特表 2023-517621 ２，５－フランジカルボン酸の製造のための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-26

(54)【発明の名称】２，５－フランジカルボン酸の製造のための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/58 20060101AFI20230419BHJP

   C12N 9/04 20060101ALI20230419BHJP

【ＦＩ】

C12P7/58 ZNA

C12N9/04

C12N9/04 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022554646

(86)(22)【出願日】2021-02-25

(85)【翻訳文提出日】2022-10-31

(86)【国際出願番号】 US2021019690

(87)【国際公開番号】W WO2021183298

(87)【国際公開日】2021-09-16

(31)【優先権主張番号】62/988,841

(32)【優先日】2020-03-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522352199

【氏名又は名称】ソリュゲン インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000394

【氏名又は名称】弁理士法人岡田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リー，トニ エム．

(72)【発明者】

【氏名】チェン，シュアイ

(72)【発明者】

【氏名】フィッシャー，ブライアン エフ．

(72)【発明者】

【氏名】ウィエマン，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】ホルク，ハンスイェルク

(72)【発明者】

【氏名】チャクラバルティ，ガウラブ

(72)【発明者】

【氏名】ハント，シーン

(72)【発明者】

【氏名】ミラー，コンラッド ブイ．

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050KK01

4B064AD21

4B064AD40

4B064BJ10

4B064CA21

4B064CB11

4B064CC01

4B064CC24

4B064CE15

4B064DA01

4B064DA16

(57)【要約】

２，５－フランジカルボン酸を製造する化学酵素的方法は、Ｄ－グルコースを（i）中間体を生成するためのガラクトースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、グルカル酸デヒドラターゼ、カタラーゼ、及びそれらの組合せから基本的になる群から選択される少なくとも２つの酵素と、（ii）２，５－フランジカルボン酸を形成するための不均一系金属触媒に接触させることを有する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

２，５－フランジカルボン酸を製造する化学酵素的方法であって、
（i）ガラクトースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、グルカル酸デヒドラターゼ、カタラーゼ、及びそれらの組合せから基本的になる群から選択される少なくとも２つの酵素にＤ－グルコースを接触させて中間体を生成すること、及び
（ii）中間体を金属触媒及び酸触媒と接触させて２，５－フランジカルボン酸を形成すること
を有する。

【請求項2】

請求項１に記載の化学酵素的方法であって、
Ｄ－グルコースはＤ－グルコジアルドースを形成するためにガラクトースオキシダーゼ及びカタラーゼと接触され、
前記方法は、２－ケト－グルコジアルドースの形成に適した条件下でＤ－グルコジアルドースをピラノースオキシダーゼ及びカタラーゼと接触させること、２－ケト－グルコジアルドースを不均一系金属触媒と接触させて２－ケト－グルカル酸を形成すること、及び、酸触媒の存在下で２－ケト－グルカル酸を脱水して２，５－フランジカルボン酸を形成することを更に有する。

【請求項3】

請求項１に記載の化学酵素的方法であって、
Ｄ－グルコースはＤ－グルコジアルドースを形成するためにガラクトースオキシダーゼ及びカタラーゼと接触され、
前記方法は、２－ケト－グルコジアルドースの形成に適した条件下でＤ－グルコジアルドースをピラノースオキシダーゼ及びカタラーゼと接触させること、酸触媒を用いて２－ケト－グルコジアルドースを脱水して２，５－フランジカルボキシアルデヒドを形成すること、及び、不均一系金属触媒の存在下で２，５－フランジカルボキシアルデヒドを酸化して２，５－フランジカルボン酸を形成することを更に有する。

【請求項4】

請求項１に記載の化学酵素的方法であって、
Ｄ－グルコースはＤ－グルコジアルドースを形成するためにガラクトースオキシダーゼ及びカタラーゼと接触され、
前記方法は、Ｄ－グルコジアルドースを金属触媒と接触させてＤ－グルカル酸を形成すること、グルカル酸デヒドラターゼによりＤ－グルカル酸を脱水して５－ケト－４－デオキシグルコジアルドースを形成すること、及び、酸触媒の存在下で５－ケト－デオキシグルコジアルドースを閉環して２，５－フランジカルボン酸を形成することを更に有する。

【請求項5】

請求項１に記載の化学酵素的方法であって、
Ｄ－グルコースは２－ケト－グルコースを形成するためにピラノースオキシダーゼ及びカタラーゼと接触され、
前記方法は、２，５－フランジカルボキシアルデヒドの形成に適した条件下で酸触媒により２－ケト－グルコースを脱水すること、酸触媒により５－ケト－４－デオキシグルコジアルドースを脱水して２，５－フランジカルボキシアルデヒドを形成すること、及び、不均一系金属触媒の存在下で２，５－フランジカルボキシアルデヒドを酸化して２，５－フランジカルボン酸を形成することを更に有する。

【請求項6】

請求項１に記載の化学酵素的方法であって、
ガラクトースオキシダーゼは配列番号１から配列番号６のいずれかの配列を有する。

【請求項7】

請求項２に記載の化学酵素的方法であって、
ガラクトースオキシダーゼは配列番号１から配列番号６のいずれかの配列を有する。

【請求項8】

請求項３に記載の化学酵素的方法であって、
ガラクトースオキシダーゼは配列番号１から配列番号６のいずれかの配列を有する。

【請求項9】

請求項４に記載の化学酵素的方法であって、
ガラクトースオキシダーゼは配列番号１から配列番号６のいずれかの配列を有する。

【請求項10】

請求項５に記載の化学酵素的方法であって、
ガラクトースオキシダーゼは配列番号１から配列番号６のいずれかの配列を有する。

【請求項11】

請求項１に記載の化学酵素的方法であって、
ガラクトースオキシダーゼは配列番号１の配列を有する。

【請求項12】

請求項１に記載の化学酵素的方法であって、
ピルビン酸－２－オキシダーゼは配列番号７から配列番号１１のいずれかの配列を有する。

【請求項13】

約１００℃未満の温度で実施される請求項１に記載の化学酵素的方法。

【請求項14】

請求項１に記載の化学酵素的方法であって、
２，５－フランジカルボン酸は約８０％より高い純度である。

【請求項15】

請求項２に記載の化学酵素的方法であって、
２，５－フランジカルボン酸は約８０％より高い純度である。

【請求項16】

請求項３に記載の化学酵素的方法であって、
２，５－フランジカルボン酸は約８０％より高い純度である。

【請求項17】

請求項４に記載の化学酵素的方法であって、
２，５－フランジカルボン酸は約８０％より高い純度である。

【請求項18】

請求項５に記載の化学酵素的方法であって、
２，５－フランジカルボン酸は約８０％より高い純度である。

【請求項19】

請求項１に記載の化学酵素的方法であって、
不均一系触媒は、炭素、シリカ、アルミナ、チタニア（ＴｉＯ_２）、ジルコニア（ＺｒＯ_２）、ゼオライト、又はそれらの組合せを含有する担体を有する。

【請求項20】

請求項１に記載の化学酵素的方法であって、
酸触媒、金属触媒、又はその両方は不均一系である。

【請求項21】

請求項１に記載の化学酵素的方法であって、
酸触媒、金属触媒、又はその両方は均一系である。

【請求項22】

請求項１に記載の化学酵素的方法であって、
２，５－フランジカルボン酸を水晶析、溶媒晶析、及びヌッチェろ過に供することを更に有する。

【請求項23】

２，５－フランジカルボン酸を製造する化学酵素的方法であって、
アリール－アルコールオキシダーゼ（ＡＡＯ）、クロロペルオキシダーゼ（ＣＰＯ）、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＨＭＦＯ）、グリオキサールオキシダーゼ（ＧＬＯＸ）、ペリプラズムアルデヒドオキシダーゼ（ＰａｏＡＢＣ）、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＵＰＯ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、活性化酵素であるホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）有り無し両方のガラクトースオキシダーゼ（ＧＡＯ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、ヨウ化物ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、オボペルオキシダーゼ、唾液ペルオキシダーゼ、バナジウムハロペルオキシダーゼ、非哺乳類脊椎動物のペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）、ペルオキシダシン（Ｐｘｄ）、微生物のペルオキシン（Ｐｘｃ）、無脊椎動物のペルオキシネクチン（Ｐｘｔ）及びショートペルオキシドケリン（ＰｘＤｏ）、ショートペルオキシドケリン（Ｐｘｔ）、アルファ－ジオキシゲナーゼ（ａＤｏｘ）、デュアルオキシダーゼ（ＤｕＯｘ）、プロスタグランジンＨシンターゼ又はシクロオキシゲナーゼ（ＰＧＨＳ／ＣｙＯｘ）、リノール酸ジオールシンターゼ（ＬＤＳ）、それらの機能的変異体、並びにそれらの組合せからなる群から選択される一つ以上の酵素を含有する酵素的酸化組成物を用いて５－ヒドロキシメチルフルフラールを酵素的酸化して中間体を形成することと、
金属触媒を用いて中間体を酸化して２，５－フランジカルボン酸を形成すること
を有する。

【請求項24】

請求項２３に記載の化学酵素的方法であって、
酵素的酸化は約１００℃未満の温度で実施される。

【請求項25】

請求項２３に記載の化学酵素的方法であって、
２，５－フランジカルボン酸は約８０％より高い純度である。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０２０年３月１２日に出願された「５－ヒドロキシメチルフルフラールからの２，５－フランジカルボン酸の製造のための組成物及び方法」の名称である米国仮特許出願第６２／９８８，８４１の利益を主張し、当該出願の全てがあらゆる目的のために参照によって本明細書中に援用される。

【0002】

連邦政府から援助を受けた研究又は開発に関する陳述
適用無し。

【0003】

本開示は、高純度の２，５－フランジカルボン酸の製造に関する。より具体的には、本開示は、穏やかな条件下における高純度の２，５－フランジカルボン酸の化学酵素的な合成に関する。

【背景技術】

【0004】

２，５－フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）は、米国エネルギー省によりバイオマス由来の最も付加価値のある１２個の化合物の一つとみなされている。ＦＤＣＡはコハク酸、イソデシルフラン－２，５－ジカルボキシレート、イソノニルフラン－２，５－ジカルボキシレート、ジペンチルフラン－２，５－ジカルボキシレート、ジヘプチルフラン－２，５－ジカルボキシレート、及びポリ（エチレンドデカンジオアート－２，５－フランジカルボキシレート）（ＰＥＤＦ）を含む広範な化合物の製造に使用される。ＦＤＣＡはヘキサン酸、大環状配位子、殺菌剤、腐食防止剤、及びチオレン（tiolene）フィルムの製造における重要な成分である。前記化合物は、ポリエステル、ポリアミド、及び可塑剤の製造用のジクロライド－、ジメチル－、ジエチル－、又はビス（ヒドロキシエチル）－誘導体などの単量体の合成における前駆体としても使用可能である。ＦＤＣＡは、麻酔薬、抗生物質、及び腎臓結石を除去するためのキレート薬として医薬品にも使用される。ＦＤＣＡは、石油由来のポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）及びポリブチレンテレフタラート（ＰＥＢ）の代替ポリマーであるポリエチレンフラノエート（ＰＥＦ）の合成における前駆体であるため、非常に興味を集めている。ＰＥＦポリマーは、別の再生可能な化合物であるモノエチレングリコール（ＭＥＧ）に結合されたフラン－２，５－ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）からなる。ＰＥＴモノマーであるパラ－テレフタル酸（ＰＴＡ）とＦＤＣＡの構造的類似性は、現存するポリエステル用のインフラを用いてＰＥＦの重合を可能にする。更に、ＰＥＦはＰＥＴと比較して向上したバリア性、熱的性質、及び機械的性質を示す。

【0005】

ＦＤＣＡはグルコースやフルクトース等の再生可能な糖から製造可能である。現在、ＦＤＣＡを生成する従来の方法は、２つの主要な競合する経路：１）ＨＭＦ中間体を介するフルクトースの酸化及び脱水、２）フランの形成を促進するためのアルダル酸のＣ２又はＣ５の位置におけるケトンの形成を含む。

【発明の概要】

【0006】

本明細書の開示内容は、２，５－フランジカルボン酸を製造する化学酵素的方法であって、（i）ガラクトースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ（pyranose-2-oxidase）、グルカル酸デヒドラターゼ、カタラーゼ、及びそれらの組合せから基本的になる群から選択される少なくとも２つの酵素とＤ－グルコースを接触させて中間体を生成すること、及び、（ii）前記中間体を金属触媒及び酸触媒と接触させて２，５－フランジカルボン酸を形成することを含む。

【0007】

同様に本明細書で開示される内容は、２，５－フランジカルボン酸を製造する化学酵素的方法であって、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＡＡＯ）、クロロペルオキシダーゼ（ＣＰＯ）、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＨＭＦＯ）、グリオキサールオキシダーゼ（ＧＬＯＸ）、ペリプラズムアルデヒドオキシダーゼ（ＰａｏＡＢＣ）、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＵＰＯ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、活性化酵素であるホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）有り無し両方のガラクトースオキシダーゼ（ＧＡＯ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、ヨウ化物ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、オボペルオキシダーゼ、唾液ペルオキシダーゼ、バナジウムハロペルオキシダーゼ、非哺乳類脊椎動物のペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）、ペルオキシダシン（Ｐｘｄ）、微生物のペルオキシン（Ｐｘｃ）、無脊椎動物のペルオキシネクチン（Ｐｘｔ）及びショートペルオキシドケリン（short peroxidockerin）（ＰｘＤｏ）、ショートペルオキシドケリン（Ｐｘｔ）、アルファ－ジオキシゲナーゼ（ａＤｏｘ）、デュアルオキシダーゼ（ＤｕＯｘ）、プロスタグランジンＨシンターゼ又はシクロオキシゲナーゼ（ＰＧＨＳ／ＣｙＯｘ）、リノール酸ジオールシンターゼ（ＬＤＳ）、それらの機能的変異体、並びにそれらの組合せからなる群から選択される一つ以上の酵素を含む酵素的酸化組成物を用いた５－ヒドロキシメチルフルフラールの酵素的酸化により中間体を生成することと、金属触媒を用いて前記中間体を酸化して２，５－フランジカルボン酸を形成することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0008】

開示される方法及びシステムの態様の詳細な説明のため、添付の図面が参照される。

【0009】

【図1】例１のサンプルのグルコース変換における特異的活性のグラフである。

【図2】例２のサンプルのグルコース及びグルコネート変換における特異的活性のグラフである。

【図3】０．５％及び２％グルコースに対するＧＡＯ－Ｍｕｔ４７及びＧＡＯ－Ｍｕｔ１０７の活性のグラフである。

【図4】パール（Parr）反応におけるグルコースの残存濃度のプロットである。

【図5】グルコース及び酸化誘導体に対する酸化酵素の特異的活性のプロットである。

【図6】グルコジアルドース又はグルコースの反応におけるピラノースオキシダーゼのＨＰＬＣ－ＭＳトレースの編集物である。

【図7】本明細書で開示される種類の化学酵素的方法のプロセスフロー図の一態様である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本明細書で使用される用語をより明確に定義するため、以下の定義が提供される。異なる定義が示されない限り、以下の定義が本開示に適用可能である。ある用語が本開示に使用されているものの、本明細書で具体的に定義されていない場合、IUPAC Compendium of ChemicalTerminology, 2^nd Ed (1997)における定義が本明細書において適用される他の開示や定義と矛盾せず、また、その定義が用いられる請求項が不明確化せず、実施不能にならない限り、当該定義が利用可能である。

【0011】

周期表の元素群は、Chemical and Engineering News,63(5), 27, 1985に公表された元素の周期表の版に示される命番方式を用いて示される。場合により、元素群は中でもグループに与えられた一般的な名称、例えば、グループ１の元素にアルカリ金属、グループ２の元素にアルカリ土類金属、グループ３～１２の元素に遷移金属、グループ１７の元素にハロゲン、を用いて示すこともできる。

【0012】

請求項の移行の用語又は文言に関して、「含む（including）」、「含有する（containing）」、「備える（having）」、又は「特徴とする（characterized by）」と同義である移行の用語「有する（comprising）」は、包括的又はオープンエンドであり、付加的な記述の無い要素又は方法の工程を除外しない。移行の用語「～のみからなる（consisting of）」は請求項で特定されていない要素、工程、又は成分を除外する。移行の文言「基本的に～からなる（consisting essentially of）」は、請求項の範囲を、特定された物質又は工程と、請求項に記載の発明の基本的で新規な特徴に実質的に影響を与えない物質又は工程とに限定する。文言「基本的に～からなる」は、「～のみからなる」形式で記載された閉鎖型の請求項と「有する」形式で記載された完全な開放型の請求項との間の中間に該当する。反対の表示が無い場合、「基本的に～からなる」化合物又は組成物を記載することは「有する」と解釈されることは無いが、用語が適用される組成又は方法を著しく変更しない要素を含む記載された構成要素を指すことを意図する。組成又は方法が、様々な要素又は工程を「有する」文言で記載されている場合、当該組成及び方法は様々な要素又は工程「から基本的になる」又は「のみからなる」であってもよい。

【0013】

上述の通り、ＦＤＣＡを生成するための従来の方法は、一般に２つの主要な競合する経路、１）ＨＭＦ中間体を介するフルクトースの酸化及び脱水、２）フラン形成を促進するためのアルダル酸のＣ２又はＣ５の位置におけるケトン形成、を含む。現在までのところ、ＦＤＣＡのための経路の大半はＨＭＦ中間体を介するものである。しかし、ＦＤＣＡを生成するための最新の化学的方法は、厳しい反応条件（例えば、高温）が必要であり、所望の生産物に対して選択性が低いという特徴がある。そのため、新規で費用対効果が高いＦＤＣＡの製造方法に対する需要が存在する。

【0014】

本明細書の開示内容は、ＦＤＣＡを製造する化学酵素的方法である。ある態様では、ＦＤＣＡを生成する化学酵素的方法は、グルコースをマルチ酵素システム（ＭＥＳ）、酸触媒、及び金属触媒と接触させることにより、最終産物である二酸を生成することを含む。ある態様では、金属触媒は不均一系であり、あるいは、金属触媒は均一系である。この方法の一態様をスキームＩに示す。スキームＩを参照すると、本方法では、Ｄ－グルコースがガラクトースオキシダーゼ（ＧＡＯ）の変異体を用いて酸化されることにより、Ｄ－グルコジアルドースを形成する。ピラノースオキシダーゼ（ＰＯＸ）は、Ｄ－グルコジアルドースを２－ケト－グルコジアルドースに変換するために使用される。この分子は、その後に不均一系の貴金属触媒により二酸に変換され、酸触媒を用いてフランの形態に変換される。効率的な閉環はジアルデヒドの代わりに二酸を要してもよく、これは、酸触媒による反応の前に不均一系触媒による酸化が進行することを意味する。しかし、そうではなく、２，５－フランジカルボキシアルデヒド（ＤＦＦ）の形成を促進するために２－ケト－グルコジアルドースが十分に高い割合で適切なフランを抽出できる場合、スキームIIに示されるように金属酸化の前に酸触媒の工程を実施してもよい。

【0015】

ＦＤＣＡの製造のための別の態様では、Ｄ－グルコースをガラクトースオキシダーゼ（ＧＡＯ）の変異体を用いて酸化することにより、Ｄ－グルコジアルドースを形成する。次に、グルカル酸デヒドラターゼ（ＧｌｕｃＤ）と呼ばれる酵素によりケト基が形成される。これはスキームIIIに示す。この酵素はグルコジアルドースを脱水して、４－ヒドロキシル基を水として除去する一方で５－ケト基を形成する。スキームIIに記載の反応サイクルと同様に、末端のアルデヒドの閉環及び酸化は酸触媒及び不均一系の貴金属触媒により進行する。閉環と末端の酸化の工程の順番は逆であってもよい。

【0016】

さらに別の態様では、Ｄ－グルコースはＧＡＯにより酸化されることにより、グルコジアルドースを形成する。グルコジアルドースは、その後に金属触媒を用いてグルカル酸へと酸化され、５－ケト－４－デオキシ－グルコジアルドースを形成する。５－ケト－４－デオキシ－グルコジアルドースは続いて閉環されることによりＦＤＣＡを形成する。これをスキームIIIに示す。

【0017】

更に別の態様では、Ｄ－グルコースはＰＯＸにより酸化されることにより、２－ケトグルコースを形成し、次に閉環されてＤＦＦを形成する。ＤＦＦは、上述したように、その後に酸化されてＦＤＣＡを形成できる。これはスキームIVに示す。

【0018】

本開示の方法は化学酵素的であり、酵素、一つ以上の酸触媒、及び一つ以上の金属触媒の組合せを利用する。ある態様では、触媒はガラクトースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、グルカル酸デヒドラターゼ、カタラーゼ、又はそれらの組合せを含む。ある態様では、一つ以上の酸触媒、一つ以上の金属触媒、又はその両方は、均一系である。別の態様では、一つ以上の酸触媒、一つ以上の金属触媒、又はその両方は、不均一系である。

【0019】

ある態様では、ＭＥＳは銅ラジカルオキシダーゼファミリーのメンバーを含む。例えば、限定はしないが、本開示における使用に適した銅ラジカルオキシダーゼはガラクトースオキシダーゼ（ＧＡＯ、EC 1.1.3.9）である。ＧＡＯは、メカニズムの解析と実際の用途の両方に関して最も広く研究されているアルコールオキシダーゼの一つである。銅ラジカルオキシダーゼファミリーの他のメンバーも本開示の発明に使用するのに適している。

【0020】

ＧＡＯはいくつかの真菌の種、特にフザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）（ジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ともいう）から分泌され、過酸化水素を生じる一方で第一級アルコールのアルデヒドへの酸化を触媒することにより、細胞外の炭化水素である食料源の分解を促進する。ＧＡＯの本来の機能は、Ｃ６の位置でＤ－ガラクトースを酸化して、Ｄ－ガラクト－ヘキソジアルドースを生成することである。一般に、小分子（フェリシアン化カリウム）又は補助酵素（すなわち、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、又はＨＲＰ）を含むことにより、ＧＡＯ活性を向上できる。通常、ＨＲＰはＧＡＯの１０分の１（重量％）を反応系に添加する。カタラーゼも過酸化水素を分解するために添加される。ＧＡＯは特異的ではないものの、天然型は、活性部位におけるＦ４６４及びＦ１９４とグルコースのエクアトリアルのＣ４のヒドロキシル基が立体的に衝突するため、グルコースに結合できない。Ｄ－グルコースを基質として受容してＣ６のアルデヒドを形成するようＧＡＯを加工する試みにより、表１に示される向上した活性が得られた。Ｍ－ＲＱＷ変異体（Ｒ３３０Ｋ，Ｑ４０６Ｔ，Ｗ２９０Ｆ）は１．６Ｕｍｇ^－１の特異的活性を示した。別の変異体Ｄｅｓ３－２（Ｑ３２６Ｅ，Ｙ３２９Ｋ，Ｒ３３０Ｋ）は、グルコースに対して天然型より４倍高い活性を示した。更に、Ｃ３８３Ｓの変異は、触媒の銅イオンの結合を改善して非天然型の基質であるグアーガム及びメチルガラクトースに対する酵素のＫ_Ｍを低下させることにより、触媒効率を最高で３倍に向上することが見出された。表１及び表２は、本開示の方法において有用な複数のＧＡＯ変異体のリストである。
表１

表２

【0021】

ある態様では、本開示における使用に適したＧＡＯは配列番号１から配列番号６のいずれかの配列を有する。

【0022】

ある態様では、ＭＥＳはピラノースオキシダーゼ（EC 1.1.3.10）を含む。ピラノースオキシダーゼ（ＰＯＸ）はフラビン依存性酸化還元酵素であり、酸化還元酵素のグルコース－メタノール－コリン（ＧＭＣ）スーパーファミリーのメンバーである。ＰＯＸは、酸素を過酸化水素に還元すると同時に、Ｄ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－キシロースを含む複数の単糖類を酸化する。例えば、リグノセルロース分解菌において、リグニンを溶解する際に、ＰＯＸは過酸化水素の形成と同時に２－ケトグルコースへのα又はβ－Ｄ－グルコースの酸化を触媒する。

【0023】

菌類において、ＰＯＸは、菌糸の周辺質空間において膜に結合する小胞又は他の膜構造体と細胞外で相互作用している。ＰＯＸホモログは、放線菌（actinobacteria）、プロテオバクテリア（protobacteria）、バシラス網（bacilli）種でも発見されている。Spongipellis unicolor(別名、Polyporus obtusus)、Phanerochaete chrysosporium（PDB 4MIF）、Trametes multicolor（別名、Trametes ochracea PDB 1TT0）、Peniophora gigantea（PDB 1TZL）、Aspergillusnidulans、A. oryzae、Irpex lacteus、Arthrobactersiccitolerans、及びKitasatospora aureofaciens（別名、Streptomyces aureofaciens）由来のＰＯＸ酵素は特徴が明らかにされている。大半のＰＯＸ酵素はヒスチジンに共有結合したＦＡＤを有するホモ四量体として存在しているが、例外もある。ＰＯＸは溶液中では単量体であり、ＦＡＤと非共有結合により結合している。ＫａＰＯＸは溶液中で二量体を形成している。この酸化活性に加えて、ＰＯＸは様々なキノン又は（複合型の）金属イオンを含む代替の電子受容体で顕著な活性を示す。ある態様では、本開示における使用に適したＰＯＸは配列番号７から配列番号１１のいずれかの配列を有する。

【0024】

ある態様では、ＭＥＳはグルカル酸デヒドラターゼ（EC 4.2.1.40）を含む。ＧｌｕＤは機構的に多様なエノラーゼスーパーファミリー、具体的にはグルカル酸デヒドラターゼサブグループに属する。ＧｌｕＤは、二つの基質のエピメリ化と同様に、５－ケト－４－デオキシグルカレート（ＫＤＧ）を形成するためのＤ－グルカレート及びＬ－イダレート（L-idarate）の両方の脱水を触媒する。第１の工程では、３３９番目のヒスチジン残基がＤ－グルカレートのＣ５原子に対して一般塩基として作用し、２０７番目のリジンが関連するエピマーであるＬ－イダレートに対して一般塩基として作用する。それぞれの残基は異なる立体選択的な機能に関連しており、２０７番目のリジンはＳ特異的な塩基として機能するのに対し、３３９番目のヒスチジンはＲ特異的な塩基として機能する。エノラートアニオン中間体は、触媒として必須である二価のＭｇカチオンとの相互作用と同様に、２０５番目のリジン及び２３７番目のアスパラギン残基に対する水素結合により安定化する。

【0025】

ある態様では、本開示のＭＥＳはカタラーゼ（EC 1.11.1.61）を含む。ＣＡＴは、全ての好気性生物に存在する四量体のヘム含有抗酸化酵素である。カタラーゼは、Ｈ_２Ｏ_２の水及び酸素への分解を触媒する。

【0026】

ある態様では、ＭＥＳ中に存在する酵素は野生型、その機能的断片、又はその機能的変異体のいずれでもよい。本明細書で用いられる場合、「断片（fragment）」は全長の酵素（例えばＡＯＸ）よりも短いアミノ酸配列を有することを意味するが、該断片は使用者の目的又は処理の目的を十分に満たす触媒活性を維持する。断片は、酵素の一部の配列と一致する単一の連続する配列を有してもよい。あるいは、断片は複数の異なる短い部分を含み、各部分のアミノ酸配列が酵素の配列の異なる部分と一致し且つ酵素とは異なる配列のアミノ酸で連結されていてもよい。本明細書において、酵素の「機能的変異体（functional variant）」は、保存的又は非保存的なアミノ酸の挿入、欠損、又は置換が一か所以上で生じているポリペプチドを指し、この種の変化は配列中に、一度又は複数回において、単独で又は一つ以上の他の変異と組み合わさって生じてもよいが、触媒活性を維持する。

【0027】

代替物又は上記変異との組み合わせにおいて、ＭＥＳ中の酵素は変異することにより触媒活性が向上する場合がある。変異はタンパク質又はホモログの活性を向上するため、生成物及び／又は過酸化水素の存在下でのタンパク質の安定性の向上するため、及びタンパク質の生産量を増加させるために実施してもよい。

【0028】

本明細書では、生体触媒又は酵素の「源（source）」に言及する。これは名前の付いた生物によって発現される生体分子を指すことと理解される。酵素は生物から得られるか、適切な発現システムに適した構成物として前記酵素（野生型又は組換え型）の態様で提供されると考えられる。

【0029】

ある態様では、本明細書で開示される種類の酵素は、適切な発現ベクターにクローニングされ、E. coli、Saccharomyces sp.、Pichia sp.、Aspergillussp.、Trichoderma sp.、又はMyceliophthora sp.等の発現システムの細胞を形質転換するために使用してもよい。「ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウィルスコンストラクト、又はコスミド等の別のＤＮＡ断片を組み込めるレプリコンである。ベクターは、細胞内でＤＮＡ断片を変換して発現するために使用される。本明細書で使用される場合、用語「ベクター」及び「コンストラクト（construct）」はプラスミド、ファージ、ウィルスコンストラクト、コスミド、大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）等の少なくとも一つの遺伝子発現カセットをライゲーションできるレプリコンを含む。本明細書において、例えばトランスフェクション試薬との複合体として又はウイルス粒子に内包されて核酸が細胞内に導入されると、細胞は外因性又は異種の核酸によって「形質転換」される。形質転換するＤＮＡは細胞のゲノムに融合（共有結合により連結）されてもよいし、されなくてもよい。

【0030】

ある態様では、本明細書で開示される酵素の遺伝子はベクター中に組換え配列として提供されており、該配列は一つ以上の制御又は調節配列に機能するよう連結されている。「機能するよう連結されている」発現制御配列は、目的の遺伝子を制御するために反対側に位置して又は距離を隔てて作用する発現制御配列と同様に、目的の遺伝子を制御するために発現制御配列が目的の遺伝子と隣接する結合を指す。

【0031】

用語「発現制御配列」又は「調節配列」は、交換可能に使用されており、機能するように連結されたコード配列の発現に影響を与えるのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後の処理、及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列は、適切な転写の開始、終結、プロモータ、及びエンハンサ配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナル等の効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上する配列（例えばリボソーム結合領域）；タンパク質の安定性を向上する配列；及び、必要な場合には、タンパク質分泌を促進する配列を含む。そのような制御配列の性質は宿主の生物によって異なる。原核生物の場合、そのような制御配列は、通常、プロモータ、リボソーム結合領域、及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最低でも、その存在が発現に必須である全ての要素を含むことを意図しており、その存在が有利に働く付加的な要素、例えばリーダー配列及び融合相手の配列を含んでもよい。

【0032】

本明細書で使用される用語「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主システム」、「発現システム」、又は単に「宿主細胞」）は、組換えベクターが導入された細胞を指すことを意図する。それらの用語は特定の対象細胞のみではなく、その細胞の子孫も指すことが理解される。ある種の変更が変異又は環境の影響により次代以降で生じる可能性があるため、実際にはその子孫は親細胞と一致しないかもしれないが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲に含まれる。組換え宿主細胞は、単離した細胞又は培養された細胞株であってもよいし、生体組織又は生物中に存在する細胞であってもよい。

【0033】

ある態様では、本明細書で開示される形態のＭＥＳにおける使用に適した酵素は一つ以上の精製した補因子を含む。本明細書において、「補因子」は、酵素の生物学的活性を調節するタンパク質ではない化学物質を指す。多くの酵素が正常に機能するために補因子を必要とする。本開示における使用に適した精製された酵素の補因子の非限定的な例は、チアミンピロリン酸、ＮＡＤ^＋、ＮＡＤＰ^＋、ピリドキサールリン酸、メチルコバラミン、コバラミン、ビオチン、コエンザイムＡ、テトラヒドロ葉酸、メナキノン、アスコルビン酸、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、及びコエンザイムＦ４２０を含む。このような補因子は、ＭＥＳに含まれてもよく、及び／又は、反応中の様々な時点で添加されてもよい。ある態様では、ＭＥＳに含まれる補因子は、酸素で容易に再生できてもよく、及び／又は、酵素の寿命全体において安定であってもよい。

【0034】

一つ以上の態様において、ＭＥＳの酵素成分は、使用者及び／又は方法に求められる触媒活性を提供するのに十分な量がＭＥＳ中及び／又は反応混合物中に存在する。そのような態様では、本明細書に開示される酵素は、ＭＥＳの総重量に対して約０．０００１重量％～約１重量％、又は約０．０００５重量％～約０．１重量％、又は約０．００１重量％～約０．０１重量％の範囲で存在してもよい。

【0035】

スキームIからVに示す反応において、ＭＥＳは最初にグルコースを酸化するために作用し、グルコースは続いて反応がなされて脱水される中間体を形成する。例えば、本開示の方法は、ＤＦＦを形成するための中間体である５－ケト－４－デオキシグルカレート、５－ケト－４－デオキシグルコジアルドース、２－ケト－グルコジアルドース、２－ケト－グルカル酸、及び／又は２－ケト－グルコースの脱水を含む。ある態様では、脱水は酸触媒の存在下で実施される。

【0036】

ある態様では、上述の中間体の脱水を促進するために使用される酸触媒は、ブレンステッド酸である、又は、反応混合物中でプロトン又はヒドロニウムイオンを供給する能力を特徴とする強力なブレンステッド酸領域を含有する。本開示における使用に適したブレンステッド酸は、グルカル酸におけるフラン形成で試験される均一系の酸触媒又は不均一系の酸触媒を含む。ある態様では、酸触媒はイオン交換樹脂（DIAIONシリーズ、Amberlyst-15など）、スルホン化シリカ、ゼオライト、酸化ニオブ、HCl等の鉱酸、又はそれらの組合せを含む。ある態様では、酸触媒は中間体の変換を触媒するのに効果的な量が存在する。ある態様では、酸触媒はジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシド等の好適な溶媒中に存在する。例えば、酸触媒は反応混合物の総重量に対して約０．１～０．２重量％、又は約０．００１～約２．０重量％、又は約０．００１～約２０重量％で存在する。

【0037】

本開示の一つ以上の態様では、スキームIからIVに示すように、最後の酸化工程が行われることにより、アルデヒドはカルボン酸に変換される。本開示のある態様では、酸化は金属触媒、又は担持金属触媒を用いて行ってもよい。ある態様では、金属触媒は、不均一系金属触媒又は均一系金属触媒（ＨＭＣ）等の担持金属触媒を含む。ある態様では、担体は、炭素、シリカ、アルミナ、チタニア（ＴｉＯ_２）、ジルコニア（ＺｒＯ_２）、ゼオライト、又はそれらの組合せを含み、それらは、担体の総重量に対して約１．０重量％未満、又は約０．１重量％未満、又は約０．０１重量％未満のＳｉＯ_２バインダを含む。

【0038】

好適な担持物質は、主にメソポーラス又はマクロポーラスであり、ほぼミクロ細孔がない。例えば、担体は約２０％未満のミクロ細孔を有してもよい。ある態様では、ＨＭＣの担体は、多孔質のナノ粒子の担体である。本明細書で使用される場合、用語「ミクロ細孔」は、ＩＵＰＡＣに規定されるように、窒素吸着及び水銀圧入法で測定される直径が２ｎｍ未満の細孔を指す。本明細書で使用される場合、用語「メソ細孔」は、ＩＵＰＡＣに規定されるように、窒素吸着及び水銀圧入法で測定される直径が約２ｎｍから約５０ｎｍの細孔を指す。本明細書で使用される場合、用語「マクロ細孔」は、ＩＵＰＡＣに規定されるように、窒素吸着及び水銀圧入法で測定される直径が５０ｎｍより大きい細孔を指す。

【0039】

ある態様では、ＨＭＣ担体は、平均孔径が約１０ｎｍから約１００ｎｍであり、表面積が約２０ｍ^２ｇ^－１より大きく且つ約３００ｍ^２ｇ^－１より小さいメソポーラスの炭素押出成形物を含む。本開示における使用に適した担体は、いかなる好適な形状であってもよい。例えば、担体は０．８～３．０ｍｍの三葉状（trilobe）、四葉状（quadralobe）、又はペレット状の押出成形物に成形されてもよい。そのように成形された担体により固定式トリクルベッド反応器の使用が可能になるため、最後の酸化工程を連続するフローで実施できる。

【0040】

ある態様では、ＨＭＣは主要なIV、V、VI族の金属を含有し、又は、金属はI、IV、V、VII亜族であり、又は、ＨＭＣは金Ａｕを含有する。一つ以上の態様では、金属は８族の金属（例えば、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ）、三番目の遷移金属、早期遷移金属、又はそれらの組合せを含有する。別の態様では、脱水触媒は、ゼオライト又はβ－ゼオライト等の担体上にハフニウム、タンタル、亜鉛、又はその組み合わせを有する。ある態様では、本開示における使用に適した金属触媒は、金属酸化物、アルカリ土類要素でドープされたジルコニア、希土類オルトリン酸触媒、ルテニウム、又はそれらの組合せを含有する。

【0041】

ＨＭＣは、任意の好適な方法を用いて調製できる。例えば、ＨＭＣは、約２００℃～約６００℃の範囲の温度の水素中で金属塩が浸透した担体（例えば炭素）の気相還元を用いて調製してもよい。別の態様では、ＨＭＣは、約０℃～約１００℃の温度で酸素化物（例えば、ギ酸、グルコン酸、クエン酸、エチレングリコール等）の水溶液に浸された金属塩が浸透した担体の液相還元を用いて調製してもよい。または、浸透した担体は、非還元状態で水素化反応器に投入され、開始時に方法の反応物によってストリーム上で還元することもできる。液相還元（ＬＰＲ）は、押出成形物の周面に活性冶金のコア－シェル分散を形成する合成方法である。

【0042】

ある態様では、本明細書で開示される種類の材料は、押出成形物の担体への金属前駆体塩溶液の初期の湿潤又は大部分の吸着後に、Ｈ_２／Ｎ_２雰囲気下における１００℃～５００℃での気相還元（ＧＰＲ）又はアルカリ水溶液を用いた液相還元（ＬＰＲ）を実施することにより調製される。

【0043】

一つ以上の別の態様では、本開示の方法は、中間体を生成するために穏やかな反応条件においてＨＭＦを酵素により酸化することを含む。ある態様では、本開示の方法は、ＦＤＣＡを生成するために金属触媒又は不均一系金属触媒（ＨＭＣ）による中間体の酸化を更に含む。このスキームの概要をスキームVに示す。

【0044】

理論による限定は望まないが、それぞれ実行される酸化により一般に過酸化水素の分子を一つ生じるオキシダーゼは、過酸化水素を別の酸化を触媒するためのオキシダントとして利用するペルオキシゲナーゼ又はペルオキシダーゼと組み合わせることもできる。これは、溶液から高反応性の過酸化水素を除去するのみではなく、ペルオキシゲナーゼ／ペルオキシダーゼの機能に必要な過酸化物を供給する。

【0045】

ある態様では、ＦＤＣＡを生成する方法は、酵素的酸化組成物（ＥＯＣ）によるＨＭＦの酵素的酸化を含む。ある態様では、ＥＯＣは、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＡＡＯ）、クロロペルオキシダーゼ（ＣＰＯ）、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＨＭＦＯ）、グリオキサールオキシダーゼ（ＧＬＯＸ）、ペリプラズムアルデヒドオキシダーゼ（ＰａｏＡＢＣ）、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＵＰＯ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、活性化酵素であるホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）有り無し両方のガラクトースオキシダーゼ（ＧＡＯ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、ヨウ化物ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、オボペルオキシダーゼ、唾液ペルオキシダーゼ、バナジウムハロペルオキシダーゼ、非哺乳類脊椎動物のペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）、ペルオキシダシン（Ｐｘｄ）、微生物のペルオキシン（Ｐｘｃ）、無脊椎動物のペルオキシネクチン（Ｐｘｔ）及びショートペルオキシドケリン（ＰｘＤｏ）、ショートペルオキシドケリン（Ｐｘｔ）、アルファ－ジオキシゲナーゼ（ａＤｏｘ）、デュアルオキシダーゼ（ＤｕＯｘ）、プロスタグランジンＨシンターゼ、シクロオキシゲナーゼ（ＰＧＨＳ／ＣｙＯｘ）、リノール酸ジオールシンターゼ（ＬＤＳ）、それらの機能的変異体、並びにそれらの組合せからなる群から選択される一つ以上の酵素を含有する。本明細書で開示される種類の酵素は適切な供給源から単離可能である。本開示における使用に適した酵素の非限定的な例をそれらの触媒効率（Kcat）と共に表３に示す。また、表３は酵素により触媒されるスキームIの工程を示す。
表３

【0046】

本明細書において、Kcatは回転率、回転頻度、又は回転数を指す。この定数は、１個の酵素分子が単位時間当たり（通常は１分又は１秒当たり）に生成物へと変換できる基質分子の数を表す。

【0047】

当業者が本開示の利点と共に理解するように、本明細書に開示される種類の反応（例えば、ＨＭＦのＡＡＯ酸化）は、反応混合物の他の成分に有害な影響を与え得る副産物の生成を引き起こす場合がある。例えば、過酸化水素はＥＯＣの酵素を分解し、酵素の効率を低減する可能性がある。その様な態様では、過酸化水素の有害な影響はカタラーゼ（EC 1.11.1.61）の導入などによって軽減可能である。カタラーゼは過酸化水素を分解するのみではなく、オキシダーゼを機能させるための酸素を生成する。

【0048】

ある態様では、本開示のＥＯＣは、(i)オキシダーゼと(ii)ペルオキシダーゼと(iii)カタラーゼを含有する。あるいは、本開示のＥＯＣは、(i)オキシダーゼと(ii)ペルオキシゲナーゼと(iii)カタラーゼ、(i)オキシダーゼと(ii)ペルオキシダーゼ、(i)オキシダーゼと(ii)ペルオキシゲナーゼ、オキシダーゼ、又は、ペルオキシダーゼを含有する。これらの酵素はそれぞれ本明細書で開示された種類であってもよい。

【0049】

ある態様では、本開示のＥＯＣの一つ以上の酵素は、約９ｓ^－１以上、又は約５０ｓ^－１以上、又は約１００ｓ^－１以上のKcatを有する特徴がある。

【0050】

ある態様では、本明細書で開示される種類のＥＯＣは、ＨＭＦをＦＤＣＡに変換する際の中間体の生成に使用されてもよい。本明細書で開示される種類のＥＯＣを用いて生成可能な中間体の非限定的な例は、ジホルミルフラン（ＤＦＦ）、５－ヒドロキシメチル－２－フロ酸（ＨＭＦＣＡ）、及び５－ホルミル－２－フランカルボン酸（ＦＦＣＡ）を含む。ある態様では、本開示のＥＯＣは、ＨＭＦと反応する際に、ジホルミルフラン（ＤＦＦ）、５－ヒドロキシメチル－２－フロ酸（ＨＭＦＣＡ）、及び５－ホルミル－２－フランカルボン酸（ＦＦＣＡ）からなる群から選択される一つ以上の中間体を形成する。ＥＯＣとＨＭＦとの反応により生じる中間体（例えば、ジホルミルフラン）は、ＦＤＣＡを生成するために遷移金属触媒を用いて更に酸化されてもよい。

【0051】

ある態様では、本明細書に開示される種類の化学酵素的方法は好適な反応器中で実施される。好適な反応器の一態様を図７に図示する。図７を参照すると、第１の酵素反応器４０は、スパージャ式の気泡塔、エアリフトカラム、撹拌スパージャ式のバイオリアクタ、又は流下液膜式の高圧酸化容器であってもよい。反応物であるグルコース及びＭＥＳは、貯留容器１０及び２０からそれぞれ導管５及び７を介して反応器に導入される。ある態様では、酵素反応器４０は約１００℃未満の温度、又は約２０～約６０℃の温度において、約１～約１５バールの圧力下で作動される。ある態様では、酵素反応器４０内において、グルコースはＧＡＯ及びＨＲＰによってＤ－グルコジアルドースへと酵素的に変換され、また、過酸化水素を分解して酵素を安定化するためにカタラーゼも存在する。更に、酵素反応器４０は、エアーコンプレッサ３０によって導管９を介して供給される両方の圧縮空気を（酸素分子のために）注入されてもよい。図示しないが、強酸、塩基、又は緩衝液の添加によりｐＨを調節可能である。酵素反応器４０からの流出物は、酵素反応器内の酵素を保護するために導管１３を介してタンジェンシャルフローフィルタ（ＴＦＦ）４５に送られ、導管１１を介して残余分としてリサイクルされる。Ｄ－グルコジアルドースの浸透物は導管１７を介して第２の酵素反応器６０へと流下する。

【0052】

第２の酵素反応器６０は、スパージャ式の気泡塔、エアリフトカラム、撹拌スパージャ式のバイオリアクタ、又は流下液膜式の高圧酸化容器であってもよい。ある態様では、第２の酵素反応器６０は、約１００℃未満の温度、又は約２０～約６０℃の温度において、約１～約１５バールの圧力下で作動される。第２の酵素反応器６０内において、Ｄ－グルコジアルドースがＰＯＸにより２－ケト－グルコジアルドースへと酵素的に変換され、また、過酸化水素を分解して酵素を安定化するためにカタラーゼも存在する。スキームIIIに示す別の態様では、ＧｌｕｃＤがＰＯＸの代わりになる。第２の酵素反応器６０は、（酸素分子のために）圧縮空気が注入されてもよい。図示しないが、強酸、塩基、又は緩衝液の添加によりｐＨを調節可能である。第２の酵素反応器６０からの流出物は、酵素反応器内の酵素を保護するために導管２１を介してＴＦＦ５５に送られ、導管１９を介して残余分をリサイクルする。２－ケト－グルコジアルドースの浸透物は導管２３を介して金属酸化反応器６５及び脱水反応器７０へと流下する。

【0053】

ある態様では、第２の酵素反応器６０からの浸透物は、２－ケト－グルコジアルドースが２－ケト－グルカル酸に変換される金属酸化反応器６５に向けて下流に供給される。一つ以上の態様では、酸化反応器６５は、本明細書で開示される種類の金属触媒を用いたトリクルベッド反応器として作動される。酸化反応器６５は、頂部から２－ケトグルコジアルドースが供給され、底部から（酸素分子を供給するために）高圧の空気が供給されることにより、適切な層の湿潤と物質移動を確保できる。酸化反応器６５は、約１００～約２００℃の温度において、約１０～約１００バールの圧力で稼働されてもよい。ある態様では、反応器の生成物は、底部から回収されて、脱水反応器７０へと送られる。

【0054】

金属酸化反応器６５を出た２－ケト－グルカル酸は、脱水反応器７０において脱水されることによりＦＤＣＡに変換される。ある態様では、脱水反応器７０は、上流側又は下流側の構成で作動される。脱水反応器７０は、本明細書で上述したように、固定された強酸交換触媒を備えている。脱水反応器７０は、約１６０～約２００℃の温度で作動する。例えば、脱水反応は、高圧で液状の水を用いて行われてもよい。

【0055】

ある態様では、脱水反応器の生成物は、副産物の不純物と共に、水とＦＤＣＡの混合物を含む。脱水反応器の生成物ストリームは、導管３７を介して水晶析ユニット７５、溶媒晶析ユニット８０、及びヌッチェ（Nustche）フィルタ８５からなる精製列に移される。水に対するＦＤＣＡの溶解度は温度に強い相関関係があるため、水晶析ユニット７５は冷却晶析装置又は冷却真空晶析装置であってもよい。ある態様では、ＦＤＣＡの結晶はその後に濾過により分離され、第２の有機溶媒晶析装置に送られる。

【0056】

有機溶媒晶析装置８０において、溶媒は１－ブタノール、イソブタノール、メタノール、又は他の好適な有機溶媒であってもよい。理論により限定されることは望まないが、水と溶媒との間で切り替えることにより、母液中の異なる不純物を除去することができる。ＦＤＣＡは、その後に冷却又は真空結晶化により晶析され、結晶は回収されてヌッチェフィルタ８５に送られる。有機溶媒は、非揮発性の不純物を除去するために、蒸留により回収及び再生できる。

【0057】

ＦＤＣＡの結晶は、その後にヌッチェフィルタ８５で洗浄されることにより、残留する不純物が除去される。アセトニロリルのような極性の非プロトン性溶媒は、（１）水、極性のプロトン性溶媒、又は１－ブタノール、非極性のプロトン性溶媒中において前段階で回収されなかった不純物を溶媒和にするため、及び（２）ＦＤＣＡはアセトニトリル中で僅かにしか溶解しないため、使用可能である。ヌッチェフィルタ８５を通過したアセトニトリルは、その後に非揮発性の不純物を除去するために蒸留により再生可能である。高純度のＦＤＣＡの結晶は、その後にヌッチェフィルタ８５から最終産物として回収される。

【0058】

上述の図はプロセスフロー図レベルの詳細であるが、スピルバック、ブロックアンドブリード、リサイクルライン、制御弁、冷却／加熱機構、ポンプ、中間タンク、消泡機構などの全ての処理の相互接続が示されているわけではない。

【0059】

ある態様では、本明細書で開示される方法は、高純度のＦＤＣＡを調製できる。例えば、ＦＤＣＡは、約８０％より高い純度、約８５％より高い純度、約９５％より高い純度、約８０％～約９９％の純度、約８５％～約９９％の純度、又は約９０％～約９９％の純度を有する。

【0060】

追加の開示
本開示の以下に列挙される態様は、非限定的な例として提供される。

【0061】

第１の態様は、２，５－フランジカルボン酸を製造する化学酵素的方法であって、（i）ガラクトースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、グルカル酸デヒドラターゼ、カタラーゼ、及びそれらの組合せから基本的になる群から選択される少なくとも２つの酵素をＤ－グルコースと接触させることにより中間体を生成すること、及び（ii）前記中間体を金属触媒及び酸触媒と接触させることにより２，５－フランジカルボン酸を形成することを含む。

【0062】

第２の態様は第１の態様の化学酵素的方法であって、Ｄ－グルコースはＤ－グルコジアルドースを形成するためにガラクトースオキシダーゼ及びカタラーゼと接触され、前記方法は、２－ケト－グルコジアルドースの形成に適した条件下でＤ－グルコジアルドースをピラノースオキシダーゼ及びカタラーゼと接触させること、２－ケト－グルコジアルドースを不均一系金属触媒と接触させて２－ケト－グルカル酸を形成すること、及び、酸触媒の存在下で２－ケトグルカル酸を脱水して２，５－フランジカルボン酸を形成することを更に含む。

【0063】

第３の態様は第１又は第２の態様の化学酵素的方法であって、Ｄ－グルコースはＤ－グルコジアルドースを形成するためにガラクトースオキシダーゼ及びカタラーゼと接触され、前記方法は、２－ケト－グルコジアルドースの形成に適した条件下でＤ－グルコジアルドースをピラノースオキシダーゼ及びカタラーゼと接触させること、酸触媒の存在下で２－ケト－グルコジアルドースを脱水して２，５－フランジカルボキシアルデヒドを形成すること、及び、不均一系金属触媒の存在下で２，５－フランジカルボキシアルデヒドを酸化して２，５－フランジカルボン酸を形成することを更に含む。

【0064】

第４の態様は第１から第３の態様のいずれかの化学酵素的方法であって、Ｄ－グルコースはＤ－グルコジアルドースを形成するためにガラクトースオキシダーゼ及びカタラーゼと接触され、前記方法は、Ｄ－グルコジアルドースを金属触媒と接触させることによりＤ－グルカル酸を形成すること、グルカル酸デヒドラターゼによりＤ－グルカル酸を脱水して５－ケト－４－デオキシグルコジアルドースを形成すること、及び、酸触媒の存在下で５－ケト－４－デオキシグルコジアルドースを閉環して２，５－フランジカルボン酸を形成することを更に含む。

【0065】

第５の態様は第１から第４の態様のいずれかの化学酵素的方法であって、Ｄ－グルコースは２－ケト－グルコースを形成するためにピラノースオキシダーゼ及びカタラーゼと接触され、前記方法は、２，５－フランジカルボキシアルデヒドの形成に適した条件下で酸触媒により２－ケト－グルコースを脱水すること、５－ケト－４－デオキシグルコジアルドースを酸触媒で脱水して２，５－フランジカルボキシアルデヒドを形成すること、及び、不均一系金属触媒の存在下で２，５－フランジカルボキシアルデヒドを酸化して２，５－フランジカルボン酸を形成することを更に含む。

【0066】

第６の態様は第１から第５の態様のいずれかの化学酵素的方法であって、ガラクトースオキシダーゼは配列番号１から配列番号６のいずれかの配列を有する。

【0067】

第７の態様は第２の態様の化学酵素的方法であって、ガラクトースオキシダーゼは配列番号１から配列番号６のいずれかの配列を有する。

【0068】

第８の態様は第３の態様の化学酵素的方法であって、ガラクトースオキシダーゼは配列番号１から配列番号６のいずれかの配列を有する。

【0069】

第９の態様は第４の態様の化学酵素的方法であって、ガラクトースオキシダーゼは配列番号１から配列番号６のいずれかの配列を有する。

【0070】

第１０の態様は第５の態様の化学酵素的方法であって、ガラクトースオキシダーゼは配列番号１から配列番号６のいずれかの配列を有する。

【0071】

第１１の態様は第１から第５の態様のいずれかの化学酵素的方法であって、ガラクトースオキシダーゼは配列番号１の配列を有する。

【0072】

第１２の態様は第１から第１１の態様のいずれかの化学酵素的方法であって、ピルビン酸－２－オキシダーゼは配列番号７から配列番号１１のいずれかの配列を有する。

【0073】

第１３の態様は第１から第１２の態様のいずれかの化学酵素的方法であって、約１００℃未満の温度で実施される。

【0074】

第１４の態様は第１から第１３の態様のいずれかの化学酵素的方法であって、２，５－フランジカルボン酸は約８０％より高い純度を有する。

【0075】

第１５の態様は第２の態様の化学酵素的方法であって、２，５－フランジカルボン酸は約８０％より高い純度を有する。

【0076】

第１６の態様は第３の態様の化学酵素的方法であって、２，５－フランジカルボン酸は約８０％より高い純度を有する。

【0077】

第１７の態様は第４の態様の化学酵素的方法であって、２，５－フランジカルボン酸は約８０％より高い純度を有する。

【0078】

第１８の態様は第５の態様の化学酵素的方法であって、２，５－フランジカルボン酸は約８０％より高い純度を有する。

【0079】

第１９の態様は第１から第１８の態様のいずれかの化学酵素的方法であって、不均一系金属触媒は、炭素、シリカ、アルミナ、チタニア（ＴｉＯ_２）、ジルコニア（ＺｒＯ_２）、ゼオライト、又はそれらの組合せを含有する担体を有する。

【0080】

第２０の態様は第１から第１９の態様のいずれかの化学酵素的方法であって、酸触媒、金属触媒、又はその両方は不均一系である。

【0081】

第２１の態様は第１から第２０の態様のいずれかの化学酵素的方法であって、酸触媒、金属触媒、又はその両方は均一系である。

【0082】

第２２の態様は２，５－フランジカルボン酸を製造する化学酵素的方法であって、アリール－アルコールオキシダーゼ（ＡＡＯ）、クロロペルオキシダーゼ（ＣＰＯ）、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ（ＨＭＦＯ）、グリオキサールオキシダーゼ（ＧＬＯＸ）、ペリプラズムアルデヒドオキシダーゼ（ＰａｏＡＢＣ）、非特異的ペルオキシゲナーゼ（ＵＰＯ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、活性化酵素であるホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）有り無し両方のガラクトースオキシダーゼ（ＧＡＯ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、ヨウ化物ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、オボペルオキシダーゼ、唾液ペルオキシダーゼ、バナジウムハロペルオキシダーゼ、非哺乳類脊椎動物のペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）、ペルオキシダシン（Ｐｘｄ）、微生物のペルオキシン（Ｐｘｃ）、無脊椎動物のペルオキシネクチン（Ｐｘｔ）及びショートペルオキシドケリン（ＰｘＤｏ）、ショートペルオキシドケリン（Ｐｘｔ）、アルファ－ジオキシゲナーゼ（ａＤｏｘ）、デュアルオキシダーゼ（ＤｕＯｘ）、プロスタグランジンＨシンターゼ又はシクロオキシゲナーゼ（ＰＧＨＳ／ＣｙＯｘ）、リノール酸ジオールシンターゼ（ＬＤＳ）、それらの機能的変異体、並びにそれらの組合せからなる群から選択される一つ以上の酵素を含有する酵素的酸化組成物を用いて５－ヒドロキシメチルフルフラールを酵素的酸化して中間体を形成することと、金属触媒を用いて中間体を酸化して２，５－フランジカルボン酸を形成することを含む。

【0083】

第２３の態様は第２２の態様の化学酵素的方法であって、化学的酸化は約１００℃未満の温度で実施される。

【0084】

第２４の態様は第２２又は第２３の態様の化学酵素的方法であって、２，５－フランジカルボン酸は約８０％より高い純度を有する。

【0085】

第２５の態様は第１から第２４の態様のいずれかの化学酵素的方法であって、２，５－フランジカルボキシル（2,5-furandicarboxylic）を水晶析、溶媒晶析、及びヌッチェろ過に供することを更に含む。

【0086】

実施例
ここで開示される発明は一般的な態様で説明されたが、以下の例は発明の具体的な態様として提供され、その実施及び利点を示す。これらの例は説明のために提供されており、どのような態様でも明細書又は請求の範囲を限定することを意図しない。

【0087】

例１
グルコースに対する表１の変異体の特異的活性が解析された。その結果を図１に示す。グルコースをグルコジアルドースに変換可能な他のＧＡＯ変異体を作成した。指向性進化及び理論的な酵素開発により、改善されたＧＡＯ変異体はグルコースに対して３５Ｕｍｇ^－１の特異的活性を示した。触媒の銅から１０Å内の３０か所の指向性進化が、元となる配列に施され、該配列は以下の追加変異：１）Ｒ３３０、Ｑ４０６Ｔ、２）により発見されたＷ２９０Ｆ、２）Ｃ３８３Ｓ、及び３）Ｙ４０５Ｆ，Ｑ４０６Ｅを含む。表４に記載の他の変異は、グルコジアルドース生成活性に対する中立的な又は有害な効果を有することが見出された。我々は新たな組み合わせ配列にＧＡＯ－Ｍｕｔ１と名付けた。発現した構造の全配列は配列番号１に表されており、それはE.coliで発現及び精製するための“ＭＧＨＨＨＨＨＨＳＳＧＨＩＥＧＲＨＭ”のＮ末端ヒスチジンタグ及びリンカーを含む。

【0088】

ＮＮＳコドンを含むプライマを用いたQUIKCHANGE法により、ＧＡＯ－Ｍｕｔ１中の選択した位置の合計２０個のアミノ酸に対して変異を入れた。その後、構成物を以下のようにスクリーニングした。コロニーを採取し、溶原培地（ＬＢ）を入れた９６ディープウェルプレートのそれぞれのウェルに播種した。そして、成長したクローンをタンパク質発現用の別々の９６ディープウェルプレート中の自動誘導培地に播種した。回収した細胞を微生物タンパク質抽出試薬（Ｂ－ＰＥＲ）で溶解した後、過酸化水素を検出する比色ＡＢＴＳアッセイにより溶解物をオキシダーゼ活性でスクリーニングした。

【0089】

簡潔に述べると、溶解物は加熱の有無それぞれで活性を測定された。加熱せずに活性を測定するために、溶解物は５０倍に希釈された。５μＬの希釈溶解物はＡＢＴＳ試験溶液（最終濃度、２ｗ／ｖ％のグルコース、０．０１２５ｍｇ／ｍｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ、ｐＨ８の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．０５％のＡＢＴＳ）と混合されて２００μＬの最終量に調節され、反応が終了するまで４０５ｎｍの吸光度の変化を観測した。加熱した後の残存活性を測定するため、５０μＬの溶解物が５０℃で１０分加熱され、２０μＬの加熱処理された溶解物がＡＢＴＳ溶液に添加された後に、４０５ｎｍの吸光度の変化を観測した。ΔＡ４０５／分を測定するための曲線の直線部分を利用し、４０５ｎｍにおけるＡＢＴＳの吸光係数を３６．８ｍＭ^－１ｃｍ^－１とみなす以下の式から特異的な活性を算出した。

【0090】

ＧＡＯ－Ｍｕｔ１より高いΔＡ４０５／分を示す変異体の溶解物が更なる特性解析のために選択された。ＤＮＡ配列解析による変異の同定の後、成功したものが発現、精製され、特異的な活性と熱安定性が測定された。熱安定性は、最大活性の半分の活性が観察される温度（Ｔ_５０）で評価された。変異体は、２４ウェルプレートにおいて自動誘導培地を用いた５ｍＬの培養から精製された。回収された細胞はＢ－ＰＥＲで溶解され、溶解物は４℃で１５，０００相対遠心力（ｒｃｆ）で３０分間遠心沈殿された。溶解物の上澄みをHisPur（商標）のNi-NTA Spin Plateを用いたタンパク質精製に使用した。溶出したタンパク質のサンプルを０．５ｍＭのＣｕＳＯ_４を含むｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液で希釈し、特異的な活性をＡＢＴＳアッセイにより測定した。Ｔ_５０は、基質の不存在下でタンパク質を加熱し、冷却し、その後にＡＢＴＳアッセイにより残存活性を測定することで解析した。加熱は、ｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸緩衝液にタンパク質を２．５ｍｇ／Ｌの濃度になるよう希釈し、５０μＬずつ９６ウェルＰＣＲプレートの１列に分注し、１０分間における最高及び最低の酵素作用を捕捉するのに十分な温度勾配をかけてインキュベーションすることにより実施した。加熱後すぐに混合物は氷上で冷却され、２００μＬの最終量のＡＢＴＳ溶液中の２０μＬの酵素溶液のΔＡ４０５／分が上述のように測定された。

【0091】

成功したものは精製され、活性及びＴ_５０を試験され、指向性進化の工程から最終的な最良の変異体を作成するために遺伝子操作された。Ｍｕｔ１を基にして有益に組み合わせられた有望な点変異体はＡ１９３Ｒ、Ｄ４０４Ｈ、Ｆ４４１Ｙ、Ａ１７２Ｖを含んでおり、それらを表４に列挙する。これらの変異はＧＡＯ－Ｍｕｔ４７と名付けられた単一の組合せ変異体中で組み合わせられており、該変異体は、２７．３Ｕｍｇ^－１の特異的活性及び５６．８℃のＴ_５０を示した。表３は、実施された点変異とそれらの特性の一覧である。
表４

【0092】

例２
グルコース基質を更に受容し且つ安定な変異を特定するためのＧＡＯの合理的な改変を、構造と多重整列（ＭＳＡ）のデータに基づく算出方法の組合せで行った。ＧＡＯ－Ｍ－ＲＱＷ－Ｓがグルコースとグルコネートの両方を基質として受容し得ることを特定した。結果を図２に示す。合理的な設計は、ＧＡＯ－Ｍｕｔ１よりもＧＡＯ－Ｍ－ＲＱＷ－Ｓ配列に対して行われた。採用した構造的手法は、ＧＡＯ－Ｍ－ＲＱＷ－Ｓの変異を含むよう改変されたタンパク質データベース（ＰＤＢ）構造２ＷＱ８にFoldX55（４０個の予測の変異）とPROSS56（８０個の変異）を適用する工程を含んだ。ＭＳＡを基にした予測は１８５個のメンバーのＭＳＡに適用された。このＭＳＡはJALVIEWによって精選された最初のセットである１０００個の配列から生成されることにより、９８％の余分な配列を除去し、炭化水素のオキシダーゼとして実験的に実証された配列のみを維持した。ＨＩＶ感染症治療薬であるイスラトラビルの中間体を合成するためのＧＡＯの設計において同定された３０の変異もパネルに追加された。

【0093】

指向性進化のクローンをスクリーニングするための上述の方法と同じ方法を用いて、合計で２０２個の点変異体がスクリーニングされた。３９個の目的物が最初のスクリーニングで特定され、２回目のスクリーニングで１６個が特定された。指向性進化工程由来の最良の組合せ変異体（ＧＡＯ－Ｍｕｔ４７）を基にした組合せ変異体の生成により、Ｎ６６Ｓ、Ｓ３０６Ａ、Ｓ３１１Ｆ、及びＱ４８６Ｌの変異は補足的及び有益であり、Ｎ２８Ｉ、Ｙ１８９Ｗ、Ｓ３３１Ｒ、Ａ３７８Ｄ、及びＲ４５９Ｑはこの配列において有害と思われた。結果を表５に纏めた。Ｍｕｔ４７の変異とＮ６６Ｓ、Ｓ３０６Ａ、Ｓ３１１Ｆ、及びＱ４８６Ｌとを含む最終的なＧＡＯ－Ｍｕｔ１０７構造は、図３に示すように、２％グルコースに対して３４．９６Ｕｍｇ^－１の特異的活性と６０．５６℃のＴ_５０を示した。機械学習アルゴリズムで特定された追加の変異が後で導入され、ＧＡＯ－ｍｕｔ１４２及びＧＡＯ－ｍｕｔ１６４を作成した。
表５

太字の変異は、Ｍｕｔ４７配列において有益なＡ１９３Ｒ、Ｄ４０４Ｈ、Ｆ４４１Ｙ、Ａ１７２Ｖである。
ａ：データは他のデータから別々の実験で収集された。向上率は基にしたＭｕｔ４７コントロールと比較して算出した。
ｂ：データは他のデータから別々の実験で収集された。向上率は基にしたＭｕｔ４７コントロールと比較して算出した。

【0094】

例５
５０ｍｌの反応が１００ｐｓｉに加圧された２００ｍＬの容器内で行われた。ｐＨ８の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、５０μＭのＣｕＳＯ_４、１５ｗ／ｖ％のグルコース、０．００５ｗ／ｖ％のカタラーゼ、０．００１％のホースラディッシュペルオキシダーゼ、及び０．００１ｗ／ｖ％の遺伝子操作されたＧＡＯが容器に入れられた。反応物は、１１℃で４８時間にわたって５００ｒｐｍで撹拌された。そして、０、２４、４８時間の時点でサンプルが採取され、残存グルコースを測定するためにＨＰＬＣで試験された。その結果を図４に示す。開始物質の量は４８時間で１５％から５．７％（ｗ／ｖ）に低下した。

【0095】

例４
ＰＯＸによるグルコジアルドースからの２－ケト－グルコジアルドースの生成
ＰＯＸがＤ－グルコース又はＤ－グルコジアルドースをどのようにスキームIIIにおいて有用な生成物に変換するかを特定するために、市販のＰＯＸ酵素を入手して、ｐＨ６の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中に２０ｍＭの濃度でＤ－グルコース、Ｄ－グルコジアルドース、２－ケト－Ｄ－グルコネート、２－ケト－Ｄ－グルコース、又は５－ケト－Ｄ－グルコースを用いた室温における比色用の２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチオアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）反応に使用した。グルコースをＣ１の位置でグルコノラクトンへと酸化することが周知のグルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）及びＧＡＯ変異体がコントロールとして試験に用いられた。簡潔に述べると、４倍の原液が調製され、最終反応濃度が２０ｍＭの基質、０．０２５ｍｇ／ｍｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ｐＨ６の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、及び０．１％（ｗ／ｖ）ＡＢＴＳに希釈された。この溶液は、反応を開始するために０．８μｇ／ｍｌの最終濃度になるよう酵素と混合され、マイクロタイタープレート測定器においてＡ４０５を測定しながら２５分間保温された。特異的活性は以下の式で計算された。

【0096】

活性スクリーニングの結果は、グルコジアルドースから２－ケト－グルコジアルドースを生成するためにＰＯＸを使用するポテンシャルを示した。ＰＯＸは、グルコジアルドースに対して８．８Ｕ／ｍｇの特異的活性（自然のままのグルコース基質に対する７７％の作用）を示した。この特異的活性は、変異により改善可能であった。結果を表６及び図５に示す。２－ケトグルコース、２－ケトグルコネート、及び５－ケトグルコネートはＰＯＸの基質ではなかった。いずれのＧＡＯ酵素も２－ケト－グルコースに対して活性が無かった。このデータから、２－ケト－グルコジアルドースの製造は、基質がグルコジアルドースを生成するためにＧＡＯを含む第１の反応器を通過した後に２－ケト－グルコジアルドースを生成するためにＰＯＸを含む第２の反応器に通されるデュアルリアクタシステム内で実施可能である。一つの酵素酸化反応器を介した製造は、２－ケト－グルコジアルドースを基質として受容可能なＧＡＯの開発が必要である。期待された通り、ＧＯＸは天然の基質であるグルコースに対して高い活性を示した。
表６

【0097】

生成物の性質をＨＰＬＣ－ＭＳを用いて調べた。９６ウェルマイクロタイタープレートに入れられた０．１％（ｗ／ｖ）のＰＯＸ、１０％（ｗ／ｖ）の基質、０．００５％（ｗ／ｖ）のカタラーゼ、及びｐＨ６．０の８０ｍＭリン酸カリウム緩衝液を含有する５０μｌの反応物が、以下の方法で解析された：移動相Ａ：５０ｍＭギ酸アンモニウム＋１％ギ酸の水溶液、移動相Ｂ：１％ギ酸のアセトニトリル溶液、カラム温度：５０℃、カラム：Torus2-Pic １．７μｍ、３．０ｍｍ×１５０ｍｍ、選択イオン測定：１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５を実施、コーン電圧：デフォルト値。

【0098】

前記方法の時間経過を表７に示す。
表７

【0099】

期待される２－ケト－グルコジアルドース生成物に相当する１７５ｍ／ｚチャンネルにおけるピークが早くも５４分で検出され、グルコジアルドース（１７７ｍ／ｚ）の消失に伴い成長し続けた。これらの結果を図６に示す。ネガティブイオンモードにおけるマスチャンネルは、上から下に向かって１７３、１７５、１７７、１７９、１９３、１９５ｍ／ｚに相当する。１７３ｍ／ｚチャンネルは、グルコースの０．９、１．６、又は２．８時間の反応において示されていない。

【0100】

グルコジアルドースは、通常、１７７ｍ／ｚのチャンネルに３個のピークを示しており、それらは異なる閉環形状の化合物に相当する可能性がある。最も保持時間が長いグルコジアルドースのピークは他のピークよりもゆっくりと消失しており、これはＰＯＸが基質の幾つかの形状を他の形状よりも好むことを示唆しており興味深い。複数のピークが１９３ｍ／ｚチャンネルに出現しており、該ピークはグルクロニック（glucuronic）又はグルクロン酸に相当する可能性がある。

【0101】

本明細書に開示の発明の態様が上述されたが、該発明の意図及び教示を逸脱することなく当業者はその改変が可能である。本明細書で説明された態様は単なる例示であり、限定することを意図しない。本明細書で開示された発明の多数の変更及び改変が可能であり、開示された発明の範囲に属する。数値範囲又は数値限定が明確に記載されている場合、そのように表現される範囲又は限定は、明確に記載された範囲又は限定内に入る同程度の反復する範囲又は限定を含む（例えば、約１から約１０は２，３，４等を含み、０．１０より大きいは０．１１、０．１２、０．１３等を含む）と理解されなければならない。請求項の構成要素に対する用語「任意」の使用は、対象の要素が必要である、又は必要でないことを意味することを意図する。両方の選択肢が請求項の範囲に属することを意図している。「有する（comprise）」、「含有する（includes）」、「備える（having）」等の広範な用語の使用は、「からなる（consistingof）」、「基本的に～からなる（consisting essentially of）」、「実質的に～からなる「comprisedsubstantialy of」」等の狭小な用語に対するサポートを提供すると理解されなければならない。

【0102】

したがって、保護の範囲は上述の説明で限定されることはなく、請求項の発明の全ての均等物を含む範囲である以下の請求項によってのみ限定される。それぞれ及び全ての請求項は、本開示の態様として明細書に援用される。そのため、請求項は更なる説明であり、本発明の態様の追加である。本明細書における参考文献、特に、本願の優先日後の発行日を有する参考文献の説明は、ここで開示された発明に対する従来技術とは認めない。本明細書で引用した全ての特許、特許出願、及び公報の開示内容は、本明細書に記載の内容に対してそれらが例示的な方法の又は他の詳細な事項を補う限度において、参照によって援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

2023517621000001.app

【国際調査報告】