対照群におけるマウスに、胃内で２５ｍｇ／ｋｇソラフェニブを投与し、低用量または高用量の群のＣｕ－１およびＣｕ－２におけるマウスに、腹腔内注射により、それぞれ、２．５または１０ｍｇ／ｋｇの対応の試験材を投与した。そして、空白対照群およびモデル群におけるマウスに、腹腔内注射により、１０ｍＬ／ｋｇで生理食塩水を投与した。前記投与は、１日１回、２０日間連続した。
【0081】
３．４ 生化学的検査
【0082】
投与が完了した後、血液をマウスの眼窩から採取し、そして、Ｚｈｏｎｇｓｈｅｎｇ Ｂｅｉｋｏｎｇキットおよび生化学分析装置（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を用いて、アルブミン（ＡＬｂｕｍｉｎ、ＡＬＢ）、全ビリルビン（ＴＢｉｌ）、アラニンアラニンアミノトランスフェラ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびモノアミンオキシダー（ＭＡＯ）の生化学的検査のために、血清を得た。検出方法は、キットの指示に従って厳密に行った。
【0083】
【0084】
３．５ 病理学的検査
【0085】
３．５．１ ＨＥ染色
【0086】
安楽死後、マウス肝臓組織サンプルを４％パラホルムアルデヒド固定剤で４８時間以上固定した。固定後、肝臓サンプルをアルコール系列で脱水し、キシレンおよびエタノールで処理した。次いで、肝臓組織をワックス中に浸漬し、包埋した。包埋した材料がトリミングされ、付着、修復された後、パラフィンミクロトームで肝臓組織を４μｍの厚さで薄切した。ＨＥ染色の主な過程は以下の通りであった。オーブン中で６５℃でベーキングした後、切片をキシレンで処理し、エタノール系列で脱水した。切片をヘマトキシリン、青色発色性溶液（blue color-enhancing solution）および０．５％エオシンで順次染色し、次いでエタノール系列およびキシレンで処理し、中性ガムで密封した。顕微鏡で肝臓組織の線維症を観察した。
【0087】
３．５．２ マッソン染色
【0088】
ベーキング後、マウス肝臓組織切片を脱ロウし、脱水した。染色後、核をＲｅｇａｕｄ氏ヘマトキシリン染色溶液で染色した。水で洗浄した後、切片をＭａｓｓｏｎ氏ポンソー赤色酸性フクシン（Masson's Ponceau Red Acidic Fuchsin）で染色し、切片を２％氷酢酸水溶液に浸漬し、１％ホスホモリブデン酸溶液で分化させた。アニリンブルーまたは淡緑色溶液で直接染色した後、切片を０．２％氷酢酸水溶液に少し浸漬し、その後９５％アルコール、無水アルコールおよびキシレンで透明化させ、次いで中性ガムで密封した。顕微鏡で肝臓組織を観察した。
【0089】
３．６ 実験結果
【0090】
３．６．１ 成功したモデリング
【0091】
モデル群におけるマウスの肝臓は、増殖した繊維性隔壁により、異なるサイズの丸形または楕円形の塊に分割した。血清中のＡＬＴ、ＴＢｉｌ、およびＡＳＴ指数は空白対照群のものと比較して有意に増加し、血清中のＡＬＢは空白対照群と比較して有意に減少し、ＭＡＯ指数は対照群と有意差はなかったが、その値も増加した。上記すべての結果は、この実験モデルが成功したことを示唆している。
【0092】
３．６．２ アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、全ビリルビン（ＴＢｉｌ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）およびアルブミン（ＡＬＢ）に対する試験薬物の効果
【0093】
図２Ａに示すように、空白対照群と比較して、モデル群のＡＬＴ活性が極めて有意に増加し（４３．５±８．１Ｕ／Ｌから１８８．５±４．９Ｕ／Ｌに増加した；Ｐ＜０．０１）、モデル群マウスの肝臓機能が病理学的変化を有していることを示す。モデル群と比較して、低用量および高用量のＣｕ－１およびＣｕ－２（最低値は３７．０±５．７Ｕ／Ｌ、最高値は３８．６±５．６Ｕ／Ｌであった）、並びに陽性対照群（４２．８±５．４Ｕ／Ｌ）は、ＡＬＴ活性を空白対照群のレベルに有意に減少した（Ｐ＜０．０１）。
【0094】
図２Ｂに示すように、空白対照群と比較して、モデル群のＡＳＴ活性が有意に増加した（１４１．８±１３．５Ｕ／Ｌから１９２．０±１１．３Ｕ／Ｌに増加した；Ｐ＜０．０５）。高用量のＣｕ－１およびＣｕ－２の投与は、それぞれ、ＡＳＴ活性を１４６．３±８．４Ｕ／Ｌまたは１４４．３±８．１Ｕ／Ｌに有意に減少することができ、これらが空白対照群と同様のレベル（１４１．８±１３．５Ｕ／Ｌ）であるが、モデル群よりも有意に低い（Ｐ＜０．０１）。陽性対照群も、ＡＳＴ活性を減少することもできるが（１６５．５±１１．６Ｕ／Ｌ；Ｐ＜０．０５）、減少幅が高用量群のＣｕ－１およびＣｕ－２よりも低い。
【0095】
図２Ｃに示すように、モデル群のＴＢｉｌ濃度は、空白対照群よりも有意に高くなった（１．０２±０．２０μｍｏｌ／Ｌから２．９１±０．３９μｍｏｌ／Ｌに増加した；Ｐ＜０．０１）。モデル群と比較して、低用量および高用量のＣｕ－１およびＣｕ－２の投与は、血清中のＴＢＩＬレベルを有意に減少することができ（最高値は１．１６±０．３０μｍｏｌ／Ｌ、最低値は１．０８±０．０８μｍｏｌ／Ｌであった；Ｐ＜０．０１）、これらは、空白対照群に近い（１．０２±０．２０μｍｏｌ／Ｌ；Ｐ＜０．０１）。
【0096】
図２Ｄに示すように、モデル群のＭＡＯ活性（２１．５±０．７Ｕ／Ｌ）は、空白対照群（１８．８±２．９Ｕ／Ｌ）よりも高いが、統計学的に有意な差がなく、四塩化炭素により誘導された肝硬変マウスにおけるＭＡＯ活性指標の変化が明らかでなかったと示した。しかしながら、モデル群と比較して、高用量のＣｕ－１およびＣｕ－２は、血清中のＭＡＯ活性を１７．３±１．５Ｕ／Ｌ（Ｐ＜０．０１）または（１８．３±２．１Ｕ／Ｌ；Ｐ＜０．０５）に有意に減少し、その効果が陽性対照群よりも優れた。
【0097】
図２Ｅに示すように、モデル群のＡＬＢレベル（２４．２±０．６ ｇ／Ｌ）は、空白対照群（２２．１±１．３ ｇ／Ｌ）よりも有意に低くなり（Ｐ＜０．０５）、四塩化炭素処理が血清中のＡＬＢレベルを有意に減少できることを示した。しかしながら、Ｃｕ－１およびＣｕ－２は、血清中のＡＬＢレベルに有意な影響を与えなかった。
【0098】
以上の結果から、銅クラスター（ＣｕＣｓ）は用量依存的にＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＢＩＬおよびＭＡＯレベルを低下させ、マウスの肝機能が回復されたことが示唆され、その効果は少なくともある指標において陽性対照薬物より優れた。
【0099】
３．６．３ 病理学的分析
【0100】
肝硬変は、肝臓組織の線維症および偽小葉の形成を病理学的な特徴とする。ＨＥ染色病理学的分析の結果は、図３Ａに示すように、明瞭な構造を有し、肝小葉が完全で、肝細胞がきれいに配列され、中心静脈を中心として放射状に配列され、肝細胞の核が正常で、門脈域（catchment area）中の少量の繊維状組織のみを有していたことを示した。図３Ｂに示すように、モデル群の肝臓組織では、肝細胞が乱れ、バルーン状の構造が現れ、肝小葉がほとんど消失し、偽小葉（図３Ｂには右向きの矢印で示す）が多く生成され、肝組織に多くの増殖した原線維が存在し、丸型または楕円形の繊維性隔壁（図３Ｂには左向きの矢印で示す）が形成された。図３Ｃに示すように、モデル対照群と比較して、陽性対照群は肝臓損傷の有意な減少を示し、肝細胞は明らかに整然な配列を有し、線維過形成は明らかに減少し、繊維性隔壁を形成することなく、偽小葉が消失したが、正常な肝臓組織と比較して、陽性対照群の肝臓組織は細胞間ギャップの明らかな増加を示した（下向きの矢印によって示されている）。モデル対照群と比較して、銅クラスター薬物（Ｃｕ－１およびＣｕ－２）を投与した２つの群は、線維過形成および偽小葉の明らかな減少により証明されるように、肝細胞が肝臓損傷から有意に回復したこと、および回復がある程度の用量依存性を示すことを示した。
【0101】
図３Ｄおよび図３Ｅは、肝臓損傷の回復について、例示的なＣｕ－１の低用量および高用量薬物投与の効果をそれぞれ示したＨＥ画像を示す。図３Ｄに示すように、Ｃｕ－１低用量薬物投与群は、肝細胞が比較的整然に配列され、偽小葉がほとんど消失し、線維過形成が明らかに減少したが、正常な肝臓組織と比較して、ある程度の肝細胞間ギャップの増加を示した（図３Ｄの下向きの矢印で示す）。図３Ｅに示されるように、Ｃｕ－１の低用量薬物投与群と比較して、Ｃｕ－１の高用量薬物投与群では、肝臓損傷が減少し、偽小葉が完全に消失し、線維過形成が確認されることなく、肝細胞間ギャップの識別可能な増加がなく、正常な肝臓組織と明らかな差異がないという点においてより良い効果を示した。結論として、Ａ－０１薬物は、陽性対照薬物よりも肝臓損傷の回復に優れた効果を示した。
【0102】
マッソン染色の結果は、ＨＥ染色の結果と同じ結論を提供した。
【0103】
Ｃｕ－２薬物もＣｕ－１薬物と同様の効果を示し、詳細な説明は必要ではない。
【0104】
以上をまとめると、Ｃｕ－１およびＣｕ－２試験薬物は、肝臓の繊維および肝臓の偽小葉を有意に減少させた。肝臓機能指標の試験結果はまた、肝臓機能の回復を示した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および全ビリルビン（ＴＢｉｌ）の変化は最も明らかであった。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびモノアミノオキシダーゼ（ＭＡＯ）も有意に回復され、一方、アルブミン（ＡＬＢ）に有意な変化はなかった。２つの試験薬物は、肝硬変マウスにおいて肝臓機能および肝臓の病理学的構造を有意に改善することができ、そして銅クラスターの全体的な効果は、陽性対照薬物ソラフェニブよりも優れた。将来のさらなる適用のための実験的根拠を提供する。
【0105】
その他のサイズのＬ－Ｃｙｓ－ＣｕＣｓおよびＬ－ＧＳＨ－ＣｕＣｓ、および異なるサイズのその他のリガンド結合ＣｕＣｓも同様の効果を有し、一方、それらの効果はある程度ことなる。ここでは詳細に説明しない。
【0106】
本発明を特定の実施形態を参照して説明したが、実施形態は例示的なものであり、本発明の範囲はそのように限定されないことが理解されるであろう。本発明の別の実施形態は、本発明が関係する当業者には明らかになるであろう。このような代替実施形態は、本発明の範囲内に包含されると考えられる。従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定され、前述の説明によって支持される。
参照文献
Deng H.H. et al. An ammonia－based etchant for attaining copper nanoclusters with green fluorescence emission. Nanoscale, 2018, 10, 6467.
Jia X. et al. Cu Nanoclusters with Aggregation Induced Emission Enhancement. Small, 2013, DOI: 10.1002/smll.201300896.
Wang C. and Huang Y. GREEN ROUTE TO PREPARE BIOCOMPATIBLE AND NEAR INFRARED THIOLATE－PROTECTED COPPER NANOCLUSTERS FOR CELLULAR IMAGING. NANO: Brief Reports and Reviews. 2013, 8(5): 1350054 (10 pages).
参照文献
Deng H.H. et al. An ammonia－based etchant for attaining copper nanoclusters with green fluorescence emission. Nanoscale, 2018, 10, 6467.
Jia X. et al. Cu Nanoclusters with Aggregation Induced Emission Enhancement. Small, 2013, DOI: 10.1002/smll.201300896.
Wang C. and Huang Y. GREEN ROUTE TO PREPARE BIOCOMPATIBLE AND NEAR INFRARED THIOLATE－PROTECTED COPPER NANOCLUSTERS FOR CELLULAR IMAGING. NANO: Brief Reports and Reviews. 2013, 8(5): 1350054 (10 pages).
【図1】
【図2】
【図3】
【手続補正書】
【提出日】2022-11-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
肝硬変を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、リガンド結合銅クラスター（ＣｕＣ）を含み、前記リガンド結合ＣｕＣが、銅コアと、
前記銅コアに結合して前記リガンド結合銅クラスター（ＣｕＣ）を形成するリガンドと、
を含む、医薬組成物。
【請求項2】
前記銅コアは、直径が０．５～５ｎｍである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記銅コアは、直径が０．５～３ｎｍである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記リガンドが、チミン、チミン修飾ヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記Ｌ－システインとその誘導体は、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして前記Ｄ－システインとその誘導体は、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド、またはシステイン含有テトラペプチドである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記システイン含有ジペプチドは、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－リシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記システイン含有テトラペプチドは、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記その他のチオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、およびドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる、請求項４に記載の医薬組成物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、リガンド結合銅クラスター（ＣｕＣｓ）、リガンド結合ＣｕＣｓを含む組成物、およびそれらの肝硬変の治療のための使用に関する。
【背景技術】
【0002】
肝臓は、ヒト体内の最大の固形臓器であり、凝固、酸素輸送、および免疫系を補助する血液タンパク質の製造、過剰の栄養素の貯蔵および一部の栄養素の血流への返送、食品を消化するための胆汁の製造、グリコーゲンとしての糖（グルコース）の体における蓄積の補助、薬物およびアルコールを含む血流中の有害物質からの生体保護、および飽和脂肪の分解とコレステロールの生成、を含む多くの重要な機能を実行する。
【0003】
肝硬変は、肝臓に対する長期間の連続的損傷により長年にわたって進行していく、緩徐進行性疾患である。肝硬変の進行と共に、健康な肝臓組織は徐々に破壊され、瘢痕組織に置き換われる。瘢痕組織は、肝臓を通過する血液の流れを遮断し、栄養、ホルモン、薬物および天然毒素を処理する肝臓の能力を低下させる。また、肝臓によって作られたタンパク質および他の物質の生成を減少させる。肝硬変は、最終的に、肝臓移植が必要とする肝不全および／または肝臓癌につながる可能性がある。
【0004】
肝硬変の初期段階では、肝臓補償機能が強いため、明らかな症状はない。後期において、症状は、肝臓機能障害、門脈圧亢進、上部消化管出血、肝性脳症、二次感染、脾臓機能亢進、腹水、癌化および他の合併症を含む。肝硬変は、漸進的な肝臓の変形および硬化から生じる。組織病理学的には、肝硬変は、広範な肝細胞壊死、残留肝細胞の結節状再生、結合組織の過形成および線維性中隔の生成を特徴とし、肝小葉構造の破壊および偽小葉の形成をもたらす。
【0005】
肝硬変にはさまざまな原因がある。肝硬変を有する一部の人々の肝臓損傷は１つ以上の原因によるものである。肝硬変の一般的な原因は、長期間のアルコール乱用、Ｂ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルスの重複感染、脂肪性肝疾患、毒性金属、遺伝子疾患、栄養障害、工業性毒物、麻薬、循環障害、代謝障害、胆汁うつ滞、住血吸虫症などを含む。
【0006】
肝硬変は、多くの検査／技術により診断することができる。例えば、血液検査において、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を含む肝臓酵素及びビリルビンのレベルが増加し、血液タンパク質のレベルが減少する場合、肝硬変を示唆し得る。
【0007】
現在、治療は、その原因に対処することによって肝硬変の進行を遅延させることができるが、肝硬変のための特定の処置は存在しない。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、肝硬変を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、リガンド結合銅クラスター（ＣｕＣ）を含み、前記リガンド結合ＣｕＣが、銅コアと、前記銅コアに結合して前記リガンド結合銅クラスター（ＣｕＣ）を形成するリガンドと、を含む、医薬組成物を提供する。
【0009】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記銅コアは、直径が０．５～５ｎｍである。特定の実施形態では、前記銅コアは、直径が０．５～３ｎｍである。
【0010】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記リガンドは、チミン、チミン修飾ヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである。
【0011】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記Ｌ－システインとその誘導体は、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして前記Ｄ－システインとその誘導体は、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる。
【0012】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド、またはシステイン含有テトラペプチドである。
【0013】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有ジペプチドは、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－（Ｄ）Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる。
【0014】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－リシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる。
【0015】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有テトラペプチドは、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる。
【0016】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記その他のチオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、およびドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる。
【0017】
本発明の目的および利点は、添付の図面に関連するその好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
次に、本発明による好ましい実施形態を、同様の参照番号が同様の要素を示す図を参照して説明する。
【0019】
【図1】Ｌ－ＧＳＨ－ＣｕＣの同定データを示す。（Ａ）ＧＳＨ－ＣｕＣの典型的な透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。（Ｂ）ＴＥＭ画像から算出されたＧＳＨ－ＣｕＣのサイズ分布である。（Ｃ）ＧＳＨ－ＣｕＣにおけるＣｕ（０）の２ｐ３／２および２ｐ１／２電子のＸ線光電子分光（ＸＰＳ）スペクトルである。（Ｄ）ＧＳＨ－ＣｕＣ（上）とＧＳＨ（下）とのフーリエ変換赤外線（ＦＴ－ＩＲ）分光の比較である。（Ｅ）ＧＳＨ－ＣｕＣの蛍光励起（左）および発光スペクトル（右）である。
【0020】
【図2】１）空白対照群、２）モデル群、３）ソラフェニブで治療した陽性群、４）Ｃｕ－１低用量群、５）Ｃｕ－１高用量群、６）Ｃｕ－２低用量群、および７）Ｃｕ－２高用量群を示す、肝硬変モデルマウスにおける血清中の（Ａ）ＡＬＴ、（Ｂ）ＡＳＴ、（Ｃ）ＴＢＩＬ、（Ｄ）ＭＡＯおよび（Ｅ）ＡＬＢレベルに対する様々な用量のＢ－０１およびＢ－０２の効果を示す棒グラフである。
【0021】
【図3】（Ａ）空白対照群、（Ｂ）モデル群、（Ｃ）陽性対照群、（Ｄ）Ｃｕ－１低用量群、（Ｅ）Ｃｕ－１高用量群のＨＥ染色画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本発明は、以下の本発明の特定の実施形態に対する詳細な説明を参照することによって、より容易に理解することができる。
【0023】
本出願全体において、刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が適用する技術の現状をより十分に説明するために、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
【0024】
リガンド結合銅クラスターは、二つから数百の銅原子からなる銅コアと、リガンドとから構成される。前記リガンドは、前記リガンド結合銅クラスター分子の一部として、銅コアに結合し、溶液において安定的なリガンド結合銅クラスターを形成する。銅原子の低いコントラストのため、ＴＥＭにより極めて正確な銅コアのサイズを提供することが困難である。一般的には、ＴＥＭにより測定されたリガンド結合銅クラスターにおける銅コアのサイズが、０．５～５ｎｍの範囲にあると思われる。
【0025】
本発明は、一つまたは複数のリガンドが銅コアに結合した、リガンド結合銅クラスター（ＣｕＣｓ）を提供する。前記リガンドと銅コアとの結合とは、リガンドが、共有結合、水素結合、静電気力、疎水性力（hydrophobic force）、ファンデルワールス力等を介して銅コアと溶液中で安定している複合体を形成することを意味する。特定の実施形態では、前記銅コアの直径が、０．５～５ ｎｍであり、好ましくは０．５～３ ｎｍの範囲にあり、より好ましくは０．５～２．５ｎｍの範囲にある。
【0026】
特定の実施形態では、前記リガンドは、チミン、チミン修飾ヒアルロン酸（ＴＭＨＡ）、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、及び、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン等のその他のシステイン誘導体；システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体（Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等の、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない）；及び１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン及びドデシルメルカプタンのうちの一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物を含むが、これらに限定されない。
【0027】
異なるサイズを有するリガンド結合ＣｕＣｓは、文献に記載の方法により製造されることができる（Ｄｅｎｇ ２０１８、Ｊｉａ ２０１３；Ｗａｎｇ ２０１３）。
【0028】
本発明は、肝硬変を有する対象を治療するための組成物を提供する。特定の実施形態では、前記組成物は、リガンド結合銅クラスター（ＣｕＣｓ）と、薬理学的に許容される賦形剤と、を含む。特定の実施形態では、前記賦形剤は、リン酸緩衝液、または、生理食塩水である。特定の実施形態では、前記対象は、人である。特定の実施形態では、前記対象は、犬のようなペット動物である。
【0029】
本発明は、対象における肝硬変の治療のための医薬の製造における上文で開示されたリガンド結合ＣｕＣｓの使用を提供する。
【0030】
本発明は、対象における肝硬変の治療のための上文で開示されたリガンド結合ＣｕＣｓの使用、または上文で開示されたリガンド結合ＣｕＣｓを使用して対象における肝硬変を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、前記治療方法は、前記対象に薬学的に有効な量のリガンド結合ＣｕＣｓを投与することを含む。前記薬学的に有効な量は、通常の体内研究によって確認することができる。
【0031】
以下の実施例は、本発明の原理を説明することのみを目的として提供されている。それらは、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【0032】
実施形態
【0033】
実施形態１． ＴＭＨＡを有するＴＭＨＡ修飾ＣｕＣｓの合成
【0034】
１０ｍＬのＴＭＨＡ（ＤＳが１０．５%）溶液（０．１ｍＭ、ｐＨ７．０）を徐々に３７℃まで加熱して、ＴＭＨＡを溶解した。２ｍＬのＣｕＳＯ４（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）溶液を滴下し、遮光しながらさらに３７℃で２０分間反応させた。ＵＶ光照射（３６５ｎｍ）で、明るいオレンジ色の発光がはっきりと見られ、発光ＴＭＨＡ修飾ＣｕＣｓの合成に成功したことを示した。最後に、使用まで、得られた溶液を４℃で遮光保存した。球形ＴＭＨＡ修飾ＣｕＣｓの銅コアは、直径が０．５～３ｎｍの範囲にあり、平均直径が１．６４±０．４８ｎｍであった。
【0035】
実施形態２． 異なるリガンドを有するリガンド結合ＣｕＣｓの合成および同定
【0036】
２．１ Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）結合銅クラスター（Ｌ－ＧＳＨ－ＣｕＣｓ）の合成
【0037】
５０ｍＬの水にグルタチオン（ＧＳＨ）５００ｍｇを加え、ゆっくり攪拌しながら５ｍＭのＣｕ（ＮＯ３）２溶液２０ｍＬをＧＳＨ溶液に加え、速やかに白色懸濁液が形成された。混合液を５０～６０℃に徐々に加熱し、２０分間加熱し続け、溶液が淡黄色で透明になるまで１ＭのＮａＯＨ溶液を滴下した。生成物を室温まで冷却し、数倍の体積のエタノールを加えることで生成物を沈殿させ、３回繰り返した。
【0038】
２．２ Ｌ－システイン結合銅クラスターの合成
【0039】
５０ｍＬの１０ｍＭのＣｕＣｌ２を、新鮮に調製したＬ－システイン（５０ｍＬ、１０ｍＭ）溶液に、激しく撹拌しながら、１滴ずつ徐々に加えた。約３０分後、０．５ｍＬのＮａＯＨ（１Ｍ）を１滴ずつ徐々に上記溶液に加えた。２時間反応を続けた。生成物は８０００ｒｐｍで２０分間遠心され、上澄み液を採取して４℃で遮光保存した。
【0040】
２．３ ＰＥＧ結合銅クラスターの合成
【0041】
室温で２．５ｇのＰＥＧ－ＳＨ（分子量２０００または５０００）を１００ｍｌの超純水に溶解させ、激しく攪拌しながら、４ｍＬの０．５ＭのＣｕ（ＮＯ３）２溶液を１滴ずつ滴下して加えた。混合液を色が引いて徐々に乳白色になるまで室温で一時攪拌した。上記ゲルを徐々に８０℃に加熱し、１５分間保持した。溶液が透明になるまで３ＭのＮａＯＨ溶液を滴下した。生成物を８０００ｒｐｍで２０分間遠心され、最終的に得られた生成物を凍結乾燥機で凍結乾燥して固体サンプルを得た。
【0042】
２．４ その他のリガンドを有するリガンド結合銅クラスターの合成
【0043】
その他のリガンドを有するリガンド結合銅クラスターも、上記方法により合成されることができ、その具体的な合成方法は、いくつかの溶媒と操作を少し変更する必要がある。その他のリガンドは、チミン、Ｌ（Ｄ）－システイン、及び、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン等のその他のシステイン誘導体；システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体（Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等の、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない）；及び１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン及びドデシルメルカプタンのうちの一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物を含むが、これらに限定されない。
【0044】
２．５ リガンド結合銅クラスターの同定
【0045】
以下、Ｌ－ＧＳＨ－ＣｕＣｓの同定データを例として示す。
【0046】
１）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるモーフォロジーの観察
【0047】
試験粉末（ＧＳＨ－ＣｕＣｓサンプル）を超純水に２ｍｇ／Ｌになるまで溶解してサンプルとし、そして懸滴法により試験サンプルを製造した。より具体的に、５μＬのサンプルを銅メッシュに滴下し、水滴がなくなるまで自然蒸発させ、そしてＪＥＭ－２１００Ｆ ＳＴＥＭ／ＥＤＳ電界放出形高分解能ＴＥＭによりサンプルのモーフォロジーを観察した。
【0048】
図１のパネルＡとパネルＢはＧＳＨ－ＣｕＣｓの典型的なＳＥＭ画像を示し、異なるＴＥＭ画像からそれらのサイズ分布を算出した。その結果、ＧＳＨ－ＣｕＣｓは良好な分散性を有し、そのサイズは０．５～５．０ｎｍの範囲にあった。
【0049】
２）Ｘ線光電子分光法
【0050】
ＥＳＣＡＬＡＢ ２５０Ｘｉ Ｘ線光電子分光器でＸ線光電子分光（ＸＰＳ）を測定した。両面導電接着テープ（３ｍｍ×３ｍｍ）をアルミ箔に貼り付け、試験粉末を両面テープに均一に塗布し、アルミ箔で覆った。サンプルは圧力８ＭＰａで１分間保持した。表面の残留粉末を除去した後、中心サンプル（１ｍｍ×１ｍｍ）を切り出してＸＰＳテストを行った。
【0051】
図１のパネルＣは、ＧＳＨ－ＣｕＣｓ中の銅元素のＸＰＳスペクトルである。二つのピークはそれぞれ９３１．９８ｅＶと９５１．８８ｅＶに現れ、これは銅の２ｐ３／２と２ｐ１／２電子の結合エネルギーに起因する。９４２．０ｅＶ付近にＣｕの２ｐ３／２サテライトピークがなかったため、Ｃｕ（ＩＩ）電子が存在しないことが証明された。Ｃｕ（０）の結合エネルギーとＣｕ（Ｉ）の結合エネルギーとの差は０．１ｅＶしかないため、Ｃｕ（Ｉ）の形成を排除することはできず、また、得られたＧＳＨ－ＣｕＣｓでは銅の価数が０と+１の間にある可能性が高い。
【0052】
３） フーリエ変換赤外線（ＦＴ－ＩＲ）分光法
【0053】
ＰｅｒｋｉｎＥｌｅｍｅｒ ＬＳ ５５蛍光分光器でＦＴ－ＩＲスペクトルを測定した。試験粉末を超純水に溶解し、室温で測定した。スキャン範囲は２００－８００ｎｍで、サンプルセルは標準石英試験管で、光路は１ｃｍであった。
【0054】
図１のパネルＤはＧＳＨ－ＣｕＣｓ（上）とＧＳＨ（下）のＦＴ－ＩＲスペクトルの比較を示している。ＧＳＨはＣＯＯＨ－（１３９０と１５００ｃｍ－１）、ＮＨ２基のＮ－Ｈ伸縮（３４１０ｃｍ－１）、Ｎ－Ｈ屈曲（１６１０ｃｍ－１）という複数の特徴的な赤外波長域を示す。２５０３ｃｍ－１で観察されたピークはＳ－Ｈ伸縮振動モードに帰属できる。Ｓ－Ｈ伸縮振動帯（２５０３ｃｍ－１）を除いて、ＧＳＨ－ＣｕＣｓはすべて対応する赤外特性を持っている。その結果から、Ｓ－Ｈ結合が切断され、ＧＳＨ分子はＣｕ－Ｓ結合の形成によって銅コアの表面に結合することが分かった。
【0055】
４）蛍光分光法
【0056】
試験粉末を超純水に溶解し、室温で蛍光分光法により測定した。
【0057】
図１のＥ図に示すように、３６５ｎｍでの励起ピーク下で、ＧＳＨ－ＣｕＣは、５９５ｎｍでピークがあり、対応する半値全幅（ＦＷＨＭ）が約８０ｎｍである赤色発光を示した。なお、凝集誘起発光が増強されるため、エタノールを溶液に加えるとＧＳＨ－ＣｕＣｓのＦＬ強度が著しく向上した。また、大きなストークス変位（２３０ｎｍ）は蛍光プローブ及びバイオグラフィーのための良好な見込みを示した。
【0058】
実施形態３
【0059】
３．１ 材料および動物
【0060】
３．１．１ 試験サンプル
【0061】
Ｃｕ－０１： ＧＳＨ修飾銅クラスター（Ｌ－ＧＳＨ－ＣｕＣｓ）、０．５～５ｎｍである。
【0062】
Ｃｕ－０２： システイン修飾銅クラスター（Ｌ－Ｃｙｓ－ＣｕＣｓ）、０．５～５ｎｍである。
【0063】
全ての試験サンプルは、上記の方法に従って調製されたがわずかな変更を加えた。それらの品質は上記の方法を使用して特徴づけられた。
【0064】
３．１．２ 陽性対照サンプル
【0065】
ソラフェニブ（Sorafenib）。
【0066】
３．１．３ 実験用動物および群分け
【0067】
７０匹の、６～８週齢で、体重１６～２０ｇのＳＰＦ雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスは、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｈｕａｆｕｋａｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（Ｊｉｎｇ）２０１９－０００８）から購入された。体重によって、それらを７の群（ｎ＝１０）（空白対照群、モデル群、陽性対照群、Ｃｕ－１低用量群、Ｃｕ－１高用量群、Ｃｕ－２低用量群、Ｃｕ－２高用量群）にランダムに分けた。
【0068】
３．２ モデリング・プロトコル
【0069】
空白対照群を除いて、その他の群におけるマウスの肝硬変モデルは、四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘導処理の方法により製造された。モデリング・プロトコルは、以下の通りであった。（１）それぞれのマウスは、週２回、合計８週間で、体重１ｇあたり７μＬの１０％ ＣＣｌ４（オリーブ油で希釈したもの）を腹腔内注射し、空白対照群のマウスは、同じ量のオリーブ油溶媒を腹腔内注射した。（２）６週目から、２匹のマウスを選択し、そして毎週の最後の注射４８時間後に処刑した。肝臓の外観を観察した。外観が肝硬変の特性と一致した後（８週目）、肝臓組織をホルマリンで固定した。ＨＥ染色およびマッソン染色（Masson staining）を使用して、肝硬変のモデルを評価した。
【0070】
３．３ 投与
【0071】
モデリングが成功した後、陽性対照群におけるマウスに、胃内で２５ｍｇ／ｋｇソラフェニブを投与し、低用量または高用量の群のＣｕ－１およびＣｕ－２におけるマウスに、腹腔内注射により、それぞれ、２．５または１０ｍｇ／ｋｇの対応の試験材を投与した。そして、空白対照群およびモデル群におけるマウスに、腹腔内注射により、１０ｍＬ／ｋｇで生理食塩水を投与した。前記投与は、１日１回、２０日間連続した。
【0072】
３．４ 生化学的検査
【0073】
投与が完了した後、血液をマウスの眼窩から採取し、そして、Ｚｈｏｎｇｓｈｅｎｇ Ｂｅｉｋｏｎｇキットおよび生化学分析装置（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を用いて、アルブミン（ＡＬｂｕｍｉｎ、ＡＬＢ）、全ビリルビン（ＴＢｉｌ）、アラニンアラニンアミノトランスフェラ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびモノアミンオキシダー（ＭＡＯ）の生化学的検査のために、血清を得た。検出方法は、キットの指示に従って厳密に行った。
【0074】
【0075】
３．５ 病理学的検査
【0076】
３．５．１ ＨＥ染色
【0077】
安楽死後、マウス肝臓組織サンプルを４％パラホルムアルデヒド固定剤で４８時間以上固定した。固定後、肝臓サンプルをアルコール系列で脱水し、キシレンおよびエタノールで処理した。次いで、肝臓組織をワックス中に浸漬し、包埋した。包埋した材料がトリミングされ、付着、修復された後、パラフィンミクロトームで肝臓組織を４μｍの厚さで薄切した。ＨＥ染色の主な過程は以下の通りであった。オーブン中で６５℃でベーキングした後、切片をキシレンで処理し、エタノール系列で脱水した。切片をヘマトキシリン、青色発色性溶液（blue color-enhancing solution）および０．５％エオシンで順次染色し、次いでエタノール系列およびキシレンで処理し、中性ガムで密封した。顕微鏡で肝臓組織の線維症を観察した。
【0078】
３．５．２ マッソン染色
【0079】
ベーキング後、マウス肝臓組織切片を脱ロウし、脱水した。染色後、核をＲｅｇａｕｄ氏ヘマトキシリン染色溶液で染色した。水で洗浄した後、切片をＭａｓｓｏｎ氏ポンソー赤色酸性フクシン（Masson's Ponceau Red Acidic Fuchsin）で染色し、切片を２％氷酢酸水溶液に浸漬し、１％ホスホモリブデン酸溶液で分化させた。アニリンブルーまたは淡緑色溶液で直接染色した後、切片を０．２％氷酢酸水溶液に少し浸漬し、その後９５％アルコール、無水アルコールおよびキシレンで透明化させ、次いで中性ガムで密封した。顕微鏡で肝臓組織を観察した。
【0080】
３．６ 実験結果
【0081】
３．６．１ 成功したモデリング
【0082】
モデル群におけるマウスの肝臓は、増殖した繊維性隔壁により、異なるサイズの丸形または楕円形の塊に分割した。血清中のＡＬＴ、ＴＢｉｌ、およびＡＳＴ指数は空白対照群のものと比較して有意に増加し、血清中のＡＬＢは空白対照群と比較して有意に減少し、ＭＡＯ指数は対照群と有意差はなかったが、その値も増加した。上記すべての結果は、この実験モデルが成功したことを示唆している。
【0083】
３．６．２ アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、全ビリルビン（ＴＢｉｌ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）およびアルブミン（ＡＬＢ）に対する試験薬物の効果
【0084】
図２Ａに示すように、空白対照群と比較して、モデル群のＡＬＴ活性が極めて有意に増加し（４３．５±８．１Ｕ／Ｌから１８８．５±４．９Ｕ／Ｌに増加した；Ｐ＜０．０１）、モデル群マウスの肝臓機能が病理学的変化を有していることを示す。モデル群と比較して、低用量および高用量のＣｕ－１およびＣｕ－２（最低値は３７．０±５．７Ｕ／Ｌ、最高値は３８．６±５．６Ｕ／Ｌであった）、並びに陽性対照群（４２．８±５．４Ｕ／Ｌ）は、ＡＬＴ活性を空白対照群のレベルに有意に減少した（Ｐ＜０．０１）。
【0085】
図２Ｂに示すように、空白対照群と比較して、モデル群のＡＳＴ活性が有意に増加した（１４１．８±１３．５Ｕ／Ｌから１９２．０±１１．３Ｕ／Ｌに増加した；Ｐ＜０．０５）。高用量のＣｕ－１およびＣｕ－２の投与は、それぞれ、ＡＳＴ活性を１４６．３±８．４Ｕ／Ｌまたは１４４．３±８．１Ｕ／Ｌに有意に減少することができ、これらが空白対照群と同様のレベル（１４１．８±１３．５Ｕ／Ｌ）であるが、モデル群よりも有意に低い（Ｐ＜０．０１）。陽性対照群も、ＡＳＴ活性を減少することもできるが（１６５．５±１１．６Ｕ／Ｌ；Ｐ＜０．０５）、減少幅が高用量群のＣｕ－１およびＣｕ－２よりも低い。
【0086】
図２Ｃに示すように、モデル群のＴＢｉｌ濃度は、空白対照群よりも有意に高くなった（１．０２±０．２０μｍｏｌ／Ｌから２．９１±０．３９μｍｏｌ／Ｌに増加した；Ｐ＜０．０１）。モデル群と比較して、低用量および高用量のＣｕ－１およびＣｕ－２の投与は、血清中のＴＢＩＬレベルを有意に減少することができ（最高値は１．１６±０．３０μｍｏｌ／Ｌ、最低値は１．０８±０．０８μｍｏｌ／Ｌであった；Ｐ＜０．０１）、これらは、空白対照群に近い（１．０２±０．２０μｍｏｌ／Ｌ；Ｐ＜０．０１）。
【0087】
図２Ｄに示すように、モデル群のＭＡＯ活性（２１．５±０．７Ｕ／Ｌ）は、空白対照群（１８．８±２．９Ｕ／Ｌ）よりも高いが、統計学的に有意な差がなく、四塩化炭素により誘導された肝硬変マウスにおけるＭＡＯ活性指標の変化が明らかでなかったと示した。しかしながら、モデル群と比較して、高用量のＣｕ－１およびＣｕ－２は、血清中のＭＡＯ活性を１７．３±１．５Ｕ／Ｌ（Ｐ＜０．０１）または（１８．３±２．１Ｕ／Ｌ；Ｐ＜０．０５）に有意に減少し、その効果が陽性対照群よりも優れた。
【0088】
図２Ｅに示すように、モデル群のＡＬＢレベル（２４．２±０．６ ｇ／Ｌ）は、空白対照群（２２．１±１．３ ｇ／Ｌ）よりも有意に低くなり（Ｐ＜０．０５）、四塩化炭素処理が血清中のＡＬＢレベルを有意に減少できることを示した。しかしながら、Ｃｕ－１およびＣｕ－２は、血清中のＡＬＢレベルに有意な影響を与えなかった。
【0089】
以上の結果から、銅クラスター（ＣｕＣｓ）は用量依存的にＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＢＩＬおよびＭＡＯレベルを低下させ、マウスの肝機能が回復されたことが示唆され、その効果は少なくともある指標において陽性対照薬物より優れた。
【0090】
３．６．３ 病理学的分析
【0091】
肝硬変は、肝臓組織の線維症および偽小葉の形成を病理学的な特徴とする。ＨＥ染色病理学的分析の結果は、図３Ａに示すように、明瞭な構造を有し、肝小葉が完全で、肝細胞がきれいに配列され、中心静脈を中心として放射状に配列され、肝細胞の核が正常で、門脈域（catchment area）中の少量の繊維状組織のみを有していたことを示した。図３Ｂに示すように、モデル群の肝臓組織では、肝細胞が乱れ、バルーン状の構造が現れ、肝小葉がほとんど消失し、偽小葉（図３Ｂには右向きの矢印で示す）が多く生成され、肝組織に多くの増殖した原線維が存在し、丸型または楕円形の繊維性隔壁（図３Ｂには左向きの矢印で示す）が形成された。図３Ｃに示すように、モデル対照群と比較して、陽性対照群は肝臓損傷の有意な減少を示し、肝細胞は明らかに整然な配列を有し、線維過形成は明らかに減少し、繊維性隔壁を形成することなく、偽小葉が消失したが、正常な肝臓組織と比較して、陽性対照群の肝臓組織は細胞間ギャップの明らかな増加を示した（下向きの矢印によって示されている）。モデル対照群と比較して、銅クラスター薬物（Ｃｕ－１およびＣｕ－２）を投与した２つの群は、線維過形成および偽小葉の明らかな減少により証明されるように、肝細胞が肝臓損傷から有意に回復したこと、および回復がある程度の用量依存性を示すことを示した。
【0092】
図３Ｄおよび図３Ｅは、肝臓損傷の回復について、例示的なＣｕ－１の低用量および高用量薬物投与の効果をそれぞれ示したＨＥ画像を示す。図３Ｄに示すように、Ｃｕ－１低用量薬物投与群は、肝細胞が比較的整然に配列され、偽小葉がほとんど消失し、線維過形成が明らかに減少したが、正常な肝臓組織と比較して、ある程度の肝細胞間ギャップの増加を示した（図３Ｄの下向きの矢印で示す）。図３Ｅに示されるように、Ｃｕ－１の低用量薬物投与群と比較して、Ｃｕ－１の高用量薬物投与群では、肝臓損傷が減少し、偽小葉が完全に消失し、線維過形成が確認されることなく、肝細胞間ギャップの識別可能な増加がなく、正常な肝臓組織と明らかな差異がないという点においてより良い効果を示した。結論として、Ａ－０１薬物は、陽性対照薬物よりも肝臓損傷の回復に優れた効果を示した。
【0093】
マッソン染色の結果は、ＨＥ染色の結果と同じ結論を提供した。
【0094】
Ｃｕ－２薬物もＣｕ－１薬物と同様の効果を示し、詳細な説明は必要ではない。
【0095】
以上をまとめると、Ｃｕ－１およびＣｕ－２試験薬物は、肝臓の繊維および肝臓の偽小葉を有意に減少させた。肝臓機能指標の試験結果はまた、肝臓機能の回復を示した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および全ビリルビン（ＴＢｉｌ）の変化は最も明らかであった。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびモノアミノオキシダーゼ（ＭＡＯ）も有意に回復され、一方、アルブミン（ＡＬＢ）に有意な変化はなかった。２つの試験薬物は、肝硬変マウスにおいて肝臓機能および肝臓の病理学的構造を有意に改善することができ、そして銅クラスターの全体的な効果は、陽性対照薬物ソラフェニブよりも優れた。将来のさらなる適用のための実験的根拠を提供する。
【0096】
その他のサイズのＬ－Ｃｙｓ－ＣｕＣｓおよびＬ－ＧＳＨ－ＣｕＣｓ、および異なるサイズのその他のリガンド結合ＣｕＣｓも同様の効果を有し、一方、それらの効果はある程度ことなる。ここでは詳細に説明しない。
【0097】
本発明を特定の実施形態を参照して説明したが、実施形態は例示的なものであり、本発明の範囲はそのように限定されないことが理解されるであろう。本発明の別の実施形態は、本発明が関係する当業者には明らかになるであろう。このような代替実施形態は、本発明の範囲内に包含されると考えられる。従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定され、前述の説明によって支持される。
参照文献
Deng H.H. et al. An ammonia－based etchant for attaining copper nanoclusters with green fluorescence emission. Nanoscale, 2018, 10, 6467.
Jia X. et al. Cu Nanoclusters with Aggregation Induced Emission Enhancement. Small, 2013, DOI: 10.1002/smll.201300896.
Wang C. and Huang Y. GREEN ROUTE TO PREPARE BIOCOMPATIBLE AND NEAR INFRARED THIOLATE－PROTECTED COPPER NANOCLUSTERS FOR CELLULAR IMAGING. NANO: Brief Reports and Reviews. 2013, 8(5): 1350054 (10 pages).
参照文献
Deng H.H. et al. An ammonia－based etchant for attaining copper nanoclusters with green fluorescence emission. Nanoscale, 2018, 10, 6467.
Jia X. et al. Cu Nanoclusters with Aggregation Induced Emission Enhancement. Small, 2013, DOI: 10.1002/smll.201300896.
Wang C. and Huang Y. GREEN ROUTE TO PREPARE BIOCOMPATIBLE AND NEAR INFRARED THIOLATE－PROTECTED COPPER NANOCLUSTERS FOR CELLULAR IMAGING. NANO: Brief Reports and Reviews. 2013, 8(5): 1350054 (10 pages).
【国際調査報告】