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特表2023-517464微生物を検出するためのマルチプレックスＰＣＲ方法およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-26
(54)【発明の名称】微生物を検出するためのマルチプレックスＰＣＲ方法およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20230419BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20230419BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALN20230419BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
C12Q1/6876 Z
C12Q1/6869 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022546074
(86)(22)【出願日】2021-01-29
(85)【翻訳文提出日】2022-09-01
(86)【国際出願番号】 EP2021052115
(87)【国際公開番号】W WO2021152096
(87)【国際公開日】2021-08-05
(31)【優先権主張番号】2000902
(32)【優先日】2020-01-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522300787
【氏名又は名称】オーシャン ディーエックス
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】タレンドゥ，フランク
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ05
4B063QQ54
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR62
4B063QR66
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、プライマー対（１）およびプライマー対（２）を使用して試料中に存在する少なくとも２つの異なる核酸配列を増幅するための方法に関する。特に、プライマー対（２）の第１のプライマーはまた、（５’）位に、プライマー対（１）の第１のプライマーの配列を含み、プライマー対（２）の第２のプライマーはまた、（５’）位に、プライマー対（１）の第２のプライマーの配列を含む。本発明はまた、当該方法を実施することができるキットおよび検出キットならびにそれらの使用に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中に存在する少なくとも２つの異なる目的の核酸配列を、目的の第１の核酸配列（Ａ）を増幅することができるプライマー対１と、目的の第２の核酸配列（Ｂ）を増幅することができる少なくとも１つのプライマー対２とを使用して増幅するための方法であって、以下、ａ．前記試料を、前記核酸配列（Ａ）を増幅することができる前記プライマー対１および前記第２の核酸配列（Ｂ）を増幅することができる前記プライマー対２と接触させるステップであって、
ｉ．前記プライマー対１が、前記第１の配列（Ａ）に対応する核酸を増幅することができる第１のプライマーおよび第２のプライマーから形成され、
ｉｉ．前記プライマー対２が、前記第２の配列（Ｂ）に対応する核酸を増幅することができる第１のプライマーおよび第２のプライマーから形成される、接触させるステップと、
ｂ．選択した試薬、およびＰＣＲ増幅を可能にする条件を加えるステップと、
ｃ．前記第１および第２の核酸配列（ＡおよびＢ）を増幅するステップと、を含み、
前記プライマー対２の前記第１のプライマーの配列が、５’に、前記プライマー対１の前記第１または前記第２のプライマーの配列をさらに含み、前記プライマー対２の前記第２のプライマーの配列が、５’に、前記プライマー対１の前記第１または前記第２のプライマーの前記配列をさらに含むことを特徴とする、方法。
【請求項2】
前記プライマー対２の前記第１のプライマーの前記配列および前記プライマー対１の前記第１または前記第２のプライマーの前記配列が隣接しており、前記プライマー対２の前記第２のプライマーの前記配列および前記プライマー対１の前記第１または前記第２のプライマーの前記配列が隣接していることを特徴とする、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項3】
前記対１の前記第２のプライマーが、５’に、前記対１の前記第１のプライマーの前記配列を含むハイブリッドプライマーであり、前記配列が隣接していることを特徴とする、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
前記プライマー対２の濃度が、前記プライマー対１の濃度以下であることを特徴とする、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記プライマー対１と前記プライマー対２との濃度比が、１：１～１０００：１であることを特徴とする、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記プライマー対１と前記プライマー対２との前記濃度比が、１：１～１００：１、好ましくは２５：１であることを特徴とする、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記試料を、第３の核酸配列（Ｃ）に対応する核酸配列を増幅することができるプライマー対３と接触させることをさらに含み、前記プライマー対３の第１のプライマーの配列が、５’に、前記プライマー対１の前記第１または前記第２のプライマーの前記配列をさらに含み、前記プライマー対３の第２のプライマーの配列が、５’に、前記プライマー対１の前記第１または前記第２のプライマーの前記配列をさらに含むことを特徴とする、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記プライマー対１の前記濃度が、第２および／または第３の対の前記濃度よりも大きい、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記プライマー対２の前記濃度が、前記プライマー対３の濃度に等しい、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記試料を、第４の核酸配列（Ｄ）を増幅することができるプライマー対４と接触させることをさらに含み、前記プライマー対４の第１のプライマーの配列が、５’に、前記プライマー対１の前記第１または前記第２のプライマーの前記配列をさらに含み、前記プライマー対４の第２のプライマーの配列が、５’に、前記プライマー対１の前記第１または前記第２のプライマーの前記配列をさらに含むことを特徴とする、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記プライマー対４の濃度が、前記プライマー対１の濃度未満である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記プライマー対２、前記プライマー対３、および前記プライマー対４の前記濃度が、同一である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記増幅された核酸を配列決定するステップをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記目的の核酸配列の増幅が、少なくとも１つの感染症に関与する少なくとも１つの微生物を検出および特定することを可能にする、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記微生物が、蛍光プローブ、蛍光マーキング、融解曲線、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、またはＤＮＡ配列決定によって特定されることを特徴とする、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
キットであって、－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７、
－以下で構成される前記遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ４～Ｖ６を標的とするプライマー対２：
■配列番号２８または配列番号２９または配列番号３０のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号３１または配列番号３２または配列番号３３、を含む、キット。
【請求項17】
キットであって、－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７、
－以下で構成される前記遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ７～Ｖ９を標的とするプライマー対２：
■配列番号３４または配列番号３５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号３６または配列番号３７または配列番号３８、を含む、キット。
【請求項18】
キットであって、－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７、
－以下で構成される前記遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ４～Ｖ６を標的とするプライマー対２：
■配列番号２８または配列番号２９または配列番号３０のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号３１または配列番号３２または配列番号３３、
－以下で構成される前記遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ７～Ｖ９を標的とするプライマー対３：
■配列番号３４または配列番号３５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号３６または配列番号３７または配列番号３８、を含む、キット。
【請求項19】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法を実施し、少なくとも１つの感染症の場合に存在する少なくとも１つの微生物を検出するための、請求項１６～１８のいずれか一項に記載のキットの、使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、特に感染診断における、少なくとも１つの目的の核酸の検出および増幅の分野に関する。したがって、本発明は、試料中に存在する少なくとも２つの異なる核酸配列を、第１の核酸配列（Ａ）を増幅するプライマー対１と、第２の核酸配列（Ｂ）を増幅する少なくとも１つのハイブリッドまたはキメラプライマー対２とを使用して増幅するための方法に関する。特に、プライマー対２のセンスプライマーなどの第１のプライマーは、５’に、プライマー対１の第１のプライマーの配列をさらに含み、プライマー対２の第２のプライマーは、５’に、プライマー対１の第１または第２のプライマーの配列をさらに含む。本発明はまた、当該方法を実施することができるプライマー、キット、およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、感染診断は、特にゲノム増幅またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの分子生物学の方法を使用することによって、著しい発展を遂げている。ＰＣＲは、細菌の培養またはＥＬＩＳＡ試験などの従来の血清学的および微生物学的方法にますます取って代わっている。ＰＣＲには、試験が迅速で、感度が高く、特異的であるといういくつかの利点がある。依然として比較的高価であり、したがって、困難な分析または特定の分析研究所のために確保されているにもかかわらず、ＰＣＲによる診断の特異性および感度は、最終的に、まず第１に実施される従来の分析に取って代わるだろう。
【0003】
標準的なＰＣＲは、特定のプライマー対から目的の核酸を増幅することを可能にする。感染診断の場合、例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ感染の疑いのある場合、Ｅ．Ｃｏｌｉに特異的な核酸の増幅を可能にするプライマー対が使用され得る。感染の起源が知られていない場合、検出されるように意図されている各病原体に特異的なプライマー対を使用する必要がある。「シンプレックス」と称されるＰＣＲアプローチでは、単一のプライマー対が使用され、感染の原因として特定されることが意図されるウイルス、細菌、または酵母の数に関して、ＰＣＲ反応は、必要に応じて何度でも再現されなければならない。「マルチプレックス」と称されるＰＣＲアプローチでは、すべてのプライマー対が１つの単一反応で添加され、求められるすべての病原体が同時に特定される。
【0004】
マルチプレックスＰＣＲは、同じ生体試料から複数の異なる核酸配列を同時に特定することを可能にするＰＣＲである。これにより、１つの同一の反応において複数の標的化増幅を実施することが可能となる。したがって、マルチプレックスＰＣＲは、感染診断において特に好適である。感染診断の間、異なるプライマー対が、標的生体試料の存在下で、同じＰＣＲ反応中に複数の細菌、ウイルス、または酵母を標的化するために使用される。
【0005】
しかしながら、マルチプレックスＰＣＲで使用されるプライマー対は、ＰＣＲ中にすべてのプライマーが同じ温度で機能することができるように顕著に最適化される必要があり、特に交差反応の現象を防止することが可能である。
【0006】
例として、マルチプレックスＰＣＲは、地域感染型肺炎の場合、培養物による３９％と比較して、入院患者の７７％において少なくとも１つの病原体を明らかにすることができる（ＮＪ Ｇａｄｓｂｙ ＣＤ Ｒｕｓｓｅｌｌ ＭＰ ＭｃＨｕｇｈ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ－ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０１６）。下痢の場合、従来の方法よりも最大３倍多くの病原体を便中で検出することが可能である（ＣＲ Ｓｔｅｎｓｖｏｌｄ ＨＶ Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐａｒａｓｉｔｅｓ ｉｎ Ｄａｎｉｓｈ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ａｎ ｉｎｃｅｎｔｉｖｅ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１２）。したがって、１つの単一テキストが、２時間未満で、試料中の複数の感染性因子の存在を示すことができる。今日では、髄膜炎、性感染症、呼吸器感染症、および感染性腸炎のパネルがすでに臨床医に提案されている。
【0007】
それにもかかわらず、マルチプレックスＰＣＲは、所定量の病原体の検出に限定され、当該病原体の特定の遺伝子の少なくとも１つの断片を標的とするプライマー対がパネルに含まれる。検出パネルを拡張するために、検出キットは非常に多数のプライマーを含んでもよいため、大量の微生物を検出することが可能である。したがって、パネルにおいて標的化される病原体の数を増加させることが望ましいほど、プライマー対の数を増加させる傾向がある。一般的な方法では、病原体は、プライマー対によって検出され、そのアンプリコンは、当該病原体に特異的である。
【0008】
しかしながら、１つの単一試験における高濃度の異なるプライマーは、有害な矛盾する効果をもたらす。したがって、プライマー間の競合現象が現れ、プライマーの阻害をもたらす。さらに、使用される複数のプライマーのため、非特異的増幅の可能性がはるかに高い。したがって、高すぎる多重化は、検出感度が非常に低いことにつながる。
【0009】
２００７年のＩ．Ａｆｏｎｉｎａらによる研究（５’フラップを有するプライマーは、リアルタイムＰＣＲを向上させる）から、５’にプライマーの標的に相補的でない配列を付加することで、ＰＣＲ増幅の有効性が向上することも知られている。しかしながら、これらの配列付加は、マルチプレックスＰＣＲ中に典型的に使用される高濃度のプライマーに関連する、非特異的増幅または感受性の喪失の問題に対処するものではない。
【0010】
本発明は、問題を解決し、従来技術の欠点を克服すること、特に、プライマーが大きすぎる量で同じ試験に存在するときのプライマー間の競合現象のため、標的化核酸の増幅の欠如または不十分な増幅をもたらし得るマルチプレックスＰＣＲの感度の劣化を防止または制限すること、ならびに望ましくない方法で増幅試薬を消費する非特異的増幅に関連するマルチプレックスＰＣＲの感度の劣化を抑制または制限することを目的としている。
【発明の概要】
【0011】
したがって、第１の態様によれば、本発明は、試料中に存在する少なくとも２つの異なる目的の核酸配列を、目的の第１の核酸配列（Ａ）を増幅することができるプライマー対１と、目的の第２の核酸配列（Ｂ）を増幅することができる少なくとも１つのハイブリッドプライマー対２とを使用して増幅するための方法に関し、当該方法は、以下、
ａ．試料を、第１の核酸配列（Ａ）を増幅することができるプライマー対１および第２の核酸配列（Ｂ）を増幅することができるプライマー対２と接触させるステップであって、
■プライマー対１が、第１の核酸配列（Ａ）に対応する核酸を増幅することができる第１のプライマーおよび第２のプライマーから形成され、
■プライマー対２が、第２の核酸配列（Ｂ）に対応する核酸を増幅することができる第１のプライマーおよび第２のプライマーから形成される、接触させるステップと、
ｂ．選択した試薬、およびＰＣＲ増幅を可能にする条件を加えるステップと、
ｃ．第１および第２の核酸配列（ＡおよびＢ）を、試料中に存在する核酸配列（Ａ）および核酸配列（Ｂ）の特異的転写に基づいて増幅反応を実施することにより増幅するステップと、を含み、
プライマー対２の第１のプライマーの配列が、５’に、プライマー対１の第１のプライマーの配列をさらに含み、プライマー対２の第２のプライマーの配列が、５’に、プライマー対１の第２のプライマーの配列をさらに含むことを特徴とする。
ａ．試料を、第１の核酸配列（Ａ）を増幅することができるプライマー対１および第２の核酸配列（Ｂ）を増幅することができるプライマー対２と接触させるステップであって、
■プライマー対１が、第１の核酸配列（Ａ）に対応する核酸を増幅することができる第１のプライマーおよび第２のプライマーから形成され、
■プライマー対２が、第２の核酸配列（Ｂ）に対応する核酸を増幅することができる第１のプライマーおよび第２のプライマーから形成される、接触させるステップと、
ｂ．選択した試薬、およびＰＣＲ増幅を可能にする条件を加えるステップと、
ｃ．第１および第２の核酸配列（ＡおよびＢ）を、試料中に存在する核酸配列（Ａ）および核酸配列（Ｂ）の特異的転写に基づいて増幅反応を実施することにより増幅するステップと、を含み、
プライマー対２の第１のプライマーの配列が、５’に、プライマー対１の第１のプライマーの配列をさらに含み、プライマー対２の第２のプライマーの配列が、５’に、プライマー対１の第２のプライマーの配列をさらに含むことを特徴とする。
【0012】
変異形によれば、プライマー対２（キメラまたはハイブリッドと称される）の第１のプライマーの配列は、５’に、プライマー対１の第１または第２のプライマーの配列をさらに含み、プライマー対２の第２のプライマーの配列は、５’に、プライマー対１の第１または第２のプライマーの配列をさらに含む。
【0013】
プライマー対２の濃度は、好ましくはプライマー対１の濃度以下であり、より好ましくはそれ未満である。
【0014】
本発明による方法はまた、第３のプライマー対３、第４のプライマー対４などを含んでもよく、各々、第１のプライマー（その配列は、５’に、プライマー対１の第１または第２のプライマーの配列をさらに含む）、および第２のプライマー（その配列は、５’に、プライマー対１の第１または第２のプライマーの配列をさらに含む）を含む。
【0015】
別の変異形によれば、第１の核酸配列（Ａ）を標的とする第２のプライマーは、同様に、その５’の領域において、この同じ核酸（Ａ）を標的とする第１のプライマーの配列も含有することができる。
【0016】
例えば、プライマー対１、２、３、または４の第１のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスプライマーであり得、プライマー対１、２、３、または４の第２のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスまたはセンスプライマーであり得る。
【0017】
好ましくは、本発明による方法は、マルチプレックスＰＣＲであり、差分定量的増幅を実施する、すなわち、標的が同じ方法で増幅されないことを可能にし、標的間の同じのサイクル数に対して産生される量において差をもたらすことができる。本発明による当該ＰＣＲは、本明細書の残りの部分では、リレーＰＣＲまたは本発明によるＰＣＲとも称される。
【0018】
本発明によるＰＣＲは特に、感染症に関与する細菌、ウイルス、酵母などの微生物を検出および特定することを可能にする。疾患は、動物もしくはヒトなどの対象において、または植物において検出され得る。
【0019】
第２の態様によれば、本発明はさらに、特定のプライマーを含むプライマーおよびキット、本発明の方法を実施することができる検出キット、ならびに感染症の場合に存在する微生物を検出するためのそれらの使用に関する。
【0020】
本発明は、以下で説明する図面を参照して詳細に説明される。図面は、本発明のいくつかの実施形態の単なる例示であり、限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】本発明によるリレーＰＣＲの原理を示す。
【図2A】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを標的とするプライマー対１、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを標的とするプライマー対２を含む、標準的なデュプレックスＰＣＲ試験（２つの標的を有するマルチプレックス）を示す。プライマー対１：プライマー対２の比は１：１である。黒色：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの特定の遺伝子を標的とする増幅曲線。灰色：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの特定の遺伝子を標的とする増幅曲線。
【図2B】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを標的とするプライマー対１、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを標的とするプライマー対２を含む、本発明によるリレーＰＣＲ試験を示す。プライマー対１：プライマー対２の比は１０：１である。黒色：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの特定の遺伝子を標的とする増幅曲線。灰色：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの特定の遺伝子を標的とする増幅曲線。
【図2C】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを標的とするプライマー対１、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを標的とするプライマー対２を含む、本発明によるリレーＰＣＲ試験を示す。プライマー対１：プライマー対２の比は１：１である。黒色：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの特定の遺伝子を標的とする増幅曲線。灰色：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの特定の遺伝子を標的とする増幅曲線。
【図3A】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを標的とするプライマー対１、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを標的とするプライマー対２を含む、標準的なデュプレックスＰＣＲ試験を示す。プライマー対１：プライマー対２の比は１：１である。黒色：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの特定の遺伝子を標的とする増幅曲線。灰色：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの特定の遺伝子を標的とする増幅曲線。
【図3B】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを標的とするプライマー対１、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを標的とするプライマー対２を含む、本発明によるリレーＰＣＲ試験を示す。プライマー対１：プライマー対２の比は１０：１である。黒色：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの特定の遺伝子を標的とする増幅曲線。灰色：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの特定の遺伝子を標的とする増幅曲線。
【図3C】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを標的とするプライマー対１、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを標的とするプライマー対２を含む、本発明によるリレーＰＣＲ試験を示す。プライマー対１：プライマー対２の比は１：１である。黒色：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの特定の遺伝子を標的とする増幅曲線。灰色：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの特定の遺伝子を標的とする増幅曲線。
【図4】センス配列ＦＷ１のセンスプライマーおよび配列ＲＴ１のアンチセンスプライマーを含む、標的配列、例えばＡを増幅することができる標準的なＰＣＲで使用されるプライマー対の構造、ならびに標的配列、例えばＢを増幅することができるリレーＰＣＴで使用される本発明によるハイブリッドまたはキメラプライマー対の構造を示す。ハイブリッドまたはキメラプライマー対は、配列ＦＷ１＋ＦＷ２のセンスプライマーおよび配列ＲＴ１＋ＲＴ２のアンチセンスプライマーを含む。配列ＦＷ２は、標的配列Ｂの領域とハイブリダイズすることができ、配列ＦＷ１は、混合物中により高い濃度で存在するプライマー対１のセンスプライマーの配列に対応し、当該配列ＦＷ１およびＦＷ２は、１２～１４０ヌクレオチドの長さの単一のセンスプライマーを形成するように隣接している。ハイブリッドまたはキメラプライマー対はまた、配列ＲＴ１＋ＲＴ２のアンチセンスプライマーを含み、配列ＲＴ２は、標的配列Ｂの領域に相補的であり、配列ＲＴ１は、混合物中により高い濃度で存在するプライマー対１のアンチセンスプライマーの配列に対応し、当該配列ＦＷ１およびＦＷ２は、１２～１４０ヌクレオチドの長さの単一のプライマーを形成するように隣接している。第２のＰＣＲサイクルの効果により、混合物中により高い濃度で存在するプライマー対１は、第１のサイクル中にプライマー対２によって生成されたアンプリコンを増幅し、したがって、標的配列Ｂも増幅することができる。したがって、プライマー対１は、第２のＰＣＲサイクルから標的配列Ａだけでなく標的配列Ｂも増幅することができる。
【図5】細菌遺伝子１６Ｓの配列を示す。当該配列は、各種に特異的な９つの可変領域、および当該可変領域に隣接する種間の１０の保存領域を含む。可変領域には、Ｖ１～Ｖ９の番号が付けられている。保存領域は、当業者の知識に応じて、少なくとも１つの目的の可変領域（例えば、Ｖ１～Ｖ２）を囲むこれらの保存領域上でハイブリダイズすることができるセンスおよびアンチセンスプライマーのヌクレオチド配列を定義することを可能にする。
【図6】標準的なデュプレックス方法（２つの標的を有するマルチプレックス）または本発明のデュプレックスリレー方法によるＰＣＲの結果を表すアガロースゲルである。すべての条件下で、１００コピーのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムを添加した。ライン１：当該可変域に隣接する保存域を標的とする高濃度のプライマーを使用して得られた、遺伝子１６Ｓの５’の領域のアンプリコン（可変域Ｖ１～Ｖ２を網羅するアンプリコン）（対照ＰＣＲ）。２：当該可変域に隣接する保存域を標的とする高濃度のプライマーを使用して得られた、遺伝子１６Ｓの中央領域のアンプリコン（可変域Ｖ４～Ｖ６を網羅するアンプリコン）（対照ＰＣＲ）。３：各可変域を標的とする２つのプライマー対を使用して、遺伝子１６Ｓの５’の領域（Ｖ１～Ｖ２）および中央領域（Ｖ４～Ｖ６）の標準的なマルチプレックスＰＣＲにおけるアンプリコン、それぞれ、プライマーは高濃度である。４：デュプレックスリレーにおける、本発明の方法の遺伝子１６Ｓの２つの領域のアンプリコン、ここで、第１のプライマー対は５′の領域（Ｖ１～Ｖ２）を標的とし、第２のハイブリッドまたはキメラプライマー対は、中央領域（Ｖ４～Ｖ６）だけでなく、第１のプライマー対の配列も標的とすることができる配列を含み、当該プライマーは、それぞれ、高濃度（第１のプライマー対）および低濃度（第２のプライマー対）で使用される。矢印は、目的のアンプリコン（この場合、遺伝子１６Ｓの領域Ｖ１～Ｖ２）の増幅または増幅の欠如を示す。
【図7】標準的なトリプレックス方法（３つの標的を有するマルチプレックス）または本発明の方法（トリプレックスリレー）によるＰＣＲの結果を表すアガロースゲルである。すべての条件下で、１００コピーのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムを添加した。１：標準的なトリプレックスＰＣＲを使用して得られたアンプリコン、プライマーは各々１ｍＭである。２ ：キメラまたはハイブリッドプライマーを０．０４ｍＭの低濃度で使用した、トリプレックスリレーＰＣＲを使用して得られたアンプリコン。トリプレックスリレーのアンプリコンＶ４～Ｖ６およびＶ７～Ｖ９は、重合後にサイズが増加するキメラプライマーの長さのため、標準的なトリプレックスにおける同等物よりもわずかに大きい。
【図8】１つの単一プライマーを高濃度で含む、マルチプレックスリレーＰＣＲ方法によるＰＣＲの結果を表すアガロースゲルである。すべての条件下で、１００コピーのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムを添加した。１：遺伝子１６Ｓの領域Ｖ１～Ｖ２を標的とする高濃度のプライマー対１、および遺伝子１６ＳのＶ７～Ｖ９の領域を標的とする低濃度のハイブリッドまたはキメラプライマー対２を含む、デュプレックスリレーＰＣＲによって得られたアンプリコン。２：高濃度のセンスプライマーおよび５’にセンスプライマー配列を含む低濃度のハイブリッドまたはキメラアンチセンスプライマーで構成される、遺伝子１６Ｓ領域のＶ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１、ならびに遺伝子１６Ｓの領域Ｖ７～Ｖ９を標的とする低濃度のハイブリッドまたはキメラプライマー対２を含む、デュプレックスリレーＰＣＲによって得られたアンプリコン。したがって、第１の対のアンチセンスプライマー、ならびに第２の対のセンスおよびアンチセンスプライマーは、ハイブリッドまたはキメラプライマーである。プライマー対１のセンスプライマーのみが高濃度で存在する。
【0022】
定義
本発明の意味の範囲内で、「患者」は、ヒトまたは動物、好ましくはヒトまたは哺乳動物であり得る対象を意味する。対象は、好ましくは、年齢または性別に関わらず、ヒト患者である。新生児、乳幼児、および小児も含まれる。
本発明の意味の範囲内で、「患者」は、ヒトまたは動物、好ましくはヒトまたは哺乳動物であり得る対象を意味する。対象は、好ましくは、年齢または性別に関わらず、ヒト患者である。新生児、乳幼児、および小児も含まれる。
【0023】
本発明の意味の範囲内で、「診断」は、対象または植物に、病理に対応する治療を施すことができるように、１つ以上の病理（ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）／病理（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ）を検出および特定すること、特に対象または植物における感染症を検出および特定することを目的とする試験を意味する。
【0024】
本発明の意味の範囲内で、「プライマー対」または「オリゴヌクレオチド対」は、ＰＣＲの文脈内で標的配列を増幅することを可能にする２つのオリゴヌクレオチドを意味する。
【0025】
本発明の意味の範囲内で、「プライマー」または「オリゴヌクレオチド」は、１～数十のヌクレオチドの核酸の短いセグメントを意味する。当該プライマーは、相補配列とハイブリダイズすることができる。本発明の文脈内では、それらは標的配列の断片とハイブリダイズすることができる。標的配列は、核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。
【0026】
本発明の意味の範囲内で、「配列ＦＷ１」は、１～数十のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの配列、特に、目的の配列の相補配列とハイブリダイズすることができるセンスプライマーの配列を意味する。
【0027】
本発明の意味の範囲内で、「配列ＲＴ１」は、１～数十のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの配列、特に、目的の配列の相補配列とハイブリダイズすることができるアンチセンスプライマーの配列を意味する。
【0028】
本発明の意味の範囲内で、「目的の核酸配列を増幅することができるプライマー対」は、ＰＣＲによって特定の目的の配列を増幅することができるセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを含むプライマー対を意味する。例として、目的の核酸配列は、細菌の遺伝子１６Ｓの可変部に存在する配列であってもよい。当該プライマーは、当業者の一般的な知識に従って、目的の当該配列を標的にするように設計される。
【0029】
本発明の意味の範囲内で、「増幅」は、ＰＣＲ反応中の標的配列の増幅、したがって、標的配列のコピー数の増加を意味する。プライマーは、ポリメラーゼの作用により、鎖の伸長によって、以前に変性した相補配列とハイブリダイズする。反応は複数の連続したサイクルで進行し、アンプリコンのコピー数を増加させることを可能にする。
【0030】
本発明の意味の範囲内で、「アンプリコン」は、ＰＲＣ中に増幅され、使用される２つのプライマーによって区切られる配列に対応する核酸断片を意味する。したがって、アンプリコンは、標的配列のコピーである。
【0031】
本発明の意味の範囲内で、「ハイブリッドプライマー」または「キメラプライマー」は、標的配列の相補鎖とハイブリダイズすることができる核酸配列、および５’に、別のプライマー対に属するプライマーの配列、例えば別のプライマー対のセンスまたはアンチセンスプライマーの配列に対応する核酸配列を含むプライマーを意味する。本発明の文脈内では、プライマー対２、３、および４は、ハイブリッドまたはキメラプライマーから形成される。本発明の変異形によると、プライマー対１は、１つの「標準的な」プライマーおよび１つのハイブリッドまたはキメラプライマーを含む。例えば、プライマー対２の第１のオリゴヌクレオチドは、特異的核酸配列（標的Ｂ）とハイブリダイズすることができる配列、および５’に、別の特異的核酸配列（標的Ａ）とハイブリダイズすることができるプライマー対１の第１のオリゴヌクレオチドの配列に対応する核酸配列を含む。
【0032】
本発明の意味の範囲内で、「濃度比」は、プライマー対１の濃度の、プライマー対２などの第２のプライマー対に対する比を意味する。例えば、１：１の比は、第１の対および第２の対の同一の濃度に対応し、１０：１の比は、第２の対と比較して１０倍大きい第１の対の濃度に対応する。
【発明を実施するための形態】
【0033】
したがって、本発明は、マルチプレックスと称される、新しいＰＣＲ方法に関する。非常に多数の標的配列を特定することが可能である「標準的な」マルチプレックスＰＣＲが知られている。この種の標準的なマルチプレックスＰＣＲは、特定の核酸を標的とする、高濃度の各プライマー対の存在を必要とする。したがって、標準的なマルチプレックスＰＣＲでは、各プライマー対は、マルチプレックスＰＣＲ反応中に同じ高濃度で存在する。少なくとも４または５つの異なるプライマー対を超えると、反応条件が損なわれ始める。さらに、プライマー間の競合現象の出現は、プライマーの特異的ハイブリダイゼーションの阻害をもたらす。さらに、使用される複数のプライマーは、非特異的増幅をもたらし得る。これにより、標準的なマルチプレックスＰＣＲは、検出感度が非常に低い。
【0034】
本発明は、マルチプレックスリレーＰＣＲ（またはリレーＰＣＲ）と称される新しいマルチプレックスＰＣＲ方法に関する。マルチプレックスリレーＰＣＲ、すなわち本発明による方法の場合、１つの単一のプライマー対または１つの単一のプライマーが高濃度で使用され、他のすべてのプライマーは非常に低い濃度のものである。本発明により、標的化されたすべての核酸に対して非常に高い感度を保持することが可能である。
【0035】
いくつかの核酸の増幅を他のものよりも促進する（定量的増幅非対称または差分定量的増幅）、特に標的Ａの核酸の増幅を他のものよりも促進することも可能である。したがって、優先的に増幅される当該核酸は、より大量に存在する。診断において、いくつかの核酸を好むことは、いくつかの核酸が他より多くの情報を提供するという事実のため、医学的利点を有する。
【0036】
したがって、本発明は、試料中に存在する少なくとも２つの異なる目的の核酸配列を、目的の第１の核酸配列（Ａ）を増幅することができるプライマー対１と、目的の第２の核酸配列（Ｂ）を増幅することができる少なくとも１つのプライマー対２とを使用して増幅するための方法に関し、当該方法は、以下、
ａ．試料を、第１の核酸配列（Ａ）を増幅することができるプライマー対１および第２の核酸配列（Ｂ）を増幅することができるプライマー対２と接触させるステップであって、
ｉ．プライマー対１が、第１の核酸配列（Ａ）に対応する核酸を増幅することができる第１のプライマーおよび第２のプライマーから形成され、
ｉｉ．プライマー対２が、第２の核酸配列（Ｂ）に対応する核酸を増幅することができる第１のプライマーおよび第２のプライマーから形成される、接触させるステップと、
ｂ．選択した試薬、およびＰＣＲ増幅を可能にする条件を加えるステップと、
ｃ．第１および第２の核酸配列（ＡおよびＢ）を増幅するステップと、を含み、
プライマー対２の第１のプライマーの配列が、５’に、プライマー対１の第１のプライマーの配列をさらに含み、プライマー対２の第２のプライマーの配列が、５’に、プライマー対１の第２のプライマーの配列をさらに含むことを特徴とする。
ａ．試料を、第１の核酸配列（Ａ）を増幅することができるプライマー対１および第２の核酸配列（Ｂ）を増幅することができるプライマー対２と接触させるステップであって、
ｉ．プライマー対１が、第１の核酸配列（Ａ）に対応する核酸を増幅することができる第１のプライマーおよび第２のプライマーから形成され、
ｉｉ．プライマー対２が、第２の核酸配列（Ｂ）に対応する核酸を増幅することができる第１のプライマーおよび第２のプライマーから形成される、接触させるステップと、
ｂ．選択した試薬、およびＰＣＲ増幅を可能にする条件を加えるステップと、
ｃ．第１および第２の核酸配列（ＡおよびＢ）を増幅するステップと、を含み、
プライマー対２の第１のプライマーの配列が、５’に、プライマー対１の第１のプライマーの配列をさらに含み、プライマー対２の第２のプライマーの配列が、５’に、プライマー対１の第２のプライマーの配列をさらに含むことを特徴とする。
【0037】
ステップｃの間、第１および第２の核酸配列（ＡおよびＢ）の増幅は、試料中に存在する核酸配列（Ａ）および核酸配列（Ｂ）の重合（伸長）に基づく増幅反応によって実施される。
【0038】
変異形によれば、プライマー対２の第１のプライマーの配列は、５’に、プライマー対１の第１のプライマーまたは第２のプライマーの配列をさらに含み、プライマー対２の第２のプライマーの配列は、５’に、プライマー対１の第１または第２のプライマーの配列をさらに含む。
【0039】
好ましくは、プライマー対２の第１のプライマーの配列およびプライマー対１の第１または第２のプライマーの配列は隣接しており、プライマー対２の第２のプライマーの配列およびプライマー対１の第１または第２のプライマーの配列は隣接している。変異形によれば、当該配列は隣接していないが、１～１２ヌクレオチドのサイズのスペーサー（または「リンカー」）によって、いくつかのヌクレオチドだけ離れている。
【0040】
別の変異形によれば、本発明による方法は、
－プライマー対１の第２のプライマーの配列が、５’に、当該プライマー対１の第１のプライマーの配列をさらに含み、当該配列が隣接しており、
－プライマー対２の第１のプライマーの配列が、５’に、プライマー１対の第１のプライマーの配列をさらに含み、プライマー対２の第２のプライマーの配列が、５’に、プライマー対１の第１のプライマーの配列をさらに含み、当該配列が隣接していることを特徴とする。
－プライマー対１の第２のプライマーの配列が、５’に、当該プライマー対１の第１のプライマーの配列をさらに含み、当該配列が隣接しており、
－プライマー対２の第１のプライマーの配列が、５’に、プライマー１対の第１のプライマーの配列をさらに含み、プライマー対２の第２のプライマーの配列が、５’に、プライマー対１の第１のプライマーの配列をさらに含み、当該配列が隣接していることを特徴とする。
【0041】
別の変異形によれば、プライマー対１の第２のプライマーの配列は、５’に、当該プライマー対１の第１のプライマーの配列をさらに含み、かつ／またはプライマー対２の第１のプライマーの配列は、５’に、プライマー対１の第１のプライマーの配列をさらに含み、プライマー対２の第２のプライマーの配列は、５’に、プライマー対１の第１のプライマーの配列をさらに含み、当該配列は、３～１２ヌクレオチドのサイズのスペーサー（または「リンカー」）によって、いくつかのヌクレオチドだけ離れている。
【0042】
本発明の好ましい実施形態によれば、方法は、以下を使用する：
－標的配列Ａを増幅することができる少なくとも１つのプライマー対１であって、
－標的配列Ａの断片に相補的である配列ＦＷ１のセンスプライマーであって、当該プライマーが、６～７０ヌクレオチドのサイズである、センスプライマーと、
－標的配列Ａの断片に相補的である配列ＲＴ１のアンチセンスプライマーであって、当該プライマーが、６～７０ヌクレオチドのサイズである、アンチセンスプライマーとを含む、少なくとも１つのプライマー対１、ならびに
－標的配列Ｂを増幅することができる少なくとも１つのプライマー対２であって、
－配列ＦＷ１またはＲＴ１および配列ＦＷ２のセンスプライマーであって、配列ＦＷ２が、標的配列Ｂの断片に相補的であり、当該配列ＦＷ１またはＲＴ１およびＦＷ２が、１２～１４０ヌクレオチドのサイズの単一プライマーを形成するために隣接している、センスプライマーと、
－配列ＦＷ１またはＲＴ１および配列ＲＴ２のアンチセンスプライマーであって、配列ＲＴ２が、標的配列Ｂの断片に相補的であり、当該配列ＦＷ１またはＲＴ１およびＲＴ２が、１２～１４０ヌクレオチドのサイズの単一プライマーを形成するために隣接している、アンチセンスプライマーとを含む、少なくとも１つのプライマー対２。
－標的配列Ａを増幅することができる少なくとも１つのプライマー対１であって、
－標的配列Ａの断片に相補的である配列ＦＷ１のセンスプライマーであって、当該プライマーが、６～７０ヌクレオチドのサイズである、センスプライマーと、
－標的配列Ａの断片に相補的である配列ＲＴ１のアンチセンスプライマーであって、当該プライマーが、６～７０ヌクレオチドのサイズである、アンチセンスプライマーとを含む、少なくとも１つのプライマー対１、ならびに
－標的配列Ｂを増幅することができる少なくとも１つのプライマー対２であって、
－配列ＦＷ１またはＲＴ１および配列ＦＷ２のセンスプライマーであって、配列ＦＷ２が、標的配列Ｂの断片に相補的であり、当該配列ＦＷ１またはＲＴ１およびＦＷ２が、１２～１４０ヌクレオチドのサイズの単一プライマーを形成するために隣接している、センスプライマーと、
－配列ＦＷ１またはＲＴ１および配列ＲＴ２のアンチセンスプライマーであって、配列ＲＴ２が、標的配列Ｂの断片に相補的であり、当該配列ＦＷ１またはＲＴ１およびＲＴ２が、１２～１４０ヌクレオチドのサイズの単一プライマーを形成するために隣接している、アンチセンスプライマーとを含む、少なくとも１つのプライマー対２。
【0043】
したがって、本発明はまた、ハイブリッドまたはキメラプライマー対であって、
－配列ＦＷ１またはＲＴ１および配列ＦＷ２のセンスプライマー（または第１のオリゴヌクレオチド）であって、配列ＦＷ２が、標的配列Ｂの断片に相補的であり、配列ＦＷ１またはＲＴ１が、それぞれ、混合物中により高い濃度で存在するプライマー対１のセンスまたはアンチセンスプライマーの配列に対応し、当該配列ＦＷ１またはＲＴ１およびＦＷ２が、１２～１４０ヌクレオチドの長さの単一のセンスプライマーを形成するように隣接している、センスプライマーと、
－配列ＦＷ１またはＲＴ１および配列ＲＴ２のアンチセンスプライマー（または第２のオリゴヌクレオチド）であって、配列ＲＴ２が、標的配列Ｂの断片に相補的であり、配列ＲＴ１またはＦＷ１が、それぞれ、混合物中に等しいまたはより高い濃度で存在するプライマー対１のアンチセンスまたはセンスプライマーの配列に対応し、当該配列ＦＷ１またはＲＴ１およびＦＷ２が、１２～１４０ヌクレオチドの長さの単一のセンスプライマーを形成するように隣接している、アンチセンスプライマーとを含む、ハイブリッドまたはキメラプライマー対に関する。
－配列ＦＷ１またはＲＴ１および配列ＦＷ２のセンスプライマー（または第１のオリゴヌクレオチド）であって、配列ＦＷ２が、標的配列Ｂの断片に相補的であり、配列ＦＷ１またはＲＴ１が、それぞれ、混合物中により高い濃度で存在するプライマー対１のセンスまたはアンチセンスプライマーの配列に対応し、当該配列ＦＷ１またはＲＴ１およびＦＷ２が、１２～１４０ヌクレオチドの長さの単一のセンスプライマーを形成するように隣接している、センスプライマーと、
－配列ＦＷ１またはＲＴ１および配列ＲＴ２のアンチセンスプライマー（または第２のオリゴヌクレオチド）であって、配列ＲＴ２が、標的配列Ｂの断片に相補的であり、配列ＲＴ１またはＦＷ１が、それぞれ、混合物中に等しいまたはより高い濃度で存在するプライマー対１のアンチセンスまたはセンスプライマーの配列に対応し、当該配列ＦＷ１またはＲＴ１およびＦＷ２が、１２～１４０ヌクレオチドの長さの単一のセンスプライマーを形成するように隣接している、アンチセンスプライマーとを含む、ハイブリッドまたはキメラプライマー対に関する。
【0044】
変異形によれば、本発明はまた、ハイブリッドまたはキメラプライマー対であって、
－配列ＦＷ１またはＲＴ１のセンスまたはアンチセンスプライマー（または第１のオリゴヌクレオチド）であって、配列ＦＷ１またはＲＴ１が、混合物中により高い濃度で存在する標的配列Ａの断片に相補的であり、当該配列が、６～７０ヌクレオチドの長さのものである、センスまたはアンチセンスプライマーと、
－配列ＦＷ１および配列ＲＴ１、または配列ＲＴ１および配列ＦＷ１のハイブリッドもしくはキメラセンスまたはアンチセンスプライマー（または第２のオリゴヌクレオチド）であって、当該プライマーが、配列ＦＷ１もしくはＲＴ１の第１のオリゴヌクレオチドと比較して低い濃度で混合物中に存在し、当該配列ＦＷ１およびＲＴ１、またはＲＴ１およびＦＷ１が、１２～１４０ヌクレオチドの長さの単一プライマーを形成するように隣接している、ハイブリッドまたはキメラセンスまたはアンチセンスプライマーとを含む、ハイブリッドまたはキメラプライマー対に関する。
－配列ＦＷ１またはＲＴ１のセンスまたはアンチセンスプライマー（または第１のオリゴヌクレオチド）であって、配列ＦＷ１またはＲＴ１が、混合物中により高い濃度で存在する標的配列Ａの断片に相補的であり、当該配列が、６～７０ヌクレオチドの長さのものである、センスまたはアンチセンスプライマーと、
－配列ＦＷ１および配列ＲＴ１、または配列ＲＴ１および配列ＦＷ１のハイブリッドもしくはキメラセンスまたはアンチセンスプライマー（または第２のオリゴヌクレオチド）であって、当該プライマーが、配列ＦＷ１もしくはＲＴ１の第１のオリゴヌクレオチドと比較して低い濃度で混合物中に存在し、当該配列ＦＷ１およびＲＴ１、またはＲＴ１およびＦＷ１が、１２～１４０ヌクレオチドの長さの単一プライマーを形成するように隣接している、ハイブリッドまたはキメラセンスまたはアンチセンスプライマーとを含む、ハイブリッドまたはキメラプライマー対に関する。
【0045】
デュプレックスリレーＰＣＲの間、本発明によれば、ＰＣＲ反応は、標準的なデュプレックスＰＣＲの場合と同様に、第１の核酸配列（Ａ）をハイブリダイズおよび増幅することができるプライマー対１と、第２の核酸配列（Ｂ）をハイブリダイズおよび増幅することができるプライマー対２とを含む混合物中で起こる。しかしながら、デュプレックスリレーＰＣＲは、第２のプライマー対のハイブリッドまたはキメラプライマー、および任意選択で第１のプライマー対のセンスまたはアンチセンスプライマーの使用において、標準的なデュプレックスＰＣＲとは異なる。
【0046】
したがって、第２のＰＣＲサイクルの効果により、プライマー対１は、プライマー対２によって生成されたアンプリコン、したがって、標的配列Ｂも増幅することができる。
【0047】
デュプレックスリレーＰＣＲは特に、試料を、核酸配列（Ａ）を増幅することができるプライマー対１および第２の核酸配列（Ｂ）を増幅することができるプライマー対２を含む反応混合物と接触させることを含む。
【0048】
プライマー対１は、各々、核酸（Ａ）の鎖のうちの１つの相補配列にハイブリダイズし、２つのプライマー間の鎖の相補配列に対応する配列を増幅することができる、第１のセンスプライマー（例えば、配列ＦＷ１）および第２のアンチセンスプライマー（例えば、配列ＲＴ１）で構成される。当該相補配列は、標的配列（Ａ）である。
【0049】
プライマー対２は、各々、核酸（Ｂ）の鎖のうちの１つの相補配列にハイブリダイズし、２つのプライマー間の鎖の相補配列に対応する配列を増幅することができる、第１のセンスプライマー（例えば、配列ＦＷ１－ＦＷ２）および第２のアンチセンスプライマー（例えば、配列ＲＴ１－ＲＴ２）で構成される。当該相補配列は、標的配列（Ｂ）である。
【0050】
さらに、反応混合物は、ＰＣＲ増幅を実施するために必要なすべての試薬および条件を含む。当該試薬は、最初に反応混合物中に存在するか、または試料の接触後に添加され得る。必要な試薬としては、特に、ＰＣＲおよび反応の条件に応じて当業者が選択することができるｄＮＴＰおよびポリメラーゼが挙げられる。ポリメラーゼは、好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓのポリメラーゼ、または当該ポリメラーゼの「クレノウ」断片である。
【0051】
すべての構成要素が反応混合物中に存在すると、増幅を開始することができる。
【0052】
ＰＣＲ反応の様々なステップは、当業者に既知である。ＰＣＲサイクルは、２つの一本鎖を得るために二本鎖を分離することを目的とする変性ステップ、続いてハイブリダイゼーションステップを含む。このステップの間、プライマーは、以前に変性された一本鎖のうちの１つに存在する相補配列を認識し、次いでハイブリダイズする。続いて伸長ステップが行われ、ポリメラーゼが一本鎖に相補的な鎖を合成することが可能となる。当該鎖は、反応混合物中に存在する遊離ｄＮＴＰから合成される。このステップの持続時間は、増幅される配列の長さに依存する。
【0053】
ＰＣＲ反応は、各々が同じステップを含む第２のサイクル、第３のサイクルなどを続ける。したがって、ＰＣＲの終了時に、プライマー間に含有される配列の増幅が達成される。当該配列は、アンプリコンに対応する。
【0054】
したがって、第１および第２の核酸配列の増幅は、試料中に存在する標的核酸配列（Ａ）および標的核酸配列（Ｂ）の増幅、好ましくは、試料中に存在する標的核酸配列（Ａ）および標的核酸配列（Ｂ）の同時増幅に基づく。
【0055】
本発明による方法は、プライマー対２の第１のプライマーが、５’に、プライマー対１の第１のプライマーの配列をさらに含み、プライマー対２の第２のプライマーが、５’に、プライマー対１の第２のプライマーの配列をさらに含むことを特徴とする。対２の第１のプライマーおよび対１の第１のプライマーの配列は隣接しており、対２の第２のプライマーおよび対１の第２のプライマーの配列も隣接している。
【0056】
変異形によれば、プライマー対２の第２のプライマーは、５’に、プライマー対１の第１または第２のプライマーの配列をさらに含む。対２の第１のプライマーおよび対１の第１のプライマーの配列は隣接しており、対２の第１または第２のプライマーおよび対１の第２のプライマーの配列も隣接している。
【0057】
好ましくは、プライマー対２の第１のプライマーは、標的配列（Ｂ）などの増幅される配列の相補配列とハイブリダイズすることができる核酸配列、さらに、５’に、プライマー対１の第１または第２のプライマーの配列を含み、プライマー対２の第２のプライマーは、標的配列（Ｂ）などの増幅される配列の相補配列とハイブリダイズすることができる核酸配列、さらに、５’に、プライマー対１の第１または第２のプライマーの配列を含む。標的配列（Ｂ）などの増幅される相補配列とハイブリダイズすることができる核酸配列は、プライマー１およびプライマー２によって異なる。特に、プライマー１はセンスプライマーであってもよく、プライマー２はアンチセンスプライマーであってもよい。
【0058】
好ましくは、第１のプライマー対は、第２のＰＣＲサイクルの効果により、第１の配列（Ａ）および第２の配列（Ｂ）を増幅することができる。実際、第１のＰＣＲサイクルの間、第１のプライマー対は、第１の配列（Ａ）を増幅することができ、第２のプライマー対は、第２の配列（Ｂ）を増幅することができる。第１のＰＣＲサイクルの終了時に、第１の対の第１のプライマーの配列および配列（Ａ）の相補配列を含む核酸配列、第１の対の第２のプライマーの配列および配列（Ａ）の相補配列を含む核酸配列、第２の対の第１のプライマーの配列および配列（Ｂ）の相補配列を含む核酸配列、ならびに第２の対の第２のプライマーの配列および配列（Ｂ）の相補配列を含む核酸配列を生成する。
【0059】
実際に、第２の対の第１のプライマーは、第１の対の第１のプライマーの配列と、配列（Ｂ）とハイブリダイズすることができる配列とを含み、第２の対の第２のプライマーは、第１の対の第２のプライマーの配列と、配列（Ｂ）とハイブリダイズすることができる配列とを含む。したがって、第２のサイクル中に、プライマー対１は、第１のサイクル中に生成された核酸配列を増幅することができる（図１）。
【0060】
一実施形態によれば、第１の対の第１のプライマーの配列は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５から選択され、第１の対の第２のプライマーの配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６から選択され、第２の対の第１のプライマーの配列は、配列番号７または配列番号９から選択され、第２の対の第２のプライマーの配列は、配列番号８または配列番号１０から選択される。当該配列は、以下の表１に列挙される。
【表1】
【0061】
診断の目的のために、すべての細菌に存在する遺伝子１６Ｓの可変領域を標的化することが目的のものである。
【0062】
遺伝子１６Ｓは、保存領域および可変領域、特に９つの可変領域および１０の保存領域を含む（図５を参照）。可変領域は、Ｖ１～Ｖ９の番号が付けられており、すべて保存領域に囲まれている。当業者は、一般的な知識に基づいて、遺伝子１６Ｓ上の当該領域を完全に決定することができる。Ｔｒｅｍｂｌａｙら、 ２０１５（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）は、例えば、試料中に存在する細菌を特定するために、当該領域を増幅および配列決定するためのこれらの多数の方法のうちの１つを記載している。
【0063】
したがって、好ましい実施形態によれば、目的の配列は、単一の遺伝子または少なくとも２つの別個の遺伝子の可変配列に対応し、より好ましくは、目的の配列は、遺伝子１６Ｓの可変配列に対応し、当該プライマーは、遺伝子１６Ｓの保存配列の少なくとも１２ヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。好ましくは、センスプライマーは、遺伝子１６Ｓの可変配列の５’位で当該遺伝子１６Ｓの保存配列の少なくとも１２ヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、アンチセンスプライマーは、遺伝子１６Ｓの可変配列の３’位で当該遺伝子１６Ｓの保存配列の少なくとも１２ヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。
【0064】
本発明の文脈内では、発明者らは、Ｖ１～Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４～Ｖ６、およびＶ７～Ｖ９などの目的の可変領域に隣接する保存領域上で特異的にハイブリダイズすることを可能にするプライマーを設計した。したがって、生成されたアンプリコンは、可変領域Ｖ１～Ｖ２またはＶ３またはＶ４～Ｖ６またはＶ７～Ｖ９の配列に対応し、その配列は、１つの病原体に特異的である。
【0065】
好ましい実施形態によれば、第１の対の第１のプライマー（センスプライマー）の配列は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２４から選択され、第１の対の第２のプライマー（アンチセンスプライマー）の配列は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７から選択される。
【0066】
好ましくは、第１の対の第１のプライマー（センスプライマー）の配列は、配列番号１４または配列番号１５から選択され、第１の対の第２のプライマー（アンチセンスプライマー）の配列は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２６、および配列番号２７から選択される。
【0067】
第２の対の第１のプライマー（センスプライマー）の配列は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号Ｓ４、または配列番号３５から選択され、第２の対の第２のプライマーの配列は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、または配列番号３８から選択される。当該配列は、以下の表１Ｂに列挙される。
【表2】
【0068】
遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とする第１のプライマー対は、好ましくは、以下で構成される：
－配列番号１４または配列番号１５と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
－配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー。
－配列番号１４または配列番号１５と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
－配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー。
【0069】
遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ４～Ｖ６を標的とするハイブリッドまたはキメラプライマーの第２の対は、好ましくは、以下で構成される：
－配列番号２８または配列番号２９または配列番号３０と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
－配列番号３１または配列番号３２または配列番号３３と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー。
－配列番号２８または配列番号２９または配列番号３０と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
－配列番号３１または配列番号３２または配列番号３３と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー。
【0070】
遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ７～Ｖ９を標的とする第２のプライマー対または第３のプライマー対は、好ましくは、以下で構成される：
－配列番号３４または配列番号３５と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
－配列番号３６または配列番号３７または配列番号３８と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー。
－配列番号３４または配列番号３５と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
－配列番号３６または配列番号３７または配列番号３８と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー。
【0071】
７０％の配列相同性は、特に、当該配列の３’位の最初の１０ヌクレオチドに関することが好ましい。
【0072】
より好ましくは、遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とする第１のプライマー対は、以下で構成される：
－配列番号１４または配列番号１５のセンスプライマー、および
－配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７のアンチセンスプライマー。
－配列番号１４または配列番号１５のセンスプライマー、および
－配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７のアンチセンスプライマー。
【0073】
遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ４～Ｖ６を標的とするハイブリッドまたはキメラプライマーの第２の対は、好ましくは、以下で構成される：
－配列番号２８または配列番号２９または配列番号３０のセンスプライマー、および
－アンチセンスプライマー配列番号３１または配列番号３２または配列番号３３。
－配列番号２８または配列番号２９または配列番号３０のセンスプライマー、および
－アンチセンスプライマー配列番号３１または配列番号３２または配列番号３３。
【0074】
遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ７～Ｖ９を標的とする第２のプライマー対または第３のプライマー対は、好ましくは、以下で構成される：
－配列番号３４または配列番号３５のセンスプライマー、および
－アンチセンスプライマー配列番号３６または配列番号３７または配列番号３８。
－配列番号３４または配列番号３５のセンスプライマー、および
－アンチセンスプライマー配列番号３６または配列番号３７または配列番号３８。
【0075】
本発明による方法の間、プライマー対２の濃度は、プライマー対１の濃度未満、それより大きい、またはそれと等しくてもよい。したがって、１つのプライマー対を別のプライマー対と比較して促進するか、または促進せず、したがって、目的の１つの配列の増幅を促進することが可能である。
【0076】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、プライマー対２の濃度は、プライマー対１の濃度以下であり、より好ましくはそれ未満である。プライマー対２の濃度がプライマー対１の濃度よりも低い場合、プライマー対２は、第１の対に対して不利である。したがって、プライマー対１によって生成されたアンプリコンは、より多くの量で存在する。次いで配列決定が行われる場合、標的Ａのアンプリコンは過剰に提示されるため、優先的に配列決定される。したがって、その配列をより迅速に得ることができる。
【0077】
本発明による方法は、プライマー対１によって、プライマー対２によって生成されるアンプリコンの少なくとも４倍の量のアンプリコンを生成することを可能にする。したがって、第２の対によって生成されたアンプリコンは、より少ない量で存在し、配列決定中にあまり速く除去されない。
【0078】
プライマー１対とプライマー２対の濃度比は、好ましくは１：１～１０００：１、さらにより好ましくは１：１～１００：１である。特に有利な実施形態によれば、プライマー対１とプライマー対２の濃度比は、１０：１、より好ましくは２５：１の間である。この種の比は、例えば、１ｍＭのプライマー対１の濃度、および０．１ｍＭまたは０．０４ｍＭのプライマー対２の濃度に対応し得る。
【0079】
別の実施形態によれば、本発明による方法は、さらに、試料を、第３の核酸配列（Ｃ）を増幅することができる第３のプライマー対と接触させることを含み得る。プライマー対３の第１のプライマーは、相補配列（Ｃ）とハイブリダイズすることができる核酸配列、さらに、５’に、プライマー対１の第１のプライマーまたは第２のプライマーの配列に対応する配列を含む。プライマー対３の第２のプライマーは、相補配列（Ｃ）とハイブリダイズすることができる核酸配列、さらに、５’に、プライマー対１の第１または第２のプライマーの配列に対応する配列を含む。
【0080】
したがって、本発明による方法は、３つの異なる標的核酸配列、特に配列Ａ、配列Ｂ、および配列Ｃを増幅することを可能にする３つの異なるプライマー対を含む。当該方法は、トリプレックスリレーと称されるＰＣＲである。
【0081】
配列ＢおよびＣは、各々、より高い濃度で存在するプライマー対１のセンスプライマーの配列、およびより高い濃度で存在するプライマー対１のセンスまたはアンチセンスプライマーの配列を含む、ハイブリッドまたはキメラセンスおよびアンチセンスプライマーによって増幅されることが好ましい。
【0082】
したがって、本発明による方法は、以下を使用する：
－標的配列Ａを増幅することができる少なくとも１つのプライマー対１であって、
－標的配列Ａの断片に相補的である配列ＦＷ１のセンスプライマーであって、当該プライマーが、６～７０ヌクレオチドのサイズである、センスプライマーと、
■標的配列Ａの断片に相補的である配列ＲＴ１のアンチセンスプライマーであって、当該プライマーが、６～７０ヌクレオチドのサイズである、アンチセンスプライマーとを含む、少なくとも１つのプライマー対１、ならびに
－標的配列Ｂを増幅することができる少なくとも１つのハイブリッドまたはキメラプライマー対２であって、
■配列ＦＷ１またはＲＴ１および配列ＦＷ２のセンスプライマーであって、配列ＦＷ２が、標的配列Ｂの断片に相補的であり、当該配列ＦＷ１またはＲＴ１およびＦＷ２が、１２～１４０ヌクレオチドのサイズの単一プライマーを形成するために隣接している、センスプライマーと、
■配列ＦＷ１またはＲＴ１および配列ＲＴ２のアンチセンスプライマーであって、配列ＲＴ２が、標的配列Ｂの断片に相補的であり、当該配列ＦＷ１またはＲＴ１およびＲＴ２が、１２～１４０ヌクレオチドのサイズの単一プライマーを形成するために隣接している、アンチセンスプライマーとを含む、少なくとも１つのハイブリッドまたはキメラプライマー対２、ならびに
－標的配列Ｃを増幅することができる少なくとも１つのプライマー対３であって、
■配列ＦＷ１および配列ＦＷ３のセンスプライマーであって、配列ＦＷ３が、標的配列Ｃの断片に相補的であり、当該配列ＦＷ１およびＦＷ３が、１２～１４０ヌクレオチドのサイズの単一プライマーを形成するために隣接している、センスプライマーと、
■配列ＦＷ１またはＲＴ１および配列ＲＴ３のアンチセンスプライマーであって、配列ＲＴ３が、標的配列Ｃの断片に相補的であり、当該配列ＦＷ１またはＲＴ１およびＲＴ３が、１２～１４０ヌクレオチドのサイズの単一プライマーを形成するために隣接している、アンチセンスプライマーとを含む、少なくとも１つのプライマー対３。
－標的配列Ａを増幅することができる少なくとも１つのプライマー対１であって、
－標的配列Ａの断片に相補的である配列ＦＷ１のセンスプライマーであって、当該プライマーが、６～７０ヌクレオチドのサイズである、センスプライマーと、
■標的配列Ａの断片に相補的である配列ＲＴ１のアンチセンスプライマーであって、当該プライマーが、６～７０ヌクレオチドのサイズである、アンチセンスプライマーとを含む、少なくとも１つのプライマー対１、ならびに
－標的配列Ｂを増幅することができる少なくとも１つのハイブリッドまたはキメラプライマー対２であって、
■配列ＦＷ１またはＲＴ１および配列ＦＷ２のセンスプライマーであって、配列ＦＷ２が、標的配列Ｂの断片に相補的であり、当該配列ＦＷ１またはＲＴ１およびＦＷ２が、１２～１４０ヌクレオチドのサイズの単一プライマーを形成するために隣接している、センスプライマーと、
■配列ＦＷ１またはＲＴ１および配列ＲＴ２のアンチセンスプライマーであって、配列ＲＴ２が、標的配列Ｂの断片に相補的であり、当該配列ＦＷ１またはＲＴ１およびＲＴ２が、１２～１４０ヌクレオチドのサイズの単一プライマーを形成するために隣接している、アンチセンスプライマーとを含む、少なくとも１つのハイブリッドまたはキメラプライマー対２、ならびに
－標的配列Ｃを増幅することができる少なくとも１つのプライマー対３であって、
■配列ＦＷ１および配列ＦＷ３のセンスプライマーであって、配列ＦＷ３が、標的配列Ｃの断片に相補的であり、当該配列ＦＷ１およびＦＷ３が、１２～１４０ヌクレオチドのサイズの単一プライマーを形成するために隣接している、センスプライマーと、
■配列ＦＷ１またはＲＴ１および配列ＲＴ３のアンチセンスプライマーであって、配列ＲＴ３が、標的配列Ｃの断片に相補的であり、当該配列ＦＷ１またはＲＴ１およびＲＴ３が、１２～１４０ヌクレオチドのサイズの単一プライマーを形成するために隣接している、アンチセンスプライマーとを含む、少なくとも１つのプライマー対３。
【0083】
方法の間、プライマー対３の濃度は、プライマー対１の濃度未満、もしくはそれより大きい、もしくはそれと等しく、かつ／またはプライマー対２の濃度は、プライマー対１の濃度未満、もしくはそれより大きい、もしくはそれと等しい。したがって、１つのプライマー対を別のプライマー対と比較して促進するか、または促進しないことが可能である。好ましくは、プライマー対３の濃度は、プライマー対１の濃度未満であり、かつ／またはプライマー対２の濃度は、プライマー対１の濃度未満である。
【0084】
好ましくは、プライマー対１の濃度は、第２および／または第３のプライマー対の濃度よりも高く、プライマー対２の濃度は、プライマー対３の濃度と等しい。
【0085】
一実施形態によれば、プライマー対１の濃度は、第２および第３のプライマー対の濃度よりも大きく、プライマー対２の濃度は、プライマー対３の濃度よりも大きい。したがって、第１の対は第２の対と比較して促進され、第２の対も第３の対と比較して促進される。
【0086】
別の実施形態によれば、本発明による方法は、さらに、試料を、第４の核酸配列（Ｄ）を増幅することができる、ハイブリッドまたはキメラと称される第４のプライマー対と接触させることを含み得る。プライマー対４の第１のプライマーは、相補配列（Ｄ）とハイブリダイズすることができる核酸配列、さらに、５’に、プライマー対１の第１のプライマーまたは第２のプライマーの配列に対応する配列を含む。プライマー対４の第２のプライマーは、相補配列（Ｄ）とハイブリダイズすることができる核酸配列、さらに、５’に、プライマー対１の第１のプライマーまたは第２のプライマーの配列に対応する配列を含む。
【0087】
好ましくは、第４のプライマー対の濃度は、プライマー対１の濃度以下であり、第２、第３、および第４の対の濃度は同一である。
【0088】
別の実施形態によれば、本発明による方法は、さらに、試料を、第ｎの核酸配列を増幅することができる第ｎのプライマー対と接触させることを含み得る。プライマー対ｎの第１のプライマーは、標的相補配列とハイブリダイズすることができる核酸配列、さらに、５’に、プライマー対１の第１のプライマーまたは第２のプライマーの配列に対応する配列を含む。プライマー対ｎの第２のプライマーは、標的相補配列とハイブリダイズすることができる核酸配列、さらに５’に、プライマー対１の第１のプライマーまたは第２のプライマーの配列に対応する配列を含む。
【0089】
好ましくは、第ｎのプライマー対の濃度は、プライマー対１の濃度以下であり、第２、第３、第４、および第ｎの対の濃度は同一である。
【0090】
本発明の意味の範囲内で、「ｎ」は、正の数である自然数を意味し、各々を１としてカウントすることで、物体を列挙することが可能である。したがって、単一の後継としての整数、すなわち、それよりも直ちに大きい整数であり、自然数のリストは無限である。
【0091】
さらに、本発明による方法を実施することを可能にする反応媒体は、フルオロフォアに結合された１つ以上の特定のプローブを含んでよく、その発光スペクトルは他のものとは異なる。したがって、ＰＣＲ反応の各生成物は、当該特異的プローブによってリアルタイムで測定される。
【0092】
したがって、一実施形態によれば、本発明による方法は、フルオロフォア、好ましくは「ＴａｑＭａｎ」プローブに結合したプローブを使用することによるアンプリコンの定量化のステップをさらに含む。
【0093】
本発明によるこの種のプローブは、以下の表２に列挙される。
【表3】
【0094】
別の実施形態によれば、本発明による方法は、蛍光プローブ、蛍光マーキング、融解曲線、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、またはＤＮＡ配列決定による、アンプリコン、したがって微生物の検出ステップを含む。
【0095】
アンプリコンの検出が配列決定によって実施される場合、方法は、増幅された核酸またはアンプリコンを配列決定するステップをさらに含む。
【0096】
特に好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、少なくとも１つの感染症、好ましくは細菌に関与する微生物（細菌、酵母、ウイルスなど）の検出および特定することを可能にする。
【0097】
本発明による方法はまた、腫瘍学で遺伝子疾患の診断に、および分子生物学で一般的な方法で使用することができる。
【0098】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１および配列番号２、または配列番号３および配列番号４、または配列番号５および配列番号６を含むプライマー対１と、配列番号７および配列番号８、または配列番号９および配列番号１０を含むプライマー対２とを含むキットに関する。
【0099】
好ましい実施形態によれば、本発明は、以下を含むキットに関する：
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
■配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ４～Ｖ６を標的とするプライマー対２：
■配列番号２８または配列番号２９または配列番号３０と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
■配列番号３１または配列番号３２または配列番号３３と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー。
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
■配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ４～Ｖ６を標的とするプライマー対２：
■配列番号２８または配列番号２９または配列番号３０と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
■配列番号３１または配列番号３２または配列番号３３と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー。
【0100】
別の好ましい実施形態によれば、本発明は、以下を含むキットに関する：
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
■配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ７～Ｖ９を標的とするプライマー対２：
■配列番号３４または配列番号３５と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
■配列番号３６または配列番号３７または配列番号３８と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー。
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
■配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ７～Ｖ９を標的とするプライマー対２：
■配列番号３４または配列番号３５と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
■配列番号３６または配列番号３７または配列番号３８と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー。
【0101】
別の実施形態によれば、本発明は、以下を含むキットに関する：
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
■配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ４～Ｖ６を標的とするプライマー対２：
■配列番号２８または配列番号２９または配列番号３０と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
■配列番号３１または配列番号３２または配列番号３３と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ７～Ｖ９を標的とするプライマー対３：
■配列番号３４または配列番号３５と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
■配列番号３６または配列番号３７または配列番号３８と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー。
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
■配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ４～Ｖ６を標的とするプライマー対２：
■配列番号２８または配列番号２９または配列番号３０と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
■配列番号３１または配列番号３２または配列番号３３と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ７～Ｖ９を標的とするプライマー対３：
■配列番号３４または配列番号３５と少なくとも７０％の配列相同性を有するセンスプライマー、および
■配列番号３６または配列番号３７または配列番号３８と少なくとも７０％の配列相同性を有するアンチセンスプライマー。
【0102】
上記実施形態のいずれかに記載のキットは、好ましくは、７０％の配列相同性が、特に、当該配列の３’位の最初の１０ヌクレオチドに関するプライマーを含む。
【0103】
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、以下を含むキットに関する：
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ４～Ｖ６を標的とするプライマー対２：
■配列番号２８または配列番号２９または配列番号３０のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号３１または配列番号３２または配列番号３３。
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ４～Ｖ６を標的とするプライマー対２：
■配列番号２８または配列番号２９または配列番号３０のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号３１または配列番号３２または配列番号３３。
【0104】
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、以下を含むキットに関する：
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ７～Ｖ９を標的とするプライマー対２：
■配列番号３４または配列番号３５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号３６または配列番号３７または配列番号３８。
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ７～Ｖ９を標的とするプライマー対２：
■配列番号３４または配列番号３５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号３６または配列番号３７または配列番号３８。
【0105】
別の特に好ましい実施形態によれば、本発明は、以下を含むキットに関する：
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ４～Ｖ６を標的とするプライマー対２：
■配列番号２８または配列番号２９または配列番号３０のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号３１または配列番号３２または配列番号３３、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ７～Ｖ９を標的とするプライマー対３：
■配列番号３４または配列番号３５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号３６または配列番号３７または配列番号３８。
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対１：
■配列番号１４または配列番号１５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号１６または配列番号１７または配列番号２６または配列番号２７、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ４～Ｖ６を標的とするプライマー対２：
■配列番号２８または配列番号２９または配列番号３０のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号３１または配列番号３２または配列番号３３、
－以下で構成される遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ７～Ｖ９を標的とするプライマー対３：
■配列番号３４または配列番号３５のセンスプライマー、および
■アンチセンスプライマー配列番号３６または配列番号３７または配列番号３８。
【0106】
本発明によるキットは、好ましくは、本発明の方法を実施することができる。
【0107】
本発明はまた、細菌、ウイルス、または酵母などの感染症の場合に存在する微生物を検出するための本発明によるキットの使用にも関する。本発明は、好ましくは、対象または植物における感染症を診断するためのキットの使用に関する。
【0108】
本発明はまた、少なくとも１つの遺伝子疾患または少なくとも１つのがんを検出するための本発明によるキットの使用に関する。
【実施例】
【0109】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの特異的遺伝子の２つの配列を増幅するための本発明による方法の実施例１（図２Ａ／２Ｂ／２Ｃ）
材料および方法
リレーＰＣＲ反応は、以下の方法で実施された：供給業者の条件に従って、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５のＦａｓｔＳｔａｒｔポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）の単位、および緩衝液。プライマー対１のＴａｑＭａｎプローブは０．２５ｍＭであり、プライマー対２のプローブは０．１ｍＭであった。プライマー対を異なる濃度で設定した：標準的なデュプレックスに関しては１ｍＭ、デュプレックス－リレーでのプライマー対１に関しては１ｍＭ、およびデュプレックスリレーでのプライマー対２に関しては０．１ｍＭまたは１ｍＭ。サイクルは以下の通りであった：９５℃で１０分間変性し、次いで９５℃で１５秒／５５℃で１５秒／６８℃で１５秒で５５サイクル。増幅を実施するために、試験した各細菌のおよそ１００当量のゲノムコピーをミックスに添加した。
材料および方法
リレーＰＣＲ反応は、以下の方法で実施された：供給業者の条件に従って、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５のＦａｓｔＳｔａｒｔポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）の単位、および緩衝液。プライマー対１のＴａｑＭａｎプローブは０．２５ｍＭであり、プライマー対２のプローブは０．１ｍＭであった。プライマー対を異なる濃度で設定した：標準的なデュプレックスに関しては１ｍＭ、デュプレックス－リレーでのプライマー対１に関しては１ｍＭ、およびデュプレックスリレーでのプライマー対２に関しては０．１ｍＭまたは１ｍＭ。サイクルは以下の通りであった：９５℃で１０分間変性し、次いで９５℃で１５秒／５５℃で１５秒／６８℃で１５秒で５５サイクル。増幅を実施するために、試験した各細菌のおよそ１００当量のゲノムコピーをミックスに添加した。
【0110】
結果
目的の２つの配列の増幅は、標準的なデュプレックスＰＣＲ、１０：１のプライマー対１：プライマー対２の比を有する本発明によるリレーＰＣＲ、および１：１のプライマー対１：プライマー対２の比を有する本発明によるリレーＰＣＲによって実施した。
目的の２つの配列の増幅は、標準的なデュプレックスＰＣＲ、１０：１のプライマー対１：プライマー対２の比を有する本発明によるリレーＰＣＲ、および１：１のプライマー対１：プライマー対２の比を有する本発明によるリレーＰＣＲによって実施した。
【0111】
標準的なデュプレックスＰＣＲの文脈内では、２つのプライマー対を高濃度で使用した。遺伝子Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの特異的配列の増幅を可能にするプライマー対は、配列番号３および配列番号４の配列のプライマーから形成され、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの増幅を可能にする対は配列番号１および配列番号２の配列のプライマーで構成される。結果を図２Ａおよび表３に示す。したがって、発明者らは、Ｃｑ（蛍光シグナルの検出を開始するサイクルの数）の重なりを観察しており、これは、同一量の細菌ゲノムが実際にＰＣＲミックスに添加されていることを意味する。さらに、同じ量のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのアンプリコンが生成された。
【0112】
１０：１の比を有するデュプレックスリレーＰＣＲ中に、プライマー対１は配列番号２および配列番号３の配列のプライマーから形成され、プライマー対２は配列番号７および配列番号８の配列のプライマーで構成される。第１のプライマー対は、遺伝子Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの特異的配列を増幅することを可能にし、第２のハイブリッドまたはキメラプライマー対は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの遺伝子の特異的配列を増幅することを可能にする。結果を図２Ｂおよび表３に示す。したがって、発明者らは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉアンプリコンとの間に曲線のＣｑオフセットを観察した。デュプレックスリレーＰＣＲによってもたらされたこの遅延は、１０：１のプライマー比に関して２．０９サイクル（３５．２７～３３．１８）、すなわちおよそ因子４（２＾１．９９）であった。これは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのアンプリコンと比較して、遺伝子Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに関しておよそ４倍少ないアンプリコンの差異量につながる。
【0113】
１：１の比を有するリレーＰＣＲの間、使用されるプライマー対は、リレーＰＣＲで使用されるものと同一である（比１０：１）。結果を図２Ｃおよび表３に示す。したがって、発明者らはまた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉアンプリコンとの間に曲線のＣｑオフセットを観察した。デュプレックスリレーＰＣＲによってもたらされたこの遅延は、１．７９サイクル（３５．６８～３３．８９）、すなわち、およそ因子３．５（２＾１．７９）であった。アンプリコンの差異量は、同様の因子に関して、ここでも観察された。
【表4】
【0114】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの特異的遺伝子の２つの配列を増幅するための本発明による方法の実施例２（図３Ａ／３Ｂ／３Ｃ）
材料および方法は、実施例１に記載されているものと同一である。
材料および方法は、実施例１に記載されているものと同一である。
【0115】
結果
目的の２つの配列の増幅は、標準的なデュプレックスＰＣＲ、１０：１のプライマー対１：プライマー対２の比を有する本発明によるデュプレックスリレーＰＣＲ、および１：１のプライマー対１：プライマー対２の比を有する本発明によるデュプレックスリレーＰＣＲによって実施した。
目的の２つの配列の増幅は、標準的なデュプレックスＰＣＲ、１０：１のプライマー対１：プライマー対２の比を有する本発明によるデュプレックスリレーＰＣＲ、および１：１のプライマー対１：プライマー対２の比を有する本発明によるデュプレックスリレーＰＣＲによって実施した。
【0116】
標準的なデュプレックスＰＣＲの文脈内では、２つのプライマー対を高濃度で使用した。遺伝子Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの特異的配列の増幅を可能にするプライマー対は、配列番号５および配列番号６の配列のプライマーから形成され、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの増幅を可能にする対は配列番号３および配列番号４の配列のプライマーで構成される。結果を図３Ａおよび表４に示す。したがって、発明者らは、Ｃｑ（蛍光シグナルの検出を開始するサイクルの数）の重なりを観察しており、これは、同一量の細菌ゲノムが実際にＰＣＲミックスに添加されていることを意味する。さらに、同じ量のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのアンプリコンが生成された。
【0117】
１０：１の比を有するリレーＰＣＲ中に、プライマー対１は配列番号５および配列番号６の配列のプライマーから形成され、プライマー対２は配列番号９および配列番号１０の配列のプライマーで構成される。第１のプライマー対は、遺伝子Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの特異的配列を増幅することを可能にし、第２のキメラプライマー対は、遺伝子Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの特異的配列を増幅することを可能にする。結果を図３Ｂおよび表４に示す。したがって、発明者らは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓアンプリコンとの間に曲線のＣｑオフセットを観察した。デュプレックスリレーＰＣＲによってもたらされたこの遅延は、１０：１のプライマー比に関して１．９９サイクル（３５．３５～３３．３６）、すなわち、およそ因子４（２＾１．９９）であった。これは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのアンプリコンと比較して、遺伝子Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに関しておよそ４倍少ないアンプリコンの差異量につながる。
【0118】
１：１の比を有するリレーＰＣＲの間、使用されるプライマー対は、リレーＰＣＲで使用されるものと同一である（比１０：１）。結果を図３Ｃおよび表４に示す。発明者らはまた、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓアンプリコンとの間に曲線のＣｑオフセットを観察した。デュプレックスリレーＰＣＲによってもたらされたこの遅延は、２．５９サイクル（３６．４３～３３．８４）、すなわち、およそ因子６（２＾２．５９）であった。これは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのアンプリコンと比較して、遺伝子Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに関しておよそ６倍少ないアンプリコンの差異量につながる。
【表5】
【0119】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの２つの配列の増幅のための標準的なマルチプレックスＰＣＲと比較した本発明による方法の実施例３（図６）
材料および方法
リレーＰＣＲ反応は、以下の方法で実施された：供給業者の条件に従って、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５のＦａｓｔＳｔａｒｔポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）の単位、および緩衝液。プライマー対を異なる濃度で設定した：標準的なシンプレックスに関しては１ｍＭ、標準的なデュプレックスに関しては１ｍＭ、デュプレックス－リレーでのプライマー対１に関しては１ｍＭ、およびデュプレックスリレーでのプライマー対２に関しては０．０４ｍＭ。サイクルは以下の通りであった：９５℃で１０分間変性し、次いで９５℃で１５秒／５５℃で１５秒／６８℃で３０秒で６５サイクル。増幅を実施するために、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのおよそ１００当量のゲノムコピーをミックスに添加した。
材料および方法
リレーＰＣＲ反応は、以下の方法で実施された：供給業者の条件に従って、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５のＦａｓｔＳｔａｒｔポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）の単位、および緩衝液。プライマー対を異なる濃度で設定した：標準的なシンプレックスに関しては１ｍＭ、標準的なデュプレックスに関しては１ｍＭ、デュプレックス－リレーでのプライマー対１に関しては１ｍＭ、およびデュプレックスリレーでのプライマー対２に関しては０．０４ｍＭ。サイクルは以下の通りであった：９５℃で１０分間変性し、次いで９５℃で１５秒／５５℃で１５秒／６８℃で３０秒で６５サイクル。増幅を実施するために、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのおよそ１００当量のゲノムコピーをミックスに添加した。
【0120】
結果
目的の２つの配列の増幅は、２５：１のプライマー対１：プライマー対２の比を有する、本発明による標準的なデュプレックスＰＣＲ（図６、ライン３）およびデュプレックスリレーＰＣＲ（図６、ライン４）によって実施した。
目的の２つの配列の増幅は、２５：１のプライマー対１：プライマー対２の比を有する、本発明による標準的なデュプレックスＰＣＲ（図６、ライン３）およびデュプレックスリレーＰＣＲ（図６、ライン４）によって実施した。
【0121】
ライン１は、遺伝子１６Ｓの５’の領域のアンプリコン（可変域Ｖ１～Ｖ２を網羅する）を表す（対照ＰＣＲ）。
【0122】
ライン２は、遺伝子１６Ｓの中央領域のアンプリコン（可変域Ｖ４～Ｖ６を網羅する）を表す（対照ＰＣＲ）。
【0123】
ライン３は、遺伝子１６ＳのＶ１～Ｖ２およびＶ４～Ｖ６の領域の標準的なマルチプレックスＰＣＲにおけるアンプリコンを表す。
【0124】
ライン４は、本発明による方法（マルチプレックスリレーＰＣＲ）を用いた遺伝子１６Ｓの領域Ｖ１～Ｖ２およびＶ４～のアンプリコンを表す。
【0125】
標準的なデュプレックスＰＣＲの文脈内では、２つのプライマー対を高濃度で使用した（ライン３）。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの配列Ｖ１Ｖ２の増幅を可能にするプライマー対は、配列番号１４および配列番号１６の配列のプライマーから形成され、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの配列Ｖ４～Ｖ６の増幅を可能にする対は、配列番号２０および配列番号２３の配列のプライマーで構成される。結果を図６に示す。発明者らは、遺伝子１６Ｓの領域Ｖ１～Ｖ２のアンプリコンが存在しないことを観察し（ライン３および左側の矢印）、マルチプレックスＰＣＲの標準的な条件が、遺伝子１６Ｓの２つの領域の同時増幅と互換性がないことを示した。
【0126】
２５：１の比を有するリレーＰＣＲ中に、プライマー対１は配列番号１４および配列番号１６の配列のプライマーから形成され、プライマー対２は配列番号２８および配列番号３３の配列のプライマーで構成される。第１のプライマー対は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの領域Ｖ１～Ｖ２を増幅することができ、第２のキメラプライマー対は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの領域Ｖ４～Ｖ６を増幅することができる。結果を図６に示す。したがって、発明者らは、リレーＰＣＲの条件により、遺伝子１６Ｓの２つの領域を同時に共増幅することが可能であり（ライン４）、領域Ｖ１～Ｖ２のアンプリコンは、中央領域よりも大きい量で存在する（サイズが小さいにもかかわらず、アンプリコンＶ１～Ｖ２のシグナルがより強い）ことを観察した。
【0127】
したがって、本発明による方法は、標準的なマルチプレックスＰＣＲに反して、２つの標的化領域を共増幅することを可能にする。したがって、本発明によるキメラプライマーの特定の構造は、従来技術の問題、特にマルチプレックスＰＣＲの問題を克服することを可能にする。
【0128】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの３つの配列の増幅のための標準的なマルチプレックスＰＣＲと比較した本発明による方法の実施例４（図７）
材料および方法
リレーＰＣＲ反応は、以下の方法で実施された：供給業者の条件に従って、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５のＦａｓｔＳｔａｒｔポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）の単位、および緩衝液。プライマー対を異なる濃度で設定した：標準的なトリプレックスに関しては１ｍＭ、トリプレックスリレーでのプライマー対１に関しては１ｍＭ、ならびにトリプレックスリレーでのプライマー対２およびプライマー対３に関しては０．０４ｍＭ。サイクルは以下の通りであった：９５℃で１０分間変性し、次いで９５℃で１５秒／５５℃で１５秒／６８℃で１８秒で６５サイクル。増幅を実施するために、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのおよそ１００当量のゲノムコピーをミックスに添加した。
材料および方法
リレーＰＣＲ反応は、以下の方法で実施された：供給業者の条件に従って、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５のＦａｓｔＳｔａｒｔポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）の単位、および緩衝液。プライマー対を異なる濃度で設定した：標準的なトリプレックスに関しては１ｍＭ、トリプレックスリレーでのプライマー対１に関しては１ｍＭ、ならびにトリプレックスリレーでのプライマー対２およびプライマー対３に関しては０．０４ｍＭ。サイクルは以下の通りであった：９５℃で１０分間変性し、次いで９５℃で１５秒／５５℃で１５秒／６８℃で１８秒で６５サイクル。増幅を実施するために、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのおよそ１００当量のゲノムコピーをミックスに添加した。
【0129】
結果
標準的なトリプレックスＰＣＲの文脈内では、３つのプライマー対を高濃度で使用した（ライン１）。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの特異的配列（Ｖ１～Ｖ２）の増幅を可能にするプライマー対は、配列番号１４および配列番号１６の配列のプライマーから形成され、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの特異的配列（Ｖ４～Ｖ６）の増幅を可能にする対は、配列番号２０および配列番号２３の配列のプライマーで構成され、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの特異的配列（Ｖ７～Ｖ９）の増幅を可能にする対は、配列番号２４および配列番号２５の配列のプライマーで構成される。
標準的なトリプレックスＰＣＲの文脈内では、３つのプライマー対を高濃度で使用した（ライン１）。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの特異的配列（Ｖ１～Ｖ２）の増幅を可能にするプライマー対は、配列番号１４および配列番号１６の配列のプライマーから形成され、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの特異的配列（Ｖ４～Ｖ６）の増幅を可能にする対は、配列番号２０および配列番号２３の配列のプライマーで構成され、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの特異的配列（Ｖ７～Ｖ９）の増幅を可能にする対は、配列番号２４および配列番号２５の配列のプライマーで構成される。
【0130】
トリプレックスリレーＰＣＲ（ライン２）の文脈内では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの特異的配列（Ｖ１Ｖ２）の増幅を可能にするプライマー対は、配列番号１４および配列番号１６の配列のプライマーから形成され、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの特異的配列（Ｖ４～Ｖ６）の増幅を可能にする対は、配列番号２８および配列番号３３の配列のプライマーで構成され、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの特異的配列（Ｖ７～Ｖ９）の増幅を可能にする対は、配列番号３４および配列番号３６の配列のプライマーで構成される。領域Ｖ１～Ｖ２を標的とするプライマー対は高濃度で設定され、他のハイブリッドまたはキメラプライマー対は低濃度で設定される。結果を図７に示す。
【0131】
発明者らは、標的化領域、特にＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの可変領域Ｖ１およびＶ２が、標準的なトリプレックスによって十分に増幅されなかったことを観察した。対照的に、トリプレックスリレーは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの３つの領域、すなわち、領域Ｖ１～Ｖ２（３４３ｐｂ）、領域Ｖ７～Ｖ９（標準的なデュプレックスＰＣＲでは４１３ｂｐ、およびデュプレックスリレーＰＣＲでは４４７ｂｐ）、および領域Ｖ４～Ｖ６（標準的なデュプレックスＰＣＲでは５０９ｂｐ、およびデュプレックスリレーＰＣＲでは５４３ｂｐ）を増幅することができる。
【0132】
したがって、本発明による方法は、３つの標的化領域を共増幅することを可能にする。
【0133】
高濃度の１つのプライマー、および低濃度の１つのハイブリッドまたはキメラプライマーを含むプライマー対１を用いた本発明による方法の実施例５（図８）。
材料および方法
２つのリレーＰＣＲ反応は、以下の方法で実施された：供給業者の条件に従って、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５のＦａｓｔＳｔａｒｔポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）の単位、および緩衝液。デュプレックスリレーの第１の条件下で、プライマーを異なる濃度に設定した：対１の２つのプライマーに関しては１ｍＭ、およびプライマー対２については０．０４ｍＭ。デュプレックスリレーの第２の条件下で、プライマーを異なる濃度に設定した：対１の第１の標準的なプライマーに関しては１ｍＭ、対１の第２のキメラプライマーに関しては０．０４ｍＭ、および対２のキメラプライマーに関しては０．０４ｍＭ。サイクルは以下の通りであった：９５℃で１０分間変性し、次いで９５℃で１５秒／５５℃で１５秒／６８℃で４５秒で５５サイクル。増幅を実施するために、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのおよそ１００当量のゲノムコピーをミックスに添加した。
材料および方法
２つのリレーＰＣＲ反応は、以下の方法で実施された：供給業者の条件に従って、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５のＦａｓｔＳｔａｒｔポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）の単位、および緩衝液。デュプレックスリレーの第１の条件下で、プライマーを異なる濃度に設定した：対１の２つのプライマーに関しては１ｍＭ、およびプライマー対２については０．０４ｍＭ。デュプレックスリレーの第２の条件下で、プライマーを異なる濃度に設定した：対１の第１の標準的なプライマーに関しては１ｍＭ、対１の第２のキメラプライマーに関しては０．０４ｍＭ、および対２のキメラプライマーに関しては０．０４ｍＭ。サイクルは以下の通りであった：９５℃で１０分間変性し、次いで９５℃で１５秒／５５℃で１５秒／６８℃で４５秒で５５サイクル。増幅を実施するために、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのおよそ１００当量のゲノムコピーをミックスに添加した。
【0134】
結果
第１のデュプレックスリレーＰＣＲ（ライン１）の文脈内では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの配列Ｖ１～Ｖ２の増幅を可能にするプライマー対は、高濃度の配列番号１４および配列番号１６の配列のプライマーから形成され、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの領域Ｖ７～Ｖ９の増幅を可能にする対は、低濃度の配列番号３４および配列番号３６の配列のキメラプライマーで構成される。
第１のデュプレックスリレーＰＣＲ（ライン１）の文脈内では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの配列Ｖ１～Ｖ２の増幅を可能にするプライマー対は、高濃度の配列番号１４および配列番号１６の配列のプライマーから形成され、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの領域Ｖ７～Ｖ９の増幅を可能にする対は、低濃度の配列番号３４および配列番号３６の配列のキメラプライマーで構成される。
【0135】
第２のデュプレックスリレーＰＣＲ（ライン２）の文脈内では、対１の一方の単一プライマー（配列番号１４）を高濃度に設定し、ハイブリッドプライマーである他方のプライマー（配列番号２６）を低濃度に設定した。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの配列Ｖ１Ｖ２の増幅を可能にするプライマー対は、配列番号１４および配列番号２６の配列のプライマーから形成され、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの遺伝子１６Ｓの領域Ｖ７～Ｖ９の増幅を可能にする対は、配列番号３４および配列番号３７の配列のプライマーで構成される。結果を図８に示す。
【0136】
発明者らは、２つの条件下で、領域Ｖ１～Ｖ２（第１のデュプレックスリレーＰＣＲに関しては３４３ｂｐ（ライン１）、および第２のデュプレックスリレーＰＣＲに関しては３４９ｐｂ（ライン２））、およびＶ７～Ｖ９（第１のデュプレックスリレーＰＣＲに関しては４４７ｂｐ（ライン１）、および第２のデュプレックスリレーＰＣＲに関しては４５３ｐｂ（ライン２）に対応するアンプリコンが正常に増幅されることを観察した。しかしながら、高濃度の対１の単一プライマーを使用する事実は、本発明によるリレーＰＣＲをさらに容易にするように思われることに留意する。さらに、Ｖ７～Ｖ９片と同一のアンプリコンＶ１～Ｖ２片の輝度は、アンプリコンＶ１～Ｖ２の量がアンプリコンＶ７～Ｖ９よりもはるかに大きく、アンプリコンＶ１～Ｖ２がより小さいことを示唆する。したがって、発明の方法のこの変異形は、高濃度のプライマーが使用される領域の好ましい増幅を保持する。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-09-28
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】