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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-01
(54)【発明の名称】標的配列の切断のための最適化された方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230424BHJP
A01K 67/027 20060101ALI20230424BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230424BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20230424BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230424BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20230424BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230424BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230424BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230424BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230424BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
A01K67/027 ZNA
C12N15/11 Z
C12N15/55
C12N15/63 Z
C12N9/16 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022555852
(86)(22)【出願日】2021-03-16
(85)【翻訳文提出日】2022-11-14
(86)【国際出願番号】 GB2021050650
(87)【国際公開番号】W WO2021186163
(87)【国際公開日】2021-09-23
(31)【優先権主張番号】2003814.7
(32)【優先日】2020-03-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】598176569
【氏名又は名称】キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ラッセル，イアン アラスデア
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050DD02
4B050LL01
4B050LL10
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA31
4B065CA44
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は、ガイドＲＮＡ配列を選択する方法、および標的配列のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集におけるそのような配列の使用を提供する。特に、本発明は、ある場合には低いモザイク現象をもたらし、別の場合には大規模な欠失またはノックアウトをもたらす、編集結果の決定された頻度に基づく、ガイドＲＮＡ配列を選択する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸配列のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集における使用のための１つ以上のガイドＲＮＡ配列を選択する方法であって、－ 前記核酸配列を標的化する複数のガイドＲＮＡ配列を特定すること、
－ 前記複数のガイドＲＮＡ配列のそれぞれについて編集結果の頻度を決定すること、および
－ 最も豊富な編集結果の頻度が、２番目に豊富な編集結果の頻度の少なくとも２倍を超えると決定される、１つ以上のガイドＲＮＡ配列を選択すること、
を含む、方法。
【請求項2】
前記複数のガイドＲＮＡ配列のそれぞれについての編集結果の頻度が、コンピュータモデルを使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記核酸配列が遺伝子配列であり、前記方法が、前記複数のガイドＲＮＡ配列を特定する前に、遺伝子の１つまたは複数の一次転写物を特定することをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
遺伝子の最初の約５０％に位置する領域を標的化するガイドＲＮＡ配列を選択することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
遺伝子のすべての主要な転写物中に存在しないオーファンエクソンを標的化するあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記方法が、フレームシフティング変異をもたらすと予測されるガイドＲＮＡ配列を選択することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
各ガイドＲＮＡ配列にオフターゲットスコアを割り当て、スコアが予め定めた閾値未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
各ガイドＲＮＡ配列にオンターゲット活性スコアを割り当て、スコアが予め定めた閾値未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法を使用して選択されたガイドＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ分子を生成することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ガイドＲＮＡ分子がシングルガイドＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
選択された１つ以上のガイドＲＮＡ配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡ分子を使用して細胞の試験集団中の標的配列を編集し、前記細胞における各ガイドＲＮＡ配列と関連する編集結果を決定することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
予測される最も豊富な結果を前記試験集団の細胞中に最も一貫して引き起こすガイドＲＮＡ分子を、前記１つ以上のガイドＲＮＡ分子から選択することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
核酸配列のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集における使用のための一対のガイドＲＮＡ配列を選択する方法であって、－ 前記核酸配列を囲む５’フランクと３’フランクを標的化する複数のガイドＲＮＡ配列を特定すること、
－ 前記複数のガイドＲＮＡ配列のそれぞれについて編集結果の頻度を決定すること、および
－ 前記５’フランクを標的化する第１のガイドＲＮＡおよび前記３’フランクを標的化する第２のガイドＲＮＡを含む一対のガイドＲＮＡ配列であって、それぞれのガイドＲＮＡについて最も豊富な編集結果の頻度が２番目に豊富な編集結果の頻度の４倍未満であると決定される一対のガイドＲＮＡ配列、を選択すること、
を含む、方法。
【請求項14】
請求項２から１２に記載のいずれかの特徴をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
生物、細胞または細胞の集団あるいはセルフリー発現システムにおいて核酸配列を編集するための方法であって、前記方法が、前記核酸配列を含む二本鎖（ｄｓＤＮＡ）を、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを前記核酸配列内の標的配列に誘導することができるガイドＲＮＡ分子に曝露することを含み、ここで、前記ガイドＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集において使用された場合に、２番目に豊富な編集結果の少なくとも２倍を超える頻度を有する主要な編集結果をもたらす（またはもたらすと予測される、例えばコンピュータモデルによってもたらすと予測される）ガイドＲＮＡ配列を含む、方法。
【請求項16】
ガイドＲＮＡ分子が、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法に従って選択されたガイドＲＮＡ配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
ガイドＲＮＡ分子およびＤＮＡエンドヌクレアーゼを細胞または複数の細胞に導入することをさらに含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項18】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、前記核酸配列内の標的配列を切断して二本鎖切断末端を生じさせる、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
前記生物、細胞または細胞の集団が真核生物である、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
生物、細胞または細胞の集団が動物、真菌または植物由来であり、好ましくは前記生物、細胞または細胞の集団が哺乳動物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項22】
細胞が接合体または接合体を形成する細胞の集団である、請求項１９に記載の方法。
【請求項23】
前記方法が、胚をレシピエントの雌の動物に移植して妊娠させることをさらに含み、移植前に前記胚を発生のより後期にまで適宜培養する、請求項２０に記載の方法。
【請求項24】
非モザイクのトランスジェニック動物を生成するためのものである、請求項１３から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
動物が、げっ歯類、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリまたは霊長類である、請求項２２に記載の方法。
【請求項26】
生物、細胞または細胞の集団あるいはセルフリー発現システムにおいて核酸配列を編集するための方法であって、前記方法が、前記核酸配列を含む二本鎖（ｄｓＤＮＡ）を、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを前記核酸配列を囲む５’フランクと３’フランクを標的化させるように誘導することができる一対のガイドＲＮＡ分子に曝露することを含み、ここで、前記一対のガイドＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集において使用された場合に、２番目に豊富な編集結果の頻度の４倍未満である頻度を有する主要な編集結果をもたらす（またはもたらすと予測される、例えばコンピュータモデルによってもたらすと予測される）第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、方法。
【請求項27】
請求項１６から２５に記載のいずれかの特徴をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
請求項１５から２７のいずれか一項に記載の方法によって取得される、細胞、細胞集団およびヒト以外の生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、標的核酸配列中の切断のための部位であって、例えばエンドヌクレアーゼによる切断のための部位を選択する方法に関する。本発明は、ガイドＲＮＡ配列を選択する方法、および標的配列のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集におけるそのような配列の使用を提供する。特に、本発明は、例えばガイドＲＮＡ配列を選択することによる、編集結果の決定された頻度に基づく、切断のための部位を選択する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子編集は、目的の核酸配列中に切断末端（ｂｒｅａｋ）を導入するヌクレアーゼを使用して実施することができる。それらの切断末端の修復中に、自然な修復プロセスによってその配列中に誤りが導入される可能性があり、それによって配列が編集される。例えば、そのようなヌクレアーゼシステムの１つであるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集は、世界中で遺伝子修飾動物の作製に大きな改革をもたらした。しかし、ヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲの技法を使用して作製される細胞集団および遺伝子修飾動物はモザイクであり、細胞集団または動物の組織全体にわたって、意図された標的部位にさまざまな遺伝子編集を含有する。モザイク現象は、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９が意図された標的ＤＮＡを特定し、切断した後に起こるセミランダムな修復に由来する。加えて、多細胞集団、例えば１細胞期（ｏｎｅ－ｃｅｌｌ ｓｔａｇｅ）胚の後に起きるゲノム編集は、新たに形成される編集が、細胞集団、例えば動物全体にわたって一様に分布しないため、さらにモザイク現象の原因となる。要するに、モザイク現象は、個々の二本鎖ＤＮＡ切断末端（ＤＳＢ）の修復が確率的結果を伴う独立したプロセスであるために起こる。従って、複数のＤＳＢが同じ様に修復される見込みは、単細胞中の異なるアレル間であれ、異なる細胞においてであれ、概して非常に少ない。遺伝子が純粋でないとデータの混乱につながるため、モザイク細胞集団または動物は、実験に使用することができない。動物全体にわたって純粋な編集を有するマウスを生成するために、動物中のモザイク現象を複数回の繁殖および戻し交配によって除去する。これはコストがかかり、時間を要するプロセスであり、新規のマウスモデルを作製するごとに、平均で１７０匹のマウスが無駄になる。他の種、例えば非ヒト霊長類および家畜では、繁殖させてモザイク現象を取り去るプロセスに何年もかかる。細胞集団の状況では、単細胞クローニングおよび個々のクローンの拡大のプロセスにより、モザイク現象は除去される。
【0003】
モザイク現象を低減させるための既知の戦略は、起こる独立した編集の総数を制限することを中心に展開している。胚の状況では、これは１細胞期において編集することを意味し、そこでは総編集の数は、正常細胞中では普通１アレルにつき１編集（すなわち二倍体生物中では２編集）に制限される。これを細胞集団において実現するためには、個々に単離された細胞を編集できるか、または編集した集団からの単細胞由来クローニングが必要になるかのいずれかである。どちらの状況でも、編集は１細胞期に限定する必要がある。これまでに試みられたアプローチは、モザイク現象を含有するまたは抑えることに重点を置いている。例えば、編集のプロセスを高速化することによって（例えば、編集が起こり得る前に転写および翻訳の細胞内プロセスが必要な、メッセンジャー（ｍ）ＲＮＡまたはＤＮＡプラスミド中にコードされた編集コンポーネントを有するよりも、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で転写されたｇＲＮＡおよび組換えＣａｓ９タンパク質を使用することにより）；１細胞期（ｏｎｅ－ｃｅｌｌ ｐｈａｓｅ）においてより早期に編集することによって［例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９コンポーネントを極初期の接合体、特にインビトロ受精（ＩＶＦ）によって作製されたものに導入して、２細胞期よりも前の早期に編集を「完了させる」ことを可能にすることにより、または代替的なマイクロインジェクションプロトコール（Lamas-Torazo et al., Nature Scientific Reports, Volume 9, Article number: 14900 (2019)）を使用することにより］；編集ウインドウを積極的に短くカットすることによって（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの分解を加速して２細胞期における編集を回避することにより）；あるいは１細胞期の前に編集することによって（例えば、精原幹細胞、卵母細胞または一倍体のＥＳＣを編集することによる生殖細胞系列修飾）；あるいは、最終的に、正確なゲノム編集の効率を高めることによって（例えば、従来型の効率性に劣る手段よりも長いｓｓＤＮＡを修復ドナーとして使用することにより）（Mehravar et al., Dev Biol.2019 Jan 15;445(2):156-162）。
【0004】
全般的に、これらの戦略は、すべての編集が１細胞期または単細胞内で起こるように、ヌクレアーゼの「活性ウインドウ」を制限することに重点を置いている。これは独立した編集イベントの総数を低減させることを意味するが、モザイク現象の基盤である所与のＤＳＢがどのように修復されるかについての課題には取り組まれていない。そのため、これらの既存のアプローチはいずれも、偶然以外に、モザイク現象を広範に取り除くことはない。
【0005】
モザイク現象の問題はトランスジェニック動物の創出だけに限られるものではなく、治療的状況における課題でもあり、そこでは細胞の集団またはプールにおける異なる変異が、異なる表現型の帰結（例えばインフレーム欠失または意図されない機能獲得変異）を有し得る。その結果、編集された細胞プールの均一性（すなわち、すべての細胞における同じ編集結果）を確実にするためには、プールは、単細胞クローニングした後に個々のクローンを拡大したものでなくてはならない。これは極めてリソースを消費するプロセスであり、さらに、多くの初代細胞タイプ、例えばＴ細胞との適合性がない。これは特定の治療法の作製、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞の作製において著しい障害となるが、そのような医薬品の安全性プロファイルにとっては不可欠であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、これらの課題を念頭に置いて考案された。
【課題を解決するための手段】
【0007】
第１の態様によれば、本発明は、核酸配列における切断のための部位または標的配列を特定する方法を提供する。部位は、例えば、編集された配列の均一性をより良く制御するための、および／または編集された細胞の集団のモザイク現象を低減するための、最適化された切断部位と考えることができる。核酸配列は、例えば、遺伝子配列を含んでもよい。切断は、核酸配列中に二本鎖切断末端、例えば平滑末端化された二本鎖切断末端を生じさせることのできるヌクレアーゼによるものであってもよい。
【0008】
方法は、
－ 核酸配列中で複数の標的配列を特定することであって、切断、例えばヌクレアーゼによる切断に対して標的化することができる標的配列を特定すること、
－ 複数の標的配列のそれぞれについて編集結果の頻度を決定すること、および
－ 切断後に主要な編集結果をもたらすと予測される１つ以上の標的配列を選択すること、
を含む。
－ 核酸配列中で複数の標的配列を特定することであって、切断、例えばヌクレアーゼによる切断に対して標的化することができる標的配列を特定すること、
－ 複数の標的配列のそれぞれについて編集結果の頻度を決定すること、および
－ 切断後に主要な編集結果をもたらすと予測される１つ以上の標的配列を選択すること、
を含む。
【0009】
方法は、遺伝子編集のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを最適化することにおいて特に役立つ。これらの実例ではガイドＲＮＡ配列が標的配列に結合し、それによって標的配列がＣａｓエンドヌクレアーゼによる切断に対して標的化されるため、標的配列はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム中で使用されるガイドＲＮＡ配列によって定義されると理解することができる。従って、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集における核酸配列の使用のために１つ以上のガイドＲＮＡ配列を選択する方法であって、
－ 核酸配列を標的化する複数のガイドＲＮＡ配列を特定すること、
－ 複数のガイドＲＮＡ配列のそれぞれについて編集結果の頻度を決定すること、および
－ 主要な編集結果をもたらすと予測される１つ以上のガイドＲＮＡ配列を選択すること、
を含む、方法を提供する。
－ 核酸配列を標的化する複数のガイドＲＮＡ配列を特定すること、
－ 複数のガイドＲＮＡ配列のそれぞれについて編集結果の頻度を決定すること、および
－ 主要な編集結果をもたらすと予測される１つ以上のガイドＲＮＡ配列を選択すること、
を含む、方法を提供する。
【0010】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、主要な編集結果をもたらすと予測される１つ以上の標的（例えばガイドＲＮＡ）配列を選択する工程は、最も豊富な（すなわち主要な）編集結果の頻度が、２番目に豊富な編集結果の頻度の少なくとも２倍を超えると決定される１つ以上の標的（例えばガイドＲＮＡ）配列を選択することを含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集における１つを超える核酸配列の使用のための、１つを超えるガイドＲＮＡ配列を選択する工程を含んでもよい。そのような実施形態では、適切には、１つを超える核酸配列を標的化し、編集することができる。適切には、１つを超える核酸配列を、同じ方法において、適切には同時に、編集することができる。そのような実施形態では、方法は、複数の核酸配列を標的化する複数のガイドＲＮＡ配列を特定する工程を含んでもよい。適切には（Ｓｕｔｉａｂｌｙ）、そのような実施形態は、ガイドＲＮＡ配列のスタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）と称することができる。
【0012】
本明細書で使用される場合、「編集結果」という用語は、編集プロセス、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集プロセスによってもたらされる遺伝子型（すなわちＤＮＡ配列）のことを指す。
【0013】
以下において、「ガイドＲＮＡ配列」または類似物が言及される場合、それは標的化された核酸切断のための好ましい部位として同様にかつ対応して特定された標的配列に、等しく適用できることは認識されるであろう。従って、「ガイドＲＮＡ配列」が、それがそれ用にデザインされたところのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素またはシステムと組み合わせて言及される場合、これは対応する「標的配列」および「標的配列」を切断する関連ヌクレアーゼを指すと、等しく考えることができる。
【0014】
いくつかの実施形態では、方法は、最も豊富な（すなわち主要な）編集結果の頻度が、２番目に豊富な編集結果の頻度の少なくとも２倍、例えば少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍または少なくとも２０倍を超えると決定される１つ以上の標的またはガイドＲＮＡ配列を選択することを含む。
【0015】
本発明の方法は、従って、主要な（最も豊富な）遺伝子型の頻度と２番目に豊富な遺伝子型の頻度との間の差を最大化する選択プロセスに基づく。これは、以下の式を使用して計算することができる：
［最も豊富な（主要な）編集結果の頻度］／（２番目に豊富な編集結果の頻度）。
［最も豊富な（主要な）編集結果の頻度］／（２番目に豊富な編集結果の頻度）。
【0016】
例えば、所与のガイドＲＮＡ配列を使用する標的配列のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集によってもたらされる主要な（最も豊富な）編集結果は７塩基対欠失であり、５４．４％の頻度を有すると決定する（例えば予測する）ことができる。２番目に豊富な編集結果はシトシンヌクレオチドの１塩基対挿入であり、４．３％の頻度を有すると決定する（例えば予測する）ことができる。この場合、最も豊富な編集結果の頻度は、２番目に豊富な編集結果の頻度の１２．７倍（５４．４／４．３）を超える。
【0017】
好ましい方法では、最も豊富な編集結果（遺伝子型頻度）は、所望の結果、例えば以下でさらに説明する特定のフレームシフト変異である。従って、方法は、主要な編集結果に基づいて選択を決定することにより、所望の結果と２番目に可能性の高い編集の結果との間の倍率変化の差を最大化することができる。
【0018】
本発明者らは、切断のための標的配列を選択する際、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集のためのガイドＲＮＡ配列をデザインする際に、倍率変化メトリックを初めて利用した。特に、細胞集団、例えば多細胞生物中のモザイク現象を低減するまたは取り除くためのガイドＲＮＡ配列の選択において、本メトリックを初めて適用した。本発明者らは、モザイク現象を低減するまたは取り除くには、同じ編集結果が単細胞中の各アレル上で起こるだけでなく、複数の細胞にわたって各アレル上で起こることも必要であると認識している。倍率変化の使用により、均一に編集された細胞の集団の確実な生成が可能となり、これによりモザイク現象を低減するまたは取り除くことができるようになる。
【0019】
複数のガイドＲＮＡ配列のそれぞれについての編集結果の頻度は、コンピュータモデル（例えばマシンラーニングアルゴリズム）を使用して決定することができる。コンピュータモデルは、所与のガイドＲＮＡ配列に対して、編集結果と、各結果の相対的な頻度を予測するように構成することができる。適したコンピュータモデルには、ＦＯＲＥｃａｓＴ（Allen, Nature Biotechnology, Volume 37, Pages 64-72, 2019）、ｉｎＤｅｌｐｈｉ（Shen et al., Nature volume 563, page 646, 2018）およびＬｉｎｄｅｌ（Nucleic Acids Research, Volume 47, Pages 7989-8003, 2019）が含まれる。ＦＯＲＥｃａｓＴモデルはウェブツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｏｒｅｃａｓｔ．ａｐｐ）として利用可能であり、ローカルでも走らせることができる（例えばＲプログラミング言語を使用して）。ｉｎＤｅｌｐｈｉモデルもウェブツールを介して利用可能（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｎｄｅｌｐｈｉ．ｇｉｆｆｏｒｄｌａｂ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／において利用可能）であり、ローカルでも走らせることができる（例えばＰｙｔｈｏｎプログラミング言語において）。Ｌｉｎｄｅｌモデルもウェブツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｄｅｌ．ｇｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／Ｌｉｎｄｅｌ／ｄｏｃｓ／）として利用可能であり、ローカルでも走らせることができる（例えばＰｙｔｈｏｎプログラミング言語を使用して）。加えて、Ｌｉｎｄｅｌモデルは、ＣＲＩＳＰＯＲ ｇｕｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｉｓｐｏｒ．ｏｒｇにおいて利用可能）中に適合されている。
【0020】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、切断部位周囲のマイクロホモロジーの度合が、その部位における切断がどのように修復されるかを決定するのに重要な役割を果たすことを特定した。代替の標的部位のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９切断がどのように修復されるかについての重要な情報が、上記で特定したようなコンピュータモデルの形態で現在利用可能であり、本発明の方法によれば、その情報を使用して、所望の編集結果を予測し、選択することができる。しかし、それらの部位における切断がどのように修復されるかを決定するために重要であるのは切断部位の性質であるため、本発明の方法は、代替の方法、例えばＴＡＬＥＮまたはＺＦＮを含む代替のヌクレアーゼを使用する方法によって実施される切断にも関し得る。代替のヌクレアーゼを使用するそのような方法では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９切断に基づくコンピュータモデル、例えば上記のものを、例えば、主要な編集結果を有する標的配列を特定するために使用することができ、その後、それらの配列をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９：ガイドＲＮＡシステムを使用して切断する代わりに、配列を、代替のヌクレアーゼ、例えば、それらの配列を標的化するようにデザインされたＴＡＬＥＮまたはＺＦＮを使用して、切断することができる。所与の標的配列がどのように修復されるかについての決定は、これらの配列を切断のために標的化し、編集結果を配列決定することによって、細胞中での直接的な実験法を介して実験的にも決定することができることは認識されるであろう。
【0021】
従って、いくつかの実施形態では、方法は、コンピュータモデルを使用して、複数の標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列のそれぞれの編集結果を予測することを含む。コンピュータモデルを使用する方法および関連する計算は、単一の場所にある１台以上のコンピュータ、例えば単一の場所にあるデスクトップ・コンピュータまたはサーバ上で実施してもよく、あるいはコンピュータモデルを使用する方法および関連する計算は、例えばインターネットを使用するまたはクラウドベースのサーバ上で計算を実施するなどして、異なる場所にわたって実施してもよい。コンピュータモデル、例えばマシンラーニングツールからの利益は、望ましい修復結果パターンをもたらすであろう標的配列すなわちガイドＲＮＡの選択をそれらが加速することである。しかし、例えば、複数の標的配列において細胞を編集するかまたは目的の核酸配列を標的化する複数のガイドＲＮＡ配列を使用して細胞を編集し、得られたＤＮＡを配列決定して編集結果の幅を決定し、配列決定したアウトプットに基づいて標的配列またはガイドを選ぶことにより、同じ結果を実験的に得ることができるであろうことは認識されるであろう。編集結果の幅は、異なる起源の細胞間で高度に類似することが一般的に認識されている。ＤＮＡ修復経路の忠実度に違いが存在する細胞タイプ、例えば、基本的なＤＮＡ修復遺伝子が変異していたり、または化学的手段による撹乱を受けていたりする細胞タイプでは、検討中の特定の細胞タイプにおいてＤＮＡ修復結果を決定する必要があり得ることは認識されるであろう。
【0022】
従って、いくつかの実施形態では、複数の標的配列のそれぞれについて編集結果の頻度を決定する工程は、目的のヌクレアーゼを使用して複数の標的配列のそれぞれにおいて編集を実施すること、および各編集プロセスによってもたらされるＤＮＡを配列決定すること、を含む。同様に、複数のガイドＲＮＡ配列のそれぞれについて編集結果の頻度を決定する工程は、複数のガイドＲＮＡ配列のそれぞれを使用して核酸配列のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集を実施すること、および各編集プロセスによってもたらされるＤＮＡを配列決定すること、を含んでもよい。
【0023】
当分野において知られているように、モザイク現象は、エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの切断後に二本鎖切断末端（ＤＳＢ）を修復する働きをする細胞機構の作用に由来する。ドナーテンプレート非存在下では、これらの修復機構［非相同末端結合（ＮＨＥＪ）およびマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）を含む］は不完全であり、多くの場合１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入（まとめて「インデル」と称する）につながり、結果として変異をもたらす。カット部位は必ずしも同様に修復されるとは限らず、所与の部位の切断は、さまざまな相対頻度を伴って出現するさまざまな遺伝子型を生じ得る。ガイドＲＮＡは、それらの標的部位のＣａｓ切断後に、特徴的なパターンの編集結果を生じさせることが知られている。これらのパターンはランダムでなく、ガイドがどのような細胞において使用されようとも、所与のガイド配列からは同じ分布の編集が通常は生じることになる。例えば、所与のガイドＲＮＡ配列が、編集結果の４０％において７塩基対欠失、編集結果の２０％において１塩基対欠失、編集結果の２０％において１塩基対欠失、編集結果の１０％において２塩基対挿入、および残りの１０％において別の編集結果または編集結果なしのいずれか、の結果を与えると見出される場合がある。よって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集を細胞の集団に適用する場合、修復プロセスによって異なる細胞中に異なる変異がもたらされる可能性があり、集団にわたって編集結果のモザイクが生じ得る。ＤＳＢ修復における誤りが、カット部位周囲のＤＮＡ配列のマイクロホモロジーによって影響されることが最近見出された。ホモロジーの低いＤＮＡ配列は、全体として幅広い編集結果を与えるように修復されるが、ホモロジーの高いエリアは、全体としてより幅の狭い編集結果へと修復される。本発明者らは、驚くべきことに、この結果を利用してモザイク現象を低減するまたは取り除くことができることを見出した。
従って、最も豊富な（主要な）遺伝子型（すなわち編集結果）の頻度と２番目に豊富な遺伝子型（すなわち編集結果）の頻度との間の比率を最大化することにより、単一の主要な編集結果を達成することができる。
従って、最も豊富な（主要な）遺伝子型（すなわち編集結果）の頻度と２番目に豊富な遺伝子型（すなわち編集結果）の頻度との間の比率を最大化することにより、単一の主要な編集結果を達成することができる。
【0024】
モザイク現象を低減させることに対する既存のアプローチは、所与のＤＳＢがどのように修復されるかを規定する局所的なＤＮＡアーキテクチャおよびＤＮＡの特徴を考慮していない。これらのアプローチは、局所的なＤＮＡアーキテクチャおよび特徴によって情報が与えられるＤＳＢの解消（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）よりも、ヌクレアーゼ作用およびＤＳＢの生成のタイミングに重点を置いている。対照的に、本発明は、ＤＢＳの解消は局所的なＤＮＡの特徴に影響されるという理解に基づき、ＤＳＢがどのように解消されるかに重点を置いている。本発明は、より独立したＤＳＢを同じ様式で形成し、修復することを可能にする（同じ細胞内または分離した複数の細胞内において）。実際面では、ＤＳＢがどのように修復されるかを制御するということは、編集がもはや単細胞集団、例えば胚発生の１細胞期または個々に単離された細胞に限られなくなることを意味する。
【0025】
核酸配列を標的化する複数のガイドＲＮＡ配列は、当業者に知られている任意の適した技術によって特定することができる。潜在的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的領域（およびそれに対応するガイド配列）は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）への近接性によって特定することができる。例えば、所与の遺伝子を標的化する、可能性のあるすべてのガイドＲＮＡ配列は、公的に利用可能なソフトウェア、例えばＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ、Ｄｅｓｋｇｅｎ、ＣＲＩＳＰＯＲまたはＬｉｎｄｅｌを使用して特定することができる。同様に、可能性のある標的配列は、切断機構の特徴、例えば切断のために使用されるヌクレアーゼに従って特定することができる。
【0026】
いくつかの実施形態では、方法は、遺伝子のコード配列を標的化する複数の標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列を特定することを含む。
【0027】
モザイク現象を取り除く代替手段として、局所的なホモロジーが編集結果に影響を及ぼすという知見を、大規模な欠失または「ノックアウト」を実行するために利用することもできる。マイクロホモロジーの高いエリアを標的化するｇＲＮＡを選んで幅の狭い編集を確実にしてモザイク現象を低減するのではなく、本発明者らは、マイクロホモロジーの低い領域を標的化するｇＲＮＡのペアを選ぶことが、欠失を実行するために使用できることを見出した。そのような欠失は、遺伝子配列の一部を切除し、モザイク現象が低減したモデルと等しく有用なノックアウトモデルを作製するために使用することができる。そのような方法は、本明細書における本発明の第２の態様において記載される。
【0028】
従って、いくつかの実施形態では、方法は、遺伝子の非コード配列を標的化する複数の標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列を特定することを含む。例えば、エクソン全体を切除してノックアウトを引き起こすために、エクソンの両側のイントロンを標的化することが望ましい場合がある。方法は、遺伝子間領域または他の非コード「遺伝子」、例えばｍｉＲＮＡまたは他の非コードＲＮＡクラス（ｌｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）を標的化することを含んでもよい。方法は、基本的な調節エレメント、例えばエンハンサー領域を標的化することを含んでもよい。
【0029】
標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列を特定することの前に、方法は、標的化すべき遺伝子の１つまたは複数の一次転写物を特定することをさらに含んでもよい。所与の遺伝子の１つまたは複数の一次転写物は、公的に利用可能なゲノミクスツール、例えばＥｎｓｅｍｂｌを使用して決定することができる。
【0030】
いくつかの実施形態で、方法は、遺伝子（またはそのコード配列）の最初の４０％～７０％または最初の５０～６０％に位置する領域を標的化する（すなわち、に相補的な）標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列を選択することをさらに含む。遺伝子の残りの部分を標的化する標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列は除外してもよい。
【0031】
いくつかの実施形態では、遺伝子（またはそのコード配列）の最初の４０％～７０％（例えば最初の約５０％）を標的化する標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列を選択する工程は、便宜上、標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列の編集結果を決定する工程より前に実施されてもよい。遺伝子の上流部分（例えば前半）を標的化すると、遺伝子によってコードされるタンパク質の基本的な機能ドメインを取り除ける可能性が増加する。
【0032】
いくつかの実施形態では、方法は、フレームシフティング変異をもたらすと決定または予測される標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列を選択することをさらに含む。タンパク質は、ＲＮＡ／ＤＮＡのトリプレットからコードされているため、編集が３の倍数になる確率は３回中１回あり、その場合は遺伝子のフレームは変化しない。これにより、場合によっては機能タンパク質の発現がもたらされる。従って、カット部位の下流のＤＮＡが元の配列のフレームとは合わないように、フレームシフティングを引き起こす標的配列すなわちガイドＲＮＡを選択することが有利であり得る。
【0033】
最も豊富な（すなわち主要な）編集結果が、３の倍数となる複数のヌクレオチドの挿入または欠失と決定されないまたは予測されない配列を選択することにより、フレームシフティングを選択することができる。
【0034】
フレームシフティングを回避することが望ましい場合があることは認識されるであろう。例えば、タンパク質の機能を消失させるために、タンパク質からいくつかのアミノ酸を欠失させることが望ましい場合もある。従って、いくつかの実施形態では、方法は、フレームシフティング変異を回避すると決定または予測される標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列を選択することを含む。最も豊富な編集結果が、３の倍数となる複数のヌクレオチドの挿入または欠失と決定または予測される標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列を選択することにより、非フレームシフティング変異を選択することができる。
【0035】
いくつかの実施形態では、方法は、コンピュータモデルを使用して、標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列のそれぞれにフレームシフティングスコアを割り当てることを含んでもよい。次いで、最も望ましいフレームシフティングスコアを有する配列が選択されてもよい。
【0036】
例えば、コンピュータモデルのＬｉｎｄｅｌを使用して、所与のガイドＲＮＡ配列について「フレームシフト％」スコアを決定することができる。フレームシフト％スコアは、編集が、非フレームシフティング変異、１ヌクレオチドのフレームシフトまたは２ヌクレオチドのフレームシフトのいずれかをもたらす確率を示す。例えば、＋０＝３３．３％、＋１＝３３．３％、＋２＝３３．３％の比率は、編集が、配列を、それぞれインフレーム、１塩基対ずれたフレーム、または２塩基対ずれたフレームのいずれかに動かす機会が等しいことを意味する。いくつかの実施形態では、方法は、選択されたガイドＲＮＡが、結果をフレームシフティング編集に偏らせると予測されるように、非フレームシフト％スコアが約３３％未満（例えば３３．３％未満）のガイドＲＮＡを選択することを含む。一部の他の実施形態では、例えば、インフレーム欠失が望ましい場合には、方法は、非フレームシフト％スコアが約３３％を超える（例えば３３．３％を超える）ガイドＲＮＡを選択することを含んでもよい。
【0037】
いくつかの実施形態では、方法は、すべての主要な転写物中に存在しないオーファンエクソンを標的化するあらゆる標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列を除外することをさらに含む。真核細胞では、一部の遺伝子は、エクソンのすべてを真に共有する複数の転写物を有する。従って、真核細胞中で目的の遺伝子のノックアウトを創出することが望まれる実施形態では、遺伝子の発現が完全に取り除かれるのを確実にするために、すべての転写物に共通する遺伝子のエリアを標的化することが有利な場合がある。これに対する例外は、オーファンエクソンの存在によって特徴付けられる特定のアイソフォームをノックアウトすることが望ましい場合であり、従って、一部の実施形態は、遺伝子の転写物から、オーファンエクソンまたはその一部を除外することを促進する標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列を選択することを含んでもよい。
【0038】
いくつかの実施形態では、方法は、各標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列にオフターゲットスコアを割り当てること、およびスコアが予め定めた閾値未満のあらゆる配列を除外することをさらに含む。これは、標的配列以外の部位におけるゲノムの望まれない編集を回避する助けとなる。
【0039】
標的配列およびガイドＲＮＡ配列に、コンピュータモデルまたはアルゴリズムを使用してオフターゲットスコアを割り当てることができる。適したモデルが当業者に知られており、それにはＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ、ＣＲＩＳＰＯＲおよびＤｅｓｋｇｅｎが含まれる。これらのモデルは、Hsu et al., Nature Biotechnology volume 31, pages 827-832 (2013)によって記載されるアルゴリズムに基づく。
【0040】
いくつかの実施形態では、各ガイドＲＮＡ配列には、１～１００のオフターゲットスコアが割り当てられ、ここで、スコア１は何百、または何千ものオフターゲットを表し、スコア１００はオフターゲットがないことを表す。方法は、スコアが８０未満、７０未満、６０未満、５０未満または４０未満のガイドＲＮＡ配列を除外することを含んでもよい。オフターゲットスコアは、本明細書に記載のコンピュータモデルまたはアルゴリズムを使用して計算することができる。
【0041】
いくつかの実施形態では、方法は、各標的配列すなわちガイドＲＮＡ配列にオンターゲット活性スコアを割り当てること、およびスコアが予め定めた閾値未満のあらゆる配列を除外することをさらに含む。オンターゲット活性スコアは、ガイド配列が、所与の部位においてどれだけうまくカットしそうであるかを予測するために使用される。
【0042】
コンピュータモデルまたはアルゴリズムを、例えばウェブプラットフォーム上で使用して、ガイドＲＮＡ配列にオンターゲット活性スコアを割り当てることができる。適したウェブプラットフォームが当業者に知られており、それにはＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ、ＣＲＩＳＰＯＲ、Ｄｅｓｋｇｅｎが含まれる。適したモデルは、Doench et al., Nature Biotechnology volume 34, pages 184-191(2016)またはMoreno-Mateos et al, Nature Methods volume 12, pages 982-988 (2015)によって記載されるメトリックに基づいてもよい。
【0043】
いくつかの実施形態では、各ガイドＲＮＡ配列には、１～１００のオンターゲット活性スコアが割り当てられ、ここで、スコア１００はヌクレオチド配列に基づいて予測される最高活性を表し、スコア１は予測される最低活性を表す。方法は、スコアが５０未満、４０未満、３０未満または２０未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外することを含んでもよい。オンターゲットスコアは、本明細書に記載のコンピュータモデルまたはアルゴリズムを使用して計算することができる。
【0044】
本発明の第１の態様に従ってガイドＲＮＡ配列を使用する方法は、以下のすべての工程またはそれらの任意の組合せを含んでもよい：目的の遺伝子（またはそのコード配列であってもよい）の最初の４０～７０％（例えば５０％）に位置する領域を標的化するガイドＲＮＡ配列を選択すること；フレームシフティング変異をもたらすまたは回避すると決定または予測されるガイドＲＮＡ配列を選択すること；すべての主要な転写物中に存在しないオーファンエクソンを標的化するあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外すること；各ガイドＲＮＡ配列にオフターゲットスコアを割り当て、スコアが予め定めた閾値未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外すること；ならびに各ガイドＲＮＡ配列にオンターゲット活性スコアを割り当て、スコアが予め定めた閾値未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外すること。これらの工程を、任意の順番で実施することができることは認識されるであろう。複数のガイドＲＮＡ配列のそれぞれについて編集結果の頻度を決定する工程の前または後に、これらの工程の一部またはすべてを実施してもよい。各工程が実施されることにより、それに続く工程における分析から一部のガイドＲＮＡ配列の除外がもたらされ得ることがさらに認識されるであろう。よって、遺伝子またはコード配列を標的化するとして特定されるすべてのガイドＲＮＡ配列が、必ずしも方法の各工程において分析されるとは限らない。潜在的な分析されるガイドＲＮＡ配列の数は、追加の工程が実施されるごとに減少し得る。
【0045】
いくつかの実施形態では、遺伝子のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集における使用のための１つ以上のガイドＲＮＡ配列を選択する方法は、
－ 遺伝子（またはそのコード配列）を標的化する複数のガイドＲＮＡ配列を特定すること、
－ 適宜、遺伝子（またはそのコード配列）の最初の約５０％に位置する領域を標的化するガイドＲＮＡ配列を選択すること（これらの実施形態では、遺伝子の次の約５０％を標的化するガイドＲＮＡ配列は、それに続く分析から除外される）、
－ 適宜、すべての主要な転写物中に存在しないオーファンエクソンを標的化するあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外すること、
－ 複数のガイドＲＮＡ配列のそれぞれについて編集結果の頻度を決定すること、および
－ 最も豊富な（すなわち主要な）編集結果の頻度が、２番目に豊富な編集結果の頻度の少なくとも２倍を超えると決定される、１つ以上のガイドＲＮＡ配列を選択すること、
－ 適宜、フレームシフティング変異をもたらすと決定または予測されるガイドＲＮＡ配列を選択すること（インフレーム変異をもたらすと決定または予測されるガイドＲＮＡ配列はそれに続く分析から除外される）、
－ 適宜、各ガイドＲＮＡ配列にオフターゲットスコアを割り当て、スコアが予め定めた閾値未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外すること、ならびに
－ 適宜、各ガイドＲＮＡ配列にオンターゲット活性スコアを割り当て、スコアが予め定めた閾値未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外すること、
を含む。
－ 遺伝子（またはそのコード配列）を標的化する複数のガイドＲＮＡ配列を特定すること、
－ 適宜、遺伝子（またはそのコード配列）の最初の約５０％に位置する領域を標的化するガイドＲＮＡ配列を選択すること（これらの実施形態では、遺伝子の次の約５０％を標的化するガイドＲＮＡ配列は、それに続く分析から除外される）、
－ 適宜、すべての主要な転写物中に存在しないオーファンエクソンを標的化するあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外すること、
－ 複数のガイドＲＮＡ配列のそれぞれについて編集結果の頻度を決定すること、および
－ 最も豊富な（すなわち主要な）編集結果の頻度が、２番目に豊富な編集結果の頻度の少なくとも２倍を超えると決定される、１つ以上のガイドＲＮＡ配列を選択すること、
－ 適宜、フレームシフティング変異をもたらすと決定または予測されるガイドＲＮＡ配列を選択すること（インフレーム変異をもたらすと決定または予測されるガイドＲＮＡ配列はそれに続く分析から除外される）、
－ 適宜、各ガイドＲＮＡ配列にオフターゲットスコアを割り当て、スコアが予め定めた閾値未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外すること、ならびに
－ 適宜、各ガイドＲＮＡ配列にオンターゲット活性スコアを割り当て、スコアが予め定めた閾値未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外すること、
を含む。
【0046】
第２の態様では、本発明の方法は、２つの標的部位の間のＤＮＡストレッチの欠失を生成するための改善されたシステムをデザインするために、使用することができる。そのような方法は、欠失を意図するＤＮＡ配列の５’フランクと３’フランクを標的化する上記のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのためのガイドＲＮＡを選ぶことを含み得るが、２つの切断部位の間に介在するＤＮＡ配列の欠失によって切断が優先的に修復されるように、多くの編集結果を伴うガイドを特定することを含む（切断に対して標的化される配列が全体として低いマイクロホモロジーによって特徴付けられるように）。欠失させるべきＤＮＡに隣接する標的配列は、２０ｂｐ、２００ｂｐ、２０００ｂｐを超えても、または２Ｍｂを超える距離で分離されていてもよい。
【0047】
そのような、大きなＤＮＡ配列のストレッチを欠失させるための改善された方法では、標的配列の切断からの最も豊富な結果の頻度は、２番目に豊富な結果の頻度の４倍未満、３倍未満、２倍未満、１．５倍未満であってもよく、最も豊富な結果の頻度は、３番目、４番目または５番目に豊富な結果の２倍未満であってもよく、例えば２．５倍未満であっても、３倍未満であってもまたは４倍未満であってもよい。一実施形態では、最も豊富な結果の頻度は、２番目に豊富な結果の２倍未満であってもよい。一実施形態では、最も豊富な結果の頻度は、３番目に豊富な結果の２倍未満であってもよい。
【0048】
それらの方法は、各ガイドＲＮＡ配列にオフターゲットスコアを割り当てることおよびスコアが予め定めた閾値未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外すること、例えば、オフターゲットスコアが５０未満、４０未満、３０未満または２０未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外することをさらに含んでもよい。さらに、それらの方法は、各ガイドＲＮＡ配列にオンターゲットスコアを割り当てることおよびスコアが予め定めた閾値未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外すること、例えば、オンターゲットスコアが８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満または３０未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外することを含んでもよい。当然ながら、フレームシフティングスコア、および切断部位の位置が遺伝子の前半部分にあることは、大きなＤＮＡ配列のストレッチを欠失するためのそのような方法においては、あまり重要でなくてもよい。
【0049】
従って、一実施形態では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集における核酸配列の使用のために一対のガイドＲＮＡ配列を選択する方法であって、
－ 核酸配列を囲む５’フランクと３’フランクを標的化する複数のガイドＲＮＡ配列を特定すること、
－ 複数のガイドＲＮＡ配列のそれぞれについて編集結果の頻度を決定すること、および
－ ５’フランクを標的化する第１のガイドＲＮＡおよび３’フランクを標的化する第２のガイドＲＮＡを含む一対のガイドＲＮＡ配列であって、それぞれのガイドＲＮＡについて最も豊富な編集結果の頻度が２番目に豊富な編集結果の頻度の４倍未満であると決定される一対のガイドＲＮＡ配列、を選択すること、
を含む方法、を含んでもよい。
－ 核酸配列を囲む５’フランクと３’フランクを標的化する複数のガイドＲＮＡ配列を特定すること、
－ 複数のガイドＲＮＡ配列のそれぞれについて編集結果の頻度を決定すること、および
－ ５’フランクを標的化する第１のガイドＲＮＡおよび３’フランクを標的化する第２のガイドＲＮＡを含む一対のガイドＲＮＡ配列であって、それぞれのガイドＲＮＡについて最も豊富な編集結果の頻度が２番目に豊富な編集結果の頻度の４倍未満であると決定される一対のガイドＲＮＡ配列、を選択すること、
を含む方法、を含んでもよい。
【0050】
一実施形態では、本方法は、核酸配列のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ欠失における使用のための一対のガイドＲＮＡ配列を選択する方法である。適切には、核酸配列を欠失させることを意図している。
【0051】
一実施形態では、方法は、核酸配列の５’フランクを標的化する複数のガイドＲＮＡ配列を特定すること、および核酸配列の３’フランクを標的化する複数のガイドＲＮＡ配列を特定することを含む。
【0052】
さらなる実施形態では、本発明は、生物、細胞または細胞の集団あるいはセルフリー発現システムにおいて核酸配列を編集するための方法であって、方法が、核酸配列を含む二本鎖（ｄｓＤＮＡ）を、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを核酸配列を囲む５’フランクと３’フランクを標的化させるように誘導することができる一対のガイドＲＮＡ分子に曝露することを含み、ここで、一対のガイドＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集において使用された場合に、２番目に豊富な編集結果の頻度の４倍未満である頻度を有する主要な編集結果をもたらす（または、例えばコンピュータモデルによってもたらすと予測される）第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡを含む、方法を含む。
【0053】
一実施形態では、両方のガイドＲＮＡ分子が、２番目に豊富な編集結果の頻度の４倍未満である頻度を有する主要な編集結果をもたらす（または例えばコンピュータモデルによってもたらすと予測される）。
【0054】
一実施形態では、核酸配列を１つを超えるＣａｓエンドヌクレアーゼ、適切には少なくとも２つのＣａｓエンドヌクレアーゼに曝露する。いくつかの実施形態では、核酸配列を、例えば細胞内で、複数のＣａｓエンドヌクレアーゼに曝露してもよい。
【0055】
適切には、一対のガイドＲＮＡ分子が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたは各Ｃａｓエンドヌクレアーゼを、核酸配列を囲む５’フランクと３’フランクを標的化させて切断させるように誘導することができる。
【0056】
適切には、一対のガイドＲＮＡ分子が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたは各Ｃａｓエンドヌクレアーゼを、核酸配列を囲む５’フランクと３’フランクを標的化させて切断させて２つの二本鎖切断末端を生じさせるように誘導することができる。適切には、二本鎖切断末端を、核酸配列を囲む５’フランクと３’フランク内に生じさせる。適切には、二本鎖切断末端を、核酸配列の両側において生じさせる。
【0057】
適切には核酸配列は除去される。適切には、Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたは各Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、核酸配列を囲む５’フランクと３’フランクを標的化し、切断した後に、核酸配列は除去される。
【0058】
一実施形態では、方法は、生物、細胞または細胞の集団あるいはセルフリー発現システムにおいて核酸配列を欠失させるための方法である。
【0059】
適切には、そのような実施形態における核酸配列は、欠失させることが望ましい配列である。適切には、欠失させることが望ましい配列は任意の配列であってもよい。適切には、配列はコード領域または非コード領域内にあってもよい。適切には、配列は、遺伝子配列の全体または一部、あるいは調節エレメントを含んでもよい。適した調節エレメントには、シスまたはトランスの調節エレメントが含まれる。欠失させてもよい適したシス調節エレメントには、エンハンサー、サイレンサー、プロモーター、インスレーターをコードする核酸配列が含まれる。欠失させてもよい適したトランス調節エレメントには、転写因子、ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＰ、ＳＲタンパク質、ＤＮＡ編集タンパク質をコードする核酸配列が含まれる。
【0060】
一実施形態では、欠失させることが望ましい核酸配列には、エクソンが含まれる。適切には、エクソンはコードエクソンであってもよい。適切には、エクソンは、前記エクソンの除去がその遺伝子のコード配列中にフレームシフトを引き起こすことになる「クリティカルなエクソン」であってもよい。適切には、そのような実施形態では、一対のｇＲＮＡが、Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたは各Ｃａｓエンドヌクレアーゼを、クリティカルなエクソンを囲む５’フランクと３’フランクを標的化させるように誘導する。適切には、クリティカルなエクソンとは、除去された場合に、核酸配列の残りの部分におけるコドンのフェージング（ｃｏｄｏｎ ｐｈａｓｉｎｇ）を破壊し、フレームシフト変異を引き起こす１つ以上のエクソンのことを指す。適切には、結果として生じるフレームシフト変異は、核酸の残りの部分のコード配列の破壊をもたらす。
【0061】
一実施形態では、そのような配列には、有害または病的核酸配列が含まれていてもよい。適切には、そのような配列には、疾患を引き起こすまたはそれに関与する分子をコードする核酸配列が含まれていてもよい。例えば、核酸配列は、遺伝性障害を引き起こすタンパク質の突然変異型をコードしていてもよく、または核酸配列は、遺伝性障害をもたらすタンパク質の発現を増加させるように作用するエンハンサーエレメントをコードしていてもよい。あるいは、配列には、その欠失が研究の対象となる核酸配列が含まれていてもよい。適切には、核酸配列の欠失は疾患を引き起こす。適切には、そのような配列を欠失させることにより、疾患モデルを創出する。
【0062】
一実施形態では、そのような配列は、修飾すべき細胞または生物に対して内在性または外来性であってもよい。適切には、欠失させることが望ましい核酸配列は、修飾すべき細胞または生物に対して外来性であってもよい。適切には、外来性の核酸配列は、トランスジェニックまたは異種の核酸配列であってもよい。適切には、そのような実施形態では、異種またはトランスジェニック核酸配列はそれ以前のプロセスによってＤＮＡ中に組み込まれていてもよく、それがその後の段階において除去されることが望ましい。
【0063】
適切には、５’フランクを標的化する第１のガイドＲＮＡは、５’フランク内の配列を標的化し、適切には、３’フランクを標的化する第２のガイドＲＮＡは、３’フランク内の配列を標的化する。「５’フランク」は、欠失させるべき核酸配列の前にあるヌクレオチド配列を意味する。「３’フランク」は、欠失させるべき核酸配列の後にあるヌクレオチド配列を意味する。適切には、５’から３’の順において。適切には直前または直後において。適切には、５’フランクおよび３’フランクは、それぞれ、核酸配列の５’末端および３’末端から最大１ｋｂ、最大５００ｂｐ、最大４００ｂｐ、最大３００ｂｐ、最大２００ｂｐ、最大１００ｂｐ、最大５０ｂｐ、最大４０ｂｐ、最大３０ｂｐ、最大２０ｂｐ、最大１０ｂｐを含むと考えることができる。適切には、第１のガイドＲＮＡによって標的化される配列は、核酸配列の５’末端から最大１ｋｂ、最大５００ｂｐ、最大４００ｂｐ、最大３００ｂｐ、最大２００ｂｐ、最大１００ｂｐ、最大５０ｂｐ、最大４０ｂｐ、最大３０ｂｐ、最大２０ｂｐ、最大１０ｂｐを含む５’フランク内にある。適切には、第２のガイドＲＮＡによって標的化される配列は、核酸配列の３’末端から最大１ｋｂ、最大５００ｂｐ、最大４００ｂｐ、最大３００ｂｐ、最大２００ｂｐ、最大１００ｂｐ、最大５０ｂｐ、最大４０ｂｐ、最大３０ｂｐ、最大２０ｂｐ、最大１０ｂｐを含む３’フランク内にある。適切には、５’フランクおよび３’フランクは、核酸配列の両端に隣接していてもよく、適切には、それぞれ核酸配列の５’末端および３’末端に隣接していてもよい。
【0064】
欠失させるべき核酸配列は、２０ｂｐ、２００ｂｐ、２０００ｂｐの長さを超えても、または２Ｍｂの長さを超えてもよい。
【0065】
一実施形態では、５’フランクおよび３’フランクには、マイクロホモロジーの低い配列が含まれる。一実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、５’フランク内のマイクロホモロジーが低い配列を標的化する。一実施形態では、第２のガイドＲＮＡは、３’フランク内のマイクロホモロジーが低い配列を標的化する。
【0066】
一実施形態では、それぞれのガイドＲＮＡについて、最も豊富な編集結果の頻度は、２番目に豊富な編集結果の頻度の４倍未満である、３倍未満である、２．５倍未満である、２倍未満である、１．５倍未満であると決定される。一実施形態では、それぞれのガイドＲＮＡについて、最も豊富な編集結果の頻度は、２番目に豊富な編集結果の頻度にほぼ等しいと決定される。
【0067】
一実施形態では、それぞれのガイドＲＮＡについて、最も豊富な編集結果の頻度は、その他の編集結果の頻度の４倍未満である、３倍未満である、２．５倍未満である、２倍未満である、１．５倍未満であると決定される。一実施形態では、それぞれのガイドＲＮＡについて、最も豊富な編集結果の頻度は、その他の編集結果の頻度にほぼ等しいと決定される。
【0068】
本発明は、本第２の態様に従ってデザインされたシステムも提供する。
【0069】
第３の態様では、本発明の方法は、異種配列を標的ＤＮＡのストレッチ内に組み入れるための改善されたシステムをデザインするために使用することができる。すなわちそれらを「ノックイン」実験のために使用することができる。そのような方法は、（ｉ）ＤＮＡ配列を標的化する上記のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのためのガイドＲＮＡを選ぶが、多くの編集結果を伴うガイドを特定すること（切断に対して標的化される配列が全体として低いマイクロホモロジーによって特徴付けられるように）、および（ｉｉ）ドナー配列の組入れによって切断が優先的に修復されるように、標的領域に導入されるべきドナー配列の各末端にマイクロホモロジーを設計し、カット部位とノックイン鋳型との間にマイクロホモロジーの高い人工領域を創出すること、を含んでもよい。
【0070】
そのような、異種配列を標的ＤＮＡのストレッチ内に組み入れるための改善された方法では、最も豊富な結果の頻度は、２番目に豊富な結果の頻度の１．５倍未満であってもよく、最も豊富な結果の頻度は、５番目に豊富な結果の２倍未満であってもよく、例えば２．５倍未満であっても、３倍未満であっても、または４倍未満であってもよい。それらの方法は、各ガイドＲＮＡ配列にオフターゲットスコアを割り当てることおよびスコアが予め定めた閾値未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外すること、例えば、オフターゲットスコアが５０未満、４０未満、３０未満または２０未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外することをさらに含んでもよい。さらに、それらの方法は、各ガイドＲＮＡ配列にオンターゲットスコアを割り当てることおよびスコアが予め定めた閾値未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外すること、例えば、オンターゲットスコアが８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満または３０未満のあらゆるガイドＲＮＡ配列を除外することを含んでもよい。当然ながら、フレームシフティングスコアおよび切断部位の位置が遺伝子の前半部分にあることは、異種配列を標的ＤＮＡのストレッチ内に組み入れるためのそのような方法においては、あまり重要でなくてもよい。
【0071】
インデル形成よりも、ＤＳＢにおけるドナー核酸分子の組込みに偏らせるために、人工のマイクロホモロジーをドナー分子中に設計してもよい。ドナー分子の配列をジヌクレオチド、トリヌクレオチドまたはより長いマイクロホモロジーのストレッチを含むように変えてもよく、それはＤＳＢの３０ｂｐ上流（５’）または下流（３’）内である。マイクロホモロジーのストレッチを、ドナー分子内の任意の位置に組み入れてもよい。これらの方法は、それらが組み入れられる遺伝子のコード配列が保存されるマイクロホモロジー領域の包含を、さらに含んでもよい。これらの場合、ドナー配列によって目的を持って導入される意図的な変化（例えば、疾患を引き起こす変異、活性化変異または不活性化変異）以外に、タンパク質配列を意図的でなく破壊することはない。
【0072】
天然のＤＮＡのフランクおよび人工的に設計されたマイクロホモロジーを有するＤＮＡのフランクから成る、カット部位において新たに形成された配列は、切断された場合、上記で述べたのと同様に、２番目に多く予測される編集結果の２倍以上の主要な編集結果を生成すると予測される。設計されたマイクロホモロジーのストレッチの予測される編集結果を決定するために、コンピュータモデル、例えばＬｉｎｄｅｌなどを使用することができる。これは、設計されたマイクロホモロジーを細胞に導入し、これを標的化して切断し、編集結果を配列決定することによる細胞内での直接的な実験法を介して、実験的にも決定できることは認識されるであろう。
【0073】
本発明は、本第３の態様に従ってデザインされたシステムも提供する。
【0074】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載の方法を使用して選択されたガイドＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ分子を生成することをさらに含む。本明細書に記載のガイドＲＮＡ配列を選択する方法は、選択プロセスにおいて適用されるクライテリアを満たしかつＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集において使用することができる可能性のあるいくつかのガイドＲＮＡ配列をもたらし得る。従って、いくつかの実施形態では、方法は、複数の（例えば２、３、４、５、８、１０またはそれを超える）ガイドＲＮＡ分子を生成することを含んでもよい。次に、ガイドＲＮＡ分子を試験してもよい。
【0075】
いくつかの実施形態では、方法は、選択された１つまたは複数のガイドＲＮＡ配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡ分子を試験して、標的配列のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集によってもたらされる１つまたは複数の編集結果すなわち遺伝子型を決定することをさらに含む。ガイドＲＮＡ分子を使用して標的配列のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集を実施し（例えば適した細胞株、例えばマウスＥＳ細胞において）、次いで編集された配列を配列決定することにより、ガイドＲＮＡ分子を試験することができる。
【0076】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集および／またはそれに続く配列決定は、本明細書に記載のプロトコールを使用して実施してもよい。編集プロセスの後に、ゲノムのＤＮＡを、標準的な技術を使用して細胞から抽出してもよい。標的遺伝子座を囲む領域は、例えばＰＣＲを使用して、配列決定の前に増幅してもよい。配列決定を、任意の適した技術、例えばサンガー配列決定を使用して実施してもよい。試験済みの各ガイドＲＮＡ分子の編集結果を決定するために、ソフトウェア、例えばサンガー配列決定トレースのデコンボリューションウェブツール（ＩＣＥ、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ社から入手可能）を使用して、配列決定データを分析してもよい。各ガイドＲＮＡ分子について、生成された各遺伝子型の頻度をそれによって決定することができる。ガイドＲＮＡ分子ごとに取得される編集効率、すなわち予測される切断部位において編集されるＤＮＡ分子の総数のパーセンテージも評価することができる。好ましくは、さらなる使用のために選択されるガイドＲＮＡ分子の編集効率は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％である。３０％編集効率のカットオフとは、例えば調べた胚または細胞プールにおいて、利用可能なすべての標的部位のうちの３０％が標的ＤＮＡ中で編集されることを意味する。
【0077】
本発明の好ましい方法は、上記で詳述したように、標的配列すなわちガイドＲＮＡを、それらを使用して生じた遺伝子型の数および頻度に従って評価および選択し、その後に２５％の編集効率を有するそれらの標的配列すなわちガイドＲＮＡを選択することを含む。少なくとも２５％の編集効率を有するガイドＲＮＡを選択することは、非ヒト動物モデル、例えばマウスモデルを生成する方法において特に好ましい。
【0078】
以下の試験では、選択されたガイドＲＮＡ分子を使用して細胞（例えば接合体）または細胞の集団を編集することができる。以下の試験では、選択された標的配列をヌクレアーゼによって標的化させて細胞（例えば接合体）または細胞の集団を編集することができる。
【0079】
「ガイドＲＮＡ分子」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、複合体を標的核酸配列に対する配列特異的な結合に誘導する核酸分子のことを指すと理解されたい。ガイドＲＮＡ分子は、本明細書に記載の方法を使用して選択されたガイドＲＮＡ配列（「標的化する配列」と称される場合もある）を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ分子は化学的に修飾されていても、核酸アナログであってもよい。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ配列を含んでもよい。
【0080】
ガイドＲＮＡ分子は、当業者に一般に知られている技術を使用して生成することができる。例えば、ガイドＲＮＡ分子は、化学合成を使用して生成することができる。別の方法はインビトロ転写を使用することであり、ここではガイドＲＮＡ分子はＤＮＡ鋳型を使用して転写される。あるいは、ガイドＲＮＡ分子は、宿主細胞中にトランスフェクトされたベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクターによって発現してもよい。
【0081】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ分子はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。「シングルガイドＲＮＡ」という用語は、足場となるｔｒａｃｒＲＮＡ配列と融合させたｃｒＲＮＡ配列（標的化する配列を含む）を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおける使用のための単一のＲＮＡ分子のことを指す。しかし、本発明はまた、２分子からなるｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡシステムまたは従来とは異なるｔｒａｃｒＲＮＡ配列を使用するシステムを使用して実行することもできることは、認識されるであろう。
【0082】
ガイドＲＮＡ配列の「標的」（当分野においては「標的遺伝子座」とも称される）とは、ガイドＲＮＡ配列を含む分子が、例えばワトソン・クリック塩基対形成を介して結合する（「ハイブリダイズする」）ことができる核酸配列の領域であることが、当業者によって認識されるであろう。その標的に結合するガイドＲＮＡ配列の能力は、ガイドＲＮＡ配列と標的配列との間の相補性のレベルを基準にして記載することができる。相補性のレベルは、ガイドＲＮＡ配列とその標的配列との間の同一性パーセンテージとして表すことができ、同一性パーセンテージとは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対形成）を形成することができる、核酸分子中の残基のパーセンテージのことである（例えば１０個中５個、６個、７個、８個、９個、１０個は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％の同一性である）。
【0083】
ガイドＲＮＡ配列は、標的核酸配列にハイブリダイズするために、その標的核酸配列に対して十分な相補性を有していなければならない。従って、いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、少なくとも約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％であり得る。ＲＮＡ配列のオフターゲットスコアを低減させるために相補性の程度がより高いことが好ましい場合があり、ＲＮＡ配列の特定の領域、例えばＰＡＭ配列に近い領域においては、相補性の程度がより高いことが必要な場合がある。ガイドＲＮＡ配列とその標的配列との間のアライメントは、例えばＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて入手可能）、ＥＬＡＮＤ（イルミナ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて入手可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて入手可能）のいずれかを使用して決定することができる。
【0084】
本発明の第４の態様によれば、生物、細胞または細胞の集団あるいはセルフリー発現システムにおいて核酸配列を編集するための方法が提供される。方法は、切断後に主要な編集結果をもたらすと予測される、核酸配列内の標的配列に対して標的化させられるヌクレアーゼに、核酸配列を含む二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを曝露することを含んでもよい。標的配列は、例えば、上記で説明したように、標的遺伝子にあっても、または非コード領域内にあってもよい。標的配列は、上記の方法を使用して選択してもよく、従って、本第４の態様の方法は、第１の態様の工程または方法をさらに含んでもよい。
【0085】
好ましくは、ヌクレアーゼはＣａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを標的配列、例えば標的遺伝子の標的配列に誘導することができるガイドＲＮＡ分子によって標的化させられる。ガイドＲＮＡは、上記の方法を使用して選択してもよく、従ってガイドＲＮＡ配列の使用を必要とする本第４の態様の方法は、ガイドＲＮＡ配列に関係する第１の態様の工程または方法をさらに含んでもよい。
【0086】
第４の態様による方法は、第２または第３の態様に従ってデザインされたシステムを使用することを含んでもよく、従って、第２または第３の態様の工程または方法を含んでもよい。
【0087】
本発明の第４の態様は、生物、細胞または細胞の集団あるいはセルフリー発現システムにおいて核酸配列を編集するための方法であって、核酸配列を含む二本鎖（ｄｓＤＮＡ）を、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを核酸配列内の標的配列に誘導することができるガイドＲＮＡ分子に曝露することを含む、方法を提供する。
【0088】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集において使用された場合に、２番目に豊富な編集結果の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍または少なくとも２０倍を超える頻度を有する主要な編集結果をもたらす（または、例えばコンピュータモデルによってもたらすと予測される）ガイドＲＮＡ配列を含む。あるいは、いくつかの実施形態では、第２の態様において記載されるように、ガイドＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集において使用された場合に、他の編集結果の４倍未満である豊富さを有する主要な編集結果をもたらすことができる。
【0089】
ガイドＲＮＡ分子は、本明細書に記載の方法に従って生成されていてもよい。ガイドＲＮＡ分子は、本明細書に記載の方法に従って選択されたガイドＲＮＡ配列を含んでもよい。
【0090】
一実施形態では、本明細書において上述されるように、１つを超えるガイドＲＮＡが、第４の態様のそのような方法において使用されてもよい。従って、適切には、第４の態様の方法は、生物、細胞または細胞の集団あるいはセルフリー発現システムにおいて、１つを超える核酸配列を編集するための方法を含んでもよい。
【0091】
一実施形態では、従って、生物、細胞または細胞の集団あるいはセルフリー発現システムにおいて、１つを超える核酸配列を編集するための方法であって、方法が、各核酸配列を含む二本鎖（ｄｓＤＮＡ）を、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび１つを超えるガイドＲＮＡ分子に曝露することを含み、ここで各ガイドＲＮＡ分子は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを核酸配列のうちの１つの内部の標的配列に誘導することができる、方法を提供する。
【0092】
例えば、生物、細胞または細胞の集団あるいはセルフリー発現システムにおいて、２つの核酸配列を編集するための方法であって、方法が、第１および第２の核酸配列を含む二本鎖（ｄｓＤＮＡ）を、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび２つのガイドＲＮＡ分子に曝露することを含み、ここで第１のガイドＲＮＡ分子は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを第１の核酸配列内の標的配列に誘導することができ、第２のガイドＲＮＡ分子は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを第２の核酸配列内の標的配列に誘導することができる、方法を提供する。
【0093】
方法は、例えばノックアウト変異、例えばフレームシフト変異を創出することによって、標的遺伝子の発現を抑制するためのものであってもよい。適切には、これは、クリティカルなエクソンの欠失によって達成されてもよい。
【0094】
方法が細胞または細胞の集団において標的配列を編集するためのものである実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡ分子およびＤＮＡエンドヌクレアーゼを細胞または複数の細胞に導入することを含んでもよい。方法が細胞または細胞の集団において１つを超える標的配列を編集するためのものである実施形態では、方法は１つを超えるガイドＲＮＡ分子、および適宜１つを超えるＤＮＡエンドヌクレアーゼを、細胞または複数の細胞に導入することを含んでもよい。
【0095】
ガイドＲＮＡ分子およびＣａｓエンドヌクレアーゼを、細胞または集団内の各細胞に、別々に（逐次的または同時に）、あるいは組合せにおいて、導入してもよい。例えば、ガイドＲＮＡ分子およびＣａｓエンドヌクレアーゼは、１つまたは複数の細胞への投与のための単一の組成物において提供されてもよい。ガイドＲＮＡ分子およびＣａｓエンドヌクレアーゼの細胞への導入は、当業者に知られているウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクターを介して、遂行されてもよい。
【0096】
ガイドＲＮＡ分子およびＣａｓエンドヌクレアーゼを、任意の適した技術によって、１つまたは複数の細胞内に導入することができる。そのような技術は当業者に知られており、リポフェクション、ウイルスベクター（例えばレンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター）、ウイルス様粒子、ナノ粒子、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、ならびに他のトランスフェクション手段または形質導入手段が含まれる。
【0097】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ分子およびＣａｓエンドヌクレアーゼは、１つまたは複数の細胞にエレクトロポレーションによって導入される。エレクトロポレーションの前に、ガイドＲＮＡ分子とＣａｓエンドヌクレアーゼを複合体形成させてもよい。適したエレクトロポレーション法が、当分野において知られており、本明細書においてさらに記載され得る。
【0098】
本発明の方法における使用のための適したヌクレアーゼには、クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが含まれる。好ましくは、本明細書に記載の方法は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、例えばクラスＩＩ、特にクラスＩＩＢ（例えばＣａｓ９）またはクラスＶ－Ａ（例えばＣａｓ１２ａ）に属するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用する核酸配列編集を利用してもよく、またはそのために構成されていてもよい。
【0099】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、標的配列を切断して、平滑末端化された二本鎖切断末端を生じさせる。他の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、標的配列を切断して、８ヌクレオチド未満、例えば６ヌクレオチド未満または４ヌクレオチド未満または２ヌクレオチド未満の切断部位におけるオーバーハングを伴う、ねじれ型の二本鎖切断末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を生じさせる。
【0100】
好ましい実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。例えば、Ｃａｓ９は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＳｐＣａｓ９）から単離された天然に存在するＣａｓ９であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、天然に存在するＣａｓ９、例えばＳｐＣａｓ９に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する、天然に存在するＣａｓ９の変異体またはホモログである。
【0101】
適している可能性のある他のＣａｓ９エンドヌクレアーゼには、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＳｔＣａｓ９）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮｍＣａｓ９）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ（ＦｎＣａｓ９）およびカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（ＣｊＣａｓ９）およびストレプトコッカス・カニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｎｉｓ）（ＳｃＣａｓ９）から単離されたＣａｓ９、ならびにこれらの天然に存在するＣａｓ９酵素のエンドヌクレアーゼ変異体またはホモログが含まれる。
【0102】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ以外の酵素を用いて遂行されてもよい。適切には、本発明の方法は、ＤＮＡ中に標的化された二本鎖切断末端を生じさせることができる任意の酵素を用いて遂行されてもよい。例えば、本発明の方法は、任意のヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ、適切には制限エンドヌクレアーゼを使用して遂行されてもよい。
【0103】
細胞または細胞の集団は、原核生物、例えば古細菌であっても、または真核生物であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、細胞または細胞の集団は原核生物であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞または細胞の集団は細菌であってもよく、いくつかの実施形態では細胞または細胞の集団は古細菌であってもよい。いくつかの実施形態では、生物、細胞または細胞の集団は真核生物、例えば動物界、真菌類または植物界であってもよい。
【0104】
適切には、生物、細胞または細胞の集団は、哺乳動物、鳥類、無脊椎動物、魚類、爬虫類、両生類に由来してもよい。いくつかの実施形態では、生物、細胞または細胞の集団は哺乳動物である。生物あるいは１つまたは複数の細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、霊長類、ニワトリまたはヒトであってもよい。
【0105】
細胞の集団は、生物から、例えば哺乳動物の体から取得してもよい（または以前に取得していてもよい）。あるいは、集団は、生物から取得した細胞または複数の細胞を培養液中で拡大することによって得てもよい。
【0106】
いくつかの実施形態では、細胞は免疫細胞である。適している免疫細胞は、リンパ球、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞であってもよく、または骨髄系細胞、例えば好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、樹状細胞、単球またはマクロファージであってもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の細胞はＴ細胞である。適切には、Ｔ細胞はキラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞または調節性Ｔ細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の細胞はＣＡＲ－Ｔ細胞である。従って、いくつかの実施形態では、遺伝子編集されたＴ細胞を生成する方法であって、本発明の方法に従って標的配列すなわちガイドＲＮＡを特定し、その後、Ｔ細胞集団のゲノムを、標的配列すなわちガイドＲＮＡによって特定された部位において編集することを含む、方法を提供する。好ましくは、Ｔ細胞集団のゲノムは、本発明の方法に従って選択されたガイドＲＮＡを使用して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９をＴ細胞ゲノム中の標的配列に対して標的化させることによって、編集される。
【0107】
いくつかの実施形態では、細胞は前駆細胞または幹細胞である。適した幹細胞には、初代幹細胞または不死化幹細胞が含まれる。一実施形態では、細胞は誘導多能性幹細胞である。適切には、前駆細胞または幹細胞はヒトのものである。
【0108】
いくつかの実施形態では、生物、細胞または細胞の集団は、修飾された生物、細胞または細胞の集団であってもよい。いくつかの実施形態では、生物、細胞または細胞の集団は、遺伝子修飾されていてもよい。従って、適切には、本発明の方法は、既に修飾されている生物、細胞または細胞の集団、すなわちトランスジェニックの生物、細胞または細胞の集団上で実施されてもよい。
【0109】
いくつかの実施形態では、生物から細胞を取得する工程を含む方法は、本発明の範囲から除外される。
【0110】
従って、いくつかの実施形態では、方法は、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で、細胞の集団の各細胞中の標的配列を編集するためのものである。方法は、エクスビボで、細胞の集団の各細胞中の標的遺伝子を編集するためのものであってもよい。一部の代替の実施形態では、方法は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で標的配列を編集するためのものであり、例えば、インビボで標的遺伝子を編集するためのものである。インビボでの編集は治療法の一部としてであってもよく、あるいはインビボでの編集は治療ではない方法の一部としてであってもよい。例えば、編集は、実験的使用のための組織または生物を生成するために、非ヒト真核細胞においてインビボで実施されてもよい。従って、好ましい方法は、モデル生物、例えばマウスモデルまたはラットモデルを生成する方法である。
【0111】
いくつかの実施形態では、集団の細胞中にガイドＲＮＡ分子およびＣａｓエンドヌクレアーゼを導入した後に、集団内の細胞の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または実質上すべてが、同じ遺伝子型（編集結果）を有するように、標的配列のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集が起こる。
【0112】
いくつかの実施形態では、細胞は接合体である。いくつかの実施形態では、接合体は非ヒトのものである。本発明の好ましい方法には、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性を修飾するための工程は包含されない。適切には、本明細書で言及された胚または接合体は、非ヒトの胚または接合体であり得る。
【0113】
従って、本発明は、非ヒトの、哺乳動物であってもよいトランスジェニック動物を作製する方法であって、方法が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ分子を胚に導入することを含み、ここでガイドＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集において使用された場合に、２番目に豊富な編集結果の少なくとも２倍を超える頻度を有する主要な編集結果をもたらす（または、例えばコンピュータモデルによってもたらすと予測される）ガイドＲＮＡ配列を含む、方法を提供することができる。好ましくは、ガイドＲＮＡは、上記に詳述される、本発明に従ってガイドＲＮＡを選択する方法を使用して選択される。あるいは、本発明は、非ヒトのトランスジェニック動物を作製する方法であって、Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたは各Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ９エンドヌクレアーゼならびにガイドＲＮＡ分子または各ガイドＲＮＡ分子を胚に導入し、第２の態様の工程を遂行することを含む、方法を提供することができる。
【0114】
一実施形態では、本発明は、キメラ動物を作製する方法を提供することができる。適切には、キメラ動物は、種間キメラであっても、または種内キメラであってもよい。適切には、そのような方法は、本発明の方法を実施することにより、第１の生物に由来する細胞または細胞の集団中の核酸配列を修飾し、第２の生物中に、細胞または細胞の集団を移植することを含んでもよい。適切には、移植すると、修飾された細胞または細胞の集団は、増殖し、拡大する可能性がある。適切には、第１の生物はヒトであってもよく、第２の生物は異なる哺乳動物、例えばブタであってもよい。いくつかの実施形態では、細胞または細胞の集団は、非ヒトの胚であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞または細胞の集団は、幹細胞、多能性幹細胞または前駆細胞であってもよい。好ましくは、そのような方法は、ヒトおよび動物の生殖細胞または全能性細胞からキメラを作製する工程は包含しない。
【0115】
方法は、胚をレシピエントの雌の動物に移植して妊娠させることをさらに含んでもよい。
【0116】
ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ分子を、１細胞期（すなわち接合体）において、胚の中に導入してもよい。接合体は、移植前に、発生の後期（例えば、２細胞期、４細胞期または８細胞期）にまで培養してもよい。
【0117】
従って、いくつかの実施形態では、本発明の第４の態様の方法は、胚において、１つまたは複数の核酸配列、例えば遺伝子、を編集するためのものである。方法は、ガイドＲＮＡ分子または各ガイドＲＮＡ分子ならびにＣａｓエンドヌクレアーゼを胚の各細胞に導入すること含んでもよい。ガイドＲＮＡ分子または各ガイドＲＮＡ分子ならびにＣａｓエンドヌクレアーゼは、２細胞期、４細胞期または８細胞期、あるいはより後期における胚の細胞中に導入してもよい。
【0118】
いくつかの実施形態では、複数の胚を、単一のレシピエントの雌中にトランスファーする。例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０または少なくとも１５個の胚を、一匹のレシピエントの雌にトランスファーしてもよい。これは、複数の生きた子孫の誕生をもたらし得る。有利には、２５％を超える子孫が非モザイクであり得る。いくつかの実施形態では少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の子孫が非モザイクである。「非モザイク」により、個々の動物内の実質上すべての細胞（実質上すべての組織における）が、同じ遺伝子型を有することが理解されるであろう。
【0119】
従って、本発明は、その後の繁殖工程を必要としない、単一世代における、トランスジェニック動物中のモザイク現象を低減させるまたは取り除く方法を提供する。よって、本発明の方法は、非モザイクのトランスジェニック動物を生成するために使用することができる。
【0120】
動物は、哺乳動物であってもよい。動物は、げっ歯類、例えばマウスまたはラットであってもよい。あるいは、動物はウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリまたは霊長類であってもよい。霊長類は非ヒトであってもよい。
【0121】
従って、さらにさらなる態様では、本明細書に記載の方法によって取得可能な、細胞（例えば胚）、細胞集団および非ヒト生物（例えばトランスジェニック動物）が提供される。適切には、そのような細胞、細胞集団および非ヒト生物は、修飾された細胞集団および修飾された非ヒト生物である。
【0122】
次に、本発明の実施形態を、例を挙げ、添付の図を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【0123】
【図1】図１Ａは、Ｖｓｉｇ４遺伝子の二本鎖切断末端（ｄｓｂ）修復における精度に対してプロットした、マイクロホモロジー強度を示すグラフである。精度は、修復結果の予測可能性として理解することができる。図１Ｂは、Ｖｓｉｇ４遺伝子の最も頻度の高い遺伝子型（Ｍ．Ｆ．ｇｔ）に対してプロットした、マイクロホモロジー強度を示すグラフである。マイクロホモロジーが高いと、修復結果の幅および複雑さが低減され、より一貫性のある結果が生じる。
【図2】図２Ａは、Ｖｓｉｇ４のＣＲＩＳＰＲデザインの予測される編集結果に対する各編集の頻度を示すグラフである。７ｂｐの欠失の頻度が圧倒的に最も高い。図２Ｂ（Ａ）は、標的部位におけるマイクロホモロジーに留意せず生成された、代表的なＣＲＩＳＰＲマウスモデル創出例についての結果を示すチャートである。生まれた子の半分は未編集、半分はモザイクであった。図２Ｂ（Ｂ）は、マイクロホモロジーの知見が適用された場合のＣＲＩＳＰＲマウスモデル創出の結果を示すチャートである。生まれたマウスの半分未満が未編集またはモザイクであった。大部分（２１／３８）は非モザイクであり、実験用となった。図２Ｃは、代表的な３匹の遺伝子修飾マウスにおける個々の組織のＤＮＡ配列分析の結果を示す。全く異なる発生系譜に由来する異なる組織全体にわたって、同じ挿入および欠失（７ｂｐの欠失、２ｂｐの挿入、１ｂｐの欠失）が観察された。図２Ｄは、直接的な、編集の生殖細胞系伝達の代表データを示す。編集された雌由来の卵母細胞を、野生型（ＷＴ）の雄によって受精させ、溶解および配列分析前に、胚盤胞期まで培養した。胚盤胞は、どの場合においても、遺伝子修飾の遺伝形質を示した。予想された通り、遺伝形質は、伴性遺伝子に特徴的なパターンに従った。
【図3】図３は、生殖細胞系伝達を評価するための、１匹の野生型雄およびＶｓｉｇ４修飾を伴う２匹の非モザイクの雌から成る３匹のマウスの繁殖の結果を表す。結果として得られた子はすべて、Ｘ連鎖遺伝子に一致するパターンの編集を含有した。すべての雄は完全な編集を示した一方、雌の遺伝子編集はヘテロ接合性であった。重要なことに、同腹仔において完全な野生型マウスまたは予想外の遺伝子編集はなく、ゲノム修飾の完全な伝播性が示された。
【図4】図４は、Ｖｓｉｇ４に関して遂行される本発明の方法は、他の遺伝子に対して反復可能および一般化可能であることを示す。円グラフは、遺伝子Ｖｓｉｇ４、Ｃｃｒ１およびＰｒｄｍ１４における、局所的なＤＮＡ配列を活用する本発明の方法の遂行から得られた集計データを示し、遺伝子Ｈｍｇａ１、ＨＭｇａ１－ｐｓおよびＨｍｇａ２における、局所的なＤＮＡ配列の特徴を無視する伝統的な方法についてのデータを示すチャートと比較する。
【図5】図５は、表現効果のあるＰｒｄｍ１４ノックアウトの機能分析を示す。（Ａ）遺伝子型を同定したＰｒｄｍ１４－／－マウスから、精巣および卵巣組織を切除し、秤量した。スチューデントｔ検定を使用して統計学的解析を遂行し、Ｐ＝９．４×１０－９（精巣）およびＰ＝２．２×１０－４（卵巣）を得た。（Ｂ）精巣組織の可視化。（Ｃ）Ｐｒｄｍ１４－／－の雄ではないｗｔにおける精子細胞（赤色のアステリスク）の顕微鏡観察。
【図6】図６は、本発明の方法を使用して、ＤＮＡマイクロホモロジーを分析することにより大規模な欠失を亢進させる能力を示す。（Ａ）局所的なマイクロホモロジーが低い領域を標的化することにより、ホモ接合性の大規模な欠失を亢進させることができ、それが非モザイクの動物を生む。（Ｂ）遺伝子Ｄｄｘ３ｙを使用した予備データは、マイクロホモロジーの低い領域は、マイクロホモロジーの高い領域を標的化することと比較して、より高頻度に両アレル性の大規模な欠失をもたらすことを示し、（Ｃ）および（Ｄ）の円グラフは、遺伝子Ｇａｔａ１における同じ方法論の遂行についての生データを示す。（Ｃ）では、左から右にかけて：Ｇａｔａ１モデルのモザイク現象全体についての円グラフ、「非モザイク」は、単一の編集結果が両編集部位に存在した場合である。これらの編集結果には、インデルおよび所望の欠失が含まれる；マイクロホモロジーの低いガイドＲＮＡのペアにのみ注目した場合の、Ｇａｔａ１モデルのモザイク現象についての円グラフ。これらの編集結果には、インデルおよび所望の欠失が含まれる；マイクロホモロジーの高いガイドＲＮＡのペアにのみ注目した場合の、Ｇａｔａ１モデルのモザイク現象についての円グラフ。これらの編集結果には、インデルおよび所望の欠失が含まれる。（Ｄ）では、左から右にかけて：すべてのＧａｔａ１編集マウス中に存在する大規模な欠失についての円グラフ。大規模な欠失、インデルおよび未編集のマウスを比較する（モザイク現象を示すものではない）；マイクロホモロジーの低いガイドＲＮＡのペアを使用して生成したＧａｔａ１マウス中に存在する大規模な欠失についての円グラフ；マイクロホモロジーの高いガイドＲＮＡのペアを使用して生成したＧａｔａ１マウス中に存在する大規模な欠失についての円グラフ；
【図7】図７は、生存率の減少を伴わない、ヒト初代Ｔ細胞の効率的なＣａｓ９編集を示す。ＨＥＫ２９３Ｔおよびヒト初代Ｔ細胞を、本発明の方法を使用して、ＣＴＬＡ４に対してデザインしたガイドを用いて編集した（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびヒト初代Ｔ細胞中のＣＴＬＡ４を標的化する増量を伴うＣａｓ９：ｓｇＲＮＡの編集効率（ｎ＝３、技術的反復（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）、エラーバー＝ＳＤ、ｎｓ＝有意でない）。未編集対照と比較して、タンパク質のコード領域中にフレームシフトをもたらすインデルを有する細胞の率を決定することにより、効率を測定した。（Ｂ）編集の３日後に記録したＴ細胞生存率。％生存率を、総細胞数／ｍＬに対する、生きている細胞数／ｍＬのパーセンテージとして計算した。
【図8】図８は、（Ａ）ＣＴＬＡ４を標的化するｓｇＲＮＡを用いて編集した健康なドナーＴ細胞の配列決定トレースを示す。ｓｇＲＮＡの標的配列に黒で下線を引く。編集された細胞のプール内の特定の編集の寄与を示す。（Ｂ）プール内の編集結果の分布を示す。７０％を超える編集は純粋であり、モザイク現象のレベルが３０％未満に低減したことを示す。
【図9】図９は、（Ａ）初代Ｔ細胞中のＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＰＴＰＮ２、ＤＧＫおよびＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３としても知られる）に対する、本発明の方法（接合性）を使用してデザインされたｇＲＮＡとサンガー法（Ｓａｎｇｅｒ）でデザインされた（ベンチマーク）ｇＲＮＡｓとの間の編集効率の比較を示す。初代Ｔ細胞を編集したとき、本発明に従ってデザインされたｇＲＮＡは、６遺伝子にわたってより効率的であった（Ｐ＜０．００５）（Ｂ）初代Ｔ細胞中のＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＰＴＰＮ２、ＤＧＫおよびＨＡＶＣＲ２に対する、本発明の方法（接合性）を使用してデザインされたｇＲＮＡとサンガー法でデザインされた（ベンチマーク）ｇＲＮＡとの間のノックアウト効率の比較を示す。サンガー法でデザインされたガイドと比較した場合、本発明の方法を使用してデザインされたｇＲＮＡは、初代Ｔ細胞中の遺伝子をより高い割合でノックアウトした（Ｐ＜０．００６）（Ｃ）初代Ｔ細胞中のＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＰＴＰＮ２、ＤＧＫおよびＨＡＶＣＲ２に対する、本発明の方法（接合性）を使用してデザインされたｇＲＮＡとサンガー法でデザインされた（ベンチマーク）ｇＲＮＡとの間のモザイク現象の度合の比較を示す。サンガー法でデザインされたガイドと比較した場合、本発明の方法を使用してデザインされたｇＲＮＡは、初代Ｔ細胞中にモザイク現象の低下（純度（％）の増加によって示される）をもたらした（Ｐ＜０．００６）。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0124】
本発明の方法に従って選択されたガイドＲＮＡ配列を使用するＣＲＩＳＰＲ編集は、以下のプロトコールを使用して実施することができる。
胚を編集するためのプロトコール例
１．合成修飾されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として、ガイドＲＮＡ配列を注文する（例えばＭｅｒｃｋ社に）、
２．ｓｇＲＮＡを水中に再懸濁する、
３．インビトロで受精させたマウスの接合体を、精子注入３時間後のエレクトロポレーションに備えて調製しておく、
４．６０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社）中で、４．５μｇのｓｇＲＮＡと２０μｇのＣａｓ９タンパク質（ＴｒｕｅＣｕｔ Ｖ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、室温で２０分間、複合体形成させる、
５．５０μｌの複合体溶液を、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレーターのＣＵＹ５２０Ｐ５電極にトランスファーする、
６．インピーダンスが０．４８～０．５２ｋＷの範囲になるまで、容量を調整する、
７．Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで洗浄した接合体を、エレクトロポレーションチャンバーに移す、
８．インピーダンスを再度確認する、
９．表１に略述したパラメータを使用してエレクトロポレーションする、
１０．接合体を、エレクトロポレーションチャンバーから取り出し、ＫＳＯＭ溶液に３０分間入れる、
１１．接合体をＫＳＯＭ溶液で３回洗浄する、
１２．接合体を新しいＫＳＯＭ溶液に戻し、少なくとも２細胞期、場合によっては胚盤胞期まで培養する、
１３．偽妊娠レシピエント雌マウスにトランスファーする。
胚を編集するためのプロトコール例
１．合成修飾されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として、ガイドＲＮＡ配列を注文する（例えばＭｅｒｃｋ社に）、
２．ｓｇＲＮＡを水中に再懸濁する、
３．インビトロで受精させたマウスの接合体を、精子注入３時間後のエレクトロポレーションに備えて調製しておく、
４．６０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社）中で、４．５μｇのｓｇＲＮＡと２０μｇのＣａｓ９タンパク質（ＴｒｕｅＣｕｔ Ｖ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、室温で２０分間、複合体形成させる、
５．５０μｌの複合体溶液を、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレーターのＣＵＹ５２０Ｐ５電極にトランスファーする、
６．インピーダンスが０．４８～０．５２ｋＷの範囲になるまで、容量を調整する、
７．Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで洗浄した接合体を、エレクトロポレーションチャンバーに移す、
８．インピーダンスを再度確認する、
９．表１に略述したパラメータを使用してエレクトロポレーションする、
１０．接合体を、エレクトロポレーションチャンバーから取り出し、ＫＳＯＭ溶液に３０分間入れる、
１１．接合体をＫＳＯＭ溶液で３回洗浄する、
１２．接合体を新しいＫＳＯＭ溶液に戻し、少なくとも２細胞期、場合によっては胚盤胞期まで培養する、
１３．偽妊娠レシピエント雌マウスにトランスファーする。
【0125】
【表1】
細胞を編集するためのプロトコール例
１．合成修飾されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として、ガイドＲＮＡ配列を注文する（例えばＭｅｒｃｋ社に）、
２．ｓｇＲＮＡを水中に再懸濁する、
３．８０ｐｍｏｌのｓｇＲＮＡと４μｇのＣａｓ９タンパク質（ＴｒｕｅＣｕｔ Ｖ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を複合体形成させる、
４．細胞（～４００，０００）を回収し、沈殿物を１×ＰＢＳで洗浄し、２０μＬの適切なエレクトロポレーション緩衝液中に再懸濁する、
ａ．細胞数および容量は、Ｌｏｎｚａ社の１６ウェルカセットを用いた使用に適していること。異なるエレクトロポレーション容器を使用する場合にはスケールアップし、キットの手順に従う、
ｂ．Ａｍａｘａ ４Ｄ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用し、エレクトロポレーション容器および緩衝液をＬｏｎｚａを介して購入する。異なる緩衝液を、さまざまな細胞タイプを用いた異なる使用に対して最適化する、
ｃ．細胞をエレクトロポレーション緩衝液と混合したら、できるだけ速やかにエレクトロポレーションを完了させる、
５．細胞を、複合体形成させたｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質と混合し、エレクトロポレーション容器にトランスファーする、
６．Ｌｏｎｚａが推奨する、細胞タイプに特異的なプログラムに従ってエレクトロポレーションする、
７．８０μｌの細胞培地をエレクトロポレーションカセットに添加し、インキュベーター内に１０分間置いて細胞を回復させる、
８．細胞を、１ｍＬの予熱した培地を含有する１２ウェルプレート中に載せる、
９．必要に応じて培養する。
【0126】
［実施例１］
Ｃａｓ９切断によって誘発される標的配列の二本鎖ＤＮＡ切断末端（ＤＳＢ）の修復は、かつてランダムだと考えられていたが、ランダムではないことが最近示された。Ｃａｓ９カット部位周囲の、短い反復ＤＮＡ配列（マイクロホモロジー）エリアは、ＤＳＢがどのように修復されるかにおいて主要な役割を果たす。図１に示されるように、局所的なマイクロホモロジーと標的配列のランダムではない修復、すなわち精度との間には、直接的な関係性がある（図１Ａ）。直接的な関係性は、我々が編集結果を新たに理解し、予測することを可能とする。マイクロホモロジーの低いＤＮＡ配列は、予測が困難な様式で修復されて、幅広い編集結果を与える。高いマイクロホモロジーは、修復結果の幅の減少に相関する（図１Ｂ）。さらに、編集イベントは標的配列の再カットによって時間とともに進み、モザイク現象につながる可能性がある。本発明者らは、編集結果を偏らせ、モザイク現象を低減させるまたは取り除くために、二本鎖切断末端修復とマイクロホモロジーとの間の関係性を活用することができると仮定した。
Ｃａｓ９切断によって誘発される標的配列の二本鎖ＤＮＡ切断末端（ＤＳＢ）の修復は、かつてランダムだと考えられていたが、ランダムではないことが最近示された。Ｃａｓ９カット部位周囲の、短い反復ＤＮＡ配列（マイクロホモロジー）エリアは、ＤＳＢがどのように修復されるかにおいて主要な役割を果たす。図１に示されるように、局所的なマイクロホモロジーと標的配列のランダムではない修復、すなわち精度との間には、直接的な関係性がある（図１Ａ）。直接的な関係性は、我々が編集結果を新たに理解し、予測することを可能とする。マイクロホモロジーの低いＤＮＡ配列は、予測が困難な様式で修復されて、幅広い編集結果を与える。高いマイクロホモロジーは、修復結果の幅の減少に相関する（図１Ｂ）。さらに、編集イベントは標的配列の再カットによって時間とともに進み、モザイク現象につながる可能性がある。本発明者らは、編集結果を偏らせ、モザイク現象を低減させるまたは取り除くために、二本鎖切断末端修復とマイクロホモロジーとの間の関係性を活用することができると仮定した。
【0127】
胚において、マイクロホモロジーと、精度および一貫性の両方との間の直線的な関係性を利用することにより、驚くべきことに、編集の幅を１つの主要な結果に限定することが可能であることが見出された。編集の幅を限ることで、編集が偏って単一の遺伝子型を生じることにより、再カットベースのモザイク現象が無くなる。これら２つのアプローチを組み合わせることにより、非モザイクの実験用マウスを一工程で作製することが可能になる。
【0128】
材料と方法
ＣＲＩＳＰＲガイドのデザイン
Ｖｓｉｇ４（ＥＮＳＭＵＳＧ００００００４４２０６）に対するＳｐＣａｓ９シングルガイドＲＮＡを、以下のプロトコールに従って選択した。
１．一次転写物を、公的に利用可能なゲノムツールのｅｎｓｅｕｍｂｌｅ．ｏｒｇを使用して特定した、
２．Ｖｓｉｇ４のコード配列を標的化する可能性のあるすべてのガイドＲＮＡを、公的に利用可能なソフトウェアのＦＯＲＥｃａｓＴ、ＩｎＤｅｌｐｈｉまたはＬｉｎｄｅｌを使用して特定した。他の適したソフトウェアには、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ、Ｄｅｓｋｇｅｎ．ｃｏｍおよびＣＲＩＳＰＯＲが含まれる、
３．遺伝子の次の５０％を標的化するガイドＲＮＡ配列を取り除いた、
４．Ｌｉｎｄｅｌを使用し、「最も頻度の高い遺伝子型（ＭＦ ｇｔ）」のメトリックを使用してガイドＲＮＡ配列を分析し、最も豊富な編集結果と２番目に豊富な編集結果との間の倍率変化を各ガイドＲＮＡ配列について計算した。上位１０個に順位付けされたガイド配列を選択した、
５．Ｌｉｎｄｅｌを使用し、「フレームシフト％」のメトリックを使用してガイドＲＮＡ配列を順位付けした。主要な編集結果が３の倍数でないガイドを選択した、
６．ガイドＲＮＡ配列に、ウェブツールのＤｅｓｋｇｅｎを使用してオフターゲットスコアを割り当てた。他の適したツールには、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ ＢｒｏｗｓｅｒおよびＣＲＩＳＰＯＲが含まれる。Ｄｅｓｋｇｅｎおよび他のほとんどのツールによって使用されるアルゴリズムは、Ｈｓｕら（Nature Biotechnology volume 31, pages 827-832(2013)）のものである。ウェブツールのＤｅｓｋｇｅｎでは、スコアは０（多くのオフターゲット）～１００（オフターゲットなし）の範囲である。スコアが７０未満のガイドは除いた、
７．望ましくないオンターゲットプロファイルを有するガイドＲＮＡ配列を、Ｄｅｓｋｇｅｎを使用して除いた。Ｄｅｓｋｇｅｎにより、Ｄｏｅｎｃｈら（Nature Biotechnology volume 34, pages 184-191(2016)）によって記載されたメトリックに基づく０～１００のスコアが割り当てられる。スコアが３５を超えるガイド（インビトロおよびインビボにおいてうまく機能することが見出されている）を選択した、
８．上位３位に順位付けされたガイドＲＮＡ配列を、マウスＥＳ細胞中でＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を実施することにより試験した。Ｖｓｉｇ４に対する、合成ホスホロチオエート修飾ｓｇＲＮＡを、Ｍｅｒｃｋ社（ＵＫ）から購入した。次いで、編集後にゲノムＤＮＡを抽出し、標準的な技術を使用して編集領域全体を配列決定して、編集パーセンテージおよび編集の分布を決定した。情報を、ＩＣＥ ｖ２ ＣＲＩＳＰＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ社）を使用して分析した。
９．次いで、最小のモザイク現象をもたらすことが見出されたガイドＲＮＡ配列を使用して、トランスジェニックマウスを生成した。
ＣＲＩＳＰＲガイドのデザイン
Ｖｓｉｇ４（ＥＮＳＭＵＳＧ００００００４４２０６）に対するＳｐＣａｓ９シングルガイドＲＮＡを、以下のプロトコールに従って選択した。
１．一次転写物を、公的に利用可能なゲノムツールのｅｎｓｅｕｍｂｌｅ．ｏｒｇを使用して特定した、
２．Ｖｓｉｇ４のコード配列を標的化する可能性のあるすべてのガイドＲＮＡを、公的に利用可能なソフトウェアのＦＯＲＥｃａｓＴ、ＩｎＤｅｌｐｈｉまたはＬｉｎｄｅｌを使用して特定した。他の適したソフトウェアには、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ、Ｄｅｓｋｇｅｎ．ｃｏｍおよびＣＲＩＳＰＯＲが含まれる、
３．遺伝子の次の５０％を標的化するガイドＲＮＡ配列を取り除いた、
４．Ｌｉｎｄｅｌを使用し、「最も頻度の高い遺伝子型（ＭＦ ｇｔ）」のメトリックを使用してガイドＲＮＡ配列を分析し、最も豊富な編集結果と２番目に豊富な編集結果との間の倍率変化を各ガイドＲＮＡ配列について計算した。上位１０個に順位付けされたガイド配列を選択した、
５．Ｌｉｎｄｅｌを使用し、「フレームシフト％」のメトリックを使用してガイドＲＮＡ配列を順位付けした。主要な編集結果が３の倍数でないガイドを選択した、
６．ガイドＲＮＡ配列に、ウェブツールのＤｅｓｋｇｅｎを使用してオフターゲットスコアを割り当てた。他の適したツールには、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ ＢｒｏｗｓｅｒおよびＣＲＩＳＰＯＲが含まれる。Ｄｅｓｋｇｅｎおよび他のほとんどのツールによって使用されるアルゴリズムは、Ｈｓｕら（Nature Biotechnology volume 31, pages 827-832(2013)）のものである。ウェブツールのＤｅｓｋｇｅｎでは、スコアは０（多くのオフターゲット）～１００（オフターゲットなし）の範囲である。スコアが７０未満のガイドは除いた、
７．望ましくないオンターゲットプロファイルを有するガイドＲＮＡ配列を、Ｄｅｓｋｇｅｎを使用して除いた。Ｄｅｓｋｇｅｎにより、Ｄｏｅｎｃｈら（Nature Biotechnology volume 34, pages 184-191(2016)）によって記載されたメトリックに基づく０～１００のスコアが割り当てられる。スコアが３５を超えるガイド（インビトロおよびインビボにおいてうまく機能することが見出されている）を選択した、
８．上位３位に順位付けされたガイドＲＮＡ配列を、マウスＥＳ細胞中でＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を実施することにより試験した。Ｖｓｉｇ４に対する、合成ホスホロチオエート修飾ｓｇＲＮＡを、Ｍｅｒｃｋ社（ＵＫ）から購入した。次いで、編集後にゲノムＤＮＡを抽出し、標準的な技術を使用して編集領域全体を配列決定して、編集パーセンテージおよび編集の分布を決定した。情報を、ＩＣＥ ｖ２ ＣＲＩＳＰＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ社）を使用して分析した。
９．次いで、最小のモザイク現象をもたらすことが見出されたガイドＲＮＡ配列を使用して、トランスジェニックマウスを生成した。
【0129】
過剰排卵
１０～１４週齢の雌のＣ５７Ｂｌ６／Ｊ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社、ＵＫ）を、７．５ＩＵの妊馬血清性ゴナドトロピン（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社、８５９４４８）の腹腔内（ｉｐ）投与により過剰に排卵させ、その４８時間後に、７．５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社、８０４７４５）のｉｐ注射を続けて行った。ｈＣＧ注射の１４～１６時間後に、過剰に排卵させた雌から卵母細胞を採取した。
１０～１４週齢の雌のＣ５７Ｂｌ６／Ｊ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社、ＵＫ）を、７．５ＩＵの妊馬血清性ゴナドトロピン（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社、８５９４４８）の腹腔内（ｉｐ）投与により過剰に排卵させ、その４８時間後に、７．５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社、８０４７４５）のｉｐ注射を続けて行った。ｈＣＧ注射の１４～１６時間後に、過剰に排卵させた雌から卵母細胞を採取した。
【0130】
インビトロ受精（ＩＶＦ）
ヒト卵管液（ＨＴＦ）培地を、表２にリストされた試薬を使用して水で調製し、滅菌ろ過（０．２μｍ）した。
ヒト卵管液（ＨＴＦ）培地を、表２にリストされた試薬を使用して水で調製し、滅菌ろ過（０．２μｍ）した。
【0131】
【表2】
１０μＬの凍結保存精子を、４ウェル組織培養皿中の、１．２５ｍＭの還元Ｌ－グルタチオン（ｒＧＳＨ）（Ｍｅｒｃｋ社、Ｇ－４２５１）を含有する４９０μＬのＨＴＦ培地に添加し、４５分間プレインキュベートした。過剰に排卵させた雌から卵母細胞を採取し、解凍した精子を含有する培地中にトランスファーし、２時間インキュベートした。明らかに第二極体を示す接合体を収集し、事前調製したＫＳＯＭ溶液（ＫＳＯＭ培地（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＲ－１０７－Ｄ）および３ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ａ－３３１１））中で３回洗浄した。接合体を１ｍＬのＫＳＯＭ溶液中で、エレクトロポレーションまで培養した。
【0132】
胚のエレクトロポレーション
以下に示すｓｇＲＮＡ標的配列（５’－３’）：
Ｖｓｉｇ４ガイド：ＡＴＧＡＴＣＣＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＴＡＣ（配列番号１）
６０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）中で、４．５μｇのｓｇＲＮＡと２０μｇのＴｒｕｅＣｕｔ Ｃａｓ９タンパク質ｖ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、室温で２０分間、複合体形成させた。この溶液の５０μｌをＮＥＰＡ２１エレクトロポレーターのＣＵＹ５２０Ｐ５電極（Ｎｅｐａ Ｇｅｎｅ社）にトランスファーし、インピーダンスが０．４８～０．５２ｋΩの範囲内になるまで容量を調整した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで洗浄した接合体をエレクトロポレーションチャンバーに添加し、インピーダンスを再度評価してそれが範囲内であることを確認した。ＮＥＰＡ２１を使用するエレクトロポレーション用のパラメータを、上記の表１に示す。
以下に示すｓｇＲＮＡ標的配列（５’－３’）：
Ｖｓｉｇ４ガイド：ＡＴＧＡＴＣＣＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＴＡＣ（配列番号１）
６０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）中で、４．５μｇのｓｇＲＮＡと２０μｇのＴｒｕｅＣｕｔ Ｃａｓ９タンパク質ｖ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、室温で２０分間、複合体形成させた。この溶液の５０μｌをＮＥＰＡ２１エレクトロポレーターのＣＵＹ５２０Ｐ５電極（Ｎｅｐａ Ｇｅｎｅ社）にトランスファーし、インピーダンスが０．４８～０．５２ｋΩの範囲内になるまで容量を調整した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで洗浄した接合体をエレクトロポレーションチャンバーに添加し、インピーダンスを再度評価してそれが範囲内であることを確認した。ＮＥＰＡ２１を使用するエレクトロポレーション用のパラメータを、上記の表１に示す。
【0133】
接合体をエレクトロポレーションチャンバーから取り出し、ＫＳＯＭ溶液中に３０分入れた。接合体をＫＳＯＭ溶液で３回洗浄し、新しいＫＳＯＭ溶液に戻し、それらが２細胞期に達するまで培養した。
【0134】
胚のトランスファー
雌のＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社、ＵＫ）を、精管切除術を施した雄と交配した。２細胞期胚を、偽妊娠レシピエントの雌の卵管に外科的にトランスファーし、１つの卵管につき１０個の胚、１匹の雌につき２０個の胚をトランスファーした。
雌のＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社、ＵＫ）を、精管切除術を施した雄と交配した。２細胞期胚を、偽妊娠レシピエントの雌の卵管に外科的にトランスファーし、１つの卵管につき１０個の胚、１匹の雌につき２０個の胚をトランスファーした。
【0135】
編集結果の遺伝子型同定およびデコンボリューション
接合体をＫＳＯＭ溶液中で胚盤胞期にまで培養し、タイロード液（ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｔ－１７８８）を使用して透明帯を除去し、試料を抽出試薬（Ｑｕａｎｔａ社、８４１５８）中で溶解した。Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡキット（Ｏｍｅｇａ社、Ｄ３３９６－０１）を使用して、組織（耳生検、肺、心臓、肝臓または精巣）からＤＮＡを抽出した。Ｖｓｉｇ４ ｓｇＲＮＡの標的部位を囲む領域のＰＣＲ増幅を、以下のプライマー（５’－３’）を使用して遂行した：
Ｖｓｉｇ４－Ｆ：ＣＣＴＡＡＣＴＣＴＣＡＣＡＴＡＡＴＡＴＴ（配列番号２）
Ｖｓｉｇ４－Ｒ：ＡＴＴＡＣＡＧＡＧＡＡＣＣＴＡＴＧＴＡＣ（配列番号３）
接合体をＫＳＯＭ溶液中で胚盤胞期にまで培養し、タイロード液（ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｔ－１７８８）を使用して透明帯を除去し、試料を抽出試薬（Ｑｕａｎｔａ社、８４１５８）中で溶解した。Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡキット（Ｏｍｅｇａ社、Ｄ３３９６－０１）を使用して、組織（耳生検、肺、心臓、肝臓または精巣）からＤＮＡを抽出した。Ｖｓｉｇ４ ｓｇＲＮＡの標的部位を囲む領域のＰＣＲ増幅を、以下のプライマー（５’－３’）を使用して遂行した：
Ｖｓｉｇ４－Ｆ：ＣＣＴＡＡＣＴＣＴＣＡＣＡＴＡＡＴＡＴＴ（配列番号２）
Ｖｓｉｇ４－Ｒ：ＡＴＴＡＣＡＧＡＧＡＡＣＣＴＡＴＧＴＡＣ（配列番号３）
【0136】
組織試料からのＰＣＲ増幅を、Ｑ５ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼおよびｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＮＥＢ社）を使用して遂行した。Ｖｓｉｇ４サイクリング条件：９８℃で３０秒間、（９８℃で１０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で４５秒間）を３５サイクル、ならびに７２℃で５分間。
【0137】
胚盤胞試料からのＰＣＲ増幅を、ＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼおよびＨＦ緩衝液（ＮＥＢ社）を使用して遂行した。Ｖｓｉｇ４サイクリング条件：９８℃で３分間、（９８℃で３０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で４５秒間）を３５サイクル、ならびに７２℃で５分間。
【0138】
ＰＣＲ試料を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して浄化し、サンガー配列決定を行った（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社）。サンガートレースの配列デコンボリューションを、Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ（ＩＣＥ）ツール（Ｓｙｔｈｅｇｏ社）を使用して決定した。
【0139】
結果
ＣＲＩＳＰＲ活性をＸ連鎖遺伝子内のマイクロホモロジーの高い領域、Ｖ－ｓｅｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ４（Ｖｓｉｇ４）に限定することによって、モザイク現象を取り除くことができることを実証した。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を化膿性連鎖球菌のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質と事前に複合体形成させ、複合体を、インビトロで受精させた接合体に、精子注入の３時間後にエレクトロポレーションした。接合体を、生児出生のために、偽妊娠雌レシピエントマウスにトランスファーした。標的化したカット部位周囲のＰＣＲ増幅、サンガー配列決定およびデコンボリューションにより、子の遺伝子型を耳生検から同定して、モザイク現象を特定した。半分を超える（２１／３８、５５％）子が非モザイクであった。それと比較して、研究室で行われた他の試験では、モザイクまたは非編集動物のみがもたらされた（図２Ａ）。全く異なる組織における編集の度合を、異なる発生系譜に由来する臓器からＤＮＡを抽出することによって決定した。組織を、内胚葉、外胚葉、中胚葉および生殖細胞にそれぞれ起源をもつ肝臓、表皮、心臓および精巣から抽出した。臓器全体を消化し、ＤＮＡを抽出して分析した。分析したすべての動物（Ｎ＝７）が組織全体にわたって同一の編集結果を有し、これにより、すべての発生系譜（ｌｉｎａｇｅｓ）にわたってモザイク現象が効率的に取り去られたことが示された（図２Ｂ（Ｂ））。
ＣＲＩＳＰＲ活性をＸ連鎖遺伝子内のマイクロホモロジーの高い領域、Ｖ－ｓｅｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ４（Ｖｓｉｇ４）に限定することによって、モザイク現象を取り除くことができることを実証した。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を化膿性連鎖球菌のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質と事前に複合体形成させ、複合体を、インビトロで受精させた接合体に、精子注入の３時間後にエレクトロポレーションした。接合体を、生児出生のために、偽妊娠雌レシピエントマウスにトランスファーした。標的化したカット部位周囲のＰＣＲ増幅、サンガー配列決定およびデコンボリューションにより、子の遺伝子型を耳生検から同定して、モザイク現象を特定した。半分を超える（２１／３８、５５％）子が非モザイクであった。それと比較して、研究室で行われた他の試験では、モザイクまたは非編集動物のみがもたらされた（図２Ａ）。全く異なる組織における編集の度合を、異なる発生系譜に由来する臓器からＤＮＡを抽出することによって決定した。組織を、内胚葉、外胚葉、中胚葉および生殖細胞にそれぞれ起源をもつ肝臓、表皮、心臓および精巣から抽出した。臓器全体を消化し、ＤＮＡを抽出して分析した。分析したすべての動物（Ｎ＝７）が組織全体にわたって同一の編集結果を有し、これにより、すべての発生系譜（ｌｉｎａｇｅｓ）にわたってモザイク現象が効率的に取り去られたことが示された（図２Ｂ（Ｂ））。
【0140】
誘発された遺伝子修飾を次の世代に伝達する非モザイクの初代動物を創出することは、迅速な繁殖を創出するために不可欠である。これを試験するために、７塩基対（ｂｐ）欠失を含有する非モザイクの雌由来の卵母細胞をインビトロで野生型雄由来の精子と受精させ、得られた接合体を胚盤胞期にまで培養した。７つの胚盤胞を個別に収集し、溶解し、遺伝子修飾の存在について分析した。７つの胚盤胞のうちの２つは５０％が野生型で５０％が７ｂｐ欠失の遺伝子型を有したが、残りの５つは７ｂｐ欠失のみを含有した（図２Ｃ）。Ｖｓｉｇ４のように、遺伝形質パターンは伴性遺伝子に特徴的である。生殖細胞系伝達を、１匹の野生型雄および２匹の編集された雌から成る３匹の繁殖をセットアップすることにより、さらに特徴付けた（図３）。調べたすべての動物が、それらの遺伝子修飾を次の世代に伝えることができた。
【0141】
［実施例２］
上記の、Ｖｓｉｇ４遺伝子において使用した同じ方法論を、他の遺伝子：Ｃｃｒ１およびＰｒｄｍ１４において繰り返した。Ｃｃｒ１およびＰｒｄｍ１４用のＳｐＣａｓ９シングルガイドＲＮＡを、上記のようにデザインした。本発明の方法を他のモデルに拡張することにより、方法論の一般化が可能であることを実証する。方法が試験された各例において、非モザイクの実験コホートを作製した。
上記の、Ｖｓｉｇ４遺伝子において使用した同じ方法論を、他の遺伝子：Ｃｃｒ１およびＰｒｄｍ１４において繰り返した。Ｃｃｒ１およびＰｒｄｍ１４用のＳｐＣａｓ９シングルガイドＲＮＡを、上記のようにデザインした。本発明の方法を他のモデルに拡張することにより、方法論の一般化が可能であることを実証する。方法が試験された各例において、非モザイクの実験コホートを作製した。
【0142】
重要なことには、Ｃｃｒ１の実験は、複雑な遺伝的背景（Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ）上で遂行したものであり、本アプローチが、野生型遺伝子の状況においてだけではなく、事前に確立された疾患モデル上でも機能することを実証した。Ｐｒｄｍ１４は、始原生殖細胞（ＰＧＣ）が備える特性において基本となる役割を果たしており、変異は不妊をもたらす。従って、Ｐｒｄｍ１４－／－系統を確立して繁殖させることはできないが、非モザイクのＰｒｄｍ１４－／－系統のコホートを、本発明の方法を使用してオンデマンドに作製することはできる。これらの実験の結果を図４に示す。表現型に関するＰｒｄｍ１４－／－の結果を図５に示す。
Ｃｃｒ１ ｓｇＲＮＡ：ＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＴＴＡＴＴＡＣＣＴ（配列番号４）
Ｐｒｄｍ１４ ｓｇＲＮＡ：ＧＧＴＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡ（配列番号５）
Ｃｃｒ１ ｓｇＲＮＡ：ＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＴＴＡＴＴＡＣＣＴ（配列番号４）
Ｐｒｄｍ１４ ｓｇＲＮＡ：ＧＧＴＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡ（配列番号５）
【0143】
【表3】
【0144】
［実施例３］
さらに、本発明者らは、単一の編集結果を亢進するためにどのガイドＲＮＡを使用するかを予測するだけでなく、大規模な欠失を達成させるためにどのガイドＲＮＡのペアを使用すべきか予測するための本発明の方法の使用について検討した。
さらに、本発明者らは、単一の編集結果を亢進するためにどのガイドＲＮＡを使用するかを予測するだけでなく、大規模な欠失を達成させるためにどのガイドＲＮＡのペアを使用すべきか予測するための本発明の方法の使用について検討した。
【0145】
欠失させた領域の機能を探索するために、または遺伝子ノックアウトを生成する代替のアプローチとして、大規模なゲノムの欠失を担持するモデルを生成することが望ましい場合がある。発明者らは、単一の優占的な編集結果（非モザイク）へと修復するＤＮＡ領域と比較して、多くの編集結果（モザイク）へと修復するＤＮＡ領域は、細胞が損傷を修復するために適合する（局所的な）配列を探すために、修復工程中に遅延を招くと考える。この提案された修復遅延を活用する、所望のゲノム領域に隣接する２つのガイドＲＮＡの使用は、大規模な欠失イベントの効率性を亢進するはずである。
【0146】
Ｙ連鎖精子形成レギュレーター（Ｙ－ｌｉｎｋｅｄ ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、Ｄｄｘ３ｙ、をノックアウトに対して標的化した。エクソンの除去によってコード配列のフレームがずれるように、Ｄｄｘ３ｙのクリティカルなエクソンを囲む領域にＣＲＩＳＰＲデザインを限定した。少数または多数の編集結果をそれぞれもたらすと予測されるマイクロホモロジーの高いまたは低い領域を標的化するガイドＲＮＡのペアを、上記のガイドデザインプロトコールを使用してデザインした（図６Ａ）。マイクロホモロジーの高い領域を標的化するｇＲＮＡを選択するために、上記と同じ方法を使用した。マイクロホモロジーの低い領域を標的化するガイドＲＮＡを選択するために、上記のデザイン法における工程４に下位１０個のｇＲＮＡを選択することを含め、工程５を外し、工程８に下位３個のｇＲＮＡを選択することを含め、最終工程に最も高いモザイク現象をもたらすことが見出されたｇＲＮＡを選択することを含めた。これを、欠失させるべきＤＮＡ配列を囲む５’フランクおよび３’フランク領域の両方に対して行った。
【0147】
欠失させるべき介在ＤＮＡ配列の３’フランクを標的化するｇＲＮＡおよび５’フランクを標的化するｇＲＮＡの両方を使用して、接合体を上記に説明したようにインビトロで編集し、上記で説明したＰＣＲおよび個々の胚盤胞の配列決定により分析した。データは、両条件で欠失イベントが生成したが、マイクロホモロジーの低い群においてより多くの欠失イベントが生成したことを示す（６３％対２８％）（図６Ｂ）。これらのデータは、マイクロホモロジーの低いガイドＲＮＡの隣接ペアが、介在ＤＮＡ配列の切除を亢進することを示す。
【0148】
マイクロホモロジーの低い領域を標的化して欠失を亢進させるｇＲＮＡのペアを使用することのコンセプトを、遺伝子Ｇａｔａ１の状況においてさらに検討した。結果を図６Ｃおよび図６Ｄに示す。図６Ｄは、マイクロホモロジーの低い領域に対して標的化させたｇＲＮＡのペアを使用すると、ｇＲＮＡのペアをマイクロホモロジーの高い領域に対して標的化させるよりも高い率で、大規模な欠失が生成することを特に示す。
ＤＤＸ３ｙ＿５’＿ＨＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＴＣＣＡＧＴＧＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＴＡＣ（配列番号１０）
ＤＤＸ３ｙ＿３’＿ＨＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＴＡＧＴＡＡＡＴＴＣＴＴＡＧＧＴＡＡＧＴ（配列番号１１）
ＤＤＸ３ｙ＿５’＿ＬＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＣＣＣＡＧＴＡＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣ（配列番号１２）
ＤＤＸ３ｙ＿３’＿ＬＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＡＡＴＣＴＴＡＡＣＴＴＡＧＣＡＡＡＧＴＣ（配列番号１３）
Ｇａｔａ１＿５’＿ＨＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＧＣＣＧＣＡＧＴＡＡＣＡＧＧＣＴＧＴＣＴ（配列番号１４）
Ｇａｔａ１＿３’＿ＨＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＡＣＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＣ（配列番号１５）
Ｇａｔａ１＿５’＿ＬＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＧＧＣ（配列番号１６）
Ｇａｔａ１＿３’＿ＬＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡＧＣＣＣＣ（配列番号１７）
ＤＤＸ３ｙ＿５’＿ＨＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＴＣＣＡＧＴＧＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＴＡＣ（配列番号１０）
ＤＤＸ３ｙ＿３’＿ＨＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＴＡＧＴＡＡＡＴＴＣＴＴＡＧＧＴＡＡＧＴ（配列番号１１）
ＤＤＸ３ｙ＿５’＿ＬＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＣＣＣＡＧＴＡＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣ（配列番号１２）
ＤＤＸ３ｙ＿３’＿ＬＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＡＡＴＣＴＴＡＡＣＴＴＡＧＣＡＡＡＧＴＣ（配列番号１３）
Ｇａｔａ１＿５’＿ＨＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＧＣＣＧＣＡＧＴＡＡＣＡＧＧＣＴＧＴＣＴ（配列番号１４）
Ｇａｔａ１＿３’＿ＨＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＡＣＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＣ（配列番号１５）
Ｇａｔａ１＿５’＿ＬＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＧＧＣ（配列番号１６）
Ｇａｔａ１＿３’＿ＬＭＨ ｓｇＲＮＡ：ＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡＧＣＣＣＣ（配列番号１７）
【0149】
【表4】
【0150】
［実施例４］
ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集は、全般的な非効率性／毒性およびモザイク現象を喫する。この状況では、これらの両要素が、これらの次世代治療法の治療可能性および安全性プロファイルを制限する役目を果たす。本発明の方法を、ＣＴＬＡ４中のイントロンに対するＳｐＣａｓ９シングルガイドＲＮＡを生成するためにさらに使用し、ＨＥＫ２９３Ｔおよびヒト初代Ｔ細胞中で試験した。
ＣＴＬＡ４＿ｉｎｔｒｏｎ ｓｇＲＮＡ：ＴＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＡＡＣＴＡＡＧ（配列番号２２）
ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集は、全般的な非効率性／毒性およびモザイク現象を喫する。この状況では、これらの両要素が、これらの次世代治療法の治療可能性および安全性プロファイルを制限する役目を果たす。本発明の方法を、ＣＴＬＡ４中のイントロンに対するＳｐＣａｓ９シングルガイドＲＮＡを生成するためにさらに使用し、ＨＥＫ２９３Ｔおよびヒト初代Ｔ細胞中で試験した。
ＣＴＬＡ４＿ｉｎｔｒｏｎ ｓｇＲＮＡ：ＴＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＡＡＣＴＡＡＧ（配列番号２２）
【0151】
【表5】
【0152】
ＰＢＭＣ細胞を刺激するための方法
抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を、滅菌ＰＢＳ中に、５μｇ／ｍＬの最終濃度で希釈し、３枚の９６ウェルプレートに対して、１ウェルにつき５０μｌを添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベートする。各プレートを２００μＬのＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣ細胞（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を、７ｍＬの温めた培地（ＲＰＭＩ ｇｌｕｔａｍａｘ ２１８７５－０３４、１０％ ＨＩ－ＦＢＳ、１．７５μＬ ＢＭＥ）中で復活させる。４２５ｇにおいて、５分の遠心を３回行う。最終的に得られた沈殿物を１０ｍＬの培地中に再懸濁し、細胞数をカウントする。６０，０００細胞／２００μＬの濃度の細胞、５μｇ／ｍｌの最終濃度の抗ＣＤ２８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）および２０ｎｇ／ｍＬの最終濃度のＩＬ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を含有する細胞懸濁液を作る。細胞懸濁液を、準備した９６ウェルプレートに、６０，０００細胞／ウェルおよび２００μＬ／ウェルで分注する。インキュベーター内に７２時間置く。
抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を、滅菌ＰＢＳ中に、５μｇ／ｍＬの最終濃度で希釈し、３枚の９６ウェルプレートに対して、１ウェルにつき５０μｌを添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベートする。各プレートを２００μＬのＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣ細胞（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を、７ｍＬの温めた培地（ＲＰＭＩ ｇｌｕｔａｍａｘ ２１８７５－０３４、１０％ ＨＩ－ＦＢＳ、１．７５μＬ ＢＭＥ）中で復活させる。４２５ｇにおいて、５分の遠心を３回行う。最終的に得られた沈殿物を１０ｍＬの培地中に再懸濁し、細胞数をカウントする。６０，０００細胞／２００μＬの濃度の細胞、５μｇ／ｍｌの最終濃度の抗ＣＤ２８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）および２０ｎｇ／ｍＬの最終濃度のＩＬ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を含有する細胞懸濁液を作る。細胞懸濁液を、準備した９６ウェルプレートに、６０，０００細胞／ウェルおよび２００μＬ／ウェルで分注する。インキュベーター内に７２時間置く。
【0153】
刺激した細胞をエレクトロポレーションするための方法
細胞数をカウントし、生存率を記録する。生存率が６５％を超えた場合にのみエレクトロポレーションを進める。３μｇのＴｒｕｅＣｕｔ Ｃａｓ９タンパク質ｖ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と６０ｐｍｏｌの合成ガイドＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ社）を、室温で２０分間、複合体形成させる。細胞をペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、再度ペレット化する。１サンプルにつき２００，０００細胞で細胞をＰ３＋緩衝液（Ｌｏｎｚａ社）中に再懸濁し、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体と混合し、このうちの２０μＬをエレクトロポレーションキュベットに添加する。プログラムＥＯ １１５を使用してエレクトロポレーションし、３７℃で１０分間インキュベートし、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２を含む培地の溶液を１ウェルにつき１ｍＬ含有する予熱した２４ウェルプレートにトランスファーする。細胞をインキュベーター内に７２時間置いた後、分析のために回収する。
細胞数をカウントし、生存率を記録する。生存率が６５％を超えた場合にのみエレクトロポレーションを進める。３μｇのＴｒｕｅＣｕｔ Ｃａｓ９タンパク質ｖ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と６０ｐｍｏｌの合成ガイドＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ社）を、室温で２０分間、複合体形成させる。細胞をペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、再度ペレット化する。１サンプルにつき２００，０００細胞で細胞をＰ３＋緩衝液（Ｌｏｎｚａ社）中に再懸濁し、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体と混合し、このうちの２０μＬをエレクトロポレーションキュベットに添加する。プログラムＥＯ １１５を使用してエレクトロポレーションし、３７℃で１０分間インキュベートし、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２を含む培地の溶液を１ウェルにつき１ｍＬ含有する予熱した２４ウェルプレートにトランスファーする。細胞をインキュベーター内に７２時間置いた後、分析のために回収する。
【0154】
発明者らは、生成したガイドＲＮＡが、広範な濃度範囲でかつ２つの細胞タイプにわたって、遺伝子編集において非常に効率的であったことを見出した。生成したガイドＲＮＡは、患者由来初代Ｔ細胞に対して、ユビキタスなＨＥＫ２９３Ｔがん細胞株に匹敵するレベルの９０％の遺伝子編集効率を有し（図７Ａ）、細胞の生存率は、濃度範囲にわたって維持された（図７Ｂ）。さらに、ガイドＲＮＡは、大部分の編集（７０％）が＋１ｂｐ挿入であったために初代Ｔ細胞におけるモザイク現象も低減させ、モザイク現象のレベルは３０％未満に低減した（図８Ａおよび図８Ｂ）。
【0155】
さらに、本発明の方法を使用して、初代Ｔ細胞中の遺伝子ＣＴＬＡ４（上記）、ＰＤ－１（ＰＤＣＤ１）、ＬＡＧ－３、ＰＴＰＮ２、ＤＧＫおよびＨＡＶＣＲ２に対するガイドＲＮＡをデザインし、それらの編集効率、ノックアウト効率および純度を、先行する方法；Tzelepis et al. Cell Reports, Volume 17, Issue 4, 18th October 2016において記載されるサンガー（図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃ）法によってデザインされたｇＲＮＡと比較した。本発明の方法によってデザインされたｇＲＮＡはより効果的であった。
【0156】
本発明の方法または従来のサンガー法のいずれかを使用してデザインされたｓｇＲＮＡの表：
【0157】
【表6-1】
【表6-2】
【表6-3】
【0158】
各遺伝子に対して使用したプライマーの表：
【表7-1】
【表7-2】
【0159】
従って、本発明の方法は、患者由来Ｔ細胞の効率的な編集を可能にする一方で、モザイク現象を低減させることができる。
【0160】
本発明者らは、ガイドＲＮＡの合理的デザインにより、モザイク現象を制御する能力を実証した。有利には、これは、すべての組織全体にわたって均一な編集を有しかつ設計された編集を次の世代に伝える能力を有する動物の直接的な創出を可能にする。最小限の動物を使用して、わずかの時間において実験用のマウス疾患モデルを迅速に創出するために、本方法を使用することができる。本発明者らは、治療上重要なヒト細胞におけるモザイク現象を制御する能力をさらに実証した。特に、本発明者らは、ここで本方法を使用して、制御された様式でヒト初代Ｔ細胞を編集し、それによって治療のために直接使用することができる均一な細胞集団を迅速に創出した。
【0161】
加えて、発明者らは、均一な編集を創出する能力だけではなく、マイクロホモロジーの低い領域を標的化することによってマウス中に所望の大規模な欠失を創出するために本方法を使用する能力も実証した。それにより、遺伝子ノックアウトモデルを生成するための効率的な代替アプローチを提供する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【配列表】
【国際調査報告】