特表 2023-518377 安定化された対象となるタンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-01

(54)【発明の名称】安定化された対象となるタンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/36 20060101AFI20230424BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 38/47 20060101ALI20230424BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20230424BHJP

   C12N 9/48 20060101ALI20230424BHJP

【ＦＩ】

C12N9/36

A61P17/00

A61K38/43

A61K9/06

A61K47/46

A61K38/47

A61P31/04

A61K9/19

C12N9/48 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022555848

(86)(22)【出願日】2021-03-18

(85)【翻訳文提出日】2022-11-11

(86)【国際出願番号】 EP2021056910

(87)【国際公開番号】W WO2021185948

(87)【国際公開日】2021-09-23

(31)【優先権主張番号】20164184.2

(32)【優先日】2020-03-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513277337

【氏名又は名称】マイクレオス ヒューマン ヘルス ビー．ブイ．

【氏名又は名称原語表記】Ｍｉｃｒｅｏｓ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｂ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】アイヘンゼーハー， フリッツ

【テーマコード（参考）】

4B050

4C076

4C084

【Ｆターム（参考）】

4B050CC07

4B050DD01

4B050HH02

4B050KK03

4B050KK20

4B050LL01

4C076AA08

4C076BB31

4C076CC18

4C076CC31

4C076EE58Q

4C076FF36

4C076FF63

4C076GG06

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA44

4C084DA41

4C084DC22

4C084MA05

4C084MA28

4C084MA63

4C084NA03

4C084ZA891

4C084ZA892

4C084ZB351

4C084ZB352

4C084ZC021

4C084ZC022

(57)【要約】

本発明は、医学の分野に関し、詳細には、悪性状態の急増を悪化及び／又は誘発する細菌による感染に伴う悪性状態の治療の分野に関する。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象となるタンパク質を安定化させるための方法であって、前記タンパク質を穀物ミール又はそのバリアントと接触させるステップを含む、方法。

【請求項2】

対象となるタンパク質及び穀物ミール又はそのバリアントを含む、非水性組成物。

【請求項3】

対象となる前記タンパク質が酵素である、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載の非水性組成物。

【請求項4】

前記酵素がエンドリシンである、請求項３に記載の方法又は請求項３に記載の非水性組成物。

【請求項5】

前記エンドリシンが、ブドウ球菌、好ましくは黄色ブドウ球菌に特異的である、請求項４に記載の方法又は請求項４に記載の非水性組成物。

【請求項6】

前記穀物ミール又はそのバリアントが、重量で、約５０％～約８５％（オートムギ６６％）の炭水化物、約１０～約２５％（オートムギ１７％）のタンパク質、約０％～約１２％（オートムギ７％）の脂質、約０％～約１０％（オートムギ５％）のβ－グルカン、及び約０％～約１５％（オートムギ１１％）の繊維を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法又は請求項１～５のいずれか一項に記載の非水性組成物。

【請求項7】

穀物が、トウモロコシ、コメ、コムギ、オオムギ、ソルガム、キビ、オートムギ、ライムギ、ライコムギ、キノア、スペルト、及びフォニオからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法又は請求項１～６のいずれか一項に記載の非水性組成物。

【請求項8】

前記穀物ミールが、オートミール、好ましくはコロイドオートミール、より好ましくはオートコム（商標）、オートシルク（商標）、又はデルミヴェイル（商標）である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法又は請求項１～７のいずれか一項に記載の非水性組成物。

【請求項9】

対象となる前記タンパク質及び前記穀物ミール又はそのバリアントが、水性液体において混合され、続いて混合物が凍結乾燥される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法又は請求項１～８のいずれか一項に記載の非水性組成物。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能であるか、又は得られる、安定化されたタンパク質。

【請求項11】

請求項１０に記載の安定化されたタンパク質を含む、非水性組成物。

【請求項12】

前記組成物がクリームである、請求項１～９、１１のいずれか一項に記載の非水性組成物。

【請求項13】

請求項１１又は１２に記載の非水性組成物を、必要とする対象に投与することを含む、アトピー性皮膚炎を治療する方法。

【請求項14】

対象となるタンパク質を安定化させるための、請求項１～８のいずれか一項に規定される穀物ミール又はそのバリアントの使用。

【請求項15】

穀物ミール、好ましくはオートミール、より好ましくはコロイドオートミール、さらにより好ましくはオートコム（商標）、オートシルク（商標）、又はデルミヴェイル（商標）、及び
酵素活性を有する抗細菌ポリペプチド
を含む、組成物。

【発明の詳細な説明】

【発明の分野】

【0001】

本発明は、分子生物学の分野、詳細には、酵素の分野に関する。

【発明の背景】

【0002】

湿疹としても知られる皮膚炎は、皮膚の炎症を引き起こす疾患群である（Ｎｅｄｏｒｏｓｔら、２０１２）。これらの疾患は、痒み、皮膚の発赤、及び発疹によって特徴付けられる。短期間の場合、小さな水ぶくれが生じ得るが、長期の場合、皮膚は厚くなり得る。関わる皮膚の領域は、小領域から全身に至るまで変化し得る（Ｈａｎｄｏｕｔ ｏｎ Ｈｅａｌｔｈ：Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ（Ａ ｔｙｐｅ ｏｆ ｅｃｚｅｍａ）．ＮＩＡＭＳ．Ｍａｙ ２０１３）。皮膚炎は、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、及びうっ血性皮膚炎を含む一群の皮膚状態である。皮膚炎の正確な原因は、多くの場合、不明である。刺激、アレルギー、及び静脈還流不良の組合せが含まれる場合がある。皮膚炎の種類は、一般に、その人の病歴及び発疹箇所によって決定される。例えば、刺激性皮膚炎は、多くの場合、手を頻繁に濡らす人の手において生じる。アレルギー性接触皮膚炎は、アレルゲンに曝されると生じ、皮膚に過敏性反応を引き起こす。アトピー性皮膚炎の先行技術の治療には、典型的には、保湿剤及びステロイドクリームが用いられている（ＭｃＡｌｅｅｒら、２０１２）。ステロイドクリームは、一般に、中強度から高強度であり、副作用が生じる可能性があるため、２週間未満に１回使用されることが好ましい（Ｈａｂｉｆら、２０１５）。皮膚感染の徴候がある場合、典型的には、抗生物質が使用される。接触皮膚炎は、典型的には、アレルゲン又は刺激物を避けることによって治療される（Ｍｏｗａｄら、２０１６；Ｌａｒｕｔｉら、２０１５）。抗ヒスタミン薬は、睡眠を補助し、夜間の引っかき傷を減少させるのに役立ち得る。皮膚炎の症状は、異なる形態の状態に応じて変わり得る。これらの症状は、皮膚の発疹から、でこぼこした発疹又は水ぶくれにまで及ぶ。皮膚炎の種類ごとに症状は異なり得るものの、皮膚の発赤、腫れ、痒み、並びに滲み出し及び瘢痕を伴うことがある皮膚病変を含む、皮膚炎すべてに共通する特定の兆候がある。また、症状が現れる皮膚の領域は、首、手首、前腕、大腿、又は足首にあろうと、皮膚炎の種類ごとに異なる傾向がある。箇所は変わり得るが、この状態の主な症状は皮膚の痒みである。

【0003】

アトピー性皮膚炎の症状は人によって様々であるものの、最も一般的な症状は、皮膚の乾燥、痒み、及び発赤である。影響を受ける典型的な皮膚領域としては、腕の窪み、膝の裏側、手首、顔、及び手が挙げられる。皮膚炎は、２０１５年に世界で２億４５００万人が患っていると推定された（Ｌａｎｃｅｔ．３８８（１００５３）：１５４５～１６０２）。アトピー性皮膚炎は、最もよく見られる種類であり、一般に小児期に発症する。米国では、約１０～３０％の人がアトピー性皮膚炎を患っている。

【0004】

最近では、細菌細胞を特異的に標的とする第２の化合物と組み合わせて抗炎症性の第１の化合物を使用する皮膚炎の新規の併用治療であって、該第２の化合物が、好ましくは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）を特異的に標的とする（キメラ）バクテリオファージエンドリシンである、併用治療（参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５００５７８７号）。

【0005】

オートムギも、少なくとも症状を緩和するために、皮膚炎の治療に使用されている。オートムギ（アベナ・サティバ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ））は、青銅器時代から栽培されており、何世紀にもわたって伝統医学で使用されてきた。局所治療として、コロイドオートミールは、皮膚軟化及び抗炎症特性があり、一般に、皮膚の発疹、紅斑、火傷、痒み、及び湿疹に使用されている。

【0006】

湿疹の治療法はない。局所コルチコステロイドの長期使用は、副作用のリスクを高めると考えられており、そのうち最もよく見られるのは、皮膚の薄化及び脆化（萎縮）である。このことから、顔又は他のデリケートな皮膚に使用する場合は、低強度のステロイドを使用するべきであるか、又は頻度を減らして適用するべきである。さらに、広領域にわたって又は閉塞下で使用される高強度のステロイドは、体内に吸収され、視床下部－下垂体－副腎軸抑制（ＨＰＡ軸抑制）を引き起こし得る。抗生物質治療の有効性は、人によって異なる。従来の抗生物質の周知の欠点は特異性であり、すなわち、非病原性細菌及び／又は有益な細菌も殺傷され、標的細菌のみならずおそらく他の病原性細菌によっても耐性が生じるリスクがある。さらに、従来の全身的な抗生物質治療は、避妊薬を含む他の薬物と相互作用する可能性がある。

【0007】

まとめると、湿疹の改善された治療が必要とされている。

【発明の説明】

【0008】

エンドリシンは、水溶液において経時的にそれらの活性を失う。タンパク質を凍結乾燥形態にする場合、発明者らは、担体としてオートミールを使用すると、エンドリシンの安定性が驚くほど増加したことを見出した。本発明者らは、他のタンパク質も同様に安定化させることができることをさらに確立した。

【0009】

したがって、第１の態様では、対象となるタンパク質を安定化させるための方法であって、タンパク質を穀物ミール又はそのバリアントと接触させることを含む、方法が提供される。この方法は、本明細書では、すべての実施形態について、本明細書で開示されている方法又は本方法と称される。

【0010】

対象となるタンパク質及び穀物ミール又はそのバリアントを含む、非水性組成物がさらに提供される。組成物は、本明細書では、すべての実施形態について、本明細書で開示されている組成物又は本組成物と称される。

【0011】

非水性とは、本明細書では、組成物が水を実質的に含有していないことと解釈され、好ましくは、水の量は、（重量パーセントとして）最大１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は最大０．１％である。

【0012】

本方法又は組成物において、対象となるタンパク質は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、又は成熟タンパク質などの任意のタンパク質でもよい。タンパク質は、バクテリオシン又は抗真菌タンパク質、好ましくは本明細書の「定義」の項に定義されているようなバクテリオシンでもよい。好ましくは、タンパク質は酵素である。酵素は、任意の酵素でもよい。酵素は、バクテリオファージエンドリシン又は組換えバクテリオファージエンドリシンなどのエンドリシンなどの抗細菌酵素でもよい。抗細菌酵素は、リゾチーム、ホスホリパーゼＡ２、及び胃酵素の群から選択されるものでもよい。

【0013】

本方法又は組成物において、バクテリオファージエンドリシン又は組換えエンドリシンは、当業者に公知の任意のバクテリオファージエンドリシンでもよい。本明細書では、バクテリオファージ溶解素、バクテリオファージエンドリシン、及びエンドリシンという用語が互換的に使用される。エンドリシンは、国際公開第２０１１／０２３７０２号、国際公開第２０１２／１４６７３８号、国際公開第２００３／０８２１８４号（ＢＩＯＳＹＮＥＸ）、国際公開第２０１０／０１１９６０号（Ｄｏｎｏｖａｎ）、国際公開第２０１０／１４９７９５号、国際公開第２０１０／１４９７９２号、国際公開第２０１２／０９４００４号、国際公開第２０１１／０２３７０２号、国際公開第２０１１／０６５８５４号、国際公開第２０１１／０７６４３２号、国際公開第２０１１／１３４９９８号、国際公開第２０１２／０５９５４５号、国際公開第２０１２／０８５２５９号、国際公開第２０１２１４６７３８号、国際公開第２０１８／０９１７０７号に定義されているエンドリシン、エクセバケース（Ｅｘｅｂａｃａｓｅ）（商標）（Ｌｙｓｉｎ ＣＦ－３０１；Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１９、ｖｏｌ ６３：６、１～１７）、ＳＡＬ２００（商標）（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１８、ｖｏｌ ６２：１０、１～１０）、アウレシン（Ａｕｒｅｓｉｎｅ）（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＳＡＥ００８３）、及びエクトリシン（Ｅｃｔｏｌｙｓｉｎ）（商標）Ｐ１２８（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１８、ｖｏｌ ６２：２、１～１０）の群から選択し得るが、これらは、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0014】

本方法又は組成物において、エンドリシンはブドウ球菌特異的エンドリシンでもよく、これは、このエンドリシンが、黄色ブドウ球菌などのブドウ球菌を効率的に溶解するが、ブドウ球菌又は黄色ブドウ球菌以外の細菌を実質的に溶解しないことを意味する。一実施形態では、エンドリシンは、黄色ブドウ球菌を溶解するが、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）は溶解しない。ペプチドグリカンヒドロラーゼ活性を呈するほとんどの天然ブドウ球菌バクテリオファージエンドリシンは、Ｃ末端細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）と、中央のＮ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼドメインと、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ（ＣＨＡＰ）相同性を有するＮ末端アラニル－グリシルエンドペプチダーゼドメイン、又はＰｌｙ２６３８の場合ペプチターゼ＿Ｍ２３相同性を有するＮ末端グリシル－グリシンエンドペプチダーゼドメインとで構成されており、後者の３つのドメインは、それぞれ異なる標的結合特異性を有するペプチドグリカンヒドロラーゼ活性を呈し、一般に酵素的活性ドメインと呼ばれている。Ｐｌｙ２６３８エンドリシンは、配列番号１及び配列番号２に記載されており（表１を参照）、いくつかのエンドリシンドメインは、配列番号３～配列番号１８に記載されており（表１を参照）、これらのドメインは、好ましいドメインである。エンドリシンは、組換えエンドリシン、例えば、組換えブドウ球菌特異的エンドリシン、特に、１つ又は複数の異種ドメインを含む組換えブドウ球菌特異的キメラエンドリシンでもよい。一般に、エンドリシンは、様々なサブユニット（ドメイン）で構成されており、例えば、細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）と、ペプチドグリカン活性を有する１つ又は複数の酵素ドメイン、例えば、アミダーゼドメイン、Ｍ２３ペプチダーゼドメイン及びＣＨＡＰ（システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ）ドメインとで構成されている。１つ又は複数の異種ドメインを含むブドウ球菌特異的キメラエンドリシンの例は、バクテリオファージＰｌｙ２６３８のアミダーゼドメイン、リゾスタフィン（Ｓ．シミュランス（Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ））のＭ２３ペプチダーゼドメイン、及びバクテリオファージＰｌｙ２６３８の細胞壁結合ドメインを含む、エンドリシンである。そのようなブドウ球菌特異的キメラエンドリシンは、好ましいエンドリシンであり、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１５０８５８号に広範に記載されている。他の好ましいエンドリシンは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１６９１０４号に広範に記載されている。本発明による他の好ましいエンドリシンは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／１４２４４５号に広範に記載されている。本発明による他の好ましいエンドリシンは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０４６０２１号に広範に記載されている。エンドリシンはさらに、表１に配列番号１９～配列番号７５として示されているエンドリシンからなる群から選択されるものであってもよい。表１に示されているようなエンドリシンは、タグ（ＨＸａ）の有無にかかわらず使用できると留意されたい。

【0015】

本方法又は組成物において、エンドリシンは、国際公開第２０１２／１５０８５８号、国際公開第２０１３／１６９１０４号、国際公開第２０１６／１４２４４５号、国際公開第２０１７／０４６０２１号に示されているドメイン又は配列番号３～配列番号１８のうちのいずれかに示されているエンドリシンのドメインと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る（表１を参照）。

【0016】

本方法又は組成物において、エンドリシンは、国際公開第２０１２／１５０８５８号、国際公開第２０１３／１６９１０４号、国際公開第２０１６／１４２４４５号、国際公開第２０１７／０４６０２１号に示されているエンドリシン又は配列番号１、２、及び配列番号１９～配列番号７５のうちのいずれかに示されているエンドリシンと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有し得る（表１を参照）。表１に示されているようなエンドリシンは、タグ（ＨＸａ）の有無にかかわらず使用できると留意されたい。

【0017】

当業者であれば、異なるエンドリシンの混合物が、例えば、本明細書で指定されている２つ、３つ、又は４つのエンドリシンを含む混合物において使用され得ると理解するであろう。

【0018】

穀草は、胚乳、胚芽、及びぬかで構成される、その穀粒（植物学的には、頴果と呼ばれる果実の一種）の食用成分のために栽培（育成）されている任意の草本である。この用語は、得られる穀粒自体（具体的には「穀物粒」）も指し得る。穀物粒作物は、他のどの種類の作物よりも大量に育成され、世界中でより多くの食物エネルギーを供給することから、主要作物となっている。ソバ（タデ科（Ｐｏｌｙｇｏｎａｃｅａｅ））、キノア（ヒユ科（Ａｍａｒａｎｔｈａｃｅａｅ））、及びチア（シソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ））などの他の植物科の食用穀粒は、疑似穀類と称される。

【0019】

天然の加工されていない全粒形態において、穀物は、ビタミン、ミネラル、炭水化物、脂肪、油、及びタンパク質の豊富な供給源である。ぬか及び胚芽の除去によって処理されると、残りの胚乳は、ほとんどが炭水化物である。一部の発展途上国では、コメ、コムギ、キビ、又はトウモロコシの形態の穀粒が、日々の食物の大部分を占めている。

【0020】

コロイドオートミールは、細かく粉砕された全粒オートムギ穀粒又は脱穀粒であり、米国のＦＤＡ ＯＴＣ Ｓｋｉｎ Ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔモノグラフに包含されている活性天然成分である（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ、Ｉｎｔｅｒｉｍ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔ；Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊａｎｕａｒｙ １、２０１３）。典型的には、全粒子の３％以下が１５０μｍを上回り、２０％以下が７５μｍを上回るまで、オートムギ穀粒を粉砕及び加工する。コロイドオートミールの組成は、デンプン（６５～８５％）、タンパク質（１５～２０％）、脂質（３～１１％）、繊維（５％）、及びβ－グルカン（５％）で主に構成されている。オートムギ脂質は、極性脂質及び不飽和遊離脂肪酸とともに、主にトリグリセリドで構成されている。オートムギトリグリセリドは、哺乳類の正常な健康に必要且つ皮膚バリア機能に重要なオメガ－３リノール酸及びオメガ－６リノレン酸、並びに必須脂肪酸が豊富である。さらに、オートムギ脂質は、リン脂質、糖脂質、及びステロールなどの重要な哺乳類細胞膜成分を含有している。脂質酸化保護は、混合されたトコフェロール（ビタミンＥ）及びトコトリエノールによって与えられる。コロイドオートミールは、フェノール系酸化防止剤及びサポニンの豊富な供給源でもある。オートムギに特有の窒素含有フェノール化合物であるアベナンスラミドは、用量依存的にＮＦ－κＢ及びＩＬ－８の放出を阻害することがこれまでに示されている強力な酸化防止剤及び抗炎症剤である。サポニンは、グリコシル化された代謝物質であり、この代謝物質は、オートムギ植物を病気から保護するのに役立ち、コロイドオートミールが製剤に使用されたときに安定したエマルションを生成するのにも役立ち得る。

【0021】

本方法又は組成物において、穀物ミール又はそのバリアントは、重量で、約５０％～約８５％の炭水化物、約１０～約２５％のタンパク質、約０％～１２％の脂質、約０％～約１０％のβ－グルカン、及び約０％～約１５％の繊維を含み得る。そのバリアントの穀物ミールは、重量で、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、又は約８５％の炭水化物を含み得る。そのバリアントの穀物ミールは、重量で、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は約２５％のタンパク質を含み得る。そのバリアントの穀物ミールは、重量で、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は約１２％の脂質を含み得る。そのバリアントの穀物ミールは、重量で、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は約１０％のβ－グルカンを含み得る。そのバリアントの穀物ミールは、重量で、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は約１５％の繊維を含み得る。

【0022】

本方法又は組成物において、そのバリアントの穀物ミールは、重量で、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、又は約８５％の炭水化物を含み得る。そのバリアントの穀物ミールは、重量で、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５％のタンパク質を含み得る。そのバリアントの穀物ミールは、重量で、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２％の脂質を含み得る。そのバリアントの穀物ミールは、重量で、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０％のβ－グルカンを含み得る。そのバリアントの穀物ミールは、重量で、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５％の繊維を含み得る。穀物ミールは、重量で、約６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、又は約８５％の炭水化物、約１５、１６、１７、１８、１９、又は約２０％のタンパク質、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は約１１％の脂質、約５％のβ－グルカン、及び約１１％の繊維を含み得る。穀物ミールは、重量で、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、又は８５％の炭水化物、１５、１６、１７、１８、１９、又は約２０％のタンパク質、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は約１１％の脂質、５％のβ－グルカン、及び１１％の繊維を含み得る。穀物ミールは、重量で、約６６％の炭水化物、約１７％のタンパク質、約７％の脂質、約５％のβ－グルカン、及び約１１％の繊維を含み得る。穀物ミールは、重量で、６６％の炭水化物、１７％のタンパク質、７％の脂質、５％のβ－グルカン、及び１１％の繊維を含み得る。

【0023】

本方法又は組成物において、穀物ミール又はそのバリアントは、トウモロコシ、コメ、コムギ、オオムギ、ソルガム、キビ、オートムギ、ライムギ、ライコムギ、キノア、スペルト、及びフォニオからなる群から選択される穀物から調製され得る。

【0024】

本方法又は組成物において、穀物ミールは、コロイドオートミールなどのオートミール、好ましくは、オートコム（Ｏａｔ Ｃｏｍ）（商標）、オートシルク（Ｏａｔ Ｓｉｌｋ）（商標）、又はデルミヴェイル（ＤｅｒｍｉＶｅｉｌ）（商標）などの市販のコロイドオートミールであってもよく、さらなる詳細については、表４を参照されたい。コロイドオートミールは、細かく粉砕された全粒オートムギ穀粒又は脱穀粒であり、米国のＦＤＡ ＯＴＣ Ｓｋｉｎ Ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔモノグラフに包含されている活性天然成分である。典型的には、全粒子の３％以下が１５０μｍを上回り、２０％以下が７５μｍを上回るまで、オートムギ穀粒を粉砕及び加工する。コロイドオートミールの組成は、デンプン（６５～８５％）、タンパク質（１５～２０％）、脂質（３～１１％）、繊維（５％）、及びβ－グルカン（５％）で主に構成されている。オートムギ脂質は、極性脂質及び不飽和遊離脂肪酸とともに、主にトリグリセリドで構成されている。オートムギトリグリセリドは、哺乳類の正常な健康に必要且つ皮膚バリア機能に重要なオメガ－３リノール酸及びオメガ－６リノレン酸、並びに必須脂肪酸が豊富である。さらに、オートムギ脂質は、リン脂質、糖脂質、及びステロールなどの重要な哺乳類細胞膜成分を含有している。脂質酸化保護は、混合されたトコフェロール（ビタミンＥ）及びトコトリエノールによって与えられる。コロイドオートミールは、フェノール系酸化防止剤及びサポニンの豊富な供給源でもある。オートムギに特有の窒素含有フェノール化合物であるアベナンスラミドは、用量依存的にＮＦ－κＢ及びＩＬ－８の放出を阻害することがこれまでに示されている強力な酸化防止剤及び抗炎症剤である。サポニンは、グリコシル化された代謝物質であり、この代謝物質は、オートムギ植物を病気から保護するのに役立ち、コロイドオートミールが製剤に使用されたときに安定したエマルションを生成するのにも役立ち得る。

【0025】

本方法又は組成物において、一実施形態では、対象となるタンパク質及び穀物ミール又はそのバリアントは、水性液体中で混合され、続いて、混合物は凍結乾燥される。当業者は、ある化合物を凍結乾燥する手法を知っており、先行技術の方法を使用して混合物を凍結乾燥する。

【0026】

第２の態様では、第１の態様による方法によって得ることが可能であるか、又は得られた、安定化されたタンパク質が提供される。安定化されたタンパク質は、本明細書では、すべての実施形態についてタンパク質と称される。第２の態様のすべての実施形態の特徴は、好ましくは、第１の態様の実施形態の特徴である。また、非水性組成物に含まれている安定化されたタンパク質も提供される。組成物は、クリーム、オイントメント（ointment）、バーム（balm）、アンギュエント（unguent）、又はサルブ（salve）、典型的にはクリームなどの、当業者に公知の任意の形態でもよい。

【0027】

対象となるタンパク質を穀物ミール又はそのバリアントと接触させることによって、本明細書で定義されているような対象となるタンパク質を安定化させるための、本明細書で定義されているような穀物ミール又はそのバリアントの使用がさらに提供される。

【0028】

以下のもの：
本明細書で定義されているような穀物ミール、好ましくはオートミール、より好ましくはコロイドオートミール、さらにより好ましくはオートコム（商標）、オートシルク（商標）、又はデルミヴェイル（商標）、及び
本明細書で定義されているような酵素活性を含む抗細菌ポリペプチド
を含む、組成物がさらに提供される。

【0029】

第３の態様では、本明細書の第１又は第２の態様による非水性組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、アトピー性皮膚炎を治療する方法が提供される。本明細書のすべての実施形態において、対象は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。当業者であれば、非水性組成物による治療を当技術分野で公知の他の化合物と好都合に組み合わせてアトピー性皮膚炎を治療することができると理解するであろう。

【0030】

ここで先に記載されているような医学的治療は、アトピー性皮膚炎の予防、遅延、又は治療を必要とする対象におけるアトピー性皮膚炎の予防、遅延、又は治療のための医薬を製造するための本明細書で定義されているような非水性組成物と、アトピー性皮膚炎の予防、遅延、又は治療を必要とする対象におけるアトピー性皮膚炎の予防、遅延、又は治療のための方法であって、非水性組成物を対象に投与するステップを含む、方法とを含む。投与は、当業者に公知の任意の形態で行うことができ、典型的には、組成物は、皮膚に適用される。

【0031】

【表1】

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】黄色ブドウ球菌ニューマンの菌叢にスポットされた異なる量のＸＺ．７００でコーティングされたデルミヴェイル（商標）（左側の列）、オートコム（商標）（中央の列）、及びオートシルク（商標）（右側の列）によるプレート溶解アッセイである。粉末１グラムあたり１μｇ（１列目）、１０μｇ（２列目）、及び１００μｇ（３列目）のＸＺ．７００の濃度を各粉末について試験した。コーティングされていない粉末（４列目）は、対照としての役割を果たしていた。粉末１グラムあたり１００μｇのＸＺ．７００について、粉末の周囲の明確な溶解域が観察できる。

【図2】熱処理後に粉末１グラムあたり１００μｇのＸＺ．７００でコーティングされた３つの粉末デルミヴェイル（商標）（第１の列）、オートコム（商標）（中央の列）、及びオートシルク（商標）（右側の列）を比較したプレート溶解アッセイである。１列目は、室温で保存されたサンプルを示し、２列目は、１２０℃で１時間インキュベートされたサンプルを示し、３列目は、室温で保存されたコーティングされていない粉末を示し、最終列は、１２０℃で１時間インキュベートされたコーティングされていない粉末を示す。

【図3】熱処理後に粉末１グラムあたり１００μｇのＸＺ．７００でコーティングされたスクロース（左側）とコーティングされていないスクロース（右側）とを比較したプレート溶解アッセイである。１列目は、室温で保存されたサンプルを示し、２列目は、１００℃で１時間インキュベートされたサンプルを示し、３列目は、１１０℃で１時間インキュベートされたサンプルを示し、最終列は、１２０℃で１時間インキュベートされたサンプルを示す。

【図4】熱処理後に粉末１グラムあたり１００μｇのＸＺ．７００でコーティングされたマンニトール（左側）とコーティングされていないスクロース（右側）とを比較したプレート溶解アッセイである。１列目は、室温で保存されたサンプルを示し、２列目は、１００℃で１時間インキュベートされたサンプルを示し、３列目は、１１０℃で１時間インキュベートされたサンプルを示し、最終列は、１２０℃で１時間インキュベートされたサンプルを示す。

【図5】熱処理後に粉末１グラムあたり１００μｇのＸＺ．７００でコーティングされたデンプン（左側）とコーティングされていないスクロース（右側）とを比較したプレート溶解アッセイである。１列目は、室温で保存されたサンプルを示し、２列目は、１００℃で１時間インキュベートされたサンプルを示し、３列目は、１１０℃で１時間インキュベートされたサンプルを示し、最終列は、１２０℃で１時間インキュベートされたサンプルを示す。

【図6】オートコム（商標）にコーティングされた５０ｎＭ～６．２５ｎＭの酵素濃度範囲のＸＺ．７００について１時間にわたって測定された正規化されたＯＤ６００ｎｍである。ＸＺ．７００は、最高１３０℃で１時間曝された後にその溶解能を保った。１３５℃で酵素は失活した。

【図7】オートシルク（商標）にコーティングされた５０ｎＭ～６．２５ｎＭの酵素濃度範囲のＸＺ．７００について１時間にわたって測定された正規化されたＯＤ６００ｎｍである。ＸＺ．７００は、最高１２０℃で１時間曝された後にその溶解能を保った。１３０℃で溶解活性が低下し、１３５℃で酵素が失活した。

【図8】デルミヴェイル（商標）にコーティングされた５０ｎＭ～６．２５ｎＭの酵素濃度範囲のＸＺ．７００について１時間にわたって測定された正規化されたＯＤ６００ｎｍである。ＸＺ．７００の溶解活性は、試験したすべての温度で測定されなかった。室温でも活性が失われるため、アッセイは１回だけ実施した（統計分析なし）。

【図9】デンプンにコーティングされた５０ｎＭ～６．２５ｎＭの酵素濃度範囲のＸＺ．７００について１時間にわたって測定された正規化されたＯＤ６００ｎｍである。溶解は、室温（Ａ）、１００℃（Ｂ）、及び１１０℃（Ｃ）で、サンプルについて観察された。１２０℃（Ｄ）で溶解活性が失われた。

【図10】マンニトールにコーティングされた５０ｎＭの酵素濃度のＸＺ．７００について１時間にわたって測定された正規化されたＯＤ６００ｎｍである。室温（Ａ）で、サンプルについていくらかの溶解能が測定された。１００℃（Ｂ）、１１０℃（Ｃ）、及び１２０℃（Ｄ）に曝されたサンプルは、それらの溶解活性を失った。

【図11】スクロースにコーティングされた５０ｎＭの酵素濃度のＸＺ．７００について１時間にわたって測定された正規化されたＯＤ６００ｎｍである。室温（Ａ）で、サンプルについて溶解活性が観察された。１００℃（Ｂ）、１１０℃（Ｃ）、及び１２０℃（Ｄ）に曝されたサンプルは、それらの溶解活性を失った。

【図12】オートコム（商標）にコーティングされた５０ｎＭ～６．２５ｎＭの酵素濃度範囲のＨＰｌｙ５１１について１時間にわたって測定された正規化されたＯＤ６００ｎｍである。ＨＰｌｙ５１１は、最高１３５℃で１時間曝された後にその溶解能を保った。

【図13】オートシルク（商標）にコーティングされた５０ｎＭ～６．２５ｎＭの酵素濃度範囲のＨＰｌｙ５１１について１時間にわたって測定された正規化されたＯＤ６００ｎｍである。ＨＰｌｙ５１１は、最高１３５℃（Ｆ）で１時間曝された後にその溶解能を保った。

【図14】デルミヴェイル（商標）にコーティングされた５０ｎＭ～６．２５ｎＭの酵素濃度範囲のＨＰｌｙ５１１について１時間にわたって測定された正規化されたＯＤ６００ｎｍである。ＨＰｌｙ５１１の溶解活性は、室温の場合と、ある程度までで、１時間１００℃に曝されたサンプル（Ｂ）の場合とで測定された。１１０℃（Ｃ）及び１２０℃（Ｄ）では１時間後に、ＨＰｌｙ５１１の活性が失われた。

【図15】デンプンにコーティングされた５０ｎＭ～６．２５ｎＭの酵素濃度範囲のＨＰｌｙ５１１について１時間にわたって測定された正規化されたＯＤ６００ｎｍである。溶解は、室温（Ａ）、１００℃（Ｂ）、及び１１０℃（Ｃ）で、サンプルについて観察された。１２０℃（Ｄ）では、タンパク質はほとんど失活した。

【図16】マンニトールにコーティングされた５０ｎＭの酵素濃度のＨＰｌｙ５１１について１時間にわたって測定された正規化されたＯＤ６００ｎｍである。室温（Ａ）で、サンプルについていくらかの溶解能が測定された。１００℃に曝されたサンプル（Ｂ）では、わずかな活性しか検出されなかった。１１０℃（Ｃ）及び１２０℃（Ｄ）に曝されたサンプルは、それらの溶解活性を失った。

【図17】７５℃～１３５℃の温度に１時間曝された後に異なる担体にコーティングされて発色性大腸菌群寒天にスポットされたβ－ガラクトシダーゼである。コーティングされていない担体を対照として使用した（プレートの右側）。オートコム（商標）（Ａ）及びオートシルク（商標）（Ｂ）は、１２０℃で１時間後も完全に活性のままであったが、１３５℃に曝された後はわずかな活性しか検出されなかった。デルミヴェイル（商標）（Ｃ）は、室温で良好な活性を示し、７５℃及び１００℃で残留活性を示した。デンプンにコーティングしたβ－ガラクトシダーゼ（Ｄ）は、１００℃までは完全な活性を示し、１２０℃では活性が低下した。マンニトール（Ｅ）は、室温でのみ少しの残留活性を維持した。

【0033】

定義
本明細書におけるバクテリオシンは、当業者に公知の任意のバクテリオシン、好ましくは、任意のクラスＩ～ＩＶのバクテリオシンでもよい。

【0034】

本明細書のクラスＩのバクテリオシンは、小ペプチド阻害剤であり、ナイシン及び他のランチビオティックを含む。

【0035】

本明細書のクラスＩＩのバクテリオシンは、小さな（１０ｋＤａ未満）熱安定性タンパク質である。このクラスは、５つのサブクラスに細分される。クラスＩＩａのバクテリオシン（ペディオシン様バクテリオシン）は、最大のサブグループであり、このグループ全体で、Ｎ末端コンセンサス配列－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｘａａ－Ｃｙｓを含む。Ｃ末端は、種特異的な活性に関与しており、標的細胞壁を透過性にすることによって細胞漏出を引き起こす。クラスＩＩｂのバクテリオシン（２ペプチドバクテリオシン）は、活性のために２つの異なるペプチドを必要とする。１つのそのような例は、ラクトコシンＧであり、これは、Ｎａ及びＫなどの１価のイオンに対して細胞膜を透過性にするが、２価のイオンに対しては透過性にしない。これらのバクテリオシンのほとんどすべてが、ＧｘｘｘＧモチーフを有する。このモチーフは、膜貫通タンパク質にも見られ、ここで、これらの膜貫通タンパク質は、ヘリックス間相互作用に関わる。バクテリオシンのＧｘｘｘＧモチーフは、細菌細胞の膜のモチーフと相互作用し、そうすることによって細菌を殺傷することができる。クラスＩＩｃは、共有結合したＮ末端及びＣ末端領域を有する環状ペプチドを包含する。エンテロシンＡＳ－４８は、このグループの原型である。クラスＩＩｄは、翻訳後修飾されておらず、ペディオシン様シグネチャーを示さない、単一ペプチドバクテリオシンを包含する。このグループの最良の例は、非常に安定したオーレオシンＡ５３である。このバクテリオシンは、強酸性環境（ＨＣｌ ６Ｎ）下で安定であり、プロテアーゼの影響を受けず、耐熱性である。ごく最近に提示されたサブクラスは、クラスＩＩｅであり、このクラスＩＩｅは、３つ又は４つの非ペディオシン様ペプチドによって構成されるバクテリオシンを包含する。最良の例は、４ペプチドバクテリオシンのオーレオシンＡ７０であり、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対して活性が高く、バイオテクノロジーへの応用の可能性がある。

【0036】

クラスＩＩＩのバクテリオシンは、大きな熱不安定性（１０ｋＤａ超）タンパク質バクテリオシンである。このクラスは、サブクラスＩＩＩａ又はバクテリオリシン及びサブクラスＩＩＩｂの２つのサブクラスに細分される。サブクラスＩＩＩａは、細胞壁の分解によって細菌細胞を殺傷することで細胞溶解を引き起こすペプチドを含む。最もよく研究されているバクテリオリシンは、いくつかのブドウ球菌属菌種の細胞壁、主に黄色ブドウ球菌を加水分解する、２７ｋＤａペプチドのリゾスタフィンである。対照的に、サブクラスＩＩＩｂは、細胞溶解を引き起こさず、膜電位を乱すことによって標的細胞を殺傷し、それによってＡＴＰ流出を引き起こす、ペプチドを含む。

【0037】

クラスＩＶのバクテリオシンは、脂質又は炭水化物部分を含有する複雑なバクテリオシンとして定義される。確証となる実験データは、２つの独立したグループによるサブランシン及びグリコシンＦ（ＧｃｃＦ）の特徴付けによって最近確立されたばかりであった。

【0038】

好ましいバクテリオシンは、アシドシン、アクタガルジン、アグロシン、アルベイシン、オーレオシン、オーレオシンＡ５３、オーレオシンＡ７０、カルノシン、カルノサイクリンサーキュラリンＡ、コリシン、クルバチシン、ジベルシン、デュラマイシン、エンテロシン、エンテロリシン、エピデルミン／ガリデルミン、エルウィニオシン、ガセリシンＡ、グリシネシン、ハロシン、ハロデュラシン、ラクトシンＳ、ラクトコシン、ラクチシン、レウコッシン、リゾスタフィン、マセドシン、メルサシジン、メセンテリシン、ミクロビスポリシン、ミクロシンＳ、ミュータシン、ナイシン、パエニバシリン、プラノスポリシン、ペディオシン、ペントシン、プランタリシン、ピオシン、ロイテリシン６、サカシン、サリバリシン、スブチリン、スルホロビシン、ツリシン１７、トリホリトキシン、バリアシン、ビブリオシン、ワルネリシン、及びワルネリンからなる群から選択される。

【0039】

バクテリオシンは、限定されることはないが、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のピオシン、好ましくはピオシンＳＡ１８９（２５）などの細菌自体（２４）に由来していてもよい。

【0040】

抗菌ペプチドは、当業者に公知の任意の抗菌ペプチドでもよい。当技術分野において、抗菌ペプチドは、ここで先に列挙したようなバクテリオシンであると考慮されることがある。好ましい抗菌ペプチドは、カチオン性又はポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、スシペプチド、デフェンシン、及び疎水性ペプチドからなる群から選択される。

【0041】

細菌自己溶解素は、当業者に公知の任意の細菌自己溶解素でもよい。好ましい細菌自己溶解素はＬｙｔＭである。抗細菌タンパク質は、ラクトフェリン又はトランスフェリンでもよい。バクテリオファージエンドリシンは、バクテリオファージに含まれていても、又は含まれていなくてもよい。

【0042】

本明細書において、「配列同一性」とは、配列を比較することによって決定されるような、２つ以上のアミノ酸（ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ヌクレオチド、ポリヌクレオチド）配列間の関係として定義される。当技術分野において、「同一性」とは、場合によっては、そのような配列のストリング間の一致によって決定され得るような、アミノ酸又はヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのペプチド又はポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を、第２のペプチド又はポリペプチドの配列と比較することによって決定される。好ましい実施形態では、同一性又は類似性は、本明細書で識別されている全配列番号にわたって計算される。「同一性」及び「類似性」は、限定されることはないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ, Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；並びにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）に記載されている方法を含む公知の方法によって容易に計算することができる。

【0043】

同一性を決定するための好ましい方法は、試験した配列間で最大の一致を与えるように設計されている。同一性及び類似性を決定する方法は、公表されているコンピュータープログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法としては、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ，ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮａｎｄ ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０（１９９０）が挙げられる。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０（１９９０）から公表されている。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用され得る。

【0044】

ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータとしては、以下のものが挙げられる：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３～４５３（１９７０）；比較マトリクス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５～１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２；ギャップペナルティ：１２；並びにギャップ長さペナルティ：４。これらのパラメータで有用なプログラムは、マディソン、ＷＩにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから「Ｏｇａｐ」プログラムとして公表されている。前述のパラメータは、（エンドギャップのためのペナルティなしでの）アミノ酸比較についてのデフォルトパラメータである。

【0045】

核酸比較についての好ましいパラメータは、以下のものを含む：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３～４５３（１９７０）；比較マトリクス：一致＝＋１０、不一致＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長さペナルティ：３。マディソン、ＷｉｓにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＧｒｏｕｐからＧａｐプログラムとして利用可能。先に与えられているのは、核酸比較についてのデフォルトパラメータである。

【0046】

任意選択で、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者はまた、当業者に明らかであるように、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れることができる。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンである。本明細書に開示されているアミノ酸配列の置換バリアントは、開示されている配列における少なくとも１つの残基が除去されており、異なる残基がその位置に挿入されている、置換バリアントである。好ましくは、アミノ酸の変化は保存的である。天然に存在するアミノ酸のそれぞれについての好ましい保存的置換は、以下の通りである：Ａｌａからｓｅｒ；Ａｒｇからｌｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ；ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ；及びＶａｌからｉｌｅ又はｌｅｕ。

【0047】

「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」（これらの用語は、本明細書では互換的に使用される）は、ヌクレオチド配列によって表される。「ポリペプチド」は、アミノ酸配列によって表される。「核酸構築物」は、天然に存在する遺伝子から単離された、又はそうでなければ天然には存在しない形式で結合又は並置された核酸のセグメントを含有するように修飾された、核酸分子として定義される。核酸分子は、ヌクレオチド配列によって表される。任意選択で、核酸構築物に存在するヌクレオチド配列は、細胞又は対象における該ペプチド又はポリペプチドの産生又は発現を指示する１つ又は複数の制御配列に作動可能に連結されている。

【0048】

本明細書において、「作動可能に連結された」とは、制御配列が、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して適切な位置に配置されており、それによって、制御配列が、細胞及び／又は対象において本発明のペプチド又はポリペプチドの産生／発現を命令するようになる、構成として定義される。「作動可能に連結された」は、配列が、機能ドメインをコードする別の配列に対して適切な位置に配置されており、それによって、キメラポリペプチドが、細胞及び／又は対象においてコードされるようになる、構成を定義するためにも使用され得る。

【0049】

「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むがこれらに限定されることはない、ペプチド又はポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含むと解釈される。

【0050】

本明細書において、「制御配列」は、ポリペプチドの発現に必要又は有利なすべての成分を含むと定義される。最小でも、制御配列は、プロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む。任意選択で、核酸構築物に存在するヌクレオチド配列によって表されるプロモーターは、本明細書で同定されるペプチド又はポリペプチドをコードする別のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。

【0051】

「形質転換」という用語は、新しいＤＮＡ（すなわち、細胞にとって外因性のＤＮＡ）の導入に続いて細胞において誘導された永続的又は一過性の遺伝的変化を指す。本発明で意図されているように、細胞が細菌細胞である場合、この用語は、通常、選択可能な抗生物質耐性を有する染色体外の自己複製ベクターを指す。

【0052】

「発現ベクター」とは、組換えＤＮＡ手順に好都合に供することができ、細胞及び／又は対象において本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる、任意のベクターでもよい。本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写開始部位の転写方向に関して上流に位置する、１つ又は複数の遺伝子又は核酸の転写を制御するように機能する核酸断片を指す。このプロモーターは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位と、転写開始部位と、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位を含むがこれらに限定されることはない任意の他のＤＮＡ配列と、プロモーターからの転写量を調節するために直接的又は間接的に作用すると当業者に知られている任意の他のヌクレオチド配列との存在によって同定される結合部位に関連している。本発明の文脈で、プロモーターは、好ましくは、転写開始部位（ＴＳＳ）のヌクレオチド－１で終わる。

【0053】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」とは、任意のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、遺伝子産物、発現産物、又はタンパク質を指す。ポリペプチドは、連続したアミノ酸で構成されている。「ポリペプチド」という用語は、天然に存在する分子又は合成分子を包含する。

【0054】

本明細書で提供される配列情報は、誤って同定された塩基を含める必要があると狭く解釈されるべきではない。当業者は、そのような誤って同定された塩基を同定することができ、そのような誤りを正す方法を知っている。

【0055】

この文書及びその特許請求の範囲において、「含む」という動詞及びその活用形は、この単語に続く項目が含まれるが、特に言及されていない項目が除外されないことを意味する、その非限定的な意味合いで使用される。さらに、「からなる」という動詞は、「から本質的になる」で置き換えることができ、これは、本明細書で定義されているような、生成物、又は組成物、又は核酸分子、又は核酸構築物のペプチド若しくはポリペプチド、又はベクター、又は細胞が、具体的に同定されているもの以外の追加成分（複数可）を含んでもよいが、該追加成分（複数可）が本発明の独自の特徴を変更しないことを意味する。さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、文脈から要素が１つだけであることが明確に要求されない限り、１つより多くの要素が存在する可能性を排除することはない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。「約」又は「およそ」という言葉は、数値（例えば、約１０）に関連して使用される場合、好ましくは、その値が、（１０の）所与の値の１０％前後の値であってもよいことを意味する。

【0056】

本明細書で引用されているすべての特許及び参考文献は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0057】

以下の実施例は、単に例示を目的として提示されるのであって、決して本発明の範囲を限定することを意図してはいない。

【実施例】

【0058】

導入
エンドリシンは、子孫ビリオンを放出するために溶解サイクルの最後に産生されるファージ由来のペプチドグリカンヒドロラーゼである（Ｓｃｈｍｅｌｃｈｅｒ、Ｄｏｎｏｖａｎら ２０１２）。エンドリシンは、それらの宿主特異性と薬剤耐性株に対する活性のために、有望な抗菌剤である。しかしながら、水溶液におけるタンパク質の分解及び活性の喪失は、タンパク質治療の足かせとなる（Ｍａｎｎｉｎｇ、Ｐａｔｅｌら １９８９）。キメラエンドリシンＸＺ．７００は、黄色ブドウ球菌に対して強力な溶解活性を示すが、経時的な活性の喪失が水溶液において観察される。したがって、対象となるタンパク質を凍結乾燥によって固体状態にすることによって、タンパク質の安定性を増加させることができるであろう。治療用量を制御し、皮膚へのＸＺ．７００の適用を可能にするために、凍結乾燥されたタンパク質のための担体が必要とされている。

【0059】

コロイドオートミールは、１９８９年に食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、皮膚への適用に安全な成分であると宣言された（Ｆｏｗｌｅｒ ２０１４）。コロイドオートミールは、その抗炎症特性のために、アトピー性皮膚炎を含む様々な皮膚状態の治療に使用されている（Ｆｏｗｌｅｒ ２０１４）。これらの有益な特徴によって、コロイドオートミールは有望な担体となる。Ｏａｔ Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ、２ Ｖｅｎｔｕｒｅ Ｒｏａｄ、Ｃｈｉｌｗｏｒｔｈ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、ＳＯ１６ ７ＮＰ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の２つのオートミール由来粉末（アベナ・サティバ）であるオートコム（商標）及びオートシルク（商標）を担体として選択した。さらに、オオムギデンプン粉末であるデルミヴェイル（商標）（ホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、マンニトール、スクロース、及びデンプンが潜在的な担体として含まれていた。

【0060】

担体コーティング及び凍結乾燥も他のタンパク質の安定性を増加させるかどうかを試験するために、様々な酵素活性タンパク質を研究に含めた。一般的なエンドリシンの概念を証明するために、精製用のＨｉｓタグを含有するリステリアファージエンドリシンＨＰｌｙ５１１（Ｅｕｇｓｔｅｒ及びＬｏｅｓｓｎｅｒ ２０１２）を含めた。２つのエンドリシンの活性を異なる溶解アッセイで評価した。ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、及びホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、発光測定又は比色アッセイによるそれらの単純な活性検出のために選択した。フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）からのホタルルシフェラーゼ及びβ－ガラクトシダーゼを凍結乾燥粉末として購入した。ルシフェラーゼ活性は、酵素によって触媒される２段階の反応中に生成される光として検出することができた。β－ガラクトシダーゼ活性は、比色アッセイで測定した。化合物であるＳａｌｍｏｎ－β－Ｄ－ガラクトシダーゼの加水分解は、酵素の活性が維持されていることを示す赤い染色をもたらす。この研究で使用したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼは、サルモネラＳ１６バクテリオファージロングテールファイバー（ＬＴＦ）に融合され、Ｍａｔｔｈｅｗ Ｄｕｎｎｅ（Ｆｏｏｄｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂ、ＥＴＨ Ｚｕｒｉｃｈ）によって提供された。ＬＴＦ－ＨＲＰコンジュゲーション産物が、迅速なサルモネラ検出のために開発された（Ｄｅｎｙｅｓ、Ｄｕｎｎｅら ２０１７）。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンの酸化によって、青色ジアミンが形成され、この青色ジアミンは、測定可能であり、ＨＲＰの残存活性を反映している。

【0061】

材料及び方法
材料：培地、緩衝液、及び担体
成長培地（表２）及びすべての緩衝液（表３）を、透析に使用する場合を除いて、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。担体（表４）は、乾燥粉末として用い、直接的に使用した。

【0062】

【表2】

【0063】

【表3】

【0064】

【表4】

【0065】

方法
粉末におけるタンパク質コーティング
２つのオートミール由来粉末であるオートコム（商標）及びオートシルク（商標）、オオムギ粉末であるデルミヴェイル（商標）、マンニトール、スクロース、並びにデンプンを担体として使用し（表４）、異なるタンパク質でコーティングした（表５）。第１の試験は、粉末１グラムあたり１μｇ、１０μｇ、又は１００μｇのＸＺ．７００でコーティングされたオートコム（商標）、オートシルク（商標）、及びデルミヴェイル（商標）を用いて実施した。他の担体は、粉末１グラムあたり１００μｇのＸＺ．７００でコーティングした。簡単に述べると、各種類を１ｇ秤量し、超純水（１８．２ＭΩｃｍ、Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して懸濁液を作製した。体積を異なる粉末種類に合わせて調整した（表５）。ＸＺ．７００及びＨＰｌｙ５１１を、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析チューブ（分子量カットオフ６～８ｋＤ、Ｓｐｒｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（表３）に対して一晩かけて透析した。フォティヌス・ピラリスからの凍結乾燥されたルシフェラーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号：ＳＲＥ００４５－２ＭＧ）を、１ＭのＴｒｉｓ緩衝液（表３）に再懸濁し、次いで、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析チューブ（分子量カットオフ６～８ｋＤ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（表３）に対して一晩かけて透析した。凍結乾燥されたβ－ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号：４８２７５－１ＭＧ－Ｆ）を２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（表３）に直接的に再懸濁した。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼがコンジュゲートしたＳ１６ロングテールファイバーを先行技術の技術に従って合成した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸収測定（Ａ２８０、Ｎａｎｏｄｒｏｐ）によって決定し、値は、ＣＬＣＢｉｏソフトウェアで計算されたタンパク質の理論上の吸収係数によって補正した。次いで、タンパク質を懸濁液に添加した。混合物を凍結乾燥（－４６℃、真空２１１μＢ、コンデンサー－４５．６）前に－８０℃で凍結した。凍結乾燥された生成物を室温で乾燥保存した。

【0066】

【表5】

【0067】

プレート溶解アッセイ
コーティングプロセス後のＸＺ．７００の活性を試験するために、黄色ブドウ球菌ニューマン（黄色ブドウ球菌亜種アウレウスローゼンハッハ、ＡＴＣＣ（登録商標）２５９０４（商標））を含有する正方形のＴＳＡプレートにサンプルをスポットした（表２）。黄色ブドウ球菌ニューマンをＴＳＢにおいて０．４～０．６のＯＤ６００ｎｍになるまで育成し（表２）、培養液５ｍＬをプレートに広げた。過剰な液体を捨て、プレートをラミナーフローフードにおいて１５分間乾燥させた。スパチュラを使用して５ｍｇの粉末をプレートにスポットした。次いで、プレートを３０℃で一晩かけてインキュベートした。

【0068】

固体支持体（粉末）にコーティングされたＸＺ．７００の熱安定性を評価するために、サンプルを、ＰＣＲグラジエントサーモサイクラーにおいて、５０℃～１００℃の温度で１時間インキュベートした。さらに、サンプルを、ヒートブロックにおいて、１時間１００℃、１１０℃、及び１２０℃に、２４時間１００℃に曝した。さらに、オートコム（商標）サンプルを１時間１３０℃に曝した。上記のように、すべてのサンプルをＴＳＡプレートにスポットした。

【0069】

濁度低減アッセイ
ＸＺ．７００及びＨＰｌｙ５１１の活性を、ＰＢＳで再構成した後に、経時的な光学密度の低下として試験した。ＸＺ．７００については黄色ブドウ球菌ニューマンを、ＨＰｌｙ５１１についてはＬ．モノサイトゲン（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ）１００１を、１／２ＢＨＩ培地（表２）で０．４のＯＤ６００ｎｍになるまで培養した。次いで、細胞を７０００ｇ（４℃で１０分間；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＪＡ－１０ローター）で回収し、ＰＢＳ（表３）で洗浄した。ペレットを１％の元の培養液体積のＰＢＳ（表３）に再懸濁し、２００μＬのアリコートを使用まで－８０℃で保存した。

【0070】

１００ｎＭの理論上のタンパク質濃度を得るために、ＸＺ．７００を有する５２ｍｇの粉末及びＨＰｌｙ５１１を有する３７．８ｍｇの粉末（粉末１ｇあたり１００μｇのエンドリシンでコーティング）に１ｍＬのＰＢＳ（表３）を添加した。懸濁液を１０ｒｐｍのオーバーヘッドローテーターにおいて２時間４℃でインキュベートし、次いで、４℃にて３０分間３００００ｇで遠心分離して、透明な溶液を得た（Ｓｉｇｍａ ３Ｋ ３０、１９７７７ローター）。上清を使用して、９６ウェルプレートにおいてＰＢＳ（表３）で２倍希釈系列を調製し、５０ｎＭ～６．２５ｎＭの濃度にした。対応する基質細胞をＰＢＳ（表３）で２．０のＯＤ６００ｎｍになるまで希釈し、時点ゼロで９６ウェルプレートにおいてＯＤ６００ｎｍを１．０にした。オメガフォトスペクトロメーター（ＯｍｅｇａＰｈｏｔｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）（フルオスター（ＦＬＵＯｓｔａｒ）（登録商標）オメガ、ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を使用して、ＯＤ６００ｎｍを１時間にわたって３０秒ごとに測定した。値を正規化及び使用して、溶解曲線をプロットした。同じ手順を、熱処理したサンプル（１００℃、１１０℃、１２０℃、１３０℃、及び１３５℃に１時間曝す）を用いて行い、異なる担体におけるタンパク質の熱安定性を試験した。

【0071】

ＬＴＦ－ＨＲＰ比色アッセイ
ＬＴＦ－ＨＲＰの活性は、ＰＢＳ（表３）で再構成した後に試験した。ルシフェラーゼでコーティングされた１０ｍｇの粉末及びそのコーティングされていない対照を秤量し、熱処理した（室温、７５℃、１００℃、１２５℃、１３５℃で１時間）。１μｇ／ｍＬの理論上のタンパク質濃度を得るために、１ｍＬのＰＢＳ（表３）をサンプルに添加した。懸濁液を１０ｒｐｍのオーバーヘッドローテーターにおいて２時間４℃でインキュベートし、次いで、４℃にて３０分間３００００ｇで遠心分離して、透明な溶液を得た（Ｓｉｇｍａ ３Ｋ ３０、１９７７７ローター）。９９μＬのＴＭＢ溶液（Ｍｅｒｃｋ；カタログ番号６１３５４４－１００ＭＬ）を９６ウェルプレートのウェルごとにピペッティングし、次いで、１μＬの上清を添加した。ＬＴＦ－ＨＲＰストックは、陽性対照としての役割を果たしていた（ＰＢＳにおいて２μｇ／ｍＬ）。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンの酸化によって、青色ジアミンが形成され、この青色ジアミンは、ＨＲＰの残存活性を反映する３７０ｎｍでの吸光度として測定可能である。オメガフォトスペクトロメーター（フルオスター（登録商標）オメガ、ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）において１５分後に吸光度を測定した。残存活性を分類するために閾値を定義した（ｘ＜０．１活性なし、０．１≦ｘ＜１．０いくらかの残留活性、及びｘ≧１．０活性維持）。

【0072】

ルシフェラーゼグローアッセイ
ホタルルシフェラーゼの活性は、１ＭのＴｒｉｓ緩衝液（表３）で再構成した後に試験した。ルシフェラーゼでコーティングされた２４．８ｍｇの粉末及びそのコーティングされていない対照を秤量し、熱処理した（室温、７５℃、１００℃、１２５℃、１３５℃で１時間）。１００ｎＭの理論上のタンパク質濃度を得るために、４００μＬの１ＭのＴｒｉｓ緩衝液（表３）をサンプルに添加した。懸濁液を１０ｒｐｍのオーバーヘッドローテーターにおいて２時間４℃でインキュベートし、次いで、４℃にて３０分間３００００ｇで遠心分離して、透明な溶液を得た（Ｓｉｇｍａ ３Ｋ ３０、１９７７７ローター）。２５μＬのサンプルを白色の９６ウェルプレートに分注した。ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）（商標）ホタルルシフェラーゼグローアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号：１６１７６）からの１００×ｄ－ルシフェリンをグローアッセイ緩衝液で希釈した。１：１の比を得るために、この反応混合物をサンプルに添加した。４００ｎＭのルシフェラーゼストック溶液を陽性対照として使用し、コーティングされていない粉末懸濁液を陰性対照としての役割を果たし、１ＭのＴｒｉｓ緩衝液（表３）をブランクとして使用した。プレートを機械内で暗所に１０分間保った後に、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）ナビゲーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）において測定した。すべての測定値は、ブランクを差し引くことによって補正した。担体のバックグラウンド発光を排除するために、対応するコーティングされていない対照の値をサンプル値から差し引いた。残存活性を分類するために閾値を定義した（ｘ＜１０２活性なし、１０２≦ｘ＜１０４いくらかの残留活性、及びｘ≧１０４活性維持）。

【0073】

β－ガラクトシダーゼ比色アッセイ
コーティングプロセス後のβ－ガラクトシダーゼの活性を試験するために、サンプルを発色性大腸菌群寒天にスポットした（表２）。β－ガラクトシダーゼでコーティングされた５ｍｇの粉末及びそのコーティングされていない対照をエッペンドルフチューブに分注し、異なる温度（室温、７５℃、１００℃、１２５℃、１３５℃）で１時間熱処理した。同じ担体からのすべてのサンプルを同じ発色寒天プレートにスポットし、室温で一晩かけて保った。スポット部位でのプレートの色の変化を活性指標として使用した。

【0074】

結果
プレート溶解アッセイ
３つの異なるタンパク質濃度及び３つの異なる粉末（オートコム（商標）、オートシルク（商標）、及びデルミヴェイル（商標））を試験したプレート溶解アッセイでは、３つの粉末すべてについて粉末１グラムあたり１００μｇのＸＺ．７００の明確な溶解が示された（図１）。粉末１グラムあたり１μｇ又は１０μｇのＸＺ．７００の濃度は、溶解が生じるには低過ぎた。

【0075】

サンプルをサーモサイクラーにおいて５０℃～１００℃の温度に１時間曝した場合、すべてのサンプルがそれらの溶解能を保持した（結果は示していない）。ヒートブロックにおいて１００℃で１時間加熱されたサンプルは、依然として活性があったが、デルミヴェイル（商標）にコーティングされたＸＺ．７００は、１１０℃でその活性を失った。１２０℃で１時間後に、オートコム（商標）について活性を依然として観察することができた。オートシルク（商標）の場合、１２０℃で１時間加熱した後に、非常に小さな溶解域によって示される残留活性は非常にわずかしかないように思われる（図２）。１００℃で２４時間の熱処理によって、すべてのサンプルのタンパク質が失活した（データは示していない）。

【0076】

他の担体材料であるスクロース、マンニトール、デンプンは、黄色ブドウ球菌ニューマンで覆われたＴＳＡプレートにスポットする前に、１００℃、１１０℃、及び１２０℃に１時間曝した。室温に保たれたすべてのコーティングされた担体は、溶解活性を示した。スクロースにコーティングされたＸＺ．７００は、１００℃に１時間曝された場合、その活性をすでに失った（図３）。マンニトールのサンプルは、１時間で１００℃においてほとんど失活しているように思われ、わずかな残留活性しか検出できない（図４）。室温及び１００℃では、デンプンサンプルの明確な溶解域を見ることができたが、１１０℃では、かすかな検出可能な溶解のみを伴う主要な不活化が起こった（図５）。

【0077】

オートコム（商標）にコーティングされたＸＺ．７００は、すべての複製において高温で最も高い活性を示した（表６）。デルミヴェイル（商標）にコーティングされたＸＺ．７００の活性は、活性が最初の複製でしか観察されなかったため、経時的に非常に不安定であるように思われた。

【0078】

【表6】

【0079】

濁度低減アッセイ：ＸＺ．７００
再構成後の５２ｍｇの粉末を使用して、細胞溶解に反映される残存活性を測定した。１時間における黄色ブドウ球菌ニューマン細胞懸濁液の光学密度の低下の測定によって、オートコム（商標）及びオートシルク（商標）についての活性は示されたが、デルミヴェイル（商標）についての活性は示されなかった（図６Ａ、７Ａ、８Ａ）。残留粉末粒子によって残留濁度が生じることから、ＯＤ６００ｎｍ測定における変動が観察された。

【0080】

異なる担体におけるＸＺ．７００の熱安定性を試験するために、１００℃、１１０℃、及び１２０℃で１時間事前に加熱したサンプルに同じ手順を適用した。すべてのコーティングされた担体（デルミヴェイル（商標）を除く）が、室温で少なくともいくらかの活性を示した。オートコム（商標）及びオートシルク（商標）にコーティングされたＸＺ．７００は、１２０℃に曝された後でもその溶解能を保った（図６Ｄ、７Ｄ）。１３５℃では、オートコム（商標）及びオートシルク（商標）にコーティングされたＸＺ．７００の活性は１時間後に失われたが（図６Ｆ、７Ｆ）、１３０℃では、ＸＺ．７００を完全に失活させるには不十分であった（図６Ｅ、７Ｅ）。

【0081】

室温で保存されたサンプルの場合、再構成後に、スクロース、マンニトール、及びデンプンにコーティングされたＸＺ．７００は活性を示した。しかしながら、マンニトールは、ＸＺ．７００の活性を完全には補助していないため、担体として劣っているように思われる（図１０Ａ）。デンプンにコーティングした場合、ＸＺ．７００は、１００℃で１時間インキュベートした後に依然として活性があった（図９）。１１０℃に曝した後は、実質的に活性は検出されず、１２０℃では、デンプンにコーティングされたＸＺ．７００の活性は完全に失われた。対照的に、マンニトール（図１０）又はスクロース（図１１）にコーティングされたＸＺ．７００は、１００℃に曝された場合、その溶解活性をすでに失った。

【0082】

異なる担体にコーティングされて高温に曝されたＸＺ．７００の溶解活性は、表７において各生物学的複製についてまとめられている。複製４を実施して、完全な熱失活を決定した。

【0083】

【表7】

【0084】

濁度低減アッセイ：ＨＰｌｙ５１１
ＸＺ．７００の場合と同じ手順を適用して、異なる担体にコーティングされたＨＰｌｙ５１１の活性を試験した。１時間にわたるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）１００１基質細胞の光学密度の低下から、室温ですべての担体について溶解活性が示された（図１２Ａ、１３Ａ、１４Ａ、１５Ａ、１６Ａ）。１００℃で１時間後に残存活性を非常にわずかしか示さなかったマンニトールを除いて（図１６Ｂ）、他のすべての担体は、溶解活性を保持した。デルミヴェイル（商標）にコーティングされたＨＰｌｙ５１１については、１１０℃に曝された後に活性が失われた（図１４Ｃ）。デンプンにコーティングされたＨＰｌｙ５１１については、わずかな活性しか残存しなかった（図１５）。オートコム（商標）及びオートシルク（商標）にコーティングされたＨＰｌｙ５１１は、１３５℃に１時間曝された後でも完全に活性なままであった（図１２Ｆ、図１３Ｆ）。

【0085】

異なる担体にコーティングされて高温に曝されたＨＰｌｙ５１１の溶解活性は、表８において各生物学的複製についてまとめられている。

【0086】

【表8】

【0087】

ＬＴＦ－ＨＲＰ比色アッセイ
ＬＴＦ－ＨＲＰコーティングされた粉末１０ｍｇを再構成し、比色アッセイにおいて残存活性を試験した。表９には、３回の複製すべてにおける各条件についての色の変化がまとめられている（付録の未加工データ、表１１）。先のアッセイと同様に、オートコム（商標）及びオートシルク（商標）は、他の担体よりも高い温度で、コーティングされたタンパク質の活性を保持した。デルミヴェイル（商標）にコーティングされたＨＲＰは、室温では活性をわずかしか示さず、経時的に不安定であるように思われた。このセットアップでは、デンプンは、他のタンパク質でコーティングされた先のアッセイよりも、乾熱曝露中の活性維持においてはるかに効果が低かった。

【0088】

【表9】

【0089】

ルシフェラーゼグローアッセイ
２４．８ｍｇのホタルルシフェラーゼでコーティングされた粉末をＴｒｉｓ緩衝液に再懸濁し、タンパク質の再構成のために、１０ｒｐｍ及び４℃でオーバーヘッドローテーターにおいて２時間インキュベートした。固体粒子をペレット化し、上清をグローアッセイに使用した。酵素によるｄ－ルシフェリンの酸化を発光として測定することができる。オートコム（商標）及びオートシルク（商標）にコーティングされたルシフェラーゼは、１３５℃に１時間曝された後でも活性のままであった（表１０）。デルミヴェイル（商標）、デンプン、又はマンニトールにコーティングされたタンパク質の活性は、１００℃～１２０℃で低下するか、又は失われた。

【0090】

【表10】

【0091】

β－ガラクトシダーゼ
異なる担体にコーティングされて異なる温度に曝されたβ－ガラクトシダーゼの残存活性は、これを発色性大腸菌群寒天に直接スポットすることによって試験した。β－ガラクトシダーゼによって触媒された培地に存在する化合物Ｓａｌｍｏｎ－β－ｄ－ガラクトシダーゼの加水分解によって、活性部位に赤い染色がもたらされる。オートコム（商標）及びオートシルク（商標）にコーティングされたβ－ガラクトシダーゼは、１２０℃で１時間後に完全な活性を示し、１３５℃でいくらかの残留活性を示した（図１７Ａ、１７Ｂ）。デンプンを担体として使用した場合、室温、７５℃、及び１００℃で完全な活性が保持された。１２０℃でβ－ガラクトシダーゼ活性は減少し、１３５℃で完全に失われた（図１７Ｄ）。デルミヴェイル（商標）上のβ－ガラクトシダーゼは、室温で活性を示し、７５℃及び１００℃でいくらかの残留活性を示した（図１７Ｃ）。マンニトールは、β－ガラクトシダーゼのための担体として使用された場合、熱安定性を付与しなかった（図１７Ｅ）。したがって、活性は、室温でのサンプルについてのみ観察された。

【0092】

異なる担体にコーティングされて高温に曝されたβ－ガラクトシダーゼの活性は、表１１において各生物学的複製についてまとめられている。

【0093】

【表11】

【0094】

考察及び結論
この研究では、異なる酵素を凍結乾燥プロセスによって担体にコーティングした。特に、２つのオートミール由来粉末であるオートコム（商標）及びオートシルク（商標）は、高温に曝された場合でも、タンパク質の活性維持の改善を示した。残留粉末粒子が濁度低減アッセイのＯＤ６００ｎｍ測定の変動をもたらしたとしても、ＸＺ．７００及びＨＰＬ５１１それぞれで、最高１３０℃及び１３５℃で明確な溶解活性が観察された。デンプンは、特定のタンパク質にとって良好な担体であるように思われた。活性が維持について非常に低く、吸湿性の傾向があることから、スクロースは、ＸＺ．７００でのみ試験し、さらなる実験から除外した。一般に、ホタルルシフェラーゼは、試験された他のタンパク質と比較して、熱処理の影響を受けにくいように思われた。対照的に、凍結乾燥手順は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに最も害を及ぼすように思われた。全体として、この技術は、驚くほど良好に機能して、幅広いタンパク質の酵素活性を維持した。タンパク質が水溶液において活性を失う傾向は、使用まで固体形態でこれらを保存することによって克服することができた（Ｍａｎｎｉｎｇ、Ｐａｔｅｌら １９８９）。この技術は、治療部位がタンパク質の再構成に必要な水分をもたらすため、皮膚に特に良好に作用する。さらに、オートミールを担体として使用すると、その抗炎症性及び痒み止め特性を理由に、多くの皮膚状態に有益であろう（Ｆｏｗｌｅｒ ２０１４）。

【0095】

参考文献
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図17E】

【配列表】

2023518377000001.app

【国際調査報告】