特表 2023-518293 新規の組換え細胞表面マーカー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-28

(54)【発明の名称】新規の組換え細胞表面マーカー

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20230421BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20230421BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230421BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230421BHJP

   C12N 1/11 20060101ALI20230421BHJP

   C12N 1/13 20060101ALI20230421BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230421BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230421BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230421BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230421BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230421BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230421BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230421BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230421BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230421BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230421BHJP

   A61K 47/68 20170101ALN20230421BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K14/47 ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/867 Z

C12N1/11

C12N1/13

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/113 Z

A61P35/00

A61K48/00

A61K39/395 T

A61K39/395 E

A61K39/395 P

A61K35/17

A61K35/76

A61K47/68

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022556560

(86)(22)【出願日】2021-03-19

(85)【翻訳文提出日】2022-10-27

(86)【国際出願番号】 US2021023337

(87)【国際公開番号】W WO2021189008

(87)【国際公開日】2021-09-23

(31)【優先権主張番号】62/992,806

(32)【優先日】2020-03-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/137,022

(32)【優先日】2021-01-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522368949

【氏名又は名称】ライル・イミュノファーマ，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ハウエル・フランクリン・モフェット

(72)【発明者】

【氏名】マルク・ジョセフ・ラジョワ

(72)【発明者】

【氏名】スコット・エドワード・ボイケン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93Y

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA13

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB021

4C084ZB091

4C084ZB261

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB12

4C085BB22

4C085BB36

4C085BB50

4C085CC03

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG02

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BC83

4C087CA04

4C087CA12

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB02

4C087ZB09

4C087ZB26

4H045AA10

4H045BA09

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、短膜近傍配列、それらをコードする核酸、および短縮ＥＧＦＲマーカーの細胞表面発現を向上させるためにそれらを使用する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞外領域と、膜貫通領域と、細胞内領域とを含む組換えポリペプチドであって、
該細胞外領域は、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ドメインＩＩＩ配列を含み、
該細胞内領域は、（ｉ）最初の少なくとも３つのアミノ酸が正味中性の、または正味正電荷を持つ膜近傍ドメインを含むが、（ｉｉ）活性ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインを欠く、前記組換えポリペプチド。

【請求項2】

膜近傍ドメインの半数を超えるアミノ酸が、グリシン、セリン、アルギニン、リシン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンおよび／またはプロリンである、請求項１に記載の組換えポリペプチド。

【請求項3】

膜近傍ドメインの各位置におけるアミノ酸は、表１に従って選択される、請求項１または２に記載の組換えポリペプチド。

【請求項4】

膜近傍ドメインは、ＲＲＲＨＩＶＲＫＲ（配列番号１６）、ＲＲＲＨＩＶＲＫ（配列番号１７）、ＲＲＲＨＩＶＲ（配列番号１８）、ＲＲＲＨＩＶ（配列番号１９）、ＲＲＲＨＩ（配列番号２０）、ＲＲＲＨ（配列番号２１）、ＲＲＲ、ＲＫＲまたはＲＲを含む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。

【請求項5】

細胞内領域は、リン酸化された残基を含まない、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項6】

ドメインＩＩＩ配列は、配列番号２を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項7】

細胞外領域は、ドメインＩＩＩ配列のＣ末端側に、（ｉ）ＥＧＦＲドメインＩＶに由来する配列、（ｉｉ）人工配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項8】

細胞外領域は、配列番号１のアミノ酸３３４～５０４、３３４～５２５または３３４～６４５を含む、請求項７に記載の組換えポリペプチド。

【請求項9】

膜貫通領域は、場合により配列番号５を含むヒトＥＧＦＲ膜貫通ドメインに由来する、請求項１～８のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項10】

ヒトＥＧＦＲ、ヒト顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ヒトＩｇカッパ、マウスＩｇカッパ、またはヒトＣＤ３３に由来するシグナルペプチドをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項11】

配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０；またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。

【請求項12】

核酸分子であって、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組換えポリペプチドのコード配列を含む前記核酸分子。

【請求項13】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のコード配列をさらに含む、請求項１２に記載の核酸分子。

【請求項14】

組換えポリペプチドおよびＣＡＲのコード配列は、２つのコード配列が共転写されるように、同一のプロモーターに動作可能に結合され、
場合により、２つのコード配列が、（ｉ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、または（ｉｉ）自己切断性ペプチドのコード配列によって離間され、組換えポリペプチド、ＣＡＲおよび自己切断性ペプチドのコード配列が互いにインフレームになる、請求項１３に記載の核酸分子。

【請求項15】

第３のポリペプチドのコード配列であって、場合により第３のポリペプチドがヒトｃ－Ｊｕｎまたはその機能的類似体であるコード配列をさらに含む、請求項１３に記載の核酸分子。

【請求項16】

組換えポリペプチド、ＣＡＲおよびヒトｃ－Ｊｕｎのコード配列は、３つのコード配列が共転写されるように同一のプロモーターに動作可能に結合され、
場合により、３つのコード配列が、（ｉ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、または（ｉｉ）自己切断性ペプチドのコード配列によって互いに離間され、組換えポリペプチド、ＣＡＲ、ヒトｃ－Ｊｕｎおよび自己切断性ペプチドのコード配列が互いにインフレームになる、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項17】

プロモーターは、構成的または誘導的プロモーターであり、場合により、プロモーターはＭＮＤプロモーターであり、
自己切断ペプチドは、２Ａペプチドであり、かつ／または
ＣＡＲは、場合により、ＡＦＰ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＥｐＣＡＭ、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１６、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２から選択される腫瘍抗原に特異的である、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項18】

核酸分子は、ウイルスベクター、場合によりレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項19】

細胞であって、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む前記細胞。

【請求項20】

ヒトＴ細胞である、請求項１９に記載の細胞。

【請求項21】

医薬組成物であって、請求項１９もしくは２０に記載の細胞、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の核酸分子を含む組換えビリオン；および医薬として許容し得る担体を含む前記医薬組成物。

【請求項22】

治療を必要とする患者を治療する方法であって、請求項１９または２０に記載の細胞を患者に投与することを含み、場合により該細胞は該患者に由来する、前記方法。

【請求項23】

請求項２０に記載のＴ細胞を患者に投与することを含み、患者はがんを有し、Ｔ細胞は、前記がんに存在する腫瘍抗原に特異的であるＣＡＲ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、改変ＴＣＲまたはＴＣＲ模倣体を発現する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

患者が治療された後に、ヒトＥＧＦＲに特異的な有効量の抗体を患者に投与することを含み、抗体は、組換えポリペプチドを発現する細胞に対する細胞毒性を生じさせ、場合により抗体はＩｇＧ_１またはＩｇＧ_２であり、場合により抗体はセツキシマブである、請求項２２または２３に記載の方法。

【請求項25】

請求項２２～２４のいずれか１項に記載の方法に使用するための、請求項１９もしくは２０に記載の細胞、または請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項26】

請求項２２～２４のいずれか１項に記載の方法において治療を必要とする患者を治療するための医薬品の製造のための請求項１２～１８のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項１９もしくは２０に記載の細胞の使用。

【請求項27】

遺伝子改変ヒト細胞を製造する方法であって、単離ヒト細胞を準備すること、および請求項１２～１８のいずれか１項に記載の核酸分子をヒト細胞に導入することを含む、前記方法。

【請求項28】

ヒト細胞はヒトＴ細胞である、請求項２７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月２０日に出願された米国仮出願第６２／９９２，８０６号および２０２１年１月１３日に出願された米国仮出願第６３／１３７，０２２号の優先権を主張するものである。前述の仮出願の開示内容は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含む。該配列表は、その全体が参照によって組み入れられている。２０２１年３月１９日に作成されたＡＳＣＩＩのコピーは、０２６２２５＿ＷＯ０１２＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズが６０，１９８バイトである。

【背景技術】

【0003】

受容体型チロシンキナーゼ（ＥｒｂＢｓ）の上皮増殖因子ファミリーは、４つのメンバー：ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４（非特許文献１）からなる。これらの受容体は、上皮、間葉および神経組織に広く発現され、細胞の増殖、分化および成長に重要な役割を果たす（非特許文献２）。それらは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）相同体のホモまたはヘテロ二量体化を誘発するリガンドによって活性化される。ＥＧＦＲは、大きな細胞外領域、単一のスパニング膜貫通ドメイン（ｓｉｎｇｌｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）、細胞内膜近傍領域、チロシンキナーゼドメインおよびＣ末端調節領域を含む１８０ｋＤａのモノマー糖タンパク質である。細胞外領域は、４つのドメインを含む：ドメインＩおよびＩＩＩは、相同性のリガンド結合ドメインであり、ドメインＩＩおよびＩＶは、システインリッチのドメインである（非特許文献３）。

【0004】

ヒトＥＧＦＲの構造化ドメインＩＩＩは、ＦＤＡの認可を受けたモノクローナル抗体セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））の標的になる。受容体の選択的欠失によりＥＧＦＲの生物活性からそのセツキシマブ結合能を除くと、不活性な完全ヒト細胞表面マーカーになる可能性がある（非特許文献４；および非特許文献５）。しかし、臨床的に有用な細胞表面マーカーの重要な特徴は、必要に際して改変細胞を十分に識別して標的とすることができるように、マーカーが改変細胞に一定して高濃度で発現される必要があることである。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】ＷｉｅｄｕｗｉｌｔおよびＭｏａｓｓｅｒ、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（２００８）６５（１０）：１５６６～８４頁

【非特許文献2】Ｙａｎｏら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００３）２３（５Ａ）：３６３９～５０頁

【非特許文献3】Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ．（２００８）３７：３５３～３頁

【非特許文献4】Ｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２００５）７（４）：３０１～１１頁

【非特許文献5】Ｗａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ（２０１１）１１８（５）：１２５５～６３頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、細胞外領域と、膜貫通領域と、細胞内領域とを含む組換えポリペプチドであって、細胞外領域は、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ドメインＩＩＩ配列を含み、細胞内領域は、（ｉ）最初の少なくとも３つのアミノ酸が正味中性の、または正味正電荷を持つ膜近傍ドメインを含むが、（ｉｉ）活性ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインを欠く組換えポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、活性チロシンキナーゼドメインを有さない。

【0007】

いくつかの実施形態において、膜近傍ドメインの半数を超えるアミノ酸が、グリシン、セリン、アルギニン、リシン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンおよび／またはプロリンである。いくつかの実施形態において、膜近傍ドメインの各位置のアミノ酸は、表１に従って選択される。例えば、膜近傍ドメインは、ＲＲＲＨＩＶＲＫＲ（配列番号１６）、ＲＲＲＨＩＶＲＫ（配列番号１７）、ＲＲＲＨＩＶＲ（配列番号１８）、ＲＲＲＨＩＶ（配列番号１９）、ＲＲＲＨＩ（配列番号２０）、ＲＲＲＨ（配列番号２１）、ＲＲＲ、ＲＫＲまたはＲＲを含む。ある実施形態において、細胞内領域は、リン酸化された残基を含まない。

【0008】

いくつかの実施形態において、ヒトＥＧＦＲドメインＩＩＩ配列は、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９０％の同一性を含む配列などのその機能的変異体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、細胞外領域は、ドメインＩＩＩ配列のＣ末端側に、（ｉ）ＥＧＦＲドメインＩＶに由来する配列、（ｉｉ）人工配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方をさらに含む。特定の実施形態において、細胞外領域は、配列番号１のアミノ酸３３４～５０４、３３４～５２５または３３４～６４５を含む。

【0009】

いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、場合により配列番号５を含むヒトＥＧＦＲ膜貫通ドメインに由来する。

【0010】

いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、ヒトＥＧＦＲ、ヒト顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ヒトＩｇカッパ、マウスＩｇカッパ、またはヒトＣＤ３３に由来するシグナルペプチドを含む。例えば、シグナルペプチドは、配列番号２２、２３、２４または２５を含んでいてもよい。

【0011】

特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０；またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0012】

別の態様において、本開示は、本開示の組換えポリペプチドのコード配列を含む発現コンストラクトなどの核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、核酸分子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のコード配列をさらに含む。ＣＡＲは、例えば、ＡＦＰ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＥｐＣＡＭ、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１６、ＲＯＲ１またはＲＯＲ２などの腫瘍抗原を標的とすることができる。さらなる実施形態において、ＣＡＲは、二重特異性であり、例えばＣＤ１９およびＣＤ２０またはＣＤ１９およびＣＤ２２を標的としてもよい。特定の実施形態において、組換えポリペプチドおよびＣＡＲのコード配列は、２つのコード配列が共転写されるように、同一のプロモーター（例えば、構成的または誘導的プロモーター；例えばＭＮＤプロモーター）に動作可能に結合され、場合により、２つのコード配列が、（ｉ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、または（ｉｉ）自己切断性ペプチド（例えば２Ａペプチド）のコード配列によって離間され、組換えポリペプチド、ＣＡＲおよび自己切断性ペプチドのコード配列が互いにインフレームになる。

【0013】

いくつかの実施形態において、核酸分子は、第３のポリペプチドのコード配列であって、場合により第３のポリペプチドがヒトｃ－Ｊｕｎまたはその機能的類似体であるコード配列をさらに含む。さらなる実施形態において、組換えポリペプチド、ＣＡＲおよびヒトｃ－Ｊｕｎのコード配列は、３つのコード配列が共転写されるように同一のプロモーター（例えば、構成的または誘導的プロモーター；例えばＭＮＤプロモーター）に動作可能に結合され、場合により、３つのコード配列が、（ｉ）ＩＲＥＳ、または（ｉｉ）自己切断性ペプチド（例えば２Ａペプチド）のコード配列によって互いに離間され、組換えポリペプチド、ＣＡＲ、ヒトｃ－Ｊｕｎおよび自己切断性ペプチドのコード配列が互いにインフレームになる。

【0014】

いくつかの実施形態において、核酸分子は、ウイルスベクター、場合によりレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。

【0015】

他の態様において、本開示は、本明細書に記載の核酸分子を含む細胞（例えば自己または同種異系ヒトＴ細胞）；該核酸分子を含む組換えビリオン；ならびに該細胞、該核酸分子または該ビリオン、および医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。

【0016】

別の態様において、本開示は、治療を必要とする患者を治療する方法であって、場合により自己または同種異系細胞である細胞を患者に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、患者は、がんを有し、本明細書に記載のＴ細胞製剤を投与され、Ｔ細胞は、そのがんに存在する腫瘍抗原に特異的であるＣＡＲ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、改変ＴＣＲまたはＴＣＲ模倣体を発現する。さらなる実施形態において、該方法は、患者が治療された（例えば、がんが退行した）後に、ヒトＥＧＦＲに特異的な有効量の抗体を患者に投与することを含み、抗体は、組換えポリペプチドを発現するＴ細胞に対する細胞毒性を生じさせ、場合により抗体はＩｇＧ_１またはＩｇＧ_２（例えばセツキシマブ）である。

【0017】

本開示は、該治療方法に使用するための細胞、核酸分子、組換えウイルス、医薬組成物、ならびに本明細書に記載される、患者を治療するための医薬品の製造のための細胞、核酸分子またはウイルスをも提供する。

【0018】

さらに別の態様において、本開示は、遺伝子改変ヒト細胞（例えば改変Ｔ細胞）を製造する方法であって、単離ヒト細胞を準備すること、および本明細書に記載の核酸分子または組換えウイルスをヒト細胞に導入することを含む方法を提供する。

【0019】

本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明に明示されている。しかし、詳細な説明は、発明の実施形態および態様を示しており、例示のみを目的とし、限定することを意図しないということが理解されるべきである。発明の範囲内の様々な変更および修正は、詳細な説明により当業者に明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1A】Ｒ１２ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔもしくはＲ１２ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔ－ＤＥＡＲＫＡＩＡＲが形質導入された生ＣＡＲ＋Ｔ細胞、または非形質導入生細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体ＡＹ１３の結合を示すグラフである。図１Ａ：フロープロット。図１Ｂ：図１Ａの幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）データを定量化した棒グラフ。「ＤＥＡＲＫＡＩＡＲ」：膜近傍配列ＤＥＡＲＫＡＩＡＲＶＫＲＥＳＫＲＩＶＥＤＡＥＲＬＩＲＥＡＡＡＡＳＥＫＩＳＲＥＡＥＲＬＩ（配列番号４１）。Ｒ１２ＣＡＲ：ＲＯＲ１に対するＣＡＲ。Ｐ２Ａ：自己切断ペプチド。ＥＧＦＲｔ：ＥＧＦＲ細胞外ドメインＩＩＩおよびＩＶならびにＥＧＦＲ膜貫通ドメインを含むが、ＥＧＦＲドメインＩおよびＩＩならびにＥＧＦＲ細胞内配列を欠く短縮ヒトＥＧＦＲ。

【図1B】Ｒ１２ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔもしくはＲ１２ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔ－ＤＥＡＲＫＡＩＡＲが形質導入された生ＣＡＲ＋Ｔ細胞、または非形質導入生細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体ＡＹ１３の結合を示すグラフである。図１Ａ：フロープロット。図１Ｂ：図１Ａの幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）データを定量化した棒グラフ。「ＤＥＡＲＫＡＩＡＲ」：膜近傍配列ＤＥＡＲＫＡＩＡＲＶＫＲＥＳＫＲＩＶＥＤＡＥＲＬＩＲＥＡＡＡＡＳＥＫＩＳＲＥＡＥＲＬＩ（配列番号４１）。Ｒ１２ＣＡＲ：ＲＯＲ１に対するＣＡＲ。Ｐ２Ａ：自己切断ペプチド。ＥＧＦＲｔ：ＥＧＦＲ細胞外ドメインＩＩＩおよびＩＶならびにＥＧＦＲ膜貫通ドメインを含むが、ＥＧＦＲドメインＩおよびＩＩならびにＥＧＦＲ細胞内配列を欠く短縮ヒトＥＧＦＲ。

【図2A】ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００５２１９．２のヒトＥＧＦＲのドメイン構造を示す図である。膜貫通ドメインは配列番号５であり、膜近傍ドメインは配列番号１５である（配列番号４３で示される完全長配列）。膜近傍ドメインにおいて、塩基性残基は赤および「＋」で示され、酸性残基は青および「－」で示される。さらにリン酸化残基（緑）を以下に示す。

【図2B】（ＲＲＲ、配列番号１６、配列番号１２または配列番号１３（出現順にそれぞれ配列番号４４～４７で示される完全長配列）の膜近傍ドメインを含まない、または含む配列番号５の膜貫通ドメインを含む）本ＥＧＦＲ由来ポリペプチドの特定の実施形態の設計を示す図である。Ｓ．ペプチド：シグナルペプチド。ＧＭＣＳＦ：ＧＭ－ＣＳＦに由来するシグナルペプチド。星印は、ポリペプチドのＣ末端を示す。

【図3】図３Ａ～３Ｃは、２つのドナーから得られ、発現コンストラクトが形質導入された初代Ｔ細胞におけるＥＧＦＲ由来ポリペプチドに対する一連のバイシストロニック発現コンストラクトの発現を示すグラフである。図３Ａは、Ｒ１２ＣＡＲのコード配列を含むコンストラクトの基本構造を示す。図３Ｂおよび３Ｃは、それぞれ、Ｒ１２ＣＡＲ＋形質導入生細胞、または非形質導入条件での生細胞における結合ＲＯＲ１－Ｆｃ融合タンパク質およびＡＹ１３に対するｇＭＦＩを示す。形質導入の８日後にフローサイトメトリーが行われた。図３Ｂおよび３Ｃは、出現順にそれぞれ配列番号１６、１２、１３、１６、１２および１３を示す。

【図4A】Ｒ１２ＣＡＲ発現によって示される形質導入Ｔ細胞の割合を示す棒グラフである。Ｔ細胞は、図３Ａ～３Ｃに示されるとおりであった。形質導入の５日後にフローサイトメトリーが行われた。図４Ａは、出現順にそれぞれ配列番号１６、１２、１３、１６、１２および１３を示す。

【図4B】ドメインＩＩＩ特異的セツキシマブおよびドメインＩＩＩ特異的ＡＹ１３によるＥＧＦＲｔ検出の比較を示すグラフである。形質導入の５日後にフローサイトメトリーが行われた。図４Ｂは、出現順にそれぞれ配列番号１６、１２および１３を示す。

【図5】図５Ａおよび５Ｂは、それぞれ、図３Ａ～３Ｃのバイシストロニック発現コンストラクトが形質導入された初代Ｔ細胞におけるＲ１２ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔ表面発現に対する形質導入効率の影響を示すグラフである。形質導入の４日後にフローサイトメトリーが行われた。図５Ａおよび５Ｂは、出現順にそれぞれ配列番号１６、１２および１３を示す。

【図6】図６Ａ～６Ｃは、２つのドナーから得られ、発現コンストラクトが形質導入された初代Ｔ細胞におけるＥＧＦＲ由来ポリペプチドに対する一連のトリシストロニック発現コンストラクトの発現を示すグラフである。図６Ａは、コンストラクトの基本構造を示す。図６Ｂおよび６Ｃは、それぞれ、Ｒ１２ＣＡＲ＋形質導入生細胞または全非形質導入生細胞における結合ＲＯＲ１－Ｆｃ融合タンパク質およびＡＹ１３に対するｇＭＦＩを示す。形質導入の８日後にフローサイトメトリーが行われた。図６Ｂおよび６Ｃは、それぞれ配列番号１６を示す。

【図7】図３ＡのバイシストロニックコンストラクトからＥＧＦＲ由来ポリペプチドを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞におけるセツキシマブによって誘発された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示すグラフである。図は、４時間のセツキシマブ処理後に残留するＣＡＲ－Ｔ細胞の部分を、抗体で処理されていないＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して示す。Ｒｉｔｕｘ：リツキシマブ。

【図8】図６ＡのトリシストロニックコンストラクトからＥＧＦＲ由来ポリペプチドを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞におけるセツキシマブ誘発細胞毒性を示すグラフである。図は、４時間のセツキシマブ処理後に残留するＣＡＲ－Ｔ細胞の部分を、抗体で処理されていないＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して示す。図８は、配列番号１６を示す。

【図9】図６ＡのトリシストロニックコンストラクトからＥＧＦＲ由来ポリペプチドを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞におけるセツキシマブ誘発細胞毒性を示すグラフである。図は、２４時間のセツキシマブ処理後に残留するＣＡＲ－Ｔ細胞の部分を、抗体で処理されていないＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して示す。図９は、配列番号１６を示す。

【図10】ＥＧＦＲｔが形質導入されたＲＯＲ１ ＣＡＲ＋生細胞、もしくはさらなる細胞内膜近傍配列（Ｒ、ＲＲ、ＲＲＲもしくはＲＫＲ）を有するその変異体、または非形質導入条件での全生細胞における抗ＥＧＦＲ抗体結合に対するｇＭＦＩを定量化した棒グラフである。

【図11】図１１Ａおよび１１Ｂは、モノシストロニック（図１１Ａ）またはバイシストロニック（図１１Ｂ）であるＭＰ７１レトロウイルスコンストラクトが形質導入されたマウスＴ細胞におけるＥＧＦＲｔ（白）またはＥＧＦＲ－ＲＲＲ（ＲＲＲ膜近傍ドメインを含むＥＧＦＲｔ；グレー）の表面発現量を示すグラフである。ＭＦＩ：平均蛍光強度。

【図12A】指定されたＣＡＲ－Ｔ点滴製品（中図）のインビボ試験の概略（上図）、およびＥＧＦＲポリペプチドＥＧＦＲｔまたはＥＧＦＲ－ＲＲＲの発現量を示す（下図）図である。

【図12B】セツキシマブ（Ｃｅｔｘ）処理の後のＥＧＦＲｔおよびＥＧＦＲ－ＲＲＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞（白丸）の循環の動態を、リツキシマブ（対照：Ｒｉｔｘ）（黒丸）と比較して示すグラフ図である。グレーの線は、枯渇時点（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ）を表す。

【図12C】循環ＥＧＦＲｔおよびＥＧＦＲ－ＲＲＲ形質導入Ｔ細胞の枯渇動態（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）のインビボ試験の結果を示す図である。上図：ＥＧＦＲ^＋Ｔ細胞の養子移植を示す概略図。下図：セツキシマブによる処理の後のＥＧＦＲ^＋Ｔ細胞の循環の動態を示すグラフ（白丸）。グレーの線は、枯渇時点を表す。

【図13A】セツキシマブ（白丸）または媒体（黒丸）による処理の後のＥＧＦＲｔ（左）およびＥＧＦＲ－ＲＲＲ（右）ＣＡＲ－Ｔ細胞の循環の枯渇動態のインビボ試験の結果を示す図である。陰影部は、枯渇後の範囲を表す。

【図13B】図１３Ａに示される試験におけるＢ細胞の循環の反発動態を示すグラフである。図示されているように２つの異なる用量のセツキシマブが使用された。

【図13C】高用量（１ｍｇ）または低用量（０．１ｍｇ）のセツキシマブの投与後のＢ細胞再生不良の動物（全ＣＤ４５のうちのＣＤ１９^＋が３％未満）の頻度を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0021】

細胞療法の重要な構成要素は、改変細胞の検出、選択および富化、ならびにインビボ細胞剥離に使用されるコンパクトで機能不活性の細胞表面マーカーである。本開示は、これらの目的に使用される新規のＥＧＦＲ由来タンパク質を提供する。これらのタンパク質は、野生型のＥＧＦＲのリガンド結合機能および／またはシグナル形質導入機能を欠くが、なおも一般的な抗ＥＧＦＲ抗体によって認識される。

【0022】

それらの配列の設計により、本ＥＧＦＲ由来タンパク質は、細胞表面に高濃度で発現されるため、細胞療法における安全スイッチ（自殺遺伝子）として特に有用である。該療法における改変細胞が体内で必要とされなくなると、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブまたはネシツムマブなどの医薬グレードの抗ＥＧＦＲ抗体を患者に投与することによって、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）により改変細胞を除去することができる。

【0023】

別段の指示がなければ、本明細書に用いられるＥＧＦＲは、ヒトＥＧＦＲを指す。ヒトＥＧＦＲポリペプチド配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（識別子番号Ｐ００５３３－１）に見いだされ、以下の配列を有する：

【化1】

【0024】

上記配列において、各種ＥＧＦＲドメインは、以下のように記述される。シグナルペプチドは、アミノ酸１～２４にまたがる。細胞外配列は、アミノ酸２５～６４５にまたがり、ドメインＩ、ドメインＩＩ、ドメインＩＩＩおよびドメインＩＶは、それぞれアミノ酸２５～１８８、１８９～３３３、３３４～５０４および５０５～６４５にまたがる。膜貫通ドメインは、アミノ酸６４６～６６８にまたがる。細胞内ドメインは、アミノ酸６６９～１，２１０にまたがり、膜近傍ドメインは、アミノ酸６６９～７０３にまたがり、チロシンキナーゼドメインは、アミノ酸７０４～１，２１０にまたがる。別段の指示がなければ、本明細書に記載のＥＧＦＲアミノ酸位置は、配列番号１における位置、または配列番号１の変異体（例えば、天然の多型変異体または遺伝子改変変異体）における対応する位置を指す。

【0025】

Ｉ．ＥＧＦＲ由来ポリペプチド
本開示の組換えポリペプチドは、ＥＧＦＲに由来するが、ＥＧＦＲの全体配列ではなく、部分配列のみを含む。これらのポリペプチドは、哺乳動物細胞に発現される場合は細胞表面タンパク質である。ポリペプチドの細胞外領域、膜貫通領域および細胞内領域を以下に説明する。

【0026】

Ａ．細胞外領域
本ＥＧＦＲ由来ポリペプチドの細胞外領域は、セツキシマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体によって結合されるエピトープを含む。例として、該領域は、以下のドメインＩＩＩ配列などのＥＧＦＲのドメインＩＩＩ、またはその機能的変異体を含んでいてもよい：

【化2】

【0027】

「機能的変異体」とは、配列の所望の生物学的機能に影響を及ぼさない欠失、挿入および／または置換（例えば同類置換）などの配列変異を有する配列を意味する。配列番号２の機能的変異体は、なおもセツキシマブによって結合される。

【0028】

ドメインＩＩＩ配列の三次構造を維持するために、細胞外領域は、ドメインＩＩＩ構造におけるジスルフィド結合を安定化させやすくするＥＧＦＲ配列などのさらなるＥＧＦＲ配列をさらに含んでいてもよい。例えば、細胞外領域は、ドメインＩＩＩ配列の後に、ＥＧＦＲのドメインＩＶに由来する配列を含んでいてもよい。ドメインＩＶ由来配列は、以下のドメインＩＶ配列を含んでいてもよい：

【化3】

【0029】

あるいは、ドメインＩＶ由来配列は、配列番号３の機能的変異体を含んでいてもよい。当該機能的変異体は、ドメインＩＩＩの三次構造を維持して、セツキシマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体によりポリペプチドを結合させやすくすることが可能である。機能的変異体は、天然ＥＧＦＲドメインＩＶの一部を含んでいれば、ＥＧＦＲに非相同のさらなる配列（例えば、天然ＥＧＦＲ配列の一部ではない配列）を含んでいてもいなくてもよい。

【0030】

いくつかの実施形態において、ドメインＩＶ由来配列は、天然ＥＧＦＲドメインＩＶ配列の一部を含み、その部分は、ドメインＩＩＩの構造的折りたたみの維持に関与するアミノ酸残基を含む。当該アミノ酸残基は、成熟ＥＧＦＲのＷ４９２残基（配列番号１のＷ５１６および配列番号３のＷ１２に対応し；上記配列の囲み部分）、ならびに場合によりそれに隣接する１つまたはそれ以上の残基を含む。Ｗ４９２は、この残基がドメインＩＩＩの核に入り込み、重要な側鎖パッキング相互作用を生じさせるため、ＥＧＦＲドメインＩＩＩの折りたたみに重要であることが構造解析により証明される。ドメインＩＶ由来配列の例は、成熟ＥＧＦＲの残基４９２～４９６（配列番号１の残基５１６～５２０および配列番号３の残基１２～１６に対応する）を含むものである。

【0031】

ドメインＩＶ由来配列の１つの特定の例は、

【化4】

であり、天然ドメインＩＶの残基４８２～４９１および４９７～６１２が除去され、Ｖ４８１が、合成４残基リンカー（上記の囲み部分）を介してＷ４９２に接続され、Ｐ４９６の後に、それを本ポリペプチドの膜貫通領域に結合するＧ／Ｓリンカー（上記の下線部分）が続く。

【0032】

いくつかの実施形態において、本ＥＧＦＲ由来ポリペプチドは、ＥＧＦおよびＴＧＦ－アルファなどのリガンドを結合するＥＧＦＲ細胞外部分を欠く。例えば、細胞外領域は、ＥＧＦＲのドメインＩおよび／またはドメインＩＩの配列を含まない、またはそれらのドメインのいずれか、もしくは両方の部分配列のみを含む。

【0033】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドの細胞外領域は、さらなる配列を含む。例えば、細胞外領域は、膜貫通領域のすぐＮ末端側に茎部を含んでいてもよい。茎部は、例えば、Ｇ／Ｓリッチのペプチドリンカーなどの柔軟な茎、または抗体定常領域からのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、もしくは別のタンパク質からの細胞外ドメインなどの構造化された茎であってもよい。細胞外領域は、抗原結合領域（例えば、ｓｃＦｖまたは設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ））などのさらなる機能的ドメインをも含んでいてもよい。

【0034】

Ｂ．膜貫通領域
本ポリペプチドの膜貫通領域は、疎水性配列を含む。この領域は、人工配列を含んでいてもよく、例えば、ＥＲＢＢ１（ＥＧＦＲ）、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ３（ＨＥＲ３）、ＥＲＢＢ４（ＨＥＲ４）、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＮＳＲＲ、ＰＧＦＲＡ、ＰＧＦＲＢ、ＫＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＦＬＴ３、ＶＧＦＲ１、ＶＧＦＲ２、ＶＧＦＲ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＰＴＫ７、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＵＦＯ、ＴＹＲＯ３、ＭＥＲＴＫ、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡＡ、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６、ＲＥＴ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＯＳ１、ＬＭＴＫ１、ＬＭＴＫ２、ＬＭＴＫ３、ＬＴＫ、ＡＬＫ、またはＳＴＹＫ１であってもよい任意の膜貫通タンパク質に由来する。

【0035】

膜貫通領域の１つの特定の例は、ＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭの配列（配列番号５）を有するＥＧＦＲ、またはその機能的変異体に由来する。

【0036】

Ｃ．細胞内領域
発明人らは、適切な膜近傍ドメインをＥＧＦＲ由来タンパク質の細胞内領域に含めると、タンパク質の細胞表面の発現量が顕著に増加することを思いがけなく発見した。膜近傍ドメインとは、膜貫通ドメインのすぐＣ末端側の細胞表面タンパク質の細胞内部分を指す。細胞表面の発現量が大きいと、タンパク質を発現する細胞が抗ＥＧＦＲ抗体によって認識されることで、細胞が例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰにより根絶される。

【0037】

本ポリペプチドにおける膜近傍ドメインは、長さが１～２０（例えば、２～２０、３～２０、４～２０、５～２０、２～１８、３～１８、４～１８または５～１８）アミノ酸であってもよい。長さが２０アミノ酸を超えることもできる。いくつかの実施形態において、本ポリペプチドの最初の１つまたはそれ以上の（例えば、最初の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個）のアミノ酸は、正味中性の、または正味正電荷を持つ配列である（例えば、アルギニンおよびリシン残基の数は、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基の数以上である）。さらなる実施形態において、それらの第１のアミノ酸は、親水性アミノ酸を３０％超（例えば、４０、５０、６０、７０、８０または９０％超）含む。膜貫通ドメインのＣ末端に付加される配列の各位置におけるアミノ酸選択肢の非限定的な例を以下の表１に示す。

【0038】

【表1】

【0039】

当該膜近傍ドメインのいくつかの非限定的な例を以下に示す：

【0040】

【表2】

【0041】

本膜近傍ドメインは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）またはフォスファチジルイノシトール－４，５－ビスフォスフェート（ＰＩＰ２）と相互作用するヒト受容体チロシンキナーゼの膜近傍領域（例えば、最初の２０個の膜近傍アミノ酸の全体または部分配列）などの天然細胞表面タンパク質の膜近傍領域に由来する（例えば、Ｈｅｄｇｅｒら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０１５）５：９１９８頁参照）。受容体チロシンキナーゼは、ＥＲＢＢ１（ＥＧＦＲ）、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ３（ＨＥＲ３）、ＥＲＢＢ４（ＨＥＲ４）、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＮＳＲＲ、ＰＧＦＲＡ、ＰＧＦＲＢ、ＫＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＦＬＴ３、ＶＧＦＲ１、ＶＧＦＲ２、ＶＧＦＲ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＰＴＫ７、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＵＦＯ、ＴＹＲＯ３、ＭＥＲＴＫ、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡＡ、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６、ＲＥＴ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＯＳ１、ＬＭＴＫ１、ＬＭＴＫ２、ＬＭＴＫ３、ＬＴＫ、ＡＬＫおよびＳＴＹＫ１である。所望により、誘導された配列は、本タンパク質の意図しないシグナル伝達能を回避するようにリン酸化されることが知られる残基を除去する変異（例えば置換または欠失）を含んでいてもよい。

【0042】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドの膜近傍ドメインは、以下のような膜近傍領域を含む：

【化5】

【0043】

いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ由来膜近傍ドメインは、天然ＥＧＦＲ膜近傍領域（例えば配列番号１５）の最初の１９個のアミノ酸に由来し、本ポリペプチドの二量体化を回避するように、天然膜近傍領域の残留部分の全体を含まない。いくつかの実施形態において、リン酸化することが知られる残基（上記囲み部分、配列番号１のＴ６７８、Ｔ６９３およびＳ６９５に対応する）が欠失、または置換される。ＥＧＦＲ由来膜近傍ドメインの非限定的な例は、以下の配列の１つを含む：

【0044】

【表3】

【0045】

いくつかの実施形態において、細胞内領域は、膜近傍ドメインのＣ末端側のさらなる配列、例えば機能的ドメイン（例えばスイッチ受容体）をも含む。

【0046】

本ＥＧＦＲ由来タンパク質は、タンパク質がシグナル伝達能を欠くように、ＥＧＦＲの機能的チロシンキナーゼドメインを欠く。例えば、該タンパク質は、配列番号１のアミノ酸７０４～１，２１０に対応する領域の全体を欠く。いくつかの実施形態において、細胞内領域は、可能性のあるリン酸化モチーフ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）を含まない。

【0047】

Ｄ．シグナルペプチド
いくつかの実施形態において、本ポリペプチドのコード配列は、シグナルペプチドのコード配列を含む。シグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞表面の発現を容易にすることができ、成熟ポリペプチドから切断される。シグナルペプチドは、任意の細胞表面タンパク質または分泌タンパク質のペプチドに由来する。例えば、シグナルペプチドは、以下に示すシグナルペプチドであってもよい：

【0048】

【表4】

【0049】

本ポリペプチドの細胞外領域、膜貫通領域および細胞内領域について以上に記載した各種ドメインは、直接、またはペプチドリンカーを介して結合される。

【0050】

Ｅ．ＥＧＦＲ由来ポリペプチドの例
いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、膜近傍ドメイン（不図示）が膜貫通ドメインのＣ末端に付加され、シグナルペプチド（不図示）を含む、または含まない、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、ドメインＩＶ（下線部分）および膜貫通ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化6】

【0051】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、シグナルペプチド（不図示）を含む、または含まない、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、ＥＧＦＲドメインＩＶの改造部（太字および下線部分）、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、ならびに膜貫通ドメインのＣ末端に付加された膜近傍ドメイン（不図示）を含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化7】

【0052】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、シグナルペプチド（不図示）を含む、または含まない、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、合成配列（太字および下線部分）、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、ならびに膜貫通ドメインのＣ末端に付加された膜近傍ドメイン（不図示）を含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化8】

【0053】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチド（太字部分）、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、ＥＧＦＲドメインＩＶ（下線部分）、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン（太字およびイタリック体部分）、ならびにＲＲＲの配列を有する膜近傍ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化9】

【0054】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチド（太字部分）、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、ＥＧＦＲドメインＩＶ（下線部分）、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン（太字およびイタリック体部分）、ならびにＲＲＲＨＩＶＲＫＲの配列（配列番号１６）を有する膜近傍ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化10】

【0055】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチド（太字部分）、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、ＥＧＦＲドメインＩＶ（下線部分）、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン（太字およびイタリック体部分）、ならびにＲＲＲＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳの配列（配列番号１２）を有する膜近傍ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化11】

【0056】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチド（太字部分）、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、ＥＧＦＲドメインＩＶ（下線部分）、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン（太字およびイタリック体部分）、ならびにＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳの配列（配列番号１３）を有する膜近傍ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化12】

【0057】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチド（太字部分）、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、ＥＧＦＲドメインＩＶの改造部（下線部分）、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン（太字およびイタリック体部分）、ならびにＲＲＲの配列を有する膜近傍ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化13】

【0058】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチド（太字部分）、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、ＥＧＦＲドメインＩＶの改造部（下線部分）、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン（太字およびイタリック体部分）、ならびにＲＲＲＨＩＶＲＫＲの配列（配列番号１６）を有する膜近傍ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化14】

【0059】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチド（太字部分）、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、ＥＧＦＲドメインＩＶの改造部（下線部分）、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン（太字およびイタリック体部分）、ならびにＲＲＲＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳの配列（配列番号１２）を有する膜近傍ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化15】

【0060】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチド（太字部分）、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、ＥＧＦＲドメインＩＶの改造部（下線部分）、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン（太字およびイタリック体部分）、ならびにＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳの配列（配列番号１３）を有する膜近傍ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化16】

【0061】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチド（太字部分）、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、合成配列（下線部分）、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン（太字およびイタリック体部分）、ならびにＲＲＲの配列を有する膜近傍ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化17】

【0062】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチド（太字部分）、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、合成配列（下線部分）、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン（太字およびイタリック体部分）、ならびにＲＲＲＨＩＶＲＫＲの配列（配列番号１６）を有する膜近傍ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化18】

【0063】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチド（太字部分）、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、合成配列（下線部分）、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン（太字およびイタリック体部分）、ならびにＲＲＲＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳの配列（配列番号１２）を有する膜近傍ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化19】

【0064】

いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチド（太字部分）、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（イタリック体部分）、合成配列（下線部分）、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン（太字およびイタリック体部分）、ならびにＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳの配列（配列番号１３）を有する膜近傍ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから実質的になる：

【化20】

【0065】

本開示では、配列が以上に例示した配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）同一であるＥＧＦＲ由来ポリペプチドも提供される。

【0066】

ＩＩ．ＥＧＦＲ由来タンパク質に対する発現コンストラクト
本開示は、細胞療法に使用される細胞においてＥＧＦＲ由来タンパク質を発現するのに好適な発現コンストラクトを提供する。本開示の発現コンストラクトは、１つまたはそれ以上の転写調節要素に動作可能に結合されるＥＧＦＲ由来ポリペプチドのコード配列（好ましくはシグナルペプチドを含む）を含む発現カセットを含む。本明細書に用いられているように、「転写調節要素」とは、例えば、ＥＧＦＲ由来ポリペプチドコード配列の組織特異的発現パターンおよび転写効率、ＲＮＡ転写物の安定性、およびＲＮＡ転写物の翻訳効率を調節することによってコード配列の発現を制御する発現コンストラクトの塩基配列を指す。これらの要素は、プロモーター、コザック配列、エンハンサー、ＲＮＡ安定化要素（例えばＷＰＲＥ配列）、ポリアデニル化シグナル、およびそれらの任意の組合せの１つまたはそれ以上であってもよい。

【0067】

いくつかの実施形態において、発現カセットは、標的細胞において構成的に活性または誘導可能である哺乳動物プロモーターを含む。有用なプロモーターの例は、限定することなく、マロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬ Ｖ）ＬＴＲ、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーによる改造ＭｏＭｕＬ Ｖ ＬＴＲのＵ３領域を含む合成プロモーター）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦｌαプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、テトラシクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、Ｅ２因子（Ｅ２Ｆ）プロモーター、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、およびＲＵ－４８６応答性プロモーターである。

【0068】

ある実施形態において、発現カセットは、さらなる調節配列、例えば内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、またはＥＧＦＲ由来ポリペプチドに加えて別のポリペプチドの共発現を可能にするための自己切断ペプチドをコードする配列をも含む。（リボソームスキッピングペプチドとしても知られる）自己切断ペプチドの例は、典型的な長さが１８～２２アミノ酸のウイルス由来ペプチドであり、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａを含む２Ａペプチドである（Ｌｉｕら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０１７）７：２１９３）。

【0069】

いくつかの実施形態において、本発現コンストラクトは、抗原受容体および／または別のさらなるポリペプチドをも発現する。抗原受容体は、例えば、抗体、ｓｃＦｖなどの改変抗体、ＣＡＲ、改変ＴＣＲ、ＴＣＲ模倣体（例えば、抗体－Ｔ細胞受容体（ａｂＴＣＲ）もしくはキメラ抗体－Ｔ細胞受容体（ｃａＴＣＲ））、またはキメラシグナル伝達受容体（ＣＳＲ）であってもよい。例として、ａｂＴＣＲは、ＴＣＲ（例えば、アルファ／ベータＴＣＲまたはガンマ／デルタＴＣＲ）の抗原結合ドメインが（抗体の定常ドメインを含む、または含まない）抗体の抗原結合ドメインに置き換えられた改変ＴＣＲを含んでいてもよく；次いで改変ＴＣＲは、ＴＣＲのシグナル伝達機能を保持しながら抗体の抗原に特異的になる。ＣＳＲは、（１）細胞外結合ドメイン（例えば、天然／改変受容体細胞外ドメイン、天然／改変リガンド細胞外ドメイン、ｓｃＦｖ、ナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎおよびアフィボディ）、（２）膜貫通ドメイン、ならびに（３）細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、転写因子を活性化する、またはＪＡＫ／ＳＴＡＴ、キナーゼ、ホスファターゼおよびユビキチンを補充および／または活性化するドメイン；ＳＨ３；ＳＨ２；ならびにＰＤＺ）。例えば、ＥＰ３４０７９３Ｂ１、ＷＯ２０１７／０７０６０８、ＷＯ２０１８／２００５８２、ＷＯ２０１８／２００５８３、ＷＯ２０１８／２００５８５、およびＸｕら、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１８）４：６２参照。

【0070】

抗原受容体は、対象の抗原（例えば、腫瘍抗原または病原体の抗原）を標的とすることができる。抗原としては、限定することなく、ＡＦＰ（アルファフェトプロテイン）、αｖβ６もしくは別のインテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡ９（炭酸脱水酵素９）、ＣＣＬ－１（Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド１）、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ４５、ＣＤ４７、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ３５２、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、クローディン１８．２、クローディン６、ｃ－ＭＥＴ、ＤＬＬ３（デルタ様タンパク質３）、ＤＬＬ４、ＥＮＰＰ３（エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３）、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＧ－２（上皮糖タンパク質２）、ＥＰＧ－４０、エフリンＢ２、ＥＰＨａ２（エフリン受容体Ａ２）、ＥＲＢＢ二量体、エストロゲン受容体、ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ受容体）、ＦＡＰ－α（線維芽細胞活性化タンパク質α）、胎児性ＡｃｈＲ（胎児性アセチルコリン受容体）、ＦＢＲ（葉酸結合タンパク質）、ＦＣＲＬ５、ＦＲ－α（葉酸受容体アルファ）、ＧＣＣ（グアニルシクラーゼＣ）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＣ２（グリピカン－２）、ＧＰＣ３、ｇｐ１００（糖タンパク質１００）、ＧＰＮＭＢ（糖タンパク質ＮＭＢ）、ＧＰＲＣ５Ｄ（Ｇタンパク質共役受容体５Ｄ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、Ｂ型肝炎表面抗原、ＨＬＡ－Ａ１（ヒト白血球抗原Ａ１）、ＨＬＡ－Ａ２（ヒト白血病抗原Ａ２）、ＨＭＷ－ＭＡＡ（ヒト高分子量メラノーマ関連抗原）、ＩＧＦ１Ｒ（インスリン様増殖因子１受容体）、Ｉｇカッパ、Ｉｇラムダ、ＩＬ－２２Ｒａ（ＩＬ－２２受容体アルファ）、ＩＬ－１３Ｒａ２（ＩＬ－１３受容体アルファ２）ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）、ＬＩ細胞接着分子（ＬＩ－ＣＡＭ）、Ｌｉｖ－１、ＬＲＲＣ８Ａ（８ファミリーメンバーＡ含有ロイシンリッチリピート）、ルイスＹ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＲＴ－１（メランＡ）、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）、ＭＣＳＰ（メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、ＭＨＣ／ペプチド錯体（例えば、ＡＦＰ、ＫＲＡＳ、ＮＹ－ＥＳＯ、ＭＡＧＥ－ＡおよびＷＴ１由来ペプチドと錯体を形成するＨＬＡ－Ａ）、ＮＣＡＭ（神経細胞接着分子）、ネクチン－４、ＮＫＧ２Ｄ（ナチュラルキラー群２メンバーＤ）リガンド、ＮＹ－ＥＳＯ、腫瘍胎児抗原、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＲＡＭＥ（メラノーマの優先発現抗原）、プロゲステロン受容体、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＳＩＲＰα（シグナル調節タンパク質アルファ）、ＳＬＩＴ、ＳＬＩＴＲＫ６（ＮＴＲＫ様タンパク質６）、ＳＴＥＡＰ１（前立腺６膜貫通上皮抗原１）、スルビビン、ＴＡＧ７２（腫瘍関連糖タンパク質７２）、ＴＰＢＧ（栄養膜糖タンパク質）、Ｔｒｏｐ－２、ＶＥＧＦＲ１（血管内皮増殖因子受容体１）、ＶＥＧＦＲ２、ならびにＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶおよび他の病原体からの抗原を挙げることができる。

【0071】

いくつかの実施形態において、抗原受容体は、二重特異性であり、上記抗原のうちの２つのような２つの異なる抗原を標的とするものであってもよい。例えば、ＣＡＲなどの抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２０、またはＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする。

【0072】

さらなるポリペプチドは、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、およびそれらの改変変異体）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－７Ｒ、およびそれらの改変変異体）、ケモカイン、転写因子（例えば、ｖ－Ｊｕｎまたはｃ－ｆｏｓ；例えばＷＯ２０１９／１１８９０２参照）、それらの機能的類似体、他の改変受容体（例えばＴＧＦＢｅｔａＲ）、ならびに他の改変エフェクター（例えば、分泌性二次エフェクター；例えばＷＯ２０１８／２００５８５参照）。「機能的類似体」とは、同種のポリペプチドまたはペプチドと配列の相違があるが、対象とする生物活性がその同種の分子と同一または同様である分子を意味する。

【0073】

これらのさらなるポリペプチドのコード配列は、ＥＧＦＲ由来ポリペプチドコード配列と異なるプロモーターの制御下にあってもよい。あるいは、それらは、ＥＧＦＲ由来のコード配列と同じプロモーターの制御下にあってもよいが、それらのコード配列を同じプロモーター下で共発現できるように、ＩＲＥＳ、または２Ａペプチドのためのインフレームコード配列を介して互いに離間される。

【0074】

本開示の発現コンストラクトは、電気穿孔法、細胞超音波処理、ウイルス形質導入、リポフェクション、顕微注入、バイオリステック法、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソームおよびナノ粒子（例えば、ポリマーまたは脂質ナノ粒子）などの好適な手段によってインビトロ、エクスビボまたはインビボで標的細胞に送達される。いくつかの実施形態において、発現コンストラクトは、ウイルスベクターであり、それらのコンストラクトを含む組換えウイルスを介して標的細胞に送達される。ウイルスベクターは、ＥＧＦＲ由来ポリペプチド発現カセット、ならびに（該当する場合は）パッケージングおよびそれに続く宿主への統合に必要な最小限のウイルス配列を含む。足りないウイルス機能は、組換えウイルスをパッケージングするのに使用されるパッケージング細胞株により移行中に補充される。ウイルスベクターは、例えば、ワクチンベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、単純疱疹ウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびハイブリッドウイルスベクターであってもよい。一部にウイルス型に応じて、ＥＧＦＲ由来ポリペプチド発現カセットは、標的細胞のゲノムに安定的に統合され、エピソームとして細胞に残留する。宿主ゲノムへの統合は、レトロウイルスおよびレンチウイルスにて可能である。

【0075】

ＩＩＩ．ＥＧＦＲ由来タンパク質を発現する細胞の製薬学的用途
本発現コンストラクトは、細胞療法に使用される細胞に導入される。これらの細胞は、例えば、造血性幹細胞、造血系の各種原始細胞または前駆細胞、および各種免疫細胞（例えば、ヒト自己または同種Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞またはＢ細胞）などの多能細胞である。治療用細胞集団を生成するのに使用できるヒト胚性幹細胞および誘発多能性幹細胞などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）であってもよい。いくつかの実施形態において、多能性細胞および多能細胞は、患者に移植される前にインビトロで所望の細胞型に分化される。

【0076】

いくつかの実施形態において、本開示は、ＥＧＦＲ由来タンパク質を発現するとともに、同一のコンストラクトまたは別個のコンストラクトから１つまたはそれ以上のさらなるポリペプチドを発現する改変Ｔリンパ球を提供する。１つまたはそれ以上のさらなるポリペプチドは、上記のように、抗体などの抗原受容体、ｓｖＦｖなどの改変抗体、ＣＡＲ、改変ＴＣＲ、ＴＣＲ模倣体（例えばａｂＴＣＲもしくはｃａＴＣＲ）、またはＣＳＲであってもよい。抗原受容体は、例えば、上記の抗原を標的としてもよい。さらなるポリペプチドは、例えば、サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、転写因子、それらの機能的類似体、別の改変受容体、または上記の改変エフェクターであってもよい。これらのさらなるポリペプチドのコード配列は、ＥＧＦＲ由来ポリペプチドコード配列と異なるプロモーターの制御下にあってもよい。いくつかの実施形態において、本開示は、改変受容体を発現する改変自己または同種ＮＫ細胞、および抗体、改変抗体、または治療用タンパク質を発現する改変組織特異的細胞を発現する改変Ｂリンパ球を提供する。

【0077】

本明細書に記載の遺伝子改変細胞は、該細胞および医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物にて提供される。医薬として許容し得る担体は、動物由来成分を場合により含まない細胞培地であってもよい。保管および輸送に際して、細胞は凍結保存される。使用に先立ち、細胞は解凍され、無菌細胞培地で希釈される。細胞は、患者に（例えば静脈注射もしくは注入により）全身投与される、または（例えば、局部組織、例えば固形腫瘍の部位に対する直接注射により）局所投与される。

【0078】

治療有効数の改変細胞が患者に投与される。本明細書に用いられているように、「治療有効」という用語は、疾患、障害および／または状態に罹患している、または罹患しやすいヒト被験体に投与して、その疾患、障害および／または状態を治療する、予防する、および／またはその症状の発症もしくは進行を遅らせる場合に十分である細胞の数または医薬組成物の量を指す。例えば、改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療有効量は、腫瘍増殖の停止、腫瘍退縮、腫瘍代謝の防止または腫瘍再発の防止を生じさせるのに十分な量である。

【0079】

改変細胞が患者において所望されなくなったとき、例えば細胞が適切に機能しなくなったとき、または治療目標が達成されたとき、抗ＥＧＦＲ抗体は、抗体を媒介して細胞を殺すのに十分な量で患者に投与される。例えば、セツキシマブ（例えばＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標））が、患者に残留する改変細胞の数に応じて適宜判断される１つまたはそれ以上の用量にて、注入により投与される。

【0080】

本明細書に別段に規定されていない限り、本開示に関して用いられている科学技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料を以下に説明するが、本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を本開示の実践および試験にも使用できる。矛盾する場合は、本明細書が、定義を含めて、優先する。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医薬品および製薬化学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる用語体系およびそれらの技術は、当該技術分野で周知であり、広く用いられている。酵素反応および精製技術は、当該技術分野で一般に遂行される、または本明細書に記載されるように、製造元の仕様に従って実施される。さらに、文脈によって別段に定められていない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。本明細書および実施形態の全体を通じて、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、または「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、明記された整数または整数群を含めるが、任意の他の整数または整数群を除外しないことを暗示するものと理解される。本明細書に記載されるすべての出版物および他の参考文献は、それらの全体が参照によって組み入れられている。いくつかの文献が本明細書に引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれも当該技術分野における一般的な常識の一部を形成していることを認めるものではない。

【実施例】

【0081】

本開示がより良く理解されるために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示に過ぎず、いかなる形においても本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。

【実施例1】

【0082】

ＥＧＦＲ由来ポリペプチドの表面発現
本実施例は、ＥＧＦＲ由来ポリペプチドの細胞表面発現量に対する各種膜近傍ドメインの影響を分析する試験について記載する。

【0083】

方法
発現コンストラクト
レンチウイルスコンストラクトをバイシストロニックまたはトリシストロニック発現カセットにより生成した。バイシストロニック発現カセットによるコンストラクトでは、（ｉ）ＲＯＲ１特異的Ｒ１２ＣＡＲ、（ｉｉ）Ｐ２Ａ自己切断ペプチド、および（ｉｉｉ）ＥＧＦＲｔ（ドメインＩＩＩおよびＩＶならびに膜貫通ドメインのみを有する短縮ＥＧＦＲ；配列番号２６）またはさらに細胞内膜近傍ドメインを有する変異体のコード配列をインフレームで結合し、ＭＮＤプロモーターの制御下に置いた。トリシストロニック発現カセットによるコンストラクトでは、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎ、（ｉｉ）Ｐ２Ａペプチド、（ｉｉｉ）ＲＯＲ１特異的Ｒ１２ＣＡＲ、（ｉｖ）Ｐ２Ａペプチド；および（ｖ）ＥＧＦＲｔ、またはさらに細胞内膜近傍ドメインを有する変異体のコード配列をインフレームで結合し、ＭＮＤプロモーターの制御下に置いた。Ｒ１２ＣＡＲは、Ｒ１２抗ＲＯＲ１抗体に由来し（Ｙａｎｇら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ．（２０１１）６：ｅ２１０１８）、ＣＤ２８由来膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。

【0084】

細胞培養およびレンチウイルス形質導入
ジャーカット細胞をアメリカンタイプカルチャコレクション（ＡＴＣＣ；バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手した。レンチウイルス形質導入については、形質導入の前に細胞に新鮮培地を４～１６時間供給した後、完全培地＋製造元が推奨する濃度のＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標）（Ｓｉｒｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にてレンチウイルスとともにインキュベートした。形質導入の１８時間後に、レンチウイルスおよびＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標）を１容量の新鮮培地の添加によって希釈した。

【0085】

通常のドナーからの予め選択され冷凍保存された初代ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をＢｌｏｏｄｗｏｒｋｓ（ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ）から入手した。ヒトＴ細胞を、Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのグルタマックス（Ｇｉｂｃｏ）、２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－７（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）および２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）が補充されたＯｐＴｍｉｚｅｒ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にて培養した。レンチウイルス形質導入では、Ｔ細胞をＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の１：１００希釈物で３０時間刺激した。次いで、ウイルスをＴ細胞に１８～２４時間かけて添加した。次いで、ＴｒａｎｓＡｃｔを含まない７容量の新鮮培地を添加することにより刺激およびウイルス感染を終了させ、分析前に細胞をさらに３～７日培養した。

【0086】

フローサイトメトリー
Ｚｅ５サイトメーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でフローサイトメトリーを行った。細胞表面マーカーの発現を測定するために、約１×１０^５～２×１０^５個の全細胞を底がＶ字形の９６ウェル培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。細胞をフローサイトメトリー染色バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で２回洗浄し、全容量が５０μｌのフローサイトメトリー染色バッファー中にて適切な試薬により氷上で３０分間染色した。染色後、細胞をフローサイトメトリー染色バッファーで２回洗浄し、ＦｌｕｏｒｏＦｉｘバッファー（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）にて固定し、分析するまで４℃で暗所にて維持した。ＦｌｏｗＪｏ１０（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用してフローサイトメトリーデータを解析した。

【0087】

フローサイトメトリー分析では、蛍光色素ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で標識したＡＹ１３抗体を使用して、ＥＧＦＲ変異体を検出した。Ｒ１２ＣＡＲを検出するために、ヒトＩｇＦｃに融合した精製組換えＲＯＲ１を自家製造し、Ａｌｅｘａ６４７染料に結合させた。一次抗体染色時にｅＦｌｕｏｒ７８０Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ染料（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を１：８０００の希釈率で含めた。

【0088】

結果
ＥＧＦＲｔの細胞表面発現を調節するために、その膜貫通Ｃ末端を、膜近傍に２つの酸残基（アスパラギン酸およびグルタミン酸）を含む４３アミノ酸合成配列（ＤＥＡＲＫＡＩＡＲＶＫＲＥＳＫＲＩＶＥＤＡＥＲＬＩＲＥＡＡＡＡＳＥＫＩＳＲＥＡＥＲＬＩ；配列番号４１）に融合させた。形質導入した初代Ｔ細胞においてＣ末端融合されていないＥＧＦＲｔと比較してＥＧＦＲｔの細胞表面検出が劇的に低減されていることを見いだした（図１Ａおよび１Ｂ）。これに対して、ＥＧＦＲｔの膜貫通Ｃ末端を（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号４２、ｎ＝２）に融合させると、融合されていないＥＧＦＲｔと比較して、検出された融合タンパク質の細胞表面における濃度が劇的（５倍に）に増加していた（ジャーカット細胞；データ不図示）。これらのデータは、適切な膜近傍細胞内部分を含めると、ＥＧＦＲｔ変異体の表面発現が調節されることを示唆している。

【0089】

膜近傍細胞内領域における特定のアミノ酸組成物は、タンパク質合成時に膜挿入を増強すること、および／または膜貫通タンパク質の安定性を向上させることによって、ＥＧＦＲｔマーカーの表面発現を増大させることができると仮定した。この仮説を試験するために、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ－ＩＶ、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン、および原生ＥＧＦＲ配列または合成配列に由来する短い細胞内ドメインを含むＥＧＦＲｔモジュールを生成した。ヒトＥＧＦＲのＴ６７８は調節的リン酸化のサイトになり得るため、アミノ酸６６９～６７１（ＲＲＲ）または６６９～６７７（ＲＲＲＨＩＶＲＫＲ；配列番号１６）を含む試験タンパク質（図２Ａおよび２Ｂ）を選択した。グリシンは、α－螺旋構造を破壊でき、他の受容体チロシンキナーゼタンパク質の膜近傍領域に富むため、構造化されていないグリシン／セリンリッチのリンカーを含む細胞内ドメイン（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号１３）、またはその後ろにグリシン／セリンリッチのリンカーが続く原生膜近傍ドメインの短部分（ＲＲＲＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号１２）についても試験した。この試験では、Ｐ２Ａスキップ配列によりＥＧＦＲｔ変異体に結合されたＲＯＲ１特異的Ｒ１２ＣＡＲを発現するレンチウイルスを初代Ｔ細胞に形質導入した（図３Ａ）。Ｒ１２ＣＡＲおよび共発現されたＥＧＦＲ由来ポリペプチドの発現をフローサイトメトリーによって測定した。

【0090】

それらのデータにより、膜に近接した酸残基（図１Ａおよび１Ｂ）を含む膜近傍配列を除いて、膜近傍配列を含むＥＧＦＲｔ変異体は、膜近傍配列を含まないＥＧＦＲｔポリペプチド（図３Ｂ）と比較して、一定して高い平均蛍光強度を示したことが実証される。とりわけ、翻訳的に結合されたＲ１２ＣＡＲの表面発現は、すべてのコンストラクトに対して一定であり（図３Ｂ）、ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔの両方の発現に影響を与えるのは、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率の調節に対する影響ではなく、ＥＧＦＲｔ安定性に対する膜近傍配列の直接的な影響であることが示される。

【0091】

ＥＧＦＲドメインＩＩＩ特異的ＡＹ１３モノクローナル抗体の結合が正確にセツキシマブの結合を反映することを確認するために、ＡＹ１３とセツキシマブバイオシミラーとで測定されたＥＧＦＲｔの発現量（ｇＭＦＩ）を比較した。それら２つの抗体のｇＭＦＩ間の直線的関係、および膜近傍配列を有するＥＧＦＲｔ変異体に対するセツキシマブバイオシミラーの結合の明白な増加（図４Ａおよび４Ｂ）が、データにより実証された。ＥＧＦＲｔの発現に対するウイルスコピー数の役割を調べるため、ある範囲のレンチウイルス価にわたって初代Ｔ細胞を形質導入した。先述の結果と同様に、Ｒ１２ＣＡＲの表面ｇＭＦＩは、一致した形質導入頻度ですべてのコンストラクトを通じて均一であった。これに対して、細胞内配列を含むすべてのＥＧＦＲｔ変異体の表面ｇＭＦＩは、この配列を欠くＥＧＦＲｔマーカーの約３～５倍であった（図５Ａおよび５Ｂ）。これらのデータは、好適な細胞内ドメインが存在すると、共発現Ｒ１２ＣＡＲの発現量によって測定された場合に、翻訳効率が同等であってもＥＧＦＲｔタンパク質の細胞表面提示が向上することを示している。これらの結果は、タンパク質合成時の膜挿入の増強または膜タンパク質安定性の向上が、ＥＧＦＲ由来タンパク質の表面発現を向上させる役割を果たすことを実証するものである。

【0092】

２Ａ含有発現カセットにおけるシストロン要素の数が増加すると、一部にリボソームの脱落および２Ａ要素の不十分な切断によりそれらの要素の発現が５’から３’に低下するという一般的傾向がある。この理由により、ＥＧＦＲｔ変異体の有効表面発現を最大限に大きくすることが、トリシストロニックおよびより高次元のベクターにとって特に重要である。トリシストロニック発現カセットにおけるＥＧＦＲｔ発現に対する膜近傍配列の影響を試験するため、ｃ－Ｊｕｎ転写因子、Ｒ１２ＣＡＲ、およびＰ２Ａスキップ配列により結合されたＥＧＦＲｔモジュールを含むレンチウイルスベクターを生成した（図６Ａ）。ＥＧＦＲｔモジュールは、細胞内ドメインを含まないもの、またはヒトＥＧＦＲ配列のアミノ酸６６９～６７１もしくは６６９～６７７を含む細胞内ドメインを含むものであった。バイシストロニックベクターについて観察すると、Ｒ１２ＣＡＲ発現は、すべてのコンストラクトを通じて同様であった。これに対して、ＥＧＦＲｔの表面発現は、膜近傍配列の追加により約４倍に増加した（図６Ｂおよび６Ｃ）。

【実施例2】

【0093】

ＥＧＦＲｔ変異体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のセツキシマブ媒介ＡＤＣＣ
本実施例では、細胞療法における安全スイッチとしての本明細書に記載のＥＧＦＲ由来タンパク質の効率を分析する試験について説明する。ＥＧＦＲｔの表面発現の変化は、このマーカーのインビボでの選択マーカーおよび安全スイッチとしての有用性に影響を及ぼす可能性がある。セツキシマブは、腫瘍細胞のＡＤＣＣをＥＧＦＲ依存的に誘発する（Ｋｉｍｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．（２００７）９８（８）１２７５～８０頁）。試験した４つ膜近傍配列がすべて表面ＥＧＦＲｔ発現の同様の増大を誘発したため、膜近傍配列を含まない、またはヒトＥＧＦＲ由来ＲＲＲおよびＲＲＲＨＩＶＲＫＲ（配列番号１６）配列を含むＥＧＦＲｔコンストラクトをＡＤＣＣ試験のために選択した。

【0094】

方法
ＡＤＣＣ試験において、初代ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をエフェクター細胞として使用した。ＥａｓｙＳｔｅｐ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を製造元のプロトコルに従って使用して、陰性選択によりナチュラルキラー細胞を、凍結保存したＴ細胞枯渇（ＣＤ４－／ＣＤ８－）ＰＢＭＣ（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）から単離した。それらの細胞溶解性機能を活性化させるために、単離したＮＫ細胞を、使用前に、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１５が補給されたＲＰＭＩ－１０にて一晩培養した（Ｗａｇｎｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（２０１７）１２７（１１）：４０４２～５８頁；Ｄｅｒｅｒ ２０１２、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２）１８９（１１）：５２３０～９頁）。

【0095】

凍結保存された形質導入原始Ｔ細胞を解凍し、上記のようにＯｐＴｍｉｚｅｒ培地＋サイトカインにて一晩予備培養した。次いで細胞をカウントし、ＲＰＭＩ－１０に再懸濁し、底がＶ字形の９６ウェルプレートに１００μｌ容量添加し、（ｉ）指定最終濃度のセツキシマブバイオシミラー、（ｉｉ）無抗体（０）、または（ｉｉｉ）２，０００ｎｇ／ｍｌのリツキシマブバイオシミラー（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、ＩＬ－１５で感作されたＮＫ細胞をＮＫ：ＣＡＲ－Ｔ細胞が１０：１の割合になるように添加し、底がＶ字形のプレートに緩やかに（１００ｘｇで３０秒）遠心分離を施して、エフェクターと標的細胞を一緒にした。４時間の共培養後、残留するＣＡＲ＋Ｔ細胞をＦＡＣＳによって識別した。サンプルを抗ＣＤ３、抗ＣＤ５６、ＲＯＲ１－ＦｃおよびＦＶＤ７８０で染色し、固定し、容量計数方式のＺｅ５サイトメーターに配置した。抗体で処理された、または処理されていない全生ＣＤ５６－ＣＤ３＋ＲＯＲ１－Ｆｃ＋集団を比較することによってＴ細胞の抗体特異的ＡＤＣＣを評価した。

【0096】

【表5】

【0097】

結果
それらのデータにより、膜近傍配列を欠くＥＧＦＲｔは、ＮＫ細胞およびセツキシマブの存在下で低ＡＤＣＣを示したのに対して、３アミノ酸ＲＲＲ膜近傍配列を含むＥＧＦＲｔは、５ｎｇ／ｍｌの低いセツキシマブ用量においてもＮＫ細胞の存在下で効率的に死滅させられた（図７）。

【0098】

３’位にＥＧＦＲｔ配列を含むトリシストロニックコンストラクト（図６Ａ）では、４時間の処理後に、膜近傍配列を欠くＥＧＦＲｔのＡＤＣＣが最小になった。これに対して、ＲＲＲまたはＲＲＲＨＩＶＲＫＲ（配列番号１６）膜近傍ドメインを含むＥＧＦＲｔは、４時間の処理後に、用量依存的に有意なセツキシマブ媒介ＡＤＣＣを示した（図８）。２４時間のセツキシマブ処理後に、膜近傍配列を欠くＥＧＦＲｔは、セツキシマブおよびＮＫ依存的に部分的なアブレーションを示したのに対して、ＲＲＲまたはＲＲＲＨＩＶＲＫＲ（配列番号１６）膜近傍配列を含むＥＧＦＲｔは、セツキシマブおよびＮＫ依存的にほぼ完全なアブレーションを示した（図９）。

【実施例3】

【0099】

さらなるＥＧＦＲ由来ポリペプチドの表面発現
本実施例では、ＥＧＦＲ由来ポリペプチドの細胞表面発現量に対する各種短膜近傍配列および残基交換膜近傍配列の影響の分析について検討する。

【0100】

ＥＧＦＲ由来ポリペプチドの細胞表面発現を最大にするための最小限の配列要件を試験するために、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎ、（ｉｉ）ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ、および（ｉｉｉ）ＥＧＦＲ由来ポリペプチドを含むトリシストロニックコンストラクトを実施例１に記載したように設計した。これらのトリシストロニックコンストラクトは、ＥＧＦＲｔ、またはさらなる短膜近傍配列：（ｉ）アルギニン残基が１つ（Ｒ）、（ｉｉ）アルギニン残基が２つ（ＲＲ）、（ｉｉｉ）アルギニン残基が３つ（ＲＲＲ）、もしくは（ｉｖ）１つのアルギニン残基をリシンと交換（ＲＫＲ）を有するその変異体をコードした。

【0101】

２つの異なるヒトドナーからの初代Ｔ細胞に指定のトリシストロニックコンストラクトを形質導入するか、または形質導入しなかった。形質導入の６日後に、細胞をＲＯＲ１－Ｆｃ抗原結合、ＥＧＦＲ発現および固定性生死判定染料に関して染色した。

【0102】

図１０は、ＲＯＲ１ ＣＡＲ＋形質導入細胞、または形質導入しない条件での全生細胞中で結合する抗ＥＧＦＲ抗体についてのｇＭＦＩを示す。図に示されるように、ＲＫＲ膜近傍配列を含むＥＧＦＲ由来ポリペプチドは、強い細胞表面発現を維持した。アルギニン残基が１つ、２つまたは３つ（Ｒ、ＲＲまたはＲＲＲ）の膜近傍配列を含むＥＧＦＲ由来ポリペプチドの細胞表面発現量を比較すると、細胞内膜近傍ドメインをＲＲＲからＲＲに短縮することにより表面発現が２．７％低下したことが分かる。これに対して、細胞内膜近傍ドメインをＲＲＲからＲに短縮することにより表面発現が２２％低下した。

【実施例4】

【0103】

インビボにおけるＥＧＦＲ由来ポリペプチドのキルスイッチ機能
本実施例では、セツキシマブ投与後の短縮ＥＧＦＲのインビボのキルスイッチ機能に対する膜近傍ＲＲＲドメインの影響の評価について検討する。

【0104】

方法
発現コンストラクト
ＭＰ７１レトロウイルスベクターを使用して、これらの試験に使用するコンストラクトを生成した。ヒトＥＧＦＲｔ（ＭＰ７１－ＥＧＦＲｔ）、膜近傍ドメインＲＲＲを有する変異体（ＭＰ７１－ＥＧＦＲ－ＲＲＲ）、ｍＣＤ１９ｓｃＦｖ．２８ｚ ＣＡＲ（ｍ１９．２８ｚまたはｍＣＤ１９．２８ｚとも表記される）およびＥＧＦＲｔもしくはＥＧＦＲ－ＲＲＲ（ＭＰ７１－ｍＣＤ１９ｓｃＦｖ．２８ｚ．ＥＧＦＲｔ／ＥＧＦＲ－ＲＲＲ；本明細書ではＭＰ７１＿ｍ１９．２８ｚ．Ｐ２Ａ．ＥＧＦＲｔ／ＥＧＦＲ－ＲＲＲとも表記される）をコードするバイシストロニックＣＡＲ発現カセット、またはｃ－Ｊｕｎ、ｍＣＤ１９ｓｃＦｖ．２８ｚおよびＥＧＦＲｔもしくはＥＧＦＲ－ＲＲＲ（ＭＰ７１－ｃＪｕｎ．ｍＣＤ１９ｓｃＦｖ．２８ｚ．ＥＧＦＲｔ／ＥＧＦＲ－ＲＲＲ；本明細書ではＭＰ７１＿ｃＪｕｎ．Ｔ２Ａ．ｍ１９．２８ｚ．Ｐ２Ａ．ＥＧＦＲｔ／ＥＧＦＲ－ＲＲＲＴ、もしくはｃＪｕｎ．ｍ１９．２８ｚ．ＥＧＦＲｔ／ＥＧＦＲ－ＲＲＲとも称する）をコードするトリシストロニックＣＡＲ発現カセットのコード配列を含めるようにベクターを改造した。

【0105】

バイシストロニックＣＡＲコンストラクトは、マウスＣＤ８ａシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１７３１アミノ酸１～２７）、ＩＤ３ハイブリドーマに由来するマウスＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ（Ｄａｖｉｌａら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１３）８（４）：ｅ６１３３８）、マウスＣＤ８ａヒンジおよび膜貫通領域（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１７３１アミノ酸１５１～２１９）、マウスＣＤ２８細胞内領域（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ３１０４１アミノ酸１７７～２１８）、ならびにマウスＣＤ３ｚ細胞内ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２４１６１アミノ酸５２～１６４）を含むＣＡＲ（ｍＣＤ１９．２８ｚ ＣＡＲ）のコード配列を含んでいた。このＣＡＲコード配列を、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列のコード配列によりヒトＥＧＦＲポリペプチドのコード配列（ヒトＥＧＦＲｔのためのＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ００５３３アミノ酸３３４～６６８）に結合させた。トリシストロニックコンストラクトでは、マウスｃ－Ｊｕｎのコード配列（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０５６２７アミノ酸１～３３４）をｍＣＤ１９．２８ｚ ＣＡＲコード配列の上流でクローン化し、Ｔ２Ａペプチドコード配列により結合させた。

【0106】

細胞培養、形質導入、および養子移植
レトロウイルス製造では、リン酸カルシウム（Ｔａｋａｒａ）を使用してＰｌａｔ－Ｅ細胞（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）を過渡的に形質転換した。４８時間後に上清を回収し、０．４５μｍフィルタでろ過し、ドライアイスで急速冷凍してから－８０℃で保管した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢ６．ＳＪＬ（ＣＤ４５．１）ドナーマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。

【0107】

Ｔ細胞の形質導入では、単一細胞懸濁液を６～８週齢のＣＤ４５．１ドナーマウスの脾臓および末梢リンパ節から得て、４０μｍのメッシュでろ過した。マウスＣＤ８Ｔ細胞を陰性選択（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）により濃縮し、５０Ｕ／ｍｌのマウスＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）が補給された完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ１６４０、１０％加熱不活性化ＦＢＳ、１ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび５０μＭのβ－メルカプトエタノール）中３７℃および５％ＣＯ_２にて１μｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（１４５－２Ｃ１１）および抗ＣＤ２８（３７．５１）で２０時間刺激した。予め力価を測定したレトロウイルスを、１２．５μｇ／ｍｌのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｔａｋａｒａ）がプレコートされた無組織培養プレート上に加え、３２℃にて２５６０ｒｃｆで２時間遠心分離を施すことによって取り込んだ。刺激したＣＤ８^＋Ｔ細胞を採取し、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２および抗ＣＤ３／２８マウスＴ活性化因子Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）が１：１の割合で補給された完全ＲＰＭＩ中にて１×１０^６個／ｍｌで再懸濁した。ウイルスがコートされたウェルを吸引し、ＰＢＳで濯いだ後、Ｔ細胞を添加し、３２℃にて８００ｒｃｆで３０分間遠心分離を施し、５％ＣＯ_２中３７℃でインキュベートした。

【0108】

２４時間後、ＩＬ－２が補給された完全ＲＰＭＩ培地を取り換え、Ｔ細胞をさらに２４時間インキュベートした。Ｔ細胞を採取し、５０Ｕ／ｍｌのマウスＩＬ－１５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）が補給された完全ＲＰＭＩに１×１０^６個／ｍｌで再懸濁し、さらに４８時間インキュベートした。続いて、磁性活性化ビーズを除去し、Ｔ細胞形質導入効率（４０～６０％ＥＧＦＲ^＋）をフローサイトメトリーにより確認した。次いで、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０に３×１０^６ＥＧＦＲ^＋／１００μｌで再懸濁することによって養子移植のための形質導入細胞を調製し、養子移植に先立って氷上に維持した。

【0109】

ＣＡＲ－Ｔ細胞養子移植では、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを２００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドの腹腔内注射により前処置し、６時間後に、３×１０^６ＥＧＦＲ^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を後眼窩注射により静脈内注射した。末梢血の分析では、ＣＡＲ－Ｔ細胞移植から指定日数後に、ＥＤＴＡコートされた管内に後眼窩から出血させることによって１００μｌの血液サンプルを回収し、表面染色に先立って血液サンプルをＡＣＫ溶解バッファーにより２回処理した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して４℃で１５分間サンプルを染色した。また、細胞を、抗ＣＤ８ａＦＩＴＣ（５３－６．７、別段に指定されていない限りＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１９ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ（商標）５．５（１Ｄ３）、抗ＣＤ４ＰＥ－Ｃｙ（商標）７（ＰＭ４－５）、抗ＣＤ４５．２ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ（商標）７５０（１０４）、抗ＣＤ４５．１ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１（商標）（Ａ２０）、ｈＥＧＦＲ ＡＰＣまたはＰＥ（ＡＹ１３）を含む流動バッファー（ＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび２％ＦＢＳ）中暗所にて４℃で３０分間染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（商標）細胞分析装置に配置した。

【0110】

移植ＥＧＦＲ^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の枯渇では、８日目にセツキシマブをマウス１匹あたり１ｍｇまたは０．１ｍｇ注入した。フローサイトメトリーにより、血液サンプル中のＣＡＲ－Ｔ細胞の増加および枯渇を監視した。マウスは、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞の頻度が、全循環内因性ＣＤ４５．２^＋細胞の３％未満に維持されているときにＢ細胞形成不全を示すことが実証された。

【0111】

結果
ＥＧＦＲ－ＲＲＲは、注入生成物において優れた表面発現量を示す
インビトロにおける短縮ＥＧＦＲの表面発現に対する膜近傍改造の影響を評価するために、マウスＣＤ８^＋Ｔ細胞に、ＲＲＲ膜近傍ドメインを含む、または含まないヒトＥＧＦＲｔのマウスコドン最適化配列を含むレトロウイルスコンストラクトを形質導入し、先述のようにフローサイトメトリーによる分析を行った。ＣＤ８^＋Ｔ細胞に同様のレベル（５０～５６％）で形質導入を行った場合、ＥＧＦＲ^＋Ｔ細胞は、ＥＧＦＲｔと比較して、３倍を超えるＥＧＦＲ－ＲＲＲ表面発現の増加を示した（図１１Ａ）。

【0112】

マルチシストロニックコンストラクトに関する膜近傍ドメインの影響を測定するために、ＥＧＦＲポリペプチドのコード配列をＰ２Ａ自己切断ペプチドのコード配列によりＣＡＲ標的マウスＣＤ１９のコード配列の３’末端に結合させた。同様の形質導入効率において、ＥＧＦＲ－ＲＲＲコンストラクトが形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＥＧＦＲｔコンストラクトが形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞より高レベルのＥＧＦＲ染色を示した（図１１Ｂ）。そのため、同様の形質導入レベルのＴ細胞サンプルにおいて表面発現をフローサイトメトリーにより測定すると、ＥＧＦＲ－ＲＲＲは、ＣＡＲ Ｔ細胞注入生成物での表面発現量の増加を示した。

【0113】

ＥＧＦＲ－ＲＲＲは、インビボでの抗体媒介枯渇の安定標的である
安定的に発現されるＥＧＦＲｔをＥＧＦＲ標的抗体セツキシマブによる枯渇のための標的とすることができる（Ｐａｓｚｋｉｅｗｉｃｚら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（２０１６）１２６（１１）：４２６２～７２頁）。インビボにおいてＥＧＦＲ－ＲＲＲ表面発現が維持され、枯渇のための標的とされるかどうかを評価するために、ＥＧＦＲｔまたはＥＧＦＲ－ＲＲＲをバイシストロニックコンストラクト（ｍＣＤ１９ＣＡＲの下流）またはトリシストロニックコンストラクト（ｃＪｕｎ．ｍＣＤ１９ＣＡＲの下流）にて、コンジェニック標識された（ｃｏｎｇｅｎｉｃａｌｌｙ ｍａｒｋｅｄ）ＣＤ４５．１^＋ドナーＣＤ８^＋Ｔ細胞上に発現させた。それらのデータは、ＥＧＦＲ－ＲＲＲが注入生成物においてより高い量の表面発現を示したことを実証している（図１２Ａ、下図）。３×１０^６個のＥＧＦＲ^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を含むバルクＴ細胞注入物をリンパ球枯渇（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｅｄ）マウスに養子移植した。示されるように、血液中の循環ＣＡＲ－Ｔ細胞量を追跡した（図１２Ａ、上図）。ＥＧＦＲ^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞は、注入の１～２週間後に増加ピークを迎え、その後は減少した。

【0114】

ＥＧＦＲ－ＲＲＲを枯渇のための標的とすることができることを確認するために、１４日目に、各群のマウスの半分に１ｍｇのセツキシマブまたは１ｍｇのリツキシマブ（対照）を投与した。注射後、セツキシマブでは、ＥＧＦＲｔおよびＥＧＦＲ－ＲＲＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞の大部分が枯渇したのに対して、リツキシマブ群では、ＣＡＲ－Ｔ細胞が観察期間を通じてより高い量を維持していた（図１２Ｂ）。ＣＡＲを含まない場合のＴ細胞がＥＧＦＲｔまたはＥＧＦＲ－ＲＲＲを発現したときも同様の枯渇結果が得られた（図１２Ｃ）。これらの結果は、ＥＧＦＲ－ＲＲＲ表面発現量がインビボで維持され、セツキシマブによる枯渇のために効率的に標的とされたことを実証している。

【0115】

ＥＧＦＲ－ＲＲＲは、セツキシマブによるＴ細胞枯渇の後のＢ細胞のより迅速な回復を媒介する
膜近傍ドメインの追加によりＥＧＦＲの表面量が増加したため、次に、ＥＧＦＲ－ＲＲＲがインビボで差別的なＣＡＲ－Ｔ細胞枯渇動態および機能的成果を示すかどうかを判断した。その目的のために、ＥＧＦＲｔまたはＥＧＦＲ－ＲＲＲを発現するコンジェニック表式されたｍＣＤ１９．２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をリンパ球枯渇マウスに養子移植した。Ｔ細胞生着およびＢ細胞形成不全を血液中で経時的に追跡した（図１３Ａ）。ＥＧＦＲｔとＥＧＦＲ－ＲＲＲ ｍＣＤ１９．２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞との枯渇動態の差を明確にするために、セツキシマブの用量滴定を行った。０．１ｍｇのセツキシマブの単一投与により枯渇のためにＥＧＦＲを標的とすることは、抗体注射の３日後に循環ＥＧＦＲｔおよびＥＧＦＲ－ＲＲＲ ＣＡＲ－Ｔを枯渇するのに十分であった。表面ＥＧＦＲの発現量は、インビボでのｍＣＤ１９．２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の枯渇動態を決定づけることが既に実証されている（Ｐａｓｚｋｉｅｗｉｃｚら、２０１６）。ＥＧＦＲ－ＲＲＲは、セツキシマブ後のより迅速なＢ細胞回復の動態を媒介できるかどうかを判断するために、事後の枯渇が発生する場合、または発生しない場合において、ｍＣＤ１９．２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が投与されたマウスでの循環Ｂ細胞を追跡した。ｍＣＤ１９．２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で処理されたマウスは、持続的なＢ細胞形成不全を示したのに対して、セツキシマブ処理マウスにおけるＢ細胞は、抗体投与から３週間以内に回復した。既にＥＧＦＲ－ＲＲＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞が注入されたマウスへのセツキシマブ投与は、より低用量の投与の場合も含めてＢ細胞のより迅速な回復（図１３Ｂ）、およびより迅速なＢ細胞形成不全の解消（図１３Ｃ）をもたらした。したがって、ＥＧＦＲ－ＲＲＲは、ＣＡＲ－Ｔ細胞のより効率的な枯渇を媒介することで、セツキシマブ後のＣＡＲ－Ｔ細胞応答のより迅速な停止動態が得られる。

【0116】

要約すると、ｍＣＤ１９．２８ｚ．ＥＧＦＲ－ＲＲＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、より高いＥＧＦＲ発現量を示す。この発現は、インビボで維持され、セツキシマブによる枯渇のために効率的に標的とされた。ＥＧＦＲｔと異なり、セツキシマブでＥＧＦＲ－ＲＲＲを標的とすることにより、インビボにおけるｍＣＤ１９．２８ｚ．ＣＡＲ Ｔ細胞の完全な枯渇およびＢ細胞のより迅速な回復がもたらされた。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【配列表】

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【国際調査報告】