特表 2023-518327 アデノ随伴ウイルスカプシドポリペプチドおよびベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-28

(54)【発明の名称】アデノ随伴ウイルスカプシドポリペプチドおよびベクター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20230421BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230421BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20230421BHJP

   C07K 14/015 20060101ALI20230421BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230421BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20230421BHJP

   C12N 15/35 20060101ALN20230421BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N7/01

C12N5/071

C07K14/015

C12N5/10

C12N15/85 Z

C12N15/35 ZNA

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022576570

(86)(22)【出願日】2021-02-25

(85)【翻訳文提出日】2022-10-21

(86)【国際出願番号】 AU2021050158

(87)【国際公開番号】W WO2021168509

(87)【国際公開日】2021-09-02

(31)【優先権主張番号】2020900529

(32)【優先日】2020-02-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522336937

【氏名又は名称】チルドレンズ・メディカル・リサーチ・インスティテュート

【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ

(71)【出願人】

【識別番号】522336948

【氏名又は名称】ザ・シドニー・チルドレンズ・ホスピタルズ・ネットワーク・（ランドウィック・アンド・ウエストミード）・（インコーポレイティング・ザ・ロイヤル・アレクサンドラ・ホスピタル・フォー・チルドレン）

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｓｙｄｎｅｙ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ （Ｒａｎｄｗｉｃｋ ａｎｄ Ｗｅｓｔｍｅａｄ） （ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ａｌｅｘａｎｄｒａ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆｏｒ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ）

(71)【出願人】

【識別番号】521058818

【氏名又は名称】ロジックバイオ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】リソウスキー，レスゼク

(72)【発明者】

【氏名】カバネス クルース，マルティ

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンダー，イアン

(72)【発明者】

【氏名】ヘッベン，マチアス シャルル ジェローム

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA01

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、一般に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドおよびコードする核酸分子に関する。本開示はまた、カプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクター、およびコードする核酸分子を含む核酸ベクター（例えば、プラスミド）、ならびにベクターを含む宿主細胞にも関する。本開示はまた、ポリペプチド、コードする核酸分子、ベクターおよび宿主細胞の方法および使用にも関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）配列番号２～２０および６５～７９のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約９５％の配列同一性を有する配列；
（ｉｉ）配列番号２、６、７、９、１０、１２～１４、１６～２０、６９、７１～７４、７６および７８のいずれか１つの位置１３８～７３５、配列番号５、８および１１のいずれか１つの位置１３８～７３４、配列番号３、１５、６５、６８、７５、７７および７９のいずれか１つの位置１３８～７３６、配列番号４、６７および７０のいずれか１つの位置１３８～７３７、または配列番号６６の位置１３８～７３８のアミノ酸の配列；またはそれに対して少なくとももしくは約９５％の配列同一性を有する配列；ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）配列番号５、８および１１のいずれか１つの位置２０３～７３４、配列番号１５の位置２０３～７３６、配列番号２、６、７、９、１０、１２～１４、１６～２０、６９、７１～７４、７６および７８のいずれか１つの位置２０４～７３５、配列番号３、６５、６８、７５、７７および７９のいずれか１つの位置２０４～７３６、配列番号４、６７および７０のいずれか１つの位置２０４～７３７、または配列番号６６の位置２０４～７３８のアミノ酸の配列；またはそれに対して少なくとももしくは約９５％の配列同一性を有する配列
を含む、カプシドポリペプチド。

【請求項2】

（ｉ）配列番号１３に示されるアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列；
（ｉｉ）配列番号１３の位置１３８～７３５のアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列；および／あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１３の位置２０４～７３５のアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列
を含む、請求項２に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項3】

（ｉ）配列番号１３に示されるアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％の配列同一性を有する配列；
（ｉｉ）配列番号１３の位置１３８～７３５のアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％の配列同一性を有する配列；および／あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１３の位置２０４～７３５のアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％の配列同一性を有する配列
を含み；
ａ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ２６３、Ｑ２６４、Ｓ２６５、Ｓ２６８およびＨ２７２；
ｂ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｔ５４６、Ｇ５４７、Ｔ５４９、Ｎ５５０、Ｋ５５１、Ｔ５５２、Ｔ５５３、Ｌ５５４、Ｅ５５５、Ｎ５５６、Ｌ５５８、Ｍ５５９、Ｎ５６１、Ｒ５６６およびＰ５６７；ならびに／または配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ５８０、Ｓ５８１、Ａ５８５、Ａ５８６、Ａ５９０、Ｔ５９２、Ｑ５９３、Ｖ５９４、およびＮ５９７
を含む、カプシドポリペプチド。

【請求項4】

ａ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３～２７２のアミノ酸の配列ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号５８）；ならびに
ｂ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置５４６～５６７のアミノ酸の配列ＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号５９）、および／または配列番号１３に対するナンバリングで、位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）
を含む、請求項３に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項5】

ａ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６１～２７２のアミノ酸の配列ＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号８０）；
ｂ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置５４５～５６７のアミノ酸の配列ＫＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号８１）、および／または配列番号１３に対するナンバリングで、位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）
を含む、請求項３または４に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項6】

配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｄ５３２、Ｓ５３８、およびＶ５４０を含む、請求項３～５のいずれか一項に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項7】

配列番号１３に対するナンバリングで、位置５３２～５４０のアミノ酸の配列ＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号６１）を含む、請求項６に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項8】

配列番号１３に対するナンバリングで、位置５３２～５４０のアミノ酸の配列ＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号８２）を含む、請求項６または７に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項9】

配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ４５１、Ｑ４５６、Ｇ４５７、Ｑ４６０、Ｌ４６２、Ａ４６６、Ａ４６９、Ｎ４７０、Ｓ４７２およびＡ４７３を含む、請求項３～８のいずれか一項に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項10】

配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５１～４７３のアミノ酸の配列ＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号６２）を含む、請求項９に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項11】

配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５０～４７３のアミノ酸の配列ＱＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号８３）を含む、請求項９または１０に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項12】

配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｌ４９３、Ｓ４９４、Ｇ５０５、Ａ５０６、Ｖ５１８およびＶ５２２を含む、請求項３～８のいずれか一項に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項13】

配列番号１３に対するナンバリングで、位置４９３～５２２のアミノ酸の配列ＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号６３）を含む、請求項９に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項14】

配列番号１３に対するナンバリングで、位置４８８～５２２のアミノ酸の配列ＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号８４）を含む、請求項１２に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項15】

（ｉ）配列番号１３に示されるアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％の配列同一性を有する配列；
（ｉｉ）配列番号１３の位置１３８～７３５のアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％の配列同一性を有する配列；および／あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１３の位置２０４～７３５のアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％の配列同一性を有する配列
を含み；
配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ４５１、Ｑ４５６、Ｇ４５７、Ｑ４６０、Ｌ４６２、Ａ４６６、Ａ４６９、Ｎ４７０、Ｓ４７２、Ａ４７３、Ｌ４９３、Ｓ４９４、Ｇ５０５、Ａ５０６、Ｖ５１８、Ｖ５２２、Ｄ５３２、Ｓ５３８、Ｖ５４０、Ｔ５４６、Ｇ５４７、Ｔ５４９、Ｎ５５０、Ｋ５５１、Ｔ５５２、Ｔ５５３、Ｌ５５４、Ｅ５５５、Ｎ５５６、Ｌ５５８、Ｍ５５９、Ｎ５６１、Ｒ５６６、Ｐ５６７、Ｓ５８０、Ｓ５８１、Ａ５８５、Ａ５８６、Ａ５９０、Ｔ５９２、Ｑ５９３、Ｖ５９４、およびＮ５９７を含む、カプシドポリペプチド。

【請求項16】

配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５１～４７３のアミノ酸の配列ＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号６２）；位置４９３～５２２のアミノ酸の配列ＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号６３）；位置５３２～５４０のアミノ酸の配列ＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号６１）；位置５４６～５６７のアミノ酸の配列ＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号５９）；位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）を含む、請求項１５に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項17】

配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５０～４７３のアミノ酸の配列ＱＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号８３）；位置４８８～５２２のアミノ酸の配列ＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号８４）；位置５３２～５４０のアミノ酸の配列ＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号８２）；位置５４５～５６７のアミノ酸の配列ＫＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号８１）；および配列番号１３に対するナンバリングで、位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）を含む、請求項１５または１６に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項18】

ａ）配列番号１３に対するナンバリングで、２６２位の後のＮＧ、ならびに残基Ｔ２６３、Ｓ２６４、Ｇ２６５、Ｔ２６８、およびＴ２７２の挿入；またはｂ）配列番号１３に対するナンバリングで、２６２位の後のＮＧおよび位置２６３～２７２のアミノ酸の配列ＴＳＧＧＡＴＮＤＮＴの挿入をさらに含む、カプシド請求項１５～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項19】

配列番号１３に示されるアミノ酸の配列、配列番号１３の位置１３８～７３５のアミノ酸の配列、または配列番号１３の位置２０４～７３５のアミノ酸の配列に対して少なくとももしくは約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％の配列同一性を含む、請求項３～１８のいずれか一項に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項20】

以下のうちの１つ以上：
ａ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ２６３、Ｑ２６４、Ｓ２６５、Ｓ２６８およびＨ２７２；
ｂ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｔ５４６、Ｇ５４７、Ｔ５４９、Ｎ５５０、Ｋ５５１、Ｔ５５２、Ｔ５５３、Ｌ５５４、Ｅ５５５、Ｎ５５６、Ｌ５５８、Ｍ５５９、Ｎ５６１、Ｒ５６６およびＰ５６７；
ｃ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ５８０、Ｓ５８１、Ａ５８５、Ａ５８６、Ａ５９０、Ｔ５９２、Ｑ５９３、Ｖ５９４、およびＮ５９７；
ｄ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｄ５３２、Ｓ５３８およびＶ５４０；
ｅ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ４５１、Ｑ４５６、Ｇ４５７、Ｑ４６０、Ｌ４６２、Ａ４６６、Ａ４６９、Ｎ４７０、Ｓ４７２およびＡ４７３；
ｆ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｌ４９３、Ｓ４９４、Ｇ５０５、Ａ５０６、Ｖ５１８およびＶ５２２；
ｇ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３～２７２のアミノ酸の配列ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号５８）；
ｈ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置５４６～５６７のアミノ酸の配列ＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号５９）；
ｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）；
ｊ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置５３２～５４０のアミノ酸の配列ＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号６１）；
ｋ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５１～４７３のアミノ酸の配列ＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号６２）；ならびに
ｌ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置４９３～５２２のアミノ酸の配列ＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号６３）
を含む、請求項１または２に記載のカプシドポリペプチド。

【請求項21】

請求項１～２０のいずれか一項に記載のカプシドポリペプチドを含む、ＡＡＶベクター。

【請求項22】

配列番号１に示されるアミノ酸の配列を含むカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターと比較して、インビボ形質導入効率の増加を示す、請求項２１に記載のＡＡＶベクター。

【請求項23】

配列番号１に示されるアミノ酸の配列を含むカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターと比較して、ヒト肝細胞のインビボ形質導入効率の増加を示す、請求項２１または２２に記載のＡＡＶベクター。

【請求項24】

形質導入効率が、少なくとももしくは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、または５００％増加する、請求項２１～２３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項25】

配列番号１に示されるアミノ酸の配列を含むカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターと比較して、プールされたヒト免疫グロブリンによる中和に対する耐性の増加を示す、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項26】

中和に対する耐性が、少なくとももしくは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、または５００％増加する、請求項２５に記載のＡＡＶベクター。

【請求項27】

異種コード配列をさらに含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項28】

異種コード配列がペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードする、請求項２８に記載のＡＡＶベクター。

【請求項29】

ペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが治療用ペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである、請求項２９に記載のＡＡＶベクター。

【請求項30】

請求項１～２０のいずれか一項に記載のカプシドポリペプチドをコードする単離された核酸分子。

【請求項31】

請求項３０に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項32】

プラスミド、コスミド、ファージ、およびトランスポゾンの中から選択される、請求項３１に記載のベクター。

【請求項33】

請求項２１～２９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター、請求項３０に記載の核酸分子、または請求項３１もしくは請求項３２に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項34】

宿主細胞を請求項２７～２９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターと接触させることを含む、異種コード配列を宿主細胞に導入するための方法。

【請求項35】

宿主細胞が肝細胞である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

宿主細胞をＡＡＶベクターと接触させることが、対象にＡＡＶベクターを投与することを含む、請求項３４または３５に記載の方法。

【請求項37】

インビトロまたはエクスビボである、請求項３４または３５に記載の方法。

【請求項38】

ＡＡＶベクターを産生するための方法であって、請求項１～２０のいずれか一項に記載のカプシドポリペプチドをコードする核酸分子、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ逆方向末端反復が隣接する異種コード配列、および増殖性ＡＡＶ感染を生成するためのヘルパー機能を含む宿主細胞を、請求項１～２０のいずれか一項に記載のカプシドポリペプチドを含むカプシドを含むＡＡＶベクターのアセンブリを促進するのに適した条件下で培養することを含み、カプシドが異種コード配列をカプシド化する、方法。

【請求項39】

宿主細胞が肝細胞である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

ＡＡＶベクターのインビボヒト肝細胞形質導入効率を増強するための方法であって、
ａ）ヒト肝細胞をインビボで形質導入するための参照カプシドポリペプチドを同定することと；
ｂ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３、２６４、２６５、２６８、２７２、５４６、５４７、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５８、５５９、５６１、５６６、５６７、５８０、５８１、５８５、５８６、５９０、５９２、５９３、５９４および５９７のうちの１つ以上で参照カプシドポリペプチドの配列を改変し、それによって、
ｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ２６３、Ｑ２６４、Ｓ２６５、Ｓ２６８およびＨ２７２；
ｉｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｔ５４６、Ｇ５４７、Ｔ５４９、Ｎ５５０、Ｋ５５１、Ｔ５５２、Ｔ５５３、Ｌ５５４、Ｅ５５５、Ｎ５５６、Ｌ５５８、Ｍ５５９、Ｎ５６１、Ｒ５６６およびＰ５６７；ならびに／または配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ５８０、Ｓ５８１、Ａ５８５、Ａ５８６、Ａ５９０、Ｔ５９２、Ｑ５９３、Ｖ５９４、およびＮ５９７
を含む改変カプシドポリペプチドを産生することと；
ｃ）改変カプシドポリペプチドをベクター化し、それによって改変ＡＡＶベクターを産生することと
を含む方法。

【請求項41】

参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置５３２、５３８、および５４０のうちの１つ以上で改変することをさらに含み、改変されたカプシドポリペプチドが、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｄ５３２、Ｓ５３８およびＶ５４０を含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５１、４５６、４５７、４６０、４６２、４６６、４６９、４７０、４７２および４７３のうちの１つ以上で改変することをさらに含み、改変カプシドポリペプチドが、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ４５１、Ｑ４５６、Ｇ４５７、Ｑ４６０、Ｌ４６２、Ａ４６６、Ａ４６９、Ｎ４７０、Ｓ４７２およびＡ４７３を含む、請求項４０または４１に記載の方法。

【請求項43】

参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４９３、４９４、５０５、５０６、５１８および５２２のうちの１つ以上で改変することをさらに含み、改変カプシドポリペプチドが、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｌ４９３、Ｓ４９４、Ｇ５０５、Ａ５０６、Ｖ５１８、およびＶ５２２を含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

ＡＡＶベクターのインビボヒト肝細胞形質導入効率を増強するための方法であって、
ａ）ヒト肝細胞をインビボで形質導入するための参照カプシドポリペプチドを同定することと；
ｂ）参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３～２７２、５４６～５６７および５８２～５９７の１つ以上で改変し、それによって：
ｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３～２７２のアミノ酸の配列ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号５８）；
ｉｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置５４６～５６７のアミノ酸の配列ＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号５９）、および／または配列番号１３に対するナンバリングで、位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）
を含む改変カプシドポリペプチドを産生することと；
ｃ）改変カプシドポリペプチドをベクター化し、それによって改変ＡＡＶベクターを産生することと
を含む方法。

【請求項45】

参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置５３２～５４０のうちの１つ以上の位置で改変することをさらに含み、改変されたカプシドポリペプチドが、配列番号１３に対するナンバリングで、位置５３２～５４０のアミノ酸の配列ＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号６１）を含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項46】

参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５１～４７３の１つ以上で改変することをさらに含み、改変されたカプシドポリペプチドが、配列番号１に対するナンバリングで、位置４５１～４７３のアミノ酸の配列ＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号６２）を含む、請求項４０または４１に記載の方法。

【請求項47】

参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４９３～５２２のうちの１つ以上で改変することをさらに含み、改変されたカプシドポリペプチドが、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４９３～５２２のアミノ酸の配列ＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号６３）を含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

参照カプシドポリペプチドが、配列番号１３に示される配列に対して、少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含む、請求項４０～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

ヒト肝細胞を利用する改変ＡＡＶベクターインビボ系の形質導入効率を評価することをさらに含む、請求項４０～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

インビボ系が、ヒト肝細胞を含むキメラ肝臓を有する小動物（例えば、マウス）を含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

インビボ系がｈＦＲＧマウスを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

改変ＡＡＶベクターが、参照カプシドポリペプチドを含む参照ＡＡＶベクターと比較して、少なくとももしくは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％またはそれ以上増強されたインビボ形質導入効率を有する、請求項４０～５１のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２０年２月２５日に出願された「アデノ随伴ウイルスカプシドポリペプチドおよびベクター（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒｓ）」と題するオーストラリア仮出願第２０２０９００５２９号に対する優先権を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、一般に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドおよびコードする核酸分子に関する。本開示はまた、カプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクター、およびコードする核酸分子を含む核酸ベクター（例えば、プラスミド）、ならびにベクターを含む宿主細胞にも関する。本開示はまた、ポリペプチド、コードする核酸分子、ベクターおよび宿主細胞の方法および使用にも関する。

【背景技術】

【0003】

遺伝子治療は、ウイルスベクターを用いて最も一般的に研究され、達成されてきており、最近の注目すべき進歩は、アデノ随伴ウイルスベクターに基づくものである。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムの長さは約４．７ｋｂである。ＡＡＶゲノムには、分子の両端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が含まれており、ｒｅｐおよびｃａｐという２種のオープンリーディングフレームに隣接している。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３という３つの構造カプシドタンパク質をコードする。３つのカプシドタンパク質は通常、１：１：８～１０の比率でアセンブルして、ＡＡＶカプシドを形成するが、ＶＰ３、またはＶＰ１およびＶＰ３、またはＶＰ２およびＶＰ３のみを含むＡＡＶカプシドが生成されている。ｃａｐ遺伝子は、別のオープンリーディングフレーム由来のアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）もコードする。ＡＡＰは、カプシドアセンブリを促進し、カプシドタンパク質を核小体に向けてカプシド形成を促進するように作用する。ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０という４つの既知の調節タンパク質をコードしている。これらのＲｅｐタンパク質は、ＡＡＶゲノムの複製、パッケージング、ゲノム統合、およびその他のプロセスに関与している。最近では、ＡＡＶ２ゲノムの３’末端にＸ遺伝子が同定された（Cao et al. PLoS One, 2014, 9: e104596）。コードされたＸタンパク質は、ＤＮＡ複製を含むＡＡＶのライフサイクルに関与しているようである。

【0004】

ＩＴＲは、いくつかの機能、特にＡＡＶ ＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組み込み、ならびにゲノムの複製およびパッケージングに関与している。ＡＡＶが宿主細胞に感染すると、ウイルスゲノムが宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれ、細胞の潜伏感染が起こる。したがって、ＡＡＶは、異種配列を細胞に導入するために活用され得る。自然界では、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）は、感染細胞でのＡＡＶウイルスの複製および新しいビリオンのパッケージングを可能にするタンパク質因子を提供する。アデノウイルスの場合、遺伝子Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡがヘルパー機能を提供する。ヘルパーウイルスに感染すると、ＡＡＶプロウイルスがレスキューおよび増幅され、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスの両方が生成される。

【0005】

天然のＡＡＶゲノムの一部、大部分、または全てを欠き、代わりにＩＴＲが隣接する１つ以上の異種配列を含むゲノムを含むＡＡＶベクター（組換えＡＡＶ、ｒＡＡＶとも呼ばれる）は、遺伝子治療設定において首尾よく使用されてきた。これらのＡＡＶベクターは、治療目的で対象の細胞に異種核酸を送達するために広く使用され、多くの場合、治療効果を与えるのは異種核酸の発現である。現在、いくつかのＡＡＶベクターが臨床で使用されているが、治療用途に異種核酸の適切な発現を促進するために必要な初代ヒト細胞／組織のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）形質導入効率を示す数は限られている。したがって、インビボでの宿主細胞の効率的な形質導入を促進するカプシドタンパク質を含む代替ＡＡＶベクターを開発する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本開示は、新規ＡＡＶカプシドポリペプチドの生成に一部基づいている。特定の実施形態では、カプシドポリペプチドは、ＡＡＶベクターに含まれる場合、ヒト細胞（ヒト肝細胞など）の効率的な形質導入を促進する。典型的には、本開示のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターのインビボ形質導入は、他のＡＡＶカプシドポリペプチド（例えば、配列番号１に示されるプロトタイプのＡＡＶ２カプシド）を含むＡＡＶベクターと比較して改善される。したがって、本開示のカプシドポリペプチドは、ＡＡＶベクター、特に遺伝子治療用のＡＡＶベクターを調製するのに特に有用である。同様に、本開示のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクター（すなわち、本開示のカプシドポリペプチドを含むか、またはそれからなるカプシドを有する）は、遺伝子治療用途、例えば、様々な疾患および状態の治療のための異種核酸の送達に特に有用である。

【課題を解決するための手段】

【0007】

一態様では、本開示は、（ｉ）配列番号２～２０および６５～７９のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約９０％もしくは９５％の配列同一性を有する配列；（ｉｉ）配列番号２、６、７、９、１０、１２～１４、１６～２０、６９、７１～７４、７６および７８のいずれか１つの位置１３８～７３５、配列番号５、８または１１の位置１３８～７３４、配列番号３、１５、６５、６８、７５、７７および７９のいずれか１つの位置１３８～７３６、配列番号４、６７および７０のいずれか１つの位置１３８～７３７、または配列番号６６の位置１３８～７３８のアミノ酸の配列；あるいはそれらに対して少なくともまたは約９０％もしくは９５％の配列同一性を有する配列；ならびに／あるいは（ｉｉｉ）配列番号５、８および１１のいずれか１つの位置２０３～７３４、配列番号１５の位置２０３～７３６、配列番号２、６、７、９、１０、１２～１４、１６～２０、６９、７１～７４、７６および７８のいずれか１つの位置２０４～７３５、配列番号３、６５、６８、７５、７７および７９のいずれか１つの位置２０４～７３６、配列番号４、６７および７０のいずれか１つの位置２０４～７３７、または配列番号６６の位置２０４～７３８のアミノ酸の配列；またはそれに対して少なくとももしくは約９０％または９５％の配列同一性を有する配列
を含む、カプシドポリペプチドを提供する。

【0008】

一実施形態では、このカプシドポリペプチドは、（ｉ）配列番号１３に示されるアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列；（ｉｉ）配列番号１３の位置１３８～７３５のアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列；および／あるいは（ｉｉｉ）配列番号１３の位置２０４～７３５のアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0009】

特定の例では、このカプシドポリペプチドは、以下のうちの１つ以上を含む：ａ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ２６３、Ｑ２６４、Ｓ２６５、Ｓ２６８およびＨ２７２；ｂ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｔ５４６、Ｇ５４７、Ｔ５４９、Ｎ５５０、Ｋ５５１、Ｔ５５２、Ｔ５５３、Ｌ５５４、Ｅ５５５、Ｎ５５６、Ｌ５５８、Ｍ５５９、Ｎ５６１、Ｒ５６６およびＰ５６７；ｃ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ５８０、Ｓ５８１、Ａ５８５、Ａ５８６、Ａ５９０、Ｔ５９２、Ｑ５９３、Ｖ５９４、およびＮ５９７；ｄ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｄ５３２、Ｓ５３８およびＶ５４０；ｅ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ４５１、Ｑ４５６、Ｇ４５７、Ｑ４６０、Ｌ４６２、Ａ４６６、Ａ４６９、Ｎ４７０、Ｓ４７２およびＡ４７３；ｆ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｌ４９３、Ｓ４９４、Ｇ５０５、Ａ５０６、Ｖ５１８およびＶ５２２；ｇ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３～２７２のアミノ酸の配列ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号５８）；ｈ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置５４６～５６７のアミノ酸の配列ＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号５９）の配列；ｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）；ｊ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置５３２～５４０のアミノ酸の配列ＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号６１）；ｋ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５１～４７３のアミノ酸の配列ＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号６２）；ならびに／またはｌ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置４９３～５２２のアミノ酸の配列ＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号６３）。

【0010】

本開示の別の態様は、以下を含むカプシドポリペプチドに関する：（ｉ）配列番号１３に示されるアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％の配列同一性を有する配列；（ｉｉ）配列番号１３の位置１３８～７３５のアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％の配列同一性を有する配列；および／あるいは（ｉｉｉ）配列番号１３の位置２０４～７３５のアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％の配列同一性を有する配列；このカプシドポリペプチドは、以下を含む：ａ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ２６３、Ｑ２６４、Ｓ２６５、Ｓ２６８、およびＨ２７２；ならびにｂ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｔ５４６、Ｇ５４７、Ｔ５４９、Ｎ５５０、Ｋ５５１、Ｔ５５２、Ｔ５５３、Ｌ５５４、Ｅ５５５、Ｎ５５６、Ｌ５５８、Ｍ５５９、Ｎ５６１、Ｒ５６６およびＰ５６７；ならびに／あるいは配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ５８０、Ｓ５８１、Ａ５８５、Ａ５８６、Ａ５９０、Ｔ５９２、Ｑ５９３、Ｖ５９４、およびＮ５９７。

【0011】

いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、ａ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３～２７２のアミノ酸の配列ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号５８）；ならびにｂ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置５４６～５６７のアミノ酸の配列ＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号５９）および／または配列番号１３に対するナンバリングで、位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）を含む。さらなる実施形態では、カプシドポリペプチドは、ａ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６１～２７２のアミノ酸の配列ＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号８０）；ｂ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置５４５～５６７のアミノ酸の配列ＫＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号８１）、ならびに／あるいは配列番号１３に対するナンバリングで、位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）を含む。

【0012】

このカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｄ５３２、Ｓ５３８およびＶ５４０を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置５３２～５４０のアミノ酸の配列ＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号６１）を含む。さらなる実施形態では、このカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置５２３～５４０のアミノ酸の配列ＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号８２）を含む。

【0013】

いくつかの例では、このカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ４５１、Ｑ４５６、Ｇ４５７、Ｑ４６０、Ｌ４６２、Ａ４６６、Ａ４６９、Ｎ４７０、Ｓ４７２およびＡ４７３を含む。一実施形態では、カプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５１～４７３のアミノ酸の配列ＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号６２）を含む。さらなる実施形態では、このカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５０～４７３のアミノ酸の配列ＱＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号８３）を含む。

【0014】

さらなる例では、このカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｌ４９３、Ｓ４９４、Ｇ５０５、Ａ５０６、Ｖ５１８およびＶ５２２を含む。いくつかの実施形態では、このカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４９３～５２２のアミノ酸の配列ＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号６３）を含む。さらなる実施形態では、このカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４８８～５２２のアミノ酸の配列ＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号８４）を含む。

【0015】

別の態様では、本開示は、以下を含むカプシドポリペプチドを提供する：（ｉ）配列番号１３に示されるアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％の配列同一性を有する配列；（ｉｉ）配列番号１３の位置１３８～７３５のアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％の配列同一性を有する配列；および／あるいは（ｉｉｉ）配列番号１３の位置２０４～７３５のアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％の配列同一性を有する配列；このカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ４５１、Ｑ４５６、Ｇ４５７、Ｑ４６０、Ｌ４６２、Ａ４６６、Ａ４６９、Ｎ４７０、Ｓ４７２、Ａ４７３、Ｌ４９３、Ｓ４９４、Ｇ５０５、Ａ５０６、Ｖ５１８、Ｖ５２２、Ｄ５３２、Ｓ５３８、Ｖ５４０、Ｔ５４６、Ｇ５４７、Ｔ５４９、Ｎ５５０、Ｋ５５１、Ｔ５５２、Ｔ５５３、Ｌ５５４、Ｅ５５５、Ｎ５５６、Ｌ５５８、Ｍ５５９、Ｎ５６１、Ｒ５６６、Ｐ５６７、Ｓ５８０、Ｓ５８１、Ａ５８５、Ａ５８６、Ａ５９０、Ｔ５９２、Ｑ５９３、Ｖ５９４、およびＮ５９７を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５１～４７３のアミノ酸の配列ＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号６２）；位置４９３～５２２のアミノ酸の配列ＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号６３）；位置５３２～５４０のアミノ酸の配列ＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号６１）；位置５４６～５６７のアミノ酸の配列ＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号５９）；および位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）を含む。さらなる実施形態では、このカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５０～４７３のアミノ酸の配列ＱＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号８３）；位置４８８～５２２のアミノ酸の配列ＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号８４）；位置５２３～５４０のアミノ酸の配列ＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号８２）；位置５４５～５６７のアミノ酸の配列ＫＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号８１）；ならびに配列番号１３に対するナンバリングで、位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）を含む。一例では、カプシドポリペプチドは、さらに、ａ）配列番号１３に対するナンバリングで、２６２位の後のＮＧの挿入、ならびに残基Ｔ２６３、Ｓ２６４、Ｇ２６５、Ｔ２６８、およびＴ２７２；またはｂ）配列番号１３に対するナンバリングで、２６２位の後のＮＧの挿入および位置２６３～２７２のアミノ酸の配列ＴＳＧＧＡＴＮＤＮＴを含む。

【0017】

一実施形態では、このカプシドポリペプチドは、配列番号１３に示されるアミノ酸の配列、配列番号１３の位置１３８～７３５のアミノ酸の配列、または配列番号１３の位置２０４～７３５のアミノ酸の配列に対して少なくとももしくは約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％または９７％の配列同一性を含む。

【0018】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターを提供する。

【0019】

いくつかの例では、このベクターは、配列番号１に示されるアミノ酸の配列を含むカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターと比較して、インビボ形質導入効率の増加を示す。特定の例では、このベクターは、配列番号１に示されるアミノ酸の配列を含むカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターと比較して、ヒト肝細胞のインビボ形質導入効率の増大を示す。一実施形態では、形質導入効率は、少なくとももしくは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％または５００％増加される。

【0020】

さらなる例では、ＡＡＶベクターは、配列番号１に示されるアミノ酸の配列を含むカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターと比較して、プールされたヒト免疫グロブリンによる中和に対する耐性の増加を示す。一実施形態では、中和に対する耐性は、少なくとももしくは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％または５００％増大される。

【0021】

本開示のＡＡＶベクターは、ペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドをコードする配列のような異種コード配列をさらに含み得る。いくつかの例では、ペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、治療用ペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。

【0022】

さらなる態様では、本明細書に記載のカプシドポリペプチドをコードする単離された核酸分子、およびこの核酸分子を含むベクターが提供される。いくつかの例では、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、およびトランスポゾンの中から選択される。上記および本明細書に記載のＡＡＶベクター、核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も提供される。

【0023】

異種コード配列を含む本開示のＡＡＶベクターと宿主細胞を接触させることを含む、異種コード配列を宿主細胞に導入するための方法もまた提供される。いくつかの例では、宿主細胞は肝細胞である。この方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞をＡＡＶベクターと接触させることは、対象にＡＡＶベクターを投与することを含む。他の実施形態では、この方法はインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）である。

【0024】

別の態様では、ＡＡＶベクターを産生する方法であって、本開示のカプシドポリペプチドをコードする核酸分子、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ逆方向末端反復が隣接する異種コード配列、および増殖性ＡＡＶ感染を生成するためのヘルパー機能を含む宿主細胞を、カプシドポリペプチドを含むカプシドを含むＡＡＶベクターのアセンブリを促進するのに適した条件下で培養することを含み、カプシドが異種コード配列をカプシド化する、方法が提供される。いくつかの例では、宿主細胞は肝細胞である。

【0025】

さらなる態様では、提供されるのは、ＡＡＶベクターのインビボヒト肝細胞形質導入効率を増強するための方法であって、
ａ）ヒト肝細胞をインビボで形質導入するための参照カプシドポリペプチドを同定すること；
ｂ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３、２６４、２６５、２６８、２７２、５４６、５４７、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５８、５５９、５６１、５６６、５６７、５８０、５８１、５８５、５８６、５９０、５９２、５９３、５９４および５９７のうちの１つ以上で参照カプシドポリペプチドの配列を改変し、それによって、ｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ２６３、Ｑ２６４、Ｓ２６５、Ｓ２６８およびＨ２７２；ならびにｉｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｔ５４６、Ｇ５４７、Ｔ５４９、Ｎ５５０、Ｋ５５１、Ｔ５５２、Ｔ５５３、Ｌ５５４、Ｅ５５５、Ｎ５５６、Ｌ５５８、Ｍ５５９、Ｎ５６１、Ｒ５６６およびＰ５６７；ならびに／または配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ５８０、Ｓ５８１、Ａ５８５、Ａ５８６、Ａ５９０、Ｔ５９２、Ｑ５９３、Ｖ５９４、およびＮ５９７を含む改変カプシドポリペプチドを産生することと；
ｃ）この改変カプシドポリペプチドをベクター化し、それによって改変ＡＡＶベクターを産生することと
を含む方法である。

【0026】

いくつかの実施形態では、この方法は、参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置５３２、５３８、および５４０のうちの１つ以上で改変することをさらに含み、この改変されたカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｄ５３２、Ｓ５３８およびＶ５４０を含む。さらなる実施形態では、この方法は、参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５１、４５６、４５７、４６０、４６２、４６６、４６９、４７０、４７２および４７３のうちの１つ以上で改変することをさらに含み、この改変されたカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ４５１、Ｑ４５６、Ｇ４５７、Ｑ４６０、Ｌ４６２、Ａ４６６、Ａ４６９、Ｎ４７０、Ｓ４７２およびＡ４７３を含む。他の実施形態では、この方法は、参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４９３、４９４、５０５、５０６、５１８、および５２２のうち１つ以上で改変することをさらに含み、この改変されたカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｌ４９３、Ｓ４９４、Ｇ５０５、Ａ５０６、Ｖ５１８およびＶ５２２を含む。

【0027】

別の態様では、提供されるのは、ＡＡＶベクターのインビボヒト肝細胞形質導入効率を増強するための方法であって、
ａ）ヒト肝細胞をインビボで形質導入するための参照カプシドポリペプチドを同定することと；
ｂ）参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３～２７２、５４６～５６７および５８２～５９７のうちの１つ以上で改変し、それによって、以下：配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３～２７２のアミノ酸ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号５８）の配列；およびｉｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置５４６～５６７のアミノ酸の配列ＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号５９）および／または配列番号１３に対するナンバリングで、位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）を含む改変カプシドポリペプチドを産生することと；
ｃ）この改変カプシドポリペプチドをベクター化し、それによって改変ＡＡＶベクターを産生することと
を含む方法である。

【0028】

いくつかの実施形態では、この方法は、参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置５３２～５４０のうちの１つ以上の位置で改変することをさらに含み、この改変されたカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置５３２～５４０でアミノ酸の配列ＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号６１）を含む。さらなる実施形態では、この方法は、参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５１～４７３のうちの１つ以上で改変することをさらに含み、この改変されたカプシドポリペプチドは、配列番号１に対するナンバリングで、位置４５１～４７３で、アミノ酸の配列ＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号６２）を含む。他の実施形態では、この方法は、参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４９３～５２２のうちの１つ以上で改変することをさらに含み、この改変されたカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４９３～５２２で、アミノ酸の配列ＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号６３）を含む。

【0029】

ＡＡＶベクターのインビボヒト肝細胞形質導入効率を増強するための方法のいくつかの例では、参照カプシドポリペプチドは、配列番号１３に示される配列に対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含む。特定の実施形態では、この方法は、ヒト肝細胞を利用する改変ＡＡＶベクターインビボ系（例えば、ヒト肝細胞を含むキメラ肝臓を有する小動物（例えばマウス）を含むインビボ系、例えばｈＦＲＧマウスモデル）の形質導入効率を評価することをさらに含む。特定の例では、本方法によって産生された改変ＡＡＶベクターは、参照カプシドポリペプチドを含む参照ＡＡＶベクターと比較して、少なくともまたは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、またはそれ以上増強されたインビボ形質導入効率を有する。

【0030】

本開示の実施形態は、以下の図面を参照して、非限定的な例としてのみ、本明細書に記載される。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1-1】ＡＡＶカプシドポリペプチドのアラインメントである。

【図1-2】ＡＡＶカプシドポリペプチドのアラインメントである。

【図1-3】ＡＡＶカプシドポリペプチドのアラインメントである。

【図1-4】ＡＡＶカプシドポリペプチドのアラインメントである。

【図1-5】ＡＡＶカプシドポリペプチドのアラインメントである。

【図2】様々なＡＡＶベクターのインビボ性能を表す。肝臓にヒト初代肝細胞およびマウス初代肝細胞を有するヒト化Ｆａｈ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｉｌ２ｒｇ^－／－（ｈＦＲＧ）マウスに、バーコード付きＡＡＶベクターのそれぞれを１．８×１０^１１ｖｇ注入した。プロトタイプのＡＡＶ２およびＡＡＶ８ベクター、ならびに生物工学によるＬＫ０３およびＮＰ５９ベクターも注入した。注入の１週間後、マウスのキメラ肝臓を灌流し、細胞選別を用いてヒトおよびマウスの肝細胞を分離した。肝細胞のヒト集団からＤＮＡおよびＲＮＡを回収し、各ＡＡＶ ベクターのバーコード付き導入遺伝子のＩｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＮＧＳ）を実行した。次に、ＤＮＡおよびＲＮＡ（ｃＤＮＡ）レベルでのバーコード、したがって各ベクターに特異的なＮＧＳリードの数を定量し、総リードの割合として表した。ＤＮＡリードも、同じバーコード領域のＮＧＳを使用して定量化された注入前の混合物に対して正規化された。（Ａ）注入前のリードに対して正規化された、ヒト肝細胞由来のＤＮＡ。（Ｂ）ヒト肝細胞由来のｃＤＮＡ。（Ｃ）注入前のリードに対して正規化された、マウス肝細胞由来のＤＮＡ。（Ｄ）マウス肝細胞由来のｃＤＮＡ。

【図3】選択されたＡＡＶベクターの肝細胞のインビボ形質導入のグラフ表示である。ＡＡＶＣ１１．０１、ＡＡＶＣ１１．０４、ＡＡＶＣ１１．０５、ＡＡＶＣ１１．０６、ＡＡＶＣ１１．０７、ＡＡＶＣ１１．０９、ＡＡＶＣ１１．１１、ＡＡＶＣ１１．１２、ＡＡＶＣ１１．１３、ＡＡＶＣ１１．１５、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＬＫ０３、ＮＰ５９を、５×バーコード付き導入遺伝子／カプシド（ＢＣ Ａ－Ｅ）とパッケージングして、等比率（１×１０^１０ｖｇ／カプシド）で混合し、単一のｈＦＲＧマウスに注入した。ヒトおよびマウスの肝細胞を単離し、１週間後に選別した。ＤＮＡおよびＲＮＡを抽出し、ＤＮＡおよびｃＤＮＡに対してＮＧＳを実行した。グラフは、ＤＮＡ リードに対して正規化されたｃＤＮＡリードを表す、ヒト発現指数（Ｈｕｍａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）（ＨＥＸＩ）を示している。

【図4-1】ＩＶＩｇの存在下でのインビボでのＡＡＶベクターの形質導入効率のグラフ表示を提供する。３匹のｈＦＲＧマウスに、１、５ｍｇ、または２０ｍｇの可溶性ＩＶＩｇを注入し、続いてバーコード付きＡＡＶＣ１１．０１、ＡＡＶＣ１１．０４、ＡＡＶＣ１１．０７、ＡＡＶＣ１１．０９、ＡＡＶＣ１１．１１－ＡＡＶＣ１１．１３およびＡＡＶＣ１１．１５ベクターの混合物ならびに各種対照を注入して受動免疫した。ＩＶＩｇ注入を受けなかった４番目のｈＦＲＧマウス（図３のｈＦＲＧマウス）を対照として使用した。ＤＮＡおよびＲＮＡを抽出し、ＤＮＡおよびｃＤＮＡに対してＮＧＳを実行した。（Ａ）対照マウス（すなわち、ＩＶＩｇなし）のＤＮＡレベル（細胞侵入、物理的形質導入）でヒト肝細胞の各バーコードにマッピングされたＮＧＳリードの割合。（Ｂ）対照マウスのｃＤＮＡレベル（発現、機能的形質導入）でヒト肝細胞の各バーコードにマッピングされたＮＧＳリードの割合。（Ｃ）ＩＶＩｇの存在下でのＡＡＶカプシドあたりのベクターゲノムの推定減少。値は、ＩＶＩｇ条件（ｈＦＲＧの２～４番）および無ＩＶＩＧ 対照（ｈＦＲＧの１番）のベクターゲノム間の商の対数を表す。（Ｄ）ヒトクラスターあたりの形質導入されたヒト肝細胞の割合の定量化、ｎ＝１０クラスター／マウス。（Ａ－Ｂ：データは平均値±標準偏差である。平均値間の統計的有意性は、クラスカル－ワリス検定を使用して計算され、ダネットの多重比較検定を使用して、ＡＡＶバリアントと対照ＡＡＶ－ＮＰ５９とを比較した（^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ≦０．０１、^＊＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、ｎ．ｓ．Ｐ値＞０．０５）。（Ｄ：データは平均値±標準偏差である。平均値間の統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡを使用して計算され、ダネットの多重比較検定を使用して、ＡＡＶ－ＳＹＤを対照ＡＡＶ－ＮＰ５９と比較した（^＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、ｎ．ｓ．Ｐ値＞０．０５）。

【図4-2】ＩＶＩｇの存在下でのインビボでのＡＡＶベクターの形質導入効率のグラフ表示を提供する。３匹のｈＦＲＧマウスに、１、５ｍｇ、または２０ｍｇの可溶性ＩＶＩｇを注入し、続いてバーコード付きＡＡＶＣ１１．０１、ＡＡＶＣ１１．０４、ＡＡＶＣ１１．０７、ＡＡＶＣ１１．０９、ＡＡＶＣ１１．１１－ＡＡＶＣ１１．１３およびＡＡＶＣ１１．１５ベクターの混合物ならびに各種対照を注入して受動免疫した。ＩＶＩｇ注入を受けなかった４番目のｈＦＲＧマウス（図３のｈＦＲＧマウス）を対照として使用した。ＤＮＡおよびＲＮＡを抽出し、ＤＮＡおよびｃＤＮＡに対してＮＧＳを実行した。（Ａ）対照マウス（すなわち、ＩＶＩｇなし）のＤＮＡレベル（細胞侵入、物理的形質導入）でヒト肝細胞の各バーコードにマッピングされたＮＧＳリードの割合。（Ｂ）対照マウスのｃＤＮＡレベル（発現、機能的形質導入）でヒト肝細胞の各バーコードにマッピングされたＮＧＳリードの割合。（Ｃ）ＩＶＩｇの存在下でのＡＡＶカプシドあたりのベクターゲノムの推定減少。値は、ＩＶＩｇ条件（ｈＦＲＧの２～４番）および無ＩＶＩＧ 対照（ｈＦＲＧの１番）のベクターゲノム間の商の対数を表す。（Ｄ）ヒトクラスターあたりの形質導入されたヒト肝細胞の割合の定量化、ｎ＝１０クラスター／マウス。（Ａ－Ｂ：データは平均値±標準偏差である。平均値間の統計的有意性は、クラスカル－ワリス検定を使用して計算され、ダネットの多重比較検定を使用して、ＡＡＶバリアントと対照ＡＡＶ－ＮＰ５９とを比較した（^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ≦０．０１、^＊＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、ｎ．ｓ．Ｐ値＞０．０５）。（Ｄ：データは平均値±標準偏差である。平均値間の統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡを使用して計算され、ダネットの多重比較検定を使用して、ＡＡＶ－ＳＹＤを対照ＡＡＶ－ＮＰ５９と比較した（^＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、ｎ．ｓ．Ｐ値＞０．０５）。

【図5-1】インビボでのＡＡＶベクターの形質導入効率をグラフで表したものである。異なるヒトドナー由来の肝細胞を移植したＦＲＧマウスにおけるＡＡＶＣ１１．１２および関連するＡＡＶバリアントのＮＧＳベースの比較を実施した。（図５Ａ～図５Ｃ）Ｎ＝３２ ｈＦＲＧ（ベクターコピー数の場合はＮ＝３１）で１０の血清型を包含するバーコード付きＡＡＶミックスの複合形質導入。各データポイントは、独立したマウスを表す。（Ａ）ＦＡＣ選別したヒト肝細胞およびマウス肝細胞上のＧＦＰ＋細胞の割合。（Ｂ）男性および女性のドナーに生着されたＦＡＣ選別したヒト肝細胞上のＧＦＰ＋細胞の割合。（Ｃ）ＦＡＣ選別したヒト肝細胞上の二倍体ヒト肝細胞あたりのベクターコピー数。（Ａ～Ｃ）の場合、データは平均±標準偏差である。平均値間の統計的有意性は、それぞれ、対応のあるｔ検定、対応のないｔ検定、および対応のないｔ検定とウェルチ補正を使用して計算された（^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、ｎ．ｓ．Ｐ値＞０．０５）。（Ｄ）ＤＮＡ（細胞侵入、物理的形質導入）レベルでヒト肝細胞の各ＡＡＶカプシド（ｎ＝５ バーコード／カプシドの合計）にマッピングされたＮＧＳリードの割合を、注入前の混合物に対して正規化して示す。（Ｅ）各ＡＡＶカプシドにマッピングされたＮＧＳリードの割合（ｎ＝５ バーコード／カプシドの合計）を、ｃＤＮＡ（発現、機能的形質導入）レベルでヒト肝細胞において、注入前の混合物に対して正規化して示す。（Ｄ～Ｅ）の場合、各データポイントは、独立したマウスの割合を表す（ＤＮＡについて分析されたｈＦＲＧはＮ＝３１、およびｃＤＮＡについてはＮ＝３２）。データは平均±標準偏差である。一元ＡＮＯＶＡを使用して平均値間の統計的有意性を計算し、ダネットの多重比較検定を使用して、ＡＡＶ－ＳＹＤ１２を他の全てのＡＡＶバリアントと比較した（^＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、ｎ．ｓ．Ｐ値＞０．０５）。（Ｆ）ＤＮＡ（Ｎ＝３１ ｈＦＲＧ）およびｃＤＮＡ（Ｎ＝３２ ｈＦＲＧ）レベルでＦＡＣ選別したヒト肝細胞のＡＡＶカプシドあたりのマッピングされたＮＧＳリードの平均割合。発現指数は、平均 ｃＤＮＡおよびＤＮＡ百分率リードの間の商として定義される。

【図5-2】インビボでのＡＡＶベクターの形質導入効率をグラフで表したものである。異なるヒトドナー由来の肝細胞を移植したＦＲＧマウスにおけるＡＡＶＣ１１．１２および関連するＡＡＶバリアントのＮＧＳベースの比較を実施した。（図５Ａ～図５Ｃ）Ｎ＝３２ ｈＦＲＧ（ベクターコピー数の場合はＮ＝３１）で１０の血清型を包含するバーコード付きＡＡＶミックスの複合形質導入。各データポイントは、独立したマウスを表す。（Ａ）ＦＡＣ選別したヒト肝細胞およびマウス肝細胞上のＧＦＰ＋細胞の割合。（Ｂ）男性および女性のドナーに生着されたＦＡＣ選別したヒト肝細胞上のＧＦＰ＋細胞の割合。（Ｃ）ＦＡＣ選別したヒト肝細胞上の二倍体ヒト肝細胞あたりのベクターコピー数。（Ａ～Ｃ）の場合、データは平均±標準偏差である。平均値間の統計的有意性は、それぞれ、対応のあるｔ検定、対応のないｔ検定、および対応のないｔ検定とウェルチ補正を使用して計算された（^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、ｎ．ｓ．Ｐ値＞０．０５）。（Ｄ）ＤＮＡ（細胞侵入、物理的形質導入）レベルでヒト肝細胞の各ＡＡＶカプシド（ｎ＝５ バーコード／カプシドの合計）にマッピングされたＮＧＳリードの割合を、注入前の混合物に対して正規化して示す。（Ｅ）各ＡＡＶカプシドにマッピングされたＮＧＳリードの割合（ｎ＝５ バーコード／カプシドの合計）を、ｃＤＮＡ（発現、機能的形質導入）レベルでヒト肝細胞において、注入前の混合物に対して正規化して示す。（Ｄ～Ｅ）の場合、各データポイントは、独立したマウスの割合を表す（ＤＮＡについて分析されたｈＦＲＧはＮ＝３１、およびｃＤＮＡについてはＮ＝３２）。データは平均±標準偏差である。一元ＡＮＯＶＡを使用して平均値間の統計的有意性を計算し、ダネットの多重比較検定を使用して、ＡＡＶ－ＳＹＤ１２を他の全てのＡＡＶバリアントと比較した（^＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、ｎ．ｓ．Ｐ値＞０．０５）。（Ｆ）ＤＮＡ（Ｎ＝３１ ｈＦＲＧ）およびｃＤＮＡ（Ｎ＝３２ ｈＦＲＧ）レベルでＦＡＣ選別したヒト肝細胞のＡＡＶカプシドあたりのマッピングされたＮＧＳリードの平均割合。発現指数は、平均 ｃＤＮＡおよびＤＮＡ百分率リードの間の商として定義される。

【図6-1】ＡＡＶカプシドタンパク質配列への親の寄与の分析の模式図である。ライブラリーの親は、水平の点線として表す（上から下へ：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２）。大きなドットは、１００％の親マッチ（すなわち、問題の位置が１つの親のみに一致）を表し、小さなドットは、各位置で複数の親マッチ（すなわち、位置が複数の親に一致）を表す。各キメラの実線は、クロスオーバー間の配列内で識別されたライブラリーの親を表す。交差間の一連の細い水平平行線は、複数の親が等しい確率で一致することを示す。

【図6-2】ＡＡＶカプシドタンパク質配列への親の寄与の分析の模式図である。ライブラリーの親は、水平の点線として表す（上から下へ：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２）。大きなドットは、１００％の親マッチ（すなわち、問題の位置が１つの親のみに一致）を表し、小さなドットは、各位置で複数の親マッチ（すなわち、位置が複数の親に一致）を表す。各キメラの実線は、クロスオーバー間の配列内で識別されたライブラリーの親を表す。交差間の一連の細い水平平行線は、複数の親が等しい確率で一致することを示す。

【図6-3】ＡＡＶカプシドタンパク質配列への親の寄与の分析の模式図である。ライブラリーの親は、水平の点線として表す（上から下へ：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２）。大きなドットは、１００％の親マッチ（すなわち、問題の位置が１つの親のみに一致）を表し、小さなドットは、各位置で複数の親マッチ（すなわち、位置が複数の親に一致）を表す。各キメラの実線は、クロスオーバー間の配列内で識別されたライブラリーの親を表す。交差間の一連の細い水平平行線は、複数の親が等しい確率で一致することを示す。

【図6-4】ＡＡＶカプシドタンパク質配列への親の寄与の分析の模式図である。ライブラリーの親は、水平の点線として表す（上から下へ：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２）。大きなドットは、１００％の親マッチ（すなわち、問題の位置が１つの親のみに一致）を表し、小さなドットは、各位置で複数の親マッチ（すなわち、位置が複数の親に一致）を表す。各キメラの実線は、クロスオーバー間の配列内で識別されたライブラリーの親を表す。交差間の一連の細い水平平行線は、複数の親が等しい確率で一致することを示す。

【図6-5】ＡＡＶカプシドタンパク質配列への親の寄与の分析の模式図である。ライブラリーの親は、水平の点線として表す（上から下へ：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２）。大きなドットは、１００％の親マッチ（すなわち、問題の位置が１つの親のみに一致）を表し、小さなドットは、各位置で複数の親マッチ（すなわち、位置が複数の親に一致）を表す。各キメラの実線は、クロスオーバー間の配列内で識別されたライブラリーの親を表す。交差間の一連の細い水平平行線は、複数の親が等しい確率で一致することを示す。

【図7】ＡＡＶＣ１１．１２カプシドタンパク質配列への親の寄与の分析の模式図である。太い実線は、５’から３’方向への親バリアントへの同一性の最長シーケンスに基づいて、各領域の最も可能性の高い親の起源を表す。親のＡＡＶは水平の点線で示され（ＡＡＶ１－１２、上から下へ）ＶＲ－ＩおよびＡＡＶＣ１１．１２由来のＶＲ－ＩＶ～ＶＩＩＩは、親の起源（ＡＡＶ２、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶ７）を示すブロックで示される。

【図8-1】インビボでのＡＡＶベクターの形質導入効率のグラフ表示を提供する。２匹のヒト化ＦＲＧマウス（ｈＦＲＧ＃３１およびｈＦＲＧ＃４４）を使用して、ＡＡＶＣ１１．１２と親ＡＡＶ２、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ１０のバーコード付きのＮＧＳ比較を実施した。ＤＮＡ（細胞侵入、物理的形質導入）およびｃＤＮＡ（発現、機能的形質導入）レベルでのヒトおよびマウス肝細胞の各バーコードにマッピングされたＮＧＳリードの割合を、注入前の混合物に対して正規化して示す。（Ａ）ヒト肝細胞侵入（ＤＮＡ）。（Ｂ）ヒト肝細胞発現（ｃＤＮＡ）。（Ｃ）マウス肝細胞侵入（ＤＮＡ）。（Ｄ）マウス肝細胞発現（ｃＤＮＡ）。ｈＦＲＧ＃３１のデータは、グラフの各マウスの左側にあり、ｈＦＲＧ＃４４のデータは各侵入の右側にある。データは、平均±標準偏差である。平均値間の統計的有意性は、クラスカル・ウォリス検定を使用して計算し、ダネットの多重比較検定を使用して、ＡＡＶ－ＳＹＤ１２および親ＡＡＶバリアントを対照ＡＡＶ８と比較した（^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ≦０．０１、^＊＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、ｎ．ｓ．Ｐ値＞０．０５）。

【図8-2】インビボでのＡＡＶベクターの形質導入効率のグラフ表示を提供する。２匹のヒト化ＦＲＧマウス（ｈＦＲＧ＃３１およびｈＦＲＧ＃４４）を使用して、ＡＡＶＣ１１．１２と親ＡＡＶ２、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ１０のバーコード付きのＮＧＳ比較を実施した。ＤＮＡ（細胞侵入、物理的形質導入）およびｃＤＮＡ（発現、機能的形質導入）レベルでのヒトおよびマウス肝細胞の各バーコードにマッピングされたＮＧＳリードの割合を、注入前の混合物に対して正規化して示す。（Ａ）ヒト肝細胞侵入（ＤＮＡ）。（Ｂ）ヒト肝細胞発現（ｃＤＮＡ）。（Ｃ）マウス肝細胞侵入（ＤＮＡ）。（Ｄ）マウス肝細胞発現（ｃＤＮＡ）。ｈＦＲＧ＃３１のデータは、グラフの各マウスの左側にあり、ｈＦＲＧ＃４４のデータは各侵入の右側にある。データは、平均±標準偏差である。平均値間の統計的有意性は、クラスカル・ウォリス検定を使用して計算し、ダネットの多重比較検定を使用して、ＡＡＶ－ＳＹＤ１２および親ＡＡＶバリアントを対照ＡＡＶ８と比較した（^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ≦０．０１、^＊＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、ｎ．ｓ．Ｐ値＞０．０５）。

【図9】ＡＡＶ８カプシド足場に交換されたＡＡＶ可変領域の模式図である。

【図10】ＡＡＶ８およびＡＡＶＣ１１．１２カプシドポリペプチドの配列のアラインメントである。可変領域（ＶＲ）－Ｉ、ＶＲ－ＩＶ、ＶＲ－Ｖ、ＶＲ－ＶＩ、ＶＲ－ＶＩＩ、およびＶＲ－ＩＩＩを示し、これらの領域を構成する残基は、ＡＡＶ８ポリペプチドの中で太字かつ斜体で示されている。ＡＡＶ８の対応する残基を置換するために使用されたＡＡＶＣ１１．１２の残基には下線を引いており、各可変領域の最初と最後の置換にまたがる領域は灰色で網掛けされている。

【図11】ｈＦＲＧマウス（Ｎ＝２）におけるＡＡＶＣ１１．１２、ＡＡＶ８およびスワップ（Ｓｗａｐ）１～７のインビボ性能を表す。ヒト肝細胞およびマウス肝臓の各ＡＡＶカプシド（合計がｎ＝５というバーコード／カプシド）にマッピングされたＮＧＳリードの割合を、ＤＮＡ（細胞侵入、物理的形質導入）およびｃＤＮＡ（発現、機能的形質導入）レベルで、注入前の混合物に対して正規化して示している。各カプシドの可変領域の起源は、参照用に下のパネルに示しており、ＡＡＶＣ１１．１２起源の可変領域は濃い灰色で、ＡＡＶ８起源の可変領域は薄い灰色で示されている。

【図12】ｈＦＲＧマウス（Ｎ＝２）におけるＡＡＶＣ１１．１２、ＡＡＶ８およびスワップ（Ｓｗａｐ）１～１５のインビボ性能を表す。ヒト肝細胞およびマウス肝臓における各ＡＡＶカプシド（合計がｎ＝５というバーコード／カプシド）にマッピングされたＮＧＳリードの割合を、ＤＮＡ（細胞侵入、物理的形質導入）およびｃＤＮＡ（発現、機能的形質導入）レベルで、注入前の混合物に対して正規化して、示している。各カプシドの可変領域の起源は、参照用に下のパネルに示されており、ＡＡＶＣ１１．１２起源の可変領域は濃い灰色で、ＡＡＶ８起源の可変領域は薄い灰色で示されている。

【図13】高度に移植されたｈＦＲＧマウス（Ｎ＝２）におけるＡＡＶＣ１１．１２、ＡＡＶ８、およびスワップ１～７のインビボ性能を表す。ＤＮＡ（細胞侵入、物理的形質導入）およびｃＤＮＡ（発現、機能的形質導入）レベルでのヒト肝細胞における各ＡＡＶカプシド（合計でｎ＝５というバーコード／カプシド）にマッピングされたＮＧＳリードの割合を、注入前の混合物に対して正規化して、示す。各カプシドの可変領域の起源は、参照用に下のパネルに示されており、ＡＡＶＣ１１．１２起源の可変領域は濃い灰色で、ＡＡＶ８起源の可変領域は薄い灰色で示されている。

【発明を実施するための形態】

【0032】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。特に断りのない限り、開示全体を通じて参照される全ての特許、特許出願、公開された出願および出版物、データベース、ウェブサイト、ならびにその他の公開された資料は、参照によりその全体が組み込まれる。用語の定義が複数ある場合は、このセクションの定義が優先される。ＵＲＬまたはその他のそのような識別子もしくはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変更されてもよく、インターネット上の特定の情報は行き来してもよいが、インターネットを検索することで同等の情報を見つけることができることが理解される。識別子への言及は、そのような情報の入手可能性および一般への普及を証明する。

【0033】

本明細書で使用されるとき、単数形「１つの、ある（不定冠詞：ａ）」、「１つの、ある（不定冠詞：ａｎ）」および「この、その（定冠詞：ｔｈｅ）」はまた、文脈が明確に指示しない限り、複数の態様（すなわち、少なくとも１つ以上）を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」への言及は、単一のポリペプチド、ならびに２種以上のポリペプチドを含む。

【0034】

本明細書の文脈において、「約」という用語は、当業者が同じ機能または結果を達成する文脈において列挙された値と等価であると考える数の範囲を指すと理解される。

【0035】

本明細書および以下の特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の要求がない限り、「含む」という語、ならびに「含む」および「含んでいる」などの変形は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを含むが、任意の他の整数もしくはステップ、または整数もしくはステップのグループを除外するものではないことを意味すると理解される。

【0036】

本明細書で使用される場合、「ベクター」とは、ベクター内に含まれる導入遺伝子を宿主細胞に各々が送達し得る、ポリヌクレオチドベクターおよびウイルスベクターの両方への言及を含む。ベクターは、エピソームであり、すなわち、宿主細胞のゲノムに組み込まれないか、または宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。ベクターはまた、複製可能であってもまたは複製欠損であってもよい。例示的なポリヌクレオチドベクターとしては、限定するものではないが、プラスミド、コスミド、およびトランスポゾンが挙げられる。例示的なウイルスベクターとしては、例えば、ＡＡＶ、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよび肝炎ウイルスベクターが挙げられる。

【0037】

本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター」とは、カプシドがアデノ随伴ウイルスに由来するベクターを指し、これには限定するものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３、他のクレードもしくは分離株由来のＡＡＶが挙げられ、またはキメラカプシドタンパク質を含む、合成、生物工学的または改変されたＡＡＶカプシドタンパク質に由来する。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、本開示のカプシドポリペプチドを含むカプシドを有する。ＡＡＶベクターを参照する場合、ゲノムの供給源とカプシドの供給源の両方を特定し得、ここで、ゲノムのソースは指定された最初の数であり、カプシドの供給源は指定された２番目の数である。したがって、例えば、カプシドとゲノムの両方がＡＡＶ２に由来するベクターは、より正確にはＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ６由来のカプシドとＡＡＶ２由来のゲノムを有するベクターは、最も正確にはＡＡＶ２／６と呼ばれる。生物工学によるＤＪカプシドおよびＡＡＶ２由来のゲノムを有するベクターは、最も正確にはＡＡＶ２／ＤＪと呼ばれる。簡単にするために、またほとんどのベクターがＡＡＶ２由来のゲノムを使用するので、ＡＡＶ６ベクターへの言及は一般にＡＡＶ２／６ベクターを指し、ＡＡＶ２ベクターへの言及は一般にＡＡＶ２／２ベクターを指す、などが理解される。ＡＡＶベクターはまた、本明細書において「組換えＡＡＶ」、「ｒＡＡＶ」、「組換えＡＡＶビリオン」、「ｒＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶバリアント」、「組換えＡＡＶバリアント」、および「ｒＡＡＶバリアント」という用語で呼ばれることがあり、これらは交換可能に使用され、ＡＡＶゲノムをカプシド化するＡＡＶカプシドシェルを含む複製欠損ウイルスを指す。ＡＡＶベクターゲノム（ベクターゲノム、組換えＡＡＶゲノムまたはｒＡＡＶゲノムとも呼ばれる）は、機能的ＡＡＶ ＩＴＲが両側に隣接する導入遺伝子を含む。典型的には、野生型ＡＡＶ遺伝子の１つ以上は、ゲノムから全体または一部が、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が欠失している。ベクターゲノムのレスキュー、複製、およびｒＡＡＶビリオンへのパッケージングには、機能的なＩＴＲ配列が必要である。

【0038】

「ＩＴＲ」という用語は、ＡＡＶゲノムのいずれかの末端における逆方向末端反復を指す。この配列はヘアピン構造を形成し得、原核生物のプラスミド由来のＡＡＶ ＤＮＡの複製およびレスキューまたは切除に関与している。本開示で使用するためのＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列がｒＡＡＶの機能的レスキュー、複製およびパッケージングを提供する限り、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてもよい。

【0039】

本明細書で使用される場合、カプシドポリペプチドに関して「機能的」とは、ポリペプチドが自己アセンブルするか、または異なるカプシドポリペプチドとアセンブルして、ＡＡＶビリオンのタンパク質性シェル（カプシド）を生成し得ることを意味する。所与の宿主細胞内の全てのカプシドポリペプチドがＡＡＶカプシドにアセンブルするわけではないことを理解すべきである。好ましくは、全ＡＡＶカプシドポリペプチド分子の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％がＡＡＶカプシドにアセンブルする。この生物学的活性を測定するための適切なアッセイは、例えば、Smith-Arica and Bartlett(2001), Curr Cardiol Rep 3(1): 43-49に記載されている。

【0040】

「ＡＡＶヘルパー機能」または「ヘルパー機能」とは、ＡＡＶが宿主細胞によって複製およびパッケージ化されることを可能にする機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、限定するものではないが、ヘルパーウイルスとして、またはＡＡＶの複製およびパッケージングを助けるヘルパーウイルス遺伝子として、任意の多数の形態で提供され得る。ヘルパーウイルス遺伝子としては、限定するものではないが、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡなどのアデノウイルスヘルパー遺伝子が挙げられる。ヘルパーウイルスとしては、限定するものではないが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、例えば、ワクシニア、およびバキュロウイルスが挙げられる。アデノウイルスには多くの異なるサブグループが含まれるが、サブグループＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が最も一般的に使用されている。ヒト、ヒト以外の哺乳動物、および鳥類起源の多数のアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ＡＴＣＣなどの寄託機関からも入手できるヘルペス科のウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる。寄託機関から入手可能なバキュロウイルスとしては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ 核多角体病ウイルスが挙げられる。

【0041】

本明細書で使用する「形質導入」という用語は、１つ以上の特定の細胞型へのＡＡＶベクターの侵入、およびＡＡＶベクター内に含まれるＤＮＡの細胞への移動を指す。形質導入は、細胞または細胞集団においてＡＡＶ ＤＮＡから発現されたＡＡＶ ＤＮＡもしくはＲＮＡの量を測定することによって、および／またはＤＮＡから発現されたＡＡＶ ＤＮＡもしくはＲＮＡを含む集団中の細胞の数を評価することによって評価され得る。ＲＮＡの存在または量が評価される場合、評価される形質導入のタイプは、本明細書では「機能的形質導入」、すなわちＡＡＶがＤＮＡを細胞に移し、そのＤＮＡを発現させる能力と呼ばれる。「形質導入効率」という用語およびその文法上の変形は、ＡＡＶベクターが宿主細胞に形質導入する能力、より具体的にはＡＡＶベクターが宿主細胞に形質導入する効率を指す。特定の実施形態では、形質導入効率は、インビボ形質導入効率であり、対象へのベクターの投与後に、ＡＡＶベクターがインビボで宿主細胞に形質導入する能力を指す。形質導入効率は、所定の数のベクター粒子への曝露またはその投与後に形質導入された宿主細胞の数（例えば、顕微鏡またはフローサイトメトリー技術を使用したＧＦＰまたはｅＧＦＰなどのベクターゲノムからのレポーター遺伝子の発現によって評価されるように）；所定の数のベクター粒子への曝露後の宿主細胞の集団におけるベクターＤＮＡの量（例えば、ベクターゲノムの数）；所定の数のベクター粒子への曝露後の宿主細胞集団中のベクターＲＮＡの量；ならびに所定の数のベクター粒子への曝露またはその投与後の宿主細胞集団におけるベクターゲノム中のレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰまたはｅＧＦＰ）由来のタンパク質発現レベルを評価することを含む、当業者に公知である多くの方法で評価され得る。宿主細胞の集団は、特定の数の宿主細胞、組織の体積もしくは重量、または器官全体（例えば、肝臓）を表し得る。インビボ形質導入効率は、ＡＡＶベクターが肝臓の肝細胞などの宿主細胞にアクセスする能力；ＡＡＶベクターが宿主細胞に侵入する能力；および／または宿主細胞侵入時のベクターゲノムに含まれる異種コード配列の発現を反映し得る。

【0042】

本明細書で使用される場合、「対応するヌクレオチド」、「対応するアミノ酸残基」または「対応する位置」とは、整列された遺伝子座で生じるヌクレオチド、アミノ酸または位置を指す。関連またはバリアントのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列は、当業者に公知の任意の方法によって整列される。そのような方法は、典型的には一致を最大化し（例えば、位置における同一のヌクレオチドまたはアミノ酸）、手動アラインメントの使用および利用可能な多数のアラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＣｌｕｓｔｌＷ、ＣｌｕｓｔｌＷ２、ＥＭＢＯＳＳ、ＬＡＬＩＧＮ、Ｋａｌｉｇｎ、等）および当業者に公知の他のものを用いることによる方法を含む。ポリヌクレオチドの配列を整列させることにより、当業者は、対応するヌクレオチドを同定し得る。例えば、配列番号１に示されるプロトタイプのＡＡＶ２カプシドポリペプチドを別のＡＡＶカプシドポリペプチドと整列させることにより（例えば、図１に示されるように）、当業者は、配列番号１に示されるＡＡＶポリペプチドの様々な領域または残基に対応する、他のＡＡＶポリペプチド内の領域またはアミノ酸残基を同定し得る。例えば、配列番号２の２０４位のメチオニンは、配列番号１の２０３位のメチオニンの対応するアミノ酸であるか、またはそれに対応する。別の例では、図１０のＡＡＶ８およびＡＡＶＣ１１．１２のカプシドポリペプチドのアラインメントを参照すると、ＡＡＶＣ１１．１２カプシドポリペプチドの２６２位のセリンの２６２位は、ＡＡＶ８カプシドポリペプチドの２６４位と整列するか、または対応し、およびＡＡＶＣ１１．１２カプシドポリペプチドの２６２位のセリンは、ＡＡＶ８カプシドポリペプチドの２６４位のトレオニンに対応するか、または対応するそのアミノ酸である。したがって、アミノ酸残基または位置が特定のカプシドポリペプチドに関して本明細書で言及される場合、適切な場合、別のカプシドポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基または位置にもその言及がなされていることが理解される。例えば、「配列番号１３に対するナンバリングを有するＳ２６４」を含むカプシドポリペプチドへの言及は、２６４位にセリンを有する配列番号１３に示されるＡＡＶＣ１１．１２カプシドポリペプチドだけでなく、配列番号１３の２６４位に対応する位置にセリンを有する他のカプシドポリペプチドも包含する。これには、例えば、ＡＡＶ８Ｓｗａｐ１（配列番号６５）カプシドポリペプチドなどのカプシドポリペプチドが含まれ、ここで、配列番号１３の２６４位に対応するＡＡＶ８Ｓｗａｐ１中の位置は２６４位であり、セリン；およびＡＡＶＣ１１．１２ ＶＰ３タンパク質によって占められており、ここで、配列番号１３の２６４位に対応するＡＡＶＣ１１．１２ ＶＰ３タンパク質中の位置は、６０位である（そして当然セリンによって占められている）。別の例では、「配列番号１３に対するナンバリングで、Ｓ５８０」を含むカプシドポリペプチドへの言及とは、５８０位にセリンを有する配列番号１３に示されるＡＡＶＣ１１．１２カプシドポリペプチド、および配列番号１３の５８０位に対応する位置のセリンを有する他のカプシドポリペプチド、例えば、ＡＡＶ８Ｓｗａｐ３カプシドポリペプチド（配列番号６７）であって、この配列番号１３の５８０位に対応する、ＡＡＶ８Ｓｗａｐ３中の位置は、５８２位であり、セリンで占められているカプシドポリペプチドを指す。

【0043】

本明細書で使用される「異種コード配列」とは、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞に存在する核酸配列であって、そのポリヌクレオチド、ベクターもしくは宿主細胞に天然には見出されないか、またはそのポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞に存在する位置に天然には見出されない、すなわち非天然である、核酸配列を指す。「異種コード配列」とは、ペプチドもしくはポリペプチド、またはそれ自体が機能もしくは活性を有するポリヌクレオチド、例えば、アンチセンスまたは阻害オリゴヌクレオチド、例としては、アンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ）をコードし得る。いくつかの例では、異種コード配列は、動物のゲノムＤＮＡ内の核酸のストレッチと本質的に相同な核酸のストレッチであり、その結果、異種コード配列が動物の細胞に導入されると、異種配列とゲノムＤＮＡとの間で相同組換えが起こり得る。一例では、異種コード配列は、欠陥／変異コピーを有する細胞への導入のための遺伝子の機能的コピーである。

【0044】

本明細書において、プロモーターおよびコード配列に関して「作動可能に連結された」という用語は、コード配列の転写がプロモーターの制御下にあるか、またはプロモーターによって駆動されることを意味する。

【0045】

「宿主細胞」という用語は、ベクターまたは他のポリヌクレオチドなどの外因性ＤＮＡが導入された哺乳動物細胞などの細胞を指す。この用語は、外因性ＤＮＡが導入された元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」とは、一般に、外因性ＤＮＡでトランスフェクトまたは形質導入された細胞を指す。

【0046】

本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して「単離された」とは、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが由来する細胞由来の細胞物質も他の夾雑タンパク質も実質的に含まないこと、または科学的に合成された場合、化学的前駆体も他の化学物質も実質的に含まないことを意味する。

【0047】

本明細書で使用される「対象」という用語は、本発明から利益を得ることができる動物、特に哺乳動物、より具体的には下等霊長類を含む霊長類、さらにより具体的にはヒトを指す。対象は、ヒトまたはヒト以外の動物または胚に関係なく、個体、対象、動物、患者、宿主、またはレシピエントと呼ばれてもよい。本開示は、ヒトおよび獣医学の両方の用途を有する。便宜上、「動物」には、特に牛、馬、羊、豚、ラクダ、ヤギ、およびロバなどの家畜、ならびに犬および猫などの家庭内動物が含まれる。馬に関しては、これらとしては競馬産業で使用される馬だけでなく、レクリエーションまたは畜産業で使用される馬も含まれる。実験動物の例には、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびハムスターが挙げられる。ウサギおよびげっ歯類、例えば、ラットおよびマウスは、霊長類および下等霊長類と同様に、便利な試験系または動物モデルを提供する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

【0048】

本明細書で使用される場合、「保存的配列改変」または「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むベクターの特徴に有意な影響を及ぼさず、変化もさせないアミノ酸改変を指す。そのような保存的改変には、アミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。改変は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当該技術分野で公知の標準的な技術によって、様々な実施形態に適合するベクターに導入され得る。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、カプシド内の１つ以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置き換えてもよく、変更されたカプシドは、本明細書に記載の機能アッセイを使用して指向性および／またはペイロードを送達する能力について試験され得る。

【0049】

上記の用語および関連する定義は、説明のみを目的として使用され、限定を意図するものではないことを理解されたい。

【0050】

【表1】

【0051】

カプシドポリペプチド
本開示は、新規ＡＡＶカプシドポリペプチドの同定に部分的に基づいている。典型的には、カプシドポリペプチドは、ＡＡＶベクターのカプシドに存在する場合、ヒト細胞（ヒト肝細胞など）の効率的な形質導入を促進する。本開示のカプシドポリペプチドを含むカプシドを有するＡＡＶベクターによる細胞のインビボ形質導入は、参照ＡＡＶカプシドポリペプチド（例えば、配列番号１に示されるプロトタイプのＡＡＶ２カプシド）を含むＡＡＶベクターと比較して、一般に増加または増強される。ＡＡＶベクターの形質導入または形質導入効率は、少なくとももしくは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上増加し得、例えば、本開示のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターは、参照ＡＡＶカプシドポリペプチド（例えば、配列番号１に示されるもの）と比較してインビボでの形質導入細胞で少なくとももしくは約１．２×、１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×、１６×、１７×、１８×、１９×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×またはそれ以上の効率であり得る。特定の例では、ヒト肝臓組織またはヒト肝細胞において、形質導入または形質導入効率の増加が観察される。

【0052】

本開示のカプシドを含むＡＡＶベクターはまた、プールされたヒト免疫グロブリン（静脈内免疫グロブリンまたはＩＶＩｇとも呼ばれる）による中和に対する耐性の増強または増大を示し得る。ＩＶＩｇ中和に対する耐性は、以下の実施例に記載されるものなどの周知のアッセイを使用して、インビボまたはインビトロで観察され得る。ＩＶＩｇ中和に対する耐性は、少なくとももしくは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上増加し得、例えば、本開示のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターのＩＶＩｇ中和に対する耐性は、参照ＡＡＶカプシドポリペプチド（例えば、配列番号１に示されるもの）を含むＡＡＶベクターのＩＶＩｇ中和に対する耐性よりも少なくとももしくは約１．２×、１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×、１６×、１７×、１８×、１９×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×またはそれ以上であり得る。

【0053】

したがって、本開示のカプシドポリペプチドは、ＡＡＶベクター、特に遺伝子治療用のＡＡＶベクターを調製するのに特に有用である。例示的な実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、肝細胞、特にヒト肝細胞を形質導入するＡＡＶベクターを調製するのに特に有用であり、したがって肝臓を標的とする遺伝子治療用途に有用である。

【0054】

本明細書に提供されるのは、配列番号２～２０および６５～７９のいずれか１つに示されるＡＡＶカプシドポリペプチドの全てまたは一部を含む、単離されたポリペプチドを含むポリペプチドであり、これには、ＶＰ１タンパク質（配列番号１の１～７３５位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含む）、ＶＰ２タンパク質（配列番号１の位置１３８～７３５のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含む）および／またはＶＰ３タンパク質（配列番号１の２０３～７３５位の残基に対応するアミノ酸残基を含む）、およびそのバリアント（本明細書に記載のＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３タンパク質に対して、少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含むバリアントを含む）のうちの全てまたは一部を含む。

【0055】

本開示のカプシドポリペプチドには、配列番号２（ＡＡＶＣ１１．０１とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが挙げられる。したがって、配列番号２のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号２のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含むカプシドポリペプチド；ならびに配列番号２のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号２のアミノ酸２０４～７３５として示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むカプシドポリペプチドも本開示に含まれる。

【0056】

本開示のカプシドポリペプチドにはまた、配列番号３に示されるＶＰ１タンパク質（ＡＡＶＣ１１．０２とも呼ばれる）の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが挙げられる。したがって、配列番号３のアミノ酸１３８～７３６として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号３のアミノ酸１３８～７３６として示されるＶＰ２タンパク質またはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むカプシドポリペプチド；ならびに配列番号３のアミノ酸２０４～７３６に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号３のアミノ酸２０４～７３６として示されるＶＰ３タンパク質、もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むカプシドポリペプチドも本開示に含まれる。

【0057】

本開示の例示的なカプシドポリペプチドにはまた、配列番号４（ＡＡＶＣ１１．０３とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが挙げられる。したがって、配列番号４のアミノ酸１３８～７３７として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号４のアミノ酸１３８～７３７として示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むカプシドポリペプチド；ならびに配列番号４のアミノ酸２０４～７３７に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号４のアミノ酸２０４～７３７として示されるＶＰ３タンパク質、もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むカプシドポリペプチドも本開示に含まれる。

【0058】

また本明細書では、配列番号５（ＡＡＶＣ１１．０４とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むカプシドポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチドも本明細書に提供される。したがって、配列番号５のアミノ酸１３８～７３４として示されるＶＰ２タンパク質の全てまたは一部を含むか、または配列番号５のアミノ酸１３８～７３４として示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して、少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号５のアミノ酸２０３～７３４に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号５のアミノ酸２０３～７３４として示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むカプシドポリペプチドも本開示に含まれる。

【0059】

本開示のカプシドポリペプチドにはまた、配列番号６に示されるＶＰ１タンパク質（ＡＡＶＣ１１．０５とも呼ばれる）の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドも本明細書に含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号６のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質の全てまたは一部を含むか、または配列番号６のアミノ酸１３８～７３５に示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号６のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号６のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0060】

本開示のカプシドポリペプチドにはまた、配列番号７（ＡＡＶＣ１１．０６とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号７のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号７のアミノ酸１３８～７３５に示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号７のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号７のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0061】

本開示の他の例示的なカプシドポリペプチドとしては、配列番号８（ＡＡＶＣ１１．０７とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号８のアミノ酸１３８～７３４として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号８のアミノ酸１３８～７３４に示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号８のアミノ酸２０３～７３４に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号８のアミノ酸２０３～７３４に示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0062】

本開示のさらなる例示的なカプシドポリペプチドとしては、配列番号９（ＡＡＶＣ１１．０８とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号９のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号９のアミノ酸１３８～７３５に示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号９のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号９のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0063】

本開示のカプシドポリペプチドには、配列番号１０（ＡＡＶＣ１１．０９とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号１０のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１０のアミノ酸１３８～７３５に示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号１０のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１０のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0064】

本開示のカプシドポリペプチドには、配列番号１１（ＡＡＶＣ１１．１０とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号１１のアミノ酸１３８～７３４として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１１のアミノ酸１３８～７３４に示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号１１のアミノ酸２０３～７３４に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１１のアミノ酸２０３～７３４に示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0065】

本開示の例示的なカプシドポリペプチドには、配列番号１２（ＡＡＶＣ１１．１１とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号１２のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１２のアミノ酸１３８～７３５に示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号１２のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１２のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0066】

本開示のさらなる例示的なカプシドポリペプチドには、配列番号１３（ＡＡＶＣ１１．１２とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号１３のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１３のアミノ酸１３８～７３５に示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号１３のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１３のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0067】

また、配列番号１４（ＡＡＶＣ１１．１３とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むカプシドポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドも提供される。したがって、本開示にはまた、配列番号１４のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１４のアミノ酸１３８～７３５に示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号１４のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１４のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0068】

本開示のカプシドポリペプチドにはまた、配列番号１５（ＡＡＶＣ１１．１４とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号１５のアミノ酸１３８～７３６として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１５のアミノ酸１３８～７３６に示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号１５のアミノ酸２０３～７３６に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１５のアミノ酸２０３～７３６に示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0069】

本開示のカプシドポリペプチドにはまた、配列番号１６に示されるＶＰ１タンパク質（ＡＡＶＣ１１．１５とも呼ばれる）の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号１６のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１６のアミノ酸１３８～７３５に示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号１６のアミノ酸２０４～７３５として示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１６のアミノ酸２０４～７３５として示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0070】

本開示の例示的なカプシドポリペプチドにはまた、配列番号１７（ＡＡＶＣ１１．１６とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号１７のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１７のアミノ酸１３８～７３５に示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号１７のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１７のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0071】

例示的なカプシドポリペプチドにはまた、配列番号１８（ＡＡＶＣ１１．１７とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号１８のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１８のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号１８のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１８のアミノ酸２０４～７３５として示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0072】

本開示のさらなる例示的なカプシドポリペプチドには、配列番号１９（ＡＡＶＣ１１．１８とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号１９のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１９のアミノ酸１３８～７３５に示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号１９のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号１９のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0073】

本開示のカプシドポリペプチドには、配列番号２０（ＡＡＶＣ１１．１９とも呼ばれる）に示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号２０のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号２０のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチド；ならびに配列番号２０のアミノ酸２０４～７３５として示されるＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むか、または配列番号２０のアミノ酸２０４～７３５に示されるＶＰ３タンパク質もしくはその機能的フラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0074】

本開示のカプシドポリペプチドにはまた、配列番号６５～７９のいずれか１つに示されるＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。したがって、本開示にはまた、配列番号６９、７１～７４、７６および７８のいずれか１つのアミノ酸１３８～７３５、配列番号６５、６８、７５、７７および７９のいずれか１つのアミノ酸１３８～７３６、配列番号６７もしくは７０のアミノ酸１３８～７３７，または配列番号６６のアミノ酸１３８～７３８として示されるＶＰ２タンパク質の全てまたは一部を含むか；または上述のＶＰ２タンパク質もしくはその機能的なフラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。また本開示には、配列番号６９、７１～７４、７６および７８のいずれか１つのアミノ酸２０４～７３５、配列番号６５、６８、７５、７７および７９のいずれか１つのアミノ酸２０４～７３６、配列番号６７もしくは７０のアミノ酸２０４～７３７、または配列番号６６のアミノ酸２０４～７３８として示されるＶＰ３タンパク質の全てまたは一部を含むか；あるいは上述のＶＰ３タンパク質またはその機能的なフラグメントに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、カプシドポリペプチドも含まれる。

【0075】

いくつかの例では、上記および本明細書に記載のカプシドポリペプチドは、ＡＡＶＣ１１．１２ポリペプチド（配列番号１３）に存在する対応する可変領域の配列と同じ配列を有する１つ以上の可変領域の全てもしくは一部を含む。ＡＡＶカプシドポリペプチドの可変領域は、記載されており（例えば、ＤｒｏｕｉｎおよびＡｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ、２０１３、Ｆｕｔｕｒｅ Ｖｉｒｏｌ．８（１２）：１１８３～１１９９を参照）、そしてＡＡＶ２に対するナンバリングで、位置２６０～２６７にまたがるＶＲ－１；位置３２６～３３０にまたがるＶＲ－ＩＩ；３８０～３８４位にまたがるＶＲ－ＩＩＩ；位置４４９～４６７にまたがるＶＲ－ＩＶ；位置４８７～５０４にまたがるＶＲ－Ｖ；位置５２２～５３８にまたがるＶＲ－ＶＩ；位置５４４～５５７にまたがるＶＲ－ＶＩＩ；位置５８０～５９２にまたがるＶＲ－ＶＩＩＩ；および位置７０３～７１１にまたがるＶＲ－ＩＸを含む。ＤＮＡシャッフルライブラリーから生成されたＡＡＶＣ１１．１２ポリペプチドには、ＡＡＶ２由来のＶＲ－Ｉ、ＡＡＶ１０由来のＶＲ－ＩＶおよびＶＲ－Ｖ、ならびにＡＡＶ７由来のＶＲ－ＶＩ、ＶＲ－ＶＩＩ、およびＶＲ－ＶＩＩＩが含まれている（上記ならびにＤｒｏｕｉｎおよびＡｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ，２０１３で定義されているＶＲ領域を使用する場合、配列番号１３に示されるＡＡＶＣ１１．１２ポリペプチドのＶＲ－Ｉは位置２６１～２６８にまたがり、ＶＲ－ＩＶは位置４５０～４６８にまたがり、ＶＲ－Ｖは位置４８８～５０５にまたがり；ＶＲ－ＶＩは位置５２３～５３９にまたがり；ＶＲ－ＶＩＩは位置５４５～５５７にまたがり；そしてＶＲ－ＶＩＩＩは位置５８０～５９２にまたがる）。したがって、いくつかの例では、本開示のカプシドポリペプチドは、ＡＡＶＣ１１．１２ポリペプチドのＶＲ－Ｉ、ＶＲ－ＩＶ、ＶＲ－Ｖ、ＶＲ－ＶＩ、ＶＲ－ＶＩＩおよびＶＲ－ＶＩＩＩの１つ以上の全てもしくは一部を含む。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、ＡＡＶＣ１１．１２ポリペプチドのＶＲ－Ｉ、ＶＲ－ＩＶ、ＶＲ－Ｖ、ＶＲ－ＶＩ、ＶＲ－ＶＩＩおよびＶＲ－ＶＩＩＩの１つ以上の全てもしくは一部に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0076】

一例では、本開示のカプシドポリペプチド（例えば、配列番号２～２０または６５～７９のいずれか１つのＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３タンパク質に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含むカプシドポリペプチド）は、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基、Ｓ２６３、Ｑ２６４、Ｓ２６５、Ｓ２６８およびＨ２７２（すなわち、ＡＡＶＣ１１．１２のＶＲ－１中またはその近くの残基を含む）；アミノ酸残基Ｓ４５１、Ｑ４５６、Ｇ４５７、Ｑ４６０、Ｌ４６２、Ａ４６６、Ａ４６９、Ｎ４７０、Ｓ４７２およびＡ４７３（すなわち、ＡＡＶＣ１１．１２のＶＲ－ＩＶ中および／またはその近くの残基を含む）；アミノ酸残基Ｌ４９３、Ｓ４９４、Ｇ５０５、Ａ５０６、Ｖ５１８およびＶ５２２（すなわち、ＡＡＶＣ１１．１２のＶＲ－Ｖ内またはその近くの残基を含む）；アミノ酸残基Ｄ５３２、Ｓ５３８およびＶ５４０（すなわち、ＡＡＶＣ１１．１２のＶＲ－ＶＩ内またはその近くの残基を含む）；アミノ酸残基Ｔ５４６、Ｇ５４７、Ｔ５４９、Ｎ５５０、Ｋ５５１、Ｔ５５２、Ｔ５５３、Ｌ５５４、Ｅ５５５、Ｎ５５６、Ｌ５５８、Ｍ５５９、Ｎ５６１、Ｒ５６６、およびＰ５６７（すなわち、ＡＡＶＣ１１．１２のＶＲ－ＶＩＩ内またはその近くの残基を含む）；および／またはアミノ酸残基Ｓ５８０、Ｓ５８１、Ａ５８５、Ａ５８６、Ａ５９０、Ｔ５９２、Ｑ５９３、Ｖ５９４、およびＮ５９７（すなわち、ＡＡＶＣ１１．１２のＶＲ－ＶＩＩＩ中またはその近くの残基を含む）を含む。

【0077】

さらなる例では、カプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３～２７２のアミノ酸の配列ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号５８）；位置２６１～２７２のアミノ酸の配列ＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号８０）；位置４５１～４７３のアミノ酸の配列の配列ＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号６２）；位置４５０～４７３のアミノ酸の配列ＱＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号８３）；位置４９３～５２２のアミノ酸の配列ＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号６３）；位置４８８～５２２のアミノ酸の配列ＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号８４）；位置５３２～５４０のアミノ酸の配列ＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号６１）；位置５２３～５４０のアミノ酸の配列ＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号８２）；位置５４６～５６７のアミノ酸の配列ＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号５９）；位置５４５～５６７のアミノ酸の配列ＫＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号８１）；および／または位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）を含む。

【0078】

特定の例では、本開示のカプシドポリペプチド（例えば、配列番号２～２０または６５～７９のいずれか１つのＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３タンパク質に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むカプシドポリペプチド）は、ＡＡＶＣ１１．１２のＶＲ－Ｉ、およびＡＡＶＣ１１．１２のＶＲ－ＶＩＩおよび／またはＶＲ－ＶＩＩＩの全てもしくは一部を含む。したがって、一例では、このポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、ａ）アミノ酸残基Ｓ２６３、Ｑ２６４、Ｓ２６５、Ｓ２６８およびＨ２７２；ならびにｂ）アミノ酸残基Ｔ５４６、Ｇ５４７、Ｔ５４９、Ｎ５５０、Ｋ５５１、Ｔ５５２、Ｔ５５３、Ｌ５５４、Ｅ５５５、Ｎ５５６、Ｌ５５８、Ｍ５５９、Ｎ５６１、Ｒ５６６およびＰ５６７；ならびに／またはアミノ酸残基Ｓ５８０、Ｓ５８１、Ａ５８５、Ａ５８６、Ａ５９０、Ｔ５９２、Ｑ５９３、Ｖ５９４、およびＮ５９７を含む。さらなる例では、このカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、ａ）位置２６３～２７２のアミノ酸の配列ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号５８）；およびｂ）位置５４６～５６７のアミノ酸の配列ＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号５９）および／または位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）を含む。他の例では、このカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６１～２７２のアミノ酸の配列ＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号８０）；およびｂ）位置５４５～５６７のアミノ酸の配列ＫＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号８１）および／または位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）を含む。そのようなカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、ＡＡＶＣ１１．１２のＶＲ－ＶＩの全てもしくは一部（例えば、アミノ酸残基Ｄ５３２、Ｓ５３８およびＶ５４０；位置５３２～５４０のアミノ酸ＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号６１）の配列；および／または位置５２３～５４０のアミノ酸の配列ＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号８２））、ＡＡＶＣ１１．１２のＶＲ－ＩＶの全てもしくは一部（例えば、アミノ酸残基Ｓ４５１、Ｑ４５６、Ｇ４５７、Ｑ４６０、Ｌ４６２、Ａ４６６、Ａ４６９、Ｎ４７０、Ｓ４７２およびＡ４７３；位置４５１～４７３のアミノ酸の配列ＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号６２）、および／または位置４５０～４７３のアミノ酸の配列ＱＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号８３））、および／またはＡＡＶＣ１１．１２のＶＲ－Ｖの全てもしくは一部（例えば、アミノ酸残基Ｌ４９３、Ｓ４９４、Ｇ５０５、Ａ５０６、Ｖ５１８およびＶ５２２、位置４９３～５２２のアミノ酸の配列ＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号６３）および／または位置４８８～５２２のアミノ酸の配列ＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号８４））を含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号５８と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、位置２６４～２７２のいずれかにおける少なくとも１つの置換（例えば、少なくとも１つの保存的置換、例えば、少なくとも２、３、４、または５つの置換）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号５８と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み（例えば、少なくとも１つの保存的置換、例えば、少なくとも２、３、４、または５つの置換）、かつ位置２６６、２６７、２６９、２７０、および２７１のいずれかで少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号５８に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、少なくとも１つの欠失または挿入を含む。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、２６３位にＳ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、２６４位にＱ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、２６５位にＳ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、２６８位にＳ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、２７２位にＨ、またはその保存的置換を含み得る。

【0080】

いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号５９に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、位置５４５～５６７のいずれかに少なくとも１つの置換を含む（例えば、少なくとも１つの保存的置換、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、または７つの置換）。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号５９に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み（例えば、少なくとも１つの保存的置換、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、または７つの置換）、位置５４５、５４８、５５７、５６０、５６２、５６３、５６４または５６５のいずれかに少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号５９に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、かつ少なくとも１つの欠失または挿入を含む。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５４６位にＴ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５４７位にＧ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５４９位にＴ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５５０位にＮ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５５１位にＫ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５５２位にＴ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５５３位にＴ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５５４位にＬ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５５５位にＥ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５５６位にＮ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５５８位にＬ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５５９位にＭ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５６１位にＮ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５６６位にＲ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５６７位にＰ、またはその保存的置換を含み得る。

【0081】

いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号６０に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み（例えば、少なくとも１つの保存的置換、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの置換）、かつ位置５８１～５９７のうちのいずれかで少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号６０に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み（例えば、少なくとも１つの保存的置換、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの置換）、かつ位置５８２、５８３、５８４、５８７、５８８、５８９、５９１、５９５、または５９６のうちのいずれかで少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号６０に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、かつ少なくとも１つの欠失または挿入を含む。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５８０位にＳ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５８１位にＳ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５８５位にＡ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５８６位にＡ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５９０位にＡ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５９２位にＴ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５９３位にＯ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５９４位にＶ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５９７位にＮ、またはその保存的置換を含み得る。

【0082】

いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号６１に対して少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み（例えば、少なくとも１つの保存的置換、例えば、少なくとも２、３、４、５、または６つの置換）、かつ位置５３２～５４０のうちのいずれかで少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号６１に対して少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み（例えば、少なくとも１つの保存的置換、例えば、少なくとも２、３、４、５、または６つの置換）、かつ位置５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、または５３９のうちのいずれかで少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号６１に対して少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、かつ少なくとも１つの欠失または挿入を含む。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５３２位にＤ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５３８位にＳ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５４０位にＶ、またはその保存的置換を含み得る。

【0083】

いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号６２に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み（例えば、少なくとも１つの保存的置換、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の置換）、かつ位置４５１～４７３のいずれかに少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号６２に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み（例えば、少なくとも１つの保存的置換、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の置換）、かつ位置４５２、４５３、４５４、４５５、４５８、４５９、４６１、４６３、４６４、４６５、４６７、４６８、または４７１のいずれかに少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号６２に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、かつ少なくとも１つの欠失または挿入を含む。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、４５１位にＳ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、４５６位にＱ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、４５７位にＧ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、４６０位にＱ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、４６２位にＬ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、４６６位にＡ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、４６９位にＡ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、４７０位にＮ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、４７２位にＳ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、４７３位にＡ、またはその保存的置換を含み得る。

【0084】

いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号６３に対して少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み（例えば、少なくとも１つの保存的置換、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４の置換）、位置４９３～５２２のいずれかで少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号６３に対して少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み（例えば、少なくとも１つの保存的置換、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４の置換）、かつ位置４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１９、５２０、または５２１のいずれかで少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドポリペプチドは、配列番号６３に対して少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、かつ少なくとも１つの欠失または挿入を含む。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、４９３位にＬ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、４９４位にＳ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５０５位にＧ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５０６位にＡ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５１８位にＶ、またはその保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、カプシドポリペプチドは、５２２位にＶ、またはその保存的置換を含み得る。

【0085】

特定の例では、本開示のカプシドポリペプチド（例えば、配列番号２～２０または６５～７９のいずれか１つのＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３タンパク質に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、する９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含むカプシドポリペプチド）は、ＡＡＶＣ１１．１２のＶＲ－ＩＶ、ＶＲ－Ｖ、ＶＲ－ＶＩ、ＶＲ－ＶＩＩ、ＶＲ－ＶＩＩＩの全てまたは一部を含む。したがって、一例では、ポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ４５１、Ｑ４５６、Ｇ４５７、Ｑ４６０、Ｌ４６２、Ａ４６６、Ａ４６９、Ｎ４７０、Ｓ４７２、Ａ４７３、Ｌ４９３、Ｓ４９４、Ｇ５０５、Ａ５０６、Ｖ５１８、Ｖ５２２、Ｄ５３２、Ｓ５３８、Ｖ５４０、Ｔ５４６、Ｇ５４７、Ｔ５４９、Ｎ５５０、Ｋ５５１、Ｔ５５２、Ｔ５５３、Ｌ５５４、Ｅ５５５、Ｎ５５６、Ｌ５５８、Ｍ５５９、Ｎ５６１、Ｒ５６６、Ｐ５６７、Ｓ５８０、Ｓ５８１、Ａ５８５、Ａ５８６、Ａ５９０、Ｔ５９２、Ｑ５９３、Ｖ５９４、Ｎ５９７を含む。特定の例では、カプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５１～４７３のアミノ酸の配列ＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号６２）；位置４９３～５２２のアミノ酸の配列ＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号６３）；位置５３２～５４０のアミノ酸の配列ＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号６１）；位置５４６～５６７のアミノ酸の配列ＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号５９）；位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）を含む。さらなる例では、ポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５０～４７３のアミノ酸の配列ＱＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号８３）；位置４８８～５２２のアミノ酸の配列ＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号８４）；位置５２３～５４０のアミノ酸の配列ＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号８２）；位置５４５～５６７のアミノ酸の配列ＫＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号８１）；ならびに配列番号１３に対するナンバリングで、位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）を含む。通常、そのようなポリペプチドは、ＡＡＶＣ１１．１２由来のＶＲ－１を有さない（すなわち、ＡＡＶ２ ＶＲ－１を有さない）。これらのポリペプチドは、ＡＡＶ８由来のＶＲ－１を有し得る。例えば、ポリペプチドは、２６２位の後にＮＧの挿入を有し、配列番号１３に対するナンバリングで、残基Ｔ２６３、Ｓ２６４、Ｇ２６５、Ｔ２６８、およびＴ２７２を含み得る。特定の例では、ポリペプチドは、２６２位の後にＮＧの挿入を含み、配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３～２７２のアミノ酸の配列ＴＳＧＧＡＴＮＤＮＴの配列を含む。

【0086】

本明細書に記載のカプシドポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を含む核酸分子も提供される。したがって、例えば、本明細書に記載の核酸分子の中には、本明細書に記載のカプシドポリペプチドのいずれか１つのＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３をコードする核酸分子がある。したがって、核酸分子の非限定的な例としては、配列番号２１～３９および８５～９９に示される核酸分子、それに対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する核酸分子、ならびに配列番号２１～３９および８５～９９のいずれか１つに示される配列を含む核酸分子に対して中度または高度のストリンジェンシーでハイブリダイズする核酸分子が挙げられる。

【0087】

ベクター
本開示はまた、本明細書に記載のカプシドポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター、および本明細書に記載のカプシドポリペプチドを含むベクターを提供する。ベクターとしては、本明細書に記載のカプシドポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸ベクター、および本明細書に記載のカプシドポリペプチドを含むカプシドを有するＡＡＶベクターが挙げられる。

【0088】

核酸ベクター
本開示のベクターとしては、本明細書に記載のカプシドポリペプチドの全てもしくは一部をコードする、例えば、上記にように、配列番号２～２０のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列、または配列番号２～２０のいずれか１つに示される配列、またはそのフラグメント（例えば、ＶＰ２またはＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部）に対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含む核酸ベクターが挙げられる。このベクターは、エピソームベクター（すなわち、宿主細胞のゲノムに組み込まれない）であってもよいし、または宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターであってもよい。カプシドポリペプチドをコードする核酸分子を含む例示的なベクターとしては、限定するものではないが、プラスミド、コスミド、トランスポゾン、および人工染色体が挙げられる。特定の例では、ベクターはプラスミドである。

【0089】

細菌、昆虫、および哺乳動物細胞での使用に適したプラスミドなどのベクターは、広く記載されており、当該技術分野で周知である。当業者は、本開示のベクターが、原核細胞および／または真核細胞におけるベクターの複製、ベクターの選択、ならびに様々な宿主細胞における異種配列の発現に有用な追加の配列およびエレメントも含み得ることを理解するであろう。例えば、本開示のベクターは、原核レプリコン（すなわち、細菌宿主細胞などの原核宿主細胞において染色体外でベクターの自律複製および維持を指向する能力を有する配列）を含んでもよい。このようなレプリコンは当該分野で周知である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ベクターを原核生物および真核生物の両方における複製および組み込みに適したものにするシャトルエレメントを含み得る。さらに、ベクターは、その発現が検出可能なマーカー、例えば、宿主細胞の選択および維持を可能にする薬剤耐性遺伝子を付与する遺伝子も含んでもよい。ベクターはまた、蛍光または他の検出可能なタンパク質をコードする遺伝子などの報告可能なマーカーを有してもよい。核酸ベクターは、以下に記載されるベクターのうちのいずれか１つ以上を含む、他のエレメントも含む可能性が高い。最も典型的には、ベクターは、カプシドタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。

【0090】

本開示の核酸ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＤＮＡのインビトロまたは化学合成、およびＤＮＡ配列決定の標準的な技術を含むがこれらに限定されない公知の技術を使用して構築され得る。本開示のベクターは、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して宿主細胞に導入され得る。したがって、本開示は、本明細書に記載のベクターまたは核酸を含む宿主細胞にも関する。

【0091】

ＡＡＶベクター
本明細書で提供されるのは、ＡＡＶカプシドタンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチド（例えば、配列番号２～２０のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列、または配列番号２～２０のいずれか１つに示される配列もしくはそのフラグメント（例えば、ＶＰ２またはＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部）に対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチド）などの、本明細書に記載のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターである。

【0092】

カプシドタンパク質をベクター化する方法は当該技術分野で周知であり、本開示の目的のために任意の適切な方法を使用してもよい。例えば、ｃａｐ遺伝子を回収し（例えば、ＰＣＲまたはｃａｐの上流および下流を切断する酵素で消化することによって）、ｒｅｐを含むパッケージングコンストラクトにクローニングしてもよい。例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３およびそれらの任意のバリアントに由来するｒｅｐ遺伝子を含む、任意のＡＡＶｒｅｐ遺伝子を使用してもよい。通常、ｃａｐ遺伝子は、ｒｅｐの下流にクローニングされるため、ｒｅｐ ｐ４０プロモーターがｃａｐ発現を駆動し得る。このコンストラクトにはＩＴＲを含まない。次いで、このコンストラクトは、典型的には異種コード配列に隣接するＩＴＲを含む第２のコンストラクトと共にパッケージング細胞系に導入される。ヘルパー機能またはヘルパーウイルスも導入され、ｃａｐ遺伝子から発現されたカプシドタンパク質から生成されたカプシドを含み、かつＩＴＲが隣接する導入遺伝子を含むゲノムをカプシド化する組換えＡＡＶが、パッケージング細胞株の上清から回収される。パッケージング細胞株として、様々なタイプの細胞を使用してもよい。例えば、使用され得るパッケージング細胞株としては、限定するものではないが、例えば米国特許出願公開第号２０１１０２０１０８８号に開示されているように、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＶｅｒｏ細胞が挙げられる。ヘルパー機能は、アデノウイルスヘルパー遺伝子を含む１つ以上のヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルスによって提供され得る。アデノウイルスヘルパー遺伝子の非限定的な例としては、ＡＡＶパッケージングにヘルパー機能を提供し得るＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡが挙げられる。ＡＡＶのヘルパーウイルスは、当該技術分野で公知であり、例えば、アデノウイルス科およびヘルペスウイルス科に由来するウイルスが挙げられる。ＡＡＶのヘルパーウイルスの例としては、限定するものではないが、米国特許出願公開第２０１１０２０１０８８号に記載のＳＡｄＶ－１３ヘルパーウイルスおよびＳＡｄＶ－１３様ヘルパーウイルス、ヘルパーベクターｐＨＥＬＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｍｉｃｓ）が挙げられる。当業者は、ＡＡＶに適切なヘルパー機能を提供し得るＡＡＶの任意のヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドが本明細書で使用され得ることを理解するであろう。

【0093】

場合によっては、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶビリオン産生に必要な成分のいくつかを安定して発現する細胞株を使用して産生される。例えば、本明細書に記載のように同定されたｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子を含む核酸、ならびにネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）を、細胞のゲノムに組み込んでもよい（パッケージング細胞）。次いで、このパッケージング細胞株は、ＡＡＶベクターおよびヘルパープラスミドでトランスフェクトするか、またはＡＡＶベクターでトランスフェクトし、ヘルパーウイルス（例えば、ヘルパー機能を提供するアデノウイルス）で同時感染してもよい。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、組換えＡＡＶの大規模生産に適していることである。別の非限定的な例として、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用して、カプシドポリペプチドをコードする核酸、およびｒｅｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入してもよい。さらに別の非限定的な例として、ＡＡＶベクターはプロデューサー細胞のＤＮＡにも安定に組み込まれ、ヘルパー機能が、野生型アデノウイルスによって提供されて組換えＡＡＶを生成し得る。

【0094】

さらなる例では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質を合成し、インビトロでカプシドをアセンブルしてパッケージングすることによって、合成的に生成される。

【0095】

通常、本開示のＡＡＶベクターは、異種コード配列も含む。異種コード配列は、配列の発現を促進するためにプロモーターに作動可能に連結され得る。異種コード配列は、治療用ペプチドまたはポリペプチドなどのペプチドもしくはポリペプチドをコードしてもよいし、またはアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ）を含む、アンチセンスまたは阻害性のオリゴヌクレオチドなどの機能または活性を有するポリヌクレオチドまたはその転写物自体をコードしてもよい。いくつかの例では、異種コード配列は、動物のゲノムＤＮＡ内の核酸のストレッチと本質的に相同な核酸のストレッチであり、その結果、この異種コード配列が動物の細胞に導入されると、異種コード配列とゲノムＤＮＡとの間の相同組換えが起こり得る。理解されるように、異種コード配列の性質は、本開示にとって必須ではない。特定の実施形態では、異種コード配列を含むベクターは、遺伝子治療に使用される。

【0096】

特定の例では、異種コード配列は、例えば、疾患または障害の治療のためなど、その発現が治療用途であるペプチドまたはポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードする。例えば、治療用ペプチドまたはポリペプチドの発現は、欠陥のあるペプチドまたはポリペプチドの内因性形態の機能を回復または置換するのに役立ち得る（すなわち、遺伝子置換療法）。他の例では、異種配列由来の治療用ペプチドもしくはポリペプチド、またはポリヌクレオチドの発現は、宿主細胞における１つ以上の他のペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドのレベルおよび／または活性を変化させるのに役立つ。したがって、特定の実施形態によれば、本明細書に記載のベクターによって宿主細胞に導入された異種コード配列の発現を使用して、疾患または障害の症状を改善する治療量のペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを提供することができる。他の例では、異種コード配列は、動物のゲノムＤＮＡ内の核酸のストレッチと本質的に相同な核酸のストレッチであり、その結果、この異種配列が動物の細胞に導入されると、異種コード配列とゲノムＤＮＡとの間の相同組換えが発生する場合がある。したがって、本明細書に記載のＡＡＶベクターによる異種配列の宿主細胞への導入は、ゲノムＤＮＡの突然変異を修正するために使用され得、これは次に疾患または障害の症状を改善し得る。

【0097】

非限定的な例において、異種コード配列は、対象、特に対象の肝臓に送達されると、肝臓関連の疾患または状態を処置する発現産物をコードする。例示的な実施形態では、肝臓関連の疾患または状態は、尿素サイクル障害（ＵＣＤ；Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ欠損症（ＮＡＧＳＤ）、カルバミルリン酸シンテターゼ１欠損症（ＣＰＳ１Ｄ）、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣＤ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ欠損症（ＡＳＳＤ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬＤ）、アルギナーゼ１欠損症（ＡＲＧ１Ｄ）、シトリンまたはアスパラギン酸／グルタミン酸キャリア欠損症、および高オルニチン血症－高アンモニア血症－ホモシトルリン尿症症候群（ＨＨＨ症候群）を引き起こすミトコンドリアオルニチントランスポーター１欠損症）、有機酸症（または有機アカデミア、例としては、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、イソ吉草酸血症、およびメープルシロップ尿症）、アミノアシドパシー、グリコーゲン症（Ｉ、ＩＩＩ、およびＩＶ型）、ウィルソン病、進行性家族性肝内胆汁うっ滞、原発性高シュウ酸尿症、補体障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｏｐａｔｈｙ）、凝固障害（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ））、クリグラー・ナジャー症候群、家族性高コレステロール血症、α－１アンチトリプシン欠乏症、ミトコンドリア呼吸鎖肝障害、およびシトリン欠乏症の中から選択される。当業者は、そのような疾患を治療するのに有用な適切な異種コード配列を容易に選択することができるであろう。いくつかの例では、異種コード配列は、表２に示す遺伝子の全てもしくは一部など、疾患に関連する遺伝子の全てもしくは一部を含む。肝臓へのそのような配列の導入は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用する、遺伝子置換または遺伝子編集／修正に使用され得る。特定の例では、異種コード配列は、表２に示される遺伝子などの疾患に関連する遺伝子によってコードされるタンパク質をコードする。

【0098】

【表2】

【0099】

ＡＡＶベクターの異種コード配列は、３’および５’ＡＡＶ ＩＴＲが隣接している。本開示のベクターで使用されるＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって改変され得る。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３を含むいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。そのようなＩＴＲは、当該技術分野で周知である。

【0100】

当業者には理解されるように、ＡＡＶを精製するのに適した任意の方法を、本明細書に記載の実施形態で使用してＡＡＶベクターを精製してもよく、そのような方法は当該技術分野で周知である。例えば、ＡＡＶベクターは、パッケージング細胞および／またはパッケージング細胞の上清から単離および精製してもよい。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＣｓＣｌまたはイオジキサノール勾配遠心分離を使用する分離方法によって精製される。他の実施形態では、ＡＡＶ付着を媒介する人工受容体または受容体様分子が固定化されたマトリックスを含む固体支持体を使用して、米国特許出願公開第２００２０１３６７１０号に記載のようにＡＡＶを精製する。

【0101】

ベクトルの追加のエレメント
本開示のベクターはプロモーターを含んでもよい。ベクターがカプシドポリペプチドをコードする核酸を含む核酸ベクターである場合、プロモーターは、カプシドポリペプチドをコードする核酸の発現を促進し得る。ベクターがＡＡＶベクターである場合、プロモーターは、上記のように、異種コード配列の発現を促進し得る。

【0102】

いくつかの例では、プロモーターは、ｐ５、ｐ１９またはｐ４０プロモーターなどのＡＡＶプロモーターである。他の例では、プロモーターは他の供給源に由来する。構成的プロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（適宜ＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（適宜ＣＭＶエンハンサーを伴う）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給された化合物、温度などの環境要因、または特定の生理学的状態、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態の存在、または細胞の複製のみによって調節され得る。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの非限定的な例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系；エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制系、テトラサイクリン誘導系、ＲＵ４８６誘導系、およびラパマイシン誘導系が挙げられる。この文脈において有用であり得るさらに他のタイプの誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態、または細胞の複製のみによって調節されるものである。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターが使用される。そのようなプロモーターの非限定的な例としては、肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモーター、シナプシン－１（Ｓｙｎ）プロモーター、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、α－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）プロモーター、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、およびＢ型肝炎ウイルスコアプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターの選択は、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0103】

ベクターはまた、転写エンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写および翻訳終結シグナルを含んでもよい。転写終結シグナルの例としては、限定するものではないが、ポリアデニル化シグナル配列、例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）、ウサギベータグロビン（ＲＢＧ）ポリ（Ａ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリ（Ａ）配列、およびその任意のバリアントが挙げられる。いくつかの実施形態では、転写終結領域は、転写後調節エレメントの下流に位置する。いくつかの実施形態では、転写終結領域は、ポリアデニル化シグナル配列である。

【0104】

ベクターは、様々な転写後調節エレメントを含んでもよい。いくつかの実施形態では、転写後調節エレメントは、ウイルスの転写後調節エレメントであってもよい。ウイルス転写後調節エレメントの非限定的な例としては、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＢＶＰＲＥ）、ＲＮＡ輸送エレメント、およびそれらの任意のバリアントが挙げられる。ＲＴＥは、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、例えばレンチウイルスＲＲＥであり得る。非限定的な例は、ウシ免疫不全ウイルスｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）である。いくつかの実施形態では、ＲＴＥは、構成的輸送エレメント（ＣＴＥ）である。ＣＴＥの例としては、限定するものではないが、メイソン・ファイザー・モンキー・ウイルスＣＴＥおよびトリ白血病ウイルスＣＴＥが挙げられる。

【0105】

哺乳動物細胞由来のポリペプチドの分泌を提供するために、シグナルペプチド配列をベクターに含めてもよい。シグナルペプチドの例としては、限定するものではないが、ＨＧＨの内因性シグナルペプチドおよびそのバリアント；Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型インターフェロンのシグナルペプチドならびにそのバリアントを含む、インターフェロンおよびそのバリアントのための内因性シグナルペプチド；ならびに公知のサイトカインおよびそのバリアントの内因性シグナルペプチド、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ＴＧＦ－β１、ＴＮＦ、ＩＬ１－α、およびＩＬ１－βのシグナルペプチド、ならびにそれらのバリアントが挙げられる。典型的には、シグナルペプチドのヌクレオチド配列は、ベクター中の異種配列のすぐ上流に位置する（例えば、目的のタンパク質のコード領域の５’で融合）。

【0106】

さらなる例では、ベクターは、例えば、単一のｍＲＮＡ由来の複数のタンパク質の翻訳を可能にする調節配列を含み得る。そのような調節配列の非限定的な例としては、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）および口蹄疫ウイルス由来の２Ａペプチド部位（Ｆ２Ａ配列）などの２Ａ自己プロセシング配列が挙げられる。

【0107】

宿主細胞
また、本開示の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も本明細書に提供される。場合によっては、宿主細胞を使用して、ポリヌクレオチドまたはベクターを増幅、複製、パッケージング、および／または精製してもよい。他の例では、宿主細胞は、ＡＡＶベクター内にパッケージされた配列のような異種配列を発現するために使用される。例示的な宿主細胞としては、原核細胞および真核細胞が挙げられる。場合によっては、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。本開示のポリヌクレオチド、ベクターまたはｒＡＡＶビリオンの発現、増幅、複製、パッケージングおよび／または精製のために適切な宿主細胞を選択することは、十分に当業者の技術の範囲内である。例示的な哺乳動物宿主細胞としては、限定するものではないが、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｕＨ－７細胞、およびＨｅｐＧ２細胞が挙げられる。特定の例では、宿主細胞は、肝細胞または肝細胞由来の細胞株である。

【0108】

組成物
本開示の核酸分子、ポリペプチドおよび／またはベクターを含む組成物もまた提供される。特定の例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。この組成物は、希釈剤、安定剤、賦形剤、およびアジュバントなどの追加の成分も含んでもよい。

【0109】

担体、希釈剤およびアジュバントとしては、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化物質；低分子量ポリペプチド（例えば、約１０残基未満）；血清ａＡＡＶＣ．ｕｍｉｎ、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／あるいはＴｗｅｅｎ（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。

【0110】

方法
本開示のＡＡＶベクター、およびＡＡＶベクターを含有する組成物は、宿主細胞への異種コード配列の導入のための方法において使用され得る。そのような方法は、宿主細胞をＡＡＶベクターと接触させることを含む。これは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行ってもよい。特定の実施形態では、宿主細胞は、肝細胞（例えば、ヒト肝細胞）である。

【0111】

この方法がエクスビボまたはインビボで実施される場合、典型的には宿主細胞への異種配列の導入は治療目的のためであり、この異種配列の発現は疾患または状態の治療をもたらす。したがって、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、本明細書に記載される異種配列によってコードされるタンパク質、ペプチド、またはポリヌクレオチドによる治療に修正可能な疾患または状態を有する対象など、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に投与され得る。

【0112】

インビボで使用される場合、対象に投与されるＡＡＶベクターの力価は、例えば、特定の組換えウイルス、治療される疾患または障害、投与様式、治療目標、処置される個体、および目標とされている細胞型に応じて変化し、当業者に周知の方法によって決定され得る。正確な投与量は個々に決定されるが、ほとんどの場合、典型的には、本開示の組換えウイルスは、組換えウイルスが、対象の１ｋｇあたり１×１０^１０から１ｋｇあたり１×１０^１４の間のゲノムコピーという用量で対象に投与され得る。他の例では、１×１０^１０未満のゲノムコピーが治療効果に十分であり得る。他の例では、治療効果のために１×１０^１４を超えるゲノムコピーが必要になる場合がある。

【0113】

投与経路は特に限定されない。例えば、治療有効量のＡＡＶベクターは、例えば、筋肉内、膣内、静脈内、腹腔内、皮下、表皮、皮内、直腸、眼内、肺、頭蓋内、骨内、経口、口腔内、または経鼻のルートで対象に投与してもよい。ＡＡＶベクターは、単回投与または複数回投与として、様々な間隔で投与され得る。

【0114】

また、上記および本明細書に記載のＡＡＶベクター、すなわち、本開示のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターを産生する方法も提供される。そのような方法は、本開示のカプシドポリペプチドをコードする核酸分子、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ逆方向末端反復が隣接する異種コード配列、および増殖性ＡＡＶ感染を生成するためのヘルパー機能を含む宿主細胞を、本開示のカプシドポリペプチドを含むＡＡＶベクターのアセンブリを容易にするのに適した条件下で培養することを含み、このカプシドが異種コード配列をカプシド化する。

【0115】

さらなる態様では、提供されるのは、ＡＡＶベクターのインビボヒト肝細胞形質導入効率を増強するための方法である。本明細書に示されるように、いくつかの可変領域、およびカプシド可変領域の組み合わせは、ＡＡＶベクターによるヒト肝細胞の効率的な形質導入に重要である。特に、カプシドポリペプチド中のＡＡＶ７由来のＶＲ－ＶＩＩおよび／またはＶＲ－ＶＩＩＩの全てもしくは一部の存在は、インビボでのヒト肝細胞のＡＡＶベクターによる形質導入の増強をもたらす。ＡＡＶ２由来のＶＲ－１はまた、インビボでヒト肝細胞のＡＡＶベクターによる形質導入を増強し得る。

【0116】

したがって、ＡＡＶベクターのインビボヒト肝細胞形質導入効率を増強する（またはインビボヒト肝細胞形質導入効率が増強されたＡＡＶベクターを産生する）ための方法が本明細書に提供され、この方法は参照カプシドポリペプチドの配列を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３、２６４、２６５、２６８、２７２、５４６、５４７、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５８、５５９、５６１、５６６、５６７、５８０、５８１、５８５、５８６、５９０、５９２、５９３、５９４および５９７のうちの１つ以上で改変し、それによって、ｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ２６３、Ｑ２６４、Ｓ２６５、Ｓ２６８およびＨ２７２；ならびに、ｉｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｔ５４６、Ｇ５４７、Ｔ５４９、Ｎ５５０、Ｋ５５１、Ｔ５５２、Ｔ５５３、Ｌ５５４、Ｅ５５５、Ｎ５５６、Ｌ５５８、Ｍ５５９、Ｎ５６１、Ｒ５６６およびＰ５６７；ならびに／あるいは配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ５８０、Ｓ５８１、Ａ５８５、Ａ５８６、Ａ５９０、Ｔ５９２、Ｑ５９３、Ｖ５９４、およびＮ５９７を含む改変カプシドポリペプチドを産生するステップを含む。追加の改変は、ＶＲ－ＩＶ、ＶＲ－ＶおよびＶＲ－ＶＩなどの１つ以上の他の可変領域で、またはそれに隣接して行ってもよい。例えば、改変は、配列番号１３に対するナンバリングで、位置５３２、５３８および５４０の１つ以上で行ってもよく、この改変されたカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｄ５３２、Ｓ５３８およびＶ５４０を含む。別の例では、改変は、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５１、４５６、４５７、４６０、４６２、４６６、４６９、４７０、４７２および４７３のうちの１つ以上であってもよく、ここで、改変カプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｓ４５１、Ｑ４５６、Ｇ４５７、Ｑ４６０、Ｌ４６２、Ａ４６６、Ａ４６９、Ｎ４７０、Ｓ４７２およびＡ４７３を含む。さらなる例では、改変は、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４９３、４９４、５０５、５０６、５１８および５２２のうちの１つ以上で行ってもよく、この改変されたカプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、アミノ酸残基Ｌ４９３、Ｓ４９４、Ｇ５０５、Ａ５０６、Ｖ５１８およびＶ５２２を含む。

【0117】

ＡＡＶベクターのインビボヒト肝細胞形質導入効率を増強する（または増強されたインビボヒト肝細胞形質導入効率を有するＡＡＶベクターを産生する）ための方法にはまた、配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３～２７２、５４６～５６７、および５８２～５９７のうち１つ以上で参照カプシドポリペプチドの配列を改変し、それによって、以下を含む改変カプシドポリペプチドを産生するステップを含む方法も含む：ｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６３～２７２のアミノ酸の配列ＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号５８）；ならびにｉｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置５４６～５６７のアミノ酸の配列ＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号５９）および／または配列番号１３に対するナンバリングで、位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）の配列。

【0118】

ＡＡＶベクターのインビボヒト肝細胞形質導入効率を増強する（またはインビボヒト肝細胞形質導入効率が増強されたＡＡＶベクターを産生する）ための方法にはまた、配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６１～２７２、５４５～５６７、および５８２～５９７のうちの１つ以上の位置で参照カプシドポリペプチドの配列を改変し、それによって、以下を含む改変カプシドポリペプチドを産生するステップを含む方法が含まれる：ｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置２６１～２７２のアミノ酸の配列ＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ（配列番号８０）；ならびにｉｉ）配列番号１３に対するナンバリングで、位置５４５～５６７のアミノ酸の配列ＫＴＧＡＴＮＫＴＴＬＥＮＶＬＭＴＮＥＥＥＩＲＰ（配列番号８１）および／または配列番号１３に対するナンバリングで、位置５８２～５９７のアミノ酸の配列ＳＳＮＬＱＡＡＮＴＡＡＱＴＱＶＶＮＮ（配列番号６０）の配列。

【0119】

追加の改変は、ＶＲ－ＩＶ、ＶＲ－ＶおよびＶＲ－ＶＩなどの１つ以上の他の可変領域で、またはそれに隣接して行ってもよい。例えば、改変は、配列番号１３に対するナンバリングで、位置５３２～５４０の１つ以上で行ってもよく、ここで、改変されたカプシドポリペプチドは、アミノ酸の配列ＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号６１）を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置５３２～５４０に；配列番号１３に対するナンバリングで、位置５２３～５４０の１つ以上で含み、この改変カプシドポリペプチドは、アミノ酸の配列ＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＲＦＦＰＳＳＧＶ（配列番号８２）を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置５２３～５４０で；配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５１～４７３の１つ以上で含み、ここで改変カプシドポリペプチドは、アミノ酸の配列ＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号６２）を、配列番号１に対するナンバリングで、位置４５１～４７３に、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４５０～４７３の１つ以上で含み、この改変カプシドポリペプチドは、アミノ酸の配列ＱＳＴＧＧＴＱＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＡＮＭＳＡ（配列番号８３）を、配列番号１に対するナンバリングで、位置４５０～４７３に；配列番号１３に対するナンバリングで、位置４９３～５２２の１つ以上で含み、この改変カプシドポリペプチドは、アミノ酸の配列ＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号６３）を、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４９３～５２２に；および／または配列番号１３に対するナンバリングで、位置４８８～５２２のうちの１つ以上で含み、この改変カプシドポリペプチドは、配列番号１３に対するナンバリングで、位置４８８～５２２のアミノ酸の配列ＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＶＮＰＧＶ（配列番号８４）を含む。

【0120】

任意の改変または改変の組み合わせ、例えば、アミノ酸の置き換えまたは置換、アミノ酸欠失および／またはアミノ酸挿入は、参照カプシドポリペプチドと比較して改変カプシドポリペプチドのアミノ酸の配列の変化をもたらすことが理解される。したがって、例えば、改変への言及には、その範囲内に、１つのアミノ酸残基が同じアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換も、アミノ酸欠失がその欠失アミノ酸の挿入も伴う場合は、改変も含まず、その結果、参照カプシドポリペプチド配列と比較して改変カプシドポリペプチドのアミノ酸配列に違いはなく、すなわち、改変カプシドポリペプチドのアミノ酸配列は、参照カプシドポリペプチド配列のアミノ酸配列と同じであってはならない（または異なっていなければならない）。

【0121】

典型的には、この本方法は、インビボでヒト肝細胞を形質導入するための参照カプシドポリペプチドを最初に同定する最初のステップを含む。参照カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２もしくはＡＡＶ１３カプシドポリペプチド、または合成もしくはキメラカプシドポリペプチドなどの任意のＡＡＶポリペプチドであってもよい。例示的な実施形態では、参照ポリペプチドは、配列番号１３に示される配列に対して、少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含む。参照カプシドポリペプチドには、ＶＰ１タンパク質、ＶＰ２タンパク質またはＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含むポリペプチドが含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、参照カプシドポリペプチドは、配列番号１３に示される配列（ＡＡＶＣ１１．１２とも呼ばれる）に対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＶＰ１タンパク質の全てもしくは一部；配列番号１３のアミノ酸１３８～７３５として示されるＶＰ２タンパク質に対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＶＰ２タンパク質の全てもしくは一部；ならびに配列番号１３のアミノ酸２０４～７３５として示されるＶＰ３タンパク質に対して少なくともまたは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＶＰ３タンパク質の全てもしくは一部を含む。

【0122】

参照カプシドポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列を改変して、改変カプシドポリペプチドまたはポリヌクレオチドを生成するための方法は当該技術分野で周知であり、本開示の方法を実施するために任意のそのような方法を利用してもよい。例えば、改変カプシドポリヌクレオチドを生成するための参照カプシドポリヌクレオチドの配列の改変は、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）および／またはインビトロで（部分的または全体的に）実施される組換えおよび合成法を含む、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して実施してもよい。特定の例で、配列の改変はインシリコで行われ、続いて、改変された配列を有する改変カプシドポリヌクレオチドのデノボ合成が行われる（例えば、重複オリゴヌクレオチドの化学合成、その後の遺伝子アセンブリを含むものなどの遺伝子合成法による）。

【0123】

改変カプシドポリヌクレオチドは、その後の発現、複製、増幅および／または操作のために、プラスミドなどの核酸ベクターに含まれ得る。細菌、昆虫、および哺乳動物細胞での使用に適したベクターは、広く記載されており、当該技術分野で周知である。当業者は、このベクターが、原核細胞および／または真核細胞におけるベクターの複製、ベクターの選択、および様々な宿主細胞における異種配列の発現に有用な追加の配列およびエレメントも含み得ることを理解するであろう。例えば、ベクターは、細菌宿主細胞などの原核宿主細胞において染色体外で自律複製およびベクターの維持を指示する能力を有する配列である原核レプリコンを含み得る。そのようなレプリコンは、当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ベクターを原核生物および真核生物の両方における複製および組み込みに適したものにするシャトルエレメントを含んでもよい。さらに、ベクターはまた、その発現が、宿主細胞の選択および維持を可能にする薬剤耐性遺伝子などの検出可能なマーカーを付与する遺伝子を含み得る。ベクターはまた、蛍光または他の検出可能なタンパク質をコードする遺伝子などの報告可能なマーカーを有し得る。核酸ベクターは、以下に記載するエレメントのいずれか１つ以上を含む、他のエレメントも含む可能性が高い。最も典型的には、ベクターは、カプシドタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。

【0124】

核酸ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＤＮＡのインビトロまたは化学合成、およびＤＮＡ配列決定の標準技術を含むがこれらに限定されない公知の技術を使用して構築してもよい。改変カプシドポリヌクレオチドを含むベクターは、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して宿主細胞に導入してもよい。

【0125】

改変後、改変カプシドは次にベクター化される。カプシドポリペプチドをベクター化する方法は当該技術分野で周知であり、非限定的な例は上記に記載されている。

【0126】

これらの方法によって産生されるＡＡＶベクターは、典型的には、参照カプシドポリペプチドを含むカプシドを有する参照ＡＡＶベクターと比較して増強されたインビボ形質導入効率を有する。この形質導入効率は、少なくとももしくは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上向上し得、例えば、ＡＡＶベクターの形質導入効率は、インビボでの細胞の形質導入において少なくとももしくは約２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１２×、１３×、１４×、１５×、１６×、１７×、１８×、１９×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×またはそれ以上効率的であり得る。

【0127】

したがって、本開示の方法によって産生されるＡＡＶベクターも提供される。

【0128】

本発明が容易に理解され、実際に効果を発揮できるようにするために、特定の好ましい実施形態を、以下の非限定的な実施例によって説明する。

【0129】

本明細書における先行刊行物（またはそれから派生した情報）、または知られている任意の事項への言及は、その先行刊行物（またはそこから派生した情報）または既知の事項は、本明細書が関係する努力傾注分野における共通の一般知識の一部を形成するという示唆の確認としても承認としてもなんらの形態としても解釈されるべきではない。

【0130】

実施例
実施例１
材料と方法
シャッフルされたＡＡＶカプシドプラスミドライブラリー生成
親ＡＡＶｃａｐ遺伝子（ＡＡＶ１から１２、ＡＡＶ－ｍＡＡＶ１（ＷＯ２０１９２２７１６８）およびＡＡＶ－ＥＶＥ１（ＷＯ２０１７１９２６９９））を、最適なギブソンアセンブリ（ＧＡ）のために、トリメトプリム耐性およびカプシドに隣接するランダム化された末端を保有するように改変されている、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｅｔｅｍ（カタログ［Ｃａｔ］番号Ａ１３６０；Ｐｒｏｍｅｇａ）に基づくコンストラクトであるプラスミドｐ－ＲｅｓｃｕｅＶｅｃｔｏｒ（ｐＲＶ１－１２）にクローニングした。個々のクローンはサンガー配列決定された（Ｇａｒｖａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）。カプシド遺伝子（血清型１～１２）を、ＳｗａＩおよびＮｓｉＩ（ＮＥＢ）を使用して切り出し、１：１のモル比で混合し、１：１０に前希釈したＤＮａｓｅＩ（カタログ番号Ｍ０３０Ｓ；ＮＥＢ）で２～５分間消化した。フラグメントのプールを、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで分離し、および２００～１，０００ｂｐの範囲のフラグメントは、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（カタログ番号Ｄ４００１Ｔ；Ｚｙｍｏｇｅｎ）を使用して回収した。各プライマーレスＰＣＲ再アセンブル反応では、５００ｎｇのゲル抽出フラグメントを使用して、完全に再アセンブルされたカプシドは、キャップ遺伝子に結合し、ｐＲＶプラスミドにオーバーラップする末端を持っているプライマー（シャッフリング＿レスキュー－Ｆ／Ｒ、表３）を使用した２番目のＰＣＲで増幅された。ＧＡ反応は、等量の２ＧＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号Ｅ２６１１Ｌ；ＮＥＢ）を１ｐｍｏＬのＰＣＲ増幅およびＤｐｎＩ処理ｐＲＶ（ＢＢ＿ＧＡＲ－Ｆ／Ｒ、表３）および１ｐｍｏｌの回収したシャッフルカプシドと混合することによって、５０℃で３０分間行った。ＤＮＡをエタノール沈殿させ、ＳＳ３２０ エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（カタログ番号６０５１２－２；Ｌｕｃｉｇｅｎ）にエレクトロポレーションした。形質転換体の総数は、エレクトロポレーションされた細菌の５つの１０倍連続希釈液を調製してプレーティングすることによって計算した。形質転換体のプールを、トリメトプリム（１０ｍｇ／ｍＬ）を補充した２５０ｍＬのＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ培地で一晩増殖させた。全ｐＲＶライブラリープラスミドをＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（カタログ番号１２３６２；ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。次に、ｐＲＶベースのライブラリーをＳｗａＩおよびＮｓｉＩで一晩消化し、１．４μｇのインサートをＴ４ ＤＮＡリガーゼ（カタログ番号Ｍ０２０２；ＮＥＢ）を使用して１６℃で１６時間、ＩＴＲ－２およびｒｅｐ２を含む１μｇの複製可能なＡＡＶ２－ベースのプラスミドプラットフォーム（ｐ－Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ［ｐ－ＲＣ］）、ならびに１ｋｂのランダム化スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）［ＩＴＲ２－ｒｅｐ２－（ＳｗａＩ）－スタッファー－（ＮｓｉＩ）ＩＴＲ２］に隣接する独自のＳｗａＩおよびＮｓｉＩ部位にライゲーションした。ライゲーション反応物は、エタノール沈殿を使用して濃縮し、ＳＳ３２０ エレクトロコンピテント細菌にエレクトロポレーションし、上記のように増殖させた。全ｐＲＣライブラリープラスミドを、ＥｎｄｏＦｒｅｅＭａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（カタログ番号１２３６２；ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。

【0131】

ＡＡＶライブラリーのインビボ選択
ヒト化ＦＲＧ（ｈＦＲＧ）マウスに、１×１０^１１ｖｇの複製コンピテントＲＣ－ＡＡＶＣ１１をｉ．ｖ．尾静脈投与によって注入した。５×１０^９ＰＦＵの野生型ヒトアデノウイルス－５（ＡＴＣＣ、ＶＲ－５、ロット番号７００１０１５３）を、２４時間後に腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。ｈＡｄ５投与の７２時間後に異種移植片肝臓を採取し、ホモジナイズし、液体窒素で瞬間凍結した。ＡＡＶ粒子を抽出するために、約０．３ｇの肝臓の断片を、２×ｗ／ｖのＰＢＳの存在下で３回の凍結融解サイクルおよび機械的ホモジナイゼーションに供した。その後、サンプルを卓上遠心機で最高速度、４℃で３０分間遠心分離し、ウイルスを含む上清を細胞破片から分離した。ｗｔＡｄ５を不活性化するために、ウイルスを含む上清を６５℃で３０分間インキュベートした。ｑＰＣＲによる力価測定の後、ウイルスを含む上清２００μＬを、選択の後続のラウンドのためにｈＦＲＧマウスにｉ．ｐ．（腹腔内）投与した。この選択には、全部で５回の選択を行った。

【0132】

ＡＡＶキャップ候補のベクター化
第５ラウンドの選択の後、ＡＡＶカプシド配列を、カプシド領域に隣接するプライマー（Ｃａｐレスキュー－Ｆ／Ｒ、表３）を使用するＰＣＲによって上清から回収した。ＰＣＲ増幅されたｃａｐ遺伝子は、次のプライマー（ｐヘルパー－Ｆ／Ｒ）および処理したＤｐｎＩを使用したＰＣＲ増幅によって、開かれたレシピエントｐヘルパーパッケージングプラスミドのｒｅｐ２遺伝子のインフレーム下流にＧＡによってクローニングした。次に、全長キャップ候補を含む個々のクローンをサンガー配列決定した。

【0133】

ＡＡＶベクターのパッケージングおよびウイルス産生
ＡＡＶコンストラクトは、以前に記載されたようにＨＥＫ２９３細胞およびヘルパーウイルスを含まない系を使用してＡＡＶカプシドにパッケージングした（Xiao et al, 1998 J Virol, 1998. 72(3): 2224-32）。ゲノムは、パッケージングプラスミドコンストラクトｐＡＡＶ２、ｐＡＡＶ８、ｐＬＫ０３およびｐＡＡＶＮＰ５９をそれぞれ使用して、カプシド血清型ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＬＫ０３およびＮＰ５９にパッケージングした。複製コンピテントな（ＲＣ）ライブラリーＡＡＶＣ１１は、全長ＡＡＶゲノム（ＩＴＲ２－ｒｅｐ２－ｃａｐ－ＩＴＲ２）およびｐＡｄ５を含む対応するプラスミドをＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションすることによってパッケージングした。

【0134】

全てのベクター／ウイルスは、以前に記載されているように、イオジキサノール勾配超遠心分離を使用して精製した［Khan et al. 2011. Nat Protoc, 2011. 6(4): p.482-501］。ＡＡＶの調製は、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用してｅＧＦＰ特異的ｑＰＣＲプライマーＧＦＰ－ｑＰＣＲ－Ｆｏｒ／ＲｅｖまたはＡＡＶ２－ｒｅｐ－特異的ｑＰＣＲプライマーＲｅｐ－ｑＰＣＲ－Ｆｏｒ／Ｒｅｖを用いて滴定した（表３）。カプシド候補のインビボ試験（実施例２）では、ｎ＝４の独立したバーコード付き導入遺伝子を、２種の異なる濃度を使用してカプシドごとにパッケージングした（高用量でｎ＝２バーコード付き導入遺伝子：１調製物あたり１０μｇ／導入遺伝子、および低用量ではｎ＝２バーコード付き導入遺伝子：１調製物あたり１μｇ／導入遺伝子）。２種の異なる集団の存在は、注入前の混合物の次世代シーケンスによって確認した。さらに比較するために、ｎ＝５のバーコード付き導入遺伝子を、バーコードあたり１調製あたり２、４、８、１２、および１６μｇで同時トランスフェクトすることにより、漸増濃度でパッケージングした。ベクターミックスのＮＧＳ分析により、カプシドあたり５つのバーコード化された集団の存在を確認した。

【0135】

マウス研究
全ての動物管理および実験手順は、合同小児医学研究所（ＣＭＲＩ）および小児病院のウエストミード動物管理および倫理委員会によって承認された。ＣＭＲＩの確立されたＦａｈ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｉｌ２ｒｇ^－／－（ＦＲＧ）マウスコロニーを使用して、レシピエント動物を繁殖させた。ＦＲＧマウスは、２－（２－ニトロ－４－トリフルオロ－メチルＡＡＶＣ．エンゾイル）－１，３－シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を飲料水に補った、個別に換気されたケージに収容した。以前に記載されたとおり［Azuma et al., 2007, Nat Biotechnol. 25(8): 903-10］、６～８週齢のＦＲＧマウスにヒト肝細胞を移植した（Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．、バーゼル、スイス）。ベクターによる形質導入の１週間前に、ヒト化ＦＲＧ（ｈＦＲＧ）マウスを１０％ＮＴＢＣ上に置き、採取まで１０％ＮＴＢＣ上で維持した。

【0136】

注入用のベクターは、生理食塩水を使用して最終容量１５０μＬに調製した。マウスを無作為に選択し、ＮＧＳ比較用には１×１０^１０ｖｇ／ベクターの用量で、および免疫組織化学用には２×１０^１１ｖｇ／ベクターの用量で、示されたベクターを静脈内注入（外側尾静脈）により形質導入した。インビボＩＶＩｇスクリーニングでは、ベクター注入の２４時間前に、５ｍｇまたは２０ｍｇのＩＶＩｇ（Ｉｎｔｒａｇａｍ １０、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ）を、ｈＦＲＧに注入（ｉ．ｖ．）した。マウスは、免疫組織化学のための形質導入の２週間後、およびバーコード次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析のための形質導入の１週間後に、ＣＯ_２吸入によって安楽死させた。フローサイトメトリー分析用の肝細胞は、肝臓のコラゲナーゼ灌流によって得た（下記参照）。

【0137】

コラゲナーゼ灌流によるヒト肝細胞の分離
マウス肝臓を灌流し、単細胞懸濁液を得るために、下大静脈（ＩＶＣ）にカニューレを挿入し、浸透圧ミニポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ Ｍｉｎｉｐｕｌｓ ３）を用いて溶液を次の順序でポンピングした：２５ｍＬのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（－／－）（カタログ番号Ｈ９３９４；Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを補充した２５ｍＬのＨＢＳＳ（－／－）、２５ｍＬのＨＢＳＳ（－／－）、および２５ｍＬのＨＢＳＳ（－／－）で補充が５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％のコラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ）および０．０１（ｗｔ／ｖｏｌ）％のＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ）。

【0138】

灌流後、肝臓を注意深く取り出し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した２５ｍｌのＤｕＡＡＶＣ．ｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含むペトリ皿に入れた。メスの刃の鈍端を使用して肝被膜を破壊し、細胞を培地に放出した。回収後、細胞を５０×ｇで３分間、４℃でスピンダウンした。そのペレットを、２１ｍＬのＤＭＥＭに再懸濁し、１００μｍのナイロンセルストレーナーに通した。Ｉｓｏｔｏｎｉｃ Ｐｅｒｃｏｌｌ（９ｍＬ）（Ｐｅｒｃｏｌｌ ９部を含む１部の１０×ＰＢＳ（－／－）；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を細胞懸濁液に加えて、生細胞と死細胞を分離した。生細胞を、６５０×ｇ、４℃で１０分間ペレット化し、そのペレットをＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（－／－））に再懸濁した。マウス肝細胞とヒト肝細胞との間を区別するために、細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ヒトＨＬＡ－ＡＢＣ（クローンＷ６／３２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２－９９８３－４２；１：２０）、ビオチン結合抗マウス－Ｈ２Ｋｂ（クローンＡＦ６－８８．５、ＢＤＰｈａｒｍｉｇｅｎ ５５３５６８；１：１００）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ストレプトアビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １７－４３１７－８２；１：５００）で標識した。ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ セルソーターを使用して、ＧＦＰ陽性標識サンプルを最低９５％の純度で選別した。ｐＬＳＰ１－ＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ＢＧＨｐＡ ＡＡＶコンストラクトの肝細胞限定発現を考慮して、ＧＦＰ陽性集団の選別を含めて、非実質細胞中のマウス肝細胞を濃縮した。フローサイトメトリーは、オーストラリアのニューサウスウェールズ州、ウェストミードにあるウエストミード医学研究所のフローサイトメトリー施設で実施した。ＦｌｏｗＪｏ ７．６．１（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用してデータを分析した。

【0139】

ヒトＡＡＡＶＣ．ｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ
キメラマウスにおけるヒト細胞生着のレベルは、以前に報告されたように［Azuma et al., 2007, Nat Biotechnol. 25(8): 903-10］ヒトＡＡＡＶＣ．ｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｙｌ，カタログ番号Ｅ８０－１２９）を用いて、末梢血上でヒトａＡＡＶＣ．ｕｍｉｎの存在を測定することによって評価した。

【0140】

アデノ随伴ウイルス導入遺伝子コンストラクト
ＡＡＶ導入遺伝子コンストラクトは、標準的な分子生物学的技術を使用してクローニングした。この研究で使用された全てのベクターには、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列が含まれている。ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーターの１つのコピーおよびＡＰＯＥエンハンサーエレメントの２種のコピーを含む異種プロモーターの転写制御下でｅＧＦＰをコードするＡＡＶコンストラクトｐＬＳＰ１－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ＢＧＨｐＡは、以前に報告されている［Dane et al., 2009, Mol Ther, 2009. 17(9): 1548-54］。ｐＬＳＰ１－ｅＧＦＰ－ＢＣ－ＷＰＲＥ－ＢＧＨｐＡコンストラクトの８４（ｎ＝８４）バージョンは、ｅＧＦＰの下流にｎ＝８４の固有の６ヌクレオチド長のバーコード（ＢＣ）をクローニングすることによって生成した。

【0141】

ＤＮＡおよびＲＮＡの分離
選別された細胞からＤＮＡを抽出するために、細胞を２００μＬの溶解緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．５（Ａｓｔｒａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＢｉｏＳＤ８１４１－４５０ＭＬ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼ Ｋ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含む２００ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））に再懸濁した。サンプルを５６℃で一晩インキュベートした。標準フェノール：クロロホルムプロトコールを使用して、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用し、続いてＤＮＡエタノール沈殿を用いてＤＮＡを抽出した。

【0142】

選別された細胞由来のＲＮＡは、Ｄｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌキット（Ｚｙｍｏｇｅｎカタログ番号Ｒ２０６２）を使用して抽出し、ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＡＭ２２３８）で処理した。製造元の説明書（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１８０９１０５０）に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを使用してｃＤＮＡを合成した。

【0143】

細胞培養、ベクター形質導入およびヘパリン競合アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＴＣＣによって検証して、提供した。ＨｕＨ－７細胞は、Ｊｅｒｏｍｅ Ｌａｕｒｅｎｃｅ博士（シドニー大学）から提供された。全ての細胞は、１０％ ＦＢＳ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｆ９４２３－５００ｍＬ、ロット番号１６Ｋ５９８）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｐ４４５８）を補充したＤｕＡＡＶＣ．ｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ、１１９６５－０９２）で培養し、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｇｉｂｃｏ、１２６０４－２１）を使用して継代した。ＨｕＨ－７培養では、培地に非必須アミノ酸も補充した（Ｇｉｂｃｏ、１１１４０－０５０）。全ての細胞を、マイコプラズマについて試験し、マイコプラズマフリーであった。形質導入研究のために、細胞を、完全ＤＭＥＭ中の２４ウェルプレートに１ウェルあたり２×１０^５細胞で播種し、組織培養インキュベーターで３７℃／５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。１６時間後、ベクターストックを、１ｍｌの完全ＤＭＥＭで希釈し、細胞に添加した（細胞あたりの示されたベクターゲノムコピー（ｖｇｃ／細胞）で）。指示された場合、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）（Ｉｎｔｒａｇａｍ １０、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ）の２倍希釈を、細胞形質導入の前に３７℃で１時間、ベクターと混合した。

【0144】

７２時間のインキュベーション後、細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して採取し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析器を使用してＧＦＰについて分析した。ＦｌｏｗＪｏ ７．６．１を使用してデータを分析した。

【0145】

バーコード増幅、次世代シーケンシングおよび分布分析
ＢＣ＿ＦおよびＢＣ＿Ｒプライマー（表３）を使用して、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ポリメラーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を用いて、６量体バーコードを取り囲む１５０塩基対領域を増幅した。次世代シーケンスライブラリーの準備および２×１５０ペアエンド（ＰＥ）構成を使用した配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置を使用してＧｅｎｅｗｉｚ（蘇州、中国）によって実行した。Snakemake(5.6)(Koster et al. 2012 Bioinformatics 28:2520-2522)で、リードを処理してバーコードをカウントするワークフローを作成した。ペアになったリードは、ＢＢＭｅｒｇｅを使用してマージして、ＢＢＴｏｏｌｓ ３８．６８由来の２ 回目のＢＢＤｕｋのパスで予想される長さのリードに対してフィルタリングされた。マージされ、フィルタリングされたｆａｓｔｑ ファイルを、ＡＡＶバリアントに対応するバーコードを識別するＰｅｒｌ（５．２６）スクリプトに渡した。

【0146】

マウス肝臓の免疫組織化学分析
マウス肝臓を、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、Ｏ．Ｃ．Ｔ（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ；Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ、カリフォルニア州トーランス）で凍結する前に１０～３０％（ｗ／ｖ）スクロースで凍結保護した。凍結肝臓切片（５μｍ）を、－２０℃のメタノール、次に室温の０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理し、次いで、抗ヒトＧＡＰＤＨ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ２１５２２７、クローンＡＦ６７４）、およびＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄ１３０６）と０．０８ｎｇ／ｍＬで反応させた。免疫標識後、ＺＥＮ ２ソフトウェアを使用してＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ．Ｍ１で画像をキャプチャして分析した。１視野あたりの形質導入されたヒト肝細胞の割合は、全ヒト ＧＡＰＤＨ陽性細胞およびｅＧＦＰ／ヒト ＧＡＰＤＨ二重陽性細胞をカウントすることによって決定した。

【0147】

サンガーシーケンシング
特定された場合、クローンは、Ｇａｒｖａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｄａｒｌｉｎｇｈｕｒｓｔ、ＮＳＷ、オーストラリア）のＧａｒｖａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ施設で、外部＿Ｓｅｑ＿Ｆ／Ｒプライマーを用いてサンガー配列決定した（表３）。

【0148】

１細胞あたりのベクターＤＮＡコピー数
ベクターのコピー数は、ＱＸ２００ ｄｄＰＣＲ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１８６４０３４）を用いたＤｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ（ｄｄ）ＰＣＲ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＵＳ）を用いて、プライマーＧＦＰ－ｑＰＣＲ－Ｆｏｒ／Ｒｅｖを用いて、製造業者の指示に従って測定した。ベクターゲノムは、プライマーヒト＿ＡＡＡＶＣ．＿Ｆ／Ｒ＿ｄｄＰＣＲを使用して、ヒトａＡＡＶＣ．ｕｍｉｎコピー数に対して正規化した。

【0149】

【表3】

【0150】

実施例２
新規カプシドの生成および評価
実施例１に記載のように、シャッフルされたＤＮＡライブラリーを生成した。ライブラリーを用いて産生された複製コンピテントなウイルスを産生し、ｈＦＲＧマウスに注入し、上記のように５ラウンドの選択を行って、１６個のＡＡＶカプシドポリペプチド：ＡＡＶＣ１１．０１（配列番号２）、ＡＡＶＣ１１．０２（配列番号３）、ＡＡＶＣ１１．０３（配列番号４）、ＡＡＶＣ１１．０４（配列番号５）、ＡＡＶＣ１１．０５（配列番号：６）、ＡＡＶＣ１１．０６（配列番号７）、ＡＡＶＣ１１．０７（配列番号８）、ＡＡＶＣ１１．８（配列番号９）、ＡＡＶＣ１１．０９（配列番号１０）、ＡＡＶＣ１１．１０（配列番号１１）、ＡＡＶＣ１１．１１（配列番号１２）、ＡＡＶＣ１１．１２（配列番号１３）、ＡＡＶＣ１１．１３（配列番号１４）、ＡＡＶＣ１１．１４（配列番号１５）、ＡＡＶＣ１１．１５（配列番号１６）、およびＡＡＶＣ１１．１６（配列番号１７）を同定した（表４）。

【0151】

４つのバーコード付きＡＡＶ導入遺伝子（肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）－ＧＦＰ－バーコード－ＷＰＲＥ－ＢＧＨｐＡ）を各カプシド（ＡＡＶＣ１１．０１～ＡＡＶＣ１１．１６カプシド、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＬＫ０３およびＮＰ５９）にパッケージングして、ベクターを産生した。ＡＡＶＣ１１．０３、ＡＡＶＣ１１．１０、およびＡＡＶＣ１１．１６ベクター由来の収量は、ＡＡＶ２よりも低かったので、これらはさらなる試験から除外した。残りのベクターは、機能の比較のためにｈＦＲＧマウスに同時注入した（１×１０^１０ｖｇ／カプシド；合計１．８×１０^１１ｖｇ／カプシド）。注入の１週間後、マウス由来のキメラ肝臓を灌流し、ヒトおよびマウスの肝細胞を単一細胞選別した。マウスおよびヒトの肝細胞集団からＤＮＡおよびＲＮＡを回収し、バーコード付き導入遺伝子のＮＧＳを、ＤＮＡおよびＲＮＡ（ｃＤＮＡ）に対して実行した。

【0152】

図２に示すように、ＡＡＶＣ１１．０１、ＡＡＶＣ１１．０４、ＡＡＶＣ１１．０５、ＡＡＶＣ１１．０６、ＡＡＶＣ１１．０７、ＡＡＶＣ１１．０９、ＡＡＶＣ１１．１１、ＡＡＶＣ１１．１２、ＡＡＶＣ１１．１３およびＡＡＶＣ１１．１５を含む新規ベクターの大部分は、いずれもヒト肝細胞への侵入および導入遺伝子の発現に効果的であり、これらのベクターをさらなる分析のために選択した。

【0153】

ＡＡＶＣ１１．０１、ＡＡＶＣ１１．０４、ＡＡＶＣ１１．０５、ＡＡＶＣ１１．０６、ＡＡＶＣ１１．０７、ＡＡＶＣ１１．０９、ＡＡＶＣ１１．１１、ＡＡＶＣ１１．１２、ＡＡＶＣ１１．１３およびＡＡＶＣ１１．１５、ならびにＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＬＫ０３およびＮＰ５９は、ＤＮＡからＲＮＡへの変換の比率を調べる目的で、バーコード濃度を上げて５×バーコード化トランスジーン／カプシドで再パッケージングした。ＡＡＶ－ＤＪベクターも力価対照として含まれていた。各カプシドについて、５×１５ｃｍ ＨＥＫ２９３Ｔプレート（約２０Ｍ 細胞－１５ｍＬ培地）を個別にトランスフェクトし、処理し、滴定した。

【0154】

次いで、ベクター（ＡＡＶ－ＤＪを除く）を、等比（１×１０^１０ｖｇ／カプシド）で混合し、単一のｈＦＲＧマウスに注入した。ヒトおよびマウスの肝細胞を単離し、１週間後に選別した。ＤＮＡおよびＲＮＡを抽出し、ＤＮＡおよびｃＤＮＡに対してＮＧＳを実行した。注入前の混合物のＮＧＳも検証のために実行し、肝細胞由来のＤＮＡおよびＲＮＡ（ｃＤＮＡ）のリードは、注入前のリードに対して正規化した。この正規化は、「ヒト侵入指数（Ｈｕｍａｎ Ｅｎｔｒｙ Ｉｎｄｅｘ）」（ＨＥＩ）として表され、これは、決定された実験での各カプシドの定数であり、実験に含まれる他のカプシドとの関連で、特定のカプシドがヒト肝細胞を物理的に形質導入する際にどれだけ効率的であるかを表す。初期のバーコード濃度に関係なく、各カプシドのＨＥＩは一定のままであることが観察された（データは示さず）。

【0155】

次いで、ｃＤＮＡリードをＤＮＡリードに対して正規化した。この正規化は、「ヒト発現指数」（ＨＥＸＩ）として表され、これは、決定された実験での各カプシドの定数であり、特定のカプシドがヒト肝細胞を機能的に変換する、すなわちＤＮＡリードをＲＮＡリードに変換する際にどれほど効率的であるかを示す。一部のＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶ２）は、肝細胞への侵入は比較的効率的であるが、機能的伝達（すなわち、導入遺伝子の発現）は比較的不十分であるため、これは重要な特性である。図３は、各ベクターのＨＥＸＩを示している。

【0156】

ＨＥＩおよびＨＥＸＩを正規化割合リードに変換して、試験したカプシドの全体的な機能的形質導入力を分析した。このデータを図４Ａおよび図４Ｂに示す。

【0157】

ＤＮＡからＲＮＡへの変換の速度は、各特定のＨＥＸＩ（ＲＮＡ／ＤＮＡ）に対応する勾配を有する線形傾向に従うことが観察された。正規化されていないＲＮＡリードに対して、正規化されていないＤＮＡリードをプロットし、このｘ軸の拡張は、カプシドがヒトの侵入でどれほど効率的であるかの推定値を示し、この勾配は、ＤＮＡからＲＮＡへの変換のおおよその比率を示す。このような分析を行うと、ＡＡＶ２はヒトの侵入ではＡＡＶ８よりも相対的に優れていることが明らかになるが、ＡＡＶ８は発現（機能的形質導入）ではＡＡＶ２よりも相対的に優れている（データ示さず）。この分析は、ＮＰ５９およびＡＡＶＣ１１．０４、ＡＡＶＣ１１．０６、ＡＡＶＣ１１．１１、ＡＡＶＣ１１．１２およびＡＡＶＣ１１．１３を用いて行われ、ＡＡＶＣ１１．０４、ＡＡＶＣ１１．０６、ＡＡＶＣ１１．１１、ＡＡＶＣ１１．１２およびＡＡＶＣ１１．１３のそれぞれが、以前に説明された非常に効率的なカプシドであるＮＰ５９に匹敵することを実証した（Paulk et al., 2018, Mol Ther 26:289-303）。

【0158】

実施例３
ＩＶＩｇ中和耐性
最も機能的なＡＡＶＣ１１バリアントを特定したので、プールされたヒト免疫グロブリンの存在下でのヒト肝細胞におけるそれらの相対的なインビボ性能を調査した。そうするために、最近報告された方法（Cabanes-Creus et al. 2020, Mol Ther Methods Clin Dev, 17:1139-1154）に従って、５つのバーコード化されたＡＡＶ－ＬＳＰ１－ｅＧＦＰカセットを、選択されたＡＡＶバリアントカプシドに漸増濃度でパッケージングした。ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－ＬＫ０３、およびＡＡＶ－ＮＰ５９を、対照として含んだ。３匹のｈＦＲＧ動物を、ＡＡＶ投与（１×１０^１０ｖｇｓ／カプシド）の２４時間前に、プールされたヒトＩｇＧの漸増用量の静脈内投与により受動免疫した。ＩＶＩｇを投与されていない対照ｈＦＲＧ動物も含まれていた（図３に示す研究に使用したのと同じ動物）。１週間後、ヒト肝細胞を選別し、二倍体ゲノムあたりのベクターコピー数を決定した。１細胞あたりのベクターゲノムのＩＶＩｇ用量依存的な減少が観察され、無ＩＶＩｇ対照（ｈＦＲＧ＃１＝３２１．２５ ｖｃ／ｄｃ）と、２０ｍｇのヒト免疫グロブリン（ｈＦＲＧ＃４＝０．６３ｖｃ／ｄｃ）とを事前に注入したｈＦＲＧマウスの間に＞５００倍の差が生じた。１ｍｇ（ｈＦＲＧ＃２）または５ｍｇ（ｈＦＲＧ＃３）のヒト免疫グロブリンを事前に注入したｈＦＲＧマウスも、ベクターゲノムの減少を示した（ｈＦＲＧ＃２＝８１．１６ｖｃ／ｄｃ；ｈＦＲＧ＃３＝１０．６２ｖｃ／ｄｃ）。

【0159】

次いで、ｈＦＲＧ＃１（無ＩＶＩｇ対照）から採取したヒト肝細胞における個々のＡＡＶバリアントの相対的性能を分析した。図４に示すように、ＡＡＶＣ１１．０９を除く全てのＡＡＶバリアントは、ＤＮＡ（細胞侵入）およびＲＮＡ／ｃＤＮＡ（導入遺伝子発現）レベルで測定されたベンチマークＡＡＶ－ＮＰ５９と比較して、高い効率で肝細胞を形質導入した。ＤＮＡリードの割合は最終的に、各ＡＡＶバリアントの１細胞あたりの最終的なベクターコピー数への寄与を示すので、各カプシドのＩＶＩｇ中和効果を経験的に推定することが可能である（図４Ｃ）。１カプシドあたりのベクターゲノムコピーの減少を計算し、ＩＶＩｇと無ＩＶＩｇ対照との間の商の対数として表した（すなわち、－１の値は、ベクターゲノム／カプシドの１０倍の減少を示す、図４Ｃ）。ＡＡＶ８は、ヒトＩＶＩｇによる中和に対して最も耐性があることがわかった。興味深いことに、以前の報告［Lisowski et al. 2014, Nature, 506(7488):382-6; Cabanes-Creus et al. 2020, Mol Ther Methods Clin Dev, 17:1139-1154］とは対照的に、生物工学によるＡＡＶ－ＬＫ０３およびＡＡＶ－ＮＰ５９（それぞれＡＡＶ３ｂおよびＡＡＶ２様）も、このインビボモデルで試験したＩＶＩｇ濃度で強力に中和された。全てのＡＡＶＣ１１バリアントは、試験した全てのＩＶＩｇ用量で、ＡＡＶ８とＡＡＶ－ＮＰ５９との間の中間の耐性を示した。

【0160】

最終検証として、ＡＡＶ－ＮＰ５９を対照（２×１０^１１ｖｇｓ／ｈＦＲＧ）として使用して、上位３つの実行者（ＡＡＶＣ１１．０６、ＡＡＶＣ１１．１１、およびＡＡＶＣ１１．１２）を個々のヒト化ＦＲＧマウスに注入した。図４Ｄに示すように、ＡＡＶＣ１１．１２は、ＡＡＶ－ＮＰ５９対照よりも大幅に機能的であることがわかった。これらの結果に基づいて、ＡＡＶＣ１１．１２をさらに評価した。前臨床モデルでベクター機能を研究する能力は、その臨床開発に大きな影響を与える可能性があるので、ｈＦＲＧ研究と同じ用量（２×１０^１１ベクターゲノム／マウス）を使用して、非生着ＦＲＧでのＡＡＶＣ１１．１２の性能を評価した。ＡＡＶＣ１１．１２がマウス肝細胞を機能的に形質導入できることが観察されたが、効率はヒト肝細胞よりも実質的に低く（データは示さず）、これは図２に示され、実施例４に記載された観察と一致する。

【0161】

実施例４
免疫組織化学分析
ＡＡＶＣ１１．１２およびＡＡＶＣ１１．１３を、２×１０^１１ｖｇ／マウスで個々のｈＦＲＧマウスに注入した。注入の２週間後に肝臓を採取し、免疫組織化学のために処理した。ＤＡＰＩ（青）を使用して、全ての細胞（マウス／ヒト）を染色し、ヒトＧＡＰＤＨに対する抗体（ｈＧＡＰＤＨ、赤）を使用して、ヒト細胞のみを染色した。ＡＡＶから発現したｅＧＦＰ（緑色）によって、ｒＡＡＶで機能的に形質導入された細胞が示された。ＡＡＶＣ１１．１２およびＡＡＶＣ１１．１３が優先的にヒト肝細胞を形質導入したことが観察された（データ示さず）。

【0162】

実施例５
ＡＡＶＣ１１．１２のさらなる評価
次に、本発明者らは、ＡＡＶバリアント間の相対的な形質導入効率が、生着されたヒト肝細胞の起源に依存するか否かを調査した。これを行うために、ＡＡＶＣ１１．１２に加えて、プロトタイプのバリアント（ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８）、生物工学によるバリアント（ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＮＰ５９、ＡＡＶ２－Ｎ４９６Ｄ（Cabanes-Creus et al. 2020, Mol Ther Methods Clin Dev, 17:1139-1154）、ＡＡＶ２－ＲＣ０１、ならびに天然に存在するヒトバリアントＡＡＶ－ｈｕ．Ｌｖｒ０２［オーストラリア仮特許第２０２０９０４６８７号およびCabanes-Creus et al. 2020, Sci Transl Med, 12(560): eaba3312］を含んだバーコード付きＡＡＶの等モル混合物が生成された。ＦＲＧマウスに、年齢、性別、および民族性が異なる１７人の異なるヒトドナー由来の肝細胞を生着させた（１ドナーあたりｎ＝２ｈＦＲＧ、ドナー１３および１６についてｎ＝１）。肝臓の再増殖のレベルは、中間レベルの生着でバーコード化されたＮＧＳベースの比較を実行する目的で、血中のヒトアルブミンの濃度を測定することによって評価された（血液１ｍＬあたり平均３．６ｍｇのヒトアルブミン、これは、ヒト生着の２０～６０％のレベルに相当する）。ドナーの間で生着率には明らかなばらつきがあったが、採取された肝臓におけるヒトアルブミンの濃度とヒト肝細胞の割合との間に正の相関が観察された（データ示さず）。各動物に、１カプシドバリアントあたり１×１０^１０ｖｇの用量に相当する１×１０^１１ｖｇを注入した。注入の１週間後、キメラ肝臓を灌流し、ヒトＧＦＰ陽性肝細胞を選別し、１細胞あたりのベクターコピー数と各サンプルのバーコード組成を分析した。ＡＡＶベクターミックスが、生細胞のそれぞれのＧＦＰ陽性集団によって推定されるとおり、マウス細胞よりも効率的にヒト肝細胞を形質導入することが観察された（図５Ａ）。ＧＦＰ＋細胞の割合に基づいて評価した場合、男性と女性のヒトドナー間のＡＡＶ伝達に有意差は見られなかった（図５Ｂ）が、二倍体細胞あたりのベクターコピー数は、女性の肝細胞でわずかに高いことがわかった（図５Ｃ、最近発表されたZou et al. 2020, Mol Ther Methods Clin Dev 18:189-198のデータと一致している）。ＡＡＶカプシドあたりのＮＧＳリードの全体的なシェアに対応する正規化された割合を図５Ｄ～Ｆに示す。分析されたＡＡＶベクターの相対的な性能は、このモデルの初代ヒト肝細胞の供給源に影響されないように見えた。より具体的には、生物工学によるバリアントＡＡＶ－ＮＰ５９、ＡＡＶ２－Ｎ４９６Ｄ、ＡＡＶ２－ＲＣ０１、およびＡＡＶＣ１１．１２、ならびに天然に存在するＡＡＶ－ｈｕ．Ｌｖｒ０２は、ＤＮＡレベルで測定すると、プロトタイプのカプシド（ＡＡＶ２／３ｂ／５／８）および生物工学によるＡＡＶ－ＬＫ０３（図５Ｄ）に基づくベクターよりも効率的にヒト肝細胞に侵入した。ＡＡＶ－ｈｕ．Ｌｖｒ０２およびＡＡＶＣ１１．１２の平均物理的伝達は高く、これらの相違は他のバリアントと比較して有意であった（図５Ｄ）。機能的パフォーマンスを推定するｃＤＮＡレベルでのバーコード付き導入遺伝子の分析により、試験したコホートの中で最も機能的なバリアントとして出現するＡＡＶＣ１１．１２を含む個々のバリアント間の実質的な違いが明らかになった（図５Ｅ）。相対的なベクトルの適合性をよりよく理解するために、細胞の侵入（ＤＮＡ、図５Ｄ）と発現（ＲＮＡ／ｃＤＮＡ、図５Ｅ）との間の相対的な違いを分析し、発現指数（図５Ｆ）を示した。興味深いことに、分析により、ＡＡＶＣ１１．１２は、発現指数が１を超えていたため、ＤＮＡリードよりもＲＮＡ／ｃＤＮＡリードの割合が大きいことを証明した一方で、他のベクター、特にＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、およびＡＡＶ－ｈｕ．Ｌｖｒ０２は、ＲＮＡ／ｃＤＮＡレベルでのリードの相対的なシェア（図５Ｆ）を失ったことが明らかになり、物理的な形質導入とベクター機能（導入遺伝子発現）との間の違いを強調している。以前のレポートと一致して、ＡＡＶ－ＮＰ５９は機能的に高効率でヒト肝細胞を形質導入した。興味深いことに、ＡＡＶ８の発現指数も１を超えており、ヒト肝細胞におけるこのバリアントの比較的劣った性能によって、最適未満の細胞侵入によって引き起こされる可能性があることが示唆されている（図５Ｆ）。

【0163】

実施例６
追加のカプシドの同定
ＲＮＡリードに基づく上位３つのカプシド（ＡＡＶＣ１１．０６、ＡＡＶＣ１１．１２、ＡＡＶＣ１１．１３）は、系統発生クラスターの一部であることが観察された。ＡＡＶＣ１１．０６、ＡＡＶＣ１１．１２およびＡＡＶＣ１１．１３でクラスター化された同じ選択由来の４つの追加のクローンを配列決定し、ＡＡＶＣ１１．１７（配列番号１８）、ＡＡＶＣ１１．１８（配列番号１９）およびＡＡＶＣ１１．１９（配列番号２０）と名付けた（表５）。

【0164】

実施例７
カプシドの系統分析
系統発生分析および親の寄与の分析を行った。図６に示すように、複数の親カプシドが新しいカプシドのそれぞれの配列に寄与した（系統分析については、オーストラリア仮出願番号２０２０９００５２９の図６Ａを参照のこと）。

【0165】

実施例８
ＡＡＶＣ１１．１２と親バリアントのインビボ機能比較
他の肝指向性ベクターと比較した場合のＡＡＶＣ１１．１２の実質的に優れた性能を考慮して、どのカプシド領域がｈＦＲＧモデルにおけるヒト肝細胞指向性の主な決定要因であるかを調査する研究を行った。ＡＡＶＣ１１．１２はＤＮＡ ファミリーシャッフルライブラリーから選択されたという事実に起因して、図７に詳細に示すように、複数の親バリアント（ＡＡＶ１／ＡＡＶ６、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ７、ＡＡＶ１０、およびＡＡＶ１２）の領域を含んでいる。興味深いことに、本明細書に記載される機能的ＡＡＶＣ１１バリアントの全ては、親ＡＡＶ７由来の領域がＶＲ－Ｖに拡張したＡＡＶＣ１１．１３を除いて、可変領域（ＶＲ）Ｉ（ＡＡＶ２）、ＶＲ ＩＶおよびＶ（ＡＡＶ１０）、ならびにＶＲ ＶＩ～ＶＩＩＩ（ＡＡＶ７）について高い配列同一性および共通の親カプシド領域を共有する（図１および５Ｂ）。２種のヒト化ＦＲＧマウスを使用して、ＡＡＶＣ１１．１２と親のＡＡＶ２、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ１０とのバーコード付きＮＧＳ比較を実行した。ＡＡＶ８を、マウス細胞の形質導入の陽性対照として含んだ。図８に示すように、ＡＡＶＣ１１．１２は、ヒト肝細胞の物理的（ＤＮＡ）および機能的（ＲＮＡ／ｃＤＮＡ）形質導入において、全ての親バリアントよりも大幅に優れていることが判明した。興味深いことに、ＡＡＶＣ１１．１２は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ１０と同様の効率でマウス肝臓を物理的に形質導入することが観察された。しかし、前に観察されたように、この物理的形質導入は、親バリアントと比較した場合、マウス細胞の比較的弱い機能的形質導入と関連していた。これらのデータによって、ヒト肝細胞におけるＡＡＶＣ１１．１２の優れた機能が、単独では親ＡＡＶのいずれにも利益をもたらすのに十分ではない、親の特徴の独自の組み合わせに起因することが示唆される。

【0166】

実施例９
ヒト肝細胞指向性に重要な可変領域の同定。
ヒトおよびマウス細胞におけるＡＡＶＣ１１．１２（配列番号１３）およびＡＡＶ８（配列番号６４）の異なる性能を考慮して、どの機能カプシドドメインがＡＡＶＣ１１．１２の優れた機能の原因であるかを理解し、２種のＡＡＶの間の一連のドメインスワップを生成した。図９に模式的に示すように、ＡＡＶＣ１１．１２由来の可変領域Ｉ（ＡＡＶ２起源）、ＩＶ－Ｖ（ＡＡＶ１０起源）、およびＶＩ－ＶＩＩＩ（ＡＡＶ７起源）の組み合わせを、ＡＡＶ８カプシド足場に体系的にクローニングした。ＡＡＶ８とスワップされたバリアントとの間の特定のアミノ酸変化を表４に示す。図１０は、ＡＡＶＣ１１．１２（配列番号１３）とＡＡＶ８（配列番号６４）との間のアラインメントを提供し、ＡＡＶ８に代わりに入れられたＡＡＶＣ１１．１２由来の残基も示す。得られたカプシドポリペプチド（すなわち、Ｓｗａｐ１～Ｓｗａｐ１５）のアミノ酸配列および核酸配列を、以下の表５に提供する。

【0167】

【表4】

【0168】

次いで、これらのバリアントのうち２種の独立したバーコード付きＡＡＶ ＮＧＳ比較を実行した。最初の実験（Ｎ＝２ ｈＦＲＧ、ｈＦＲＧ＃１および＃２）では、対照としてＡＡＶＣ１１．１２およびＡＡＶ８、ならびにＡＡＶ８－Ｓｗａｐｓ１－７が含まれていた。図１１に示すように、ＡＡＶ２のＶＲ－ＩおよびＡＡＶ７のＶＲ－ＶＩのＶＲ－ＶＩＩＩへの導入は、ヒト肝細胞におけるＡＡＶ８の性能を有意に向上させるのに十分であった（ＡＡＶ８－Ｓｗａｐ－５、図１１）。対照的に、ＡＡＶ１０由来のＶＲ ＩＶ－Ｖは、ヒト細胞の形質導入に実質的な影響を与えないように見えた（Ｓｗａｐ－５およびＳｗａｐ－７を比較、図１０）。ＡＡＶ８のＶＲ－Ｉ起源を維持したＡＡＶ８－Ｓｗａｐ６は、ＡＡＶ８ よりも低いヒト侵入性能を示したが、ｃＤＮＡ集団でのリードシェアの大幅な増加は、ＤＮＡからＲＮＡへの変換で優れた性能を示唆している（図１１）。ＡＡＶ８－Ｓｗａｐ６の表現型は、マウス肝細胞でさらに顕著であった（図１１）。これらの細胞において、ＡＡＶ７由来のＶＲのＶＩ～ＶＩＩＩの包含は、ＡＡＶ８の侵入および発現を増強した（ＡＡＶ８－Ｓｗａｐ３、図１１）。

【0169】

第２の比較（Ｎ＝２のｈＦＲＧ、ｈＦＲＧ＃３および＃４、図１２）において、本発明者らはバーコード付きＡＡＶを拡張して、１５個のＡＡＶ８スワップ（ｓｗａｐ）を含めた。Ｓｗａｐ５、Ｓｗａｐ６、およびＳｗａｐ７については、研究＃１と同じ相対的な傾向が確認された。さらに、ＡＡＶ８（Ｓｗａｐ８～Ｓｗａｐ１５）への可変領域の体系的な復帰の結果の分析は、ＶＲ－ＶＩ（ＡＡＶ７の起源）がヒトの能力を向上させるために必須ではないことを示唆した（Ｓｗａｐ７およびＳｗａｐ１０を比較する）。対照的に、ＶＲ－ＶＩＩおよびＶＲ－ＶＩＩＩの復帰は、ヒト細胞への侵入と発現の両方に影響を与えた。マウスサンプルに関しては、ＡＡＶ８－Ｓｗａｐ６の非常に効率的なＤＮＡからＲＮＡへの転写が、このより大きな比較プールで確認された。

【0170】

これらの結果を検証するために、ＡＡＶ８＋Ｓｗａｐ５およびＡＡＶ８＋Ｓｗａｐ６の多重免疫蛍光比較を、２つの独立したｈＦＲＧで実施した。簡単に説明すると、同じ動物の２種のＡＡＶの形質導入パターンを可視化するために、肝臓特異的プロモーターの制御下でセルリアンまたはビーナス蛍光レポーターを発現する２種のＡＡＶカセットをクローニングした。１×１０^１１ｖｇのＡＡＶ８－ＣｅｒｕｌｅａｎとＳｗａｐ５－Ｖｅｎｕｓとを、ＡＡＶ８－ＣｅｒｕｌｅａｎとＳｗａｐ６－Ｖｅｎｕｓで混合し、２匹の独立したｈＦＲＧマウスに注入した。免疫蛍光実験により、ＮＧＳの結果を確認し、Ｓｗａｐ５は、ＡＡＶ８よりも実質的に優れてヒト肝細胞を形質導入し、Ｓｗａｐ６はヒトおよびマウス肝細胞の両方で細胞侵入が少なく、強い発現を示した（データ示さず）。

【0171】

結果のさらなる検証において、最初の実験由来の同じバーコード混合物（すなわち、ＡＡＶＣ１１．１２およびＡＡＶ８、ならびにＡＡＶ８－Ｓｗａｐｓ１－７）を、２匹の高度に生着されたマウスに注入した。高度に生着されたマウスは、血液１ｍＬあたり平均で１１ｍｇのヒトアルブミンを有していたが、それと比較して以前の実験の「低生着」マウスは、血液１ｍＬあたり平均１．８ｍｇのヒトアルブミンを有していた。各カプシドにマッピングされた相対的なＮＧＳリードは、ＤＮＡおよびｃＤＮＡ集団について以前と同様に分析された。図１３に示すように、全体的な傾向は、低生着マウスで観察されたものと同様であったが、割合は横ばいになった。これは、それぞれＡＡＶ８由来のＶＲ－Ｉを含む、ＡＡＶ８、Ｓｗａｐ３、およびＳｗａｐ６のベクターの利用可能性の増加を反映し得る。ＡＡＶ８由来のＶＲ－１は、マウス肝細胞が存在する場合、ベクターの一部がヒト肝細胞ではなくマウス肝細胞に侵入するように、マウス肝細胞に対する優先性を与えるようである。高生着マウスなど、存在するマウス肝細胞が少ない場合、これらのベクターのヒト肝細胞への侵入がより多く観察される。

【0172】

要約すると、ＡＡＶ７由来のＶＲ－ＶＩＩ（特に）およびＶＲ－ＶＩＩＩは、単独または組み合わせて、ヒト肝細胞の効率的な形質導入に重要であると思われる（Ｓｗａｐ７と比較して、Ｓｗａｐ１１およびＳｗａｐ１２の形質導入の減少によって証明されるとおり）。逆に、ＶＲ－ＶＩ（これもＡＡＶ７由来）は、ヒトにおけるＡＡＶ８の性能を改善するために不可欠であるように思われる（Ｓｗａｐ１０と比較したＳｗａｐ５を参照）。ＡＡＶ２由来のＶＲ－Ｉは、ヒト肝細胞の侵入に重要である可能性があり、その結果、ＡＡＶＣ１１．１２ ＶＲ－ＩおよびＶＲ－ＶＩＩおよび／またはＶＲ－ＶＩＩＩの組み合わせは、ヒト肝細胞の良好な侵入、およびまた良い発現を付与するようである。対照的に、Ｓｗａｐ６に存在する組み合わせ、すなわちＡＡＶ８由来のＶＲ－Ｉ、ＡＡＶ１０由来のＶＲ－ＩＶおよびＶ、ならびにＡＡＶ７由来のＶＲ－ＶＩ、ＶＲ－ＶＩＩおよびＶＲ－ＶＩＩＩは、ヒト肝細胞への侵入がはるかに少ないように見えるが、それにもかかわらず強力な発現であり、表現型は遺伝子治療の文脈でいくつかの利点を持っている場合がある（例えば、物理的な形質導入が少ない同等の発現、潜在的にＤＮＡ統合に関する懸念を軽減する）。

【0173】

【表5】

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】