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特表2023-518257真空支援電気穿孔装置、並びに関連するシステム及び方法
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45A-47C
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-28
(54)【発明の名称】真空支援電気穿孔装置、並びに関連するシステム及び方法
(51)【国際特許分類】
A61N 1/32 20060101AFI20230421BHJP
A61N 1/04 20060101ALI20230421BHJP
【ＦＩ】
A61N1/32
A61N1/04
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022555995
(86)(22)【出願日】2021-03-19
(85)【翻訳文提出日】2022-10-19
(86)【国際出願番号】 US2021023344
(87)【国際公開番号】W WO2021189012
(87)【国際公開日】2021-09-23
(31)【優先権主張番号】62/992,513
(32)【優先日】2020-03-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509320254
【氏名又は名称】イノビオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100092624
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴田 準一
(74)【代理人】
【識別番号】100114018
【弁理士】
【氏名又は名称】南山 知広
(74)【代理人】
【識別番号】100153729
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 有一
(74)【代理人】
【識別番号】100211177
【弁理士】
【氏名又は名称】赤木 啓二
(72)【発明者】
【氏名】ポール フィッシャー
(72)【発明者】
【氏名】アンドレア ケンメ
(72)【発明者】
【氏名】エリック シャーデ
(72)【発明者】
【氏名】ジェイ マッコイ
(72)【発明者】
【氏名】ケイト ブロデリック
(72)【発明者】
【氏名】アリソン エー．ジェネロッティ
【テーマコード（参考）】
4C053
【Ｆターム（参考）】
4C053BB13
4C053BB32
4C053JJ02
4C053JJ11
4C053JJ21
4C053JJ24
4C053JJ32
4C053JJ40
(57)【要約】
組織の真空支援インビボ電気穿孔のための装置は、チャンバ及び該チャンバ内への少なくとも１つの開口を画定する筐体を含む。ポートは、筐体を通って延在し、少なくとも１つの開口から離れており、真空源に接続可能である。ポートは、真空源からチャンバに真空圧を伝達するように構成されている。複数の電極は、チャンバ内に位置付けられ、真空圧に応答して、開口を通って延在し、チャンバ内に保持されている組織の標的部分に、１つ以上の電気穿孔パルスを送達するように構成されている。
【選択図】図２Ａ
【選択図】図２Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組織の真空支援インビボ電気穿孔のための装置であって、チャンバ及び前記チャンバ内への少なくとも１つの開口を画定する筐体と、
前記筐体を通って延在する少なくとも１つのポートであって、前記少なくとも１つのポートは、前記少なくとも１つの開口から離れており、真空源に接続可能であり、それにより前記少なくとも１つのポートは、前記真空源から前記チャンバに真空圧を伝達するように構成されている、少なくとも１つのポートと、
前記チャンバ内に位置付けられた複数の電極であって、前記複数の電極は、前記真空圧に応答して、前記少なくとも１つの開口を通って延在し、少なくとも瞬間的に前記チャンバ内に保持されている組織の標的部分に、１つ以上の電気穿孔パルスを送達するように構成されている、複数の電極と、を備える、装置。
【請求項2】
前記少なくとも１つの開口は単一の開口であり、前記開口は円形である、請求項１に記載の装置。
【請求項3】
前記筐体は、前記チャンバを少なくとも部分的に画定する内面を画定する壁を有し、前記複数の電極は、前記内面に沿って延在する４つの電極を含み、前記４つの電極は９０度の間隔で互いから離隔されている、請求項２に記載の装置。
【請求項4】
前記少なくとも１つのポートに加えて第２のポートを更に備え、前記第２のポートは、前記チャンバ内へのジェット注入装置又は皮下注入針の挿入のために構成されている、請求項２に記載の装置。
【請求項5】
前記筐体は、前記少なくとも１つの開口の反対側の端面と、前記端面から前記開口まで延在する壁とを有し、前記壁は、前記チャンバまでを少なくとも部分的に画定する内面を画定し、前記複数の電極のうちの少なくとも１つの第１の電極は、前記端面から延在し、前記複数の電極のうちの少なくとも１つの第２の電極は、前記内面に沿って延在し、前記少なくとも１つの第１の電極と前記少なくとも１つの第２の電極とは、互いに同心である、請求項２に記載の装置。
【請求項6】
前記少なくとも１つの第１の電極は、前記端面に対して中心に位置付けられた単一の電極であり、前記少なくとも１つの第２の電極は、前記内面の全周に沿って延在する、請求項５に記載の装置。
【請求項7】
前記複数の電極は、前記チャンバ内で露出する電極面を有し、前記電極面のうちの少なくともいくつかは、テクスチャ加工されている、及び前記チャンバ内へと突出しているのうちの１つ以上である、請求項１に記載の装置。
【請求項8】
前記筐体は、可撓性である材料で構築され、前記材料は、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリフタルアミド、ポリエチレン、ポリエーテルイミド、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアミド、ポリイミド、ポリシロキサン（シリコーン）、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、架橋又は非架橋ゴム、ポリエステルのうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項9】
前記複数の電極と電気的に連通し、前記１つ以上の電気穿孔パルスを前記複数の電極に送信するように構成されている、信号生成器と、前記信号生成器及び前記チャンバ内に位置付けられた少なくとも１つのセンサと電気的に連通するプロセッサであって、前記少なくとも１つのセンサは、前記１つ以上の電気穿孔パルスの送達の間に前記組織の少なくとも１つのパラメータを感知し、前記少なくとも１つのパラメータのフィードバックデータを前記プロセッサに通信するように構成され、前記プロセッサは、前記フィードバックデータを利用して１つ以上のアルゴリズムを実行し、前記１つ以上のパルスの送達の間に前記１つ以上のパルスの少なくとも１つのパルスパラメータを調節するように構成されている、プロセッサと、を更に備える、請求項１に記載の装置。
【請求項10】
前記複数の電極は、約２Ｖ～約１０００Ｖの範囲の電位の大きさを有するパルスを印加するように構成されている、請求項１に記載の装置。
【請求項11】
前記複数の電極は、約０．０１アンペア～約２．０アンペアの範囲の電流の大きさを有するパルスを印加するように構成され、前記パルスは、約０．１ミリ秒～約１００ミリ秒の範囲のパルス継続時間を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項12】
前記少なくとも１つのポートはポートのアレイを含み、前記ポートのアレイの各々は、前記筐体が前記ポートのアレイを画定するマニホールドを含むように、前記筐体を通って前記チャンバ内へと延在する、請求項１に記載の装置。
【請求項13】
前記組織の前記標的部分は、皮膚組織及び脂肪組織のうちの少なくとも一方である、請求項１に記載の装置。
【請求項14】
対象の組織を電気穿孔する方法であって、前記対象の組織に隣接してチャンバを置くことと、
前記チャンバに真空圧を加え、それにより前記組織を、前記チャンバの開口を通して引き込み、前記チャンバの内面に沿って延在する複数の電極に接触させることと、
前記複数の電極を通して１つ以上の電気穿孔パルスを前記組織に送達し、それにより前記組織内に電気穿孔場を生成することと、を含む、方法。
【請求項15】
前記加えるステップは、前記組織を前記内面に貼付し、流体を前記電気穿孔場の前記組織内に分散させるのに十分なレベルで前記真空圧を加えることを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記送達するステップの前に、前記組織に物質を注入することを更に含み、前記送達するステップは、前記電気穿孔場内の前記組織の細胞内に、前記電気穿孔場に応答して前記細胞の細胞膜に形成された可逆的な孔を通して、前記物質を移送することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記物質は、前記対象において免疫応答を誘発する核酸を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記加えるステップは、変動する真空圧のパルスを前記組織に加えることと、前記パルスの継続時間を変化させることとを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項19】
第２のポートを通って前記チャンバ内へと延在する注入装置から前記組織内に流体を注入することを更に含み、前記注入するステップ及び前記加えるステップは、前記送達するステップの前に実行され、前記注入装置は、注入針及びジェット注入装置のうちの一方である、請求項１４に記載の方法。
【請求項20】
組織の真空支援処置のための装置であって、チャンバ及び前記チャンバ内への少なくとも１つの開口を画定する筐体と、
前記筐体を通って延在する第１のポートであって、前記第１のポートは、前記少なくとも１つの開口から離れており、真空源に接続可能であり、それにより前記第１のポートは、前記真空源から前記チャンバに真空圧を伝達するように構成されている、少なくとも１つのポートと、
第２のポートを通って前記チャンバ内へと延在するジェット注入装置であって、前記第２のポートは、前記少なくとも１つの開口の反対側にあり、前記ジェット注入装置は、前記真空圧に応答して、前記少なくとも１つの開口を通って延在し、少なくとも瞬間的に前記チャンバ内に保持されている組織の標的部分に、流体のジェット注入を送達するように構成されている、ジェット注入装置と、を備える、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月２０日に出願された米国仮出願第６２／９９２，５１３号の利益を主張するものであり、その内容全体が、この参照により本明細書に組み込まれたものとする。
本出願は、２０２０年３月２０日に出願された米国仮出願第６２／９９２，５１３号の利益を主張するものであり、その内容全体が、この参照により本明細書に組み込まれたものとする。
【0002】
本発明は、真空圧を用いて組織を把持し、変形させ、組織に流体を注入し、電極を用いて組織を電気穿孔するための装置、並びに組織への流体の注入又は別様の送達及び組織の電気穿孔に関するシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【0003】
１９７０年代に、細胞に永久的な損傷を与えることなく、細胞内に孔を生成するために、電場を使用できることが発見された。電気穿孔（ＥＰ）と呼ばれるこの発見は、大きな分子、小さな分子、イオン及び水が、細胞壁を通して細胞の細胞質内に導入されることを可能とした。いくつかの例において、電気穿孔は、頭頸部がんのような局所処置において、化学物質及びその他の化合物を腫瘍に導入するために使用することができる。これらの処置の間、患者は全身麻酔下である場合とそうでない場合があるため、痛み及び不随意筋の動きが最小化される必要がある。
【0004】
皮膚は、容易にアクセスされ、ＤＮＡワクチンの送達に適した多様な免疫細胞を豊富に含んでいるため、ＥＰのためによく使われる標的である。皮膚の自然な免疫機能及びその高い細胞回転率は、典型的に、ＥＰ増強ＤＮＡワクチン送達に対する、迅速で強力な体液性応答に導く。皮膚はまた、ＥＰ増強ＤＮＡワクチン送達に続いて、細胞性免疫応答を生成することが可能である。その表面的な性質により、皮膚は、低侵襲性又は非侵襲性のＥＰに適している。
【0005】
骨格筋もまた、インビボでのＤＮＡの電気穿孔媒介（ＥＰ）送達のためのよく特徴付けられた標的である。筋細胞は、長期間にわたってタンパク質を産生及び分泌することが可能であり、筋肉へのＥＰ増強ＤＮＡワクチン接種が免疫応答を生成することが可能であることが、繰り返し実証されている。しかしながら、筋肉へのＥＰ ＤＮＡ送達の適用は、皮下脂肪の厚さが異なるために複雑であり、異なる脂肪の厚さは筋肉組織への針の異なる侵入深さに帰着するため、「１つのサイズで全てに対応する」アプローチを妨げる。骨格筋は典型的には、特に大型動物及びヒトでは、絶縁体である皮下脂肪層及び電場を発生させるために必要な深さのため、低侵襲性又は非侵襲性のＥＰ技術には適していない。それ故、筋肉においてＥＰを行うためには、貫通針電極が最も一般的に使用されている。
【0006】
歴史的に、脂肪組織（脂肪）は、主に脂質滴の形でエネルギーを貯蔵するために使用される不活性組織とみなされてきた。そのため、ＥＰ増強ＤＮＡ処置が組織の脂肪層に向けられたのは、最近のことである。しかしながら、最近の研究は、皮下脂肪が実際には多くの動的な役割を担っていることを示している。脂肪組織は、多くの幹細胞及び免疫細胞を含み、多数のホルモンを分泌することにより内分泌器官として働き、多くの局所的信号を分泌し、精巧な毛細血管網を含む。脂肪組織のインビボのトランスフェクションを達成しようとする試みは、主に、管理者が患者の皮膚のサンプルを切り取って物理的に除去して、脂肪組織と直接接触することを可能にする必要がある、外科的手法に限られていた。これらの処置は極めて侵襲的であり、臨床的装置には適さない。
【発明の概要】
【0007】
本開示の一実施形態によれば、組織の真空支援インビボ電気穿孔のための装置は、チャンバ及びチャンバ内への少なくとも１つの開口を画定する筐体を含む。ポートが、筐体を通って延在し、少なくとも１つの開口から離れており、真空源に接続可能である。ポートは、真空源からチャンバに真空圧を伝達するように構成されている。複数の電極は、チャンバ内に位置付けられ、真空圧に応答して、開口を通って延在し、少なくとも瞬間的にチャンバ内に保持されている組織の標的部分に、１つ以上の電気穿孔パルスを送達するように構成されている。
【0008】
本開示の別の実施形態によれば、対象の組織を電気穿孔する方法は、組織に隣接してチャンバを置くことと、チャンバに真空圧を加え、それにより組織を、チャンバの開口を通して引き込み、チャンバの内面に沿って延在する複数の電極に接触させることと、複数の電極を通して１つ以上の電気穿孔パルスを組織に送達し、それにより組織内に電気穿孔場を生成することと、を含む。
【0009】
本開示の更なる実施形態によれば、組織の真空支援処置のための装置は、チャンバ及びチャンバ内への少なくとも１つの開口を画定する筐体を含む。第１のポートは、筐体を通って延在し、少なくとも１つの開口から離れている。第１のポートは、真空源に接続可能であり、それにより第１のポートが、真空源からチャンバに真空圧を伝達するように構成されている。本装置は、第２のポートを通ってチャンバ内へと延在するジェット注入装置を含む。第２のポートは、少なくとも１つの開口の反対側にある。ジェット注入装置は、真空圧に応答して、少なくとも１つの開口を通って延在し、少なくとも瞬間的にチャンバ内に保持されている組織の標的部分に、流体のジェット注入を送達するように構成されている。
【図面の簡単な説明】
【0010】
本特許出願は、少なくとも１枚のカラーで作成された図面を含む。カラー図面を含む本特許出願の写しは、請求及び必要な手数料の支払いに応じて、官庁から提供される。前述の概要、及び本出願の例示的な実施形態の以下の詳細な説明は、添付図面とともに読まれたときに、より良く理解されるであろう。本出願の構造を説明する目的で、図面には例示的な実施形態が示されている。しかしながら、本出願は、図示された正確な配置及び器具に限定されるものではないことは、理解されるべきである。
【0011】
【図1】本開示の一実施形態による、針注入装置と組み合わせて真空支援電気穿孔カップ（又は「真空カップ」）を利用する電気穿孔システムの図式的な図である。
【図3C-3M】本開示の追加的な実施形態による、代替の電極アレイパターンを有するスリーブのそれぞれ底面図及び断面側面図である。
【図5A】本開示の一実施形態による、可撓性の電極を有する真空カップの斜視図である。
【図6A-6B】本開示の一実施形態による、突出部を画定する接触面を有する電極のそれぞれ斜視図及び側面立面図である。
【図6C-6D】本開示の別の実施形態による、横方向に長細い突出部を画定する接触面を有する電極のそれぞれ斜視図及び側面立面図である。
【図7A】本開示の一実施形態による、三角形の遠位開口及び真空チャンバの幾何学的形状を有する真空カップの斜視図である。
【図8A】本開示の一実施形態による、長方形の遠位開口及び真空チャンバの幾何学的形状を有する真空カップの斜視図である。
【図9A】本開示の一実施形態による、針なし注入装置が受容されるレセプタクルを有する真空カップを含む電気穿孔アセンブリの断面側面図である。
【図10A】針なし注入装置が受容されるレセプタクルを有する真空カップの別の実施形態の断面斜視図であり、真空カップは、電極に画定された対応する複数の開口を通して真空チャンバと流体連通する複数のポートを含むマニホールドを画定するカップ筐体を有する。
【図10C】本開示の別の実施形態による、対応するポート及び開口の代替の構成の斜視部分断面図である。
【図11B-11C】メチレンブルーの注入後のモルモット脂肪組織における流体分布の並べられた比較を示し、図１１Ｂにおける注入は、図９Ａに示されるものと同様の針なし真空カップを用いて行われたものであり、図１１Ｃにおける注入は、皮下針法で行われたものである。
【図12】ｐＧＸ２０１３（インフルエンザウイルス核タンパク質（ＮＰ）に対するＤＮＡワクチン）による脂肪組織における電気穿孔処置後のモルモットにおける１２週間の体液性免疫原性ＥＬＩＳＡデータを示すグラフであり、特に、図２Ａに示される真空カップを用いた電気穿孔処置後と、キャリパー電極電気穿孔装置を用いた電気穿孔処置後との、比較体液性免疫応答を示す。
【図13】ｐＧＸ２３０３（ヒト呼吸器合胞体ウイルス融合グリコール－タンパク質（ＲＳＶ－Ｆ）に対するＤＮＡワクチン）の処置後のモルモットにおける８週間の体液性免疫原性ＥＬＩＳＡデータを示すグラフであり、特に、図２Ａに示される真空カップを用いた脂肪組織の電気穿孔処置後と、先行技術の針アレイ電気穿孔装置を用いた皮膚中の電気穿孔処置後との、比較体液性免疫応答を示す。
【図14A】ｐＧＸ２０１３（インフルエンザウイルス核タンパク質（ＮＰ）に対するＤＮＡワクチン）の処置後のモルモットにおける６週間の体液性免疫原性ＥＬＩＳＡデータを示すグラフであり、特に以下を伴う処置後の比較体液性免疫応答を示す。（１）先行技術の針アレイ電気穿孔装置を使用した皮内組織の電気穿孔、（２）電気穿孔後真空圧を加える、図９Ａに示される針なし真空カップを用いた脂肪組織の電気穿孔、（３）電気穿孔後真空圧を加えるが、電気穿孔は行わない、図２Ａに示される針注入真空カップを用いた脂肪組織への注入、（４）及び電気穿孔後真空圧を加える、図２Ａに示される針注入真空カップを用いた脂肪組織の電気穿孔。
【図15A】本開示の一実施形態による、皮内組織の真空支援電気穿孔のために構成された真空カップの斜視図である。
【図16A-16B】本開示の実施形態による、真空チャンバのそれぞれの遠位開口に対向するそれぞれの真空チャンバ内の端面上に電極が配設されている、真空電気穿孔アセンブリの断面側面図である。
【図18A】複数の遠位真空チャンバを有する真空電気穿孔装置の斜視図である。
【図19A】本開示の一実施形態による中に真空ポートを有する電極の遠位アレイを有する真空電気穿孔装置の断面側面図である。
【図22】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子をエンコードする様々な体積のプラスミドを皮内注入し、次いで様々な技術及び装置を用いて処置した後の、モルモットの皮膚における遺伝子発現を示す図である。
【図23】ＨＰＶ ＤＮＡワクチンの処置後のモルモットにおける８週間の体液性免疫原性ＥＬＩＳＡデータを示すグラフであり、特に、先行技術の針アレイ電気穿孔装置と、図２Ａに示される真空カップと、他の処置の３倍（３ｘ）投与量を有する図２Ａに示される真空カップと、を使用した皮膚におけるそれぞれの電気穿孔処置後の比較体液性免疫応答を示す。
【図24A】ＨＰＶ ＤＮＡワクチン（ｐＧＸ３００１＆３００２）の処置後の非ヒト霊長類モデルにおける１１週間の体液性免疫原性ＥＬＩＳＡデータを示すグラフであり、特に、先行技術の針アレイ電気穿孔装置と、図２Ａに示される真空カップと、他の処置の３倍（３ｘ）投与量を有する図２Ａに示される真空カップと、を使用した皮膚におけるそれぞれの電気穿孔処置後の比較体液性免疫応答を示す。
【図25】先行技術のマントゥー注入から生じた一対のブレブの斜視図を示す断層画像であり、左に示されるブレブはヒアルロニダーゼ製剤と予め混合された薬剤を含み、右に示されるブレブはヒアルロニダーゼ製剤なしで注入されたものである。
【図27】ＭＥＲＳに対するＤＮＡワクチン（ｐＧＸ９１０１）を用いた皮内処置後のモルモットのエンドポイント力価の観点からの４週間の体液性免疫応答データを示すプロットであり、特に、ヒアルロニダーゼ製剤あり及びなしの先行技術の針アレイ電気穿孔装置と、１５ｍｍチャンバ直径を有する、ヒアルロニダーゼ製剤あり及びなしの両方の、図２Ａに示される真空カップのバージョンと、を使用した皮膚におけるそれぞれの電気穿孔処置後の比較体液性免疫応答を示す。
【図28】ＭＥＲＳ ＤＮＡワクチン（ｐＧＸ９１０１）を用いた皮内処置後のエンドポイント力価の観点からのモルモットにおける６週間の体液性免疫原性データを示すグラフであり、特に、先行技術の針アレイ電気穿孔装置と、１５ｍｍ及び１０ｍｍのチャンバ直径を有する図２Ａに示される真空カップのバージョンと、を使用した皮膚におけるそれぞれの電気穿孔処置後の比較体液性免疫応答を示す。
【図29A】インフルエンザ核タンパク質に対するＤＮＡワクチン（ｐＧＸ２０１３）の皮内注入後のモルモットにおける平均エンドポイント力価の観点からの６週間の体液性免疫原性データを示すグラフであり、特に、先行技術の針アレイ電気穿孔装置と、１５ｍｍのチャンバ直径を有する図２Ａに示される真空カップのバージョンと、を使用した皮膚におけるそれぞれの電気穿孔処置後の比較体液性免疫応答を示す。
【図30A】脂肪組織を電気穿孔するために本開示の円形開口真空カップとともに使用するための、中心軸のまわりに９０度の間隔で置かれた４つの電極を有する円形電極アレイの斜視図を示す。
【図30B-30F】様々な電極サイズに従って脂肪組織に生成される様々な模擬電場強度を示す。
【図31B-31F】様々な電極サイズに従って皮膚組織に生成される様々な模擬電場強度を示す。
【図32A】脂肪組織を電気穿孔するために本開示の長方形開口真空カップとともに使用するための、中心軸のまわりに９０度の間隔で置かれた４つの平面電極を有する長方形電極アレイの斜視図を示す。
【図32B-32F】様々な電極サイズに従って脂肪組織に生成される様々な模擬電場強度を示す。
【図33B-33F】様々な電極サイズに従って皮膚組織中に生成される様々な模擬電場強度を示す。
【図34A-34B】真空支援処置後のモルモット脂肪組織における細胞浸潤（青色）の並べられた比較を示し、図３４Ａにおける処置は、図２Ａに示されるものと同様の真空カップを用いた真空のみの処置（すなわち電気穿孔なし）であり、図３５Ｂにおける処置は、真空カップを使用した真空支援電気穿孔処置（すなわち真空圧＋電気穿孔）であった。
【図35A】ＭＥＲＳに対するＤＮＡワクチンを用いた処置後のモルモットにおける６週間の体液性免疫原性データを示すグラフであり、特に、図２Ａに示されるものと同様の真空カップを使用し、様々なチャンバ直径及び同じ電気穿孔パラメータを有する、皮膚におけるそれぞれの電気穿孔処置後の比較体液性免疫応答を示す。
【図36A】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子をエンコードするプラスミドの皮内注入、次いで真空カップを使用して様々な真空圧及び電気穿孔電圧で処置した後の、モルモット皮膚における遺伝子発現を示す図である。
【図37A】ＭＥＲＳに対するＤＮＡワクチンを用いた処置後のモルモットにおける６週間の体液性免疫原性ＥＬＩＳＡデータを示すグラフであり、特に、（１）先行技術の針アレイ電気穿孔装置及び（２）図２Ａに示されるものと同様の真空カップ、を使用した皮膚におけるそれぞれの電気穿孔処置後の比較体液性免疫応答を示す。
【図38】再発性呼吸器乳頭腫症（ＲＲＰ）に対するワクチンを用いた処置後の６週目におけるスポット形成単位の観点からの細胞免疫応答を示すチャートであり、特に、（１）先行技術の針アレイ電気穿孔装置及び（２）図２Ａに示されるものと同様の真空カップ、を使用した皮膚におけるそれぞれの電気穿孔処置後の比較応答を示す。
【図39A】ＭＥＲＳに対するＤＮＡワクチンを用いた処置後のモルモットにおける４週間の体液性免疫原性データを示すグラフであり、特に、マントゥー注入のみと、真空圧に続くマントゥー注入と、真空圧に続くマントゥー注入及び図２Ａに示されるものと同様の真空カップを使用した電気穿孔と、を使用した皮膚における処置後の体液性免疫応答を比較する。
【図40B】図１５Ａに示される真空カップと同様に構成された真空カップに引き込まれた組織のマウンドにおいて生成されたときの、一対の環状リング電極及び中央の同心電極を有する電極アレイによって生じる模擬電場の断面側面図である。
【図41A】ＭＥＲＳに対するＤＮＡワクチンを用いた処置後のモルモットにおける８週間の体液性免疫原性データを示すグラフであり、特に、図４０Ａ～４０Ｂに示される電極アレイを使用した電極パルスパターンに基づく、皮膚における真空支援電気穿孔処置後の体液性免疫応答を比較する。
【図42A】マントゥー注入後の、（１）真空圧を加えないものと、（２）図４０Ａに示される電極アレイを有する真空カップを使用して真空圧を加えたものと、（３）図４０Ｂに示される電極アレイを有する真空カップを使用して真空圧を加えたものと、の比較注入物流体分散を示すグラフである。
【図43A-43B】図４０Ｂに示される電極アレイを有する真空カップの下に位置付けられたモルモット皮膚に配設された注入物を示す蛍光透視画像であり、図４３Ａは、チャンバ内に真空圧を加える前の注入物を示し、図４３Ｂは、チャンバ内に真空圧を加えている間の注入物を示す。
【図43C】以下の分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現を比較することを示すグラフである。（１）図４３Ａ～Ｂに示される真空カップを使用する単一の高注入量の真空支援電気穿孔処置及び（２）先行技術の針アレイ電気穿孔装置を使用する６回の注入、６回の電気穿孔イベント処置。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本開示は、本開示の一部を形成する添付の図及び例に関連して示される以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解され得る。本開示は、本明細書で説明される及び／又は示される特定の装置、方法、アプリケーション、条件又はパラメータに限定されるものではないこと、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を例として説明する目的のためのものであり、本開示の範囲を限定することを意図されたものではないことは、理解されるべきである。また、添付の請求項を含む本明細書で使用される、単数形「ａ）、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数形を含み、特定の数値への言及は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、少なくともその特定の値を含む。
【0013】
本明細書で使用される用語「複数」は、１つよりも多いことを意味する。値の範囲が表現される場合、別の実施形態は、ある特定の値から及び／又はその他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」の使用により、値が近似値として表現される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。全ての範囲は、包括的であり、組み合わせ可能である。
【0014】
寸法、角度及びその他の幾何学的形状に関して本明細書で使用される用語「約」及び「実質的に」は、製造公差を考慮に入れている。更に、用語「約」及び「実質的に」は、記載された寸法又は角度より１０％大きい又は小さいものを含み得る。更に、用語「約」及び「実質的に」は、記載された特定の値に等しく適用することができる。
【0015】
本明細書で使用される用語「薬剤」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、低分子、又はそれらの任意の組み合わせを意味する。薬剤は、抗体、そのフラグメント、その変異型、又はそれらの組み合わせをエンコードする組換え核酸シーケンスであってもよい。薬剤は、非限定的な例として、水又は生理食塩水－クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）若しくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝液中に配合されてもよい。
【0016】
本明細書で使用される用語「皮内」は、表皮（すなわち角質層から基底層までの表皮層）及び真皮（すなわち真皮層）を含む皮膚の層内を意味する。
【0017】
本明細書で使用される用語「脂肪」は、皮下層に存在する含脂肪細胞（すなわち脂肪細胞）を含む層を意味する。
【0018】
本明細書で使用される用語「電気穿孔」は、組織内の細胞の細胞膜の透過性及び／又は多孔性を一時的かつ可逆的に増大させ、それにより、例えば、薬剤が細胞内に導入されることを可能にする、組織内の電場を利用することを意味する。
【0019】
本明細書で使用される用語「電気穿孔場」は、細胞を電気穿孔することが可能な電場を意味する。電場が、細胞を電気穿孔することが可能な部分と、細胞を電気穿孔することが可能ではない別の部分とを含む例においては、「電気穿孔場」は特に、細胞を電気穿孔することが可能な電場の部分を指す。したがって、電気穿孔場は、電場のサブセットであり得る。
【0020】
本明細書で使用される用語「ゾーン」は、組織内のある体積の空間のような、ある体積の空間を意味する。
【0021】
本明細書で使用される用語「トランスフェクションゾーン」は、トランスフェクションが生じるある体積の組織を意味し、用語「トランスフェクション体積」と同義に使用され得る。
【0022】
本明細書で使用される用語「細胞浸潤」は、ある体積の組織への細胞の移行を意味する。
【0023】
本明細書で使用される用語「皮内針電極電気穿孔装置」及び「ＩＤ針電極ＥＰ」は各々、皮内組織を電気穿孔するために三角形のパターンに配置された３つの針電極の電極アレイを利用する、先行技術の電気穿孔装置を指す。
【0024】
以下に説明される実施形態は、特に皮内組織又は脂肪組織のような組織の標的層といった組織の真空支援電気穿孔を行うシステム及び装置に関する。これらの実施形態は、組織の標的体積（又は「組織体積」）を真空圧（すなわち負圧）にさらして、組織を、組織層内の標的ゾーン内の細胞を電気穿孔するのに好適な態様で変形させる。特に、真空カップのような真空装置の開放端が、組織体積を覆う組織（例えば「皮膚」）の外面に接触して置かれ、真空圧がカップの内部に加えられ、それにより組織体積を真空カップ内に引き込み、それにより組織体積がカップに位置的に固定されて、真空カップ内に位置付けられた電極が組織体積内に予測可能で実質的に均一な電気穿孔場を生成することを可能にし、それにより組織体積内に予測可能で実質的に均一なトランスフェクションゾーンをもたらす。以下に説明される実施形態によって提供される真空圧はまた、組織体積内の注入物の好適なインビボの分散を含む、組織体積内の流体の好適な再分配、並びに標的ゾーン内への及び標的ゾーンからの流体の好適なインビボの出入りをもたらすことが観察されている。換言すれば、真空圧は、組織全体の注入物の分散を向上させて、トランスフェクションゾーンを拡大し、また、より多くのインビボ流体を標的ゾーンに引き込み、トランスフェクションされた細胞にさらされる細胞の量を増大させる。本発明者らは、本開示を通して説明される真空支援電気穿孔処置が、注入物に対する対象の増大した反応に帰着することを観察した。
【0025】
本発明者らはまた、驚くべきことに、また予想外にも、真空圧を加えることが、電気穿孔を行わなくても、組織体積内にトランスフェクションを引き起こし得ることを観察した。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、真空カップによって付与される真空圧が、組織体積内の細胞膜に機械的応力を付与し、細胞膜透過性を増大させて、かくして組織体積内で観察されるトランスフェクションを増大させると考えている。本発明者らはまた、前述の流体の再分配も、電気穿孔なしで観察されるトランスフェクションに少なくとも部分的に関与し得ると考えている。本発明者らは更に、前述の流体の再分配及び機械的応力が互いに相互作用して、細胞への外部の薬剤のトランスフェクションに好適な環境を組織体積内に生成する可能性が高いと考えている。
【0026】
更に、以下に説明される実施形態は、機械的な再構成なしで、使用と使用との間及び／又は使用の間に適合させることができる。例えば、使用の間及び／又は使用と使用との間に、電極の電気的パラメータは、好適な処置結果を達成するよう、組織体積中の電気穿孔場を操作するために、必要に応じて調節することができる。これに加えて又は代替として、真空圧は、好適な処置結果を達成するよう、組織体積を物理的に操作するために、使用の間及び／又は使用と使用との間に、必要に応じて調節することができる。例えば、より大きな組織体積を真空カップ内に引き込むために、より高い真空圧が加えることができ、より小さな組織体積を真空カップ内に引き込むために、より低い真空圧を加えることができる。このようにして、異なる組織層を電気穿孔場に選択的にさらすことにより、電気穿孔処置のための異なる組織層を標的にするために、同じ真空カップを利用することができる。これに加えて、組織内の流体再分配を向上させるためなど、標的組織の機械的挙動を操作するために、真空圧が使用の間にパルス状にされ得る。
【0027】
ここで図１を参照すると、本開示による患者を処置するための電気穿孔システム１００は、真空支援電気穿孔装置２を含み、該装置は、内部真空チャンバ６を画定する筐体４と、チャンバ６内に位置付けられた複数の電極８（例えば、図２Ａ～２Ｃを参照）とを含む。複数の電極８は、電極８のアレイ９に配置され、これは電極アレイ９とも称され得る。装置２は、「真空カップ」又は単に「カップ」とも称され得る。筐体４は、「カップ筐体」とも称され得る。真空カップ２は、医師が、真空カップ２の遠位端１０を、電気穿孔処置の標的とされる組織１０２の外面１０１上に置き、真空チャンバ６に真空圧を加えて、組織１０２を真空チャンバ６内に引き込む、引っ張る又はその他の方法で誘導して、その中の電極８と接触させることができるように構成される。電極８は、真空圧によってチャンバ６内に引き込まれ、その中に保持された組織１０２に、１つ以上の電気穿孔パルスを送達するように構成される。組織１０２は、脂肪組織１０３（本明細書では「脂肪層」１０３とも称される）又は皮内組織１０４（本明細書では「皮膚層」１０４とも称される）のような、処置の標的とされる層を含む。
【0028】
真空カップ２は、１つ以上の外部構成要素への接続のための、ポートのような１つ以上の結合部を含む。例えば、真空カップ２は、真空チャンバ６と真空ポンプのような真空源１０６との間の流体連通を提供するための、第１のポート１２を有する。真空カップ２はまた、電極８と発電機のようなエネルギー源１１０との間の電気的な連通を提供する回路１０８へのアクセスを提供するための、第２のポート１４を有することができる。真空カップ２は、特に薬剤を含む注入物のような注入物を担持する注入装置１８のような外部ツールに、真空チャンバ６へのアクセスを提供するための、第３のポート１６を更に含むことができる。図示されるように、注入装置１８は皮下注入針であり得るが、真空カップ２は、以下でより詳細に説明されるように、ジェット注入装置を含む他のタイプの注入装置１８とともに使用するように適合することができる。また、真空カップ２は任意選択的に、薬剤が組織１０２に注入された後に利用され得ることは、理解されるべきである。
【0029】
エネルギー源１１０は、真空チャンバ６内の組織１０２内の細胞を電気穿孔するために、特定の電気的パラメータを有する１つ以上の電気パルスの形態の電気信号を生成して、電極８に送信するための、波形生成器のような信号生成器１１２と電気的に連通することができる。かかる電気的パラメータは、電位（電圧）、電流タイプ（交流（ＡＣ）又は直流（ＤＣ））、電流の大きさ（アンペア数）、パルス継続時間、パルス量（すなわち送達されるパルスの数）、及びパルス間の時間間隔又は「遅延」（複数パルス送達の場合）を含む。信号生成器１１２は、送達されたパルスの電気的パラメータを記録するための波形ロガーを含むことができる。信号生成器１１２は、信号生成器１１２の動作を含む電気穿孔システム１００の動作を制御するように構成されたプロセッサ１１６を含むことができる、制御ユニット１１４（本明細書では「コントローラ」とも称される）と電気的に連通することができる。プロセッサ１１６は、コンピュータメモリ１１８と電子的に連通することができ、システム１００の動作を制御するための１つ以上のアルゴリズムを含むソフトウェア及び／又はファームウェアを実行するように構成することができる。プロセッサ１１６は、ユーザインタフェース１２０と電気的に連通することができ、該ユーザインタフェースは、システム１００の動作に関連する情報を提示するためのディスプレイ１２２と、医師のような操作者がシステム１００の動作に関連するコマンドのような情報を入力することを可能にするキーパッド１２４とを含むことができる。ディスプレイ１２２は、操作者がディスプレイ１２２において直接情報を入力することを可能にする、タッチスクリーンディスプレイであり得ることは、理解されるべきである。また、インタフェース１２０は、テーブルトップコンピュータ若しくはラップトップコンピュータのようなコンピュータインタフェース、又はスマートフォンのようなハンドヘルド電子装置などであり得ることは、理解されるべきである。
【0030】
ここで図２Ａ～２Ｂを参照すると、真空カップ２の遠位端１０は、真空チャンバ６に通じる少なくとも１つの開口２０を画定している。開口２０は、図示されるように円形であり得るが、以下でより詳細に説明されるように、他の開口形状も本開示の範囲内である。真空カップ２の遠位端１０（したがって開口２０も）は、筐体の遠位端１０からチャンバ６の近位端２４まで延在する内面２２を画定し得る、筐体４によって画定され得る。したがって、チャンバ６もまた、遠位端１０から近位端２４まで延在する。内面２２は、真空チャンバ６の境界を少なくとも部分的に画定する。内面２２は、好ましくは、ベル型又は「ベル曲線」の幾何学的形状を有する。遠位端１０からチャンバ６内に至る内面２２の遠位部分２２ａは、真空カップ２の使用の間の、遠位端１０の周縁における組織への打撲のような損傷を低減又はその他の方法で緩和するための、先細の曲がった輪郭を有し得る。遠位部分２２ａは、内面２２の「リードイン」部分２２ａと称され得る。真空チャンバ６の近位端２４におけるような内面２２の近位部分は、真空チャンバ６の「近位端面」又は単に「端面」と称され得る。
【0031】
電極８の少なくとも１つ及び最大で全ては、内面２２と並んで延在する。図示されるように、電極８は、筐体４の中心軸Ｘに沿って配向された長手方向Ｌに関して、遠位端１０と近位端２４との間で内面２２と並んで延在し得る。本実施形態の電極８は、好ましくは実質的に剛性であるが、他の実施形態においては、電極８は、多少の可撓性を有し得る。電極８は、プラスチック又はその他の好適な非導電性材料で構築され得る、関連する実質的に剛性の非導電性支持体に結合された（例えば、コーティング、堆積、結合及び／又は接着を介して）、導電性材料の薄層を含み得る。電極８は、内面２２と実質的に共形の表面形状を有し得る。電極８は、長手方向Ｌに沿った方向成分を有する方向に沿って長細のものであり得る。電極８はまた、中心軸Ｘのまわりの円周方向Ｃに沿って内面２２と並んで延在し得る。図２Ｂ～２Ｃに示されるように、電極８は各々、円周方向Ｃに沿って測定される円周方向寸法Ｃ１（又は「幅」Ｃ１）を画定し得る。電極８は、中心軸Ｘのまわりに一定の角度間隔Ａ１で位置付けられ得る。角度間隔Ａ１は、電極８のそれぞれの中心軸８ｘから測定され得る。図２Ｂに示されるように、電極８は、例えば、中心軸Ｘのまわりに９０度の角度間隔Ａ１で位置付けられ得る。したがって、電極８は、中心軸Ｘのまわりに対称的な間隔で置かれていると言える。以下でより詳細に説明されるように、電極８間の他の角度間隔Ａ１も本開示の範囲内にあることは、理解されるべきである。更に、いくつかの実施形態においては、電極８間の角度間隔Ａ１は、内面２２に沿って変化し得る。すなわち、電極８は、中心軸Ｘのまわりに不規則な間隔で置かれ得る。更に、電極８は、中心軸Ｘのまわりに対称的な間隔で置かれる必要はない。
【0032】
図２Ｃに示されるように、各電極８は、中心電極軸８ｘに沿って互いから離隔された電極８の第１の端８ａから第２の端８ｂまで測定される電極長Ｌ１を画定し得る。電極８はまた、円周方向Ｃに沿って電極幅Ｃ１を画定するように互いから離隔された第１及び第２の側面８ｃ、８ｄを有し得る。各電極８は、１つ以上の電気穿孔パルスを送達するために組織表面１０１に接触するように構成された、内部電極面８ｚを有し得る。内部電極面８ｚは、電極８の第１の端８ａから第２の端８ｂまで、及び第１の側面８ｃから第２の側面８ｄまで延在し得る。各電極８は、電極８の第２の電極端８ｂから第１の電極端８ａに向かって延在し、また第１の側面８ａから第２の側面８ｂに向かって延在する、一次又は「接触」部分８ｅを画定し得る。図示されるように、電極幅Ｃ１は、第１及び第２の電極側面８ａ、８ｂの間で測定され得、接触部分８ｅに沿って均一である必要はない。電極長Ｌ１及び幅Ｃ１は各々、約１．０ｍｍ～約３０ｍｍの範囲内、より詳細には約２ｍｍ～約２５ｍｍの範囲内、より詳細には約４ｍｍ～約２０ｍｍの範囲内にあり得る。電極８は、約０．０００５ｍｍ～約２．０００ｍｍの範囲内の厚さＴ１（図２Ｆ参照）を画定し得る。電極長Ｌ１は、電極幅Ｃ１よりも大きいか、小さいか、又は同等であり得ることは、理解されるべきである。
【0033】
接触部分８ｅ内の内部電極面８ｚの部分は、電極の「接触面」８ｚと称され得る。接触面８ｚは、中心軸Ｘに直交する基準面において、筐体４の内面２２と円弧状にかつ同心に延在し得る（すなわち同じ中心点を共有し得る）。接触面８ｚはまた、中心電極軸８ｘに沿った方向において内面２２と実質的に共形の、曲線状の輪郭を有し得る。接触面８ｚは、図示されるように滑らかである場合があるが、他の実施形態においては、接触面８ｚは、非限定的な例として、突出部、ディンプル、刻み目、マイクロ針及び／又は粗面などを有するように、組織１０２に対するグリップを向上させるためにテクスチャ加工される場合がある。追加的な実施形態においては、電極８と組織１０２との間のグリップ及び／又は導電性を改善するために、コーティング又は接着剤が接触面８ｚに適用され得る。電極８はまた、接触部分８ｅから第１の端８ａまで延在する二次部分８ｆを画定し得、電極８に電気穿孔パルスを伝達するための回路１０８のそれぞれのリード線と接続するように構成され得る。
【0034】
ここで図２Ｄを参照すると、筐体４は、筐体本体２６を含み得、該筐体本体は、非限定的な例として、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリフタルアミド（ＰＰＡ）、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリアミド、ポリイミド、ポリシロキサン（シリコーン）、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、架橋又は非架橋のゴム（エラストマー）、ポリエステルを含む高分子材料のような、好ましくは多少の可撓性を有する材料から形成され得る。他の生物適合性及び／又は医療用材料が、筐体本体２６に利用され得ることは、理解されるべきである。筐体本体２６は、任意選択的に筐体４を画定するモノリシック構造である場合もあるが、筐体本体２６がモノリシック構造である必要はなく、その代わりに、筐体４を画定するように一緒に結合された２つ以上の本体構成要素を含む場合がある。筐体本体２６は、長手方向Ｌに沿って近位端２８から遠位端１０まで延在する。筐体本体２６はまた、筐体４の内面２２から外面３２まで延在する壁３０を画定する。壁３０は、真空チャンバ６の全周のまわりを円周方向に延在する。
【0035】
筐体本体２６は、ポート１２、１４、１６を画定している。図示されるように、第１、第２及び第３のポート１２、１４、１６の各々は、筐体本体２６の近位端２８に隣接し、遠位端１０からは離れている場合がある。換言すれば、ポート１２、１４、１６は、筐体４の遠位端１０よりも近位端２８の近くに位置し得る。「真空ポート」とも称され得る第１のポート１２は、真空チャンバ６から、筐体本体２６を通り、真空ポート１２を真空源１０６と相互接続する取り付け部材３６との接続のためのポート結合部３４まで延在する。ポート結合部３４は、座部３８と、座部３８から外側に延在し、座部３８がレセプタクルの内端を画定するようにレセプタクルを画定する、管状延長部４０とを含み得る。取り付け部材３６は、取り付け部材結合部４２と、そこから延在する挿管ステム４４とを含み得る。取り付け部材結合部４２は、管状延長部４０によって画定されたレセプタクル内に嵌合する態様で延在することなどによって、ポート結合部３４の管状延長部４０と相互接続する管状延長部であり得る。一方向弁部材４６が、座部３８（「弁座部」と称され得る）上に位置付けられ得る。弁部材４６は、弁座部３８から、取り付け部材結合部４２の内部空間内に延在し、それにより、真空ポート１２と取り付け部材３６の挿管ステム４４との間の流体経路に介在し得る。弁部材４６は、図示されるようにダックビル弁であり得、他の実施形態においては、非限定的な例として、弁４６は、ボール弁又はアンブレラ弁であり得る。
【0036】
第２のポート１４は、第１のポート１２の反対側に延在し得、筐体４を通って真空チャンバ６内の電極８と接触する、ワイヤのような回路１０８のための通路を可能にするように構成され得る。第２のポート１４はまた、１つ以上のツール及び／又は１つ以上のセンサのような１つ以上の追加的な構成要素のための、筐体４を通って真空チャンバ６内への通路を可能にするように構成され得る。真空チャンバ６内に位置付けられている間、かかるツール及び／又はセンサは、チャンバ６に供給される真空圧を介して、組織に対して位置的に固定され得る。第３のポート１６は、チャンバ６の近位端２４から、中心軸Ｘに沿って延在し得る。筐体４は、第３のポート１６の外側端に装着形成部４８を画定し得る。装着形成部４８は、穿刺ストッパのようなキャップ５０を第３のポート１６上に装着するように構成され得る。装着形成部４８及び穿刺ストッパ５０は、穿刺ストッパ５０と第３のポート１６との間に気密封止を提供する、相補的な嵌合形状を有し得る。穿刺ストッパ５０は、皮下注入針１８によって突き刺すことができ、針１８が真空チャンバ６内に引き込まれた組織１０２に薬剤を注入することを可能にする材料で、形成され得る。
【0037】
図２Ｄを引き続き参照すると、電極アレイ９は、チャンバ６内に位置し、筐体４の内面２２に沿って延在する、スリーブのような挿入物５２上に配設され得る。スリーブ５２、又は少なくともその外面５３は、筐体４の内面２２と実質的に同じプロファイル形状を有し得る。スリーブ５２は、非限定的な例として、ゴム、シリコーン及び熱可塑性エラストマーのような可撓性材料で構築され得る。図２Ｅに示されるように、スリーブ５２の外面５３は、摩擦嵌合を介して筐体４の内面２２に直接付着し得るが、スリーブ５２を内面２２に取り付けるために１つ以上の接着剤が任意選択的に利用され得る。スリーブ５２は、真空チャンバ６の近位端２４に隣接する第１の又は近位端５４から、筐体４の遠位端１０に隣接する第２の又は遠位端５６まで延在し得る。スリーブ５２の遠位端５６は、筐体４の内面２２のリードイン部分２２ａ内に延在し得る。第１の端５４は、中心軸Ｘと同心であり得るスリーブ５２の近位開口５２ａ、及びスリーブ５２の遠位開口５２ｂを画定し得る。図２Ｆにより明確に示されるように、スリーブ５２の第１の端５４は、第１のポート１２を部分的に閉塞し得、また、真空チャンバ６内への回路２０６のための通路を可能にしながら、第３のポート１６も部分的に閉塞し得る。したがって、スリーブ５２は、チャンバ６内の真空圧を制御するか又は少なくとも影響を与えるための機構として利用され得る。
【0038】
真空チャンバ６は、チャンバ６の近位端２４から長手方向Ｌに沿って開口１０まで画定され、長手方向Ｌに実質的に垂直な方向に沿うなどして、筐体本体２６の内面２２によって少なくとも部分的に画定され得るチャンバ体積Ｖを画定する。図示された例においては、長手方向Ｌに垂直な方向は、中心軸Ｘと交差する径方向Ｒである。チャンバ体積Ｖはまた、径方向Ｒに沿うなどして、スリーブ５２によって少なくとも部分的に画定され得る。チャンバ６は、筐体４の遠位端１０を囲む基準平面に対して、チャンバ６の近位端２４から測定される深さＬ２を有し得る。チャンバ深さＬ２は、約１．０ｍｍ～約５０．０ｍｍの範囲内、より詳細には約３ｍｍ～約２０ｍｍの範囲内、より詳細には約５ｍｍ～約１７ｍｍの範囲内であり得る。チャンバ６はまた、スリーブ５２の遠位端５６において径方向Ｒに沿って測定され得るベース直径Ｄ１のようなベース幅を有する。チャンバ直径Ｄ１は、約１．０ｍｍ～約５０．０ｍｍの範囲内、詳細には約３．０ｍｍ～約２０．０ｍｍの範囲内、より詳細には約６．０ｍｍ～約１７．０ｍｍの範囲内であり得る。本実施形態においては、チャンバ直径Ｄ１は、その遠位端５６におけるスリーブ５２の内面５５の対向する部分間で測定され得る。他の実施形態においては、スリーブ５２は省略することができ、電極８は、例えば、筐体壁３０内に埋め込まれるか又は少なくとも部分的に埋め込まれることによって、筐体４の内面２２に直接取り付けられ得る。かかる実施形態においては、真空チャンバ６、したがってチャンバ体積Ｖは、筐体４の内面２２及び電極８の内面８ｚによって少なくとも部分的に画定され得る。したがって、かかる実施形態においては、チャンバ直径Ｄ１は、電極８の遠位端８ｂにおける筐体４の内面２２の対向する部分間で測定され得る。
【0039】
ここで図３Ａ～３Ｂを参照すると、スリーブ５２は、電極８、したがって電極アレイ９の各々を担持し得る。したがって、スリーブ５２は、電極アレイベース、支持体、又は基板とも称され得る。図示された実施形態においては、電極アレイ９は、第１から第４の電極８－１、８－２、８－３、８－４がスリーブ５２の中心軸Ｘ２（スリーブ５２がそこに挿入されたときにカップ筐体４の中心軸Ｘと実質的に同延となる）のまわりに９０度間隔Ａ１で位置付けられるように、第１の電極８－１、第２の電極８－２、第３の電極８－３及び第４の電極８－４を含む電極パターンを画定している。本実施形態の電極アレイ９は、４つの電極８である、電極の総数８ｎを有するものとして特徴付けられ得る。電極の総数８ｎは、本明細書では、「総数」８ｎ又は単に「全体」８ｎとも称され得る。スリーブ５２はまた、真空チャンバ６に引き込まれた組織１０２内に異なる特性を有する電場を生成するためのような、異なる電極アレイ９パターン及び構成を有する他のスリーブ５２と交換可能であり得る。例えば、図３Ｃ～３Ｄに示されるように、スリーブ５２は、上述のように、スリーブ５２の中心軸Ｘ２のまわりに９０度間隔で離隔された４つの電極８を含む電極アレイ９を有し得るが、電極８は各々、上で説明された実施形態における電極８よりも狭い円周方向寸法Ｃ１、したがってより少ない累積表面積も有し得る。図３Ｅ～３Ｆに示されるように、スリーブ５２は、中心軸Ｘ２のまわりに６０度の間隔で離隔された６つの電極８を含む電極アレイ９を有し得る。図３Ｇ～３Ｈに示されるように、電極アレイ９は、中心軸Ｘ２のまわりに３６度の間隔で離隔された１０個の電極８を含み得る。
【0040】
図３Ｉ～３Ｊに示されるように、電極アレイ９は、長手方向Ｌに沿って互いに離隔されて、各々がスリーブ５２の全周のまわりに延在する、７つの電極８を含み得る。かかるアレイ９の設計は、電極８が、真空カップ２によって把持された組織体積を通して、結果として生じる電気穿孔場を「上方」に及び／又は「下方」に駆動するシーケンスで、パルス化又は「発射」されることを可能にし得る。
【0041】
図３Ｋ～３Ｌに示されるように、電極アレイ９は、円周方向に長細い電極８の４つのサブセット９ａ～ｄを含む、複数の円周方向に長細い電極８を含み得る。各サブセット９ａ～ｄ内の電極８は、互いに実質的に長手方向に整列させられ得、各サブセット９ａ～ｄは、電極８の各隣接するサブセット９ａ～ｄから円周方向に離隔され得る。本例においては、電極８の各サブセット９ａ～ｄは、５つの長手方向に離隔された電極８を含み得る。したがって、スリーブ５２は、合計２０個の円周方向に長細い電極８を含み得る。本実施形態においては、各サブセット９ａ～ｄ内の電極８は、中心軸Ｘ２のまわりに約１度～約９０度の範囲の角度スパンＡ２を有し、隣接するサブセット８ａ～ｄの間の約１度～約９０度の範囲の電極間スパンＡ３を有し得る。サブセット９ａ～ｄを互いに円周方向に離隔することは、数ある中でも、サブセット９ａ～ｄが互いに独立して発射（又は電流源若しくは電圧源によって別様に駆動）させられることを可能にする。このことは、サブセット９ａ～ｄに隣接し、これらに関連する組織体積内の領域（この実施形態においては、かかる組織領域は、組織体積の「四分円」として特徴付けられ得る）の各々が、電気穿孔場の適用範囲を受け入れることを確実にすることを支援し得、このことは、より対称的な電気穿孔場に帰着し、組織体積内の組織の導電性の局所的差異が、組織体積内の領域のうちの１つ以上から離れる方向に電気穿孔場を付勢する事態を回避し得る。
【0042】
更に、図３Ｋ～３Ｌに示される円周方向に離隔されたサブセット９ａ～ｄは、後続のパルスにおいて複数の角度から細胞に電気パルスを当てる（すなわち細胞を異なる方向に沿った電気穿孔場の勾配にさらす）ためのような、組織体積内で固有の方向性の電気穿孔場を生成することも可能にし得、単一方向から細胞に電気パルスを当てるよりも効率良く細胞を電気透過させ得る。かかる多方向電気穿孔場は、図３Ａ～３Ｈの様々なアレイ設計によっても生成され得ることは、理解されるべきである。しかしながら、図３Ｋ～３Ｌの円周方向に離隔されたサブセット９ａ～ｄはまた、電極８が、組織体積を横切って横方向及び／又は円周方向に発射させるだけでなく、組織体積を通して「上向き」及び／又は「下向き」にも発射させることを可能にする。アレイ９内の電極８の量を増大させることによって、可能な固有のパルスパターンの量も増大させることができ、電気穿孔場が電極８の接触面８ｚに集中することを考慮して、より均質な電気穿孔場の適用範囲も可能にする。
【0043】
以上に説明された様々な電極アレイ９のパターンは、非限定的な例として提供されたものであり、他の電極アレイ９の構成も本開示の範囲内であることは、理解されるべきである。例えば、以上に説明された電極アレイ９のパラメータの１つ以上は、必要に応じて調整することができ、これらパラメータは、限定するものではないが、各アレイ９における電極８の量、電極長Ｌ１及び幅Ｃ１、並びに電極間の間隔を含む。これらのパラメータは、電場の３次元（３Ｄ）形状に（したがって電気穿孔場の３Ｄ形状にも）影響を与え得る。換言すれば、電極８のサイズ、形状及び配置は、増強された電気穿孔処置を提供する態様で、組織１０２内の電場の分布を集中させるために、必要に応じて調整され得る。
【0044】
図４Ａ～４Ｆを参照すると、脂肪組織１０３に電気穿孔処置を提供するために真空カップ２を使用する例示的な方法が、ここで説明される。
【0045】
図４Ａに示されるように、医師は、真空カップ２の遠位端１０を、脂肪組織１０３の標的ゾーン１０５を覆う位置に置いて、患者の皮膚１０４の外面１０１上に配置し得る。標的ゾーン１０５は、予め選択され得るか、又は真空カップ２の配置の結果であり得る。好ましくは、医師は、遠位端１０の全周を皮膚１０４と接触させて置く。
【0046】
図４Ｂに示されるように、医師は、特に真空源を作動させて、組織１０２の体積又は「マウンド」１４０をチャンバ６内に引き込んで、電極８の接触面８ｚと接触させるのに十分な、真空チャンバ６内における約－０．１ｐｓｉ～約－１４．７ｐｓｉの範囲内、より好ましくは約－３ｐｓｉ～約－１４．７ｐｓｉの範囲内で、真空圧を生成することにより、真空チャンバ６に真空圧のパルス（本明細書では「真空パルス」とも称される）を適用し得る。本開示を通して含まれる真空圧の大きさは、海面で測定される大気圧に対するかかる圧力を指すことは、理解されるべきである。組織のマウンド１４０（特にその皮膚層１０４）とカップ２の内面２２との間の接触圧は、約０．１ｐｓｉ～約２００ｐｓｉの範囲内であり得る。このようにして、真空カップ２は、標的ゾーン１０５の少なくとも一部を、カップ２によって画定される処置ゾーン１０７内に引き込む。本例においては、組織のマウンド１４０は、皮膚１０４及び脂肪組織１０３を含む。本開示の目的のため、処置ゾーン１０７は、電極８の間に延在する組織体積（組織のマウンド１４０のような）の部分として定義される。図示されるように、処置ゾーン１０７の底部境界１０７ａは、電極８の第２の端８ｂに沿って及びそれらの間に延在する、仮想的な経路によって定義され得る。そのため、組織のマウンド１４０が真空チャンバ６に引き込まれた後、本実施形態の処置ゾーン１０７は、処置ゾーン１０７に組織のマウント１４０の少なくとも一部と、注入部位１０９（図４Ｃ参照）の少なくとも一部とを含むことになる。図示された実施形態においては、処置の間に処置ゾーン１０７内に位置付けられる組織は、皮膚層１０４及び脂肪層１０３に限定される。他の実施形態においては、処置ゾーン１０７は、平滑筋層１１１を含み得る。好ましくは、処置ゾーン１０７は、その中にいかなる骨格筋を含まない。以上に説明されたように、真空圧は、好ましくは、真空カップ２に組織のマウンド１４０に対する頑丈なグリップを提供し、それにより、真空カップ２と組織のマウンド１４０との間の相対位置を保持するのに十分である。図示された実施形態は、組織のマウンド１４０の皮膚１０４が電極８の接触面８ｚに直接接触して置かれることを示しているが、電極８と皮膚１０４との間の電気的な連通を改善するために、導電ゲルのような追加的な物質が利用され得ることは、理解されるべきである。
【0047】
図４Ｃに示されるように、医師は、マウンド１４０の脂肪組織１０３に薬剤を注入し得る。注入を実行するために、医師は、皮下注入針１８を、穿刺ストッパ５０を通り、第３のポート１６に沿って、皮膚１０４を通り、チャンバ体積Ｖ内の脂肪組織１０３内へと貫通させることができる。医師は次いで、脂肪組織１０３内の注入部位に薬剤を注入し、続いて皮下注入針１８を真空カップ２から引き抜き得る。本発明者らは、驚くべきことに、また予想外にも、皮下注入針１８から脂肪組織１０３内に排出された注入物１４２が、脂肪組織１０３内にプールされたボーラス１４２ａに残るのではなく、真空圧に応答して皮膚１０４に向かって分散することを観察した。したがって、医師は、注入物１４２を処置ゾーン１０７の近傍若しくは底部において、又は処置ゾーン１０７のわずかに下で注入し、真空圧が注入物１４２を処置ゾーン１０７内へと上向きに効果的に引き込むことを可能にし、注入物１４２が処置ゾーン１０７内で集中させられることさえ可能にし得る。本発明者らはまた、試験の間の観察に基づいて、注入物１４２をインビボ流体、細胞外成分、及び細胞と混合するのを支援し、注入物１４２を処置ゾーン１０７内において、そこでの注入物１４２の潜時を高める態様で保持し、それによりトランスフェクションを増大させるために、真空圧が操作され得ると考えている。
【0048】
いくつかの実施形態において、針１８は、注入後に組織１０２に挿入されたままにすることができ、針１８の少なくとも一部は、以下でより詳細に説明されるように、電気穿孔の間又は後に、電気的パラメータのような組織１０２のパラメータを検出するためのセンサ１５２を含み得ることは、理解されるべきである。
【0049】
図４Ｄに示されるように、医師は、１つ以上の電気穿孔パルスを組織のマウンド１４０に送達し得る。特に、医師は、信号生成器１１２に、１つ以上の電気穿孔パルスの形態の電気穿孔信号を電極８へと送達させることができ、この電極が次いで、電極８と接触する組織１０２に１つ以上の電気穿孔パルスを送達し、それにより、図示の実施形態においては、処置ゾーン１０７における脂肪組織１０３内に電気穿孔場１４４を生成する。電気穿孔場１４４は実質的に、処置ゾーン１０７内の細胞（例えば脂肪細胞）の細胞膜に可逆的な部分を生じさせ、一時的に多孔化された細胞への注入物のトランスフェクションを引き起こす。このようにして、電気穿孔場１４４は、処置ゾーン１０７内にトランスフェクションゾーンを生成する。本実施形態の電極８によって生成される電気穿孔場１４４は、実質的に球状の形状を有する。電気穿孔場１４４は、パルス送達の間に電極８によって生成される電場１４５のサブ領域であることは、理解されるべきである。
【0050】
電極８によって送達される１つ以上の電気穿孔パルスは、約５Ｖ～約１０００Ｖ（１ｋＶ）の範囲内の電位（電圧）を有し得る。
【0051】
１つ以上の電気穿孔パルスは、約０．０１Ａｍｐ～約２．０Ａｍｐの範囲内の電流（アンペア数）を有し得る。
【0052】
１つ以上の電気穿孔パルスは各々、約１００マイクロ秒～約５００ミリ秒の範囲内の継続時間を有し得る。
【0053】
電気穿孔パルスの量は、１パルス～約１０パルスの範囲内であり得る。
【0054】
マルチパルス送達の場合には、各電気穿孔パルスは、約１ミリ秒～約１秒の範囲内のパルス遅延によって、隣接するパルスから時間的に分離され得る。
【0055】
いくつかの実施形態においては、電気穿孔信号は、パルス間に２００ミリ秒の遅延を有する、約１００ミリ秒の継続時間の、約２００Ｖの３つのパルスを含み得る。他の実施形態においては、電気穿孔信号は、パルス間に２００ミリ秒の遅延を有する、約１００ミリ秒の継続時間の、約５０Ｖの３つのパルスを含み得る。更に他の実施形態においては、電気穿孔信号は、パルス間に１秒の遅延を有する、１００ミリ秒の継続時間の、約５０Ｖの１０個のパルスをみ得る。更に他の実施形態においては、電気穿孔信号は、パルス間に約１００ミリ秒の遅延を有する、約１００ミリ秒の継続時間の、７５Ｖの８つのパルスを含み得る。更に他の実施形態においては、電気穿孔信号は、パルス間に約１００ミリ秒～約１秒の遅延を有する、約１０マイクロ秒～約１００マイクロ秒の継続時間の、約５００Ｖ～約１０００Ｖの間の３つのパルスを含み得る。前述の電気穿孔信号は、特に細胞へのＤＮＡ送達のための可逆的な孔形成のための非限定的な例として提供されていることは、理解されるべきである。また、本明細書に開示された実施形態は、非限定的な例として、細胞への小分子の送達、電気化学療法、及び不可逆的電気穿孔用のためのような、他のタイプの薬剤を細胞に送達することを含む、他のタイプの処置を提供するために適合され得ることは、理解されるべきである。
【0056】
複数の電気穿孔パルスを伴う処置において、パルスは、電極８によって、処置の最後の電気穿孔パルスまで及びそれを含めて、以下のパルスシーケンス又はパターンで送達され得る。第１の電気穿孔パルスが、組織１０２を通して電極８の第１の正のサブセットによって、電極８の第１の負のサブセットへ送達され、第２の電気穿孔パルスが、組織１０２を通して電極８の第２の正のサブセットによって、電極８の第２の負のサブセットへ送達されるなど。各電気穿孔パルスの間、電極８の各正及び負のサブセットは、単一の電極８から、アレイ９の電極８ｎの総数より少なくとも１つ少ない（すなわち８ｎ－１個の）電極８の任意の組み合わせに及び得る。電気穿孔パルスパターンは、プログラムされたシーケンスに従って送達され得、該シーケンスは、ユーザによってコントローラ１１４に（ユーザインタフェース１２０を介するなどして）入力され得る。更に、電気穿孔パルスのシーケンスは任意選択的に、分散型パターンで送達され得る。かかる分散型パターンシーケンスにおいては、複数の電気穿孔パルスの各パルスは、電極８の少なくとも２つのセットの間で送達され得、複数の電気穿孔パルスの各後続パルスは、少なくとも２つの電極８の異なるセットにより送達される。分散型電気穿孔パルスパターンは、電気穿孔される組織１０２に対する電気穿孔に関連する熱応力の発生を最小限に抑え得るか、又は好ましくは排除し、組織１０２内に生成される電場の均質性を向上させ得る。
【0057】
真空カップ２は、電気穿孔パルス送達の間に組織１０２の１つ以上の電気的パラメータを感知、測定又はその他の方法で検出し、検出された情報を診断及びフィードバックのためにコントローラ１１４に中継して戻すように構成され得る。組織１０２において検出される電気的パラメータは、非限定的な例として、電圧、電流、インピーダンス及び／又は抵抗を含み得る。電気穿孔パルス送達の間にかかるパラメータを検出するための１つの手法は、電極８の少なくとも１つに、パルスの間の所望の電気的パラメータを測定させることである。かかる電極８は、感知電極８又は単に「センサ」として特徴付けられ得る。感知電極８は、パルスの間、中性であり得る。分散型電気穿孔パルスパターンシーケンスの非限定的な例として、複数の電気穿孔パルスの各パルスは、電極８の少なくとも２つのセット間で送達され得、少なくとも１つの他の電極８は、中性でありかつインピーダンスのような組織１０２の電気的パラメータを測定する感知電極８であり、複数の電気穿孔パルスの各後続パルスは、異なるセット少なくとも２つの電極８によって送達され、少なくとも１つの電極８は、中性でありかつ電気的パラメータを測定する感知電極８である。少なくとも１つの中性電極８は、パルスごとに交番し得るが、同じ電極８（又は電極８のセット）は連続するパルスにおいて中性のままであり得る。代替としては、電気穿孔パルスの間、アレイ９の少なくとも１つの電極８は、組織１０２の電気的パラメータを測定しながらも、パルスを能動的に送達し得る。
【0058】
電気穿孔パルス送達の間に電気的パラメータを検出するための別の任意の手法は、パラメータを検出するための少なくとも１つの別個のセンサを利用することである。別個のセンサは、例えば、図４Ｄに示されるように、接触センサ１５０のような非侵襲性センサ１５０であり得る。接触センサ１５０は、パラメータを測定し、測定されたパラメータについての情報をコントローラ１１４に伝達するように構成される。接触センサ１５０は、第２のポート１４のようなポートを通して、真空チャンバ６に挿入され得る。医師は、接触センサ１５０を、皮膚１０４のような組織１０２と接触させるように置くことができ、そこで接触センサ１５０はパラメータを測定し得る。他の実施形態においては、別個のセンサは、プローブ型センサ１５２のような侵襲性センサ１５２であり得る。プローブ型センサ１５２のかかる例の１つにおいては、センサ１５２は、注入針１８の一部、例えば、その遠位先端領域（図４Ｃ参照）であり得、測定パラメータについての情報をコントローラ１１４に関連付けるために、コントローラ１１４と電気的に連通し得る。組織１０２の単一の電気的パラメータ又は複数の電気的パラメータに関する情報をコントローラ１１４に中継するために、１つ以上の非侵襲性センサ１５０及び１つ以上のプローブ型センサ１５２を含む複数のセンサが処置の間に利用され得ることは、理解されるべきである。
【0059】
コントローラ１１４によって受信された電気的パラメータ情報は、性能診断目的のため、及び／又は電極８に送達され、したがって組織１０２に送達される電気穿孔信号のアクティブなフィードバック制御のために利用され得る。例えば、能動的なフィードバック制御を提供するために、１つ以上のセンサ８、１５０、１５２は、組織１０２における１つ以上のそれぞれの電気的パラメータを測定し、これらパラメータについての情報をコントローラ１１４に伝達し得る。プロセッサ１１６は、電気穿孔パルスを制御するための制御コマンドのような出力を処理するか又はその他の方法で導出するために、パラメータ情報を組み込む１つ以上のアルゴリズムを実行することなどにより、パラメータ情報を組み込んだソフトウェアを実行し得る。アルゴリズムはまた、コンピュータメモリ１１８から取得されたパラメータデータを利用し得る。アルゴリズムから導出された制御コマンドは、センサ８、１５０、１５２からのパラメータ情報に基づいて、電気穿孔目的のために実質的に瞬時になどのように、リアルタイムで電気穿孔パルスを調節し得ることは、理解されるべきである。このようにして、電気穿孔システム１００は、標的組織１０２において所望の電気穿孔処置結果を達成するために、必要に応じて電気穿孔パルスの一定の制御及び調節のために、能動的なフィードバックループにおいてセンサ８、１５０、１５２を利用し得る。かかるフィードバック制御を実行するための技術及び／又は電子部品は、「Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ ｆｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｓ」と題された２０１６年９月２７日に発行された米国特許第９，４５２，２８５号（‘２８５参考文献）、及び「Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｅｅｄｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ」と題された２０１１年１月１３日に発行された米国特許公開第２０１１／０００９８０７Ａ１号（‘８０７参考文献）により完全に開示されているように利用することができ、それらの各々の全体開示がここで参照によって本明細書に組み込まれたものとする。
【0060】
図４Ｅに示されるように、１つ以上の電気穿孔パルスに続いて、医師は、真空チャンバ６内の圧力を大気圧に戻し、真空カップ２が組織１０２を離すことを可能にし得、組織はその解剖学的形状に戻ることができる。トランスフェクトされた脂肪細胞は、脂肪層１０３にトランスフェクションゾーン１０５ｚを画定し得る。
【0061】
ここで図４Ｆを参照すると、本明細書に開示された真空カップ２の重要な利点の１つは、真空源１０６と関連して、医師が電気穿孔処置のために処置ゾーン１０７に引き込まれる組織１０２の体積（すなわちマウンド１４０のサイズ）を制御することを可能にすることである。したがって、標的ゾーン１０５が皮膚層１０４のみに存在する場合、医師は、皮膚層１０４をチャンバ体積Ｖ内に引き込み、その遠位端８ｂなどにおいて電極８と接触させるために必要な真空圧を、真空チャンバ６に加えることができる。標的ゾーン１０５が脂肪層１０３に存在する場合、医師は、脂肪層１０３を処置ゾーン１０７に引き込むのに必要な、増大させられた真空圧を加え得る。標的ゾーン１０５が平滑筋層のような筋肉層に存在する場合、医師は、更に増大させられた真空圧を加えることができ、標的ゾーン１０５が骨格筋層に存在する場合は、更により増大させられた真空圧を加えることができる。標的ゾーン１０５は、組織の単一層（例えば、皮膚層１０４又は脂肪層１０３）に存在し得、又は皮膚層１０４、脂肪層１０３、及び任意選択的に平滑筋層を含む複数の組織層に存在し得ることは、理解されるべきである。真空圧は、標的ゾーン１０５の深さに従って、必要に応じて制御され得る。
【0062】
本開示の真空カップ２の別の重要な利点は、真空カップ２が、真空源１０６と関連して、医師が、複数の真空パルスを組織１０２に適用して、以上に説明された好適なインビボ流体分散機構を含む、組織と注入物との間の相互作用を増強することを可能にすることである。真空パルスは、注入の前、注入の間、及び／又は注入後に適用され得、また電気穿孔の前、電気穿孔の間、及び／又は電気穿孔の後に適用され得る。真空パルスは、１パルス～２０パルスの範囲内の量で付与され得、各パルスは、約０．１秒～約３０秒の範囲内の継続時間を有し得る。真空パルスはまた、所望の結果を達成するために、真空圧及び／又は継続時間を変化させて（及び／又はパルス間の時間を変化させて）適用され得る。
【0063】
本発明者らは、本開示の真空カップ２に関連して、多くの驚くべき、予想外の観察を得た。例えば、本発明者らは、真空カップ２を使用して真空支援電気穿孔を用いて処置された試験対象における免疫応答において、予想外の驚くべき増大を観察した。この結果は、本発明者らの当初の目的が、先行技術のキャリパー型電気穿孔装置によってもたらされるグリップと比較して、対象組織においてより安全なグリップを達成するという主目的のために真空カップ２を利用することであったため、驚くべき予想外のものであった。本発明者らは、真空カップ２を用いて処置された試験対象において測定された増大した免疫応答を、単に真空カップ電極８と組織との間の増強された位置的安定性の結果として説明することができなかった。注目すべきことに、本発明者らはまた、真空カップ２を用いて処置された処置部位において、予想外の驚くべき量の細胞浸潤を観察した。真空カップ２を利用したいくつかの処置の後、本発明者らは、紅斑及び／又は血腫の特性である皮膚における打撲及び変色を観察し、後者は破裂した毛細管を通した血液の拡散を伴う。
【0064】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、免疫応答及び細胞浸潤の驚くべき増大は関連している見込みが高いと考えている。更に、本発明者らは、増大した細胞浸潤は、少なくとも部分的に、追加的な白血球のような追加的な細胞を引き寄せて処置ゾーンに反応的に移動させる、処置ゾーンにおける破裂毛細管及び近くの白血球からの化学的信号の自然分泌によって駆動されると考えている。本発明者らはまた、観察された細胞浸潤は、少なくとも部分的に、炎症反応によって駆動され得ると考えている。本発明者らは更に、真空圧に応答して組織を通る注入物の観察された分散に基づいて、処置ゾーン１０７の外側のインビボ流体が、真空圧に応答して処置ゾーン１０７に機械的に引き込まれると考えている。
【0065】
ここで図５Ａ～５Ｄを参照しながら、可撓性電極５０８を利用した真空カップ５０２の一実施形態について説明する。本実施形態の真空カップ５０２は、以上に説明された真空カップ２と同様である。したがって、以上に用いられたような同様の参照番号は、本実施形態における共通の特徴を示している。簡潔さのため、以下の説明は、本実施形態の真空カップ５０２と以上に説明された真空カップ２との相違点に焦点を当てる。
【0066】
図５Ａ～５Ｂに示されるように、真空カップ５０２は、真空チャンバ５０６を部分的に画定する内面５２２を画定する、筐体本体５２６を有する。筐体本体５２６はまた、筐体本体５２６の外面５３２から筐体本体５２６の内面５２２に画定された複数のチャネル５６２まで延在する、複数のリリーフポート５６０を画定する。チャネル５６２は、長手方向Ｌに沿って互いから離隔された近位チャネル５６２及び遠位チャネル５６２を含み得る。チャネル５６２は、それぞれ中心軸Ｘのまわりの全周に沿って環状に延在し得るが、他の実施形態においては、チャネル５６２の１つ以上は、中心軸Ｘのまわりの全周よりも短い範囲で環状に延在し得る。
【0067】
真空カップ５０２は、真空チャンバ５０６内に存在し、電極アレイ５０９に配置された複数の電極５０８を担持する、可撓性スリーブ５５２を含む。可撓性スリーブ５５２は、筐体本体５２６の内面５２２に取り付けられた外面５５３を有する。可撓性スリーブ５５２は、チャネル５６２と真空チャンバ６との間に可撓性の障壁又は膜を提供する態様で、チャネル５６２を覆っている。電極５０８は、スリーブ５５２の内面５５５上に配設される。スリーブ５５２はまた、電極５０８とコントローラ１１４との間の電気的な連通を提供するための、例えば、有線回路又は印刷回路のような回路を担持し得る。本実施形態の電極５０８は、図３Ｋ～３Ｌを参照して以上に説明された電極８と同様に、円周方向に長細いものであり得る。電極５０８の１つ以上及び最大で各々は、チャネル５６２の少なくとも１つを覆っており、可撓性材料で構築されている。電極材料は、非限定的な例として、銅、ステンレス鋼及び金のような金属であり得る。代替として又はこれに加えて、電極材料は、非限定的な例として、導電性ポリマー、又はカーボンナノチューブを含み得るグラフェンのような炭素同素体を含み得る。他の実施形態においては、電極５０８は、以上に説明されたもののような導電性材料で被覆された非導電性コアを有し得る。
【0068】
電極アレイ５０９は、電極５０８の４つのサブセット５０９ａ～ｄを含み得る。各サブセット５０９ａ～ｄ内の電極５０８は、長手方向Ｌに沿って実質的に整列され得、各サブセット５０９ａ～ｄは、円周方向Ｃに沿って各隣接するサブセット５０９ａ～ｄから離隔され得る。サブセット５０９ａ～ｄは、中心軸Ｘのまわりに９０度間隔などのように、互いから規則的に離隔され得る。図示される例においては、各サブセット９ａ～ｄは、互いから長手方向に離隔された近位電極５０８及び遠位電極５０８を含み、アレイ５０９に合計で８つの電極５０８を提供する。アレイ５０９の電極５０８はまた、近位チャネル５６２を覆う電極５０８の近位環状列と、遠位チャネル５６２を覆う電極５０８の遠位環状列とに配置されているものとして特徴付けられ得る。以上に説明されたように、電極５０８は、電極５０８とコントローラ１１４との間の電気的な連通を提供する回路に接続される。コントローラ１１４が、電極５０８の各サブセット５０９ａ～ｄに対する電気穿孔パルスのパラメータを個別に制御することができ、更に各サブセット５０９ａ～ｄ内の各電極５０８に対する電気穿孔パルスのパラメータを個別に制御することができるように、電極アレイ５０９の回路が構成され得ることは、理解されるべきである。
【0069】
ここで図５Ｃ～５Ｄを参照すると、可撓性スリーブ５５２及び電極５０８は、チャンバ６内の真空圧を加えているときに、真空チャンバ６内へと内向きに（中心軸Ｘに向かって）撓むように構成され、電極５０８の接触面５０８ｚとチャンバ６内に引き込まれた組織の間の接触を増大させる。リリーフポート５６０は、チャネル５６２と真空カップ５０２の外部との間に流体連通をもたらし、それによりチャネル５６２内の圧力が実質的に大気圧に留まることを可能にする。このようにして、チャンバ内の真空圧は、チャンバ６とチャネル５６２との間のスリーブ５５２の壁に圧力勾配をもたらし、スリーブ５５２及びその上の電極５０８が、チャンバ６内へと内向きに撓むことを可能にする。
【0070】
ここで図６Ａ～６Ｄを参照すると、真空カップ２、５０２の真空チャンバ６内に位置付けるための電極６０８は、電極６０８の接触面６０８ｚによって画定され得る複数の突出部６６４を含み得る。以上に説明された態様と同様に、電極６０８は、電極６０８の中心軸６０８ｘに沿って、第１の端６０８ａから第２の端６０８まで延在する。電極６０８は、中心軸６０８ｘに沿って配向された方向に沿って長細ものであり得る。電極６０８はまた、電極６０８の横軸６０８ｙに沿って、第１の側面６０８ｃから第２の側面６０８ｄまで延在し得る。接触面６０８ｚは、実質的に滑らかなベース部分６６５を含み得、突出部６６４は、ベース部分６６５から外向きに（すなわちチャンバ６内へと内向きに）延在し得る。ベース部分６６５は、図示されるように、実質的に平面状であり得るが、他の実施形態においては、ベース部分６６５は、カップ筐体４の内面２２と実質的に共形の曲線的な輪郭を有し得る。ベース部分６６５から外向きに延在することによって、突出部６６４は、電極６０８の接触面６０８ｚとチャンバ６内に引き込まれた組織との間の接触面積を増大させ得る。使用の間、突出部６６４は、皮膚１０４の最上層を破壊して、変化させる態様で組織１０２に押し込むことができ、標的組織内の電場分布を改善することができる。より具体的には、突出部６６４は、「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｕｓｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」と題された２０１８年３月２９日に公開された国際（ＰＣＴ）特許公開第ＷＯ２０１８／０５７９００Ａ１号（‘９００参考文献）に更に完全に記載されているように、所与の入力電圧に対して組織１０２内に形成される電場の大きさを増大させ、この開示全体が参照により本明細書に組み込まれたものとする。
【0071】
図６Ａ～６Ｂに示されるように、突出部６６４は、凸状、円弧状、ドーム状の幾何学的形状を有し得る。突出部６６４は、突出部６６４の列及び行に配置され得る。図６Ｃに示されるように、突出部は、横軸６０８ｙに沿って配向された方向に沿って長細であり得る。図６Ｂ及び６Ｄに示されるように、図６Ａ及び図６Ｃに示される突出部６０８は、同様の側面プロファイルを有し得る。尖った形、円錐形、錐台形、ピラミッド形などを含む他の突出部の幾何学的形状も本開示の範囲内であることは、理解されるべきである。また、電極６０８は、真空カップ２の長手方向Ｌに沿って長細になるように、真空カップ２の円周方向Ｃに沿って長細になるように、又は長手方向及び円周方向Ｌ、Ｃに対して斜めの方向に沿って長細になるように、チャンバ６との位置付けのために構成され得ることは、理解されるべきである。
【0072】
チャンバ深さＬ２、チャンバ直径Ｄ１、並びに中心軸Ｘに直交する基準面における断面形状、及び／又は開口２０の形状のようなカップ形状など、本明細書に記載された真空カップ２、５０２の様々なパラメータは、広範の哺乳類及び皮膚の生体構造にわたるような望ましい電気穿孔処置を達成するために、必要に応じて調整され得る。例えば、本開示の真空カップは、非限定的な例として、多角形の開口及び／又はチャンバの幾何学的形状のような、非円形の開口及び／又はチャンバの幾何学的形状を有し得る。図７Ａ～７Ｅを参照しながら、三角形の開口及びチャンバの幾何学的形状を有する真空カップ７０２が説明される。図８Ａ～８Ｃを参照しながら、長方形の開口及びチャンバの幾何学的形状を有する真空カップ８０２が説明される。かかる実施形態においては、チャンバ寸法Ｄ１は、「チャンバ幅」Ｄ１と称され得る。
【0073】
ここで図７Ａ～７Ｃを参照すると、三角形の開口７２０を画定する遠位端７１０を有する真空カップ７０２が示されている。本実施形態の真空カップ７０２は、以上に説明された真空カップ２、５０２と同様である。したがって、以上で使用されたような同様の参照番号は、本実施形態における共通の特徴を示す。簡潔さのため、以下の説明は、本実施形態の真空カップ７０２と以上に説明された真空カップ２、５０２との相違点に焦点を当てる。
【0074】
真空カップ７０２は、真空カップ７０２の中心軸Ｘに直交する基準平面で見て、三角形のパターンに配置された３つの側壁７３０を画定する、筐体本体７２６を含む。したがって、筐体本体７２６は、直交する基準平面において、これも三角形の形状を有する真空チャンバ７０６を画定する。側壁７３０は、筐体本体７２６の３つの角７３５において互いに交差し、これらの角７３５は、好ましくは曲がっている。三角形のパターンは、図示されるように正三角形であり得るが、直角三角形、二等辺三角形、及び不等辺三角形を含む他の三角形のパターンも、本実施形態の範囲内である。
【0075】
側壁７３０の内面７２２は、遠位リードイン部分７２２ａからチャンバ７０６の近位端７２４に向かって延在する主部分７２２ｂを画定し得る。主部分７２２ｂは、平面状であり得、それにより、直線状の表面プロファイルを画定し、この直線状の表面プロファイルに沿って測定されると、約１ｍｍ～約２０ｍｍの範囲内の長さＬ４を画定し得る。主部分７２２ｂは、代替として非平面状であってもよく、非直線状のプロファイルを有してもよいことは、理解されるべきである。主部分７２２ｂは、好ましくは、チャンバ７０６の近位端７２４に向かって、中心軸Ｘに向かって内向きに先細である。主部分７２２ｂは、中心軸Ｘと平行な軸に関して測定されるテーパ角Ａ４を、約０度～約８０度の範囲内、より詳細には約０．２５度～約１０度の範囲内、及びより詳細には約０．５度～約５度の範囲内で画定し得る。
【0076】
真空カップ７０２は、電極アレイ７０９に配置された複数の電極７０８を含み、このアレイは、電極７０８の３つのサブセット７０９ａ～ｃを含み得る。電極７０８の第１のサブセット７０９ａは、第１の側壁７３０の内面７２２上に配設され得、電極７０８の第２のサブセット７０９ｂは、第２の側壁７３０の内面７２２上に配設され得、電極７０８の第３のサブセット７０９ｃは、第３の側壁７３０の内面７２２上に配設され得る。電極７０８のサブセット７０９ａ～ｃは、それぞれの基板又は「パッド」７５２によって担持され得、これらの基板は、非限定的な例として、シリコン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリフタルアミド（ＰＰＡ）、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリエーテルイミド（ＰＥＩ）のような電気絶縁材料で構築され得る。基板７５２は、可撓性であってもよいし、又は剛性であってもよい。基板７５２はまた、電極７０８とコントローラ１１４との間の電気的な連通を提供するための、例えば、有線回路又は印刷回路のような回路を担持し得る。したがって、基板７５２は、印刷回路基板（ＰＣＢ）のような回路基板であり得る。以上に説明されたように、コントローラ１１４が、電極７０８の各サブセット７０９ａ～ｄに対する電気穿孔パルスのパラメータを個別に制御することができ、また各サブセット７０９ａ～ｃの各電極７０８のパルスパラメータを個別に制御することができるように、回路が構成され得る。基板７５２の外面７５３は、接着剤を介してそれぞれの側壁７３０の内面７２２に取り付けられ得るが、他の締結技術も本開示の範囲内である。
【0077】
電極７０８の各サブセット７０９ａ～ｃは、単一の電極７０８又は好ましくは複数の電極７０８を含み得る。図示された実施形態においては、各サブセット７０９ａ～ｃは、４つの電極７０８を有する。各サブセット７０９ａ～ｃは、単一の、電極、２つ、３つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、又は１２個より多い電極７０８、例えば、１００個以上の電極７０８のような、４つよりも少ない又は多い電極７０８を有し得ることは、理解されるべきである。微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）技術及びナノ技術の進歩により、各離散電極７０８のサイズは、各サブセット７０９ａ～ｃが事実上無制限の量の離散電極７０８を有し得る程度まで縮小させられ得る。
【0078】
電極７０８は、図示されるように滑らかであり得る接触面７０８ｚを画定する。接触面７０８ｚの主要部分は、内面７２２の主部分７２２ｂを覆うそれぞれの部分のように、平面状であり得る。しかしながら、少なくとも１つ及び最大で全ての電極７０８の接触面７０８ｚは、以上に説明された態様と同様に、テクスチャ加工され得、及び／又は突出部を画定し得ることは、理解されるべきである。更に、基板７５２及び電極７０８は、可撓性であってもよく、図５Ａ～５Ｄを参照しながら以上に説明された態様と同様に、真空圧がチャンバ７０６に加えられたときに電極７０８が内向きに撓むことを可能にするために、筐体本体７２６に画定されたチャネル及びリリーフポートを覆い得る。
【0079】
ここで図７Ｄを参照すると、各サブセット７０９ａ～ｃにおける電極７０８は、互いに平行であり得る。電極７０８は、その中心軸７０８ｘに沿って電極７０８の第１及び第２の端７０８ａ、ｂの間で測定される、電極長Ｌ１を定義し得る。電極長Ｌ１は、以上に説明された範囲内であり得る。電極７０８はまた、電極７０８の第１及び第２の側面７０８ｃ、ｄの間で測定される、電極幅Ｗ１を定義し得る。電極幅Ｗ１は、以上に説明されたＣ１についての範囲内であり得る。各サブセット７０９ａ～ｃの電極７０８はまた、約１．０ｍｍ～約３０ｍｍの範囲内であり得る、電極間の離隔間隙Ｗ２を定義し得る。
【0080】
ここで図７Ｅを参照すると、電極７０８は、基板７５２から内向きに（真空チャンバ７０６内へと）延在し得る。電極７０８は、基板７５２の内面７５５から接触面７０８ｚまで測定される電極厚さＴ１を定義し得る。電極厚さＴ１は、約０．００１ｍｍ～約２．０００ｍｍの範囲内であり得る。図示されるように、電極７０８の外面７０８ｗは、基板７５２の内面７５５に貼付され得る。他の実施形態においては、電極７０８の外面７０８ｗは、基板７５２に部分的に埋め込まれ得る。すなわち、電極７０８の外面７０８ｗは、基板７５２の外面及び内面７５３、７５５の間の深さで存在し得る。更なる実施形態においては、電極７０８の外面７０８ｗは、基板７５２に完全に埋め込まれ得る。すなわち、電極７０８の外面７０８ｗは、基板７５２の外面７５３と同延であり得る。
【0081】
本実施形態の電極アレイ７０９ａ～ｃは、真空圧が組織１０２を真空チャンバ内に引き込むと、組織１０２が接触面７０８ｚに接触するように、及び電極間の間隙Ｗ２内へと引き込まれて、それにより電極の側面７０８ｃ、ｄにも接触し、それにより組織１０２と電極７０８との間の全体的な接触界面面積が増大するように構成される。
【0082】
本実施形態の真空チャンバ７０６の幾何学的形状及び電極アレイ７０９ａ～ｃの構成は、真空カップ７０２の側壁７３０に沿った実質的に平面状の電極７０８を可能にし、以上に説明された真空カップ２、５０２のものと比較して、組織１０２においてより柱状の電気穿孔場（すなわち中心軸Ｘに沿ってより長細の）をもたらす。本実施形態の三角形の形状はまた、有利にも、先行技術の電気穿孔装置よりも大きな程度に、三角形のパルスパターンによって画定される電気穿孔場の境界内に、組織を拘束し得る。これに加えて、本実施形態の三角形のアレイを含む多角形のアレイの幾何学的形状は、円形の設計を含む他のアレイ設計と比較して、角７３５の反対側の隣接電極間の鋭角すなわち「鋭い」角度により、より不均質な電気穿孔場を生成し得る。例えば、標的組織内で増大した電場の大きさ（増大した電流に帰着する）の領域を生成することが望ましい場合があり、「鋭い」すなわち鋭角の隣接電極端を有することは、かかる増大した電場／電流の領域を組織内に生成する１つの方法である。
【0083】
ここで図８Ａ～８Ｃを参照すると、長方形開口８２０を画定する遠位端８１０を有する真空カップ８０２が示されている。本実施形態の真空カップ８０２は、以上に説明された真空カップ２、５０２、７０２と類似する。したがって、以上で使用されたような同様の参照番号は、本実施形態における共通の特徴を示す。簡潔さのため、以下の説明は、本実施形態の真空カップ８０２と以上に説明された真空カップ２、５０２、７０８との相違点、特に図７Ａ～７Ｅを参照して以上に説明された真空カップ７０２との相違点に焦点を当てる。
【0084】
真空カップ８０２は、４つの壁、特に、長方形のパターンに配置された一対の対向する端壁８３１の間に延在する一対の対向する側壁８３０を画定する筐体本体８２６を含み、それにより直交基準面において、これも長方形形状を有する真空チャンバ８０６を提供する。図示された実施形態においては、側壁８３０は端壁８３１よりも長いが、他の実施形態においては、側壁８３０及び端壁８３１は、長方形が正方形となるように、同じ長さであっ得る。また、筐体本体８２６の壁は、他の四角形の幾何学的形状（すなわち非長方形）を画定し得ることは、理解されるべきである。
【0085】
壁８３０、３２１の内面８２２は、遠位リードイン部分８２２ａからチャンバ８０６の近位端８２４に向かって延在する、主部分８２２ｂを画定し得る。側壁８３０及び／又は端壁８３１の主部分８２２ｂは、内側に向かって近位にテーパ角Ａ４で先細であり得、該テーパ角は、以上に説明された範囲内であり得る。真空カップ８０２は、電極アレイ８０９に配置された複数の電極８０８を含み、該電極アレイは、側壁８３０の内面８２２上に配設された電極８０８の２つの対向するサブセット８０９ａ、ｂを含み得る。端壁８３１は、図示されるように、電極８０８を欠き得るが、他の実施形態においては、端壁８３１の一方又は両方は、電極８０８の追加的なサブセットを有し得る。更に他の実施形態においては、端壁８３１は電極を有してもよく、側壁８３９は電極を欠いていてもよい。更に他の実施形態においては、壁８３０、８３１の１つ以上及び最大で各々が、様々なサイズ及び形状に従って構成され得る、単一の電極を有し得る。
【0086】
上述したように、電極８０８のサブセット８０９ａ、ｂは、内面８２２に取り付けられたそれぞれの非導電性基板８５２によって担持され得る。各サブセット８０９ａ、ｂは、４つの電極８０８を有し得るが、各サブセット８０９ａ、ｂは、４つよりも多い又は少ない電極８０８を有し得る。以上に説明されたように、電極アレイ８０９は、コントローラ１１４が、電極８０８の各サブセット８０９ａ、ｂへの電気穿孔パルスのパラメータを個別に制御し、また各サブセット８０９ａ、ｂ内の各電極８０８のパルスパラメータを個別に制御できるように構成された回路を含み得る。
【0087】
図示されるように、電極８０８の接触面８０８ｚは、滑らかであってもよく、その主要部分は、平面状であってもよい。しかしながら、他の実施形態においては、接触面８０８ｚは、以上に説明されたように、テクスチャ加工され得、及び／又は突出部を画定し得る。筐体本体８２６、基板８５２及び電極８０８はまた、図５Ａ～５Ｄを参照しながら以上に説明された態様と同様に、電極８０８が真空圧に応答して内向きに撓むことを可能にするように協働的に構成され得る。電極８０８は、図７Ｄ～７Ｅを参照しながら以上に説明されたものと同様の長さＬ１、幅Ｗ１及び厚さＴ１を有し得、以上に説明されたものと同様に動作し得る。
【0088】
本実施形態の真空チャンバ８０６の長方形の幾何学的形状及び電極アレイ８０９ａ、ｂの構成は、以上に説明された真空カップ２、５０２、７０２のものと比較して、中心軸Ｘを横切る方向に沿って（特に端壁８３１に直交する方向に沿って）より長細である、球状の電気穿孔場を提供する。更に、本実施形態の長方形アレイは、互いに直接対向し、直接対向する電気パルスを発射することが可能な、実質的に平面状の電極を可能にする。この点に関して、本実施形態のアレイは、本技術分野で既知の対向プレート型又はキャリパー型電気穿孔装置と同様の方法で利用することができる。例えば、本実施形態の長方形アレイ設計は、医師が、キャリパー型電極構成と同様に、組織の長細いセクションを「つまむ」ことを可能にし得る。主に１つの軸に沿って組織を「把持」し、組織内に長細い処置ゾーンを形成するようにつまむことは、有利であり得る。例えば、アスペクト比を増大させると、長方形カップ８０２は、電極間の間隙を増大させずに、より大きな組織領域全体を処置することができる。このことは、例えば、同じ電圧で動作する円形アレイ設計よりも、低い電圧の使用及び大きな組織領域の処置を可能にし得る。
【0089】
これに加えて、以上に説明されたものと同様に、本実施形態のアレイを含む多角形アレイ形状は、カップ８０２の対向側壁８３０上の隣接電極間の鋭角（本実施形態においてはほぼ平行）により、より不均質な電気穿孔場を生成し得る。更に、以上に説明されたように、増大した電場の大きさの領域を組織内に生成するために、以上に説明されたように、アレイが利用され得る。
【0090】
他の実施形態の真空カップは、五角形、六角形、七角形、八角形などから、円形の幾何学的形状に至るまでの、他の多角形形状の開口及び／又はチャンバの幾何学的形状を有し得ることは、理解されるべきである。更に、かかる多角形形状は、等辺の構成を有する必要はない。更に他の実施形態においては、真空カップは、非限定的な例として、楕円形、長円形又は不規則な形状のような、他の形状の開口及び／又はチャンバの幾何学的形状を有し得る。楕円形のカップ形状は、主に１つの軸に沿って組織を「把持」し、それをつまんで、組織内に長細い処置ゾーンを形成し、それにより、より大きな組織領域を処置するための低電圧を可能にする能力を含む、上述の長方形カップ８０２と同様の利点を提供できることは、理解されるべきである。
【0091】
ここで図３０Ａ～３３Ｆを参照しながら、脂肪組織１０３及び皮膚１０４に対する様々な４電極アレイ９の模擬試験結果を説明する。図３０Ａ～３３Ｆの各々において、対向電極８は、１５ｍｍの距離（この距離はチャンバ直径Ｄ１に近い）で互いに離隔されており、電極間の印加電圧は同じである。したがって、図３０Ａ～３３Ｆは、電場生成に対する電極の形状、サイズ及び離隔の効果を実証している。
【0092】
図３０Ａ～３１Ｆは、電極の接触面が概ね円形の外周に沿って延在する、円形アレイ９を示す。図３０Ａ～３１Ｆに示される電極の幅は、チャンバ直径の割合によって定義され、したがって、上部に向かって内向きに先細となるチャンバは、チャンバの内面に沿った任意の位置で常にチャンバの円周の同じ割合を占めながら、上部付近において薄い電極幅、及び底部付近において厚い電極幅を有することとなる。図３０Ｂ及び図３１Ｂにおける電極は各々、１５度の角度スパンＡ２を有し、図３０Ｃ及び図３１Ｃにおける電極は各々、３０度の角度スパンＡ２を有し、図３０Ｄ及び図３１Ｄにおける電極は各々、４５度の角度スパンＡ２を有し、図３０Ｅ及び図３１Ｅにおける電極は各々、６０度の角度スパンＡ２を有し、図３０Ｆ及び図３１Ｆにおける電極は各々、７５度の角度スパンＡ２を有している。
【0093】
図３２Ａ～３３Ｆは、電極の接触面が長方形の辺を画定する、長方形（具体的には正方形）アレイ９を示す。図３２Ｂ及び３３Ｂにおける電極は各々、２．５ｍｍの幅を有し、図３２Ｃ及び図３３Ｃにおける電極は各々、５．０ｍｍの幅を有し、図３２Ｄ及び図３３Ｄにおける電極は各々、７．５ｍｍの幅を有し、図３２Ｅ及び図３３Ｅにおける電極は各々、１０．０ｍｍの幅を有し、図３２Ｆ及び図３３Ｆにおける電極は各々、１２．５ｍｍの幅を有している。図３２Ａ～３３Ｆに示される電極の幅は、上部から底部まで一定である。したがって、上部に向かって内向きに先細であるチャンバは、このように構築された隣接する電極を、底部におけるよりも上部において互いに近くなるようにする。カップの寸法及び壁のテーパ角に応じて、このことは、チャンバの上部において、隣接する電極が互いに非常に接近するか又は互いに接触することさえ引き起こし得るため、これは好ましくない。
【0094】
これらの図から、正方形アレイ（図３２Ａ～３３Ｆ）は、それらの円形アレイの対応物（図３０Ａ～３１Ｆ）よりも、脂肪組織１０３及び皮膚１０４の両方において、不均質な電場を形成することがわかる。したがって、円形アレイは、それらの長方形アレイの対応物よりも、脂肪組織１０３及び皮膚１０４の両方において、より均質な電場を生成するとも言える。円形及び長方形のアレイによって生じる電場の不均質性／均質性におけるこれらの相違は、所望の処置に応じて、必要に応じて有益に利用され得る。例えば、特定の電気穿孔処置がより均質な電場から利益を得る場合には、医師は円形の真空カップ（及び電極アレイ）を選択することができる。特定の電気穿孔処置がより不均質な電場から利益を得る場合には、医師は多角形の真空カップ（及び電極アレイ）を選択することができる。電極の設計に関しては、特に図３０Ａ～３１Ｆに示す設計のように、真空チャンバが上部において内向きに先細である場合、隣接する電極の間の適切な離隔を維持することが好ましいことは、理解されるべきである。
【0095】
ここで図９Ａを参照すると、特にジェット注入を介した、薬剤の針なし注入のために構成された真空カップ９０２を含む、真空電気穿孔アセンブリの例９００が示されている。したがって、真空カップ９０２は、「針なし」真空カップ９０２は又は「ジェット注入」真空カップ９０２と称され得る。本実施形態の真空カップ９０２は、以上に説明された真空カップ２、５０２、７０２、８０２、特に図１～４Ｆを参照しながら以上に説明された真空カップ２と同様である。したがって、以上で使用されたような同様の参照番号は、本実施形態における共通の特徴を示す。簡潔さのため、以下の説明は、本実施形態の真空カップ９０２と図１～４Ｆを参照しながら以上に説明された真空カップ２との間の相違点に焦点を当てる。
【0096】
上述したように、真空カップ９０２は、中に電極９０８が配設された真空チャンバ９０６と、それぞれが真空チャンバ９０６と連通する第１のポート９１２、第２のポート９１４及び第３のポート９１６とを画定する、筐体本体９２６を有する。上述したように、第１のポート９１２は、真空源１０６への接続のために構成され、第２のポート９１４は、数ある中でも、真空チャンバ９０６内への回路の通路のために構成される。しかしながら、本実施形態の第３のポート９１６は、真空チャンバ９０６に引き込まれた組織９０２に注入物１４２の小さなストリーム又は「ジェット」を注入するための、ジェット注入装置９７０を受容するように構成される。これに加えて、筐体本体９２６は、注入装置９７０との封止された結合を提供するように構成された、第３のポート９１６の外側端における、装着形成部９４８を画定する。装着形成部９４８は、装着形成部９４８に画定されたレセプタクル９５３内に存在し得、かつ注入装置９７０の外部との封止係合を提供するように構成された、封止Ｏリング９５１のような、１つ以上の封止部材を担持し得る。
【0097】
ジェット注入装置９７０は、薬剤を含む注入物１４２が貯蔵される流体チャンバ又は容器９７４を画定する、注入筐体９７２を含む。注入筐体９７２の外面９７５は、注入筐体９７２と真空チャンバ９０６との間の封止接続を提供するために、第３のポート９１６及び封止Ｏリング９５１と協働するサイズとされる。注入筐体９７２の遠位部分９７６は、容器９７４と流体連通しているノズル９７８を画定する。ノズル９７８は、容器９７４から真空チャンバ９０６に注入物１４２を排出するように構成される。遠位部分９７６はまた、ノズル９７８を少なくとも部分的に取り囲むシールド９８０を含み得る。シールド９８０は、ジェット注入の間に生成される注入物１４２の潜在的なはね止め又はリバウンドを含む、物理的な障壁として機能し得る。シールド９８０はまた、カップ９０２の回路を注入物１４２への露出から保護することができる。
【0098】
ノズル９７８の遠位端９７９は、好ましくは、シールド９８０の遠位端９８１を越えて遠位に延在する。ジェット注入装置９７０は、その遠位端にピストン９８４を担持するプランジャ９８２を含む。ピストン９８４の遠位先端９８６及びその遠位端９９０における容器９７４の内面９８８は、ピストン９８４の遠位端９９０への前進が、注入物１４２のジェットをノズル９７８から組織１０２の中に排出するように、相補的な幾何学的形状を有している。容器９７４は、注入物の予め測定された体積又は用量を担持するように構成され得ることは、理解されるべきである。更に、プランジャ９８２は、発射機構又はアクチュエータなどによって制御され、ノズル９７８を通って患者の組織１０２内へと所定の用量の注入物を排出し得る。かかる発射機構は、非限定的な例として、予め負荷をかけられた又は負荷をかけることが可能な１つ以上のばね、圧縮ガスキャニスタ、及び同様のものを含み得る。
【0099】
ジェット注入装置９７０は、「Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ」と題された２０１８年８月１４日に発行された米国特許第１０，０４５，９１１号（「‘９１１文献」）、「Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ Ｊｅｔ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ」と題された２０１９年１月３日に公開された米国特許公開第２０１９／００００４８９Ａ１号、及び「Ｎｅｅｄｌｅ－Ｆｒｅｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ ｗｉｔｈ Ｎｏｚｚｌｅ Ａｕｔｏ－Ｄｉｓａｂｌｅ」と題された２００９年５月２８日に公開された米国特許公開第２００９／０１３７９４９Ａ１号（「‘９４９文献」）のいずれかに更に完全に開示されるように構築され得、これらの各々の開示全体が参照により本明細書に組み込まれたものとする。
【0100】
針なし真空カップ９０２及びジェット注入装置９７０は、それにより提供される電気穿孔処置を増強する相補的な特徴を有する。例えば、図９Ｂを参照すると、真空圧が組織１０２のマウンド１４０を真空チャンバ６内に引き込むと、マウンド１４０上の皮膚層１０４が堅く締まり、皮膚層１０４の弾力性を一時的に減少させ、これによりノズル９７８から出る注入物のジェット又はストリームが、注入物のリバウンドを少なくして皮膚層１０４をより効率的に穿刺することを可能にする。皮膚層１０４を堅く締めることを補助するために、医師は、皮膚層１０４がノズル９７８の遠位端９７９のまわりで変形し、それにより遠位端９７９との接触界面において皮膚層１０４に窪み１０４ａを形成し、窪み１０４ａにおいて皮膚層１０４を更に引き延ばすように、十分な真空圧を利用して、皮膚層１０４を引き込みノズル９７８の遠位端９７９に接触させ得る。ジェット注入装置９７０の使用と組み合わせた、皮膚層１０４におけるかかる引き締めは、排出される注入物１４２が、注入時に皮膚層１０４を穿刺して、針注入（図４Ｃと比較して）よりも大きな程度に、また真空圧によって補助されないジェット注入装置を用いる場合よりも大きな程度に、組織のマウンド１４０の全体に浸透することを可能にする。
【0101】
組織のマウンド１４０全体への注入物の浸透は、注入物が組織１０２、特に脂肪組織１０３の全体に強制的に浸透させられるので、加圧された注入物が組織１０２内に数千の微細な切れ目又は経路を形成し、組織を効果的に浸透性にするとして特徴付けることができる。更に、その後に組織１０２を真空圧にさらすことによって（すなわち組織のマウンド１４０をチャンバ９０６内に引き込んだ真空パルスの継続、及び任意選択的に後続する１つ以上の真空パルスなどにおいて）、既により広範囲に分散された注入物１４２は、以上に説明された流体分散機構に従って、真空圧に応答して組織のマウンド１４０全体に更に分散させられ得る。
【0102】
ここで図１０Ａ～１０Ｄを参照しながら、針なし真空カップ１００２の別の実施形態が説明され、ここで真空カップ１００２は、そこに引き込まれた組織１０２が、真空チャンバ１００６内の電極１００８に画定された複数の開口１０６３内へと少なくとも部分的に引き込まれるように構成された、真空チャンバ１００６を有する。本実施形態の真空カップ１００２は、以上に説明された真空カップ、特に図９Ａ～９Ｂを参照しながら以上に説明された真空カップ９０２と同様である。したがって、以上に使用されたような同様の参照番号は、本実施形態における共通の特徴を示す。簡潔さのため、以下の説明は、本実施形態の真空カップ１００２と以上に説明された真空カップ９０２との相違点に焦点を当てる。
【0103】
ここで図１０Ａ～１０Ｂを参照すると、本実施形態の真空カップ１００２は、上述したように、真空源１０６への接続のための第１のポート１０１２と、真空チャンバ１００６へのアクセスを回路に提供するための第２のポート（図示されていない）と、ジェット注入装置９７０との封止接続を提供するための第３のポート１０１６と、を画定する筐体本体１０２６を有する。本実施形態においては、第３のポート１０１６が真空チャンバ１００６まで直接延在する代わりに、第３のポート１０１６は、筐体本体１０２６によって画定された環状チャネル１０６２まで内向きに延在する。環状チャネル１０６２は、少なくとも部分的に真空チャンバ１００６を取り囲み、径方向Ｒに沿ってそこから外向きに離隔される。筐体本体１０２６は、環状チャネル１０６２から真空チャンバ１００６に向かって内向きに延在する複数の筐体ポート１０６０を更に画定する。したがって、筐体本体１０２６は、複数の筐体ポート１０６０を画定するマニホールドを画定し得る。上述したように、電極１００８は、筐体本体１０２６の内面１０２２に貼付されるスリーブ１０５２によって担持され得る。スリーブ１０５２は、筐体ポート１０６０と開口１０６３との間の流体連通を提供するスリーブポート１０５７を画定する。したがって、スリーブポート１０５７はまた、環状チャネル１０６２と真空チャンバ１００６との間の流体連通を提供する。真空圧は、第３のポート１０１６、環状チャネル１０６２、筐体ポート１０６０、スリーブポート１０５７、及び電極開口１０６３を順に通って、真空チャンバ１００６に供給される。電極１００８が、筐体本体１０２６の内面１０２２に直接結合される実施形態においては、電極開口１０６３は、筐体ポート１０６０と直接連続し得る。環状チャネル１０６２は、中心軸のまわりの全周に沿って環状に延在し得るが、他の実施形態においては、チャネル１０６２は、中心軸Ｘのまわりの全周よりも小さい範囲に延在し得る。
【0104】
図１０Ａに示されるように、各電極１００８は、円周方向Ｃに沿って長細であり得る開口１０６３の単一の列を画定し得る。各列は、図示されるように、開口１０６３の「５ｘ１」（すなわち５行１列）のアレイ又は「開口アレイ」として特徴付けられ得る、５つの開口１０６３を含み得る。他の開口アレイも、本開示の範囲内である。例えば、図１０Ｃに示されるように、各電極１００８の開口１０６３は、スリーブポート１０５７の対応する行及び列並びに筐体ポート１０６０の対応する行及び列と整列させられた、開口１０６３の複数の行及び複数の列を有する開口アレイに配置することができる。開口アレイは、４ｘ５アレイであり得るが、他の開口アレイ構成も本開示の範囲内である。
【0105】
図１０Ｄに示されるように、開口１００８は、真空チャンバ１００６内に引き込まれた組織１０２が、ハイライト領域１０４ａで示された開口１０６３の１つ以上内に少なくとも部分的に延在し得るように構成される。このことは、皮膚層１０４と電極１００８との間の付着力を増大させ、また組織１０２と電極１００６との間の接触表面積を増大させる。更に、皮膚層１０４のような組織１０２を、真空圧をチャンバ１００６内に伝達する１つ以上の開口１０６３内に引き込むことによって、本実施形態の真空カップ１００２は、例えば、中心軸Ｘから離れるように、マウンド１４０の皮膚層１０４を効果的に引き伸ばし、それにより注入物１４２のジェット注入されたストリームが、他の実施形態よりも効率的に組織１０２に浸透することを可能にし得る。例えば、真空ポート１０６０をチャンバ１００６全体に分散させることによって、チャンバ１００６内の真空圧が注入部位の組織から注入物を引き抜く見込みが低くなる。更に、開口１０６３内へと延在する皮膚層１０４の部分は、皮膚層１０４の上部を破壊して、変化させ、それにより、図６Ａ～６Ｄの突出部６６４を参照しながら以上に説明された態様と同様に、組織のマウンド１４０内の電場分布を改善し得る。
【0106】
図１０Ａ～１０Ｄを引き続き参照すると、真空カップ１００２は、個々の開口１０６３内、個々のスリーブポート１０５７内、及び／又は個々の筐体ポート１０６０内の組織の存在及び／又は不在を感知するように構成され得ることは、理解されるべきである。例えば、各電極１００８内の個々の開口１０６３の１つ以上及び最大で全ては、関連する開口１０６３内の組織の存在及び／又は不在を感知することができる個々のセンサを含み得る。かかる組織センサは、非限定的な例として、インピーダンスのような組織の存在／不在を示す電気的パラメータを感知するように構成され得る、別個の電極を含み得る。前述の例の別個の組織感知電極は、電気穿孔電極１００８から電気的に絶縁されていてもよく、又は代替として電気穿孔電極１００８とは別個のチャネル上に存在してもよい。他の実施形態においては、組織センサは、非限定的な例として、組織の直接接触を検出できる力タイプセンサ、又は個々の開口１０６３、スリーブポート１０５７及び若しくは筐体ポート１０６０が封止されたときに検出することができる圧力センサのような、別のタイプのものであり得る。
【0107】
組織センサは、コントローラ１１４と電気的に連通している有線回路又は印刷回路のような回路に接続され得る。例えば、かかる回路は、電極１００８を制御するための回路と同じ印刷回路基板（ＰＣＢ）上の印刷回路であり得る。組織センサは、チャンバ１００６全体の組織付着をマッピングするために利用され得る。かかる組織付着マッピング情報は、データ収集目的のために利用されてもよく、これに加えて又は代替として、各開口におけるセンサ読み取り値に基づいて真空圧のレベルを上方又は下方に調節するための、能動的圧力フィードバック機構において利用され得る。かかる組織付着マッピングの実施形態においては、組織センサ回路は、好ましくは、各組織センサのための個別の回路を含む。組織付着マッピングに対する代替として、組織センサは、集合的に共有回路上にあり得、コントローラ１１４は、最初のベースライン測定値と比較した集合的なセンサ測定値の変化（すなわち全体の「デルタ」）を算出し、チャンバ壁への組織の付着がどの程度生じたかの全体的尺度を提供し得る。
【0108】
以上に説明されたカップ９０２、１００２のようなジェット注入真空カップの追加的な実施形態においては、ノズル９７８の遠位端９７９は、アレイの電極を画定するように適合され得る。かかる実施形態の非限定的な例として、ノズル９７８の遠位端９７９は、導電性塗料、金属若しくはポリマーのような導電性材料で被覆されるか又はこれらから製造されてもよく、コントローラ１１４と電気的に連通し得る。この態様において、ノズル９７８の遠位端９７９は、真空チャンバの内面上の他の電極に及び／又はこれら電極から、電気穿孔パルスを送達するために利用され得る。かかる実施形態においては、他の電極は、図３Ｉ～３Ｌを参照して以上に説明されたもの、及び／又は図１５Ａ～１５Ｃを参照して以下に説明されるもののような、環状リング型電極又は半環状電極であり得る。かかる実施形態は、以下により詳細に議論されるものを含む、同心円状の電気穿孔パルスパターン（「発射パターン」）を可能にする。本発明者らは、ウサギ及びモルモットに流体の皮内ジェット注入を実行し、その後に、注入部位において皮内組織の電気穿孔を実行するために、真空カップ内のかかる同心電極アレイをうまく使用した。
【0109】
上述したように、本発明者らは、以上に説明された真空カップを使用する真空支援電気穿孔処置に起因する、多くの有益な結果を発見した。皮下組織及び皮膚組織における注入物の増大した流体分散、並びに処置部位におけるインビボ流体の増大した浸潤を含む、かかる有益な結果である。
【0110】
ここで図１１Ａを参照すると、注入部位に対する真空圧の効果が見られる。本例においては、同じ皮下深さにおいて同じ注入手法を使用して、２つの部位においてブタ組織に等量のメチレンブルー注入物が注入された。左に示された注入部位は、真空圧にさらされなかった。右に示された注入部位は、約１５ｍｍのベース直径Ｄ１、約１５ｍｍのチャンバ深さＬ２、及び約４度の内壁テーパ角を有する、図２Ａ～２Ｆを参照しながら以上に説明された真空カップ２を使用して、約－１０．６ｐｓｉの真空圧に１５秒間さらされた。いずれの部位も、電気穿孔を用いて処置されなかった。本例においては、真空圧が効果的に流体を再分配し、続いて注入物をカップの下の領域内に保持した。このことは、電気穿孔が実行されていたならば、カップの処置ゾーン内でより高い注入物濃度をもたらしたであろう。
【0111】
ここで図１１Ｂ～１１Ｃを参照すると、流体分散に対する真空圧の比較調査が、モルモットに対して実行された。対象は、ともに脂肪組織へのメチレンブルーの注入を施された。図１１Ｂにおける注入は、図９Ａに図示したものと同様の針なし真空カップを用いて実行された。特に、組織は、ジェット注入の間、真空圧に応答する真空チャンバ内にあった。図１１Ｃにおける注入は、皮下注入針法で実行され、真空圧は加えられなかった。この調査におけるいずれの対象も、電気穿孔を用いて処置されなかった。実証されたように、真空支援ジェット注入（図１１Ｂ）は、真空圧を加えない皮下針注入（図１１Ｃ）よりも、脂肪層中に著しく多い注入物の分散を引き起こした。
【0112】
ここで図３４Ａ～３４Ｂを参照すると、脂肪組織における細胞浸潤に対する電気穿孔及び真空圧の累積効果の比較調査が、モルモットに対して実行された。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子をエンコードするプラスミドが、２９ゲージのインスリン注射器を使用して肩甲骨間脂肪パッドへの皮下注入を介して、脂肪組織に注入された。両方の対象の注入部位が、同じ真空圧で処置された。図３４Ｂにおける対象は更に、図２Ａに示されたものと同様の真空カップを使用して、注入部位における電気穿孔を介して処置された。図３４Ａにおける対象は、電気穿孔を介して処置されなかった。ＧＦＰ発現（緑色蛍光として見える）及び細胞浸潤（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色後の青色蛍光として見える）の比較のために、処置部位において組織学的切片が採取された。図示されるように、ＧＦＰの発現（緑色）は、いずれの対象においても（すなわち処置部位が電気穿孔されたか否かにかかわらず）、真空圧後に検出可能である。しかしながら、真空圧のみを加えたもの（図３４Ａ）と比較して、真空圧と組み合わせた電気穿孔の更なる更適用（図３４Ｂ）が、細胞浸潤（青色）を増大させた。これらの調査は、電気穿孔と組み合わせて真空圧を加えることが、免疫原性を増強し得ることを実証している。
【0113】
ここで図１２を参照すると、対象のモルモットの体液性免疫応答を比較する１２週間のＥＬＩＳＡ調査にわたって、図２Ａに示された真空カップ２を用いて処置された対象（青色のプロット－「真空」）は、１２週間の調査にわたって、キャリパー型電気穿孔装置を用いて処置した対象（赤色のプロット－「キャリパー」）よりも、増大した体液性免疫原性を示したことを、試験データが示している。いずれのグループの対象も、脂肪層に針注入を介して等量のｐＧＸ２０１３（インフルエンザウイルス核タンパク質（ＮＰ）に対するＤＮＡワクチン）を注入され、電気穿孔を用いて処置された。
【0114】
ここで図１３を参照すると、対象モルモットの体液性免疫応答を比較する８週間のＥＬＩＳＡ調査にわたって、脂肪組織へのｐＧＸ２３０３（ヒト呼吸器合胞体ウイルス融合糖タンパク質（ＲＳＶ－Ｆ）に対するＤＮＡワクチン）の注入及び図２Ａに示された真空カップ２を使用した電気穿孔を処置された対象（青色のプロット－「真空」）は、該ワクチンの皮内注入及び皮内針電極電気穿孔装置（赤色のプロット－「ＩＤ針電極ＥＰ」）を使用した電気穿孔を処置された対象と、同等の体液性免疫原性を示した。注入は等量（２０ｕｇ）であった。皮内注入は１００ｕＬであり、脂肪注入は３００ｕＬであった。真空カップ２は、４つの電極を有する１５ｍｍのチャンバ直径Ｄ１を有するものであった。
【0115】
ここで図１４Ａ～１４Ｂを参照すると、６週間の調査は、インフルエンザ核タンパク質に対するＤＮＡワクチン（ｐＧＸ２０１３）を用いた処置（０、２及び４週目）後の、モルモットの体液性免疫原性データを比較している。図１４Ａは、ＥＬＩＳＡデータを示し、図１４Ｂは、同じ調査からのＥＬＩＳｐｏｔデータを示す。グラフにおいて、以下のグループが表されている。（１）「ＩＤ針電極ＥＰ」（赤色のプロット）－８ｕｇのマントゥー注入に続いて、皮内針電極電気穿孔装置を用いた皮内電気穿孔、（２）「真空ジェット＋ＥＰ」（青色のプロット）－脂肪組織への４０ｕｇジェット注入に続いて、図９Ａに示されたものと同様の装置を使用した真空支援電気穿孔、（３）「真空針」（緑色のプロット）－脂肪組織への４０ｕｇの皮下注入に続いて、図２Ａに示された装置を使用して、電気穿孔を行わずに、負の真空圧を加える、及び（４）「真空針＋ＥＰ」（紫色のプロット）－脂肪組織への４０ｕｇ皮下注入に続いて、図２Ａに示された装置を使用した真空支援電気穿孔。
【0116】
これらの調査は、本明細書に記載の針注入、真空電気穿孔装置２及びジェット注入、真空電気穿孔装置９０２が、脂肪組織を処置するときに、皮内針電極電気穿孔装置を用いた処置によって生成される体液性応答に相当する体液性免疫応答を生成することを実証している。
【0117】
図１５Ａ～２２を参照しながら、皮膚層１０４における電気穿孔を標的とするように構成された真空カップが、ここで説明される。
【0118】
ここで図１５Ａ～１５Ｂを参照すると、１つ以上の環状リング電極１５０８及び真空カップ１５０２の中心軸Ｘに沿って延在する中心電極１５１１を有する電極アレイ１５０９を含む、真空カップ１５０２の例が示されている。本実施形態の真空カップ１５０２は、以上に説明された真空カップ２、５０２、７０２、８０２、９０２、１００２、特に図９Ａ～９Ｂを参照しながら以上に説明された真空カップ９０２と同様である。したがって、以上に使用されたような同様の参照番号は、本実施形態における共通の特徴を示す。簡潔さのため、以下の説明は、本実施形態の真空カップ１５０２と以上に説明された真空カップ９０２との相違点に焦点を当てる。
【0119】
本実施形態の真空カップ１５０２は、真空チャンバ１５０６を少なくとも部分的に画定する内面１５２２を画定する、筐体本体１５２６を有する。筐体本体１５２６はまた、中心軸Ｘに沿って真空チャンバ１５０６から近位に延在する第３のポート１５１６を画定する。中心電極１５１１は、第３のポート１５１６を通って、内面１５２２の端面部分から真空チャンバ１５０６内へと延在する。第３のポート１５１６はまた、中心電極１５１１との封止係合を提供するための装着形成部１５４８を通って延在する。以上に説明された態様と同様に、装着形成部１５４８は、中心電極１５１１の外面１５１３に封止係合する、封止Ｏリング１５５１のような、１つ以上の封止部材を担持し得る。中心電極１５１１の外面１５１３の遠位部分１５１３ｚは、真空チャンバ１５０６に引き込まれた組織１０２に接触するように構成される。したがって、遠位部分１５１３ｚは、中心電極１５１１の「接触面」１５１３ｚと称され得る。接触面１５１３ｚは、０．５ｍｍ～約１０ｍｍの範囲内、より詳細には約１ｍｍ～約７ｍｍの範囲内、より詳細には約１ｍｍ～約４ｍｍの範囲内の半径Ｒ１を有する、半球形プロファイルのような、丸いプロファイルを有し得る。真空カップ１５０２の中心軸Ｘは、好ましくは、接触面１５１３ｚの頂点を通って延在する。中心電極１５１１は、近位部分１５１８を有し、この近位部分は、封止Ｏリング１５５１と接触する中心電極１５１１の部分よりも狭くなり得る。したがって、近位部分１５１８は、中心電極１５１１の「ステム」と称され得る。
【0120】
ここで図１５Ｃを参照すると、電極アレイ１５０９は、電気穿孔パルス送達の間に、中心電極１５１１が正又は負の電極として機能する一方、環状リング電極１５０８の一方又は両方が正又は負の電極の他方（すなわち中心電極１５１１の反対極性）として機能するように構成される。このようにして、中心電極１５１１は、パルスの間の電場１４５を効果的に上方に移動させ、皮膚層１０４に電気穿孔場１４４を集中させる。本実施形態の真空カップ１５０２は、例えば、マントゥー注入のような針注入、又は皮内ジェット注入などを介して、薬剤が皮膚層１０４に注入された後に、標的ゾーンにおいて組織１０２上に置かれ得る。他の実施形態においては、真空カップ１５０２は、中心電極１５１１の代わりに特徴部又は「ポスト」を利用し得ることは、理解されるべきである。ポストは、真空チャンバ１５０６内の表面１５１３ｚに類似する形状の表面を呈し得る。ポスト表面は、真空圧を介してチャンバ１５０６内に引き込まれた皮膚に接触するように構成される。例えば、ポストは、真空圧を加えている間に、組織をポスト表面の一部のまわりに適合させるか、又はそのまわりに湾曲させるように構成され得る。かかる組織－ポスト接触は、図４２Ａ及び４２Ｄを参照しながら以下により詳細に議論されるように、真空圧を加えている間に、組織内の流体分散を有利に増強することが示されている。
【0121】
ここで図１６Ａを参照すると、各々がその遠位開口１６２０の反対側の真空チャンバ１６０６内の端面１６２４上に位置付けられた電極アレイ１６０９を有する真空カップ１６０２を含む、真空電気穿孔アセンブリ１６００のバージョンが示されている。端面１６２４は、実質的に平坦であり得、チャンバ１６０６内に位置付けられた電極支持部材１６５２によって画定され得る。支持部材１６５２は、「挿入物」と称され得、アレイ１６０９の電極１６０８を担持し得る。例えば、支持部材１６５２は、上述のコントローラ１１４のような制御ユニットと電気的に連通する回路を有する、印刷回路基板（ＰＣＢ）のような回路基板であり得る。支持部材１６５２はまた、真空チャンバ１６０６と真空源への接続の外部ポート１６１６との間の流体連通を提供する、該部材を通って延在する複数のポート１６６０を画定している。このようにして、支持部材１６５２におけるポート１６６０は、真空圧をチャンバ１６０６内に伝達し、組織１０２をそこに引き込み、電極１６０８に接触させる。電極１６０８は、組織のマウンド１４０の皮膚層１０４に押し込んでチャンバ１６０６内に引き込み、それにより皮膚１０４の最上層を破壊して、変化させ、以上に説明されたように、その中の電場分布を改善するための、円錐、ピラミッド型など、突出する及び／又は先端を持つ幾何学的形状を有し得る。
【0122】
真空電気穿孔アセンブリ１６００は、以上に説明されたジェット注入装置９７０のような針なし注入装置のような注入装置を受容するように構成され得る。したがって、真空カップ１６０２は、そのノズル９７８が支持部材１６５２に画定された注入開口１６１７と整列させられるように、ジェット注入装置９７０の少なくとも遠位部分を受容するためのレセプタクル１６１６を画定し得る、筐体本体１６２６を有する。図示されるように、ノズル９７８及び注入開口は、真空カップ１６０２の中心軸と同心に整列させられ得る。
【0123】
筐体本体１６２６はまた、支持部材１６５２が真空チャンバ１６０６とスタンドオフチャンバ１６０７との間を分離する又はこれらの間に介在するように、真空チャンバ１６０６からオフセットされた二次又は「スタンドオフ」チャンバ１６０７も画定し得る。スタンドオフチャンバ１６０７は、注入物１４２の皮内分散の目的のため、ノズル９７８と組織１０２との間に注入物１４２のストリームの好適な形成を可能にするために、ノズル９７８の遠位端と端面１６２４との間にスタンドオフ距離Ｌ５をもたらすように構成される。特に、スタンドオフ距離Ｌ５は、液体ストリームが皮膚１０４に接近する際に、液体ストリームに不規則性を形成することを可能にし得る。例えば、かかる不規則性は、数百、数千、又は更に多数のマイクロ及び／又はナノサイズの液滴を含み得、その各々が、皮膚１０４の外面１０１における数百又は数千のマイクロ及び／又はナノサイズの切れ目に対してストリームを効果的に可能にするのに十分な速度で皮膚１０４に近づき、皮膚層１０４に局所化された増強された注入物拡散を提供する。スタンドオフ距離Ｌ５は、ジェット注入器のノズル形状及び注入器の力のような他の因子と組み合わせて、注入物の最大浸透深さを制御する手段としても使用できる。スタンドオフ距離Ｌ５はまた、使用の間に、ノズル９７８の遠位端と皮膚１０４の外面１０１との間の最小スタンドオフ距離として特徴付けられ得ることは、理解されるべきである。スタンドオフ距離Ｌ５は、約１．０ｍｍ～約２０ｍｍの範囲内であり得る。
【0124】
図１６Ｂに示されるように、筐体本体１６２６は、スタンドオフチャンバ１６０７を通って延在し、シールド１６８５の挿管が支持部材１６５２の注入開口１６１７と流体連通するように、支持部材１６５２の後面１６２５に当接し得る、挿管シールド１６８５を任意選択的に画定し得る。このようにして、挿管されたシールド１６８５は、ノズル９７８の遠位端から真空チャンバ１６０６までの直線状の整列されたシールドされた通路を提供することができ、それにより、支持部材１６５２（及びその回路）を注入物のストリームに対する不慮の露出から保護する。
【0125】
ここで図１７Ａ～１７Ｂを参照すると、電極１６０８及びポート１６６０が注入開口１６１７のまわりに異なるパターンで配置されている、支持部材１６５２の異なる実施形態が示されている。図１７Ａに示されるように、電極１６０８は、中心軸Ｘと同心の円周軸Ｃ２に沿って円形の又はリング状のパターンで配列され得る。電極１６０８は、単一の同心リングに配列されるか、又は図１７Ｂに示されるように、中心軸Ｘと同心の又は代替として中心軸Ｘに対して偏心したものであり得る、複数のリングに配列され得る。引き続き図１７Ｂを参照すると、ポート１６６０はまた、中心軸Ｘのまわりの１つ以上の環状リングに配列され得る。更に、電極１６０８及び／又はポート１６６０はまた（又は代替として）、中心軸Ｘから径方向外側に延在するそれぞれの軸Ｒ４、Ｒ５に沿って、スポーク状のパターンで配列することもできる。隣接する電極１６０８「スポーク」、及び隣接するポート１６６０スポークのそれぞれの軸Ｒ４、Ｒ５は、中心軸のまわりにそれぞれの角度間隔Ａ５、Ａ６で互いからオフセットされ得、この角度間隔は、約５度～約１８０度、より詳細には約１５度～約１２０度の範囲であり得る。軸Ｒ４、Ｒ５は、図示されるように直線状であり得るが、他の実施形態においては、軸Ｒ４、Ｒ５は円弧状であり得る。電極１６０８及びポート１６６０のパターンの例は、非限定的な例として提供されるものであり、非対称及び／又は不規則なパターンを含む他のパターンも本開示の範囲内にあることは、理解されるべきである。
【0126】
ここで図１８Ａ～１８Ｂを参照すると、更なる実施形態において、真空電気穿孔装置１８０２は中の組織、特に皮膚を誘導するための複数の遠位真空チャンバ１８０７を含み得る。電極１８０８は、電極支持部材１８５２によって担持され、該部材は、主真空チャンバ１８０６を画定する真空筐体本体１８２６の遠位端１８１０に取り付けることができる。このようにして、支持部材１８５２の遠位端面１８２４は、装置１８０２の遠位端を画定する。筐体本体１８２６は、主真空チャンバ１８０６に真空圧を提供するための主真空ポート１８１２を画定し、主真空チャンバ１８０６内及び支持部材１８５２に延在する回路のためのアクセスを提供するためのもののような、第２のポート１８１４を画定し得る。
【0127】
ここで図１８Ｂを参照すると、本実施形態の電極１８０８は対に配置され、その各々は、互いに対して同心に位置する外側リング電極１８０８ａ及び内側リング電極１８０８ｂを含む。外側及び内側リング電極１８０８ａ、ｂは、長手方向Ｌに沿って長細く、支持部材１８５２を通ってその後面１８２５まで延在し、任意選択的に更に主真空チャンバ１８０６内まで延在する、管状部材であり得る。各対の外側及び内側リング電極１８０８ａ、ｂは、材料の電気絶縁性の環状層１８９４によって互いから径方向に離隔され、それにより内側及び外側リング電極１８０８ａ、ｂを互いから電気的に絶縁する。各同心の電極対において、外側リング電極１８０８ａは、支持部材１８５２の遠位端面１８２４まで延在し、一方で、内側リング電極１８０８ｂは、遠位端面１８２４から近位で凹状になっている。このようにして、遠位真空チャンバ１８０７は、外側リング電極１８０８ａの内側表面１８０８ｚ、内側リング電極１８０８ｂの遠位端、及び絶縁層１８９４の遠位端面、更には任意選択的に外側リング電極１８０８ａの任意の遠位引き込み表面１８０８ｙによって、協働的に画定される。
【0128】
図１８Ｃ～１８Ｄに示されるように、内側リング電極１８０８ｂの遠位端（及び任意選択的に絶縁層１８９４の遠位端も）は、遠位表面１８２４からオフセット距離Ｌ６で凹状であり得、これは約０．０５ｍｍ～約５．０ｍｍの範囲内、より詳細には約０．５ｍｍ～約２．０ｍｍの範囲内、好ましくは約０．８ｍｍ～約１．２ｍｍの範囲内であり得る。装置は、長手方向Ｌに沿って近位端１８２８から遠位端面１８２４まで測定される装置長Ｌ７を画定し得る。装置長Ｌ７は、約１５．０ｍｍ～約２００ｍｍの範囲内、より詳細には約２０ｍｍ～約４０ｍｍの範囲内であり得るが、１５．０ｍｍより小さい及び２００ｍｍより大きい長さＬ７も、本実施形態の範囲内である。
【0129】
上述したように、内側リング電極１８０８ｂは、特に、主真空チャンバ１８０６との流体連通を提供するポート１８６０を画定する態様で、管状であり得る。この態様においては、主真空チャンバ１８０６に加えられる真空圧は、内側リング電極１８０８ｂを通して遠位真空チャンバ１８０７に伝達され、それにより、装置１８０２が皮膚層１０４の一部を遠位真空チャンバ１８０７に引き込み、内側及び外側リング電極１８０８ａ、ｂと接触させることを可能にする。皮膚層１０４のかかる変形は、その上部を破壊し変化させることができ、したがって、以上に説明された態様と同様に、皮膚層１０４内の電場分布を改善することができる。
【0130】
各対の内側及び外側リング電極１８０８ａ、ｂは、好ましくは反対の極性のものであり、かかる電気穿孔パルスは、リング電極１８０８ａ、ｂの一方から、組織を通って、対のリング電極１８０８ａ、ｂの他方に送達される。
【0131】
図１８に示されるように、電極アレイ１８０９は、中心電極対１８０８ａ、ｂと、中心電極対１８０８ａ、ｂのまわりに同心に円周軸Ｃ２に沿って配置された周縁電極対１８０８ａ、ｂの円形パターンとを含む、円形アレイであり得る。他のアレイパターンも本実施形態の範囲内であることは、理解されるべきである。周縁部の隣接する電極対１８０８ａ、ｂは、以上に説明された態様と同様に、それぞれの角度間隔Ａ５で互いに離隔され得る。
【0132】
ここで図１９Ａ～１９Ｂを参照すると、更なる実施形態において、真空電気穿孔装置１９０２は、上述した実施形態の装置１８０２と同様に、筐体本体１９２６の遠位端１９１０において電極支持部材１９５２を含み得る。本実施形態において、各電極１９０８は管状であり、支持部材１９２４を通ってその遠位端面１９２４からその後面１９２５まで延在し、それにより、筐体本体１９２６の真空チャンバ１９０６と流体連通しているポート１９６０を画定している。電極１９０８のポート１９６０は、皮膚層１０４の外側部分が真空チャンバ１９０６内の真空圧に応答してポート１９６０内へと延在し得るようなサイズとされる。本実施形態の各電極１９０８は、電気パルスの間、単極性（正又は負）である。電極１９０８は、電気パルスの間、電極１９０８の１つ以上が一方の極性（正又は負）であり、電極１９０８の他の１つ以上が反対の極性となるように、電気穿孔信号を送達することができる回路に接続される。例えば、図１９Ａ～１９Ｂを引き続き参照すると、電極１９０８は、中心電極１９０８と、中心電極１９０８のまわりに同心円状に配置された周縁電極１９０８の円形パターンとを含む、円形電極アレイ１９０８に配置することができる。電気穿孔パルスの１つ以上及び最大で各々は、中心電極１９０８と周縁電極１９０８の少なくとも１つとの間で送達することができる。電気穿孔信号は、以上に説明された態様と同様に、電極１９０８の分散型パターンを利用したシーケンスで送達される複数の電気穿孔パルスを含み得る。
【0133】
ここで図２０及び２１Ａ～２１Ｂを参照すると、電極支持部材２０５２、２１５２は、非円形のパターンを有する電極アレイ２００９、２１０９を担持することができる。図２０に示されるように、支持部材２０５２は、互いに実質的に垂直である第１及び第２のアレイ方向ＡＤ１、ＡＤ２に沿って実質的に等距離である、正方形の電極アレイ２００９を有し得る。図示された実施形態においては、アレイ２００９は４ｘ４アレイパターンを有するが、非限定的な例として、２ｘ２、３ｘ３、５ｘ５、６ｘ６、７ｘ７、８ｘ８、９ｘ９、１０ｘ１０などを含む、他の正方形アレイパターンも本開示の範囲内である。
【0134】
図２１Ａ～２１Ｂに示されるように、支持部材２１５２は、第２のアレイ方向ＡＤ２に沿ってよりも第１のアレイ方向ＡＤ１に沿って長い、長方形の電極アレイ２１０９を有し得る。アレイ２１０９は、例えば、２ｘ６（すなわち２行６列）のアレイ２１０９におけるように、電極の第１の列及び電極の対応する第２の列を含み得るが、非限定的な例として、１ｘ２、１ｘ３、１ｘ４、２ｘ３、２ｘ４、２ｘ５、２ｘ７、２ｘ８、２ｘ９、２ｘ１０、３ｘ４、３ｘ５、３ｘ６、３ｘ７、３ｘ８、３ｘ９、３ｘ１０、４ｘ５、４ｘ６、４ｘ７、４、８、４ｘ９、４ｘ１０、５ｘ６、５ｘ７、５、８、５ｘ９、５ｘ１０の電極アレイ２１０９を含む、他の長方形アレイ２１０９パターンも、本開示の範囲内である。
【0135】
以上に説明された正方形及び長方形の電極アレイ２００９、２１０９は、それぞれのパターンに配置された実質的に任意の数の電極２００８、２１０８を有し得ることは、理解されるべきである。かかる正方形及び長方形の電極アレイ２００９、２１０９は、行又は列方向に活性化され得る概ね長方形の電場を生成し、所与の軸に沿って高度に順序付けられた電場を可能にし得る。例えば、注入物が組織の１つの軸方向に沿って意図的に注入されるか、又はたまたま蓄積される場合、電極２００８、２１０８の追加的な行又は列が、所望の組織体積を処置するために容易に活性化され得る。この点に関し、これらの電極アレイ２００９、２１０９は、モジュール式の活性化機能を提供すると特徴付けられ得る。これに加えて、長方形の電極アレイ２１０９は、第１のアレイ方向ＡＤ１（これに沿ってアレイは長細い）が、流体が意図的に注入された軸、又は繊維組織のような異方性の特徴の存在により流体が自然に分散させられる軸と実質的に整列するように、標的ゾーン上の皮膚１０４の上に置かれ、それにより、注入物が組織を通して分散するときに、より長い継続時間の間、注入物を電気穿孔場内にカプセル化し得る。更に、アレイ２１０９はまた、真空圧を加えている間に皮膚１０４の最上層を破壊する真空ポートのアレイを画定するため、長方形のアレイ２１０９はまた、更に電気穿孔場に沿って分散する注入物を流す皮内組織内の破壊経路も効果的に形成することができる。
【0136】
ここで図２２を参照すると、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子をエンコードする様々な体積のプラスミドを皮内注入し、その後に様々な装置を用いて電気穿孔処置を行った後の、モルモット皮膚における遺伝子発現が示されている。この調査においては、１００ｕＬ、３００ｕＬ、５００ｕＬ及び９００ｕＬの注入量において、本明細書に記載の真空カップ２、９０２を使用した皮内組織の真空支援電気穿孔が、注入量に比例した態様で遺伝子発現を有意に増大させた。同様の調査において、本発明者らは、ＧＦＰの遺伝子発現もまた、真空圧の増大とともに増大することを見出した。一方、皮内針電極電気穿孔装置を使用した遺伝子発現は、注入量の増大に伴って増強されなかった。更に、真空を加えること又は電気穿孔のない、増大した注入量だけでは、遺伝子発現を増強しなかった。これらの調査は、真空圧及び注入量が遺伝子発現に影響を与えることを実証している。
【0137】
ここで図３５Ａ～３５Ｂを参照すると、６週間の調査が、真空支援電気穿孔装置を使用して、所定の電気穿孔電圧及び電流における、モルモット皮膚における免疫原性に対するチャンバ直径Ｄ１の影響を評価している。図３５Ａは、８ｍｍ、１０ｍｍ、１２ｍｍ及び１５ｍｍのチャンバ直径Ｄ１を有する真空カップを使用する皮内真空支援電気穿孔処置後の、体液性免疫原性ＥＬＩＳＡデータを比較している。各真空カップについての皮内処置は、ＭＥＲＳ ＤＮＡワクチンの５０ｕｇのマントゥー注入、並びに後続する同じ電圧及び電流を使用した電気穿孔を含むものであった。図３５Ｂは、図３５Ａに示された同じ調査の間の２及び４週目における細胞性免疫応答ＥＬＩＳｐｏｔデータを示す。この調査は、所与の電気穿孔電圧及び電流の限界における、体液性免疫応答と真空カップ直径との間の、直接的な逆相関を実証している。細胞性免疫応答の観点から、この調査はまた、８ｍｍ～１２ｍｍのチャンバ直径Ｄ１を有する真空カップが同様の結果をもたらし、直径Ｄ１が１２ｍｍから１５ｍｍまで増大したときに細胞応答の減少が起こることを実証している。
【0138】
ここで図３６Ａ～３６Ｂを参照すると、調査が、モルモット皮膚における遺伝子発現に対する、真空圧及び電気穿孔電圧パラメータの好適な組み合わせを評価している。これらの調査は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子をエンコードするプラスミドの皮内注入（具体的にはマントゥー注入）を利用し、次いで、以上に説明されたカップ２と同様の真空カップを使用して、様々な真空圧及び電圧で電気穿孔処置を実行した。０ｋＰａ（真空なし）、４０ｋＰａ及び７０ｋＰａの真空圧、並びに０Ｖ（電圧なし）、５０Ｖ、１００Ｖ及び２００Ｖの電圧が、皮膚に加えられた。処置後３日目に、処置部位の反応及びＧＦＰの発現が観察された。図３６Ａは、様々な真空圧及び電圧における処置部位の視覚的な観察結果を示す。図３６Ｂにおいては、皮膚蛍光信号の測定値が、様々な電圧及び真空圧についてプロットされている。これらの調査は、真空圧と電圧とが独立してＧＦＰ発現を増大させることを実証している。これらの調査はまた、試験した各電圧において、より高い真空圧がＧＦＰの発現を増強したことを実証している。
【0139】
ここで図２３を参照すると、８週間の調査が、ＨＰＶ ＤＮＡワクチンの皮内処置に続いて電気穿孔を行った後の、モルモットの体液性免疫原性ＥＬＩＳＡデータを比較している。以下のグループが表されている。（１）「ＩＤ針電極ＥＰ」（黒色のプロット）－６６．７ｕｇのプラスミドの１００ｕＬのマントゥー注入後の皮内針電極電気穿孔装置を使用した処置、（２）「真空カップ」（赤色のプロット）－１３９Ｕ／ｍｌのＨｙｌｅｎｅｘも用いて調製された６６．７ｕｇの相当量のプラスミドを１ｍＬ注入した後に、４つの壁電極からなる１５ｍｍの真空カップ電気穿孔装置を使用した処置（例えば図２Ａ参照）、（３）「真空カップ３倍投与」（栗色のプロット）－「真空カップ」グループと同じ装置及び方法を用いた処置であるが、投与量は前述のグループの３倍、すなわち２００ｕｇのプラスミドに増大された。全てのグループは０、４及び７週目に処置された。
【0140】
ここで図２４Ａを参照すると、１１週間の調査が、ＨＰＶ ＤＮＡワクチン（ｐＧＸ３００１＆３００２）の皮内処置に続いて電気穿孔を行った後の、非ヒト霊長類における体液性免疫原性ＥＬＩＳＡデータを比較している。以下のグループが表されている。（１）「ＩＤ針電極ＥＰ」（黒色のプロット）－皮内針電極電気穿孔装置を使用した処置、（２）「真空カップ」（赤色のプロット）－「ＩＤ針電極ＥＰ」と同等の用量を注入した後に図２Ａに示された真空カップを使用した処置、（３）「真空カップ６倍投与」（茶色のプロット）－「真空カップ」グループと同じ装置及び方法を用いた処置であるが、用量は前述のグループの６倍まで増大させられた処置。全てのグループは、０、４及び９週目に処置された。ここで図２４Ｂ～図２４Ｄを参照すると、図２４Ａに示された同じ調査の２、６及び１１週目における細胞性免疫応答ＥＬＩＳｐｏｔデータが、各グループについてそれぞれ示されている。これらの調査は、大きな用量の真空支援電気穿孔処置（グループ３）が、ＩＤ針電極ＥＰ装置（グループ１）よりも迅速な体液及び細胞応答を生じ、一方で、同等の用量において、真空支援電気穿孔処置（グループ２）は、ＩＤ針電極ＥＰ装置（グループ１）と概して同様の性能を示したことを実証している。更に、大きな用量の真空支援電気穿孔処置（グループ３）は、１１週目に、ＩＤ針電極ＥＰ装置（グループ１）の約１０倍（１０ｘ）大きい細胞応答を生じた。
【0141】
ここで図３７Ａ～図３７Ｂを参照すると、６週間の調査が、真空支援電気穿孔装置の性能を、免疫原性の観点から皮内針電極電気穿孔装置と比較している。図３７Ａは、５０ｕｇのＭＥＲＳ ＤＮＡワクチンをマントゥー注入で皮内処置した後に電気穿孔を行った後の、モルモットの体液性免疫原性ＥＬＩＳＡデータを比較している。グラフで表されるグループは、以下の通りである。（１）「ＩＤ－ＶＥＰ」－図２Ａに示したものと同様の真空カップを使用した処置及び（２）「ＩＤ－ＥＰ」－皮内針電極電気穿孔装置を使用した処置。両方のグループとも、０、２及び４週目に処置された。この調査は、真空カップが、皮内針電極電気穿孔装置と比較して、より迅速で強い体液性応答を生成することを実証している。図３７Ｂは、図３７Ａに示された同じ調査の間の２及び４週目における細胞性免疫応答データを示す。
【0142】
図３８は、マントゥー注入に続いて電気穿孔を介した１００ｕｇの再発性呼吸器乳頭腫症（ＲＲＰ）ＤＮＡワクチンの皮内処置後の、モルモットの細胞性免疫応答データを比較する、６週間の調査を示す。図３８に表されるグループは、以下を含む。（１）「ＩＤ－ＥＰ」皮内針電極電気穿孔装置を使用した処置及び（２）「ＩＤ－ＶＥＰ」－図２Ａに示されたものと同様の真空カップを使用する処置。
【0143】
図３７Ｂ及び３８に示される調査は、真空カップが、皮内針電極電気穿孔装置と比較して、実質的に同等の細胞性免疫応答を生成することを実証している。これに加えて、図３７Ａ～３８に示される調査の間、処置後７～１０日以内には、真空カップ処置部位に目に見える組織損傷がないことが観察された。
【0144】
ここで図３９Ａ～３９Ｂを参照すると、４週間の調査が、皮膚における免疫原性に対する真空圧及び電気穿孔の累積効果を評価している。この調査は、マントゥー注入による５０ｕｇのＭＥＲＳ ＤＮＡワクチンの皮内処置後の、モルモットにおける体液性及び細胞性免疫応答を比較している。図３９Ａは、以下のグループについての０、２及び４週目の体液性免疫原性ＥＬＩＳＡデータを示す。（１）「ＩＤ－ＶＥＰ」－図２Ａにおいて示されたものと同様の真空カップを使用した真空支援電気穿孔処置、（２）「ＩＤ－真空」－真空カップを使用した真空パルス非電気穿孔処置、及び（３）「ＩＤ」－マントゥー注入のみ。図３９Ｂは、図３９Ａに示された同じ調査の４週目における細胞性免疫応答ＥＬＩＳｐｏｔデータを示す。これらの調査は、電気穿孔は、真空圧が免疫原性を引き起こすのに必須であるが、マントゥー注入の後、真空圧のみ（すなわち電気穿孔なし）で、少なくとも部分的な体液性応答を生成し得ることを実証している。本発明者らは、これらの調査はまた、前述の免疫応答が、ＤＮＡワクチンの表面トランスフェクションによっては部分的にしか説明されないことを示唆していると考えている。更なる調査は、電気穿孔電圧が、免疫原性に関して真空圧よりも強い推進力であることを確認した。
【0145】
ここで図４０Ａ～４０Ｂを参照すると、真空チャンバに引き込まれた組織のマウンド内の２つの異なる電極アレイの例によって生成される比較電場の断面図が示されている。図４０Ａは、図２Ａに示された真空カップ２のものと同様に構成された一対の対向電極を有する電極アレイによって生成される電場を示す。対向電極８間の電気穿孔パルス送達パターン（「発射パターン」とも称される）が、組織のマウンド１４０を横切って横方向に電流を電極間で移動させる。図４０Ｂは、図１５Ａに示された真空カップ１５０２のものと同様に構成された２つの環状リング電極及び中心電極を有する電極アレイによって生成される電場を示す。本例における電気穿孔パルス発射パターンは、電流を環状リング電極と中心電極との間で同心円状に移動させ、それにより中心電極に隣接する皮膚層１０４に電場を集中させる。かくして、図４０Ａ～４０Ｂは、対向する電極間の電気穿孔パルス発射パターン（図４０Ａ）が、環状リング電極と中心電極との間に生じる電場（図４０Ｂ）と比較して、皮膚層１０４を通してより均質な電場を生じることを実証している。電場生成におけるこれらの違いは、所望される特定の電気穿孔処置に基づいて有利に利用され得る。
【0146】
ここで図４１Ａ～４１Ｂを参照すると、８週間の調査が、電気穿孔パルス発射パターンの免疫原性への影響を評価している。この調査においては、モルモットの体液性及び細胞性免疫応答が、マントゥー注入によるＭＥＲＳ ＤＮＡワクチンの皮内処置、及びその後の図４０Ａ～４０Ｂに示される電極アレイを有する真空カップを使用した真空支援電気穿孔の後に試験された。図４１Ａは、両方のアレイ構成について、０、２、４及び８週目における体液性免疫原性ＥＬＩＳＡデータを示す。両方のグループとも、０、２及び４週目に処置された。図４１Ｂは、図４１Ａに示された同じ調査の間の４週目及び４週目より後の細胞性免疫応答ＥＬＩＳｐｏｔデータをチャートで示す。この調査は、体液性応答の観点からはアレイ構成が同様の性能を示す一方、細胞応答の観点からは同心円アレイが対向アレイを有意に上回ったことを実証している。
【0147】
ここで図４２Ａ～４２Ｄを参照すると、調査が、中心電極がモルモット皮膚における流体分散に及ぼす比較効果を評価している。着色された注入物の流体分散は、以下の３つのグループについて測定された。（１）マントゥー注入のみ（すなわち真空圧なし）、（２）中心電極を有さない対向電極を有するアレイ（図４０Ａ参照）、及び（３）中心電極を有するアレイ（図４０Ｂ参照）。等量の注入物が、マントゥー注入を介して各グループに注入された。グループ２及び３には、真空圧が加えられた。この調査においては、電気穿孔は実行されなかった。図４２Ｂ、４２Ｃ及び４２Ｄは、それぞれグループ１、２及び３についての組織内の流体分散を示す。結果は、着色された注入物の視覚的アスペクト比に従って、図４２Ａにチャートで示されている。この結果は、中心電極又は特徴の存在が、真空圧を加えているときに注入物の流体分散に影響を与え得ることを実証している。これらの結果は、真空チャンバの内部形状が、真空圧を加えているときに流体分散に影響を及ぼし得ることを、更に示唆している。
【0148】
以上に説明された皮内真空電気穿孔アセンブリ、装置及びカップは、真空支援電気穿孔処置を増強するための様々な製剤とともに利用できることは、理解されるべきである。例えば、注入物１４２は、好適な態様で薬剤の特性に影響を与えるための製剤との混合物を含み得る。かかる製剤の非限定的な例は、ヒアルロニダーゼ及びＨｙｌｅｎｅｘ（ヒト組換えヒアルロニダーゼ）を含み、これらは、薬剤マトリックスを一時的に分解し、皮膚において小さく痛みの少ない塊又は少ない出血しか伴わない、より多い薬剤量での注入を可能にすることができる。図２５～２６に示されるように、ヒアルロニダーゼを含むマントゥー注入は、ヒアルロニダーゼを含まない注入よりも、高さ及び直径のいずれも小さい出血しか生じない（左図）。ヒアルロニダーゼ製剤は、「Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎａｓｅ ａｎｄ／ｏｒ Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎ Ａｇｅｎｔ」（「’２６３文献」）と題された２０１９年９月１９日に公開された米国特許公開第２０１９／０２８４２６３Ａ１号に、より完全に記載されており、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれたものとする。本明細書に開示される真空電気穿孔装置を用いて実行される注入においてヒアルロニダーゼを利用することによって、薬剤は、皮内組織においてより大きな体積で注入されることができ、医師が、より大きな処置ゾーン１０７を有する本明細書の装置を用いて、より大きな組織体積を処置することを可能にする。例えば、本発明者らは、様々なチャンバ直径Ｄ１（例えば８ｍｍ、１０ｍｍ及び１２ｍｍ）を有する真空カップを、ヒアルロニダーゼを含む製剤（すなわち５０％のＯｍｎｉｐａｑｕｅ３５０＋５０％の１５０Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（最終的に７５Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ））を有する注入物１４２と組み合わせて使用する多数の試験を通して、８ｍｍの直径の真空カップは、実質的に全ての注入物が真空チャンバに引き込まれた状態で０．２ｍＬの注入物体積に対応し得ること；１０ｍｍの直径の真空カップは、実質的に全ての注入物が真空チャンバに引き込まれた状態で約０．４ｍＬ量の注入物に対応し得ること；及び１２ｍｍの直径の真空カップは、実質的に全ての注入物が真空チャンバに引き込まれた状態で０．８ｍＬの注入物に対応し得ること、を発見した。注入物の製剤におけるヒアルロニダーゼの存在は、注入物の皮膚層内での流体分散を劇的に促進することが観察された。これらの試験から得られたデータは、注入物の量が多いほど注入物の製剤内にヒアルロニダーゼを利用すべきであり、そうでなければ注入ブレブが大きくなり、皮膚を通して横方向に好適に拡散しないことを、強く示唆している。
【0149】
ここで図２７を参照すると、４週間の調査が、ＭＥＲｓに対するＤＮＡワクチン（ｐＧＸ９１０１）を皮内処置し次いで電気穿孔を行った後の、エンドポイント力価の点での、モルモットの体液性免疫応答を比較している。全てのグループは、０週目及び２週目に、１００ｕＬのマントゥー注入で５０ｕｇのプラスミドを脇腹に受容した。グラフに表されたグループは、以下の通りである。（１）「ＩＤ針電極ＥＰ」（黒色のプロット）－皮内針電極電気穿孔装置を使用した処置、（２）「ＩＤ針電極ＥＰ＋ＨＹＡ」（灰色のプロット）－前のグループと同様に皮内針電極電気穿孔装置を使用した処置であるが、製剤は２７０Ｕ／ｍＬのイントロファーマヒアルロニダーゼを含む処置、（３）「１５ｍｍ真空カップ」（赤色のプロット）－１５ｍｍのチャンバ直径Ｄ１を有する図２Ａに示された真空カップ２を使用した処置、（４）２７０Ｕ／ｍＬのイントロファーマヒアルロニダーゼを含む製剤を使用した、「１５ｍｍ真空カップ」プロットにおける同じ真空カップ。
【0150】
ここで図２８を参照すると、６週間の調査が、ＭＥＲｓに対するＤＮＡワクチン（ｐＧＸ９１０１）を皮内処置した後、０、２及び４週目に電気穿孔を行った後の、エンドポイント力価の観点からのモルモットの体液性免疫応答を比較している。グラフ中に表されるグループは、以下の通りである：（１）「ＩＤ針電極ＥＰ」（青色のプロット）－５０ｕｇのプラスミドを１００ｕＬ注入し、その後に皮内針電極電気穿孔装置で処置；（２）「１５ｍｍ真空－５００ｕｇ」（赤色のプロット）－５００ｕｇのプラスミドの１ｍＬのマントゥー注入であり、ここで製剤は２７０Ｕ／ｍＬのイントロファーマヒアルロニダーゼを含む。電気穿孔は、１５ｍｍのチャンバ直径Ｌ１を有する図２Ａに示された真空カップによって送達された；（４）「１５ｍｍ真空－ＩＤ注入５００ｕｇ」（緑色のプロット）－５００ｕｇのプラスミドの１ｍＬの深い真皮注入であるが、少なくとも２分の経過で注入され、製剤は２７０Ｕ／ｍＬのイントロファーマヒアルロニダーゼを含む。電気穿孔は、先のグループと同じ真空カップ２によって送達された；（４）「１０ｍｍ真空－５０ｕｇ」（紫色のプロット）－５０ｕｇのプラスミドの１００ｕＬのマントゥー注入の後に、１０ｍｍのチャンバ直径Ｌを有する図２Ａに示された真空カップ２による処置。
【0151】
ここで図２９Ａを参照すると、６週間の調査が、インフルエンザ核タンパク質に対するＤＮＡワクチン（ｐＧＸ２０１３）の皮内注入後、０、３及び６週目に電気穿孔を行ったモルモットの体液性免疫応答を、平均エンドポイント力価の観点から比較している。グラフで表されるグループは、以下の通りである。（１）「ＩＤ針電極ＥＰ １ｕｇ」（赤色のプロット）－１ｕｇのプラスミドを含むマントゥー注入、及び次いで皮内針電極電気穿孔装置を使用した電気穿孔による処置、（２）「ＨＹＡ １０ｕｇを伴う真空」（青色のプロット）－１３９．５Ｕ／ｍＬのＨｙｌｅｎｅｘを含む製剤中の１０ｕｇのプラスミドの１ｍＬのマントゥー注入が、１５ｍｍのチャンバ直径Ｄ１を有する図２Ａに示される真空カップ２を用いて処置された、（３）「ＨＹＡ １ｕｇを伴う真空」（緑色のプロット）－１３９．５Ｕ／ｍＬのＨｙｌｅｎｅｘを含む１ｕｇのプラスミドで１００ｕＬのマントゥー注入が次いで、先のグループと同じ真空カップ２を使用して電気穿孔された、（４）「ＨＹＡ １ｕｇを伴わない真空」（紫色のプロット）－１ｕｇのプラスミドを有する１００ｕＬのマントゥー注入が次いで、グループ（２）及び（３）と同じ真空カップ２を使用して電気穿孔された。図２９Ｂ及び２９Ｃは、図２９Ａの調査の２週目（図２９Ｂ）及び４週目（図２９Ｃ）における、スポット形成単位の観点からの細胞性免疫応答を示す。
【0152】
ここで図４３Ａ～４３Ｃを参照すると、７日間の試験が、モルモットにおける、単回の大量注入及び真空支援電気穿孔処置と、皮内針電極電気穿孔装置を使用した複数回注入、複数回電気穿孔処置との比較効果を評価した。図１５Ａに示された真空カップと同様に、環状リング電極の対及び中心（同心）電極を有する直径１５ｍｍの真空カップを使用して、単回の高容量真空支援電気穿孔処置が実行された。単回の注入は、１３５Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼと共配合された分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をエンコードするプラスミドの０．８ｍＬのマントゥー注入であり、その後に真空支援電気穿孔を行うものであった。複数回注入、複数回電気穿孔処置は、６回の個別の０．１ｍＬのマントゥー注入と、それぞれに後続する皮内針電極を使用した電気穿孔（合計０．６ｍＬの注入物と６回の電気穿孔の適用）とを含むものであった。図４３Ａは、真空圧を加える前に注入物の上に位置付けられた真空カップを示す。図４３Ｂは、真空圧を加えている間の真空カップ内の注入物を示し、組織内の注入物が中心電極のまわりに変形し、それにより注入物を電気穿孔場に集中させていることがわかる（図４０Ｂを参照）。図４３Ｃは、０、１、２、６及び７日目における両方の処置についてのＳＥＡＰ発現（対象における全身性タンパク質産生の計測値として）を示す。この調査は、真空カップを使用する単回の、大量の、真空支援電気穿孔処置が、針電極装置を使用する６回の注入、６回の電気穿孔処置と実質的に同等に作用することを実証している。
【0153】
これらの調査は、本開示の装置及びアセンブリを使用する真空支援電気穿孔が、皮膚へのＤＮＡの大量送達を可能にすることを実証している。更に、ヒアルロニダーゼ製剤（例えばＨｙｌｅｎｅｘ）は、皮膚の真空支援電気穿孔に後続する免疫原性を増強する。更に、本明細書に記載の真空カップは、１０００ｕＬ（１ｍＬ）以上の注入量を含むヒアルロニダーゼ製剤によって提供される、皮内組織における著しく高い注入量を利用するように適合されている。換言すれば、本開示の真空カップを用いてヒアルロニダーゼ製剤を利用することにより、真空カップはかなり大量の皮内組織を処置することができる。これに加えて、本開示の装置及びアセンブリは、皮内針電極電気穿孔装置よりも迅速な体液性応答と、皮内針電極電気穿孔装置と比較して同等の全体的な体液性免疫応答を生じる。更に、これらの調査は、細胞応答の動態及び大きさが、皮内組織の真空支援電気穿孔を通して増強され得ることを実証している。本発明者らはまた、ヒアルロニダーゼ製剤を皮内組織の真空支援電気穿孔とともに使用することが、表層より下の真皮層のトランスフェクションを効果的に可能にすることを見出した。
【0154】
ここで図４４を参照すると、８週間の調査が、免疫原性に対する電気穿孔のパルス発射パターンの体液性免疫応答データ効果を比較している。この調査においては、モルモットの体液性及び細胞性免疫応答が、マントゥー注入によるＭＥＲＳ ＤＮＡワクチンの皮内処置、及び後続する図４０Ａ～図４０Ｂに示される電極アレイを有する真空カップを用いた真空支援電気穿孔後に試験された。図４１Ａは、両方のアレイ構成について、０、２、４及び８週目における体液性免疫原性ＥＬＩＳＡデータを示す。両グループは、０、２及び４週目に処置された。図４１Ｂは、図４１Ａに示された同じ調査の間の４週目及び４週目より後の細胞性免疫応答ＥＬＩＳｐｏｔデータをチャートで示す。この調査は、アレイ構成が体液性応答の点で同様の性能を示し、一方で同心アレイが細胞応答の点で対向アレイを著しく上回ったことを実証している。
【0155】
ここで図４５Ａ～４７Ｃを参照すると、蛍光透視画像が、図９に示された真空カップ９０２と同様に構成されたジェット注入真空カップを使用した、様々な真空圧及びノズル－皮膚オフセット距離でのジェット注入の間のモルモットにおける比較の組織の撓みを示す。これらの画像において使用された注入物は、Ｘ線写真撮影を可能にするための５０％のＯｍｎｉｐａｑｕｅ３５０溶液である。これらの画像の各々において、重ねられた横方向の基準線は、真空カップの遠位端（したがって真空チャンバの遠位端及び真空適用前の最初の皮膚－チャンバ界面）を示している。図４５Ａ～４５Ｃは、チャンバ内に真空圧を加えずに実行されるジェット注入を示す。図４６Ａ～４６Ｃは、チャンバ内に真空圧が加えられ、ノズル－皮膚オフセット距離なしで実行されるジェット注入を示す。図４７Ａ～４７Ｃは、チャンバ内に真空圧を加え、ノズル－皮膚オフセット距離を３ｍｍにして実行されたジェット注入を示す。図４５Ａ、４６Ａ及び４７Ａは、注入前の組織を示し、図４５Ｂ、４６Ｂ及び４７Ｂは、ジェット注入の間の組織を示し、図４５Ｃ、４６Ｃ及び４７Ｃは、注入後の組織を示すことに留意されたい。
【0156】
図４５Ａ～４５Ｃに示されるように、チャンバ内に真空圧を加えないと、注入が組織の大きな撓みを引き起こし（図４５Ｂ）、その後、注入物は真空チャンバの下に概ね存在するものの、組織は注入後にノズルに向かって跳ね返される（図４５Ｃ）。
【0157】
図４６Ａ～４６Ｃに示されるように、注入の間にチャンバ内に真空圧が加えられると（図４６Ｂ）、組織の撓みは解消される。しかしながら、図４６Ｃに示されるように、ノズル－皮膚オフセット距離の欠如は、注入後に注入物が真空チャンバの下に存在することに帰着する。
【0158】
ここで図４７Ａ～４７Ｃを参照すると、ノズル－皮膚オフセット距離が３ｍｍであり、チャンバ内に真空圧が加えられている間に注入が行われると、組織の撓みは、注入の間に実質的に解消される（図４７Ｂ）。この調査におけるように、注入の前に皮膚が真空チャンバ内に引き込まれると、注入の間にジェットノズルと皮膚との間に密着が存在し、真空圧が組織の撓みを防ぐのに十分となる。更に、注入後（図４７Ｃ）、注入物はチャンバ内に存在し、注入物がより小さい垂直スペースに圧縮される図４６Ｃに示される非オフセット設定と比較して、より大きい垂直分布がある。これらの試験は、注入物流体分布の観点から、本明細書に開示されるジェット注入真空カップによって提供される重要な利点を実証している。
【0159】
本明細書に記載の実施形態は、皮内及び／又は皮下組織における電気穿孔を標的とするように構成されているが、真空カップ２、５０２、７０２、８０２、９０２、１００２、１５０２、１６０２及び真空装置１８０２、１９０２の設計パラメータのいずれも、平滑筋層及び骨格筋層のような、皮膚内の特定の組織層又は筋肉層のような、より特定の及び／又は異なる組織層を標的とするよう、サイズを上下にスケーリングされ得ることは、理解されるべきである。更に、本明細書における真空カップ２、５０２、７０２、８０２、９０２、１００２、１５０２、１６０２及び真空装置１８０２、１９０２の設計パラメータは、粘膜、器官などを含む他のタイプの組織の電気穿孔を標的とするよう、必要に応じて適合させられ得る。
【0160】
本開示が詳細に説明されたが、添付の請求項によって定義される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換及び代替が、本明細書でなされ得ることは、理解されるべきである。例えば、本明細書に記載された様々な実施形態の特徴は、本明細書に記載された他の実施形態のうちの１つ以上及び最大で全てに組み込まれ得る。更に、本開示の範囲は、本明細書に記載された特定の実施形態に限定されることを意図されるものではない。このことから当業者は容易に理解するように、本明細書に記載された対応する実施形態と実質的に同じ機能を実行する又は実質的に同じ結果を達成する、現在存在する又は後に開発されるプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法又はステップが、本開示に従って利用され得る。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図3J】
【図3K】
【図3L】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図18E】
【図19A】
【図19B】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【図22】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【図24C】
【図24D】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29A】
【図29B】
【図29C】
【図30A-30F】
【図31A-31F】
【図32A-32F】
【図33A-33F】
【図34A】
【図34B】
【図35A】
【図35B】
【図36A】
【図36B】
【図37A】
【図37B】
【図38】
【図39A】
【図39B】
【図40A】
【図40B】
【図41A】
【図41B】
【図42A】
【図42B】
【図42C】
【図42D】
【図43A】
【図43B】
【図43C】
【図44】
【図45A-47C】
【国際調査報告】