(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-27
(54)【発明の名称】酵素を使用して核酸配列を調製するための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20230420BHJP
C12N 9/12 20060101ALN20230420BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z
C12N9/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022565531
(86)(22)【出願日】2019-12-30
(85)【翻訳文提出日】2022-06-28
(86)【国際出願番号】 US2019068865
(87)【国際公開番号】W WO2021137845
(87)【国際公開日】2021-07-08
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522259245
【氏名又は名称】源點生物科技股▲フン▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＹＵＡＮＤＩＡＮ ＢＩＯＬＡＢＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ７１７， Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｈａｌｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｓｉｎｇ Ｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｎｏ． １０１， Ｓｅｃ． ２， Ｋｕａｎｇ－Ｆｕ Ｒｄ． Ｈｓｉｎｃｈｕ ３００１３，Ｔａｉｗａｎ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100126354
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 尚
(72)【発明者】
【氏名】陳呈堯
(72)【発明者】
【氏名】顏睿康
【テーマコード（参考）】
4B050
【Ｆターム（参考）】
4B050KK07
4B050LL05
(57)【要約】
【課題】酵素を使用して核酸配列を調製するための方法を提供することである。
【解決手段】本発明の一実施例で提供される酵素を使用して核酸配列を調製するための方法は、以下のステップ（１）～（５）を含む。（１）前処理された表面を有する反応基質を提供するステップ。（２）反応酵素により前処理された表面に末端保護基を有するヌクレオチドを配置し、かつ反応温度は４５℃～１０５℃であるステップ。（３）照射または加熱によりヌクレオチドの末端保護基を除去するステップ。（４）前記反応酵素により末端保護基を有する別のヌクレオチドをヌクレオチドに連結させ、かつ反応温度は４５℃～１０５℃であるステップ。（５）核酸配列が完成しているかどうかを判断し、完成している場合は核酸配列を取得し、完成していない場合はステップ（３）と（４）を繰り返すステップ。本発明の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法は、核酸配列の調製効率を向上することができる。
【選択図】図１
【解決手段】本発明の一実施例で提供される酵素を使用して核酸配列を調製するための方法は、以下のステップ（１）～（５）を含む。（１）前処理された表面を有する反応基質を提供するステップ。（２）反応酵素により前処理された表面に末端保護基を有するヌクレオチドを配置し、かつ反応温度は４５℃～１０５℃であるステップ。（３）照射または加熱によりヌクレオチドの末端保護基を除去するステップ。（４）前記反応酵素により末端保護基を有する別のヌクレオチドをヌクレオチドに連結させ、かつ反応温度は４５℃～１０５℃であるステップ。（５）核酸配列が完成しているかどうかを判断し、完成している場合は核酸配列を取得し、完成していない場合はステップ（３）と（４）を繰り返すステップ。本発明の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法は、核酸配列の調製効率を向上することができる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１） 前処理された表面を有する反応基質を提供するステップと、（２） 反応酵素により前記前処理された表面に末端保護基を有するヌクレオチドを配置し、かつ反応温度は４５℃～１０５℃であるステップと、
（３） 照射または加熱により前記ヌクレオチドの前記末端保護基を除去するステップと、
（４） 前記反応酵素により末端保護基を有する別のヌクレオチドを前記ヌクレオチドに連結させ、かつ反応温度は４５℃～１０５℃であるステップと、
（５） 核酸配列が完成しているかどうかを判断し、完成している場合は核酸配列を取得し、完成していない場合はステップ（３）と（４）を繰り返すステップと、
を含む、酵素を使用して核酸配列を調製するための方法。
【請求項2】
前記反応酵素はＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法。
【請求項3】
前記反応酵素はファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼである、請求項２に記載の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法。
【請求項4】
前記反応酵素はファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼである、請求項２に記載の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法。
【請求項5】
前記反応酵素はファミリーＸのＤＮＡポリメラーゼである、請求項４に記載の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法。
【請求項6】
照射または加熱により前記ヌクレオチドの前記末端保護基を除去する方法は、パターン化された方法で部分的に除去することを含む、請求項１に記載の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法。
【請求項7】
照射により前記ヌクレオチドの前記末端保護基を除去する方法は、ＵＶデジタル光処理（ＤＬＰ）チップを使用して照射を行うことを含む、請求項１に記載の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法。
【請求項8】
反応温度は５０℃～８５℃である、請求項１に記載の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法。
【請求項9】
反応温度は５５℃～７５℃である、請求項１に記載の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法。
【請求項10】
前記前処理された表面は複数のプライマーを有し、前記前処理された表面上に前記末端保護基を有する前記ヌクレオチドを配置する方法は、前記反応酵素によって前記末端保護基を有する前記ヌクレオチドを前記複数のプライマーに連結することを含む、請求項１に記載の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法。
【請求項11】
（６）制限酵素によって前記前処理された表面から前記核酸配列を切断するステップをさらに含む、請求項１に記載の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生体分子構造を調製するための装置および方法、特に、酵素を使用して核酸配列を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
２０世紀半ばに、今日の医療分野の発展につながる遺伝的および生化学的研究におけるいくつかの進歩があった。これは、１９４１年にＸ線で誘発された遺伝子ノックアウト研究から始まった一連の出来事であり、遺伝子が酵素（enzyme）機能に直接関与しているという関係を築いた。その後、遺伝子は核酸（DNA）で構成されており、二重らせんは遺伝情報を保存する核酸の構造であり、ＤＮＡポリメラーゼによって正確に複製できることが発見された。
【0003】
核酸合成は、現代のバイオテクノロジーにとって重要である。ＤＮＡや、ＲＮＡ、タンパク質を人工的に合成する科学界の能力は、バイオテクノロジーの分野を急速に発展させる。１０億の成長する市場である人工ＤＮＡ合成により、バイオテクノロジーおよび製薬会社は、例えば、糖尿病の治療のためのインスリンなどのさまざまなペプチド治療薬を開発することができる。これにより、研究者は細胞タンパク質の特性を明らかにし、心臓病や癌など、高齢者が現在直面している疾患の治療のための新しい小分子療法を開発することができる。
【0004】
しかし、現在のＤＮＡ合成技術は、バイオテクノロジー業界の要求を満たすことができない。ＤＮＡ合成には多くの利点があるが、く言及される問題が人工ＤＮＡ合成産業、およびバイオテクノロジー分野のさらなる成長を妨げている。ＤＮＡ合成は成熟した技術であるが、実際には２００ヌクレオチドを超える長いＤＮＡ鎖を合成することは非常に困難であり、ほとんどのＤＮＡ合成会社は１２０ヌクレオチドまでしか提供できない。比較すると、平均的なタンパク質コード遺伝子は２０００～３０００ヌクレオチドのオーダーであり、平均的な真核生物のゲノム数は数十億ヌクレオチドである。したがって、今日のすべての主要な遺伝子合成会社は、「合成と接着」技術アプローチに依存している。このアプローチでは、約４０～６０の重複する配列フラグメントが合成され、ＰＣＲによって接着される（Young, L. et al. (2004) Nucleic Acid Res. 32, e59）。遺伝子合成会社が提供する現在の方法では、通常、ルーチンの生産で最大３ｋｂの長さが可能である。
【0005】
今日まで、核酸のインビトロ合成には、化学合成と酵素合成との２つの主要なタイプがある。最も一般的な核酸化学合成法は、Adams et al. (1983, J. Amer. Chem Soc., 105: 661) およびFroehler et al. (1983, Tetrahedron Lett, 24: 3171)によって記載されたホスホラミダイト法（phosphoramidite method）である。この方法では、添加される各ヌードオチドは、同じタイプのいくつかのヌクレオチドの制御されていない重合を回避するために、５'-OH基の保護基を構成されている。通常、トリチル基は５'-OH基の保護基として使用できる。強力な反応物の使用による分解の可能性を回避するために、ヌクレオチドによって運ばれる塩基も保護することもできる。一般に、使用される保護基はイソブチリル基を含む（Reddy et al. 1997, Nucleosides & Nucleotides 16: 1589）。次の重合ステップで使用できるように、新しいヌクレオチドが添加されるたびに、鎖の最後のヌクレオチドの５'-OH基が脱保護される。ヌクレオチドによって運ばれる窒素塩基は、すべての重合反応が完了した後にのみ脱保護される。
【0006】
ＷＯ９５ ／ ０３５０ Ａ１は、フォトリソグラフィを使用して基質の上でオリゴヌクレオチドプローブを合成することによりヌクレオチドアレイを調製するための方法を開示する。基質にオリゴヌクレオチドを固定し、５’末端ヒドロキシル基の感光性保護基を使用して３’から５’の方向で塩基を合成する。各合成サイクル中に、フォトリソグラフィーマスクを通して表面を照らすことにより、保護基が選択的に除去される。脱保護されたヒドロキシル基は、選択された５’－光保護されたデオキシヌクレオシドホスホラミダイトに連結されるが、表面の非照射領域の核酸配列は保護されており、反応できない。目的の核酸配列が得られるまで、必要に応じて１ラウンドの照明と異なるヌクレオチドとのカップリングを繰り返す。所望のオリゴヌクレオチドプローブのセットが得られるまで、必要に応じて異なる活性化デオキシヌクレオシドを用いて、照射と連結のラウンドを繰り返す。
【0007】
米国特許ＵＳ２０１６０１８４７８８Ａ１には、表面上の１つまたは複数の部位を選択的にマスキングし、および分子アレイを合成する方法を開示している。基質上にヌクレオチドを固定し、５’末端ヒドロキシル基の感熱性保護基を使用して３’から５’の方向で塩基を合成する。異なる部位で加熱することにより、その部位のヌクレオチドの感熱性保護基を除去することができ、脱保護されたヒドロキシル基が選択された５’－光保護ヌクレオチドホスファイトに連結され、したがって、多数かつ異なる核酸配列を生成することができる。
【0008】
しかし、上記のような化学合成法は、環境および健康に影響を与える可能性のある、不安定で、危険で、高価な大量の反応剤を必要とする。さらに、この化学合成法で使用される装置は非常に複雑で、多額の投資が必要であり、資格のある専門の技術者が操作する必要がある。この化学合成方法の主な欠点の1つは、生産量が低いことである。各サイクルにおいて、カップリング反応の成功率はわずか９８％から９９．５％であるため、調製物中の核酸配列は正しい配列を持たない可能性がある。合成工程が進むにつれて、反応媒体の中に誤った配列のフラグメントで満たされる可能性がある。したがって、この削除タイプのエラーは深刻な結果をもたらす可能性があり、その結果、核酸フラグメントのリーディングフレームが変化する。
【0009】
例えば、カップリング反応が９９％正確であるためには、７０ヌクレオチドを含む核酸合成の生産量は５０％未満になる。これは、７０サイクルの添加後、反応媒体は正しい配列のフラグメントよりも間違った配列のフラグメントを多く含むことを意味する。この混合物は、その後の使用には不適切である。
【0010】
したがって、核酸を化学的に合成する方法は、不純物と見なされる多くの間違った配列のフラグメントが生成されるため、長いフラグメントの合成には効率的ではない。実際には、化学合成する方法で効果的に生成できるフラグメントの最大長は、５０～１００ヌクレオチドである。
【0011】
他方、酵素合成方法と化学合成方法との違いは、酵素合成方法が、カップリングステップを行うために酵素触媒を使用することである。従来、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡの合成によく使用される。ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列に基づいて、７つの進化ファミリー、すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、およびＲＴに分類される。ＤＮＡポリメラーゼのファミリーは関連していない。つまり、あるファミリーのメンバーは他のファミリーのメンバーとは同源（Homologous）ではない。ＤＮＡポリメラーゼは、そのファミリーの典型的なメンバーとの同源性により、特定のファミリーのメンバーであると判断される。例えば、ファミリーＡのメンバーは大腸菌（E.coli）ＤＮＡポリメラーゼＩと相同であり、ファミリーＢのメンバーは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩと相同であり、ファミリーＣのメンバーは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩと相同であり、ファミリーＤのメンバーはパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）ＤＮＡポリメラーゼと相同であり、ファミリーＸのメンバーは真核生物のＤＮＡポリメラーゼベータと相同であり、ファミリーＹのメンバーは真核生物のＲＡＤ３０Ｒと相同であり、ファミリーＲＴのメンバーは逆転写酵素と相同である。
【0012】
多数の文書（Ud-Dean et al. (2009) Syst. Synth. Boil. 2, 67-73、US 5763594及US 8808989）が、制御されたデノボ一本鎖ＤＮＡ合成のための末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（terminal deoxynucleotidyl transferase、TdT）の使用を開示している。制御されたものとは対照的に、制御されていないデノボ一本鎖ＤＮＡ合成は、一本鎖ＤＮＡ上のＴｄＴのデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）３'テーリング特性を利用して、例えば、次世代シーケンシングライブラリー調製用のホモポリマーアダプター配列を作成する（Roychoudhur R. et al. (1976) Nucleic Acids Res. 3, 10-116およびWO 2003/050242）。
【0013】
ただし、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼの主な目的は抗原受容体の多様性を高めることであったため、他のポリメラーゼのように、正常で予測可能な動作を示すことは難しい場合がある。これは、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼが、ヌクレオチド合成サイクルで高生産率の自動化を達成するために、依然として多くの課題に直面していることを意味する。
【0014】
要約すると、核酸の化学合成は、大量の核酸を合成することができる。ただし、使用する反応剤は高価で環境を汚染し、また、合成工程でエラーが発生する可能性が高い。核酸の酵素的合成は安価であり、核酸配列はより高い精度を持つ。ただし、酵素の反応速度により、大量の合成はできない。したがって、核酸を正しく大量に合成するという問題を解決できるより良い核酸合成法は現在も存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
本発明は、酵素を使用して核酸配列を調製するための方法を提供し、これは、核酸配列の調製効率を改善することができる。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明の一実施例で提供される酵素を使用して核酸配列を調製するための方法は、以下のステップを含み：（１）前処理された表面を有する反応基質を提供するステップ。（２）反応酵素により前処理された表面に末端保護基を有するヌクレオチドを配置し、かつ反応温度は４５℃～１０５℃であるステップ。（３）照射または加熱によりヌクレオチドの末端保護基を除去するステップ。（４）前記反応酵素により末端保護基を有する別のヌクレオチドをヌクレオチドに連結させ、かつ反応温度は４５℃～１０５℃であるステップと。（５）核酸配列が完成しているかどうかを判断し、完成している場合は核酸配列を取得し、完成していない場合はステップ（３）と（４）を繰り返すステップ。
【0017】
本発明の一実施例では、上記の反応酵素はＤＮＡポリメラーゼである。
【0018】
本発明の一実施例では、上記の反応酵素はファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼである。
【0019】
本発明の一実施例では、上記の反応酵素はファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼである。
【0020】
本発明の一実施例では、上記の反応酵素はファミリーＸのＤＮＡポリメラーゼである。
【0021】
本発明の一実施例では、上記の照射または加熱によりヌクレオチドの末端保護基を除去する方法は、パターン化された方法で部分的に除去することを含む。
【0022】
本発明の一実施例では、上記の照射によりヌクレオチドの末端保護基を除去する方法は、ＵＶデジタル光処理（ＤＬＰ）チップを使用して照射を行うことを含む。
【0023】
本発明の一実施例では、上記の反応温度は５０℃～８５℃である。
【0024】
本発明の一実施例では、上記の反応温度は５５℃～７５℃である。
【0025】
本発明の一実施例では、上記の前処理された表面は複数のプライマーを有し、上記の前処理された表面上に末端保護基を有するヌクレオチドを配置する方法は、反応酵素によって末端保護基を有するヌクレオチドを複数のプライマーに連結することを含む。
【0026】
本発明の一実施例では、上記の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法は、（６）制限酵素によって前記前処理された表面から前記核酸配列を切断するステップをさらに含む。
【0027】
本発明の実施例の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法は、酵素を使用して核酸配列を合成するので、化学合成の方法と比較して環境を汚染する可能性がより低い、かつコストを削減する可能性がある。また、反応温度は４５℃～１０５℃であり、従来の３７℃の酵素使用と比較して、本発明の実施形態は、４５℃以上の酵素を使用することにより、より良好な活性を示し得る。これにより、核酸配列の調製効率を向上することができる。
【0028】
本発明の他の目的、特徴および利点は、本発明の実施例によって開示されるさらなる技術的特徴からさらに理解されるであろう。ここでは、本発明を実施するのに最も適したモードを単に例示するために、本発明の好ましい実施例が示され、説明されている。
【図面の簡単な説明】
【0029】
本発明は、以下の詳細な説明および添付の図面を検討した後、当技術分野における通常の知識を有する者にさらに容易に明らかになるであろう、そのうち：
【0030】
図１は、本発明の一実施例による酵素を使用して核酸配列を調製するための方法を示す概略フローチャートである。
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【発明を実施するための形態】
【0035】
次に、以下の実施例を参照して、本発明をより具体的に説明する。本発明の好ましい実施例の以下の説明は、例示および説明のみを目的として本文に提示されていることに留意されたい。網羅的であること、または、開示された正確な形式に限定されることを意図するものではない。
【0036】
図１は、本発明の一実施例による酵素を使用して核酸配列を調製するための方法を示す概略フローチャートである。図１を参照すると、本実施例の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法は、以下のステップを含む。ステップＳ１０１：前処理された表面を有する反応基質を提供することを実行する。次に、ステップＳ１０２：反応酵素により前処理された表面に末端保護基を有するヌクレオチドを配置し、かつ反応温度は４５℃～１０５℃、好ましくは５０℃～８５℃、より好ましくは５５℃～７５℃であることを実行する。具体的には、核酸配列を調製するための反応温度は、例えば、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃または７５℃、これらに限定されない。
【0037】
反応基質の材料は、例えば、シリコン、ガラス（SiO2）、金属またはポリマーを含み、ポリマーは、例えば、ポリカーボネートまたはポリメチルメタクリレートなどであるが、これらに限定されない。反応基質は、例えば、ウェーハまたは平板などの板状構造であり、前処理された表面は、板状構造の平面である。
【0038】
本実施例では、例えば、デオキシリボ核酸（DNA）配列の合成を例にとると、その合成に必要なヌクレオチドの窒素塩基はさらにアデニン（A）、チミン（T）、シトシン（C）、グアノ（G）の４つのカテゴリーに分類できるため、４種類のヌクレオチドが使用される（dAMP、 dTMP、dCMP、dGMP）。リボ核酸（RNA）配列を合成する場合、ウラシルヌクレオチド（UMP）の材料も必要である反応酵素は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、特に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるが、これに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼには、例えば、ファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼと、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼと、ファミリーＸのＤＮＡポリメラーゼとを含み、その例には、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、古細菌ＤＮＡ、耐熱性逆転写酵素などを含む。これらのＤＮＡポリメラーゼは、４５℃以上の温度で、３７℃で従来使用されている末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（TdT）よりも良好な活性を示し、核酸配列の合成効率を改善することができる。
【0039】
本発明の全文に記載されている「反応酵素」、「末端保護基を有するヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「制限酵素」などは、それらの実際の量を表すのではなく、これらの物質の総称と見なされるべきである。例えば、反応を実行する反応酵素および末端保護基を有するヌクレオチドの数は両方とも複数である。
【0040】
反応酵素により前処理された表面に末端保護基を有するヌクレオチドを配置する方法は、例えば、浸漬法または液体輸送法を含む。具体的には、反応酵素と末端保護基を有するヌクレオチドとを配合溶液に調製する。浸漬法では、反応基質を配合溶液に浸漬し、溶液の温度を４５℃～１０５℃に維持し、反応が完了するまで待つ。液体輸送法では、配合溶液が反応基質の前処理した表面を通過し、かつ溶液の温度を４５℃～１０５℃に維持する。上記の方法は、本発明の実施態様にすぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【0041】
前処理された表面は、例えば、複数のプライマー（primer）を有するが、これらに限定されない。前処理された表面上に末端保護基を有するヌクレオチドを配置する方法は、反応酵素により末端保護基を有するヌクレオチドを複数のプライマーに連結することを含む。本実施例では、ＤＮＡ配列の合成におけるプライマーの助けにより、ＤＮＡポリメラーゼ（反応酵素）が前処理された表面上に末端保護基を有するヌクレオチドをより容易に配置することができる。これらのプライマーは、例えば、一本鎖ＤＮＡであるが、それに限定されない。別の実施例では、前処理された表面は、例えば、プライマーを有さない場合もある。
【0042】
次に、ステップＳ１０３：照射または加熱によりヌクレオチドの末端保護基を除去し、末端保護基は、例えば、感光性または感熱性であることを実行する。末端保護基の例には、メチル、２－ニトロベンジル、２’-Ｏ-（２－シアノエチル）、アリル、アミン、アジドメチル、ｔｅｒｔ-ブトキシエトキシ（TBE）などが含まれるが、これらに限定されない。感光性末端保護基は照射により除去することができ、感熱性末端保護基は加熱により除去することができる。末端保護基の除去後、ヌクレオチドは次のヌクレオチドに連結し続けて配列を延長することができる。ヌクレオチドの末端保護基を除去する特定の実施形態を、図面を参照して以下にさらに説明するが、本発明の照射または加熱によりヌクレオチドの末端保護基を除去する特定の方法は、以下の実施例に限定されない
【0043】
図２Ａおよび図２Ｂは、本発明の一実施例によるヌクレオチドの末端保護基を除去することを示す概略図である。図２Ａおよび図２Ｂを参照すると、本実施例は、感光性の末端保護基ＰＧを使用するため、図２Ｂに示すように、前処理された表面２００を発光ユニット１００で照射することができ、プライマー２１０に接続されたヌクレオチド２２０の末端保護基ＰＧは、光Ｌが照射された後に分解される。発光ユニット１００は、例えば、発光ダイオードまたはレーザーダイオードであるが、これらに限定されない。照明処理は、発光ユニット１００の使用に限定されず、例えば、自然光を使用することができる。前処理された表面２００は、同時に複数のヌクレオチド２２０を配置することができるため、一度に複数の核酸配列を調製することができ、調製効率が向上する。
【0044】
さらに、前処理された表面２００は、複数の領域に分割することもできる。各領域はそれぞれが一つの調製中の核酸配列を含み、末端保護基ＰＧはパターン化された方法で部分的に除去され、複数の異なる核酸配列を同時に調製する効果を達成できる。図３Ａおよび図３Ｂは、本発明の別の実施例によるヌクレオチドの末端保護基を除去することを示す概略図である。図３Ａおよび図３Ｂを参照すると、本実施例はまた、感光性の末端保護基ＰＧを使用され、違うところは、本実施例ではＵＶデジタル光処理（digital light processing，DLP）チップを使用して照射を行うことである。具体的には、ＵＶデジタル光処理チップは、発光ユニット３００と反射光弁３１０とを含む。図３Ａおよび図３Ｂの複数の領域は、破線で区切られている。発光ユニット３００が光Ｌを反射光弁３１０に放出した後、前処理された表面４００の複数の領域の一部が、パターン化された方法で反射光弁３１０によって照射される。図３Ｂに示すように、これらの領域でプライマー４１０に連結されたヌクレオチド４２０の末端保護基ＰＧは、光Ｌによって照射された後に分解され、ヌクレオチド４２０は、次のヌクレオチド４２０に連結されことができる。パターン化された方法を設計することにより、異なる核酸配列を各領域で同時に調製することができる。
【0045】
図４Ａおよび図４Ｂは、本発明の別の実施例によるヌクレオチドの末端保護基を除去することを示す概略図である。図４Ａおよび図４Ｂを参照すると、本実施例の方法の利点は、上記の方法の利点と似ているが、違うところは、本実施例が感熱性末端保護基ＰＧを使用することのみである。したがって、図４Ｂに示すように、前処理された表面６００は、加熱ユニット５００により加熱され（熱エネルギー伝達は曲線矢印で示されている）、プライマー６１０に連結されたヌクレオチド６２０の末端保護基ＰＧは、加熱後に分解される。たとえば、加熱処理は、パターン化された方法で、すなわち局所加熱の方法で、末端保護基ＰＧを部分的に除去することもできる。例えば、シリコンチップを反応基板として使用する場合、各領域に回路を分散させて通過電流を制御し、局所加熱の効果を得ることができる。
【0046】
図１を再び参照すると、ヌクレオチドの末端保護基が除去された後、ステップＳ１０４：末端保護基を有する別のヌクレオチドを、反応酵素により前処理された表面に配置されたヌクレオチドに連結させることを実行する。ステップＳ１０４の反応はステップＳ１０２の反応と似ているが、違うところは、末端保護基を有するヌクレオチドは、以前にプライマーに連結されていたヌクレオチドに連結する。合成する核酸配列の長さの違いに応じて、ステップＳ１０５：設計された核酸配列が完成しているかどうかを判断し、完成している場合は核酸配列を取得し、完成していない場合はステップＳ１０３とＳ１０４を繰り返し、設計された核酸配列が完成するまで、核酸配列の長さを延長し続けることを実行する。ステップを繰り返すとき、ステップＳ１０３がパターン化された方法で異なる領域の末端保護基を部分的に除去することである場合、異なる領域の核酸配列の長さは異なる可能性がある。酵素を使用して核酸配列を調製する方法の具体的な実施態様を、図面を参照して以下にさらに説明するが、本発明の酵素を使用して核酸配列を調製する方法の具体的な実施態様は、以下の実施例に限定されない。
【0047】
図５Ａ～図５Ｉは、本発明の一実施例による酵素を使用して核酸配列を調製するための方法を示すステップ概略図である。図１および図５Ａ～図５Ｉを参照すると、図５ＡでステップＳ１０１：前処理された表面７００を有する反応基質を提供し、前処理された表面７００は、複数のプライマー７１０を有することを実行する。この実施例では、複数のプライマー７１０は、例えば、一本鎖ＤＮＡであるが、これに限定されない。ここで前処理された表面７００は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの４つの領域に分割される。各領域は、複数のプライマー７１０を有し、また、領域Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶは、それぞれ異なる核酸配列を調製するように設計されている。
【0048】
図５ＢでステップＳ１０２：反応酵素により前処理された表面に末端保護基を有するヌクレオチドを前処理された表面７００上の複数のプライマー７１０に連結され、かつ反応温度は４５℃～１０５℃であることを実行する。本実施例で使用されるヌクレオチド７２０は、ヌクレオチド７２０ａ、７２０ｃ、７２０ｇ、７２０ｔを含み、それぞれアデニンヌクレオチド（dAMP）、シトシンヌクレオチド（dCMP）、グアノプリンヌクレオチド（dGMP）、およびチミジン（dTMP）に対応する。図５Ｂに配置されたヌクレオチド７２０ｃは、シトシンヌクレオチドである。
【0049】
図５ＣでステップＳ１０３：照射または加熱によりヌクレオチド７２０の末端保護基ＰＧを除去することを実行する。ここでは、異なる領域の末端保護基ＰＧがパターン化された方法で部分的に除去されており、照明または加熱の実施方法が詳細に説明されているため、ここでは繰り返さない。図５Ｃでは、領域ＩＩおよびＩＩＩのヌクレオチド７２０ｃの末端保護基ＰＧが除去される。
【0050】
図５ＤでステップＳ１０４：反応酵素により末端保護基ＰＧを有する別のヌクレオチド７２０を前処理された表面７００に配置されたヌクレオチド７２０に連結させることを実行する。図５Ｄでは、領域ＩＩ、ＩＩＩのヌクレオチド７２０ｃのみが、反応酵素により別のヌクレオチド７２０ｇにさらに結合される。
【0051】
次に、ステップＳ１０５：設計された核酸配列が完成しているかどうかを判断し、完成していない場合はステップＳ１０３とＳ１０４を繰り返すことを実行する。図５Ｅでは、ステップＳ１０３が再び実行され、領域Ｉのヌクレオチド７２０ｃの末端保護基ＰＧおよび領域ＩＩＩのヌクレオチド７２０ｇの末端保護基ＰＧが除去される。次に、図５Ｆで工程Ｓ１０４が再度実行され、末端保護基ＰＧを有する別のヌクレオチド７２０ｔが、反応酵素により領域Ｉのヌクレオチド７２０ｃおよび領域ＩＩＩのヌクレオチド７２０ｇに連結される。
【0052】
その後、ステップＳ１０５：設計された核酸配列が完成しているかどうかを判断し、完成していない場合はステップＳ１０３とＳ１０４を繰り返すことを再び実行する。図５Ｇでは、領域Ｉのヌクレオチド７２０ｔの末端保護基ＰＧおよび領域ＩＶのヌクレオチド７２０ｃの末端保護基ＰＧが除去される。図５Ｈでは、反応酵素により、末端保護基ＰＧを有する別のヌクレオチド７２０ａを、領域Ｉのヌクレオチド７２０ｔおよび領域ＩＶのヌクレオチド７２０ｃに連結する。
【0053】
図５Ｉに示すように、領域Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの異なる核酸配列Ｓがすべてそれぞれ合成されることが判断されるまで、ステップＳ１０３およびＳ１０４を繰り返す。上記は、パターン化された方法で照射または加熱により異なる領域Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの末端保護基ＰＧを、部分的に除去する実施形態である。この方法により、多数の異なる核酸配列Ｓを短時間で調製することができる。これらの異なる核酸配列Ｓが同じ遺伝子の配列断片に属する場合、後続の配列断片は互いに連結し、すなわち、従来の技術と比較してより長い長さの核酸配列を大量生産することができる。
【0054】
核酸配列Ｓの合成が完了した後、酵素を使用して核酸配列を調製するための方法はステップＳ１０６：制限酵素により前処理された表面７００から核酸配列Ｓを切断することをさらに含み、制限酵素が前処理された表面に配置された後、制限酵素は、前処理された表面７００から合成された核酸配列Ｓを切断する。その後、核酸配列Ｓを収集し、すなわち、核酸配列Ｓの調製工程が完了する。制限酵素の例には、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）と、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩと、ＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ＃Ｍ５５０８）とそれらの組み合わせを含む。例えば、ウラシルヌクレオチド（ＵＭＰ）に切断される制限酵素が使用される場合、反応酵素が末端保護基ＰＧを有するヌクレオチド７２０をプライマー７１０に配置する前に、ウラシルヌクレオチドは最初にプライマー７１０に配置される。核酸配列が完成すると、それらはＤＮＡ配列であるため、ＤＮＡ配列にウラシルヌクレオチドを含まない。制限酵素には、最初に配置された単一のウラシルヌクレオチドのみを切断することができ、それにより、核酸配列Ｓを正しく切断することができる。異なる制限酵素は異なる切断部位を有し、本発明は特に限定されない。
【0055】
上記の前処理された表面２００、４００、６００、および７００は、異なる実施例を区別するために異なる数字記号のみを使用し、それらは、様々な実施例において交換可能に使用することができる。プライマー２１０、４１０、６１０、７１０およびヌクレオチド２２０、４２０、６２０、７２０ａ、７２０ｃ、７２０ｇ、７２０ｔも同じ方法で使用することができる。
【0056】
要約すると、本発明の実施形態の酵素を使用して核酸配列を調製するための方法は、酵素を使用して核酸配列を合成するので、化学合成の方法と比較して、環境を汚染することが少なくなり、またコストを削減できる可能性がある。さらに、反応器の反応温度は４５℃～１０５℃であり、従来の３７℃の酵素の使用と比較して、本発明の実施例は、４５℃以上で酵素を使用することにより、より良好な活性を示し得、それにより、核酸配列を調製する効率を高めることができる。
【0057】
以上は、現在最も実用的で好ましい実施例であると考えられているものに関して説明したが、開示された実施例に限定される必要はないことを理解されたい。それどころか、すべてのそのような修正および類似の構造を包含するように、最も広い解釈に一致し、添付の特許請求の精神および範囲に含まれる様々な修正および類似の配置を含むことを意図している。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図5I】
【国際調査報告】