特表 2023-517939 オーロラＡキナーゼの分解のためのタンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-27

(54)【発明の名称】オーロラＡキナーゼの分解のためのタンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/54 20170101AFI20230420BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230420BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230420BHJP

   A61K 31/454 20060101ALI20230420BHJP

   A61K 31/55 20060101ALI20230420BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230420BHJP

   C07D 401/04 20060101ALN20230420BHJP

   C07D 487/04 20060101ALN20230420BHJP

【ＦＩ】

A61K47/54

A61P35/00

A61P35/02

A61K31/454

A61K31/55

A61P43/00 105

C07D401/04

C07D487/04 150

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022554480

(86)(22)【出願日】2021-03-10

(85)【翻訳文提出日】2022-11-08

(86)【国際出願番号】 EP2021056048

(87)【国際公開番号】W WO2021180787

(87)【国際公開日】2021-09-16

(31)【優先権主張番号】20162690.0

(32)【優先日】2020-03-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】510232393

【氏名又は名称】ユリウス・マクシミリアンス－ウニヴェルジテート・ヴュルツブルク

【氏名又は名称原語表記】Ｊｕｌｉｕｓ Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｓ－Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和 清司

(72)【発明者】

【氏名】ヴォルフ，エルマー

(72)【発明者】

【氏名】アイラース，マルティン

【テーマコード（参考）】

4C050

4C063

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C050AA01

4C050AA07

4C050BB08

4C050CC10

4C050DD10

4C050EE03

4C050FF01

4C050GG02

4C050GG03

4C050GG04

4C050HH01

4C063AA01

4C063BB02

4C063CC11

4C063DD07

4C063EE01

4C076AA95

4C076CC41

4C076CC42

4C076DD33

4C076DD39

4C076EE23

4C076EE59

4C076FF34

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA04

4C086BC22

4C086CB11

4C086GA07

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZB27

(57)【要約】

本発明は、哺乳動物の細胞におけるオーロラＡキナーゼの分解のためのタンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）またはその薬学的許容し得る塩に関し、ＰＲＯＴＡＣは、化学構造ＡＡＢ－Ｌ－Ｅ３Ｂを有し、式中ＡＡＢは、オーロラＡについての結合ユニットであり、Ｌは、リンカーであり、およびＥ３Ｂは、Ｅ３ユビキチンリガーゼセレブロンについての結合ユニットであり、ここでＥ３Ｂは、サリドマイドの構造、またはその類似体レナリドマイド、ポマリドミド、およびアプレミラストのうちの１つの構造を含み、ここでＬは、アルキルエーテル残基もしくはポリアルキルエーテル残基、または少なくとも１つのＣ－Ｃ結合がＣ＝Ｃ二重結合によって置き換えられているアルキルエーテル残基もしくはポリアルキルエーテル残基を含むか、あるいはこれからなり、ポリアルキルエーテル残基は、少なくとも２つのエーテル基、または１個のＯ原子がＳ原子によって置き換えられているかもしくは一部のＯ原子がＳ原子によって置き換えられている少なくとも２つのエーテル基を有し、あるいは、ここでＬは、アルキルチオエーテル残基もしくはポリアルキルチオエーテル残基、または少なくとも１つのＣ－Ｃ結合がＣ＝Ｃ二重結合によって置き換えられているアルキルチオエーテル残基もしくはポリアルキルチオエーテル残基を含むか、あるいはこれからなり、ポリアルキルチオエーテル残基は、少なくとも２つのチオエーテル基を有し、ここでＬは、ＡＡＢおよびＥ３Ｂを、５～１３個の続いて配置される原子を有する原子鎖を介して連結し、ここでリンカーをＡＡＢおよびＥ３Ｂと連結する官能基の原子は、該鎖の一部とはみなされない。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳動物の細胞におけるオーロラＡキナーゼの分解のためのタンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）またはその薬学的許容し得る塩であって、そのＰＲＯＴＡＣは、化学構造ＡＡＢ－Ｌ－Ｅ３Ｂを有し、
式中ＡＡＢは、オーロラＡについての結合ユニットであり、Ｌは、リンカーであり、およびＥ３Ｂは、Ｅ３ユビキチンリガーゼセレブロンについての結合ユニットであり、
ここでＥ３Ｂは、サリドマイドの構造、またはその類似体レナリドマイド、ポマリドミド、およびアプレミラストのうちの１つの構造を含み、
ここでＬは、アルキルエーテル残基もしくはポリアルキルエーテル残基、または少なくとも１つのＣ－Ｃ結合がＣ＝Ｃ二重結合によって置き換えられているアルキルエーテル残基もしくはポリアルキルエーテル残基を含むか、あるいはこれからなり、そのポリアルキルエーテル残基は、少なくとも２つのエーテル基、または１個のＯ原子がＳ原子によって置き換えられているかもしくは一部のＯ原子(複数)がＳ原子(複数)によって置き換えられている少なくとも２つのエーテル基であり、あるいは、
ここでＬは、アルキルチオエーテル残基もしくはポリアルキルチオエーテル残基、または少なくとも１つのＣ－Ｃ結合がＣ＝Ｃ二重結合によって置き換えられているアルキルチオエーテル残基もしくはポリアルキルチオエーテル残基を含むか、あるいはこれからなり、そのポリアルキルチオエーテル残基は、少なくとも２つのチオエーテル基を有し、
ここでアルキルエーテル残基、ポリアルキルエーテル残基、アルキルチオエーテル残基、またはポリアルキルチオエーテル残基は、少なくとも１つの位置にて、アミノ基、ヒドロキシル基、またはカルボニル基によって任意に置換されており、
ここでＬは、ＡＡＢおよびＥ３Ｂを、５～１３個の続いて配置される原子を有する原子鎖を介して連結し、ここでリンカーをＡＡＢおよびＥ３Ｂと連結する官能基の原子は、該鎖の一部とはみなされず、ここで官能基は、－ＮＨ－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＳＯ－、および－ＣＯＳ－から選択される、前記ＰＲＯＴＡＣ。

【請求項2】

Ｌは、アミド結合Ａ、とりわけペプチド結合Ａを介して、ＡＡＢに結合されているか、および／または、Ｌは、アミド結合Ｂ、とりわけペプチド結合Ｂを介して、Ｅ３Ｂに結合されている、請求項１に記載のＰＲＯＴＡＣ。

【請求項3】

アミド結合ＡのＨ原子は、アルキル残基Ａ、とりわけメチル残基Ａまたはエチル残基Ａによって、置換されているか、および／または、アミド結合ＢのＨ原子は、アルキル残基Ｂ、とりわけメチル残基Ｂまたはエチル残基Ｂによって、置換されている、請求項２に記載のＰＲＯＴＡＣ。

【請求項4】

Ｌは、少なくとも２個のＯ原子か、少なくとも２個のＳ原子か、または少なくとも１個のＯ原子および少なくとも１個のＳ原子を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＰＲＯＴＡＣ。

【請求項5】

Ｌは、直鎖状の分子残基であり、および／または該原子鎖は、６～１３個の続いて配置される原子、とりわけ６～１０個の続いて配置される原子を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のＰＲＯＴＡＣ。

【請求項6】

Ｌは、以下の部分：
－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－および
－ＣＨ_２－（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２）_２－ＣＨ_２－
のいずれかである、請求項１～５のいずれか一項に記載のＰＲＯＴＡＣ。

【請求項7】

ＡＡＢは、アリセルチブの構造、（３－クロロ－２－フルオロフェニル）［４－［［６－（２－チアゾリルアミノ）－２－ピリジニル］メチル］－１－ピペラジニル］－メタノン（ＭＫ－８７４５）または１－［４－（｛４－［（５－シクロペンチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）アミノ］ピリミジン－２－イル｝アミノ）フェニル］－３－［３－（トリフルオロメチル）フェニル］尿素（ＣＤ５３２）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＰＲＯＴＡＣ。

【請求項8】

ＡＡＢは、アリセルチブの構造を含み、これは、アリセルチブのカルボキシ基およびＬのアミノ基から形成されるペプチド結合を介して、Ｌに結合される、請求項７に記載のＰＲＯＴＡＣ。

【請求項9】

ＰＲＯＴＡＣは、以下の化合物のいずれかである、請求項１～８のいずれか一項に記載のＰＲＯＴＡＣ：

【化1】

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載のＰＲＯＴＡＣを合成するための方法であって、
２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）オキシ）酢酸（化合物ａ）

【化2】

が、非プロトン性溶媒に溶解され、
（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）またはトリメチルアミンと、構造「ＮＨ_２－アルキルエーテル残基－ＮＨ－アミン保護基」、「ＮＨ_２－ポリアルキルエーテル残基－ＮＨ－アミン保護基」、「ＮＨ_２－アルキルチオエーテル残基－ＮＨ－アミン保護基」、または「ＮＨ_２－ポリアルキルチオエーテル残基－ＮＨ－アミン保護基」を有するリンカー前駆体との添加がそれに続き、ならびに、
さらに、中間体産物をもたらすインキュベーションがそれに続き、
次いで前記中間体産物が脱保護されて、化合物ｂ

【化3】

がもたらされ、
ここでポリアルキルエーテル残基は、少なくとも２つのエーテル基、または少なくとも１個のＯ原子がＳ原子によって置き換えられている少なくとも２つのエーテル基を有し、およびポリアルキルチオエーテル残基は、少なくとも２個のＳ原子を有し、
ここでアルキルエーテル残基、ポリアルキルエーテル残基、アルキルチオエーテル残基、またはポリアルキルチオエーテル残基は、５～１３個の続いて配置される原子を有する原子鎖を有し、
ここでアルキルエーテル残基、ポリアルキルエーテル残基、アルキルチオエーテル残基、またはポリアルキルチオエーテル残基の、直鎖状の原子配列はいずれも、１７個の原子数を超えず、
ここで化合物ｂが、非プロトン性溶媒に溶解され、（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、アリセルチブ、およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）またはトリメチルアミンの添加がそれに続き、およびさらにインキュベーションがそれに続き、化合物ｃ

【化4】

がもたらされる、前記方法。

【請求項11】

溶媒は、極性溶媒、とりわけジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）であり、および／または、アミン保護基は、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

リンカー前駆体は、以下の化合物１および２：
１．ＮＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｂｏｃ
２．ＮＨ_２－ＣＨ_２－（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２）_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｂｏｃ
のいずれかである、請求項１０または１１に記載の方法。

【請求項13】

人または別の哺乳動物のがんの処置における使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載のＰＲＯＴＡＣ。

【請求項14】

がんは、白血病、神経芽細胞腫、肝細胞癌、または骨肉腫である、請求項１３に記載のＰＲＯＴＡＣ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、オーロラＡキナーゼの分解のためのタンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）またはその薬学的許容し得る塩に関する。ＰＲＯＴＡＣは、化学構造ＡＡＢ－Ｌ－Ｅ３Ｂを有し、ここで、ＡＡＢは、オーロラＡキナーゼについての結合ユニットであり、Ｌは、連結ユニットであり、およびＥ３Ｂは、Ｅ３ユビキチンリガーゼセレブロンについての結合ユニットである。

【背景技術】

【0002】

ＵＳ２０１９／０２１０９９６Ａ１は、式「標的タンパク質バインダー－リンカー－セレブロンバインダー」の化合物またはその薬学的許容し得る塩を開示し、式中、標的タンパク質は、数個のキナーゼのうちの１つ、とりわけ、オーロラＡキナーゼである。リンカーは、最も短い長さで４～２０個の原子である、化学的なリンカー基である。それは、１個以上の炭素原子が－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－、－ＣＯ－、ピペリジン、ピペラジン、ピリミジンおよびピリジンから独立して選択される基によって置き換えられている、４～２０個の炭素原子の直鎖アルキレン基であってもよい。セレブロン結合部分は、サリドマイド、ポマリドミドまたはレナリドマイドであってもよい。ＵＳ２０１９／０２１０９９６Ａ１はさらに、治療的に有効な量の化合物またはその薬学的許容し得る塩を、それを必要とするヒトに投与することを含む、標的タンパク質を変性させる方法を開示する。

【0003】

ＷＯ２０１８／０９８２８０Ａ１は、式（標的リガンド）－（リンカー）－（デグロン）の二機能性化合物を開示し、式中、標的リガンドは、１以上のタンパク質キナーゼに結合することができ；リンカーは、標的リガンドおよびデグロンに共有結合的に結合する基であり；およびデグロンは、ユビキチンリガーゼに結合することができる。多くの実行可能な標的リガンド、リンカーおよびデグロンは、文献において言及されている。
ＷＯ２０１７／２０１４４９Ａ１から、抗体－ＰＲＯＴＡＣ抱合体は、知られている。ＰＲＯＴＡＣは、タンパク質結合基に共有結合的に結合されたリンカーに共有結合的に結合されたＥ３リガーゼ結合基を含む。Ｅ３リガーゼ結合基は、セレブロンを含む基から選択されるＥ３リガーゼを結合する基であってもよい。

【0004】

Ｅ３リガーゼ結合基は、とりわけ、サリドマイド、レナリドマイドおよびポマリドミドを含む群から選択されてもよい。タンパク質結合基は、多数の他のタンパク質の中でオーロラＡを結合する基であってもよい。

【0005】

Wang, Y. et al., Acta Pharm Sin B, 2020, 10(2), pages 207-238は、ＰＲＯＴＡＣおよび他のストラテジーによるタンパク質の分解に関する。それは、リンカーおよびＥ３ユビキチンリガーゼセレブロンについての結合ユニットを含むセレブロンをベースとしたＰＲＯＴＡＣを開示し、その結合ユニットは、サリドマイド、レナリドマイドまたはポマリドミドであってもよい。

【発明の概要】

【0006】

本発明によって解決されるべき課題は、代替のＰＲＯＴＡＣ、そのＰＲＯＴＡＣを合成するための方法、および、医療処置における使用のための該ＰＲＯＴＡＣを提供することである。

【0007】

課題は、請求項１、１０、および１３の特徴によって解決される。本発明の態様は、請求項２～９、１１、１２および１４の主題である。

【0008】

本発明に従って、哺乳動物の細胞においてオーロラＡキナーゼの分解のためのタンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）または該ＰＲＯＴＡＣの薬学的に許容し得る塩が、提供される。ＰＲＯＴＡＣは、化学構造ＡＡＢ－Ｌ－Ｅ３Ｂを有し、式中、ＡＡＢは、オーロラＡキナーゼについての結合ユニットであり、Ｌは、リンカーであり、およびＥ３Ｂは、Ｅ３ユビキチンリガーゼセレブロンについての結合ユニットであり、式中、Ｅ３Ｂは、サリドマイドの構造またはその類似体のレナリドマイド、ポマリドミド、およびアプレミラストの構造を含む。サリドマイドまたは該類似体の１つの構造を含むために、サリドマイドまたは類似体は、２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）オキシ）酢酸（化合物ａ）：

【化1】

におけるように、Ｌへのカップリングを促進するカップリング部分にカップリングされてもよい。

【0009】

Ｌは、アルキルエーテル残基またはポリアルキルエーテル残基、または１つ以上のＣ－Ｃ結合がＣ＝Ｃ二重結合によって置き換えられている、アルキルエーテル残基またはポリアルキルエーテル残基を含むかまたはこれからなり、ポリアルキルエーテル残基は、少なくとも２のエーテル基を有し、ここで、１個のＯ原子は、Ｓ原子によって置き換えられているか、または、Ｏの一部は、Ｓ原子によって置き換えられている。代替的に、Ｌは、アルキルチオエーテル残基またはポリアルキルチオエーテル残基、または１つ以上のＣ－Ｃ結合がＣ＝Ｃ二重結合によって置き換えられている、アルキルチオエーテル残基またはポリアルキルチオエーテル残基を含むまたはこれからなることが可能であり、ここで、ポリアルキルチオエーテル残基は、少なくとも２のチオエーテル基を有する。

【0010】

Ｌは、５～１３個の続いて配置される原子を有する原子鎖を介して、ＡＡＢおよびＥ３Ｂを連結し、ここで、リンカーをＡＡＢおよびＥ３Ｂと連結する官能基の原子は、該鎖の一部とみなされない。このことは、アルキルエーテル残基、ポリアルキルエーテル残基、１つ以上のＣ－Ｃ結合がＣ＝Ｃ二重結合によって置き換えられている、アルキルエーテル残基またはポリアルキルエーテル残基、アルキルチオエーテル残基、ポリアルキルチオエーテル残基、または１つ以上のＣ－Ｃ結合がＣ＝Ｃ二重結合によって置き換えられている、アルキルチオエーテル残基またはポリアルキルチオエーテル残基の原子の直鎖状配列のいずれもが、１３個の原子数を超えないことを意味する。

【0011】

この直鎖状配列は、ＡＡＢをＥ３Ｂと直接連結する原子配列よりも長い原子配列であってもい。リンカーをＡＡＢおよびＥ３Ｂと連結する官能基は、－ＮＨ－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＳＯ－または－ＣＯＳ－から選択される。

【0012】

本発明の本発明者らは、リンカーの長さは、ＰＲＯＴＡＣの機能に不可欠であることを認識している。さらに、彼らは、エーテル基（単数または複数）またはチオエーテル基（単数または複数）によって提供される親水性は、ＰＲＯＴＡＣとしての機能に重要であることを認識している。さらにまた、彼らは、セレブロン以外の、別のＥ３ユビキチンリガーゼについての結合ユニット（例えば、フォンヒッペル・リンドウ腫瘍サプレッサー（ＶＨＬ））が、機能的なＰＲＯＴＡＣを結果として生じないことを認識している。本発明者らは、本発明に従うＰＲＯＴＡＣにおける特定のリンカーを用いて達成される、セレブロンとオーロラＡとの間の特定の空間的関係が、ＰＲＯＴＡＣによるオーロラＡの欠乏を引き起こすのに重要であると推定する。

【0013】

Ｌは、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－または－ＣＨ_２－（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２）_２－ＣＨ_２－であってもよい。

【0014】

結合研究において、本発明者らは、本発明に従うＰＲＯＴＡＣは、オーロラＡに結合できるが、リンカーが短く、および、５個のみの続いて配置される原子鎖を介してＡＡＢおよびＥ３Ｂを連結するときに、結合は低減されることを見出した。さらに、本発明者らは、本発明に従うＰＲＯＴＡＣは、本発明に従うＰＲＯＴＡＣで処置した細胞において、オーロラＡ－Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体を形成できること、および、このＰＲＯＴＡＣは、該ＰＲＯＴＡＣで処置した細胞において、オーロラＡのほとんど完全な分解を達成できることを見出した。分解は、ヒト白血病細胞株のリンパ芽級およびヒト神経芽細胞腫、肝細胞癌および骨肉腫細胞株の細胞において観察された。さらにまた、ＰＲＯＴＡＣによるオーロラＡの欠乏は、がん細胞株のすべての試験細胞において、アポトーシスを誘導することが観察された。

【0015】

Ｌは、アミド結合Ａ、とりわけペプチド結合Ａを介して、ＡＡＢに結合されてもよい。代替的にまたは加えて、Ｌは、アミド結合Ｂ、とりわけペプチド結合Ｂを介して、Ｅ３Ｂに結合されてもよい。「Ａ」および「Ｂ」とのアミド結合およびペプチド結合の種類は、ＬのＡＡＢへの結合とＬのＥ３Ｂへの結合との間の区別のためのみに選択されている。しかしながら、アミド結合Ａそれ自体は、アミド結合Ｂそれ自体と同一であってもよく、および、ペプチド結合Ａそれ自体は、ペプチド結合Ｂそれ自体と同一であってもよい。Ｅ３Ｂは、レナリドマイドまたはポマリドミドの構造を含んでいる場合、Ｌは、レナリドマイドまたはポマリドミドのアミノ基の使用により、この構造に結合されてもよい。

【0016】

アミド結合ＡのＨ原子は、アルキル残基Ａ、とりわけメチル残基Ａまたはエチル残基Ａによって置換されてもよい。代替的にまたは加えて、アミド結合ＢのＨ原子は、アルキル残基Ｂ、とりわけメチル残基Ｂまたはエチル残基Ｂによって置換されてもよい。これは、分解（とりわけ加水分解による）に対してＰＲＯＴＡＣのアミド結合（単数または複数）を安定化する。上述のとおり、「Ａ」および「Ｂ」を有するメチル残基およびエチル残基の種類は、アミド結合Ａにおける、および、アミド結合Ｂにおける残基の分類のためのみに選択されるが、メチル残基Ａおよびメチル残基Ｂの構造ならびにエチル残基Ａおよびエチル残基Ｂの構造は、同一である。

【0017】

本発明の１つの態様において、Ｌは、少なくとも２個のＯ原子、少なくとも２個のＳ原子または少なくとも１個のＯ原子および少なくとも１個のＳ原子を含む。これにより、１個のみのＯ原子または１個のみのＳ原子を含むＰＲＯＴＡＣのそれよりも高い親水性を結果として生じる。より高い親水性は、オーロラＡキナーゼの分解に関するＰＲＯＴＡＣの効率を改善するようである。さらにまた、Ｌが、直鎖状分子残基であるとき、および／または、該原子鎖が、６～１３個の続いて配置される原子、とりわけ６～１２個の続いて配置される原子、とりわけ６～１１個の続いて配置される原子、とりわけ６～１０個の続いて配置される原子を有するときに、効率は、改善するようである。

【0018】

Ｃ＝Ｃ二重結合による１以上のＣ－Ｃ結合の置き換えは、リンカーの硬性を増加させる。

【0019】

１つの態様において、リンカーＬのアルキルエーテル残基、ポリアルキルエーテル残基、アルキルチオエーテル残基またはポリアルキルチオエーテル残基は、少なくとも１つの位置でアミノ基、ヒドロキシル基またはカルボニル基によって置換されている。これらの基は、オーロラＡおよびセレブロンとＰＲＯＴＡＣとの複合体を安定化するようである。

【0020】

ＡＡＢは、アリセルチブの構造、（３－クロロ－２－フルオロフェニル）［４－［［６－（２－チアゾリルアミノ）－２－ピリジニル］メチル］－１－ピペラジニル］－メタノン（ＭＫ－８７４５）または１－［４－（｛４－［（５－シクロペンチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）アミノ］ピリミジン－２－イル｝アミノ）フェニル］－３－［３－（トリフルオロメチル）フェニル］尿素（ＣＤ５３２）を含んでいてもよい。

【0021】

ＡＡＢがアリセルチブの構造を含むとき、この構造は、アリセルチブのカルボキシ基およびＬのアミノ基から形成されるペプチド結合を介して、Ｌに結合されてもよい。

【0022】

特定の態様において、ＰＲＯＴＡＣは、以下の化合物のいずれかである：

【化2】

【0023】

本発明はさらに、ＰＲＯＴＡＣを合成するための方法に関し、ここで、２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）オキシ）酢酸（化合物ａ）

【化3】

は、非プロトン性、とりわけ有機溶媒中、とりわけ保護ガス雰囲気下で溶解され、これに続き（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）またはトリメチルアミン、ならびに構造「ＮＨ２－アルキルエーテル残基－ＮＨ－アミン保護基」、「ＮＨ２－ポリアルキルエーテル残基－ＮＨ－アミン保護基」、「ＮＨ２－アルキルチオエーテル残基－ＮＨ－アミン保護基」または「ＮＨ２－ポリアルキルチオエーテル残基－ＮＨ－アミン保護基」を有するリンカー前駆体が添加され、および、これにさらにインキュベーションが続き、中間代謝物（次いで脱保護されて化合物ｂ

【化4】

【0024】

を結果として生じる）を結果として生じ、ここで、ポリアルキルエーテル残基は、少なくとも２のエーテル基、または少なくとも１個のＯ原子がＳ原子によって置き換えられている少なくとも２のエーテル基を有し、および、ポリアルキルチオエーテル残基は、少なくとも２個のＳ原子を有し、ここで、アルキルエーテル残基、ポリアルキルエーテル残基、アルキルチオエーテル残基、またはポリアルキルチオエーテル残基は、５～１７個、とりわけ６～１３個、とりわけ６個～１０個の続いて配置される原子を有する原子鎖を有し、ここで、アルキルエーテル残基、ポリアルキルエーテル残基、アルキルチオエーテル残基、またはポリアルキルチオエーテル残基の直鎖状の原子の配列はいずれも、１７個の原子数を超えず、ここで、化合物ｂは、非プロトン性、とりわけ有機溶媒中に、とりわけ保護ガス雰囲気下で溶解され、これに続き、（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、アリセルチブおよびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）またはトリメチルアミンが添加され、および、これにインキュベーションがさらに続き、化合物ｃ

【化5】

を結果として生じる。

【0025】

２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）オキシ）酢酸は、Remillard, D. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, pages 5738 to 5743に関する“Supporting Information”において記載されるように合成されてもよい。保護ガスは、アルゴンまたは窒素であってもよい。第一および第二のインキュベーションの間のｐＨ値は、１２より高いようにチェックされてもよく、および、もしそれが１２よりも高くないとき、１２より高い値に調整されてもよい。溶媒は、極性溶媒、とりわけジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）であってもよい。溶媒は、その比誘電率が１５より高いときに、極性とみなされる。

【0026】

アミン保護基は、ｔｅｒ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）であってもよい。
リンカー前駆体は、以下の化合物１および２のいずれかであってもよい：
１．ＮＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｂｏｃ
２．ＮＨ_２－ＣＨ_２－（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２）_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｂｏｃ

【0027】

脱保護は、当該技術分野において知られているとおり、例えば、中間代謝物を精製することによって、および、中間代謝物を酸性条件に移すことによって、とりわけ、ジクロロメタンおよびトリフルオロ酢酸の混合物中にそれを溶解することによって、達成してもよい。

【0028】

本発明はさらに、人または別の哺乳動物のがんの処置における使用のための本発明に従うＰＲＯＴＡＣに関する。がんは、白血病、神経芽細胞腫、肝細胞癌または骨肉腫であってもよい。

【図面の簡単な説明】

【0029】

本発明の態様：

【図1】図１は、サリドマイド部分を有する化合物ＪＢ１５８、ＪＢ１５９、ＪＢ１６９、ＪＢ１７０、ＪＢ１７１の、ならびに、ＶＨＬリガンドを有する化合物ＪＢ１６０、ＪＢ１６１の、一般的な合成を図示的に示し、これらの化合物は、様々な（ポリ）エチレングリコール（ＰＥＧ）および脂肪族リンカーによって、アリセルチブに連結されている。

【図2】図２は、ヒト白血病細胞株ＭＶ４－１１の細胞からの内在性オーロラＡの免疫ブロットおよび定量化を示し、これらの細胞は、各場合において、単回用量の化合物ＪＢ１５８、ＪＢ１６０、ＪＢ１６１、ＪＢ１６９、ＪＢ１７０、ＪＢ１５９およびＪＢ１７１で、１μＭの濃度で処置された。ビンクリンは、免疫ブロットにおいてローディング対照として機能した。

【0030】

【図3】図３は、ＭＶ４－１１未処置細胞、ならびに、様々な濃度のＪＢ１７０（上のパネル）およびＪＢ１５８（下のパネル）で、ならびに、抱合されていないアリセルチブ（ｕＡ）で６時間処置した、ローディング対照としてビンクリンを用いる、細胞からの内在性オーロラＡの免疫ブロットを示す。

【図4】図４は、様々な濃度のＪＢ１７０（上のパネル）およびＪＢ１５８ （下のパネル）で、ならびに、抱合されていないアリセルチブ（ｕＡ）で６時間処置した、ローディング対照としてビンクリンを用いる、ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２ＯＳの細胞からの内在性オーロラＡの免疫ブロットを示す。

【0031】

【図5】図５は、様々な濃度のＪＢ１７０（上のパネル）およびＪＢ１５８（下のパネル）で、ならびに、抱合されていないアリセルチブ（ｕＡ）で６時間処置した、ローディング対照としてビンクリンを用いる、ヒト肝細胞癌細胞株ＨＬＥの細胞からの内在性オーロラＡの免疫ブロットを示す。

【図6】図６は、ＪＢ１７０で０．１μＭの濃度で指し示された期間処置した、ローディング対照としてビンクリンを用いる、ヒト神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ５の細胞からの内在性オーロラの免疫ブロットを示す。

【0032】

【図7】図７は、ＪＢ１５８で０．１μＭの濃度で指し示された期間処置した、ローディング対照としてビンクリンを用いる、ＨＬＥ細胞の細胞からの内在性オーロラＡの免疫ブロットを示す。

【図8】図８は、１μＭ ＪＢ１７０で処置したＭＶ４－１１細胞の細胞生存率を示す棒図表である。

【0033】

【図9】図９は、０．５μＭ ＪＢ１７０で処置し、およびアネキシンについて染色し、およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で処置したＭＶ４－１１細胞のアポトーシスを示す図表であり、ここで、初期（アネキシン＋、ＰＩ－）および後期（アネキシン＋、ＰＩ＋）アポトーシス細胞の量は、ＦＡＣＳによって分析した。

【図10】図１０は、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ（オーロラＡ^{Ｔ２１７Ｄ}））とともにインキュベーションした際の、オーロラＡ^{Ｔ２１７Ｄ}を発現するＩＭＲ５細胞（ＥｔＯＨ）およびＩＭＲ５細胞のアポトーシスを示す図表であり、これらの細胞は、０．５μＭ ＪＢ１７０で７２時間処置し、アネキシンについて染色され、および、ヨウ化プロピジウムで染色され、ＦＡＣＳによって分析された。

【発明を実施するための形態】

【0034】

本発明者らは、図１に図示的に示されるとおり、様々な（ポリ）エチレングリコール（ＰＥＧ）または脂肪族リンカーを介して、セレブロン結合部分としてのサリドマイドに、または、ＶＨＬ結合部分としてのＨＩＦ１由来ペプチド模倣物に、アリセルチブを連結することによって、オーロラＡ標的キメラ分解剤(degrader)を合成した。

【0035】

詳細には、合成は、以下のように実施された：
別様に述べられない限り、すべての反応は、室温（ＲＴ）にて実施された。化合物の構造および純度は、ＨＰＬＣ、質量分析およびＮＭＲによって確認された。

【0036】

サリドマイド誘導体－リンカーのカップリングのために、サリドマイド誘導体２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）オキシ）酢酸（化合物ａ）（３１０ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を、５ｍｌ ＤＭＦ中にアルゴン下で溶解し、およびＨＡＴＵ（４１８ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（３２４μｌ、１．８６ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）を添加した。

【0037】

ＲＴにて１５分の撹拌後、２ｍｌＤＭＦ中の夫々のリンカー１～５の溶液（１．１２ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）を添加し、および、反応混合物を終夜撹拌した。混合物を、分離漏斗に移し、および水（２０ｍｌ）および酢酸エチル（３０ｍｌ）で抽出した。層を分離し、および、水性層を、酢酸エチルで３回抽出した。有機層を併せて、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、および濃縮した。残渣を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９５：５を使用するフラッシュクロマトグラフィー（ＦＣ）で精製した。その結果得られる中間代謝物を、無色油として得た。中間代謝物を、ＤＣＭおよびトリフルオロ酢酸（６ｍｌ、４０ｖｏｌ．％）の混合物中に溶解した。３０分後、溶媒を減圧下で除去し、脱保護されたサリドマイド－リンカー中間体をＴＦＡ塩（ｃ～ｇ）として得た。反応は、以下の反応スキームで説明される：

【化6】

【0038】

中間体ｃ Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）オキシ）アセトアミド（Ｔｈ－ＰＥＧ１－ＮＨ２）は、２ステップ（第一 ７１％、第二 ９７％）にわたり、全収率６９％（３３９ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）で得られた。

【0039】

中間体ｄ Ｎ－（３－（２－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）－２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）オキシ）アセトアミド（Ｔｈ－ＰＥＧ３－ＮＨ２）は、２ステップ（第一 ６０％、第二 ９５％）にわたり、全収率５７％（２８５ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）で得られた。

【0040】

中間体ｅ Ｎ－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル）－２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）オキシ）アセトアミド（Ｔｈ－ＰＥＧ２－ＮＨ_２）は、２ステップ（第一 ７５％、第二 ９７％）にわたり、全収率７３％（３１６ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）で得られた。

【0041】

中間体ｆ Ｎ－（３－アミノプロピル）－２－［［２－（２，６－ジオキソ－３－ピペリジニル）－２，３－ジヒドロ－１，３－ジオキソ－１Ｈ－イソインドール－４－イル］オキシ］アセトアミドは、２ステップ（第一 ６３％、第二 ９５％）にわたり、全収率６０％（２３３ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）で得られた。

【0042】

中間体ｇ Ｎ－（５－アミノペンチル）－２－［［２－（２，６－ジオキソ－３－ピペリジニル）－２，３－ジヒドロ－１，３－ジオキソ－１Ｈ－イソインドール－４－イル］オキシ］アセトアミドは、２ステップ（第一 ６０％、第二 ８８％）にわたり、全収率５３％（２０６ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）で得られた。

【0043】

ＶＨＬ－リガンド－リンカーのカップリングのために、ＶＨＬリガンド化合物ｂ（９２ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を、アルゴン下で、フラスコ（Ａ）中の６ｍｌ ＤＭＦに溶解した（反応混合物（Ａ））。夫々のリンカー６～７（０．２３６ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）およびＨＡＴＵ（９２ｍｇ、０．２４１ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を、アルゴン雰囲気下、別のフラスコ（Ｂ）中の６ｍｌ ＤＭＦに溶解した（反応混合物（Ｂ））。両方のフラスコを、０℃に冷却した。ＤＩＰＥＡ（１１７μｌ、０．６５ｍｍｏｌ、４．０ｅｑ）をフラスコ（Ａ）に添加し、０．１２ｍｌ（１１７μｌ、０．６５ｍｍｏｌ、４ｅｑ）をフラスコ（Ｂ）に添加した。氷浴から取り出し、および、両方の溶液を、２０分撹拌し、次いでフラスコ（Ｂ）からの溶液を、フラスコ（Ａ）に移し、および反応混合物を終夜撹拌した。

【0044】

オレンジ色の混合物を、分離漏斗に移し、およびブラインを添加した。層を分離し、および、水性層を、ＤＣＭで５回抽出した。有機層を併せて、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、および減圧下で濃縮した。残存する残渣を、ＦＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１００：０－９５：５）で精製した。その結果得られる中間代謝物を、無色油として得た。中間代謝物を、ＤＣＭに溶解し、および、トリフルオロ酢酸（１０ｖｏｌ．％）を添加した。３０分後、溶媒を減圧下で除去し、脱保護されたＶＨＬ－リガンド－リンカー中間体を、遊離のＴＦＡ塩として得た（ｈ～ｉ）。反応は、以下の反応スキームにおいて説明される：

【化7】

【0045】

中間体ｈ Ｌ－プロリンアミド、Ｎ－［３－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］－１－オキソプロピル］－３－メチル－Ｌ－バリル－４－ヒドロキシ－Ｎ－［［４－（４－メチル－５－チアゾリル）フェニル］メチル］－（４Ｒ） （ＶＨＬ－ＰＥＧ２－ＮＨ_２））を、２ステップ（第一 ６１％、第二 ９７％）にわたり、全収率５９％（７５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）で得た。

【0046】

中間体ｉ Ｎ－［３－［２，２［２－アミノエトキシ－（２－アミノエトキシ）］エトキシ］－１－オキソプロピル］－３－メチル－Ｌ－バリル－４－ヒドロキシ－Ｎ－［［４－（４－メチル－５－チアゾリル）フェニル］メチル］－（４Ｒ）（ＶＨＬ－ＰＥＧ４－ＮＨ_２）を、２ステップ（第一 ５１％、第二 ９８％）にわたり、全収率５２％（７５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）で得た。

【0047】

中間体のカップリングのために、化合物ｃ～ｇ（サリドマイド誘導体）およびｈ～ｉ（ＶＨＬ－リガンド）、０．０２ｍｍｏｌ（１．０ｅｑ）を、１．５ｍｌＤＭＦに溶解した。ＨＢＴＵ（７．６ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を添加した。溶解後、アリセルチブ（１０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を添加し、これに続きＤＩＰＥＡ（１４μｌ、０．０８ｍｍｏｌ、４．０ｅｑ）を添加した。ｐＨは、より多くの等価物ＤＩＰＥＡを添加することによって、８～１０に調整した。反応混合物は、終夜撹拌した。溶媒は、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器を使用して除去した。残基は、精製し、および分取および分析ＨＰＬＣを介して特徴づけた。すべての反応は、ＪＢ１７０を除き、１０ｍｇアリセルチブを用いて行った。この化合物は、最初に５ｍｇおよび次いで５０ｍｇのアリセルチブを用いて合成された。反応は、以下の反応スキームにおいて説明される：

【化8】

【0048】

ＪＢ１５８サリドマイド－ＰＥＧ３－アリセルチブは、白色固体として収率９０％（１７ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）で得られた。

【0049】

ＪＢ１５９サリドマイド－（ＣＨ_２）_３－アリセルチブは、白色固体として収率７０％（１２ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）で得られた。
ＪＢ１６０ＶＨＬ－ＰＥＧ２－アリセルチブは、白色固体として、収率４３％（９ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）で得られた。
ＪＢ１６１ＶＨＬ－ＰＥＧ４－アリセルチブは、白色固体として、収率６２％（１４ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）で得られた。

【0050】

ＪＢ１６９サリドマイド－（ＣＨ_２）_５－アリセルチブは、白色固体として収率６１％（１１ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）で得られた。
ＪＢ１７０サリドマイド－ＰＥＧ２－アリセルチブは、白色固体として収率４８％（９ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）で得られた。
ＪＢ１７１サリドマイド－ＰＥＧ１－アリセルチブは、白色固体として収率 ７５％（１３ｍｇ ０，０１４ｍｍｏｌ）で得られた。

【0051】

産生能のあるオーロラＡ－Ｅ３リガーゼ複合体の形成
合成された分子のどれが、オーロラＡ－Ｅ３リガーゼ複合体の形成を媒介し、内在性オーロラＡの分解を結果として生じるかを試験するために、白血病細胞株ＭＶ４－１１の細胞を、０．１μＭサリドマイドをベースとしたＰＲＯＴＡＣ ＪＢ１５８、ＪＢ１６０、ＪＢ１６１、ＪＢ１６９またはＪＢ１７０で、または、１μＭ ＶＨＬ－リガンドをベースとしたＰＲＯＴＡＣ ＪＢ１５９またはＪＢ１７１で、夫々の化合物の単回用量で処置した。次いで、細胞は、プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビター（シグマ）を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ－１００、０．１％ＳＤＳ、０．１％デオキシコール酸ナトリウム）中に溶解し、２０分、４℃でヘッドオーバーテールでインキュベートした。ライセートは、遠心分離によって透明化した。タンパク質定量化は、ＢＣＡアッセイを使用して行い、および、等量のタンパク質を、ビストリス－ＰＡＧＥによって分離し、および、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。膜を、ＴＢＳ－Ｔ（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）中に溶解した５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳で、ＲＴで１時間ブロッキングし、および次いで、一次抗体とともに終夜４℃でインキュベートした。

【0052】

可視化は、ＨＲＰ標識二次抗体を用いて行い、および、化学発光ＨＲＰ基質 (Millipore)をLAS3000またはLAS4000 Mini(Fuji)において使用して検出した。シグナルは、ImageJ(version 1.52q)またはImage Studio Lite(LI-COR Biosciences, Version 5.2.5)を使用して定量化した。

【0053】

図２の上部は、オーロラＡの免疫ブロットを示す。ビンクリンを、ローディング対照として使用した。図２の下部の棒図表は、対照細胞のオーロラＡレベルと比較した、分解剤処置の際の細胞内オーロラＡレベルを示す。エラーバーは、４つの生物学的な複製実験の標準偏差を表す。

【0054】

ＶＨＬリガンドをベースとした分解剤ＪＢ１６０およびＪＢ１６１のいずれもオーロラＡの定常レベルを低減しなかったが、サリドマイドをベースとした分解剤ＪＢ１５８は、オーロラＡタンパク質レベルの６２％の低減を結果として生じ、およびサリドマイドをベースとした分解剤ＪＢ１７０は、６９％の低減を結果として生じた。最も強いオーロラＡ分解を結果として生じるこれらの２つの分解剤において、サリドマイドの構造とアリセルチブの構造との間の連結は、２つ（ＪＢ１７０）または３つ（ＪＢ１５８）エチレングリコール部分を有するリンカーによって提供される。両方の化合物は、ＪＢ１５８またはＪＢ１７０での処置の約３時間後にその最大に達するオーロラＡレベルの迅速な減少に繋がった。

【0055】

内在性オーロラＡの分解
細胞株ＭＶ４－１１、Ｕ２ＯＳおよびＨＬＥの細胞を、指し示された濃度の化合物ＪＢ１７０またはＪＢ１５８ならびに抱合されていないアリセルチブ（ｕＡ）で６時間処置した。さらなる実験において、細胞株ＩＭＲ５およびＨＬＥの細胞を、０．１μＭの化合物ＪＢ１７０で指し示された期間処置した。その後、細胞を、プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビター（シグマ）を含有する、ＲＩＰＡ溶解緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ－１００、０．１％ＳＤＳ、０．１％デオキシコール酸ナトリウム）中で溶解し、および、２０分間、４℃でヘッドオーバーテイルでインキュベートした。得られた細胞ライセートのさらなる処理および免疫ブロッティングを、上に記載のとおり実施した。ＪＢ１７０（上のパネル）およびＪＢ１５８（下のパネル）で処置した細胞株ＭＶ４－１１、Ｕ２ＯＳおよびＨＬＥの細胞についての結果は、図３～５に示す。０．１μＭのＪＢ１７０で指し示された期間処置した細胞についての結果を、細胞株ＩＭＲ５の細胞について図６に、および、細胞株ＨＬＥの細胞について図７に示す。

【0056】

図３上パネルに従って、オーロラＡレベルは、ＭＶ４－１１細胞において１０ｎＭ ＪＢ１７０の濃度で既に有意に減少し、および、ほとんど完全な分解は、１００ｎＭおよび１μＭにおいて観察された。他の分解剤／ＰＲＯＴＡＣと一致して、オーロラＡ欠乏活性の逆転が、高濃度のＪＢ１７０において観察された。この現象は、「フック効果」と呼ばれ、および、３元複合体形成に依存する分解剤分子について予測される。

【0057】

１μＭの抱合されていないアリセルチブは、オーロラＡレベルを減少させなかったが、それらの標的の活性状態を安定化するタイプ１キナーゼインヒビターについて頻繁に観察されるように、有意な増加を誘導した。図３下パネルにおいて示されるのと同様の結果が、ＪＢ１５８およびＵ２ＯＳ細胞（ＪＢ１７０を用いる図４下パネルおよびＪＢ１５８を用いる下パネル）およびＨＬＥ細胞（ＪＢ１７０を用いる図５上パネル、およびＪＢ１５８を用いる下パネル）で得られた。フック効果が可視化する欠乏および濃度の程度は、潜在的にセレブロンおよびオーロラＡの異なる細胞内濃度に起因して、細胞株間で有意に変化した。

【0058】

図６および７は、内在性オーロラＡの最大限の分解が、３～６時間後に既に、ＩＭＲ５細胞およびＨＬＥ細胞において生じたことを示す。

【0059】

本発明に従うＰＲＯＴＡＣによって引き起こされる細胞死
がん細胞生存に対するＪＢ１７０媒介性のオーロラＡの欠乏効果を決定するために、ＭＶ４－１１細胞を、ＪＢ１７０で処置して、および、レサズリンのレゾルフィンへの細胞内還元を測定して、アラマーブルーアッセイを介する細胞生存率を査定した。アラマーブルーアッセイについて、ウェル当たり６０００個の ＭＶ４－１１細胞を、９６ウェルプレートに播種し、および、１μＭ ＪＢ１７０で様々な時点について処置した（２４時間毎にリフレッシュした）。アラマーブルーアッセイ(Thermo Fisher Scientific)は、製造業者の指示に従って、ＨＳ細胞生存率試薬を使用して実施した。蛍光は、Tecan Infinite-200において蛍光励起波長５５０ｎｍおよび放射波長６００ｎｍを使用して測定した。７２時間後、生存細胞は、対照細胞と比較して、ＪＢ１７０によって３２％まで低減された（図８）。

【0060】

ドキシサイクリンとともにインキュベートした際にオーロラＡ^{Ｔ２１７Ｄ}を発現するＭＶ４－１１細胞およびＩＭＲ５細胞およびＩＭＲ５細胞を、０．５μＭ ＪＢ１７０で処置した。アネキシン－ＰＩ ＦＡＣＳのために、細胞が培養された培地を、細胞と併せた。細胞は、氷冷のＰＢＳで１回洗浄し、２μｌのアネキシンＶ／パシフィックブルー染料を含む、１００μｌアネキシンＶ結合緩衝剤（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２）中で再懸濁し、１５分間、暗中室温にてインキュベートした。ヨウ化プロピジウムを含む、４００μｌアネキシンＶ結合緩衝剤（１８．５μＭ）を添加して、および、試料は、分析まで、冷蔵して暗中で貯蔵した。ＦＡＣＳ実験は、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターに基づいて実施し、および、分析は、ＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェアおよびＦｌｏｗＪｏ（ｖｅｒｓｉｏｎ ８．８．６）を使用して行った。結果は、図９および１０に示す。

【0061】

図９は、ＪＢ１７０が、経時的に、培養物中のアポトーシス細胞の画分を増大させ、７２時間後にアネキシン陽性ＭＶ４－１１細胞の５６％に達したことを示す。
オーロラＡ^{Ｔ２１７Ｄ}は、オーロラＡの機能的突然変異体である。ＩＭＲ５細胞は、エタノールとともにインキュベーションする際ではなく（対照ＥｔＯＨ）、ドキシサイクリンとともにインキュベーションする際に（Ｄｏｘ）、オーロラＡ^{Ｔ２１７Ｄ}を発現する。オーロラＡ^{Ｔ２１７Ｄ}のアリセルチブ類似体ＭＬＮ８０５４に対する親和性は、オーロラＡのその類似体に対する親和性と比較して、約８倍低減する。

【0062】

図１０は、オーロラＡ^{Ｔ２１７Ｄ}の発現が、ＩＭＲ５細胞におけるＪＢ１７０によって誘導されるアポトーシスの誘導を完全に復帰させたことを示し、ＪＢ１７０誘導アポトーシスは、オーロラＡの欠乏によって排他的に引き起こされることを指し示す。
実験は、がん細胞の、本発明に従うＰＲＯＴＡＣへの暴露により、これらの細胞においてアポトーシスおよび細胞傷害性の強力な誘導を結果として生じたことを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【国際調査報告】