特表 2023-517777 バイオリアクターにおける治療用細胞のスケーラブルな製造のためのシステムおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-26

(54)【発明の名称】バイオリアクターにおける治療用細胞のスケーラブルな製造のためのシステムおよび方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/02 20060101AFI20230419BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20230419BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20230419BHJP

   C12N 5/07 20100101ALI20230419BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20230419BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230419BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20230419BHJP

【ＦＩ】

C12M3/02

C12M3/00 Z

C12M1/34 A

C12N5/07

C12N5/0735

C12N5/10

C12N5/0775

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022572259

(86)(22)【出願日】2021-01-27

(85)【翻訳文提出日】2022-08-09

(86)【国際出願番号】 US2021015256

(87)【国際公開番号】W WO2021154832

(87)【国際公開日】2021-08-05

(31)【優先権主張番号】62/966,441

(32)【優先日】2020-01-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ

(71)【出願人】

【識別番号】520052994

【氏名又は名称】ピービーエス バイオテック インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リー，チャンヨン・ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】ボリス，ブレアナ・シャリン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029BB11

4B029CC01

4B029CC02

4B029CC13

4B029DB01

4B029DB06

4B029DF08

4B065AA91X

4B065AA91Y

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC12

4B065AC20

4B065BA01

4B065BC09

4B065BC42

4B065CA44

(57)【要約】

バイオリアクターにおける治療用細胞のスケーラブルな製造のためのシステムおよび方法が開示される。実施態様によるスケールに対する流体力学的考慮には、懸濁液ベースのバイオリアクターにおいて、マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した治療用細胞を産生する方法であって、ある体積の培養液中に懸濁された細胞を含む懸濁液を、バイオリアクター内に沈積させることと、バイオリアクター内に配置されたミキサーの撹拌速度を設定することと、を含む、方法が含まれる。この方法は、設定された撹拌速度でミキサーを作動させて、バイオリアクター内の懸濁液を混合することを含む。懸濁液は、ミキサーによって生成された複数の乱流渦を含む。乱流渦のうちの少なくとも約６０％のエネルギー散逸率（ＥＤＲ）の大きさは、約０．００１５ｍ２／ｓ３未満であり得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

懸濁液ベースのバイオリアクターにおいて、マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した治療用細胞の産生をスケーリングする方法であって、前記方法が、
小規模バイオリアクター内に配置された細胞を含む懸濁液中の乱流渦の目標平均エネルギー散逸率（ＥＤＲ）を決定することと、
前記小規模バイオリアクター内で前記目標平均ＥＤＲを達成する小規模撹拌速度を決定することと、
大規模バイオリアクター内で前記目標平均ＥＤＲを達成する大規模撹拌速度を決定することであって、前記大規模撹拌速度が、前記小規模撹拌速度に直接依存する、決定することと、
ある体積の培養液中に懸濁された複数の細胞を含む懸濁液を、前記大規模バイオリアクター内に沈積させることと、
前記大規模バイオリアクター内に配置されたミキサーの撹拌速度を、前記大規模撹拌速度に設定することと、
前記大規模撹拌速度で前記大規模バイオリアクター内の前記ミキサーを作動させて、前記懸濁液を、前記目標平均ＥＤＲとほぼ等しい平均ＥＤＲで混合することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記平均ＥＤＲが、前記大規模バイオリアクター内の前記懸濁液の前記体積内の複数の実際のＥＤＲデータ点の平均を含み、前記複数の実際のＥＤＲデータ点のうちの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％の大きさが、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記小規模および大規模撹拌速度のうちの少なくとも１つが、約０ｒｐｍ～約１２０ｒｐｍの範囲にある、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項4】

前記小規模および大規模撹拌速度のうちの少なくとも１つが、約１２ｒｐｍ～約７７ｒｐｍの範囲にある、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記目標平均ＥＤＲが、約０ｍ^２／ｓ^３～約０．００６ｍ^２／ｓ^３の範囲にある、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記目標平均ＥＤＲが、約０．０００３ｍ^２／ｓ^３～約０．００１５ｍ^２／ｓ^３の範囲にある、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記大規模バイオリアクター内の前記ミキサーを作動させることが、水平回転軸を有する垂直ホイールミキサーを作動させることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記大規模バイオリアクター内の前記ミキサーを作動させることが、垂直回転軸を有するミキサーを作動させることを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

細胞を含む懸濁液を前記大規模バイオリアクター内に沈積させることが、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を前記大規模バイオリアクター内に沈積させることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

マイクロ担体を前記大規模バイオリアクター内に沈積させることをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記大規模バイオリアクターが、前記小規模バイオリアクターの容積よりも大きい容積を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した細胞を産生するための大規模な懸濁液ベースのバイオリアクターを操作する方法であって、前記方法が、
マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した細胞を産生するための大規模バイオリアクターを選択することであって、前記大規模バイオリアクターが、大規模容器内に大規模ミキサーを有する、選択すること、
前記大規模ミキサーについての大規模撹拌速度を決定することであって、前記大規模撹拌速度が、小規模バイオリアクター内の懸濁液中の乱流渦の目標平均エネルギー散逸率（ＥＤＲ）を達成する、前記小規模バイオリアクターの小規模容器中の小規模ミキサーの小規模撹拌速度に基づいて決定される、決定すること、
ある体積の培養液中に懸濁された細胞を含む懸濁液を、前記大規模バイオリアクター内に沈積させること、
前記大規模ミキサーの前記撹拌速度を、前記大規模撹拌速度に設定すること、
前記大規模ミキサーを、前記大規模撹拌速度で作動させて、前記懸濁液中の前記細胞を、前記目標平均ＥＤＲとほぼ等しい平均ＥＤＲで混合すること、を含む、方法。

【請求項13】

前記平均ＥＤＲが、前記大規模バイオリアクター内の前記懸濁液の前記体積内の複数の実際のＥＤＲデータ点の平均を含み、前記複数の実際のＥＤＲデータ点のうちの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％の大きさが、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記小規模および大規模撹拌速度のうちの少なくとも１つが、約０ｒｐｍ～約１２０ｒｐｍの範囲にある、請求項１２または１３に記載の方法。

【請求項15】

前記小規模および大規模撹拌速度のうちの少なくとも１つが、約１２ｒｐｍ～約７７ｒｐｍの範囲にある、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記目標平均ＥＤＲが、約０ｍ^２／ｓ^３～約０．００６ｍ^２／ｓ^３の範囲にある、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記目標平均ＥＤＲが、約０．００３ｍ^２／ｓ^３～約０．００１５ｍ^２／ｓ^３の範囲にある、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記大規模ミキサーを作動させることが、水平回転軸を有する垂直ホイールミキサーを含む、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記大規模ミキサーを作動させることが、垂直回転軸を有するミキサーを作動させることを含む、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

細胞を含む懸濁液を前記大規模バイオリアクター内に沈積させることが、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を前記大規模バイオリアクター内に沈積させることを含む、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

マイクロ担体を前記大規模バイオリアクター内に沈積させることをさらに含む、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

大規模バイオリアクターを選択することが、前記小規模バイオリアクターの容積よりも大きい容積を有するバイオリアクターを選択することを含む、請求項１２～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した細胞を産生するための大規模な懸濁液ベースのシステムであって、前記システムが、
容器と、前記容器内に配置されたミキサーと、を含む、バイオリアクターであって、前記ミキサーが、駆動機構に動作可能に結合され、撹拌速度で動作する、バイオリアクター、
前記容器内に配置され、前記ミキサーによって混合される、ある体積の培養液中に懸濁された細胞を含む懸濁液であって、前記懸濁液が、前記ミキサーによって生成された複数の乱流渦を含み、前記複数の乱流渦が、各々、エネルギー散逸率（ＥＤＲ）を有し、前記乱流渦のうちの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％の前記ＥＤＲの大きさが、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満である、懸濁液、を含む、システム。

【請求項24】

前記目標平均ＥＤＲが、約０ｍ^２／ｓ^３～約０．００６ｍ^２／ｓ^３の範囲にある、請求項２３に記載のシステム。

【請求項25】

前記目標平均ＥＤＲが、約０．０００３ｍ^２／ｓ^３～約０．００１５ｍ^２／ｓ^３の範囲にある、請求項２３または２４に記載のシステム。

【請求項26】

前記容器が、約０．１Ｌ～約５００Ｌ、または約０．１Ｌ～約２０００Ｌのうちの少なくとも１つの容積を有する、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項27】

前記ミキサーが、水平回転軸を有する垂直ホイールミキサーを含む、請求項２３～２６のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項28】

前記容器が、湾曲した底壁を含む、請求項２３～２７のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項29】

前記ミキサーが、垂直回転軸を含む、請求項２３～２６のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項30】

前記細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む、請求項２３～２９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項31】

前記懸濁液中のマイクロ担体をさらに含む、請求項２３～２９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項32】

懸濁液ベースのバイオリアクターにおいてマイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した治療用細胞を産生する方法であって、前記方法が、
ある体積の培養液中に懸濁された細胞を含む懸濁液を、バイオリアクター内に沈積させること、
前記バイオリアクター内に配置されたミキサーの撹拌速度を設定すること、
前記ミキサーを前記設定された撹拌速度で作動させて、前記懸濁液を前記バイオリアクター内で混合することであって、前記懸濁液が、前記ミキサーによって生成された複数の乱流渦を含み、前記乱流渦のうちの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％のエネルギー散逸率（ＥＤＲ）の大きさが、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満である、混合すること、を含む、方法。

【請求項33】

前記目標平均ＥＤＲが、約０ｍ^２／ｓ^３～約０．００６ｍ^２／ｓ^３の範囲にある、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記目標平均ＥＤＲが、約０．０００３ｍ^２／ｓ^３～約０．００１５ｍ^２／ｓ^３の範囲にある、請求項３２または３３に記載の方法。

【請求項35】

前記バイオリアクターを複数の利用可能なバイオリアクターから選択することをさらに含み、各々が、約０．１Ｌ～約５００Ｌ、または約０．１Ｌ～約２０００Ｌのうちの少なくとも１つの容積を含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記ミキサーが、水平回転軸を有する垂直ホイールミキサーを含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記容器が、湾曲した底壁を含む、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記ミキサーが、垂直回転軸を含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

ある体積の培養液中に懸濁された細胞を含む懸濁液を、前記バイオリアクター内に沈積させることが、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を前記バイオリアクター内に沈積させることを含む、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

マイクロ担体を前記バイオリアクター内に沈積させることをさらに含む、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

バイオリアクターシステムであって、
第１の作業容積を画定する格納容器と、
前記格納容器の内容物を撹拌するように軸の周りを回転するように構成された前記格納容器内のミキサーと、
プロセッサであって、
第２の作業容積を有する第２のバイオリアクターのミキサーが動作する第１の撹拌速度にアクセスすることであって、前記第２のバイオリアクターの前記ミキサーを、前記第１の撹拌速度で動作させることが、前記第２のバイオリアクター内に配置された細胞を含む懸濁液内の乱流渦の平均エネルギー散逸率（平均ＥＤＲ）を達成する、アクセスすることと、
前記第１の撹拌速度に基づいて、前記格納容器内の前記ミキサーが、前記格納容器内の細胞を含む懸濁液内の乱流渦の目標平均ＥＤＲを実質的に達成するように動作するように構成された第２の撹拌速度を決定することであって、前記目標平均ＥＤＲが、前記平均ＥＤＲとほぼ等しい、決定することと、
前記格納容器の前記ミキサーを、前記第２の撹拌速度で回転させることと、を行うように適合されたプロセッサと、を含む、バイオリアクターシステム。

【請求項42】

前記第１の撹拌速度に関連付けられた入力を受信するように適合されたユーザインターフェースをさらに含み、前記ユーザインターフェースが、前記プロセッサに動作可能に結合される、請求項４１に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項43】

前記第１の作業容積が、前記第２の作業容積よりも大きい、請求項４１または４２に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項44】

前記格納容器が、約０．１Ｌ～約５００Ｌ、または約０．１Ｌ～約２０００Ｌのうちの少なくとも１つの作業容積を有する、請求項４１～４３のいずれか一項に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項45】

前記格納容器が、前記容器の下端に位置する下部の湾曲した壁を含む壁を有する、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項46】

前記ミキサーが、水平軸の周りを回転するように構成された、請求項４１～４５のいずれか一項に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項47】

前記ミキサーが、垂直軸の周りを回転するように構成された、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項48】

前記目標平均ＥＤＲが、約０ｍ^２／ｓ^３～約０．００６ｍ^２／ｓ^３の範囲にある、請求項４１～４７のいずれか一項に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項49】

前記目標平均ＥＤＲが、約０．０００３ｍ^２／ｓ^３～約０．００１５ｍ^２／ｓ^３の範囲にある、請求項４１～４８のいずれか一項に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項50】

前記目標平均ＥＤＲが、前記大規模バイオリアクター内の前記懸濁液の前記体積内の複数の実際のＥＤＲデータ点の平均を含み、前記実際のＥＤＲデータ点のうちの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％の大きさが、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満である、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項51】

前記格納容器内に配置された細胞を含む前記懸濁液をさらに含む、請求項４１～５０のいずれか一項に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項52】

前記細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む、請求項５１に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項53】

前記懸濁液中にマイクロ担体をさらに含む、請求項５１に記載のバイオリアクターシステム。

【請求項54】

前記目標平均ＥＤＲが、前記大規模バイオリアクター内の前記懸濁液の前記体積内の複数の実際のＥＤＲデータ点の平均を含み、前記複数の実際のＥＤＲデータ点のうちの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％の大きさが、約０．００２ｍ^２／ｓ^３未満、約０．００２５ｍ^２／ｓ^３未満、または約０．００３ｍ^２／ｓ^３未満のエネルギー散逸率の値を有する、請求項４１～５３のいずれか一項に記載のバイオリアクターシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
優先権は、２０２０年１月２７日に出願された、米国仮特許出願第６２／９６６，４４１号に対して主張され、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、概して、バイオリアクターにおける治療用細胞の産生に関し、より具体的には、バイオリアクターにおける治療用細胞のスケーラブルな製造のためのシステムおよび方法に関する。

【背景技術】

【0003】

多数の種類の重篤な疾患の適応症を治癒する可能性がある細胞療法は、バイオ医薬品業界に革命を起こす態勢にある。現在開発中、または臨床試験の初期段階に入っている、同種異系治療用細胞候補の数が増加している。しかしながら、将来の商業的需要を満たすのに十分なこれらの治療用細胞生成物の大規模な製造は、まだ開発されておらず、実証されていない。

【0004】

治療用細胞の商業的生産のために２Ｄ製造プラットフォームを使用することの制限は、バイオ医薬品業界によって十分に認識されている。２Ｄ製造のための商品の主なコスト、すなわち高価な設備投資および人件費は、商業的規模では、非常に高額になる。代わりに、３Ｄ製造プラットフォームとしての単回使用バイオリアクターは、スケーラブルな治療用細胞製造のために使用される技術であると広く考えられている。

【発明の概要】

【0005】

第１の実施態様によれば、懸濁液ベースのバイオリアクターにおいて、マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した治療用細胞の産生をスケーリングする方法は、小規模バイオリアクター内に配置された細胞を含む懸濁液中の乱流渦の目標平均エネルギー散逸率（ＥＤＲ）を決定することを含む。この方法は、小規模バイオリアクター内で目標平均ＥＤＲを達成する小規模撹拌速度を決定することと、大規模バイオリアクター内で目標平均ＥＤＲを達成する大規模撹拌速度を決定することと、を含む。大規模撹拌速度は、小規模撹拌速度に直接依存する。この方法は、ある体積の培養液中に懸濁された複数の細胞を含む懸濁液を、大規模バイオリアクター内に沈積させることと、大規模バイオリアクター内に配置されたミキサーの撹拌速度を、大規模撹拌速度に設定することと、を含む。この方法は、大規模撹拌速度で大規模バイオリアクター内のミキサーを作動させて、懸濁液を、目標平均ＥＤＲとほぼ等しい平均ＥＤＲで混合することを含む。

【0006】

第２の実施態様によれば、マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した細胞を産生するための大規模な懸濁液ベースのバイオリアクターを操作する方法は、マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した細胞を産生するための大規模バイオリアクターを選択することを含む。大規模バイオリアクターは、大規模容器内に大規模ミキサーを有する。この方法は、大規模ミキサーについての大規模撹拌速度を決定することを含む。大規模撹拌速度は、小規模バイオリアクター内の懸濁液中の乱流渦の目標平均エネルギー散逸率（ＥＤＲ）を達成する、小規模バイオリアクターの小規模容器中の小規模ミキサーの小規模撹拌速度に基づいて決定される。この方法は、ある体積の培養液中に懸濁された細胞を含む懸濁液を、大規模バイオリアクター内に沈積させることと、大規模ミキサーの撹拌速度を、大規模撹拌速度に設定することと、を含む。この方法は、大規模ミキサーを、大規模撹拌速度で作動させて、懸濁液中の細胞を、目標平均ＥＤＲとほぼ等しい平均ＥＤＲで混合することを含む。

【0007】

第３の実施態様によれば、マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した細胞を産生するための大規模な懸濁液ベースのシステムは、バイオリアクターと、懸濁液と、を含む。バイオリアクターは、容器と、容器内に配置されたミキサーと、を含む。ミキサーは、駆動機構に動作可能に結合され、撹拌速度で動作する。懸濁液は、容器内に配置され、ミキサーによって混合される、ある体積の培養液中に懸濁された細胞を含む。懸濁液は、ミキサーによって生成された複数の乱流渦を含む。複数の乱流渦は、各々、エネルギー散逸率（ＥＤＲ）を有する。乱流渦のうちの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％のＥＤＲの大きさは、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満である。

【0008】

第４の実施態様によれば、懸濁液ベースのバイオリアクターにおいて、マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した治療用細胞を産生する方法は、ある体積の培養液中に懸濁された細胞を含む懸濁液を、バイオリアクター内に沈積させることと、バイオリアクター内に配置されたミキサーの撹拌速度を設定することと、を含む。この方法は、ミキサーを設定された撹拌速度で作動させて、懸濁液をバイオリアクター内で混合することを含む。懸濁液は、ミキサーによって生成された複数の乱流渦を含む。乱流渦のうちの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％のエネルギー散逸率（ＥＤＲ）の大きさは、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満である。

【0009】

第５の実施態様によれば、バイオリアクターシステムは、格納容器と、ミキサーと、プロセッサと、を含む。格納容器は、第１の作業容積を画定し、ミキサーは、格納容器内にあり、格納容器の内容物を撹拌するように軸の周りを回転するように構成される。プロセッサは、第２の作業容積を有する第２のバイオリアクターのミキサーが動作する第１の撹拌速度にアクセスするように適合される。第２のバイオリアクターのミキサーを、第１の撹拌速度で動作させることは、第２のバイオリアクター内に配置された細胞を含む懸濁液内の乱流渦の平均エネルギー散逸率（平均ＥＤＲ）を達成する。第１の撹拌速度に基づいて、プロセッサは、格納容器内のミキサーが、格納容器内の細胞を含む懸濁液内の乱流渦の目標平均ＥＤＲを実質的に達成するように動作するように構成された第２の撹拌速度を決定するように適合される。目標平均ＥＤＲは、平均ＥＤＲとほぼ等しい。プロセッサは、格納容器のミキサーを、第２の撹拌速度で回転させるように適合される。

【0010】

第６の実施態様によれば、ヒトまたは動物に由来する治療用多能性幹細胞を、マイクロ担体上および／または集合体中で増殖させるためのバイオリアクター。マイクロ担体および／または集合体は、３．５ｃｍ^２／ｓｅｃ^３以下の質量レベル当たりの平均動力入力を使用して培養液中に懸濁される。

【0011】

さらに、前述の第１、第２、第３、第４、第５、および／または第６の実施態様によれば、装置および／または方法は、以下のうちのいずれか１つ以上をさらに包含するか、または含むことができる。

【0012】

一実施態様によれば、平均ＥＤＲは、大規模バイオリアクター内の懸濁液の体積内の複数の実際のＥＤＲデータ点の平均を含む。複数の実際のＥＤＲデータ点のうちの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％の大きさは、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満である。

【0013】

別の実施態様によれば、小規模および大規模撹拌速度のうちの少なくとも１つは、約０ｒｐｍ～約１２０ｒｐｍの範囲にある。

【0014】

別の実施態様によれば、小規模および大規模撹拌速度のうちの少なくとも１つは、約１２ｒｐｍ～約７７ｒｐｍの範囲にある。

【0015】

別の実施態様によれば、目標平均ＥＤＲは、約０ｍ^２／ｓ^３～約０．００６ｍ^２／ｓ^３の範囲にある。

【0016】

別の実施態様によれば、目標平均ＥＤＲは、約０．０００３ｍ^２／ｓ^３～約０．００１５ｍ^２／ｓ^３の範囲にある。

【0017】

別の実施態様によれば、大規模バイオリアクター内のミキサーを作動させることは、水平回転軸を有する垂直ホイールミキサーを作動させることを含む。

【0018】

別の実施態様によれば、大規模バイオリアクター内のミキサーを作動させることは、垂直回転軸を有するミキサーを作動させることを含む。

【0019】

別の実施態様によれば、細胞を含む懸濁液を大規模バイオリアクター内に沈積させることは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を大規模バイオリアクター内に沈積させることを含む。

【0020】

別の実施態様によれば、方法は、マイクロ担体を大規模バイオリアクター内に沈積させることをさらに含む。

【0021】

別の実施態様によれば、大規模バイオリアクターは、小規模バイオリアクターの容積よりも大きい容積を有する。

【0022】

別の実施態様によれば、平均ＥＤＲは、大規模バイオリアクター内の懸濁液の体積内の複数の実際のＥＤＲデータ点の平均を含む。複数の実際のＥＤＲデータ点のうちの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％の大きさは、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満である。

【0023】

別の実施態様によれば、小規模および大規模撹拌速度のうちの少なくとも１つは、約０ｒｐｍ～約１２０ｒｐｍの範囲にある。

【0024】

別の実施態様によれば、小規模および大規模撹拌速度のうちの少なくとも１つは、約１２ｒｐｍ～約７７ｒｐｍの範囲にある。

【0025】

別の実施態様によれば、目標平均ＥＤＲは、約０ｍ^２／ｓ^３～約０．００６ｍ^２／ｓ^３の範囲にある。

【0026】

別の実施態様によれば、目標平均ＥＤＲは、約０．０００３ｍ^２／ｓ^３～約０．００１５ｍ^２／ｓ^３の範囲にある。

【0027】

別の実施態様によれば、大規模ミキサーを作動させることは、水平回転軸を有する垂直ホイールミキサーを含む。

【0028】

別の実施態様によれば、大規模ミキサーを作動させることは、垂直回転軸を有するミキサーを作動させることを含む。

【0029】

別の実施態様によれば、細胞を含む懸濁液を大規模バイオリアクター内に沈積させることは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を大規模バイオリアクター内に沈積させることを含む。

【0030】

別の実施態様によれば、この方法は、マイクロ担体を大規模バイオリアクター内に沈積させることをさらに含む。

【0031】

別の実施態様によれば、大規模バイオリアクターを選択することは、小規模バイオリアクターの容積よりも大きい容積を有するバイオリアクターを選択することを含む。

【0032】

別の実施態様によれば、目標平均ＥＤＲは、約０ｍ^２／ｓ^３～約０．００６ｍ^２／ｓ^３の範囲にある。

【0033】

別の実施態様によれば、目標平均ＥＤＲは、約０．０００３ｍ^２／ｓ^３～約０．００１５ｍ^２／ｓ^３の範囲にある。

【0034】

別の実施態様によれば、容器は、約０．１Ｌ～約５００Ｌ、または約０．１Ｌ～約２０００Ｌのうちの少なくとも１つの容積を有する。

【0035】

別の実施態様によれば、ミキサーは、水平回転軸を有する垂直ホイールミキサーを含む。

【0036】

別の実施態様によれば、容器は、湾曲した底壁を含む。

【0037】

別の実施態様によれば、ミキサーは、垂直回転軸を含む。

【0038】

別の実施態様によれば、細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む。

【0039】

別の実施態様によれば、システムは、懸濁液中にマイクロ担体をさらに含む。

【0040】

別の実施態様によれば、目標平均ＥＤＲは、約０ｍ^２／ｓ^３～約０．００６ｍ^２／ｓ^３の範囲にある。

【0041】

別の実施態様によれば、目標平均ＥＤＲは、約０．０００３ｍ^２／ｓ^３～約０．００１５ｍ^２／ｓ^３の範囲にある。

【0042】

別の実施態様によれば、この方法は、バイオリアクターを複数の利用可能なバイオリアクターから選択することをさらに含み、各々は、約０．１Ｌ～約５００Ｌ、または約０．１Ｌ～約２０００Ｌのうちの少なくとも１つの容積を含む。

【0043】

別の実施態様によれば、ミキサーは、水平回転軸を有する垂直ホイールミキサーを含む。

【0044】

別の実施態様によれば、容器は、湾曲した底壁を含む。

【0045】

別の実施態様によれば、ミキサーは、垂直回転軸を含む。

【0046】

別の実施態様によれば、ある体積の培養液中に懸濁された細胞を含む懸濁液を、バイオリアクター内に沈積させることは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）をバイオリアクター内に沈積させることを含む。

【0047】

別の実施態様によれば、この方法は、マイクロ担体をバイオリアクターに沈積させることを含む。

【0048】

別の実施態様によれば、バイオリアクターシステムは、第１の撹拌速度と関連付けられた入力を受信するように適合されたユーザインターフェースをさらに含む。ユーザインターフェースは、プロセッサに動作可能に結合されている。

【0049】

別の実施態様によれば、第１の作業容積は、第２の作業容積よりも大きい。

【0050】

別の実施態様によれば、格納容器は、約０．１Ｌ～約５００Ｌ、または約０．１Ｌ～約２０００Ｌのうちの少なくとも１つの作業容積を有する。

【0051】

別の実施態様によれば、格納容器は、容器の下端に位置する下部の湾曲した壁を含む壁を有する。

【0052】

別の実施態様によれば、ミキサーは、水平軸の周りを回転するように構成される。

【0053】

別の実施態様によれば、ミキサーは、垂直軸の周りを回転するように構成される。

【0054】

別の実施態様によれば、目標平均ＥＤＲは、約０ｍ^２／ｓ^３～約０．００６ｍ^２／ｓ^３の範囲にある。

【0055】

別の実施態様によれば、目標平均ＥＤＲは、約０．０００３ｍ^２／ｓ^３～約０．００１５ｍ^２／ｓ^３の範囲にある。

【0056】

別の実施態様によれば、バイオリアクターシステムは、格納容器に配置された細胞を含む懸濁液をさらに含む。

【0057】

別の実施態様によれば、細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む。

【0058】

別の実施態様によれば、バイオリアクターシステムは、懸濁液中にマイクロ担体をさらに含む。

【0059】

別の実施態様では、マイクロ担体または集合体は、１００ミクロン以上の平均直径を有する。

【0060】

別の実施態様では、バイオリアクター容積の９０％超は、目標平均エネルギー散逸率（ＥＤＲ）を下回り、ＥＤＲは、流体流を受ける培養液について、典型的には、ｍ^２／ｓ^３またはｃｍ^２／ｓ^３の単位で測定または予測される単位質量当たりのエネルギー散逸率である。

【0061】

別の実施態様では、バイオリアクター容積の９９％超は、目標平均ＥＤＲを下回る。

【0062】

別の実施態様では、バイオリアクター容積の９０％超は、１．３０Ｅ－２ｍ^２／ｓ^３の目標平均ＥＤＲを下回る。

【0063】

別の実施態様では、バイオリアクター容積の９９％超は、１．３０Ｅ－２ｍ^２／ｓ^３の目標平均ＥＤＲを下回る。

【0064】

別の実施態様では、この特性は、一連のますます大規模なバイオリアクターにおいてスケールアップして維持される。

【0065】

別の実施態様では、バイオリアクター作業容積のスケールの増加は、１００ｍｌ～最大３リットル、１００ｍｌ～最大１５リットル、１００ｍｌ～最大８０リットル、１００ｍｌ～最大５００リットル、または最大２０００リットルである。

【0066】

別の実施態様では、マイクロ担体または集合体は、１００ミクロン以上の平均直径を有する。

【0067】

別の実施態様では、上記および／または下記に開示された実施態様からの特性を有するバイオリアクターは、ともに、同一または同様の直径の均一な球状細胞集合体の形成をもたらす。

【0068】

別の実施態様では、混合機構の撹拌速度を変更することによって、球状細胞集合体直径を正確に制御する方法。

【0069】

別の実施態様では、特性は、上記および／または下記の実施態様に記載されるように、より大きな容積へのスケールアップの間に維持される。

【0070】

別の実施態様では、この方法は、細胞集合体のサイズ／直径の均一性が、細胞集合体の増殖効率を向上させることを含む。

【0071】

別の実施態様では、最適な集合体直径は、細胞型によって変化し得る。

【図面の簡単な説明】

【0072】

【図1】異なる蛍光染色法を使用して、懸濁マイクロ担体の表面に付着したＭＳＣの画像を例示する。

【図2】垂直ホイールバイオリアクターにおける懸濁細胞集合体としてのＰＳＣの増殖を示す。

【図3】約０．１リットル（Ｌ）のスケールを有する垂直ホイールバイオリアクターにおける、ヒトｉＰＳＣの小脳オルガノイドへの分化に向けられた撮像結果を示す。

【図4】本開示の教示に従う、システムの実装の概略図を例示する。

【図5】図４のバイオリアクターとともに使用することができるミキサーの等角図である。

【図6】図４または本明細書に開示される他の実施態様のうちのいずれかのシステム、第１のバイオリアクター、および／または第２のバイオリアクターを使用して、懸濁液ベースのバイオリアクターにおいて、マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した治療用細胞の産生をスケーリングする方法についてのフローチャートを例示する。

【図7】図４または本明細書に開示される他の実施態様のうちのいずれかのシステム、第１のバイオリアクター、および／または第２のバイオリアクターを使用して、懸濁液ベースのバイオリアクターにおいて、マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した治療用細胞の産生をスケーリングする方法についての別のフローチャートを例示する。

【図8】図４または本明細書に開示される他の実施態様のうちのいずれかのシステム、第１のバイオリアクター、および／または第２のバイオリアクターを使用して、懸濁液ベースのバイオリアクターにおいて、マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した治療用細胞の産生をスケーリングする方法についての別のフローチャートを例示する。

【図9A】渦流がマイクロ担体よりも大きいときの、渦流および付着した生存細胞を有するマイクロ担体の概略図を例示する。

【図9B】付着した生存細胞を有するマイクロ担体のうちの１つおよびマイクロ担体よりも小さい渦流の概略図を示す。

【図10】図４の第２のバイオリアクター、および第２のバイオリアクターに結合され、インペラ動力入力を測定するように構成されたジグの概略図である。

【図11】第２のバイオリアクターのホイールの撹拌を表すＸ軸と、質量当たりの動力を表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図12】レイノルズ数を表すＸ軸と、インペラ動力を表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図13】コルモゴロフ長さスケール（μｍ）を表すＸ軸と、相対純増殖率を表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図14】ｘ軸が毎分回転数（ＲＰＭ）を表す、マイクロ担体懸濁試験からの一連の結果を恨むグラフである。

【図15】異なるバイオリアクターおよび関連する撹拌速度（ｒｐｍ）を示すＸ軸と、種々のバイオリアクターにおけるマイクロ担体懸濁に必要な質量レベル当たりの平均動力を表すＹ軸と、を含むグラフである

【図16】約３Ｌの容積を有する第１のバイオリアクター上で行われた計算流体力学（ＣＦＤ）分析の結果を示す。

【図17】図４の第１のバイオリアクターおよび／または第２のバイオリアクターを使用した計算流体力学（ＣＦＤ）分析から得られた追加の結果を示す。

【図18】細胞集合体のサイズを表すＸ軸と、細胞集合体の数を表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図19】ＰＳＣ集合体のサイズを表すＸ軸と、細胞集合体の数を表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図20A】第２のバイオリアクターについてのレムニスケート液体流パターンおよび速度ストリームラインについての計算流体力学（ＣＦＤ）分析結果の上面図を示す。

【図20B】第２のバイオリアクターについてのレムニスケート液体流パターンおよび速度ストリームラインについての計算流体力学（ＣＦＤ）分析結果の側面等角図を示す。

【図21A】流れ時間を秒単位で表すＸ軸と、速度を表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図21B】流れ時間を秒単位で表すＸ軸と、シア応力を表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図21C】流れ時間を秒単位で表すＸ軸と、ＥＤＲを表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図22A】速度に関連する計算流体力学（ＣＦＤ）分析結果を示す。

【図22B】シア応力に関連する計算流体力学（ＣＦＤ）分析結果を示す。

【図22C】エネルギー散逸に関連する計算流体力学（ＣＦＤ）分析結果を示す。

【図23】垂直ホイールを含むバイオリアクターおよび水平ブレードを含むバイオリアクターにおいて、異なる撹拌速度で細胞を増殖させたときに得られた結果を例示する。

【図24】エネルギー散逸率（ＥＤＲ）を表すＸ軸と、容積パーセントを表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図25A】約０．１Ｌの容積を有する第２のバイオリアクターを使用したときのスケールアップ傾向線方程式のグラフを示す。

【図25B】第２のバイオリアクターを使用して得られた結果に関連付けられた第１のライン、水平ブレードスピナーを有するＮＤＳバイオリアクターを使用して得られた結果に関連付けられた第２のライン、および水平ブレードスピナーを有するＤａｓＧｉｐ（登録商標）バイオリアクターを使用して得られた結果に関連付けられた第３のラインを含むグラフを示す。

【図26A】エネルギー散逸率（ＥＤＲ）を表すＸ軸と、容積平均エネルギー散逸率を表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図26B】格納容器の容積を表すＸ軸と、撹拌速度（ＲＰＭ）を表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図26C】撹拌速度を表すＸ軸と、平均シア応力を表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図26D】撹拌速度を表すＸ軸と、容積平均速度を表すＹ軸と、含むグラフである。

【図26E】撹拌速度を表すＸ軸と、容積パーセントを表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図26F】図２６Ｅのグラフの一部分のより詳細な図を示す。

【図27】撹拌速度を表すＸ軸と、容積パーセントを表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図28】閾値範囲内の目標容積平均ＥＤＲを有すること、ならびに約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３の上限閾値を下回るＥＤＲ値の大部分または少なくとも一部を有することの組み合わせによって得られた生物学的結果を示す。

【図29A】時間を日数で表すＸ軸と、生存細胞をｍＬで表すＹ軸と、を含むグラフである。

【図29B】図２９Ａと関連して行われた実験からの結果を表すグラフであり、第２のバイオリアクターのホイールが動作した撹拌速度を表すＸ軸と、平均７日目の集合体直径を表すｙ軸とを含む。

【図29C】図２９Ａおよび２９Ｂに関連して行われた実験からの結果を表す画像結果である。

【発明を実施するための形態】

【0073】

以下の文章は、方法、装置および／または製造物品の実装の詳細な説明を開示しているが、財産権の法的範囲は、本特許の最後に記載される特許請求の範囲の文言によって定義されることが理解されるべきである。したがって、以下の詳細な説明は、例としてのみ解釈されるべきであり、あらゆる可能な実施態様を説明することは、不可能ではないが、非現実的であろうため、あらゆる可能な実施態様を説明するものではない。現在の技術または本特許の出願日以降に開発された技術のいずれかを使用して、多くの代替の実施態様を実施することができる。このような代替の実施態様は、依然として特許請求の範囲内にあることが想定される。

【0074】

マイクロ担体上で、または集合体として増殖した細胞を含む懸濁細胞培養プロセスを最適化するために、バイオリアクターにおける流体力学的条件を制御するための例示的なシステムおよび方法が開示される。これらの例示的なシステムおよび方法は、小規模なＲ＆Ｄ使用のための約０．１Ｌの作業容積から大規模な臨床または商業的製造のための約５００Ｌの作業容積まで、幅広い範囲のバイオリアクターサイズにわたって適用可能である。しかしながら、任意のサイズのバイオリアクターを、本開示の教示に従って使用することができる。例えば、本開示の教示に従って作製および／または動作する大規模バイオリアクターは、約２０００Ｌの作業容積を有し得る。しかしながら、本開示の教示は、例えば、約２００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約３００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約４００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約６００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約７００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約８００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約９００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約１０００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約１１００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約１２００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約１３００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約１４００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約１５００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約１６００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約１７００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約１８００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約１９００Ｌの作業容積を有するバイオリアクター、約２１００Ｌの作業容積を有するバイオリアクターなどを含む、任意のサイズのバイオリアクターに関連して使用され得る。

【0075】

バイオリアクターが治療用細胞についての標準的な製造プラットフォームになるために、小規模バイオリアクターにおいて開発された懸濁液ベースの細胞培養プロセスは、本開示の教示に従って、より大規模で反復可能な方法で実証されるべきである。バイオリアクター内部の細胞のための閾値増殖環境の提供は、閾値品質属性を維持しながら細胞収量を増加させ、治療用細胞生成物についての商業的規模の産生の実現可能性を実証するために行われ得る。

【0076】

ほとんどの同種異系治療用細胞は、接着依存性であり、したがって、増殖するために表面に付着する。異なる接着依存性細胞型は、バイオリアクターベースの懸濁培養物内で、それらの要件および挙動において著しく変化する。これらの細胞型のいくつかの例には、典型的には、バイオリアクター内で懸濁されるプラスチックマイクロ担体の表面上で増殖するヒト初代細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が含まれる（図４）。関連する細胞生成物は、マイクロ担体上のＭＳＣから生成することができるエクソソームなどの細胞外小胞を含む。

【0077】

図１は、異なる蛍光染色法を使用して、懸濁マイクロ担体の表面に付着したＭＳＣの画像を例示する。

【0078】

胚幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの種類を包含する多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、細胞増殖および指向性分化プロセスの両方の間に、自然に凝集して球状細胞集合体を形成し、したがって、マイクロ担体を必要としない。

【0079】

図２は、垂直ホイールバイオリアクターにおける懸濁細胞集合体としてのＰＳＣの増殖を示す。

【0080】

ＰＳＣの別の特徴は、細胞増殖期の後、細胞集合体が、典型的には、多能性細胞を強制して、小脳細胞などの最終標的治療用細胞型にするために、指向性分化の多段階プロセスを経て、次いで、懸濁液中にオルガノイドを形成することができることである（図３）。

【0081】

図３は、約０．１リットル（Ｌ）のスケールを有する垂直ホイールバイオリアクター（図４）における小脳オルガノイドに対するヒトｉＰＳＣの分化に向けられた撮像結果を示す。図３は、３５日間の生成後、約１００マイクロメートル（μｍ）のスケールバーを使用して、ｉＰＳＣ由来のオルガノイドが、ＰＢＳ－０．１中のＧＡＢＡｅｒｇｉｃおよびグルタミン酸作動性ニューロン（図示せず）に効率的に成熟したことを示す。

【0082】

ほとんどの市販のマイクロ担体は、典型的には、直径が平均で約１５０ミクロン～約２５０ミクロン（μ）であるが、種々の細胞型のＰＳＣ集合体は、典型的には、平均で約１００ミクロン～約４００ミクロンである。マイクロ担体および細胞集合体の両方は、バイオリアクター内に実質的に均一に懸濁され、マイクロ担体が、同じまたは同様の増殖条件および他の生物学的要件に曝露されることを可能にする。さらに、これらの粒子は単一の細胞よりも大きいため、インペラなどのバイオリアクターの混合機構へのより大きな動力入力を使用して、培養培地中に完全かつ均一に懸濁される。バイオリアクター内の混合環境が最適以下である場合、またはそれ以外で、種々のプロセスステップ中に細胞についての閾値レベルを満たさない場合、一貫性のない収量および細胞の不十分な生成物品質が生じる。

【0083】

栄養素の利用可能性および廃棄物の除去などの、懸濁細胞の生物学的必要性は、閾値細胞培養性能を達成するための既知の態様であるが、流体混合環境もまた、考慮され得る。したがって、バイオリアクターが、マイクロ担体または細胞集合体を懸濁および混合する方法は、本開示の教示に基づいて教示されるように、治療用細胞生成物の大規模な産生を可能にするために、スケールアップ中に実質的に一貫性があり、実質的に予測可能であるままのように混合環境が理解され、最適化されるべきである。

【0084】

本開示の教示は、概して、バイオリアクター内の培養培地の閾値流体力学的条件および混合特性の予測を含む、種々の種類の細胞増殖技術の生理学的要件のキュレーションを含む。これらのパラメータは、細胞が経験し、最終的に細胞培養プロセス全体を通じて細胞収量および品質に影響を与える流体混合環境と関連している。

【0085】

本開示の教示はまた、懸濁液ベースのバイオリアクターにおいて、マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した治療用細胞の最適かつスケーラブルな産生のための、物理的混合研究、動力測定、および計算流体力学（ＣＦＤ）分析によって決定される、システムおよび方法に関する。閾値産生条件は、特定の流体力学的混合条件を監視および制御することによって達成することができ、これは、次いで、マイクロ担体ベースのプロセスについての細胞増殖、ならびにＰＳＣ集合体ベースのプロセスについての増殖および分化プロセスの両方の効率に影響を及ぼし得る。これらのプロセスの種類の両方について、本開示の教示に従った方法を使用して、最終的な細胞生成物の収量および品質を最適化することができる。

【0086】

本開示の教示はまた、流体力学的条件を制御することによって、バイオリアクターにおいて、マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖したものを含む、治療用細胞の産生のためのシステムおよび方法に関する。

【0087】

バイオリアクターにおける懸濁液ベースの細胞培養プロセスは、すべての細胞（または実質的には細胞である）が液体培地中で実質的に連続的に懸濁されるように適合され得る。液体培地中で懸濁される細胞は、細胞が生物学的および流体力学的パラメータの実質的に一貫した環境に曝露され得ることを保証または少なくとも可能にし、バイオリアクター容器の底部における細胞の望ましくない沈降を抑止および／または回避し得る。回転するインペラなどのバイオリアクターの混合機構の撹拌速度は、インペラへの動力入力を通じて直接制御される。

【0088】

図４は、本開示の教示に従う、システム１００の実装の概略図を例示する。システム１００は、バイオ医薬品業界のための治療用細胞の生産を拡大するために使用され得る。示される実施態様では、システム１００は、第１の作業容積１０５を画定する第１の格納容器１０４を含む第１のバイオリアクター１０２と、第２の作業容積１０７を画定する第２の格納容器１０８を含む第２のバイオリアクター１０６と、を含む。第１のバイオリアクター１０２は、大規模バイオリアクターと称され得、第２のバイオリアクター１０６は、小規模バイオリアクターと称され得る。したがって、示されるように、第１の作業容積１０５は、第２の作業容積１０７よりも大きい。しかしながら、第１の作業容積１０５は、第２の作業容積１０７よりも小さくてもよく、またはそれと同様であってもよく、またはそれと同じであってもよい。

【0089】

いくつかの実施態様では、第１の作業容積１０５は、約２５０リットル（Ｌ）～約５００Ｌ、約４５Ｌ～約８０Ｌ、約９Ｌ～約１５Ｌ、および／または約１．８Ｌ～約３．０Ｌであり得、第２の作業容積１０７は、約６０ミリリットル（ｍＬ）～約１００ｍＬ、および／または約３００ｍＬ～約５００ｍＬであり得る。より一般的には、第１の作業容積１０５および／または第２の作業容積１０７は、約０．１Ｌ～約５００Ｌのうちの少なくとも１つ、または約０．０Ｌ～約２０００Ｌのうちの少なくとも１つであってもよい。しかしながら、第１の作業容積１０５および／または第２の作業容積１０７は、任意の容積であってもよい。

【0090】

ここで第１のバイオリアクター１０２を詳細に参照すると、示される実施態様では、第１のバイオリアクター１０２は、格納容器１０４の下端１１４に位置する下部の湾曲した壁１１２を含む壁１１０を有する格納容器１０４を含む。第１のバイオリアクター１０２はまた、格納容器１０４内に配置され、格納容器１０４の内容物を撹拌するように軸１１８の周りを回転するように構成されたミキサー１１６を含む。下部の湾曲した壁１１２は、湾曲した底壁と称され得、軸１１８は、中心軸または水平軸と称され得る。示されるように、ミキサー１１６は、水平軸１１８の周りを回転するように構成される。しかしながら、ミキサー１１６は、異なって配置されてもよい。例えば、ミキサー１１６は、垂直軸の周りに、または水平軸および／もしくは垂直軸に対してある角度で回転するように構成され得る。

【0091】

システム１００はまた、ミキサー１１６を動作／回転させるように適合されたミキサー１１６に動作可能に結合された駆動アセンブリ１２２と、プロセッサ１２５を有するコントローラ１２４と、を含む。コントローラ１２４は、駆動アセンブリ１２２に電気的および／または通信可能に結合されて、駆動アセンブリ１２２に本明細書に開示される種々の機能を実行させる。第２のバイオリアクター１０６は、第１のバイオリアクター１０２と同様の構造を有することができる。例えば、第２のバイオリアクター１０６は、第１のバイオリアクター１０２と同じもしくは同様の寸法、アスペクト比、および／またはバイオリアクター機能を有する、壁１１０、下部の湾曲した壁１１２、およびミキサー１１６を有することができる。

【0092】

動作中、第２のバイオリアクター１０６は、実質的に均一であり、かつ／または閾値標準を満たす形状および／またはサイズを有する治療用細胞を増殖させるために、第２のバイオリアクター１０６を動作させるための値（例えば、撹拌速度、ＥＤＲ値）を決定するために、より小さい容積で実験を行うために使用される。有利には、第２のバイオリアクター１０６が動作する動作値に基づいて、第１のバイオリアクター１０６は、第２のバイオリアクター１０６内で増殖した細胞の同様または同じ所望の特性を有する、より大きな容積の第１のバイオリアクター１０２内で治療用細胞を増殖させるために動作する動作値を決定することができる。別の言い方をすると、第１のバイオリアクター１０２（より大規模なバイオリアクター）は、例えば、同様のサイズおよび／または形状を有するなどの所望の属性を有する治療用細胞を増殖させるために、第２のバイオリアクター１０６（より小規模なバイオリアクター）の動作値に基づいて動作する。

【0093】

いくつかの実施態様では、パラメータ値のうちの少なくとも１つは、第２のバイオリアクター１０６のミキサー１１６が動作する撹拌速度を含む。撹拌速度は、第２のバイオリアクター１０６のミキサー１１６が回転する、毎分回転数（ＲＰＭ）に関連付けられ得る。ミキサー１１６は、第２のバイオリアクター１０６内に配置された治療用細胞を含む懸濁液内の乱流渦の平均エネルギー散逸率（平均ＥＤＲ）を達成する速度で回転し得る。別の言い方をすると、ミキサー１１６は、バイオリアクター容積全体に分布するエネルギー散逸率を達成する速度で回転し得る。懸濁液は、マイクロ担体を含んでもよく、治療用細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含んでもよい。しかしながら、懸濁液および／または治療用細胞は、異なっていてもよい。懸濁液自体は、種々の栄養素、増殖因子、化学物質、および／または細胞の増殖、分化、もしくは他の生物学的性能を改善することを意図する他の添加物を含有する液体培地を含み得る。培地は、典型的には、水と同様の密度を有し、特定の細胞型およびプロセスの必要性に合わせた市販の培地が存在するが、カスタマイズされた培地が作製されてもよい。他の治療用細胞型としては、間葉系幹細胞または遺伝子組換え単一細胞、例えば、Ｔ細胞が挙げられ得るが、これらに限定されない。治療用細胞の大部分はヒト由来であるが、また、動物由来、昆虫由来、ウイルス由来、または細菌由来である可能性もあり得る。

【0094】

このような実施態様では、コントローラ１２４のプロセッサ１２５は、第２のバイオリアクター１０６のミキサー１１６が動作する撹拌速度にアクセスし、第１の撹拌速度に基づいて第１のバイオリアクター１０２の格納容器１０４内のミキサー１１６が動作する第２の撹拌速度を決定し、第１のバイオリアクター１０２のミキサー１１６を第２の撹拌速度で回転させる。他の実施態様では、第１のバイオリアクター１０２の撹拌速度は、異なる方法で決定され得る。例えば、第２の撹拌速度は、（例えば、ペンおよび紙を使用して、計算機を使用して）ならびに／または第１および第２の撹拌速度を関連付けるチャートまたはグラフ（図２６Ａを参照のこと）を使用して手動で決定することができる。第１の撹拌速度および／または第２の撹拌速度は、約０回転／分（ＲＰＭ）～約１２０ＲＰＭおよび／または約１２ＲＰＭ～約７７ＲＰＭの範囲であり得る。しかしながら、第１のバイオリアクターリアクター１０２および／または第２のバイオリアクター１０６のミキサー１１６は、例えば、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞に関連する閾値を満たすように治療用細胞を産生することができる任意の撹拌速度で動作し得る。

【0095】

プロセッサ１２５はまた、追加入力または代替入力に基づいて撹拌速度を決定し得る。例えば、プロセッサ１２５は、使用される培地、細胞株の種類、接種条件、ならびに第１のバイオリアクター１０２および／または第２のバイオリアクター１０６の作業容積に関連付けられた入力に基づいて、第１のバイオリアクター１０２の撹拌速度を決定し得る。プロセッサ１２５で受信された入力値に基づいて、またはそれ以外の場合、プロセッサ１２５によってアクセスされた入力値に基づいて、プロセッサ１２５は、コントローラ１２４のメモリ１３８などのデータベースにアクセスし、受信された入力を、メモリ１３８に記憶された参照データ（例えば、履歴データ）と比較し得る。参照データは、異なる培地、異なる撹拌速度、異なる細胞株の種類、異なる接種条件、および／または異なる作業容積を使用して他のバイオリアクターで行われた実験からのデータを含み得、例えば、通信インターフェース１３６を使用してコントローラ１２４によってアクセスされ得る。有利には、そのような例では、プロセッサ１２５は、受信された入力値を参照データと比較することができ、次いでプロセッサ１２５は、特定の条件（例えば、作業容積、細胞株の種類、培地）に合わせられた同様のサイズおよび／または形状を有する細胞をより増殖させる可能性が高い第１のバイオリアクター１０２を動作させるための撹拌速度を決定することができる。別の言い方をすると、一例として、第１の作業容積が第１のバイオリアクター１０２とともに使用される場合、プロセッサ１２５は、第１のバイオリアクター１０２を第１の撹拌速度で動作させるための第１のフィードバックをユーザに動的に提供し、第２の作業容積が第１のバイオリアクター１０２とともに使用される場合、プロセッサ１２５は、第１のバイオリアクター１０２を第２の撹拌速度で動作させるための第２のフィードバックをユーザに動的に提供する。

【0096】

第１の撹拌速度で第２のバイオリアクター１０６を動作させると、第２のバイオリアクター１０６内に配置された細胞を含む懸濁液内の乱流渦の平均エネルギー散逸率（平均ＥＤＲ）を達成し、第２の撹拌速度で第１のバイオリアクター１０２のミキサー１１６を動作させると、格納容器１０４内の細胞を含む懸濁液内の乱流渦の目標平均ＥＤＲを実質的に達成する。いくつかの実施態様では、目標平均ＥＤＲは、平均ＥＤＲとほぼ等しい。第２の撹拌速度でミキサー１１６を動作させることによって生成された乱流渦。乱流渦の少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９７％のＥＤＲの大きさは、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満である。本明細書に記載されるように、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３は、＋／－５０％であるか、または０．００１５ｍ^２／ｓ^３に等しい。

【0097】

いくつかの実施態様では、目標平均ＥＤＲは、約０ｍ^２／ｓ^３～約０．００６ｍ^２／ｓ^３の範囲にある。他の実施態様では、目標平均ＥＤＲは、約０．０００３ｍ^２／ｓ^３～約０．００１５ｍ^２／ｓ^３の範囲にある。しかしながら、異なる目標平均ＥＤＲが、例えば、産生される治療用細胞、格納容器１０４、１０８の容積などに応じて好適であり得る。

【0098】

乱流の運動エネルギー（流体流における乱流渦に関連するエネルギー）の散逸は、渦が粘性力によって最終的に熱に変換されるまで、渦を徐々に小さくなる渦に分解することによって乱流エネルギーが吸収される割合である。ＥＤＲは、毎秒速度の二乗の単位（ｍ^２／ｓ^３）で、毎秒単位質量当たりの運動エネルギーとして表され得る。狭い範囲のＥＤＲは、サイズが実質的に変化しない渦を有する均質な流体流環境に関連し得る。十分に小さなコルモゴロフ渦は、付着した細胞に物理的な剪断効果ももたらすことができる。

【0099】

さらに図４を参照すると、示される実施態様では、第１のバイオリアクター１０２は、格納容器１０４内に実質的に均一な混合環境を作り出すための混合機構として使用される垂直ホイールバイオリアクター１０２である。駆動アセンブリ１２２は、ホイール１２０が回転してホイール１２０の周囲１２８の周りに接線流体流を生成する磁気駆動１２７などの駆動機構１２６を含む。磁気駆動１２７は、磁気結合部と称され得る。

【0100】

ホイール１２０は、軸１１８を通る流体の切断および折り畳み作用を生み出すことができ、例えば、駆動アセンブリ１２２および／またはホイール１２０への比較的低い動力入力で比較的効率的な混合を提供することができる、反対方向の軸方向ベーン１３０を含む。さらに、示される実施態様では、ホイール１２０は、比較的低いエネルギー散逸率（ＥＤＲ）および穏やかな混合を生成するようにサイズ決めされるインペラゾーン１３２を含む。例えば、インペラゾーン１３２は、比較的大きな行程容積を生成するために比較的大きくてもよい。ホイール１２０および格納容器１０４は、水平インペラ混合を伴う従来の撹拌型バイオリアクター（ＳＴＲ）と比較して、比較的低い動力入力で、格納容器１０４内のプラスチックマイクロ担体または細胞集合体などの大きな粒子を完全に懸濁させることができる強力でスイープする流れを作り出すようにともに動作する。

【0101】

他の実施態様では、駆動アセンブリ１２２を省略することができ、格納容器１０４は、空気をコンテナ容器１０４に流して、浮上し、ホイール１２０と相互作用し、ホイール１２０を空気圧で回転させる、浮遊気泡を生成する空気入力ポート（図示せず）を含み得る。気泡を使用してホイール１２０を回転させることは、上記に開示される駆動アセンブリ１２２を使用することと同様に、マイクロ担体または細胞集合体の低動力懸濁に十分な同じまたは同様の流体流特性をもたらし得る。しかしながら、格納容器１０４内の液体表面で飛び出す気泡の作用は、接着依存性細胞への剪断損傷の潜在的な原因であり、したがって、磁気駆動混合が、ＭＳＣまたはＰＳＣなどの細胞型に好ましい。

【0102】

動作中、第１のバイオリアクター１０２および／または第２のバイオリアクター１０６のミキサー１１６が、格納容器１０４、１０８内に含まれる懸濁液中で回転するとき、ミキサー１１６は、種々のサイズのコルモゴロフ渦を含む乱流を生成する。より大きな渦は、最小の渦が散逸して熱に変換されるまで、粘性力のために徐々に小さくなる渦に分解される。ＥＤＲは、渦が運動エネルギーから熱エネルギーに変換され、狭い範囲のＥＤＲは、サイズが大きく変動しない渦を伴う均質な流体流環境に関連付けられるため、このエネルギー損失の割合である。十分に小さいコルモゴロフ渦はまた、マイクロ担体の表面に付着した細胞に物理的な剪断効果をもたらし得る。マイクロ担体ベースのプロセスの文脈において、剪断力は、懸濁されたマイクロ担体の表面に付着した細胞に潜在的に有害な影響を与える可能性がある。

【0103】

ＥＤＲは、格納容器１０４内の混合環境に影響を及ぼすとして上述されているが、他のパラメータが関連し得る。例えば、これらのパラメータのうちのいくつかには、インペラへの最小限の動力入力、実質的に均質なエネルギー散逸率（ＥＤＲ）、および比較的低い流体力学的剪断応力レベルが含まれる。駆動アセンブリ１２２からのミキサー１１６への動力入力の変更は、格納容器１０４内の撹拌速度を変更し、ＥＤＲおよび剪断応力のレベルの両方に直接影響を与える。ＥＤＲは、剪断応力が直線的にスケールする間、撹拌の増加とともに指数関数的にスケールすることができる。

【0104】

バイオリアクター１０２および／または１０６が、懸濁されたマイクロ担体の直径よりも大きい渦を作り出すように動作するとき、波状の渦の流線は、流体流路に沿って付着された細胞を有するマイクロ担体をスイープする。対照的に、バイオリアクター１０２および／または１０６が、マイクロ担体の直径よりも著しく小さくなる渦を作り出すように動作するとき、より小さな渦は、細胞損傷またはさらに細胞の死を引き起こすマイクロ担体の表面上の細胞に剪断作用をもたらす。したがって、駆動アセンブリ１２２を使用したホイール１２０への動力入力は、ミキサー１１６がより速い速度で回転するとき、容器１０４および／または１０８の内部の渦のサイズに直接影響を与える。より高い動力入力は、より小さな渦を作り出す混合作用を生じる。

【0105】

コントローラ１２４を参照すると、示される実施態様では、コントローラ１２４は、ユーザインターフェース１３４、通信インターフェース１３６、１つ以上のプロセッサ１２５、および開示された実施態様を含む種々の機能を実行するために１つ以上のプロセッサ１２５によって実行可能な命令を記憶するメモリ１３８を含む。ユーザインターフェース１３４、通信インターフェース１３６、およびメモリ１３８は、１つ以上のプロセッサ１２５に電気的および／または通信的に結合される。

【0106】

一実施態様では、ユーザインターフェース１３４は、ユーザからの入力を受信し、システム１００の動作および／または発生する分析に関連付けられた情報をユーザに提供するように適合される。入力は、例えば、第２のバイオリアクター１０６が動作する第１の撹拌速度値、第２のバイオリアクター１０６が第１の撹拌速度値で動作することによって達成される平均ＥＤＲ値、第１のバイオリアクター１０２が動作する第２の撹拌速度値、および／または第１のバイオリアクター１０２が第２の撹拌速度値で動作することによって達成される平均ＥＤＲ率の値を含み得る。しかしながら、ユーザインターフェース１３４、またはより一般的には、コントローラ１２４は、他の入力を受信することができる。これらの入力のうちのいくつかは、ミキサー１１６および／もしくは駆動アセンブリ１２２に最小限の動力入力を提供すること、実質的に均質なエネルギー散逸率（ＥＤＲ）を達成すること、ならびに／または比較的低い流体力学的剪断応力レベルを達成することに関連付けられ得る。加えてまたは代替として、入力は、例えば、培地、細胞株の種類、接種条件、バイオリアクター１０２、１０６の作業容積を含み得る。ユーザインターフェース１３４は、タッチスクリーン、ディスプレイ、キーボード、スピーカ、マウス、トラックボール、および／または音声認識システムを含み得る。タッチスクリーンおよび／またはディスプレイは、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）を表示し得る。

【0107】

一実施態様では、通信インターフェース１３６は、ネットワークを介して、第１のバイオリアクター１０２および第２のバイオリアクター１０６ならびに／または遠隔システム（例えば、コンピュータ）の間の通信を可能にするように適合される。ネットワークには、インターネット、イントラネット、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、同軸ケーブルネットワーク、無線ネットワーク、有線ネットワーク、衛星ネットワーク、デジタル加入者線（ＤＳＬ）ネットワーク、セルラーネットワーク、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ接続、近距離無線通信（ＮＦＣ）接続などが含まれ得る。遠隔システムに提供される通信のうちの一部は、第１のバイオリアクター１０２によって生成されるか、またはそうでなければ取得される、分析結果などに関連付けられ得る。第１のバイオリアクター１０２に提供される通信のうちの一部は、第１のバイオリアクター１０２によって実行される混合動作、および／または撹拌速度、平均ＥＤＲ、および／または目標平均ＥＤＲと関連付けられ得る。

【0108】

１つ以上のプロセッサ１２５および／またはシステム１００は、プロセッサベースのシステムまたはマイクロプロセッサベースのシステムのうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施態様では、１つ以上のプロセッサ１２５および／またはシステム１００は、プログラマブルプロセッサ、プログラマブルコントローラ、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、グラフィックスプロセッシングユニット（ＧＰＵ）、デジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）、縮小命令セットコンピュータ（ＲＩＳＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、フィールドプログラマブルロジックデバイス（ＦＰＬＤ）、論理回路および／または本明細書に記載のものを含む種々の機能を実行する別の論理ベースのデバイスのうちの１つ以上を含む。

【0109】

メモリ１３８は、半導体メモリ、磁気可読メモリ、光学メモリ、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、光学記憶ドライブ、ソリッドステート記憶デバイス、ソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）、フラッシュメモリ、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラマブル読み取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）、電気的消去可能プログラマブル読み取り専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、不揮発性ＲＡＭ（ＮＶＲＡＭ）メモリ、コンパクトディスク（ＣＤ）、コンパクトディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク、独立ディスク冗長アレイ（ＲＡＩＤ）システム、キャッシュおよび／または任意の他の記憶デバイスもしくは記憶ディスクのうちの１つ以上を含み得、情報は、任意の期間（例えば、永久的、一時的、長期間、バッファリングのため、キャッシングのため）、記憶される。

【0110】

図５は、図４のバイオリアクター１０２、１０６とともに使用することができるミキサー１１６の等角図である。示される実施態様では、ミキサー１１６は、２つの軸流ベーン１４０および４つの半径方向流ブレード１４２を含むホイール１２０を含む。ミキサー１１６は、２つの軸流ベーン１４０および４つの半径方向流ブレード１４２を含むが、任意の数の軸流ブレードが含まれてもよく（例えば、１つ、３つ、４つ）、かつ／または任意の数の半径方向流ブレード１４２が含まれてもよい（例えば、１つ、２つ、３つ）。他の実施態様では、軸流ベーン１４０および／または半径方向流ブレード１４２は省略され得る。

【0111】

図６～８は、図４のシステム１００、第１のバイオリアクター１０２、および／もしくは第２のバイオリアクター１０６、または本明細書に開示される他の実施態様のうちのいずれかを使用して、懸濁液ベースのバイオリアクターにおいて、マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した治療用細胞の産生をスケーリングする方法についてのフローチャートを例示する。ブロックの実行順序は、変更されてもよく、かつ／または記載されるブロックのうちのいくつかは、変更されてもよく、排除されてもよく、組み合わされてもよく、かつ／もしくは複数のブロックに細分化されてもよい。

【0112】

図６のプロセス６００は、小規模バイオリアクター１０６内に配置された細胞を含む懸濁液内の乱流渦の目標平均エネルギー散逸率（ＥＤＲ）が決定されることから開始する（ブロック６０２）。いくつかの実施態様では、目標平均ＥＤＲは、プロセッサ１２５を使用して、別のコンピュータを使用して、またはチャートもしくはグラフを参照することによって、手動（例えば、ペンおよび紙）で決定される（図２６Ａを参照のこと）。目標平均ＥＤＲは、約０ｍ^２／ｓ^３～約０．００６ｍ^２／ｓ^３の範囲、および／または約０．０００３ｍ^２／ｓ^３～約０．００１５ｍ^２／ｓ^３の範囲にあり得る。小規模バイオリアクター１０６内で目標平均ＥＤＲを達成する小規模撹拌速度が決定され（ブロック６０４）、大規模バイオリアクター１０２内で目標平均ＥＤＲを達成する大規模撹拌速度が決定される（ブロック６０６）。大規模撹拌速度は、小規模撹拌速度に直接依存する。大規模バイオリアクター１０２は、小規模バイオリアクター１０６の容積よりも大きい容積を有し、いくつかの実施態様では、小規模および大規模撹拌速度のうちの少なくとも１つは、約０ｒｐｍ～約１２０ｒｐｍの範囲、および／または約１２ｒｐｍ～約７７ｒｐｍの範囲にある。

【0113】

ある体積の培養液中に懸濁された複数の細胞を含む懸濁液を、大規模バイオリアクター１０２内に沈積させる（ブロック６０８）。細胞を含む懸濁液を大規模バイオリアクター１０２に沈積させることは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を大規模バイオリアクター１０２内に沈積させることを含み得る。マイクロ担体は、任意選択で、例えば、ＭＳＣと組み合わせて、大規模バイオリアクター内に沈積される（ブロック６１０）。マイクロ担体および懸濁液は、大規模バイオリアクター１０２内に、同時に、順番に異なる時間で、および／または同様の時間で（例えば、順々におよび／または一定の時間内に）沈積され得る。

【0114】

大規模バイオリアクター１０２内に配置されたミキサー１１５の撹拌速度を、大規模撹拌速度に設定し（ブロック６１２）、大規模バイオリアクター１０２内のミキサー１１６を、大規模撹拌速度で作動させて、懸濁液を、目標平均ＥＤＲとほぼ等しい平均ＥＤＲで混合する（ブロック６１４）。平均ＥＤＲは、大規模バイオリアクター１０２内の懸濁液の体積内の複数の実際のＥＤＲデータ点の平均を含み得、複数の実際のＥＤＲデータ点の少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９７％の大きさは、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満である。

【0115】

いくつかの実施態様では、大規模バイオリアクター１０２内のミキサー１１６を作動させることは、回転の水平軸１１８を有する垂直ホイールミキサー１１６を作動させることを含む。他の実施態様では、大規模バイオリアクター１０２内でミキサー１１６を作動させることは、スピナー型ミキサーなどの垂直回転軸を有するミキサー１１６を作動させることを含む。しかしながら、ミキサー１１６は、例えば、格納容器１０４内に異なって構成および／または配置されてもよく、空気圧（例えば、気泡ミキサー）および／または他の機構を含む撹拌のための異なる手段を含んでもよい。

【0116】

図７のプロセス７００は、マイクロ担体上で、または細胞集合体として増殖した細胞を産生するために選択される大規模バイオリアクター１０２から開始する（ブロック７０２）。大規模バイオリアクター１０２を選択することは、小規模バイオリアクター１０６の容積よりも大きい容積を有するバイオリアクター１０２を選択することを含む。大規模バイオリアクター１０２は、大規模容器１０４内に大規模ミキサー１１６を有する。大規模ミキサー１１６について、大規模撹拌速度が決定される。（ブロック７０４）大規模撹拌速度は、小規模バイオリアクター１０６内の懸濁液中の乱流渦の目標平均エネルギー散逸率（ＥＤＲ）を達成する、小規模バイオリアクター１０６の小規模容器１０８中の小規模ミキサー１１６の小規模撹拌速度に基づいて決定される。いくつかの実施態様では、小規模および大規模撹拌速度のうちの少なくとも１つは、約０ｒｐｍ～約１２０ｒｐｍの範囲、および／または約１２ｒｐｍ～約７７ｒｐｍの範囲にある。いくつかの実施態様では、目標平均ＥＤＲは、約０ｍ^２／ｓ^３～約０．００６ｍ^２／ｓ^３の範囲、および／または約０．００３ｍ^２／ｓ^３～約０．００１５ｍ^２／ｓ^３の範囲にあり得る。

【0117】

ある体積の培養液中に懸濁された細胞を含む懸濁液は、大規模バイオリアクター１０２内に沈積される（ブロック７０６）。細胞を含む懸濁液を大規模バイオリアクター内に沈積させることは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を大規模バイオリアクター内に沈積させることを含み得る。次いで、例えば、ＭＳＣとともに使用される場合、マイクロ担体は、任意選択で、大規模バイオリアクター内に沈積され得る（ブロック７０８）。マイクロ担体および懸濁液は、大規模バイオリアクター１０２内に、同時に、順番に異なる時間で、および／または同様の時間で（例えば、順々におよび／または一定の時間内に）沈積され得る。

【0118】

大規模ミキサー１１６の撹拌速度を大規模撹拌速度に設定し（ブロック７１０）、大規模ミキサー１１６を大規模撹拌速度で作動させて、目標平均ＥＤＲとほぼ等しい平均ＥＤＲで懸濁液中の細胞を混合する（ブロック７１２）。いくつかの実施態様では、平均ＥＤＲは、大規模バイオリアクター１０２内の懸濁液の体積内の複数の実際のＥＤＲデータ点の平均を含み、複数の実際のＥＤＲデータ点の少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９７％の大きさは、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満である。いくつかの実施態様では、大規模ミキサー１１６を作動させることは、回転の水平軸１１８を有する垂直ホイールミキサー１１６を含むことを含む。他の実施態様では、大規模ミキサー１１６を作動させることは、スピナー型ミキサーなどの垂直回転軸を有するミキサー１１６を作動させることを含む。他のミキサーが可能であり、空気圧（例えば、気泡ミキサー）および／または他の機構を含む、撹拌のための異なる手段を含んでもよい。

【0119】

図８のプロセス８は、バイオリアクター１０２、１０６を、複数の利用可能なバイオリアクター１０２、１０６から選択することから開始する（ブロック８０２）。バイオリアクター１０２、１０６の各々は、約０．１Ｌ～約５００Ｌ、または約０．１Ｌ～約２０００Ｌの容積を有する。バイオリアクター１０２、１０６は、ミキサー１１６を含む。ミキサー１１６は、回転の水平軸１１８を有する垂直ホイールミキサー１１６であってもよく、または回転の垂直軸を有してもよい。バイオリアクター１０２、１０６は、湾曲した底壁１１２を有し得る格納容器１０４、１０８を含む。

【0120】

ある体積の培養液中に懸濁した細胞を含む懸濁液を、バイオリアクターに沈積させる（ブロック８０４）。ある体積の培養液中に懸濁した細胞を含む懸濁液をバイオリアクター内に沈積させることは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をバイオリアクター１０２内に沈積させることを含み得る。次いで、マイクロ担体を、任意選択で、例えばＭＳＣとともに、バイオリアクター内に沈積させることができ（ブロック８０６）、バイオリアクター１０２内に配置されたミキサー１１６の撹拌速度を設定する（ブロック８０８）。ミキサー１１６を、設定された撹拌速度で作動させて、懸濁液をバイオリアクター内で混合する（ブロック８１０）。懸濁液は、ミキサーによって生成された乱流渦を含み、乱流渦は各々、エネルギー散逸率（ＥＤＲ）を有する。乱流渦の少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９７％のＥＤＲの大きさは、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満である。いくつかの実施態様では、目標平均ＥＤＲは、約０ｍ^２／ｓ^３～約０．００６ｍ^２／ｓ^３の範囲、および／または約０．０００３ｍ^２／ｓ^３～約０．００１５ｍ^２／ｓ^３の範囲にある。

【0121】

図９Ａは、渦流９０２がマイクロ担体９０４よりも大きいときの、渦流９０２および付着した生存細胞を有するマイクロ担体９０４の概略図を例示する。図９Ｂは、付着した生存細胞９０６を有するマイクロ担体９０４のうちの１つおよびマイクロ担体９０４よりも小さい渦流９０２の概略図を例示する。図９Ｂに示すように、いくつかの死滅細胞９０８は分離されている。

【0122】

図９Ａを参照すると、渦９０２が、懸濁されたマイクロ担体９０４の直径よりも大きいとき、波状渦流線９０２は、流体流路に沿って付着された細胞を有するマイクロ担体９０４全体をスイープする。対照的に、図９Ｂを参照すると、渦９０２が、マイクロ担体９０４の直径よりも著しく小さくなると、マイクロ担体９０４の表面上の細胞に対して剪断効果が生じ、これにより、細胞損傷またはさらに死滅が引き起こされ得る。バイオリアクターのインペラ１１６への動力入力は、容器１０４内の渦のサイズに直接影響を与え、より高速な回転または混合作用のためのより高い動力入力は、より小さい渦を生成する。

【0123】

均一なＥＤＲは、液体中のマイクロ担体および栄養素の均等な分布に有益であるが、マイクロ担体ベースの細胞培養プロセスについての別の要因は、細胞を損傷する閾値を下回る剪断応力レベルを維持することである。より大きな渦の形成を促進するインペラ設計は、剪断力が特に関心がある場合に有益であり得るが、依然としてマイクロ担体の完全な底部外懸濁を達成しながら、インペラ１２０への動力入力を最小限に抑えることが望ましい場合がある。

【0124】

対照的に、ＰＳＣなどの細胞の集合体形成についての因子は、主に、狭い変動を伴うすべてまたは少なくともいくつかのＥＤＲ値の均質な分布を通じて作り出される均一な混合環境である。これは、均一な形状およびサイズを有する球状細胞集合体の形成を促進し、多くの場合、増殖および分化プロセスステップの両方の間の生物学的要件に有用である。動力入力、したがって撹拌速度を調整することは、比較的一貫した剪断応力レベルを維持することとともに、細胞集合体のサイズの制御にも直接的な影響を与える。

【0125】

マイクロ担体を用いた研究を通じて示されているように、このような粒子の完全な懸濁に使用される撹拌動力は、撹拌器およびバイオリアクターの形状に強く依存する。完全な懸濁に使用される動力は、撹拌器およびバイオリアクターの形状、ならびにマイクロ担体の直径、ならびにマイクロ担体と培養液との間の密度差に依存する。典型的なマイクロ担体は、約１５０～約２００ミクロンの直径、および約１．０３～約１．０４の比重を有し、培養液よりも０．０３～０．０４ｇ／ｍｌ高い密度差をもたらす。

【0126】

典型的なＰＳＣ集合体は、約１００～約４００ミクロンの直径を有する。集合体は、細胞型に応じて、以下のように異なる比重を有することができる細胞から構成される：肝細胞については１．０５～１．１５、Ｈｅｌａ細胞については１．０４～１．０８、線維芽細胞については１．０３～１．０５、および脂肪細胞については０．９２。これらの密度に基づいて、ＰＳＣ集合体は、懸濁細胞培養プロセスに典型的に使用されるマイクロ担体と同様の直径および密度を有すると考慮され得る。したがって、所与のバイオリアクターについて、マイクロ担体を首尾良く懸濁する動力入力および撹拌速度は、ほとんどの細胞集合体の懸濁に対しても良好に作用する。

【0127】

垂直ホイールバイオリアクター内のマイクロ担体懸濁に使用される撹拌動力を決定するために、垂直ホイールシステムについての動力数とレイノルズ数との関係を特徴付けた。レイノルズ数は、流体流が層流か乱流かを決定するために使用され、流体流のパターンを予測することができる。動力数とレイノルズ数との関係の特徴付けは、水平インペラシステムに何度も使用されてきた十分に確立されたアプローチである。いくつかの実施態様では、０．５Ｌの垂直ホイール単回使用容器を有する第２のバイオリアクター１０６を使用した。第２のバイオリアクター１０６のホイール１２０は、約７．２４センチメートル（ｃｍ）の直径を有し得、下部の湾曲した壁１１２は、約４．２５ｃｍの半径を有し得る。しかしながら、異なるサイズのホイール１２０および／または下部の湾曲した壁１１２が使用されてもよい。

【0128】

図１０は、第２のバイオリアクター１０６、および第２のバイオリアクター１０６に結合され、インペラ動力入力を測定するように構成されたジグ１００２の概略図である。示される実施態様では、ジグ１００２は、基部１００４と、ボールベアリング１００８によって支持されたシャフト／車軸１００６上に装着された磁気駆動ホイール１００５と、を含む。示される実施態様では、中空スピンドル１０１０は、シャフト１００６上に取り付けられ、細いねじ１０１２は、スピンドル１０１０上の単一の層に巻かれる。小ボックス１０１４は、ねじ１０１２の緩い端部１０１６に取り付けられる。ジグ１００２は、地面から約２．２メートル（ｍ）上に設置することができる。

【0129】

第２のバイオリアクター１０６は、駆動磁石１０１８および容器インペラ磁石１０２０が結合され得る（磁気的に結合され得る）ように、磁気駆動ホイール１００５に隣接して取り付けられて示される。デジタルタコメーターに接続されたホール効果センサーを使用して撹拌を測定することができる。既知の重りが、ボックス１０１４内に配置され得、ボックス１０１４は、重力の影響下で落下させることができる。システムの総摩擦（流体抗力＋ジグベアリングの摩擦＋ホイールベアリングの摩擦）は、ボックス１０１４の加速度を阻止し、ボックス１０１４は、ほぼ一定の（最終）速度で落下する。ボックス１０１４の速度は、スピンドル１０１０の周囲を通る撹拌に直接関連する。システムを駆動する総動力は、落下物質の速度、物質そのもの、および重力加速度定数ｇの積に等しい。

【0130】

第２のバイオリアクター１０６および／またはジグ１００２を使用して実験を行うために、撹拌器（ホイール１２０）に動力を入力し、注意深く測定した。ダイナモメーターまたは伝達トルクメーターを使用した従来の測定は、関係する非常に低い動力レベル、および回転するホイール１２０の磁気的に結合された性質の両方のために、実用的ではないとみなされた。その他は、低動力シナリオ下でのこれらの測定の課題に留意すべきである。さらに、この場合、従来の器具を取り付けるシステムを通して実行する垂直軸は存在しない。したがって、「重量測定」アプローチを定着させた。

【0131】

図１１は、第２のバイオリアクター１０６のホイール１２０の撹拌を表すＸ軸１１０２と、質量当たりの動力を表すＹ軸１１０４と、を含むグラフ１１００である。より具体的には、図１１は、約２６℃で脱イオン（ＤＩ）水を用いた０．５Ｌの容積および３００－ｍｌの作業容積を有する第２のバイオリアクター１０６の撹拌の関数としての質量当たりのインペラ動力入力を示す。グラフ１１００に示されるように、ミキサー１１６が、より高い撹拌速度で回転するとき、質量当たりの動力も増加する。試験した最低速度である１３ｒｐｍでは、質量当たりの動力入力は、約４．１ｃｍ^２／ｓｅｃ^３であり、試験した最高速度である１８０ｒｐｍでは、質量当たりの動力入力は、約１３６０ｃｍ^２／ｓｅｃ^３であった。

【0132】

グラフ１１００上にプロットされたデータを得るために、測定は、ジグベアリング１００８の動的摩擦を測定するためにジグ１００２単独で、ジグ１００２および空の格納容器１０８で（ジグベアリング１００８＋容器ベアリングの動的摩擦を測定するために）、ならびに水を含有する格納容器１０８で（ベアリングの摩擦＋インペラ抗力の両方を測定するために）行われた。各測定を複数の加重で行い、動力対撹拌曲線をグラフ１１００上にプロットした。格納容器１０８が空であるときの状態について動力または多項式曲線の適合を行い、これらの適合を使用して、任意の撹拌速度または少なくともいくつかの撹拌速度についての動力を補間した。このデータを使用して、格納容器１０８が、全システム摩擦（水を含有する格納容器１０８で測定された）から空になっているときの摩擦を差し引き、正味の動力を得た。正味の動力は、インペラ抗力または正味の混合動力に等しい。これらの実験は、マイクロ担体なしで水を使用して、約２６℃で実施した。固体を有しない無気体のニュートン流体についての標準方程式を使用して、インペラのレイノルズ数および動力数を決定した。水の密度および粘度は、それぞれ１．００ｇ／ｍｌおよび０．００８５ｇ／（ｃｍ－ｓｅｃ）と仮定した。

【0133】

ジグ１００２および上記を用いて実施した測定は、標準的なインペラ／バイオリアクター形状を用いてこれを試験することによって検証され、動力数とレイノルズ数との関係が十分に確立されている。次いで、実験結果を、十分に確立された結果（すなわち、予想される結果）に対して比較することができる。選択した標準的なインペラ／バイオリアクター形状は、標準的な（水平）ラシュトン（Ｒｕｓｈｔｏｎ）インペラを備えた標準的なバッフル撹拌タンクであった。乱流レジームで動作されるこの標準的な形状に関して、予想される動力数は５～６であり、予想される対数Ｐ対対数Ｎのグラフ上の予想される指数は３であり、Ｐは動力であり、Ｎは撹拌速度である。上記の測定システムを使用して、９０度回転させて、乱流レジームで動作するこの標準的な形状で作用させると、測定された動力数は５．５５で、予想される５～６の範囲の中央にあり、測定された対数Ｐ対対数Ｎ指数は３．１で、予想される３の数字にかなり近かった。したがって、測定システムは検証されたものと考慮され、０．５Ｌ垂直ホイールバイオリアクターの動力を測定するために使用された。

【0134】

図１２は、レイノルズ数を表すＸ軸１２０２と、インペラ動力を表すＹ軸１２０４と、を含むグラフ１２００である。具体的には、図１２は、約０．５Ｌの容積を有し、約２６°のＤＩ水で約３００－ｍｌの作業容積を有する第２のバイオリアクター１０６についてのインペラ動力数対レイノルズ数を示す。図１２に示すように、レイノルズ数が増加するにつれて、インペラ動力数は減少する。

【0135】

図１２は、インペラ動力数対レイノルズ数としてプロットした、図１１に含まれるものと同じ結果を示す。この相関関係は、固定された螺旋リボン、二重螺旋、および非常に大きいインペラ直径対タンク直径（Ｄｉ／Ｔ）比を有する他のインペラについて見出されるものと類似している。このようなインペラについて、動力数がレイノルズ数に反比例する層状レジームは、多くの場合、およそ１００までレイノルズ数に対して観察される。これは、典型的なタービンおよびプロペラとは対照的であり、典型的なＤｉ／Ｔ比は０．２５～０．５であり、層状レジームは、１０未満のレイノルズ数に対して観察される。約０．５Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６を使用すると、Ｄｉ／Ｔ比が０．８５であり、通常ではない垂直ホイールを使用すると、層状レジームは、約４０００のレイノルズ数まで持続するように見える。１０，０００を超えるレイノルズ数では、平均０．７８の一定の動力数で、完全に乱流レジームに到達する。フラットパドルまたは他のインペラを備えた非バッフル容器とは異なり、動力数は、約１０，０００のレイノルズ数を超えてゆっくりと減少し続けることはない。これは、垂直インペラ構成による渦巻きの欠如に起因し得る。図１２の２番目と３番目の点の間で、それぞれ、１８５０と４２１４のレイノルズ数において、べき法則適合の傾きは－１．３である。最初の３点を通る傾きが、層状レジームについて他の場合に予想されるように、マイナス１．０よりも急であるという事実は、これらの非常に低いレベルでの動力測定に関する実験的課題に起因する可能性が高い。この傾き、および中程度に高いレイノルズ数での層状レジームの持続性は、本明細書で提示されているプロトコルの下で再現可能である。

【0136】

図１３は、コルモゴロフ長さスケール（μｍ）を表すＸ軸１３０２と、相対純増殖率を表すＹ軸１３０４と、を含むグラフ１３００である。具体的には、グラフ１３００は、種々の粘度でスピナーＳＴＲを撹拌したときのサイトデックス（ｃｙｔｏｄｅｘ）１マイクロ担体上で増殖したＦＳ－４細胞、ならびに約０．５Ｌ（層流レジームを含む）の容積を有する第２のバイオリアクター１０６内のＳｏｌｏｈｉｌｌプラスチックプラスマイクロ担体上のＭＳＣに対する、コルモゴロフ渦長さの相対増殖度への影響を例示する。図１３に示すように、コルモゴロフ長さスケール数が増加するにつれて、相対純増殖率も増加し、次いで相対純増殖率が約１．０になった後に相対的に一貫したものとなる。

【0137】

図１３のグラフ１３００にプロットされたデータを得るために、図１２に以前に示された相関を使用し、コルモゴロフ長さスケールを介した動力入力の観点から、垂直ホイールバイオリアクターにおけるマイクロ担体培養物に関する公開されたデータを分析した。その結果を図１３に示し、以前に公開された結果と一致する。細胞が、水平インペラまたは垂直ホイールインペラバイオリアクターのいずれかで、約１５０～約２００ミクロンの直径を有するマイクロ担体上で増殖するとき、コルモゴロフ長さスケール（平均動力／質量に基づく）が１３０ミクロン以下に達すると、流体力学的損傷が明らかになる。０．００７１ｃｍ^２／ｓｅｃの動粘度で、これは、１２．５ｃｍ^２／ｓｅｃ^３の質量当たりの平均動力に変換される。

【0138】

図１３に示される相関はまた、例えば、第２のバイオリアクター１０６などの一連の異なるスケールの垂直ホイールバイオリアクターにわたって、マイクロ担体懸濁液に使用される動力を決定するために使用した。図１４は、Ｘ軸１４０２が毎分回転数（ＲＰＭ）を表す、マイクロ担体懸濁液試験からの結果のセットを提示するグラフ１４００である。異なるバイオリアクターに使用される動力を決定するために、マイクロ担体を、バイオリアクター１０２、１０６内のリン酸緩衝生理食塩水中の低濃度で懸濁した。種々の撹拌レベルで、各バイオリアクター１０２、１０６の表面付近から小さな試料を引き出し、試料１ｍｌ当たりのマイクロ担体の数を倒立顕微鏡によりカウントした。カウントの明確なプラトーが得られるまで、ミキサー１１６および／またはホイール１２０を使用して撹拌を増加させた。図１４は、約０．１Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６を使用して得られた結果を表す。１５～２０ＲＰＭ以上の撹拌でのカウントのプラトーは、マイクロ担体が懸濁中であること、ならびに／またはマイクロ担体のすべてもしくは少なくとも一部が、上記のいずれかもしくは少なくとも一部の撹拌速度、１５～２０ＲＰＭの範囲内および／もしくはその範囲で完全に懸濁していることを示す。これも目視で確認した。

【0139】

図１５は、異なるバイオリアクターおよび関連する撹拌速度（ｒｐｍ）を示すＸ軸１５０２と、種々のバイオリアクターにおけるマイクロ担体懸濁に必要な質量レベル当たりの平均動力を表すＹ軸１５０４と、を含むグラフ１５００である。図１４に示すような相関を使用して、マイクロ担体懸濁に使用される最小毎分回転数（ＲＰＭ）を動力レベルに変換すると、種々のバイオリアクター内でマイクロ担体を懸濁するために使用される質量当たりの平均動力を計算することができる。異なるスケールにわたる垂直ホイールバイオリアクターは、水平インペラ混合を使用する、より高品質の撹拌タンクリアクター（ＳＴＲ）よりも、ＦＳ－４細胞およびＭＳＣを含む多くの他の細胞株についての１２．５ｃｍ^２／ｓｅｃ^３の損傷閾値をはるかに下回る、約２ｃｍ^２／ｓｅｃ^３～約３．５ｃｍ^２／ｓｅｃ^３の範囲内で、質量当たり非常に低いレベルの動力でマイクロ担体を懸濁することができる。ＣｏｒｎｉｎｇスピナーＳＴＲおよび様々な２０－Ｌ ＳＴＲとともに、種々のサイズの垂直ホイールバイオリアクターについてのデータが示される。前述のように、１２．５ｃｍ^２／ｓｅｃ^３において、渦は、表面付着細胞に対して剪断効果を有するのに十分に小さい（マイクロ担体の直径の約３分の２以下）、約１３０ミクロンのサイズで接近する。

【0140】

以前に説明したように、種々の細胞型の細胞集合体は、図１３～１５に示される懸濁研究で使用されるＳｏｌｏｈｉｌｌマイクロ担体などのプラスチックマイクロ担体と同様の直径および密度を有する。したがって、約２ｃｍ^２／ｓｅｃ^３～約３．５ｃｍ^２／ｓｅｃ^３の質量当たりの動力範囲は、０．１Ｌ～８０Ｌの同じ範囲の垂直ホイールバイオリアクターにわたって細胞集合体も懸濁することができる最小ベースラインであると推測され得る。しかしながら、質量当たりの他の動力範囲を使用してもよい。しかしながら、質量当たりの他の動力範囲が好適であることが証明され得る。

【0141】

図１６は、約３Ｌの容積を有する第１のバイオリアクター１０２上で実施された計算流体力学（ＣＦＤ）分析の結果１６００を示す。図１６の結果１６００は、３Ｌスケールでの液体混合中に、ホイール１２０（空気圧駆動インペラ）の表面上に比較的一貫して、低レベルの流体力学的剪断応力が存在することを示す。示されるように、ホイール１２０の側面１６０２は、シア応力の約０．０パスカル（Ｐａ）を経験し、一方、ホイール１２０の半径方向流ブレード１４２は、シア応力の約０．０パスカル（Ｐａ）～シア応力の約２．０パスカルを経験する。

【0142】

さらに、垂直ホイールバイオリアクターの種々のスケールで試験が実施され、その結果は、ホイール１２０の表面上の低い流体力学的剪断応力レベルを示す。図１６の結果１６００を提供する分析は、磁気結合とは対照的に、流動気泡の浮力を通して空気圧的に回転されるインペラバージョンを使用して、垂直ホイールバイオリアクター１０２、１０６に対して実行された。しかしながら、ホイール１２０およびＵ字形容器の寸法、アスペクト比、ならびにバイオリアクター機能は、第１のバイオリアクター１０２と第２のバイオリアクター１０６との間で類似または同一であるため、インペラの表面上の剪断応力レベルは、磁気または空気混合にかかわらず比較的低いであろう。

【0143】

約２ｃｍ^２／ｓｅｃ^３～約３．５ｃｍ^２／ｓｅｃ^３の質量当たりの動力範囲は、細胞集合体を懸濁するのに十分であり、また、垂直ホイールバイオリアクター内に均質なＥＤＲを作り出すことができる最小撹拌速度にも変換される。均質なＥＤＲは、均一な混合環境の前提条件であり、これは、均一な形状の細胞集合体の形成を促進する。ＰＳＣ集合体のサイズおよび形状は、細胞増殖およびその後の指向性分化の効率に直接影響を及ぼす。集合体が大きくなりすぎるか、または奇形になった場合、栄養素または分化因子は、その中心に拡散することができず、望ましくない細胞死または不均一な分化につながる可能性がある。均質な混合環境は、等しいサイズの球状細胞集合体の形成を促す。細胞集合体についての狭い範囲の直径および均一な球状形状を達成することで、ＰＳＣの増殖および分化の両方の生産性、ならびに最終生成物としての標的細胞の収量および品質が向上する。

【0144】

図１７は、図４の第１のバイオリアクター１０２および／または第２のバイオリアクター１０６を使用した計算流体力学（ＣＦＤ）分析から得られたさらなる結果１７００を示し、Ｕ字型格納容器１０４、１０８内の垂直ホイール混合（空気圧駆動インペラ１２０）のために、乱流エネルギー散逸率の実質的に均質な分布を得ることができることを示す。結果は、乱流エネルギー散逸率（ＥＤＲ）の範囲が比較的狭く、スペクトルの中央に向かって（約１０Ｅ－０２～約１０Ｅ－０６）、散逸率が、極端に異なるゾーンを伴わずに格納容器１０４、１０８全体に均一に分布していること、およびその率が、イプシロン（ｍ^２ｓ^－３）の単位で示されていることを示す。

【0145】

図１７の結果１７００はまた、第１のバイオリアクター１０２および／または第２のバイオリアクター１０６によって提供されるようなＵ字形容器と組み合わせた垂直ホイール混合が、格納容器１０４、１０８内の狭い範囲のＥＤＲで均質な混合環境をもたらす方法を示す（ホイール１２０を取り囲む領域１７０２によって示されるように、いくつかの領域１７０４は、図１７において、約１０Ｅ－０８のＥＤＲ率を有する）。結果１７００および関連するモデルは、空気圧駆動バージョンの垂直ホイールバイオリアクター１０２、１０６を使用して得られたが、同一または類似の考慮事項が適用され得る。例えば、空気圧駆動混合と磁気駆動混合との間には、ＣＦＤモデルについての均質性に類似点があるだろう。

【0146】

空気圧駆動インペラ混合は、約０．１Ｌから約５００Ｌの作業容積にスケーリングされ得る均質性およびＥＤＲを示し、同じＵ字形格納容器１０４、１０８内での磁気駆動インペラ混合は、類似または同一の均質性およびスケーラビリティを達成することができることが予測される。

【0147】

垂直ホイールインペラ１２０およびＵ字形格納容器１０４、１０８の組み合わせに基づいて、流体混合の第１のバイオリアクター１０２および／または第２のバイオリアクター１０６を使用した計算流体力学（ＣＦＤ）分析は、格納容器１０４、１０８全体にわたる均質な乱流エネルギー散逸率の狭い範囲、およびインペラ１２０の表面上の一貫した流体力学的剪断応力を示し、ＰＳＣ集合体のための閾値均一混合環境を作り出す。これは、小規模の垂直ホイールバイオリアクター内で増殖したＰＳＣ集合体の均一なサイズおよび形状分布を観察することによって確認された。

【0148】

図１８は、細胞集合体のサイズを表すＸ軸１８０２と、細胞集合体の数を表すＹ軸１８０４と、を含むグラフ１８００である。グラフ１８００は、エネルギーの散逸率の広範囲の勾配ならびに不整合なサイズおよび／または形状を有する産生された細胞集合体を有するバイオリアクターと関連付けられた第１の曲線１８０６と、散逸エネルギー率の均質な分布ならびに同様のサイズおよび／または形状を有する細胞集合体を有するバイオリアクターと関連付けられた第２の曲線１８０８と、を含む。図１８のグラフ１８００は、急な釣鐘曲線によって表される、均質な乱流ＥＤＲを有するバイオリアクター内で増殖したＰＳＣ集合体サイズの変動が、緩やかな釣鐘曲線によって表される、広い勾配の乱流ＥＤＲを有するバイオリアクター内で増殖したＰＳＣ集合体サイズの変動よりも、はるかに狭いことを示す。

【0149】

ＰＳＣ集合体のサイズおよび形状は、細胞培養プロセス中に、バイオリアクター内の流体混合環境によって著しく影響を受ける。特に、ＥＤＲと、得られた細胞集合体の平均直径との間には逆相関がある：ＥＤＲが高いと、細胞集合体の平均直径が小さくなるが、ＥＤＲが低いと、直径が大きくなる。一貫した直径の球状ＰＳＣ集合体を達成するために、狭い範囲の乱流ＥＤＲが使用される。バイオリアクター格納容器１０４、１０８全体にわたって広範囲の乱流ＥＤＲをもたらす混合機構（ミキサー１１６）を有する第１のバイオリアクター１０２および／または第２のバイオリアクター１０６などのバイオリアクターは、細胞集合体のサイズの広範な変動を生じ、これにより、細胞の増殖および分化の効率に悪影響を及ぼす可能性がある。

【0150】

図１９は、ＰＳＣ集合体のサイズを表すＸ軸１９０２と、細胞集合体の数を表すＹ軸１９０４と、を含むグラフ１９００である。具体的には、グラフ１９００は、撹拌速度を変化させることによる、バイオリアクターにおけるＰＳＣ集合体のサイズの制御可能性を例示する。示されるように、ＲＰＭ速度を増加させることによって、ＰＳＣ集合体のサイズは減少し、ＲＰＭ速度を減少させることによって、ＰＳＣ集合体のサイズは増加する。ＰＳＣ集合体の平均直径は、均質なＥＤＲを有するバイオリアクターにおける撹拌速度を調整することによって制御することができる。異なる種類のＰＳＣは、細胞の増殖または分化の効率を増加させるために必要な異なる閾値の集合体直径を有することができるので、望ましい。

【0151】

図２０Ａは、約０．１Ｌの容積を有する垂直インペラホイール１２０を含む、第２のバイオリアクター１０６についてのレムニスケート液体流パターンおよび速度ストリームラインに関する計算流体力学（ＣＦＤ）分析結果２０００の上面図を示し、試験のいくつかは、ホイール１２０が約４０ｒｐｍで回転して行われ、また、試験のいくつかは、ホイール１２０が約１００ｒｐｍで回転して行われる。

【0152】

図２０Ｂは、約０．１Ｌの容積を有する垂直インペラホイール１２０を含む第２のバイオリアクター１０６についてのレムニスケート液体流パターンおよび速度流線に関する計算流体力学（ＣＦＤ）分析結果２００２の側面等角図を示し、試験は、ホイール１２０が約６０ｒｐｍで回転して行われる。

【0153】

図２０Ａおよび２０Ｂの両方を参照すると、結果２０００、２００２は、レムニスケートまたは「図８」パターンである、Ｕ字形格納容器１０８の容積全体にわたる液体流のパターンを示す。これは、ＳＴＲにおける液体の流れの典型的な漏斗または「竜巻」パターンと比較して特有の流線流パターンであり、垂直ホイールインペラ１２０とＵ字形格納容器１０８との組み合わせに起因して発生し得、均質なエネルギー散逸率および一貫して低いシア応力レベルを有する均一かつスケーラブルな混合環境を可能にし得る。図２０Ａに示すように、乱流渦２００４は、ホイール１２０を通って、格納容器１０４、１０８全体に流れる。いくつかの実施態様では、集合体のすべてまたは実質的にすべては、格納容器１０４、１０８全体に移動し、同一または少なくとも類似の流体力学的条件（例えば、ＥＤＲおよびシア応力）を経験する。したがって、集合体は、実質的に等しいまたは類似のサイズおよび／または形状を有する。図２０Ａに示すように、４０ＲＰＭで動作する第２のバイオリアクター１０６の渦２００４は、約０．０３ｍ／ｓ～約０．０６ｍ／ｓで移動しており、渦２００４の速度は、約０．０６で移動するブレード１４２により近い。図２０Ａに示すように、１００ＲＰＭで動作する第２のバイオリアクター１０６の渦２００４は、約０．０３ｍ／ｓ～約０．１５ｍ／ｓで移動しており、渦２００４の速度は、約０．０１２ｍ／ｓ～約０．０１５ｍ／ｓで移動するブレード１４２により近い。図２０Ｂに示すように、ホイール１２０からより遠い渦２００６は、約０．０ｍ／ｓ～約０．０６ｍ／ｓで移動しているが、ホイール１２０により近い渦２００８は、約０．０６ｍ／ｓ～約０．１１ｍ／ｓで移動している。

【0154】

図２１Ａは、流れ時間を秒単位で表すＸ軸２１０２と、速度を表すＹ軸２１０４と、を含むグラフ２１００である。グラフ２１００は、２０ｒｐｍで動作するホイール１２０に関連付けられた第１のライン２１０６、４０ｒｐｍで動作するホイール１２０に関連付けられた第２のライン２１０８、６０ｒｐｍで動作するホイール１２０に関連付けられた第３のライン２１１０、８０ｒｐｍで動作するホイール１２０に関連付けられた第４のライン２１１２、および１００ｒｐｍで動作するホイール１２０に関連付けられた第５のライン２１１４を含む。示されるように、速度値は、流れ時間の約１秒後に比較的一貫している。

【0155】

図２１Ｂは、流れ時間を秒単位で表すＸ軸２１１８と、シア応力を表すＹ軸２１２０と、を含むグラフ２１１６であり、図２１Ｃは、流れ時間を秒単位で表すＸ軸２１２４と、ＥＤＲを表すＹ軸２１２６と、を含むグラフ２１２２である。図２１Ｂに示すように、剪断応力値は、流れ時間の約１秒半後に比較的一貫している。図２１Ｃに示すように、ＥＤＲ値は、流れ時間の約２秒後に比較的一貫している。

【0156】

図２１Ａ、２１Ｂ、および２１Ｃを参照すると、これらのグラフ２１００、２１１６、２１２２は、インペラ１２０が静止位置または停止位置から初期回転を開始すると、流体流線速度、剪断応力、およびＥＤＲが、どのくらい速くそれらの閾値（例えば、最大）の定常状態値に達するかを示す。３つすべての流体力学的特性についての定常状態は、使用したＲＰＭに関係なく、約３秒で達成された。これは、培地交換などの細胞培養プロセスステップ中に定着した可能性のある任意の細胞集合体を迅速に再懸濁するのに有用である。約０．１Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６は、グラフ２１００、２１１６、２１２２に表示されるデータを取得するための試験を実施するときに使用した。

【0157】

図２２Ａは、ホイール１２０が約４０ｒｐｍおよび約１００ｒｐｍで回転する速度に関連する計算流体力学（ＣＦＤ）分析結果２２０２を示し、図２２Ｂは、ホイール１２０が約４０ＲＰＭおよび約１００ＲＰＭで回転するシア応力に関連する計算流体力学（ＣＦＤ）分析結果２２０４を示し、図２２Ｃは、ホイール１２０が約４０ＲＰＭおよび約１００ＲＰＭで回転するエネルギー散逸に関連する計算流体力学（ＣＦＤ）分析結果２２０６を示す。したがって、図２２Ａ、２２Ｂ、および２２Ｃは、４０および１００ＲＰＭにおける速度、剪断応力、およびＥＤＲの関係を示し、約０．１Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６を使用して試験が実施されている。

【0158】

図２２Ａ、２２Ｂ、および２２Ｃを参照すると、４０ＲＰＭおよび１００ＲＰＭの両方で（ならびにすべてのＲＰＭ、実質的にすべてのＲＰＭ、および／またはいくつかのＲＰＭについて推測することができる）、剪断応力およびＥＤＲの変動は、速度と同じ割合で増加しない（インペラへの動力入力が増加する場合）。実際、４０ＲＰＭにおいて、ＥＤＲは、ほぼ完全に均質である（領域２２０８および２２１０を参照のこと）。参照番号２２０８において、速度は、約０．０ｍ／ｓ～約０．０３ｍ／ｓであり、参照番号２２１０において、速度は、約０．０３ｍ／ｓ～約０．０９ｍ／ｓである。図２２Ｂの参照番号２１１２では、約４０ＲＰＭで動作しているホイール１２０の周りのシア応力は、約１Ｅ－２～約３Ｅ－２であり、図２２Ｃの参照番号２１１４では、エネルギー散逸値は、約０．０ｍ^２／ｍ^３であり、格納容器１０８全体で実質的に一貫している。

【0159】

１００ＲＰＭで、図２２Ａの参照番号２１１６に示されるように、ホイール１２０の周りの速度は、約０．０９ｍ／ｓ～約０．１５ｍ／ｓである。図２２Ｂに示すように、ホイール１２０が１００ＲＰＭで動作したときには、ホイール１２０が４０ＲＰＭで動作したときと比較してはるかに大きな速度の変動があるが、比較的高い剪断応力またはＥＤＲの最小のゾーンが存在する（シア応力が約３Ｅ－２Ｐａ～約４Ｅ－２Ｐａの領域２２１８を参照のこと）。したがって、インペラホイール１２０への動力入力を増加させることは、速度により影響を与えるが、実質的に均一な混合環境は、より高いＲＰＭでも維持される。また、これらの３つの流体条件、速度、シア応力、およびエネルギー散逸の間の同様の関係／挙動は、例えば、第１のバイオリアクター１０２などのより大きなバイオリアクター容積へのスケールアップ中に実質的に一致することが予測され得る。さらに、図２２Ｃに示されるように、第２のバイオリアクター１０６が約１００ＲＰＭで動作するとき、エネルギー散逸値は、約４．０Ｅ－３ｍ^２／ｓ^３～約２．０Ｅ－２ｍ^２／ｓ^３である。

【0160】

動力入力が増加するにつれて、速度、剪断応力、およびＥＤＲ（特に速度）についての最大値と最小値との間に大きな差が生じ得る。最大値および最小値は、実際には、バイオリアクター環境に多くの入力を提供しない。なぜなら、バイオリアクターのわずかな部分が、今までにこれらの条件を経験したことがあるからである。典型的には、バイオリアクター環境に影響を与えるのは、平均値であり、バイオリアクター１０２、１０６の高い多数のパーセントが、細胞集合体形成に悪影響を及ぼさない妥当な平均値で動作しているかどうかである。

【0161】

ＰＳＣ集合体直径および対応する優れた生物学的性能に対する撹拌速度の効果は、第２のバイオリアクター１０６などの小規模（０．１Ｌ）の垂直ホイールバイオリアクターで実証されており、ＳＴＲと比較されている。垂直ホイールインペラ１２０によって作り出される均質な混合環境は、撹拌型バイオリアクター（ＳＴＲ）における少なくとも一部の水平インペラ混合によって作り出される非均一な環境と顕著に対照的である。

【0162】

図２３は、異なる撹拌速度、４０ＲＰＭ、６０ＲＰＭ、および８０ＲＰＭで、図４のバイオリアクター１０２、１０６などの垂直ホイールを含むバイオリアクター、ならびに水平ブレードを含むバイオリアクターにおいて細胞を増殖させたときに得られた結果２３００を例示する。より具体的には、結果２３００は、約０．１Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６、および水平ブレードを有するバイオリアクターにおいて異なる撹拌速度でｉＰＳＣ集合体直径および形態の比較を可能にする。

【0163】

ｉＰＳＣを単一の細胞として播種し、５日間増殖させた例では、開示されたバイオリアクター１０２、１０６によって提供されるものなどの垂直ホイール混合は、水平ブレードを使用したときと比較して、集合体直径の範囲が狭く、非常により均一な集合体をもたらすことが示された。インペラホイール１２０のＲＰＭと細胞集合体直径との間のこの逆相関をまた、約０．１Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６を使用して確認した。

【0164】

図２４は、エネルギー散逸率（ＥＤＲ）を表すＸ軸２４０２と、容積パーセントを表すＹ軸２４０４と、を含むグラフ２４００である。より具体的には、図２４は、４０および１００ｒｐｍでの、０．１Ｌ垂直ホイールバイオリアクターおよび水平ブレードスピナーについてのこのＥＤＲ閾値リアクター下の容積パーセンテージの差を示す。

【0165】

グラフ２４００は、約４０ＲＰＭで約０．１Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６の動作に関連付けられた第１のライン２４０６、約１００ＲＰＭで約０．１Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６の動作に関連付けられた第２のライン２４０８、約４０ＲＰＭで約０．５Ｌの容積を有する水平ホイールバイオリアクターの動作に関連付けられた第３のライン２４１０、約１００ＲＰＭで約０．５Ｌの容積を有する水平ホイールバイオリアクターの動作に関連付けられた第４のライン２４１２を含む。第１のライン２４０６は、有意な隆起（例えば、外れ値）を伴わない比較的滑らかで急な傾きの分布を有し、ＥＤＲ値の大部分は、２．０Ｅ－３の前に生じ、したがって、ＥＤＲ値は比較的類似しており、増殖した細胞は、類似した形状および／またはサイズを有し得る。第２、第３、および第４のライン２４０８、２４１０、２４１２は、より浅いラインを有し、したがって、より広い範囲のＥＤＲ値を有する。

【0166】

結果は、０．１Ｌバイオリアクターにおける成功したＰＳＣ集合体の増殖および一貫性が、作業容積のうちの少なくとも９０％が、１．３０Ｅ－２ｍ^２／ｓ^３以下のエネルギー散逸率を維持するときに生じることが測定されたことを示す。

【0167】

さらに図２４を参照すると、４０ｒｐｍにおいて、０．１Ｌの垂直ホイールバイオリアクター容積の約１００％は、１．３０Ｅ－２ｍ^２／ｓ^３未満であり、０．５Ｌの水平ブレードスピナーは、そのＥＤＲ未満で同様の９９％を有する。しかしながら、１００ｒｐｍでは有意差がある：垂直ホイールバイオリアクター容積の９０％は、依然として１．３０Ｅ－２ｍ^２／ｓ^３未満であるが、水平ブレードスピナーは、１．３０Ｅ－２ｍ^２／ｓ^３ＥＤＲ値未満で約２８．５％を有する。これは、水平ブレードスピナーが、より高いＲＰＭで著しく不均一なＥＤＲを有し、ＰＳＣ集合体の不均一なサイズおよび形状につながることを意味する。一例では、Ｕ字形容器内の垂直ホイール混合は、好ましい９０％容積の均質なＥＤＲを依然として維持しながら、幅広い範囲のＲＰＭを可能にする流体力学を有する。別の言い方をすると、水平ブレードは、「複数のピーク」を伴う比較的「広範な」分布を有し、これは、集合体のサイズおよび形状の不均一な分布をもたらす（図２３を参照のこと）。

【0168】

４０ＲＰＭは、マイクロ担体および細胞集合体を完全に懸濁するための最小要件であり得る、約２ｃｍ^２／ｓｅｃ^３～約３．５ｃｍ^２／ｓｅｃ^３の質量当たりの動力範囲よりもわずかに多くに対応する。１００ＲＰＭは、典型的には、細胞培養プロセスに使用されるものの上端にあるが、それでも、水平インペラ混合が同じ撹拌速度で達成するものと比較して、非常により均質なＥＤＲ、および一貫して低い剪断応力を有する混合環境を達成する。

【0169】

図２５Ａは、約０．１Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６を使用した場合のスケールアップ傾向線方程式のグラフ２５０２、２５０４、２５０６を示す。グラフ２５０２、２５０４、２５０６の各々は、撹拌速度（ＲＰＭ）を表すＸ軸２５０８を有し、グラフ２５０２は速度を表すＹ軸２５１０を有し、グラフ２５０４は剪断応力を表すＹ軸２５１２を有し、グラフ２５０６はＥＤＲを表すＹ軸２５１４を有する。グラフ２５０２、２５０４、２５０６の各々に示すように、速度、剪断応力、ＥＤＲ値は、撹拌速度が増加するにつれて増加する。

【0170】

図２５Ｂは、第２のバイオリアクター１０２を使用して得られた結果に関連付けられた第１のライン２５２２、水平ブレードスピナーを有するＮＤＳバイオリアクターを使用して得られた結果に関連付けられた第２のライン２５２４、および水平ブレードスピナーを有するＤａｓＧｉｐ（登録商標）バイオリアクターを使用して得られた結果に関連付けられた第３のライン２５２６を含む、グラフ２５１６、２５１８、２５２０を示す。

【0171】

図２５Ａおよび２５Ｂに示すように、剪断応力は、撹拌速度（速度）とともに直線的に増加することが確認され、一方、ＥＤＲは、速度とともに指数関数的に増加する。２種類の水平ブレードスピナーと比較すると（ライン２５２２をライン２５２４および２５２６と比較する）、垂直ホイールバイオリアクター１０６は、０．１Ｌスケールにおける広範囲の撹拌速度にわたって、同様またはより低い平均速度、剪断応力、およびＥＤＲを有する。しかしながら、垂直ホイールバイオリアクター１０６の均一な混合環境、およびその後の均一な細胞集合体形成の優位性は、容積が規模を増大するにつれて、はるかに顕著になる。

【0172】

ＥＤＲについての容積平均値を使用して、特定の細胞培養物についての動作撹拌速度を定義することが可能である。例えば、約４０ｒｐｍ～約８０ｒｐｍの動作を０．１Ｌスケールで定義することを望む場合、約５．６７Ｅ－５ｍ^２／ｓ^３～約１．５９Ｅ－３ｍ^２／ｓ^３の容積平均ＥＤＲで動作する。垂直ホイールバイオリアクター１０６内で小規模の実験を行うことにより、所与のＰＳＣ型についての閾値直径の所望の集合体を産生するＥＤＲ範囲を決定することができ、次いで、より大きなスケールでそのＥＤＲ範囲を再生成するために使用される撹拌速度を、例えば、コントローラ１２４を使用して計算することができる。これにより、ＰＳＣ集合体が任意のサイズの垂直ホイールバイオリアクターにおいて同様または同一の混合環境を経験することが可能となり、これは、標的細胞の高い収量および品質を生じるスケーラブルなＰＳＣ製造プロセスに重要である。垂直ホイールバイオリアクターの均一な混合環境は、均一な球状細胞集合体のスケーラブルな形成を促進し、これにより、不均一な分化を回避または抑止することができる。したがって、垂直ホイールバイオリアクター１０２、１０６は、ＰＳＣ集合体を高品質の標的細胞に大規模に分化させるための実行可能なツールである。

【0173】

図２６Ａは、エネルギー散逸率（ＥＤＲ）を表すＸ軸２６０２と、容積平均エネルギー散逸率を表すＹ軸２６０４と、を含むグラフ２６００である。第１のライン２６０６は、約０．１Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６を使用することに関連付けられた結果を表し、第２のライン２６０８は、約０．５Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６を使用することに関連付けられた結果を表し、第３のライン２６１０は、約３Ｌの容積を有する第１のバイオリアクター１０２を使用した結果を表し、第４のライン２６１２は、約１５Ｌの容積を有する第１のバイオリアクター１０２を使用した結果を表す。示されるように、撹拌速度が増加するにつれて、容積平均ＥＤＲ値も増加する。ライン２６０６、２６０８、２６１０、２６１２は、実験中に得られたデータ点を適合することによって生成された。したがって、各撹拌速度値および各容積平均エネルギー散逸率値についてのライン２６０６、２６０８、２６１０は、各サイズ格納容器１０４、１０８についての各撹拌速度が対応する容積平均ＥＤＲ値を有することを可能にするために、最適適合方程式を使用して決定された。

【0174】

有利には、開示された例を使用して、異なるサイズのバイオリアクター１０２、１０６を動作させて、同様のサイズおよび／または直径を有する細胞を増殖させることができる、上位平均ＥＤＲ値２６１４および下位平均ＥＤＲ値２６１６を決定することができる。示される例では、ボックス２６１８は、閾値特性（サイズおよび／または形状）を有する細胞を増殖させ、閾値特性を有する細胞増殖を達成する異なる容積について、ボックス２６１８内および対応するライン２６０６、２６０８、２６１０、２６１２において撹拌速度を選択することを可能にする上位および下位ＥＤＲ値２６１４、２６１６を境界とするグラフ２６００に示される。

【0175】

図２６Ｂは、格納容器１０４、１０８の容積を表すＸ軸２６２２と、撹拌速度（ＲＰＭ）を表すＹ軸２６２４と、を含むグラフ２６２０である。示されるように、容積が増加するにつれて、撹拌速度は減少する。図２６Ｂにおいて、第１のライン２６８０は、約４０ＲＰＭの撹拌で開始して得られた結果を表し、第２のライン２６８２は、約５０ＲＰＭの撹拌で開始して得られた結果を表し、第３のライン２６８４は、約６０ＲＰＭの撹拌で開始して得られた結果を表し、第４のライン２６８６は、約６０ＲＰＭの撹拌で開始して得られた結果を表し、第５のライン２６６８は、約８０ＲＰＭの撹拌で開始して得られた結果を表す。

【0176】

図２６Ｃは、撹拌速度を表すＸ軸２６２８と、平均シア応力を表すＹ軸２６３０と、を含むグラフ２６２６である。グラフ２６２６は、約０．１Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６を使用することに関連付けられた結果を表す第１のライン２６０６を含み、第２のライン２６０８は、約０．５Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６を使用することに関連付けられた結果を表し、第３のライン２６１０は、約３Ｌの容積を有する第１のバイオリアクター１０２を使用した結果を表し、第４のライン２６１２は、約１５Ｌの容積を有する第１のバイオリアクター１０２を使用した結果を表す。示されるように、撹拌速度が増加するにつれて、剪断応力も増加する。

【0177】

図２６Ｄは、撹拌速度を表すＸ軸２６３４と、容積平均速度を表すＹ軸２６３６と、を含むグラフ２６３２である。グラフ２６２６は、約０．１Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６を使用することに関連付けられた結果を表す第１のライン２６０６を含み、第２のライン２６０８は、約０．５Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６を使用することに関連付けられた結果を表し、第３のライン２６１０は、約３Ｌの容積を有する第１のバイオリアクター１０２を使用した結果を表し、第４のライン２６１２は、約１５Ｌの容積を有する第１のバイオリアクター１０２を使用した結果を表す。示されるように、撹拌速度が増加するにつれて、平均速度も増加する。

【0178】

図２６Ｅは、撹拌速度を表すＸ軸２６４０と、容積パーセントを表すＹ軸２６３６と、を含むグラフ２６３８である。図２６Ｆは、図２６Ｅのグラフ２６３８の一部分のより詳細な図を示す。グラフ２６３８は、ホイール１２０が約６０ＲＰＭで回転するときに約０．１Ｌの容積を有するバイオリアクター１０２、１０６を使用することに関連付けられた結果を表す第１のライン２６４４、ホイール１２０が約３０ＲＰＭで回転するときに約０．５Ｌの容積を有するバイオリアクター１０２、１０６を使用することに関連付けられた結果を表す第２のライン２６４６、ホイール１２０が約２０ＲＰＭで回転するときに約３Ｌの容積を有するバイオリアクター１０２を使用した結果を表す第３のライン２６４８、およびホイール１２０が約１３ＲＰＭで回転するときに約１５Ｌの容積を有するバイオリアクター１０２、１０６を使用した結果を表す第４のライン２６５０を含む。グラフ２６３８はまた、ホイール１２０が約４０ＲＰＭで回転するときに約０．５Ｌの容積を有するバイオリアクター１０２、１０６を使用した結果を表す第５のライン２６５５も含む。

【0179】

示される例では、ライン２６４４、２６４６、２６４８、２６５０の各々は、バイオリアクター１０２、１０６における懸濁液の体積内の実際のＥＤＲデータ点を含み、ライン２６４４、２６４６、２６４８、２６５０の急な負の傾きに基づいて、実際のＥＤＲ点の大部分の大きさは、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満のＥＤＲ値を有する（参照番号２６５０を参照のこと）。例えば、第１のライン２６４４について、ＥＤＲ値の約９７．５７％は、約６．１Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３（参照番号２６５２を参照のこと）～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３（参照番号２６５４を参照のこと）に配置される。９７．５７％の値は、約６．１Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３での９１．５１容積パーセント値と、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３での６．０６％値を加えることによって決定される。第１のライン２６４４について、ＥＤＲ値の約９７．５７％は、約６．１Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３（参照番号２６５２を参照のこと）～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３（参照番号２６５４を参照のこと）に配置される。第２のライン２６４６について、ＥＤＲ値の約８０．７８％は、約６．１Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３に配置される。第３のライン２６４８について、ＥＤＲ値の約９１．９８％は、約６．１Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３に配置される。第４のライン２６５０について、ＥＤＲ値の約８７．１８％は、約６．１Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３に配置される。

【0180】

以下の表１は、開示された実施態様を使用した実験から得られたデータを含む。表に示すように、約０．１Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６が約６０ＲＰＭで動作するとき、ＥＤＲ値の約９７．５７％が、約０．０ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３に配置され、約０．５Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６が約３０ＲＰＭで動作するとき、ＥＤＲ値の約８０．７８％が、約０．０ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３に配置され、約０．５Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６が約４０ＲＰＭで動作するとき、ＥＤＲ値の約６２．２１％が、約０．０ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３に配置され、約３．０Ｌの容積を有する第１のバイオリアクター１０２が約２０ＲＰＭで動作するとき、ＥＤＲ値の約９１．９８％が、約０．０ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３に配置され、約１５Ｌの容積を有する第１のバイオリアクター１０２が約１３ＲＰＭで動作するとき、ＥＤＲ値の約８７．１８％が、約０．０ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３に配置される。

【0181】

さらに、表に示すように、約０．１Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６が約６０ＲＰＭで動作するとき、ＥＤＲ値の約９９．８０％が、約０．０ｍ^２／ｓ^３～約１．０Ｅ－０２ｍ^２／ｓ^３に配置され、約０．５Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６が約３０ＲＰＭで動作するとき、ＥＤＲ値の約９５．３８％が、約０．０ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３に配置され、約０．５Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６が約４０ＲＰＭで動作するとき、ＥＤＲ値の約８７．７２％が、約０．０ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３に配置され、約３．０Ｌの容積を有する第１のバイオリアクター１０２が約２０ＲＰＭで動作するとき、ＥＤＲ値の約９９．１４％が、約０．０ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３に配置され、約１５Ｌの容積を有する第１のバイオリアクター１０２が約１３ＲＰＭで動作するとき、ＥＤＲ値の約９６．８８％が、約０．０ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３に配置され、約０．５Ｌの容積を有する第２のバイオリアクター１０６が約４０ＲＰＭで動作するとき、ＥＤＲ値の約６２．２１％が、約０．０ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３に配置される。

【表1】

【0182】

いくつかの実施態様では、第２のバイオリアクター１０６が、例えば、約４０ＲＰＭで動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約６０％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。例えば、１つのバージョンでは、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、ＥＤＲ値のうちの約６２．２１％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であり、より具体的には、約３．０Ｅ－０４ｍ２／ｓ３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約２０％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約２０％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約２５％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約２５％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約３０％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約３０％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約３５％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約３５％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約４０％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約４０％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約４５％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約４５％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約５０％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約５０％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約５５％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約５５％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約６０％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約６０％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約６５％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約６５％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約７０％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約７０％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約７５％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約７５％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約８０％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約８０％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約８５％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約８５％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約９０％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約９９％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約９５％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約９５％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約９７％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、約９７％～約９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。他の実施態様では、第２のバイオリアクターが動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも約９９％は、約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３未満であるか、または例えば、第２のバイオリアクター１０６が、約４０ＲＰＭで動作するとき、ＥＤＲ値のうちの少なくとも９９％は、約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３であり、その間、同様のサイズおよび／または形状を有する細胞を増殖させることができる。

【0183】

より一般的に、複数の実際のＥＤＲデータ点のうちの少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の大きさは、約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満である。他の実施態様では、第２のバイオリアクターの動作中の第２のバイオリアクターにおける、（ａ）約０．００１５ｍ^２／ｓ^３未満、（ｂ）約０．００２ｍ^２／ｓ^３未満、（ｃ）約０．００２５ｍ^２／ｓ^３未満、または（ｄ）約０．００３ｍ^２／ｓ^３未満である実際のＥＤＲデータ点のパーセンテージは、約６０％～約９９％、約６０％～約９７％、約６０％～約９５％、約６０％～約９０％、約６０％～約８５％、約６０％～約８０％、約６０％～約７５％、約６０％～約７０％、約６０％～約６５％、約６５％～約９９％、約６５％～約９７％、約６５％～約９５％、約６５％～約９０％、約６５％～約８５％、約６５％～約８０％、約６５％～約７５％、約６５％～約７０％、約７０％～約９９％、約７０％～約９７％、約７０％～約９５％、約７０％～約９０％、約７０％～約８５％、約７０％～約８０％、約７０％～約７５％、約７５％～約９９％、約７５％～約９７％、約７５％～約９５％、約７５％～約９０％、約７５％～約８５％、約７５％～約８０％、約８０％～約９９％、約８０％～約９７％、約８０％～約９５％、約８０％～約９０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９９％、約８５％～約９７％、約８５％～約９５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９９％、約９０％～約９７％、約９０％～約９５％、約９５％～約９９％、または約９５％～約９７％の範囲である。

【0184】

他の実施態様では、第２のバイオリアクターの動作中の第２のバイオリアクターにおける、（ａ）約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３、（ｂ）約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約０．００２ｍ^２／ｓ^３、（ｃ）約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～０．００２５ｍ^２／ｓ３、または（ｄ）約３．０Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３～約０．００３ｍ^２／ｓ^３である実際のＥＤＲデータ点のパーセンテージは、約６０％～約９９％、約６０％～約９７％、約６０％～約９５％、約６０％～約９０％、約６０％～約８５％、約６０％～約８０％、約６０％～約７５％、約６０％～約７０％、約６０％～約６５％、約６５％～約９９％、約６５％～約９７％、約６５％～約９５％、約６５％～約９０％、約６５％～約８５％、約６５％～約８０％、約６５％～約７５％、約６５％～約７０％、約７０％～約９９％、約７０％～約９７％、約７０％～約９５％、約７０％～約９０％、約７０％～約８５％、約７０％～約８０％、約７０％～約７５％、約７５％～約９９％、約７５％～約９７％、約７５％～約９５％、約７５％～約９０％、約７５％～約８５％、約７５％～約８０％、約８０％～約９９％、約８０％～約９７％、約８０％～約９５％、約８０％～約９０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９９％、約８５％～約９７％、約８５％～約９５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９９％、約９０％～約９７％、約９０％～約９５％、約９５％～約９９％、または約９５％～約９７％の範囲である。

【0185】

他の実施態様では、複数の実際のＥＤＲデータ点のうちの少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の大きさは、約０．００２ｍ^２／ｓ^３未満、約０．００２５ｍ^２／ｓ^３未満、または約０．００３ｍ^２／ｓ^３未満のエネルギー散逸率の値を有する。

【0186】

図２７は、撹拌速度を表すＸ軸２６５６と、容積パーセントを表すＹ軸２６５８と、を含むグラフ２６５４である。グラフ２６３８は、約６０ＲＰＭで回転するホイールとともに約０．５Ｌの容積を有するバイオリアクターを使用することに関連付けられた結果を表す第１のライン２６６０を含む。バイオリアクターは、水平バイオリアクターまたは垂直バイオリアクターであってもよい。示されるように、第１のライン２６６０の傾きは、図２６Ｅのライン２６４４、２６４６、２６４８、２６５０の傾きと比較して比較的緩やかであり、ボックス２６１４の外側にある撹拌速度（図２６Ａを参照のこと）に関連付けられる。したがって、６０ＲＰＭの撹拌速度で、このようなバイオリアクター内で増殖した細胞は、同様の形状および／またはサイズを有しない場合がある。

【0187】

図２８は、閾値範囲内の目標ＶＡ ＥＤＲを有すること、ならびに約１．５Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３の上限閾値を下回るＥＤＲ値の大部分または少なくとも一部を有することの組み合わせによって得られた生物学的結果３１００を示す。この結果では、第１の行３１０２および第２の行３１０２は、第２のバイオリアクター１０６を使用する２つの異なる容積で約６．１Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３の所望の目標ＶＡ ＥＤＲを達成するための撹拌速度を示す。視覚的に、１日目からでも、集合体のサイズおよび形状の分布が類似している。第３の行３１０６は、約１．４Ｅ－０３ｍ^２／ｓ^３の異なる目標ＶＡ ＥＤＲ、および０．５Ｌバイオリアクター内の対応して、より高い撹拌速度を表す。最初は、１日目に、集合体は比較的小さいサイズであるが、３日目以降に、集合体は、より低い目標ＶＡ ＥＤＲで形成されたもの（それは依然として閾値範囲内である）に類似するように見える。第４の行３１０８は、閾値範囲の外側（未満）にある、約１．４Ｅ－０４ｍ^２／ｓ^３の目標ＶＡ ＥＤＲの例である。閾値範囲の外側にある結果として、集合体は、サイズおよび／または形状においてより多くの変動を有し、７日目以降、集合体は、液体中で懸濁することができないか、または懸濁する傾向がより少ないほど一緒に凝集している。また、バイオリアクター容積および撹拌速度の各組み合わせについて、閾値範囲内に収まるすべてのＥＤＲ値について対応する％が存在する（それぞれ、行１、２、３について、約９８％、８１％、６２％）。同様のサイズおよび形状の集合体の均一または実質的に均一な分布は、これらの３つすべての流体力学的条件を使用して達成した。

【0188】

図２９Ａは、時間を日数で表すＸ軸２８０２と、生存細胞をｍＬで表すＹ軸２８０４と、を含むグラフ２８００である。グラフ２８００は、ホイール１２０が約６０ＲＰＭで回転するときに約０．１Ｌの容積を有するバイオリアクター１０２、１０６を使用することに関連付けられた結果を表す第１のライン２８０６、ホイール１２０が約３０ＲＰＭで回転するときに約０．５Ｌの容積を有するバイオリアクター１０２、１０６を使用することに関連付けられた結果を表す第２のライン２８０８、およびホイール１２０が約４０ＲＰＭで回転するときに約０．５Ｌの容積を有するバイオリアクター１０２、１０６を使用することに関連付けられた結果を表す第３のライン２８１０を含む。示されるように、日数が増加するにつれて、生存細胞の数も増加する。

【0189】

図２９Ｂは、図２９Ａと関連して行われた実験からの結果を表すグラフ２８５０であり、第２のバイオリアクター１０６のホイール１２０が動作した撹拌速度を表すＸ軸２８５２と、平均７日目の集合体直径を表すｙ軸２８５４と、を含む。有利には、示されるように、異なる撹拌速度で第２のバイオリアクター１０６を使用して増殖した細胞の直径は、比較的類似しており、約２７０ミクロン～約３２０ミクロンである。

【0190】

図２９Ｃは、図２８Ａおよび２８Ｂに関連して行われた実験からの結果を表す画像結果２９００である。示されるように、画像２９０２、２９０４、および２９０６は、各々、細胞が７日間増殖した後に実質的に類似した形状および／またはサイズを有する細胞２９０８を有する。結果２９００は、集合体が平均直径において統計的に類似しており、単一の標準偏差のエラーバーが重複していることを示す。

【0191】

上述の概念および以下でより詳細に論じられる追加の概念のすべての組み合わせ（そのような概念が相互に矛盾しないことを条件とする）は、本明細書に開示される主題の一部として企図されることを理解されたい。特に、本開示の最後に現れる特許請求される主題のすべての組み合わせは、本明細書に開示される主題の一部として企図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図26E】

【図26F】

【図27】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【国際調査報告】