(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-27
(54)【発明の名称】ガス基質からの２－フェニルエタノールの発酵産生
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20230420BHJP
C12P 7/06 20060101ALI20230420BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20230420BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20230420BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P7/06
C12N15/31
C12N15/53
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022555717
(86)(22)【出願日】2021-01-15
(85)【翻訳文提出日】2022-09-14
(86)【国際出願番号】 US2021013723
(87)【国際公開番号】W WO2021188190
(87)【国際公開日】2021-09-23
(31)【優先権主張番号】62/991,428
(32)【優先日】2020-03-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518403425
【氏名又は名称】ランザテク，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100153693
【弁理士】
【氏名又は名称】岩田 耕一
(72)【発明者】
【氏名】リュー，ファンミン
(72)【発明者】
【氏名】コープケ，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ナガラジュ，シルパ
(72)【発明者】
【氏名】ハリス，オードリー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AC03
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA16
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA02X
4B065AA02Y
4B065AA23X
4B065AA23Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA06
4B065CA27
4B065CA28
4B065CA54
4B065CA55
(57)【要約】
一酸化炭素および／または二酸化炭素を含む基質の微生物発酵による２－フェニルエタノールの産生方法が本明細書に開示され、そのような方法で使用される遺伝子組換えされた微生物がさらに開示される。加えて、本明細書に開示されるプロセスは、天然プロセスおよび石油化学プロセスへの依存を緩和する改善された２－ＰＥ産生方法である。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
２－フェニルエタノールを産生することができる微生物であって、前記微生物が、（ａ）フェニルピルビン酸をフェニルアセトアルデヒドに変換する異種酵素と、
（ｂ）フェニルアセトアルデヒドを２－フェニルエタノールに変換する異種酵素と、を含む、微生物。
【請求項2】
前記微生物が、（ａ）フェニルピルビン酸をフェニルアセトアルデヒドに変換する前記異種酵素が、デカルボキシラーゼであり、
（ｂ）フェニルアセトアルデヒドを２－フェニルエタノールに変換する前記異種酵素が、フェニルアセトアルデヒドレダクターゼである、請求項１に記載の微生物。
【請求項3】
前記デカルボキシラーゼが、フェニルピルビン酸特異的デカルボキシラーゼである、請求項２に記載の微生物。
【請求項4】
前記微生物が、Ｃ１固定微生物である、請求項１に記載の微生物。
【請求項5】
前記微生物が、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物である、請求項１に記載の微生物。
【請求項6】
前記微生物が、細菌である、請求項１に記載の微生物。
【請求項7】
前記微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属のメンバーである、請求項１に記載の微生物。
【請求項8】
前記微生物が、フェニルピルビン酸を天然に産生することができる、請求項１に記載の微生物。
【請求項9】
前記微生物が、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２をアセチル－ＣｏＡに変換するＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項10】
前記微生物が、（ｃ）アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換する天然酵素、
（ｄ）ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する天然酵素、
（ｅ）ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸を２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸に変換する天然酵素、
（ｆ）２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸を３－デヒドロキナ酸に変換する天然酵素、
（ｇ）３－デヒドロキナ酸を３－デヒドロシキミ酸に変換する天然酵素、
（ｈ）３－デヒドロシキミ酸をシキミ酸に変換する天然酵素、
（ｉ）シキミ酸をシキミ酸３－リン酸に変換する天然酵素、
（ｊ）シキミ酸３－リン酸を５－Ｏ－（１－カルボキシビニル）－シキミ酸３－リン酸に変換する天然酵素、
（ｋ）５－Ｏ－（１－カルボキシビニル）－シキミ酸３－リン酸をコリスミ酸に変換する天然酵素、または
（ｌ）コリスミ酸をフェニルピルビン酸に変換する天然酵素のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項11】
（ｃ）アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換する前記天然酵素が、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素である、（ｄ）ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する前記天然酵素が、ピルビン酸リン酸ジキナーゼである、
（ｅ）ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸を２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸に変換する前記天然酵素が、２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸シンターゼである、
（ｆ）２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸を３－デヒドロキナ酸に変換する前記天然酵素が、３－デヒドロキナ酸シンターゼである、
（ｇ）３－デヒドロキナ酸を３－デヒドロシキミ酸に変換する前記天然酵素が、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼである、
（ｈ）３－デヒドロシキミ酸をシキミ酸に変換する前記天然酵素が、シキミ酸デヒドロゲナーゼである、
（ｉ）シキミ酸をシキミ酸３－リン酸に変換する前記天然酵素が、シキミ酸キナーゼである、
（ｊ）シキミ酸３－リン酸を５－Ｏ－（１－カルボキシビニル）－シキミ酸３－リン酸に変換する前記天然酵素が、５－エノールピルビルシキミ酸３－リン酸シンターゼである、
（ｋ）５－Ｏ－（１－カルボキシビニル）－シキミ酸３－リン酸をコリスミ酸に変換する前記天然酵素が、コリスミ酸シンターゼである、または
（ｌ）コリスミ酸をフェニルピルビン酸に変換する前記天然酵素が、二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼである、請求項１０に記載の微生物。
【請求項12】
前記微生物が、（ｅ）ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸を２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸に変換する異種酵素、
（ｈ）３－デヒドロシキミ酸をシキミ酸に変換する異種酵素、または
（ｌ）コリスミ酸をフェニルピルビン酸に変換する異種酵素のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項13】
（ｅ）ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸を２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸に変換する前記異種酵素が、２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸シンターゼである、（ｈ）３－デヒドロシキミ酸をシキミ酸に変換する前記異種酵素が、シキミ酸デヒドロゲナーゼである、または
（ｌ）コリスミ酸をフェニルピルビン酸に変換する前記異種酵素が、二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼである、請求項１２に記載の微生物。
【請求項14】
前記微生物が、（１）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（５）ｃｇＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｒｒＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（７）ｐｈｅＡ１、ａｒｏＧ、ａｂＰＰＤＣ、およびｅｃＰＡＲ、
（８）ｅｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（９）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１１）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１２）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１３）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１６）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１７）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１８）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１９）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２１）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（２３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２４）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、または
（２７）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項15】
前記微生物が、コンビナトリアル株２Ｃ０３、１Ｃ１０、２Ｃ５４、２Ｃ０９、２Ｃ４７、２Ｃ５５、２Ｃ５３、Ｈ５７、１Ｃ４７、２Ｃ１０、２Ａ１８、１Ｃ５４、２Ｃ０１、１Ｃ３１、２Ｂ１７、２Ｃ５２、１Ｃ０９、Ｈ１８、Ｈ５８、２Ｃ２７、２Ｄ２２、２Ｄ０７、２Ｄ２４、２Ｄ０３、１Ｃ２９、２Ｂ２６、２Ｃ３８、２Ａ２７、２Ｃ１２、または２Ｂ２７の異種遺伝子およびプロモータを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項16】
前記微生物が、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２を含むガス基質を発酵させて、２－フェニルエタノールを産生する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項17】
前記ガス基質が、合成ガスまたは産業廃棄物ガスを含む、請求項１６に記載の微生物。
【請求項18】
前記微生物が、いずれの他のＣ３＋アルコールも産生しない、請求項１６に記載の微生物。
【請求項19】
前記微生物が、いずれの他のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０アルコールも産生しない、請求項１８に記載の微生物。
【請求項20】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の微生物をガス基質の存在下で培養することを含む、２－フェニルエタノールを産生する、方法。
【請求項21】
前記ガス基質が、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２を含むＣ１炭素源を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記ガス基質が、合成ガスまたは産業廃棄物ガスを含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／９９１，４２８号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年３月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／９９１，４２８号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府の権利
本発明は、エネルギー省によって授与された協力協定ＤＥ－ＥＥ０００７７２８の下で政府の支援を受けて行われた。
本発明は、エネルギー省によって授与された協力協定ＤＥ－ＥＥ０００７７２８の下で政府の支援を受けて行われた。
【0003】
本出願は、二酸化炭素（ＣＯ２）、一酸化炭素（ＣＯ）、および／または水素（Ｈ２）を含む基質の微生物発酵による２－フェニルエタノールの製造方法、およびそのような方法で使用するための遺伝子改変された微生物に関する。
【背景技術】
【0004】
差し迫った気候変動を緩和するには、石炭および石油などの化石燃料の燃焼を介して発生する温室効果ガス（ＧＨＧ）の排出を大幅に削減する必要がある。化学物質および輸送用燃料の持続可能な供給源は、現在、化石炭素への依存を大幅に置き換えるには不十分であるが、ＣＯ２、ＣＯ、および／またはＨ２などのガスの持続可能な燃料や化学物質への生物学的固定のための代替プラットフォームとしてガス発酵が近年現れている。特に、ガス発酵技術は、ガス化有機物（例えば、都市固形廃棄物もしくは農業廃棄物）または産業廃棄物ガス（例えば、製鉄所もしくは石油精製所から）を含む広範囲な原料を利用して、エタノール、ジェット燃料、および様々な他の生成物を生成することができる。ガス発酵だけで原油使用量の３０％を置き換え、世界のＣＯ２排出量を１０％低減することができるが、あらゆる革新的な技術と同様に、この可能性が完全に達成されるまでには多くの技術的課題を乗り越える必要がある。
【0005】
２－フェニルエタノール（２－ＰＥ）は、エステル中間体として、かつ理論的にはスチレン製造において、その「バラのような」香りのために食品、香料、フレーバー業界で年間６，０１０トンの市場を有し、化学業界で年間９００トンの市場を有するコモディティケミカルである。現在、２－ＰＥは、食品、香料、フレーバー業界での用途のために天然源から調達されるか、他の用途のために化学的手段によって合成されている。したがって、天然および石油化学プロセスへの依存を軽減する改善された２－ＰＥ製造方法が必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
一態様では、本開示は、２－フェニルエタノールを産生することができる微生物を提供し、微生物は、フェニルピルビン酸をフェニルアセトアルデヒドに変換する異種酵素と、フェニルアセトアルデヒドを２－フェニルエタノールに変換する異種酵素とを含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、フェニルピルビン酸をフェニルアセトアルデヒドに変換する異種酵素はデカルボキシラーゼであり、フェニルアセトアルデヒドを２－フェニルエタノールに変換する異種酵素はフェニルアセトアルデヒドレダクターゼである。特に、デカルボキシラーゼは、フェニルピルビン酸特異的デカルボキシラーゼであり得る。
【0008】
いくつかの実施形態では、微生物は、Ｃ１固定微生物、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物、および／または細菌である。いくつかの実施形態では、微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、またはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒのメンバーである。
【0009】
いくつかの実施形態では、微生物は、フェニルピルビン酸を天然に産生することができる。いくつかの実施形態では、微生物は、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２をアセチル－ＣｏＡに変換するＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、微生物は、ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する天然酵素、ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸を２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸に変換するネイティブ酵素、２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸を３－デヒドロキナ酸に変換するネイティブ酵素、３－デヒドロキナ酸を３－デヒドロシキミ酸に変換する天然酵素、３－デヒドロシキミ酸をシキミ酸に変換するネイティブ酵素、シキミ酸をシキミ酸３－リン酸に変換する天然酵素、シキミ酸３－リン酸を５－Ｏ－（１－カルボキシビニル）－シキミ酸３－リン酸に変換するネイティブ酵素、５－Ｏ－（１－カルボキシビニル）－シキミ酸３－リン酸をコリスミ酸に変換する天然酵素、またはコリスミ酸をフェニルピルビン酸に変換するネイティブ酵素のうちの１つ以上を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換する天然酵素は、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素（ＰＦＯＲ；Ｅ．Ｃ１．２．７．１）である、ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する天然酵素は、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ；Ｅ．Ｃ２．７．９．１）である、ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸を２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸に変換する天然酵素は、２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸シンターゼ（ＤＡＨＰＳまたはＤＡＨＰシンターゼ；ＥＣ２．５．１．５４）である、２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸を３－デヒドロキナ酸に変換するネイティブ酵素は、３３－デヒドロキナ酸シンターゼ（ＤＨＱＳ；Ｅ．Ｃ４．２．３．４）である、３－デヒドロキナ酸を３－デヒドロシキミ酸に変換する天然の酵素は、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（ＤＨＱ；Ｅ．Ｃ４．２．１．１０）である、３－デヒドロシキミ酸をシキミ酸に変換する天然酵素は、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ；Ｅ．Ｃ１．１．１．２５）である、シキミ酸をシキミ酸３－リン酸に変換する天然酵素は、シキミ酸キナーゼ（ＳＫ；Ｅ．Ｃ２．７．１．７１）である、シキミ酸３－リン酸を５－Ｏ－（１－カルボキシビニル）－シキミ酸３－リン酸に変換する天然酵素は、５－エノールピルビルシキミ酸３－リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳまたはＥＰＳＰシンターゼ；Ｅ．Ｃ２．５．１．１９）である、５－Ｏ－（１－カルボキシビニル）－シキミ酸３－リン酸をコリスミ酸に変換する天然の酵素は、コリスミ酸シンターゼ（ＣＳ；Ｅ．Ｃ４．２．３．５）である、または、コリスミ酸をフェニルピルビン酸に変換する天然の酵素は、二官能性コリスミ酸ムターゼ（Ｅ．Ｃ５．４．９９．５）／プレフェン酸デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ４．２．１．５１）である。
【0012】
いくつかの実施形態では、微生物は、ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸を２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸に変換する異種酵素、３－デヒドロシキミ酸をシキミ酸に変換する異種酵素、またはコリスミ酸をフェニルピルビン酸に変換する異種酵素のうちの１つ以上をさらに含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸を２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸に変換する異種酵素は、２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸シンターゼである、３－デヒドロシキミ酸をシキミ酸に変換する異種酵素は、シキミ酸デヒドロゲナーゼである、またはコリスミ酸をフェニルピルビン酸に変換する異種酵素は、二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼである。
【0014】
いくつかの実施形態では、微生物は、
（１）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（５）ｃｇＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｒｒＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（７）ｐｈｅＡ１、ａｒｏＧ、ａｂＰＰＤＣ、およびｅｃＰＡＲ、
（８）ｅｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（９）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１１）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１２）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１３）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１６）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１７）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１８）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１９）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２１）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（２３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２４）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、または
（２７）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧを含む。
（１）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（５）ｃｇＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｒｒＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（７）ｐｈｅＡ１、ａｒｏＧ、ａｂＰＰＤＣ、およびｅｃＰＡＲ、
（８）ｅｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（９）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１１）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１２）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１３）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１６）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１７）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１８）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１９）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２１）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（２３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２４）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、または
（２７）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧを含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、微生物は、コンビナトリアル株２Ｃ０３、１Ｃ１０、２Ｃ５４、２Ｃ０９、２Ｃ４７、２Ｃ５５、２Ｃ５３、Ｈ５７、１Ｃ４７、２Ｃ１０、２Ａ１８、１Ｃ５４、２Ｃ０１、１Ｃ３１、２Ｂ１７、２Ｃ５２、１Ｃ０９、Ｈ１８、Ｈ５８、２Ｃ２７、２Ｄ２２、２Ｄ０７、２Ｄ２４、２Ｄ０３、１Ｃ２９、２Ｂ２６、２Ｃ３８、２Ａ２７、２Ｃ１２、または２Ｂ２７の異種遺伝子およびプロモータを含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、微生物は、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２を含むガス状基質を発酵させて、２－フェニルエタノールを産生する。いくつかの実施形態では、ガス基質は、合成ガスまたは産業廃棄物ガスを含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、微生物は、いずれの他のＣ３＋アルコールも産生しない。いくつかの実施形態では、微生物は、いずれの他のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０アルコールも産生しない。
【0018】
別の態様では、本開示は、ガス基質の存在下で微生物を培養することを含む、２－フェニルエタノールを生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ガス基質は、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２を含むＣ１炭素源を含む。いくつかの実施形態では、ガス基質は、合成ガスまたは産業廃棄物ガスを含む。
【0019】
本開示の特定の実施形態は、特定の実施形態および特許請求の範囲の以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ガス発酵からＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍによる２－フェニルエタノールの生合成までつながる代謝経路を示す。異種発現を必要とする酵素ステップは、デカルボキシラーゼおよびフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（ＰＡＲ）ステップである。破線の矢印は、Ｃ． ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおける多酵素コア代謝経路を示す。炭素および水素は、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路によってアセチル－ＣｏＡに同化され、これは次いで、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素によってピルビン酸に変換される。芳香族アミノ酸の生合成は、糖新生およびペントースリン酸経路などの必須代謝経路によってピルビン酸から生合成されるホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸から始まる。２－フェニルピルビン酸は、シキミ酸経路から、およびフェニルアラニンとケト酸の間のアミノトランスフェラーゼ反応により誘導され得る。本明細書に開示される実施例において異種発現または過剰発現された酵素は、チェックマークでマークされている。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨを含む。
【図2A】Ｓｃｈｏｔｔ瓶中での異なる量の２－ＰＥの存在下でのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの独立栄養性増殖を示す。図２Ａ：増殖プロファイル、図２Ｂ：ＧＣ－ＦＩＤによって測定された２－ＰＥ濃度。Ｕｎｃ＝挑戦されていない、Ｎ＝２、エラーバー＝Ｓ．Ｄ。
【図2B】（上記の通り。）
【図3A】増殖プロファイルを示す。
【図3B】３つのデカルボキシラーゼ株：ａｂＰＰＤＣ、ａｒｏ１０およびコントロールｋｉｖＤ＿ｌａ間のＳｃｈｏｔｔ瓶中での１５０ｋＰａの合成ガス混合物（５０％のＣＯ、１０％のＨ２、３０％のＣＯ２および１０％のＮ２）を使用した独立栄養性増殖中のエンドポイントアルコール産生力価。Ｎ＝３、エラーバー＝Ｓ．Ｄ。
【図4A】２－ＰＥ産生のためのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（ＰＡＲ）の過剰発現を示す。図４Ａ：採用されたＰＡＲの種の起源、アミノ酸の長さ、補因子の特異性、および参照。図４Ｂ：アミノ酸配列を使用したＰＡＲ変異形の系統樹。スケールバーは、アミノ酸当たり０．２の変更に対応する。図４Ｃ：２００ｋＰａの合成ガス混合物（５０％のＣＯ、１０％のＨ２、３０％のＣＯ２および１０％のＮ２）の存在下での７日間のインキュベーション後の１２ウェルプレートにおける異なるＰＡＲ変異形を有する株による正規化された２－ＰＥ産生、Ｎ＝３～５、エラーバー＝Ｓ．Ｄ。
【図4B】（上記の通り。）
【図4C】（上記の通り。）
【図5】Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法を用いた２－ＰＥ経路遺伝子のコンビナトリアルアセンブリを示す。
【図6】実施例４に記載の２つの２－ＰＥコンビナトリアルライブラリーに使用された遺伝子およびプロモータ変異形を示す。
【図7A】２００ｋＰａの合成ガス混合物（５０％のＣＯ、１０％のＨ２、３０％のＣＯ２、および１０％のＮ２）を有する１２ウェルプレート中の１６２個の２－ＰＥコンビナトリアル株の特徴付けを示す。図７Ａ：コントロール株ｓＦＡ２１２に対する２－ＰＥ力価、図７Ｂ：バイオマス濃度で正規化された２－ＰＥ力価、図７Ｃ：バイオマス濃度、インキュベーション期間＝８～１０日、Ｎ＝２、エラーバー＝Ｓ．Ｄ。
【図7B】（上記の通り。）
【図7C】（上記の通り。）
【図8A】プラスミドの数（図８Ａ）、二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ変異形（図８Ｂ）、デカルボキシラーゼ変異形（図８Ｃ）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ変異形（図８Ｄ）、およびフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ変異形（図８Ｅ）別のコンビナトリアル株のエンドポイント２－ＰＥ力価の比較を示す。インキュベーション期間＝８～１０日。エラーバー＝ＳＤ
【図8B】（上記の通り。）
【図8C】（上記の通り。）
【図8D】（上記の通り。）
【図8E】（上記の通り。）
【図9A】合成ガス混合物（４０％のＣＯ、２０％のＨ２、２０％のＣＯ２、および２０％のＮ２）を使用した連続ＣＳＴＲ発酵における１２種のコンビナトリアル株の特性を示す。株１Ｃ２９では、参照株ｓＦＡ２１２と比較して２－ＰＥ力価の２．９倍の増加が観察された。参照株と比較した場合、１０種の株がより高い２－ＰＥ収量を達成した。
【図9B】（上記の通り。）
【図10A】窒素制限下での２回の連続ＣＳＴＲの実行におけるコンビナトリアル株１Ｃ２９の２－ＰＥ産生を示す。
【図10B】（上記の通り。）
【図11A】株ｓＦＡ２１２を用いた連続ＣＳＴＲ発酵における前処理したトウモロコシ茎葉由来合成ガス（２３．３％のＨ２、３８．７％のＣＯ、１９．６％のＣＯ２、および１８．４％のＮ２）の効果を試験した結果を示す。図１１Ａ：ＨＰＬＣによって分析された代謝物プロファイル、図１１Ｂ：ＧＣ－ＴＣＤによって分析されたガスプロファイル（負＝取り込み）、図１１Ｃ：分析されたＧＣ－ＦＩＤによる２－ＰＥプロファイル。実際の合成ガスは、６．９日目から１０．９日目まで（合計４日間）使用された。
【図11B】（上記の通り。）
【図11C】（上記の通り。）
【発明を実施するための形態】
【0021】
本明細書に開示されるのは、合成ガスからの２－フェニルエタノール（２－ＰＥ）のデノボ生合成のための方法および組成物であり、これは、２－ＰＥを製造するための天然および石油化学プロセスへの依存を緩和する可能性を有する。
【0022】
定義
別段の定めがない限り、本明細書全体で使用される以下の用語は、以下のように定義される。
別段の定めがない限り、本明細書全体で使用される以下の用語は、以下のように定義される。
【0023】
「発酵」という用語は、基質に化学変化をもたらす代謝プロセスとして解釈されるべきである。例えば、発酵プロセスは、１つ以上の基質を受け取り、１つ以上の微生物の利用を介して１つ以上の生成物を生成する。「発酵」、「ガス発酵」などの用語は、ガス化によって生成された合成ガスなどの１つ以上の基質を受け取り、１つ以上のＣ１固定微生物を利用して１つ以上の生成物を生成するプロセスとして解釈されるべきである。好ましくは、発酵プロセスは、１つ以上のバイオリアクターの使用を含む。発酵プロセスは、「バッチ」または「連続」のいずれかとして説明され得る。「バッチ発酵」は、バイオリアクターが微生物とともに原材料、すなわち炭素源で満たされ、発酵が完了するまで生成物がバイオリアクター内に留まる発酵プロセスを説明するために使用される。「バッチ」プロセスでは、発酵が完了した後に、生成物を抽出し、次の「バッチ」が始まる前にバイオリアクターを洗浄する。「連続発酵」は、発酵プロセスがより長期間にわたって延長され、発酵中に生成物および／または代謝物が抽出される発酵プロセスを説明するために使用される。好ましくは、発酵プロセスは連続的である。
【0024】
微生物に関して使用される場合の「非自然発生型」という用語は、参照種の野生型株を含む参照種の自然発生型の株には見られない少なくとも１つの遺伝子改変を微生物が有することを意味するように意図される。非自然発生型の微生物は、典型的には、実験室または研究施設で開発される。
【0025】
「遺伝子改変」、「遺伝子変化」、または「遺伝子操作」という用語は、広範には、人間の手による微生物のゲノムまたは核酸の操作を指す。同様に、「遺伝子改変された」、「遺伝子変化した」、または「遺伝子操作された」という用語は、そのような遺伝子改変、遺伝子変化、または遺伝子操作を含む微生物を指す。これらの用語は、実験室で産生された微生物を自然発生の微生物と区別するために使用され得る。遺伝子改変の方法は、例えば、異種遺伝子発現、遺伝子またはプロモータの挿入または欠失、核酸変異、改変遺伝子発現または不活性化、酵素操作、指向性進化、知識ベース設計、ランダム変異導入法、遺伝子シャフリング、およびコドン最適化を含む。
【0026】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａなどの微生物の代謝工学は、天然代謝物、例えば、エタノール以外の多くの重要な燃料および化学分子を生成する能力を大幅に拡大することができる。近年、イントロンベースの方法（ＣｌｏｓＴｒｏｎ）（Ｋｕｅｈｎｅ，Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，３８９－４０７，２０１１）、対立遺伝子交換法（ＡＣＥ）（Ｈｅａｐ，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，４０：ｅ５９，２０１２；Ｎｇ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８：ｅ５６０５１，２０１３）、Ｔｒｉｐｌｅ Ｃｒｏｓｓ（Ｌｉｅｗ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７：６９４，２０１６）、Ｉ－ＳｃｅＩを介して仲介される方法（Ｚｈａｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０８：４９－６０，２０１５）、ＭａｚＦ（Ａｌ－Ｈｉｎａｉ，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７８：８１１２－８１２１，２０１２）、または他の方法（Ａｒｇｙｒｏｓ，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７７：８２８８－８２９４，２０１１）、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ（Ｕｅｋｉ，ｍＢｉｏ，５：ｅ０１６３６－０１６１４，２０１４）、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ （Ｎａｇａｒａｊｕ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，９：２１９，２０１６）を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉａについてのゲノム工学のためのいくつかの異なる方法が開発された。しかしながら、遅くて骨の折れるサイクリング時間と種間でのこれらの遺伝的手法の移転可能性の制限とのために、いくつかの遺伝的変化を繰り返し導入することは非常に困難なままである。さらに、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのＣ１代謝は、Ｃ１の取り込み、変換、および生成物合成に向けた炭素／エネルギー／酸化還元の流れを最大化するであろう修飾を確実に予測するには、まだ十分に良く理解されていない。したがって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａへの標的経路の導入は、退屈で時間のかかるプロセスのままである。
【0027】
「組換え」は、核酸、タンパク質、または微生物が、遺伝子改変、操作、または組換えの生成物であることを示す。一般に、「組換え」という用語は、微生物の２つ以上の異なる株または種など、複数の源から誘導される遺伝物質を含有するか、またはそれによってコードされる核酸、タンパク質、または微生物を指す。
【0028】
「野生型」は、変異体または変異形とは区別されるように天然に存在する、生物、株、遺伝子、または特性の典型的な形態を指す。
【0029】
「内因性」または「天然」は、本開示の微生物が由来する野生型または親微生物中に存在するまたは発現する核酸またはタンパク質を指す。例えば、内在性遺伝子は、本開示の微生物が由来する野生型または親微生物に天然に存在する遺伝子である。一実施形態では、内在性遺伝子の発現は、外因性プロモータなどの外因性調節エレメントによって制御され得る。
【0030】
「外因性」は、本開示の微生物の外側から生じる核酸またはタンパク質を指す。例えば、外因性遺伝子または酵素は、人工的または組換え的に作成され、本開示の微生物に導入されるかまたはそこで発現され得る。外因性遺伝子または酵素はまた、異種微生物から単離され、本開示の微生物に導入されるかまたはそこで発現され得る。外在性核酸は、本開示の微生物のゲノムに統合されるように、または本開示の微生物、例えばプラスミド中で染色体外の状態に留まるように適合され得る。
【0031】
「異種」は、本開示の微生物が由来する野生型または親微生物に存在しない核酸またはタンパク質を指す。例えば、異種遺伝子または酵素は、異なる株または種に由来し、本開示の微生物に導入されるかまたはそこで発現され得る。異種遺伝子または酵素は、それが異なる株または種で発生する形態で本開示の微生物に導入されるかまたはそこで発現され得る。代替的に、異種遺伝子または酵素は、何らかの方法、例えば、本開示の微生物における発現のためにコドン最適化することによって、または酵素活性の方向を逆転させるため、もしくは基質特異性を変更するためなど、機能を変更するように操作することによって修飾され得る。
【0032】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を実行し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体などの１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの組織化の前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは、重合の後、例えば標識構成成分との接合により、さらに修飾され得る。
【0033】
本明細書で使用する場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へ）転写される過程、および／または転写されたｍＲＮＡが、続いて、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へ翻訳される過程を指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と呼ばれ得る。
【0034】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、直鎖であっても分枝鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって割り込まれていてもよい。これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識構成成分との接合などの任意の他の操作を含む。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン、ＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸を含む。
【0035】
「酵素活性」または単に「活性」は、広範には、酵素の活性、酵素の量、または反応に触媒作用を及ぼすための酵素の可用性を含むがこれらに限定されない、酵素的活性を指す。したがって、酵素活性を「増加させること」は、酵素の活性を増大させること、酵素の量を増加させること、または反応に触媒作用を及ぼすための酵素の可用性を増加させることを含む。同様に、酵素活性を「減少させること」は、酵素の活性を減少させること、酵素の量を減少させること、または反応に触媒作用を及ぼすための酵素の可用性を減少させることを含む。
【0036】
「コドン最適化」は、特定の株または種における核酸の最適化または改善された翻訳のための、遺伝子などの核酸の変異を指す。コドン最適化により、翻訳速度の高速化または翻訳精度の向上がもたらされ得る。
【0037】
「過剰発現した」は、本開示の微生物が由来する野生型または親微生物と比較して、本開示の微生物中の核酸またはタンパク質の発現の増加を指す。過剰発現は、遺伝子コピー数、遺伝子転写速度、遺伝子翻訳速度、または酵素分解速度の変更を含む、当該技術分野において既知の任意の手段によって達成することができる。
【0038】
「変異形」という用語は、核酸およびタンパク質の配列が、従来技術において開示されるかまたは本明細書に例示される参照核酸およびタンパク質の配列などの、参照核酸およびタンパク質の配列とは異なる、核酸およびタンパク質を含む。本開示の方法および組成物は、参照核酸またはタンパク質と実質的に同じ機能を実行する変異形核酸またはタンパク質を使用して実施され得る。例えば、変異形タンパク質は、参照タンパク質と実質的に同じ機能を実行するか、または実質的に同じ反応に触媒作用を及ぼし得る。変異形遺伝子は、参照遺伝子と同じ、または実質的に同じタンパク質をコードしてもよい。変異形プロモータは、参照プロモータと実質的に同じ、１つ以上の遺伝子の発現を促進するための能力を有し得る。
【0039】
そのような核酸またはタンパク質は、本明細書では「機能的に同等な変異形」または「機能的相同体」と称され得る。例として、核酸の機能的に同等な変異形としては、対立遺伝子変異形、遺伝子の断片、変異遺伝子、多型などを挙げることができる。他の微生物からの相同遺伝子も、機能的に同等な変異形の例である。これらとしては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉなどの種の相同遺伝子が挙げられ、それらの詳細は、ＧｅｎｂａｎｋまたはＮＣＢＩなどのウェブサイトで公開されており入手可能である。機能的に同等な変異形としてはまた、特定の微生物のコドン最適化の結果として配列が変化している核酸が挙げられる。核酸の機能的に同等な変異形は、好ましくは、参照核酸と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれを超える核酸配列同一性（相同性割合）を有する。タンパク質の機能的に同等な変異形は、好ましくは、参照タンパク質と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれを超えるアミノ酸同一性（相同性割合）を有する。変異形核酸またはタンパク質の機能的同等性は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して評価され得る。
【0040】
核酸またはアミノ酸配列の同一性には、２ つのアラインメントされた配列間で同一のアミノ酸配列が必要である。したがって、参照配列と８０％の核酸またはアミノ酸同一性を共有する候補配列は、アラインメント後に、候補配列中の核酸またはアミノ酸の８０％が参照配列中の対応する核酸またはアミノ酸と同一であることを必要とする。本発明による同一性は、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータアラインメントプログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）などのコンピュータ解析、およびそれにおいて示唆されたデフォルトパラメータの助けで決定されるが、これらに限定されない。例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアをそのデフォルト設定で使用して、クエリの成熟（生物活性）部分および参照ポリペプチドが整列される。完全に保存された残基の数をカウントされ、参照ポリペプチドの長さで除算される。
【0041】
核酸は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、本開示の微生物に送達され得る。例えば、核酸は裸の核酸として送達されてもよく、リポソームなどの１つ以上の薬剤とともに配合されてもよい。核酸は、必要に応じて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある特定の実施形態では、制限阻害剤を使用してもよい。追加のベクターには、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、および人工染色体が含まれ得る。好ましい実施形態では、核酸は、プラスミドを使用して、本開示の微生物に送達される。例として、形質転換（形質導入またはトランスフェクションを含む）は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、化学的または自然の能力、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘発、または接合によって達成され得る。活性制限酵素系を有するある特定の実施形態では、核酸を微生物に導入する前に核酸をメチル化する必要があり得る。
【0042】
さらに、特定の核酸の発現を増加または制御するために、プロモータなどの調節エレメントを含むように核酸を設計してもよい。プロモータは、構成的プロモータまたは誘導性プロモータであり得る。理想的には、プロモータは、ウッド－ユングダール経路プロモータ、フェレドキシンプロモータ、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素プロモータ、Ｒｎｆ複合オペロンプロモータ、ＡＴＰシンターゼオペロンプロモータ、またはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモータである。
【0043】
「微生物」は、微小な生物、特に細菌、古細菌、ウイルス、または真菌である。本開示の微生物は、典型的に細菌である。本明細書で使用される場合、「微生物」の記載は、「細菌」を包含するものと解釈されるべきである。
【0044】
「親微生物」は、本開示の微生物を生成するために使用される微生物である。親微生物は、天然に存在する微生物（即ち、野生型微生物）または以前に組換えされた微生物（すなわち、変異体または組換え微生物）であり得る。本開示の微生物は、親微生物において発現または過剰発現しなかった１つ以上の酵素を発現または過剰発現するように修飾され得る。同様に、本開示の微生物は、親微生物が含有しなかった１つ以上の遺伝子を含有するように修飾され得る。本開示の微生物は、また、親微生物において発現された１つ以上の酵素を発現しないまたはより少ない量を発現させるように修飾され得る。一実施形態において、親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉである。好ましい実施形態では、親微生物は、２０１０年６月７日にＩｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ ７Ｂ，Ｄ－３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙにあるドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ））にブダペスト条約の条項下で２０１０年６月７日に寄託され、受託番号ＤＳＭ２３６９３を付与されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＺ１５６１である。この株については、国際特許出願第ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００１４４号に記載されており、ＷＯ２０１２／０１５３１７として公開される。
【0045】
「から誘導される」という用語は、核酸、タンパク質、または微生物が異なる（例えば、親または野生型）核酸、タンパク質、または微生物から改変または適合されて、新しい核酸、タンパク質、または微生物を生成することを示す。そのような修飾または適合は、典型的に、核酸または遺伝子の挿入、欠失、変異、または置換を含む。一般に、本開示の微生物は、親微生物に由来する。一実施形態では、本開示の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉに由来する。好ましい実施形態では、本開示の微生物は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３の下で寄託される、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＺ１５６１から誘導される。
【0046】
本開示の微生物は、機能特徴に基づいてさらに分類され得る。例えば、本開示の微生物は、Ｃ１固定微生物、嫌気性菌、アセトゲン、エタノロゲン、カルボキシド栄養生物、および／またはメタン資化性菌であり得るか、またはそれらに由来し得る。表１は、微生物の代表的なリストを提供し、微生物の機能特徴を特定する。
【表1】
【表A】
【0047】
「Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ」は、例えば、Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１７８４：１８７３－１８９８，２００８に記載の炭素固定のＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を指す。「Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物」は、予想通り、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む微生物を指す。一般に、本開示の微生物は天然のＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含有する。本明細書では、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、天然の未修飾のＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路であってもよく、またはＣＯ、ＣＯ２、および／もしくはＨ２をアセチル－ＣｏＡに変換するように依然として機能する限り、ある程度の遺伝子修飾（例えば、過剰発現、異種発現、遺伝子欠損など）を有するＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路であってもよい。
【0048】
「Ｃ１」は、１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１酸素化物」は、少なくとも１つの酸素原子も含む１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１炭素源」は、本開示の微生物のための部分的または唯一の炭素源として機能する１炭素分子を指す。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、ＣＨ３ＯＨ、またはＣＨ２Ｏ２のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、Ｃ１炭素源は、ＣＯおよびＣＯ２のうちの１方または両方を含む。「Ｃ１固定微生物」は、Ｃ１炭素源から１つ以上の生成物を生成する能力を有する微生物である。典型的に、本開示の微生物はＣ１固定細菌である。好ましい実施形態では、本開示の微生物は、表１で特定されるＣ１固定微生物から誘導される。
【0049】
「嫌気性菌」は、増殖のために酸素を必要としない微生物である。嫌気性菌は、酸素が特定の閾値を超えて存在する場合、負の反応を起こし得るか、または死滅し得る。しかしながら、いくつかの嫌気性菌は、低レベルの酸素（例えば、０．０００００１～５％の酸素）を許容可能である。典型的に、本開示の微生物は嫌気性菌である。一実施形態では、本開示の微生物は、表１で特定される嫌気性菌から誘導される。
【0050】
「アセトゲン」は、エネルギー節約のため、ならびにアセテートなどのアセチル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡ由来生成物の合成のためのそれらの主要機構としてＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を使用する、偏性嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１７８４：１８７３－１８９８，２００８）。特に、アセトゲンはＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を、（１）ＣＯ２からのアセチルＣｏＡの還元的合成のメカニズム、（２）末端電子受容、エネルギー節約プロセス、（３）セル炭素の合成におけるＣＯ２の固定（同化）のメカニズム（Ｄｒａｋｅ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ、Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ、３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．３５４、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００６）として使用する。天然に存在する全てのアセトゲンは、Ｃ１固定、嫌気性、独立栄養性、および非メタン資化性である。典型的に、本開示の微生物はアセトゲンである。好ましい実施形態では、本開示の微生物は、表１で特定されるアセトゲンから誘導される。
【0051】
「エタノロゲン（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎ）」は、エタノールを生成する、または生成することが可能である微生物である。典型的に、本開示の微生物はエタノロゲンである。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で特定されるエタノロゲンから誘導される。
【0052】
「独立栄養生物」は、有機炭素の不在下で増殖することが可能な微生物である。代わりに、独立栄養生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ２などの無機炭素源を使用する。典型的に、本開示の微生物は独立栄養生物である。好ましい実施形態では、本開示の微生物は、表１で特定される独立栄養生物から誘導される。
【0053】
「カルボキシド栄養生物」は、炭素およびエネルギーの唯一の供給源としてＣＯを利用することが可能な微生物である。典型的に、本開示の微生物はカルボキシド栄養生物である。好ましい実施形態では、本開示の微生物は、表１で特定されるカルボキシド栄養生物から誘導される。
【0054】
「メタン資化性菌」は、炭素およびエネルギーの唯一の供給源としてメタンを利用することが可能な微生物である。特定の実施形態では、本開示の微生物は、メタン資化性菌であるか、またはメタン資化性菌から誘導される。他の実施形態では、本開示の微生物は、メタン資化性菌ではないか、メタン資化性菌から誘導されない。
【0055】
より広くは、本開示の微生物は、表１で特定される任意の属または種に由来し得る。例えば、微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属のメンバーであり得る。具体的には、微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｖｕｉからなる群から選択される親細菌に由来し得る。
【0056】
これらのタイプの微生物は、熱力学的な生命の限界で生存することが知られており（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１２：８０９－８２１，２０１４）、その理由は、本発明以前には、それらがＣ８芳香族アルコールを、全く合成できない、意味のある量よりもはるかに少ない量合成できる、特に、２－ＰＥがこれらの微生物に有毒な影響を与える可能性があることを考慮しても合成できるかどうかは、知られていなかったためである。
【0057】
好ましい実施形態では、本開示の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ種、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ種を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのクラスターから誘導される。これらの種は、Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５－３５１，１９９４（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２－２３６，１９９３（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、およびＨｕｈｎｋｅ，ＷＯ２００８／０２８０５５（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ）によって初めて報告され、かつ特徴付けられた。
【0058】
これら３つの種は、多くの類似点を有する。特に、これらの種は全て、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属のＣ１固定、嫌気性、アセトゲン系、エタノロゲン系、およびカルボキシド栄養性のメンバーである。これらの種は、類似の遺伝子型および表現型ならびにエネルギー節約および発酵代謝のモードを有する。さらには、これらの種は、９９％を超えて同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡを有するクロストリジウムｒＲＮＡホモロジー群Ｉ内にクラスター化し、約２２～３０モル％の含有量でＤＮＡ Ｇ＋Ｃを有し、グラム陽性であり、同様の形態およびサイズ（０．５～０．７×３～５μｍの対数増殖細胞）を有し、中温性であり（３０～３７℃で最適に増殖し）、同様の約４～７．５のｐＨ範囲（最適ｐＨが約５．５～６）を有し、シトクロムを欠いており、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを節約する。また、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの種において示されている（Ｐｅｒｅｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１０６６－１０７７，２０１２）。重要なことに、これらの種はまた、全て、ＣＯ含有ガスで強い独立栄養性増殖を示し、主要な発酵生成物としてエタノールおよびアセテート（または酢酸）を生成し、特定の条件下で少量の２，３－ブタンジオールおよび乳酸を生成する。
【0059】
しかしながら、これら３つの種は、いくつかの違いも有する。これらの種は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍはウサギの腸から、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは養鶏場の廃棄物から、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉは淡水堆積物からというように、異なる供給源から単離された。これらの種は、様々な糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸、クエン酸）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、および他の基質（例えば、べタイン、ブタノール）の利用において異なる。さらに、これらの種は、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求性において異なる。これらの種は、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子およびタンパク質の核酸およびアミノ酸配列において違いを有するが、これらの遺伝子およびタンパク質の一般的構成および数は、全ての種において同じであることが分かっている（Ｋｏｐｋｅ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０－３２５，２０１１）。
【0060】
したがって、要約すると、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉの特徴の多くは、その種に特異的ではなく、むしろＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の、Ｃ１固定、嫌気性、アセトゲン系、エタノロゲン系、およびカルボキシド栄養性のメンバーのこのクラスターについて一般的な特徴である。しかしながら、これらの種は、実際は、全く異なるため、これらの種のうちの１つの遺伝子改変または操作は、これらの種のうちの別のものにおいては同一の効果を有しない場合がある。例えば、増殖、性能、または生成物生成における違いが観察され得る。
【0061】
「基質」は、本開示の微生物のための炭素および／またはエネルギー源を指す。典型的に、基質は、ガス状であり、Ｃ１炭素源、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＣＨ４を含む。好ましくは、基質は、ＣＯまたはＣＯ＋ＣＯ２のＣ１炭素源を含む。基質は、Ｈ２、Ｎ２、または電子などの他の非炭素構成成分をさらに含み得る。
【0062】
基質は、概して、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００モル％のＣＯなどの少なくともいくらかの量のＣＯを含む。基質は、約２０～８０、３０～７０、または４０～６０モル％のＣＯなど、ある範囲のＣＯを含み得る。好ましくは、基質は、約４０～７０モル％のＣＯ（例えば、製鋼所または高炉ガス）、約２０～３０モル％のＣＯ（例えば、塩基性酸素転炉ガス）、または約１５～４５モル％のＣＯ（例えば、合成ガス）を含む。いくつかの実施形態では、基質は、約１～１０または１～２０モル％のＣＯなどの比較的低い量のＣＯを含み得る。本開示の微生物は、典型的には、基質中のＣＯの少なくとも一部分を生成物に変換する。いくつかの実施形態では、基質は、ＣＯを含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【0063】
基質は、いくらかの量のＨ２を含み得る。例えば、基質は、約１、２、５、１０、１５、２０、または３０モル％のＨ２を含み得る。いくつかの実施形態では、基質は、約６０、７０、８０、または９０モル％のＨ２など、比較的多量のＨ２を含み得る。さらなる実施形態では、基質は、Ｈ２を含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【0064】
基質は、いくらかの量のＣＯ２を含み得る。例えば、基質は、約１～８０または１～３０モル％のＣＯ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約２０、１５、１０、または５モル％未満のＣＯ２を含み得る。別の実施形態において、基質は、ＣＯ２を含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【0065】
基質は典型的にはガス状であるが、基質はまた、代替的な形態で提供されてもよい。例えば、基質は、マイクロバブル分散物発生装置を使用して、ＣＯ含有ガスで飽和した液体中に溶解されてもよい。さらなる例として、基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。
【0066】
基質および／またはＣ１炭素源は、自動車の排出ガス、電気分解、熱分解、焙焼、またはガス化などの産業プロセスのまたは何らかの他の源から副産物として得られる廃棄物ガスであってもよい。例えば、廃棄物材料は、熱分解、焙焼、またはガス化によって再利用されて、基質および／またはＣ１炭素源を生成することができる。特定の実施形態では、産業プロセスは、鉄鋼製造などの鉄金属生成物製造、非鉄金属生成物製造、石油精製、石炭ガス化、発電、カーボンブラック生成、紙およびパルプ製造、黒液ガス化、アンモニア生成、メタノール生成およびコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、基質および／またはＣ１炭素源は、任意の簡便な方法を使用して、それが大気中に放出される前に産業プロセスから捕捉されてもよい。
【0067】
基質および／またはＣ１炭素源は、石炭もしくは精錬残渣のガス化、バイオマスもしくはリグノセルロース材料のガス化、または天然ガスの改質によって得られる合成ガスなど、合成ガスであってもよい。別の実施形態では、合成ガスは、都市固形廃棄物または産業固形廃棄物のガス化から得られてもよい。
【0068】
基質の組成は、反応の効率および／またはコストに著しい影響を及ぼし得る。例えば、酸素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵プロセスの効率を低減させ得る。基質の組成に応じて、基質を処理、スクラブ、または濾過して、毒素、望ましくない構成成分、またはちり粒子などの任意の望ましくない不純物を除去すること、および／または所望の構成成分の濃度を増加させることが望ましくあり得る。
【0069】
特定の実施形態では、発酵は、糖、デンプン、リグニン、セルロース、またはヘミセルロースなどの炭水化物基質の不在下で実施される。
【0070】
本開示の微生物は、ガス基質とともに培養されて、１つ以上の生成物を生成し得る。例えば、本開示の微生物は、エタノール（ＷＯ２００７／１１７１５７）、アセテート（ＷＯ２００７／１１７１５７）、１－ブタノール（ＷＯ２００８／１１５０８０、ＷＯ２０１２／０５３９０５、およびＷＯ２０１７／０６６４９８）、ブチレート（ＷＯ２００８／１１５０８０）、２，３－ブタンジオール（ＷＯ２００９／１５１３４２およびＷＯ２０１６／０９４３３４）、ラクテート（ＷＯ２０１１／１１２１０３）、ブテン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、ブタジエン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、メチルエチルケトン（２－ブタノン）（ＷＯ２０１２／０２４５２２およびＷＯ２０１３／１８５１２３）、エチレン（ＷＯ２０１２／０２６８３３）、アセトン（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、イソプロパノール（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、脂質（ＷＯ２０１３／０３６１４７）、３－ヒドロキシプロピオネート（３－ＨＰ）（ＷＯ２０１３／１８０５８１）、イソプレンを含むテルペン（ＷＯ２０１３／１８０５８４）、脂肪酸（ＷＯ２０１３／１９１５６７）、２－ブタノール（ＷＯ２０１３／１８５１２３）、１，２－プロパンジオール（ＷＯ２０１４／０３６１５２）、１－プロパノール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、１－ヘキサノール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、１－オクタノール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、コリスメート由来生成物（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、３－ヒドロキシブチレート（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、１，３－ブタンジオール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、２－ヒドロキシイソブチレートまたは２－ヒドロキシイソ酪酸（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、イソブチレン（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、アジピン酸（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、１，３－ヘキサンジオール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、３－メチル－２－ブタノール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、２－ブテン－１－オール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、イソバレレート（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、イソアミルアルコール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、および／またはモノエチレングリコール（ＷＯ２０１９／１２６４００）を生成し得るか、これらを生成するために操作され得る。特定の実施形態では、微生物バイオマス自体が生成物とみなされ得る。これらの生成物はさらに変換されて、ディーゼル、ジェット燃料、および／またはガソリンのうちの少なくとも１つの成分を生成し得る。特定の実施形態では、２－フェニルエタノールは、香料、エッセンシャルオイル、フレーバー、および石鹸の成分として使用され得る。加えて、微生物バイオマスはさらに処理されて、単細胞タンパク質（ＳＣＰ）を生成し得る。
【0071】
「天然生成物」は、遺伝子修飾されていない微生物によって生成される生成物である。例えば、エタノール、アセテート、および２，３－ブタンジオールは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉの天然生成物である。「非天然生成物」は、遺伝子組換えされた微生物によって生成されるが、遺伝子組換えされた微生物が由来する遺伝子改変されない微生物によって生成されない生成物である。
【0072】
「選択性」は、微生物によって生成される全発酵生成物の生成に対する標的生成物の生成の比率を指す。本開示の微生物は、ある特定の選択性で、または最小の選択性で生成物を生成するように操作され得る。一実施形態では、標的生成物は、本開示の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、または７５％を占める。一実施形態では、標的生成物は、本開示の微生物が少なくとも１０％の標的生成物に対して選択性を有するように、本開示の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも１０％を占める。別の実施形態では、標的生成物は、本開示の微生物が少なくとも３０％の標的生成物に対して選択性を有するように、本開示の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも３０％を占める。
【0073】
「効率を増大させること」、「増大した効率」などは、増殖速度、生成物生成速度もしくは体積、消費される基質の体積当たりの生成物体積、または生成物選択性を増大させることを含むが、これらに限定されない。効率は、本開示の微生物が由来する親微生物の性能に対して測定され得る。
【0074】
典型的には、培養は、バイオリアクター中で実行される。「バイオリアクター」という用語は、連続撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、またはガス－液体接触に好適な他の容器もしくは他のデバイスなどの１つ以上の容器、塔、または配管配置からなる培養／発酵デバイスを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、第１の増殖反応器および第２の培養／発酵反応器を含み得る。基質は、これらの反応器のうちの一方または両方に提供され得る。本明細書で使用する場合、「培養」および「発酵」という用語は、交換可能に使用される。これらの用語は、培養／発酵プロセスの増殖期および生成物生合成期の両方を包含する。
【0075】
培養物は概して、微生物の増殖を可能にするのに十分な栄養素、ビタミン、および／または無機物を含有する水性培地中で維持される。好ましくは、水性培養培地は、最小嫌気性微生物増殖培地などの嫌気性微生物増殖培地である。好適な培地は、当該技術分野において周知である。
【0076】
培養／発酵は、望ましくは、標的生成物の生成に適切な条件下で実施されるべきである。典型的に、培養／発酵は、嫌気性条件下で実施される。考慮すべき反応条件は、圧力（または分圧）、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のガスが制限的にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、および生成物阻害を回避するための最大生成物濃度を含む。特に、基質の導入速度は、生成物がガス制限条件下での培養によって消費され得るため、液相中のガスの濃度が制限的にならないことを確実にするように制御されてもよい。
【0077】
特定の実施形態において、発酵は、光の不在下で、または光合成微生物のエネルギー要求を満たすには不十分な量の光の存在下で行われる。特定の実施形態では、本開示の微生物は、非光合成微生物である。
【0078】
いくつかの実施形態では、２－フェニルエタノールは、例えば、分留、蒸発、浸透蒸発、ガスストリッピング、相分離、および、例えば、液－液抽出を含む抽出発酵を含む、当該技術分野で既知の任意の方法またはそれらの組み合わせを使用して、発酵ブロスから分離または精製され得る。特定の実施形態では、２－フェニルエタノールは、発酵ブロスの一部分をバイオリアクターから連続除去し、微生物細胞をブロスから分離し（濾過により簡便に）、かつ２－フェニルエタノールをブロスから回収することによって、発酵ブロスから回収される。一般に、アルコールおよび／またはアセトンは、例えば、蒸留によって回収され得る。分離された微生物細胞は、好ましくは、バイオリアクターに再循環されて戻される。２－フェニルエタノールが除去された後に残っている無細胞透過液も、好ましくは、バイオリアクターに返送される。追加の栄養素を、無細胞透過液に添加して、バイオリアクターに返送する前に、培地を補充し得る。
【0079】
実施例
一実施形態では、本開示は、２－フェニルエタノールを産生することができる微生物を提供し、微生物は、フェニルピルビン酸をフェニルアセトアルデヒドに変換する異種酵素と、フェニルアセトアルデヒドを２－フェニルエタノールに変換する異種酵素とを含む。
一実施形態では、本開示は、２－フェニルエタノールを産生することができる微生物を提供し、微生物は、フェニルピルビン酸をフェニルアセトアルデヒドに変換する異種酵素と、フェニルアセトアルデヒドを２－フェニルエタノールに変換する異種酵素とを含む。
【0080】
いくつかの実施形態では、フェニルピルビン酸をフェニルアセトアルデヒドに変換する異種酵素はデカルボキシラーゼであり、フェニルアセトアルデヒドを２－フェニルエタノールに変換する異種酵素はフェニルアセトアルデヒドレダクターゼである。特に、デカルボキシラーゼは、フェニルピルビン酸特異的デカルボキシラーゼであり得る。いくつかの実施形態では、異種デカルボキシラーゼ酵素をコードする核酸は、ａｒｏ１０（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来）またはａｂＰＰＤＣ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来）を含む。いくつかの実施形態では、異種デカルボキシラーゼ酵素をコードする核酸は、（ｉ）配列番号１、２、もしくは４、（ｉｉ）配列番号１、２、もしくは４によってコードされるデカルボキシラーゼ酵素に機能的に相同なデカルボキシラーゼ酵素をコードする、配列番号１、２、もしくは４と少なくとも９０％の同一性を有する核酸、または（ｉｉｉ）配列番号１、２、もしくは４によってコードされるデカルボキシラーゼ酵素と少なくとも９０％の同一性を有する機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸を含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、異種デカルボキシラーゼ酵素をコードする核酸は、ａｒｏ１０、ａｂＰＰＤＣ、または配列番号１、２、もしくは４、または、例えば、それとの少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも８６％、もしくは少なくとも８７％、もしくは少なくとも８８％、もしくは少なくとも８９％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９１％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９３％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、もしくは１００％の核酸配列同一性を共有するその機能的相同体を含む。いくつかの実施形態では、異種デカルボキシラーゼ酵素をコードする核酸は、例えば、ａｒｏ１０、ａｂＰＰＤＣ、または配列番号１、２、もしくは４によってコードされるデカルボキシラーゼ酵素に少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％のペプチド配列同一性を共有する機能的に相同なポリペプチドをコードする。
【0082】
いくつかの実施形態では、異種ＰＡＲ酵素をコードする核酸は、ｂｌＰＡＲ、ｅｃＰＡＲ、ｌｅＰＡＲ、ｒｒＰＡＲ、ｒｓＰＡＲ、またはａｄｈ６を含む（出典は図４Ａに記載されている）。いくつかの実施形態では、異種ＰＡＲ酵素をコードする核酸は、（ｉ）配列番号３、５、６、７、８、もしくは９、（ｉｉ）配列番号３、５、６、７、８、もしくは９によってコードされるＰＡＲ酵素に機能的に相同なＰＡＲ酵素をコードする、配列番号３、５、６、７、８、もしくは９と少なくとも９０％の同一性を有する核酸、または（ｉｉｉ）配列番号３、５、６、７、８、もしくは９によってコードされるＰＡＲ酵素と少なくとも９０％の同一性を有する機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸を含む。
【0083】
いくつかの実施形態では、異種ＰＡＲ酵素をコードする核酸は、ｂｌＰＡＲ、ｅｃＰＡＲ、ｌｅＰＡＲ、ｒｒＰＡＲ、ｒｓＰＡＲ、ａｄｈ６、または配列番号３、５、６、７、８、もしくは９、または、例えば、それと少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも８６％、もしくは少なくとも８７％、もしくは少なくとも８８％、もしくは少なくとも８９％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９１％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９３％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、もしくは１００％の核酸配列同一性を共有するその機能的相同体を含む。いくつかの実施形態では、異種ＰＡＲ酵素をコードする核酸は、例えば、ｂｌＰＡＲ、ｅｃＰＡＲ、ｌｅＰＡＲ、ｒｒＰＡＲ、ｒｓＰＡＲ、ａｄｈ６、または配列番号３、５、６、７、８、もしくは９によってコードされるＰＡＲ酵素に少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％のポリペプチド配列同一性を共有する機能的に相同なポリペプチドをコードする。
【0084】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物は、ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸を２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸に変換する異種酵素、３－デヒドロシキミ酸をシキミ酸に変換する異種酵素、またはコリスミ酸をフェニルピルビン酸に変換する異種酵素のうちの１つ以上をさらに含む。
【0085】
いくつかの実施形態では、ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸を２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸に変換する異種酵素は、２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸シンターゼである、３－デヒドロシキミ酸をシキミ酸に変換する異種酵素は、シキミ酸デヒドロゲナーゼである、またはコリスミ酸をフェニルピルビン酸に変換する異種酵素は、二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼである。
【0086】
いくつかの実施形態では、異種シキミ酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする核酸は、ｃｇＡｒｏＥ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来）またはｅｃＡｒｏＥ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来）を含む。いくつかの実施形態では、異種シキミ酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする核酸は、（ｉ）配列番号１１もしくは１２、（ｉｉ）配列番号１１もしくは１２によってコードされるシキミ酸デヒドロゲナーゼ酵素に機能的に相同なシキミ酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする、配列番号１１もしくは１２と少なくとも９０％の同一性を有する核酸、または（ｉｉｉ）配列番号１１もしくは１２によってコードされるシキミ酸デヒドロゲナーゼ酵素と少なくとも９０％の同一性を有する機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸を含む。
【0087】
いくつかの実施形態では、異種シキミ酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする核酸は、ｃｇＡｒｏＥ、ｅｃＡｒｏＥ、または配列番号１１もしくは１２、または、例えば、それと少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも８６％、もしくは少なくとも８７％、もしくは少なくとも８８％、もしくは少なくとも８９％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９１％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９３％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、もしくは１００％の核酸配列同一性を共有するその機能的相同体を含む。いくつかの実施形態では、異種シキミ酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする核酸は、例えば、ｃｇＡｒｏＥ、ｅｃＡｒｏＥ、または配列番号１１もしくは１２によってコードされるシキミ酸デヒドロゲナーゼ酵素と少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％のポリペプチド配列同一性を共有する機能的に相同なポリペプチドをコードする。
【0088】
いくつかの実施形態では、異種ＤＡＨＰシンターゼ酵素をコードする核酸は、ａｒｏＧを含む。いくつかの実施形態では、異種ＤＡＨＰシンターゼ酵素をコードする核酸は、（ｉ）配列番号１０、（ｉｉ）配列番号１０によってコードされるＤＡＨＰシンターゼ酵素に機能的に相同なＤＡＨＰシンターゼ酵素をコードする、配列番号１０と少なくとも９０％の同一性を有する核酸、または（ｉｉｉ）配列番号１０によってコードされるＤＡＨＰシンターゼ酵素と少なくとも９０％の同一性を有する機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸を含む。
【0089】
いくつかの実施形態では、異種ＤＡＨＰシンターゼ酵素をコードする核酸は、ａｒｏＧもしくは配列番号１０、または、例えば、それと少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも８６％、もしくは少なくとも８７％、もしくは少なくとも８８％、もしくは少なくとも８９％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９１％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくともそれと９３％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、もしくは１００％の核酸配列同一性を共有するその機能的相同体を含む。いくつかの実施形態では、異種ＤＡＨＰシンターゼ酵素をコードする核酸は、例えば、ａｒｏＧまたは配列番号１０によってコードされるＤＡＨＰシンターゼ酵素と少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％のポリペプチド配列同一性を共有するその機能的に相同なポリペプチドをコードする。
【0090】
いくつかの実施形態では、異種二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ酵素をコードする核酸は、ｐｈｅＡ１またはｐｈｅＡ２を含む。いくつかの実施形態では、異種二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ酵素をコードする核酸は、（ｉ）配列番号１３または１４、（ｉｉ）配列番号１３または１４によってコードされる二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ酵素に機能的に相同な二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ酵素をコードする、配列番号１３または１４と少なくとも９０％の同一性を有する核酸、または（ｉｉｉ）配列番号１３または１４によってコードされる二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ酵素と少なくとも９０％の同一性を有する機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸を含む。
【0091】
いくつかの実施形態では、異種二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ酵素をコードする核酸は、ｐｈｅＡ１、ｐｈｅＡ２、または配列番号１３もしくは１４、または、例えば、それと少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも８６％、もしくは少なくとも８７％、もしくは少なくとも８８％、もしくは少なくとも８９％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９１％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９３％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、もしくは１００％の核酸配列同一性を共有するその機能的相同体を含む。いくつかの実施形態では、異種の二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ酵素をコードする核酸は、ｐｈｅＡ１、ｐｈｅＡ２、または配列番号１３もしくは１４によってコードされる二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ酵素と少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％のポリペプチド配列同一性を共有する機能的に相同なポリペプチドをコードする。
【0092】
いくつかの実施形態では、微生物は、以下の選択肢の中から選択される異種酵素のセットを含む：
（１）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（５）ｃｇＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｒｒＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（７）ｐｈｅＡ１、ａｒｏＧ、ａｂＰＰＤＣ、およびｅｃＰＡＲ、
（８）ｅｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（９）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１１）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１２）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１３）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１６）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１７）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１８）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１９）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２１）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（２３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２４）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、または
（２７）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ。
（１）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（５）ｃｇＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｒｒＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（７）ｐｈｅＡ１、ａｒｏＧ、ａｂＰＰＤＣ、およびｅｃＰＡＲ、
（８）ｅｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（９）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１１）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１２）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１３）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１６）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１７）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１８）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１９）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２１）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（２３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２４）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、または
（２７）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ。
【0093】
いくつかの実施形態では、微生物は、以下の選択肢の中から選択される異種核酸のセットを含む：
（１）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（５）ｃｇＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｒｒＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（７）ｐｈｅＡ１、ａｒｏＧ、ａｂＰＰＤＣ、およびｅｃＰＡＲ、
（８）ｅｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（９）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１１）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１２）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１３）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１６）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１７）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１８）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１９）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２１）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（２３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２４）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、または
（２７）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ。
（１）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（５）ｃｇＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｒｒＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（７）ｐｈｅＡ１、ａｒｏＧ、ａｂＰＰＤＣ、およびｅｃＰＡＲ、
（８）ｅｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（９）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１１）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１２）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１３）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１６）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１７）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１８）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１９）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２１）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（２３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２４）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、または
（２７）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ。
【0094】
いくつかの実施形態では、微生物は、表３に記載されるコンビナトリアル株２Ｃ０３、１Ｃ１０、２Ｃ５４、２Ｃ０９、２Ｃ４７、２Ｃ５５、２Ｃ５３、Ｈ５７、１Ｃ４７、２Ｃ１０、２Ａ１８、１Ｃ５４、２Ｃ０１、１Ｃ３１、２Ｂ１７、２Ｃ５２、１Ｃ０９、Ｈ１８、Ｈ５８、２Ｃ２７、２Ｄ２２、２Ｄ０７、２Ｄ２４、２Ｄ０３、１Ｃ２９、２Ｂ２６、２Ｃ３８、２Ａ２７、２Ｃ１２、または２Ｂ２７の異種遺伝子およびプロモータを含む。
【0095】
別の実施形態では、本開示は、細菌を形質転換して、本開示の２－フェニルエタノール産生細菌を産生するために使用することができるプラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、プラスミドは、（ａ）異種デカルボキシラーゼ酵素をコードする核酸と、（ｂ）異種フェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（ＰＡＲ）酵素をコードする核酸とを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、（ａ）異種デカルボキシラーゼ酵素をコードする核酸と、（ｂ）異種フェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（ＰＡＲ）酵素をコードする核酸と、（ｃ）異種シキミ酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする核酸と、（ｄ）異種ＤＡＨＰシンターゼ酵素をコードする核酸と、（ｅ）異種二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ酵素をコードする核酸とを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）異種デカルボキシラーゼ酵素をコードする核酸と、（ｂ）異種フェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（ＰＡＲ）酵素をコードする核酸と、（ｃ）異種シキミ酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする核酸とを含む第１のプラスミド、（ｄ）異種ＤＡＨＰシンターゼ酵素をコードする核酸と、（ｅ）異種二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ酵素をコードする核酸とを含む第２のプラスミドである、２プラスミド系を提供する。１つ以上のプラスミドが細菌に形質転換される場合、望ましくは、細菌は酵素を発現する。あるいは、誘導可能なプロモータが発現のために使用される場合、酵素は誘導された場合にのみ発現され得る。
【0096】
一実施形態は、２－フェニルエタノールを産生することができる微生物であり、微生物は、（ａ）フェニルピルビン酸をフェニルアセトアルデヒドに変換する異種酵素と、（ｂ）フェニルアセトアルデヒドを２－フェニルエタノールに変換する異種酵素とを含む。
【0097】
（ａ）フェニルピルビン酸をフェニルアセトアルデヒドに変換する異種酵素がデカルボキシラーゼであり、（ｂ） フェニルアセトアルデヒドを２－フェニルエタノールに変換する異種酵素がフェニルアセトアルデヒドレダクターゼである、一実施形態の微生物。
【0098】
デカルボキシラーゼがフェニルピルビン酸特異的デカルボキシラーゼである、一実施形態の微生物。
【0099】
微生物がＣ１固定微生物である、一実施形態の微生物。
【0100】
微生物がＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物である、一実施形態の微生物。
【0101】
微生物が細菌である、一実施形態の微生物。
【0102】
微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属のメンバーである、一実施形態の微生物。
【0103】
微生物が、フェニルピルビン酸を天然に産生することができる、一実施形態の微生物。
【0104】
微生物が、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２をアセチル－ＣｏＡに変換するＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む、一実施形態の微生物。
【0105】
微生物が、（ｃ）アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換する天然酵素、（ｄ）ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する天然酵素、（ｅ）ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸を２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸に変換する天然酵素、（ｆ）２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸を３－デヒドロキナ酸に変換する天然酵素、（ｇ）３－デヒドロキナ酸を３－デヒドロシキミ酸に変換する天然酵素、（ｈ）３－デヒドロシキミ酸をシキミ酸に変換する天然酵素、（ｉ）シキミ酸をシキミ酸３－リン酸に変換する天然酵素、（ｊ）シキミ酸３－リン酸を５－Ｏ－（１－カルボキシビニル）－シキミ酸３－リン酸に変換する天然酵素、（ｋ）５－Ｏ－（１－カルボキシビニル）－シキミ酸３－リン酸をコリスミ酸に変換する天然酵素、または（ｌ）コリスミ酸をフェニルピルビン酸に変換する天然酵素のうちの１つ以上を含む、一実施形態の微生物。
【0106】
（ｃ）アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換する天然酵素が、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素である、（ｄ）ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する天然酵素は、ピルビン酸リン酸ジキナーゼである、（ｅ）ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸を２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸に変換する天然酵素が、２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸シンターゼである、（ｆ）２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸を３－デヒドロキナ酸に変換するネイティブ酵素が、３－デヒドロキナ酸シンターゼである、（ｇ）３－デヒドロキナ酸を３－デヒドロシキミ酸に変換する天然の酵素が、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼである、（ｈ）３－デヒドロシキミ酸をシキミ酸に変換する天然酵素が、シキミ酸デヒドロゲナーゼである、（ｉ）シキミ酸をシキミ酸３－リン酸に変換する天然酵素が、シキミ酸キナーゼである、（ｊ）シキミ酸３－リン酸を５－Ｏ－（１－カルボキシビニル）－シキミ酸３－リン酸に変換する天然酵素が、５－エノールピルビルシキミ酸３－リン酸シンターゼである、（ｋ）５－Ｏ－（１－カルボキシビニル）－シキミ酸３－リン酸をコリスミ酸に変換する天然の酵素が、コリスミ酸シンターゼである、または、（ｌ）コリスミ酸をフェニルピルビン酸に変換する天然の酵素が、二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼである、一実施形態の微生物。
【0107】
微生物が、（ｅ）ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸を２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸に変換する異種酵素、（ｈ）３－デヒドロシキミ酸をシキミ酸に変換する異種酵素、または（ｌ）コリスミ酸をフェニルピルビン酸に変換する異種酵素のうちの１つ以上をさらに含む、一実施形態の微生物。
【0108】
（ｅ）ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース－４－リン酸を２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸に変換する異種酵素が、２－デヒドロ－３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプトン酸７－リン酸シンターゼである、（ｈ）３－デヒドロシキミ酸をシキミ酸に変換する異種酵素が、シキミ酸デヒドロゲナーゼである、または（ｌ）コリスミ酸をフェニルピルビン酸に変換する異種酵素が、二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼである、一実施形態の微生物。
【0109】
微生物が、
（１）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（５）ｃｇＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｒｒＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（７）ｐｈｅＡ１、ａｒｏＧ、ａｂＰＰＤＣ、およびｅｃＰＡＲ、
（８）ｅｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（９）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１１）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１２）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１３）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１６）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１７）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１８）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１９）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２１）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（２３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２４）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、または
（２７）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧを含む、実施形態のいずれか１つの微生物。
（１）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（５）ｃｇＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｒｒＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（７）ｐｈｅＡ１、ａｒｏＧ、ａｂＰＰＤＣ、およびｅｃＰＡＲ、
（８）ｅｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（９）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１１）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１２）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１３）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１４）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１６）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｌｅＰＡＲ、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（１７）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１８）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（１９）ｅｃＡｒｏＥ、ｋｉｖＤ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２０）ｃｇＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２１）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｂｌＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２２）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ１、およびａｒｏＧ、
（２３）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２４）ｃｇＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２５）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ｒｓＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、
（２６）ｅｃＡｒｏＥ、ａｒｏ１０、ａｄｈ６、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧ、または
（２７）ｅｃＡｒｏＥ、ａｂＰＰＤＣ、ｅｃＰＡＲ、ｐｈｅＡ２、およびａｒｏＧを含む、実施形態のいずれか１つの微生物。
【0110】
微生物が、コンビナトリアル株２Ｃ０３、１Ｃ１０、２Ｃ５４、２Ｃ０９、２Ｃ４７、２Ｃ５５、２Ｃ５３、Ｈ５７、１Ｃ４７、２Ｃ１０、２Ａ１８、１Ｃ５４、２Ｃ０１、１Ｃ３１、２Ｂ１７、２Ｃ５２、１Ｃ０９、Ｈ１８、Ｈ５８、２Ｃ２７、２Ｄ２２、２Ｄ０７、２Ｄ２４、２Ｄ０３、１Ｃ２９、２Ｂ２６、２Ｃ３８、２Ａ２７、２Ｃ１２、または２Ｂ２７の異種遺伝子およびプロモータを含む、実施形態のいずれか１つの微生物。
【0111】
微生物が、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２を含むガス基質を発酵させて、２－フェニルエタノールを産生する、実施形態のいずれか１つの微生物。
【0112】
ガス基質が、合成ガスまたは産業廃棄物ガスを含む、一実施形態の微生物。
【0113】
微生物が、いずれの他のＣ３＋アルコールも産生しない、一実施形態の微生物。
【0114】
微生物が、いずれの他のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０アルコールも産生しない、一実施形態の微生物。
【0115】
一実施形態は、ガス基質の存在下で実施形態のいずれか１つの微生物を培養することを含む、２－フェニルエタノールを産生する方法である。
【0116】
ガス基質が、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２を含むＣ１炭素源を含む、一実施形態の方法。
【0117】
ガス基質が、合成ガスまたは産業廃棄物ガスを含む、実施形態のいずれか１つの方法。
【実施例】
【0118】
以下の実施例は、本開示の方法および組成物をさらに例示するが、いかなる方法によってもその範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【0119】
本研究では、デカルボキシラーゼおよびフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（ＰＡＲ）の標的代謝工学を、Ｃ１固定細菌で実施して、２－ＰＥの選択性および産生を改善した。２－ＰＥ生合成へのフラックスをさらに改善するために、シキミ酸経路からの３つの異種遺伝子がさらに組み合わせて含まれていた。以下の実施例で異種発現された２－ＰＥ生合成経路および遺伝子が、図１で強調されている。
【0120】
実施例１．Ｓｃｈｏｔｔ瓶中のＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの２－ＰＥ耐性
２－ＰＥは２６～４３ｍＭ（３．２～５．３ｇ／Ｌ）レベルで、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍなどのグラム陽性微生物に対して増殖阻害効果を発揮することが報告されている（Ｃｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９０；１４１（４）：４８３－９７）。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの独立栄養性増殖に対する２－ＰＥの毒性を調べるために、２－ＰＥチャレンジ実験（０、０．２、０．６、２および５ｇ／Ｌでの）が、合成ガス混合物（５０％のＣＯ、１０％のＨ２、３０％のＣＯ２および１０％のＮ２）を有するＳｃｈｏｔｔボトル中で行われた。チャレンジされていない培養物と比較して、２ｇ／Ｌの２－ＰＥは、増殖遅延期の増加およびバイオマス濃度の低下をもたらした（図２ＡおよびＢ）。５ｇ／Ｌのチャレンジレベルでは、増殖は検出されなかった（図２ＡおよびＢ）。０．２ｇ／Ｌおよび０．６ｇ／Ｌでの２－ＰＥのチャレンジは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの独立栄養性増殖にほとんど影響を与えなかった。
２－ＰＥは２６～４３ｍＭ（３．２～５．３ｇ／Ｌ）レベルで、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍなどのグラム陽性微生物に対して増殖阻害効果を発揮することが報告されている（Ｃｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９０；１４１（４）：４８３－９７）。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの独立栄養性増殖に対する２－ＰＥの毒性を調べるために、２－ＰＥチャレンジ実験（０、０．２、０．６、２および５ｇ／Ｌでの）が、合成ガス混合物（５０％のＣＯ、１０％のＨ２、３０％のＣＯ２および１０％のＮ２）を有するＳｃｈｏｔｔボトル中で行われた。チャレンジされていない培養物と比較して、２ｇ／Ｌの２－ＰＥは、増殖遅延期の増加およびバイオマス濃度の低下をもたらした（図２ＡおよびＢ）。５ｇ／Ｌのチャレンジレベルでは、増殖は検出されなかった（図２ＡおよびＢ）。０．２ｇ／Ｌおよび０．６ｇ／Ｌでの２－ＰＥのチャレンジは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの独立栄養性増殖にほとんど影響を与えなかった。
【0121】
実施例２．改善された２－ＰＥ選択性と産生のための脱炭酸酵素変異形の試験
２－ＰＥ株の最適化では、フェニルピルビン酸特異的デカルボキシラーゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｋｎｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２０１１；２７８：１８４２－５３）由来のａｒｏ１０）（配列番号：４）およびＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ（Ｓｐａｅｐｅｎ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００７；１８９：７６２６ ＬＰ－７６３３）（配列番号：２）由来のａｂＰＰＤＣを含む２つのプラスミドを、Ｃ． ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに形質転換し、それぞれｓＦＡ２１２株およびｓＦＡ２１３株を得た。これらの２つのデカルボキシラーゼ株は、デカルボキシラーゼｋｉｖｄ＿１ａ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来）（配列番号１）を発現するコントロール株（ｓＦＡ２００）とともに、Ｓｃｈｏｔｔ瓶中で合成ガス混合物（５０％のＣＯ、１０％のＨ２、３０％のＣＯ２、および１０％のＮ２）における独立栄養性増殖処理された（図３ＡおよびＢ）。３つのデカルボキシラーゼ株は、同様の増殖プロファイルを示したが、異なるアルコールプロファイルを示した（図３ＡおよびＢ）。水素炎イオン化検出を伴うエンドポイントガスクロマトグラフィー（ＧＣ－ＦＩＤ）の結果は、ａｒｏ１０株が、５．６ｍｇ／Ｌの２－メチル－１－プロパノールおよび４．０ｍｇ／Ｌの３－メチル－１－ブタノールを産生しながら、コントロールのｋｉｖｄ＿ｌａ株よりも５７％少ない２－ＰＥを産生することを示した。対照的に、ａｂＰＰＤＣ株はコントロール株と同様の量の２－ＰＥを産生したが、分岐鎖アルコールは産生しなかった。いくつかの実施形態では、ａｂＰＰＤＣ株による２－ＰＥに対する選択性の増加は、分岐鎖アルコールが細胞毒性に対して相加効果を及ぼす可能性があるため、下流の産生物分離を簡素化し、株の安定性を改善する可能性がある。
２－ＰＥ株の最適化では、フェニルピルビン酸特異的デカルボキシラーゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｋｎｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２０１１；２７８：１８４２－５３）由来のａｒｏ１０）（配列番号：４）およびＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ（Ｓｐａｅｐｅｎ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００７；１８９：７６２６ ＬＰ－７６３３）（配列番号：２）由来のａｂＰＰＤＣを含む２つのプラスミドを、Ｃ． ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに形質転換し、それぞれｓＦＡ２１２株およびｓＦＡ２１３株を得た。これらの２つのデカルボキシラーゼ株は、デカルボキシラーゼｋｉｖｄ＿１ａ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来）（配列番号１）を発現するコントロール株（ｓＦＡ２００）とともに、Ｓｃｈｏｔｔ瓶中で合成ガス混合物（５０％のＣＯ、１０％のＨ２、３０％のＣＯ２、および１０％のＮ２）における独立栄養性増殖処理された（図３ＡおよびＢ）。３つのデカルボキシラーゼ株は、同様の増殖プロファイルを示したが、異なるアルコールプロファイルを示した（図３ＡおよびＢ）。水素炎イオン化検出を伴うエンドポイントガスクロマトグラフィー（ＧＣ－ＦＩＤ）の結果は、ａｒｏ１０株が、５．６ｍｇ／Ｌの２－メチル－１－プロパノールおよび４．０ｍｇ／Ｌの３－メチル－１－ブタノールを産生しながら、コントロールのｋｉｖｄ＿ｌａ株よりも５７％少ない２－ＰＥを産生することを示した。対照的に、ａｂＰＰＤＣ株はコントロール株と同様の量の２－ＰＥを産生したが、分岐鎖アルコールは産生しなかった。いくつかの実施形態では、ａｂＰＰＤＣ株による２－ＰＥに対する選択性の増加は、分岐鎖アルコールが細胞毒性に対して相加効果を及ぼす可能性があるため、下流の産生物分離を簡素化し、株の安定性を改善する可能性がある。
【0122】
本明細書に開示される本実施例および他の実施例について、以下のように、直鎖アルコールおよび分枝鎖アルコールについてＧＣ－ＦＩＤを実行した。アルコール濃度は、ＺＢ－１カラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．３μｍ）に直列に接続されたオートサンプラー、水素炎イオン化検出（ＦＩＤ）、およびＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＺＢ－ＷＡＸｐｌｕｓカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ×１μｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ｂ ＧＣを使用したガスクロマトグラフィー分析によって測定された。１．４００ｍＬの試料を新しい２ｍＬのマイクロ遠心チューブに移し、続いて、２０μＬの内部標準溶液（エタノール中の酢酸フェニル）を添加することにより、試料を調製した。これに、４００μＬのクロロホルムを添加し、質量を記録した。試料を水平方向に６０秒間振とうし、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離し、次いで、２００μＬの最下層を少量のインサートを含有するガラスバイアルに移した。１ｕＬ注入の分析を、１０対１のスプリット比および２５０°Ｃの注入口温度を使用して実行した。７０°Ｃの開始オーブン温度（保持なし）、３°Ｃ／ｍｉｎでの１２０°Ｃまでの初期ランプ（保持なし）、および７°Ｃ／ｍｉｎでの２３０°Ｃまでの最終ランプ（１４分間保持）で、分離が達成された。キャリアガスとしてヘリウムを用いて、カラム流速を３５ｃｍ／秒に設定した。４００ｍＬ／ｍｉｎの空気、４０ｍＬ／ｍｉｎの水素ガス、および１５ｍＬ／ｍｉｎのヘリウム（メークアップガス）で、ＦＩＤを２８０°Ｃに設定した。結果は、線形適合を使用した内部標準キャリブレーションを使用して計算された。
【0123】
実施例３．改善された２－ＰＥ産生のためのフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（ＰＡＲ）変異形の試験
２－ＰＥ経路（図１）の最後のステップを触媒するフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（ＰＡＲ）の５つの遺伝子変異形（ｌｅＰＡＲ（配列番号９）、ｅｃＰＡＲ（配列番号６）、ｂｌＰＡＲ（配列番号５）、ｒｒＰＡＲ（配列番号７）、およびｒｓＰＡＲ（配列番号８）、図４ＡおよびＢ）は、デカルボキシラーゼａｂＰＰＤＣ（配列番号：２）およびシキミ酸デヒドロゲナーゼｅｃＡｒｏＥ（配列番号：１１）を含む発現ベクターに個別にクローニングされた。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍへの形質転換後、得られた組換え株を、２００ｋＰａの合成ガス混合物（５０％のＣＯ、１０％のＨ２、３０％のＣＯ２、および１０％のＮ２）を使用した１２ウェルプレートにおいて２－ＰＥ産生について試験した。１日目にインデューサーを添加し、７日目にＧＣ－ＦＩＤ分析用に試料を収集した。新しいＰＡＲ株のうちの３つ（ｂｌＰＡＲ、ｅｃＰＡＲ、およびｒｓＰＡＲ）は、ａｄｈ６（配列番号３）コントロール株よりも多くの２－ＰＥ（バイオマスによって正規化された）を産生した（図４Ｃ）。
２－ＰＥ経路（図１）の最後のステップを触媒するフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（ＰＡＲ）の５つの遺伝子変異形（ｌｅＰＡＲ（配列番号９）、ｅｃＰＡＲ（配列番号６）、ｂｌＰＡＲ（配列番号５）、ｒｒＰＡＲ（配列番号７）、およびｒｓＰＡＲ（配列番号８）、図４ＡおよびＢ）は、デカルボキシラーゼａｂＰＰＤＣ（配列番号：２）およびシキミ酸デヒドロゲナーゼｅｃＡｒｏＥ（配列番号：１１）を含む発現ベクターに個別にクローニングされた。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍへの形質転換後、得られた組換え株を、２００ｋＰａの合成ガス混合物（５０％のＣＯ、１０％のＨ２、３０％のＣＯ２、および１０％のＮ２）を使用した１２ウェルプレートにおいて２－ＰＥ産生について試験した。１日目にインデューサーを添加し、７日目にＧＣ－ＦＩＤ分析用に試料を収集した。新しいＰＡＲ株のうちの３つ（ｂｌＰＡＲ、ｅｃＰＡＲ、およびｒｓＰＡＲ）は、ａｄｈ６（配列番号３）コントロール株よりも多くの２－ＰＥ（バイオマスによって正規化された）を産生した（図４Ｃ）。
【0124】
実施例４．２－ＰＥ経路のコンビナトリアル解析
２－ＰＥの生合成に最適なフラックスおよび遺伝子変異形を決定するために、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ（ＧＧ）メソッドを使用した２－ＰＥ経路遺伝子およびプロモータのコンビナトリアルアセンブリを、Ｃ１利用微生物への形質転換前に大腸菌で最初に実行した（図５）。アセンブリのスクリーニングを容易にするために、Ｇｏｌｄｅｎ ＧａｔｅサイトＧＧ１およびＧＧ６に隣接するｃｃｄＢ毒素抗毒素対抗選択マーカーを最初にクロストリジウム－Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターｐＭＴＬ８２２５にクローニングした（Ｈｅａｐ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，７８：７９－８５，２００９）。これらのシャトルベクターは、プレクローニングされたクロストリジウムプロモータ（図５にＰ１として示される）およびターミネーター（図５にＴ３として示される）を有する。シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ａｒｏＥによってコードされる）、ＤＡＨＰシンターゼ（ａｒｏＧによってコードされる）、二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ（ｐｈｅＡ）、デカルボキシラーゼ、およびフェニルアセトアルデヒド（ＰＡＲ）をコードする遺伝子を、２つのドナーベクター（ターミネーターとプロモータを提供するｐＤｏｎｏｒ２およびｐＤｏｎｏｒ４）とともに、ＧＧアセンブリ用のシャトルベクターに添加した。プロモータ配列。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅサイトおよびアセンブリワークフローは、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０２０）ｖｏｌ５（１）：ｙｓａａ０１９に記載されている。得られたｅｒｍＢ抗生物質選択マーカーを有するコンビナトリアルプラスミド（表３においてまとめてプラスミド１と呼ばれる）は、ａｒｏＥ（またはｐｈｅＡ＋ａｒｏＧ）、デカルボキシラーゼおよびＰＡＲの各々を隔離された方法で発現するプロモータおよびターミネーターを有する。
２－ＰＥの生合成に最適なフラックスおよび遺伝子変異形を決定するために、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ（ＧＧ）メソッドを使用した２－ＰＥ経路遺伝子およびプロモータのコンビナトリアルアセンブリを、Ｃ１利用微生物への形質転換前に大腸菌で最初に実行した（図５）。アセンブリのスクリーニングを容易にするために、Ｇｏｌｄｅｎ ＧａｔｅサイトＧＧ１およびＧＧ６に隣接するｃｃｄＢ毒素抗毒素対抗選択マーカーを最初にクロストリジウム－Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターｐＭＴＬ８２２５にクローニングした（Ｈｅａｐ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，７８：７９－８５，２００９）。これらのシャトルベクターは、プレクローニングされたクロストリジウムプロモータ（図５にＰ１として示される）およびターミネーター（図５にＴ３として示される）を有する。シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ａｒｏＥによってコードされる）、ＤＡＨＰシンターゼ（ａｒｏＧによってコードされる）、二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ（ｐｈｅＡ）、デカルボキシラーゼ、およびフェニルアセトアルデヒド（ＰＡＲ）をコードする遺伝子を、２つのドナーベクター（ターミネーターとプロモータを提供するｐＤｏｎｏｒ２およびｐＤｏｎｏｒ４）とともに、ＧＧアセンブリ用のシャトルベクターに添加した。プロモータ配列。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅサイトおよびアセンブリワークフローは、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０２０）ｖｏｌ５（１）：ｙｓａａ０１９に記載されている。得られたｅｒｍＢ抗生物質選択マーカーを有するコンビナトリアルプラスミド（表３においてまとめてプラスミド１と呼ばれる）は、ａｒｏＥ（またはｐｈｅＡ＋ａｒｏＧ）、デカルボキシラーゼおよびＰＡＲの各々を隔離された方法で発現するプロモータおよびターミネーターを有する。
【0125】
この研究では、２つの２ＰＥコンビナトリアルライブラリー、１プラスミドライブラリーおよび２プラスミドライブラリー（表３）を構築して試験した。コンビナトリアル分析に含まれた遺伝子変異形（２ｘａｒｏＥ（配列番号：１１、１２）、３ｘデカルボキシラーゼ（配列番号：１、２、４）、６ｘＰＡＲ（配列番号：３、５、６、７、８、９）、２×二官能性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ（ｐｈｅＡ）（配列番号１３、１４）、および１×ＤＡＨＰシンターゼ（ａｒｏＧ）（配列番号１０））を表２に示す。（図１２）は、実施例４に記載の２つの２－ＰＥコンビナトリアルライブラリーに使用された遺伝子およびプロモータ変異形を示す。
【表2】
【0126】
２プラスミドライブラリーの場合、強度の異なる３つのプロモータ（Ｐｆｅｒ－ｌａｃＯ－ＵＳ、ＰＷＬおよびＰｐｆｏｒ）を使用して、プラスミド１でａｒｏＥ、デカルボキシラーゼ、およびＰＡＲの各々を発現させた。ｐｈｅＡ１＋ａｒｏＧまたはｐｈｅＡ２＋ａｒｏＧの発現を駆動する１つのプロモータ（ＰＷＬ）のみを有するプラスミド２（ｃａｔＰ抗生物質選択マーカー）を個別にＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに形質転換した。得られた形質転換体は、その後、コンビナトリアルプラスミド１が導入された宿主となり、互換性のあるグラム陽性レプリコンを備えた異なる抗生物質耐性を付与する２つの発現ベクターを担持する組換え株が得られた。２プラスミドコンビナトリアルライブラリーの順列総数は１９４４通り（３×２×３×３×３×６×１×２×１）であった。
【0127】
１プラスミドライブラリーの場合、プラスミド１のａｒｏＥは（ｐｈｅＡ１／ｐｈｅＡ２）＋ａｒｏＧで置換された。これにより、１つのプラスミド（ａｒｏＥは省略されている）および９７２通り（３×２×３×３×３×６）の順列のみが得られた。このプロセス中に、リボソーム結合部位とａｒｏＧの開始コドンとの間のスペーサー距離は、ａｒｏＧの翻訳を強化するために５ヌクレオチドから８ヌクレオチドに拡張された。
【0128】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるコンビナトリアルプラスミドのアセンブリ効率を決定し、プロモータと遺伝子変異形の組み合わせを調査するために、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株ＮＥＢ１０－ベータから４００個のプラスミドを抽出して、配列決定にかけた。シーケンス結果の分析は、５１．３％のアセンブリ率を示し、各プロモータおよび遺伝子変異形の多様性が良好であった。これらの配列検証済みコンビナトリアルプラスミドをＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに形質変換した後、合計１６２個のコンビナトリアル株（４２個の１プラスミド株および１２０個の２プラスミド株）を１２ウェルプレートで独立栄養性増殖にかけた。
【0129】
増殖実験は、２ｍＬの最少培地および２００ｋＰａの合成ガス混合物（５０％のＣＯ、１０％のＨ２、３０％のＣＯ２、および１０％のＮ２）を有する１２ウェルプレートで、３７°Ｃで８～１０日間技術的に複製して実施した（図７Ａ～Ｃ）。次いで、バイオマス測定およびＧＣ－ＦＩＤ分析のためにブロスサンプルを採取して、２－ＰＥ力価を決定した。誘導性プロモータＰｉｐｌ１２の下でａｂＰＰＤＣとともにａｄｈ６を発現するプラスミド（プラスミド１と同じバックボーン）を持つｓＦＡ２１２株の３つの生物学的クローンをコントロール株として選択したが、これは、この株が、１２ウェルプレート、Ｓｃｈｏｔｔ瓶、および連続撹拌タンク反応器（ＣＳＴＲ）内で豊富な量の２－ＰＥを連続的に産生したためである。１２ウェルプレート当たり１つのメディアブランクコントロールウェルがネガティブコントロールとして含まれており、ＧＣ－ＦＩＤ分析では１．７ｍｇ／Ｌ未満の２－ＰＥが示され、皆無かそれに近いウェル間の相互汚染が示された。
【0130】
８～１０日間のインキュベーションの後、２－ＰＥコンビナトリアル株は０．６～１．０ｇＤＣＷ／Ｌのバイオマス濃度に達した（図７Ｃ）。これらの１６２個のコンビナトリアル株のうち、８０個の株（スクリーニングされたライブラリーの４９％）が、コントロール株よりも１．５倍以上の２－ＰＥを産生した（図７Ａ）。４８個の株（スクリーニングされたライブラリーの３０％）は、コントロール株によって生成された２－ＰＥの半分未満を産生した（図７Ａ）。
【0131】
２－ＰＥコンビナトリアルライブラリーの詳細な分析を、２－ＰＥ産生に対する遺伝子変異形およびプラスミド数の影響を識別するために実施した（図８Ａ～Ｅ）。１プラスミドライブラリーおよび２プラスミドライブラリー、デカルボキシラーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ間で２－ＰＥ力価に有意差は観察されなかった（図８Ａ、８Ｃ、および８Ｄ）。ｐｈｅＡ２を有する株は、ｐｈｅＡ１を有する株よりもわずかに高い２－ＰＥ力価を示した（図８Ｂ）。ＰＡＲ変異形のいくつか（例えば、ｂｌＰＡＲ）は、ａｄｈ６変異形よりも多くの２－ＰＥを産生した（図８Ｅ）。各遺伝子変異形またはプラスミド番号で観察された大きな２－ＰＥ力価の変動は、コンビナトリアルデザインにおける単一パラメーターの効果を希薄にする、他の経路遺伝子変異形とプロモータの組み合わせの集合的な効果に起因する可能性がある。
【0132】
コントロール株ｓＦＡ２１２と比較して２－ＰＥの力価をランク付けすることにより、上位３０の２－ＰＥ産生コンビナトリアル株とそれらの遺伝子型のリストが作成された（表３）。スクリーニングされたコンビナトリアルライブラリーの７４％はいずれかのａｒｏＥを有する２プラスミド株であったが、上位３０の２－ＰＥ産生株の９０％が２つのプラスミドを担持していた。上位１０の２－ＰＥ産生株は全て、脱炭酸酵素変異形ｋｉｖＤ＿ｌａまたはａｂＰＰＤＣのいずれかで構成されていたが、脱炭酸酵素ａｒｏ１０を有する株は、上位１１と上位３０の２－ＰＥ産生株間に８回出現した。ＰＡＲ変異形ｌｅＰＡＲおよびｅｃＰＡＲを有する株は、上位３０の２－ＰＥ産生物の７０％を占め、スクリーニングされたライブラリーの５７％の全体的な表現と比較して不釣り合いに高かった。ＰＡＲ変異形ａｄｈ６を有する株は、上位３０の２－ＰＥ産生物で大幅に過小評価され、スクリーニングされたライブラリー全体での１３．６％に対して、上位３０でわずか６．７％であった。
【表3】
【0133】
実施例５．ＣＳＴＲでの合成ガス発酵からの２－ＰＥ産生
合計１２個のコンビナトリアル株を連続発酵モードでＣＳＴＲで特徴付け、それらの２－ＰＥ産生を参照株ｓＦＡ２１２と比較した。大気圧で合成ガス混合物（４０％のＣＯ、２０％のＨ２、２０％のＣＯ２、および２０％のＮ２）を含む２－Ｌ ＣＳＴＲについての接種材料として、Ｓｃｈｏｔｔ瓶からの活発に増殖する（初期指数関数的）培養物を使用した。バイオマス濃度が約０．５ｇＤＣＷ／Ｌに達すると、１／日の培地希釈率および０．５／日の細菌希釈率を維持した。
合計１２個のコンビナトリアル株を連続発酵モードでＣＳＴＲで特徴付け、それらの２－ＰＥ産生を参照株ｓＦＡ２１２と比較した。大気圧で合成ガス混合物（４０％のＣＯ、２０％のＨ２、２０％のＣＯ２、および２０％のＮ２）を含む２－Ｌ ＣＳＴＲについての接種材料として、Ｓｃｈｏｔｔ瓶からの活発に増殖する（初期指数関数的）培養物を使用した。バイオマス濃度が約０．５ｇＤＣＷ／Ｌに達すると、１／日の培地希釈率および０．５／日の細菌希釈率を維持した。
【0134】
これらの連続的なＣＳＴＲ条件下で、参照株ｓＦＡ２１２は７０ｍｇ／Ｌの２－ＰＥ力価を達成した。５個のコンビナトリアル株（１Ｃ２９、２Ｃ５４、２Ｃ０３、２Ｃ５３、および２Ｃ３１）は、参照株よりも多くの２－ＰＥを産生した（図９Ａ）。特に、株１Ｃ２９は、参照株よりも２．９倍高い２００ｍｇ／Ｌの２－ＰＥを産生した。２－ＰＥ収量に基づくと、１２個のコンビナトリアル株のうちの１０株が、参照株と比較して優れた２－ＰＥ性能を示した（図９Ｂ）。
【0135】
２回の反復ＣＳＴＲ実験におけるコンビナトリアル株１Ｃ２９の性能を図１０ＡおよびＢに示す。２－ＰＥ産生を強化するために、ＮＨ４ＯＨの形での窒素供給を、複製物１（図１０Ａ）では７日目、複製物２（図１０Ｂ）では９日目に、１５ｍＭに制限した。その結果、２－ＰＥの産生が両方の実行で増加し、それぞれ３５０ｍｇ／Ｌおよび３００ｍｇ／Ｌでピークに達した。２－ＰＥの産生性は、実行１で一時的に１６ｍｇ／Ｌ／ｈでピークに達した。
【0136】
バイオマス、林業廃棄物、都市固形廃棄物などの廃棄物材料のガス化に由来する合成ガスには、多くの場合、有毒な汚染物質が含有されている。例えば、メタン、エタン、エチレン、およびアセチレンは、検出された汚染物質に含まれており、微生物に対してｐｐｍレベルで有毒であることが知られている。遺伝子操作されたＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるデノボ２－ＰＥ生合成の堅牢性を評価するために、ｓＦＡ２１２株をトウモロコシ茎葉由来の合成ガスを使用して連続的なＣＳＴＲ実行にかけた。この「実際の」合成ガスは、ガス処理システムを使用して前処理され、２３．３％のＨ２、３８．７％のＣＯ、１９．６％のＣＯ２、および１８．４％のＮ２の後処理ガス組成が得られた。実際の合成ガスの入手可能性が限られているため、６．９日目にガス供給を実際の合成ガスに切り替える前に、合成混合ガス（同様のガス組成を有する）を最初に使用して、定常状態の発酵培養を確立した。
【0137】
実際の合成ガス発酵の結果を（図１１Ａ～Ｃ）に示し、実際の合成ガスは６．９日目から１０．９日目まで（合計４日間）使用されている。より長い連続的なＣＳＴＲ実行を可能にするために、わずかに異なるガス組成のいくつかの実際の合成ガス瓶を使用し、その結果、ガス取り込みの変動が観測された（図１１Ｂ）。実際の合成ガスへの切り替え後、２－ＰＥ産生は、増加し続け、１０日目には安定した状態に達した。８．０日目から１３．７日目までの２－ＰＥの平均力価および産生性は、それぞれ２０８ｍｇ／Ｌおよび１１．９５ｍｇ／Ｌ／ｈである。
配列
配列
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表4-4】
【表4-5】
【表4-6】
【表4-7】
【表4-8】
【表4-9】
【表4-10】
【表4-11】
【表4-12】
【表4-13】
【表4-14】
【表4-15】
【0138】
本明細書に列挙される公表文献、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献があたかも参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、かつその全体が本明細書中に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中で任意の先行技術を参照することは、その先行技術が、あらゆる国における努力分野の共通の一般知識の一部を形成していることを認めるものではなく、またそのように受け取られるべきでもない。
【0139】
本開示の方法および組成物を記載する文脈における（特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）「１つの（ａおよびａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という用語ならびに同様の指示語の使用は、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈と明らかに相反することがない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきものとする。用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有すること」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有すること」は、特に断りのない限り、非限定的な用語（すなわち、「～を含むがこれらに限定されないこと」を意味する）と解釈されるものとする。「から本質的になる」という用語は、組成物、プロセス、または方法の範囲を、特定の材料もしくは工程、または組成物、プロセス、もしくは方法の基本的かつ新規の特性に実質的に影響しないものに限定する。代替語（例えば、「または」）の使用は、代替語の一方、両方、またはこれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別段の指示がない限り、指示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。
【0140】
本明細書の値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る各それぞれの値を個々に言及する省略法としての機能を果たすことを単に意図し、各それぞれの値は、あたかも本明細書に個々に記載されたかのように、本明細書中に組み込まれる。例えば、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、整数範囲、サイズ範囲、または厚さ範囲は、別段の指示がない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分数（整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。
【0141】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる例または例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、本開示をより良く解明することを単に意図し、かつ、別段、特許請求されない限り、本開示の方法および組成物の範囲を制限しない。本明細書におけるいかなる言葉も、本開示の方法および組成物の実施に不可欠ないかなる非特許請求要素を示すものと解釈されるべきではない。
【0142】
本開示の好ましい実施形態が、本明細書に記載されている。それらの好ましい実施形態の変化形態は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者等は、当業者が必要に応じてそのような変異形を採用することを予想し、本発明者等は、本開示の方法および組成物が本明細書に具体的に記載されるものとは別様に実施されることを意図する。したがって、本開示は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての修正物および均等物を含む。さらに、それらの全ての考えられる変異形における上記の要素のあらゆる組み合わせは、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈と明らかに相反することがない限り、本開示の方法および組成物によって包含される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【配列表】
【国際調査報告】