特表 2023-517768 ＭＳ療法のためのκオピオイド受容体リガンドと組み合わしてのシクロチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-26

(54)【発明の名称】ＭＳ療法のためのκオピオイド受容体リガンドと組み合わしてのシクロチド

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/16 20060101AFI20230419BHJP

   C07K 14/415 20060101ALI20230419BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230419BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20230419BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230419BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20230419BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20230419BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20230419BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230419BHJP

   A61K 31/485 20060101ALI20230419BHJP

   A61K 31/35 20060101ALI20230419BHJP

   A61K 31/352 20060101ALI20230419BHJP

   A61K 31/137 20060101ALI20230419BHJP

   C12N 15/29 20060101ALN20230419BHJP

   A61K 36/74 20060101ALN20230419BHJP

   A61K 36/86 20060101ALN20230419BHJP

【ＦＩ】

A61K38/16

C07K14/415

A61P25/00

A61P25/04

A61K45/00

A61P27/02

A61P7/00

A61P25/02

A61P43/00 111

A61K31/485

A61K31/35

A61K31/352

A61K31/137

C12N15/29 ZNA

A61K36/74

A61K36/86

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022556053

(86)(22)【出願日】2021-03-19

(85)【翻訳文提出日】2022-11-16

(86)【国際出願番号】 EP2021057094

(87)【国際公開番号】W WO2021186035

(87)【国際公開日】2021-09-23

(31)【優先権主張番号】20164576.9

(32)【優先日】2020-03-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508317424

【氏名又は名称】メディツィニシェ ウニベルジテート ウィーン

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100182730

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 浩明

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン グルーバー

(72)【発明者】

【氏名】エディン ムラトシュパヒク

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4C088

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA19

4C084BA01

4C084BA19

4C084BA26

4C084MA02

4C084ZA02

4C084ZA08

4C084ZA20

4C084ZA33

4C084ZA51

4C084ZC01

4C084ZC41

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA07

4C086BA08

4C086CB23

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA06

4C086ZA02

4C086ZA08

4C086ZA20

4C086ZA33

4C086ZA51

4C086ZC01

4C086ZC41

4C088AB12

4C088AB14

4C088BA08

4C088BA16

4C088MA02

4C088NA05

4C088NA06

4C088ZA02

4C088ZA08

4C088ZA20

4C088ZA33

4C088ZA51

4C088ZC01

4C088ZC41

4C206AA01

4C206AA02

4C206FA11

4C206MA02

4C206MA04

4C206NA05

4C206NA06

4C206ZA02

4C206ZA08

4C206ZA20

4C206ZA33

4C206ZA51

4C206ZC01

4C206ZC41

4H045BA18

4H045CA30

4H045EA20

4H045EA21

4H045FA71

4H045FA74

4H045GA25

(57)【要約】

本発明は、多発性硬化症（ＭＳ）の治療、再ミエリン化、ＣＮＳ病変の改善、脱髄及び／又はＣＮＳ病変の予防又は軽減、及び／又は痛み、特に神経因性疼痛及び／又は ＭＳ に起因する/ＭＳ に付随する疼痛の治療への使用のための、シクロチド及びκオピオイド受容体（ｋＯＲ）のリガンド、又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、シクロチドとｋＯＲのリガンドとの組合せ、及び前記組合せを含む医薬組成物に関する。 本発明はさらに、ｋＯＲのリガンドの悪影響を軽減するため、及び／又はｋＯＲのリガンドの効力及び／又は有効性を高めるためのシクロチドの使用に関する。さらに、本発明は、シクロチド及びｋＯＲのリガンドを含むキットに関する。 本発明はさらに、キットの一部としての医薬組成物に関し、ここで含まれるシクロチド及びｋＯＲのリガンドは、ＭＳ及び関連する疾患及び／又は症状の治療に使用するためのものである。本発明はさらに、シクロチド及びｋＯＲのリガンドを含む医薬組成物を含むキットであって、前記医薬組成物及び／又は前記シクロチド及びｋＯＲのリガンドは、ＭＳ及び関連疾患及び／又は症状の治療に使用するためのものであるキットに関する。本発明はさらに、（ａ）新規ビオラ型シクロチドに関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

(i) 多発性硬化症 （ＭＳ) の治療;
（ii）オリゴデンドロサイトの再ミエリン化及び/又はＣＮＳ病変の改善;
(iii) 脱髄及び/又はＣＮＳ病変の予防又は軽減; 及び/又は
(iv) 神経障害性疼痛及び/又はＭＳに起因する/付随する疼痛の治療への使用のための； 又は
(v) ＣＮＳ病変の治療; 及び／又は
(vi) 脱髄疾患、神経障害及び/又は神経関連疾患の治療への使用のための、
(a)シクロチド；及び
(b)κオピオイド受容体(ｋＯＲ)のリガンド（前記リガンドはシクロチド（cyclotide）ではない）を含む医薬組成物。

【請求項2】

前記医薬組成物が、
(i) 多発性硬化症 （ＭＳ) の治療;
（ii）オリゴデンドロサイトの再ミエリン化及び/又はＣＮＳ病変の改善;
(iii) 脱髄及び/又はＣＮＳ病変の予防又は軽減; 及び/又は
(iv) 前記ＣＮＳ病変、神経障害、神経関連疾患及び／又はＭＳに起因する／付随する神経因性疼痛及び／又は疼痛の治療への使用のためである、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記脱髄疾患、神経疾患及び／又は神経関連疾患が、多発性硬化症、視神経炎、デビック病、炎症性脱髄疾患、中枢神経系ニューロパシー、ミエロパシー (背部田状筋など)、白質脳症及び白質ジストロフィーから成る群から選択されるか、又はギラン・バレー症候群及びその慢性対応物、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、抗－ＭＡＧ (ミエリン関連糖タンパク質) 末梢神経障害、シャルコー・マリー・トゥース (ＣＭＴ) 病、銅欠乏及び進行性炎症性神経障害から成る群から選択される、請求項１又は２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記治療、再ミエリン化、改善、予防又は軽減は、MSエピソードの再発率及び/又は頻度を減少させることを含むか、又は減少させる結果となる、請求項１～３のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記治療が、
(i)ＣＮＳ病変の再ミエリン化及び/又は改善;
（ii）脱髄及び/又はＣＮＳ病変の予防又は軽減; 及び/又は
(iii) 神経障害性疼痛及び/又はＭＳに起因する/付随する疼痛の治療を含むか、又はもたらす、請求項１～４のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

(a) 不快気分、鎮静、利尿及び/又は幻覚などのκＯＲ依存性の副作用が軽減/改善又は回避されているか、又は軽減/改善又は回避されるべきである、請求項１～５のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記ｋＯＲがヒトｋＯＲ（ｈｋＯＲ）である、請求項１～６のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

ｋＯＲの前記リガンドが、前記ｋＯＲのアゴニストであるか、又はアゴニストとして作用することができる、請求項１～７のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記アゴニストが偏りのないアゴニストである、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

ｋＯＲの前記リガンドが、β－アレスチン２動員を誘導又は増加させることができる(前記シクロチドの非存在下で)、請求項１～９のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記アゴニストが偏ったアゴニストである、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項12】

ｋＯＲの前記リガンドが、β－アレスチン２動員を誘導又は増加させない(前記シクロチドの非存在下で)、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記シクロチドが、前記ｋＯＲの（偏った）（オルソステリック）アゴニストであるか、又はそのように作用することができる、請求項１～１２のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記シクロチドが、β－アレスチン２動員を誘導又は増加することができない(ｋＯＲの前記リガンドが存在しない場合)、請求項１～１３のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記シクロチドが、環状シスチンノット（ＣＣＫ）モチーフに配置された３つのジスルフィド結合を形成することができる６つの保存されたシステイン残基をシクロチド鎖が含む頭尾環化ペプチドであるか、又はそれを含む、請求項１～１４のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記シクロチドが非グラフトシクロチドである、請求項１～１５のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記シクロチドが、カラタ型、特にカラタＢ型シクロチド、カリペ型シクロチド又はビオラ型シクロチドである、請求項１～１６のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記シクロチドが、カラタＢ１又はカラタＢ１の突然変異体である、請求項１～１７のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記シクロチドが、配列番号７、５、４、６、１５５又は８６に示されるアミノ酸配列の（頭から尾への）環化形を含むか、又はそれらから成るシクロチドである、請求項１～１８のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記シクロチドが、カラタＢ１（配列番号１）のＴ２０Ｋ変異体、すなわち、配列番号７に示される変異シクロチドである、請求項１～１９のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項21】

ｋＯＲの前記リガンドが、小分子又はペプチドリガンドである、請求項１～２０のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項22】

ｋＯＲの前記リガンドが、表６に列挙されるｋＯＲアゴニストから成る群から選択される、請求項１～２１のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項23】

ｋＯＲの前記リガンドが、Ｕ５０，４８８及びダイノルフィンＡ－（１－１３）から成る群から、又はダイノルフィン－（１－１１）、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィンＡ－（１－８）、Ｕ６９５９３、ＧＲ８９６９６、スピラドリン、ＢＲＬ－５２５３７、ＪＴ０９、ジフェリケファリン、ダイノルフィン、ナルブフィン、ペンタソジン、ペチジン及びスルフェンタニルから成る群から選択される、請求項１～１０及び１３～２２のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項24】

ｋＯＲの前記リガンドが、ナルフラフィン（モルヒネ誘導体）、コリボリド（マッシュルームＣｏｌｌｙｂｉａ ｍａｃｕｌａｔｅ）、ノリボガイン（植物イボガの代謝産物）、Ｂ－６４（サルビノリンＡ誘導体）、トリアゾール１．１、６－ＧＮＴＩ、ＨＳ６６６、ＨＳ６６５及びメシルサルビノリンＢから成る群から選択される、請求項１～８及び１１～２２のいずれか1項に記載の医薬組成物。

【請求項25】

（ａ）請求項１及び１３～２０のいずれか１項に記載のシクロチド； 及び
（ｂ）請求項１、７～１２及び２２～２４のいずれか１項に記載のｋＯＲのリガンドの組合せ。

【請求項26】

（ａ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ（配列番号７）であり、そして前記リガンドが以下から成る群から選択される：
(i) ナルフラフィン、コリボリド、ノリボガイン、サルビノリン Ａ 誘導体 Ｂ－６４、トリアゾール １．１、６－ＧＮＴＩ、ＨＳ６６６、ＨＳ６６５、及びメシルサルビノリン Ｂ; 又は
(ii) Ｕ５０，４８８、ダイノルフィン Ａ－（１－１３）、ダイノルフィン－（１－１１）、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィン Ａ－（１－８）、Ｕ６９５９３、ＧＲ ８９６９６、スピラドリン、ＢＲＬ－５２５３７、ＪＴ０９、ジフェリケファリン 、ダイノルフィン、ナルブフィン、ペンタソジン、ペチジン及びスルフェンタニル;
（ｂ）前記シクロチドがＮ２９Ｋ（配列番号５）であり、そして前記リガンドが以下から成る群から選択される：
(i) ナルフラフィン、コリボリド、ノリボガイン、サルビノリン Ａ 誘導体 Ｂ－６４、トリアゾール １．１、６－ＧＮＴＩ、ＨＳ６６６、ＨＳ６６５、及びメシルサルビノリン Ｂ; 又は
(ii) Ｕ５０，４８８、ダイノルフィン Ａ－（１－１３）、ダイノルフィン－（１－１１）、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィン Ａ－（１－８）、Ｕ６９５９３、ＧＲ ８９６９６、スピラドリン、ＢＲＬ－５２５３７、ＪＴ０９、ジフェリケファリン 、ダイノルフィン、ナルブフィン、ペンタソジン、ペチジン及びスルフェンタニル;
(c)前記シクロチドがＧ１８Ｋ(配列番号４)であり、そして前記リガンドが以下から成る群から選択される:
(i) ナルフラフィン、コリボリド、ノリボガイン、サルビノリン Ａ 誘導体 Ｂ－６４、トリアゾール １．１、６－ＧＮＴＩ、ＨＳ６６６、ＨＳ６６５、及びメシルサルビノリン Ｂ; 又は
(ii) Ｕ５０，４８８、ダイノルフィン Ａ－（１－１３）、ダイノルフィン－（１－１１）、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィン Ａ－（１－８）、Ｕ６９５９３、ＧＲ ８９６９６、スピラドリン、ＢＲＬ－５２５３７、ＪＴ０９、ジフェリケファリン 、ダイノルフィン、ナルブフィン、ペンタソジン、ペチジン及びスルフェンタニル;
(d)前記シクロチドがＴ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ(配列番号６)であり、そして前記リガンドが以下から成る群から選択される:
(i) ナルフラフィン、コリボリド、ノリボガイン、サルビノリン Ａ 誘導体 Ｂ－６４、トリアゾール １．１、６－ＧＮＴＩ、ＨＳ６６６、ＨＳ６６５、及びメシルサルビノリン Ｂ; 又は
(ii) Ｕ５０，４８８、ダイノルフィン Ａ－（１－１３）、ダイノルフィン－（１－１１）、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィン Ａ－（１－８）、Ｕ６９５９３、ＧＲ ８９６９６、スピラドリン、ＢＲＬ－５２５３７、ＪＴ０９、ジフェリケファリン 、ダイノルフィン、ナルブフィン、ペンタソジン、ペチジン及びスルフェンタニル;又は
（ｅ）前記シクロチドがビトリシクロチド（配列番号１５５）であり、そして前記リガンドが以下から成る群から選択される：
(i) ナルフラフィン、コリボリド、ノリボガイン、サルビノリン Ａ 誘導体 Ｂ－６４、トリアゾール １．１、６－ＧＮＴＩ、ＨＳ６６６、ＨＳ６６５、及びメシルサルビノリン Ｂ; 又は
(ii) Ｕ５０，４８８、ダイノルフィン Ａ－（１－１３）、ダイノルフィン－（１－１１）、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィン Ａ－（１－８）、Ｕ６９５９３、ＧＲ ８９６９６、スピラドリン、ＢＲＬ－５２５３７、ＪＴ０９、ジフェリケファリン 、ダイノルフィン、ナルブフィン、ペンタソジン、ペチジン及びスルフェンタニル；又は
（ｆ）前記シクロチドがカリペ１０（配列番号８６）であり、そして前記リガンドが以下から成る群から選択される：
(i) ナルフラフィン、コリボリド、ノリボガイン、サルビノリン Ａ 誘導体 Ｂ－６４、トリアゾール １．１、６－ＧＮＴＩ、ＨＳ６６６、ＨＳ６６５、及びメシルサルビノリン Ｂ; 又は
(ii) Ｕ５０，４８８、ダイノルフィン Ａ－（１－１３）、ダイノルフィン－（１－１１）、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィン Ａ－（１－８）、Ｕ６９５９３、ＧＲ ８９６９６、スピラドリン、ＢＲＬ－５２５３７、ＪＴ０９、ジフェリケファリン 、ダイノルフィン、ナルブフィン、ペンタソジン、ペチジン及びスルフェンタニル、請求項１～２４のいずれか1項に記載の医薬組成物、又は請求項２５に記載の組合せ。

【請求項27】

（ａ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ（配列番号７）であり、そして前記リガンドがナルフラフィンであり；
（ｂ）前記シクロチドがＮ２９Ｋ（配列番号５）であり、そして前記リガンドがナルフラフィンであり；
（ｃ）前記シクロチドがＧ１８Ｋ（配列番号４）であり、そして前記リガンドがナルフラフィンであり；
（ｄ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ（配列番号６）であり、そして前記リガンドがナルフラフィンであり；
（ｅ）前記シクロチドがビトリ（配列番号１５５）であり、そして前記リガンドがナルフラフィンであり；
（ｆ）前記シクロチドがカリペ１０（配列番号８６）であり、そして前記リガンドがナルフラフィンであり；
（ｇ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ（配列番号７）であり、そして前記リガンドがＵ５０，４８８であり；
（ｈ）前記シクロチドがＮ２９Ｋ（配列番号５）であり、そして前記リガンドがＵ５０，４８８であり；
（ｉ）前記シクロチドがＧ１８Ｋ（配列番号４）であり、そして前記リガンドがＵ５０，４８８であり；
（ｊ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ（配列番号６）であり、そして前記リガンドがＵ５０，４８８であり；
（ｋ）前記シクロチドがビトリ（配列番号１５５）であり、そして前記リガンドがＵ５０，４８８であり；
（ｌ）前記シクロチドがカリペ１０（配列番号８６）であり、そして前記リガンドがＵ５０，４８８であり；
（ｍ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ（配列番号７）であり、そして前記リガンドがダイノルフィンＡ １－１３であり；
（ｎ）前記シクロチドがＮ２９Ｋ（配列番号５）であり、そして前記リガンドがダイノルフィンＡ １－１３であり；
（ｏ）前記シクロチドがＧ１８Ｋ（配列番号４）であり、そして前記リガンドがダイノルフィンＡ １－１３であり；
（ｐ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ（配列番号６）であり、そして前記リガンドがダイノルフィンＡ １－１３であり；
（ｑ）前記シクロチドがビトリ（配列番号１５５）であり、そして前記リガンドがダイノルフィンＡ １－１３であり；
（ｒ）前記シクロチドがカリペ１０（配列番号８６）であり、そして前記リガンドがダイノルフィンＡ １－１３であり；
（ｓ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ（配列番号７）であり、そして前記リガンドがジフェリケファリンであり；
（ｔ）前記シクロチドがＮ２９Ｋ（配列番号５）であり、そして前記リガンドがジフェリケファリンであり；
（ｕ）前記シクロチドがＧ１８Ｋ（配列番号４）であり、そして前記リガンドがジフェリケファリンであり；
（ｖ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ（配列番号６）であり、そして前記リガンドがジフェリケファリンであり；
（ｗ）前記シクロチドがビトリ（配列番号１５５）であり、そして前記リガンドがジフェリケファリンであり；
（ｘ）前記シクロチドがカリペ１０（配列番号８６）であり、そして前記リガンドがジフェリケファリンであり；
（ｙ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ（配列番号７）であり、そして前記リガンドがナルブフィンであり；
（ｚ）前記シクロチドがＮ２９Ｋ（配列番号５）であり、そして前記リガンドがナルブフィンであり；
（ａａ）前記シクロチドがＧ１８Ｋ（配列番号４）であり、そして前記リガンドがナルブフィンであり；
（ａｂ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ（配列番号６）であり、そして前記リガンドがナルブフィンであり；
(ａｃ)前記シクロチドがビトリ(配列番号１５５)であり、そして前記リガンドがナルブフィンであり；
（ａｄ）前記シクロチドがカリペ１０（配列番号８６）であり、そして前記リガンドがナルブフィンであり；
（ａｅ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ（配列番号７）であり、そして前記リガンドがペンタソジンであり；
（ａｆ）前記シクロチドがＮ２９Ｋ（配列番号５）であり、そして前記リガンドがペンタソジンであり；
（ａｇ）前記シクロチドがＧ１８Ｋ（配列番号４）であり、そして前記リガンドがペンタソジンであり；
（ａｈ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ（配列番号６）であり、そして前記リガンドがペンタソジンであり；
（ａｉ）前記シクロチドがビトリ（配列番号１５５）であり、そして前記リガンドがペンタソジンであり；
（ａｊ）前記シクロチドがカリペ１０（配列番号８６）であり、そして前記リガンドがペンタソジンであり；
（ａｋ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ（配列番号７）であり、そして前記リガンドがペチジンであり；
（ａ１）前記シクロチドがＮ２９Ｋ（配列番号５）であり、そして前記リガンドがペチジンであり；
（ａｍ）前記シクロチドがＧ１８Ｋ（配列番号４）であり、そして前記リガンドがペチジンであり；
（ａｎ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ（配列番号６）であり、そして前記リガンドがペチジンであり；
（ａｏ）前記シクロチドがビトリ（配列番号１５５）であり、そして前記リガンドがペチジンであり；
（ａｐ）前記シクロチドがカリペ１０（配列番号８６）であり、そして前記リガンドがペチジンであり；
（ａｑ）前記シクロチドがＴ２０Ｋ（配列番号７）であり、そして前記リガンドがスルフェンタニルであり；
(ａｒ)前記シクロチドがＮ２９Ｋ(配列番号５)であり、そして前記リガンドがスルフェンタニルであり、
（ａｓ）前記シクロチドがＧ１８Ｋ（配列番号４）であり、そして前記リガンドがスルフェンタニルであり；
(ａｔ)前記シクロチドがＴ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ(配列番号６)であり、そして前記リガンドがスルフェンタニルであり；
（ａｕ）前記シクロチドがビトリ（配列番号１５５）であり、そして前記リガンドがスルフェンタニルであり；そして
（ａｖ）前記シクロチドがカリペ１０（配列番号８６）であり、そして前記リガンドがスルフェンタニルである、請求項１～２４及び２６のいずれか1項に記載の医薬組成物、又は請求項２５又は２６に記載の組合せ。

【請求項28】

請求項１及び１３～２０のいずれか１項に定義されたシクロチド、及び請求項１、７～１２及び２２～２４のいずれか１項に定義されたｋＯＲのリガンド、又は請求項２５～２７のいずれか１項に定義された組み合わせ、及び任意には医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項29】

（ｉ）請求項１、７～１２及び２２～２４のいずれか１項に定義されたｋＯＲのリガンド、特に請求項５、６及び１４のいずれか１項に定義されたｋＯＲのリガンドの悪影響の軽減； 及び/又は
（ｉｉ）請求項１、７～１２及び２２～２４のいずれか１項に定義されたｋＯＲのリガンド、特に請求項９、１０及び２３のいずれか１項に定義されたｋＯＲのリガンドの効力の増大への使用のための、請求項１及び１３～２０のいずれか１項に記載のシクロチド、又はそれを含む医薬組成物。

【請求項30】

ｋＯＲの前記リガンド及び/又は前記シクロチド又は医薬組成物が、治療方法で使用するためのものである、請求項２９に記載のシクロチド又は医薬組成物。

【請求項31】

ｋＯＲの前記リガンド及び／又は前記シクロチド又は医薬組成物が、請求項１～６のいずれか１項に従って使用するためのものである、請求項２９又は３０に記載のシクロチド又は医薬組成物。

【請求項32】

例えば、２つの異なるバイアルに、
（ａ）請求項１及び１３～２０のいずれか１項に記載のシクロチド；及び
（ｂ）請求項１、７～１２及び２２～２４のいずれか１項に記載のｋＯＲのリガンド、 又は (a) と (b) の組み合わせを含むキット（内容物のキット/パーツのキット）。

【請求項33】

前記
(a) シクロチド; 及び
(b) ｋＯＲのリガンド、又は
前記組み合わせが、請求項１～６のいずれか１項に従って使用するためのものである、請求項３２に記載のキット。

【請求項34】

前記
(a) シクロチド; 及び
(b) ｋＯＲのリガンド、又は
前記組み合わせ、又は前記医薬組成物が、請求項１～６のいずれか１項に従って使用するためのものである、請求項３２又は３３に記載のキット（内容物のキット／パーツのキット）の一部としての医薬組成物。

【請求項35】

（ａ）請求項１及び１３～２０のいずれか１項に記載のシクロチド；及び
（ｂ）請求項１、７～１２及び２２～２４のいずれか１項に記載のｋＯＲのリガンドを含む医薬組成物又は (a) 及び (b) の組み合わせを含むキット（内容物のキット／パーツのキット）であって、
前記
(a) シクロチド; 及び
(b) ｋＯＲのリガンド、
又は前記組み合わせ又は前記医薬組成物が請求項１～６のいずれか１項に従って使用するためのものである、キット。

【請求項36】

請求項１～６のいずれか１項に記載の使用のためである、請求項３２、３３及び３５のいずれか１項に記載のキット。

【請求項37】

請求項２５～２８のいずれか１項に記載の組合せ又は医薬組成物の製造方法であって、前記請求項のいずれかに定義されたシクロチド及びｋＯＲリガンドを混合する工程、及び任意には、医薬的に許容される担体を混合するさらなる工程を含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、多発性硬化症（ＭＳ）などの脱髄疾患、神経障害及び/又は神経関連疾患の治療, 再ミエリン化、ＣＮＳ病変の治療/改善、脱髄及び/又はＣＮＳ病変の予防又は軽減、及び/又は疼痛、特に神経因性疼痛、及び/又はＭＳに起因する/ＭＳに伴う又は付随する疼痛の治療への使用のための、シクロチド（cyclotide）及びκオピオイド受容体（ｋＯＲ）のリガンド、又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、シクロチドとｋＯＲのリガンドとの組合せ、及び前記組合せを含む医薬組成物に関する。 本発明はさらに、ｋＯＲのリガンドの悪影響を軽減するため、及び／又はｋＯＲのリガンドの効力及び／又は有効性を高めるためのシクロチドの使用に関する。 さらに、本発明は、シクロチド及びｋＯＲのリガンドを含むキットに関する。本発明はさらに、キットの一部としての医薬組成物に関し、ここで含まれるシクロチド及びｋＯＲのリガンドは、ＭＳ及び関連する疾患及び／又は症状の治療に使用するためのものである。本発明はさらに、シクロチド及びｋＯＲのリガンドを含む医薬組成物を含むキットに関し、 ここで、前記医薬組成物及び／又は前記シクロチド及びｋＯＲのリガンドは、脱髄疾患、神経障害及び／又はＭＳなどの神経関連疾患、並びに関連疾患及び／又は症状の治療に使用するためのものである。 本発明はさらに、（ａ）新規ビオラ型シクロチドに関する。

【背景技術】

【0002】

ＭＳ は、中枢神経系 (ＣＮＳ) に炎症性損傷を引き起こし、若年成人に障害を引き起こす Ｔ 細胞媒介性自己免疫疾患である。ＭＳの病因は、免疫系の活性化、リンパ球の浸潤、ミクログリアの活性化、限局性炎症性脱髄及び軸索損傷を含む、一連の病理学的事象によって特徴付けられる(Ciccarelli, Lancet Neurol 13 (8), 2014, 807-22)。ＣＤ４^＋Ｔ 細胞、特に Ｔｈ１７ 及び Ｔｈ１サブグループは、この疾患を開始することが示唆されている(Sospedra, Annu Rev Immunol 23, 2005, 683-747)。

【0003】

現在利用可能な ＭＳ の治療法はすべて、ベータ インターフェロン、フィンゴリモド、フマル酸ジメチルなどの一般的な免疫抑制/免疫調節、及びナタリズマブなどの中枢神経系への免疫細胞浸潤の遮断を含む作用機序で免疫系を標的としている(Haghikia, Trends Mol Med 19 (5), 2013, 309-19)。これらの薬は、再発率と新しい病変の形成を減らすのに効果的であり；ただし、障害の進行を防ぐ効果は非常に限られている。オリゴデンドロ サイト前駆細胞 (ＯＰＣ) の分化、再ミエリン化、及びその後のニューロンの機能回復の促進は、ＭＳ 療法の新しい方向性であると提案されている(Plemel, Nat Rev Drug Discov 16 (9), 2017, 617-634; Franklin, Nat Rev Neurosci 18 (12), 2017, 753-769)。

【0004】

さらに、一般的に、天然物は創薬と開発の最も価値のある情報源の 1 つであり続けている(Muratspahic, Trends Pharmacol Sci 40 (5), 2019, 309-326)。ペプチドベースの医薬品に対する関心の高まりにより、治療用途向けの天然由来ペプチドの開発が強化されている(Muratspahic, Trends Pharmacol Sci 40 (5), 2019, 309-326)。最近、環状植物ペプチドであるカラタ Ｂ１が、ＩＬ－２ 依存性メカニズムでインビトロ で Ｔ 細胞増殖を抑制することが示されている(Grundemann, PLoS One 8 (6), 2013, e68016)。さらに、ＭＳ ＥＡＥマウスモデルを用いた突然変異シクロチド［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１のインビボ活性が示された(Thell, Proc Natl Acad Sci U S A 113 (15), 2016, 3960-5; 国際公開第２０１３/０９３０４５号)。この突然変異シクロチドでのマウスの処置は、経口投与によるＥＡＥの有意な遅延及び症状の減少をもたらした（Thell、前記）。サイクロタイドは、リンパ球増殖の阻害と炎症誘発性サイトカイン、特に ＩＬ－２ の減少により、他の市販薬と区別される（Thell、前記）。

【0005】

さらに、内因性オピオイド システムは、ＭＳ の病因に役割を果たすことが示唆されている。 ＭＳ の Theiler マウス脳脊髄炎ウイルスモデルでは、３ つのオピオイド受容体すべて、つまりミュー、デルタ、カッパオピオイド受容体 (ｍＯＲ、ｄＯＲ、ｋＯＲ) の ｍＲＮＡ レベルが脊髄で有意に減少した(Lynch, Brain Res 1191, 2008, 180-91)。特に、ＧＰＣＲ ｋＯＲ は最近、ＭＳ の病因に関与することが示唆されている(Du, Nat Commun 7, 2016, 11120; Mei, J Neurosci, 2016, 36 (30), 7925-35)。オピオイド受容体の喪失は、ＭＳ患者に一般的に観察される中枢性神経因性疼痛を部分的に説明する可能性がある(Baron, Nat Clin Pract Neurol 2 (2), 2006, 95-106)。妊娠中の女性は、より高いレベルの内因性オピオイドを発現することが報告されている(Akil, Annu Rev Neurosci 7, 1984, 223-55)。妊娠中のＭＳ患者は、病気の寛解を経験し、再発が少ない。 しかし、分娩後 ３ か月で、内因性オピオイド レベルの低下とは対照的に、これらの女性は再発率の著しい増加を示す(Roullet, J Neurol Neurosurg Psychiatry 56 (10), 1993, 1062-5; Lutton, Exp Biol Med (Maywood) 229 (1), 2004, 12-20)。さらに、研究は最近、ｋＯＲの遺伝子欠失がＥＡＥの有意に深刻な表現型を誘発することを実証した(Du, 前記; Mei, Nat Med 20 (8), 2014, 954-960; Mei, 2016, 前記)。ｋＯＲ は Ｔ 細胞の分化と機能に影響を与えず、代わりに、有髄オリゴデンドロ サイト (ＯＬ) へのＯＰＣ の分化に大きく関与している(Du 前記)。従って、Ｕ５０，４８８などのアゴニストによるｋＯＲの標的化はＯＰＣの分化と再ミエリン化を促進するが、ｋＯＲノックアウトはアゴニストを介した有益な効果を防ぐ(Du, 前記; Mei, 2014, loc. cit.; Mei, 2016, 前記)。いくつかの研究は、おそらく軸索に物理的および代謝的サポートを提供することにより、軸索の完全性を維持するためのミエリンの重要な役割を報告した(Lee, Nature, 2012, 487 (7408), 443-8; Mei, 2014, 前記)。最近の高処理スクリーニングの取り組みにより、再ミエリン化を促進する多数の化合物が特定されている(Mei, 2014, loc. cit.; Najm, Nature, 2015, 522 (7555), 216-20)。国際公開第２０１９/１７１３３３号では、脱髄疾患の治療におけるｋＯＲ アゴニスト ナルフラフィンの使用が予見されている。Denny (Clinical & Translational Immunology 10(1), e1234, 2021, 1-19) は、ＣＮＳ 脱髄疾患のモデルにおける神経炎症の減少と再ミエリン化の促進を考慮して、ＭＳ 治療におけるナルフラフィンの臨床使用の可能性について論じている。さらに、Tangherlini (J. Med. Chem. 62, 2019, 893-907) は、神経炎症の治療のためのキノキサリンベースのｋＯＲ アゴニストの開発について説明している。さらに、[Ｔ２０Ｋ]カラタＢ1 は ｈｋＯＲ に結合して活性化することが示されている(Muratspahic and Gruber, 2018, “Nature-derived peptides as molecular tools to study GPCR signaling” JOURNAL OF PEPTIDE SCIENCE 24, S137-S137, 2018)。

【0006】

ただし、Ｕ５０，４８８ などの ｋＯＲ アゴニストの臨床的可能性は、有害な副作用とオフターゲット受容体のために制限されている。 特に、Ｕ５０，４８８などの ｋＯＲ アゴニストがあり、必要な薬学的に有効な用量/濃度で、不快感、鎮静、利尿、及び/又は幻覚などの副作用を示す(Lalanne, Front Psychiatry, 2014, 5, 170)。細胞質タンパク質ベータアレスチン２(β－アレスチン ２) の動員は、この点で関連するメカニズムであることが知られている (Lalanne 前記)。 従って、ＭＳ 及び関連する疾患/欠陥/症状の治療において、副作用の軽減と効能の改善に関連する新規化合物の継続的な同定が強く求められている。さらに、利用可能な ＭＳ 薬の多様性にもかかわらず、ＭＳ患者の身体障害の進行を防ぐ有効性が改善された新しいＭＳ薬を開発するという満たされていない臨床的必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

従って、本発明の根底にある問題は、悪影響がないか、少ないか、又は改善された副作用を伴って、ＭＳ及び関連する疾患、欠陥及び／又は症状における改善された医療介入、特にＭＳ及び関連する疾患、欠陥及び／又は症状における医療介入のための手段及び方法の提供である。

【0008】

技術的問題は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態の提供によって解決される。

【0009】

本発明は、脱髄疾患、神経障害及び／又はＭＳなどの神経関連疾患、並びに関連疾患、欠陥及び／又は症状の併用治療に関し、前記併用治療は、シクロチド及びｋＯＲのリガンドの投与／医学的使用を含む。これに関連して、神経炎症の治療も想定される。

【0010】

本発明は、ＭＳ及び関連する疾患、欠陥及び／又は症状の併用治療に関し、前記併用治療は、シクロチド及びｋＯＲのリガンドの投与／医学的使用を含む。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明はさらに、
(i) ＭＳの治療(例えば、療法による治療又は予防的/予防的治療);
(ii) 特にオリゴデンドロサイトの再ミエリン化 (すなわち、その誘導又は増加)、及び/又は ＣＮＳ 病変 (例えば、脳病変) の改善 (例えば、減少又は養生/治癒);
（ｉｉｉ）脱髄（特にオリゴデンドロサイトの）の防止又は低減、及び／又は（新しい）ＣＮＳ病変（例えば、脳病変）の形成の防止、及び／又は既存のＣＮＳ病変（例えば、脳病変）の低減； 及び/又は
(iv) 疼痛、特に神経因性疼痛 (例えば、中枢性又は末梢性神経因性疼痛) 及び/又は ＭＳ に起因する/付随する疼痛の治療 (例えば、治療又は予防/予防治療による治療)への使用のための、
(a)シクロチド；及び
(b)ｋＯＲのリガンド、
又は (a) と (b) の組み合わせ、
を含む医薬組成物に関する。

【0012】

本発明はさらに、
(v) ＣＮＳ病変の治療; 及び/又は
(vi) 脱髄疾患、神経障害及び/又は神経関連疾患の治療への使用のための、
(a)シクロチド；及び
(b)ｋＯＲのリガンド、
又は (a) と (b) の組み合わせ、
を含む医薬組成物に関する。

【0013】

本発明はまた、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び／又は（ｖｉ）、上記において、ｋＯＲのリガンド（を含む医薬組成物）と組み合わせて使用するシクロチド（を含む医薬組成物）にも関する。

【0014】

本発明はまた、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び／又は（ｖｉ）、上記において、シクロチド（を含む医薬組成物）と組み合わせて使用するｋＯＲのリガンド（を含む医薬組成物）にも関する。

【0015】

本発明はさらに、
(i) ＭＳの治療(例えば、療法による治療又は予防的/予防的治療);
(ii) 特にオリゴデンドロサイトの再ミエリン化 (すなわち、その誘導又は増加)、及び/又は ＣＮＳ 病変 (例えば、脳病変) の改善 (例えば、減少又は養生/治癒);
（ｉｉｉ）脱髄（特にオリゴデンドロサイトの）の防止又は低減、及び／又は（新しい）ＣＮＳ病変（例えば、脳病変）の形成の防止、及び／又は既存のＣＮＳ病変（例えば、脳病変）の低減； 及び/又は
(iv) 疼痛、特に神経因性疼痛 (例えば、中枢性又は末梢性神経因性疼痛) 及び/又は ＭＳ に起因する/付随する疼痛の治療 (例えば、治療又は予防/予防治療による治療)方法に関し、
前記方法は、それを必要とする対象に薬学的に有効な量の
(a)シクロチド；及び
(b) ｋＯＲのリガンド、
又は（ａ）及び（ｂ）の組合せ、又は（ａ）及び（ｂ）を含む医薬組成物、又は前記組合せを投与する工程を含む。

【0016】

本発明はさらに、
(v) ＣＮＳ病変の治療; 及び／又は
(vi) 脱髄疾患、神経障害及び/又は神経関連疾患の治療方法に関し、
前記方法は、それを必要とする対象に薬学的に有効な量の
(a)シクロチド；及び
(b) ｋＯＲのリガンド、
又は（ａ）及び（ｂ）の組合せ、又は（ａ）及び（ｂ）を含む医薬組成物、又は前記組合せを投与する工程を含む。

【0017】

本明細書の以下及び添付の実施例に記載されているように、シクロチドがｋＯＲに結合することができ、特にｋＯＲのリガンドとして作用することが驚くべきことに見出されたため、本発明は上記で特定された技術的問題を解決する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、ｋＯＲに対するシステインに富む植物抽出物の結合効果を示す。データは、試験濃度 ３００μｇ/ｍＬ での結合率を示している。 提示されたデータは、それぞれが重複して実行された２つの独立した実験から取得される。 特異的結合は、全結合から非特異的結合を差し引いて計算し、１．０ に標準化した (１ｎＭの ［^３Ｈ］－ジプレノルフィン)。 ダイノルフィンＡ１－１３ (１０ｎＭ) を陽性対照として使用した。 赤で着色された植物抽出物は、最も顕著な結合効果を示した。

【0019】

【図2】図２は、ｋＯＲ での C. ipecacuanha及び V. tricolor の植物抽出物の受容体薬理学を示す。Ａ) 結合データは、C. ipecacuanha (３００ μg/mL) 及び対照ダイノルフィン Ａ１－１３ (１０ｎＭ) のペプチド濃縮画分による放射性 ［^３Ｈ］－ジプレノルフィン (１ｎＭ) の置換を測定することによって得られた（ｎ＝２）。 Ｂ) 分離されたカリペ ペプチド (１０ μ Ｍ) とダイノルフィンＡ１－１３（１０ ｎＭ）の置換結合 (ｎ＝２)、及び Ｃ) ｋＯＲ を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞膜におけるカリペ１０ の濃度応答曲線 (ｎ＝３)。カリペ１０ 及びダイノルフィン Ａ１－１３ の Ｋｉ値は、それぞれ 1 μＭ 及び２８０ｐＭ と計算された。Ｄ) V. tricolor（３００ μｇ/ｍＬ) 及び陽性対照ダイノルフィンＡ１－１３（１０ｎＭ）のペプチド濃縮画分による、放射性標識 ［^３Ｈ］－ジプレノルフィンの置換結合(ｎ＝２)。 Ｅ) V. tricolor から分離されたビトリペプチドの分析用 ＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムと ＭＡＬＤＩ 質量スペクトル。 ペプチド質量（３４３１．８７）は、モノアイソトピック質量 (［Ｍ^＋Ｈ］^＋) としてラベル付けされる。 Ｆ) 分離されたビトリ ペプチド (１００ μｇ/ｍＬ) は、競合する １ｎＭ の放射性リガンドについて試験された。 ダイノルフィンＡ１－１３（１０ｎＭ）は陽性対照として機能した(ｎ＝２)。特異的結合は、総結合から非特異的結合を差し引くことによって計算され、１．０ (分数) 又は １００％ (パーセンテージ) に正規化された。 １．０ 又は １００％ は、膜 ２ｍｇ当たり約５～７ピコモルのリガンドが結合していることを示す。 データは平均 ±ＳＤとして示され、濃度応答曲線は非線形回帰（シグモイド、３パラメーター、１のヒル勾配）によって適合された。

【0020】

【図3】図３は、ｋＯＲにおける［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１の受容体薬理学を示す。Ａ)ｋＯＲ を安定して発現するＨＥＫ２９３ 細胞膜における ［Ｔ２０Ｋ］－カラタ Ｂ１ による放射性ジプレノルフィン (１ ｎＭ) の置換放射性リガンド結合 (ｎ ＝２)。 全結合から非特異的結合を差し引くことによって特異的結合を計算し、１００％に標準化した(５～７ｐｍｏｌ/ｍｇタンパク質)。Ｂ) ｋＯＲ を安定して発現する ＨＥＫ２９３ 細胞における［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１の機能的ｃＡＭＰアッセイ（ｎ＝４）。 細胞を指示濃度の[Ｔ２０Ｋ]－カラタＢ１で３７℃で３０分間処理した。 データは、最高の内因性リガンド濃度で検出された最大活性化のパーセンテージに正規化された。Ｃ) ナノルシフェラーゼ （ＮＬｕｃ）と ｋＯＲ の Ｃ 末端に導入されたＥＧＦＰ（ｋＯＲ－ＥＧＦＰ） 及び β－アレスチン２ (β－アレスチン ２－ＮＬｕｃ) の間で ＢＲＥＴ をモニターした。 ｋＯＲ－ＥＧＦＰとβ－アレスチン２－ＮＬｕｃを共発現するＨＥＫ２９３細胞は、ルシフェラーゼ基質（フリマジン）の添加５分後に、ダイノルフィンＡ１－１３（１０μＭ）とＴ２０Ｋ（１０及び１００μＭ）によって刺激された。 結果は、アゴニストの存在下と非存在下での ＢＲＥＴシグナルの差として示され、平均値±ＳＤ (ｎ＝３) として表される。Ｄ) ダイノルフィンＡ１－１３及びＴ２０Ｋの濃度応答曲線 （ｎ＝３）。 リガンドを５分間インキュベートし、終点に続いて生物発光の測定を行った。 リガンド促進 ＢＲＥＴ は、(発光 ＥＧＦＰリガンド/発光ＮＬｕｃリガンド)－(発光ＥＧＦＰ ＨＢＳＳ/発光 ＮＬｕｃ ＨＢＳＳ) として計算された。 データは、ダイノルフィン１－１３ の最大活性化に対して正規化された。 データは平均 ±ＳＤ として表示され、非線形回帰 (シグモイド、３つのパラメーター、ヒル勾配 １) によって適合される。

【0021】

【図4】図４は、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１が、ｋＯＲ のアロステリック モジュレーターとして機能することを示す。Ａ) さまざまな濃度の［Ｔ２０Ｋ］－カラタ Ｂ１とダイノルフィン Ａ１－１３ 又はＢ) ｋＯＲ を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞膜におけるＵ５０，４８８ の共培養による放射性ジプレノルフィン (１ｎＭ) の置換放射性リガンド結合 (ｎ＝２)。 全結合から非特異的結合を差し引くことによって特異的結合を計算し、１００％に標準化した(５～７ｐｍｏｌ/ｍｇタンパク質)。Ｃ) ダイノルフィンＡ１－１３又は Ｄ) ｋＯＲ を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＵ５０，４８８と組み合わせた ［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１ の機能的ｃＡＭＰ アッセイ(ｎ＝５)。 細胞を ［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１と共に３７℃で３０分間インキュベートした後、ダイノルフィンＡ１－１３ 又はＵ５０，４８８ と ３７℃でさらに ３０ 分間インキュベートした。 データは、最高の内因性リガンド濃度で検出された最大活性化のパーセンテージに正規化された。Ｅ) ＢＲＥＴ は、ナノルシフェラーゼ （ＮＬｕｃ）と、ｋＯＲ のＣ 末端に導入されたＥＧＦＰ（ｋＯＲ－ＥＧＦＰ） 及び β－アレスチン２ (β－アレスチン２－ＮＬｕｃ) の間でモニターされた。 ｋＯＲ－ＥＧＦＰ と β－アレスチン２－ＮＬｕｃを共発現する ＨＥＫ２９３ 細胞は、ルシフェラーゼ基質 (フリマジン) の添加の５分後に、Ｕ５０，４８８（１０μＭ） と Ｔ２０Ｋ (１０ μＭ) によって刺激された。 結果は、アゴニストの存在下と非存在下での ＢＲＥＴ シグナルの差として示され、平均値 ± ＳＤ（ｎ＝３） として表される。Ｆ) Ｕ５０，４８８ 及び Ｔ２０Ｋの濃度応答曲線 （ｎ＝４）。 リガンドを５分間インキュベートし、終点に続いて生物発光の測定を行った。 リガンド促進ＢＲＥＴは、(発光ＥＧＦＰリガンド/発光ＮＬｕｃリガンド) － (発光ＥＧＦＰ ＨＢＳＳ/発光ＮＬｕｃ ＨＢＳＳ) として計算された。 データは、Ｕ５０，４８８ の最大活性化に対して正規化された。 データは平均 ±ＳＤ として表示され、非線形回帰 (シグモイド、３つのパラメーター、ヒル勾配１) によって適合される。

【0022】

【図5】図５は、VivoTag 標識［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１の体内分布を示す。［Ｔ２０Ｋ－ＶｉｖｏＴａｇ］－ｋＢ１ (５ｍｇ／ｋｇ) をＥＡＥマウスに腹腔内注射した。標識ペプチドの体内分布は、ＩＶＩＳ を使用して、示された疾患スコア (０．５ 及び １．７５) でモニターされた。注射後４時間の器官を蛍光強度についてスキャンした。Ａ) [Ｔ２０Ｋ－ＶｉｖｏＴａｇ]－ｋＢ１ 及び Ｂ）エバンブルー 色素は脊椎における Ｃ）、Ｄ）と同様に脳にも蓄積する。Ｅ) [Ｔ２０Ｋ－ＶｉｖｏＴａｇ]－ｋＢ１ 及び Ｆ） エバンブルー色素の定量化は、ＩＶＩＳ Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して実行された。

【0023】

【図6】図６は、シクロチドの配列多様性を示す。Ａ) Ｏ．ａｆｆｉｎｉｓ、Ｂ） Ｃ．ｉｐｅｃａｃｕａｎｈａ及びＣ）Ｖ．ｔｒｉｃｏｌｏｒで同定されたシクロチドは、ＭＳ の潜在的な治療法として新規の ｋＯＲ リガンドを発見するための成長する適所を構成する。配列 アラインメント及び配列多様性ホイールは、http://www.cybase.org.au/ で入手できるツールを使用して生成された。

【0024】

【図7】図７は、シクロチドの合成を示す。シクロチドは、Ｆｍｏｃ化学を使用して線状前駆体として組み立てられ、天然化学連結を使用して環化された。 (１) ジ－Ｆｍｏｃ－３，４－ジアミノ安息香酸 （Ｄｂｚ） をリンカーとして含むドーソン樹脂が出発点である。 (２) カップリングは、マイクロ波支援Ｆｍｏｃ合成を使用して実行される (星印は最初のアミノ酸をマークし、最後のアミノ酸は ＢＯＣ 保護システインである)。(３) 樹脂結合Ｄｂｚ前駆体のアシル化と活性化により、Ｎ－アシル尿素ペプチド (Ｎｂｚ－ペプチド) が得られる。 (４) 1 工程での Ｎｂｚ－ペプチドの完全な脱保護と樹脂切断 (Ａｒ、Ａｒｙｌ)。 (５ａ) チオエステル化によるペプチド環化、(５ｂ) Ｓ，Ｎ－分子内アシル シフト及び天然化学連結、及び (５ｃ) 天然の折りたたみを持つシクロチドを生成するための酸化的折りたたみ。 シクロチド (カラタＢ１、ＰＤＢ ＩＤ コード １ＮＢ１) のリボン表現と ［Ｔ２０Ｋ］カラタＢ１の配列が示されている。 システイン、ジスルフィド結合 (黄色)、及びシステイン間ループが示されている。

【発明を実施するための形態】

【0025】

最初の実験（詳細については添付の実施例を参照）において、いくつかの植物種からのペプチドに富む画分が、ｋＯＲに対して親和性を示すことが示された。 重要なことに、Carapichea ipecacuanha 及び Viola tricolor から分離されたシクロチドは、低μＭ 範囲の親和性で ｋＯＲ に結合できた。特に、突然変異シクロチド［Ｔ２０Ｋ]－カラタＢ１(本明細書では「Ｔ２０Ｋ」、「［Ｔ２０Ｋ］」、又は「Ｔ２０Ｋ自体/それ自体」とも呼ばれる;元はOldenlandia affinisで同定された;例えば、国際公開第２０１３/０９３０４５号を参照）は、ｋＯＲに結合して完全に活性化し、オルソステリックｋＯＲリガンドとして作用できることが本明細書で示された。 さらに、重要なことに、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１ は、本発明との関連で、ｋＯＲ のアロステリック モジュレーターとして作用し、それによって (正のアロステリック モジュレーター、ＰＡＭ として) 定義された (他の) オルトステリックｋＯＲリガンドの有効性/効力を高めることが示されました。特に、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１は、ダイノルフィンＡ１－１３及びＵ５０，４８８などのｋＯＲリガンドの効力/有効性に影響を与えることができることが、本発明の文脈で示された。 さらに、驚くべきことに、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１自体はβ－アレスチン２を動員せず、β－アレスチン２の動員における Ｕ５０，４８８ のようなｋＯＲリガンドの有効性を低下させることさえあることが、本発明の文脈で示された。従って、シクロチドはｋＯＲ依存性及び中枢媒介性の副作用を欠いており、ダイノルフィンＡ１－１３及びＵ５０、４８８などのｋＯＲアゴニストのそのような効果を減少させる可能性さえあるという確かな証拠が、本発明の文脈において提供される。

【0026】

従って、驚くべきことには、シクロチド、特に［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１が、オルソステリックリガンド及びアロステリックモジュレーターとして作用し、そしてそれらの作用が、ｋＯＲ依存性及び中枢性を介した悪影響の減少を伴うという点で、ｋＯＲでバイトピック作用機序を示すことができることが本発明の文脈で実証された。換言すれば、驚くべきことには、シクロチド、特に［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１は、ｋＯＲにおいてオルソステリックリガンドであり得るだけでなく、アロステリックな方法でｋＯＲを結合することができるバイトピックリガンドとしても作用し得ることが、本発明の文脈において実証された。

【0027】

最後に、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１がＥＡＥモデルで ＣＮＳ に浸透する能力は、本明細書及び添付の実施例で実証された。

【0028】

従って、(a) シクロチド、特に ［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１、及び (a) ｋＯＲ リガンド、特にダイノルフィン Ａ １－１３ 又は Ｕ５０，４８８のようなオルソステリックｋＯＲ アゴニストの組み合わせによるｋＯＲの標的化が、再ミエリン化及び/又は疼痛療法、さらに具体的にはＭＳ（再ミエリン化及び/又は疼痛）療法などの脱髄疾患、神経障害及び/又は神経関連疾患の治療（これらはさらに有益な免疫抑制効果を約束する）に高い可能性を秘めていることが本発明の文脈において提供される証拠がある。さらに、それらの配列の多様性により、シクロチドは、ｋＯＲリガンドと組み合わせた場合、再ミエリン化及び/又は疼痛治療、より具体的にはＭＳ（再ミエリン化及び/又は疼痛）治療のような、脱髄疾患、神経障害及び/又は神経関連疾患の治療のための理想的な候補となる（添付の図６Ａ、Ｂ、及びＣも参照のこと）。

【0029】

本発明に関連して適用される治療、特にＭＳ治療及び関連する疾患、欠陥及び／又は症状の治療は、 再燃率及び/又はＭＳエピソードの頻度の減少、及び/又は（関係する患者の）障害の進行の予防又は減少を含むか、又はそれらをもたらす可能性がある。

【0030】

さらに、本発明に関連して適用される治療、特にＭＳ及び関連する疾患、欠損及び／又は症状の治療は、以下を含むか、又は結果として生じることがある：
(ii) 特にオリゴデンドロサイトの再ミエリン化 (すなわち、その誘導又は増加)、及び/又は ＣＮＳ 病変 (例えば、脳病変) の改善 (例えば、減少又は治癒/治癒);
（ｉｉｉ）脱髄（特にオリゴデンドロサイトの）の防止又は低減、及び／又はＣＮＳ病変（例えば、脳病変）の形成の防止、及び／又は既存のＣＮＳ病変（例えば、脳病変）の低減； 及び/又は
(iv) 疼痛、特に神経因性疼痛 (例えば、中枢神経因性又は末梢神経因性疼痛) 及び/又は ＭＳ に起因する/ＭＳ に伴う疼痛の治療 (例えば、治療又は予防/予防治療による治療)。

【0031】

さらに、本発明の治療、特にＭＳ及び関連する疾患、欠損及び／又は症状の治療に関して、
(i) 特にオリゴデンドロサイトの再ミエリン化が誘導又は増加され、及び/又は ＣＮＳ 病変 (例えば、脳病変) が改善され(例えば、減少又は治癒/治癒され);
（ｉｉ）特にオリゴデンドロサイトの脱髄が防止又は低減されるべきであり、及び／又はＣＮＳ病変（例えば脳病変）の形成が防止されるべきであり、及び／又は既存のＣＮＳ病変（例えば脳病変）が低減されるべきであり； 及び/又は
(iii) 疼痛、特に神経障害性疼痛 (例えば、中枢性又は末梢性神経障害性疼痛) 及び/又は ＭＳ に起因する/ＭＳ に付随する疼痛が治療されるべきである。

【0032】

本発明の文脈において、特にＭＳ関連疾患、欠陥及び／又は症状の治療は、例えば、以下を意味すると考えられる：(形成) (新しい) ＣＮＳ 病変 (例えば、脳病変)、(オリゴデンドロ サイトの) 脱髄、(中枢性又は末梢性の) 神経因性疼痛、ＭＳに起因する/付随する疼痛、障害 (の進行) など。

【0033】

治療、特にＭＳ及び関連する疾患、欠陥及び／又は症状の治療はまた、ＯＰＣ分化、再ミエリン化及び／又はニューロンの（その後の）機能回復の促進を含み得るか、又は促進し得る。

【0034】

脱髄疾患、神経障害及び／又は神経関連疾患、特にＭＳ及び関連疾患、欠損及び症状の意味は、当業者に周知である。 それらは、例えば、Ciccarelli (前記) 及び Sospedra (前記) に記載されている。

【0035】

本発明に従って治療される脱髄疾患、神経障害及び／又は神経関連疾患の例は、以下から成る群から選択される：MS、視神経炎、デビック病、炎症性脱髄疾患、中枢神経系ニューロパシー、ミエロパシー（背部垂葉など）、白質脳症及び白質ジストロフィー、又は以下から成る群から選択される：ギラン・バレー症候群とその慢性対応物、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、抗ＭＡＧ（ミエリン関連糖タンパク質）末梢神経障害、シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）病、銅欠乏症、及び進行性炎症性神経障害。

【0036】

本発明の１つの側面に関連して、有害作用、特にｋＯＲ依存性有害作用（中枢媒介性又は末梢媒介性）、より具体的にはβ－アレスチン２動員から生じる有害作用は、低減／改善叉は回避されるべきである。そのような有害作用は、例えば、（関連する有害作用）オピオイドクライシス／耐性及び／又は不快気分、鎮静、利尿及び／又は幻覚である（Lalanne 前記を参照のこと）。 従って、本発明によるＭＳ及び関連する疾患、欠損及び／又は症状の治療の一態様との関連で、そのような副作用の１つ又は複数は、低減／改善又は回避されるべきである。

【0037】

本発明の文脈において標的とされるｋＯＲは、ヒトｋＯＲ（ｈｋＯＲ）であることが好ましい。 従って、好ましいｋＯＲリガンドはｈｋＯＲリガンドである。 一般的に、標的とされるｋＯＲは、治療される患者のｋＯＲであることが好ましい。 例えば、治療される患者がヒトである場合、標的とされるｋＯＲは好ましくはｈｋＯＲである。

【0038】

ｋＯＲ、特にｈｋＯＲは、当技術分野で周知である（例えば、Lalanne, 前記 及び Du, 前記に記載される）。 ｈｋＯＲ の詳細な特徴付け、特にアミノ酸配列情報は、データベース エントリ https://www.uniprot.org/uniprot/P41145 から取得できる。

【0039】

「（ｈ）ｋＯＲリガンド／アゴニスト」および「（ｈ）ｋＯＲのリガンド／アゴニスト」の意味は当技術分野で公知であり、それぞれの用語は本明細書において適宜使用される（例えば、https://www.guidetopharmacology.org/GRAC /ObjectDisplayForward?objectId=318&familyId=50&familyType=GPCR)。

【0040】

本発明の文脈において、ｋＯＲのリガンドは、ｋＯＲのアゴニスト（「偏りのない」リガンド／ｋＯＲの「偏りのない」アゴニスト」）、ｋＯＲの部分アゴニスト、又はｋＯＲの偏りのあるアゴニストであり得る。

【0041】

本発明の文脈において、それぞれｋＯＲの「アゴニスト」であること、及びｋＯＲに対して「アゴニスト」機能を示すことは、ｋＯＲが活性化されること、すなわち、その関連する生物学的機能が誘導又は増加されることを意味する。特に、それぞれｋＯＲの「アゴニスト」であること、及びｋＯＲに対して「アゴニスト」機能を示すことは、本発明の文脈において、オピオイド刺激に対する ｋＯＲ の応答、例えば細胞内 ｃＡＭＰ の減少が誘導又は増加し、ＲＡＦ／ＭＥＫ１／２／ＥＲＫ１／２ 又は ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３ シグナル伝達カスケードの活性化につながることを意味する(https://pubmed.ncbi .nlm.nih.gov/27881770-enhancing-remyelination-through-a-novel-opioid-receptor-pathway/?from_single_result=borniger+and+hesp; Borniger, J Neurosci 36(47), 2016, 3)。ｋＯＲの関連する生物学的機能を試験するためのアッセイは、当技術分野で知られており、例えば、https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27881770-enhancing-remyelination-through-a-novel-opioid-receptor-pathway/?from_single_result=borniger+and+hespに記載されている。さらに、そのようなアッセイは、添付の実施例（例えば、実施例２及び３）に記載されている。ｋＯＲの複数のアゴニストが当技術分野で知られているhttps://www.guidetopharmacology.org/GRAC/ObjectDisplayForward?objectId=318&familyId=50&familyType=GPCR。ｋＯＲアゴニストのいくつかの非限定的な例を添付の表６に示す。

【0042】

通常、ｋＯＲ のアゴニストは完全なリガンド/アゴニスト、つまり「偏りのない」リガンド/アゴニストである。 これは、それらがｋＯＲシグナル伝達経路、例えば特定の経路、すなわちＧタンパク質経路、及び/又はアレスチン経路のいずれかを完全に活性化することを意味する。例えば、本発明の文脈において、ｋＯＲの「偏りのない」リガンド／アゴニストは、アレスチン動員、特にβ－アレスチン２動員を誘導する、または誘導することができるリガンド／アゴニストであるか 又は、特に関連する内因性または薬学的に有効な濃度/用量で、アレスチン動員、特にβ－アレスチン２動員を増加させる、又は増加させることができるリガンド/アゴニストである。理論に拘束されるわけではないが、アレスチン動員、特にβ－アレスチン２ 動員は、ｋＯＲ のより高い (及び/又はより速い) 内在化と関連している可能性がある。 これにより、例えば耐性の可能性が高まる可能性がある（オピオイド危機を参照）。 アレスチン動員、特にβ－アレスチン２動員は、オピオイドクライシス/耐性及び/又は不快感、鎮静、利尿及び/又は幻覚などの悪影響と関連しているため (Lalanne 前記)、 完全にアゴニストで「偏りのない」ｋＯＲリガンドは通常、特に必要な医薬的に有効な濃度/用量で、オピオイドクライシス/耐性及び/又は不快感、鎮静、利尿及び/又は幻覚などの悪影響を示す (Lalanne 前記)。

【0043】

複数の完全アゴニストで「偏りのない」ｋＯＲリガンドは当技術分野で知られている。 そのようなｋＯＲアゴニストのいくつかの非限定的な例を添付の表６に示し、単に「アゴニスト」と呼ぶ。

【0044】

完全にアゴニストの「偏りのない」ｋＯＲリガンド/アゴニストに加えて、ｋＯＲのリガンド/アゴニストは「偏った」リガンド/アゴニストでもあり得る。 これは、それらがｋＯＲシグナル伝達経路、例えば特定の経路、すなわちＧタンパク質経路、又はアレスチン経路を活性化しない（または程度が低い）ことを意味する。例えば、本発明の文脈において、ｋＯＲの「偏った」リガンド／アゴニストは、アレスチン動員、特にβ－アレスチン２動員を誘発しない（又はより低い程度で）、又は誘発することができない（又はより低い程度で）リガンド／アゴニストであるか、又は、アレスチン動員、特にβ－アレスチン２ 動員、特に、関連する内因性又は薬学的に有効な濃度/用量で、アレスチン動員を増加させない (又はより低い程度まで)、又は増加させることができない (又はより低い程度まで) リガンド/アゴニストである。本発明の文脈において、「偏った」ｋＯＲリガンド／アゴニストは、特に必要とされる医薬的に有効な濃度／用量で、オピオイドクライシス／耐性及び／又は不快感、鎮静、利尿及び／又は幻覚などの悪影響をほとんど示さないか、または全く示さない。例えば、本発明の文脈において、Ｇタンパク質に偏ったリガンド／アゴニストは、副作用の減少を示す。 複数の「偏った」ｋＯＲリガンド／アゴニストは当技術分野で知られている。 そのようなｋＯＲアゴニストのいくつかの非限定的な例は、添付の表６に示され、「偏ったアゴニスト」と呼ばれる。

【0045】

ｋＯＲリガンド／アゴニストの「偏り」及びそれらの「偏り係数」は、それぞれ、絶対的な特徴ではなく、ある範囲内で変化し得ることが当業者によって認識されている。 特に、「偏りのない」ｋＯＲリガンド/アゴニストから「偏った」ｋＯＲリガンド/アゴニストへの「スムーズな移行」がある。しかし、ｋＯＲシグナル伝達経路に関して典型的な「偏った」ｋＯＲリガンド/アゴニストが存在する。 典型的な「偏った」ｋＯＲリガンド／アゴニストの例は、当技術分野で知られており、添付の表６に示されている（「偏ったアゴニスト」）。 「偏った」ｋＯＲリガンド／アゴニストは、天然に存在する「偏った」ｋＯＲリガンド／アゴニストであることが好ましい。本発明に従って使用される典型的な「偏った」ｋＯＲリガンド／アゴニストの特定の非限定的な例は、 コリボリド（きのこCollybia maculate）、ノリボガイン（植物イボガの代謝物）、Ｂ－６４（サルビノリンＡ誘導体）、ナルフラフィン（モルヒネ誘導体）、トリアゾール１．１、６－ＧＮＴＩ、ＨＳ６６６、ＨＳ６６５、及びメシルサルビノリンＢである。

【0046】

同様に、ｋＯＲ シグナル伝達経路に関して典型的な「偏りのない」ｋＯＲ リガンド/アゴニストがある。 典型的な「偏りのない」ｋＯＲリガンド／アゴニストの例は、当技術分野で知られており、添付の表６に示されている（「アゴニスト」）。 本発明に従って使用される典型的な「偏りのない」ｋＯＲリガンド／アゴニストの特定の非限定的な例は、ダイノルフィンＡ－（１－１３）、ダイノルフィン－（１－１１）、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィンＡ－（１－８）、Ｕ５０４８８、Ｕ６９５９３、ＧＲ ８９６９６、スピラドリン、ＢＲＬ－５２５３７、ＪＴ０９、ジフェリケファリン(ＣＲ８４５、ＦＥ－ ２０２８４５)（Ｄ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－[γ－（４－Ｎ－ピペリジニル)アミノカルボン酸としても知られている）、ダイノルフィン、ナルブフィン、ペンタソジン、ペチジン、及びスルフェンタニルである。

【0047】

当業者は、所与のｋＯＲリガンド／アゴニストの「バイアス因子」を知っているか、又は少なくとも容易に試験することができる。 それぞれのアッセイは、添付の実施例に記載されており、当技術分野で知られている(例えば、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3868907 (White, Mol Pharmacol 85(1), 2014, 83-90) 及びhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25320048 (White, J Pharmacol Exp Ther 352(1), 2015, 98-109)を参照のこと)。

【0048】

完全アゴニストの「偏りのない」ｋＯＲリガンド/アゴニストに加えて、ｋＯＲのリガンド/アゴニストは「部分的」リガンド/アゴニストでもあり得る。「部分的な」ｋＯＲリガンド/アゴニストであるということは、リガンド/アゴニストが、内因性比較/標準リガンドと比較して、有効性が低いことを意味する(特定の経路、例えば、Ｇタンパク質又はアレスチン又は他の経路、典型的にはＧタンパク質経路)。非限定的な例として、Ｅｍａｘ は １ ～ ９９％ の間で減少し；０％ はアンタゴニストであり、そして１００％ は内因性完全アゴニストである。 実際には、「部分的」ｋＯＲリガンド/アゴニストは、内因性完全リガンド/アゴニストの有効性の約２０～８０％を有し得る。複数の「部分的」ｋＯＲリガンド／アゴニストは当技術分野で知られている。 そのようなｋＯＲアゴニストのいくつかの非限定的な例は、添付の表６に与えられ、「部分アゴニスト」と呼ばれる。 典型的な「部分的」ｋＯＲリガンド／アゴニストの特定の非限定的な例は、ダイノルフィンＢ、ＤＡＭＧＯ、及びエンドモルフィン－１－Ａｍｏ２である。

【0049】

一般的に、本発明に従って使用されるｋＯＲのリガンドは、ｋＯＲの小分子又はペプチドリガンド、例えばｋＯＲの内因性ペプチドリガンドであり得る。 それぞれのリガンドは当技術分野で知られている。 それぞれの例を添付の表６に示し、それぞれ「小分子」、「ペプチド」又は「内因性」と呼ぶ。 ｋＯＲのリガンド、特にアゴニストである小分子の特定の、しかし非限定的な例は、以下にも記載されている：Tangherlini (loc. cit.), Bourgeois (J. Med. Chem. 57, 2014, 6845-60), Molenveld (Bioorg. Med. Chem. Lett. 25, 2015, 5326-30) and Soeberdt (J. Med. Chem. 60, 2017, 2526-51)。1つの側面では、キノキサリンベースのｋＯＲアゴニストを本発明に従って使用することができる（Tangherlini（前記）、Bourgeois（前記）、Molenveld（前記）に記載のものなど）。 そのようなキノキサリンベースのｋＯＲアゴニストの例は、化合物１２及び化合物１４である（例えば、Tangherlini（前記）及びそのセクション４．２．１．及び４．２．３．、並びに下記の表６も参照のこと）。

【0050】

本発明に関して使用されるｋＯＲのリガンドの特定の非限定的な例は、Ｕ５０，４８８又はダイノルフィンＡ－（１－１３）である。

【0051】

使用される（ｈ）ｋＯＲリガンド／アゴニストはオルソステリック（ｈ）ｋＯＲリガンド／アゴニストであることが好ましい。 これは、それが内因性リガンドとして （ｈ）ｋＯＲ の同じ部位に結合するか、又は内因性リガンドであることを意味する。

【0052】

本発明の文脈において、使用される（ｈ）ｋＯＲリガンド／アゴニスト（項目（ｂ））は、使用されるシクロチド（項目（ａ））ではないことが想定される。 従って、使用される（ｈ）ｋＯＲリガンド／アゴニストは、（本発明の医薬組成物、キット又は組み合わせなどにおける）異なる追加の活性成分であると想定される。 使用される（ｈ）ｋＯＲリガンド／アゴニストはシクロチドではないことが好ましい。

【0053】

一般的に、「シクロチド」という用語の意味は当技術分野で知られており、本明細書ではそれに応じて「シクロチド」という用語を使用する（例えば、http://www.cybase.org.au/index.phpのCyBaseを参照のこと）。特に、本発明の文脈で使用される「シクロチド」は、頭尾環化ペプチドであり、このシクロチド鎖には、環状シスチンノット（ＣＣＫ）モチーフに配置された３つのジスルフィド結合を形成できる６つの保存されたシステイン残基が含まれている（シクロチド鎖;図７を参照のこと）。シクロチドのシステイン間配列は、広範囲の残基置換に耐えることができる（例えば、Clark, 2006, Biochem J, 394, 85-93及び図６及び７を参照のこと）。１つの側面では、本明細書で使用される「シクロチド」という用語は、Craik (1999, J Mol Biol, 294, 1327-1336)、 Clark (2006, 前記)、及び特に米国特許第 ７，５９２，５３３ Ｂ１号に記載されているシクロチドを指す。

【0054】

本発明の文脈で使用される「シクロチド」は、ループ１に典型的なＧｌｕ（Ｅ）残基を含み得る（図７を参照のこと）。 しかしながら、他の「シクロチド」も使用することができる。 例えば、カリペ型のシクロチドの中には、ループ 1 に典型的な Ｅ を含まないものがある (Fahradpour Front Pharmacol 8, 2017, 616 を参照のこと)。それにもかかわらず、それらは、本発明による用語「シクロチド」に包含されると考えられる。 「シクロチド」という用語の意味には、ループ １ に典型的な Ｅ を含まない前述のカリペ型環状ノッチンのような「環状ノッチン」も含まれる。

【0055】

特に、本発明の文脈で使用されるｓイクロチドは、環状骨格を形成することができるアミノ酸配列を含み、ここで前記環状骨格は、構造（式Ｉ）を含む：
Cyclo(C[X₁ … X_a]C[X^I ₁ … X^I _b]C[X^II ₁ … X^II _c]C[X^III ₁ … X^III _d]C[X^IV ₁ … X^IV _e]C[X^V ₁ … X^V _f])
式中、
(i) Ｃはシステインであり；
(ii) [X₁ … X_a]、 [X^I ₁ … X^I _b]、 [X^II ₁ … X^II _c]、 [X^III ₁ … X^III _d]、 [X^IV ₁ … X^IV _e]及び [X^V ₁ … X^V _f]のそれぞれは、1つ又は複数のアミノ酸残基を表し、 配列残基内又は配列残基間の各1つ又は複数のアミノ酸残基は、同じであっても異なっていてもよく；そして
（ｉｉｉ）ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは、それぞれの配列中のアミノ酸残基の数を表し、ａからｆのそれぞれは、同じであっても異なっていてもよく、１から約２０までの範囲であり得る。

【0056】

好ましくは、ａは３～６、ｂは４～８、ｃは３～１０、ｄは１、ｅは４～８、そして／又はｆは５～１３である。

【0057】

本発明に関連して使用／投与できる特定のシクロチドは、以下である：カラタ型シクロチド（例えば、カラタＢ１又はその突然変異体又はカラタＢ２又はその突然変異体のようなカラタＢ型シクロチド；表３及び図６Ａも参照のこと）、 カリペ型シクロチド（例えば、カリペ１からカリペ１３のいずれか又はその変異体、又はＰｓｙｌｅ Ｅ又はその変異体；表４及び図６Ｂも参照のこと）、又はビオラ型シクロチド（例えば、表５に列挙されたビオラ型シクロチドのいずれか又はその変異体、特に、本発明に関連して同定された新規な「ビトリ」シクロチド（「ビトリペプチド１００」とも呼ばれる）（ＧＤＰＩＰＣＧＥＴＣＦＴＧＫＣＹＳＥＴＩＧＣＴＣＥＷＰＩＣＴＫＮ）又はその変異体； 表５ 及び図 ６Ｃも参照のこと）。

【0058】

さらに、本発明に従って使用／投与される特定のシクロチドは、Oldenlandia affinis、Viola tricolor、Carapichea ipecacuanha、Psychotria solitudinum、Viola odorata、Momordica charantia 又はBeta vulgarisの抽出物に由来するか、又はその抽出物に含まれ得る。Oldenlandia affinis、Viola tricolor、及び Carapichea ipecacuanha の抽出物が好ましい。カラタＢ型シクロチドの非限定的な例を表３及び図６Ａに示す。 カリペ型シクロチドの非限定的な例を表４及び図６Ｂに示す。 ビオラ型シクロチドの非限定的な例を表５及び図６Ｃに示す。カラタＢ型シクロチドは当技術分野で知られており、そして例えば、国際公開第２０１３／０９３０４５号、Grundemann (JNatProt 75(2), 2012, 167-74; 2013 前記)、Hellinger (J Ethnopharmacol 151(1), 2014, 299-306) 及び Thell (前記)に記載される。カリペ型シクロチドは当技術分野で知られており、そして例えば、Fahradpour (前記)に記載される。ビオラ型シクロチドも当技術分野で知られており、そして例えば、Hellinger (J Proteome Res 14(11), 2015, 4851-62)に記載される。

【0059】

本発明の文脈において使用／投与されるシクロチド、特にカラタＢ型シクロチドは、下記式ＩＩ（配列番号１７）のアミノ酸ストレッチを含み得る：
Xxx₁-Leu-Pro-Val-Cys-Gly-Glu-Xxx₂-Cys-Xxx₃-Gly-Gly-Thr-Cys-Asn-
Thr-Pro-Xxx₁-Cys-Xxx₁-Cys-Xxx₁-Trp-Pro-Xxx₁-Cys-Thr-Arg-Xxx₁ (II)
式中、
Ｘｘｘ_１、Ｘｘｘ_２及びＸｘｘ_３は、任意のアミノ酸、非天然アミノ酸又はペプチド模倣の、好ましくは脂肪族アミノ酸であり得る。 特に、Ｘｘｘ_２は、任意のアミノ酸、非天然アミノ酸又はペプチド模倣体であるがＬｙｓではなく、及び／又はＸｘｘ_３は、任意のアミノ酸、非天然アミノ酸又はペプチド模倣体であり得るが、Ａｌａ又はＬｙｓではない。好ましくは、式ＩＩのＸｘｘ_２及び／又はＸｘｘ_３は全く変異していない。 より具体的には、Ｘｘｘ_１はＧｌｙ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、又は好ましくはＬｙｓであってもよく、Ｘｘｘ_２はＴｈｒであってもよく、及び／又はＸｘｘ_３はＶａｌ又はＰｈｅであってもよい。さらにより具体的には、式ＩＩの１位のＸｘｘ_１はＧｌｙであり得、 式ＩＩの１８位のＸｘｘ_１は、Ｌｙｓ又は、好ましくは、Ｇｌｙであり得、 式ＩＩの２０位のＸｘｘ_１は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、又は好ましくはＬｙｓであり得、 式ＩＩの２２位のＸｘｘ_１は、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり得、 式ＩＩの２５位のＸｘｘ_１は、Ｖａｌ又はＩｌｅであり得、 式ＩＩの２９位のＸｘｘ_１は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、又は好ましくはＬｙｓであり得、 式ＩＩのＸｘｘ_２はＴｈｒであり得、そして／又は式ＩＩのＸｘｘ_３はＶａｌ又はＰｈｅであり得る。

【0060】

式ＩＩの具体的に定義されたアミノ酸残基はまた、特定の（タイプの）シクロチドに依存して変化し得る。 従って、Ｘｘｘ_１、Ｘｘｘ_２及び／又はＸｘｘ_３に関して述べたことは、式ＩＩだけでなく、式ＩＩの特定のアミノ酸ストレッチを含まない他のシクロチドの対応するアミノ酸残基にも当てはまる。 この文脈において、「対応する」は、特に、同じ又は類似の位置にあるアミノ酸残基を意味する。 より具体的には、「対応する」とは、相同であることを意味する。他のシクロチドの例は、本明細書で定義されるカリペ型シクロチド、特に、式ＩＩＩ（配列番号１８）のアミノ酸ストレッチを含む以下で定義されるシクロチド;及び本明細書で定義されるビオラ型シクロチド、特に式ＩＩＩ（配列番号１９）のアミノ酸ストレッチを含む以下で定義されるシクロチドである。

【0061】

本発明の文脈において使用／投与されるシクロチド、特にカリペ型シクロチドは、下記式ＩＩＩ（配列番号１８）のアミノ酸ストレッチを含み得る：
Gly-Xxx₁-Ile-Pro-Cys-Xxx₂-Xxx₃-Xxx₄-Cys-Xxx₅-Xxx₆-Xxx₇-
Xxx₈-Cys-Xxx₉-Xxx₁₀-Xxx₁₁-Ala-Xxx₁₂-Xxx₁₃-Xxx₁₄-Cys-
Xxx₁₅-Cys-Xxx_{16 or}-Xxx₁₇-Xxx₁₈-Xxx₁₉-Cys-Tyr-Xxx₂₀-Xxx₂₁
(配列番号１８)
式中、
Ｘｘｘ１～Ｘｘｘ２１のいずれか又はすべては、任意のアミノ酸、非天然アミノ酸またはペプチドミメティックであり得る。 特に、Ｘｘｘ₁ は、Ｖａｌ、Ａｌａ、又は Ｌｅｕであり得、Ｘｘｘ_２ は Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、又は Ｔｈｒ であり得、 Ｘｘｘ_３は Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、又は Ｓｅｒ であり得、 Ｘｘｘ_４ は Ｓｅｒ 又は Ｔｈｒ であり得、 Ｘｘｘ_５ は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又は Ｐｈｅ であり得、 Ｘｘｘ_６ は Ｐｈ 又は Ａｒｇ であり得、 Ｘｘｘ_７ は Ｉｌｅ 又は Ａｓｎ であり得、Ｘｘｘ_８ は Ｐｒｏ 又は Ａｒｇ であり得、 Ｘｘｘ_９ は、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、又は Ｌｅｕであり得、 Ｘｘｘ_１０ は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、又は Ｖａｌ であり得、 Ｘｘｘ_１１ は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、又は Ｐｒｏ であり得、Ｘｘｘ_１２ は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又は Ａｌａ であり得、 Ｘｘｘ_１３ は Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、又は Ｖａｌ であり得、 Ｘｘｘ_１４ は Ｇｌｙ 又は Ａｒｇであり得、 Ｘｘｘ_１５はＳｅｒ又はＴｈｒであり得、 Ｘｘｘ_１６ は Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、又は Ａｒｇ であり得、 Ｘｘｘ_１７ は Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、又は Ｌｙｓ であり得、Ｘｘｘ_１８ は、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、又は Ｔｙｒ であり得、 Ｘｘｘ_１９ は Ｖａｌ 又は Ｉｌｅ であり得、 Ｘｘｘ_２０ は、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ 又は Ａｓｎであり得、 及び/又は Ｘｘｘ_２１ は Ａｓｎ 又は Ａｓｐであり得る。

【0062】

本発明の文脈において使用／投与されるシクロチド、特にビオラ型シクロチドは、下記式ＩＩＩ（配列番号１９）のアミノ酸ストレッチを含み得る：
Gly-Xxx₁- Xxx₂- Xxx₃-Cys-Gly-Glu-Xxx₄-Cys-Xxx₅-Xxx₆-Xxx₇-
Xxx₈-Cys-Xxx₉-Xxx₁₀-Xxx₁₁-Xxx₁₂-Cys-
Xxx₁₃-Cys-Xxx₁₄-Xxx₁₅-Xxx₁₆-Xxx₁₇-Cys- Xxx₁₈-Xxx₁₉-Xxx₂₀
(配列番号１９)
式中、
Ｘｘｘ_１～Ｘｘｘ_２０のいずれか又はすべては、任意のアミノ酸、非天然アミノ酸またはペプチド模倣性であり得る。 好ましくは、Ｘｘｘ_１～Ｘｘｘ_２０のいずれか又はすべては、（ａ）配列番号１５５に示される「ビトリ」シクロチドの対応するアミノ酸残基の保存的アミノ酸交換であり得る。

【0063】

本発明の文脈で使用／投与されるシクロチドは、天然のシクロチドの変異型であり得る。

【0064】

一般的に、本発明の文脈における「突然変異」は、（天然型又は野生型）シクロチドの構造、特にその一次アミノ酸配列における任意の変化を意味する。 より具体的には、「突然変異」は、（天然型又は野生型）シクロチドの１つ又は複数のアミノ酸残基が交換、置換、又は付加されることを意味する。 １つの特定の側面において、「突然変異」は、点突然変異、すなわち、１つのアミノ酸残基の交換、置換又は付加を指す。 より具体的な側面において、「突然変異」は、1つのアミノ酸残基の交換を指す。本発明に従って使用されるシクロチドの変異型／バリアント型に関して、及び本明細書の他の箇所のそれぞれの変異に関して述べたことは、「突然変異」という用語の意味に準じて適用される。

【0065】

本発明による（天然の）シクロチドの突然変異形は、式ＩＩのＸｘｘ_１及びＸｘｘ_４－８に対応する（例えば相同である）、好ましくは異なるアミノ酸残基によって置換される、式ＩＩの２０位のＸｘｘ_５に対応する（例えば相同である）アミノ酸残基の少なくとも１つを有し得る。そのような突然変異形態の非限定的な例は、配列番号１又は２のアミノ酸位置１、１８、２０及び／又は２９に対応する（例えば相同である）、 好ましくは、配列番号１又は２のアミノ酸位置１８、２０及び／又は２９に対応する（例えば相同である）、 より好ましくは、配列番号１又は２のアミノ酸位置２０及び／又は２９に対応する（例えば相同である）、 最も好ましくは、異なるアミノ酸残基によって置換される、配列番号１又は２のアミノ酸位置２０に対応する（例えば、相同である）、アミノ酸残基の１つ（好ましい）、２つ又はそれ以上を有するシクロチドである。

【0066】

本発明に関連して使用／投与されるシクロチドの突然変異形における特定の突然変異は、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｙ（Ｇ）及び／又はＶａｌ（Ｖ）の突然変異であり得る。 これは、置換されるアミノ酸残基が、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｙ（Ｇ）及び／又はＶａｌ（Ｖ）であってもよいことを意味する。 好ましくは、変異はＬｙｓ（Ｋ）への変異である。 これは、好ましくは置換されるアミノ酸残基を置換する別のアミノ酸残基がＬｙｓ（Ｋ）であり得ることを意味する。 しかしながら、本発明に関連して使用／投与されるシクロチド、特に本発明に関連して使用／投与されるシクロチドの変異形の最も好ましい非限定的な例は、Ｔ２０Ｋ（配列番号７）である。

【0067】

１つの側面によれば、本発明の文脈で使用／投与されるシクロチドは、以下から成る群から選択され得る：
(i)配列番号７、５、４、６又は１５５のいずれか1つに示されるアミノ酸配列の頭尾環化形を含むか、又はそれらから成るシクロチド；
(ii)それぞれ、配列番号７、５、４又は６に示すアミノ酸配列のいずれか１つと同じ変異を有するか、又はそれぞれ、配列番号７、５、４又は６に示すアミノ酸配列のいずれか１つに変異しているアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置に突然変異を有するカラタＢ型シクロチド、カリペ型シクロチド又はビオラ型シクロチド；
（ｉｉｉ）表３、４又は５に示すシクロチドのアミノ酸配列を含むか、又はその頭尾環化形から成るシクロチド、ここで前記アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号７、５、４又は６に示すアミノ酸配列のいずれか１つと同じ変異を有するか、又はそれぞれ、配列番号７、５、４又は６に示すアミノ酸配列のいずれか１つに変異しているアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置に突然変異を有し；
(iv)少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、配列番号７、５、４、６又は１５５のいずれか１つに示される（又は表 ３、４、及び ５のいずれか１つに示される）アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列の頭尾環化形を含むか、又はそれらから成るシクロチド、ここで前記アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号７、５、４又は６に示すアミノ酸配列のいずれか１つと同じ変異を有するか、又はそれぞれ、配列番号７、５、４又は６に示すアミノ酸配列のいずれか１つに変異しているアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置に突然変異を有し；及び
(v)下記アミノ酸配列の頭尾環化形を含むか、又はから成るシクロチド、
アミノ酸配列：
Xxx₁-Leu-Pro-Val-Cys-Gly-Glu-Xxx₂-Cys-Xxx₃-Gly-Gly-Thr-Cys-Asn-
Thr-Pro-Xxx₁-Cys-Xxx₁-Cys-Xxx₁-Trp-Pro-Xxx₁-Cys-Thr-Arg-Xxx₁
(式II;配列番号１７)
式中、
Ｘｘｘ_１ は任意のアミノ酸、非天然アミノ酸またはペプチド模倣体である。 Ｘｘｘ_２は任意のアミノ酸、非天然アミノ酸またはペプチド模倣体であり、好ましくはＴｈｒであり； Ｘｘｘ_３は任意のアミノ酸、非天然アミノ酸又はペプチド模倣体であり、好ましくはＶａｌ又はＰｈｅであり；
アミノ酸配列：
Gly-Xxx₁-Ile-Pro-Cys-Xxx₂-Xxx₃-Xxx₄-Cys-Xxx₅-Xxx₆-Xxx₇-
Xxx₈-Cys-Xxx₉-Xxx₁₀-Xxx₁₁-Ala-Xxx₁₂-Xxx₁₃-Xxx₁₄-Cys-
Xxx₁₅-Cys-Xxx₁₆-Xxx₁₇-Xxx₁₈-Xxx₁₉-Cys-Tyr-Xxx₂₀-Xxx₂₁
(式III; 配列番号１８)
式中、
Ｘｘｘ_１ は Ｖａｌ、Ａｌａ、又は Ｌｅｕ であり； Ｘｘｘ_２ は Ｇｌｙ、Ｓｅｒ 又は Ｔｈｒ、 Ｘｘｘ_３ は Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、又は Ｓｅｒ であり；Ｘｘｘ_４はＳｅｒ又はＴｈｒであり；、 Ｘｘｘ_５ は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又は Ｐｈｅ であり； Ｘｘｘ_６ は Ｐｈ 又は Ａｒｇであり； Ｘｘｘ_７ は Ｉｌｅ 又は Ａｓｎ であり； Ｘｘｘ_８ は Ｐｒｏ 又は Ａｒｇ であり； Ｘｘｘ_９ は Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ 又は Ｌｅｕであり； Ｘｘｘ_１０ は Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、又は Ｖａｌ であり； Ｘｘｘ_１１ は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、又は Ｐｒｏ であり； Ｘｘｘ_１２ は Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又は Ａｌａ であり； Ｘｘｘ_１３ は Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、又は Ｖａｌ であり； Ｘｘｘ_１４ は Ｇｌｙ 又は Ａｒｇ であり； Ｘｘｘ_１５はＳｅｒ又はＴｈｒであり； Ｘｘｘ_１６は Ｌｙｓ、Ｓｅｒ 又は Ａｒｇであり； Ｘｘｘ_１７ は Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ 又は Ｌｙｓ であり； Ｘｘｘ_１８ は Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、又は Ｔｙｒであり；Ｘｘｘ_１９ はＶａｌ又はＩｌｅであり；、 Ｘｘｘ_２０ は、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ 又は Ａｓｎ であり、そして/又は Ｘｘｘ_２１ は Ａｓｎ 又は Ａｓｐであり；又は
アミノ酸配列：
Gly-Xxx₁- Xxx₂- Xxx₃-Cys-Gly-Glu-Xxx₄-Cys-Xxx₅-Xxx₆-Xxx₇-
Xxx₈-Cys-Xxx₉-Xxx₁₀-Xxx₁₁-Xxx₁₂-Cys-
Xxx₁₃-Cys-Xxx₁₄-Xxx₁₅-Xxx₁₆-Xxx₁₇-Cys- Xxx₁₈-Xxx₁₉-Xxx₂₀
(式IIII; 配列番号１９)
式中、
Ｘｘｘ_１～Ｘｘｘ_２０のすべては、任意のアミノ酸、非天然アミノ酸又はペプチド模倣体であってもよく、好ましくは、Ｘｘｘ_１～Ｘｘｘ_２０のいずれか又はすべては、配列番号１５５に示される「ビトリ」シクロチドの対応するアミノ酸残基の対応するアミノ酸残基の保存的アミノ酸交換であってもよく、そして
前記アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号７、５、４又は６に示すアミノ酸配列のいずれか１つと同じ変異を有するか、又はそれぞれ、配列番号７、５、４又は６に示すアミノ酸配列のいずれか１つに変異しているアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置に突然変異を有する。

【0068】

また、この態様の文脈において、好ましいシクロチドは、特にＴ２０Ｋシクロチドの２０位に対応する（例えば、相同である）位置で、Ｌｙｓ（Ｋ）への変異、より具体的にはＴ２０Ｋ変異自体又は対応する突然変異を有するシクロチドである。

【0069】

本発明の文脈で使用／投与されるシクロチドの好ましいが非限定的な例は、上記の（ｉ）～（ｖ）のいずれかに定義されるアミノ酸配列の頭尾環状化形から成るシクロチドである。

【0070】

好ましい実施形態によれば、本発明に関連して使用／投与されるシクロチドは、カラタＢ型シクロチドである。 カラタＢ型シクロチドは、カラタＢ２又はカラタＢ２型シクロチドであってもよく、より好ましくは、カラタＢ１又はカラタＢ１型シクロチドであってもよい。シクロチド カラタＢ 及び Ｂ２は、５つのアミノ酸位置(配列番号１及び ２;国際公開第２０１３／０９３０４５号の図６; 添付の表３を参照のこと)、すなわち、Ｖａｌ～ Ｐｈｅ (ループ２) 、及びカラタ Ｂ２における Ｔｈｒ～Ｓｅｒ (ループ ４)、Ｓｅｒ～Ｔｈｒ (ループ５)、Ｖａｌ～Ｉｌｅ (ループ ５)、及び Ａｓｎ～Ａｓｐ (ループ６) の保存性置換のみが異なる。これらの置換は、重要な構造上の結果を持たず （ＲＭＳＤ_{ｂａｃｋｂｏｎｅ ｋＢ１／ｋＢ２} ＝ ０．５９９Å、国際公開第２０１３／０９３０４５号の図６を参照)、そして２つのペプチドは同様の生物活性プロファイルを有する (Gruber, Toxicon 49, 2007, 561-575)。しかしながら、本発明の文脈において使用／投与される最も好ましいシクロチドは、Ｔ２０Ｋ自体（配列番号７）である。

【0071】

本発明に関連して使用／投与されるシクロチドの特定の非限定的な例は、配列番号７、５、４、６又は１５５に示されるアミノ酸配列の頭尾環化形を含むか、又はから成るシクロチドである。

【0072】

本発明の文脈において、使用されるシクロチドはグラフトされていない、すなわちグラフトされていないシクロチドであることが想定される。

【0073】

「グラフトされていない」又は「グラフトされていないシクロチド」という用語は、 シクロチドが、グラフトテンプレート又はグラフトフレームワークとしてシクロチド足場にグラフトされた、（医薬的に）活性なペプチド又はペプチドエピトープのような、別の／さらなる（医薬的に）活性な成分を含まないことを意味する。

【0074】

従って、本発明の文脈において使用／投与されるシクロチドは、（天然に存在する、天然の、又は変異した）グラフトされていないシクロチド、すなわち、さらなる（医薬的）活性成分を含まないシクロチド「それ自体」／「それ自体」であることが、最も好ましい。

【0075】

シクロチドは、他の治療用ペプチドのように、他の（薬学的に）活性成分の足場として作用できることが当技術分野で知られている（例えば、Gunasekera, 2008, J Med Chem, 51, 7697-704; Wang, ACS Chemical Biology 9, 2014, 156-63; 米国特許第２０１０／０２９８５２８号を参照のこと）。このようなグラフトされたシクロチドは、「シクロチドのグラフトされた類似体」（例えば、Gunasekera 前記）、「生物工学による環状ペプチド」（例えば、Wang 2014 前記）などとしても知られおり、すなわち、さらなる（医薬的）活性成分を含むシクロチドは、本発明の文脈ではあまり好ましくない。グラフトされたシクロチドの特定の例は、さらなる（医薬的に）活性成分によって置換される、２つのシステイン残基間の少なくとも１つの（＋／－完全な）ループを有するシクロチドであることが知られている（例えば、Gunasekera前記; Wang 2014 前記; 米国特許第２０１０／０２９８５２８号を参照のこと）。グラフトされたシクロチドの「さらなる（医薬的）活性成分」は、当技術分野では、「生物学的に活性な配列」（例えば、Gunasekera前記）、「生物活性」エピトープ」/「（ペプチド）エピトープ」（Gunasekera 前記）、「(潜在的に) 治療用アミノ酸配列」(Wang 2014 前記)、「(抗原性) ペプチド」(Wang 2014 前記)、「移植片」(米国特許第２０１０／０２９８５２８号) などとも呼ばれる。そのような「さらなる（医薬的）活性成分」の例は、ＭＯＧ_{３５－５５}エピトープ（Wang 2014 前記）、ＲＧＤエピトープ（米国特許第２０１０／０２９８５２８号）、及び例えば、米国特許第２０１０／０２９８５２８号又はGunasekera 前記の文脈においてシクロチド足場にグラフトされた他のエピトープである。

【0076】

これは、本発明の文脈において好ましく使用されるシクロチド及びシクロチド突然変異体/変種と対照的に見られるべきである。 具体的には、本発明の文脈で使用されるシクロチド変異体/変種は、さらなる(医薬的)活性成分、すなわち移植片が導入されないように変異されていることが想定される。

【0077】

従って、本発明の文脈において、用語「シクロチド」は、シクロチド自体又は変異シクロチド自体、すなわち、グラフトされていないシクロチド又はグラフトされていない変異シクロチドを指すが、シクロチドのグラフト類似体、生物工学による環状ペプチドなど、すなわちグラフトされたシクロチドを除外することを特に想定している。従って、「シクロチド」という用語は、当技術分野でも使用される。

【0078】

本発明の文脈で使用／投与されるシクロチド変異体／変種に関して、２つのシステイン残基間の１つまたは複数の（＋／－完全な）ループが、さらなる（医薬的）活性成分が導入されない限り、さらなるアミノ酸残基（のストレッチ）によって置換されることが可能である。当業者は、グラフトされたシクロチドとグラフトされていないシクロチドとの間、及びグラフトされたシクロチドとグラフトされていないシクロチド変異体/変種をそれぞれ容易に区別できる立場にある。

【0079】

しかしながら、原則として、グラフトされたシクロチドも本発明の文脈で使用／投与することができる。 例えば、グラフトされたシクロチドは、開示されたｋＯＲリガンド及び／又はグラフトされていないシクロチドと組み合わせて使用／投与され得る。

【0080】

本発明の文脈で使用／投与される様々なシクロチドについて、一次配列、すなわちアミノ酸配列主鎖における特定の柔軟性及び可変性は、少なくともいくつかの固定されたアミノ酸残基及びそれらの空間配置によって定義される、それぞれのペプチドの全体的な二次構造及び三次構造が保証される限り、可能であることが理解されるであろう(例えば、上記の式I、II、III及びIIIIを参照のこと)。

【0081】

本明細書で提供される教示に基づいて、当業者は、一方で、本発明に従って作用するシクロチドの対応する変異体/変種を容易に発見/同定する立場にある。 一方、当業者は、所定のシクロチド変異体/変種が、所望の機能、例えば、本明細書の他の箇所に記載されている機能の少なくとも1つを依然として有するかどうかを試験することができる。 そのような試験、すなわちそれぞれのアッセイのための対応する実験指針は、当技術分野で知られており、本明細書および添付の実施例において例示的に提供及び記載されている。

【0082】

従って、１つの側面によれば、本発明はまた、本明細書で定義される（天然の）シクロチドの変異体又は変種の使用／投与、特に表３、４及び５に示されるシクロチドの変異体又は変種の使用／投与、より具体的にはカラタＢ２、又は好ましくはカラタＢ１の変異体又は変種の使用／投与にも関する。変異体又は変種型は、(合成的に) 最適化され得、すなわち、それらは、非変異型/非変種型と比較して、ＭＳ 及び関連する疾患及び/又は症状の治療により適している可能性がある。 シクロチドの変異体/変種形の非限定的な例は、表３、４及び５に示されるシクロチドであり；ここで配列番号４～７のいずれか1つと同じ突全変異の1つ又は複数が行われているか、 又は、配列番号４～７のいずれか１つにおいて突然変異したアミノ酸位置に対応する（例えば、相同である）アミノ酸位置での対応する（例えば、相同な）突然変異の１つ又は複数が行われている。別段の記載がない限り、本明細書で使用される用語「シクロチド」は、「シクロチド変異体／変種」も包含すると想定される。

【0083】

本発明による変異体／変種／改変シクロチドの非限定的な例は、上記のセクション（iv）に示されているか、又は上記セクション（iv）で定義されたアミノ酸配列の頭尾環化形から成るシクロチドである。変異体／変種／改変シクロチドのさらなる例は、配列番号４～７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むシクロチド、又は配列番号４～７から成る群から選択されるアミノ酸配列の頭尾環化形から成るシクロチドである。

【0084】

シクロチドの変異体/変種に関しては、例えば、それぞれの天然又は天然シクロチドの1つ又は複数のアミノ酸が、それぞれ他の1つ又は複数の天然又は合成アミノ酸によって置換されることが想定される。これに関連して、この/これらのアミノ酸置換は保存的アミノ酸置換であり、すなわち置換アミノ酸が、置換されるアミノ酸と同じカテゴリーのアミノ酸に属することが好ましい。例えば、酸性アミノ酸は別の酸性アミノ酸によって置換され得、塩基性アミノ酸は別の塩基性アミノ酸によって置換され得、脂肪族アミノ酸は別の脂肪族アミノ酸によって置換され得、 そして／又は極性アミノ酸は、別の極性アミノ酸によって置換され得る。

【0085】

開示されたシクロチドの変異体/変種をもたらすアミノ酸置換は、結果として得られる変異体/変種の三次構造内の極性及び電荷のパターンが依然として（実質的に）それぞれのシクロチドの三次元構造を模倣/対応するようなものである。

【0086】

変異シクロチド又は変種シクロチドのさらなる例は、以下である：カラタＢ型シクロチド（例えば、カラタＢ１又はその変異体／変種、又はカラタＢ２又はその変異体；表３も参照のこと）；又はカリペ型シクロチド（例えば、カリペ１～１３のいずれか又はその変異体／変種、又はＰｓｙｌｅＥ又はその変異体／変種；表４も参照のこと）；又はビオラ型シクロチド（例えば、表５に示されるようなビオラ型シクロチドのいずれか、又はその変異体／変種；表５も参照のこと）；又は配列番号１もしくは２のアミノ酸配列又は配列番号２０～１８７のいずれか１つのアミノ酸配列の頭尾環化形から成るシクロチド、ここで前記アミノ酸配列は、以下を有する：
(i) 酸性アミノ酸残基から成る群から選択される、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の異なるアミノ酸残基により置換されるその酸性アミノ酸残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個；
(i i) 塩基性アミノ酸残基から成る群から選択される、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の異なるアミノ酸残基により置換されるその塩基性アミノ酸残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個；
(i i i) 脂肪族アミノ酸残基から成る群から選択される、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の異なるアミノ酸残基により置換されるその脂肪族アミノ酸残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個。

【0087】

他の変異体/変種シクロチドは、式II、III又はIIIIのアミノ酸ストレッチを含むが、しかし以下を有する：
(i) 酸性アミノ酸残基から成る群から選択される、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の異なるアミノ酸残基により置換される（残りの特定の）酸性アミノ酸残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個；
(i i) 塩基性アミノ酸残基から成る群から選択される、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の異なるアミノ酸残基により置換される（残りの特定の）塩基性アミノ酸残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個；
(i i i) 脂肪族アミノ酸残基から成る群から選択される、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の異なるアミノ酸残基により置換される（残りの特定の）脂肪族アミノ酸残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個。

【0088】

一般的に、「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」という用語の意味は当技術分野で知られており、本明細書ではそれに従って使用される。 従って、「アミノ酸」がペプチド／タンパク質の成分である場合、「アミノ酸」という用語は、本明細書では「アミノ酸残基」と同じ意味で使用されることに留意されたい。

【0089】

特に、本明細書で言及される「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、天然に存在するアミノ酸、より好ましくは天然に存在するＬ－アミノ酸であると想定される。 しかし、あまり好ましくないが、本発明の文脈における「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、Ｄ－アミノ酸又は非天然（つまり合成）アミノ酸、例えば、 ノルロイシン、β－アラニン、又はセレノシステインであっても良い。

【0090】

「酸性アミノ酸」、「塩基性アミノ酸」、「脂肪族アミノ酸」及び「極性アミノ酸」という用語の意味も当技術分野で知られている（例えば、Stryer, Biochemie, Spectrum Akad. Verlag, 1991, Item I. 2.を参照のこと）。これらの用語は、本発明全体で対応して使用される。 それにより、本発明のシクロチドに関して本明細書に与えられた特定の条件も適用される。

【0091】

特に、本明細書で使用される「酸性アミノ酸」という用語は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎを含む群から選択されるアミノ酸を意味することを意図しており； 本明細書で使用される「塩基性アミノ酸」という用語は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、及びＨｉｓを含む群から選択されるアミノ酸を意味することを意図し、 本明細書で使用される用語「脂肪族アミノ酸」は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、及びＭｅｔを含む群から選択される任意のアミノ酸を意味することを意図し、そして 本明細書で使用される「極性アミノ酸」という用語は、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ及びＴｒｐを含む群から選択される任意のアミノ酸を意味することを意図している。

【0092】

好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用／投与されるシクロチド及び変異体／変種シクロチドは、異なるアミノ酸残基で置換されている、式ＩＩの２０位及び／又は２９位のＸｘｘ１に対応する（例えば、相同である）それらのアミノ酸残基の少なくとも１つを有するシクロチドである。同様に、本発明に従って使用／投与されるシクロチド及び変異体／変種シクロチドはまた、アミノ酸位置１、１８、２０、１、１８、２０、１、１８、２０に対応する（例えば、相同である）、好ましくは、異なるアミノ酸残基で置換されている、アミノ酸位置２０及び／又は２９に対応するそれらのアミノ酸残基の少なくとも１つを有するシクロチドであり得る。この文脈において、「に対応する」は、特に、同じアミノ酸又はアミノ酸残基及び／又は同じ又は類似の位置を意味する。 より具体的には、「対応する」とは、相同であることを意味する。 このような異なるアミノ酸残基は、例えば、それぞれの変異体/変種シクロチドを標識するのに有用であり得る。このような異なるアミノ酸残基の非限定的な例は、Ｌｙｓである。 それぞれの変異体／変種シクロチドの非限定的な例は、配列番号４～７のアミノ酸配列（の頭尾環化形）を含むか、又はそれらからなる変異体／変種シクロチドであり、ここで配列番号５ 又は ７が好ましく； 配列番号７が最も好ましい。

【0093】

特定の側面において、本発明に従って使用される変異体/変種シクロチドは、「第１」及び「第２」Ｃｙｓ（上記の式Ｉに示されるように、それぞれ「第１」及び「第２」Ｃｙｓに対応する）の間、及び／又は「第２の」Ｃｙｓと「第３の」Ｃｙｓとの間（上記の式Ｉに示される「第２の」Ｃｙｓ及び「第３の」Ｃｙｓにそれぞれ対応する）
にある１つ以上のアミノ酸残基を置換していないシクロチドである。

【0094】

好ましくは、そのような突然変異体／変種シクロチドにおいて、「第２」のＣｙｓに隣接するアミノ酸残基はなく、特に式ＩのＮ末端方向で「第２の」Ｃｙｓの隣のアミノ酸残基も、式ＩのＣ末端方向の「第２の」Ｃｙｓの次のアミノ酸残基も、別のアミノ酸残基によって置換されず、特にＬｙｓ又はＡｌａ残基によって置換されない。

【0095】

使用／投与されるシクロチド及びその突然変異体／変種は、加水分解又は例えば血清プロテアーゼのようなプロテアーゼの切断を受けやすい部位を欠いていることが好ましい。 「加水分解」及び「（血清）プロテアーゼ」という用語の意味及び部位の構造は、当技術分野で周知である。

【0096】

好ましい側面では、本発明に従って使用／投与される変異体／変種シクロチドにおいて、特に、本明細書の他の場所でより具体的に定義される変異体／変種シクロチ（例えば、上記項目（ｉｖ）及び（ｉ）～（ｉｉｉ）、又は下記項目（ｉ）～（ｖ）で定義される突然変異体／変種シクロチド）において、 （６）Ｃｙｓ 残基のいずれも別のアミノ酸残基により置換されない。

【0097】

しかしながら、シクロチドの変異体／変種に関して、（６）Ｃｙｓ残基の１つ以上、特に本明細書で定義されるＣｙｓはまた、置換がシクロペプチド内のジスルフィド結合のような個々の分子内結合、すなわち天然シクロチドの正しいドルディング/模倣につながる限り、（１つの）他のアミノ酸によって置換されても良い。そのようなアミノ酸は、とりわけ、ジスルフィド結合を形成することができる－ＳＨ基を有する非天然アミノ酸のような非天然アミノ酸であり得る。 しかしながら、本明細書では、Ｃｙｓ、特に上記式Ｉで与えられるＣｙｓは、天然に存在するアミノ酸、好ましくはＣｙｓ自体であることが好ましい。

【0098】

本発明に従って使用されるシクロチドを形成するアミノ酸の１つ又はいくつかが修飾され得ることも、当業者によって認識されるであろう。 それに従って、本明細書で使用される／定義される任意のアミノ酸は、その改変された形態を表すこともできる。 例えば、本明細書で使用されるアラニン残基は、修飾されたアラニン残基を含み得る。そのような修飾は、とりわけ、メチル化又はアシル化などであり得、それにより、そのような修飾又は修飾されたアミノ酸は、このように修飾されたアミノ酸、より具体的には、このように修飾されたアミノ酸を含むシクロチドが、本明細書で定義されるように依然として機能的に活性である限り、好ましい。そのようなシクロチド、すなわち１つ又はいくつかの修飾アミノ酸を含むシクロチドがこの要件を満たすかどうかを決定するためのそれぞれのアッセイは、当業者に知られており、とりわけ、本明細書、特に実施例の部分にも記載されている。

【0099】

本発明はまた、ＨＣｌ、Ｈ_２ＳＯ_４ 、Ｈ_３ＰＯ_４ 、リンゴ酸、フマル酸、シトロン酸、酒石酸、酢酸などの生理的有機酸及び無機酸との塩など、開示されたシクロチドの誘導体の使用を提供する。

【0100】

本明細書で定義されるシクロチド、並びに本明細書で定義される変異シクロチド及び変種シクロチド（例えば、上記の項目（ｉｖ）又は項目（ｉ）～（ｉｉｉ）を参照のこと）は、本発明による所望の機能の少なくとも１つ、特に、以下の項目（ｉ）～（ｖ）で述べた機能の１つ（又はそれ以上）を有する。 この／これらの機能は、シクロチド及びシクロチド変異体／変種を、本発明によるＭＳ及び関連する疾患、欠損及び／又は症状の治療に十分に適したシクロチドにする。

【0101】

本発明に従って（すなわち、ｋＯＲのリガンドと組み合わせて）使用／投与され、本明細書で定義されるシクロチド又はシクロチド変異体／変種は、下記であると想定される：
（ｉ）本明細書で定義されるｋＯＲのリガンドのバイアス因子を（インビトロ及び／又はインビボで）増加させることができる（例えば、≧５％、≧１０％、≧１５％、≧２０％、≧３０％、≧５０％、≧７５％、≧１００％、≧１．５ 倍、≧２ 倍、≧３ 倍、又は≧５ 倍)；
（ｉｉ）本明細書で定義されるｋＯＲに結合（インビトロ及び／又はインビボ）及び／又は活性化（インビトロ及び／又はインビボ）できる（「活性化する」は、例えば、細胞内ｃＡＭＰの減少、又は本明細書で定義されるベータアレスチナの動員を減少させることを意味する）;
（ｉｉｉ）本明細書で定義されるｋＯＲのオルソステリックアゴニストとして（インビトロ及び／又はインビボで）作用することができ、例えば、低μＭ親和性及び／又は低μＭ効力を有する本明細書で定義されるｋＯＲのオルソステリックアゴニストとして作用することができる (例えば、約 ０．５μＭ ～ ２０μＭ の範囲);
(iv) 本明細書で定義されるｋＯＲのリガンドの、特に、ｋＯＲの内因性リガンドの（例えば、本明細書で定義されるｋＯＲの内因性リガンドの）アロステリックモジュレーター(負又は好ましくは正のアロステリックモジュレーター)として(インビトロ及び/又はインビボで)作用することができ；そして/又は
(v) β－アレスチン２動員、及び/又は(として作用することができる)本明細書で定義されるｋＯＲの偏ったリガンド(例えば、アレスチン動員なし/減少、例えばβ－アレスチン２動員; ｋＯＲの内在化が少ない、及び/又は遅い、又はない; 寛容の機会の減少（オピオイド危機を参照のこと）; 及び/又はオピオイド危機/耐性及び/又は不快気分、鎮静、利尿及び/又は幻覚などの副作用がない/軽減されている)を誘導できない。

【0102】

特に、本発明に従って（すなわち、ｋＯＲのリガンドと組み合わせて）使用／投与され、そして本明細書で定義されるようなシクロチド又はシクロチド変異体／変種は、上記（ｉ）又は（ｖ）、好ましくは上記（ｉ）及び（ｖ）の機能を示すことが想定される。

【0103】

血液脳関門を介して脳に入ることができる当技術分野で知られているノッチンの例がある（例えば、サソリ由来クロロトキシン）。 さらに、特定の状況下（例えば、本明細書で定義される疾患のような疾患（例えば、特定の炎症性又は自己免疫状態）に関連する可能性のある漏れやすい血液脳関門がある場合）では、シクロチドが、血液脳関門を介して脳に入る可能性がある。従って、本発明に従って（すなわち、ｋＯＲのリガンドと組み合わせて）使用／投与され、本明細書で定義されるシクロチド又はシクロチド変異体／変種は、例えば、上記の機能の 1 つ以上に加えて、ＣＮＳ（例えば、脳又は脊髄）を透過することができる。さらに、本発明に従って（すなわち、ｋＯＲのリガンドと組み合わせて）使用／投与され、本明細書で定義されるシクロチド又はシクロチド変異体／変種は、例えば、上記の機能の 1 つ以上に加えて、血液脳関門を通過することができる。

【0104】

しかしながら、シクロチドは、通常、血液脳関門を通過することができない（または低いか又はわずかな程度に過ぎない）と当技術分野で考えられている。従って、ＣＮＳ（例えば、脳又は脊髄）に浸透することも、血液脳関門を通過することもできないシクロチド又はシクロチド変異体／変種は、本発明に従って（すなわち、ｋＯＲのリガンドと組み合わせて）、本明細書で定義されるように、優先的に使用／投与される。 そのようなシクロチド又はシクロチド変異体/変種は、本発明に従って末梢的に作用し得る。 換言すれば、そのようなシクロチド又はシクロチド変異体/変種は、末梢作用によって本発明に従って機能し得る。末梢作用は、末梢免疫細胞の浸潤及び/又は末梢免疫応答(例えば、ＣＤ４＋及び/又はＣＤ８＋Ｔ細胞によるＣＮＳ(例えば、脳又は脊髄)への浸潤など)を低減又は阻害し得る。

【0105】

当業者は、所定のシクロチドが、本明細書で定義されるシクロチドのように（例えば、構造によって）、本発明による関連する特徴、特に上記項目 (i)、(ii)、(iii)、(iv)、及び/又は (v)に定義される特徴を示すかどうかを容易に試験することができる。それぞれの手段及び方法は当技術分野で知られており、本明細書、例えば添付の実施例にも記載されている。これに関連して、当業者は、関連する条件、例えば（シクロチド及び／又はｋＯＲリガンド及び／又はｋＯＲの）濃度を選択及び／又は最適化することができる。 例えば、低マイクロモル範囲（例えば、０．５～２０μＭ）のシクロチド濃度は、この点で適切であり得る。

【0106】

ｋＯＲのリガンドのアロステリックモジュレーター（負又は、好ましくは正）として作用することができるシクロチド（上記項目（ｉｖ）を参照のこと）は、 （ｉ）ｋＯＲリガンドの効力を（約）≧１．１－－、１．２－、１．３－、１．５－、１．８－、２－、３、５－、１０－、 ２０倍又は３０倍; 及び／又は（ｉｉ）（約）５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、５０％、７５％、１００％、１５０％又は２００％以上のｋＯＲリガンドの有効性を調節する可能性がある（低めるか、又は、好ましくは高める）。シクロチドがｋＯＲのリガンドのアロステリックモジュレーターとして作用する能力は、（測定可能な）アレスチン動員を伴わないことが特に想定される（上記項目（ｖ）も参照のこと）。

【0107】

本明細書で定義されるｋＯＲに結合及び／又は活性化することができるシクロチド（インビトロ及び／又はインビボ）（上記項目（ｉｉ）を参照のこと）は、例えば、（約）０．５～１０、１～５、２～４、２．４～３又は２．７±０．０１～０．２５μＭの範囲のＫｉでｋＯＲに結合し得；そして／又は例えば（約）１～５０、５～３０、１０～２５、１４～２０又は１７±０．１１～２．２μＭの範囲のＥＣ_５０でｋＯＲを活性化する（例えば、細胞内ｃＡＭＰ減少を減少させる）ことができる。

【0108】

本明細書の他の場所で別様に示されない場合、本発明の文脈において、「阻害する」、「減少させる」、「遮断する」、「抑制する」又は「減少させる」などは、 初期状態（例えば、脱髄、特にオリゴデンドロサイトの状態、既存のＣＮＳ病変（脳病変など）、ｋＯＲリガンドの効力及び/又は有効性、シクロチドの活性、ｋＯＲの活性など）が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも 95%、少なくとも 99%、さらには 100% (原則として、パーセンテージの値が高いほど優先される) 低められる（インビトロ及び／又はインビボ）という意味であると考えられる。当業者は、「阻害」、「減少」、「遮断」、「抑制」または「低減」のそれぞれの程度（例えば、特にオリゴデンドロサイトの脱髄の状態、既存のＣＮＳ病変（例えば、脳病変）、ｋＯＲリガンドの効力および／または有効性、シクロチドの活性などを決定することによる）を容易に試験できる立場にある。さらに、当業者は、所定の薬物（例えば、本明細書に開示されるシクロチド又はｋＯＲリガンド）について、それぞれの「阻害」、「減少」、「遮断」、「抑制」又は「低減」効果/活動に対するＩＣ _５０ を容易に決定できる立場にある。

【0109】

同様に、本明細書の他の場所で別様に示されない場合、本発明の文脈において、「増加する」、「誘導する」または「改善する」などは、初期状態（例えば、特にオリゴデンドロサイトの（再）有髄化の状態、ｋＯＲリガンドの効力および/または有効性、シクロチドの活性、ｋＯＲの活性など）が、 例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は 少なくとも １００％ (原則として、パーセンテージの値が高いほど好ましい)、高められる（インビトロ及び/又はインビボ）ことを意味する。特に、「増加する」とは、さらに「増加する」活性／状態（例えば、（再）髄鞘形成、ｋＯＲリガンドの効力および／または有効性、シクロチドの活性など）の初期程度がすでに存在することを意味する。 特に、「誘導する」とは、その後「誘導される」活性／状態の初期の程度が（実質的に）存在しないことを意味する。当業者は、「増加」、「誘導」又は「改善」のそれぞれの程度を容易に試験できる立場にある（例えば、特にオリゴデンドロサイトの（再）有髄化の状態、ｋＯＲリガンドの効力および／または有効性、シクロチドの活性などを決定することによる）。さらに、当業者は、所定の薬物（例えば、本明細書に開示されるシクロチド又はｋＯＲリガンド）について、それぞれの「増加」、「誘導」又は「改善」効果／活性についてのＩＣ_５０を容易に決定する立場にある。

【0110】

別段の指定がない限り、本発明の文脈における「誘導」、「誘導する」又は「誘導される」は、実質的にゼロであるベースラインから開始することを意味する。 「増加」/「増加される」又は「強化」/「強化される」は、必ずしも実質的にゼロのベースラインから開始することを意味するわけではなく、すでにゼロを超えるレベルから開始することを意味する場合もある。 例えば、誘導された再ミエリン化は、最初は再ミエリン化活性又は発現がまったくなかった場合を意味し；再ミエリン化の強化/増加は、最初にすでにいくらかの再ミエリン化活動があり、その後さらに強化/増加した場合を意味する。

【0111】

当業者は、所定のシクロチドまたはシクロチド変異体/変種又はｋＯＲリガンドが本発明に従って機能することができるかどうか、例えば、本明細書に記載の機能の1つ又は複数、例えば上記のセクション (i) ～ (iv) で定義された機能1つ又は複数を有するかどうかを容易に試験できる立場にある。この目的のために、当業者は、例えば、本明細書の他の場所及び添付の実施例に記載されているアッセイ、並びに当該技術分野（例えば、Du loc. cit.）に記載され、そして本明細書の他の場所及び 追加の例に言及されるようなそれぞれのアッセイに依存する場合がある。例えば、ｋＯＲの活性化を試験するためのアッセイは、Ｄｕ（前記）に開示されている。 特に、再ミエリン化（再ミエリン化の促進）並びにオリゴデンドロサイト分化及びミエリン化の刺激に対するｋＯＲ活性化の効果を試験するためのアッセイは、Ｄｕに記載されている（前記；その図３、４、及び５を参照のこと）。 マウスモデルのようなそれぞれの動物モデルも当技術分野で知られている。 これらは、例えば、ＥＡＥマウスモデル及びクプリゾン誘発性脱髄マウスモデルである（Ｄｕ、前出文献も参照のこと）。

【0112】

本明細書に記載された手段及び方法並びに彼らの共通の一般知識に依存することにより、当業者は、例えば（植物）抽出物中／から、適切なシクロチド又はシクロチド変異体／変種を同定及び単離する立場にある。 従って、当業者は、本発明に従って使用することができる、まだ知られていないシクロチド/シクロチド変異体/変種を同定及び単離することもできる。 本発明によるそのような新たに同定された／単離されたシクロチドの使用も想定される。

【0113】

そのような新たに単離／同定されたシクロチドの例は、本発明に関連して同定された「ビトリ」シクロチドである（V. tricolorから単離、実施例２及び図２参照のこと）。 「ビトリ」シクロチドは、分析用 ＲＰ－ＨＰＬＣ クロマトグラムと ＭＡＬＤＩ 質量スペクトルによって特徴付けられている。 そのペプチド質量は約 ３４３１．８７ [ｍ／ｚ] である(図２Ｅではモノアイソトピック質量 (［Ｍ＋Ｈ］^＋) としてラベル付けされている)。特に、「ビトリ」シクロチドは、例えば、それぞれ３ｍＬ/分及び１ｍＬ/分の流速で、例えば、０．１ ～ １％/分の 溶媒Ｂの線形勾配 [例: ９０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトニトリル、水中０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＴＦＡ］を用いる、例えば、セミ分取（例えば、詳細については以下を参照のこと）及び分析（例えば、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ) Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８ カラム (例えば、５μｍ、１００Å)を用いて、例えば、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣ ユニット (Thermo-Fisher Dionex) での ＲＰ－ＨＰＬＣ によって精製された。

【0114】

当業者は、本発明に従って、すなわち、本明細書で定義されるｋＯＲのリガンドと組み合わせて使用することができる、まだ知られていないさらなるシクロチド／シクロチド変異体／変種を、同じ又は類似の分離/識別手段及び方法に依存することによって容易に同定及び単離することができる。

【0115】

本発明はさらに、本明細書に記載の同一又は類似の単離／同定手段及び方法によって単離／同定でき、そして本発明に従って使用できるシクロチドに関する。 そのような単離／同定されたシクロチドの例は、本明細書に開示される「ビトリ」シクロチドである。 本発明はまた、この特定の「ビトリ」シクロチド及びその変異体/変種にも関する。 シクロチド変異体／変種に関して本明細書の他の箇所で述べられていることは、変更を加えてここに適用される。

【0116】

本発明はさらに、本発明の文脈において開示及び／又は単離／同定されたシクロチドのアミノ酸骨格／一次アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；及びそのような核酸分子のそれぞれの使用に関連する。例えば、そのような核酸分子は、配列番号１１、１２、１５及び１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１１、１２、１５及び１６のいずれか１つに含まれ、 そして成熟シクロチド又は遺伝コードの縮重のためにそれとは異なるヌクレオチド配列を含む。

【0117】

「核酸分子」、「核酸配列」及び「ヌクレオチド配列」という用語の意味は、当技術分野で周知であり、本発明の文脈において適宜使用される。例えば、本発明を通して使用される場合、これらの用語は、天然に存在する、又は組み換えによって生成されたタイプのヌクレオチド配列及び／又は核酸配列／分子の全ての形態、並びに化学的に合成されたヌクレオチド配列及び／又は核酸配列／分子を指す。これらの用語は、例えばロックされたＤＮＡ、ＰＮＡ、オリゴヌクレオチドチオホスフェート及び置換リボオリゴヌクレオチドなどの核酸類似体及び核酸誘導体も包含する。 さらに、これらの用語は、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含む任意の分子も指す。

【0118】

好ましくは、用語「核酸分子」、「核酸配列」及び「ヌクレオチド配列」などは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。 「核酸分子」、「核酸配列」及び「ヌクレオチド配列」は、当業者に知られている合成化学的方法論によって、又は組換え技術の使用によって作製することができ、又は天然源から、又はそれらの組み合わせによって単離され得る。ＤＮＡ及びＲＮＡは場合により非天然ヌクレオチドを含んでもよく、一本鎖又は二本鎖であってもよい。 「核酸分子」、「核酸配列」及び「ヌクレオチド配列」はまた、センス及びアンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡ、すなわちＤＮＡ及び/又はＲＮＡの特定の配列ヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド配列を指す。

【0119】

さらに、「核酸分子」、「核酸配列」及び「ヌクレオチド配列」などの用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はそれらのハイブリッド、または最新技術分野で知られているそれらの任意の修飾を指す場合がある（例えば、修正の例については、米国特許第５５２５７１１号、米国特許第４７１１９５５号、米国特許第５７９２６０８号又は欧州特許第３０２１７５号を参照のこと）。本発明のこれらの分子は、一本鎖又は二本鎖、線状又は環状、天然又は合成であり、サイズの制限はない。 例えば、「核酸分子」、「核酸配列」及び／又は「ヌクレオチド配列」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、又はそのようなＲＮＡをコードするＤＮＡ、又はキメラプラストであり得る(Cole-Strauss Science 1996 273(5280) 1386-9)。それらは、プラスミド又はウイルスＤＮＡ又はＲＮＡの形態であり得る。 「核酸分子」、「核酸配列」及び「ヌクレオチド配列」などは、オリゴヌクレオチドを指すこともあり、ここで、ホスホチオエート又はペプチド核酸（ＰＮＡ）などの任意の最先端の修飾が含まれる。

【0120】

本明細書で提供される核酸分子は、例えば本明細書で開示される対応する方法によって、本発明の環状ペプチドを産生するのに特に有用である。

【0121】

本明細書に開示され、そして本明細書に記載される核酸分子は、ベクターに含まれ得る。前記ベクターは、クローニングベクター又は発現ベクター、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス又はレトロウイルスベクターであり得る。 レトロウイルスベクターは、複製能力があるか、複製に欠陥がある可能性がある。 後者の場合、ウイルスの増殖は一般的に、相補的な宿主/細胞でのみ発生する。 本明細書に開示される核酸分子は、宿主における増殖のための選択マーカーを含む特定のベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物又は塩化ルビジウム沈殿物などの沈殿物、または荷電脂質との複合体、又はフラーレンなどの炭素ベースのクラスターに導入される。 ベクターがウイルスである場合、宿主細胞に適用する前に、適切なパッケージング細胞系を使用してインビトロでパッケージ化することができる。

【0122】

好ましくは、開示された核酸分子は、原核又は真核細胞又はそれらの単離された画分における発現を可能にする発現制御配列（例えば、本明細書に開示されたベクター内）に作動可能に連結される。 前記ポリヌクレオチドの発現は、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。 真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞における発現を確実にする調節要素は、当業者に周知である。 それらは通常、転写の開始を保証する調節配列と、任意に転写の終結及び転写物の安定化を保証するポリＡシグナルを含む。 追加の調節エレメントには、転写及び翻訳エンハンサーが含まれる場合がある。原核宿主細胞での発現を可能にする可能な調節エレメントは、例えば、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ、又はｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞での発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母のＡＯＸ１又はＧＡＬ１プロモーター又はＣＭＶ、ＳＶ４０－ ，ＲＳＶ－プロモーター (ラウス肉腫ウイルス)、ＣＭＶ－エンハンサー、ＳＶ４０－エンハンサー、又は哺乳動物及び他の動物細胞におけるグロビンイントロンである。 転写の開始に関与するエレメントに加えて、そのような調節エレメントは、ポリヌクレオチドの下流にあるＳＶ４０－ポリＡ部位又はｔｋ－ポリＡ部位などの転写終結シグナルも含み得る。 これに関連して、適切な発現ベクターは、Ｏｋａｙａｍａ－Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの当技術分野で知られている。好ましくは、前記ベクターは発現ベクターおよび／または遺伝子導入ベクターである。 レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターを、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを標的細胞集団に送達するために使用することができる。 当業者に周知の方法を使用して、本発明に従ってベクターを構築することができる； 例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載される技法を参照のこと。 あるいは、開示されたポリヌクレオチド及びベクターは、標的細胞への送達のためにリポソームに再構成することができる。

【0123】

「その単離された画分」という用語は、ベクターからＲＮＡを転写又は転写及び翻訳することができる真核細胞又は原核細胞又は組織の画分を指す。 前記画分は、ＲＮＡの転写又はＲＮＡの転写及び前記ＲＮＡのポリペプチドへの翻訳に必要なタンパク質を含む。 前記単離された画分は、例えば、網状赤血球などの真核細胞の核及び細胞質画分であり得る。 細胞又は組織の前記単離された画分を包含するＲＮＡを転写及び翻訳するためのキットは、例えば、ＴＮＴレチクロライセート（Ｐｒｏｍｅｇａ）として市販されている。

【0124】

再び、開示された核酸分子と同様に、開示されたベクターも、例えば本明細書に開示された対応する方法によって、本発明の環状ペプチドを産生するのに特に有用である。

【0125】

さらなる側面によれば、本明細書に開示される核酸分子及び／又はベクター及び／又はコードされたシクロチドを含む組換え宿主細胞が本明細書に開示される。 この側面に関連して、宿主細胞を遺伝子操作するために、例えば、本明細書に開示されるシクロチドのアミノ酸骨格／一次アミノ酸配列を発現及び単離するために使用することができる。

【0126】

前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。 宿主細胞に存在する核酸分子又はベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれているか、又は染色体外に維持されているかのいずれかである。宿主細胞は、細菌、昆虫、真菌、植物、動物、哺乳動物、又は好ましくはヒト細胞などの任意の原核細胞又は真核細胞であり得る。 好ましい真菌細胞は、例えば、サッカロミセス属のもの、特にＳ．セレビシエ種のもの、又は菌糸真菌の群に属するもの、例えばいくつかのペニシリア又はアスペルギラ株である。 「原核生物」という用語は、本明細書に開示されるシクロチドのアミノ酸骨格／一次アミノ酸配列の発現のために核酸分子で形質転換又はトランスフェクトできる全ての細菌を含むことを意味する。原核宿主には、グラム陰性菌及びグラム陽性菌、例えば、大腸菌、ネズミチフス菌、セラチア菌、及び枯草菌が含まれる。 本明細書に開示される環状シクロチドのアミノ酸骨格／一次アミノ酸配列をコードする核酸分子は、当業者に一般的に知られている技術のいずれかを使用して宿主を形質転換又はトランスフェクトするために使用することができる。機能的に連結された融合遺伝子を調製し、それらを細菌又は動物細胞で発現させる方法は、当技術分野で周知である(Sambrook、上記)。 そこに記載されている遺伝子構築物及び方法は、例えば原核生物宿主における上記アミノ酸骨格／一次アミノ酸配列の発現に利用することができる。一般的に、挿入されたポリヌクレオチドの効率的な転写を促進するプロモーター配列を含む発現ベクターが宿主と関連して使用される。 発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、及びターミネーター、並びに形質転換細胞の表現型選択を提供できる特定の遺伝子を含む。 形質転換された原核生物宿主は、最適な細胞増殖を達成するために、当技術分野で知られている技術に従って発酵槽で増殖させ、培養することができる。 次いで、発現したペプチドを増殖培地、細胞溶解物、又は細胞膜画分から単離することができる。微生物又は他の方法で発現されたペプチドの単離及び精製は、例えば、分取クロマトグラフィー分離及びモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の使用を伴うものなどの免疫学的分離などの任意の従来の手段によるものであり得る(Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994))。

【0127】

本明細書に開示及び記載される核酸分子及びベクターと同様に、対応する宿主細胞も、例えば本明細書に開示される対応する方法によって、本明細書に開示されるシクロチドを産生するのに特に有用である。

【0128】

当業者は、本発明に従って使用／投与されるシクロチドを容易に提供、すなわち合成するか、又は例えば抽出物（例えば、植物、真菌、動物又は微生物抽出物のような生物学的抽出物）からそれらを単離／同定することができ; 例えば、添付の実施例及び本明細書に引用されたそれぞれの文献を参照のこと。

【0129】

特に、（生）化学的に合成するアプローチ又は組換え技術によるシクロチドの生成を使用することができる。 例えば、シクロチドを生成する方法は、下記工程を含むことができる：
ａ）（ｉ）本明細書に開示されるシクロチドのアミノ酸骨格が発現されるような条件下で本明細書に開示される組換え宿主細胞を培養し、前記アミノ酸骨格を回収する工程； 又は
（ｉｉ）本明細書に開示されるシクロチドのアミノ酸主鎖を化学的に合成する工程（例えば、固相ペプチド合成によって）；及び
ｂ）本明細書に開示されるシクロチドを形成するための前記アミノ酸骨格の環化工程（例えば、（天然の）化学的連結による）。

【0130】

シクロチドを生成する方法は、（頭から尾への）環化の工程をさらに含んでもよい（例えば、Grundemann, 2013 前記; Thell, 前記を参照のこと）。 シクロチドを生成する方法はまた、（さらに）酸化的折り畳みの工程を含んでもよい（例えば、Grundemann, 2013 前記; Thell, 前記を参照のこと）。

【0131】

上述のように、産生されるシクロチドの線状ペプチド／アミノ酸主鎖は、組換え工学技術によって産生することもできる。 そのような技術は、当技術分野で周知である（例えば、Sambrook、上記）。 また上記のように、前記直鎖状ペプチド／アミノ酸骨格のこの種の産生により、本明細書に開示及び記載された核酸分子、ベクター及び／又は宿主細胞から特定の利点を得ることができる。 対応する上記の定義は、必要な変更を加えてここに適用される。

【0132】

ペプチド合成のいくつかのアプローチ、特に環状ペプチドの合成アプローチが当技術分野で知られている（例えば、Williams, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides, CRC-Press 1997; Benoiton: Chemistry of Peptide Synthesis. CRC-Press, 2005)。当業者は、本明細書で提供される教示に基づいて、環状ペプチドを製造するための開示された方法の特定の要件に先行技術の知識を容易に適用する立場にある。

【0133】

本発明はまた、本明細書で提供される開示に従って、上記のアプローチ又は方法によって取得可能又は取得されるシクロチドの使用／投与にも関する。

【0134】

本発明はさらに、以下の組み合わせに関する：
(a)本明細書で定義されるシクロチド；及び
（ｂ）本明細書で定義されるｋＯＲのリガンド。

【0135】

前記シクロチド及びリガンドに関して本明細書の他の箇所で述べられていることは、必要な変更を加えて本明細書に適用される。

【0136】

しかしながら、本発明によるシクロチド及ｋＯＲのリガンドとの組み合わせの特定の非限定的な例は、以下から成る群から選択される：
（ａ）Ｔ２０Ｋ（配列番号７）、そして前記リガンドが以下から成る群から選択される：
(i) ナルフラフィン、コリボリド、ノリボガイン、サルビノリン Ａ 誘導体 Ｂ－６４、トリアゾール １．１、６－ＧＮＴＩ、ＨＳ６６６、ＨＳ６６５、及びメシルサルビノリン Ｂ; 又は
(ii) Ｕ５０，４８８、ダイノルフィン Ａ－（１－１３）、ダイノルフィン－（１－１１）、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィン Ａ－（１－８）、Ｕ６９５９３、ＧＲ ８９６９６、スピラドリン、ＢＲＬ－５２５３７、ＪＴ０９、ジフェリケファリン 、ダイノルフィン、ナルブフィン、ペンタソジン、ペチジン及びスルフェンタニル;
（ｂ）Ｎ２９Ｋ（配列番号５）、そして前記リガンドが以下から成る群から選択される：
(i) ナルフラフィン、コリボリド、ノリボガイン、サルビノリン Ａ 誘導体 Ｂ－６４、トリアゾール １．１、６－ＧＮＴＩ、ＨＳ６６６、ＨＳ６６５、及びメシルサルビノリン Ｂ; 又は
(ii) Ｕ５０，４８８、ダイノルフィン Ａ－（１－１３）、ダイノルフィン－（１－１１）、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィン Ａ－（１－８）、Ｕ６９５９３、ＧＲ ８９６９６、スピラドリン、ＢＲＬ－５２５３７、ＪＴ０９、ジフェリケファリン 、ダイノルフィン、ナルブフィン、ペンタソジン、ペチジン及びスルフェンタニル;
(c)Ｇ１８Ｋ(配列番号４)、そして前記リガンドが以下から成る群から選択される:
(i) ナルフラフィン、コリボリド、ノリボガイン、サルビノリン Ａ 誘導体 Ｂ－６４、トリアゾール １．１、６－ＧＮＴＩ、ＨＳ６６６、ＨＳ６６５、及びメシルサルビノリン Ｂ; 又は
(ii) Ｕ５０，４８８、ダイノルフィン Ａ－（１－１３）、ダイノルフィン－（１－１１）、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィン Ａ－（１－８）、Ｕ６９５９３、ＧＲ ８９６９６、スピラドリン、ＢＲＬ－５２５３７、ＪＴ０９、ジフェリケファリン 、ダイノルフィン、ナルブフィン、ペンタソジン、ペチジン及びスルフェンタニル;
(d)Ｔ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ(配列番号６)、そして前記リガンドが以下から成る群から選択される:
(i) ナルフラフィン、コリボリド、ノリボガイン、サルビノリン Ａ 誘導体 Ｂ－６４、トリアゾール １．１、６－ＧＮＴＩ、ＨＳ６６６、ＨＳ６６５、及びメシルサルビノリン Ｂ; 又は
(ii) Ｕ５０，４８８、ダイノルフィン Ａ－（１－１３）、ダイノルフィン－（１－１１）、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィン Ａ－（１－８）、Ｕ６９５９３、ＧＲ ８９６９６、スピラドリン、ＢＲＬ－５２５３７、ＪＴ０９、ジフェリケファリン 、ダイノルフィン、ナルブフィン、ペンタソジン、ペチジン及びスルフェンタニル;又は
（ｅ）ビトリシクロチド（配列番号１５５）、そして前記リガンドが以下から成る群から選択される：
(i) ナルフラフィン、コリボリド、ノリボガイン、サルビノリン Ａ 誘導体 Ｂ－６４、トリアゾール １．１、６－ＧＮＴＩ、ＨＳ６６６、ＨＳ６６５、及びメシルサルビノリン Ｂ; 又は
(ii) Ｕ５０，４８８、ダイノルフィン Ａ－（１－１３）、ダイノルフィン－（１－１１）、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィン Ａ－（１－８）、Ｕ６９５９３、ＧＲ ８９６９６、スピラドリン、ＢＲＬ－５２５３７、ＪＴ０９、ジフェリケファリン 、ダイノルフィン、ナルブフィン、ペンタソジン、ペチジン及びスルフェンタニル；又は
（ｆ）カリペ１０（配列番号８６）、そして前記リガンドが以下から成る群から選択される：
(i) ナルフラフィン、コリボリド、ノリボガイン、サルビノリン Ａ 誘導体 Ｂ－６４、トリアゾール １．１、６－ＧＮＴＩ、ＨＳ６６６、ＨＳ６６５、及びメシルサルビノリン Ｂ; 又は
(ii) Ｕ５０，４８８、ダイノルフィン Ａ－（１－１３）、ダイノルフィン－（１－１１）、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィン Ａ－（１－８）、Ｕ６９５９３、ＧＲ ８９６９６、スピラドリン、ＢＲＬ－５２５３７、ＪＴ０９、ジフェリケファリン 、ダイノルフィン、ナルブフィン、ペンタソジン、ペチジン及びスルフェンタニル。

【0137】

しかしながら、本発明によるシクロチド及びｋＯＲのリガンドのより具体的な非限定的な組み合わせの例は、以下からなる群から選択される：
（ａ）Ｔ２０Ｋ（配列番号７）及びナルフラフィン；
（ｂ）Ｎ２９Ｋ（配列番号５）及びナルフラフィン；
（ｃＧ１８Ｋ（配列番号４）及びナルフラフィン；
（ｄ）Ｔ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ（配列番号６）及びナルフラフィン；
（ｅ）ビトリ（配列番号１５５）及びナルフラフィン；
（ｆ）カリペ１０（配列番号８６）及びナルフラフィンであ；
（ｇ）Ｔ２０Ｋ（配列番号７）及びＵ５０，４８８；
（ｈ）Ｎ２９Ｋ（配列番号５）及びＵ５０，４８８；
（ｉ）Ｇ１８Ｋ（配列番号４）及びＵ５０，４８８；
（ｊＴ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ（配列番号６）及びＵ５０，４８８；
（ｋ）ビトリ（配列番号１５５）及びＵ５０，４８８；
（ｌ）カリペ１０（配列番号８６）及びＵ５０，４８８；
（ｍ）Ｔ２０Ｋ（配列番号７）及びダイノルフィンＡ １－１３；
（ｎ）Ｎ２９Ｋ（配列番号５）及びダイノルフィンＡ １－１３；
（ｏ）Ｇ１８Ｋ（配列番号４）及びダイノルフィンＡ １－１３；
（ｐ）Ｔ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ（配列番号６）及びダイノルフィンＡ １－１３；
（ｑ）ビトリ（配列番号１５５）及びダイノルフィンＡ １－１３；
（ｒ）カリペ１０（配列番号８６）及びダイノルフィンＡ １－１３；
（ｓ）Ｔ２０Ｋ（配列番号７）及びジフェリケファリン；
（ｔ）Ｎ２９Ｋ（配列番号５）及びジフェリケファリン；
（ｕ）Ｇ１８Ｋ（配列番号４）及びジフェリケファリン；
（ｖ）Ｔ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ（配列番号６）及びジフェリケファリン；
（ｗ）ビトリ（配列番号１５５）及びジフェリケファリン；
（ｘ）カリペ１０（配列番号８６）及びジフェリケファリン；
（ｙ）Ｔ２０Ｋ（配列番号７）及びナルブフィン；
（ｚ）Ｎ２９Ｋ（配列番号５）及びナルブフィン；
（ａａ）Ｇ１８Ｋ（配列番号４）及びナルブフィン；
（ａｂ）Ｔ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ（配列番号６）及びナルブフィン；
(ａｃ)ビトリ(配列番号１５５) 及びナルブフィン；
（ａｄ）カリペ１０（配列番号８６）及びナルブフィン；
（ａｅ）Ｔ２０Ｋ（配列番号７）及びペンタソジン；
（ａｆ）Ｎ２９Ｋ（配列番号５）及びペンタソジン；
（ａｇ）Ｇ１８Ｋ（配列番号４）及びペンタソジン；
（ａｈ）Ｔ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ（配列番号６）及びペンタソジン；
（ａｉ）ビトリ（配列番号１５５）及びペンタソジン；
（ａｊ）カリペ１０（配列番号８６）及びペンタソジン；
（ａｋ）Ｔ２０Ｋ（配列番号７）及びペチジン；
（ａ１）Ｎ２９Ｋ（配列番号５）及びペチジン；
（ａｍ）Ｇ１８Ｋ（配列番号４）及びペチジン；
（ａｎ）Ｔ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ（配列番号６）及びペチジン；
（ａｏ）ビトリ（配列番号１５５）及びペチジン；
（ａｐ）カリペ１０（配列番号８６）及びペチジン；
（ａｑ）Ｔ２０Ｋ（配列番号７）及びスルフェンタニル；
(ａｒ)Ｎ２９Ｋ(配列番号５) 及びスルフェンタニル、
（ａｓ）Ｇ１８Ｋ（配列番号４）及びスルフェンタニル；
(ａｔ)Ｔ２０Ｋ／Ｇ１Ｋ(配列番号６) 及びスルフェンタニル；
（ａｕ）ビトリ（配列番号１５５）及びスルフェンタニル；及び
（ａｖ）カリペ１０（配列番号８６）及びスルフェンタニル。

【0138】

本発明はさらに、本発明又は本明細書に記載のシクロチドとｋＯＲリガンドとの組合せ、及び場合により薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

【0139】

本発明はさらに、本明細書で定義されるシクロチドの下記への使用に関する：
（ｉ）本明細書で定義されるｋＯＲのリガンド（特に、本明細書で定義される完全な（「偏りのない」）ｋＯＲアゴニスト）の悪影響の低減； 及び/又は
（ｉｉ）本明細書で定義されるｋＯＲのリガンド（特に、本明細書で定義される完全な（「偏りのない」）ｋＯＲアゴニスト）の有効性及び／又は効力の増大。

【0140】

本発明はさらに、キット／内容物のキット／部品のキットに関し、前記キットは、下記の組み合わせを含む：
(a)本明細書で定義されるシクロチド；及び
（ｂ）本明細書で定義されるｋＯＲのリガンド。

【0141】

さらに、本発明のキット／内容物のキット／部品のキットの文脈において、前記(a) シクロチド; 及び (b) ｋＯＲのリガンドの組み合わせは、 (前記キットとは別に独立して)、
(i) ＭＳの治療(例えば、療法による治療又は予防的/予防的治療);
(ii) 特にオリゴデンドロサイトの再ミエリン化 (すなわち、その誘導又は増加)、及び/又は ＣＮＳ 病変 (例えば、脳病変) の改善 (例えば、減少又は養生/治癒); （iii）脱髄（特にオリゴデンドロサイトの）の予防又は軽減、及び／又はＣＮＳ病変（例えば、脳病変）の形成の予防、及び／又は既存のＣＮＳ病変（例えば、脳病変）の軽減； 及び/又は
(iv) 疼痛、特に神経因性疼痛 (例えば、中枢、又は末梢神経因性又は末梢神経因性疼痛) 及び/又は ＭＳ に起因する/ＭＳ に伴う疼痛の治療 (例えば、治療又は予防/予防的治療による治療)への使用のためであり得る。

【0142】

本発明はさらに、本発明のキット／内容物のキット／部品のキットの一部としての医薬組成物に関し、 ここで、前記組み合わせ(a) 本明細書で定義されるシクロチド； 及び(b) 本明細書で定義されるｋＯＲのリガンド 又は前記医薬組成物は、 （前記キットとは別個に独立して）、
(i) ＭＳの治療(例えば、療法による治療又は予防的/予防的治療);
(ii) 特にオリゴデンドロサイトの再ミエリン化 (すなわち、その誘導又は増加)、及び/又は ＣＮＳ 病変 (例えば、脳病変) の改善 (例えば、減少又は養生/治癒); （iii）脱髄（特にオリゴデンドロサイトの）の予防又は軽減、及び／又はＣＮＳ病変（例えば、脳病変）の形成の予防、及び／又は既存のＣＮＳ病変（例えば、脳病変）の軽減； 及び/又は
(iv) 疼痛、特に神経因性疼痛 (例えば、中枢神経因性又は末梢神経因性疼痛) 及び/又は ＭＳ に起因する/ＭＳ に伴う疼痛の治療 (例えば、治療又は予防/予防的治療による治療)への使用のためであり得る。

【0143】

本発明はさらに、下記の組合せを含む医薬組成物を含むキット／内容物のキット／部品のキットに関し：
(a)本明細書で定義されるシクロチド；及び
(b)本明細書で定義されるｋＯＲのリガンド、
ここで前記医薬組成物及び／又は前記下記：
(a) シクロチド; 及び
(b)ｋＯＲのリガンド
の組み合わせは、（キットとは別に独立して）、
(i) ＭＳの治療(例えば、療法による治療又は予防的/予防的治療);
(ii) 特にオリゴデンドロサイトの再ミエリン化 (すなわち、その誘導又は増加)、及び/又は ＣＮＳ 病変 (例えば、脳病変) の改善 (例えば、減少又は養生/治癒); （iii）脱髄（特にオリゴデンドロサイトの）の予防又は軽減、及び／又はＣＮＳ病変（例えば、脳病変）の形成の予防、及び／又は既存のＣＮＳ病変（例えば、脳病変）の軽減； 及び/又は
(iv) 疼痛、特に神経因性疼痛 (例えば、中枢、又は末梢神経因性又は末梢神経因性疼痛) 及び/又は ＭＳ に起因する/ＭＳ に伴う疼痛の治療 (例えば、治療又は予防/予防的治療による治療)への使用のためであり得る。

【0144】

本発明によるキット／内容物のキット／部品のキット又は医薬組成物は、
(i) ＭＳの治療(例えば、療法による治療又は予防的/予防的治療);
(ii) 特にオリゴデンドロサイトの再ミエリン化 (すなわち、その誘導又は増加)、及び/又は ＣＮＳ 病変 (例えば、脳病変) の改善 (例えば、減少又は養生/治癒); （iii）脱髄（特にオリゴデンドロサイトの）の予防又は軽減、及び／又はＣＮＳ病変（例えば、脳病変）の形成の予防、及び／又は既存のＣＮＳ病変（例えば、脳病変）の軽減； 及び/又は
(iv) 疼痛、特に神経因性疼痛 (例えば、中枢、又は末梢神経因性又は末梢神経因性疼痛) 及び/又は ＭＳ に起因する/ＭＳ に伴う疼痛の治療 (例えば、治療又は予防/予防的治療による治療)への使用のためであり得る。

【0145】

本発明のキット／内容物のキット／部品のキット、及びそれぞれの医薬組成物の文脈において、また本明細書に記載の一般的な医薬組成物の文脈において、シクロチド及びｋＯＲリガンド、又はそれらの組み合わせは、 単一の容器又はバイアル、又は好ましくは ２つの異なる容器又はバイアルに含まれる。

【0146】

本発明によれば、開示された医薬組成物又はシクロチド及びｋＯＲリガンド、又はそれらの組み合わせは、医薬的／治療的に有効な用量で投与することができる／投与されるであろう。 これは、投与される各化合物（活性成分）の医薬的／治療的に有効な量に達することを意味する。 好ましくは、医薬的／治療的に有効な用量は、例えば、対象の疾患の（症状の）改善、状態の改善及び／又は生存の延長をもたらす、投与される化合物の量を指す。 これは、日常的な試験を行う当業者によって決定することができる。

【0147】

本発明に従って投与される化合物の投与計画は、主治医及び臨床要因によって決定される。 医学分野でよく知られているように、1 人の患者に対する投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与の時間と経路、一般的な健康状態、及び/又は 同時に投与されている他の薬物にに依存する。 当業者は、本発明に従って医学的に適用される化合物の適切な用量を認識しており、試験することができる。

【0148】

本発明によれば、シクロチド及び／又はｋＯＲリガンドは、例えば、１０μｇ／ｋｇＢＷ ～１００ｍｇ／ｋｇＢＷの範囲、 好ましくは２００ μｇ／ｋｇＢＷ ～６０ ｍｇ／ｋｇＢＷの範囲、 より好ましくは、４００μｇ／ｋｇＢＷ～４０ｍｇ／ｋｇ ＢＷの範囲、 より好ましくは、６００μｇ／ｋｇＢＷ～２０ｍｇ／ｋｇＢＷの範囲、 さらにより好ましくは、８００μｇ／ｋｇＢＷ～１０ｍｇ／ｋｇＢＷの範囲の用量で投与され得る。他の好ましい用量は、２０ｍｇ／ｋｇ ＢＷまでの範囲である。

【0149】

もちろん、用量は、投与スキーム及び／又は投与経路に応じて変動し得る。 例えば、静脈内投与の場合、通常、経口投与に比べて用量が少なくなる。経口投与の文脈における可能な用量の非限定的な例は、１０μｇ／ｋｇＢＷ～１００ｍｇ／ｋｇＢＷの範囲、好ましくは２００μｇ／ｋｇＢＷ～６０ｍｇ／ｋｇＢＷの範囲、より好ましくは４００ μg／ｋｇＢＷ～ ４０ ｍｇ／ｋｇＢＷ の範囲の用量である。 静脈内投与の文脈における可能な用量の非限定的な例は、６００μｇ／ｋｇＢＷ～２０ｍｇ／ｋｇＢＷの範囲、好ましくは８００μｇ／ｋｇＢＷ～１０ｍｇ／ｋｇＢＷの範囲の用量である。 例えば、最大 ２０ ｍｇ／ｋｇＢＷ の範囲の用量は、経口、腹腔内及び静脈内投与の３つすべての状況において適切且つ安全である可能性がある。

【0150】

本発明による用量は、毎日、毎週、又は毎月投与することができる。 シクロチド及び／又はｋＯＲリガンドは、１回又は複数回の単回投与、特に、１回、２ 回、３ 回、４回、又は ５ 回の単回投与 (例えば 1 日、1 週間、1 か月当たり)の形態で投与することができる。 特定の、しかし非限定的な例は、単回用量（最大）を週３回投与することである。 連続投与もまた、本発明の文脈において想定される。 シクロチド及び／又はｋＯＲリガンドは、例えば、腹腔内又は経口投与することができる。 従って、好ましいが非限定的な実施形態の文脈において、シクロチド及び／又はｋＯＲリガンド、又はそれらを含む医薬組成物は、静脈内、腹腔内又は経口投与され、又は経口投与され、そして/又腹腔内又は経口投与のための医薬的に許容される担体を含む。 特定の投与スキームの非限定的な例は、週間隔で、例えばＰＢＳ中で最大１０ｍｇ／ｋｇ ＢＷの３回の単回腹腔内注射である。 特定の投与スキームの別の非限定的な例は、週間隔で、例えばＰＢＳ中で最大５０ｍｇ／ｋｇ ＢＷの３回の単回経口投与である。 さらなる可能な投与スキームは、本明細書の別の場所に記載されている。

【0151】

本発明に従って使用されるシクロチド及びｋＯＲリガンドの用量／投薬計画は、同じであっても類似していても異なっていてもよい。 特に、シクロチドの用量は、ｋＯＲリガンドの用量と同じであってもよい。 シクロチドの用量（例えば、上記の用量）はまた、ｋＯＲリガンドの用量（例えば、上記の用量）よりも高くても低くてもよい。例えば、シクロチドの用量（例えば、上記の用量）は、ｋＯＲリガンドの用量（例えば、上記の用量）よりも１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、又は３倍以上高くても低くてもよい。同様の用量は、最大で５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又は３％異なる用量であり得る。

【0152】

本明細書に記載の医薬組成物又は組み合わせはまた、シクロチド及び／又はｋＯＲリガンドのそれぞれの１つ又は複数を含んでもよい。 従って、さらなる特定の実施形態によれば、本明細書に記載の医薬組成物又は組み合わせは、シクロチド及び／又はｋＯＲリガンドのそれぞれを少なくとも２、３、４又は５個含み得る。

【0153】

本明細書に記載のシクロチド及びｋＯＲリガンドは、一緒に、すなわち同時に投与することができるが、同じ又は異なる投与部位で、又は同じ又は異なる投与経路によって投与することができ、又はそれらは、同じ又は異なる投与部位で、又は同じ又は異なる投与経路によって、引き続いて投与されてもよい。 後者の場合、シクロチドを最初に投与し、続いてｋＯＲリガンドを投与するか、又はｋＯＲリガンドを最初に投与し、続いてシクロチドを投与することができる。

【0154】

１つの特定の実施形態によれば、本明細書に記載の医薬組成物は、（シクロチド及びｋＯＲリガンドに加えて）１つ又は複数の追加の活性剤をさらに含み得る。 同様に、本明細書に記載の（医薬組成物／組み合わせを含む）シクロチド及びｋＯＲリガンドは、１つ又は複数の追加の活性剤と共投与することができる。 本明細書に記載のシクロチド及びｋＯＲリガンドはまた、例えば１つ又は複数の追加の活性剤の有無にかかわらず、併用療法又は併用療法の文脈で使用／投与することができる。 好ましくは、この（これらの）追加の活性剤は、「グラフト」ではなく、すなわちシクロチドのグラフト形態の一部ではないが、独立して医薬組成物に含まれる。別の特定の実施形態によれば、追加の活性剤は、一時的及び／又は空間的に別々に投与される。 本明細書に記載のシクロチド及びｋＯＲリガンド（を含む医薬組成物／組み合わせ）は、１つ又は複数の追加の活性剤と共に、すなわち、追加の活性剤の投与に関して、前に、同時に又はその後に投与することができる。 １つ又は複数の追加の活性剤の非限定的な例は、ＫＯＲリガンド（例えば、https://www.guidetopharmacology.org/GRAC/ObjectDisplayForward?objectId=318&familyId=50&familyType=GPCR）又はＭＳ治療薬（例えば、https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30315270-treatment-of-multiple-sclerosis-success-from-bench-to-bedside/?from_term=tintore+2019&from_pos=1; Tintore, Nat Rev Neurol, 15(1), 2019, 53-8）から成る群から選択され得る。

【0155】

１つの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、（天然の）抽出物、特にシクロチド含有（天然の）植物抽出物を含むか、又はその形態であり得る。 そのような抽出物が得られる植物の非限定的な例は、以下である：Oldenlandia affinis、Carapichea ipecacuanha (特に Radix Ipecacuanhae)、Violaceae科の植物 (例えば、Viola sp.、好ましくは V.odorata 及び V.tricolor)、Squash種 (Cucurbitaceae 科、例えば Cucurbita pepo)、Ecballium 種、legume種 (Fabaceae科)、Psychotria 種 (Rubiaceae 科; 例えばPsychotria polyphlebia, P. poeppigiana, P. chiapensis, P. borucana, P. buchtienii, P. pillosa, P. mortomiana, P. deflexa, P. makrophylla, P. elata, P. solitudinum, P. capitata)、Bryonia alba, Momordica charantia, Strophantus kombe, Helianthus annuus, Sambuca nigra, Amaranthus sp. Amaranthus caudatusなど、Beta vulgaris, Rauwolfia serpentina, Morinda citrifolia, Moringa oleifera, Salix alba, Salix purpurea及びCajanus cajan。ｋＯＲリガンドは、（そのような）シクロチド含有抽出物に添加することができ、又は（そのような）シクロチド含有抽出物と同時投与することができる。

【0156】

それらのアミノ酸主鎖に加えて、本発明に従って使用されるシクロチドは、さらに、（a）標識のようなさらなる置換基、さらなる活性剤、アンカー（タンパク質性膜アンカーなど)、タグ (ＨＩＳ タグなど)を含むか、又は結合することができる（例えば、共有結合している）。置換基は、シクロチドに共有結合又は非共有結合で、直接又はリンカーを介して結合することができる。 更なる置換基をシクロチドに結合させることができる１つの特定の部位は、Ｋ残基、例えば、特定のシクロチドＴ２０Ｋの２０Ｋ残基に対応する（例えば、相同である）Ｋ残基である。 当業者は、この文脈で使用される適切なリンカーを容易に見出す立場にある。 さらに、適切な置換基及びそれらをシクロチドに付加する方法は、当業者に知られているか、又は確立することができる。

【0157】

標識の例には、とりわけ、以下を含む：蛍光色素（フッ素－１８、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドなど）、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、 放射性/放射性同位元素 (３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ 又は １２３Ｉ、１３５Ｉ、１２４Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏなど)、ビオチン、ジゴキシゲニン、コロイド金属、化学又は生物発光化合物 (ジオキセタン、ルミノール、アクリジニウムなど)。 シクロチドに結合することができる標識の非限定的な一例は、ＦＲＥＴ蛍光色素のような蛍光色素、例えばＧＦＰ、ＹＦＰ又はＣＦＰ変異体（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｅＧＦＰ、ＥＹＦＰ又はＥＣＦＰ）である。 生体分子を標識するために様々な技術が利用可能であり、とりわけ、酵素又はビオチニル基の共有結合、リン酸化、ビオチン化、ランダムプライミング、ニックトランスレーション、テーリング（ターミナルトランスフェラーゼの使用）を含む。そのような技法は、以下に記載される：Tijssen, "Practice and theory of enzyme immunoassays", Burden and von Knippenburg (Eds), Volume 15 (1985); "Basic methods in molecular biology", Davis LG, Dibmer MD, Battey Elsevier (1990); Mayer, (Eds) "Immunochemical methods in cell and molecular biology" Academic Press, London (1987);又は the series "Methods in Enzymology", Academic Press, Inc.。対応する検出方法には、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡法、直接的及び間接的な酵素反応などが含まれるが、これらに限定されない。

【0158】

本明細書に記載及び定義されるシクロチド、特に上記の標識シクロチドは、生体内分布研究、すなわち、例えば動物、又は好ましくはヒト対象／患者におけるシクロチドの分布パターンをもたらす研究に使用することができる。 例えば、そのような生体内分布研究は、単一光子又はＰＥＴイメージング装置によるイメージングを含み得る。 それぞれの手段及び方法は、当技術分野で知られている（例えば、PerkinElmerのIVIS（登録商標）Spectrum In Vivo Imaging System）。使用／投与されるシクロチドに結合され得るさらなる（活性）薬剤の例には、とりわけ、特定の細胞透過性ペプチド（例えば、細胞、組織など、例えば脳への指向性標的化のためのシャトルペプチド）としての抗体が含まれる。

【0159】

本発明の文脈において、「治療する」／「治療」は、一般的に、療法及び予防／予防的治療の両方を包含すると想定される。 療法は、改善又は養生/治癒さえももたらす可能性がある。

【0160】

本発明に従って使用／投与されるシクロチド及びｋＯＲリガンドは、（ａ）医薬組成物に含まれ得る。 それらは、同一の医薬組成物に含まれてもよい（すなわち、組み合わせて）。 それらの各々はまた、異なる医薬組成物中に別々に独立して含まれていてもよい。 さらに、シクロチド及びｋＯＲリガンドのそれぞれ、又はその両方を、単独の有効成分として、又は他の有効成分とともに、それぞれの医薬組成物に含めることもできる。

【0161】

本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含み得る。

【0162】

本発明の医薬組成物に任意に含まれる、又は医薬組成物と共に、又は本発明のシクロチド及びｋＯＲリガンドと共に投与される担体は、特に、医薬的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤であり得る。 そのような担体は、当技術分野で周知である。 当業者は、本発明に従って使用するのに適したそのような担体を容易に見出す立場にある。

【0163】

本明細書で定義される活性化合物（又はその塩）を含む医薬的組成物の処方に使用され得る医薬的に許容される担体／賦形剤／希釈剤は、一般液に、以下を含む：担体、ビヒクル、希釈剤、溶剤、例えば一価アルコール、例えばエタノール、イソプロパノール、多価アルコール、例えばグリコール及び食用油、例えば大豆油、ヤシ油、オリーブ油、ベニバナ油、綿実油、油性エステル、例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル； 結合剤、補助剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、崩壊剤、流動促進剤、潤滑剤、緩衝剤、乳化剤、湿潤剤、懸濁剤、甘味料、着色料、香料、コーティング剤、防腐剤、酸化防止剤、加工剤、薬物送達修飾剤及びエンハンサー、例えばリン酸カルシウム、マグネシウムステート、タルク、単糖類、二糖類、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ブドウ糖、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、ポリビニルピロリドン、低融点ワックス、イオン交換樹脂。これら及び他の適切な医薬的に許容される担体/賦形剤は、Remington`s Pharmaceutical Sciences, 15^th Ed., Mack Publishing Co., New Jersey (1991)に記載される。

【0164】

本発明による医薬組成物又はシクロチドの投与は、さまざまな方法で行うことができる。 これは、例えば、経口、静脈内、動脈内、腹腔内、膀胱内、結節内、皮下投与、吸入による投与並びに経皮投与であり得る。 他の例は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、結節内、くも膜下腔内、経皮、経粘膜、経肺硬膜下投与、局所または局所投与およびイオントフェレーシスによる投与、舌下投与、吸入スプレー又はエアロゾル又は直腸投与による投与などの非経口投与である。

【0165】

特に、患者及び／又は特定の医療用途のために、輸血（例えば、静脈内注入）、直腸投与（例えば、浣腸又は座薬の形で）又は局所投与経路のような特定の投与経路が示され得る。

【0166】

以下では、いくつかの非限定的な投与スキーム及び対応する適切な医薬的に許容される担体の使用が記載される。

【0167】

皮下（ｓ．ｃ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）／動脈内（ｉ．ａ．）注射による本発明による医薬組成物又はシクロチド及びｋＯＲリガンドの投与については、シクロチド（又はコード配列）は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液で製剤化することができる。経粘膜及び経肺投与の場合、浸透されるバリアに適した浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、当技術分野で一般に知られている。

【0168】

シクロチド及びｋＯＲリガンドを全身、すなわち静脈内／動脈内、結節内又は皮下投与に適した投薬量又は医薬組成物に処方するための医薬的に許容される担体の使用は、本発明の範囲内である。 担体の適切な選択及び適切な製造方法により、本発明の組成物、特に溶液として処方されたものは、静脈内注射などにより非経口的に投与することができる。化合物は、当技術分野で周知の医薬的に許容される担体を使用して、皮下又は経口投与に適した用量に容易に製剤化することができる。 このような担体は、本発明による化合物を、特に治療対象による経口摂取のために、錠剤、丸薬、カプセル、糖衣錠、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することを可能にする。

【0169】

体内／細胞内投与を目的とする本発明による化合物、又はそれらを含む医薬もしくは医薬組成物は、当業者に周知の技術を用いて投与することができる。 例えば、そのような薬剤は、リポソームにカプセル化され、次いで上記のように投与され得る。 リポソームは、内部が水性の球状の脂質二重層である。 リポソーム形成時に水溶液中に存在するすべての分子は、水性内部に取り込まれる。 リポソームの内容物は、外部の微小環境から保護されており、リポソームは細胞膜と融合するため、細胞表面近くに効率的に送達される。 リポソームを含む送達システムは、Ｊａｎｏｆｆらの米国特許第４，８８０，６３５号に開示されている。 刊行物及び特許は、リポソーム薬物送達のための技術の有用な説明を提供する。

【0170】

非経口及び／又は皮下投与のための本発明による化合物を含む医薬組成物は、水溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。 さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。 適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油又はヒマシ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル又はトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。 水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる化合物を含んでもよい。 任意には、懸濁液は、化合物の溶解度を高めて高濃度溶液の調製を可能にし、生体内での物質の持続的な徐放を可能にする適切な安定剤又は薬剤も含み得る。

【0171】

本発明の目的のための「患者」/「対象」、すなわち、(a)本発明による医薬組成物又はシクロチド及びｋＯＲそしてリガンドが投与される対象であり、 そして／又は本明細書に定義及び記載されている疾患又は障害及び／又は症状に苦しんでいる人には、ヒト及び動物の両方、並びに他の生物が含まれる。 従って、本発明の組成物及び方法は、手順及び方法の治療及び予防を含む、ヒト療法及び獣医学的適用の両方に適用可能であるか、又はそれらに関連して適用可能である。 好ましい実施形態では、患者／対象は哺乳動物であり、最も好ましい実施形態では、患者／対象はヒトである。

【0172】

本発明の医薬組成物、活性成分、組み合わせ、キット／内容物のキット／部品のキットなどは、医療機器、医薬品包装又は医薬組成物包装に含まれてもよく、その一部であってもよく、又はそれらであってもよい。 このような装置又は包装は、例えば、バイアル／容器、注射器、又はブリスターパックを含むか、又はそれらであり得る。 活性成分及び医薬組成物は、それぞれ、装置又はパッケージングに別々かつ独立して（例えば、異なるバイアル/容器又は注射器又はブリスターに）含まれてもよく、又はそれらは組み合わせて含まれてもよい（例えば、同じバイアル／容器又は注射器又はブリスターに）。

【0173】

本発明はさらに、例えばＭＳ及び／又は関連疾患及び／又は症状を治療するための医薬組成物の製造方法に関し、前記方法は、
（ｉ）本明細書で定義されるシクロチド及び／又はｋＯＲリガンド； 又は
(ii)本明細書に記載のようにスクリーニング、選択、生成、単離又は同定されたシクロチド及び/又はｋＯＲリガンドを、
医薬的に許容される担体、例えば、本明細書の他の箇所で定義される医薬的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に混合する工程を含む。

【0174】

医薬組成物の製造方法は、
（ｉ）本明細書で定義されるシクロチド；
（ｉｉ）本明細書で定義されるｋＯＲリガンド；及び
（ｉｉｉ）医薬的に許容される担体、例えば、本明細書の他の箇所で定義される医薬的に許容される担体／賦形剤／希釈剤を混合する工程を吹くことができる。

【0175】

本発明の医薬組成物、活性成分、組み合わせ、キットなどのいずれも、取扱説明書又は取扱説明書と一緒に提供され得る。 取扱説明書／リーフレットは、本発明に従って本明細書に記載の疾患、障害又は症状、特にＭＳ及び関連する疾患、欠損及び／又は症状をどのように治療又は予防するかについて、当業者／主治医のためのガイダンスを含んでもよい。特に、取扱説明書／リーフレットは、本明細書に記載の投与様式／投与レジメン（例えば、投与経路、投薬レジメン、投与時間、投与頻度）に関するガイダンスを含み得る。 原則として、投与様式／投与レジメンに関して本明細書の他の箇所で述べられていることは、取扱説明書／リーフレットに含まれ得る。

【0176】

以下の非限定的な図及び実施例を参照して、本発明をさらに説明する。

【0177】

本明細書では、特許出願を含む多数の文献が引用されている。 これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連するとは考えられていないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。 より具体的には、すべての参照文書は、個々の文書が具体的かつ個別に参照により組み込まれるように示されている場合と同じ程度に、参照により組み込まれる。

【0178】

以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらは単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【実施例】

【0179】

実施例1：材料及び方法
植物抽出
植物材料は Ａｌｆｒｅｄ Ｇａｌｋｅ ＧｍｂＨ (Bad Grund、Germany) から購入し、そして２５℃ で恒久的に攪拌しながら、メタノールとジクロロメタンの 1:1 (vol/vol) 混合物で一晩抽出した。 濾紙で濾過した後、０．５容量の水を加え、１０％未満のメタノール濃度に達するまで水相を蒸発させた。抽出物をさらにＣ１８シリカゲルカラム（４０～６３μｍ、Zeoprep 60; Zeochem）に適用した。 １００％ 溶媒 Ｂ [水中９０％ (vol/vol) アセトニトリル、０．１％ (vol/vol) ＴＦＡ] での洗浄、及び１００% 溶媒 Ａ [１００％ (vol/vol) 水、０．１% (vol/ ｖｏｌ）ＴＦＡ］による平衡化の後、溶媒Ｂの２０％～８０％の間の画分を集めた。 次に、抽出物を凍結乾燥し、さらに使用するまで－２０℃で保存した。

【0180】

ＲＰ－ＨＰＬＣ分画及びペプチド分離
粗抽出物または画分を 、５％ 溶媒Ｂ に溶解し、そして分取 (１０ μｍ、３００ Å、２５０ｍｍ×２１．２ｍｍ; Phenomenex Jupiter) 又はセミ分取 (５μｍ、１００ Å、２５０ｍｍ×１０ｍｍ; Kromasil) ＲＰ Ｃ１８シリカゲルカラム （５％ 溶媒 Ｂ で平衡化された）に負荷した。 分取分画は、Perkin Elmer Series 200 システムで、５ ～ ８０％ の溶媒 Ｂ の勾配を使用して、流速 ８ｍＬ/分(分取スケール) 又は３ｍＬ/分 (セミ分取スケール) で実行された。ＵＶ吸光度は、分析目的及び調製目的で、それぞれ２１４ｎｍ及び２８０ｎｍで記録された。カリペ及びビトリペプチドは、それぞれ、流速 ３ｍＬ/分及び １ｍＬ/分で、０．１－１％の溶媒 Ｂ [水中９０％ （ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトニトリル、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＴＦＡ]の直線勾配を用いて、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣ ユニット (Thermo-Fisher Dionex) での ＲＰ－ＨＰＬＣ によって精製された。

【0181】

ＭＡＬＤＩ ＭＳ 及びタンデムＭＳ分析とペプチド同定
粗抽出物及び全ての画分の分析は、リフレクター ポジティブ モードで動作し、３，５００～４，０００ (任意単位) に設定されたレーザー強度でスペクトル当たり ２，０００ ～５，０００ の合計ショットを取得する、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ ４８００ アナライザー (ＡＢ Ｓｃｉｅｘ) で実行された。 ＭＳ 及びタンデム ＭＳ 実験は、マトリックスとして５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトニトリル中の １０ｍｇ/ｍＬのα－シアノヒドロキシル桂皮酸を使用して実行された。 各サンプルのアリコート (０．５μＬ) を３μＬのマトリックスと混合し、プレートにスポットした。スペクトルは、４８００ Ａｎａｌｙｚｅｒ ソフトウェア (ＡＢ Ｓｃｉｅｘ) を使用して取得及び処理された。 次に、データベース検索又は ＤａｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ ソフトウェア (ＡＢ Ｓｃｉｅｘ) を使用した手動配列決定によって、シクロチドを同定した。

【0182】

酵素消化及びペプチド配列決定
粗抽出物内の全てのシステイン残基を減らすために、新たに調製した ０．２Ｍの ＤＴＴ(２μＬ; Sigma Aldrich) をサンプル アリコート (２０μＬ) に加え、暗所で ６０℃で３０分間インキュベートした。 各還元サンプルをアルキル化するために、新たに調製した０．５Ｍの ヨードアセトアミド (４μＬ; Sigma Aldrich) を加え、２５℃ で １０ 分間インキュベートした。消化が行われた場合、還元及びアルキル化されたサンプルは、それ以上の精製工程なしで、２μＬ の０．５μｇ／μＬのエンドプロテイナーゼ Ｇｌｕ－Ｃ (Sigma Aldrich) 又は０．１μｇ／μＬのトリプシン ( Sigma Aldrich) のいずれかを添加することにより酵素消化にゆだね、そして３７℃ で ３ 時間インキュベートした。 希釈ＴＦＡ（１μＬ）を添加することにより、反応をクエンチした。 ＭＳ 分析の前に、Ｃ１８ ＺｉｐＴｉｐｓ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ) を使用してサンプルを脱塩し、４℃で保存した。

【0183】

クローニング、細胞培養、トランスフェクション、及び膜の調製
ｋＯＲ配列を、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を使用してｐＥＧＦＰ－Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入した（Ｃ末端ＧＦＰ融合タンパク質を生成するため）。 ＨＥＫ２９３細胞の増殖及び安定してトランスフェクトされた細胞株の作製のための条件は、以前に記載されたものと同様であった（Hicks, J Neuroendocrinol 24 (7), 2012, 1012-29）。 細胞を採取し、以前に記載されたように膜を調製した（Hicks、前記）。

【0184】

放射性リガンド結合アッセイ
マウス ｋＯＲ を安定して発現する ＨＥＫ２９３ 細胞からの膜 (アッセイ当たり５～１０μｇ) を、５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）の ＢＳＡ （ｐＨ 7.4）、競合するリガンド及び ［３Ｈ］－ジプレノルフィン (競合結合の場合は １ｎＭ) を含む最終用量 ３００μＬでインキュベートした。 ［３Ｈ］－ジプレノルフィンは PerkinElmer Life Sciences から購入した。 ３７℃で６０分後、ガラス繊維フィルターマット［Skatron FilterMAT 11731 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)］上で急速濾過することにより、反応を停止させた。非特異的結合は、１０ μＭ のナロキソン (Sigma Aldrich) の存在下で測定された。 特異的結合は、総結合と非特異的結合の違いを表し、正規化されたデータとして表示される。 ＩＣ５０ 値と Ｈｉｌｌ 係数は、Levenberg-Marquardt アルゴリズムを使用してデータを ３パラメーターのロジスティック方程式 (Hill 方程式) に適合させることによって得られた。

【0185】

機能的ｃＡＭＰアッセイ
細胞のｃＡＭＰレベルは、ｋＯＲを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞で、Cisbio cAMP Gi キット (６２ＡＭ９ＰＥＣ) を使用して測定された。 細胞を ８００ｒｐｍ で遠心分離し、上清液を吸引し、細胞ペレットを ０．５ｍＭのＩＢＭＸを含む １ｘ 刺激緩衝液に再懸濁した。 ２０００個の細胞/ウェルを白色の３８４ウェルプレートに播種し、１×刺激緩衝液で希釈したリガンドで示されているように処理した後、３７℃で３０分間インキュベートした。 刺激は、５ μＬ/ウェルのクリプテート標識ｃＡＭＰ 及び ５ μＬ/ウェルの抗 ｃＡＭＰ ｄ２ コンジュゲートを順次添加することによって終了させ、それぞれ溶解検出緩衝液で希釈 (１：２０)した。室温で１ 時間インキュベーションした後、Flexstation 3(Molecular Devices, San Jose, USA) を使用して、遅延時間 １００ μs、積分時間 ３００ μs で時間分解蛍光エネルギー移動 (ＴＲ－FRET) を測定した。 得られた ６２０／６６５ｎｍ 蛍光比の値は、GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software、La Jolla、CA) でプロットされた。

【0186】

βアレスチン動員アッセイ
受容体刺激時のβ－アレスチン２の動員は、β－アレスチン－ルシフェラーゼとＥＧＦＰタグ付きｋＯＲとの間の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のリアルタイム測定によって測定された。 細胞は、β－アレスチン２－Ｎｌｕｃ（限定使用ラベルライセンス（NanoLuc、Promega、Madison、USA）の下でKevin Pflegerからの贈り物として入手）とｋＯＲ－ＥＧＦＰをコードするプラスミドを１：１０の比率で同時トランスフェクトした。 トランスフェクション後 ６時間で、１０％ ウシ胎児血清を含むフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ 中、５０，０００個の 細胞/ウェルで、細胞を白く透明な底の ９６ ウェルプレートに移した。翌日、細胞をフェノールを含まないＤＭＥＭで1 時間血清飢餓状態にした。 ハンクス平衡塩類溶液で １：５０ に希釈したフリマジン (Promega, Madison, USA) を、１：１ の比率でモニタリングする ５分前に細胞に添加した。 発光は、Flexstation 3 (Molecular Devices, San Jose, USA) で ４６０ｎｍ （Ｎｌｕｃ） 及び ５１０ｎｍ（ＥＧＦＰ）で測定された。 ５ 分間ベースラインを確立した後、ＨＢＳＳ で希釈したリガンドを添加し、応答を３５ 分間測定した。リガンド誘導 ＢＲＥＴ シグナルは、(発光 ＥＧＦＰｌｉｇａｎｄ / 発光 Ｎｌｕｃｌｉｇａｎｄ)－(発光 ＥＧＦＰＨＢＳＳ / 発光 ＮｌｕｃＨＢＳＳ) として計算された。 ｋＯＲ での濃度応答曲線は、さまざまなリガンド濃度の添加後 ５分でのＢＲＥＴシグナルから生成された。 ［Ｔ２０Ｋ］－カラタ Ｂ１及び Ｕ５０，４８８ の ｋＯＲ でのアロステリック変調は、３７℃で５ 分間の共インキュベーションによって測定された。

【0187】

ペプチド結合
ペプチド結合は、以前に記載されたものと同様に行った(Thell, 前記)。 ［Ｔ２０Ｋ］－カラタ Ｂ１ を ０．１ＭのＮａＨＣＯ_３ 緩衝液、ｐＨ ８．５ に溶解した。 ２０倍モル過剰のＶｉｖｏＴａｇ ６８０ ＸＬ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を無水ＤＭＳＯ中で調製し、反応を２５℃で４時間進行させた。 ０．１％ＴＦＡで反応を停止した。過剰な試薬からの標識ペプチドの精製は、ｄｉＣｈｒｏｍ Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８ カラム (２５０×１０ｍｍ、５μｍ) 及び直線勾配 ５ ～ ８０％ 溶媒Ｂ [２ 回蒸留 Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ、１０／９０ ／０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）、溶媒Ａ ０．１％ＴＦＡ水溶液］を用いてセミ分取ＨＰＬＣにより達成された。ＨＰＬＣ分画は、ネガティブリフレクターモードでのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって分析した。 分析用 ＨＰＬＣ 及び Ａ２８０ＵＶトレースでの ＶｉｖｏＴａｇ 標識の検出に基づいて、ペプチドサンプルの純度は ９５％ 以上であると決定された。

【0188】

ＥＡＥ及びインビボイメージング
Ｃ５７ＢＬ／６ マウスを、０ 日目に７５μＬの等量のＭＯＧ(ＭＯＧ_{３５-５５}、１ｍｇ／ｍＬ; Charite Berlin) と１０ｍｇ／ｍＬの結核菌Ｈ３７Ｒａ (Difco)により補充された不完全フロイト アジュバント (Sigma-Aldrich)とを、左右の脇腹に皮下注射することにより免疫化した。さらに、マウスは、０日目及び２日目に、１００μＬのＰＢＳに溶解された２００ｎｇの百日咳毒素（Millipore）を腔内投与された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、(Thell, 前記)に最近記載されたプロトコルに従って、０日目に免疫化された。ＥＡＥ の進行は以下の５つの臨床段階に分けられた；スコア ０、兆候なし；スコア １、完全な尾麻痺；スコア２、部分麻痺；スコア３、重度の対麻痺； スコア ４、四肢不全麻痺；スコア５、瀕死状態。マウスが除外基準 (スコア ＞ ４、体重減少 ＞ ２０％、水と食物の摂取なし、毛づくろいなし) を満たす場合、瀕死と見なされる。 マウスは、倫理的ガイドラインにより３～４のスコアに達するとケタミンで深く麻酔することにより安楽死させられた。病期０．５及び１．７５で、結合[Ｔ２０Ｋ]－カラタＢ１（５ｍｇ/ｋｇ）を腹腔内注射した。注射後４時間で臓器を採取し、シグナル応答を ＩＶＩＳ でモニターした。

【0189】

実施例２: Carapichea ipecacuanha及びViola tricolor から分離されたシクロチドは、ｋＯＲ のリガンドである
ｋＯＲ は最近、多発性硬化症の再ミエリン化療法を開発するための魅力的なターゲットとして、またより安全で効果的な鎮痛薬を開発するための代替手段として浮上してきた(Du, loc. cit.; Mei, 2014, loc. cit.; Che, Cell 172 (1-2), 2018, 55-67 e15)。植物ライブラリーを用いた結合スクリーニングの取り組みにより、ｋＯＲに結合するシステインに富むペプチドを含むいくつかの植物抽出物が特定された（図１）。 これらの植物の中で、Psychotria solitudinum、Viola tricolor、Carapichea ipecacuanha、Violaodorata、Momordica charantia、及び Beta vulgaris からの植物抽出物が、最も顕著な結合効果を示した。ｋＯＲ に対する親和性を考慮して、これらの抽出物に存在するシステインに富むペプチドを特定することが求められた。 いくつかのシステインに富むペプチド、いわゆるシクロチドがこの植物から以前に分離されていたため、それは C. ipecacuanha (トコンの根) から始まった。 トコン抽出物は、最初にペプチドからアルカロイド（例えば、エメチン、セファエリン）を分離するためにＨＰＬＣベースの精製にかけられた。 次に、ペプチドが豊富な画分を放射性リガンド結合アッセイで分析したところ、実際に、それらはｋＯＲに結合する能力を示した（図２Ａ）。続いて、トコンの根の抽出物(Fahradpour、前出)から以前に単離された６つのシクロチドを、放射性リガンド結合についてアッセイした。 興味深いことに、６ つのシクロチドすべてが ｋＯＲ に結合できた (図２Ｂ)。 その後、カリぺ１０ を使用して濃度反応曲線を作成した。 ダイノルフィンＡ１－１３ (内因性の ｋＯＲ ペプチド リガンド) と比較すると、カリペ １０ はトリチウム化されたジプレノルフィンを １ μＭ のＫｉ値で濃度依存的に置換した (図 ２Ｃ)。 トコンの根の抽出物からのシクロチドは ｋＯＲ のリガンドとして作用するため、シクロチドに富む植物抽出物 V. tricolor をさらに生物活性誘導分画にかけた。 ペプチドが豊富な画分はｋＯＲに対する親和性を示し、それによって画分９が最も活性的であった（図２Ｄ）。このペプチドに富む画分をさらに精製して、結合親和性の原因となるシクロチドを単離した。 興味深いことに、最も活性な画分から新規シクロチドが単離され、配列決定され（図２Ｅ）、その後、この新規ビトリシクロチドがｋＯＲに結合できることが実証された（図２Ｆ）。 全体として、これらのデータは、C. ipecacuanha 及び V. tricolor から分離されたシクロチドが低 μＭ 範囲の親和性でｋＯＲに結合するという証拠を提供する。

【0190】

実施例３:［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１はｋＯ に結合して活性化する
C. ipecacuanha 及び V. tricolor から分離されたシクロチドが ｋＯＲ に結合する能力は、放射性リガンド結合及び機能研究において ［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１を薬理学的に特徴付けるよう促した。 結合及び機能データは、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１がそれぞれ ２．７μＭ のＫｉ 及び １７μＭ のＥＣ_５０で ｋＯＲ に結合して活性化することを明らかにした (図 ３Ａ 及びＢ)。ダイノルフィンＡ１－１３は、２８０ ｐＭ の Ｋｉ 値と１４ｎＭのＥＣ_５０を示す陽性対照として使用された。 ｋＯＲ は、中枢神経系 (ＣＮＳ) 全体に広く発現している。 ｋＯＲ の選択的活性化は、身体依存や呼吸不全のリスクなしに、動物モデルで抗侵害受容をもたらす。 ただし、鎮痛効果に加えて、ｋＯＲ の活性化には不快感や鎮静などの望ましくない副作用があることが示されていることは注目に値する(Darcq, Nat Rev Neurosci 19 (8), 2018, 499-514)。これらの副作用は、脱髄疾患の治療におけるｋＯＲアゴニストの治療可能性を弱める可能性がある。 興味深いことに、ＧＰＣＲ シグナル伝達を調節するサイトゾルタンパク質であるベータ アレスチンは、オピオイド受容体の活性化に関連する副作用の発生に関連付けられている (Darcq, 前記)。従って、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ1 がβ アレスチン動員を誘発する能力を ＢＲＥＴ ベースのアッセイで調べることに着手した。 その結果、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ1を、ＮａｎｏＬｕｃ－β－アレスチン２と ＥＧＦＰ－ｋＯＲ を一時的に共発現する ＨＥＫ293 細胞とインキュベートした場合、β アレスチンの動員は検出されなかった (図 ３Ｃ 及びＤ)。 対照的に、ダイノルフィン Ａ １－１３ は、１８３ｎＭ の ＥＣ_５０ でβ アレスチンを動員することができた。 これらのデータは、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ1が ｋＯＲ の完全なアゴニストであり、中枢を介した ｋＯＲ の副作用を発症する可能性が低いことを示唆している。

【0191】

実施例 ４: ［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ1は ｋＯＲ のアロステリックモジュレーターである
ここ数年、アロステリック調節の概念は、ＧＰＣＲ の分野で科学的な勢いを増している (Conn, Nat Rev Drug Discov 8 (1), 2009, 41-54]。 オルトステリック部位とは異なる受容体部位に結合するいくつかのアロステリック調節因子が、ＣＮＳ障害の治療の新規アプローチとして同定されている(Conn, 前記)。 アロステリックな作用機序を有する化合物は、潜在的な治療薬として、オルソステリック リガンドよりもさまざまな理論上の利点を示すことができる。 例えば、アゴニズムを示さないアロステリックモジュレーターは、内因性オルソステリック活性の非存在下では静止しており、放出されたオルソステリックアゴニストの存在下でのみ効果を発揮する(Conn,前記)。従って、そのようなアロステリックモジュレーターは、活動依存性と、内因性生理学的シグナル伝達の時間的及び空間的側面の両方を維持する可能性がある。 アロステリック リガンドの２番目の潜在的な利点は、保存されたオルソステリック ドメインと比較して、受容体サブタイプ全体のアロステリック部位でのより高い配列分岐による、又は特定のサブタイプでの選択的協同性による他のサブタイプの排除による、より高い受容体選択性である (Conn, 前記)。 あるいは、オルソステリックとアロステリックの両方のファーマコフォアを同じ分子内で組み合わせて、新しいクラスの「バイトピック」ＧＰＣＲ リガンドを生成することにより、選択性を生み出すことができる (Conn, 前記; Valant, Annu Rev Pharmacol Toxicol 52, 2012, 153-78)。 従って、放射性リガンド及び機能アッセイを使用して、ｋＯＲでの［Ｔ２０Ｋ］－カラタ Ｂ１のアロステリック効果を調査することが求められた。放射性リガンド結合研究は、ｋＯＲ を安定して発現し、さまざまな濃度の ［Ｔ２０Ｋ］－カラタ Ｂ１を、選択的なｋＯＲアゴニストであるダイノルフィン Ａ１－１３又はＵ５０，４８８ と共培養した ＨＥＫ２９３ 細胞で実施された。 ここで、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１ がトリチウム化ジプレノルフィンを負に調節し、内因性ダイノルフィンＡ１－１３ の親和性にわずかに影響を与えるだけであることが明らかになった (図４Ａ、表１)。 ［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１を Ｕ５０，４８８ と共培養した場合にも、同様の効果が誘発された (図 ３Ｂ、表２)。驚くべきことに、細胞の ｃＡＭＰ レベルを測定することによって機能研究を行ったところ、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１はダイノルフィンＡ１－１３ の効力に影響を与えず、代わりにその有効性の増加につながることが観察された (図 ４Ｃ、 表１）。 しかし、Ｕ５０，４８８ との共インキュベーションは、逆のアロステリック効果をもたらした。つまり、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１は効力の９倍の左シフトを誘発し、オルソステリック リガンドの有効性にわずかな影響しか与えなかった (図 ４Ｄ、 表２)。 この観察結果は、ｋＯＲ でのアロステリック相互作用のプローブ依存性の古典的な例と一致していた。 明らかなように、アロステリック変調の方向及び/又は大きさの変化は、オルソステリック プローブ リガンドの性質に大きく依存する。Ｕ５０，４８８ がβ アレスチン動員を誘導できることを考えると、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１を Ｕ５０，４８８ とさらに共培養して、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１が Ｕ５０，４８８ のβアレスチン動員能力に影響を与えるかどうかを確認した。実際のところ、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１ による ｋＯＲ の共刺激は、Ｕ５０，４８８ の有効性の顕著な緩和をもたらし、その効力に影響を与えなかった (図４Ｅ及び Ｆ、表 ２)。

【0192】

これらのデータは、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１がｋＯＲのオルソステリック リガンドであるだけでなく、ｋＯＲ をアロステリックに結合できるバイトピック リガンドとしても機能することを示している。 従って、ｋＯＲ での ［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１ のアロステリック調節のこの現象は、ＭＳ の治療においてさらに有益な効果を発揮する可能性がある。

【0193】

実施例 ５: ［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１が ＭＳ の ＥＡＥ モデルの脳に蓄積する
［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１と ｋＯＲ を ＭＳ の治療候補として検討するには、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１が血液脳関門 (ＢＢＢ) を通過する能力を調べる必要がある。 この目的のために、最先端の ＭＳ のインビボモデルであるマウス ＥＡＥ アッセイを使用した。 注射前に、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１をＶｉｖｏＴａｇ ６８０ ＸＬ Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅに結合し、続いて以前に記載されたようにそのＨＰＬＣベースの精製を行った（Ｔｈｅｌｌ、前記）。マウスが疾患を発症すると、結合［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１が異なる疾患段階 (０．５ 及び １．７５) で腹腔内注射され、注射後４ 時間の臓器が採取され、ＩＶＩＳ を使用して体内分布が監視された。 標識シクロチドは脳と脊椎に蓄積されたが、その程度ははるかに低かった(図５Ａ、Ｃ、Ｄ)。 EvansBlue 色素を陽性対照として使用し、脳と脊椎で強いシグナルを示した (図 ５Ｂ、Ｅ、Ｆ)。

【0194】

最後に、これらのデータは、［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１が ＥＡＥ モデルで ＣＮＳ に浸透する能力を確認し、それによって［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１ を Ｕ５０，４８８ と組み合わせた ＭＳ 治療に関するさらなる調査に非常に適したものにする。

【0195】

実施例６：Ｕ５０，４８８／ダイノルフィンＡ１－１３と組み合わせた［Ｔ２０Ｋ］－カラタＢ１によるＥＡＥマウスのエクスビボ／インビボ処置は、再ミエリン化の増加／脱髄の減少及びＥＡＥ臨床スコアの増加をもたらす
ｋＯＲ は、オリゴデンドロ サイトの分化と髄鞘形成を促進する有望なターゲットとして識別されている。 オリゴデンドロ サイトは、ミエリンを形成する ＣＮＳ の支持グリア細胞の 1 つである。 ミエリンは、ＣＮＳ の必須成分であり、基礎となる軸索への電気伝導と代謝サポートをサポートする。 多発性硬化症 （ＭＳ) などの神経変性状態では、ミエリン鞘が損傷している。 成人の脳には幹細胞様のオリゴデンドロ サイト前駆細胞 (ＯＰＣ) の集団が含まれており、これが新しいオリゴデンドロ サイトに分化し、露出した軸索を再ミエリン化し、それによって内因性修復プロセスを示す。

【0196】

ｋＯＲアゴニストのナルフラフィンと Ｕ５０，４８８ は、インビトロ と インビボの両方で活性であることが示されている (Denny, 前記; Du 、前記)。 従って、たとえば Ｔ２０Ｋ と ＯＰＣ 分化及び再ミエリン化の促進に関するこれらのリガンドとの比較、並びにそれらの組み合わせによる改善された有効性を可能にする研究が設計されている。

【0197】

1. エクスビボ研究プロトコル：
ラットの新生児の脳を解剖し、小脳と髄膜を取り除く。 脳は １時間の酵素消化を介して解離し、その後、培地 (ダルベッコ改変イーグル培地、ＤＭＥＭ)、１０％ ウシ胎児血清 (ＦＢＳ)、1％ ペニシリン－ストレプトマイシン (Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ) を細胞に添加して消化を停止する。解離した細胞を遠心分離し、上清を除去する。 細胞を、１８ ゲージ及び ２３ ゲージの針で粉砕することにより培地に懸濁し、フラスコ当たり約 １．５ 皮質で Ｔ７５ フラスコに添加する。細胞を １０ 日間培養し、２ ～ ３ 日ごとに培地を交換する。 １０ 日目に、フラスコを ２５０ｒｐｍ で １ 時間振盪することにより、緩く付着したミクログリアを除去する。 次に、フラスコに培地を補充し、２３０ｒｐｍで １８．２０ 時間、一晩振盪する。翌日、ＯＰＣを含む培地を各フラスコから取り出す。 収集された細胞は、未処理の ＴＣ ペトリ皿に ２０ 分間プレートされ、それらの差動接着によって混入している星状細胞を除去する。残りの精製された ＯＰＣ を遠心分離し、カウントし、そして１０ ｎｇ／ｍＬ の成長因子 ＰＤＧＦＡＡ 及び ＦＧＦ を含む、ＳＡＴＯ 培地(ＤＭＥＭ、５ｍＬの１００ｘ ＳＡＴＯ、５ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、５ ｍＬの インスリン、トランスフェリン、セレナイト (ＩＴＳ)補足)でポリ－Ｄ－リジンでコーティングされた９６ウェルプレートに１ウェル当たり７，０００細胞でプレートする（０日目）。ＯＰＣ は、アッセイを開始する前に ４８ 時間培養で維持される。２ 日目に、培地を除去し、新鮮な培地 (試験物質 (Ｔ２０Ｋ 及び/又は Ｕ５０，４８８ 及び/又はナルフラフィンを含む) 又は適切な参照物質 (Ｔ３、３，３‘，５－トリヨード－Ｌ－サイロニンなど))を添加した。これらの物質のインキュベーション期間は最適化されている。 元のプロトコルでは ７２ 時間のインキュベーションが推奨されていたが、これは細胞毒性のために決定的な結果につながる可能性がある (これらの初代神経細胞は Ｔ２０Ｋ などの生体異物に非常に敏感であるため)。従って、インキュベーション プロトコルは、より短い時間 (３０ 分、１ 時間、４ 時間、８ 時間、又は ２４ 時間など) に最適化されている。 その後、細胞を ＰＦＡ (４％、１０ 分) で固定し、Ｏｌｉｇ２ (Merck など; ＭＡＢＮ５０)、ＮＧ２ (Merck; ＡＢ５３２０)、及び ＭＢＰ (Biorad; ＭＣＡ４０９Ｓ) に対する抗体を投与する。 プレートは、適切な高コンテンツ イメージング システムを使用して画像化され、細胞計数が実行され、各マーカーに対して陽性の細胞数が定量化される。 培養中に観察された形態学的変化を強調するために、低出力位相コントラスト画像が定期的に撮影される。免疫染色後、ウェルは １０ 倍の倍率で画像化される。 画像は自動画像解析を使用して処理され、細胞数が計算されｒｙ。 ５つの視野が各ウェルからイメージされ、各マーカーに陽性の細胞がカウントされる。 異なる濃度の試験化合物と参照化合物が評価され； 治療は ３ つの技術的なレプリケートで培養され、実験は複数のラットの子からプールされた細胞に対して少なくとも ３回 (Ｎ ＝ ３) 独立して実行される。

【0198】

この研究は、Ｔ２０Ｋ 単独及び既知のＫＯＲアゴニストと組み合わせた場合の再ミエリン化効果を定量化するように設計されている。 この目的のために、ＭＢＰ 陽性であるオリゴデンドログリアのパーセンテージを条件ごとに計算して、分化の影響を明らかにする。ＭＢＰ陽性オリゴデンドログリアの増加は、そのような効果を示している。 Ｏｌｉｇ２は未分化ＯＰＣのマーカーであり、ＮＧ２は多くの多様な細胞タイプの原形質膜に見られる内在性膜プロテオグリカンであり、細胞の全体的な細胞生存状態を提供する。

【0199】

２. インビボ研究プロトコル:
インビボでＫＯＲアゴニストと組み合わせたＴ２０Ｋの再ミエリン化活性は、多発性硬化症のＥＡＥマウスモデルで決定される。 ＥＡＥが誘発され、マウスは以前に確立されたように処理される(Thell et al.)。 対照処置と比較した髄鞘形成の程度は、組織学によって実施される。 マウスの脊髄を分離し、４％ 緩衝ホルマリンで固定し、組織学的評価のために処理する。 切片が、標準的なプロトコルを使用してＨ＆Ｅと ＬＦＢ で染色される。 さらに、切片は、ラット抗 ＣＤ３ (例えば、AbD Serotech) 及びヤギ抗ラット (例えば、Vector Laboratories) 抗体を用いた免疫組織化学を使用して、ＣＤ３ 表面発現について分析される。各動物の最低 ３つの断面を組織学的に評価する。 炎症指数は次のように計算される: 脊髄断面における血管周囲浸潤の数を、各動物の使用断面の数で割る。 う、炎症指数が高いほど、炎症性浸潤が多いことを示す。 脱髄領域の程度を評価するために、各断面の総脱髄領域をＫＬＢ染色で測定する。 次に、脱髄領域が計算され、全断面積のパーセントとしてプロットされる。 例えば、画像Ｊは全ての組織学的評価に使用される。

【0200】

さらに、末梢からＣＮＳへのＴ細胞浸潤の程度が決定される。これは、末梢Ｔ細胞での ＫＯＲ 活性化がその ＣＮＳ 再ミエリン化活性にとって重要であると考えられているためである(ＲＥＦ ニュージーランドの論文)。免疫細胞は、適切な動物の脳を５ｍＬのコラゲナーゼＤ (０．２３３Ｕ／ｍｇ; Roche) と ＤＮａｓｅ (Roche) (臓器当たり０．１７Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＤと ０．０１ ｍｇ／ｍＬの ＤＮａｓｅＩ）の混合物による消化によりＣＮＳから単離された。振盪インキュベーターで脳を３７℃で３０分間インキュベートする。組織をさらに破壊するために、ＥＤＴＡ (ＰＢＳ 中 ｐＨ８．０) を加えて最終濃度 ２ｍＭ にし、懸濁液を２３℃で５分間ピペッティングしてから、７０ μｍ 細胞こし器で濾過する。 細胞をＰＢＳで４００×g、４℃で８分間洗浄してから、ＲＰＭＩ培地に再懸濁する。 細胞をＦＡＣＳ分析に使用するか、３×１０^６／ｍＬ の濃度で播種し、３０μｇ／ｍＬのＭＯＧでエクスビボで刺激した。 刺激された細胞の上清は、ＥＬＩＳＡ を使用したサイトカイン分泌の検出に使用される(詳細については、Thell et al. を参照のこと)。

【0201】

ＫＯＲアゴニストと組み合わせたＴ２０ＫによるＥＡＥ疾患マウスの治療は、ＥＡＥ誘発対照治療マウスと比較して、炎症指数の低下と軸索脱髄領域の減少につながると予想される。さらに、処置されたマウスの脳からの ＣＤ３、ＣＤ４、又はＣＤ８陽性細胞の定量化は、ＣＮＳのＣＤ３＋、ＣＤ４＋細胞の数の減少をもたらすと予想され、ＣＤ３の減少は脊髄細胞の指標になると予想される。

【0202】

本発明は、以下の表を参照する：

【0203】

【表1】

【0204】

【表2】

【0205】

【表3-1】

【表3-2】

【0206】

【表4】

【0207】

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【表5-5】

【0208】

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【0209】

本発明は、以下のヌクレオチド及びアミノ酸配列を指す：
配列番号１:
カラタ Ｂ１のアミノ酸配列: GLPVCGETCVGGTCNTPGCTCSWPVCTRN

【0210】

配列番号２:
カラタ Ｂ２ のアミノ酸配列: GLPVCGETCFGGTCNTPGCSCTWPICTRD

【0211】

配列番号３:
Ｄ－カラタＢ２の参照アミノ酸配列: all-DGLPVCGETCFGGTCNTPGCSCTWPICTRD

【0212】

配列番号４:
カラタＧ１８Ｋのアミノ酸配列: GLPVCGETCVGGTCNTPKCTCSWPVCTRN

【0213】

配列番号５:
カラタＮ２９Ｋのアミノ酸配列: GLPVCGETCVGGTCNTPGCTCSWPVCTRK

【0214】

配列番号６:
カラタ Ｔ２０Ｋ、Ｇ１Ｋのアミノ酸配列: KLPVCGETCVGGTCNTPGCKCSWPVCTRN

【0215】

配列番号７：
カラタ Ｔ２０Ｋのアミノ酸配列: GLPVCGETCVGGTCNTPGCKCSWPVCTRN

【0216】

配列番号８:
カラタＴ８のアミノ酸配列: GLPVCGEKCVGGTCNTPGCTCSWPVCTRN

【0217】

配列番号９:
カラタＶ１０Ａ のアミノ酸配列: GLPVCGETCAGGTCNTPGCTCSWPVCTRN

【0218】

配列番号１０:
カラタＶ１０Ｋのアミノ酸配列: GLPVCGETCKGGTCNTPGCTCSWPVCTRN

【0219】

配列番号１１:
カラタＢ1 をコードするヌクレオチド配列: GGACTTCCAGTATGCGGTGAGACTTGTGTTGGGGGAACTTGCAACACTCCAGGCTGCACTTGCTCCTGGCCTGTTTGCACACGCAAT

【0220】

配列番号１２:
カラタＢ２をコードするヌクレオチド配列: GGTCTTCCAGTATGCGGCGAGACTTGCTTTGGGGGAACTTGCAACACTCCAGGCTGCTCTTGCACCTGGCCTATCTGCACACGCGAT

【0221】

配列番号１３:
カラタＢ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列。 成熟したカラタＢ１ドメインには下線が引かれている。 Ｐ５６２５４、カラタ－Ｂ１、Oldenlandia affinis
MAKFTVCLLLCLLLAAFVGAFGSELSDSHKTTLVNEIAEKMLQRKILDGVEATLVTDVAEKMFLRKMKAEAKTSETADQVFLKQLQLKGLPVCGETCVGGTCNTPGCTCSWPVCTRNGLPSLAA

【0222】

配列番号１４:
カラタＢ２ 前駆体タンパク質のアミノ酸配列。 ３つの成熟した カラタＢ２ドメインには下線が引かれている。 Ｐ５８４５４、カラタ－Ｂ２、Oldenlandia affinis
MAKFTNCLVLSLLLAAFVGAFGAEFSEADKATLVNDIAENIQKEILGEVKTSETVLTMFLKEMQLKGLPVCGETCFGGTCNTPGCSCTWPICTRDSLPMRAGGKTSETTLHMFLKEMQLKGLPVCGETCFGGTCNTPGCSCTWPICTRDSLPMSAGGKTSETTLHMFLKEMQLKGLPVCGETCFGGTCNTPGCSCTWPICTRDSLPLVAA

【0223】

配列番号１５:
カラタ Ｂ１前駆体タンパク質をコードするヌクレオチド配列。 成熟カラタＢ１ドメインに対応するヌクレオチド配列には下線が引かれている。 ＞ｇｉ｜１５６６７７４０｜ｇｂ｜ＡＦ３９３８２５．１｜ Oldenlandia affinis カラタ Ｂ１前駆体、ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
GGCACCAGCACTTTCTTAAAATTTACTGCTTTTTCTTATTTCTTGTTCTGTGCTTGCTTCTTCCATGGCTAAGTTCACCGTCTGTCTCCTCCTGTGCTTGCTTCTTGCAGCATTTGTTGGGGCGTTTGGATCTGAGCTTTCTGACTCCCACAAGACCACCTTGGTCAATGAAATCGCTGAGAAGATGCTACAAAGAAAGATATTGGATGGAGTGGAAGCTACTTTGGTCACTGATGTCGCCGAGAAGATGTTCCTAAGAAAGATGAAGGCTGAAGCGAAAACTTCTGAAACCGCCGATCAGGTGTTCCTGAAACAGTTGCAGCTCAAAGGACTTCCAGTATGCGGTGAGACTTGTGTTGGGGGAACTTGCAACACTCCAGGCTGCACTTGCTCCTGGCCTGTTTGCACACGCAATGGCCTTCCTAGTTTGGCCGCATAATTTGCTTGATCAAACTGCAAAAATGAATGAGAAGGCCGACACCAATAAAGCTATCAATGTAGTTGGTCCCTGTACTTAATTTGGTTGGCTCCAAACCATGTGTGCTGCTCTTGTTTTTGTTTTTTCTTTTTTCTTCTCTCTTTCGGGCACTCTTCAGGACATGAAGTGATGATCAGTACTCTTTGCTATCATGTTTTCTGTGCACACCTTCTATTGTAGGTGTTGTTGTGATGTTGATGCCCAATTGGAATAAACTGTTGTCGTTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAA

【0224】

配列番号１６:
カラタ Ｂ２前駆体タンパク質をコードするヌクレオチド配列。 ３つの成熟カラタＢ２ドメインに対応するヌクレオチド配列には下線が引かれている。 ＞ｇｉ｜１５６６７７４６｜ｇｂ｜ＡＦ３９３８２８．１｜ Oldenlandia affinis カラタ Ｂ２前駆体、ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
GGCACCAGATACAACCCCTTTCTTATAATTTATTGCTTTTCTTATTCCTTGAAAAAGGAGAAATAATATTGGATCTTCCATGGCTAAGTTCACCAACTGTCTCGTCCTGAGCTTGCTTCTAGCAGCATTTGTTGGGGCTTTCGGAGCTGAGTTTTCTGAAGCCGACAAGGCCACCTTGGTCAATGATATCGCTGAGAATATCCAAAAAGAGATACTGGGCGAAGTGAAGACTTCTGAAACCGTCCTTACGATGTTCCTGAAAGAGATGCAGCTCAAAGGTCTTCCAGTATGCGGCGAGACTTGCTTTGGGGGAACTTGCAACACTCCAGGCTGCTCTTGCACCTGGCCTATCTGCACACGCGATAGCCTTCCTATGAGGGCTGGAGGAAAAACATCTGAAACCACCCTTCATATGTTCCTGAAAGAGATGCAGCTCAAGGGTCTTCCAGTTTGCGGCGAGACTTGCTTTGGGGGAACTTGCAACACTCCAGGCTGCTCGTGCACCTGGCCTATCTGCACACGCGATAGCCTTCCTATGAGTGCTGGAGGAAAAACATCTGAAACCACCCTTCATATGTTCCTGAAAGAGATGCAGCTCAAGGGTCTTCCAGTTTGCGGCGAGACTTGCTTTGGGGGAACTTGCAACACTCCAGGCTGCTCGTGCACCTGGCCTATATGCACACGTGATAGCCTTCCTCTTGTGGCTGCATAATTTGCTTCATCAAACTGCAAAATGAATAAGAAGGGACACTAAATTAGCTATGAATTTTGTTGGCCCTTGTGTCTGGTAATTTGGTTCCCGCCAAATTAACCATATGTATGCATTGCTCCTTTTTTCTTTCTTTTTTTTCCCCCTCATTTGGGCACTCTTCATTACATGAAGAGATCATGACGCTTTGTTACTCTGAGCACCCCCTGTTGGTGTTGTTCACATGTTGATGCCCATGTTGGAATAAACTCTTGTTTTTGTTACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

【0225】

配列番号１７:
活性シクロチド、特にカラタ型シクロチドのコンセンサスアミノ酸配列（Ｘｘｘ_１は任意のアミノ酸、非天然アミノ酸又はペプチド模倣物であり、Ｘｘｘ_２は任意のアミノ酸、非天然アミノ酸又はペプチド模倣物であるが、Ｌｙｓは含まない；及びＸｘｘ_３は は任意のアミノ酸、非天然アミノ酸又はペプチド模倣体であるが、Ａｌａ 又は Ｌｙｓ は除く):
Xxx₁-Leu-Pro-Val-Cys-Gly-Glu-Xxx₂-Cys-Xxx₃-Gly-Gly-Thr-Cys-Asn-Thr-Pro-Xxx₁-Cys-Xxx₁-Cys-Xxx₁-Trp-Pro-Xxx₁-Cys-Thr-Arg-Xxx₁

【0226】

配列番号１８:
活性シクロチド、特にカリペ型シクロチドのコンセンサスアミノ酸配列（Ｘｘｘ_１ は Ｖａｌ、Ａｌａ、又はＬｅｕであり、Ｘｘｘ_２ は Ｇｌｙ、Ｓｅｒ 又はＴｈｒであり、Ｘｘｘ_３ はＧｌｕ、Ｇｌｙ、又はＳｅｒ であり、Ｘｘｘ_４はＳｅｒ又はＴｈｒであり、 Ｘｘｘ_５ は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＰｈｅ であり、Ｘｘｘ_６ は Ｐｈ 又は Ａｒｇ、 Ｘｘｘ_７ は Ｉｌｅ 又は Ａｓｎ であり、Ｘｘｘ_８ は Ｐｒｏ 又は Ａｒｇであり、Ｘｘｘ_９ は Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ又は Ｌｅｕであり、Ｘｘｘ_１０ は Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、又はＶａｌであり、Ｘｘｘ_１１ は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、又は Ｐｒｏ であり、Ｘｘｘ_１２ は Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＡｌａであり、Ｘｘｘ_１３ は Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、又はＶａｌであり、Ｘｘｘ_１４ は Ｇｌｙ 又は Ａｒｇであり、Ｘｘｘ_１５はＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘｘｘ_１６ は Ｌｙｓ、Ｓｅｒ 又は Ａｒｇ であり、Ｘｘｘ_１７は Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ 又はＬｙｓであり、Ｘｘｘ_１８ はＬｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、又は Ｔｙｒであり、Ｘｘｘ_１９ はＶａｌ 又は Ｉｌｅであり、Ｘｘｘ_２０ は、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ又はＡｓｎであり、そして/又は Ｘｘｘ_２１はＡｓｎ 又はＡｓｐである):
Gly-Xxx₁-Ile-Pro-Cys-Xxx₂-Xxx₃-Xxx₄-Cys-Xxx₅-Xxx₆-Xxx₇-Xxx₈-Cys-Xxx₉-Xxx₁₀-Xxx₁₁-Ala-Xxx₁₂-Xxx₁₃-Xxx₁₄-Cys-Xxx₁₅-Cys-Xxx₁₆-Xxx₁₇-Xxx₁₈-Xxx₁₉-Cys-Tyr-Xxx₂₀-Xxx₂₁

【0227】

配列番号１９:
活性シクロチド、特にビオラ型シクロチドのコンセンサスアミノ酸配列（Ｘｘｘ_１～Ｘｘｘ_２０のいずれか すべては、任意のアミノ酸、非天然アミノ酸又はペプチド模倣体であってもよい；好ましくは、Ｘｘｘ_１～Ｘｘｘ_２０のいずれか又はすべては、配列番号１５５に示されるような「ビトリ」シクロチドの対応するアミノ酸残基の保存的アミノ酸交換であり得る）：
Gly-Xxx₁- Xxx₂- Xxx₃-Cys-Gly-Glu-Xxx₄-Cys-Xxx₅-Xxx₆-Xxx₇-
Xxx₈-Cys-Xxx₉-Xxx₁₀-Xxx₁₁-Xxx₁₂-Cys-
Xxx₁₃-Cys-Xxx₁₄-Xxx₁₅-Xxx₁₆-Xxx₁₇-Cys- Xxx₁₈-Xxx₁₉-Xxx₂₀
（配列番号１９）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【配列表】

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【国際調査報告】