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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-28
(54)【発明の名称】抗グリカン抗体及びそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230421BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20230421BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230421BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230421BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230421BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230421BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230421BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230421BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230421BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230421BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20230421BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230421BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230421BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/30 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
C07K16/28
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P1/00
A61P1/04
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022555661
(86)(22)【出願日】2021-03-16
(85)【翻訳文提出日】2022-11-08
(86)【国際出願番号】 US2021022627
(87)【国際公開番号】W WO2021188591
(87)【国際公開日】2021-09-23
(31)【優先権主張番号】62/990,927
(32)【優先日】2020-03-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/037,374
(32)【優先日】2020-06-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/074,956
(32)【優先日】2020-09-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522364240
【氏名又は名称】ピーティーエム セラピューティクス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】プレスタ， レナード
(72)【発明者】
【氏名】リャン， トニー
(72)【発明者】
【氏名】チョン， ジェニファー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CE12
4B064DA05
4B065AA90X
4B065AA99Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085BB24
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、ｓＬｅＡ及びｓＬｅＣに結合する抗体またはそれらの抗原結合部位、ならびにそれらに関連するポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、及び方法を提供する。
【選択図】図２Ｃ
【選択図】図２Ｃ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
シアリルルイスＡ（ｓＬｅＡ）及びシアリルルイスＣ（ｓＬｅＣ）に結合する抗体またはその抗原結合部位であって、前記抗体または抗原結合部位のｓＬｅＡに対する結合親和性が６０μＭ以下のＫＤであり、ｓＬｅＣに対する結合親和性が１００μＭ以下のＫＤである、前記抗体またはその抗原結合部位。
【請求項2】
シアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ）に結合しない、請求項１に記載の抗体または抗原結合部位。
【請求項3】
ヒト化抗体またはヒト化抗原結合部位である、請求項１または請求項２に記載の抗体または抗原結合部位。
【請求項4】
ｓＬｅＡ及びｓＬｅＣに結合する抗体またはその抗原結合部位であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４と９０～１００％の配列同一性を有する配列を含み、
前記軽鎖可変領域が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列番号１１と９０～１００％の配列同一性を有する配列を含む、前記抗体またはその抗原結合部位。
【請求項5】
ｓＬｅＸに結合しない、請求項４に記載の抗体または抗原結合部位。
【請求項6】
前記重鎖可変領域が、配列番号１２の配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３の配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４の配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１５～１７からなる群から選択される配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８の配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１９の配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む、請求項４または請求項５に記載の抗体または抗原結合部位。
【請求項7】
前記重鎖可変領域が配列番号３の配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号５～８からなる群から選択される配列を含む、請求項４に記載の抗体または抗原結合部位。
【請求項8】
前記軽鎖可変領域が配列番号８の配列を含む、請求項７に記載の抗体または抗原結合部位。
【請求項9】
前記重鎖可変領域が配列番号４の配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号９～１０からなる群から選択される配列を含む、請求項４に記載の抗体または抗原結合部位。
【請求項10】
ｓＬｅＡ及びｓＬｅＣに結合する抗体またはその抗原結合部位であって、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が配列番号３と９０～１００％の配列同一性を有する配列を含む、前記抗体またはその抗原結合部位。
【請求項11】
前記抗体または前記抗原結合部位が軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号５～１１からなる群から選択される配列と９０～１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０に記載の抗体または抗原結合部位。
【請求項12】
ｓＬｅＡ及びｓＬｅＣに結合する抗体またはその抗原結合部位であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域が、配列番号１２の配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３の配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４の配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１５～１７からなる群から選択される配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８の配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１９の配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む、前記抗体またはその抗原結合部位。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合部位をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項14】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項15】
請求項１３に記載のポリヌクレオチド、または請求項１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項16】
前記抗体が産生されるように、請求項１５に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体の産生方法。
【請求項17】
前記宿主細胞から前記抗体を回収することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部位と、薬学的に許容されるキャリアとを含む、医薬組成物。
【請求項19】
消化器の疾患または障害の症状を治療または改善する方法であって、前記消化器の疾患または障害を有する個体に、有効量の、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗原結合部位、または請求項１８に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項20】
前記消化器の疾患または障害が、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、膵臓癌及び結腸癌からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記消化器の疾患または障害が炎症性腸疾患である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記個体がヒトである、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１７日出願の米国仮出願第６２／９９０，９２７号、２０２０年６月１０日出願の米国仮出願第６３／０３７，３７４号、及び２０２０年９月４日出願の米国仮出願第６３／０７４、９５６号の利益を主張するものであり、これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年３月１７日出願の米国仮出願第６２／９９０，９２７号、２０２０年６月１０日出願の米国仮出願第６３／０３７，３７４号、及び２０２０年９月４日出願の米国仮出願第６３／０７４、９５６号の利益を主張するものであり、これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、抗シアリルルイスＡ（ｓＬｅＡ）抗体及び抗シアリルルイスＣ（ｓＬｅＣ）抗体を含む抗シアル酸付加グリカン抗体、ならびにこれらの使用方法に関する。
【0003】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：２０３４６２０００１４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年３月１５日、サイズ：１４ＫＢ）。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：２０３４６２０００１４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年３月１５日、サイズ：１４ＫＢ）。
【背景技術】
【0004】
グリカンは、遊離であることができる、またはタンパク質に結合（糖タンパク質）もしくは脂質に結合（糖脂質）することができる、糖質ベースのポリマーである。糖タンパク質のグリカン、例えば糖タンパク質のシアル酸付加グリカンなどは、免疫及び炎症に関与することが知られている。ヒトの膵臓、結腸及び胃の細胞株、ならびに結腸、胃及び膵臓の腺癌では、ｓＬｅＡの高発現が報告されている。さらに、潰瘍性大腸炎を有する患者のヒト結腸の炎症性領域において、ＣＤ４４ｖ６に呼応してｓＬｅＡが上方制御されることが研究によって示されている。さらに、研究によって粘膜炎症でのｓＬｅＡの機能的役割が示され、それによってｓＬｅＡを調節することで、炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎などの疾患）に影響を与え得ることが示唆されている。
【0005】
加えて、異常なグリコシル化はがんの特徴の１つでもあり、免疫応答を調節すると報告されている。炎症性腸疾患組織で観察されたものと同様に、タンパク質の異常なグリコシル化は、悪性転換の間のがん関連糖鎖抗原の過剰発現につながる。がん関連糖鎖抗原は、がんの増殖、浸潤、血管新生及び転移など、がんが発症及び進行する様々な側面に寄与することが研究によって示されている（Ｆｕｓｔｅｒ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，５：５２６－４２（２００５）及びＤｕｂｅ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，４：４７７－８８（２００５））。
【0006】
グリコシル化の１つの種類はシアル酸であり、シアル酸は通常、Ｎ－グリカン、Ｏ－グリカン及びグリコスフィンゴリピドの分岐末端であることが判明している。シアル酸の範囲内で、α結合を通して９個の炭素骨格間に多様性が生まれ、これらの炭素位置での修飾を通して第２の多様性が生まれる。明らかになっているシアル酸付加グリコシル化の例としては、ｓＬｅＡ、ｓＬｅＣ及びシアリルルイスＸが挙げられる（各グリカンの構造は表１に記載している）。
【0007】
これらのグリカンは全て、末端シアル酸付加グリカンの例である。ｓＬｅＣはｓＬｅＡの非フコシル化前駆体であり、一方、ｓＬｅＸはｓＬｅＡの立体異性体である。一般に、ｓＬｅＣは正常なヒト組織では通常見られないが、マウス組織上で見られる。したがって、ｓＬｅＡとｓＬｅＣの両方に結合する抗体は、医薬品開発、特に疾患のインビボマウスモデルでの使用に有用であるだろう。
【0008】
一般に、疾患及び／または障害を治療する医薬品としての開発に適している抗体は、高い特異性、選択性及び親和性を有する。したがって、抗グリカン抗体は医薬品としての開発には通常適していない。その理由の１つとしては、糖鎖抗原が制限された免疫原性を有し、また観察される抗糖鎖抗体の親和性が通常、タンパク質抗原またはペプチド抗原に特異的な抗体の親和性よりも１０３～１０５倍低いことがある（Ｇｈａｓｓｅｍｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５（９）：９２０－９５２（Ｓｅｐｔ ２０１５））。糖質の全体的に弱い結合には、通常、相対的に速いｋｏｎ及びｋｏｆｆ速度が伴い、それによって抗グリカン抗体の全体的に低いＫＤがもたらされる。
【0009】
本発明は、炎症性腸疾患及び消化器系のがんを含む、消化器系に影響する障害を有する患者に向けた、グリカンのエピトープを標的とする代替的な抗体療法の必要性に対処するものである。
【発明の概要】
【0010】
本発明は、糖鎖抗原または糖鎖抗原フラグメントに結合する可変領域を含む、抗体またはその抗原結合部位を提供する。
【0011】
一態様では、本明細書において、シアリルルイスＡ（ｓＬｅＡ）及びシアリルルイスＣ（ｓＬｅＣ）に結合する抗体またはその抗原結合部位であって、このような抗体または抗原結合部位のｓＬｅＡに対する結合親和性が６０μＭ以下のＫＤであり、ｓＬｅＣに対する結合親和性が１００μＭ以下のＫＤである、抗体またはその抗原結合部位が提供される。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合部位は、シアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ）に結合しない。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合部位は、ヒト化抗体またはヒト化抗原結合部位である。
【0012】
別の態様では、本明細書において、ｓＬｅＡ及びｓＬｅＣに結合する抗体またはその抗原結合部位であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域が、配列番号１、配列番号２または配列番号３と９０～１００％の配列同一性を有する配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７と９０～１００％の配列同一性を有する配列を含む、抗体またはその抗原結合部位が提供される。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合部位はｓＬｅＸに結合しない。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１２の配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３の配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４の配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１５～１７からなる群から選択される配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８の配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１９の配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は配列番号３の配列を含み、軽鎖可変領域は配列番号５～８からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は配列番号３の配列を含み、軽鎖可変領域は配列番号８の配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は配列番号４の配列を含み、軽鎖可変領域は配列番号９または配列番号１０の配列を含む。
【0013】
別の態様では、本明細書において、ｓＬｅＡ及びｓＬｅＣに結合する抗体またはその抗原結合部位であって、重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が、配列番号３と９０～１００％の配列同一性を有する配列を含む、抗体またはその抗原結合部位が提供される。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合部位は軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、配列番号５～１１からなる群から選択される配列と９０～１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0014】
別の態様では、本明細書において、ｓＬｅＡ及びｓＬｅＣに結合する抗体またはその抗原結合部位であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域が、配列番号１２の配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３の配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４の配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１５～１７からなる群から選択される配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８の配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１９の配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む、抗体またはその抗原結合部位が提供される。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合部位は、表６に示す単一抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
【0015】
別の態様では、本明細書において、上記の実施形態のいずれか１つによる抗体またはその抗原結合部位をコードする１種以上のポリヌクレオチド（複数可）が提供される。別の態様では、本明細書において、上記の実施形態のいずれか１つによる１種以上のポリヌクレオチドを含むベクター（複数可）が提供される。別の態様では、本明細書において、上記の実施形態のいずれか１つによる１種以上のポリヌクレオチド（複数可）、または上記の実施形態のいずれか１つによるベクターを含む宿主細胞が提供される。別の態様では、本明細書において、抗体を産生する方法であって、抗体が産生されるように、上記の実施形態のいずれか１つによる宿主細胞を培養することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、宿主細胞から抗体を回収することをさらに含む。別の態様では、本明細書において、上記の実施形態のいずれか１つによる抗体またはその抗原結合部位と、薬学的に許容されるキャリアと、を含む医薬組成物が提供される。
【0016】
別の態様では、本明細書において、消化器の疾患または障害の症状を治療または改善する方法であって、上記消化器の疾患または障害を有する個体に、本明細書に記載される抗体、抗原結合部位または医薬組成物の有効量を投与することを含む上記方法が提供される。いくつかの実施形態では、消化器の疾患または障害は、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、膵臓癌または結腸癌から選択される。いくつかの実施形態では、消化器の疾患または障害は炎症性腸疾患である。いくつかの実施形態では、炎症性腸疾患はクローン病または潰瘍性大腸炎である。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】Ａは、Ｔ８４細胞を使用したインビトロ引っ掻き傷アッセイの、ヒトＩｇＧ対照または抗体クローン４７７２のいずれかで処理後、０時間及び２４時間での顕微鏡画像を示す。Ｂは、処理後２４時間に観察された創傷治癒活性の差を示す。
【図2A】結腸炎の急性ＤＳＳ誘発モデルの処理プロトコルの略図を示す。
【図2B】ナイーブ（未処理、ＤＳＳなし）、ＰＢＳ処理（試験１日目及び３日目に投与、ＤＳＳ）、ヒトＩｇＧ処理（試験１日目及び３日目に投与、ＤＳＳ）、及び抗体クローン４７７２処理（試験１日目及び３日目に投与、ＤＳＳ）のマウスの、試験１０日目の便の硬さを示す。
【図2C】マウスの試験開始時の体重のパーセントとして表される、ナイーブ（未処理、ＤＳＳなし）、ＰＢＳ処理（試験１日目及び３日目に投与、ＤＳＳ）、ヒトＩｇＧ処理（試験１日目及び３日目に投与、ＤＳＳ）、及び抗体クローン４７７２処理（試験１日目及び３日目に投与、ＤＳＳ）のマウスの体重変化を示す。
【図2D】ナイーブマウス（未処理、ＤＳＳなし）、ＰＢＳ処理マウス（試験１日目及び３日目に投与、ＤＳＳ）、ヒトＩｇＧ処理マウス（試験１日目及び３日目に投与、ＤＳＳ）、及び抗体クローン４７７２処理マウス（試験１日目及び３日目に投与、ＤＳＳ）の、最終的な屠殺処理後のマウス腸組織について、組織学観点からの炎症重症度を示す。
【図2E】ナイーブマウス（未処理、ＤＳＳなし）、ＰＢＳ処理マウス（試験１日目及び３日目に投与、ＤＳＳ）、及び４７７２処理マウス（試験１日目及び３日目に投与、ＤＳＳ）の、最終的な屠殺処理後のマウス組織の遠位結腸切片に存在する多形核好中球（ＰＭＮ）のパーセントを示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本明細書で使用されるとき、冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語のうちの１つまたは１つを超えるもの（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「（ａｎ）要素」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【0019】
用語「抗体」は、抗体、フラグメント、指定の部分及びそれらの変異体、例えば本発明の抗体に由来する一本鎖抗体及びそれらのフラグメントなどを包含することを意図する。抗体は、抗体フラグメント、抗体変異体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び組換え抗体を含む。抗体は、マウス、ラット、ウサギまたはヒトにおいて産生され得る。
【0020】
抗体は完全長であることができる、または非限定的にＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｆａｃｂ、ｐＦｃ１、Ｆｄ、ｄＡｂフラグメント、単離したＣＤＲ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、抗体フラグメントから形成される二重特異性抗体及び多重特異性抗体などの抗原部分を有する、抗体のフラグメント（または複数のフラグメント）を含むことができる。
【0021】
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体の定常領域の全体または一部を含む。定常領域は、ＩｇＡ（例えばＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＭから選択されるアイソタイプである。本明細書で使用されるとき、抗体の「定常領域」としては、天然の定常領域、アロタイプまたは天然の変異体、例えばヒトＩｇＧ１におけるＤ３５６Ｅ及びＬ３５８ＭまたはＡ４３１Ｇが挙げられる（例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，ＭＡｂｓ，１（４）：３３２－３３８（Ｊｕｌｙ－Ａｕｇｕｓｔ ２００９）参照）。
【0022】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を介して産生した抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当該技術分野において利用できる、または既知である方法によって作られ、任意の真核生物、原核生物またはファージのクローンなど、単一のクローンに由来する。本発明のモノクローナル抗体は、当該技術分野において既知である様々な技法、例えばハイブリドーマの使用、組換え及びファージディスプレイ技術またはこれらの組み合わせなどを用いて調製できる。
【0023】
本明細書で使用される用語「キメラ抗体」は、ヒト以外の免疫グロブリン、例えばラットまたはマウス抗体に由来する変更可能な配列と、通常ヒト免疫グロブリンの鋳型から選択されるヒト免疫グロブリン定常領域と、を有する抗体を指す。キメラ抗体の産生方法は、当該技術分野において既知である。
【0024】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ免疫グロブリンである。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたはほぼ全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、フレームワーク領域の全てまたはほぼ全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つの及び通常２つの可変ドメインのほぼ全てを含む。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体のヒト化の方法は、当該技術分野において既知である。
【0025】
本明細書で使用される「有効量」は、炎症性腸疾患または消化器系のがんなど、消化器系の疾患の症状と兆候を低減させるのに十分な、抗体または医薬組成物の用量を指す。このような炎症性腸疾患の症状としては、下痢、体重減少、血性の下痢、血便、疼痛、貧血、疲労感、直腸出血、及び腹部痙攣が挙げられる。消化器系のがんの症状としては、体重減少、疼痛、及び臨床的に触知可能な腫瘤として、または放射線学的に、またはその他の画像診断技術を通じて検出可能な腫瘤が挙げられる。「有効量」と「治療的有効量」という用語は、同義的に用いられる。いくつかの実施形態では、有効量の薬物、化合物、または医薬組成物は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と組み合わせて得られても、または得られなくともよい。したがって、「有効量」は１種以上の化学療法剤またはその他の有効剤の投与に関連するとみなされてよく、また単剤は１種以上の他の薬剤と組み合わせて望ましい結果が達成される可能性がある、または達成される場合に、有効量で投与されているとみなされてよい。個々のニーズは異なるが、各構成成分の有効量の最適範囲の決定は、当該技術分野の範囲内である。典型的な投薬量は、０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。好ましい投薬量は、１～１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。最も好ましい投薬量は、１０～１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。
【0026】
用語「対象」または「個体」は、消化器系の疾患を有する脊椎動物、例えば炎症性腸疾患または消化器系のがんを有する脊椎動物を指し得る。対象は、全ての温血動物、例えば哺乳動物、例えばげっ歯動物を含み、好ましくは霊長類またはヒト以外の霊長類、より好ましくはヒトである。用語「対象」にはまた、飼育動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモットなど）も含まれる。したがって、本明細書において、獣医学的使用及び医薬品製剤または薬学的製剤が考慮される。
【0027】
当業者は、抗体が本来「モジュラー」であることを理解しているであろう。本開示の全体にわたって、本発明の抗体を含む各種「モジュール」の様々な特定の実施形態が記載されている。特定の非限定例として、可変重鎖ＣＤＲ、可変重鎖、可変軽鎖ＣＤＲ、及び可変軽鎖の様々な実施形態が記載されている。全ての特定の実施形態は、それぞれの特定の組み合わせが個別に明示的に記載されているかのように、互いに組み合わせることができると意図される。
【0028】
本発明のヒト化抗体は、下表１からの重鎖可変領域を含むことができ、さらに下表２からの軽鎖可変領域を含むことができる。このような可変領域は、当該技術分野で周知の方法を使用して、ヒトＩｇＧ１骨格に組み込むことができる。
【表1】
【表2】
【0029】
その他の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、下記の表３及び表４から選択される重鎖ＣＤＲ配列及び軽鎖ＣＤＲ配列を含むことができる。
【表3】
【表4】
【0030】
本発明は、ｓＬｅＡ及びｓＬｅＣに特異的に結合するが、シアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ）には結合しない抗体及びフラグメント、抗体を含む組成物、抗ｓＬｅＸ抗体でなく抗ｓＬｅＡ／ｓＬｅＣ抗体をコードするポリヌクレオチド、このような抗体をコードするポリヌクレオチド、このような抗体及び結合フラグメントを作製するのに有用な方法及び組成物、ならびにこれらを用いる各種方法を包含する。ｓＬｅＡ、ｓＬｅＣ及びｓＬｅＸのグリカン構造を、下表５に示す。
【表5】
【0031】
糖質／グリカンに対する抗体は、通常、結合親和性が低いために医薬品開発に不向きであり得る。抗体の結合親和性を決定する方法は、当該技術分野において既知である。一般的には、特定の標的または基質に対する結合親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）を導くための結合速度（ｋａ（Ｍ－１ｓ－１））と解離速度（ｋｄ（ｓ－１））の関係によって決定する。ＫＤが低いほど、親和性は高くなる。抗体の親和性を決定する方法の例としては、Ｏｃｔｅｔシステム（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）、またはＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、または会合定数及び解離定数を決定するその他のシステム測定器を利用したアッセイが挙げられる。したがって、本発明は、ｓＬｅＡに対する結合親和性が約５００μｍ以下のＫＤであり、ｓＬｅＣに対する結合親和性が約５００μｍ以下のＫＤであり、ｓＬｅＸに結合しない抗体を含む。非限定例では、本発明の抗体は、ｓＬｅＡに対する結合親和性が、１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、４０μＭ以下、３０μＭ以下、２０μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下または０．１μＭ以下のＫＤであり、ｓＬｅＣに対する結合親和性が、１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、４０μＭ以下、３０μＭ以下、２０μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下または０．１μＭ以下のＫＤであり、ｓＬｅＸに結合しない抗体を含む。一実施形態では、本発明で有用な抗体は、グリカン標的に対する結合親和性が、ｓＬｅＡに対しては４１μＭ以下のＫＤであり、ｓＬｅＣに対しては７０μＭ以下のＫＤであり、シアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ）には結合しない。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、特定の標的（例えばｓＬｅＸ）に、抗体の標的に対する結合親和性が約１ｍＭ以上のＫＤである場合、結合しない。
【0032】
本発明の抗体はまた、疾患の診断、例えば個体のがんの診断を補助する方法において使用されてもよい。そのようながんには、消化器系のがん、例えば膵臓癌または結腸癌が挙げられる。そのような方法としては、本発明の抗体を用いて、個体または個体の特定組織におけるｓＬｅＡ及び／またはｓＬｅＣの結合レベルを決定する方法が挙げられる。本明細書で使用されるとき、「診断を補助する」方法は、これらの方法が、分類、または性質、またはがんに関して臨床的な決定を行う手助けとなり、確定診断に関して断定的であってもよく、または断定的でなくてもよい方法であることを意味する。したがって、がんの診断を補助する方法は、個体からの生体試料中のｓＬｅＡ及び／またはｓＬｅＣのレベルを検出する工程、及び／または試料中のｓＬｅＡ及び／またはｓＬｅＣのレベルを決定する工程を含み得る。また、エピトープまたはその一部を認識する抗体は、体液中、非限定的に血液、唾液、尿、肺液（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｌｕｉｄ）または腹水液などに放出される抗原決定基を検出する診断用イムノアッセイの作成に使用されてよい。同様に、本発明の抗体を使用するこの種のイムノアッセイを利用して、治療の有効性及び／または疾患の寛解を監視してもよい。このような場合、本発明の抗体に反応性の抗原決定基の存在及び／またはレベルは、疾患の活性及び／または進行を監視するためのバイオマーカーとして有用であってよい。
【0033】
いくつかの実施形態では、個体または個体の特定組織中のｓＬｅＡ及び／またはｓＬｅＣの存在を検出する方法及び／またはｓＬｅＡ及び／またはｓＬｅＣのレベルを測定する方法で、本開示の抗体を使用してもよい。
【0034】
本開示の特定の態様は、本開示の抗体をコードするポリヌクレオチド（例えば、単離したポリヌクレオチド）及び／またはベクター（例えば、発現ベクター）、ならびにポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞（例えば、単離した宿主細胞）に関する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核生物の宿主細胞、例えば細菌宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。好適な原核生物の宿主細胞には、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性の生物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えばＥ． ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えばＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａなどが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核生物の宿主細胞、例えば酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、またはその他の多細胞生物からの有核細胞である。例えば、糸状真菌または酵母菌は、抗体コードベクターに好適なクローニングまたは発現の宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン酵母菌が、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されているものである。グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）由来である。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。脊椎動物細胞または哺乳動物細胞の例としては、例えば、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎由来細胞ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胎児腎細胞株（２９３細胞、または増殖のために懸濁培養でサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））、サル腎由来細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頚部癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎由来細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝癌由来細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにＮＳ０及びＳｐ２／０のような骨髄腫細胞株が挙げられる。
【0035】
本開示のその他の態様は、本開示の宿主細胞を使用した産生方法に関する。抗体またはそれらの抗原結合部位は、組換え方法を使用して産生され得る。抗体または抗原結合部位の組換え産生では、抗体／部位をコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のためにベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、単離され、従来の手順（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）を使用して配列決定され得る。ベクター構成成分としては、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【0036】
本発明の抗体は、消化器系の疾患または障害を有する個体において、治療目的のために使用されてよい。このような疾患には、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、過敏性腸症候群、ならびに膵臓癌及び結腸癌を含む消化器系のがんが挙げられるが、それらに限定されない。
【0037】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、１種以上の疾患の症状を治療または改善するために、単独で使用されてよい。その他の実施形態では、本発明の抗体は、１種以上の疾患の症状を治療または改善するために、その他の治療剤または薬剤と組み合わせて使用されてよい。
【0038】
投与には、本発明の抗体またはそれらのフラグメントの様々な製剤が使用されてよい。いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、未希釈で投与されてよい。本発明の組成物は、薬理活性剤に加えて、好適な薬学的に許容されるキャリアを含有してもよい。このキャリアには、当該技術分野で周知であり、比較的不活性な物質である賦形剤及び助剤が含まれ、賦形剤及び助剤は、薬理的に有効な物質の投与を促進する、または作用部位への送達のために、薬学的に使用可能な調製物内への活性化合物の処理を容易にする。例えば、賦形剤は、成形性もしくは均一性を提供できる、または希釈剤として作用できる。好適な賦形剤としては、安定化剤、湿潤剤及び乳化剤、浸透圧を変えるための塩、カプセル化剤、緩衝液及び皮膚浸透促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0039】
非経口投与に好適な製剤としては、水溶性の形態、例えば水溶性塩での活性化合物の水溶液が挙げられる。加えて、油性注射剤懸濁液に適切な有効成分化合物の懸濁液が投与されてもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドが挙げられる。水性注射剤懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよく、物質の例としては、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／またはデキストランが挙げられる。場合によっては、懸濁液は安定剤を含有してもよい。また、薬剤を細胞内へ送達するために、リポソームを使用して薬剤をカプセル化することもできる。
【0040】
本発明による全身性投与用の医薬品製剤は、経腸投与、非経口投与、または局所投与用として調製されてよい。実際に、有効成分の全身性投与を達成するために、３種類全ての製剤を同時に使用してもよい。非経口及び非経口以外の薬物送達用の賦形剤ならびに製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に記載されている。
【0041】
経口投与のための好適な製剤としては、硬ゼラチンカプセルもしくは軟ゼラチンカプセル、丸剤、コーティング錠剤などの錠剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤または吸入剤、及びそれらの制御放出形態が挙げられる。
【0042】
一般的に、これらの剤は、注射剤（例えば、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与など）による投与用として調製されるが、その他の投与形態（例えば、経口投与、粘膜投与など）もまた利用できる。したがって、本発明の抗体は、薬学的に許容されるビヒクル、例えば生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などと組み合わせるのが好ましい。
【0043】
個々の投薬計画、すなわち、用量、タイミング及び反復は、特定の個体及びその個体の病歴によって決定されるものとする。一般的に、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ体重、またはより好ましくは少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重、または少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量が投与される。
【0044】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、治療の過程で、１通り以上の用量で投与される。半減期などの経験的考察は、投薬量の決定に通常寄与するだろう。ヒト化抗体または完全にヒトの抗体などの抗体は、ヒト免疫系との適合性があり、これらを使用して、抗体の半減期を延長したり、宿主の免疫系から抗体が攻撃されるのを防ぐことができる。投与頻度は、治療の過程で決定及び調整されてよく、疾患の１種以上の臨床的な症状の低減に基づいてもよい。あるいは、本発明の抗体の持続的、連続的な放出製剤が適切であり得る。持続放出を獲得するための各種の製剤及び装置が、当該技術分野において既知である。
【0045】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるものであって、限定するものではない。
【実施例】
【0046】
実施例１：ヒト化抗体クローンの生成
上記の表１からの重鎖可変領域の１つを含む重鎖可変領域と、上記の表２からの軽鎖可変領域の１つを含む軽鎖可変領域とを有するヒト化抗体を合成し、ＩｇＧ１骨格に組み込んだ。ＩｇＧ１骨格に組み込み、合成した重鎖可変領域と軽鎖可変領域のペアは、下表６のものであった。
上記の表１からの重鎖可変領域の１つを含む重鎖可変領域と、上記の表２からの軽鎖可変領域の１つを含む軽鎖可変領域とを有するヒト化抗体を合成し、ＩｇＧ１骨格に組み込んだ。ＩｇＧ１骨格に組み込み、合成した重鎖可変領域と軽鎖可変領域のペアは、下表６のものであった。
【表6】
【0047】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域のペアの上記の組み合わせを有するヒト化抗体を、哺乳動物細胞にプラスミドをトランスフェクションさせることによって産生し、親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。
【0048】
表６の９種のヒト化抗体クローンのうち、２種の抗体クローン（４７６４及び４７６７）は弱い発現を示し、精製後、１ｍｇ未満の抗体という結果になった。これらの２種のクローンの産生レベルは、実用的な細胞株産生の最適化のためには低すぎるとみなした。続いて、ｓＬｅＡ、ｓＬｅＣ及びｓＬｅＸへの結合親和性について、残りの７種のクローンをスクリーニングした。
【0049】
実施例２：シアリルルイスＡ（ｓＬｅＡ）及びシアリルルイスＣ（ｓＬｅＣ）への結合親和性
実施例１からのヒト化抗体の、ｓＬｅＡ及びｓＬｅＣに対する結合親和性のインビトロ評価を、ＰＢＳ－ｐ（０．００５％のＴｗｅｅｎ－２０）ランニングバッファーを用いるＣＭ７センサチップを使用するＢｉｏｃｏｒｅ Ｔ１００ ＳＰＲバイオセンサを使用して、摂氏２５度で実施した。抗体を、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化表面上で、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム１０ｍＭにおいて、５０ｕｇ／ｍｌで、約３０，０００ＲＵで結合させた。参照表面を活性化しブロックすることで、対照として機能させた。糖質試料（ｓＬｅＡ、ｓＬｅＣ及びシアリルルイスＸ（全てＤｅｘｔｒａ Ｌａｂｓより購入））を、１０ｍＭのストック濃度になるまでＰＢＳ－ｐランニングバッファー中に溶解させた。続いて、各試料を、２倍希釈系列において最大濃度３００μｍで調製し、抗体表面上で各濃度系列を試験した。参照表面及びバッファー注入から反応を差し引くことによって、反応データを処理した。摂氏２５度での、結合定数を決定した。
実施例１からのヒト化抗体の、ｓＬｅＡ及びｓＬｅＣに対する結合親和性のインビトロ評価を、ＰＢＳ－ｐ（０．００５％のＴｗｅｅｎ－２０）ランニングバッファーを用いるＣＭ７センサチップを使用するＢｉｏｃｏｒｅ Ｔ１００ ＳＰＲバイオセンサを使用して、摂氏２５度で実施した。抗体を、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化表面上で、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム１０ｍＭにおいて、５０ｕｇ／ｍｌで、約３０，０００ＲＵで結合させた。参照表面を活性化しブロックすることで、対照として機能させた。糖質試料（ｓＬｅＡ、ｓＬｅＣ及びシアリルルイスＸ（全てＤｅｘｔｒａ Ｌａｂｓより購入））を、１０ｍＭのストック濃度になるまでＰＢＳ－ｐランニングバッファー中に溶解させた。続いて、各試料を、２倍希釈系列において最大濃度３００μｍで調製し、抗体表面上で各濃度系列を試験した。参照表面及びバッファー注入から反応を差し引くことによって、反応データを処理した。摂氏２５度での、結合定数を決定した。
【0050】
ｓＬｅＡ、ｓＬｅＣ及びｓＬｅＸに対する結合親和性について、マウス抗体（ＧＭ３５）（Ｂｒａｚｉｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９１：４８０４－４８１７（２０１３）に記載）を、上述の方法を使用して試験した。この抗体の結果では、ｓＬｅＸへの結合は示されず、ｓＬｅＡに対して４１．５μＭ～４６．８μＭのＫＤ、及びｓＬｅＣに対して６８．８μＭ～７８．２μＭのＫＤを有した。比較として、別の抗体、ＮＳ１９－９（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）の試験を行った。この抗体はｓＬｅＡに結合することが知られる抗体であり、ｓＬｅＸには結合を示さず、ｓＬｅＡに対して３９．５μＭのＫＤ、及びｓＬｅＣに対して１．５ｍＭのＫＤを有した。
【0051】
実施例３：ヒト化抗体クローンのシアリルルイスＡ（ｓＬｅＡ）及びシアリルルイスＣ（ｓＬｅＣ）に対する結合親和性
ｓＬｅＡ、ｓＬｅＣ及びｓＬｅＡに対する結合親和性について、実施例１からの７種のヒト化抗体クローンを試験した。ｓＬｅＸは３００μＭの１種の濃度のみを用いた以外は、上述の実施例２と同様の方法を使用した。７種の各ヒト化抗体クローンの、ｓＬｅＡ及びｓＬｅＣへの平均結合ＫＤ値を下表７に示す。
ｓＬｅＡ、ｓＬｅＣ及びｓＬｅＡに対する結合親和性について、実施例１からの７種のヒト化抗体クローンを試験した。ｓＬｅＸは３００μＭの１種の濃度のみを用いた以外は、上述の実施例２と同様の方法を使用した。７種の各ヒト化抗体クローンの、ｓＬｅＡ及びｓＬｅＣへの平均結合ＫＤ値を下表７に示す。
【表7】
【0052】
３００μＭの糖質濃度での３回の独立した試験では、上記の抗体クローンのいずれもｓＬｅＸへの結合を示さなかった。上記の結合親和性データから、ＨｖＣｈ３可変領域を有するヒト化抗体クローンが、ｓＬｅＡ及びｓＬｅＣの両方に対して最も高い親和性を有することが示された。
【0053】
実施例４：インビトロ創傷治癒活性
ヒト化抗体作用の創傷治癒メカニズムを、インビトロ引っ掻き傷アッセイで試験した。ヒト結腸上皮細胞、Ｔ８４（ＣＣＬ－２４８、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を、６ウェルプレートでコンフルエンシーまで増殖させた。各条件で、ピペットチップを用いて引っ掻き傷を作り、細胞をヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）対照（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｕｇ／ｍｌ、または上記の実施例３のヒト化抗体、１０ｕｇ／ｍｌのいずれかで処理した。処理から２４時間後に、目視検査によって、及びＩｍａｇｅＪに基づく画像解析による引っ掻き傷の寸法の測定によって、創傷治癒活性を測定した。ヒト化抗体は、ｈＩｇＧ対照と比較して高い創傷治癒活性を示した。非限定例として、実施例３のヒト化抗体クローンの１つである、クローン４７７２の創傷治癒活性を図１Ａ～図１Ｂに示す。図１Ａ及び図１Ｂに見られる創傷治癒活性の高まりは、抗体クローン４７７２を含む実施例３のヒト化抗体が、炎症性腸疾患などの消化器系の障害の治療において有効であり得ることを示す。
ヒト化抗体作用の創傷治癒メカニズムを、インビトロ引っ掻き傷アッセイで試験した。ヒト結腸上皮細胞、Ｔ８４（ＣＣＬ－２４８、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を、６ウェルプレートでコンフルエンシーまで増殖させた。各条件で、ピペットチップを用いて引っ掻き傷を作り、細胞をヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）対照（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｕｇ／ｍｌ、または上記の実施例３のヒト化抗体、１０ｕｇ／ｍｌのいずれかで処理した。処理から２４時間後に、目視検査によって、及びＩｍａｇｅＪに基づく画像解析による引っ掻き傷の寸法の測定によって、創傷治癒活性を測定した。ヒト化抗体は、ｈＩｇＧ対照と比較して高い創傷治癒活性を示した。非限定例として、実施例３のヒト化抗体クローンの１つである、クローン４７７２の創傷治癒活性を図１Ａ～図１Ｂに示す。図１Ａ及び図１Ｂに見られる創傷治癒活性の高まりは、抗体クローン４７７２を含む実施例３のヒト化抗体が、炎症性腸疾患などの消化器系の障害の治療において有効であり得ることを示す。
【0054】
実施例５：ＤＳＳ誘発性結腸炎の急性モデルにおけるインビボ有効性
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性結腸炎のインビボマウス急性モデルにおいて、抗体クローン４７７２の有効性を試験した。試験１日目に、全ての動物を体重別に無作為化した。体重が１８～２２ｇである動物を試験に登録するものとする。試験０日目に開始し、「ナイーブ」グループに属さない試験に登録された全ての１０週齢の雄、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、滅菌水中に溶解させた２．５％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を、７日間、適宜与えた。ＤＳＳ水を、試験３日目に新しくした。試験７日目に、全ての測定完了後、全ての動物を飲み水のみに切り替えた。「ナイーブ」グループのマウスには、酸性水のみ適宜与え、試験物質による処理はなかった。
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性結腸炎のインビボマウス急性モデルにおいて、抗体クローン４７７２の有効性を試験した。試験１日目に、全ての動物を体重別に無作為化した。体重が１８～２２ｇである動物を試験に登録するものとする。試験０日目に開始し、「ナイーブ」グループに属さない試験に登録された全ての１０週齢の雄、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、滅菌水中に溶解させた２．５％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を、７日間、適宜与えた。ＤＳＳ水を、試験３日目に新しくした。試験７日目に、全ての測定完了後、全ての動物を飲み水のみに切り替えた。「ナイーブ」グループのマウスには、酸性水のみ適宜与え、試験物質による処理はなかった。
【0055】
抗体クローン４７７２またはヒトＩｇＧを与えている動物に、試験１日目及び試験３日目の別々の２日に、適切な薬物を１０ｍｇ／ｋｇ体重（４７７２）で、または２５ｍｇ／ｋｇ体重（ヒトＩｇＧ）で、腹腔内（ＩＰ）注入を介して注入した。ＰＢＳを与えるように指定したグループのマウスには、試験１日目及び３日目にＰＢＳ ＩＰ注入を与えた。
【0056】
試験１日目から開始して体重を毎日測定し、便の硬さ評価を試験０日目、２日目、４日目、６日目、８日目、９日目、１０日目及び１３日目に実施した。この試験の結果を、図２Ａ～図２Ｅに示す。図２Ａは、試験方法の略図である。図２Ｂは、試験１０日目に測定した便の硬さの結果を示す。図示されるように、抗体クローン４７７２を与えられたマウスは、ＰＢＳ対照及びｈＩｇＧ対照と比較して、より良好な便の硬さ（低いｙ軸の値）を有した。同様に、図２Ｂでは、抗体クローン４７７２で処理したマウスは、ＰＢＳ対照及びｈＩｇＧ対照と比較して体重減少が少なかった。便の硬さと体重減少は、炎症性腸疾患を含む消化器系の疾患の症状を示唆する、２つの要素である。これらのデータは、抗体クローン４７７２を含む実施例３のヒト化抗体が、炎症性腸疾患を含む消化器系の障害の治療において有効であり得ることを示している。
【0057】
最終的な屠殺処理後に回収した腸組織試料を、炎症の重症度（結腸組織中で観察された壊死、びらん、過形成、多形核好中球（ＰＭＮ）浸潤のパーセント、及び浮腫）について評価した。図２Ｄに示す通り、抗体クローン４７７２を与えられたマウスは、ＰＢＳ対照及びｈＩｇＧ対照と比較して、炎症の兆候が小さかった。さらに、抗体クローン４７７２を与えられたマウスは、ＰＢＳで処理したマウスと比較して、末端結腸におけるＰＭＮ浸潤が、５０％を超えて小さかった（図２Ｅ参照）。これらのデータは、抗体クローン４７７２を含む実施例３のヒト化抗体が、ＤＳＳで誘発された損傷の後に腸組織の炎症を低減させ得る、また炎症性腸疾患を含む消化器系の障害の治療において有効であり得ることを示す。
【0058】
配列表
配列番号１：ＨｖＣｈ１のアミノ酸配列
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配列番号２：ＨｖＣｈ２のアミノ酸配列
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配列番号３：ＨｖＣｈ３のアミノ酸配列
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配列番号４：ＨｖＣｈ４のアミノ酸配列
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配列番号５：ＬｉＣｈ１のアミノ酸配列
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配列番号６：ＬｉＣｈ２のアミノ酸配列
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配列番号７：ＬｉＣｈ３のアミノ酸配列
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配列番号８：ＬｉＣｈ４のアミノ酸配列
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配列番号９：ＬｉＣｈ５のアミノ酸配列
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配列番号１０：ＬｉＣｈ６のアミノ酸配列
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配列番号１１：ＬｉＣｈ７のアミノ酸配列
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配列番号１２：重鎖ＣＤＲ－１のアミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＴＮＡＭＳ
配列番号１３：重鎖ＣＤＲ－２のアミノ酸配列
ＲＬＲＰＫＳＤＮＹＡＴＹ
配列番号１４：重鎖ＣＤＲ－３のアミノ酸配列
ＶＴＧＴＧＦ
配列番号１５：軽鎖ＣＤＲ－１のアミノ酸配列
ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ
配列番号１６：軽鎖ＣＤＲ－１Ｂのアミノ酸配列
ＫＳＳＱＳＬＬＱＳＧＮＱＫＮＹＬＴ
配列番号１７：軽鎖ＣＤＲ－１Ｃのアミノ酸配列
ＫＳＳＱＳＬＬＳＳＧＮＱＫＮＹＬＴ
配列番号１８：軽鎖ＣＤＲ－２のアミノ酸配列
ＷＴＳＴＲＥＳ
配列番号１９：軽鎖ＣＤＲ－３のアミノ酸配列
ＱＮＤＹＴＳＰＹＴ
配列番号１：ＨｖＣｈ１のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＮＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＬＲＰＫＳＤＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＴＧＦＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号２：ＨｖＣｈ２のアミノ酸配列
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配列番号３：ＨｖＣｈ３のアミノ酸配列
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配列番号４：ＨｖＣｈ４のアミノ酸配列
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配列番号５：ＬｉＣｈ１のアミノ酸配列
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配列番号６：ＬｉＣｈ２のアミノ酸配列
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配列番号７：ＬｉＣｈ３のアミノ酸配列
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配列番号８：ＬｉＣｈ４のアミノ酸配列
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配列番号９：ＬｉＣｈ５のアミノ酸配列
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配列番号１０：ＬｉＣｈ６のアミノ酸配列
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配列番号１１：ＬｉＣｈ７のアミノ酸配列
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＳＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＦＹＷＴＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＴＳＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１２：重鎖ＣＤＲ－１のアミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＴＮＡＭＳ
配列番号１３：重鎖ＣＤＲ－２のアミノ酸配列
ＲＬＲＰＫＳＤＮＹＡＴＹ
配列番号１４：重鎖ＣＤＲ－３のアミノ酸配列
ＶＴＧＴＧＦ
配列番号１５：軽鎖ＣＤＲ－１のアミノ酸配列
ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ
配列番号１６：軽鎖ＣＤＲ－１Ｂのアミノ酸配列
ＫＳＳＱＳＬＬＱＳＧＮＱＫＮＹＬＴ
配列番号１７：軽鎖ＣＤＲ－１Ｃのアミノ酸配列
ＫＳＳＱＳＬＬＳＳＧＮＱＫＮＹＬＴ
配列番号１８：軽鎖ＣＤＲ－２のアミノ酸配列
ＷＴＳＴＲＥＳ
配列番号１９：軽鎖ＣＤＲ－３のアミノ酸配列
ＱＮＤＹＴＳＰＹＴ
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【配列表】
【国際調査報告】