▶ リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-26
(54)【発明の名称】抗薬物抗体アッセイにおける標的干渉の軽減方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20230419BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20230419BHJP
A61K 39/395 20060101ALN20230419BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
G01N33/543 501A
A61K39/395 D
A61K39/395 N
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022555946
(86)(22)【出願日】2021-03-16
(85)【翻訳文提出日】2022-10-11
(86)【国際出願番号】 US2021022623
(87)【国際公開番号】W WO2021188587
(87)【国際公開日】2021-09-23
(31)【優先権主張番号】62/990,681
(32)【優先日】2020-03-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】507302748
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】チェン ジフア
(72)【発明者】
【氏名】ケンドラ キンバリー
(72)【発明者】
【氏名】トーリ アルバート
(72)【発明者】
【氏名】サムナー オリヴェイラ ジアーニ
【テーマコード（参考）】
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
(57)【要約】
本発明は、医薬の投与によって誘導される抗薬物抗体を、検出、定量化または特徴付けるための方法およびシステムを提供する。方法およびシステムは、競合標的結合に基づく、可溶性標的の存在下での血清試料中の抗薬物抗体の検出を改善するための、標的の結合パートナーおよび／または補助因子の使用を含む。方法およびシステムには、検出を改善するための免疫枯渇の使用も含まれる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の抗薬物抗体を同定する方法であって、以下：前記試料を第１の標識された薬物と接触させることと；
前記試料を第２の標識された薬物と接触させることと；
前記試料を標的の結合パートナーと接触させることと；
前記第１の標識された薬物と前記抗薬物抗体と前記第２の標識された薬物とを含む複合体の存在を検出することと
を含み、
前記試料が、前記抗薬物抗体および前記標的を含み、
前記標的が、前記薬物の結合パートナーである、方法。
【請求項2】
前記標的と前記標的の前記結合パートナーとの間の結合を強化するために、前記試料を補助因子と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
弱酸性アッセイｐＨ下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
抗標的抗体を使用して前記標的を除去することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記抗標的抗体が、固体支持体に付着している、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記第１の標識された薬物が、ルテニウム標識された薬物またはビオチン化薬物である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記第２の標識された薬物が、ルテニウム標識された薬物またはビオチン化薬物である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記標的の前記結合パートナーが、天然の結合パートナーである、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記標的の前記結合パートナーが、前記標的の受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記標的が、可溶性多量体標的である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記弱酸性アッセイｐＨが、約ｐＨ４．５～約ｐＨ６．５の範囲にある、請求項３に記載の方法。
【請求項12】
前記弱酸性アッセイｐＨが、約ｐＨ６．０である、請求項３に記載の方法。
【請求項13】
前記弱酸性アッセイｐＨが、約ｐＨ５．０である、請求項３に記載の方法。
【請求項14】
前記薬物が、化学化合物、核酸、毒素、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、または医薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記薬物が、抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記試料が、血清試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
試料中の抗薬物抗体を同定するためのシステムであって、以下：第１の標識された薬物と；
第２の標識された薬物と；
標的の結合パートナーと；
前記第１の標識された薬物と前記抗薬物抗体と前記第２の標識された薬物とを含む複合体の存在を検出するためのアッセイシステムと
を含み、
前記試料が、前記抗薬物抗体および前記標的を含み、
前記標的が、前記薬物の結合パートナーである、システム。
【請求項18】
前記標的と前記標的の前記結合パートナーとの間の結合を強化することができる補助因子をさらに含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項19】
前記試料が、弱酸性アッセイｐＨを有する溶液で処理される、請求項１７に記載のシステム。
【請求項20】
抗標的抗体をさらに含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項21】
前記抗標的抗体が、固体支持体に付着している、請求項２０に記載のシステム。
【請求項22】
前記第１の標識された薬物が、ルテニウム標識された薬物またはビオチン化薬物である、請求項１７に記載のシステム。
【請求項23】
前記第２の標識された薬物が、ルテニウム標識された薬物またはビオチン化薬物である、請求項１７に記載のシステム。
【請求項24】
前記標的の前記結合パートナーが、天然の結合パートナーである、請求項１７に記載のシステム。
【請求項25】
前記標的の前記結合パートナーが、前記標的の受容体である、請求項１７に記載のシステム。
【請求項26】
前記標的が、可溶性多量体標的である、請求項１７に記載のシステム。
【請求項27】
前記弱酸性のアッセイｐＨが、約ｐＨ４．５～約ｐＨ６．５の範囲にある、請求項１９に記載のシステム。
【請求項28】
前記弱酸性のアッセイｐＨが、約ｐＨ６．０である、請求項１９に記載のシステム。
【請求項29】
前記弱酸性のアッセイｐＨが、約ｐＨ５．０である、請求項１９に記載のシステム。
【請求項30】
前記薬物が、化学化合物、核酸、毒素、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、または医薬である、請求項１７に記載のシステム。
【請求項31】
前記薬物が、抗体である、請求項１に記載のシステム。
【請求項32】
前記試料が、血清試料である、請求項１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
分野
本発明は、概して、医薬の投与によって誘導される抗薬物抗体を、特徴付け、同定し、かつ／または測定するための方法およびシステムに関する。これらの方法およびシステムは、競合リガンド結合に基づいている。
本発明は、概して、医薬の投与によって誘導される抗薬物抗体を、特徴付け、同定し、かつ／または測定するための方法およびシステムに関する。これらの方法およびシステムは、競合リガンド結合に基づいている。
【背景技術】
【0002】
背景
抗薬物抗体（ＡＤＡ）は、薬物有効性の低減、内因性タンパク質への交差反応、または治療用タンパク質の薬物動態の変化などのいくつかの臨床的結果に寄与する可能性があるため、医薬の投与によって、例えば、ＡＤＡの誘導によって誘導される抗体の存在に起因する、薬物有効性および患者の安全性について懸念がある。ＦＤＡは、安全性および有効性に影響する、治療用タンパク質製品と関連する有害な免疫学的関連応答に関する免疫応答を、評価および軽減するためのリスクベースのアプローチを採用することを推奨している。（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ａｕｇｕｓｔ ２０１４，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（非特許文献1））
抗薬物抗体（ＡＤＡ）は、薬物有効性の低減、内因性タンパク質への交差反応、または治療用タンパク質の薬物動態の変化などのいくつかの臨床的結果に寄与する可能性があるため、医薬の投与によって、例えば、ＡＤＡの誘導によって誘導される抗体の存在に起因する、薬物有効性および患者の安全性について懸念がある。ＦＤＡは、安全性および有効性に影響する、治療用タンパク質製品と関連する有害な免疫学的関連応答に関する免疫応答を、評価および軽減するためのリスクベースのアプローチを採用することを推奨している。（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ａｕｇｕｓｔ ２０１４，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（非特許文献1））
【0003】
モノクローナル抗体、酵素製品、サイトカイン、成長因子および毒素を含む免疫原性データを評価および報告するために、１２１品目のＦＤＡ承認生物製剤の処方情報およびＦＤＡの臨床薬理学的レビューが再検討された。最も報告頻度が高かったのは、免疫原性の発生についてであった。ＡＤＡの臨床的意義は不明であった。全体的に、製品の全身クリアランスの増加とＡＤＡと関連する有効性の低減との間に、顕著な一致があった。（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｉｍｐａｃｔｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｔｈｅ ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ．２０１６；１８（２）：３９５－４０３（非特許文献2））
【0004】
免疫応答の生物学的複雑性は、ＡＤＡの薬物動態への影響を評価する際の課題を提示するが、これは、薬物動態曝露が、ＡＤＡ効果を評価するための有効性エンドポイントよりも感度が高くなり得るためである。ＡＤＡを特徴付け、識別し、かつ／または測定するための方法およびシステム、例えば、ＡＤＡ検出の方法およびシステムを改善するための必要性が存在することが、認識されるであろう。これらの方法およびシステムは、薬物投与、例えば生物製剤の投与のための薬物動態、有効性、および安全性に関連する臨床薬理学における免疫原性影響に関する貴重な情報を提供することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ａｕｇｕｓｔ ２０１４，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ
【非特許文献2】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｉｍｐａｃｔｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｔｈｅ ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ．２０１６；１８（２）：３９５－４０３
【発明の概要】
【0006】
概要
モノクローナル抗体などの生物学的製剤は、がん、心血管疾患、感染症または自己免疫障害などの広範囲の病態にわたって臨床応用を有する治療用タンパク質である。タンパク質医薬の免疫原性の発生は、タンパク質医薬の投与によって誘導される抗体、例えば、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の存在を特徴付けることに対する需要の増加をもたらした。ＡＤＡの特徴付けおよび測定データは、薬物の安全性を向上させるための医薬の免疫原性の理解を提供することができる。
モノクローナル抗体などの生物学的製剤は、がん、心血管疾患、感染症または自己免疫障害などの広範囲の病態にわたって臨床応用を有する治療用タンパク質である。タンパク質医薬の免疫原性の発生は、タンパク質医薬の投与によって誘導される抗体、例えば、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の存在を特徴付けることに対する需要の増加をもたらした。ＡＤＡの特徴付けおよび測定データは、薬物の安全性を向上させるための医薬の免疫原性の理解を提供することができる。
【0007】
本明細書に開示される例示的な実施形態は、医薬の投与によって誘導されるＡＤＡを特徴付け、同定し、かつ／または測定するための方法およびシステムを提供することによって、前述の需要を満たす。本開示は、試料中の抗薬物抗体を同定する方法であって、以下：
試料を第１の標識された薬物と接触させることと；
試料を第２の標識された薬物と接触させることと；
試料を標的の結合パートナーと接触させることと；
第１の標識された薬物と抗薬物抗体と第２の標識された薬物とを含む複合体の存在を検出することと
を含み、試料が抗薬物抗体および標的を含み、標的が薬物の結合パートナーである、方法を提供する。
試料を第１の標識された薬物と接触させることと；
試料を第２の標識された薬物と接触させることと；
試料を標的の結合パートナーと接触させることと；
第１の標識された薬物と抗薬物抗体と第２の標識された薬物とを含む複合体の存在を検出することと
を含み、試料が抗薬物抗体および標的を含み、標的が薬物の結合パートナーである、方法を提供する。
【0008】
いくつかの例示的な実施形態において、試料中の抗薬物抗体を同定する方法は、標的と標的の結合パートナーとの間の結合を強化するために、試料を補助因子と接触させることをさらに含む。いくつかの態様において、試料中の抗薬物抗体を同定する方法は、弱酸性のアッセイｐＨ下で実施される。
【0009】
いくつかの態様において、試料中の抗薬物抗体を同定する方法は、抗標的抗体を使用して標的を除去することをさらに含み、抗標的抗体は、固体支持体に結合される。
【0010】
いくつかの態様において、本方法の第１の標識された薬物または第２の標識された薬物は、ルテニウム標識された薬物またはビオチン化薬物である。いくつかの態様において、本方法の標的の結合パートナーは、天然結合パートナーまたは標的の受容体であり、標的は、可溶性多量体標的である。
【0011】
いくつかの態様において、本方法の弱酸性のアッセイｐＨは、約ｐＨ４．５～約ｐＨ６．５の範囲にあり、約ｐＨ６．０であるか、または約ｐＨ５．０である。
【0012】
いくつかの態様において、本方法の薬物は、化学化合物、核酸、毒素、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、または医薬である。いくつかの態様では、本方法の薬物は、抗体であり、試料は、血清試料である。
【0013】
本開示は、少なくとも部分的に、試料中の抗薬物抗体を同定するためのシステムであって、以下：
第１の標識された薬物と；
第２の標識された薬物と；
標的の結合パートナーと；
第１の標識された薬物と抗薬物抗体と第２の標識された薬物とを含む複合体の存在を検出するためのアッセイシステムと
を含み、試料が、抗薬物抗体および標的を含み、標的が、薬物の結合パートナーである、システムを提供する。
第１の標識された薬物と；
第２の標識された薬物と；
標的の結合パートナーと；
第１の標識された薬物と抗薬物抗体と第２の標識された薬物とを含む複合体の存在を検出するためのアッセイシステムと
を含み、試料が、抗薬物抗体および標的を含み、標的が、薬物の結合パートナーである、システムを提供する。
【0014】
いくつかの例示的な実施形態において、本システムは、標的と標的の結合パートナーとの間の結合を強化することができる補助因子をさらに含む。いくつかの態様において、本システムの試料は、弱酸性のアッセイｐＨを有する溶液で処理される。いくつかの態様において、本システムは、抗標的抗体をさらに含み、抗標的抗体は、固体支持体に付着している。
【0015】
いくつかの態様において、本システムの第１の標識された薬物または第２の標識された薬物は、ルテニウム標識された薬物またはビオチン化薬物である。いくつかの他の態様において、本システムの標的の結合パートナーは、天然結合パートナーまたは標的の受容体であり、標的は、可溶性多量体標的である。
【0016】
いくつかの態様において、本システムの弱酸性のアッセイｐＨは、約ｐＨ４．５～約ｐＨ６．５の範囲にあり、約ｐＨ６．０であるか、または約ｐＨ５．０である。
【0017】
いくつかの態様において、本システムの薬物は、化学化合物、核酸、毒素、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、または医薬である。他の態様において、本システムの薬物は抗体であり、本システムの試料は血清試料である。
【0018】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の説明および添付の図面と併せて考慮される場合に、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態および多数の具体的な詳細を示すが、例証として与えられ得るものであり、限定するものではない。多くの置換、修正、追加、または再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】例示的な実施形態により、架橋ＡＤＡアッセイを実施するための中性のアッセイｐＨ下では、多量体標的タンパク質が、ルテニウム標識された薬物およびビオチン化薬物に同時に結合することができるため、血清試料中の可溶性多量体標的の存在に起因する標的媒介性シグナルの存在を示す。例示的な実施形態により、架橋ＡＤＡアッセイへの、薬物標的の天然結合パートナーおよび補助因子の組み込みは、弱酸性のアッセイｐＨの下で、標的媒介性シグナルを軽減することができる。
【図2】図２Ａは、例示的な実施形態により、サルナイーブ血清試料における標的干渉を軽減するための、対照（Ｃｔｒｌ）と比較した、１００μｇ／ｍＬでのいくつかの抗標的抗体、例えば、Ａｂ１－Ａｂ９のスクリーニングを示す。図２Ｂは、例示的な実施形態により、サルのナイーブ血清試料における標的干渉を軽減するための、市販のポリクローナル抗標的抗体の使用を示す。
【図3】例示的な実施形態により、標的媒介性シグナルを軽減することによってＡＤＡの検出を改善するための、架橋ＡＤＡアッセイへの標的受容体の組み込みを示す。
【図4】図４Ａは、例示的な実施形態により、標的媒介性シグナルを軽減することによってＡＤＡの検出を改善するための、架橋ＡＤＡアッセイへの標的受容体および補助因子の組み込みを示す。例示的な実施形態により、架橋ＡＤＡアッセイを実施するための、５０μｇ／ｍＬの可溶性標的受容体を含有する溶液に、異なる濃度の補助因子タンパク質を添加した。図４Ｂは、例示的な実施形態により、８つのナイーブサル血清試料（対照）において任意のブロッカータンパク質の非存在下で、広範囲の様々な範囲の標的媒介性アッセイシグナルが検出されたことを示す。標的受容体（５０μｇ／ｍＬ）および補助因子（５０μｇ／ｍＬ）の存在は、例示的な実施形態により、すべてのサル血清試料における標的媒介性アッセイシグナルの効果的な軽減を示す。
【図5】例示的な実施形態により、４つの実験設計を使用した架橋ＡＤＡアッセイにおける、標的干渉を軽減するためのアッセイｐＨの最適化を示す。例示的な実施形態により、４つの実験設計は、（１）中性ｐＨ（対照）での、４つのサルナイーブ血清試料、（２）中性ｐＨでの、５０μｇ／ｍＬの受容体および５０μｇ／ｍＬの補助因子を有する、４つのサルナイーブ血清試料、（３）弱酸性ｐＨ（約ｐＨ６．０）での、４つのサルナイーブ血清試料、ならびに（４）約ｐＨ６．０での、５０μｇ／ｍＬの受容体および５０μｇ／ｍＬの補助因子を有する、４つのサルナイーブ血清試料であった。
【図6】図６Ａは、例示的な実施形態により、５０μｇ／ｍＬの受容体および補助因子タンパク質の両方を使用してＡＤＡアッセイを実行したときの、異なるアッセイｐＨ条件下での、組換え標的タンパク質を使用した標的許容レベルの決定を示す。図６Ｂは、例示的な実施形態により、ＭＡＢ－Ｙ Ｆａｂ免疫化ウサギからの早期出血を使用した、異なるアッセイｐＨ条件下での、ＡＤＡシグナルの検出を示す。
【図7】図７Ａは、例示的な実施形態により、単回用量の薬物、例えば、ＭＡＢ－Ｙを投与された、２匹のサルの血清試料中の薬物濃度を示す。ＬＬＯＱは定量下限を示す。図７Ｂは、例示的な実施形態により、投与後サル試料を使用した、ＡＤＡ検出を改善するための、架橋ＡＤＡアッセイへの標的受容体、補助因子、および弱酸性アッセイｐＨの組み込みを含む、異なるアッセイ条件を有する、０日目、２８日目および５２日目の試料における、標的濃度およびＡＤＡシグナルを示す。
【図8】例示的な実施形態により、ＭＡＢ－Ｙの単回用量が与えられた３名の対象の、血清試料中の薬物濃度を示す。ＬＬＯＱは定量下限を示す。
【図9】例示的な実施形態により、ＡＤＡ検出を改善するための、架橋ＡＤＡアッセイへの標的受容体、補助因子、および弱酸性アッセイｐＨの組み込みを含む、異なるアッセイ条件を有する、０日目、２９日目、および６４日目の試料における、標的濃度およびＡＤＡシグナルを示す。
【図10】図１０Ａは、例示的な実施形態により、薬物の無いナイーブヒト血清試料中の標的媒介性シグナルを排除するための、中性アッセイｐＨでの、ＭＡＢ－Ａコンジュゲート磁気ビーズによる、標的タンパク質の免疫枯渇を示す。図１０Ｂは、例示的な実施形態により、ベースライン血清試料中の標的媒介性シグナルを排除するための、中性アッセイｐＨでの、ＭＡＢ－Ａコンジュゲート磁気ビーズによる、標的タンパク質の免疫枯渇を示す。
【図11】例示的な実施形態により、異なるアッセイ条件下、例えば、中性アッセイｐＨ下でブロッカーなし、中性アッセイｐＨ下で１００μｇ／ｍＬのＭＡＢ－Ａあり、弱酸性ｐＨ（ｐＨ約６．０）下でブロッカーなし、および弱酸性ｐＨ（ｐＨ約６．０）下で１００μｇ／ｍＬのＭＡＢ－Ａあり、で測定した、４匹のサル由来の１日目、１５日目、２９日目、および５７日目の試料における、ＡＤＡアッセイシグナルを示す。
【図12】例示的な実施形態により、弱酸性アッセイｐＨ下での、ＭＡＢ－Ａコンジュゲート磁気ビーズによる免疫枯渇の前後の、１日目、１５日目、２９日目、および５７日目の試料における、標的濃度およびＡＤＡアッセイシグナルを示す。
【図13】例示的な実施形態により、異なるｐＨ条件下での、ベースライン試料および投与後試料における、ＭＡＢ－Ａコンジュゲート磁気ビーズを使用した、免疫枯渇を示す。
【図14】例示的な実施形態により、弱酸性アッセイｐＨ下での、可溶性受容体（５０μｇ／ｍＬ）および補助因子（５０μｇ／ｍＬ）を含む競合ブロッカーＡＤＡ法および修飾免疫枯渇法を使用した、ＡＤＡ陽性対象由来の、１日目、１５日目、２９日目および５７日目の試料における、真のＡＤＡシグナルの検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
詳細な説明
タンパク質医薬の免疫原性の発生に起因する薬物有効性および患者安全性についての懸念の増加は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）を特徴付けることに対する需要の増加をもたらした。ＡＤＡを特徴付けることの需要は、例えば、薬物有効性の低減、内因性タンパク質への交差反応、または医薬の薬物動態の改変に対するＡＤＡの影響を理解する必要性によって推進される。ＡＤＡの特徴付けデータは、医薬の免疫原性に関する貴重な情報を提供することができ、したがって、薬物投与の安全性を強化することができる。
タンパク質医薬の免疫原性の発生に起因する薬物有効性および患者安全性についての懸念の増加は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）を特徴付けることに対する需要の増加をもたらした。ＡＤＡを特徴付けることの需要は、例えば、薬物有効性の低減、内因性タンパク質への交差反応、または医薬の薬物動態の改変に対するＡＤＡの影響を理解する必要性によって推進される。ＡＤＡの特徴付けデータは、医薬の免疫原性に関する貴重な情報を提供することができ、したがって、薬物投与の安全性を強化することができる。
【0021】
モノクローナル抗体などの生物学的製剤の投与は、動物対象およびヒト患者において、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の発達などの免疫応答を誘導し得る。治療用タンパク質によって誘導される免疫原性応答は、臨床的意義を有しない一過性のＡＤＡから、薬物曝露の低減、有効性の欠如または喪失、および過敏反応、アナフィラキシー、および注射部位反応などの有害事象につながり得る、高力価、持続性のＡＤＡの生成までの範囲であり得る（Ｋｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｒｉｓｋ－ｂａｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８．３３３（１－２）：ｐ．１－９）。薬物動態、有効性、および安全性に関連する臨床薬理学における免疫原性の影響などの、ＡＤＡの中和活性に関する発生が報告された。薬物処置中のＡＤＡの形成は、患者の体内の薬物濃度の低下を引き起こし得、これは、有効性の低減に寄与し得る。中和ＡＤＡまたは非中和ＡＤＡなどの、薬物の異なる部位に結合することができる様々なＡＤＡが、患者の体内に存在し得る。中和ＡＤＡは、薬物標的への結合のための薬物分子内の結合部位などの、薬物分子の活性部位、または抗体薬物の可変領域に結合することができる。中和ＡＤＡが薬物の活性部位に結合すると、薬物を不活性化する。非中和ＡＤＡは、抗体薬物分子の定常領域または骨格などの、薬物分子の非活性部位に結合することが可能であり得る。薬物は、非中和ＡＤＡの結合を受けても活性であり得るにもかかわらず、非中和ＡＤＡの存在は、臨床薬理学における特定の変化に寄与し得る。
【0022】
免疫原性とは、免疫学的に関連する有害臨床事象を誘発するなどの、それ自体および関連するタンパク質に対する免疫応答を生成する、治療用産物の性質を指す。関連する免疫原性情報には、結合抗体の誘導、中和抗体の誘導、薬物動態の改変、有効性の低減、および安全性の懸念が含まれる。しかしながら、ＡＤＡの臨床的意義は不明であった。加えて、利用可能データが限定されているために、ＡＤＡの影響の決定が妨げられる場合がある。ＡＤＡは、医薬の全身クリアランスの増加と有効性の低減との間の一致性と関連付けられ得る。いくつかの製剤は、薬物を維持するＡＤＡを有し、これは、薬物のＡＤＡ結合などのＡＤＡ－薬物複合体の形成に起因する可能性のあるクリアランスの低減をもたらした。（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｉｍｐａｃｔｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｔｈｅ ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ．２０１６；１８（２）：３９５－４０３）。
【0023】
したがって、製品の安全性の一部として、免疫原性評価が規制当局によって必要とされる場合があり、ＡＤＡおよび中和抗体（ＮＡｂ）の発生率は、処方情報の一部である（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｆ．Ｃ．，ＣＢＥＲ，Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ－Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｄｒａｆｔ）．ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ＵＳＡ，２００９；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ，Ｃ．ｆ．Ｍ．Ｐ．ｆ．Ｈ．Ｕ．，Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｄｒｉｖｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２００７）。したがって、ＡＤＡの正確な検出は、任意の生物学的薬物開発プログラムの重要な態様である（Ｍｉｒｅ－Ｓｌｕｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４．２８９（１－２）：ｐ．１－１６；Ｓｈａｎｋａｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ，２００８．４８（５）：ｐ．１２６７－８１）。
【0024】
ＡＤＡを同定または測定するためのアッセイは、通常、架橋成分としてビオチン化薬物（Ｂｉｏ－薬物）およびルテニウム標識された薬物（Ｒｕ－薬物）を組み込むことによる、例えば、ビオチン化薬物とＡＤＡとルテニウム標識薬物とを含むＡＤＡ－薬物複合体の形成である、架橋免疫アッセイである。架橋ＡＤＡアッセイは、高いスループットおよび感度、ならびにほとんどのＡＤＡ抗体アイソタイプを検出する能力を提供する。しかしながら、架橋ＡＤＡアッセイは、いくつかの干渉を受けやすい可能性がある。血清試料中の遊離薬物、可溶性薬物標的および他のマトリックスタンパク質の存在などの、試料中の特定の分子の存在は、干渉を引き起こし得る。可溶性薬物標的は、二量体または多量体ペプチドまたはタンパク質であり得る。特に、標的と薬物との間の非常に特異的な結合により、可溶性二量体または多量体標的が寄与する干渉を克服することは困難である。各標的タンパク質の非常に多様な生物学的特性を考慮するとさらに困難である。（Ｚｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ：Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．ＡＡＰＳ Ｊ，２０１７．１９（６）：ｐ．１５６４－１５７５．）
【0025】
架橋ＡＤＡアッセイにおける標的特異的抗体の組み込みを使用して、干渉シグナルを遮断することにより標的干渉を軽減した（Ｌｉａｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－５ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｔｉ－ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１７．４４１：ｐ．１５－２３．；Ｚｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１０．３５５（１－２）：ｐ．２１－８．）。しかしながら、好適な遮断抗体は、多くのモノクローナル抗体薬物に対して容易に利用可能ではない場合がある。好適な遮断抗体は、ＡＤＡと、標識された薬物分子との間の、架橋相互作用に影響を与えることなく、標的に競合的に結合することができるべきである。標的干渉を軽減する他の戦略としては、標的結合タンパク質、標的免疫枯渇、および特定のタイプのレクチンを使用して、高度にグリコシル化された標的タンパク質からの干渉を阻害することが挙げられる（Ｃａｒｒａｓｃｏ－Ｔｒｉｇｕｅｒｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｓｏｌｕｂｌｅ ｔａｒｇｅｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ａｎ ａｎｔｉ－ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ．Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，２０１２．４（１６）：ｐ．２０１３－２６．）。
【0026】
酸性での前処理、または弱い酸性もしくは塩基性ｐＨ条件下での試料インキュベーションを介した架橋ＡＤＡアッセイのｐＨ条件の調整は、薬物、ＡＤＡ、薬物標的、または標識された薬物分子が寄与する様々な相互作用を破壊または強化するための追加の戦略である。ｐＨ条件における変化はまた、標的薬物複合体からの遊離薬物の放出、または偽陽性シグナルを増加させ得る単量体薬物標的の二量体化などの意図されない結果をもたらす可能性があるため、各個々のＡＤＡアッセイに対する特定のｐＨ条件を慎重に評価する必要がある。（Ｄａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｔｈａｔ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｆａｌｓｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｕｅ ｔｏ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．ＡＡＰＳ Ｊ，２０１４．１６（３）：ｐ．４６４－７７；Ｚｏｇｈｂｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅｓｏｌｖｅ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｐｒｏｂｌｅｍ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１５．４２６：ｐ．６２－９）
【0027】
試験試料中の薬物標的の存在は、薬物標的、特に、二量体または多量体標的タンパク質が、捕捉分子と検出分子との間に架橋複合体を形成し、偽陽性のＡＤＡシグナルを生じさせ得るため、信頼性の高い架橋ＡＤＡアッセイの開発に課題をもたらし得る。個々の抗標的抗体またはそのような抗体のカクテルのいずれかの添加は、標的干渉シグナルを軽減することへの一般的なアプローチである。これらの抗体は、通常、高い特異性および標的親和性を提供し、大量に産生することが比較的容易である。しかしながら、抗標的抗体は、有効であるように特定の基準を満たす必要がある。これらの抗体とＡＤＡとの間の交差反応性を回避するために、抗標的抗体は、類似または重複したＣＤＲまたはフレームワーク配列を薬物分子と共有してはならない。加えて、ブロッカー抗体は、ヒトＩｇＧ定常領域配列を含有してはならず、これは、これらの配列が、標識された薬物分子上の類似の配列のＡＤＡ検出と競合し、偽陰性ＡＤＡ結果をもたらし得るからである。
【0028】
本開示は、医薬の投与によって誘導されるＡＤＡを、特徴付け、同定し、かつ測定するための方法およびシステムを提供することによって、前述の要件を満たす方法およびシステムを提供する。特に、本出願の方法およびシステムは、架橋ＡＤＡアッセイに、薬物標的の天然結合パートナー、例えば薬物標的の受容体を組み込むことによって、標的干渉を軽減するための改善を提供する。いくつかの例示的な実施形態において、薬物標的の結合補助因子が、標的干渉を軽減するために架橋ＡＤＡアッセイに組み込まれ、この薬物標的の結合補助因子は、薬物標的と天然結合パートナーとの間の結合を促進することができる。いくつかの態様において、薬物標的の天然結合パートナーは、薬物標的に高い親和性を有し、標的結合について薬物と競合することができる標的受容体である。いくつかの態様において、標的受容体および補助因子は、ＡＤＡ検出を改善するために架橋ＡＤＡアッセイに組み込まれる。標的の天然結合パートナーとして、受容体は標的に対して高い親和性を有し、標的結合について薬物に勝ることができる。内因的に、補助因子分子は、多くの受容体タンパク質の構造を維持し、標的受容体結合を改善するのに役立つ。
【0029】
本出願は、標的干渉の阻害のための、それらの必要な補助因子の有りまたは無しでの可溶性標的受容体などの標的結合タンパク質を提供する。これらのタンパク質は、標的の天然結合パートナーであり、通常、高い標的親和性を示す。可溶性標的タンパク質のグリコシル化特性およびレクチンのグリカン結合特異性に基づいて、特定のレクチンを使用して、高度にグリコシル化された標的タンパク質からの標的干渉を軽減することもできる（Ｃａｒｒａｓｃｏ－Ｔｒｉｇｕｅｒｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｓｏｌｕｂｌｅ ｔａｒｇｅｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ａｎ ａｎｔｉ－ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ．Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，２０１２．４（１６）：ｐ．２０１３－２６）。
【0030】
本出願はまた、二量体もしくは多量体標的タンパク質形成に直接影響を与えることによる、または標的への薬物結合親和性を変更することによる、アッセイｐＨを変更して標的干渉を軽減する戦略を提供する。本出願は、弱酸性のアッセイｐＨだけで、おそらく標的の、標識された薬物への結合を低減することによって、標的媒介性シグナルを少なくとも部分的に軽減することができることを提供する。
【0031】
一態様において、本開示は、弱酸性アッセイｐＨ下で、架橋ＡＤＡアッセイに、薬物標的の天然結合パートナーおよび補助因子を組み込むことによって、標的干渉を軽減する方法およびシステムを提供する。いくつかの態様において、架橋ＡＤＡアッセイを実施するための、弱酸性アッセイｐＨ下での、受容体および補助因子タンパク質の存在下では、２つの異なる活性が存在しこれらの活性が相乗的であるため、薬物標的は、標識された薬物（例えば、ルテニウム標識された薬物およびビオチン化薬物）をもはや架橋することができない。例えば、図１に示すように、血清試料中に可溶性多量体標的が存在するため、この多量体標的タンパク質は、標的媒介性シグナルを生成することができる架橋ＡＤＡアッセイを実施するための中性アッセイｐＨ下では、ルテニウム標識された薬物およびビオチン化薬物（例えば、Ｂｉｏ－ＭＡＢ－ＹおよびＲｕ－ＭＡＢ－Ｙ）に同時に結合することができる。架橋ＡＤＡアッセイを実施するための弱酸性アッセイｐＨ下で、標的受容体および補助因子タンパク質の存在下では、薬物標的が、図１に示すように、薬物受容体および補助因子と複合体を形成することができるため、標的媒介性シグナルを軽減することができる。架橋ＡＤＡアッセイを実施するための弱酸性のアッセイｐＨの使用は、利用可能な薬物標的と、標識された薬物との間の結合を低減する利点を提供する。これらの競合的ブロッカー、例えば受容体および／または補助因子は、特に、アッセイが弱酸性条件下で実行される場合、標的干渉を相乗的に阻害し、標的の許容レベルを増加させる。
【0032】
いくつかの例示的な実施形態において、薬物標的は、血清中に存在する多量体タンパク質であり、薬物標的は、ＡＤＡの定量を妨げ得る標的媒介性偽陽性シグナルを生成し得る。例えば、血清試料中のＭＡＢ－Ｙ（例えば、薬物）のＡＤＡは、例えば、Ｒｕ－ＭＡＢ－ＹおよびＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙを架橋するためのＡＤＡを使用して、Ｒｕ－ＭＡＢ－ＹとＡＤＡとＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙとを含む複合体を形成することによって、Ｒｕ－ＭＡＢ－Ｙ（ルテニウム標識されたＭＡＢ－Ｙ）およびＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙ（ビオチン化ＭＡＢ－Ｙ）を使用して検出することができる。しかしながら、ＭＡＢ－Ｙの標的は、サルおよびヒトナイーブ血清試料中で異なるレベルで発現される多量体タンパク質であるため、例えば、標的媒介性偽陽性シグナルに寄与する、Ｒｕ－ＭＡＢ－ＹおよびＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙを架橋するための標的を使用して、血清中の標的は、Ｒｕ－ＭＡＢ－ＹおよびＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙと複合体を形成することができる。いくつかの例示的な実施形態において、免疫枯渇を通じて薬物標的を除去することによって、薬物標的の架橋効果によって引き起こされる偽陽性シグナルの干渉を軽減するために、抗標的抗体が使用される。標的タンパク質の免疫枯渇は、抗標的抗体とコンジュゲートされた磁気ビーズを使用して実施することができ、これは、弱酸性アッセイｐＨと組み合わせて標的媒介性シグナルを軽減することにおいて有効である。これらの方法は、サルおよびヒトの投与後血清試料における真のＡＤＡシグナルの検出を可能にする。
【0033】
本出願は、可溶性標的受容体および補助因子タンパク質による標的結合の競合、ならびに抗標的抗体コンジュゲート磁気ビーズを使用した免疫枯渇を含む、サルおよびヒト血清試料における多量体標的干渉を軽減するための２つの異なるアプローチを提供する。両方のアプローチについて、弱酸性アッセイ条件（ｐＨ約６．０など）は、標識された薬物分子への標的結合を選択的に阻害するか、または標的の抗標的抗体への結合を増強することができる。弱酸性アッセイｐＨ下での標的受容体および補助因子タンパク質の組み合わせは、投与後のサル血清試料およびヒト臨床試験試料中の標的媒介性シグナルを、バックグラウンドレベルまで顕著に低減することができる。弱酸性アッセイ条件での免疫枯渇は、標的レベルの５０倍以上の低減をもたらし、真の陽性ＡＤＡ検出を維持しながら、臨床研究試料中の標的干渉を排除することができる。
【0034】
一態様において、試料中の抗薬物抗体を、特徴付け、同定し、かつ／または測定するための方法およびシステムが提供される。これらは、前臨床または臨床の毒性学および薬物動態学を研究するために使用することができる薬物または医薬の投与によって誘導される抗体を特徴付けるための、長い間の切実な要求を満たす。これらの方法およびシステムは、医薬の投与後に経時的にＡＤＡをモニタリングするために、前臨床での毒性学または薬物動態学試験に適用され得る。
【0035】
別段記載されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと類似のまたは同等の任意の方法および材料を実施または試験において使用することができるが、特定の方法および材料をこれから説明する。言及されているすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0036】
「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」および「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように標準的な変動を可能にすると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、エンドポイントが含まれる。
【0037】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、非限定的であることが意図され、それぞれ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味することが理解される。
【0038】
いくつかの例示的な実施形態において、本開示は、試料中の抗薬物抗体を同定する方法であって、以下：
試料を第１の標識された薬物と接触させることと；
試料を第２の標識された薬物と接触させることと；
試料を標的の結合パートナーと接触させることと；
第１の標識された薬物と抗薬物抗体と第２の標識された薬物とを含む複合体の存在を検出することと
を含み、試料が抗薬物抗体および標的を含み、標的が薬物の結合パートナーである、方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態において、本方法の薬物は、化学化合物、核酸、毒素、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、または医薬である。
試料を第１の標識された薬物と接触させることと；
試料を第２の標識された薬物と接触させることと；
試料を標的の結合パートナーと接触させることと；
第１の標識された薬物と抗薬物抗体と第２の標識された薬物とを含む複合体の存在を検出することと
を含み、試料が抗薬物抗体および標的を含み、標的が薬物の結合パートナーである、方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態において、本方法の薬物は、化学化合物、核酸、毒素、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、または医薬である。
【0039】
本明細書で使用する場合、「ペプチド」または「タンパク質」という用語は、共有結合で連結されたアミド結合を有する、任意のアミノ酸ポリマーを含む。タンパク質は、一般に「ペプチド」または「ポリペプチド」として当該技術分野において既知である、１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。タンパク質は、単一の機能的な生体分子を形成するために、１つ以上のポリペプチドを含み得る。いくつかの例示的な実施形態において、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、宿主細胞由来タンパク質またはそれらの組み合わせであり得る。
【0040】
本明細書で使用される場合、「医薬」という用語は、本質的に完全にまたは部分的に生物学的であり得るか、または医薬活性を有する活性成分を含む。いくつかの例示的な実施形態において、医薬は、薬物、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、ペプチド－薬物コンジュゲート、抗体のＦｃ領域、酵素製品、サイトカイン、成長因子、医薬、毒素、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学化合物、細胞、組織、抗原、ワクチン、または対象において抗体を誘導することができ得る任意の医薬成分を含み得る。いくつかの他の例示的な実施形態において、医薬は、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗原、ワクチン、ペプチド－薬物コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、タンパク質－薬物コンジュゲート、またはそれらの組み合わせの、組換え、操作、修飾、変異、または切断バージョンを含み得る。
【0041】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域などの、完全なままの抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、ならびにトリアボディ、テトラボディ、直線状抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え単鎖ポリペプチド分子である。抗体断片は、様々な手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、完全なままの抗体の断片化によって酵素的または化学的に産生され得、かつ／または、それは、部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生され得る。代替的または追加的に、抗体断片は、完全にまたは部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意選択で単鎖抗体断片を含み得る。代替的または追加的に、抗体断片は、例えば、ジスルフィド連結によって一緒に連結される複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択で多分子複合体を含み得る。
【0042】
本明細書で使用される場合、「抗体－薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」という用語は、不安定な結合を有するリンカーによって生物活性薬物に結合された抗体を指す場合がある。ＡＤＣは、抗体のアミノ酸残基の側鎖に共有結合することができる生物学的に活性な薬物（またはペイロード）のいくつかの分子を含み得る（Ｓｉｌｅｒ Ｐａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，６ ｍＡｂｓ ３４－４５（２０１３））。ＡＤＣに使用される抗体は、標的部位における選択的蓄積および持続的保持に十分な親和性で結合することができ得る。ほとんどのＡＤＣは、ナノモル範囲のＫｄ値を有することができる。ペイロードは、ナノモル／ピコモル範囲内の効力を有することができ、標的組織へのＡＤＣの分布に続いて達成可能な細胞内濃度に到達することができ得る。最後に、ペイロードと抗体との間の接続を形成するリンカーは、抗体部分の薬物動態特性（例えば、長い半減期）を利用し、ペイロードが組織内に分布するにつれて抗体に結合したままであることを可能にするが、ＡＤＣが標的細胞内に取り込まれ得ると生物学的活性薬物の効率的な放出を可能にするように、循環において十分に安定であることができ得る。リンカーは、細胞プロセシング中に開裂不可能であるもの、およびＡＤＣが標的部位に到達すると開裂可能であるものであり得る。開裂不可能なリンカーでは、要求に応じて放出される生物学的活性薬物は、ペイロードと、リソソーム内のＡＤＣの完全なタンパク質分解後に、抗体のアミノ酸残基、典型的にはリジンまたはシステイン残基に依然として結合しているリンカーのすべての要素と、を含む。開裂可能なリンカーは、その構造が、ペイロードと抗体上のアミノ酸結合部位との間の開裂部位を含むものである。開裂機構は、酸性の細胞内区画内での酸不安定結合の加水分解、細胞内プロテアーゼまたはエステラーゼによるアミドまたはエステル結合の酵素開裂、および細胞内の還元環境によるジスルフィド結合の還元開裂を含み得る。
【0043】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された４本のポリペプチド鎖、つまり２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖からなる、免疫グロブリン分子を指すことが意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）および重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含有する。各軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される高頻度可変性の領域にさらに細分化され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並んだ、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり得る。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスの、グリコシル化免疫グロブリンおよび非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたものを含むが、これらに限定されない。ＩｇＧは、抗体のサブセットを含む。
【0044】
例示的な実施形態
本明細書に開示される実施形態は、試料中の抗薬物抗体を同定するための組成物、方法、およびシステムを提供する。
本明細書に開示される実施形態は、試料中の抗薬物抗体を同定するための組成物、方法、およびシステムを提供する。
【0045】
いくつかの例示的な実施形態において、本開示は、試料中の抗薬物抗体を同定する方法であって、以下：
試料を第１の標識された薬物と接触させることと；
試料を第２の標識された薬物と接触させることと；
試料を標的の結合パートナーと接触させることと；
第１の標識された薬物と抗薬物抗体と第２の標識された薬物とを含む複合体の存在を検出することと
を含み、試料が抗薬物抗体および標的を含み、標的が薬物の結合パートナーである、方法を提供する。いくつかの態様において、試料中の抗薬物抗体を同定する方法は、弱酸性のアッセイｐＨ下で実施される。
試料を第１の標識された薬物と接触させることと；
試料を第２の標識された薬物と接触させることと；
試料を標的の結合パートナーと接触させることと；
第１の標識された薬物と抗薬物抗体と第２の標識された薬物とを含む複合体の存在を検出することと
を含み、試料が抗薬物抗体および標的を含み、標的が薬物の結合パートナーである、方法を提供する。いくつかの態様において、試料中の抗薬物抗体を同定する方法は、弱酸性のアッセイｐＨ下で実施される。
【0046】
いくつかの態様において、本方法の弱酸性のアッセイｐＨは、約ｐＨ４．５～６．５、約ｐＨ３～６．９、約ｐＨ４～６．５、約ｐＨ４．５～６．５、約ｐＨ５～６．５、約ｐＨ５．５～６．５、約５．９～６．２、約ｐＨ５．０、または好ましくは約ｐＨ６．０の範囲にある。
【0047】
いくつかの態様において、試料中の抗薬物抗体を同定する方法は、抗標的抗体を使用して標的を除去することをさらに含み、抗標的抗体は、固体支持体に結合される。
【0048】
いくつかの態様において、本出願の方法またはシステムにおける固体支持体は、ビーズ、磁気ビーズ、クロマトグラフィー樹脂、ポリマー、またはクロマトグラフィーマトリックスであり得る。
【0049】
本システムは、前述の医薬、ペプチド、タンパク質、抗体、抗薬物抗体、タンパク質複合体、または医薬のうちのいずれかに限定されないことが理解される。
【0050】
本明細書で提供される方法ステップの、数字および／または文字での連続した標識は、方法またはその任意の実施形態を特定の指示された順序に限定することを意味しない。特許、特許出願、公開特許出願、受入番号、技術論文、および学術論文を含む、様々な刊行物が、本明細書全体を通して引用される。これらの引用された文献の各々は、参照により、その全体がすべての目的のために、本明細書に組み込まれる。本開示は、本開示をより詳細に説明するために提供される以下の実施例を参照することによって、より十分に理解されるであろう。それらは、例示することを意図しており、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【0051】
試薬調製
全薬物アッセイおよび全標的アッセイに使用した溶液を、アッセイ希釈緩衝液（ＡＤＢ：０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、１×ＰＢＳ）で調製した。ＡＤＡアッセイで使用した溶液を、１％のＢＳＡ、１×ＰＢＳで調製した。（ＡＤＢはアッセイ希釈緩衝液であり、ＢＳＡはウシ血清アルブミンであり、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水である）。ＰＢＳは、Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。１．５ＭのＴｒｉｚｍａ ｂａｓｅは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。氷酢酸は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した。サルおよびヒト血清は、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）から購入した。ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロプレートは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）から購入した。組換えヒト標的タンパク質、ラット抗標的モノクローナル抗体、ビオチン化ヒツジ抗標的ポリクローナル抗体、およびホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ ）から購入した。可溶性標的受容体および補助因子タンパク質は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。黒色のマイクロウェルプレート、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎおよびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入した。ＭＡＢ－Ｙは、完全ヒトモノクローナル抗体薬物である。
全薬物アッセイおよび全標的アッセイに使用した溶液を、アッセイ希釈緩衝液（ＡＤＢ：０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、１×ＰＢＳ）で調製した。ＡＤＡアッセイで使用した溶液を、１％のＢＳＡ、１×ＰＢＳで調製した。（ＡＤＢはアッセイ希釈緩衝液であり、ＢＳＡはウシ血清アルブミンであり、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水である）。ＰＢＳは、Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。１．５ＭのＴｒｉｚｍａ ｂａｓｅは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。氷酢酸は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した。サルおよびヒト血清は、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）から購入した。ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロプレートは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）から購入した。組換えヒト標的タンパク質、ラット抗標的モノクローナル抗体、ビオチン化ヒツジ抗標的ポリクローナル抗体、およびホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ ）から購入した。可溶性標的受容体および補助因子タンパク質は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。黒色のマイクロウェルプレート、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎおよびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入した。ＭＡＢ－Ｙは、完全ヒトモノクローナル抗体薬物である。
【0052】
方法
１．ｐＨ測定
ｐＨ測定を、ＩｎＬａｂ Ｅｘｐｅｒｔ Ｐｒｏ－ＩＳＭ電極を備えた較正済みＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏメーター（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ）を使用して実行した。プールヒト血清を、３００ｍＭの酢酸で１０倍に希釈した。次いで、この酸性化した試料を、５０μｇ／ｍＬの受容体および５０μｇ／ｍＬの補助因子を用いて、異なる濃度のトリス塩基溶液で５倍に希釈した。表１に示す最終的なアッセイ溶液で、ｐＨ測定を実行した。
１．ｐＨ測定
ｐＨ測定を、ＩｎＬａｂ Ｅｘｐｅｒｔ Ｐｒｏ－ＩＳＭ電極を備えた較正済みＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏメーター（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ）を使用して実行した。プールヒト血清を、３００ｍＭの酢酸で１０倍に希釈した。次いで、この酸性化した試料を、５０μｇ／ｍＬの受容体および５０μｇ／ｍＬの補助因子を用いて、異なる濃度のトリス塩基溶液で５倍に希釈した。表１に示す最終的なアッセイ溶液で、ｐＨ測定を実行した。
【0053】
（表１）抗ＭＡＢ－Ｙ ＡＤＡを検出するためのｐＨ条件の評価
【0054】
２．磁気ビーズの、抗標的抗体とのカップリング
標的タンパク質、例えば、抗体薬物によって認識され得る標的タンパク質を枯渇させるために、抗標的抗体を、免疫枯渇を実行するための磁気ビーズにカップリングさせた。抗標的抗体ＭＡＢ－Ａを、製造業者の取扱説明書に従ってＤｙｎａｂｅａｄｓにカップリングした。適切な量のＤｙｎａｂｅａｄｓを、キットからの１ｍＬのＣ１溶液で洗浄し、次いで、Ｃ１溶液で希釈した適切な体積の抗標的抗体ＭＡＢ－Ａで再懸濁した。次いで、等体積のＣ２溶液をこの混合物に添加し、続いて３７℃で１６～２４時間インキュベートした。カップリングされたビーズを、キットからのＨＢ、ＬＢ、およびＳＢ緩衝液で順次洗浄した。次いで、カップリングされたビーズをＳＢ緩衝液で再懸濁し、室温で約１５分間インキュベートした。上清を除去した。ＭＡＢ－ＡコンジュゲートＤｙｎａｂｅａｄｓを、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＳＢ緩衝液で再懸濁し、使用するまで４℃で保存した。
標的タンパク質、例えば、抗体薬物によって認識され得る標的タンパク質を枯渇させるために、抗標的抗体を、免疫枯渇を実行するための磁気ビーズにカップリングさせた。抗標的抗体ＭＡＢ－Ａを、製造業者の取扱説明書に従ってＤｙｎａｂｅａｄｓにカップリングした。適切な量のＤｙｎａｂｅａｄｓを、キットからの１ｍＬのＣ１溶液で洗浄し、次いで、Ｃ１溶液で希釈した適切な体積の抗標的抗体ＭＡＢ－Ａで再懸濁した。次いで、等体積のＣ２溶液をこの混合物に添加し、続いて３７℃で１６～２４時間インキュベートした。カップリングされたビーズを、キットからのＨＢ、ＬＢ、およびＳＢ緩衝液で順次洗浄した。次いで、カップリングされたビーズをＳＢ緩衝液で再懸濁し、室温で約１５分間インキュベートした。上清を除去した。ＭＡＢ－ＡコンジュゲートＤｙｎａｂｅａｄｓを、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＳＢ緩衝液で再懸濁し、使用するまで４℃で保存した。
【0055】
３．架橋ＡＤＡアッセイ
イムノアッセイを開発して、血清試料中のＡＤＡの存在を検出した。サルおよびヒト血清試料中の抗ＭＡＢ－Ｙ抗体などのＡＤＡの存在を、架橋イムノアッセイ、例えば、架橋ＡＤＡアッセイを使用して検出した。マウス抗ＭＡＢ－Ｙ抗体などのマウス抗薬物モノクローナル抗体を、陽性対照として使用した。ビオチン化薬物（Ｂｉｏ－薬物）およびルテニウム標識された薬物（Ｒｕ－薬物）、例えば、ビオチン化ＭＡＢ－Ｙ（Ｂｉｏ－ＭＡＢ－Ｙ）およびルテニウム標識されたＭＡＢ－Ｙ（Ｒｕ－ＭＡＢ－Ｙ）を成分として使用して、ブリッジ複合体、例えば、ＡＤＡとＢｉｏ－薬物とＲｕ－薬物とを含むブリッジ複合体（例えば、抗ＭＡＢ－Ｙ抗体とＢｉｏ－ＭＡＢ－ＹとＲｕ－ＭＡＢ－Ｙとを含む架橋複合体）を確立した。
イムノアッセイを開発して、血清試料中のＡＤＡの存在を検出した。サルおよびヒト血清試料中の抗ＭＡＢ－Ｙ抗体などのＡＤＡの存在を、架橋イムノアッセイ、例えば、架橋ＡＤＡアッセイを使用して検出した。マウス抗ＭＡＢ－Ｙ抗体などのマウス抗薬物モノクローナル抗体を、陽性対照として使用した。ビオチン化薬物（Ｂｉｏ－薬物）およびルテニウム標識された薬物（Ｒｕ－薬物）、例えば、ビオチン化ＭＡＢ－Ｙ（Ｂｉｏ－ＭＡＢ－Ｙ）およびルテニウム標識されたＭＡＢ－Ｙ（Ｒｕ－ＭＡＢ－Ｙ）を成分として使用して、ブリッジ複合体、例えば、ＡＤＡとＢｉｏ－薬物とＲｕ－薬物とを含むブリッジ複合体（例えば、抗ＭＡＢ－Ｙ抗体とＢｉｏ－ＭＡＢ－ＹとＲｕ－ＭＡＢ－Ｙとを含む架橋複合体）を確立した。
【0056】
抗ＭＡＢ－Ｙ抗体を含有する血清試料を、３００ｍＭの酢酸で１０倍希釈を実施し、その後室温で少なくとも１０分間インキュベーションするなどして、架橋ＡＤＡアッセイを実施する前に酢酸を使用して酸性化した。中性ｐＨを有する架橋ＡＤＡアッセイを達成するために、Ｂｉｏ－ＭＡＢ－Ｙ（１．０μｇ／ｍＬ）およびＲｕ－ＭＡＢ－Ｙ（１．０μｇ／ｍＬ）を、７５ｍＭのトリス塩基を含有するアッセイ緩衝液で調製した後、それらを血清試料に組み込んだ。
【0057】
酸処理した血清試料を、標識された薬物溶液、例えば、Ｂｉｏ－ＭＡＢ－Ｙおよび／またはＲｕ－ＭＡＢ－Ｙを含有する溶液で５倍に希釈し、その後、試料を室温で約６０分間インキュベートした。インキュベート後、（５％のＢＳＡ）ブロッキングした、ストレプトアビジンＭｕｌｔｉ－Ａｒｒａｙ（登録商標）９６ウェルプレート（ＭＳＤ、すなわち、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＬＬＣ製）に、試料を移し、室温で約６０分間インキュベートした。プレートを洗浄した。ＭＳＤプレートリーダーを使用してプレートを読み取るために、Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒをプレートに添加した。
【0058】
４．総薬物アッセイ
アッセイ方法を開発し、血清試料中の薬物の存在を検出した。サル血清試料中の薬物の存在、例えば、血清試料中の薬物の総量を分析するために、マイクロタイタープレートをマウス抗ヒトＩｇＧ４抗体（２μｇ／ｍＬ）でコーティングした。ＭＡＢ－Ｙを、総薬物アッセイの標準として使用した。酢酸を使用して可溶性標的薬物複合体を解離させる、酸性化を使用した。サル血清試料、標準物質、および対照を、３０ｍＭの酢酸で処理して、血清試料中に存在する可溶性標的薬物複合体を解離させた。加えて、酸性化処理を用いて、血清中の可溶性標的の存在下での薬物の検出を改善した。ＭＡＢ－Ｙをマイクロタイタープレートに捕捉した後、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎコンジュゲートホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ、５０ｎｇ／ｍＬ）と組み合わせたカッパ軽鎖特異的モノクローナル抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）であるビオチン化マウス抗ヒトＩｇを使用して、ＭＡＢ－Ｙを検出した。すべてのインキュベーションを、室温で約６０分間実行した。その後、検出信号を生成するために、ペルオキシダーゼ特異的基質であるルミノール系基質を使用した。総ＭＡＢ－Ｙ濃度に比例する信号強度を得た。プレートをマイクロプレートルミノメーターで読み取った。
アッセイ方法を開発し、血清試料中の薬物の存在を検出した。サル血清試料中の薬物の存在、例えば、血清試料中の薬物の総量を分析するために、マイクロタイタープレートをマウス抗ヒトＩｇＧ４抗体（２μｇ／ｍＬ）でコーティングした。ＭＡＢ－Ｙを、総薬物アッセイの標準として使用した。酢酸を使用して可溶性標的薬物複合体を解離させる、酸性化を使用した。サル血清試料、標準物質、および対照を、３０ｍＭの酢酸で処理して、血清試料中に存在する可溶性標的薬物複合体を解離させた。加えて、酸性化処理を用いて、血清中の可溶性標的の存在下での薬物の検出を改善した。ＭＡＢ－Ｙをマイクロタイタープレートに捕捉した後、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎコンジュゲートホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ、５０ｎｇ／ｍＬ）と組み合わせたカッパ軽鎖特異的モノクローナル抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）であるビオチン化マウス抗ヒトＩｇを使用して、ＭＡＢ－Ｙを検出した。すべてのインキュベーションを、室温で約６０分間実行した。その後、検出信号を生成するために、ペルオキシダーゼ特異的基質であるルミノール系基質を使用した。総ＭＡＢ－Ｙ濃度に比例する信号強度を得た。プレートをマイクロプレートルミノメーターで読み取った。
【0059】
ヒト血清試料中の薬物の存在、例えば、血清試料中の薬物の総量を分析するために、マイクロタイタープレートをマウス抗ＭＡＢ－Ｙモノクローナル抗体（２μｇ／ｍＬ）でコーティングした。ＭＡＢ－Ｙを、総薬物アッセイの標準として使用した。酢酸を使用して可溶性標的薬物複合体を解離させる、酸性化を使用した。ヒト血清試料を３０ｍＭの酢酸で処理して、血清試料中に存在する可溶性標的薬物複合体を解離させた。ＭＡＢ－Ｙをマイクロタイタープレートに捕捉した後、異なるビオチン化マウス抗ＭＡＢ－Ｙ特異的モノクローナル抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）を、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎコンジュゲートホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ、５０ｎｇ／ｍＬ）と併用して使用して、ＭＡＢ－Ｙを検出した。すべてのインキュベーションを、室温で約６０分間実行した。その後、検出信号を生成するために、ペルオキシダーゼ特異的基質であるルミノール系基質を使用した。総ＭＡＢ－Ｙ濃度に比例する信号強度を得た。プレートをマイクロプレートルミノメーターで読み取った。
【0060】
５．総標的アッセイ
アッセイ方法を開発して、血清試料中の標的タンパク質の存在を検出した。血清試料中の標的タンパク質の存在、例えば、血清試料中の標的タンパク質の総量を分析するために、マイクロタイタープレートをラット抗標的モノクローナル抗体（４μｇ／ｍＬ）でコーティングした。組換え標的タンパク質を標準として使用した。酢酸を使用して可溶性標的薬物複合体を解離させる、酸性化を使用した。血清試料、標準物質、および対照を３００ｍＭの酢酸で１：１０の比で希釈して、血清試料中に存在し得る可溶性標的薬物複合体を解離させ、続いて、７５ｍＭのトリス溶液で１：５の希釈で中和した。次いで、中和された標準物質、対照および試料をマイクロタイタープレートに添加した。プレートに捕捉された標的タンパク質を、ビオチン化ヒツジ抗標的ポリクローナル抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）とストレプトアビジンコンジュゲートホースラディッシュペルオキシダーゼ（ストレプトアビジン－ＨＲＰ、ＡＤＢ中１：２００の希釈）との組み合わせで検出した。すべてのインキュベーションを室温で約６０分間実行した。その後、検出信号を生成するために、ペルオキシダーゼについての特定の基質であるルミノールベースの基質を添加した。総標的の濃度に比例した信号強度が得られた。プレートをマイクロプレートルミノメーターで読み取った。
アッセイ方法を開発して、血清試料中の標的タンパク質の存在を検出した。血清試料中の標的タンパク質の存在、例えば、血清試料中の標的タンパク質の総量を分析するために、マイクロタイタープレートをラット抗標的モノクローナル抗体（４μｇ／ｍＬ）でコーティングした。組換え標的タンパク質を標準として使用した。酢酸を使用して可溶性標的薬物複合体を解離させる、酸性化を使用した。血清試料、標準物質、および対照を３００ｍＭの酢酸で１：１０の比で希釈して、血清試料中に存在し得る可溶性標的薬物複合体を解離させ、続いて、７５ｍＭのトリス溶液で１：５の希釈で中和した。次いで、中和された標準物質、対照および試料をマイクロタイタープレートに添加した。プレートに捕捉された標的タンパク質を、ビオチン化ヒツジ抗標的ポリクローナル抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）とストレプトアビジンコンジュゲートホースラディッシュペルオキシダーゼ（ストレプトアビジン－ＨＲＰ、ＡＤＢ中１：２００の希釈）との組み合わせで検出した。すべてのインキュベーションを室温で約６０分間実行した。その後、検出信号を生成するために、ペルオキシダーゼについての特定の基質であるルミノールベースの基質を添加した。総標的の濃度に比例した信号強度が得られた。プレートをマイクロプレートルミノメーターで読み取った。
【0061】
６．標的タンパク質の免疫枯渇
血清試料中の標的タンパク質の免疫枯渇のために、２つの方法、例えば、方法ＡおよびＢを開発した。標的タンパク質の免疫枯渇の方法Ａにおいて、血清試料を３００ｍＭの酢酸で１０倍に希釈し、室温で少なくとも１０分間インキュベートした。次いで、この酸性化試料を、１５０ｍＭのトリス溶液で１：３の希釈で中和した。抗標的抗体ＭＡＢ－Ａとコンジュゲートした磁気ビーズを、１×ＰＢＳで１回洗浄した後、中和した血清試料で再懸濁した。室温で約６０分間インキュベートした後、上清を収集し、次いで、２μｇ／ｍＬのＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙおよび２μｇ／ｍＬのＲｕ－ＭＡＢ－Ｙを含有する溶液と混合した。室温で約６０分間インキュベートした後、（５％のＢＳＡ）ブロッキングした、ストレプトアビジンＭｕｌｔｉ－Ａｒｒａｙ（登録商標）９６ウェルプレート（ＭＳＤ製）に試料を移し、室温で約６０分間さらにインキュベートした。プレートを洗浄し、Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒを添加した。ＭＳＤプレートリーダーを使用して、プレートを読み取った。
血清試料中の標的タンパク質の免疫枯渇のために、２つの方法、例えば、方法ＡおよびＢを開発した。標的タンパク質の免疫枯渇の方法Ａにおいて、血清試料を３００ｍＭの酢酸で１０倍に希釈し、室温で少なくとも１０分間インキュベートした。次いで、この酸性化試料を、１５０ｍＭのトリス溶液で１：３の希釈で中和した。抗標的抗体ＭＡＢ－Ａとコンジュゲートした磁気ビーズを、１×ＰＢＳで１回洗浄した後、中和した血清試料で再懸濁した。室温で約６０分間インキュベートした後、上清を収集し、次いで、２μｇ／ｍＬのＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙおよび２μｇ／ｍＬのＲｕ－ＭＡＢ－Ｙを含有する溶液と混合した。室温で約６０分間インキュベートした後、（５％のＢＳＡ）ブロッキングした、ストレプトアビジンＭｕｌｔｉ－Ａｒｒａｙ（登録商標）９６ウェルプレート（ＭＳＤ製）に試料を移し、室温で約６０分間さらにインキュベートした。プレートを洗浄し、Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒを添加した。ＭＳＤプレートリーダーを使用して、プレートを読み取った。
【0062】
標的タンパク質の免疫枯渇の方法Ｂにおいて、血清試料を３０ｍＭの酢酸で１０倍に希釈し、次いで、抗標的抗体ＭＡＢ－Ａと室温で約３０分間コンジュゲートした磁気ビーズと、インキュベートした。上清を収集し、次いで、１μｇ／ｍＬのＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙおよび１μｇ／ｍＬのＲｕ－ＭＡＢ－Ｙを含有する１０ｍＭのトリス溶液で３倍に希釈した。室温で約６０分間インキュベートした後、（５％のＢＳＡ）ブロッキングした、ストレプトアビジンＭｕｌｔｉ－Ａｒｒａｙ（登録商標）９６ウェルプレート（ＭＳＤ製）に試料を移し、室温で約６０分間さらにインキュベートした。プレートを洗浄し、Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒを添加した。ＭＳＤプレートリーダーを使用して、プレートを読み取った。
【0063】
実施例１．ＡＤＡ検出を改善するための抗標的抗体の使用
薬物標的が血清中に存在する多量体タンパク質である場合、薬物標的は、ＡＤＡ検出を妨げ得る標的媒介性偽陽性シグナルを生成し得る。血清試料中のＭＡＢ－ＹのＡＤＡは、例えば、Ｒｕ－ＭＡＢ－ＹとＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙとを架橋するＡＤＡを使用して、Ｒｕ－ＭＡＢ－ＹとＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙとを含む複合体を形成することによって、Ｒｕ－ＭＡＢ－ＹおよびＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙを使用して検出することができる。しかしながら、ＭＡＢ－Ｙ（例えば、薬物）の標的は、サルおよびヒトナイーブ血清試料において異なるレベルで発現される多量体タンパク質であるため、例えば、Ｒｕ－ＭＡＢ－ＹおよびＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙを架橋する標的を使用して、血清中の標的はＲｕ－ＭＡＢ－ＹおよびＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙと複合体を形成し得、これは標的媒介性偽陽性シグナルに寄与する。抗標的抗体を使用して、薬物標的の架橋効果によって引き起こされる偽陽性シグナルの干渉を軽減した。
薬物標的が血清中に存在する多量体タンパク質である場合、薬物標的は、ＡＤＡ検出を妨げ得る標的媒介性偽陽性シグナルを生成し得る。血清試料中のＭＡＢ－ＹのＡＤＡは、例えば、Ｒｕ－ＭＡＢ－ＹとＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙとを架橋するＡＤＡを使用して、Ｒｕ－ＭＡＢ－ＹとＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙとを含む複合体を形成することによって、Ｒｕ－ＭＡＢ－ＹおよびＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙを使用して検出することができる。しかしながら、ＭＡＢ－Ｙ（例えば、薬物）の標的は、サルおよびヒトナイーブ血清試料において異なるレベルで発現される多量体タンパク質であるため、例えば、Ｒｕ－ＭＡＢ－ＹおよびＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙを架橋する標的を使用して、血清中の標的はＲｕ－ＭＡＢ－ＹおよびＢｉｏ－ＭＡＢ－Ｙと複合体を形成し得、これは標的媒介性偽陽性シグナルに寄与する。抗標的抗体を使用して、薬物標的の架橋効果によって引き起こされる偽陽性シグナルの干渉を軽減した。
【0064】
抗標的抗体は、架橋ＡＤＡアッセイにおける標的干渉を軽減するために頻繁に使用される（Ｌｉａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－５ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｔｉ－ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１７．４４１：ｐ．１５－２３；Ｚｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０．３５５（１－２）：ｐ．２１－８；Ｄａｉ，ｅｔ ａｌ．；Ｗｅｅｒａｒａｔｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｂｌｅ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３．３９６（１－２）：ｐ．４４－５５；Ｍａｒｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ－ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ．ＡＡＰＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ，２００９）。図２Ａに示されるように、サルナイーブ血清試料における標的干渉を軽減するために、いくつかの抗標的抗体、例えば、Ａｂ１－Ａｂ９を、１００μｇ／ｍＬで、対照（Ｃｔｒｌ）と比較してスクリーニングした。図２Ａに示されるように、スクリーニングされた抗標的抗体のうち、１つの抗標的抗体、例えば、Ａｂ４のみが、標的媒介性偽陽性シグナルを部分的に阻害することができた。試験した抗体のうちの２つ、例えば、Ａｂ８およびＡｂ９が、標的媒介性偽陽性シグナルを実際に増強（増加）させた。これらの抗体の様々な組み合わせも評価したが、サル血清試料における標的干渉を十分に阻害することはできなかった（データは示さず）。
【0065】
数ラウンドの免疫化をさらに実行して、より多くの抗標的抗体を生成した。しかしながら、スクリーニングされた抗標的抗体はいずれも、ＭＡＢ－Ｙと十分に競合し得る。１つの市販のポリクローナル抗標的抗体を使用して、標的干渉を軽減した。図２Ｂに示されるように、このポリクローナル抗標的抗体は、用量依存的な方法で標的干渉を軽減する特定の効果を示した。しかしながら、ポリクローナル抗体は、標的干渉軽減に関してアッセイ開発に負の影響を及ぼし得るバッチ間変動を示す場合がある。
【0066】
実施例２．ＡＤＡ検出を改善するための標的受容体の使用
標的受容体を架橋ＡＤＡアッセイに組み込んで、標的媒介性シグナルを軽減することによってＡＤＡ定量を改善した。可溶性標的受容体（例えば、５０μｇ／ｍＬ）を、標識された薬物の溶液に含めた。標識された薬物の溶液を５０ｍＭのトリス溶液で調製して、アッセイｐＨを、約ｐＨ６．０の弱酸性状態に調整した。弱酸性状態はまた、標的の、Ｂｉｏ－ＭＡＢ－ＹおよびＲｕ－ＭＡＢ－Ｙの両方への結合を最小限に抑えることができる。可溶性標的受容体の添加が、ナイーブサル血清試料中の標的媒介性シグナルを著しく低減するという結果が示された。図３に示されるように、可溶性標的受容体は、用量依存的な方法で標的媒介性シグナルを軽減することができた。図３において、Ｙ軸は、ＡＤＡ平均カウントを示し、Ｘ軸は、標的受容体の濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。可溶性標的受容体は、１００μｇ／ｍＬでナイーブサル血清試料において標的干渉を効果的に遮断した。
標的受容体を架橋ＡＤＡアッセイに組み込んで、標的媒介性シグナルを軽減することによってＡＤＡ定量を改善した。可溶性標的受容体（例えば、５０μｇ／ｍＬ）を、標識された薬物の溶液に含めた。標識された薬物の溶液を５０ｍＭのトリス溶液で調製して、アッセイｐＨを、約ｐＨ６．０の弱酸性状態に調整した。弱酸性状態はまた、標的の、Ｂｉｏ－ＭＡＢ－ＹおよびＲｕ－ＭＡＢ－Ｙの両方への結合を最小限に抑えることができる。可溶性標的受容体の添加が、ナイーブサル血清試料中の標的媒介性シグナルを著しく低減するという結果が示された。図３に示されるように、可溶性標的受容体は、用量依存的な方法で標的媒介性シグナルを軽減することができた。図３において、Ｙ軸は、ＡＤＡ平均カウントを示し、Ｘ軸は、標的受容体の濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。可溶性標的受容体は、１００μｇ／ｍＬでナイーブサル血清試料において標的干渉を効果的に遮断した。
【0067】
実施例３．ＡＤＡ検出を改善するための標的受容体および補助因子の使用
標的受容体および補助因子を架橋ＡＤＡアッセイに組み込んで、標的媒介性シグナルを軽減することによってＡＤＡ検出を改善した。可溶性標的受容体（例えば、５０μｇ／ｍＬ）および補助因子タンパク質（例えば、５０μｇ／ｍＬ）を標識された薬物の溶液に含めた。標識された薬物の溶液を５０ｍＭのトリス溶液で調製して、アッセイｐＨを、約ｐＨ６．０の弱酸性状態に調整した。弱酸性状態はまた、標的の、Ｂｉｏ－ＭＡＢ－ＹおよびＲｕ－ＭＡＢ－Ｙの両方への結合を最小限に抑えることができる。図４Ａに示されるように、異なる濃度の補助因子タンパク質を、架橋ＡＤＡアッセイを実施するための５０μｇ／ｍＬの可溶性標的受容体を含有する溶液に添加した。図４Ａにおいて、Ｙ軸は、ＡＤＡ平均カウントを示し、Ｘ軸は、標的受容体および／または補助因子の濃度をμｇ／ｍＬで示す。可溶性標的受容体および補助因子タンパク質の組み合わせが、ナイーブサル血清試料における標的媒介性シグナルを顕著に低減させることができるという結果が示された。２つのタンパク質、例えば、標的受容体および補助因子は、サルナイーブ試料におけるバックグラウンドシグナルを効果的に低減させるように、相乗的に一緒に機能した。図４Ａに示されるように、５０μｇ／ｍＬの受容体と５０μｇ／ｍＬの補助因子との組み合わせが最も効果的であるという結果が示された。
標的受容体および補助因子を架橋ＡＤＡアッセイに組み込んで、標的媒介性シグナルを軽減することによってＡＤＡ検出を改善した。可溶性標的受容体（例えば、５０μｇ／ｍＬ）および補助因子タンパク質（例えば、５０μｇ／ｍＬ）を標識された薬物の溶液に含めた。標識された薬物の溶液を５０ｍＭのトリス溶液で調製して、アッセイｐＨを、約ｐＨ６．０の弱酸性状態に調整した。弱酸性状態はまた、標的の、Ｂｉｏ－ＭＡＢ－ＹおよびＲｕ－ＭＡＢ－Ｙの両方への結合を最小限に抑えることができる。図４Ａに示されるように、異なる濃度の補助因子タンパク質を、架橋ＡＤＡアッセイを実施するための５０μｇ／ｍＬの可溶性標的受容体を含有する溶液に添加した。図４Ａにおいて、Ｙ軸は、ＡＤＡ平均カウントを示し、Ｘ軸は、標的受容体および／または補助因子の濃度をμｇ／ｍＬで示す。可溶性標的受容体および補助因子タンパク質の組み合わせが、ナイーブサル血清試料における標的媒介性シグナルを顕著に低減させることができるという結果が示された。２つのタンパク質、例えば、標的受容体および補助因子は、サルナイーブ試料におけるバックグラウンドシグナルを効果的に低減させるように、相乗的に一緒に機能した。図４Ａに示されるように、５０μｇ／ｍＬの受容体と５０μｇ／ｍＬの補助因子との組み合わせが最も効果的であるという結果が示された。
【0068】
図４Ｂ（対照）に示されるように、８つのナイーブサル血清試料における、任意のブロッカータンパク質の不在下で、広範囲の標的媒介性アッセイシグナルが検出され、これは、内因性標的レベルの自然変動を反映する可能性があり得る。図４Ｂに示すように、標的受容体および補助因子、例えば、５０μｇ／ｍＬの受容体と５０μｇ／ｍＬの補助因子との組み合わせの存在は、すべてのサル血清試料において標的媒介性アッセイシグナルの効果的な軽減を示した。しかし、１つの血清試料は依然として、平均カウント約４００のシグナルを有していた。
【0069】
実施例４．標的干渉を軽減するためのアッセイｐＨの最適化
その標的に対するＭＡＢ－Ｙ結合親和性は、中性ｐＨと比較した場合、酸性条件下（約ｐＨ６．０）で大幅に低減された。弱酸性のアッセイｐＨが、架橋ＡＤＡアッセイにおける標的媒介性シグナルを阻害し得るかどうかを試験するために、アッセイｐＨを最適化するための４つの実験設計を行った。４つの実験設計は、（１）中性ｐＨ（対照）での、いずれのブロッカーも有しない、４つのサルナイーブ血清試料、（２）中性ｐＨでの、５０μｇ／ｍＬの受容体および５０μｇ／ｍＬの補助因子を有する、４つのサルナイーブ血清試料、（３）弱酸性ｐＨ（約ｐＨ６．０）での、いずれのブロッカーも有しない、４つのサルナイーブ血清試料、および（４）弱酸性ｐＨ（約ｐＨ６．０）での、５０μｇ／ｍＬの受容体および５０μｇ／ｍＬの補助因子を有する、４つのサルナイーブ血清試料であった。
その標的に対するＭＡＢ－Ｙ結合親和性は、中性ｐＨと比較した場合、酸性条件下（約ｐＨ６．０）で大幅に低減された。弱酸性のアッセイｐＨが、架橋ＡＤＡアッセイにおける標的媒介性シグナルを阻害し得るかどうかを試験するために、アッセイｐＨを最適化するための４つの実験設計を行った。４つの実験設計は、（１）中性ｐＨ（対照）での、いずれのブロッカーも有しない、４つのサルナイーブ血清試料、（２）中性ｐＨでの、５０μｇ／ｍＬの受容体および５０μｇ／ｍＬの補助因子を有する、４つのサルナイーブ血清試料、（３）弱酸性ｐＨ（約ｐＨ６．０）での、いずれのブロッカーも有しない、４つのサルナイーブ血清試料、および（４）弱酸性ｐＨ（約ｐＨ６．０）での、５０μｇ／ｍＬの受容体および５０μｇ／ｍＬの補助因子を有する、４つのサルナイーブ血清試料であった。
【0070】
図５に示されるように、ナイーブサル血清試料からの高いバックグラウンドシグナルは、弱酸性ｐＨのみ（ｐＨ約６．０）によって部分的に阻害されるという結果が示された。ｐＨ最適化の結果は、弱酸性アッセイｐＨが、サル血清試料において標的干渉を阻害することができることを示した。受容体および補助因子タンパク質の組み合わせは、両方のｐＨ条件、例えば、中性ｐＨおよび弱酸性ｐＨで、標的媒介性シグナルを顕著に低減することができた。特に、受容体、補助因子、および弱酸性アッセイ条件（ｐＨ約６．０）の組み合わせは、図５に示されるように、標的媒介性シグナルを完全に阻害する相乗効果を提供した。
【0071】
５０μｇ／ｍＬの受容体および補助因子タンパク質の両方を使用してＡＤＡアッセイを実行した場合、異なるアッセイｐＨ条件下で組換え標的タンパク質を使用して、標的許容レベルを決定した。標的許容レベルは、プレートカットポイントを超えるアッセイシグナルを得るために必要な標的の量として定義された。図６Ａに示されるように、中性アッセイｐＨ条件下で、５０μｇ／ｍＬの受容体および補助因子タンパク質の両方を使用してＡＤＡアッセイを実行した場合、標的許容レベルは約９４ｎｇ／ｍＬであると判定した。アッセイｐＨが約６．５であったとき、標的許容レベルは、同じ濃度の受容体および補助因子を用いて、約３８０ｎｇ／ｍＬに増加した。アッセイｐＨが約６．０であったとき、標的許容レベルはさらに高く、約５．０μｇ／ｍＬであった。弱酸性アッセイｐＨが標的媒介性シグナルの軽減を著しく改善することができるという結果が示された。
【0072】
弱酸性ｐＨが真のＡＤＡシグナルの安定性および／または検出に対して最小限の影響を有することを確実にするために、ＭＡＢ－Ｙ Ｆａｂ免疫化ウサギからの早期出血を、異なるアッセイｐＨ条件で分析した。免疫化から約３０日後に出血１を収集し、この出血における誘導性抗体応答は、典型的には、低親和性ポリクローナルＡＤＡを含み、これの検出は、厳しいアッセイ条件によって、より影響を受ける可能性がある。図６Ｂに示されるように、ＡＤＡ平均カウント値は、アッセイｐＨ条件に関係なく、各アッセイ条件で類似していた。弱酸性ｐＨがこれらの試料における真のＡＤＡの安定性および／または検出に対して最小限の影響を有するかまたはまったく影響を有しないという結果が示された。弱酸性アッセイｐＨが標的許容レベルを改善し、真のＡＤＡ検出に及ぼす影響は最小限であるという結果が示された。
【0073】
実施例５．標的受容体、補助因子、および弱酸性アッセイｐＨの組み合わせ
標的受容体、補助因子、および弱酸性アッセイｐＨの組み合わせを、標的媒介性シグナルを軽減することによってＡＤＡ検出を改善するために、架橋ＡＤＡアッセイに組み込んだ。通常、より高いレベルの標的タンパク質を含有する投与後サル試料を、架橋ＡＤＡアッセイを実施するために使用した。薬物（例えば、ＭＡＢ－Ｙ）の単回投与から０日、２８日および５２日後の２匹のサル由来の血清試料を、架橋ＡＤＡアッセイを使用して試験した。これらの２匹のサルの薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示す血清試料中の薬物濃度を図７Ａに示す（ＬＬＯＱは、定量の下限を示す）。サル１は直線的なＰＫプロファイルを示した。サル２は、２１日目から始まる、薬物レベルの顕著な減少、例えば、薬物クリアランスの加速を示し、これは、サル２における顕著なＡＤＡ応答を示す可能性がある。
標的受容体、補助因子、および弱酸性アッセイｐＨの組み合わせを、標的媒介性シグナルを軽減することによってＡＤＡ検出を改善するために、架橋ＡＤＡアッセイに組み込んだ。通常、より高いレベルの標的タンパク質を含有する投与後サル試料を、架橋ＡＤＡアッセイを実施するために使用した。薬物（例えば、ＭＡＢ－Ｙ）の単回投与から０日、２８日および５２日後の２匹のサル由来の血清試料を、架橋ＡＤＡアッセイを使用して試験した。これらの２匹のサルの薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示す血清試料中の薬物濃度を図７Ａに示す（ＬＬＯＱは、定量の下限を示す）。サル１は直線的なＰＫプロファイルを示した。サル２は、２１日目から始まる、薬物レベルの顕著な減少、例えば、薬物クリアランスの加速を示し、これは、サル２における顕著なＡＤＡ応答を示す可能性がある。
【0074】
サル血清試料中の標的およびＡＤＡの濃度を測定した。図７Ｂは、例示的な実施形態により、投与後サル試料を使用した、異なるアッセイ条件を有する、０日目、２８日目および５２日目の標的濃度およびＡＤＡシグナルを示す。ベースラインと比較して、両方のサル由来の２８日目の試料で標的レベルが約１０～１５倍増加し、標的濃度は、サル１由来の５２日目の試料で高く維持されていた。架橋ＡＤＡアッセイを、中性アッセイｐＨで、いずれの競合ブロッカーの存在もない対照条件下で投与後試料を使用して実行したとき、図７Ｂに示されるように、強力なアッセイシグナルがこれらの血清試料から得られた。中性アッセイｐＨでの架橋ＡＤＡアッセイにおける受容体および補助因子分子の添加は、これらの試料におけるアッセイシグナルを部分的に阻害した。ベースライン試料は、シグナルにおいて、より顕著な減少を示した。しかしながら、ＡＤＡ平均カウントは、これらの条件下ではすべての試料のプレートカットポイントをはるかに上回ったままであったため、標的媒介性偽陽性シグナルから、真のＡＤＡシグナルを区別することは困難であった。
【0075】
サル血清試料を、５０μｇ／ｍＬの受容体および５０μｇ／ｍＬの補助因子の存在下で、弱酸性アッセイｐＨ（例えば、約ｐＨ６．０）下で、架橋ＡＤＡアッセイで試験したとき、図７Ｂに示されるように、サル１由来のすべての試料について低いバックグラウンドシグナルを検出した。サル２について、ＡＤＡシグナルの約２倍および２００倍の増加が、図７Ｂに示されるように、ベースラインと比較して、それぞれ２８日目および５２日目の試料について観察された。可溶性受容体、補助因子、および弱酸性アッセイｐＨの組み合わせが、標的干渉を軽減し、投与後サル試料中の真のＡＤＡを検出し得るという結果が示された。サル１の血清試料がＡＤＡを有さず、かつサル２の血清試料がＡＤＡ応答を有し、図７Ａに示されるように、これらの２つのサルの薬物濃度プロファイルが支持されるという結果も示された。
【0076】
第Ｉ相臨床研究の３名の対象由来の臨床研究試料（０日目、２９日目、および６４日目）も、標的受容体、補助因子、および弱酸性アッセイｐＨの組み合わせを組み込んで、標的媒介性シグナルを軽減することによってＡＤＡ検出を改善することにより、架橋ＡＤＡを使用して試験した。これらの臨床研究試料中の薬物濃度を測定した。図８に示されるように、ＭＡＢ－Ｙの単回投与による３名の対象の血清試料中の薬物濃度を測定した。ＬＬＯＱは、定量下限を示す。これらの試料のＰＫプロファイルは、顕著なＡＤＡ応答を示唆しなかった。しかしながら、図９に示されるように、これらの試料を、中性アッセイｐＨ下で、ブロッカー分子の存在なしで、架橋ＡＤＡアッセイにおいて試験したときに、高いアッセイシグナルがすべての試料について観察された。図９は、例示的な実施形態による、ＡＤＡ検出を改善するための、架橋ＡＤＡアッセイへの標的受容体、補助因子、および弱酸性アッセイｐＨの組み込みを含む、異なるアッセイ条件を有する、０日目、２９日目、および６４日目の試料における、標的濃度およびＡＤＡシグナルを示す。
【0077】
これらのアッセイシグナルは、これらの試料における標的レベルと相関するように現れた。すべての３名の対象における投与後試料で標的濃度が増加した。中性アッセイｐＨ下、ブロッカーの存在なしで、高い標的媒介性シグナルをすべての試料で検出した。これらの臨床試験試料を、可溶性受容体（５０μｇ／ｍＬ）および補助因子（５０μｇ／ｍＬ）の存在下、弱酸性アッセイｐＨ（約ｐＨ６．０）下で再度試験したとき、図９に示されるように、バックグラウンドシグナルのみが検出された。その後、臨床試験試料の大規模なセット（１１名の対象由来の０日目、２９日目、および６４日目の試料）を試験し、すべての試料がバックグラウンドシグナルのみを示した（データを示さず）。弱酸性アッセイ条件下で、２つの競合ブロッカータンパク質（例えば、標的受容体および補助因子）を組み込むアッセイフォーマットが、投与後ヒト血清試料における標的干渉を効果的に軽減し得るという結果が示された。この結果はまた、ＡＤＡの陽性応答を示唆しないＰＫプロファイルを支持した。
【0078】
実施例６．中性アッセイｐＨ下での標的タンパク質の免疫枯渇
免疫枯渇は、標的媒介性アッセイシグナルを阻害するために、血清試料から様々な標的タンパク質を除去するために使用されている（Ｄａｉ，ｅｔ ａｌ．）。多量体標的タンパク質をヒト血清試料から除去するために、類似するアプローチが探索された。中性アッセイｐＨでの標的結合について、薬物ＭＡＢ－Ｙと競合することができなかった免疫枯渇を実施するために、抗標的抗体であるＭＡＢ－Ａを使用した。代わりに、ＭＡＢ－Ａは、ヒト血清試料における標的媒介性シグナルを増強し得る（データを示さず）。
免疫枯渇は、標的媒介性アッセイシグナルを阻害するために、血清試料から様々な標的タンパク質を除去するために使用されている（Ｄａｉ，ｅｔ ａｌ．）。多量体標的タンパク質をヒト血清試料から除去するために、類似するアプローチが探索された。中性アッセイｐＨでの標的結合について、薬物ＭＡＢ－Ｙと競合することができなかった免疫枯渇を実施するために、抗標的抗体であるＭＡＢ－Ａを使用した。代わりに、ＭＡＢ－Ａは、ヒト血清試料における標的媒介性シグナルを増強し得る（データを示さず）。
【0079】
免疫枯渇のためのＭＡＢ－Ａコンジュゲート磁気ビーズを使用して、異なるアプローチを実施し、これは、５つのヒトナイーブ血清試料から標的タンパク質を除去するのに成功し、それによって、図１０Ａに示されるように、標的媒介性シグナルを阻害することができた。中性アッセイｐＨでの、ＭＡＢ－Ａコンジュゲート磁気ビーズによる標的タンパク質の免疫枯渇によって、薬物の無いナイーブヒト血清試料において標的媒介性シグナルを排除した。しかしながら、１つの試料は依然として、標的除去後も、平均カウント約４５０のシグナルを示した。ＭＡＢ－Ａコンジュゲート磁気ビーズをまた、臨床研究試料から、例えば、ＭＡＢ－Ｙの単回用量の２名の対象からの、１日目、１５日目、２９日目および５７日目の試料から、標的タンパク質を除去するために使用した。ベースライン試料のみがバックグラウンドシグナルへの低減を示すという結果が示された。顕著なレベルの標的媒介性シグナルが、図１０Ｂに示されるように、投与後の試料において依然として検出された。これらの投与後の試料は、高濃度の薬物ＭＡＢ－Ｙを含有していた。ＭＡＢ－Ａは、中性アッセイｐＨでは、標的結合についてＭＡＢ－Ｙと競合しないため、抗標的抗体カップリングビーズは、高濃度のＭＡＢ－Ｙの存在下では、血清試料から標的タンパク質を完全に枯渇させることができない可能性がある。投与後の試料では、薬物が依然として高濃度で存在しているとき、標的媒介性アッセイシグナルは完全には阻害されなかった。中性アッセイｐＨ条件下でのＭＡＢ－Ａコンジュゲート磁気ビーズによる免疫枯渇は、投与後ヒト試料における標的干渉を軽減するのには十分ではないという結果が示された。
【0080】
実施例７．弱酸性アッセイｐＨ下での標的タンパク質の免疫枯渇
抗標的抗体（ＭＡＢ－Ａ）および薬物ＭＡＢ－Ｙは、中性アッセイｐＨで同様のＫＤ値を示すが、ＭＡＢ－Ａのｔ１／２は、表２に示されるように、ＭＡＢ－Ｙのｔ１／２よりもわずかに大きい。しかしながら、ｐＨ約６．０では、この抗標的抗体は、はるかに長いｔ１／２を有する標的への、はるかに良好な結合を示す（表２）。ＭＡＢ－Ａが、弱酸性ｐＨ（ｐＨ約６．０）での標的結合についてＭＡＢ－Ｙと競合できるかどうかを試験するために、１日目、１５日目、２９日目、および５７日目の臨床試験試料を、中性または弱酸性（ｐＨ約６．０）のアッセイｐＨのいずれかで、ＭＡＢ－Ａを用いてまたは用いずに試験した。中性アッセイｐＨでは、ＭＡＢ－Ａの添加は、標的媒介性シグナルを阻害することに失敗した。代わりに、この抗体は、図１１に示されるように、試験試料における観察された標的干渉をわずかに増強した。弱酸性ｐＨ単独では、特に、ベースライン試料において、アッセイシグナルが減少した。ＭＡＢ－Ａを弱酸性アッセイ溶液に添加する場合、図１１に示されるように、ＭＡＢ－Ｙが依然として高濃度で存在する試料であっても、投与後試料では、標的媒介性シグナルの阻害が観察された。図１１は、中性アッセイｐＨ下でのブロッカーなし、中性アッセイｐＨ下での１００μｇ／ｍＬのＭＡＢ－Ａあり、弱酸性ｐＨ（ｐＨ約６．０）下でのブロッカーなし、および弱酸性ｐＨ（ｐＨ約６．０）下での１００μｇ／ｍＬのＭＡＢ－Ａありの、１日目、１５日目、２９日目および５７日目試料におけるＡＤＡアッセイシグナルを示す。アッセイｐＨが弱酸性である場合に、ＭＡＢ－ＡがＭＡＢ－Ｙと競合することができるという結果が示された。
抗標的抗体（ＭＡＢ－Ａ）および薬物ＭＡＢ－Ｙは、中性アッセイｐＨで同様のＫＤ値を示すが、ＭＡＢ－Ａのｔ１／２は、表２に示されるように、ＭＡＢ－Ｙのｔ１／２よりもわずかに大きい。しかしながら、ｐＨ約６．０では、この抗標的抗体は、はるかに長いｔ１／２を有する標的への、はるかに良好な結合を示す（表２）。ＭＡＢ－Ａが、弱酸性ｐＨ（ｐＨ約６．０）での標的結合についてＭＡＢ－Ｙと競合できるかどうかを試験するために、１日目、１５日目、２９日目、および５７日目の臨床試験試料を、中性または弱酸性（ｐＨ約６．０）のアッセイｐＨのいずれかで、ＭＡＢ－Ａを用いてまたは用いずに試験した。中性アッセイｐＨでは、ＭＡＢ－Ａの添加は、標的媒介性シグナルを阻害することに失敗した。代わりに、この抗体は、図１１に示されるように、試験試料における観察された標的干渉をわずかに増強した。弱酸性ｐＨ単独では、特に、ベースライン試料において、アッセイシグナルが減少した。ＭＡＢ－Ａを弱酸性アッセイ溶液に添加する場合、図１１に示されるように、ＭＡＢ－Ｙが依然として高濃度で存在する試料であっても、投与後試料では、標的媒介性シグナルの阻害が観察された。図１１は、中性アッセイｐＨ下でのブロッカーなし、中性アッセイｐＨ下での１００μｇ／ｍＬのＭＡＢ－Ａあり、弱酸性ｐＨ（ｐＨ約６．０）下でのブロッカーなし、および弱酸性ｐＨ（ｐＨ約６．０）下での１００μｇ／ｍＬのＭＡＢ－Ａありの、１日目、１５日目、２９日目および５７日目試料におけるＡＤＡアッセイシグナルを示す。アッセイｐＨが弱酸性である場合に、ＭＡＢ－ＡがＭＡＢ－Ｙと競合することができるという結果が示された。
【0081】
（表２）ＭＡＢ－ＹおよびＭＡＢ－ＡのＫＤ値およびｔ１／２値
【0082】
ベースライン試料と比較して、１５日目、２９日目および５７日目の試料における標的濃度は、図１２に示されるように、１８３日目にベースラインレベルに戻る前に、約３～５倍増加した。図１２は、例示的な実施形態による、弱酸性アッセイｐＨ下でのＭＡＢ－Ａコンジュゲート磁気ビーズによる免疫枯渇の前および後の、１日目、１５日目、２９日目、および５７日目の試料における標的濃度およびＡＤＡアッセイシグナルを示す。改変免疫枯渇法がこれらの試料中の標的タンパク質を枯渇させることができることを確実にするために、標的濃度を、免疫枯渇を実施する前後に測定した。免疫枯渇を実施する前に、標的レベルは１５０ｎｇ／ｍＬ～７５０ｎｇ／ｍＬの範囲にあったが、標的濃度は、免疫枯渇後に約２～５ｎｇ／ｍＬのみであった。図１２に示されるように、標的タンパク質が効率的に除去されるという結果が示された。改変免疫枯渇ＡＤＡアッセイにおいて臨床試験試料を試験した場合、図１２に示されるように、免疫枯渇なしで観察された１５００～２３００の平均カウントと比較して、バックグラウンドシグナル（平均カウント約２００）のみが検出された。これらの結果は、アッセイｐＨが約５．０であるときに、ＭＡＢ－Ａが標的結合についてＭＡＢ－Ｙと効果的に競合することができ、したがって、図１３に示されるように、分析された臨床試験試料由来の標的タンパク質を完全に枯渇させることができたことを示した。ＭＡＢ－Ａコンジュゲート磁気ビーズを用いた臨床試験試料由来の多量体標的タンパク質の免疫枯渇を、弱酸性のアッセイｐＨ下で実施した。
【0083】
弱酸性アッセイ条件下でのＭＡＢ－Ａコンジュゲート磁気ビーズによる免疫枯渇が、投与後ヒト試料における標的干渉を軽減することができるという結果が示された。図１３に示されるように、ベースライン試料について、ＭＡＢ－Ａコンジュゲート磁気ビーズは、標的タンパク質を効果的に除去することができた。投与後サンプルについては、ＭＡＢ－Ｙが高濃度で存在する場合でさえ、３００ｍＭの酢酸での酸処理により、標的薬物複合体を解離することができた。中和およびＭＡＢ－Ａコンジュゲート磁気ビーズの添加後、ＭＡＢ－Ａは中性アッセイｐＨ下でＭＡＢ－Ｙと競合することができなかったため、標的タンパク質の一部は、ビーズ上のＭＡＢ－Ａに結合することができ、それらの一部は、ＭＡＢ－Ｙと再会合することができた。したがって、上清中には、標的媒介性シグナルを生成することができる十分な量の再形成された標的薬物複合体が依然として存在していた。同じ投与後サンプルについて、３０ｍＭの酢酸での酸処理は、標的薬物複合体を解離することができた。この酸性条件下で、酸性化試料をＭＡＢ－Ａコンジュゲート磁気ビーズとインキュベートする場合、アッセイｐＨが５～６でありｔ１／２がはるかに大きい場合には、ＭＡＢ－Ｙと比較してＭＡＢ－Ａが標的結合に対してはるかに良好な親和性を有するため、遊離標的タンパク質は、好ましくは、上清中のＭＡＢ－Ｙにではなく、ビーズ上のＭＡＢ－Ａに結合することができた。したがって、非結合ＲＥＧＮ－Ｙのみが上清中に存在していた。
【0084】
弱酸性ｐＨ下で競合的ブロッカーＡＤＡ法を使用して、例えば、可溶性受容体（５０μｇ／ｍＬ）および補助因子（５０μｇ／ｍＬ）による競合的ブロックを用いて同定されたＡＤＡ陽性対象由来の１日目、１５日目、２９日目、および５７日目の試料を試験した。競合的ブロッカーＡＤＡ法では、ＡＤＡシグナルは、図１４に示されるように、１日目の試料と比較して、１５日目の試料では約８倍、２９日目の試料では約３倍増加することが見出された。免疫枯渇法では、ＡＤＡシグナルの同様の増加が、１５日目および２９日目の試料について観察された。図１４に示すように、この方法が真のＡＤＡシグナルの検出も可能にするという結果が示された。５７日目のサンプルについては、血清標的濃度が約４５０ｎｇ／ｍＬであったにもかかわらず、アッセイシグナルはバックグラウンドレベルに留まっていた。両方の方法が標的干渉シグナルを阻害するのに成功することができるという結果もまた示された。これらの結果は、改変免疫枯渇法が真のＡＤＡ応答を検出することができることを示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【国際調査報告】