特表2023-517525ウイルス感染を治療するためのハイブリッドインターフェロン
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-26
(54)【発明の名称】ウイルス感染を治療するためのハイブリッドインターフェロン
(51)【国際特許分類】
A61K 38/21 20060101AFI20230419BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230419BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230419BHJP
C07K 14/56 20060101ALN20230419BHJP
C12N 15/21 20060101ALN20230419BHJP
【ＦＩ】
A61K38/21
A61P31/12
A61P31/14
C07K14/56 ZNA
C12N15/21
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022552669
(86)(22)【出願日】2021-03-16
(85)【翻訳文提出日】2022-10-25
(86)【国際出願番号】 GB2021050649
(87)【国際公開番号】W WO2021186162
(87)【国際公開日】2021-09-23
(31)【優先権主張番号】2003812.1
(32)【優先日】2020-03-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】63/030,074
(32)【優先日】2020-05-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】2012967.2
(32)【優先日】2020-08-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】63/067,930
(32)【優先日】2020-08-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】2102261.1
(32)【優先日】2021-02-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520440065
【氏名又は名称】アイエルシー セラピューティクス リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＩＬＣ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100181847
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 かおり
(72)【発明者】
【氏名】ウィリアム スティムソン
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA53
4C084DA22
4C084MA52
4C084MA57
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB33
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA16
4H045EA29
4H045FA74
(57)【要約】
コロナウイルス感染およびウイルス感染を予防または治療するための組成物および方法が、より一般的に提供される。特に、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）、ヒトコロナウイルスNL６３、ヒトコロナウイルスHKU１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）からの感染を予防または治療するための組成物を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウイルス感染の治療および／または予防のための方法であって、（i）治療有効量のインターフェロンアルファサブタイプをそれを必要とする対象に投与する工程であって、該インターフェロンアルファサブタイプは、HYBRID２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体である、工程を含む、方法。
【請求項2】
細胞変性効果またはプラーク形成などのウイルス活性の低下を提供するためのウイルス感染の治療および／または予防のための方法であって、（i）治療有効量のインターフェロンアルファサブタイプをそれを必要とする対象に投与する工程であって、該インターフェロンアルファサブタイプは、HYBRID２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体である、工程を含む、方法。
【請求項3】
コロナウイルス感染の治療および／または予防のための方法であって、（i）治療有効量のインターフェロンアルファサブタイプをそれを必要とする対象に投与する工程であって、該インターフェロンアルファサブタイプは、HYBRID２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体である、工程を含む、方法。
【請求項4】
HYBRID２が配列番号３のアミノ酸配列：【化1】
を含む、または、それからなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）、ヒトコロナウイルスNL６３、ヒトコロナウイルスHKU１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）、または、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項6】
インターフェロンアルファサブタイプHYBRID２が、配列番号３：【化2】
のアミノ酸配列からなる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記投与の方法が舌下、経口または注射投与である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記インターフェロンアルファサブタイプの治療有効量が低用量である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
インターフェロンアルファサブタイプが、HYBRID２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体である、ウイルス感染の治療および／または予防に使用するための、インターフェロンアルファサブタイプ。
【請求項10】
インターフェロンアルファサブタイプがHYBRID２であり、HYBRID２は、配列番号３：
【化3】
のアミノ酸配列を含む、または、それからなる、ウイルス感染の治療および／または予防に使用するための、請求項９に記載のインターフェロンアルファサブタイプ。
【請求項11】
前記ウイルス感染がコロナウイルス感染である、ウイルス感染の治療および／または予防において使用するための、請求項８または９に記載のインターフェロンアルファサブタイプ。
【請求項12】
コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV‐１）、ヒトコロナウイルスNL６３、ヒトコロナウイルスHKU１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS‐CoV）、または、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス‐２（SARS‐CoV‐２またはCovid１９）である、ウイルス感染の治療および／または予防に使用するための、請求項９から１１のいずれか一項に記載のインターフェロンアルファサブタイプ。
【請求項13】
前記インターフェロンアルファサブタイプが舌下、経口、または注射投与によって投与される、ウイルス感染の治療および／または予防に使用するための、請求項９～１２のいずれか一項に記載のインターフェロンアルファサブタイプ。
【請求項14】
前記インターフェロンアルファサブタイプが低用量で投与される、請求項１３に記載のインターフェロンサブタイプ。
【請求項15】
インターフェロンアルファサブタイプが、HYBRID２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体である、ウイルス感染の治療および／または予防のための医薬の調製に使用するための、インターフェロンアルファサブタイプ。
【請求項16】
インターフェロンアルファサブタイプが、HYBRID２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体である、コロナウイルス感染の治療および／または予防のための医薬の調製に使用するための、インターフェロンアルファサブタイプ。
【請求項17】
インターフェロンアルファサブタイプを含む組成物であって、前記インターフェロンアルファサブタイプが、HYBRID２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体である、ウイルス感染の治療および／または予防に使用するための、組成物。
【請求項18】
インターフェロンアルファサブタイプを含む組成物であって、前記インターフェロンアルファサブタイプが、HYBRID２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体である、コロナウイルス感染の治療および／または予防に使用するための、組成物。
【請求項19】
インターフェロンアルファサブタイプを含む医薬組成物であって、前記インターフェロンアルファサブタイプが、HYBRID２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体である、ウイルス感染の治療および／または予防に使用するための、医薬組成物。
【請求項20】
インターフェロンアルファサブタイプを含む医薬組成物であって、前記インターフェロンアルファサブタイプが、HYBRID２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体である、コロナウイルス感染の治療および／または予防に使用するための、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ウイルス感染、例えば細胞変性効果またはプラーク形成、特にコロナウイルス感染のようなウイルス活性の適切な低下を予防または治療するための組成物および方法に関する。本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）、ヒトコロナウイルスNL６３、ヒトコロナウイルスHKU１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）からの感染を予防または治療するための組成物にまで及ぶ。本発明はさらに、ヒトおよび獣医学療法のためのコロナウイルス感染の治療および／または予防のための本発明の組成物および組成物の使用に及ぶ。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルス（CoV）は哺乳類や鳥類に病気を引き起こすウイルスの大きなファミリーである。ヒトにおいて、コロナウイルスは、感冒から重症急性呼吸器症候群（SARS）、ヒトコロナウイルスNL６３、ヒトコロナウイルスHKU１、中東呼吸器症候群（MERS）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス‐２（SARS‐CoV‐２またはCovid１９）などのより重症な疾患までの呼吸器感染症を引き起こす。コロナウイルスは一本鎖RNAウイルスのファミリー（コロナウイルス科）に属し、脂質エンベロープにはクラブ状の突起が詰まっている。コロナウイルス感染は、呼吸器系および腸管系に重度の疾患を引き起こすことがある。
【0003】
SARSヒトコロナウイルス（SARS－CoV－１）は、ヒトに重度の疾患を定期的に引き起こす最初のコロナウイルスであった。中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）もヒトに重症疾患を引き起こす可能性がある。SARS－CoV－２（Covid１９）は、ヒトからヒトへ容易に伝播することができるため、ヒトコロナウイルスの中で最も感染力があるものとなっている。SARS－CoV－２の症状には、咳、発熱および息切れがある。これらのウイルスは、感染者に重度の肺炎様症状を引き起こすことがあり、最も重度の症例では死亡が起こる。
【0004】
SARS－CoV－１およびSARS－CoV－２に感染したヒトには、一般的な抗ウイルス剤、ウイルス細胞の侵入または複製を阻害する処理、および免疫刺激剤を含む各種抗ウイルス処理が施されている。リバビリンはプリンヌクレオシドアナログをベースとする広域スペクトルの抗ウイルス剤であり、C型肝炎の標準的な治療レジメンである。リバビリンは様々なRNAウイルスに対して活性を示すことが知られており、動物コロナウイルスに対して抗ウイルス活性を示すことが知られている。しかしながら、SARS－CoV－１に対する本剤の有効性のin vitro試験では、一連の陰性結果が得られ、副作用も報告されている。
【0005】
SARS－CoV－２に対する特異的な治療法はない。研究者は現在、コロナウイルスに対するファビラビア、レムデシビル、ロピナビル、リトナビルなどの抗ウイルス薬の有効性を検討している。しかしながら、SARS－CoV－２に対する証明された治療法はまだ解明されていない。
【0006】
異なる病原体がin vitroで異なるインターフェロン‐α（IFN‐α）サブタイプを誘導し、IFN‐αサブタイプが異なる抗ウイルス活性、抗増殖活性および免疫調節活性を有することが知られている。IFN‐α、特に個々のIFN‐αサブタイプの作用機序は、まだ部分的にしか理解されていない。様々な経路を介した感染は、異なるサブタイプロフィールを誘導することが示されている。IFN‐αサブタイプは同じ受容体に結合し、共通のシグナル伝達経路を活性化し、同様の免疫学的機能を持つことが期待されていた。すべてのIFN‐αサブタイプは、定義上、抗ウイルス活性を有するが、この文脈における絶対的有効性はかなり異なる可能性がある。加えて、多くの他の生物学的特性が記載されているが、免疫調節活性および抗増殖活性を含む様々な効力を有する。多面的な効果は、受容体鎖との異なる相互作用と、異なる細胞内経路を介した一連のエフェクター分子へのシグナル伝達によるものと思われる。I型IFN受容体はIFNR１とIFNR２の２本の鎖からなる。１２のIFN‐αサブタイプのそれぞれには、異なる受容体鎖をもつ結合親和性の範囲がある。IFNα-14は、２つのインターフェロンレセプターの両方に対して最も高い親和性の１つを有しており、これが他の１１のサブタイプと比較して非常に活性である理由である。
【0007】
IFNα２サブタイプのみで構成される組換えインターフェロンは、現在、抗ウイルス適応症の市場を支配している。Schering Plough社のイントロンA（商標）（IFN‐α２b）とロシュ社のRoferon（商標）（IFN‐α２a）の２種類の主要な組み換え型アルファIFN産物がある。これらの単一サブタイプ産物とは対照的に、異なるサブタイプの混合物からなるいくつかのアルファIFN製剤がある。これらのマルチサブタイプIFNアルファ産物は、ウイルス（Viragen、Inc．またはその子会社のMultiferon（商標）、インターフェロン Sciences/HemispherixのAlferon－N（商標）など）からの刺激に応答してヒト白血球によって産生されるか、またはバーキットリンパ腫（住友のSumiferon（商標）など）の患者から培養されたヒトリンパ芽球様細胞において産生される。
【0008】
現在のところ、コロナウイルスに感染し、特にSARS－CoV－１、MERS－CoVまたはSARS－CoV－２に感染したヒトに対して、完全に有効な治療または予防的治療法はない。したがって、ヒトにおけるコロナウイルス感染に対する、特にSARS、MERSおよびSARS－CoV－２の治療および／または予防のための、安全で効果的な治療（処理）に対する、重大な満たされていないニーズが存在する。
【発明の概要】
【0009】
本発明者は、ウイルス感染、特にヒトにおけるコロナウイルス感染、特にSARS、MERSおよびSARS－CoV－２の治療および／または予防のための治療法を開発することが望ましいことを表明する。本発明は、NKおよびT細胞応答性を誘導することによって、ウイルス感染からの感染を予防または治療するための組成物に及ぶ。本発明はさらに、ヒトおよび獣医学療法のためのウイルス感染の治療および／または予防のための組成物および本発明の組成物の使用に及ぶ。
【0010】
本発明は、ウイルス感染の結果として引き起こされる状態、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）、ヒトコロナウイルスNL６３、ヒトコロナウイルスHKU１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）からのようなコロナウイルス感染を予防または治療するための組成物および方法に関する。本発明はさらに、SARS、MERSまたはSARS－CoV－２の治療および／または予防における本発明の組成物の使用に及ぶ。本発明はさらに、治療上有用な量の本発明のインターフェロンを、治療上有用な量の適切な抗ウイルス化合物と共に、治療を必要とする対象に投与することに及ぶ。
【0011】
本発明は、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）、ヒトコロナウイルスNL６３、ヒトコロナウイルスHKU１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）のようなウイルス状態の治療のために、呼吸器ウイルス疾患、胃腸ウイルス疾患、発疹性ウイルス疾患、肝ウイルス疾患、皮膚ウイルス疾患、出血性ウイルス疾患、神経ウイルス疾患などのウイルス状態の治療に使用することができる。特定のウイルス、特に新たに出現したウイルスを標的とするワクチンがない場合、有効な抗ウイルス薬は、SARs、インフルエンザ（特にH５N１）、ジカウイルス、WNVおよびEBOVのアウトブレイクに適切に関連して、特に有利であろう。適切には、本発明はRSV（RSウイルス／呼吸器多核体ウイルス）の治療に使用され得る。
【0012】
本発明の発明者は、広範な実験に基づき、本明細書に記載される、IFN-α14、例えば、配列番号１またはその変異体もしくはフラグメント、HYBRID１、例えば、配列番号２またはその変異体もしくはフラグメント、またはHYBRID２、例えば、配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントの投与が、コロナウイルス感染の効果の抑制または阻害に帰結するという驚くべき発見をした。発明者は、IFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２がコロナウイルス感染に起因する細胞変性効果を直接阻害することができることを予期せずに測定した。細胞壊死性効果または細胞変性効果とは、ウイルスの侵入によって引き起こされる宿主細胞の構造変化を指す。本発明者は、IFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２もまた、コロナウイルス感染に関連するプラーク形成を阻害することを実証した。驚くべきことに、この効果は、IFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２を舌下投与した場合に示される。発明者は、HYBRID２がウイルス感染に起因する細胞変性効果を直接阻害することができることを予期せずに決定した。細胞壊死性効果または細胞変性効果とは、ウイルスの侵入によって引き起こされる宿主細胞の構造変化を指す。本発明者は、HYBRID２がウイルス感染に関連するプラーク形成も阻害することを実証した。HYBRID２の活性は、抗ウイルス活性を提供するのに特に適しているようである。
【0013】
本発明者は、合成アルファ－インターフェロン、インターフェロン－アルファ－１４（配列番号１）が、SARS－CoV－１およびSARS－CoV－２による感染の結果として生じる細胞変性効果およびプラーク形成を阻害する能力を検討した。本発明者は、抗ウイルス化合物リバビリンおよびマルチサブタイプインターフェロンMultiferon（商標）と比較して、細胞変性作用の抑制を検討した。驚くべきことに、インターフェロン‐α１４（配列番号１）はSARS－CoV－１およびSARS－CoV－２に対して活性があり、一方、リバビリンおよびマルチサブタイプインターフェロンMultiferon（商標）は、はるかに少ない阻害活性を示す。
【0014】
IFN-α14（配列番号１）、HYBRID１（配列番号２）またはHYBRID２（配列番号３）またはその変異体もしくは断片を用いたSARS－CoV－２（Covid１９）の治療のために、送達の様式は、直接注入またはエアロゾルによる肺への直接的な送達によるものと考えられる。適切には、１つの投与につき１０4～１０7の用量を用いることができる。舌下治療としてのIFN-α14（配列番号１）、HYBRID１（配列番号２）またはHYBRID２（配列番号３）の使用には、何らかの関連性があるかもしれない。本発明者は、驚くべきことに、舌下治療として、IFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２、特に配列番号１、２もしくは３、またはその変異体もしくは断片を投与すると、以前の抗ウイルス薬と比較して、コロナウイルス活性のより大きな減少または阻害をもたらすことができることを発見した。さらに、発明者らは、、非常に低用量、例えば、１日当たり１０4から５×１０6 IUまでのIFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２を使用することができることを決定した。
【0015】
これにより、コロナウイルス感染、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）、ヒトコロナウイルスNL６３、ヒトコロナウイルスHKU１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）からの感染の治療および／または予防において有用性を有する改良された治療組成物の発明者による同定がもたらされた。
【0016】
したがって、本発明の第一の態様は、コロナウイルス感染の治療および／または予防のための方法を提供し、該方法は、以下の
（i）治療有効量のインターフェロンアルファサブタイプを、それを必要とする対象に投与する工程であって、インターフェロンアルファサブタイプが、IFN-α14、HYBRID１、HYBRID２、またはIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２のいずれかの組み合わせ、例えば、IFN-α14とHYBRID１またはIFN-α14とHYBRID２またはHYBRID１とHYBRID２のいずれかの組み合わせである、
工程を含む。
（i）治療有効量のインターフェロンアルファサブタイプを、それを必要とする対象に投与する工程であって、インターフェロンアルファサブタイプが、IFN-α14、HYBRID１、HYBRID２、またはIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２のいずれかの組み合わせ、例えば、IFN-α14とHYBRID１またはIFN-α14とHYBRID２またはHYBRID１とHYBRID２のいずれかの組み合わせである、
工程を含む。
【0017】
実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）、ヒトコロナウイルスNL６３、ヒトコロナウイルスHKU１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）である。
【0018】
実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）である。
【0019】
実施形態では、コロナウイルスは重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）である。
【0020】
適切には、ウイルス感染は、フラビウイルス科のメンバー（例えばフラビウイルス、ペスチウイルス、およびヘパシビンツ属（Hepacivintsgenera）のメンバー）から選択することができ、これには、C型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス；Gadgets Gully ウイルス、カダムウイルス、キャサヌル森林病ウイルス、ランガットウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ポワッサンウイルス、Royal Farn1 ウイルス、Karshi ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、Neudoerfl ウイルス、Sofjin ウイルス、Louping ill ウイルス、および Negishi ウイルスなどのダニ媒介性ウイルス；Meaban ウイルス、Saumarez Reef ウイルス、および Tyuleniy ウイルスなどの海鳥ダニ媒介性ウイルス；蚊が媒介するウイルス、例えば、アルナウイルス、デングウイルス、ケドゥグウイルス、カシパコアウイルス、コウタンゴウイルス、日本脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ウスツウイルス、ウエストナイルウイルス、ヤムデウイルス、ココベラウイルス、バガザウイルス、イリェウスウイルス、イスラエル七面鳥髄膜脳脊髄炎ウイルス、ヌタヤウイルス、テンブスウイルス、ジカウイルス、バリジウイルス、ブーブイウイルス、エッジヒルウイルス、ジュグラウイルス、サボヤウイルス、セピックウイルス、ウガンダSウイルス、ウェッセルスブロンウイルス、黄熱病ウイルス；エンテベコウモリウイルス、ヨコセウイルス、アポイウイルス、カウボーンリッジウイルス、ジュティアパウイルス、モドックウイルス、サルビエハウイルス、サンペルリータウイルス、ブカラサコウモリウイルス、キャリーアイランドウイルス、ダカールコウモリウイルス、モンタナ筋炎白質脳炎ウイルス、プノンペンコウモリウイルス、リオブラボーウイルス、タマナコウモリウイルス、細胞融合剤ウイルス、が含まれる。
【0021】
別の実施形態では、ウイルスは、Ippy ウイルス、Lassa ウイルス（例えば、Josiah、LP、または GA391株）、リンパ性脈絡膜髄膜炎ウイルス（LCMV）、モバラウイルス、モペイアウイルス、アマパリウイルス、フレクサルウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラティーノウイルス、マチュポウイルス、オリベロスウイルス、パラナウイルス、ピチンデウイルス、ピタルウイルス（Pirital virus）、サビアウイルス、タカリベウイルス、タミアミウイルス、ホワイトウォーターアロヨウイルス、シャパレウイルス、ルホウイルスを含む、アレナウイルス科ファミリーのメンバーから選択される。
【0022】
さらに他の実施態様において、ウイルスは、
ハンタンウイルス、シンノンブルウイルス、ダグベウイルス、ブニャムウェラウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラクロスウイルス、プンタ トロ ウイルス（PTV）、カリフォルニア脳炎ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱（CCHF）ウイルス、を含む、ブニヤウイルス科のメンバー（例えば、ハンタウイルス、ナイロウイルス、オルソブニアウイルス、およびフレボウイルス属のメンバー）、
エボラウイルス（例えば、ザイール、スーダン、コートジボワール、レストン、ウガンダなど）、マールブルグウイルス（例えば、Angola、Ci67、Musoke、Popp、Ravn、Lake Victoria株）を含む、フィロウイルス科のウイルス、から選択することができる
ハンタンウイルス、シンノンブルウイルス、ダグベウイルス、ブニャムウェラウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラクロスウイルス、プンタ トロ ウイルス（PTV）、カリフォルニア脳炎ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱（CCHF）ウイルス、を含む、ブニヤウイルス科のメンバー（例えば、ハンタウイルス、ナイロウイルス、オルソブニアウイルス、およびフレボウイルス属のメンバー）、
エボラウイルス（例えば、ザイール、スーダン、コートジボワール、レストン、ウガンダなど）、マールブルグウイルス（例えば、Angola、Ci67、Musoke、Popp、Ravn、Lake Victoria株）を含む、フィロウイルス科のウイルス、から選択することができる
【0023】
実施形態では、ウイルスは、
ベネズエラ馬脳炎ウイルス（VEE）、東部馬脳炎ウイルス（EEE）、西部馬脳炎ウイルス（WEE）、シンドビスウイルス、風疹ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、バーマーフォレストウイルス、オーニョンニョンウイルス、チクルムガンヤウイルスが含まれる、トガウイルス科のメンバー（例えば、アルファウイルス属）、
天然痘ウイルス、牛痘、ネズミ痘ウイルス、およびワクシニアウイルスが含まれる、ポクシイリ科のメンバー（例えば、オルソポックスウイルス属のメンバー）、
単純ヘルペスウイルス（HSV、1型、2型、および6型）、ヒトヘルペスウイルス（例えば、7型および8型）、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタインバーウイルス（EBV）、水痘・帯状疱疹ウイルス、およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）が含まれる、ヘルペスウイルス科のメンバー、
から選択することができる。
ベネズエラ馬脳炎ウイルス（VEE）、東部馬脳炎ウイルス（EEE）、西部馬脳炎ウイルス（WEE）、シンドビスウイルス、風疹ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、バーマーフォレストウイルス、オーニョンニョンウイルス、チクルムガンヤウイルスが含まれる、トガウイルス科のメンバー（例えば、アルファウイルス属）、
天然痘ウイルス、牛痘、ネズミ痘ウイルス、およびワクシニアウイルスが含まれる、ポクシイリ科のメンバー（例えば、オルソポックスウイルス属のメンバー）、
単純ヘルペスウイルス（HSV、1型、2型、および6型）、ヒトヘルペスウイルス（例えば、7型および8型）、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタインバーウイルス（EBV）、水痘・帯状疱疹ウイルス、およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）が含まれる、ヘルペスウイルス科のメンバー、
から選択することができる。
【0024】
別の実施態様において、ウイルスは、Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスまたはＨ１Ｎ１豚インフルエンザなどのインフルエンザウイルス（Ａ、Ｂ、およびＣ）が含まれる、オルトミクソウイルス科のメンバー、
重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスを含むコロナウイルス科のメンバー、
狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含むラブドウイルス科のメンバー、
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、ニューカッスル病ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、麻疹ウイルス、牛疫ウイルス、犬ジステンパーウイルス、センダイウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス（例えば、1、2、3、および4）、ライノウイルス、おたふくかぜウイルスを含むパラミクソウイルス科のメンバー、から選択することができる。
重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスを含むコロナウイルス科のメンバー、
狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含むラブドウイルス科のメンバー、
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、ニューカッスル病ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、麻疹ウイルス、牛疫ウイルス、犬ジステンパーウイルス、センダイウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス（例えば、1、2、3、および4）、ライノウイルス、おたふくかぜウイルスを含むパラミクソウイルス科のメンバー、から選択することができる。
【0025】
実施形態では、ウイルスは、ポリオウイルス、ヒトエンテロウイルス（A、B、C、およびD）、A型肝炎ウイルス、およびコクサッキーウイルスを含むピコルナウイルス科のメンバー、
B型肝炎ウイルスを含むヘパドナウイルス科のメンバーから選択することができる。
B型肝炎ウイルスを含むヘパドナウイルス科のメンバーから選択することができる。
【0026】
実施形態では、ウイルスは、
ヒトパピローマウイルスを含むパピラモウイルス科のメンバー、
アデノ随伴ウイルスを含むパルボウイルス科のメンバー、
アストロウイルスを含むアストロウイルス科のメンバー、
JCウイルス、BKビム（vim）、およびSV４０ビムを含むポリオーマウイルス科のメンバー、
から選択することができる。
ヒトパピローマウイルスを含むパピラモウイルス科のメンバー、
アデノ随伴ウイルスを含むパルボウイルス科のメンバー、
アストロウイルスを含むアストロウイルス科のメンバー、
JCウイルス、BKビム（vim）、およびSV４０ビムを含むポリオーマウイルス科のメンバー、
から選択することができる。
【0027】
実施形態では、ウイルスは、Norwalkビムを含むカリシウイルス（Calciviridae）科のメンバーから選択することができる。
【0028】
実施形態では、ウイルスは、ロタウイルスを含むレオウイルス科のメンバーから選択することができる。
【0029】
実施形態では、ウイルスは、ヒト免疫不全ビム（HIV；例えば、１型および２型）、ならびにヒトTリンパ球向性ビムタイプＩおよびＩＩ（それぞれ、HTLV－１およびHTLV－２）を含むレトロウイルス科のメンバーから選択することができる。
【0030】
実施形態では、ウイルスは、アテリウイルス、パポバウイルス、およびエコーウイルスから選択することができる。適切には、ウイルスは、１型IFN応答に拮抗することが知られているタンパク質をコードするウイルスから選択され得る：
チクングニアウイルス（CHIKV）
コクサッキーウイルス
デングウイルス（DENV）
エボラウイルス（EBOV）
エプスタイン－バーウイルス（EBV）
B型肝炎ウイルス（HBV）
C型肝炎ウイルス
ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）
ヒトパラインフルエンザウイルス（HPIV）
ヒトパピローマウイルス（HPV）
ヒトRSウイルス（HRSV）
ヒトライノウイルス（HRV）
単純ヘルペスウイルス（HSV）
A型インフルエンザウイルス（IAV）
B型インフルエンザウイルス（IBV）
ラッサ熱ウイルス（LASV）
麻疹ウイルス（MeV）
中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）
ムンプスウイルス（MuV）
ニパウイルス（NiV）
ポリオウイルス（PV）
狂犬病ウイルス（RABV）
ロタウイルス（RV）NSP１増強
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS－CoV）
ワクシニアウイルス（VACV）
ウエストナイルウイルス（WNV）
黄熱ウイルス（YFV）
ジカウイルス（ZIKV）。
チクングニアウイルス（CHIKV）
コクサッキーウイルス
デングウイルス（DENV）
エボラウイルス（EBOV）
エプスタイン－バーウイルス（EBV）
B型肝炎ウイルス（HBV）
C型肝炎ウイルス
ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）
ヒトパラインフルエンザウイルス（HPIV）
ヒトパピローマウイルス（HPV）
ヒトRSウイルス（HRSV）
ヒトライノウイルス（HRV）
単純ヘルペスウイルス（HSV）
A型インフルエンザウイルス（IAV）
B型インフルエンザウイルス（IBV）
ラッサ熱ウイルス（LASV）
麻疹ウイルス（MeV）
中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）
ムンプスウイルス（MuV）
ニパウイルス（NiV）
ポリオウイルス（PV）
狂犬病ウイルス（RABV）
ロタウイルス（RV）NSP１増強
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS－CoV）
ワクシニアウイルス（VACV）
ウエストナイルウイルス（WNV）
黄熱ウイルス（YFV）
ジカウイルス（ZIKV）。
【0031】
適切には、ウイルスは、エンベロープウイルスによって引き起こされるウイルス疾患から選択され得、好ましくは以下からなる群から選択され得る：ヒト免疫不全ウイルス１（HIV－１）、ヒト免疫不全ウイルス２（HIV－２）、ヘルペスウイルス１（HSV－１）、ヘルペスウイルス２（HSV－２）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、サイトメガロウイルス（CMV）、ジカウイルス（ZKV）、デングウイルス、西ナイルウイルス、ラッサウイルス、エボラウイルス、リロビウウイルス、ブンディブギョウイルス、レストンウイルス、スーダンウイルス、タイフォレストウイルス、マールブルグウイルス、Ravn ウイルス（RAW）、ニューモウイルス、フニンウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラクロスウイルス、豚生殖および呼吸器症候群ウイルス、ポックスウイルス、ウシ ウイルス性下痢症 ノロウイルス、
SARSコロナウイルス、チクングヤウイルス、C型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、シュマレンベルグウイルス、アフリカ豚コレラウイルス、東部馬脳炎ウイルス、牛痘ウイルス、西部馬脳炎ウイルス、ニパウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎（RSSE）ウイルス、黄熱病ウイルス、ニューカッスルウイルス、ウイルス（BVDV）、パラインフルエンザウイルス5型（PIV5）、羊の国境病ウイルス（BDV）、豚コレラウイルス（CSFV）、水疱性口内炎ウイルス（VSV）および、HSV-2 アシクロビル耐性（HSV-2 Acy R）、
より好ましくは、エンベロープウイルスは、HIV－1、HSV－1、HSV－2、HCMV、RSV、VSV、H1N1、DENV－2およびZKVからなる群から選択される。
SARSコロナウイルス、チクングヤウイルス、C型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、シュマレンベルグウイルス、アフリカ豚コレラウイルス、東部馬脳炎ウイルス、牛痘ウイルス、西部馬脳炎ウイルス、ニパウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎（RSSE）ウイルス、黄熱病ウイルス、ニューカッスルウイルス、ウイルス（BVDV）、パラインフルエンザウイルス5型（PIV5）、羊の国境病ウイルス（BDV）、豚コレラウイルス（CSFV）、水疱性口内炎ウイルス（VSV）および、HSV-2 アシクロビル耐性（HSV-2 Acy R）、
より好ましくは、エンベロープウイルスは、HIV－1、HSV－1、HSV－2、HCMV、RSV、VSV、H1N1、DENV－2およびZKVからなる群から選択される。
【0032】
適宜、コロナウイルス感染症、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）、ヒトコロナウイルスNL６３、ヒトコロナウイルスHKU１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）からの感染症からウイルス感染症を選択することができる。
【0033】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプHYBRID２は、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。機能的活性は、本明細書に記載されるようなアッセイの使用による抗ウイルス活性の特徴付けにより決定することができ、例えば、細胞変性効果、プラーク形成、IL１７Fの産生に対する効果、ヒト白血球からのCXCL１０の産生に対する効果、インターフェロンガンマ産生に対する効果、TNFアルファ分泌に対する効果、アポトーシスの誘導、NK細胞クラスタ化に対する効果のうちの１つにより決定することができる。機能的変異体およびフラグメントをHYBRID２の活性と比較して、同様の活性、好適には、いくつかのアッセイに関して類似の範囲の活性を示す変異体を決定することができる。
【0034】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14は、配列番号１のアミノ酸配列またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【0035】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプHYBRID１は、配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【0036】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプHYBRID２は、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【0037】
実施形態では、投与方法は舌下投与である。実施形態では、投与方法は経口投与である。実施形態では、投与方法は、注射である。実施形態では、投与方法は、肺へのエアロゾル送達による。
【0038】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプHYBRID２は舌下投与によって投与される。実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプは、１日１回、１日２回、１日３回または１日４回投与することができる。適切には、舌下投与においては、毎日単回投与され得る。
【0039】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２の治療有効量は低用量である。実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２の治療上有効な量は、１０4 から５x１０6 IU単位／mlの間である。実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２の治療有効量は、コロナウイルス感染に対する現在の全身治療よりも低い。
【0040】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２は、５IU／ml、１０IU／ml、５０IU／ml、１x１０2 IU／ml、１x１０3 IU／ml、１x１０4 IU／ml、１x１０5 IU／ml、１x１０6 IU／mlまたは１x１０7 IU／mlの用量で投与される。
【0041】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２は、０．１mg～１mg、適切には１ng～５０マイクログラムの用量で投与される。例えば、ヒト用途では、５×１０4 IU／ml単位以下を使用することができる。
【0042】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２は、舌下投与によって投与される。実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプは、１日１回、１日２回、１日３回または１日４回投与することができる。適切には、舌下投与においては、毎日単回用量され得る。
【0043】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２は、コロナウィルスのウィルス活性を中断する。実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２は、コロナウイルスの細胞変性効果またはプラーク形成を阻害する。
【0044】
特定の実施形態では、対象は、コロナウイルスによって引き起こされる状態に罹患し得る。実施形態では、対象は、気道感染または肺炎、または急性呼吸促迫症候群（ARDS）に罹患し得る。
【0045】
典型的には、対象は哺乳動物、特にヒトである。実施形態では、対象は鳥であり得る。実施形態では、対象は動物であり得る。
【0046】
ある態様において、本方法は、治療的に有用な量の適切な抗ウイルス化合物を投与する工程を含む。実施形態では、抗ウイルス化合物はリバビリンである。インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２と組み合わせた実施形態では、レムデシビル、LAM－002A （apilimod-選択的PIKfyveキナーゼインヒビター）、デキサメタゾン、およびアビガン（ファビピラビル）からさらなる処理を選択してもよい。
【0047】
本発明の第２の態様によれば、インターフェロンアルファサブタイプが提供され、該インターフェロンアルファサブタイプは、ウイルス感染、特にコロナウイルス感染の治療および／または予防に使用するための、IFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２のいずれかまたはIFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２の任意の組み合わせ、例えばIFN-α14とHYBRID１またはIFN-α14とHYBRID２またはHYBRID１とHYBRID２の組み合わせである。
【0048】
実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）、ヒトコロナウイルスNL６３、ヒトコロナウイルスHKU１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）である。
【0049】
実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）である。
【0050】
実施形態では、コロナウイルスは重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）である。
【0051】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14は、配列番号１のアミノ酸配列またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【0052】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプHYBRID１は、配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【0053】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプHYBRID２は、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【0054】
本発明の第２の態様によれば、ウイルス感染の治療および／または予防に使用するためのインターフェロンアルファサブタイプ、HYBRID２が提供される。
【0055】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプHYBRID２は、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【0056】
実施形態では、HYBRID２の治療効果のある量は低量である。実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプHYBRID２の治療有効量は、１０4 ～５×１０6 IU単位／mlである。実施形態では、HYBRID２の治療有効量は、コロナウイルス感染に対する現在の全身的治療よりも低い。
【0057】
実施形態では、HYBRID２は、５IU／ml、１０IU／ml、５０IU／ml、１x１０2 IU／ml、１x１０3 IU／ml、１x１０4 IU／ml、１x１０5 IU／ml、１x１０6 IU／mlまたは１x１０7 IU／mlの用量で投与される。
【0058】
実施形態では、HYBRID２は、０．１mg～１mg、適切には１ng～５０マイクログラムの用量で投与される。例えば、ヒト用途では、５×１０4 IU／ml単位以下を使用することができる。例えば、イヌにおいて、舌下使用は、例えば、１mlのPBS中で１０4 IU／Kgであり得る。
【0059】
特定の実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプは舌下投与され得る。実施形態では、投与方法は経口投与である。実施形態では、投与方法は、注射である。
【0060】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２の治療有効量は低用量である。実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２の治療上有効な量は、１０4 から５x１０6 IU単位／mlの間である。実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２の治療有効量は、コロナウイルス感染に対する現在の全身治療よりも低い。
【0061】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２は、５IU／ml、１０IU／ml、５０IU／ml、１x１０2 IU／ml、１x１０3 IU／ml、１x１０4 IU／ml、１x１０5 IU／ml、１x１０6 IU／mlまたは１x１０7 IU／mlの用量で投与される。
【0062】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２は、０．１mg～１mg、適切には１ng～５０マイクログラムの用量で投与される。例えば、ヒト用途では、５×１０4 IU／ml単位以下を使用することができる。例えば、イヌにおいて、舌下使用は、例えば、１mlのPBS中で１０4 IU／Kgであり得る。
【0063】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプは、１日１回、１日２回、１日３回または１日４回投与することができる。適切には、舌下投与においては、毎日単回用量が提供され得る。
【0064】
インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２と組み合わせた実施形態では、レムデシビル、LAM－002A（アピリモド（apilimod）‐選択的PIKfyveキナーゼインヒビター）、デキサメタゾン、およびアビガン（Avigan）（ファビピラビル）からさらなる治療を選択してもよい。
【0065】
IFN-α14、HYBRID１、もしくはHYBIRD２、またはIFN-α14、HYBRID１、およびHYBRID２のいずれかの組み合わせの投与、例えば、IFN-α14とHYBRID１またはIFN-α14とHYBRID２またはHYBRID１とHYBRID２は、当技術分野で公知の任意の適切な手段によるものであり得ることが理解される。例えば、インターフェロンアルファサブタイプIFN－α14、HYBRID１またはHYBRID２は、適切なアミノ酸配列をコードするか、または対象において適切なアミノ酸配列の発現を引き起こすことができるヌクレオチド配列を提供することによって、対象において発現され得る。
【0066】
本発明の第３の態様によれば、ウイルス感染、特にコロナウイルス感染の治療および／または予防のための医薬の調製において、インターフェロンアルファサブタイプがIFN-α14、HYBRID１、HYBIRD２、またはIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２のいずれかの組み合わせ、例えばIFN-α14とHYBRID１またはIFN-α14とHYBRID２またはHYBRID１とHYBRID２である、インターフェロンアルファサブタイプの使用が提供される。
【0067】
本発明のさらなる態様によれば、IFN-α14、HYBRID１、HYBRID２またはIFN-α14およびHYBRID１およびHYBRID２のいずれかの組み合わせ、例えば、IFN-α14とHYBRID１またはIFN-α14とHYBRID２またはHYBRID１とHYBRID２である、インターフェロンアルファサブタイプを含む組成物が提供され、この組成物は、ウイルス感染、特にコロナウイルス感染の治療および／または予防のために使用される。
【0068】
本発明のさらなる態様によれば、インターフェロンアルファサブタイプが、IFN-α14、HYBRID１、HYBRID２、またはIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２のいずれかの組み合わせ、例えばIFN-α14とHYBRID１またはIFN-α14とHYBRID２またはHYBRID１とHYBRID２である、ウイルス感染、特にコロナウイルス感染の治療および／または予防に使用するための、医薬組成物が提供される。
【0069】
実施形態では、医薬品組成物は、さらなる治療と組み合わせて、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２を提供することができ、ここで、さらなる治療は、レムデシビル、LAM－002A（アピリモド‐選択的PIKfyveキナーゼインヒビター）、デキサメタゾン、およびアビガン（ファビピラビル）から選択され得る。
【0070】
本発明のさらなる態様によれば、免疫応答の調節に使用するための、インターフェロンアルファサブタイプであって、インターフェロンサブタイプが、IFN-α14、HYBRID１、HYBRID２、またはIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２のいずれか、例えば、IFN-α14とHYBRID１またはIFN-α14とHYBRID２、またはHYBRID１とHYBRID２の組み合わせである、インターフェロンアルファサブタイプが提供される。
【0071】
本発明のさらなる態様によれば、免疫反応を調節する際に使用するためのHYBRID２が提供される。
【0072】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２と、レムデシビル、LAM－002A（アピリモド‐選択的PIKfyveキナーゼインヒビター）、デキサメタゾン、およびアビガン（ファビピラビル）から選択されるさらなる治療との組合せを用いて免疫反応を調節することができる。
【0073】
本発明のさらなる態様によれば、インターフェロンアルファサブタイプの使用であって、インターフェロンアルファサブタイプが、IFN-α14、HYBRID１、HYBRID２、またはIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２のいずれかの組み合わせ、例えばIFN-α14とHYBRID１またはIFN-α14とHYBRID２またはHYBRID１とHYBRID２のいずれかと、抗ウイルス化合物との、ウイルス、特にコロナウイルス、および特に重症急性呼吸器系（SARS）コロナウイルス－１（SARS－CoV）または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）による感染の治療または予防のための使用が提供される。
【0074】
本発明のさらなる態様によれば、ウイルス、特に重症急性呼吸器系（SARS）コロナウイルス－１（SARS－CoV）または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）による感染の治療または予防のための抗ウイルス化合物とのHYBRID２の組み合わせの使用が提供される。適切には、ウイルスを
チクングニアウイルス（CHIKV）
コクサッキーウイルス
デングウイルス（DENV）
エボラウイルス（EBOV）
エプスタイン－バーウイルス（EBV）
B型肝炎ウイルス（HBV）
C型肝炎ウイルス（HCV）
ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）
ヒトパラインフルエンザウイルス（HPIV）
ヒトパピローマウイルス（HPV）
ヒトRSウイルス（HRSV）
ヒトライノウイルス（HRV）
単純ヘルペスウイルス（HSV）
A型インフルエンザウイルス（IAV）
B型インフルエンザウイルス（IBV）
ラッサウイルス（LASV）
麻疹ウイルス（MeV）
中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）
ムンプスウイルス（MuV）
ニパウイルス（NiV）
ポリオウイルス（PV）
狂犬病ウイルス（RABV）
ロタウイルス（RV）NSP１増強（Enhances）
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS－CoV）
ワクシニアウイルス（VACV）
ウエストナイルウイルス
黄熱ウイルス（YFV）
ジカウイルス（ZIKV）
選択することができる。
チクングニアウイルス（CHIKV）
コクサッキーウイルス
デングウイルス（DENV）
エボラウイルス（EBOV）
エプスタイン－バーウイルス（EBV）
B型肝炎ウイルス（HBV）
C型肝炎ウイルス（HCV）
ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）
ヒトパラインフルエンザウイルス（HPIV）
ヒトパピローマウイルス（HPV）
ヒトRSウイルス（HRSV）
ヒトライノウイルス（HRV）
単純ヘルペスウイルス（HSV）
A型インフルエンザウイルス（IAV）
B型インフルエンザウイルス（IBV）
ラッサウイルス（LASV）
麻疹ウイルス（MeV）
中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）
ムンプスウイルス（MuV）
ニパウイルス（NiV）
ポリオウイルス（PV）
狂犬病ウイルス（RABV）
ロタウイルス（RV）NSP１増強（Enhances）
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS－CoV）
ワクシニアウイルス（VACV）
ウエストナイルウイルス
黄熱ウイルス（YFV）
ジカウイルス（ZIKV）
選択することができる。
【0075】
上記に概説した本発明の態様の実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）、ヒトコロナウイルスNL６３、ヒトコロナウイルスHKU１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）である。
【0076】
上記に概説した本発明の態様の実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）である。
【0077】
上に概説した本発明の態様の実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）である。
【0078】
上記に概説した本発明の態様の実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14は、配列番号１のアミノ酸配列またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【0079】
上記に概説した本発明の態様の実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプHYBRID１は、配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【0080】
上記に概説した本発明の態様の実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプHYBRID２は、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【0081】
上記に概説した本発明の態様の実施形態では、組成物または医薬組成物は舌下投与される。これは、獣医学治療に特に有利である可能性がある。実施形態では、投与方法は経口投与である。実施形態では、投与方法は、注射である。
【0082】
上記に概説した本発明の態様の実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２の治療有効量は低用量である。実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２の治療上有効な量は、１０4 から５x１０6 IU単位／mlの間である。実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２の治療有効量は、コロナウイルス感染に対する現在の全身治療よりも低い。
【0083】
上に概説した本発明の態様の実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２は、５ IU／ml、１０ IU／ml、５０ IU／ml、１x１０2 IU／ml、１x１０3 IU／ml、１x１０4 IU／ml、１x１０5 IU／ml、１x１０6 IU／mlまたは１x１０7 IU／mlの用量で投与される。
【0084】
上に概説した本発明の態様の実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプIFN-α14、HYBRID１およびHYBRID２は、０．１mg～１mg、適切には１ng～５０マイクログラムの用量で投与される。例えば、ヒト用途では、５×１０4 IU／ml単位以下を使用することができる。
【0085】
上に概説した本発明の態様の実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプは、１日１回、１日２回、１日３回または１日４回投与される。適切には、舌下投与においては、毎日単回用量が提供され得る。
【0086】
上に概説した本発明の態様の特定の実施形態では、IFN‐αサブタイプは、融合タンパク質、または組換えタンパク質などのIFN-α14を含み、それからなり、またはそれであり、特に、配列番号１のアミノ酸配列またはその変異体もしくは断片を含むか、またはそれからなる。実施形態では、IFN-α14またはHYBRID１またはHYBRID２は、グリコシル化され得る。
【0087】
上に概説した本発明の態様の特定の実施形態では、IFN‐αサブタイプは、融合タンパク質、または組換えタンパク質などのHYBRID１を含み、それからなり、またはそれであり、特に、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異体もしくは断片を含むか、またはそれからなる。
【0088】
上に概説した本発明の態様の特定の実施形態では、IFN‐αサブタイプは、融合タンパク質、または組換えタンパク質などのHYBRID２を含み、それからなり、またはそれであり、特に、配列番号３のアミノ酸配列またはその変異体もしくは断片を含むか、またはそれからなる。
【0089】
本発明のさらなる態様において、配列番号１またはその断片もしくは変異体を含むかまたはそれからなる組換えポリペプチドが提供される。本発明は、配列番号１のアミノ酸配列に由来する核酸配列に及ぶ。
【0090】
本発明のさらなる態様において、配列番号２またはそのフラグメントもしくは変異体を含むかまたはそれからなる組換えポリペプチドが提供される。本発明は、配列番号２のアミノ酸配列に由来する核酸配列に及ぶ。
【0091】
本発明のさらなる態様において、配列番号３またはそのフラグメントもしくは変異体を含むかまたはそれからなる組換えポリペプチドが提供される。本発明は、配列番号３のアミノ酸配列に由来する核酸配列に及ぶ。
【0092】
詳細な説明
本発明の発明者は、驚くべきことに、本明細書に記載されているように、IFN-α14、例えば配列番号１またはその変異体もしくはフラグメント、IFN-α14／IFN‐α10ハイブリッド、例えばHYBRID１、例えば配列番号２またはその変異体もしくはフラグメント、またはHYBRID２、例えば配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントを投与すると、コロナウイルス感染における免疫反応に関連するウイルス活性の抑制または阻害が生じることを発見した。IFN-α14、例えば配列番号１またはその変異体もしくはフラグメント、IFN-α14／IFN‐α10ハイブリッド、例えばHYBRID１、例えば配列番号２またはその変異体もしくはフラグメント、またはHYBRID２、例えば配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントを本明細書に記載されるように適切に投与することは、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）におけるコロナウイルス感染を治療するために使用することができる。驚くべきことに、IFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２を舌下投与すると、この効果が増強されることがある。
本発明の発明者は、驚くべきことに、本明細書に記載されているように、IFN-α14、例えば配列番号１またはその変異体もしくはフラグメント、IFN-α14／IFN‐α10ハイブリッド、例えばHYBRID１、例えば配列番号２またはその変異体もしくはフラグメント、またはHYBRID２、例えば配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントを投与すると、コロナウイルス感染における免疫反応に関連するウイルス活性の抑制または阻害が生じることを発見した。IFN-α14、例えば配列番号１またはその変異体もしくはフラグメント、IFN-α14／IFN‐α10ハイブリッド、例えばHYBRID１、例えば配列番号２またはその変異体もしくはフラグメント、またはHYBRID２、例えば配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントを本明細書に記載されるように適切に投与することは、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）におけるコロナウイルス感染を治療するために使用することができる。驚くべきことに、IFN-α14、HYBRID１またはHYBRID２を舌下投与すると、この効果が増強されることがある。
【0093】
配列番号１は、IFN-α14であり、以下のように定義することができる：
CNLSQTHSLNNRRTLMLMA QMRRISPFSCLKDRHDFEFP
QEEFDGNQFQKAQAISVLHE MMQQTFNLFSTKNSSAAWDE
TLLEKFYIELFQQMNDLEAC VIQEVGVEETPLMNEDSILA
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【0094】
配列番号２は、HYBRID１であり、以下のように定義することができる：
CDLPQTHSLGNRRALILLGQMGRISPFSCLKDRHDFRIPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMMQQTFNLFSTENSSAAWEQTLLEKFSIELFQQMNDLEACVIQEVGVEETPLMNEDSILAVRKYFQRITLYLIERKYSPCAWEVVRAEIMRSLSFSTNLQKRLRRKD
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【0095】
配列番号３は、HYBRID２であり、以下のように定義することができる：
【化1】
【0096】
特に、本発明者は、IFN-α14特に配列番号１、HYBRID１（配列番号２）またはHYBRID２（配列番号３）またはその変異体もしくはフラグメントが、コロナウイルス感染の結果として細胞変性効果およびプラーク形成を阻害することを発見した。細胞変性効果または細胞壊死性効果とは、ウイルスの侵入によって引き起こされる宿主細胞の構造変化を指す。
【0097】
特に、本発明者は、HYBRID２（配列番号３）またはその変異体もしくは断片が細胞変性効果およびプラーク形成を阻害することを発見した。細胞変性効果または細胞壊死性効果とは、ウイルスの侵入によって引き起こされる宿主細胞の構造変化を指す。
【0098】
また、本発明者は、組換えIFNハイブリッド分子HYBRID２（配列番号３）がインターフェロン受容体に対して高い結合親和性を有することを明らかにした。
【0099】
本発明者らは、天然分子IFN-α14、特に配列番号１、配列番号２、配列番号３またはその変異体もしくは断片が、非常に低用量でコロナウイルスの動作をブロックまたは阻害することを実証した。これらの知見は、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）、ヒトコロナウイルスNL６３、ヒトコロナウイルスHKU１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）からのコロナウイルス感染を治療および／または予防するための改良された方法および改良された組成物を提供するために適用することができる。
【0100】
インターフェロンサブタイプIFN-α10およびIFN-α14およびそれらのハイブリッドについては、PCT公開番号WO2014/037717およびPCT公開数WO2015/136287に記載されている。特に、１２のアルファインターフェロンすべてのコンセンサス骨格配列に基づく、IFN-α10およびIFN-α14サブタイプ結合部位に特徴的な配列を含む、IFN-α10‐IFN-α14ハイブリッドが開示されている。インターフェロンサブタイプIFN-α10およびIFN-α14およびそれらのハイブリッドについては、PCT公開番号WO2017/046583にも記載されている。特に、IFN-α10およびIFN-α14ハイブリッドは、１２種類すべてのIFN-αサブタイプのコンセンサスシーケンスに基づいていない、IFN-α10およびIFN-α14サブタイプ由来の高親和性結合部位を有することが開示されている。このハイブリッドは、他の１０のインターフェロン‐アルファサブタイプの配列特性を持たないIFN‐α10およびIFN-α14サブタイプの配列特性を誘導する。
【0101】
また、本発明者は、本明細書中でHYBRID１（配列番号２）およびHYBRID２（配列番号３）として知られる組換えIFN－ハイブリッド分子も、インターフェロン受容体に対して高い結合親和性を有することを確立した。
【0102】
理論に拘束されることを望まないが、本発明者は、IFN‐α10のアミノ酸配列を含むタンパク質は、インターフェロン受容体２（IFNR２）に対してより大きな親和性を有し、IFN-α14のアミノ酸配列を含むタンパク質は、インターフェロン受容体１（IFNR１）に対してより大きな親和性を有すると考える。このように、IFN‐α10アミノ酸配列を構成するタンパク質を、インターフェロンレセプター１との結合を可能にするIFN-α14のアミノ酸で置換したり、IFN-α14アミノ酸配列を構成するタンパク質を、インターフェロンレセプター２との結合を可能にするIFN‐α10のアミノ酸で置換したりすることは、IFN‐α10またはIFN-α14単独よりも、インターフェロンレセプター１および２の両方に対してより強い結合親和性を有するはずのIFN‐α10 IFN-α14ハイブリッドタンパク質を提供すると考えられる。IFN‐α10およびIFN-α14の一次インターフェロンレセプター結合部位を含めることにより、ハイブリッドは、IFN‐α10から選択されIFN-α14アミノ酸配列に置換されてIFN-α14サブタイプのインターフェロンレセプター２への結合能を向上させるアミノ酸を含むこと、および／または該ハイブリッドがIFN-α14から選択されてIFN‐α10アミノ酸配列に置換されてIFN‐α10サブタイプのインターフェロンレセプター１への結合能を向上させるアミノ酸を含むことを意味する。
【0103】
適切には、IFN‐α10アミノ酸配列を含むタンパク質のいくつかのアミノ酸置換が、インターフェロン受容体１への結合に関与すると決定されたIFN-α14のアミノ酸と一緒になって、タンパク質のインターフェロン受容体１への結合を増強し得る。適切には、IFN-α14アミノ酸配列を含むタンパク質の、インターフェロンレセプター２への結合に関与すると決定されたIFN‐α10のアミノ酸とのアミノ酸置換は、タンパク質のインターフェロンレセプター２への結合を増強し得る。
【0104】
実施形態では、IFN‐α10－IFN-α14ハイブリッドは、IFN‐α10のアミノ酸配列を実質的に有することができるが、アミノ酸残基８０～１５０の間、または適切にはアミノ酸残基８４～１４４の間、または適切にはアミノ酸残基９２～１１５、または適切にはアミノ酸残基９０～１１０の間（IFN‐α10配列の番号を使用）の範囲で修飾されて、IFN-α14配列によって提供されるアミノ酸を提供することができる。IFN-α14のインターフェロン受容体１への結合には、これらの領域またはこれらの領域の一部のアミノ酸残基が必要であると考えられている。特に、ハイブリッド配列は、IFN‐α10配列の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０つ、または少なくとも１１の修飾を含み、IFN-α14配列の対応する残基またはその保存された変異を提供することができる。実施形態では、太字で示されるアミノ酸によって示される１１の修飾が提供される。
【0105】
【化2】
【0106】
実施形態では、IFN‐α10－IFN-α14ハイブリッド配列は、９４位、１０１位、１０２位、１０９位または１４４位のアミノ酸から選択される少なくとも１つの突然変異、好ましくは９４位、１０１位、１０２位、１０９位または１４４位のアミノ酸から選択される少なくとも２つの突然変異、より好ましくは９４位、１０１位、１０２位、１０９位または１４４位のアミノ酸から選択される少なくとも３つの突然変異、より好ましくは９４位、１０１位、１０２位、１０９位または１４４位のアミノ酸から選択される少なくとも４つの突然変異、より好ましくは９４位、１０１位、１０２位、１０９位または１４４位のアミノ酸から選択される少なくとも５つの突然変異を含み得る。別の実施形態では、IFN-α14をハイブリッドの骨格構造として利用することができ、配列のN末端領域およびC末端領域におけるIFN‐α10配列とIFN-α14配列との間で異なる残渣を、IFN‐α10配列中に存在するものとしてハイブリッド配列中に提供することができる。IFN-α14N末端配列の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個または少なくとも１１個の置換が、それらのアミノ酸がIFN‐α10とIFN-α14との間で共有／共通でないアミノ酸位置でIFN‐α10からの残渣を提供するために、ハイブリッド配列を提供するために、適切に作製され得る。適切には、IFN‐α10とIFN-α14との間で共有されていない／共通のアミノ酸位置にIFN‐α10からハイブリッド配列への残渣を提供するために、IFN-α14 C末端配列に少なくとも１、少なくとも２、または３の置換が提供される。実施形態では、IFN-α14のN末端配列から少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０または少なくとも１１の置換およびC末端配列からの少なくとも１、少なくとも２または３の置換が、IFN‐α10からの残渣を、IFN‐α10とIFN‐α10とIFN-α14との間で共有／共通でないアミノ酸を有するそれらのアミノ酸位置でハイブリッドに提供するようになされる。
【0107】
機能的に活性であるとは、IFN‐α10およびIFN-α14の一次（プライマリ）インターフェロン結合部位を含むIFN‐α10－IFNα１４ハイブリッドポリペプチドを意味し、ここで、対象へのペプチドの投与または対象におけるペプチドの発現は、コロナウイルス感染に対する免疫応答の抑制を促進する。さらに、機能的活性は、コロナウイルス感染に対する免疫応答を抑制するハイブリッドペプチドの能力によって示され得る。
【0108】
断片（フラグメント）は、配列番号１、２または３からの少なくとも５０個、好ましくは１００個およびより好ましくは１５０個以上の連続アミノ酸を含むことができ、機能的に活性である。適切には、フラグメントは、例えば、cDNAのC末端連続欠失を用いて決定され得る。次いで、前記欠失構築物を適切なプラスミドにクローニングすることができる。次いで、これらの欠失突然変異体の活性を、本明細書に記載されるように生物学的活性について試験することができる。
【0109】
変異体とは、配列番号１、２または３と少なくとも７０％相同であるアミノ酸配列を意味し、より好ましくは配列番号１、２または３と少なくとも８０％相同であり、より好ましくは配列番号１、２または３と少なくとも９０％相同であり、さらにより好ましくは配列番号１、２または３と少なくとも９５％相同であり、さらにより好ましくは配列番号１、２または３と少なくとも９６％相同であり、さらにより好ましくは配列番号１、２または３と少なくとも９７％相同であり、最も好ましくは、配列番号１、２または３と少なくとも９８％相同であり、配列番号１、２または３と少なくとも９９％相同である、アミノ酸配列を意味する。変異体は、アミノ酸の置換を含む配列番号１、２または３のポリペプチド配列を包含し、特に、タンパク質の生物学的活性または構成、または折り畳みのいかなる有意な改変ももたらさない高い確率を有することが知られている１または複数の置換を包含する。これらの置換は、典型的には保存置換として知られており、当技術分野において公知である。例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンの基は、交換可能な塩基性アミノ酸であることが知られている。適切には、実施形態では、同じ電荷、サイズまたは疎水性のアミノ酸は、互いに置換され得る。適切には、任意の置換は、配列が整列されたときに類似または同一の位置で他のアルファサブタイプに存在するアミノ酸にアミノ酸置換を提供するために、インターフェロンアルファサブタイプのアミノ酸配列整列の分析に基づいて選択することができる。ハイブリッド、およびその変異体およびフラグメントは、当技術分野で公知の適切な分子生物学的方法を用いて作製することができる。適切には、相同性は配列同一性によって記述され得る。配列同一性は、当該技術分野で公知の方法、例えばBLASTによって決定することができる。
【0110】
当技術分野におけるIFNαの組換え型とマルチサブタイプとの間には多くの相違がある。最も明らかな差は、それぞれが有するIFNαサブタイプの数である。リコンビナント形成はアルファ２サブタイプ‐イントロンA（商標）についてのアルファ２b形成（Schering Plough）とRoferon（商標）についてのアルファ２a形成（ロシュ社）のみを含む。IFNαのマルチサブタイプ型は、IFNαの多くのサブタイプを含む。IFNαのマルチサブタイプ形成は広域スペクトルの薬物であり、IFNαサブタイプのいずれか１つが多かれ少なかれ抗ウイルス活性を有するという徴候はない。マルチサブタイプと組換え型の別の違いは、マルチサブタイプの製造過程でヒト細胞によって産生されるIFNα２がグリコシル化されるのに対し、組換え型は細菌発酵によって産生されるという点でグリコシル化されていないことである。グリコシル化は、半減期、生物活性、免疫原性など、タンパク質産物の多くの機能において重要な役割を果たしている。したがって、産生物のグリコシル化は、投与後の体内の持続時間、治療的に適切な用量の活性および産生物（プロダクト）自体に対する忍容性に影響を及ぼす可能性があるため、治療的または予防的治療を開発する際に重要な考慮事項である。
【0111】
本発明者は、IFN-α14、具体的には、配列番号１、HYBRID１（配列番号２）もしくはHYBRID２（配列番号３）またはその変異体もしくはフラグメントの投与が、IFN-α14、具体的には、配列番号１、HYBRID１（配列番号２）もしくはHYBRID２（配列番号３）またはその変異体もしくはフラグメントが投与されていないコントロール群と比較して、細胞変性効果またはプラーク形成などのウイルス活性の１０％、好ましくは２０％、好ましくは３０％、好ましくは４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％大きい減少をもたらすことを発見した。
【0112】
本発明者は、IFN-α14、具体的には、配列番号１、HYBRID１（配列番号２）もしくはHYBRID２（配列番号３）またはその変異体もしくはフラグメントの投与が、以前の抗ウイルス薬と比較して、細胞変性効果またはプラーク形成などのウイルス活性の１０％、好ましくは２０％、好ましくは３０％、好ましくは４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％およびより好ましくは９０％より大きな減少をもたらすことを発見した。
【0113】
本発明者は、HYBRID２（配列番号３）またはその変異体もしくはフラグメントの投与が、HYBRID２（配列番号３）またはその変異体もしくはフラグメントが投与されていない対照と比較して、細胞変性効果またはプラーク形成などのウイルス活性の１０％、好ましくは２０％、好ましくは３０％、好ましくは４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％およびより好ましくは９０％大きい低下をもたらすことを発見した。
【0114】
本発明者は、HYBRID２（配列番号３）またはその変異体もしくはフラグメントの投与は、以前の抗ウイルス薬と比較して、細胞変性効果またはプラーク形成などのウイルス活性の１０％、好ましくは２０％、好ましくは３０％、好ましくは４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％およびより好ましくは９０％大きい低下をもたらすことを発見した。
【0115】
HYBRID２の投与は、細胞変性効果またはプラーク形成を５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％、好ましくは９０％、好ましくは９１％、好ましくは９２％、好ましくは９３％、好ましくは９４％、好ましくは９５％、好ましくは９６％、好ましくは９７％、およびより好ましくは９８％減少させることができる。
【0116】
発明者は、IFN-α14、特に配列番号１、またはその変異体もしくはフラグメントの投与により、コロナウイルス感染の結果として、５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％、好ましくは９０％、好ましくは９１％、好ましくは９２％、好ましくは９３％、好ましくは９４％、好ましくは９５％、好ましくは９６％、好ましくは９７％、およびより好ましくは９８％の細胞変性効果またはプラーク形成が阻害されることを驚くべきことに発見した。HYBRID１およびHYBRID２も同様の機能的効果を示す。HYBRID２は、ウイルス活性の低下に特に有効であると考えられている。
【0117】
本発明者は、驚くべきことに、IFN-α14、特に配列番号１、またはその変異体もしくは断片の投与により、本明細書に記載の低用量で細胞変性効果またはプラーク形成が抑制がもたらされることを発見した。HYBRID１およびHYBRID２も同様の機能的効果を示す。HYBRID２は、ウイルス活性の低下に特に有効であると考えられる。
【0118】
本発明の処置は、５ IU／ml、１０ IU／ml、５０ IU／ml、１x１０2 IU／ml、１x１０3 IU／ml、１x１０4 IU／ml、１x１０5 IU／ml、１x１０6 IU／ml、１x１０7 IU／mlまたは１x１０8 IU／mlの用量で投与することができる。
【0119】
本発明の処置は、適切には、１ng～５０マイクログラム、０．１mg～１mg、１mg～３mg、３mg～５mgまたは５mg～１０mgの用量で投与することができる。
【0120】
本発明の治療は、１日１回、１日２回、１日３回または１日に少なくとも４回舌下に投与することができる。本発明の治療は、１日１回、１日２回、１日３回、または１日に少なくとも４回、エアロゾル送達によって肺に投与することができる。本発明の治療は、１日１回、１日２回、１日３回、または１日に少なくとも４回、注射によって投与することができる。
【0121】
さらに、本発明者は、IFN-α14、特に配列番号１、HYBRID１（配列番号２）もしくはHYBRID２（配列番号３）またはその変異体もしくはフラグメントの投与または使用が、コロナウイルス感染の結果としてのコロナウイルス活性の完全もしくは部分的抑制および／またはコロナウイルス感染の結果としてのプラーク形成の完全もしくは部分的抑制をもたらすこと、および／または細胞変性効果の完全もしくは部分的抑制をもたらすことを発見した。
【0122】
本発明は、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（SARS－CoV－１）、ヒトコロナウイルスNL６３、ヒトコロナウイルスHKU１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS－CoV）または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（SARS－CoV－２またはCovid１９）からの、コロナウイルス感染から安全かつ有効な優れた治療を提供する。この治療は、副作用プロファイルが低いことを示している。低用量の薬剤が必要であり、天然物であるIFN-α14、HYBRID１、またはHYBRID２は最高濃度（１×１０8 IU／ml）でもin vitroで細胞毒性を示さない。
【0123】
本発明者は、インターフェロン－アルファ－１４、特に配列番号１、HYBRID１、具体的には配列番号２、またはHYBRID２、具体的には配列番号３、またはその変異体もしくは断片を添加すると、コロナウイルス活性が強く阻害されることを実証した。本発明者は、合成アルファ－インターフェロン、インターフェロン－アルファ－１４（配列番号１）が、SARS－CoV－１による感染の結果として生じる細胞変性効果およびプラーク形成を阻害する能力を実証した。本発明者は、抗ウイルス化合物リバビリンおよびマルチサブタイプインターフェロンMultiferon（商標）と比較して、細胞変性作用の抑制を検討した。驚くべきことに、インターフェロン－アルファ１４（配列番号１）はSARS－CoV－１およびSARS－CoV２に対して活性であり、一方、リバビリンおよびマルチサブタイプインターフェロンMultiferon（商標）は、はるかに少ない阻害活性を示す。HYBRID１およびHYBRID２も同様の機能的効果を示す。これらの結果は、既存の抗ウイルス治療よりもコロナウイルス感染の治療において、IFNα-14、特に配列番号１、HYBRID１、特に配列番号２、またはHYBRID２、特に配列番号３またはその変異体もしくは断片が優れている可能性を明確に表示ものである。
【0124】
定義
フラグメント
フラグメントは、配列番号１、配列番号２または配列番号３からの少なくとも５０個、好ましくは１００個およびより好ましくは１５０個以上の連続アミノ酸を含むことができ、これらは機能的に活性である。適切には、フラグメントは、例えば、cDNAのC末端連続削除を用いて決定され得る。次いで、前記欠失構築物を適切なプラスミドにクローニングすることができる。次いで、これらの欠失突然変異体の活性を、本明細書に記載されるように生物学的活性について試験することができる。フラグメントは、当技術分野で公知の適切な分子生物学的方法を用いて生成され得る。
フラグメント
フラグメントは、配列番号１、配列番号２または配列番号３からの少なくとも５０個、好ましくは１００個およびより好ましくは１５０個以上の連続アミノ酸を含むことができ、これらは機能的に活性である。適切には、フラグメントは、例えば、cDNAのC末端連続削除を用いて決定され得る。次いで、前記欠失構築物を適切なプラスミドにクローニングすることができる。次いで、これらの欠失突然変異体の活性を、本明細書に記載されるように生物学的活性について試験することができる。フラグメントは、当技術分野で公知の適切な分子生物学的方法を用いて生成され得る。
【0125】
変異体
変異体とは、配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも７０％相同であり、より好ましくは配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも８０％相同であり、より好ましくは配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも９０％相同であり、さらに好ましくは配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも９５％相同であり、さらにより好ましくは配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも９６％相同であり、さらにより好ましくは配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも９７％相同であり、最も好ましくは配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも９８％相同であるアミノ酸配列を意味する。変異体は、アミノ酸の置換を含む配列番号１、配列番号２または配列番号３のポリペプチド配列を包含し、特に、タンパク質の生物学的活性または構成、または折り畳みのいかなる有意な改変ももたらさない高い確率を有することが知られている１または複数の置換を包含する。これらの置換は、典型的には保存置換として知られており、当技術分野において公知である。例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンのグループは、交換可能な塩基性アミノ酸であることが知られている。適切には、実施形態では、同じ電荷、サイズまたは疎水性のアミノ酸は、互いに置換され得る。適切には、任意の置換は、配列が整列されたときに類似または同一の位置で他のアルファサブタイプに存在するアミノ酸にアミノ酸置換を提供するために、インターフェロンアルファサブタイプのアミノ酸配列整列の分析に基づいて選択することができる。変異体は、当技術分野で公知の適切な分子生物学的方法を用いて作製され得る。
変異体とは、配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも７０％相同であり、より好ましくは配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも８０％相同であり、より好ましくは配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも９０％相同であり、さらに好ましくは配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも９５％相同であり、さらにより好ましくは配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも９６％相同であり、さらにより好ましくは配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも９７％相同であり、最も好ましくは配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも９８％相同であるアミノ酸配列を意味する。変異体は、アミノ酸の置換を含む配列番号１、配列番号２または配列番号３のポリペプチド配列を包含し、特に、タンパク質の生物学的活性または構成、または折り畳みのいかなる有意な改変ももたらさない高い確率を有することが知られている１または複数の置換を包含する。これらの置換は、典型的には保存置換として知られており、当技術分野において公知である。例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンのグループは、交換可能な塩基性アミノ酸であることが知られている。適切には、実施形態では、同じ電荷、サイズまたは疎水性のアミノ酸は、互いに置換され得る。適切には、任意の置換は、配列が整列されたときに類似または同一の位置で他のアルファサブタイプに存在するアミノ酸にアミノ酸置換を提供するために、インターフェロンアルファサブタイプのアミノ酸配列整列の分析に基づいて選択することができる。変異体は、当技術分野で公知の適切な分子生物学的方法を用いて作製され得る。
【0126】
対象
本明細書に定義されるように、「対象」は、ヒト、霊長類および家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）のような哺乳動物、マウス、ウサギ、ラットおよびモルモットのような実験室試験動物、ならびにイヌおよびネコのようなコンパニオン動物を含み、それらを包含する。
本明細書に定義されるように、「対象」は、ヒト、霊長類および家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）のような哺乳動物、マウス、ウサギ、ラットおよびモルモットのような実験室試験動物、ならびにイヌおよびネコのようなコンパニオン動物を含み、それらを包含する。
【0127】
治療・処理
「治療」という用語は、本明細書では、ヒトまたはヒト以外の動物に利益を与え得る任意のレジメンを指すために使用される。治療は、コロナウイルス感染に関してであってよく、治療は、予防的（予防的治療）であってもよい。治療には、治癒的または緩和的効果がある。本明細書における「治療的」および「予防的」治療への言及は、その最も広い文脈において考慮されるべきである。「治療的」という用語は、必ずしも、対象が全回復まで治療されることを意味するわけではない。同様に、「予防的」とは、必ずしも対象が最終的に疾患状態に罹らないことを意味するわけではない。したがって、治療的および／または予防的治療には、コロナウイルス感染の症状の改善、またはウイルス感染、適切にはコロナウイルス感染、を発症するリスクをを予防さもなければ減少させることが含まれる。「予防的」という用語は、特定の状態の重症度または発症を減少させるものとみなすことができる。「治療的」はまた、既存の状態の重症度を低下させ得る。
「治療」という用語は、本明細書では、ヒトまたはヒト以外の動物に利益を与え得る任意のレジメンを指すために使用される。治療は、コロナウイルス感染に関してであってよく、治療は、予防的（予防的治療）であってもよい。治療には、治癒的または緩和的効果がある。本明細書における「治療的」および「予防的」治療への言及は、その最も広い文脈において考慮されるべきである。「治療的」という用語は、必ずしも、対象が全回復まで治療されることを意味するわけではない。同様に、「予防的」とは、必ずしも対象が最終的に疾患状態に罹らないことを意味するわけではない。したがって、治療的および／または予防的治療には、コロナウイルス感染の症状の改善、またはウイルス感染、適切にはコロナウイルス感染、を発症するリスクをを予防さもなければ減少させることが含まれる。「予防的」という用語は、特定の状態の重症度または発症を減少させるものとみなすことができる。「治療的」はまた、既存の状態の重症度を低下させ得る。
【0128】
投与
本発明において使用される活性成分、特にインターフェロンサブタイプIFN-α14、例えば、配列番号１、HYBRID１（配列番号２）またはHYBRID２（配列番号３）は、本明細書に記載されるように、同一の対象に別々に、任意に連続的に投与することができ、または医薬組成物もしくは免疫原性組成物として同時投与することができる。
本発明において使用される活性成分、特にインターフェロンサブタイプIFN-α14、例えば、配列番号１、HYBRID１（配列番号２）またはHYBRID２（配列番号３）は、本明細書に記載されるように、同一の対象に別々に、任意に連続的に投与することができ、または医薬組成物もしくは免疫原性組成物として同時投与することができる。
【0129】
本発明のおよび本発明における使用のためのインターフェロンは、単独で、または別の薬剤と組み合わせて投与することができるが、医薬組成物として投与することが好ましい。医薬組成物は、一般に、目的とする投与経路に応じて選択される適切な医薬賦形剤、希釈剤または担体を含む。
【0130】
活性成分は、任意の適切な経路を介して、処理を必要とする患者に投与することができる。正確な用量は、以下でより詳細に論じるように、多数の要因に依存する。
【0131】
いくつかの適切な投与経路には、経口、直腸、経鼻、局所（口腔および舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下腔のおよび硬膜外を含む）投与、または経口もしくは経鼻吸入による投与が含まれる（これらに限定されるわけではない）。
【0132】
組成物は、注射用組成物として送達可能であり、経口投与され、経口または経鼻吸入によりエアロゾルとして肺に投与される。
【0133】
１つの適切な投与経路は舌下投与であり、例えば、対象の舌下に適用される。
【0134】
経口または経鼻吸入経路による投与の場合、好ましくは、活性成分は、適切な医薬製剤中にあり、吸入器またはネブライザー装置を含むがこれに限定されない機械的形態を用いて送達され得る。
【0135】
さらに、経口または経鼻吸入経路を使用する場合には、SPAG（小さな粒子状エアロゾル発生器）による投与を使用することができる。
【0136】
静脈注射の場合、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なpH、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態であろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液のような等張性ビヒクルを用いて適切な解決策を上手く調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および／または他の添加剤を含むことができる。
【0137】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体の形成であってもよい。錠剤は、ゼラチンまたは補助剤のような固体担体を含むことができる。液体医薬組成物は、一般に、水、ペトロール（石油）、動物油または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースまたは他の糖溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールを含むことができる。
【0138】
組成物はまた、ミクロスフェア、リポソーム、他のミクロ粒子デリバリーシステム、または血液を含む特定の組織に配置された徐放性製剤を介して投与されてもよい。徐放性担体の適当な例は、共有された物品、例えば座薬またはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含む。埋め込み可能またはマイクロカプセルの徐放性マトリクスには、L－グルタミン酸およびガンマエチル－L－グルタミン酸、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）またはエチレン酢酸ビニルのポリラクチドコポリマーが含まれる。
【0139】
上記の技術およびプロトコル、ならびに本発明に従って使用され得る他の技術およびプロトコルの例は、Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. (ed), 1980に見出すことができる。
【0140】
医薬組成物
上述のように、本発明はコロナウイルス感染症の治療のための医薬組成物に及ぶ。本発明による医薬組成物は、本発明に従って使用するために、活性成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝安定剤または当業者に公知の他の材料を含み得る。そのような物質は無毒であり、活性成分の有効性を妨げてはならない。担体または他の物質の正確な性質は、例えば経口、静脈内、鼻腔内、または経口もしくは経鼻吸入による投与経路に依存する。製剤は、例えば、pH ６．８～７．６の非リン酸緩衝液を含有する生理食塩溶液、または凍結乾燥またはフリーズドライ粉末であってよい。
上述のように、本発明はコロナウイルス感染症の治療のための医薬組成物に及ぶ。本発明による医薬組成物は、本発明に従って使用するために、活性成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝安定剤または当業者に公知の他の材料を含み得る。そのような物質は無毒であり、活性成分の有効性を妨げてはならない。担体または他の物質の正確な性質は、例えば経口、静脈内、鼻腔内、または経口もしくは経鼻吸入による投与経路に依存する。製剤は、例えば、pH ６．８～７．６の非リン酸緩衝液を含有する生理食塩溶液、または凍結乾燥またはフリーズドライ粉末であってよい。
【0141】
用量
組成物は、好ましくは、「治療有効量」または「所望の量」で個々に投与され、これは個々に利益を示すのに十分である。本明細書に定義されるように、「有効量」という用語は、所望の応答を少なくとも部分的に得るために必要な量、または治療される特定の状態の発症を遅らせるか、進行を阻害するか、発症または進行を完全に止めるのに必要な量を意味する。量は、治療される対象の健康状態および身体状態、治療される対象の分類群、所望される保護の程度、組成物の配合、医学的状況の評価および他の関連要因に応じて変化する。この量は比較的広い範囲で減少すると予想されており、これは日常的な試験によって決定される可能性がある。治療の処方、例えば、投薬量などの決定は、最終的には、一般開業医、医師または他の医師の責任の所在および裁量の範囲内であり、典型的には、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および開業医に知られている他の因子を考慮に入れる。最適な用量は、例えば、年齢、性別、体重、治療される状態の重症度、投与される活性成分、および投与経路を含む多くのパラメータに基づいて、医師によって決定され得る。広範囲の用量が適用可能である。ヒト患者への経口投与を考慮すると、例えば、約１０μg～約１０００μgの薬剤をヒト用量当たり、場合により３～４用量で投与することができる。最適な治療反応を示し、副作用を軽減するために、投与レジメンを調節してもよい。例えば、数回の分割投与は、毎日、毎週、毎月または他の適当な時間間隔で投与することができ、または状況の緊急性によって示されるように、投与量を比例的に減らすことができる。
組成物は、好ましくは、「治療有効量」または「所望の量」で個々に投与され、これは個々に利益を示すのに十分である。本明細書に定義されるように、「有効量」という用語は、所望の応答を少なくとも部分的に得るために必要な量、または治療される特定の状態の発症を遅らせるか、進行を阻害するか、発症または進行を完全に止めるのに必要な量を意味する。量は、治療される対象の健康状態および身体状態、治療される対象の分類群、所望される保護の程度、組成物の配合、医学的状況の評価および他の関連要因に応じて変化する。この量は比較的広い範囲で減少すると予想されており、これは日常的な試験によって決定される可能性がある。治療の処方、例えば、投薬量などの決定は、最終的には、一般開業医、医師または他の医師の責任の所在および裁量の範囲内であり、典型的には、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および開業医に知られている他の因子を考慮に入れる。最適な用量は、例えば、年齢、性別、体重、治療される状態の重症度、投与される活性成分、および投与経路を含む多くのパラメータに基づいて、医師によって決定され得る。広範囲の用量が適用可能である。ヒト患者への経口投与を考慮すると、例えば、約１０μg～約１０００μgの薬剤をヒト用量当たり、場合により３～４用量で投与することができる。最適な治療反応を示し、副作用を軽減するために、投与レジメンを調節してもよい。例えば、数回の分割投与は、毎日、毎週、毎月または他の適当な時間間隔で投与することができ、または状況の緊急性によって示されるように、投与量を比例的に減らすことができる。
【0142】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の分野において当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【図面の簡単な説明】
【0143】
【図3】図３は、IFNアルファ２a（市販のサブタイプ）をIFNアルファ１４と比較し、IC50を示すSARS－CoV－２阻害プラークアッセイのベロ細胞を使用したプラーク阻害アッセイの結果を示す－これは、アルファ‐14がアルファ‐２aよりもCovid19ウイルスに対して２０倍強力であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【0144】
実験データ
本発明者は、SARS－CoV－１およびSARS－CoV－２の感染の結果として引き起こされる細胞変性効果およびプラーク形成に基づくモデル系を用いて、合成アルファ－インターフェロンHYBRID２のウイルス感染阻害能を調べた。本発明者はまた、抗ウイルス化合物リバビリンおよびマルチサブタイプインターフェロンMultiferon（商標）と比較して、細胞変性作用の抑制を検討した。さらに、本発明者は、HYBRID２の抗ウイルス効果を実証するためにRSVを利用した。RSV感染は、乳児の入院の最も重要な原因であり、乳児死亡の主要な原因の１つである。呼吸器ウイルスの１つとして、インフルエンザ、ライノウイルス、コロナウイルスとともに、それ自体が興味深く、指標となるモデルを提供している。
本発明者は、SARS－CoV－１およびSARS－CoV－２の感染の結果として引き起こされる細胞変性効果およびプラーク形成に基づくモデル系を用いて、合成アルファ－インターフェロンHYBRID２のウイルス感染阻害能を調べた。本発明者はまた、抗ウイルス化合物リバビリンおよびマルチサブタイプインターフェロンMultiferon（商標）と比較して、細胞変性作用の抑制を検討した。さらに、本発明者は、HYBRID２の抗ウイルス効果を実証するためにRSVを利用した。RSV感染は、乳児の入院の最も重要な原因であり、乳児死亡の主要な原因の１つである。呼吸器ウイルスの１つとして、インフルエンザ、ライノウイルス、コロナウイルスとともに、それ自体が興味深く、指標となるモデルを提供している。
【0145】
実験１：SARS－CoV－１コロナウイルス感染後の細胞変性効果に対するIFNα-14の効果
SARS－CoV－１感染後の細胞変性効果を阻害するためのインターフェロンアルファサブタイプIFN-α14の有効性を、細胞変性エンドポイントアッセイにおいて試験した。すべてのエンドポイントアッセイは、比較のためにマルチサブタイプMultiferonおよびIFN-α14、ならびに抗ウイルスリバビリンを用いて実施した。
SARS－CoV－１感染後の細胞変性効果を阻害するためのインターフェロンアルファサブタイプIFN-α14の有効性を、細胞変性エンドポイントアッセイにおいて試験した。すべてのエンドポイントアッセイは、比較のためにマルチサブタイプMultiferonおよびIFN-α14、ならびに抗ウイルスリバビリンを用いて実施した。
【0146】
抗ウイルス治療の準備
他のウイルス－宿主組み合わせに一般的に使用される阻害用量を含む広範囲の濃度（１０倍希釈により得られた）を試験した。化合物をハンクス緩衝食塩水に溶解した。
他のウイルス－宿主組み合わせに一般的に使用される阻害用量を含む広範囲の濃度（１０倍希釈により得られた）を試験した。化合物をハンクス緩衝食塩水に溶解した。
【0147】
プラークアッセイのために、５倍薬物希釈物を、以下に明記されるように増殖培地を用いて調製した。SARS－CoV－１産生および感染アフリカ・グリーン・モンキー（Vero E６）細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）を、１０％ウシ胎児血清（FCS; Biological Industries、Israel）を添加したMedium199（Sigma, St Louis, USA）からなる増殖培地を含む７５cm細胞培養フラスコ中で増殖させた。SARS－HCoV2003VA2774（シンガポールのSARS患者由来の分離株）をVero E６細胞で増殖させた。簡単に述べると、Vero E６細胞のコンフルエントな単層に２mlのストックウイルスを添加し、５% CO2中３７℃で１時間インキュベートした。次いで、５% FCSを添加した１３mlのMedium199を添加した。培養物を３７℃で５% CO2中でインキュベートし、各ウェルを倒立顕微鏡で観察して細胞変性作用の抑制を測定した。４８時間後に７５％以上の抑制が観察された場合、上清を回収した。上清を2500rpmで清澄化し、次いで、凍結バイアルにアリコートし、使用まで－８０℃で保存した。
【0148】
ウイルスのハンドリングと滴定
凍結培養上清中のウイルス力価は、二重に実施したプラークアッセイを用いて測定した。簡単に言えば、１０倍連続希釈中の１００マイクロリットルのウイルスを、２４ウェルプレート中のVero E６細胞の単層に添加した。３７℃、５% CO2中で１時間インキュベートした後、５% FCSを添加したウイルスMedium199を添加した。細胞を１０％（v／v）ホルマリンで固定し、２%（w/v）クリスタルバイオレットで染色した。プラークを目視で計数し、プラーク形成単位／ml（pfu／ml）中のウイルス力価を計算した。
凍結培養上清中のウイルス力価は、二重に実施したプラークアッセイを用いて測定した。簡単に言えば、１０倍連続希釈中の１００マイクロリットルのウイルスを、２４ウェルプレート中のVero E６細胞の単層に添加した。３７℃、５% CO2中で１時間インキュベートした後、５% FCSを添加したウイルスMedium199を添加した。細胞を１０％（v／v）ホルマリンで固定し、２%（w/v）クリスタルバイオレットで染色した。プラークを目視で計数し、プラーク形成単位／ml（pfu／ml）中のウイルス力価を計算した。
【0149】
細胞変性エンドポイントアッセイ
各抗ウイルス治療の効果を４倍に試験した。簡単に述べると、各処理の連続１０倍希釈物１００マイクロリットルを１００マイクロリットルのVero E６細胞と共にインキュベートし、９６ウェルプレート中でウェル当たり２０，０００細胞の最終細胞数を得た。インキュベーションは、インターフェロン調整物については５% CO2中３７℃で一晩、０．５の感染（MOI）（ウイルス粒子／細胞）については１時間であった。プレートを３７℃で５% CO2中で３日間インキュベートし、プレートに細胞変性作用がないか毎日観察した。エンドポイントは、４つのセットアップすべてにおいて細胞変性効果を阻害する希釈濃度であった。
各抗ウイルス治療の効果を４倍に試験した。簡単に述べると、各処理の連続１０倍希釈物１００マイクロリットルを１００マイクロリットルのVero E６細胞と共にインキュベートし、９６ウェルプレート中でウェル当たり２０，０００細胞の最終細胞数を得た。インキュベーションは、インターフェロン調整物については５% CO2中３７℃で一晩、０．５の感染（MOI）（ウイルス粒子／細胞）については１時間であった。プレートを３７℃で５% CO2中で３日間インキュベートし、プレートに細胞変性作用がないか毎日観察した。エンドポイントは、４つのセットアップすべてにおいて細胞変性効果を阻害する希釈濃度であった。
【0150】
細胞毒性を測定するために、各処理の連続１０倍希釈物１００マイクロリットルを、１００マイクロリットルのVero E６細胞と共にインキュベートし、ウイルスチャレンジ（負荷）なしで、９６ウェルプレート中のウェル当たり２０，０００細胞の最終細胞数を得た。次いで、プレートを３７℃で５% CO2中で３日間インキュベートし、倒立顕微鏡を用いて毒性作用を観察した。
【0151】
次いで、１０，０００ pfu／ウェルの濃度で１０マイクロリットルのウイルスを各試験ウェルに添加した。これは感染の多重度（MOI）（細胞あたりのウイルス粒子）が０．５に等しい。プレートを３７℃で５% CO2中で３日間インキュベートし、プレートに細胞変性作用がないか毎日観察した。エンドポイントは、４つの設定（CIA１００）すべてにおいて細胞変性効果を阻害する希釈濃度であった。
【0152】
細胞毒性を決定するために、各処理の連続１０倍希釈物１００マイクロリットルを、１００マイクロリットルのVero E６細胞と共にインキュベートし、ウイルスチャレンジなしで、９６ウェルプレート中のウェル当たり２０，０００細胞の最終細胞数を得た。次いで、プレートを３７℃で５% CO2中で３日間インキュベートし、倒立顕微鏡を用いて毒性作用を観察した。完全な抑制を示したインターフェロンを、１０3および１０2 pfu／wellのより低いウイルス力価でさらに試験した。
【0153】
実験２：SARS－CoV－１コロナウイルスからの感染後のプラーク形成に対するIFNα-14の効果
SARS－CoV－１感染後のプラーク形成を阻害するインターフェロンアルファサブタイプIFN-α14の有効性を、プラーク減少アッセイで試験した。
SARS－CoV－１感染後のプラーク形成を阻害するインターフェロンアルファサブタイプIFN-α14の有効性を、プラーク減少アッセイで試験した。
【0154】
ウイルスストックの１０倍希釈を用いてプラークアッセイを行い、０．１mlアリコートを感受性細胞単層に接種した。ウイルスを細胞に付着させたインキュベーション期間の後、単層を、ゲルを形成させる物質、通常は寒天を含む栄養培地で覆った。プレ－トインキュベーション後、元の感染細胞はウイルス子孫を放出した。新しいウイルスの拡散は、ゲルによって隣接する細胞に限定される。その結果、それぞれの感染粒子はプラークとよばれる感染細胞の環状領域をつくった。最終的にプラークは肉眼で見えるほどの大きさになった。生細胞を染色する染料を用いて、生細胞とプラークの間のコントラストを増強した。この方法、すなわちSARS－CoV－１を用いて、細胞に目に見える損傷を引き起こしたウイルスのみを分析した。
【0155】
これらの結果は、合成アルファ－インターフェロン、インターフェロン－アルファ－１４（配列番号１）が、SARS－CoV－１感染の結果として生じる細胞変性効果およびプラーク形成を阻害する能力を明らかに示す。抗ウイルス化合物リバビリンおよびマルチサブタイプインターフェロンMultiferon（商標）と比較して、細胞変性作用の抑制が示された。驚くべきことに、インターフェロン‐α１４（配列番号１）はSARS－CoV－１に対して活性であるが、リバビリンおよびマルチサブタイプインターフェロンMultiferon（商標）は、はるかに少ない阻害活性を示す。HYBRID１およびHYBRID２も同様の機能的効果を示す。これらの結果は、既存の抗ウイルス処理よりもコロナウイルス感染の治療に対するIFNα-14α、特に配列番号１、HYBRID１、特に配列番号２またはHYBRID２、特に配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントの潜在的優越性を明らかに表すものである。
【0156】
実験３：SARS－CoV－２コロナウイルスからの感染後のプラーク形成に対するIFNα-14の効果
SARS－CoV－２感染後のプラーク形成を阻害するインターフェロンアルファサブタイプIFN-α14の有効性を、プラーク減少アッセイで試験した。
SARS－CoV－２感染後のプラーク形成を阻害するインターフェロンアルファサブタイプIFN-α14の有効性を、プラーク減少アッセイで試験した。
【0157】
ウイルスストックの１０倍希釈を用いてプラークアッセイを行い、０．１mlアリコートを感受性細胞単層に接種した。ウイルスを細胞に付着させたインキュベーション期間の後、単層を、ゲルを形成させる物質、通常は寒天を含む栄養培地で覆った。プレートインキュベーション後、元の感染細胞はウイルス子孫を放出した。新しいウイルスの拡散は、ゲルによって隣接する細胞に限定される。その結果、それぞれの感染粒子はプラークとよばれる感染細胞の環状領域をつくった。最終的にプラークは肉眼で見えるほどの大きさになった。生細胞を染色する染料を用いて、生細胞とプラークの間のコントラストを増強した。この方法を用いて、細胞に目に見える損傷を引き起こしたウイルス、すなわちSARS－CoV－２のみを分析した。
【0158】
これらの結果（図３および４）は、合成アルファ－インターフェロン、インターフェロン－アルファ－１４（配列番号１）が、SARS－CoV－２感染の結果として生じる細胞変性効果およびプラーク形成を阻害する能力を明確に示す。結果は、他のインターフェロンと比較して、細胞変性効果の抑制を実証する。インターフェロン－アルファ１４（配列番号１）、HYBRID１およびHYBRID２はSARS－CoV－２に対して有効である。これらの結果は、既存の抗ウイルス処理よりもコロナウイルス感染の治療に対する、IFNα-14、特に配列番号１、HYBRID１、特に配列番号２またはHYBRID２、特に配列番号３またはその変異体もしくはフラグメントの潜在的優越性を明らかに表示ものである。
【0159】
IL－１７、グランザイムB、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ、NK細胞に関するアッセイ
主要な免疫変調器に関連してインターフェロンアルファ１４およびHYBRID２を使用するアッセイが、当技術分野で理解されるように行われた。
主要な免疫変調器に関連してインターフェロンアルファ１４およびHYBRID２を使用するアッセイが、当技術分野で理解されるように行われた。
【0160】
免疫細胞殺傷に対するHYBRID２への影響
ハイブリッド組換え型インターフェロンの効果を、IncuCyte ZOOMプラットフォーム上での免疫細胞殺傷の生細胞イメージングアッセイで試験した。
ハイブリッド組換え型インターフェロンの効果を、IncuCyte ZOOMプラットフォーム上での免疫細胞殺傷の生細胞イメージングアッセイで試験した。
【0161】
SK－OV－３ 赤色標識核（SK－OV－３ NucLight Red）を有する卵巣癌細胞を試験の標的細胞として用いた。免疫細胞殺傷のために、細胞をナチュラルキラー（NK）細胞と共培養し、陽性対照をIL‐2とIL‐12で処理した細胞から構成した。アポトーシスはカスパーゼ３／７ポジティブオブジェクトの染色により検出され、一方、細胞数は赤色核の計数により決定された。共培養モデルの結果を、SK－OV－３ NucLight Red細胞のみからなる単培養モデルの結果と比較した。
【0162】
標的細胞とエフェクター細胞の４比率を試験する最初の最適化実験を行った。これらの結果は、９６ウェルプレートのウェル当たり５０００個のナチュラルキラー細胞および２０００個のSK－OV－３ NucLight Red細胞が、免疫細胞殺傷を検出するための適切なアッセイウインドウ（窓）を与えることを決定した。
【0163】
１０ IU／mlから３x１０６IU／mlの範囲のハイブリッド組換えインターフェロンの８回分を、免疫細胞殺菌に対する効果についてテストした。結果を、無処理対照、ビヒクル（溶媒）処理対照およびIL－２／IL－１２処理細胞と比較した。共培養細胞（SK－OV－３ NucLightおよびNK細胞）および単培養細胞（SK－OV－３ NucLight Red）を用いて、すべての条件を試験した。
【0164】
IncuCyte ZOOMを用いて細胞を４日間モニターし、IncuCyteソフトウェアを用いて緑色（アポトーシス）および赤色（細胞数）オブジェクトカウントを経時的に測定した。曲線下面積（AUC）分析を用いて、時間経過にわたってアポトーシスと細胞数を定量した。
【0165】
IL－１７、Il－６、CCL－５および免疫反応は、Covid－１９感染後、特にIL－１７炎症が重要なものとして示されるCovid－１９誘発急性呼吸窮迫症候群感染後に、調節されることが測定された。
【0166】
ハイブリッド組換えインターフェロンは共培養モデルにおいてアポトーシスの強い誘導を引き起こし、AUCは溶媒対照の２００からハイブリッド組換えインターフェロンの最高用量で１１７４に増加した。１．５x１０６IU／mlのEC５０をアポトーシス誘導のために導出した。対照的に、単一培養の細胞は、ハイブリッドrIFNに対してわずかな応答しか示さなかった。
【0167】
ハイブリッド組換インターフェロンも細胞数の減少を引き起こした。細胞数のAUC値は溶媒対照の３９９２１からハイブリッドrIFNの最高用量で１９５０１に低下した。細胞数の低下に対して１．３x１０６IU／mlのIC５０値を決定した。
【0168】
ハイブリッド（HYBRID）rIFNによるナチュラルキラー細胞の非常に強い直接活性化のエビデンスがあり、NK細胞単一培養モデルにおいてハイブリッド組換えインターフェロン処理に応答してNK細胞の細胞クラスター形成が観察された。
【0169】
図５～１５に示すように、IFNアルファ１４および特にHYBRID２は、Il－１７（１７AおよびFの両方を非常に強く阻害する）、Il－６、CCL－５、およびCCl－２を調節し、抗ウイルスNK応答を提供することが実証されている。
【0170】
本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の記載された実施形態に対する様々な修正および変形が当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態との関連において説明してきたが、請求項に記載した本発明はそのような特定の実施形態に限定されないことが理解されるべきである。実際、当業者に自明な本発明を実施するための記載された態様の様々な修正は、本発明によってカバーされることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】