(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-26
(54)【発明の名称】ＩＦＮ－γの抗腫瘍補助薬の調製への応用
(51)【国際特許分類】
A61K 38/21 20060101AFI20230419BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230419BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230419BHJP
C07K 14/57 20060101ALI20230419BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230419BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20230419BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230419BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230419BHJP
C12N 15/23 20060101ALI20230419BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20230419BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20230419BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230419BHJP
A61P 13/00 20060101ALI20230419BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230419BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20230419BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230419BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230419BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230419BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20230419BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230419BHJP
A61P 13/02 20060101ALI20230419BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230419BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230419BHJP
【ＦＩ】
A61K38/21
C12N5/0783 ZNA
C12N5/10
C07K14/57
C12Q1/02
C12Q1/6851 Z
C12N15/63 Z
C12N15/12
C12N15/23
C12N15/867 Z
C12N15/86 Z
A61P35/00
A61P13/00
A61P25/00
A61P1/00
A61P17/00
A61P11/00
A61P13/12
A61P13/10
A61P1/16
A61P13/02
A61K35/17
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022554580
(86)(22)【出願日】2021-03-03
(85)【翻訳文提出日】2022-11-07
(86)【国際出願番号】 CN2021078858
(87)【国際公開番号】W WO2021179967
(87)【国際公開日】2021-09-16
(31)【優先権主張番号】202010159630.9
(32)【優先日】2020-03-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202010487110.0
(32)【優先日】2020-06-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】512330318
【氏名又は名称】四川大学華西医院
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(72)【発明者】
【氏名】▲楊▼ 寒朔
(72)【発明者】
【氏名】董 娥
(72)【発明者】
【氏名】岳 小竺
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA17
4B063QA19
4B063QQ08
4B065AA94X
4B065AB01
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4C087ZB26
4H045AA30
4H045BA09
4H045DA18
4H045EA20
4H045EA31
4H045EA51
(57)【要約】
本発明は、抗腫瘍免疫療法を補助する抗腫瘍薬及びその応用に関するものである。本発明は、ＩＦＮ－γの抗腫瘍補助薬の調製への応用を提供し、前記ＩＦＮ－γは、腫瘍細胞を感作することによってＴ細胞製剤の前記腫瘍細胞に対する殺傷効果を高め、前記Ｔ細胞製剤には、非遺伝子組み換えＴ細胞及び／又は遺伝子組み換えＴ細胞が含まれ、前記ＩＦＮ－γには、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片が含まれる。本発明は、従来の技術における、ＩＦＮ－γに対する認知を打破し、ＩＦＮ－γが腫瘍細胞のＩＦＮ－γシグナル伝達経路を活性化することにより、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１を介した獲得免疫耐性を抑制し、免疫療法の抗腫瘍効果を高めることを見出したものである。
【選択図】 図１７
【選択図】 図１７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩＦＮ－γの、Ｔ細胞製剤を補助する抗腫瘍補助薬の調製への応用であって、前記ＩＦＮ－γは、腫瘍細胞を感作することによって前記Ｔ細胞製剤の前記腫瘍細胞に対する殺傷効果を高め、前記Ｔ細胞製剤には、非遺伝子組み換えＴ細胞及び／又は遺伝子組み換えＴ細胞が含まれ、前記ＩＦＮ－γには、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片が含まれる、ことを特徴とする応用。
【請求項2】
前記遺伝子組み換えＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＴＣＲ－Ｔ細胞からなる、ことを特徴とする、請求項１に記載の応用。
【請求項3】
前記ＩＦＮ－γは、前記腫瘍細胞のＩＦＮ－γシグナル伝達経路を活性化することにより、前記腫瘍細胞を感作する、請求項１又は２に記載の応用。
【請求項4】
前記腫瘍細胞のＩＦＮ－γシグナル活性化は、ＩＣＡＭ－１をアップレギュレートして、前記Ｔ細胞製剤の前記腫瘍細胞に対する殺傷効果を高める、ことを特徴とする請求項３に記載の応用。
【請求項5】
前記抗腫瘍補助薬が用いられる腫瘍は、固形腫瘍である、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の応用。
【請求項6】
前記抗腫瘍補助薬が用いられる腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の応用。
【請求項7】
ＩＦＮ－γの、免疫チェックポイント阻害剤を補助する抗腫瘍補助薬の調製への応用であって、前記ＩＦＮ－γは、腫瘍細胞を感作することによって免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果を補助し、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤からなり、前記ＩＦＮ－γには、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片が含まれる、ことを特徴とする応用。
【請求項8】
前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ及びＤｕｒｖａｌｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上であり、前記ＰＤ－１阻害剤は、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ、Ｔｙｖｙｔ及びＣａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上である、ことを特徴とする請求項７に記載の応用。
【請求項9】
前記抗腫瘍補助薬が用いられる腫瘍は、固形腫瘍である、ことを特徴とする請求項７又は８に記載の応用。
【請求項10】
前記抗腫瘍補助薬が用いられる腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである、ことを特徴とする請求項７～９のいずれか一項に記載の応用。
【請求項11】
ＩＦＮ－γの、Ｔ細胞製剤と免疫チェックポイント阻害剤とを補助する抗腫瘍補助薬の調製への応用であって、前記ＩＦＮ－γは、腫瘍細胞を感作することによって前記Ｔ細胞製剤及び前記免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果を補助し、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤からなり、前記Ｔ細胞製剤には、非遺伝子組み換えＴ細胞及び／又は遺伝子組み換えＴ細胞が含まれ、前記ＩＦＮ－γには、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片が含まれる、ことを特徴とする応用。
【請求項12】
前記遺伝子組み換えＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＴＣＲ－Ｔ細胞からなる、ことを特徴とする請求項１１に記載の応用。
【請求項13】
前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ及びＤｕｒｖａｌｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上であり、前記ＰＤ－１阻害剤は、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ、Ｔｙｖｙｔ及びＣａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上である、ことを特徴とする請求項１１又は１２に記載の応用。
【請求項14】
前記補助薬は、腫瘍細胞によるＩＣＡＭ－１の産生を刺激して、前記Ｔ細胞製剤の前記腫瘍細胞に対する殺傷効果を高める、ことを特徴とする請求項１１～１３のいずれか一項に記載の応用。
【請求項15】
前記腫瘍は、固形腫瘍である、ことを特徴とする請求項１１～１４のいずれか一項に記載の応用。
【請求項16】
前記腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである、ことを特徴とする請求項１１～１４のいずれか一項に記載の応用。
【請求項17】
ＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤からなる免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果検出用キットであって、前記キットは、腫瘍細胞におけるＩＦＮ－γシグナル伝達経路の開存性を検出する、ことを特徴とするキット。
【請求項18】
前記キットは、前記腫瘍細胞におけるＩＣＡＭ－１又はＩＦＮ－γＲ２の発現レベルを検出する、ことを特徴とする請求項１７に記載のキット。
【請求項19】
前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ及びＤｕｒｖａｌｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上であり、前記ＰＤ－１阻害剤は、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ、Ｔｙｖｙｔ及びＣａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上である、ことを特徴とする請求項１７又は１８に記載のキット。
【請求項20】
前記腫瘍は、固形腫瘍である、ことを特徴とする請求項１７～１９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項21】
前記腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである、ことを特徴とする請求項１７～１９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項22】
抗腫瘍免疫療法を補助する抗腫瘍薬であって、前記抗腫瘍薬は、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片を含み、腫瘍細胞を感作することによってＴ細胞製剤及び／又は免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果を補助する、ことを特徴とする抗腫瘍薬。
【請求項23】
前記抗腫瘍薬は、ターゲティングベクターを含み、前記ターゲティングベクターは、前記野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片を前記腫瘍細胞に送達する、ことを特徴とする請求項２２に記載の抗腫瘍薬。
【請求項24】
前記抗腫瘍薬は、前記Ｔ細胞製剤及び／又は前記免疫チェックポイント阻害剤と併用される、ことを特徴とする請求項２２又は２３に記載の抗腫瘍薬。
【請求項25】
前記抗腫瘍薬は、さらに任意の薬学的に許容されるベクター及び／又は補助剤を含む、ことを特徴とする請求項２２～２４のいずれか一項に記載の抗腫瘍薬。
【請求項26】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と腫瘍細胞感作因子をコードする核酸とを含むＣＡＲ発現ベクターであって、前記腫瘍細胞感作因子をコードする前記核酸は、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片をコードする核酸である、ことを特徴とするＣＡＲ発現ベクター。
【請求項27】
前記ＣＡＲをコードする前記核酸は、自己切断型ペプチドをコードする配列によって前記腫瘍細胞感作因子をコードする前記核酸に連結されている、ことを特徴とする請求項２６に記載のＣＡＲ発現ベクター。
【請求項28】
前記ＣＡＲをコードする前記核酸は、腫瘍特異抗原を標的とする単鎖抗体可変領域（ＳｃＦｖ）と、ＣＤ８ａシグナルペプチドと、ＣＤ８ヒンジ領域と、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインと、４－１ＢＢ細胞内共刺激要素と、ＣＤ３ζ細胞内ドメインとをコードする核酸からなる、ことを特徴とする請求項２６に記載のＣＡＲ発現ベクター。
【請求項29】
前記腫瘍特異抗原は、ＨＥＲ２、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＰＣ－３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＰＳＣＡ、ＧＤ２及びＬｅｗｉｓＹから選ばれる１種又はそれ以上である、ことを特徴とする請求項２８に記載のＣＡＲ発現ベクター。
【請求項30】
前記自己切断型ペプチドをコードする前記配列は、Ｐ２Ａ配列である、ことを特徴とする請求項２６に記載のＣＡＲ発現ベクター。
【請求項31】
前記ＣＡＲをコードする核酸配列が配列番号１、前記ＩＦＮ－γをコードする核酸配列が配列番号２、前記自己切断型ペプチドをコードする前記配列が配列番号３によって表される、ことを特徴とする請求項２６に記載のＣＡＲ発現ベクター。
【請求項32】
請求項２６～３１のいずれか一項に記載のＣＡＲ発現ベクターを包含するレンチウイルス。
【請求項33】
前記レンチウイルスは、ｐＷＰＸＬｄである、ことを特徴とする請求項３２に記載のレンチウイルス。
【請求項34】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すベクター：（ａ）請求項２６～３１のいずれか一項に記載のＣＡＲ発現ベクター、又は（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸及びＩＦＮ－γをコードする核酸を含むＣＡＲ発現ベクター、が導入された、ことを特徴とするＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項35】
請求項３４に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞と、薬学的に許容される副原料及び／又は補助剤とを含む、ことを特徴とする抗腫瘍薬。
【請求項36】
前記腫瘍は、固形腫瘍である、ことを特徴とする請求項３５に記載の抗腫瘍薬。
【請求項37】
前記腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである、ことを特徴とする請求項３５に記載の抗腫瘍薬。
【請求項38】
ＣＡＲ及びＩＦＮ－γを発現する、ことを特徴とするＴ細胞。
【請求項39】
ＣＡＲをコードする核酸とＩＦＮ－γをコードする核酸とを含む、ことを特徴とする請求項３８に記載のＴ細胞。
【請求項40】
請求項３８又は３９に記載のＴ細胞と、薬学的に許容される副原料及び／又は補助剤とを含む、ことを特徴とする抗腫瘍薬。
【請求項41】
前記腫瘍は、固形腫瘍である、ことを特徴とする請求項４０に記載の抗腫瘍薬。
【請求項42】
前記腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである、ことを特徴とする請求項４０に記載の抗腫瘍薬。
【請求項43】
ＣＡＲ及びＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の調製方法であって、ＣＡＲをコードする核酸とＩＦＮ－γをコードする核酸とをベクターで前記Ｔ細胞に再導入する、ことを特徴とする調製方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［１］．本出願は、２０２０年３月９日に出願された中国特許出願公開第２０２０１０１５９６３０．９号明細書である、「ＩＦＮ－γの抗腫瘍補助薬の調製への応用」という名称の特許出願の優先権、及び２０２０年６月１日に出願された中国特許出願公開第２０２０１０４８７１１０．０号明細書である、「ＣＡＲ発現ベクター及びその応用」という名称の特許出願の優先権を主張する。これらの優先権発明特許出願の全てが、参照することにより組み込まれる。
【0002】
［２］．本発明は、生物医学の分野に属し、詳しくは、抗腫瘍免疫療法を補助する抗腫瘍薬及びその応用に関するものである。
【背景技術】
【0003】
［３］．腫瘍免疫療法は、有機体自身の免疫機能を発揮させ腫瘍と闘う画期的な抗腫瘍治療法である。ＣＡＲ－Ｔ療法は、免疫療法の分野に属する。ＣＤ１９を標的として、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、血液腫瘍の治療において驚くべき成果を上げている。２０１８年４月現在、腫瘍を標的とした免疫療法は、中国では３８２種類、そして第ＩＩＩ相及び第ＩＶ相臨床試験では２２７種類を含む、合計２，５１３種類あるものである。これまでに市販されてきたものには、小児急性Ｂリンパ性白血病の治療薬としてノバルティス社のＫｙｍｒｉａｈ、及び成人Ｂ細胞リンパ腫の治療薬としてカイト社のＹｅｓｃａｒｔａがある。そのうちＫｙｍｒｉａｈの完全寛解（ＣＲ）率は８２．５％で、再発確率は６カ月で７５％、１２カ月で６４％である。ＦＤＡに承認されたもう一つのＣＤ１９特異ＣＡＲ－Ｔ製品であるＹｅｓｃａｒｔａは、再発性・難治性ＤＬＢＣＬ患者において４３～５２％のＣＲを達成できる。
【0004】
［４］．しかし、固形腫瘍の治療に対しては、ＣＡＲ－Ｔは有効ではなかった。例えば、再発性・難治性ＥＧＦＲ＋非小細胞肺がんの治療において上皮成長因子受容体細胞を標的とするＥＧＦＲ－ＣＡＲ－Ｔの第Ｉ相臨床試験では、１１人のがん患者のうち、奏効患者は２名のみで、安定（ＳＤ）患者は５名でした。ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を再発性・難治性ＨＥＲ２陽性腫瘍患者に投与した場合の実現可能性と安全性が、用量漸増臨床試験の第Ｉ／ＩＩ相研究で評価された。しかし、その臨床的有益性は限定的であり、評価可能な患者のうちＳＤを示したのは４／１７のみであった。つまり、固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞療法の効果は非常に限定的なものであった。固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞療法の効果が低い理由はよくわかっていないが、複数の理由があるのではないかと推測されている。例えば、生体内でのＣＡＲ－Ｔ細胞は生存率が低く、体内に投入後すぐに死滅して殺傷効果に悪影響を与えてしまった。また、固形腫瘍は代謝、免疫回避、組織形成における多能性により、免疫抑制性微小環境を形成し、その結果、ＣＡＲ－Ｔ細胞が固形腫瘍の組織内に浸潤して効果を発揮することが困難になったため、たとえ固形腫瘍に入ったとしても、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、様々な点で免疫系を制限しているので不活性化されて死滅してしまった。そのため、ＣＡＲ－Ｔ細胞の固形腫瘍に対する治療効果をいかに高め、改善させるかは、従来の技術における喫緊の課題となっている。
【0005】
［５］．ＰＤ－１は、共刺激シグナルにおける抑制分子として、Ｔ細胞のアポトーシスを誘導し、それによって免疫系ががん細胞を殺すのを妨げるという主な機能を持つことが最初に発見された。さらに、ＰＤ－１は、そのリガンドであるプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）と結合することにより、Ｔ細胞を介した免疫応答を負に制御することができる。すなわち、腫瘍細胞はＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の結合によりＴ細胞を「騙し」、Ｔ細胞による認識を回避するのである。そのため、このシグナル伝達経路を遮断することが有効ながん免疫療法と考えられている。２０１４年に最初のＰＤ－１阻害剤であるｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂとｎｉｖｏｌｕｍａｂが承認されて以来、がん免疫療法としてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤の臨床開発がかつてないほど盛んに行われてきた。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、進行性黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、ホジキンリンパ腫、肝がん、頭頸部扁平上皮がん、尿路上皮がん、メルケル細胞がんなど、様々ながん種に対して臨床試験で使用されている。現在までに、海外ではＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、及びＣｅｍｉｐｌｉｍａｂの３種類のＰＤ－１阻害剤が、中国ではＴｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ、Ｔｙｖｙｔ、及びＣａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂの４種類が市場に出回っている。ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１療法がより多くの固形腫瘍に使用されるようになった現在、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１療法をいかにしてより優れた抗腫瘍治療効果を発揮させるかは、喫緊の課題となっている。
【0006】
［６］．養子細胞療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ，ＡＣＴ）は、「生きた薬」と呼ばれるほど有効な抗がん戦略であり、がん免疫療法において重要な役割を担っている。ＡＣＴでは、腫瘍患者の体内から免疫担当細胞を分離し、生体外で増殖や機能同定を行った後、患者に戻して腫瘍を直接殺傷するか、体の免疫応答を刺激して腫瘍を死滅させる。現在、ＡＣＴには主にＴＩＬ、ＬＡＫ、ＣＩＫ、ＤＣ、ＮＫ、ＴＣＲ－Ｔ、及びＣＡＲ－Ｔが含まれる。
【0007】
［７］．ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果を高めるために、現在、ＣＡＲ－Ｔ細胞自体をさらに遺伝子組み換えしたり、ナノ修飾したりすることが主に注目されている。例えば、マルチターゲットＣＡＲ遺伝子をＣＡＲ－Ｔ細胞に挿入し、ＣＡＲ構造を最適化することによってＴ細胞の増殖や持続性に効果的に影響を与える。あるいは、ＣＡＲ－Ｔ細胞にケモカインを発現させ、又は接着分子や化学基を直接修飾することによってＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍組織に対する傾向や認識を強化するようにしている。 しかし、いずれの手法も多かれ少なかれ問題点や欠点がある。 例えば、マルチターゲットＣＡＲ－Ｔ細胞の場合、挿入された外来遺伝子が多すぎると、Ｔ細胞本来の活性に影響を与える可能性もある。したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞の修飾は、プラスとマイナスの両方の要因を総合的に考慮しなければならず、また、関連する修飾がもたらすプラスとマイナスの両方の影響を比較しバランスをとることで、最終的にはより的を絞った、より効果の高い修飾方法を選択する必要もある。
【0008】
［８］．これまでの研究から、抑制性シグナル伝達経路であるＰＤ－１がＣＡＲ－Ｔ療法の効果に影響を及ぼす要因であり、ＰＤ－１経路を遮断することでＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を向上させることができることが分かった。したがって、ＰＤ－１を阻害可能な技術的手段は、実現可能なＣＡＲ－Ｔ修飾方法として考えられている。
【0009】
［９］．従来の技術的経路のうち、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対する抗体を分泌するようにＣＡＲ－Ｔ細胞を遺伝子組み換えする試みは、固形腫瘍に対する治療効果を大幅に改善させることができ、或いは、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＰＤ－１をコードする遺伝子を遺伝子編集によってノックアウトすることで、ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍活性を向上させることもできるようになった。
【0010】
［１０］．しかし、上記のこれらの技術的解決策や技術的経路の考え方は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能そのものを向上させることに主眼が置かれており、腫瘍細胞や固形腫瘍内の免疫抑制性微小環境にはほとんど影響を与えていない。つまり、現在の技術的解決策や技術的経路は、ＣＡＲ－Ｔ細胞自体の改良にのみ焦点が当てられており、腫瘍細胞への作用という観点からＣＡＲ－Ｔ細胞療法の抗腫瘍効果をさらに高めることはできていないのである。
【0011】
［１１］．以上のことから、免疫細胞療法及び／又は免疫チェックポイント阻害剤療法及び／又は養子細胞療法等の従来の技術の抗腫瘍効果をいかに向上させ、より最適で効果的な抗腫瘍治療法を提案するかは、現在の腫瘍免疫療法分野において非常に重要な課題であり、本発明が緩解しようとする技術的課題である。さらに、本発明は、腫瘍細胞だけでなく、固形腫瘍内の免疫抑制性微小環境にも影響を与え、最適なＣＡＲ－Ｔ細胞治療戦略を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【0012】
［１２］．本発明は、上記の技術的課題に対応し、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－γ）を中心として調製された抗腫瘍補助薬及びその応用を提供するものであり、２つの下位発明（すなわち、発明Ａ及び発明Ｂ）及びこれら２つの発明に基づく各展開から構成されるものである。
【0013】
［１３］．本発明の一態様は、ＩＦＮ－γの抗腫瘍補助薬の調製への応用、免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果検出用キット、抗腫瘍免疫療法を補助する抗腫瘍薬、ＩＦＮ－γとＴ細胞製剤との併用の腫瘍免疫治療薬の調製への応用、ＩＦＮ－γと免疫チェックポイント阻害剤との併用の腫瘍免疫治療薬の調製への応用、ＩＦＮ－γとＴ細胞製剤と免疫チェックポイント阻害剤との併用の腫瘍免疫治療薬の調製への応用、及び複合薬の組合せを提供するものである。
【0014】
［１４］．本発明の別の態様は、ＩＦＮ－γで修飾された新規ＣＡＲ発現ベクター及びその構築戦略も提供するものである。
【発明の効果】
【0015】
［１５］．有益な効果
［１６］．本発明は、従来の技術における、ＩＦＮ－γに対する認知を打破し、ＩＦＮ－γが腫瘍細胞のＩＦＮ－γシグナル伝達経路を活性化することにより、例えば、腫瘍細胞におけるＩＣＡＭ－１の発現をアップレギュレートし、腫瘍細胞を免疫療法（Ｔ細胞製剤及び／又はＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１阻害剤）に対して感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）することにより、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１を介した獲得免疫耐性を抑制し、免疫療法の抗腫瘍効果を高めることを見出し、これにより、ＩＦＮ－γを免疫療法補助薬として腫瘍と闘うための技術的提案がなされた。
［１６］．本発明は、従来の技術における、ＩＦＮ－γに対する認知を打破し、ＩＦＮ－γが腫瘍細胞のＩＦＮ－γシグナル伝達経路を活性化することにより、例えば、腫瘍細胞におけるＩＣＡＭ－１の発現をアップレギュレートし、腫瘍細胞を免疫療法（Ｔ細胞製剤及び／又はＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１阻害剤）に対して感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）することにより、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１を介した獲得免疫耐性を抑制し、免疫療法の抗腫瘍効果を高めることを見出し、これにより、ＩＦＮ－γを免疫療法補助薬として腫瘍と闘うための技術的提案がなされた。
【0016】
［１７］．インターフェロン（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，ＩＦＮ）は分泌タンパク質群からなる。ＩＦＮタンパク質ファミリーは、それらの遺伝子配列と、染色体の配置と、受容体特異性とによって、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型インターフェロンの３つに分類される。そのうち、ＩＩ型インターフェロンは、単一遺伝子ファミリーであるＩＦＮ－γからなり、免疫インターフェロンとも呼ばれる。通常の状態ではＩＦＮ－γは細胞内に低レベルで存在するが、ウイルスや他のインターフェロン誘導物質によって誘導されるとその発現が著しく増加する。ＩＦＮ－γは抗腫瘍免疫に関与する最も主要なサイトカインであり、ＣＡＲ－Ｔが抗原と接触した際に放出する免疫活性化サイトカインである。正常な組織は、活性化した免疫反応による損傷を避けるために、複数の制御経路を誘導することで、炎症が存在する生体内の細胞のホメオスタシスの再構築を促進する。従来の研究では、腫瘍細胞は免疫回避のためにこれらの保護制御経路を利用することが示唆されている。例えば、腫瘍細胞はＩＦＮ－γの放出によりＰＤ－Ｌ１の発現をアップレギュレーションし、それによってＴ細胞による殺傷を抑制しており、この獲得免疫耐性がＣＡＲ－Ｔによる固形腫瘍の有効な殺傷を制限する理由の一つと考えられている。ＩＦＮ－γによるＰＤ－Ｌ１発現のアップレギュレーションが腫瘍細胞の獲得免疫耐性を誘導すると考えられているため、従来の免疫療法の技術的解決策ではＩＦＮ－γを十分に活用できていない。初期に臨床試験に入ったＩＦＮ－γ抗腫瘍治療法も、効果のなさから抗腫瘍薬として市販されるには至らなかった。現在では、ＩＦＮ－γがＰＤ－１の発現をアップレギュレートすることで抗腫瘍効果が低くなると考えられており、ＩＦＮ－γに抗腫瘍効果を発揮させるためには、ＰＤ－Ｌ１阻害剤を併用してＩＦＮ－γによるＰＤ－Ｌ１アップレギュレーションの弊害を中和する必要があると考えられている。しかし、これはあくまで理論的な推測であり、確かな研究成果によって確認されたわけではない。
【0017】
［１８］．本発明の実験結果により、ＩＦＮ－γ（腫瘍細胞を前処理することでＩＦＮ－γシグナル伝達経路を活性化する）が腫瘍細胞のＰＤ－Ｌ１発現をアップレギュレートする一方で、ＩＦＮ－γは他の因子の発現にも影響を与え（例えば、ＩＣＡＭ－１の発現をアップレギュレートする）、結果としてＩＦＮ－γは、ＣＡＲ－Ｔ細胞（又は他の種類の遺伝子組み換えＴ細胞）或いは非遺伝子組み換えＴ細胞の腫瘍細胞に対する細胞毒性を有意に増強し、また、ＩＦＮ－γは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷能力の持続性を向上させた。つまり、ＩＦＮ－γは腫瘍細胞をＴ細胞に対して感作させ、つまり腫瘍細胞のＴ細胞に対する感受性を高めるということであった。それだけでなく、本発明の実験結果から、ＩＦＮ－γシグナル伝達経路の障害は、ＣＡＲ－Ｔの腫瘍細胞に対する殺傷効果に大きな影響を与えることも明らかになった。
【0018】
［１９］．以上の実験結果及び合理的な推論に基づき、本発明は、ＩＦＮ－γを補助薬としてＴ細胞製剤と併用して固形腫瘍の治療に用いる技術的解決策、及びＩＦＮ－γを補助薬としての抗腫瘍治療への応用を提案するものである。ＩＮＦ－γを用いた腫瘍細胞シグナル伝達経路の活性化は、Ｔ細胞製剤（非遺伝子組み換えＴ細胞又は遺伝子組み換えＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲ－Ｔなど）を含む）の抗腫瘍効果を高めることができる。本発明の核心は、腫瘍細胞におけるＩＦＮ－γシグナル伝達経路の活性化であるから、野生型ＩＦＮ－γでも突然変異型ＩＦＮ－γでも、ＩＦＮ－γ全長でも断片でも、腫瘍細胞におけるＩＦＮ－γシグナル伝達経路の活性化を達成する効果があれば、本発明に適用でき、本発明の技術的解決策の範囲内にあるといえる。
【0019】
［２０］．さらに、ＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤の作用原理は、枯渇したＴ細胞を活性化して抗腫瘍効果を回復させることであるため、ＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤の抗腫瘍効果も基本的にはＴ細胞が介することになる。そこで、本発明は、ＩＦＮ－γによりＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤を増強して腫瘍を抑制するための技術的解決策、及び、ＩＦＮ－γによりＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤とＴ細胞製剤との併用効果を増強して腫瘍を阻害するための技術的解決策をも提案するものである。ここで強調したいことは、本発明で提案する技術的解決策は、ＩＦＮ－γを利用して腫瘍細胞を感作し、それによって免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤）の抗腫瘍効果の増強を補助するものであり、これは、ＩＦＮ－γシグナル伝達経路の活性化によって生じる腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１ダウンレギュレーションを阻害するＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤を用いることとは異なる技術的解決策である、ということである。また、前者の治療戦略は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤を主薬として用いるが、後者の治療戦略は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤を補助薬として用いるようになっている。
【0020】
［２１］．また、本発明の実験により、ＩＦＮ－γシグナル伝達経路の欠損がＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果に影響を与えることが示される。ＩＦＮ－γシグナル伝達経路の欠損がＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤の抗腫瘍効果に影響を与えるという研究結果と併せて、本発明はさらに、ＩＦＮ－γシグナル伝達経路の活性化／欠損を検出する（例えば、腫瘍細胞上のＩＣＡＭ－１又はＩＦＮ－γＲ２の発現を検出する）ことにより、Ｔ細胞療法及び／又はＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤が抗腫瘍治療の選択肢として適しているかどうかを事前に決定する方法を提供するものである。
【0021】
［２２］．以上、本発明の技術的解決策の貢献の１つは、従来の技術における、ＩＦＮ－γに対する認知を打破し、細胞療法の抗腫瘍効果、及び細胞療法と組み合わせた免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果を増強し、従来の免疫治療法の抗腫瘍効果をさらに高める、ＩＦＮ－γを中心とする免疫療法補助薬を提案するものである。
【0022】
［２３］．一方、本発明の実験結果から、ＩＦＮ－γは腫瘍細胞のＴ細胞に対する感受性を高めることができることがわかった。例えば、ＩＦＮ－γは腫瘍細胞の前処理により腫瘍細胞のＰＤ－Ｌ１発現をアップレギュレーションする一方、最終的にはＣＡＲ－Ｔ細胞（又はＴＣＲ－Ｔ細胞など他の種類の遺伝子組み換えＴ細胞）或いは非遺伝子組み換えＴ細胞の腫瘍細胞に対する細胞毒性を有意に増強することが示された。つまり、ＩＦＮ－γは腫瘍細胞をＴ細胞に対して感作させ、腫瘍細胞のＴ細胞に対する感受性ＣＲを高めるのである。
【0023】
［２４］．これに基づき、本発明は、ＩＦＮ－γの発現量が高いＴ細胞（天然のＴ細胞又はＩＦＮ－γを高発現するように遺伝子組み換えされたＴ細胞、並びにＩＦＮ－γを高発現する遺伝子組み換えＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ－Ｔ細胞）を含む）を用いて腫瘍細胞を抑制するという技術的解決策を提案するものである。
【0024】
［２５］．具体的には、本発明は、新規ＣＡＲ－Ｔ細胞の組み換え解決策を提案するものである。この解決策は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化する機能を持つだけでなく、より重要なこととして、固形腫瘍内の免疫抑制性微小環境を変化させ、それによって腫瘍細胞を感作し、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法により強い抗腫瘍効果を発揮させることを可能にした。
【0025】
［２６］．本発明の技術的解決策は、ＣＡＲ発現ベクターにＩＦＮ－γ遺伝子のセグメントを挿入することにより、インターフェロンサイトカインＩＦＮ－γを分泌できるＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するものである。ＩＦＮ－γ自体は、抗腫瘍免疫に関わる重要なサイトカインで、ＣＡＲ－Ｔ細胞自体を活性化する（腫瘍細胞との接触によりＣＡＲ－Ｔをさらに活性化して、ＩＬ－２やＩＦＮ－γなど、より多くのサイトカインを放出する）だけではなく、ＩＦＮ－γが腫瘍の微小環境に分泌されると、腫瘍細胞を感作し、ＣＡＲ－Ｔによる殺傷に対する腫瘍細胞の感受性を高めることができるようになった。さらに重要なことは、ＩＦＮ－γで感作された腫瘍細胞上に新たに高発現したＩＣＡＭ－１などの分子が、腫瘍細胞を免疫療法（Ｔ細胞製剤及び／又はＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１阻害剤）に感作し、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１によるＣＡＲ細胞活性阻害が抑制されることである。したがって、本発明が提供するこの最適化技術により、ＣＡＲ－Ｔの固形腫瘍に対する治療効果をさらに向上させることができる。
【0026】
［２７］．本発明の実施形態又は従来の技術における技術的解決策をより明確に説明するために、以下、実施形態又は従来の技術の説明で使用される添付の図面を簡単に紹介する。明らかに、以下の説明における図面は、本発明のいくつかの実施形態であり、当業者にとって、創造的な努力なしにこれらの図面から他の図面を取得することもできる。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】［２８］．図１は、固形腫瘍細胞をＣＡＲ－Ｔで殺傷する際のＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化とＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１の発現を示す図である（ａは上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）－ＣＡＲ細胞及びＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（ＭＳＬＮ）－ＣＡＲ細胞で、抗原刺激の存在下でＣＡＲ－Ｔ細胞上のＰＤ－１の発現がアップレギュレートされたもので、ｂはＰＤ－Ｌ１を高発現する腫瘍細胞を示すもので、ｃはＧｒａｎｚｙｍｅ ＢとＣＤ１０７ａを高発現するＣＡＲ－Ｔ細胞による効果的な腫瘍細胞殺傷を示すものであり、ｄはＭＯＣＫ、ＨＥＲ２－ＣＡＲ ｍｉｎｕｓ、及びＨＥＲ２－ＣＡＲ ｐｌｕｓという３つの場合を示すものである）。
【図5】［３２］．図５は、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＩＦＮ－γで前処理されＰＤ－Ｌ１を高発現した腫瘍細胞に遭遇した場合、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、より高い潜在的細胞溶解活性とＩＦＮ－γ分泌能を持つことを示す図である。
【図9】［３６］．図９は、ＩＦＮ－γＲ２がノックアウトされた腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効果は著しく低下し、ＩＦＮ－γ処理によりＩＦＮ－γＲ２がノックアウトされた腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効果は向上しないことが示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0028】
［５２］．本発明の実施形態の目的、技術的解決策及び利点をより明確にするために、以下、本発明の実施形態における技術的解決策を添付図面と共に明確かつ完全に説明する。なお、記載した実施形態は、本発明の実施形態の一部であり、その全てではないことは明らかである。本発明における実施形態に基づき、当業者が創意工夫をすることなく得られる他のすべての実施形態は、本発明の保護範囲に含まれる。
【0029】
［５３］．言及された実施例は、本発明をよりよく説明するためのものであるが、本発明の内容はこれらの実施例に限定されない。したがって、当業者は、本発明の上述の内容に従って、実施形態に対して本質的でない改良や調整を行い、これらの改良や調整も本発明の保護範囲に属する。
【0030】
［５４］．注意すべきことは、ここにおいて、「含む」、「包含する」、又はそれらの任意の他の変形語という用語は、非排他的な包含をカバーすることを意図しているということである。したがって、一連の要素を含むプロセス、方法、物品、又は装置は、それらの要素だけでなく、明示的に列挙されていない他の要素、又はそのようなプロセス、方法、物品、又は装置に固有の要素も含む。さらなる限定がない場合は、「一つの……を含む」という語句によって限定される要素は、その要素を含むプロセス、方法、物品、又は装置における追加の同一要素の存在を排除しない。
【0031】
［５５］．例えば、本明細書で使用される「約」という用語は、典型的には記載された値の＋／－５％、より典型的には該当値の＋／－４％、より典型的には該当値の＋／－３％、より典型的には該当値の＋／－２％、さらに典型的には該当値の＋／－１％、さらに典型的には該当値の＋／－０．５％として表示される。
【0032】
［５６］．本明細書では、特定の実施形態をある範囲内の形式で開示することができる。この「ある範囲内」の説明は、ただ便宜や簡潔さを図るためのものであり、開示された範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能な部分範囲を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１から６の範囲の説明は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６、など、及びこの範囲内の１、２、３、４、５、及び６などの個々の番号を具体的に開示したと見なされるべきである。上記のルールは、範囲の幅に関係なく適用される。
【0033】
［５７］．用語解説：
［５８］．本発明で言う「補助薬」とは、主たる治療薬（すなわち主薬）の効果を高めるために補助的に使用される薬剤を指す。例えば、本発明で言うＩＦＮ－γは、主薬による治療前に前処理薬の形態で患者に投与され、後続の主薬に対する腫瘍細胞の感受性を高め、それによって後続の主薬の抗腫瘍効果を増強することが可能である。さらなる例によって、本発明で言うＩＦＮ－γは、前処理薬として、腫瘍細胞におけるＩＣＡＭ－１の発現をアップレギュレートし、ＣＡＲ－Ｔ細胞又は非遺伝子組み換えＴ細胞による腫瘍細胞の殺傷及びサイトカイン放出を促進するためにも使用することができる。もちろん、補助薬は、必ずしも主薬治療の前に使用されるものではなく、状況に応じて主薬と並行して使用することも可能である。
［５８］．本発明で言う「補助薬」とは、主たる治療薬（すなわち主薬）の効果を高めるために補助的に使用される薬剤を指す。例えば、本発明で言うＩＦＮ－γは、主薬による治療前に前処理薬の形態で患者に投与され、後続の主薬に対する腫瘍細胞の感受性を高め、それによって後続の主薬の抗腫瘍効果を増強することが可能である。さらなる例によって、本発明で言うＩＦＮ－γは、前処理薬として、腫瘍細胞におけるＩＣＡＭ－１の発現をアップレギュレートし、ＣＡＲ－Ｔ細胞又は非遺伝子組み換えＴ細胞による腫瘍細胞の殺傷及びサイトカイン放出を促進するためにも使用することができる。もちろん、補助薬は、必ずしも主薬治療の前に使用されるものではなく、状況に応じて主薬と並行して使用することも可能である。
【0034】
［５９］．本発明で言う「感作」とは、補助薬が腫瘍細胞の主薬（免疫療法）に対する感受性を高め、主薬の作用をより助長させ、腫瘍細胞をより効果的に殺傷することを意味する。例えば、本発明は、ＩＦＮ－γを用いて腫瘍細胞のＩＦＮ－γシグナル伝達経路を活性化し、Ｔ細胞（生体内Ｔ細胞、養子注入によるＴ細胞製剤を含む）及び免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤）に対する腫瘍細胞の感受性を高めることによって、Ｔ細胞及び／又は免疫チェックポイント阻害剤を用いた免疫療法のよりよい結果を得られるものである。
【0035】
［６０］．また、本発明で言う「感作」とは、腫瘍細胞感作因子（例えば、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γ）により腫瘍内の免疫抑制性微小環境を改変し、腫瘍細胞の免疫療法に対する感受性を高めることによって、腫瘍細胞をより効果的に殺傷することも意味する。
【0036】
［６１］．Ａ 発明：ＩＦＮ－γの抗腫瘍補助薬の調製への応用
［６２］．Ａ本発明は、生物医学の分野に属し、詳しくは、抗腫瘍免疫療法を補助する抗腫瘍薬及びその応用に関するものである。
［６２］．Ａ本発明は、生物医学の分野に属し、詳しくは、抗腫瘍免疫療法を補助する抗腫瘍薬及びその応用に関するものである。
【0037】
［６３］．腫瘍免疫療法は、有機体自身の免疫機能を発揮させ腫瘍と闘う画期的な抗腫瘍治療法である。ＣＡＲ－Ｔ療法は、免疫療法の分野に属する。ＣＤ１９を標的として、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、血液腫瘍の治療において驚くべき成果を上げている。２０１８年４月現在、腫瘍を標的とした免疫療法は、中国では３８２種類、そして第ＩＩＩ相及び第ＩＶ相臨床試験では２２７種類を含む、合計２，５１３種類あるものである。これまでに市販されてきたものには、小児急性Ｂリンパ性白血病の治療薬としてノバルティス社のＫｙｍｒｉａｈ、及び成人Ｂ細胞リンパ腫の治療薬としてカイト社のＹｅｓｃａｒｔａがある。そのうちＫｙｍｒｉａｈの完全寛解（ＣＲ）率は８２．５％で、再発確率は６カ月で７５％、１２カ月で６４％である。ＦＤＡに承認されたもう一つのＣＤ１９特異ＣＡＲ－Ｔ製品であるＹｅｓｃａｒｔａは、再発性・難治性ＤＬＢＣＬ患者において４３～５２％のＣＲを達成できる。
【0038】
［６４］．しかし、固形腫瘍の治療に対しては、ＣＡＲ－Ｔは有効ではなかった。例えば、再発性・難治性ＥＧＦＲ＋非小細胞肺がんの治療において上皮成長因子受容体細胞を標的とするＥＧＦＲ－ＣＡＲ－Ｔの第Ｉ相臨床試験では、１１人のがん患者のうち、奏効患者は２名のみで、安定（ＳＤ）患者は５名でした。ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を再発性・難治性ＨＥＲ２陽性腫瘍患者に投与した場合の実現可能性と安全性が、用量漸増臨床試験の第Ｉ／ＩＩ相研究で評価された。しかし、その臨床的有益性は限定的であり、評価可能な患者のうちＳＤを示したのは４／１７のみであった。つまり、固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞療法の効果は非常に限定的なものであった。ＣＡＲ－Ｔ細胞の固形腫瘍に対する治療効果をいかに高め、改善させるかは、先行技術における喫緊の課題となっている。
【0039】
［６５］．ＰＤ－１は、共刺激シグナルにおける抑制分子として、Ｔ細胞のアポトーシスを誘導するという主な機能を持つことが最初に発見された。さらに、ＰＤ－１は、そのリガンドであるプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）と結合することにより、Ｔ細胞を介した免疫応答を負に制御し、腫瘍細胞の「逃避」を助ける。そのため、このシグナル伝達経路を遮断することが有効ながん免疫療法と考えられている。２０１４年に最初のＰＤ－１阻害剤であるｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂとｎｉｖｏｌｕｍａｂが承認されて以来、がん免疫療法としてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤の臨床開発がかつてないほど盛んに行われてきた。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、進行性黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、ホジキンリンパ腫、肝がん、頭頸部扁平上皮がん、尿路上皮がん、メルケル細胞がんなど、様々ながん種に対して臨床試験で使用されている。現在までに、海外ではＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、及びＣｅｍｉｐｌｉｍａｂという３種類のＰＤ－１阻害剤が、中国ではＴｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ、Ｔｙｖｙｔ、及びＣａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂという４種類のＰＤ－１阻害剤が市場に出回っている。ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１療法がより多くの固形腫瘍に使用されるようになった現在、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１療法をいかにしてより優れた抗腫瘍治療効果を発揮させるかは、喫緊の課題となっている。
【0040】
［６６］．以上のことから、免疫細胞療法及び／又は免疫チェックポイント阻害剤療法などの従来の免疫療法の抗腫瘍効果をいかに向上させ、より最適で効果的な抗腫瘍治療法を提案するかは現在、腫瘍免疫療法分野において非常に重要な課題であり、Ａ発明が緩解しようとする技術的課題である。
【0041】
［６７］．Ａ発明の目的は、ＩＦＮ－γの抗腫瘍補助薬の調製への応用、免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果検出用キット、抗腫瘍免疫療法を補助する抗腫瘍薬、ＩＦＮ－γとＴ細胞製剤との併用の腫瘍免疫治療薬の調製への応用、ＩＦＮ－γと免疫チェックポイント阻害剤との併用の腫瘍免疫治療薬の調製への応用、ＩＦＮ－γとＴ細胞製剤と免疫チェックポイント阻害剤との併用の腫瘍免疫治療薬の調製への応用、及び複合薬の組合せを提供するものである。
【0042】
［６８］．上記を達成するために、Ａ発明の技術的解決策は、以下のとおりである。
［６９］．ＩＦＮ－γの、Ｔ細胞製剤を補助する抗腫瘍補助薬の調製への応用であって、前記ＩＦＮ－γは、腫瘍細胞を感作することによって前記Ｔ細胞製剤の前記腫瘍細胞に対する殺傷効果を高め、前記Ｔ細胞製剤には、非遺伝子組み換えＴ細胞及び／又は遺伝子組み換えＴ細胞が含まれ、前記ＩＦＮ－γには、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片が含まれる、応用。
［７０］．さらに、前記遺伝子組み換えＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＴＣＲ－Ｔ細胞からなる。
［７１］．さらに、前記ＩＦＮ－γは、前記腫瘍細胞のＩＦＮ－γシグナル伝達経路を活性化することにより、前記腫瘍細胞を感作する。
［７２］．さらに、前記腫瘍細胞のＩＦＮ－γシグナル活性化は、ＩＣＡＭ－１をアップレギュレートして、前記Ｔ細胞製剤の前記腫瘍細胞に対する殺傷効果を高める。
［７３］．さらに、前記抗腫瘍補助薬が用いられる腫瘍は、固形腫瘍である。
［７４］．さらに、前記抗腫瘍補助薬が用いられる腫瘍は卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである。
［６９］．ＩＦＮ－γの、Ｔ細胞製剤を補助する抗腫瘍補助薬の調製への応用であって、前記ＩＦＮ－γは、腫瘍細胞を感作することによって前記Ｔ細胞製剤の前記腫瘍細胞に対する殺傷効果を高め、前記Ｔ細胞製剤には、非遺伝子組み換えＴ細胞及び／又は遺伝子組み換えＴ細胞が含まれ、前記ＩＦＮ－γには、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片が含まれる、応用。
［７０］．さらに、前記遺伝子組み換えＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＴＣＲ－Ｔ細胞からなる。
［７１］．さらに、前記ＩＦＮ－γは、前記腫瘍細胞のＩＦＮ－γシグナル伝達経路を活性化することにより、前記腫瘍細胞を感作する。
［７２］．さらに、前記腫瘍細胞のＩＦＮ－γシグナル活性化は、ＩＣＡＭ－１をアップレギュレートして、前記Ｔ細胞製剤の前記腫瘍細胞に対する殺傷効果を高める。
［７３］．さらに、前記抗腫瘍補助薬が用いられる腫瘍は、固形腫瘍である。
［７４］．さらに、前記抗腫瘍補助薬が用いられる腫瘍は卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである。
【0043】
［７５］．Ａ本発明はさらに、ＩＦＮ－γの、免疫チェックポイント阻害剤を補助する抗腫瘍補助薬の調製への応用であって、前記ＩＦＮ－γは、腫瘍細胞を感作することによって免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果を補助し、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤からなり、前記ＩＦＮ－γには、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片が含まれる、応用を提供するものである。
［７６］．さらに、前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ及びＤｕｒｖａｌｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上であり、前記ＰＤ－１阻害剤は、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ、Ｔｙｖｙｔ及びＣａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上である。
［７７］．さらに、前記抗腫瘍補助薬が用いられる腫瘍は、固形腫瘍である。
［７８］．さらに、前記抗腫瘍補助薬が用いられる腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである、ことを特徴とする。
［７６］．さらに、前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ及びＤｕｒｖａｌｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上であり、前記ＰＤ－１阻害剤は、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ、Ｔｙｖｙｔ及びＣａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上である。
［７７］．さらに、前記抗腫瘍補助薬が用いられる腫瘍は、固形腫瘍である。
［７８］．さらに、前記抗腫瘍補助薬が用いられる腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである、ことを特徴とする。
【0044】
［７９］．Ａ 本発明はさらに、ＩＦＮ－γの、Ｔ細胞製剤と免疫チェックポイント阻害剤とを補助する抗腫瘍補助薬の調製への応用であって、前記ＩＦＮ－γは、腫瘍細胞を感作することによって前記Ｔ細胞製剤及び前記免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果を補助し、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤からなり、前記Ｔ細胞製剤には、非遺伝子組み換えＴ細胞及び／又は遺伝子組み換えＴ細胞が含まれ、前記ＩＦＮ－γには、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片が含まれる、応用を提供するものである。
［８０］．さらに、前記遺伝子組み換えＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＴＣＲ－Ｔ細胞からなる。
［８１］．さらに、前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ及びＤｕｒｖａｌｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上であり、前記ＰＤ－１阻害剤は、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ、Ｔｙｖｙｔ及びＣａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上である。
［８２］．さらに、前記補助薬は、腫瘍細胞によるＩＣＡＭ－１の産生を刺激して、前記Ｔ細胞製剤の前記腫瘍細胞に対する殺傷効果を高める。
［８３］．さらに、前記腫瘍は、固形腫瘍である。
［８４］．さらに、前記腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである。
［８０］．さらに、前記遺伝子組み換えＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＴＣＲ－Ｔ細胞からなる。
［８１］．さらに、前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ及びＤｕｒｖａｌｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上であり、前記ＰＤ－１阻害剤は、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ、Ｔｙｖｙｔ及びＣａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上である。
［８２］．さらに、前記補助薬は、腫瘍細胞によるＩＣＡＭ－１の産生を刺激して、前記Ｔ細胞製剤の前記腫瘍細胞に対する殺傷効果を高める。
［８３］．さらに、前記腫瘍は、固形腫瘍である。
［８４］．さらに、前記腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである。
【0045】
［８５］．Ａ 本発明はさらに、ＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤からなる免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果検出用キットであって、前記キットは、腫瘍細胞におけるＩＦＮ－γシグナル伝達経路の開存性を検出するキットを提供するものである。
［８６］．さらに、前記キットは、前記腫瘍細胞におけるＩＣＡＭ－１又はＩＦＮ－γＲ２の発現レベルを検出する。ＩＣＡＭ－１又はＩＦＮ－γＲ２の発現レベルを検出する目的は、ＩＦＮ－γシグナル伝達経路の開存性を検出することにあるので、ＩＣＡＭ－１及びＩＦＮ－γＲ２の全長又は断片は、野生型か突然変異型かを問わず、ＩＦＮ－γシグナル伝達経路開存性の検出に有効であれば、本発明の保護範囲に入ることが強調されよう。
［８７］．さらに、前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ及びＤｕｒｖａｌｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上であり、前記ＰＤ－１阻害剤は、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ、Ｔｙｖｙｔ及びＣａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上である。
［８８］．さらに、前記腫瘍は、固形腫瘍である、ことを特徴とする。
［８９］．さらに、前記腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである、ことを特徴とする。
［９０］．Ａ 本発明さらに、抗腫瘍免疫療法を補助する抗腫瘍薬であって、前記抗腫瘍薬は、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片を含み、腫瘍細胞を感作することによってＴ細胞製剤及び／又は免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果を補助する抗腫瘍薬を提供するものである。
［９１］．さらに、前記抗腫瘍薬は、ターゲティングベクターを含み、前記ターゲティングベクターは、前記野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片を前記腫瘍細胞に送達する。
［９２］．さらに、前記抗腫瘍薬は、前記Ｔ細胞製剤及び／又は前記免疫チェックポイント阻害剤と併用される。
［９３］．さらに、前記抗腫瘍薬は、さらに任意の薬学的に許容されるベクター及び／又は補助剤を含む、ことを特徴とする。
［８６］．さらに、前記キットは、前記腫瘍細胞におけるＩＣＡＭ－１又はＩＦＮ－γＲ２の発現レベルを検出する。ＩＣＡＭ－１又はＩＦＮ－γＲ２の発現レベルを検出する目的は、ＩＦＮ－γシグナル伝達経路の開存性を検出することにあるので、ＩＣＡＭ－１及びＩＦＮ－γＲ２の全長又は断片は、野生型か突然変異型かを問わず、ＩＦＮ－γシグナル伝達経路開存性の検出に有効であれば、本発明の保護範囲に入ることが強調されよう。
［８７］．さらに、前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ及びＤｕｒｖａｌｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上であり、前記ＰＤ－１阻害剤は、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ、Ｔｙｖｙｔ及びＣａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂから選ばれる１種又はそれ以上である。
［８８］．さらに、前記腫瘍は、固形腫瘍である、ことを特徴とする。
［８９］．さらに、前記腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである、ことを特徴とする。
［９０］．Ａ 本発明さらに、抗腫瘍免疫療法を補助する抗腫瘍薬であって、前記抗腫瘍薬は、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片を含み、腫瘍細胞を感作することによってＴ細胞製剤及び／又は免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果を補助する抗腫瘍薬を提供するものである。
［９１］．さらに、前記抗腫瘍薬は、ターゲティングベクターを含み、前記ターゲティングベクターは、前記野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片を前記腫瘍細胞に送達する。
［９２］．さらに、前記抗腫瘍薬は、前記Ｔ細胞製剤及び／又は前記免疫チェックポイント阻害剤と併用される。
［９３］．さらに、前記抗腫瘍薬は、さらに任意の薬学的に許容されるベクター及び／又は補助剤を含む、ことを特徴とする。
【0046】
［９４］．Ａ本発明はさらに、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γとＴ細胞製剤とからなる抗腫瘍組成物を含む、抗腫瘍薬を提供するものである。
［９５］．Ａ 本発明はさらに、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γと、ＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤と、Ｔ細胞製剤とを含む抗腫瘍組成物を提供するものである。
［９５］．Ａ 本発明はさらに、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γと、ＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤と、Ｔ細胞製剤とを含む抗腫瘍組成物を提供するものである。
【0047】
［９６］．Ａ発明の具体的な実施形態：
［９７］．本発明の実験により、ＣＡＲ－Ｔ細胞による腫瘍細胞殺傷において、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１の発現量のアップレギュレーションがＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化、腫瘍細胞の殺傷、サイトカインの分泌と共存していることが判明した（図１）。図１ａでは、上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）－ＣＡＲ細胞とＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（ＭＳＬＮ）－ＣＡＲ細胞の２種類のＣＡＲ－Ｔ細胞を使用し、抗原刺激の存在下で両方のＣＡＲ－Ｔ細胞でＰＤ－１の発現量がアップレギュレーションされた。この場合、抗原はＨＥＲ２やＭＳＬＮを発現している腫瘍細胞であった。図１ｂでは、ＣＡＲ－Ｔと腫瘍細胞を共培養し、ＣＡＲ－Ｔを活性化して腫瘍細胞を死滅させ、細胞破片を遠心分離により除去された「上澄み」を得た。この上澄みは、ＣＡＲ－Ｔが活性化されて他の腫瘍細胞に作用する「微小環境」となっていた。
図１ｃでは、ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加すると、腫瘍細胞溶解率が高くなり、また、ＣＡＲ－Ｔ細胞でのＧｒａｎｚｙｍｅ ＢとＯＤ１０７ａ＋がともにアップレギュレートされ、ＣＡＲ－Ｔ細胞が活性化されて腫瘍細胞を死滅させる役割を担っていることがわかった。図１ｄの実験では、ＭＯＣＫ、ＨＥＲ２－ＣＡＲ ｍｉｎｕｓ、ＨＥＲ２－ＣＡＲ ｐｌｕｓの３群があり、そのうちＭＯＣＫはＣＡＲ構造を発現しなかった対照Ｔ細胞であった。図１では、ＣＡＲ－Ｔと腫瘍細胞を共培養し、２４時間後にＣＡＲ－Ｔがすべての腫瘍細胞を死滅させ、その上澄み（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を遠心分離により取得した後、その上清で新しい腫瘍細胞を培養し、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１発現を検出した。
［９７］．本発明の実験により、ＣＡＲ－Ｔ細胞による腫瘍細胞殺傷において、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１の発現量のアップレギュレーションがＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化、腫瘍細胞の殺傷、サイトカインの分泌と共存していることが判明した（図１）。図１ａでは、上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）－ＣＡＲ細胞とＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（ＭＳＬＮ）－ＣＡＲ細胞の２種類のＣＡＲ－Ｔ細胞を使用し、抗原刺激の存在下で両方のＣＡＲ－Ｔ細胞でＰＤ－１の発現量がアップレギュレーションされた。この場合、抗原はＨＥＲ２やＭＳＬＮを発現している腫瘍細胞であった。図１ｂでは、ＣＡＲ－Ｔと腫瘍細胞を共培養し、ＣＡＲ－Ｔを活性化して腫瘍細胞を死滅させ、細胞破片を遠心分離により除去された「上澄み」を得た。この上澄みは、ＣＡＲ－Ｔが活性化されて他の腫瘍細胞に作用する「微小環境」となっていた。
図１ｃでは、ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加すると、腫瘍細胞溶解率が高くなり、また、ＣＡＲ－Ｔ細胞でのＧｒａｎｚｙｍｅ ＢとＯＤ１０７ａ＋がともにアップレギュレートされ、ＣＡＲ－Ｔ細胞が活性化されて腫瘍細胞を死滅させる役割を担っていることがわかった。図１ｄの実験では、ＭＯＣＫ、ＨＥＲ２－ＣＡＲ ｍｉｎｕｓ、ＨＥＲ２－ＣＡＲ ｐｌｕｓの３群があり、そのうちＭＯＣＫはＣＡＲ構造を発現しなかった対照Ｔ細胞であった。図１では、ＣＡＲ－Ｔと腫瘍細胞を共培養し、２４時間後にＣＡＲ－Ｔがすべての腫瘍細胞を死滅させ、その上澄み（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を遠心分離により取得した後、その上清で新しい腫瘍細胞を培養し、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１発現を検出した。
【0048】
［９８］．Ｔ細胞枯渇マーカーであるＴＩＭ－３とＬＡＧ－３は、ＣＡＲ－Ｔ細胞で有意に増加した。 ＣＡＲ－Ｔ細胞が生体内の抗腫瘍環境で腫瘍細胞と連続的に遭遇しそれを死滅させるストレス実験（図２）をシミュレートすると、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１発現量が高いにもかかわらず、ＣＡＲ－Ｔ細胞は細胞毒性とサイトカイン放出能が向上することが示された（図３）。これらの結果から、ＣＡＲ－Ｔによる腫瘍細胞の殺傷において、ＣＡＲ－Ｔ自体がＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１の抑制効果を有していることが示唆された。
【0049】
［９９］．亜濃度のＩＦＮ－γは、腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１の高発現を誘導する。しかし、ＣＡＲ－Ｔ細胞がＩＦＮ－γで前処理されＰＤ－Ｌ１を高発現した腫瘍細胞に遭遇した場合、ＣＡＲ－Ｔ細胞はより高い潜在的細胞溶解活性とＩＦＮ－γ分泌能を示した（図５）。 一方、ＩＦＮ－γを抗ＩＦＮ－γ抗体で中和すると、ＣＡＲ－Ｔの細胞毒性が著しく低下したことから（図６）、ＩＦＮ－γがＣＡＲ－Ｔ活性に重要であることが示された。
【0050】
［１００］．ＩＦＮ－γ前処理試験では、ＩＦＮ－γのＣＡＲ－Ｔ細胞への直接的な影響を排除するため、残留ＩＦＮ－γが検出されない（１０ ｐｇ／ｍｌ以下）ように培地を新鮮培地に交換した。
［１０１］．本発明では、低濃度のＩＦＮ－γを用いて腫瘍細胞を前処理し、ＣＡＲ－ＴのＩＦＮ－γを中和するのに十分な抗ＩＦＮ－γ抗体を含む新鮮培地でＣＡＲ－Ｔの細胞毒性を測定した。ＩＦＮ－γで前処理されなかった腫瘍細胞に対してＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍殺滅効果を失った場合（図６）とは異なり、ＩＦＮ－γが中和された後でも、ＣＡＲ－Ｔ細胞は依然として、低濃度のＩＦＮ－γで前処理された腫瘍細胞に対する殺滅能力を示した（図７）。そのため、ＩＦＮ－γは腫瘍細胞に作用してＣＡＲ－Ｔの殺傷能力を高めると考えられている。つまり、ＩＦＮ－γで前処理することで、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する腫瘍細胞の感受性を高めたのである。
［１０１］．本発明では、低濃度のＩＦＮ－γを用いて腫瘍細胞を前処理し、ＣＡＲ－ＴのＩＦＮ－γを中和するのに十分な抗ＩＦＮ－γ抗体を含む新鮮培地でＣＡＲ－Ｔの細胞毒性を測定した。ＩＦＮ－γで前処理されなかった腫瘍細胞に対してＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍殺滅効果を失った場合（図６）とは異なり、ＩＦＮ－γが中和された後でも、ＣＡＲ－Ｔ細胞は依然として、低濃度のＩＦＮ－γで前処理された腫瘍細胞に対する殺滅能力を示した（図７）。そのため、ＩＦＮ－γは腫瘍細胞に作用してＣＡＲ－Ｔの殺傷能力を高めると考えられている。つまり、ＩＦＮ－γで前処理することで、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する腫瘍細胞の感受性を高めたのである。
【0051】
［１０２］．その後、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムでＩＦＮ－γシグナル伝達経路を遮断し、腫瘍細胞上のＩＦＮ－γＲ２（ＩＦＮＧＲ２）遺伝子の発現を阻害した。なぜなら、ＩＦＮ－γＲ１は哺乳類の細胞に遍在しているが、ＩＦＮ－γＲ２の発現はより動的で、特定の細胞集団におけるＩＦＮ－γ誘導シグナル伝達の程度を決定していると考えられるからである。ノックアウト－ＩＦＮ－γＲ２（ＩＦＮ－γＲ２－ｎｕｌｌ）腫瘍細胞は、対照細胞と同様に正常に増殖し、ノックアウト－ＩＦＮ－γＲ２腫瘍細胞は、ＩＦＮ－γ（３つの濃度：０、５、１０ｎｇ／ｍｌ）で処理するとＰＤ－Ｌ１を発現しなくなった（図８）。しかし、ノックアウト－ＩＦＮ－γＲ２腫瘍細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞による溶解に対してより抵抗性であった（図９）。いずれの腫瘍細胞（ＳＫ－ＯＶ－３、Ａ５４９）においても、ＩＦＮ－γ前処理によるＣＡＲ－Ｔ細胞毒性の増強効果は有意に抑制された（図９）、すなわちＩＦＮ－γ前処理による腫瘍細胞の感作効果は抑制された。これらの結果から、腫瘍細胞に対するＩＦＮ－γの作用は、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１の発現にもかかわらず、ＣＡＲ－Ｔがその細胞活性（及び抗腫瘍効果）を維持又は増強する本質的なメカニズムであることが示唆された。
【0052】
［１０３］．ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１に対するＩＦＮ－γの抑制効果を直接的に特徴付けるために、我々の実験グループはＰＤ－Ｌ１を安定的に発現する腫瘍細胞に対してＣＡＲ－Ｔ活性検出を実施した。腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１の過剰発現は、腫瘍細胞をＣＡＲ－Ｔによる殺傷に対して抵抗性にせず、ＩＦＮ－γで前処理した腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の毒性増強を阻害することもなかった（図１０）。つまり、ＩＦＮ－γ前処理による、腫瘍細胞のＣＡＲ－Ｔ細胞に対する感受性の向上は、ＰＤ－Ｌ１によって阻害されることはないのである。しかし、ＩＦＮ－γＲ２がノックアウトされた腫瘍細胞では、ＰＤ－Ｌ１高発現がＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効果を有意に抑制した（図１１）。 これらの結果は、ＩＦＮ－γシグナル伝達がＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１の抑制効果を克服し、腫瘍細胞のＣＡＲ－Ｔ細胞に対する感受性を高め、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を向上させることを示唆している。
【0053】
［１０４］．次に、本発明は、ＩＦＮ－γがＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１のＣＡＲ－Ｔに対する阻害作用をどのように克服するのかについても検討した。ＩＦＮ－γは、ＰＤ－Ｌ１の発現を誘導するだけでなく、腫瘍細胞によるＨＬＡ分子の発現も誘導する。ＨＬＡは、ＴＣＲがＴ細胞を活性化する天然リガンドであるが、ＨＬＡ－ＡＢＣ分子を遮断しても、ＩＦＮ－γのＣＡＲ－Ｔ細胞に対する増強効果に影響を与えない。
【0054】
［１０５］．細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１、別名ＣＤ５４）は、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）の細胞表面糖タンパク質であり、効果的な免疫応答に重要な役割を果たす。本発明では、ＩＦＮ－γ受容体が機能する腫瘍細胞でＩＣＡＭ－１をノックアウトすると、腫瘍細胞のＩＦＮ－γ前処理によるＣＡＲ－Ｔ殺傷毒性の増強がほぼ完全になくなることが明らかになり（図１４）、ＣＡＲ－Ｔ活性に対するＩＣＡＭ－１の重要性が予測された。同時に、ＩＦＮ－γは腫瘍細胞のＩＣＡＭ－１産生を刺激し、腫瘍細胞に対するＴ細胞の殺傷能力を向上させた（図１５）。一方、正常なＩＦＮ－γシグナル伝達経路を持つ腫瘍細胞でＩＣＡＭ－１を過剰発現させても、ＣＡＲ－Ｔによる腫瘍細胞の特異的な細胞溶解は有意に促進されなかった（図１３）。これは、活性化されたＣＡＲ－Ｔ細胞から放出されるＩＦＮ－γによって引き起こされるＩＣＡＭ－１のアップレギュレーションに起因していると考えている。そこで、本発明では、ＩＦＮ－γＲ２ノックアウト細胞におけるＩＣＡＭ－１の過剰発現について検討したところ、腫瘍細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞による殺傷に感受性が高くなることを見出した（図１３）。これらの結果から、ＩＦＮ－γによるＩＣＡＭ－１の発現は、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１の機能を抑制し、ＣＡＲ－Ｔ及びＴ細胞の抗腫瘍活性を高めることが示唆された。
【0055】
［１０６］．そこで、本発明の実験では、ＩＦＮ－γの前処理が、固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞製剤の治療成績の向上に寄与するかどうかを検証した。連続的な生体外殺傷検出により、ＣＡＲ－Ｔ細胞はＩＦＮ－γで前処理した腫瘍細胞に対して第５ラウンドまで殺傷活性を維持したが、非ＩＦＮ－γ前処理腫瘍細胞に対する殺傷活性は第３ラウンドまでしか維持しなかった（図１２）。すなわち、ＩＦＮ－γ（補助薬として）の前処理により、腫瘍細胞のＣＡＲ－Ｔ細胞に対する感受性が高まり、ＣＡＲ－Ｔ細胞製剤の固形腫瘍に対する一次治療薬としての治療効果が促進された。
【0056】
［１０７］．次に、本発明の実験では、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腹腔内注入前にＩＦＮ－γを２回注入したＮＳＧマウス腹腔内卵巣がんモデルを確立した（図１６）。生物発光イメージングにより、ＩＦＮ－γは腫瘍の成長を有意に抑制せず、ＣＡＲ－Ｔ単独では腫瘍の成長を遅らせるだけであったが、ＩＦＮ－γ前処理とＣＡＲ－Ｔ細胞の併用により、５匹中３匹で腫瘍が持続的に消滅し、残りの２匹ではコントロールマウス内の腫瘍より有意に小さくなった（図１７）。しかし、ＩＦＮ－γＲ２欠損腫瘍は、併用療法に対してより抵抗性を示した（図１７）。これらの生体外及び生体内実験の結果から、ＩＦＮ－γ（感作性補助薬として）とＣＡＲ－Ｔ（主薬として）の順次投与は、固形腫瘍治療において有効なアプローチであることが示唆された。
【0057】
［１０８］．まとめると、本発明の実験では、以下のことがわかった。
［１０９］．１）ＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍細胞と接触した後、抑制分子であるＰＤ－１がＣＡＲ－Ｔ細胞に、ＰＤ－Ｌ１が腫瘍細胞に高発現した。同時に、活性化マーカーであるグランザイムＢ、パーフォリン、サイトカイン放出がＣＡＲ－Ｔ細胞でアップレギュレーションし、ＣＡＲ－Ｔは腫瘍細胞を効率的に殺傷した。
［１１０］．２）ＩＦＮ－γはを前処理し、ＩＦＮ－γは腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１発現をアップレギュレートしたが、同時にＣＡＲ－Ｔによる腫瘍細胞殺傷とサイトカイン放出を促進した（抑制はしなかった）。 （ＩＦＮ－γは低濃度であり、腫瘍細胞を有意に抑制しなかった）。
［１１１］．３）ＣＡＲ－Ｔ細胞と腫瘍細胞を共培養した系で、ＩＦＮ－γ中和抗体を用いてＩＦＮ－γを中和すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷機能が著しく低下した。 腫瘍細胞のＩＦＮγ受容体遺伝子（ＩＦＮγＲ２）をノックアウトすると、腫瘍細胞はＰＤ－Ｌ１を発現しなくなったが、ＣＡＲ－Ｔの殺傷機能は低下した。
［１１２］．４）腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１の過剰発現はＣＡＲ－Ｔ活性を有意に阻害しなかったが、ＩＦＮγ受容体遺伝子（ＩＦＮγＲ２）をノックアウトした腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１の過剰発現は、ＣＡＲ－Ｔの殺傷機能を有意に阻害した。
［１１３］．５）ＩＦＮ－γは、腫瘍細胞にＩＣＡＭ－１の高発現を誘導した。腫瘍細胞のＩＣＡＭ－１をノックアウトした後、ＩＦＮ－γ前処理はもはやＣＡＲ－Ｔの殺傷活性を増強することができなくなった。
［１１４］ ．６）ＩＦＮγＲ２欠損の腫瘍細胞でＩＣＡＭ－１分子を過剰発現させ、ＣＡＲ－Ｔの殺傷機能とサイトカイン放出能を促進させた。
［１１５］．７）ＩＦＮ－γは、マウス卵巣がん腹膜腫瘍モデルにおいて、ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果を高めることができる。
［１１６］．８）腫瘍細胞をＩＦＮ－γで前処理すると、腫瘍細胞にＩＣＡＭ－１の発現が促され、腫瘍細胞に対する通常のＴ細胞の殺傷能力が向上した。
［１０９］．１）ＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍細胞と接触した後、抑制分子であるＰＤ－１がＣＡＲ－Ｔ細胞に、ＰＤ－Ｌ１が腫瘍細胞に高発現した。同時に、活性化マーカーであるグランザイムＢ、パーフォリン、サイトカイン放出がＣＡＲ－Ｔ細胞でアップレギュレーションし、ＣＡＲ－Ｔは腫瘍細胞を効率的に殺傷した。
［１１０］．２）ＩＦＮ－γはを前処理し、ＩＦＮ－γは腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１発現をアップレギュレートしたが、同時にＣＡＲ－Ｔによる腫瘍細胞殺傷とサイトカイン放出を促進した（抑制はしなかった）。 （ＩＦＮ－γは低濃度であり、腫瘍細胞を有意に抑制しなかった）。
［１１１］．３）ＣＡＲ－Ｔ細胞と腫瘍細胞を共培養した系で、ＩＦＮ－γ中和抗体を用いてＩＦＮ－γを中和すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷機能が著しく低下した。 腫瘍細胞のＩＦＮγ受容体遺伝子（ＩＦＮγＲ２）をノックアウトすると、腫瘍細胞はＰＤ－Ｌ１を発現しなくなったが、ＣＡＲ－Ｔの殺傷機能は低下した。
［１１２］．４）腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１の過剰発現はＣＡＲ－Ｔ活性を有意に阻害しなかったが、ＩＦＮγ受容体遺伝子（ＩＦＮγＲ２）をノックアウトした腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１の過剰発現は、ＣＡＲ－Ｔの殺傷機能を有意に阻害した。
［１１３］．５）ＩＦＮ－γは、腫瘍細胞にＩＣＡＭ－１の高発現を誘導した。腫瘍細胞のＩＣＡＭ－１をノックアウトした後、ＩＦＮ－γ前処理はもはやＣＡＲ－Ｔの殺傷活性を増強することができなくなった。
［１１４］ ．６）ＩＦＮγＲ２欠損の腫瘍細胞でＩＣＡＭ－１分子を過剰発現させ、ＣＡＲ－Ｔの殺傷機能とサイトカイン放出能を促進させた。
［１１５］．７）ＩＦＮ－γは、マウス卵巣がん腹膜腫瘍モデルにおいて、ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果を高めることができる。
［１１６］．８）腫瘍細胞をＩＦＮ－γで前処理すると、腫瘍細胞にＩＣＡＭ－１の発現が促され、腫瘍細胞に対する通常のＴ細胞の殺傷能力が向上した。
【0058】
［１１７］．Ｂ 発明：ＣＡＲ発現ベクターとその応用
［１１８］ ．Ｂ発明は、生物医学の分野に属し、詳しくは、ＣＡＲ発現ベクター及びその応用に関するものである。
［１１９］．養子細胞療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ，ＡＣＴ）は、「生きた薬」と呼ばれるほど有効な抗がん戦略であり、がん免疫療法において重要な役割を担っている。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）は、遺伝子操作されたＴ細胞で、血液悪性腫瘍の治療において目覚しい成果を上げているが、固形腫瘍の治療においては満足できるものではなく、未だ大きな課題を抱えている。固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞療法の効果が低い理由はよくわかっていないが、複数の理由があるのではないかと推測されている。例えば、生体内でのＣＡＲ－Ｔ細胞は生存率が低く、体内に投入後すぐに死滅して殺傷効果に悪影響を与えてしまった。また、固形腫瘍は代謝、免疫回避、組織形成における多能性により、免疫抑制性微小環境を形成し、その結果、ＣＡＲ－Ｔ細胞が固形腫瘍の組織内に浸潤して効果を発揮することが困難になったため、たとえ固形腫瘍に入ったとしても、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、様々な点で免疫系を制限しているので不活性化されて死滅してしまった。 そのため、固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞や関連する薬剤製剤の殺傷効果をいかに高めるかが、この分野の喫緊の課題となっている。
［１１８］ ．Ｂ発明は、生物医学の分野に属し、詳しくは、ＣＡＲ発現ベクター及びその応用に関するものである。
［１１９］．養子細胞療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ，ＡＣＴ）は、「生きた薬」と呼ばれるほど有効な抗がん戦略であり、がん免疫療法において重要な役割を担っている。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）は、遺伝子操作されたＴ細胞で、血液悪性腫瘍の治療において目覚しい成果を上げているが、固形腫瘍の治療においては満足できるものではなく、未だ大きな課題を抱えている。固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞療法の効果が低い理由はよくわかっていないが、複数の理由があるのではないかと推測されている。例えば、生体内でのＣＡＲ－Ｔ細胞は生存率が低く、体内に投入後すぐに死滅して殺傷効果に悪影響を与えてしまった。また、固形腫瘍は代謝、免疫回避、組織形成における多能性により、免疫抑制性微小環境を形成し、その結果、ＣＡＲ－Ｔ細胞が固形腫瘍の組織内に浸潤して効果を発揮することが困難になったため、たとえ固形腫瘍に入ったとしても、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、様々な点で免疫系を制限しているので不活性化されて死滅してしまった。 そのため、固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞や関連する薬剤製剤の殺傷効果をいかに高めるかが、この分野の喫緊の課題となっている。
【0059】
［１２０］．ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果を高めるために、現在、ＣＡＲ－Ｔ細胞自体をさらに遺伝子組み換えしたり、ナノ修飾したりすることが主に注目されている。例えば、マルチターゲットＣＡＲ遺伝子をＣＡＲ－Ｔ細胞に挿入したり、ＣＡＲ－Ｔ細胞にケモカインを発現させたり、又は接着分子や化学基を直接修飾することによってＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍組織に対する傾向や認識を強化するようにしている。 しかし、いずれの手法も多かれ少なかれ問題点や欠点がある。 例えば、マルチターゲットＣＡＲ－Ｔ細胞の場合、挿入された外来遺伝子が多すぎると、Ｔ細胞本来の活性に影響を与える可能性もある。化学修飾は通常、細胞活性の低下だけでなく、運動や移動能力の低下も引き起こす。したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞の修飾は、プラスとマイナスの両方の要因を総合的に考慮しなければならず、最終的にはより的を絞った、より効果の高い修飾方法を選択する必要もある。
【0060】
［１２１］．従来の技術的経路のうち、ＰＤ－１阻害の観点からＣＡＲ－Ｔを改変することは、実現可能な方法と考えられている。ＰＤ－１は、そのリガンドであるプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）と結合することでＴ細胞を介した免疫反応を負に制御するため、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１シグナル伝達経路を遮断することは有効な手段である。したがって、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１シグナル伝達経路を遮断することは、有効な抗腫瘍免疫療法戦略であり、良好な臨床結果が得られている。 ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１を標的とした抗体医薬がいくつか上市されており、例えば、ＰＤ－１に対する抗体：Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体：Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂなどが挙げられる。
【0061】
［１２２］．ＰＤ－１などの抑制性シグナル伝達経路も、ＣＡＲ－Ｔ治療の有効性を左右する重要な要素である。ＰＤ－１経路を遮断することで、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を向上させることができることが研究で明らかにされている。そのため、従来の技術的経路では、ＰＤ－１やＰＤ－Ｌ１に対する抗体を分泌するようにＣＡＲ－Ｔ細胞を遺伝子操作することで、固形腫瘍に対する治療効果を大幅に向上させる試みや、遺伝子編集によりＣＡＲ－Ｔ細胞のＰＤ－１をコードする遺伝子をノックアウトすることでもＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍活性を向上させることが可能である。
【0062】
［１２３］．しかし、現在のこれらの技術的解決策や技術的経路の考え方は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能そのものを向上させることに重点を置いており、腫瘍細胞や固形腫瘍内の免疫抑制性微小環境にはほとんど影響を及ぼしていないのが現状である。つまり、現在の技術的解決策や技術的経路は、ＣＡＲ－Ｔ細胞自体の改良にのみ注力し、腫瘍細胞に双方向に作用するという観点から、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の抗腫瘍効果を高めるという発想には限界があるのである。
【0063】
［１２４］．そこで、Ｂ発明は、腫瘍細胞だけでなく、固形腫瘍内の免疫抑制性微小環境にも影響を与え、ＣＡＲ－Ｔ細胞製剤の抗腫瘍効果を最適化することができる新規ＣＡＲ－Ｔ細胞製剤を提供しようとするものである。
［１２５］．Ｂ発明の目的の一つは、新規ＣＡＲ発現ベクター及び構築戦略を提供するものである。
［１２６］．上記目的を達成するために、Ｂ発明の技術的解決策は、以下のとおりである。
［１２７］．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と腫瘍細胞感作因子をコードする核酸とを含むＣＡＲ発現ベクターであって、前記腫瘍細胞感作因子をコードする前記核酸は、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片をコードする核酸である、ＣＡＲ発現ベクター。
［１２８］．さらに、前記ＣＡＲをコードする前記核酸は、自己切断型ペプチドをコードする配列によって前記腫瘍細胞感作因子をコードする前記核酸に連結されている。
［１２９］．さらに、前記ＣＡＲをコードする前記核酸は、腫瘍特異抗原を標的とする単鎖抗体可変領域（ＳｃＦｖ）と、ＣＤ８ａシグナルペプチドと、ＣＤ８ヒンジ領域と、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインと、４－１ＢＢ細胞内共刺激要素と、ＣＤ３ζ細胞内ドメインとをコードする核酸からなる。
［１３０］．さらに、前記腫瘍特異抗原は、ＨＥＲ２、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＰＣ－３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＰＳＣＡ、ＧＤ２及びＬｅｗｉｓＹから選ばれる１種又はそれ以上である。
［１３１］．さらに、前記自己切断型ペプチドをコードする前記配列は、Ｐ２Ａ配列である。
［１３２］．さらに、前記ＣＡＲをコードする核酸配列が配列番号１、前記ＩＦＮ－γをコードする核酸配列が配列番号２、前記自己切断型ペプチドをコードする前記配列が配列番号３によって表される。
［１３３］．本発明のさらなる目的は、レンチウイルスを提供するものである。
［１３４］．前記ＣＡＲ発現ベクターを包含するレンチウイルス。
［１３５］．好ましい態様として、本発明の一実施形態において、前記レンチウイルスは、ｐＷＰＸＬｄである。しかし、ｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＶＳＶＧなどを含む当技術分野で一般的に用いられるレンチウイルス発現プラスミドも、本発明の技術的実施形態に含まれ得る。
［１３６］．また、本発明の目的は、新規ＣＡＲ－Ｔ細胞及びその製剤、並びに新規Ｔ細胞及びその製剤を提供するものである。
［１３７］．以下の（ａ）又は（ｂ）に示すベクター：（ａ）前記ＣＡＲ発現ベクター、又は（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸及びＩＦＮ－γをコードする核酸を含むＣＡＲ発現ベクター、が導入された、ＣＡＲ－Ｔ細胞。
［１３８］．前記ＣＡＲ－Ｔ細胞と、薬学的に許容される副原料及び／又は補助剤とを含む、抗腫瘍薬。
［１３９］．さらに、前記腫瘍は、固形腫瘍である。
［１４０］．さらに、前記腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである。
［１４１］．ＣＡＲ及びＩＦＮ－γを発現する、Ｔ細胞。
［１４２］．さらに、前記Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸とＩＦＮ－γをコードする核酸とを含む。
［１４３］．ＣＡＲ及びＩＦＮ－γを発現するＴ細胞と、薬学的に許容される副原料及び／又は補助剤とを含む、抗腫瘍薬。
［１４４］．さらに、前記腫瘍は、固形腫瘍である。
［１４５］．さらに、前記腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである。
［１４６］．ＣＡＲ及びＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の調製方法であって、ＣＡＲをコードする核酸とＩＦＮ－γをコードする核酸とをベクターで前記Ｔ細胞に再導入する、調製方法。
［１２５］．Ｂ発明の目的の一つは、新規ＣＡＲ発現ベクター及び構築戦略を提供するものである。
［１２６］．上記目的を達成するために、Ｂ発明の技術的解決策は、以下のとおりである。
［１２７］．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と腫瘍細胞感作因子をコードする核酸とを含むＣＡＲ発現ベクターであって、前記腫瘍細胞感作因子をコードする前記核酸は、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片をコードする核酸である、ＣＡＲ発現ベクター。
［１２８］．さらに、前記ＣＡＲをコードする前記核酸は、自己切断型ペプチドをコードする配列によって前記腫瘍細胞感作因子をコードする前記核酸に連結されている。
［１２９］．さらに、前記ＣＡＲをコードする前記核酸は、腫瘍特異抗原を標的とする単鎖抗体可変領域（ＳｃＦｖ）と、ＣＤ８ａシグナルペプチドと、ＣＤ８ヒンジ領域と、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインと、４－１ＢＢ細胞内共刺激要素と、ＣＤ３ζ細胞内ドメインとをコードする核酸からなる。
［１３０］．さらに、前記腫瘍特異抗原は、ＨＥＲ２、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＰＣ－３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＰＳＣＡ、ＧＤ２及びＬｅｗｉｓＹから選ばれる１種又はそれ以上である。
［１３１］．さらに、前記自己切断型ペプチドをコードする前記配列は、Ｐ２Ａ配列である。
［１３２］．さらに、前記ＣＡＲをコードする核酸配列が配列番号１、前記ＩＦＮ－γをコードする核酸配列が配列番号２、前記自己切断型ペプチドをコードする前記配列が配列番号３によって表される。
［１３３］．本発明のさらなる目的は、レンチウイルスを提供するものである。
［１３４］．前記ＣＡＲ発現ベクターを包含するレンチウイルス。
［１３５］．好ましい態様として、本発明の一実施形態において、前記レンチウイルスは、ｐＷＰＸＬｄである。しかし、ｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＶＳＶＧなどを含む当技術分野で一般的に用いられるレンチウイルス発現プラスミドも、本発明の技術的実施形態に含まれ得る。
［１３６］．また、本発明の目的は、新規ＣＡＲ－Ｔ細胞及びその製剤、並びに新規Ｔ細胞及びその製剤を提供するものである。
［１３７］．以下の（ａ）又は（ｂ）に示すベクター：（ａ）前記ＣＡＲ発現ベクター、又は（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸及びＩＦＮ－γをコードする核酸を含むＣＡＲ発現ベクター、が導入された、ＣＡＲ－Ｔ細胞。
［１３８］．前記ＣＡＲ－Ｔ細胞と、薬学的に許容される副原料及び／又は補助剤とを含む、抗腫瘍薬。
［１３９］．さらに、前記腫瘍は、固形腫瘍である。
［１４０］．さらに、前記腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである。
［１４１］．ＣＡＲ及びＩＦＮ－γを発現する、Ｔ細胞。
［１４２］．さらに、前記Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸とＩＦＮ－γをコードする核酸とを含む。
［１４３］．ＣＡＲ及びＩＦＮ－γを発現するＴ細胞と、薬学的に許容される副原料及び／又は補助剤とを含む、抗腫瘍薬。
［１４４］．さらに、前記腫瘍は、固形腫瘍である。
［１４５］．さらに、前記腫瘍は、卵巣腫瘍、乳がん、脳神経膠腫、胃がん、結腸がん、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、肝がん又は尿路上皮がんである。
［１４６］．ＣＡＲ及びＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の調製方法であって、ＣＡＲをコードする核酸とＩＦＮ－γをコードする核酸とをベクターで前記Ｔ細胞に再導入する、調製方法。
【0064】
［１４７］．Ｂ発明の具体的な実施形態
［１４８］．Ｂ発明の実施例１：ＩＦＮ－γは、免疫療法に対する腫瘍細胞の感受性を高める
［１４９］．腫瘍細胞は、亜細胞毒性濃度のＩＦＮ－γでＰＤ－Ｌ１を高発現するように誘導される（すなわち、腫瘍細胞はＩＦＮ－γで前処理される）。 次に、ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＨＥＲ２－ＣＡＲ、ＭＳＬＮ－ＣＡＲ）をＩＦＮ－γで前処理したＰＤ－Ｌ１発現量の高い腫瘍細胞と共投与すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞はより高い潜在的細胞溶解活性とＩＦＮ－γ分泌能を示した（図１８）。 ＩＦＮ－γ前処理試験では、ＩＦＮ－γのＣＡＲ－Ｔ細胞への直接的な影響を排除するため、残留ＩＦＮ－γが検出されない（１０ ｐｇ／ｍｌ以下）ことを確認した後、新鮮な培地に交換した。
［１４８］．Ｂ発明の実施例１：ＩＦＮ－γは、免疫療法に対する腫瘍細胞の感受性を高める
［１４９］．腫瘍細胞は、亜細胞毒性濃度のＩＦＮ－γでＰＤ－Ｌ１を高発現するように誘導される（すなわち、腫瘍細胞はＩＦＮ－γで前処理される）。 次に、ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＨＥＲ２－ＣＡＲ、ＭＳＬＮ－ＣＡＲ）をＩＦＮ－γで前処理したＰＤ－Ｌ１発現量の高い腫瘍細胞と共投与すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞はより高い潜在的細胞溶解活性とＩＦＮ－γ分泌能を示した（図１８）。 ＩＦＮ－γ前処理試験では、ＩＦＮ－γのＣＡＲ－Ｔ細胞への直接的な影響を排除するため、残留ＩＦＮ－γが検出されない（１０ ｐｇ／ｍｌ以下）ことを確認した後、新鮮な培地に交換した。
【0065】
［１５０］．また、本発明では、低濃度のＩＦＮ－γを用いて腫瘍細胞を前処理し、ＣＡＲ－ＴのＩＦＮ－γを中和するのに十分な抗ＩＦＮ－γ抗体を含む新鮮培地でＣＡＲ－Ｔ（ＨＥＲ２－ＣＡＲ）の細胞毒性を測定した。ＩＦＮ－γで前処理されなかった腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅効果は著しく低下した場合（図１９）とは異なり、ＩＦＮ－γが中和された後でも、ＣＡＲ－Ｔ細胞は依然として、低濃度のＩＦＮ－γで前処理された腫瘍細胞に対する殺滅能力を示した（図２０）。
［１５１］．以上の実験から、ＩＦＮ－γがＣＡＲ－Ｔによる腫瘍細胞の殺傷に重要な影響を与え、ＩＦＮ－γが腫瘍細胞に作用してＣＡＲ－Ｔの殺傷能力を高めていることが明らかとなった。 つまり、ＩＦＮ－γで前処理することで、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する腫瘍細胞の感受性が高まったのである。
［１５１］．以上の実験から、ＩＦＮ－γがＣＡＲ－Ｔによる腫瘍細胞の殺傷に重要な影響を与え、ＩＦＮ－γが腫瘍細胞に作用してＣＡＲ－Ｔの殺傷能力を高めていることが明らかとなった。 つまり、ＩＦＮ－γで前処理することで、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する腫瘍細胞の感受性が高まったのである。
【0066】
［１５２］．次に、本発明の実験チームは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腹腔内注入前にＩＦＮ－γを２回注入したＮＳＧマウス腹腔内卵巣がんモデルを確立した（図１６）。生物発光バイオルミネッセンスイメージングにより、ＩＦＮ－γは腫瘍の成長を有意に抑制せず、ＣＡＲ－Ｔ単独では腫瘍の成長を遅らせるだけであったが、ＩＦＮ－γ前処理とＣＡＲ－Ｔ細胞の併用により、５匹中３匹で腫瘍が持続的に消滅し、残りの２匹ではコントロールマウス内の腫瘍より有意に小さくなった（図１７）。 しかし、腫瘍細胞内のＩＦＮ－γシグナル伝達経路が遮断されると（例えば、図１７の実験でＩＦＮ－γＲ２をノックアウトすることで）、腫瘍はＩＦＮ－γ前処理と組み合わせたＣＡＲ－Ｔ細胞の治療法に対してより抵抗性が高くなった（図１７）。
［１５３］．さらに、本発明の実験により、ＩＦＮ－γはＣＡＲ－Ｔによる腫瘍細胞の殺傷に重要なだけでなく、通常のＴ細胞（すなわち、非遺伝子組み換えＴ細胞）の腫瘍細胞に対する殺傷効果も増強することが示された（図２１）。
［１５４］．以上、本発明の生体外及び生体内実験の結果から、遺伝子組み換えＴ細胞及び通常のＴ細胞のいずれも、ＩＦＮ－γで前処理した腫瘍細胞と遭遇すると殺傷効果が高まる（すなわち、ＩＦＮ－γシグナル伝達経路が活性化される）ことが示された。 ＩＦＮ－γは、通常のＴ細胞系と遺伝子組み換えＴ細胞（例えば、様々な種類のＣＡＲ－Ｔ及び／又はＴＣＲ－Ｔ）の両方において、腫瘍細胞の殺傷能力を高めることが示唆されている。
［１５５］．腫瘍細胞のＩＦＮ－γ前処理によって腫瘍細胞のＴ細胞に対する感受性を高めることに加えて、本発明は、遺伝子組み換えされたＴ細胞自体が腫瘍細胞を感作するためのＩＦＮ－γを分泌し、腫瘍細胞を殺すＴ細胞の効果を高めることができるように、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）を遺伝子組み換えする技術的解決策を提案するものである。腫瘍細胞のＩＦＮ－γ前処理よりも優れた、より簡便な治療戦略が提供される可能性がある。
［１５３］．さらに、本発明の実験により、ＩＦＮ－γはＣＡＲ－Ｔによる腫瘍細胞の殺傷に重要なだけでなく、通常のＴ細胞（すなわち、非遺伝子組み換えＴ細胞）の腫瘍細胞に対する殺傷効果も増強することが示された（図２１）。
［１５４］．以上、本発明の生体外及び生体内実験の結果から、遺伝子組み換えＴ細胞及び通常のＴ細胞のいずれも、ＩＦＮ－γで前処理した腫瘍細胞と遭遇すると殺傷効果が高まる（すなわち、ＩＦＮ－γシグナル伝達経路が活性化される）ことが示された。 ＩＦＮ－γは、通常のＴ細胞系と遺伝子組み換えＴ細胞（例えば、様々な種類のＣＡＲ－Ｔ及び／又はＴＣＲ－Ｔ）の両方において、腫瘍細胞の殺傷能力を高めることが示唆されている。
［１５５］．腫瘍細胞のＩＦＮ－γ前処理によって腫瘍細胞のＴ細胞に対する感受性を高めることに加えて、本発明は、遺伝子組み換えされたＴ細胞自体が腫瘍細胞を感作するためのＩＦＮ－γを分泌し、腫瘍細胞を殺すＴ細胞の効果を高めることができるように、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）を遺伝子組み換えする技術的解決策を提案するものである。腫瘍細胞のＩＦＮ－γ前処理よりも優れた、より簡便な治療戦略が提供される可能性がある。
【0067】
［１５６］．Ｂ発明の実施例２：新規ＣＡＲ発現ベクター
［１５７］．本発明の実施例２は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と腫瘍細胞感作性因子をコードする核酸とを含む新規ＣＡＲ発現ベクターであって、前記腫瘍細胞感作性因子をコードする核酸は、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片をコードする核酸である、ことを特徴とする新規ＣＡＲ発現ベクターを提供するものである。
［１５８］．ベクター構造
［１５９］．ＩＮＦ－γを特異的に分泌できるキメラ抗原受容体を発現する発現カセットを含むプラスミドベクターを構築する。発現カセット上の要素の構造及び位置関係については図２２ａを、プラスミドベクター骨格については図２２ｂを参照する。具体的なステップは以下の通りである：レンチウイルスベクターｐＷＰＸＬｄは、ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞上のキメラ抗原受容体を標的とする第１の発現カセットを含み、第１の発現カセット（ＨＥＲ２－ＣＡＲ）は、ＣＤ８ａシグナルペプチド、ＨＥＲ２単鎖抗体可変領域、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ８ａ拡張膜ドメイン、４－１ＢＢの細胞内共刺激要素およびＣＤ３ζの細胞内ドメイン、第２の発現カセットは、Ｔ細胞ｃＤＮＡからヒトＩＦＮ－γの特異的断片を増幅するようにプライマーを設計し、ＩＦＮ－γの第２の発現カセットと第１の発現カセットとをＰ２Ａ配列（＝自己切断配列）を介してレンチウイルスベクターｐＷＰＸＬｄで共発現させて、組み換えプラスミド全体を「ＨＥＲ２－ＣＡＲ－ＩＦＮ－γプラスミド」と名づけた。
［１５７］．本発明の実施例２は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と腫瘍細胞感作性因子をコードする核酸とを含む新規ＣＡＲ発現ベクターであって、前記腫瘍細胞感作性因子をコードする核酸は、野生型又は突然変異型ＩＦＮ－γの全長又は断片をコードする核酸である、ことを特徴とする新規ＣＡＲ発現ベクターを提供するものである。
［１５８］．ベクター構造
［１５９］．ＩＮＦ－γを特異的に分泌できるキメラ抗原受容体を発現する発現カセットを含むプラスミドベクターを構築する。発現カセット上の要素の構造及び位置関係については図２２ａを、プラスミドベクター骨格については図２２ｂを参照する。具体的なステップは以下の通りである：レンチウイルスベクターｐＷＰＸＬｄは、ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞上のキメラ抗原受容体を標的とする第１の発現カセットを含み、第１の発現カセット（ＨＥＲ２－ＣＡＲ）は、ＣＤ８ａシグナルペプチド、ＨＥＲ２単鎖抗体可変領域、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ８ａ拡張膜ドメイン、４－１ＢＢの細胞内共刺激要素およびＣＤ３ζの細胞内ドメイン、第２の発現カセットは、Ｔ細胞ｃＤＮＡからヒトＩＦＮ－γの特異的断片を増幅するようにプライマーを設計し、ＩＦＮ－γの第２の発現カセットと第１の発現カセットとをＰ２Ａ配列（＝自己切断配列）を介してレンチウイルスベクターｐＷＰＸＬｄで共発現させて、組み換えプラスミド全体を「ＨＥＲ２－ＣＡＲ－ＩＦＮ－γプラスミド」と名づけた。
【0068】
［１６０］．本実施形態では、ＨＥＲ２を標的とするプラスミドベクターを構築したが、本発明が提供する方法はこれに限定されるものではない。 本発明が提供する方法は、ＨＥＲ２、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＰＣ－３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＰＳＣＡ、ＧＤ２、ＬｅｗｉｓＹなどを含むがこれらだけに限らない、ありふれたターゲットを標的とするプラスミドベクターの構築も可能にする。
［１６１］．本発明が提供する方法はまた、他のプロモーターを使用する、及び／又はＴ２ＡもしくはＩＲＥＳを使用して第１の発現カセットを第２の発現カセットに連結する、などの他の分子生物学ツールを使用して同様の機能を有する組換えプラスミドを構築するこもできる。
［１６２］．キメラ抗原受容体とＩＦＮ－γを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の構築
［１６３］．リンパ球分離株から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、ＣＤ３及びＣＤ２８磁気ビーズを用いて活性化した後、設定したＭＯＩ値に従ってウイルス量を加えて活性化Ｔ細胞に感染させた。 得られた２つのＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれＨＥＲ２－ＣＡＲＴ細胞及びＨＥＲ２－ＩＦＮＧ－ＣＡＲＴ細胞と名付け、Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーにより検出した。
［１６１］．本発明が提供する方法はまた、他のプロモーターを使用する、及び／又はＴ２ＡもしくはＩＲＥＳを使用して第１の発現カセットを第２の発現カセットに連結する、などの他の分子生物学ツールを使用して同様の機能を有する組換えプラスミドを構築するこもできる。
［１６２］．キメラ抗原受容体とＩＦＮ－γを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の構築
［１６３］．リンパ球分離株から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、ＣＤ３及びＣＤ２８磁気ビーズを用いて活性化した後、設定したＭＯＩ値に従ってウイルス量を加えて活性化Ｔ細胞に感染させた。 得られた２つのＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれＨＥＲ２－ＣＡＲＴ細胞及びＨＥＲ２－ＩＦＮＧ－ＣＡＲＴ細胞と名付け、Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーにより検出した。
【0069】
［１６４］．Ｂ発明の実施例３
［１６５］．ＣＡＲ－Ｔ 殺傷機能及びサイトカイン分泌検出
［１６６］．（１）ＨＥＲ２陽性を発現する標的細胞であるＳＫ－ＯＶ－３を、ＭＯＣＫ群（ＭＯＣＫはＣＡＲ発現構造を持たないＴ細胞）、ＨＥＲ２－ＣＡＲ群、ＨＥＲ２－ＩＦＮＧ－ＣＡＲ群、最大放出群、及び自然放出群に分けて９６ウェルプレートに１×１０４でプレーティングした。細胞付着後、対応するエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比でＣＡＲ－Ｔ細胞を加え、２４時間共培養し、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）キットを用いてＣＡＲ－Ｔの殺傷レベルを検出し、細胞上清をサイトカイン検出用に－８０℃にて凍結保存した。
［１６５］．ＣＡＲ－Ｔ 殺傷機能及びサイトカイン分泌検出
［１６６］．（１）ＨＥＲ２陽性を発現する標的細胞であるＳＫ－ＯＶ－３を、ＭＯＣＫ群（ＭＯＣＫはＣＡＲ発現構造を持たないＴ細胞）、ＨＥＲ２－ＣＡＲ群、ＨＥＲ２－ＩＦＮＧ－ＣＡＲ群、最大放出群、及び自然放出群に分けて９６ウェルプレートに１×１０４でプレーティングした。細胞付着後、対応するエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比でＣＡＲ－Ｔ細胞を加え、２４時間共培養し、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）キットを用いてＣＡＲ－Ｔの殺傷レベルを検出し、細胞上清をサイトカイン検出用に－８０℃にて凍結保存した。
【0070】
［１６７］．（２）サイトカイン検出
［１６８］．ＩＦＮ－γの発現は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社のＥＬＩＳＡキットを用いて、説明書にしたがって検出した。
［１６９］．図２３及び図２４は、ＣＡＲ－Ｔの殺傷機能及びサイトカイン分泌検出結果をまとめたものである。図２３に見られるように、本発明のＣＡＲ発現ベクター（ＩＦＮ－γ核酸を含む）を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＨＥＲ２－ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、腫瘍細胞の殺傷効果が有意に高いことが確認された。 図２４に見られるように、本発明のＣＡＲ発現ベクター（ＩＦＮ－γ核酸を含む）を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカインＩＦＮ－γ分泌能も、ＨＥＲ２－ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して有意に向上していた。
［１７０］．本発明の上記実験は、Ｔ細胞が自らＩＦＮ－γをより多く分泌するように遺伝子組み換えすることにより、腫瘍細胞の微小環境を変化させ、Ｔ細胞免疫療法に対する腫瘍細胞の感受性を向上させることができることを示している。 また、本発明により構築されたＣＡＲ発現ベクター及び該ベクターを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞に加えて、天然にＩＦＮ－γを高発現する天然Ｔ細胞や、他の遺伝子組み換えを用いてＩＦＮ－γを高発現するＴ細胞（例えば、ＴＣＲ－Ｔ細胞）なども腫瘍を殺す効果がより高くなると思われる。
［１７１］．以上、本発明の実施形態を添付図面と共に説明したが、本発明は、単に模式的なものであって限定するものではなく、本発明の目的及び請求項によって保護される範囲から逸脱することなく、当業者が本発明に触発されて作り得る多くの形態があり、それらは全て本発明の保護範囲に入るものである。
［１６８］．ＩＦＮ－γの発現は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社のＥＬＩＳＡキットを用いて、説明書にしたがって検出した。
［１６９］．図２３及び図２４は、ＣＡＲ－Ｔの殺傷機能及びサイトカイン分泌検出結果をまとめたものである。図２３に見られるように、本発明のＣＡＲ発現ベクター（ＩＦＮ－γ核酸を含む）を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＨＥＲ２－ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、腫瘍細胞の殺傷効果が有意に高いことが確認された。 図２４に見られるように、本発明のＣＡＲ発現ベクター（ＩＦＮ－γ核酸を含む）を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカインＩＦＮ－γ分泌能も、ＨＥＲ２－ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して有意に向上していた。
［１７０］．本発明の上記実験は、Ｔ細胞が自らＩＦＮ－γをより多く分泌するように遺伝子組み換えすることにより、腫瘍細胞の微小環境を変化させ、Ｔ細胞免疫療法に対する腫瘍細胞の感受性を向上させることができることを示している。 また、本発明により構築されたＣＡＲ発現ベクター及び該ベクターを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞に加えて、天然にＩＦＮ－γを高発現する天然Ｔ細胞や、他の遺伝子組み換えを用いてＩＦＮ－γを高発現するＴ細胞（例えば、ＴＣＲ－Ｔ細胞）なども腫瘍を殺す効果がより高くなると思われる。
［１７１］．以上、本発明の実施形態を添付図面と共に説明したが、本発明は、単に模式的なものであって限定するものではなく、本発明の目的及び請求項によって保護される範囲から逸脱することなく、当業者が本発明に触発されて作り得る多くの形態があり、それらは全て本発明の保護範囲に入るものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】
【国際調査報告】