▶ オキシ ロー カーボン ベンチャーズ エルエルシーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-01
(54)【発明の名称】二酸化炭素からエチレンを製造する方法
(51)【国際特許分類】
C12P 5/02 20060101AFI20230424BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230424BHJP
C12N 9/02 20060101ALN20230424BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20230424BHJP
【ＦＩ】
C12P5/02 ZNA
C12M1/00 C
C12N9/02
C12N15/53
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022555888
(86)(22)【出願日】2021-03-19
(85)【翻訳文提出日】2022-11-08
(86)【国際出願番号】 US2021023163
(87)【国際公開番号】W WO2021188897
(87)【国際公開日】2021-09-23
(31)【優先権主張番号】62/992,689
(32)【優先日】2020-03-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/052,664
(32)【優先日】2020-07-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522118573
【氏名又は名称】オキシ ロー カーボン ベンチャーズ エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】110002321
【氏名又は名称】弁理士法人永井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パワーズ，ドナルド エイチ
(72)【発明者】
【氏名】カリミ，タヘラ
(72)【発明者】
【氏名】ゼラー，ザ サード，ロバート エル
(72)【発明者】
【氏名】ペース，ジョン
(72)【発明者】
【氏名】ガーモン，マイケル エー
(72)【発明者】
【氏名】ヌーイェン，トロング フー
【テーマコード（参考）】
4B029
4B050
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B029AA01
4B029BB02
4B029BB04
4B029CC02
4B029DA05
4B029DF05
4B029DG10
4B050CC04
4B050DD02
4B050KK01
4B050LL05
4B064AB04
4B064CA02
4B064CA08
4B064CA19
4B064DA16
(57)【要約】
方法であって、（ｉ）１体積％を超える二酸化炭素を含むガス流を提供することと、（ｉｉ）水を提供することと、（ｉｉｉ）前記二酸化炭素及び前記水を、光の存在下で有機中間体及び酸素ガスに変換することと、（ｉｖ）前記有機中間体から前記酸素ガスを分離することと、（ｖ）前記有機中間体から前記酸素ガスを分離する前記工程の後に、前記有機中間体をエチレン及び二酸化炭素に変換することと、を含む方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
方法であって、（ｉ）１体積％を超える二酸化炭素を含むガス流を提供することと、
（ｉｉ）水を提供することと、
（ｉｉｉ）前記二酸化炭素及び前記水を、光の存在下で有機中間体及び酸素ガスに変換することと、
（ｉｖ）前記有機中間体から前記酸素ガスを分離することと、
（ｖ）前記有機中間体から前記酸素ガスを分離する前記工程の後に、前記有機中間体をエチレン及び二酸化炭素に変換することと
を含む方法。
【請求項2】
請求項１に記載の方法であって、前記有機中間体をエチレン及び二酸化炭素に変換する前記工程（ｉｉｉ）が、二酸化炭素及び水を有機中間体に変換する前記工程（ｉ）からの余剰水の存在下で行われ、前記有機中間体をエチレン及び二酸化炭素に変換する前記工程（ｉｉｉ）が、二酸化炭素及び水を有機中間体及び酸素ガスに変換する前記工程（ｉ）で形成された前記有機中間体の一部のみを消費し、さらに、前記余剰水及び前記有機中間体を、前記有機中間体をエチレン及び二酸化炭素に変換する前記工程（ｉｉｉ）から前記二酸化炭素及び前記水を有機中間体に変換する前記工程（ｉ）に送り戻す工程を含む、方法。
【請求項3】
請求項１に記載の方法であって、二酸化炭素及び水を有機中間体及び酸素ガスに変換する前記工程（ｉ）が、光エネルギーの存在下で、前記二酸化炭素から有機中間体及び酸素ガスを生成する微生物を含む第１のバイオリアクタ内で行われる、方法。
【請求項4】
前記ガス流が、３体積％を超える二酸化炭素を含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
燃焼工程からの煙道ガス流を圧縮して、二酸化炭素を含有する流れを形成する工程をさらに含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
前記有機中間体から酸素を分離する前記工程（ｉｉ）が、前記有機中間体をエチレン及び二酸化炭素に変換する前記工程（ｉｉｉ）に導入される有機中間体濃厚流を生成する、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
前記有機中間体濃厚流が３０ｐｐｍ未満の酸素を含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
酸素ガスを分離する前記工程が、前記第１のバイオリアクタから酸素ガスを放出することを含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
前記有機中間体をエチレン及び二酸化炭素に変換する前記工程（ｉｉｉ）が、前記有機中間体をエチレン及び二酸化炭素に変換するための酵素を生成する微生物を含む第２のバイオリアクタ内で行われる、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
前記有機中間体をエチレン及び二酸化炭素に変換する前記工程（ｉｉｉ）が、光エネルギーが実質的に存在しない状態で行われる、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
前記エチレン及び前記二酸化炭素が生成物流を形成する、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
前記生成物流の中の酸素ガスを二酸化炭素に変換する工程をさらに含む、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
前記生成物流から水を取り出す工程をさらに含む、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
前記生成物流から二酸化炭素を分離することをさらに含む、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
【請求項15】
前記エチレンから二酸化炭素を分離する前記工程が、エチレン濃厚流を生成する、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。
【請求項16】
前記エチレンから前記二酸化炭素を分離する前記工程が、二酸化炭素流を生成し、前記二酸化炭素流は、二酸化炭素を有機中間体及び水に変換する工程（ｉ）に導入される、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。
【請求項17】
二酸化炭素及び水を有機中間体及び酸素ガスに変換する前記工程が、第１のバイオリアクタ内で行われる、請求項１～１６のいずれかに記載の方法。
【請求項18】
前記有機中間体からの前記酸素ガスの前記分離が、前記有機中間体が含有される水性媒体から前記酸素ガスを放出することを含む、請求項１～１７のいずれかに記載の方法。
【請求項19】
前記有機中間体から前記酸素ガスを分離する前記工程の後に、前記有機中間体をエチレン及び二酸化炭素に変換する前記工程が、第２のバイオリアクタ内で行われる、請求項１～１８のいずれかに記載の方法。
【請求項20】
エチレンを生成するためのシステムであって、前記システムは、（ｉ）二酸化炭素を有機中間体に変換する光合成微生物を含む第１のバイオリアクタであって、二酸化炭素入口及び有機中間体用出口を有する、前記第１のバイオリアクタと、
（ｉｉ）前記第１のバイオリアクタと流体連通しており、前記第１のバイオリアクタで生成された有機中間体をエチレンに変換する微生物を含む第２のバイオリアクタであって、エチレンを含むガス状材料のための出口を有し、未反応の有機中間体を含む流体材料のための出口を有する、前記第２のバイオリアクタと
を含む、システム。
【請求項21】
前記第２のバイオリアクタの流体材料のための前記出口が、前記第１のバイオリアクタと流体連通している、請求項２０に記載のシステム。
【請求項22】
前記第２のバイオリアクタのガス状材料のための前記出口が、二酸化炭素分離器と流体連通している、請求項２０又は２１に記載のシステム。
【請求項23】
前記二酸化炭素分離器が精製二酸化炭素のための出口を含み、精製二酸化炭素のための前記出口が前記第１のバイオリアクタと流体連通している、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年３月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／９９２，６８９号、及び２０２０年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／０５２，６６４号の利益を主張する。
【0002】
本発明の実施形態は、二酸化炭素をエチレンに変換するための方法及びシステムを提供する。
【背景技術】
【0003】
大気中の二酸化炭素レベルに対する懸念と相まって、化石燃料の長期にわたる利用可能性に対する懸念により、二酸化炭素の固定を介して石油系製品を製造するための生合成法の開発が強化されている。すなわち、二酸化炭素を、より大きな有機分子のための燃料又は有機構成要素として使用することができる有用な有機化合物に変換するために、光合成プロセスが用いられている。
【0004】
例えば、米国特許第７，８０７，４２７号明細書では、二酸化炭素をグルコース及び酢酸などの中間生成物に変換するための、遺伝子改変シアノバクテリアなどの光合成生物の使用が教示されている。後の工程で、メタン生成細菌を使用して中間生成物がメタンに変換される。メタンは回収され、燃料として使用するために貯蔵することができる。
【0005】
エチレンは、多くの工業にとって最も重要な化学原料として広く知られており、二酸化炭素の固定によってエチレンを生合成するためのいくつかの方法が提案されている。
【0006】
シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）は、「ｅｆｅ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｆｏｒｍｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）」と呼ばれるエチレン形成酵素によって触媒される一段階反応で、トリカルボン酸（ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ：ＴＣＡ）回路中間体のアルファ－ケトグルタル酸を使用してエチレンを合成することが知られている。二酸化炭素からエチレンを直接生成することを目的として、米国特許第９，３０９，５４１号明細書には、光栄養的にエチレンを生成することができる株を作り出すために、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）などの宿主においてｅｆｅ遺伝子を発現及び過剰発現させる方法が開示されている。言い換えれば、生物工学により光独立栄養生物を改変して、炭素固定の生成物が一段階反応でエチレンに変換される。現在の研究では、光独立栄養生物を改変してエチレンを生成することに焦点が当てられているが、エチレンの回収が課題となり得る。Ｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｂｉｏｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＦＯＲ ＢＩＯＦＵＥＬＳ ２０１４，７：３３に概説されているように、Ｏ2が光合成系においてエチレンと同時生成される場合、Ｏ2の存在下でのエチレンの引火性に関する安全上の重要な課題があり、リスクを軽減するための工学的設計が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】米国特許第７，８０７，４２７号明細書
【特許文献2】米国特許第９，３０９，５４１号明細書
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｂｉｏｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＦＯＲ ＢＩＯＦＵＥＬＳ ２０１４，７：３３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の１つ又は複数の実施形態は、（ｉ）１体積％を超える二酸化炭素を含むガス流を提供することと、（ｉｉ）水を提供することと、（ｉｉｉ）前記二酸化炭素及び前記水を、光の存在下で有機中間体及び酸素ガスに変換することと、（ｉｖ）前記有機中間体から前記酸素ガスを分離することと、（ｖ）前記有機中間体から前記酸素ガスを分離する前記工程の後に、前記有機中間体をエチレン及び二酸化炭素に変換することと、を含む方法を提供する。
【0010】
本発明のさらに他の実施形態は、エチレンを生成するためのシステムを提供し、前記システムは、（ｉ）二酸化炭素を有機中間体に変換する光合成微生物を含む第１のバイオリアクタであって、二酸化炭素入口及び有機中間体用出口を有する、第１のバイオリアクタと、（ｉｉ）第１のバイオリアクタと流体連通し、第１のバイオリアクタで生成された有機中間体をエチレンに変換する微生物を含む第２のバイオリアクタであって、エチレンを含むガス状材料のための出口を有し、未反応の有機中間体を含む流体材料のための出口を有する、第２のバイオリアクタと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】本発明の実施形態を実施するためのシステムの概略図である。
【0012】
【図2】本発明の実施形態における、二酸化炭素を送達するためのサブシステムの概略図である。
【0013】
【図3】本発明の実施形態を実施するための第２の光合成バイオリアクタを含む代替システムの概略図である。
【0014】
【図4】本発明の実施形態を実施するための酸素－燃料燃焼システムを含むシステムの概略図である。
【0015】
【図5】本発明の実施形態を実施するための上流の二酸化炭素の精製を含むシステムの概略図である。
【0016】
【図6】本発明の１つ又は複数の実施形態に適用可能なエチレン精製及び圧縮のスキームの概略図である。
【0017】
【図7】本発明の１つ又は複数の実施形態を実施するための二酸化炭素の膜分離を含む代替システムの概略図である。
【0018】
【図8】本発明の実施形態を実施するための単一のバイオリアクタを含む代替システムの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明の実施形態は、工業的に有意なレベルで二酸化炭素からエチレンを生合成する方法の開示されたものに、少なくとも部分的に基づいている。本発明の実施形態によれば、二酸化炭素は、最初に、酸素ガスの副生成物の生成と共に、有機中間体に光合成的に変換される。次いで、副生成物の酸素ガスは有機中間体から分離され、次いで、有機中間体は、副生成物の酸素ガスが明らかに存在しない状態で、生物学的にエチレンに変換される。エチレンの生合成に関連する現在の技術では一段階合成に焦点が当てられているが、本発明の２段階法は、工業的に有意なレベルでのエチレン及び酸素ガスの同時生成に関連する安全性の懸念に対処するものである。また、有機中間体のエチレンへの生物変換により副生成物の二酸化炭素が生成され、このことが全体的な炭素効率に影響を与える。さらに、エチレン生成物流中の二酸化炭素の量は、ほとんどの二酸化炭素投入流（例えば煙道ガス）に対してかなり多く、したがって、エチレン生成物流内の二酸化炭素は、適切に管理されれば貴重な資源となり得る。したがって、本発明の実施形態は、副生成物の二酸化炭素のための管理方法を提供し、その方法は、これに限定されるものではないが、二酸化炭素を有機中間体に光合成的に変換することを含み、その有機中間体は、有機中間体を生物学的にエチレンに変換する工程に再循環させることができる。またさらに、有機中間体をエチレンに生物学的に変換する工程は、定常状態又は定常状態付近で運転する連続撹拌槽反応器などの工業用反応器を使用することによって、商業規模で効率的に実現することができ、その定常状態が、有機中間体の不完全な消費、炭素効率の損失、及び貴重な原料の損失に影響を与える。したがって、本発明の実施形態は、有機中間体がエチレンに変換される反応器からの流出流を適切に管理することによって、これらの問題に対する解決策を提供する。
【0020】
方法及びシステムの概要
本発明の実施形態は、二酸化炭素をエチレンに変換するためのシステム２０を示す図１を参照して説明することができる。当該システムは、第１のバイオリアクタ２１と、それに直列で続く第２のバイオリアクタ４１とを含む。第１のバイオリアクタ２１は、中間生成物導管３１を介して第２のバイオリアクタ４１と直接的又は間接的に流体連通している。第２のバイオリアクタ４１はまた、中間体の再循環導管３３を介して第１のバイオリアクタ２１と流体連通している。二酸化炭素分離器６１が第２のバイオリアクタ４１の下流にあり、導管５１を介して第２のバイオリアクタ４１と直接的又は間接的に流体連通している。二酸化炭素分離器６１はまた、二酸化炭素の再循環導管５３を介して、直接的又は間接的に第１のバイオリアクタ２１と流体連通してもよい。
本発明の実施形態は、二酸化炭素をエチレンに変換するためのシステム２０を示す図１を参照して説明することができる。当該システムは、第１のバイオリアクタ２１と、それに直列で続く第２のバイオリアクタ４１とを含む。第１のバイオリアクタ２１は、中間生成物導管３１を介して第２のバイオリアクタ４１と直接的又は間接的に流体連通している。第２のバイオリアクタ４１はまた、中間体の再循環導管３３を介して第１のバイオリアクタ２１と流体連通している。二酸化炭素分離器６１が第２のバイオリアクタ４１の下流にあり、導管５１を介して第２のバイオリアクタ４１と直接的又は間接的に流体連通している。二酸化炭素分離器６１はまた、二酸化炭素の再循環導管５３を介して、直接的又は間接的に第１のバイオリアクタ２１と流体連通してもよい。
【0021】
本発明の実施形態によれば、第１のバイオリアクタ２１は、バイオリアクタ２１に送給される二酸化炭素及び水を有機中間体に変換する光合成生物培養物（すなわち光合成微生物）を含む。この変換は、第１のバイオリアクタ２１に供給される光エネルギーの存在下で行われる。有機中間体の合成は、反応媒体として作用する余剰水の存在下で行われ、余剰水は中間生成物流の担体として作用する。１つ又は複数の実施形態において、有機中間体は水に可溶性である。当業者が認識するように、光合成生物培養物は、接種反応器２３からバイオリアクタ２１に供給することができる。
【0022】
バイオリアクタ２１内で有機中間体が形成される間に、副生成物として酸素ガスが生成される。本発明の態様によれば、酸素ガスは、中間生成物流が第２のバイオリアクタ４１に導入される前に、有機中間体から分離される。例えば、第１のバイオリアクタ２１から、その反応器内の窒素ガスなどの他の揮発性物質と共に酸素ガスを放出することができる。
【0023】
有機中間体は、中間生成物流内で、直接的又は間接的に、第１の反応器２１から中間生成物導管３１を介して第２のバイオリアクタ４１に移される。１つ又は複数の実施形態において、中間生成物流を、その流れがバイオリアクタ２１を出る際に濾過することができる。運転中、前記流れがバイオリアクタ２１を出る際の中間生成物流の濾過によって、光合成微生物を固定化するために使用されるいかなる媒体の移動も防ぐことができ、それによって第１のバイオリアクタ２１から第２のバイオリアクタ４１への微生物の移動を防ぐことに役立つ。
【0024】
前記流れがバイオリアクタ２１を出る際に中間生成物流を濾過することに加えて、又はその代わりに、バイオリアクタ２１とバイオリアクタ４１との間に配置された１つ又は複数の中間ユニットで、中間生成物流を濾過及び／又は滅菌することができる。例えば、図２を参照すると、第１のバイオリアクタ２１と第２のバイオリアクタ４１との間に、任意選択の滅菌ユニット３５を配置することができる。ユニット３５は濾過ユニットを含んでもよい。濾過ユニットに加えて、又はその代わりに、ユニット３５は遠心分離ユニットを含んでもよい。又は、他の実施形態において、ユニット３５は、濾過又は遠心分離に加えて、又はその代わりに、浄化ユニット（例えば沈殿槽）を含んでもよい。濾過、遠心分離、及び／又は浄化の代わりに、又はそれに加えて、ユニット３５は滅菌ユニットを含んでもよい。例えば、滅菌ユニットにより、ＵＶ滅菌、熱、又はガンマ線を利用して中間生成物流が処理されてもよく、これは、第１のバイオリアクタ２１から第２のバイオリアクタ４１へ、いかなる生きた微生物の導入も防ぐために行われてもよい。
【0025】
１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタ４１は、有機中間体をエチレンに変換するエチレン生成生物培養物（すなわちエチレン生成生物）を含む。
【0026】
当業者が認識しているように、微生物培養物をそれぞれのバイオリアクタに導入するために、いくつかのサブシステムを設計することができる。当業者なら、これらの目的を達成するために適切なシステムを容易に設計することができる。例えば、複数の図を参照すると、接種反応器２３とも呼ばれ得る接種ユニット２３から、バイオリアクタ２１及び／又はバイオリアクタ４１に適切な微生物群を供給することができる。接種ユニット２３は、それぞれの微生物のための別個のチャンバ又は容器を含んでもよく、又はそれぞれの微生物のために別個のユニットが設けられてもよい。さらに、１つ又は複数のバイオリアクタからバイオマスを取り出すことが望ましい場合がある。１つ又は複数の実施形態において、本発明のシステムは、バイオリアクタのいずれか又は両方から得られたバイオマスを任意の固定化支持媒体から取り出し、システムから取り出すことができるバイオマス消化ユニット２５を含んでもよい。運転中、バイオマス消化ユニット２５を、バイオリアクタ２１、４１のいずれか又は両方と流体連通させることができ、又は、バイオマスを（任意選択で固定化材料と共に）手動で、それぞれの反応器から取り出すことができる。１つ又は複数の実施形態において、バイオマスをアミノ酸などの栄養素に変換し、微生物の栄養源としてバイオリアクタに戻すことができる。あるいは、バイオマスをシステムから取り出し、肥料などの他の用途に宛てることができる。
【0027】
バイオリアクタ４１内ではエチレン合成の副生成物として二酸化炭素が生成され、ガス状生成物流としてエチレン及び二酸化炭素が第２のバイオリアクタ４１から取り出される。液体流出流もまた、第２のバイオリアクタ４１を出る。この液体流出流は、水及び未反応の有機中間体を含んでもよく、この流れは、有機中間体の再循環導管３３を介して第１のバイオリアクタ２１に送り戻すことができる。図２に最もよく示されているように、水及び未反応の有機中間体を含む液体流出流は、濾過／滅菌ユニット３７で濾過及び／又は滅菌を受けることができる。この濾過及び／又は滅菌は、ユニット３５と同じ種類の技術を利用してもよく、したがって、ユニット３５に関する上記の解説がここに組み込まれる。当業者が認識しているように、エチレン生成微生物が第１のバイオリアクタ２１に決して移動しないようにすることが有用であり得る。
【0028】
第２のバイオリアクタ４１を出るガス状生成物流は、第２のバイオリアクタ４１の下流で、導管５１を介して直接的又は間接的に、二酸化炭素分離ユニット６１とも呼ばれ得る二酸化炭素分離器６１に送られる。分離器システム６１とも呼ばれ得る分離器６１内では、二酸化炭素がガス状生成物流から分離されて、導管５３によって運ばれる、エチレン濃厚流とも呼ばれ得る濃縮エチレン流を提供する。このエチレン濃厚流を下流の精製加圧ユニット１００に送ることができ、これについては本明細書でより詳細に説明する。分離器６１はまた、精製二酸化炭素流とも呼ばれ得る濃縮二酸化炭素流を生成し、この濃縮二酸化炭素流を、導管５５を介して第１のバイオリアクタ２１に送り戻すことができる。
【0029】
図３を参照して説明し得る代替の実施形態において、二酸化炭素分離器６１によって生成された精製二酸化炭素流を、導管５７を介して、二酸化炭素を有機中間体及び酸素ガスに光合成的に変換する光合成生物培養物を含む中間のバイオリアクタ７１（第２の光合成バイオリアクタ７１と呼ばれ得る）に送ることができる。有利には、バイオリアクタ７１への二酸化炭素送給流は、（二酸化炭素分離器６１を介した）精製二酸化炭素流であるため、第２の光合成バイオリアクタ７１を出るガス状副生成物流は比較的純粋な酸素ガス流を含み、その酸素ガス流は導管７５を介して送ることができる。比較的純粋な酸素流は、窒素ガス及びアルゴンガスを実質的に含まない流れを含んでおり、窒素ガス及びアルゴンガスが含まれればそれらを酸素ガスから分離するために複雑でかつ高価なプロセス（例えば空気分離技術）が必要であることを、本発明の文脈において当業者なら認識するであろう。しかし、本明細書で規定される比較的純粋な酸素ガス流の中の二酸化炭素の存在は有害ではなく、したがって、特に明記しない限り、二酸化炭素は、酸素ガス流からより容易に分離することができるため、比較的純粋な酸素ガス流内に存在してもよい。第１のバイオリアクタ２１と矛盾することなく、中間のバイオリアクタ７１は流出流を生成し、その流出流は、有機中間体及び水を含んでもよく、導管７９を介して第１のバイオリアクタ２１及び／又は第２のバイオリアクタ４１に送り戻すことができる。一般に示されるように、この流出流は、図２を参照して説明したように、ユニット３７で濾過及び／又は滅菌を受けてもよい。
【0030】
図面全体を通して示されるように、第２のバイオリアクタ４１を出、導管５１を介して送られるガス流は、ユニット６１での二酸化炭素分離の前に、任意選択で１つ又は複数の処理又は操作を受けることができる。例えば、圧縮ユニット４３でその流れを加圧することができる。加圧に加えて、又はその代わりに、ガス流は、任意選択で、酸素取出しユニット４５で酸素を取り出すための処理を受けることができる。酸素取出しユニット４５で二酸化炭素が作り出され得るので、ユニット４５で生成された二酸化炭素を取り出すことができる二酸化炭素分離ユニット６１の上流に酸素取出しユニット４５を配置することが有益であり得る。
【0031】
本発明のさらに別の実施形態は、図８を参照して説明することができる。示されるように、プロセス１２０は、上記の他のシステムに関して示された２つのバイオリアクタ２１、４１の代わりに、統合バイオリアクタ１２１とも呼ばれ得る単一の容器１２１を含む。運転中、バイオリアクタ１２１に供給される光エネルギーは、明サイクル及び暗サイクルを生成する形で制御される。運転中、統合バイオリアクタ１２１内の光合成微生物が、明サイクル中に二酸化炭素を有機中間体に変換し、次いで暗サイクル中に、統合バイオリアクタ１２１内のエチレン形成微生物が、暗サイクル中に有機中間体をエチレンに変換する。明サイクル中での酸素の生成中に、バイオリアクタ１２１から酸素を取り出すことができ、暗サイクル中でのエチレンの生成中に、バイオリアクタ１２１からエチレンを取り出すことができる。他の実施形態と矛盾することなく、エチレンが二酸化炭素と同時生成されてもよく、エチレン及び二酸化炭素は、上記の下流プロセスにおいて（例えば二酸化炭素スクラバ６１で）分離することができる。
【0032】
図２に戻り、本発明の方法は、二酸化炭素投入流の調整（すなわち、バイオリアクタ２１に前記流れを提供する前の前記流れの調整）を含んでもよい。１つ又は複数の実施形態において、導管１１によって運ばれる二酸化炭素投入流は、圧縮機１３で加圧されてもよい。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素投入流内の不活性ガス（例えば窒素）が最終的に反応器のヘッドスペースに入ることができるように、その投入流の（例えば圧縮機１３内での）加圧により、第１のバイオリアクタ２１内の対抗力に打ち勝つのに十分な圧力が獲得される。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素投入流は、約２～約２０ｐｓｉｇ、他の実施形態では約３～約１８ｐｓｉｇ、他の実施形態では約５～約１５ｐｓｉｇの圧力に加圧される。
【0033】
また、図２に最もよく示されているように、二酸化炭素投入流を、導管１７を介してバイオリアクタ２１に送達する前に、急冷器１５で冷却することができる。当業者が認識するように、急冷器１５は、冷却水ループ１５’を含む水冷ユニットを含んでもよく、冷却水ループ１５’は、水を冷却するための１つ又は複数の熱交換器を含んでもよい。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素投入流は、バイオリアクタ２１内の微生物培養物に有害な影響を及ぼす温度より低い温度に冷却される。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素投入流は、バイオリアクタ２１への送達前に、約１０～約８０℃、他の実施形態では約２０～約６０℃、他の実施形態では約３０～約５０℃の温度に冷却される。
【0034】
１つ又は複数の実施形態の二酸化炭素投入流はかなりの量の水を含んでもよく、その水の少なくとも一部が急冷器１５で冷却サイクルを介して凝縮されることになるので、かなりの量の水を消費する第１のバイオリアクタ２１に、急冷器１５からの水を送給することができる。１つ又は複数の実施形態において、急冷器１５で用いられる水、及び／又は第１のバイオリアクタ２１に送られる水流を苛性物質で処理して、水のｐＨを調整することができる。１つ又は複数の実施形態において、急冷器１５で用いられる水、及び／又は急冷器１５から第１のバイオリアクタ２１に送られる水は、５．５を超えるｐＨに、他の実施形態では６．０を超えるｐＨに、他の実施形態では６．５を超えるｐＨ（例えば、５．５～８．０又は６．０～７．５の範囲）に調整される。水の苛性処理によって、炭酸ナトリウムなどの炭酸塩が形成されることが予想され、これはｐＨ制御に関して第１のバイオリアクタ２１のためになるだけでなく、炭酸ナトリウム及び／又は重炭酸ナトリウムの形態の追加的な二酸化炭素源ももたらされる。当業者なら、炭酸ナトリウムと重炭酸ナトリウムとの間の望ましいバランスを得るために、条件を容易に調整し、かつ／又は追加的な成分（例えば塩酸）を提供することができる。特定の実施形態において、急冷器１５内の冷却水に提供される苛性ソーダは、本発明の実施態様に統合することができる他のプロセスに由来する。例えば、エチレン精製で苛性ソーダを使用することができ、かつ／又は、エチレン精製で、急冷器１５に取り込ませることができる炭酸ナトリウムを作り出すことができる。
【0035】
さらに他の実施形態において、他の実施形態に関して説明したように、第２のバイオリアクタ４１を出る液体流出流は、第１のバイオリアクタ２１に送り戻すことができ、任意選択で急冷器１５に送ることができる。１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタ４１を出る液体流出流は、まず、急冷器１５に送る前に滅菌ステーション３７で処理される。
【0036】
第１のバイオリアクタへの二酸化炭素供給流
本発明の方法は、有利には、二酸化炭素投入流と呼ばれ得る様々なガス源からの二酸化炭素を、エチレンに変換し得る有用な中間体に変換することができる。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素は、１％体積を超える、他の実施形態では３％体積を超える、他の実施形態では５％体積を超える、また他の実施形態では１０％体積を超える二酸化炭素を含む二酸化炭素投入流によって、システムに提供される。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素投入流は、燃焼プロセスの排気流（すなわち煙道ガス流）であるか、又はそれに由来する。当業者が認識しているように、排気流の組成は、燃焼プロセスの設計、及び燃焼プロセスで燃やされる燃料を含むいくつかの要因に基づいて変化し得る。例えば、煙道ガス流は、石炭燃焼炉、ガス燃焼炉、タービン発電機、及び酸素燃料燃焼プロセスに由来し得る。
本発明の方法は、有利には、二酸化炭素投入流と呼ばれ得る様々なガス源からの二酸化炭素を、エチレンに変換し得る有用な中間体に変換することができる。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素は、１％体積を超える、他の実施形態では３％体積を超える、他の実施形態では５％体積を超える、また他の実施形態では１０％体積を超える二酸化炭素を含む二酸化炭素投入流によって、システムに提供される。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素投入流は、燃焼プロセスの排気流（すなわち煙道ガス流）であるか、又はそれに由来する。当業者が認識しているように、排気流の組成は、燃焼プロセスの設計、及び燃焼プロセスで燃やされる燃料を含むいくつかの要因に基づいて変化し得る。例えば、煙道ガス流は、石炭燃焼炉、ガス燃焼炉、タービン発電機、及び酸素燃料燃焼プロセスに由来し得る。
【0037】
１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素投入流は、酸素燃焼（ｏｘｙｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ）とも呼ばれ得る酸素燃料燃焼（ｏｘｙ－ｆｕｅｌ ｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ）プロセスの排気流に由来し得る。当業者なら、これらの方法が、窒素及びアルゴンが実質的に存在しない状態での燃料（例えば炭化水素）の燃焼を含むことを認識している。例えば、これらのプロセスは、実質的に純粋な酸素（すなわち、窒素及びアルゴンガスを実質的に含まない）、又は純粋な酸素と再循環煙道ガスとの混合物が燃焼プロセスに供給される燃焼プロセスを含んでもよい。結果として、燃焼生成物はほとんどが二酸化炭素及び水であり、窒素副生成物又はアルゴンが実質的に少ない。有利には、酸素燃焼プロセスからの二酸化炭素投入流はかなりのレベルの二酸化炭素を含み、窒素及び酸素を実質的に含まないので、光合成バイオリアクタからのガス状副生成物流は、未反応の二酸化炭素があればそれと共に、実質的に高濃度の酸素ガスを含むことになる。次いで、光合成バイオリアクタからのガス状副生成物流は、酸素燃焼プロセス内の燃料として酸素燃焼ユニットに再循環させることができ、その際、未反応の二酸化炭素があれば酸素燃焼プロセスは冷却される。
【0038】
例えば、図４を参照すると、本発明の一実施形態は、酸素燃焼ユニット１８からの二酸化炭素投入流を含む。先の実施形態と同様に、二酸化炭素は、第１のバイオリアクタ２１で、副生成物の酸素ガスを伴って有機中間体に光合成的に変換される。酸素ガス及び未反応の二酸化炭素を含む副生成物の酸素ガス流は、導管２２を介して酸素燃焼ユニット１８に送られる。また、示されていないものの、酸素燃焼ユニット１８からの二酸化炭素投入流は、他の実施形態に関して上で記載したように、冷却及び加圧することができる（例えば図２を参照されたい）。第１のバイオリアクタ２１で生成された中間生成物は、他の実施形態と矛盾しない形で、第２のバイオリアクタ４１に向けて下流に送られる。
【0039】
さらに他の実施形態において、比較的純粋な二酸化炭素流を第１のバイオリアクタ２１に供給することができる。比較的純粋な二酸化炭素流は、いくつかの供給源から得ることができ、一般に、９０体積％を超える、他の実施形態では９５体積％を超える、他の実施形態では９９体積％を超える二酸化炭素を含有する流れを含む。上で説明したように、比較的純粋な二酸化炭素流が使用される場合、本発明の方法は、第１のバイオリアクタ２１からの副生成物の流出物として、比較的純粋な（すなわち、窒素又はアルゴンガスが実質的にない）酸素ガス流を生成する。これらの比較的純粋な酸素ガス流は、例えば、エチレンのオキシ塩素化などの工業用途に使用することができる。
【0040】
１つ又は複数の実施形態において、本発明の工程として比較的純粋な二酸化炭素流が生成され、投入流として使用される。例えば、二酸化炭素を含有する投入流を第１のバイオリアクタ２１に導入する前に、その流れを精製及び／又は濃縮することができる。１つ又は複数の実施形態において、例えばアミンスクラビング及びストリッピングの技術を用いることによって、二酸化炭素投入流を精製することができる。先の実施形態のうちの１つ又は複数と同様に、精製二酸化炭素流を第１のバイオリアクタに提供することによって、第１のバイオリアクタを出る副生成物流として比較的高品位の酸素ガス流を生成することができる。二酸化炭素流を精製及び／又は濃縮するために、アミンスクラビング及びストリッピングの技術に加えて、又はその代わりに、様々な二酸化炭素の取出し及び分離の技術を用いることができると当業者なら認識するであろう。これらの技術としては、以下に限定されるものではないが、膜分離、固体吸着剤、及び炭酸カリウムなどの他の溶媒化学作用（ｓｏｌｖｅｎｔ ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）の使用が挙げられる。
【0041】
図５を参照して例示的な実施形態を説明することができ、図５は、二酸化炭素精製ユニット１６から二酸化炭素投入流を受け取る第１のバイオリアクタ２１を含むシステム５０を示している。精製ユニット１６は、導管１１’を介して第１のバイオリアクタ２１に導入される精製二酸化炭素流を生成する。示されていないものの、燃焼ユニットからの二酸化炭素投入流は、他の実施形態に関して上で記載したように、冷却及び加圧することができる（例えば図２を参照されたい）。二酸化炭素は、バイオリアクタ２１において、副生成物の酸素ガスを伴って有機中間体に光合成的に変換される。副生成物の酸素ガスは、導管２４を介して直接的又は間接的に、例えば、比較的高純度の酸素を必要とする工業プロセス２６に送られる。１つ又は複数の実施形態において、バイオリアクタ４１で生成されたエチレンを工業プロセス２６に送ることもできる。図５には示されていないものの、第２のバイオリアクタ４１からのエチレン流は、酸素ガス変換、二酸化炭素の取出し（及び光合成バイオリアクタへの再循環）、並びにエチレン精製を含むがこれらに限定されない、他の実施形態に関して説明した下流の処理を受けることが認識されよう。
【0042】
やはり、光合成バイオリアクタによって比較的純粋な二酸化炭素流の使用に由来することができる比較的純粋な酸素の副生成物流が得られる実施形態においては、比較的純粋な酸素流を工業用途に使用することができる。１つ又は複数の実施形態において、光合成バイオリアクタを出るガス流は、酸素ガス流中に未反応の二酸化炭素があれば取り出すために、二酸化炭素取出し処理を受けることができる。次いで、酸素ガス流を所望の工業用途に送ることができる。例えば、これらの実施形態からの酸素ガス流をオキシ塩素化ユニットに送ることができ、そこでエチレンは酸素ガスの存在下で塩酸と反応する。この例では、エチレンはエチレン生成バイオリアクタに由来し得る。エチレン生成バイオリアクタからのエチレン流は、他の実施形態に関して説明したように、二酸化炭素取出し処理及びエチレン精製を受けることが認識されよう。
【0043】
二酸化炭素の分離
１つ又は複数の実施形態において、下流の（例えば二酸化炭素分離ユニット６１での）二酸化炭素の分離は、従来のアミンスクラビング／ストリッピングを用いることによって行われてもよい。様々な他の二酸化炭素分離技術を用いることができ、二酸化炭素分離技術としては、以下に限定されるものではないが、炭酸カリウムを使用した溶媒分離、膜分離、及び固体吸着剤分離が挙げられる。
１つ又は複数の実施形態において、下流の（例えば二酸化炭素分離ユニット６１での）二酸化炭素の分離は、従来のアミンスクラビング／ストリッピングを用いることによって行われてもよい。様々な他の二酸化炭素分離技術を用いることができ、二酸化炭素分離技術としては、以下に限定されるものではないが、炭酸カリウムを使用した溶媒分離、膜分離、及び固体吸着剤分離が挙げられる。
【0044】
当業者が認識しているように、アミンスクラビング及びストリッピングの技術又は方法には、一般に、水担体内の有機アミンによる二酸化炭素の吸収（すなわちスクラビング）、及びそれに続く有機アミンからの二酸化炭素の再生又は放出（すなわちストリッピング）が含まれる。これらのシステム及びそれらを使用するための技術は、米国特許出願公開第２００９／００３８３１４号明細書、同第２００９／０１５６６９６号明細書及び同第２０１３／０２４４３１２号明細書に記載されているように当技術分野で周知であり、それらは参照により本明細書に組み込まれる。また、エンジニアリング・データ・ブック（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄａｔａ Ｂｏｏｋ）、第ＩＩ巻第１７－２６節、ガス処理業者協会（Ｇａｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓ Ｓｕｐｐｌｉｅｒｓ Ａｓｓｏｃ．）（１９９４）も参照されたい。
【0045】
アミンスクラビング／ストリッピングの代わりに、又はそれに加えて、膜分離技術を用いてもよい。当業者が認識しているように、これらの膜には、二酸化炭素が透過物を通過することが可能であるポリマー又は無機微多孔膜が含まれてもよい。これらの膜及びそれらを使用するための技術は、米国特許出願公開第２００８／０１７３１７９号明細書及び同第２０１３／０３１２６０４号明細書に記載されているように周知であり、それらは参照により本明細書に組み込まれる。本発明の実施において、アミンスクラビング／ストリッピングの技術の代わりに膜分離を使用する場合、残留エチレンを取り出すことが望ましい場合がある。残留エチレンは、透過流の中に移る可能性があり、そのため取り出さなければ固定反応器（すなわち第１のバイオリアクタ）に送り戻され、そして最終的に酸素流中に移ることになる。これに関して、図７を参照すると、導管７３を介してエチレン処理ユニット７５に向けて下流に送られる二酸化炭素の透過流を有する膜分離ユニット６１’を含む代替システム２０’が示されており、エチレン処理ユニット７５は、透過流が導管５１’を介してバイオリアクタ２１に送り戻される前に、透過流内に残留エチレンがあれば（例えば触媒燃焼により）取り出すために、前記流れを触媒作用的に処理するように適合されてもよい。
【0046】
エチレン精製
上記のように、第２のバイオリアクタ４１のエチレン含有生成物流の（例えば分離器６１内での）二酸化炭素分離により、導管５３によって運ばれるエチレン濃厚流が生成される。このエチレン濃厚流は、後の使用及びサブプロセス１００内の任意選択の輸送のために精製及び任意選択の圧縮を受けることができ、これは図６を参照して最もよく説明される。１つ又は複数の実施形態において、サブプロセス１００では、導管５３を介して提供されるエチレン濃厚流が、１つ又は複数の技術を用いて処理される。例えば、エチレン濃厚流は、任意選択の酸素ガス取出しユニット１０１で酸素ガス取出し処理を受けてもよい。このユニット内では、エチレン濃厚流内の残留酸素ガスが、例えば、エチレンの一部の触媒燃焼によって消費される。１つ又は複数の実施形態において、サブプロセス１００は、残留二酸化炭素があれば取り出す（例えば、二酸化炭素のレベルを１０ｐｐｍ未満、又は５ｐｐｍ未満、又は３ｐｐｍ未満に低減する）苛性洗浄ユニット１０３で、エチレン流のポリッシングを含んでもよい。苛性洗浄ユニット１０３の下流で、エチレン濃厚流は除水ユニット１０５で除水処理を受けてもよく、除水ユニット１０５は、分子ふるいを使用した脱水ユニットを含んでもよい。除水処理後、エチレン濃厚流を凝縮器１０７で凝縮することができ、凝縮器１０７は、プロピレン冷蔵ユニット１０８によって冷却することができる。当業者なら、様々な精製工程の順序が、複数の要因に応じて変更され得ることを認識するであろう。また、当業者なら、精製プロセスの様々な工程が、使用又は（例えばパイプラインを介した）輸送に必要とされ得る所望の圧力を獲得する目的で行われてもよいことを認識するであろう。この目的のために、エチレン濃厚流は、２つ以上の精製工程の前、後、又はその間に加圧されてもよい。例えば、図６に示すように、前記流れは圧縮ユニット９９で加圧されてもよい。同様に、エチレン生成物ポンプ１０９でさらに加圧を行うことができる。
上記のように、第２のバイオリアクタ４１のエチレン含有生成物流の（例えば分離器６１内での）二酸化炭素分離により、導管５３によって運ばれるエチレン濃厚流が生成される。このエチレン濃厚流は、後の使用及びサブプロセス１００内の任意選択の輸送のために精製及び任意選択の圧縮を受けることができ、これは図６を参照して最もよく説明される。１つ又は複数の実施形態において、サブプロセス１００では、導管５３を介して提供されるエチレン濃厚流が、１つ又は複数の技術を用いて処理される。例えば、エチレン濃厚流は、任意選択の酸素ガス取出しユニット１０１で酸素ガス取出し処理を受けてもよい。このユニット内では、エチレン濃厚流内の残留酸素ガスが、例えば、エチレンの一部の触媒燃焼によって消費される。１つ又は複数の実施形態において、サブプロセス１００は、残留二酸化炭素があれば取り出す（例えば、二酸化炭素のレベルを１０ｐｐｍ未満、又は５ｐｐｍ未満、又は３ｐｐｍ未満に低減する）苛性洗浄ユニット１０３で、エチレン流のポリッシングを含んでもよい。苛性洗浄ユニット１０３の下流で、エチレン濃厚流は除水ユニット１０５で除水処理を受けてもよく、除水ユニット１０５は、分子ふるいを使用した脱水ユニットを含んでもよい。除水処理後、エチレン濃厚流を凝縮器１０７で凝縮することができ、凝縮器１０７は、プロピレン冷蔵ユニット１０８によって冷却することができる。当業者なら、様々な精製工程の順序が、複数の要因に応じて変更され得ることを認識するであろう。また、当業者なら、精製プロセスの様々な工程が、使用又は（例えばパイプラインを介した）輸送に必要とされ得る所望の圧力を獲得する目的で行われてもよいことを認識するであろう。この目的のために、エチレン濃厚流は、２つ以上の精製工程の前、後、又はその間に加圧されてもよい。例えば、図６に示すように、前記流れは圧縮ユニット９９で加圧されてもよい。同様に、エチレン生成物ポンプ１０９でさらに加圧を行うことができる。
【0047】
光合成微生物
上で述べたように、第１のバイオリアクタは、光エネルギーの存在下で二酸化炭素及び水を有機中間体に変換する１種又は複数種の光合成微生物を含有する光合成生物培養物を含有する。様々な実施形態において、光合成微生物は天然起源であってもよい。他の実施形態において、光合成微生物は、所望の有機中間体の生成を向上させるために遺伝子改変されてもよい。１つ又は複数の実施形態において、第１のバイオリアクタで利用される光合成微生物には、シアノバクテリアなどの光合成細菌が含まれてもよい。当業者が認識しているように、光合成細菌は、光の存在下で二酸化炭素及び水を消費して炭素を固定する。有利には、好気性条件におけるシアノバクテリアの代謝経路の主な生成物は、酸素、及び糖などの有機中間体である。当業者は、所望の有機中間体を生成するために、過度の実験をせずに適切な光合成微生物を選択することができるであろう。
上で述べたように、第１のバイオリアクタは、光エネルギーの存在下で二酸化炭素及び水を有機中間体に変換する１種又は複数種の光合成微生物を含有する光合成生物培養物を含有する。様々な実施形態において、光合成微生物は天然起源であってもよい。他の実施形態において、光合成微生物は、所望の有機中間体の生成を向上させるために遺伝子改変されてもよい。１つ又は複数の実施形態において、第１のバイオリアクタで利用される光合成微生物には、シアノバクテリアなどの光合成細菌が含まれてもよい。当業者が認識しているように、光合成細菌は、光の存在下で二酸化炭素及び水を消費して炭素を固定する。有利には、好気性条件におけるシアノバクテリアの代謝経路の主な生成物は、酸素、及び糖などの有機中間体である。当業者は、所望の有機中間体を生成するために、過度の実験をせずに適切な光合成微生物を選択することができるであろう。
【0048】
１つ又は複数の実施形態において、所望の有機中間体は、スクロース、デキストロース、キシロース、グルコース、フルクトース、アルファ－ケトグルタル酸、又はそれらの混合物を含む。
【0049】
例示的な光合成微生物としては、限定されずに、シアノバクテリア、藻類及び紅色細菌が挙げられる。有用な種類のシアノバクテリアとしては、酸素産生光合成を行う光合成原核生物が挙げられる。本明細書で概説する目的に有用なシアノバクテリアは、当技術分野で一般に周知である。（例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ出版（１９９４）の、Ｄｏｎａｌｄ ＢｒｙａｎｔによるＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａを参照されたい）。代表的な例としては、シネココッカス・リビドゥス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄｕｓ）及びシネココッカス・エロンガトゥス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）などのシネココッカス属のシアノバクテリア、並びにシネコシスティス・ミネルバエ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｅｒｖａｅ）及びシンコシスティス・エスピー（Ｓｙｎｃｈｏｃｙｓｔｉｓ Ｓｐ）ＰＣＣ ６８０３などのシネコシスティス属のシアノバクテリアが挙げられる。これに関して、米国特許第７，８０７，４２７号明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。使用することができる合成微生物の例としては、米国特許第１０，１９６，６２７号明細書に開示されているものが挙げられ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに他の例としては、米国特許第９，９１４，９４７号明細書及び同第９，３０９，５４１号明細書に開示されている微生物が挙げられ、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【0050】
１つ又は複数の実施形態において、シアノバクテリアは、目的有機中間体の生成を増強する１つ又は複数の酵素をコード化する１つ又は複数の外来遺伝子を発現するように遺伝子改変される。１つ又は複数の実施形態において、目的有機中間体には、スクロース、デキストロース、キシロース、グルコース、フルクトース及びアルファ－ケトグルタル酸が含まれる。当業者に明らかなように、シアノバクテリア（及び生成される酵素）のゲノムに付加される特定の遺伝子は、特定の目的有機中間体によって決まる。
【0051】
１つ又は複数の実施形態において、改変光合成微生物は、二酸化炭素からアルファケトグルタル酸を形成する酵素を生成する改変ヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、この改変光合成微生物は、非天然のアルファ－ケトグルタル酸透過酵素タンパク質（ａｌｐｈａ－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＫＧＰ）形成ヌクレオチド配列を発現することにより、ＡＫＧＰを発現する。１つ又は複数の実施形態において、改変微生物は、改変ヌクレオチド配列を欠く対照微生物によって生成されるよりも多い量の酵素を生成する。この量は、改変ヌクレオチド配列を欠く対照微生物によって生成される量の１％を超え、他の実施形態では５０％を超え、他の実施形態では７５％を超えてもよい。
【0052】
１つ又は複数の実施形態において、イソクエン酸脱水素酵素（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＩＣＤ）によるイソクエン酸の酸化的脱炭酸によって、又はグルタミン酸脱水素酵素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＤＨ）によるグルタミン酸の酸化的脱アミノによって、アルファ－ケトグルタル酸（（ａｌｐｈａ－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ：ａＫＧ）を生成することができる。シアノバクテリアにおけるクローニング及びａＫＧ生成のための目的酵素には、ＩＣＤ酵素：１．１．１．４２、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ：Ｐ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＣＤのコード配列（配列番号１、配列番号２）、ＩＣＤ酵素：１．１．１．４２、シネココッカス・エロンガトゥスＰＣＣ７９４のコード配列（配列番号３、配列番号４）、及びＧＤＨ酵素：１．４．１．２、Ｐ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのコード配列（配列番号５、配列番号６）が含まれてもよい。
【0053】
１つ又は複数の実施形態において、アルファ－ケトグルタル酸を形成するための酵素は、イソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤ）タンパク質、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＤＨ）タンパク質、又はそれらの組合せから選択される。
【0054】
ある実施形態において、改変光合成微生物は、配列番号２と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を有する改変ＩＣＤタンパク質ヌクレオチド配列を発現することによって、配列番号１と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を有するＩＣＤタンパク質を発現する。ある実施形態において、改変光合成微生物は、配列番号４と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を有する改変ＩＣＤタンパク質ヌクレオチド配列を発現することによって、配列番号３と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を有するＩＣＤタンパク質を発現する。ある実施形態において、改変微生物は、配列番号６と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を有する改変ＧＤＨタンパク質ヌクレオチド配列を発現することによって、配列番号５と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を有するＧＤＨタンパク質を発現する。
【0055】
１つ又は複数の実施形態において、有機中間体はスクロースである。これらの実施形態のいくつかにおいて、例えば、シアノバクテリア（シネココッカス・エロンガトゥス、シネコシスティス）を、エチレン生成微生物の増殖のための基質として働くスクロースを生成するように操作することができる。スクロースを生成するためのシネココッカス・エロンガトゥスＰＣＣ７９４２の様々な操作方法には、１つの遺伝子（ｃｓｃＢ）の活性化及び１つの遺伝子（ＧｌｇＣ）の欠失が含まれ得る。
【0056】
これらの実施形態の１つ又は複数において、改変光合成微生物は、スクロース合成酵素タンパク質を発現する。１つ又は複数の実施形態において、スクロース合成酵素タンパク質は、配列番号１０と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を有する改変スクロース合成酵素タンパク質ヌクレオチド配列を発現することによって、配列番号９と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を有する。これらの実施形態の１つ又は複数において、改変微生物は、スクロースリン酸合成酵素タンパク質を発現する。１つ又は複数の実施形態において、スクロースリン酸合成酵素タンパク質は、配列番号１２と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を有する改変スクロースリン酸合成酵素タンパク質ヌクレオチド配列を発現することによって、配列番号１１と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を有する。
【0057】
本明細書で使用される場合、配列の同一性とは、配列を比較することによって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係である。配列の同一性又は類似性は、概して、それぞれの配列の全長にわたって比較される。当業者なら、「同一性」が、場合によってはアミノ酸配列又は核酸配列の文字列の間の一致性によって決定される、アミノ酸配列又は核酸配列の間の配列関連性の程度を指すことを認識している。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を、別のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。当業者なら、「同一性」及び「類似性」を様々な既知の方法によって容易に計算することができる。例えば、同一性及び類似性を決定する方法は、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）、ＢＬＡＳＴＮ（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）、ＮＣＢＩ及び他の情報源（ＢＬＡＳＴ．ＲＴＭ．Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４）から公表されているＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）、及びＥＭＢＯＳＳ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ）などの、公表されているコンピュータプログラムに成文化されている。
ＥＭＢＯＳＳを使用したアミノ酸配列比較のための例示的なパラメータは、ｇａｐ ｏｐｅｎ １０．０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ０．５、ブロックアミノ酸置換行列（ＢＬＯｃｋｓ ＳＵｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ）である。ＥＭＢＯＳＳを使用した核酸配列比較のための例示的なパラメータは、ｇａｐ ｏｐｅｎ １０．０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ０．５、ＤＮＡ完全行列（ＤＮＡ ｆｕｌｌ ｍａｔｒｉｘ）（ＤＮＡ同一性行列（ＤＮＡ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ））である。当業者が理解しているように、異なる種の間のＤＮＡ／タンパク質の配列を比較して、Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ、ＫＥＧ、ＢＬＡＳＴ及びＥｎｓｅｍｂｌｅなどのオンラインデータを使用して配列の相同性を決定することができる。当業者はまた、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れてもよい。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンである。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換変異体は、開示された配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸の変化は保存的である。天然起源のアミノ酸のそれぞれについての好ましい保存的置換は以下の通りである。すなわち、Ａｌａからｓｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ、ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ；及びＶａｌからｉｌｅ又はｌｅｕへの置換である。
ＥＭＢＯＳＳを使用したアミノ酸配列比較のための例示的なパラメータは、ｇａｐ ｏｐｅｎ １０．０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ０．５、ブロックアミノ酸置換行列（ＢＬＯｃｋｓ ＳＵｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ）である。ＥＭＢＯＳＳを使用した核酸配列比較のための例示的なパラメータは、ｇａｐ ｏｐｅｎ １０．０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ０．５、ＤＮＡ完全行列（ＤＮＡ ｆｕｌｌ ｍａｔｒｉｘ）（ＤＮＡ同一性行列（ＤＮＡ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ））である。当業者が理解しているように、異なる種の間のＤＮＡ／タンパク質の配列を比較して、Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ、ＫＥＧ、ＢＬＡＳＴ及びＥｎｓｅｍｂｌｅなどのオンラインデータを使用して配列の相同性を決定することができる。当業者はまた、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れてもよい。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンである。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換変異体は、開示された配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸の変化は保存的である。天然起源のアミノ酸のそれぞれについての好ましい保存的置換は以下の通りである。すなわち、Ａｌａからｓｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ、ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ；及びＶａｌからｉｌｅ又はｌｅｕへの置換である。
【0058】
特に明記しない限り、「適合された」又は「コドン適合された」という用語は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの「コドン最適化」を指し、そのポリヌクレオチドの配列は天然若しくは非天然であってもよく、又は他の微生物における発現に適合されてもよい。コドン最適化により、コード化されたポリペプチドに対するコドン使用が、そのポリペプチドが発現される生物のコドンバイアスに適合される。コドン最適化は、一般に、宿主細胞におけるコード化されたポリペプチドの生成レベルを増加させるのに役立つ。
【0059】
ある実施形態において、改変光合成微生物は、グルコース－１－リン酸アデニル酸転移酵素タンパク質の発現を欠くデルタ－ｇｌｇｃ（Δｇｌｇｃ）変異微生物を含む。同様に、機能性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ酵素を欠くシアノバクテリア細胞は、米国特許第９，３０９，５４１号明細書及び同第９，３０９，５４１号明細書に記載されているように既知であり、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0060】
エチレン生成微生物
上記のように、エチレン生成生物には、光合成バイオリアクタで生成された有機中間体を消費することによってエチレンを天然に生成するか、又はエチレンを生成するように遺伝子改変された生物が含まれる。１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタで利用される微生物には、エチレン形成酵素（ｅｆｅ）遺伝子を発現するか、又は発現するように遺伝子改変された微生物が含まれる。これらの微生物は、本明細書ではｅｆｅ形成微生物と呼ぶ場合がある。エチレンを生成するか、又はエチレンを生成するように改変された微生物は当技術分野で周知であり、記載された反応条件下で目的有機中間体からエチレンを生成することができる任意の微生物が使用されてもよい。１つ又は複数の実施形態において、所望の微生物は、生成されれば本明細書に記載の方法を妨害する可能性がある他のものは生成しない。
上記のように、エチレン生成生物には、光合成バイオリアクタで生成された有機中間体を消費することによってエチレンを天然に生成するか、又はエチレンを生成するように遺伝子改変された生物が含まれる。１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタで利用される微生物には、エチレン形成酵素（ｅｆｅ）遺伝子を発現するか、又は発現するように遺伝子改変された微生物が含まれる。これらの微生物は、本明細書ではｅｆｅ形成微生物と呼ぶ場合がある。エチレンを生成するか、又はエチレンを生成するように改変された微生物は当技術分野で周知であり、記載された反応条件下で目的有機中間体からエチレンを生成することができる任意の微生物が使用されてもよい。１つ又は複数の実施形態において、所望の微生物は、生成されれば本明細書に記載の方法を妨害する可能性がある他のものは生成しない。
【0061】
例示的なｅｆｅ形成微生物としては、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス・シリンガエ ｐｖ．グリシニア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．Ｇｌｙｃｉｎｉａ）、及びペニシリウム・ジギタタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）が挙げられ、これらはすべて天然にｅｆｅを発現する。他の実施形態において、第２の反応器内の微生物には、シュードモナス・シリンガエ又はペニシリウム・ジギタタムに天然に見られる遺伝子などのｅｆｅ遺伝子を発現又は過剰発現する改変微生物が含まれる。これらの実施形態において、１つ又は複数のコピーの１つ又は複数のｅｆｅ遺伝子を遺伝子導入するための当技術分野で既知の多数の方法のいずれか１つを用いて、宿主微生物に遺伝子導入する。有用な宿主微生物には、限定されずに、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）及びトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が含まれてもよい。
【0062】
１つ又は複数の実施形態において、ｅｆｅを生成するための改変微生物は、Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，’’Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｓｅｒｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｇｅｎｅ（ｅｆｅ）ａｔ ｔｈｅ １６ Ｓ ｒＤＮＡ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ ２４４０’’Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２０１０）１０１：６４０４－６４０９に記載されているように生成されてもよく、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの実施形態において、ｅｆｅ遺伝子をＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｅａ ＩＣＭＰ２１８９からクローニングし、二重交差組換えを用いてシュードモナス・プジタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｄｉｔａ）ＫＴ ２４４０宿主の１つ又は複数の１６Ｓ ｒＤＮＡ部位に挿入する。
【0063】
上で述べたように、１つ又は複数の実施形態において、ｅｆｅ酵素を生成する微生物は、遺伝子操作された微生物を含む。１つ又は複数の実施形態において、ｅｆｅ形成微生物は、発現された場合にｅｆｅを生成する１つ又は複数の外来ヌクレオチド配列を、そのＤＮＡ内に含む改変微生物である。１つ又は複数の実施形態において、改変微生物は、改変ヌクレオチド配列を欠く対照微生物によって生成されるよりも多い量のｅｆｅ酵素を生成する。この量は、改変ヌクレオチド配列を欠く対照微生物によって生成される量の５％を超え、他の実施形態では５０％を超え、他の実施形態では７５％を超えてもよい。様々な実施形態において、遺伝子改変された微生物は、発現された場合にｅｆｅを生成する外来ヌクレオチド配列の２つ以上のコピーを含むように改変され、エチレン生成がさらに向上する。
【0064】
１つ又は複数の実施形態において、シュードモナス・サバスタノイ ｐｖ．ファセオリコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｖａｓｔａｎｏｉ ｐｖ．Ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ）ｅｆｅタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＰＢ ４４７２７．１、配列番号８）をコードするポリヌクレオチドは、ｐＥＴ－３０ａ（＋）ベクタープラスミドにクローニングすることができる。対応するヌクレオチド配列はまた、大腸菌（配列番号７）での発現に適合させ、かつ終止コドン及びＨｉｎｄＩＩＩ部位が続く、Ｃ末端の任意選択のＨｉｓタグを含むように適合させたコドンとすることができる。５プライム末端でのクローニングにＮｄｅＩ部位も使用することができ、この場合、ＮｄｅＩ部位はＡＴＧ開始コドンを含む。様々な実施形態において、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を組換えプラスミドで形質転換することができる。
【0065】
いくつかの実施形態において、ＬａｃＩ遺伝子の存在下でイソプロピルチオガラクトシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ：ＩＰＴＧ）誘導性プロモータ（ｐＴｒｃ）によってアンピシリンカセットを活性化することができ、ＬａｃＩ遺伝子は、ＬａｃＩｑプロモータ（配列番号１３）によって制御することができる。
【0066】
ある実施形態において、エチレンを形成する組換え微生物は、配列番号８と少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列を有する非天然のｅｆｅタンパク質ヌクレオチド配列を発現することによって、配列番号７と少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するｅｆｅタンパク質を発現する。
【0067】
当業者なら、収率を高め、プロセス内の微生物の管理を支援する（例えば、微生物を生成物流又は反応媒体から分離するのを支援する）ために、微生物を固定化することが有益であり得ることを認識している。１つ又は複数の実施形態において、微生物は、これに限定されるものではないが、高表面積支持媒体などの支持媒体に固定化される。有用な高表面積支持材料には、スポンジ、繊維状材料、バイオボール、セラミックフィルタなどが含まれてもよい。
【0068】
第１のバイオリアクタ（光合成バイオリアクタ）
再び図を参照すると、第１のバイオリアクタ２１は、単一の反応容器を含んでもよく、又は相補的に運転してもよい複数（すなわち２つ以上）の反応容器を含んでもよい。例えば、所望の光合成反応を促すために、２つ以上の反応容器を並列又は直列で運転してもよい。
再び図を参照すると、第１のバイオリアクタ２１は、単一の反応容器を含んでもよく、又は相補的に運転してもよい複数（すなわち２つ以上）の反応容器を含んでもよい。例えば、所望の光合成反応を促すために、２つ以上の反応容器を並列又は直列で運転してもよい。
【0069】
当業者なら、一般に、微生物を持続させ、所望の光合成反応を促進するために、第１のバイオリアクタ２１で維持するべき適切な条件について認識している。１つ又は複数の実施形態において、水は反応物であるだけでなく、第１のバイオリアクタ２１内の反応媒体としても働く。
【0070】
１つ又は複数の実施形態において、光合成バイオリアクタ内の反応器媒体は、温度が約２５～約７０℃、他の実施形態では約３５～約６０℃、他の実施形態では約４０～約５０℃に維持される。これら又は他の実施形態において、光合成バイオリアクタ内の反応媒体は、ｐＨが約５．０～約８．５、他の実施形態では約５．５～約８．０、他の実施形態では約６．０～約７．０に維持される。
【0071】
１つ又は複数の実施形態において、光合成バイオリアクタは、ｅｆｅ遺伝子を生成する又は生成するように適合された微生物を実質的に含まない。
【0072】
１つ又は複数の実施形態において、第１のバイオリアクタは、少なくとも反応物（例えば二酸化炭素）をバイオリアクタに導入するための少なくとも１つの入口を含む。これら又は他の実施形態において、第１のバイオリアクタは、少なくとも１つの生成物又は少なくとも１つの副生成物をバイオリアクタから取り出すための少なくとも１つの出口を含む。１つ又は複数の実施形態において、第１のバイオリアクタ２１は、ガス状生成物／副生成物のための出口、及び液体流出物のための出口を含む。１つ又は複数の実施形態において、バイオリアクタ２１は、入口及び出口を除いて閉鎖系である。他の実施形態において、バイオリアクタ２１は開放系である。１つ又は複数の実施形態において、第１のバイオリアクタは、連続撹拌槽反応器、ガスリフト反応器、ループ反応器、及び流動床反応器から選択される。１つ又は複数の実施形態において、第１のバイオリアクタは、容量が１０，０００ガロンを超え、他の実施形態では１００，０００ガロンを超え、他の実施形態では１，０００，０００ガロン超える。
【0073】
第２のバイオリアクタ（エチレン生成バイオリアクタ）
再び図を参照すると、第２のバイオリアクタ４１は、単一の反応容器を含んでもよく、又は相補的に運転してもよい複数（すなわち２つ以上）の反応容器を含んでもよい。例えば、中間体をエチレンに変換する所望の反応を促すために、２つ以上の反応容器を並列又は直列で運転してもよい。
再び図を参照すると、第２のバイオリアクタ４１は、単一の反応容器を含んでもよく、又は相補的に運転してもよい複数（すなわち２つ以上）の反応容器を含んでもよい。例えば、中間体をエチレンに変換する所望の反応を促すために、２つ以上の反応容器を並列又は直列で運転してもよい。
【0074】
当業者なら、一般に、微生物を持続させ、所望のエチレン形成反応を促進するために、第２のバイオリアクタで維持するべき適切な条件について認識している。１つ又は複数の実施形態において、水は、第２の反応器における反応媒体として働く。
【0075】
１つ又は複数の実施形態において、エチレン形成バイオリアクタ内の反応器媒体は、温度が約２５～約７０℃、他の実施形態では約３５～約６０℃、他の実施形態では約４０～約５０℃に維持される。これら又は他の実施形態において、エチレン形成バイオリアクタ内の反応媒体は、ｐＨが約６．０～約９．５、他の実施形態では約６．５～約９．０、他の実施形態では約７．０～約８．０に維持される。
【0076】
１つ又は複数の実施形態において、エチレン形成バイオリアクタは、酸素を生成するか又は酸素を生成するように適合された微生物を実質的に含まない。例えば、第２のバイオリアクタは、光合成微生物（例えば、カルビン回路によって機能する微生物）を含まないか、又は実質的に含まない。
【0077】
１つ又は複数の実施形態において、エチレン形成バイオリアクタは、嫌気性条件下で維持される。１つ又は複数の実施形態において、エチレン形成バイオリアクタは、光エネルギーが実質的に存在しない状態に維持される。
【0078】
１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタは、有機中間生成物流をバイオリアクタに導入するための少なくとも１つの入口を含む。これら又は他の実施形態において、第２のバイオリアクタは、第２のバイオリアクタから生成物及び少なくとも１つの副生成物（例えば二酸化炭素）を取り出すための少なくとも１つの出口（例えば、エチレンガスのためのガス出口）を含む。１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタはまた、液体流出物（例えば、水及び未反応の有機中間体）を取り出すための流出物出口を含む。１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタは、連続撹拌槽反応器、ループ反応器、及び流動床反応器から選択される。１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタは、容量が１０，０００ガロンを超え、他の実施形態では１００，０００ガロンを超え、他の実施形態では１，０００，０００ガロンを超える。１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタは、反応物の入口、及び生成物又は副生成物の出口を除いて、閉鎖系を提供するように適合される。
【0079】
１つ又は複数の実施形態において、第２の反応器内の微生物の濃度は、反応器の単位体積あたりの乾燥細胞重量に基づいて定量化されてもよい。例えば、１つ又は複数の実施形態において、第２の反応器における微生物の濃度は、１リットルあたり１０グラムを超える、他の実施形態では５０グラムを超える、他の実施形態では１００グラムを超える乾燥細胞重量である。
【0080】
組換え微生物を形成するための技術
ある実施形態において、中間体形成酵素又はｅｆｅを発現させるためのヌクレオチド配列が、微生物発現ベクターに挿入される。様々な実施形態において、微生物発現ベクターは、細菌ベクタープラスミド、相同組換えシステムのヌクレオチドガイド、抗生物質耐性システム、タンパク質の精製及び検出のための補助システム、ＣＲＩＳＰＲ ＣＡＳシステム、ファージ・ディスプレイ・システム、又はそれらの組合せを含んでもよい。
ある実施形態において、中間体形成酵素又はｅｆｅを発現させるためのヌクレオチド配列が、微生物発現ベクターに挿入される。様々な実施形態において、微生物発現ベクターは、細菌ベクタープラスミド、相同組換えシステムのヌクレオチドガイド、抗生物質耐性システム、タンパク質の精製及び検出のための補助システム、ＣＲＩＳＰＲ ＣＡＳシステム、ファージ・ディスプレイ・システム、又はそれらの組合せを含んでもよい。
【0081】
上で述べたように、１つ又は複数の実施形態において、複数のコピーのｅｆｅ発現ヌクレオチド配列が、エチレン形成微生物に挿入されてもよい。同様に、複数のコピーの中間体酵素発現ヌクレオチド配列が、光合成微生物に挿入されてもよい。ベクター及び／又は宿主ゲノムに挿入された遺伝子のコピーの数は、本明細書では「コピー数」と呼ばれる。ある実施形態において、ｅｆｅ発現ヌクレオチド配列は、微生物発現ベクターにおけるコピー数が１を超え、他の実施形態では１０を超え、他の実施形態では１００を超え、また他の実施形態では２５０を超える。明らかなように、複数のコピーのｅｆｅ発現ヌクレオチド配列の発現によってエチレン収率を増加させることができるため、商業規模でのエチレン生成の体積及びコストを低減することができる。
【0082】
ある実施形態において、微生物発現ベクターは、少なくとも１つの微生物発現プロモータを含む。当業者によって理解されるように、微生物発現プロモータは、通常は隣接する後のＤＮＡ配列の転写を開始するヌクレオチド配列であり、恒常的又は誘導的であってもよい。ある実施形態において、少なくとも１つの微生物発現プロモータは、限定されずに、光感受性プロモータ、化学感受性プロモータ、温度感受性プロモータ、Ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ＣｓｐＡプロモータ、ラムダＰＬプロモータ、ラムダＣＬプロモータ、連続生成プロモータ、ｐｓｂＡプロモータ、又はそれらの組合せを含んでもよい。ある実施形態において、少なくとも１つのプロモータ誘導因子をバイオリアクタ又はバイオリアクタ内の反応媒体に加えて、有機中間体の量及び／又は生成されるエチレンの量を制御してもよい。ある実施形態において、プロモータ誘導因子は、ラクトース、キシロース、ＩＰＴＧ、低温ショック、熱ショック、又はそれらの組合せを含む。
【0083】
１つ又は複数の実施形態において、ＩＣＤ遺伝子及びＧＤＨ遺伝子は、ｐＳｙｎ６プラスミド構築物（ｐＳｙｎ６＿ＩＣＤ及びｐＳｙｎ６＿ＧＤＨ）にクローニングされたｇＢｌｏｃｋｓ（商標）遺伝子断片を使用して合成されてもよい。ｐＳｙｎ６プラスミドへのクローニングのために、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＩＣＤコード配列は、Ｎ末端ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位及びＣ末端ＢａｍＨＩ認識部位（配列番号４）に隣接している。プラスミド構築物を使用して、ＩＣＤ遺伝子及びＧＤＨ遺伝子を未改変のＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ又はＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓΔｇｌｇｃ変異株にクローニングすることができる（実施例２を参照されたい）。１～３個のコピーの標的遺伝子を形質転換してもよい。ＩＣＤ遺伝子及びＧＣＨ遺伝子のクローニングは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）及び配列決定法によって確認することができる。ａＫＧの合成及び定量化は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、ウエスタンブロット及びエチレン生成アッセイによって評価することができる。
【0084】
１つ又は複数の実施形態において、シアノバクテリアのグリコーゲン変異株を作製することにより、その細菌の経路を変化させて、ａＫＧなどのケト酸をより高い濃度で生成させ、また分泌もさせる。グリコーゲン変異シアノバクテリアは、ｇｌｇｃ遺伝子（Δｇｌｇｃ）の変異を介してグリコーゲン欠損株を作製することによって作り出すことができる。例えば、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）遺伝子を、ｇＢｌｏｃｋｓ（商標）を使用して合成し、プラスミド構築物に組み込むことができる。そのプラスミド構築物を、野生型シアノバクテリア（例えば、シネコシスティス、シネココッカス・エロンガトゥス２９７３、シネココッカス・エロンガトゥス２４３４）に形質転換することができる。次いで、野生型ｇｌｇｃ遺伝子の一部をＡｍｐＲ遺伝子で置き換えて、変異株を作製することができる。Δｇｌｇｃ変異株は、ＡｍｐＲ含有培地中で増殖させた後に、ＰＣＲ及び配列決定法によって確認することができる。
【0085】
揮発ガスのレベルの維持
１つ又は複数の実施形態において、第２の反応器は、安全なレベルの酸素ガスを含む。特に、第２の反応器のヘッドスペース及び第２の反応器のガス状出口流は、エチレンに対して安全なレベルの酸素ガスを含む。当業者が認識しているように、エチレン流内の酸素ガスの商業的に許容可能なレベルは、存在するエチレンのレベルを考慮に入れた爆発下限（ｌｏｗｅｒ ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ ｌｉｍｉｔ：ＬＥＬ）によって規定することができる。１つ又は複数の実施形態において、第２の反応器内（すなわち、反応器のヘッドスペース内又はガス状出口流中）の酸素の量は、許容可能なＬＥＬ未満であり、他の実施形態では、許容可能なＬＥＬの８０％未満であり、他の実施形態では、許容可能なＬＥＬの５０％未満である。
１つ又は複数の実施形態において、第２の反応器は、安全なレベルの酸素ガスを含む。特に、第２の反応器のヘッドスペース及び第２の反応器のガス状出口流は、エチレンに対して安全なレベルの酸素ガスを含む。当業者が認識しているように、エチレン流内の酸素ガスの商業的に許容可能なレベルは、存在するエチレンのレベルを考慮に入れた爆発下限（ｌｏｗｅｒ ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ ｌｉｍｉｔ：ＬＥＬ）によって規定することができる。１つ又は複数の実施形態において、第２の反応器内（すなわち、反応器のヘッドスペース内又はガス状出口流中）の酸素の量は、許容可能なＬＥＬ未満であり、他の実施形態では、許容可能なＬＥＬの８０％未満であり、他の実施形態では、許容可能なＬＥＬの５０％未満である。
【0086】
プロセス特性
本明細書に記載されるように、本発明の方法は、生合成プロセスを用いることによって、エチレン及び酸素の同時生成に関連する安全性の懸念に対処しながら、高い炭素効率で二酸化炭素をエチレンに変換するのに有効である。
本明細書に記載されるように、本発明の方法は、生合成プロセスを用いることによって、エチレン及び酸素の同時生成に関連する安全性の懸念に対処しながら、高い炭素効率で二酸化炭素をエチレンに変換するのに有効である。
【0087】
１つ又は複数の実施形態において、本発明の方法により、生成率が１００μｍｏｌ／ｇＣＤＷ／時を超えて、他の実施形態では５００μｍｏｌ／ｇＣＤＷ／時を超えて、他の実施形態では１０００μｍｏｌ／ｇＣＤＷ／時を超えて、他の実施形態では１５００μｍｏｌ／ｇＣＤＷ／時を超えて、他の実施形態では２０００μｍｏｌ／ｇＣＤＷ／時を超えて、また他の実施形態では２５００μｍｏｌ／ｇＣＤＷ／時を超えてエチレンが生成される。ここで、ＣＤＷは細胞乾燥重量（ｃｅｌｌ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ）を指す。
【0088】
本発明の範囲及び趣旨から逸脱しない様々な修正及び変更が、当業者には明らかになるであろう。本発明は、本明細書で述べた例証的な実施形態に正式に限定されるものではない。
【0089】
配列表
配列番号１－
配列番号２－
配列番号３－
配列番号４－
配列番号５－
配列番号６－
配列番号７－
配列番号８－
配列番号９－
配列番号１０－
配列番号１１－
配列番号１２－
配列番号１３－
配列番号１－
【数1】
【数2】
【数3】
【数4】
【数5】
【数6】
【数7】
【数8】
【数9】
【数10】
【数11】
【数12】
【数13】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-11-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年３月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／９９２，６８９号、及び２０２０年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／０５２，６６４号の利益を主張する。
【0002】
本発明の実施形態は、二酸化炭素をエチレンに変換するための方法及びシステムを提供する。
【背景技術】
【0003】
大気中の二酸化炭素レベルに対する懸念と相まって、化石燃料の長期にわたる利用可能性に対する懸念により、二酸化炭素の固定を介して石油系製品を製造するための生合成法の開発が強化されている。すなわち、二酸化炭素を、より大きな有機分子のための燃料又は有機構成要素として使用することができる有用な有機化合物に変換するために、光合成プロセスが用いられている。
【0004】
例えば、米国特許第７，８０７，４２７号明細書では、二酸化炭素をグルコース及び酢酸などの中間生成物に変換するための、遺伝子改変シアノバクテリアなどの光合成生物の使用が教示されている。後の工程で、メタン生成細菌を使用して中間生成物がメタンに変換される。メタンは回収され、燃料として使用するために貯蔵することができる。
【0005】
エチレンは、多くの工業にとって最も重要な化学原料として広く知られており、二酸化炭素の固定によってエチレンを生合成するためのいくつかの方法が提案されている。
【0006】
シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）は、「ｅｆｅ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｆｏｒｍｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）」と呼ばれるエチレン形成酵素によって触媒される一段階反応で、トリカルボン酸（ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ：ＴＣＡ）回路中間体のアルファ－ケトグルタル酸を使用してエチレンを合成することが知られている。二酸化炭素からエチレンを直接生成することを目的として、米国特許第９，３０９，５４１号明細書には、光栄養的にエチレンを生成することができる株を作り出すために、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）などの宿主においてｅｆｅ遺伝子を発現及び過剰発現させる方法が開示されている。言い換えれば、生物工学により光独立栄養生物を改変して、炭素固定の生成物が一段階反応でエチレンに変換される。現在の研究では、光独立栄養生物を改変してエチレンを生成することに焦点が当てられているが、エチレンの回収が課題となり得る。Ｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｂｉｏｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＦＯＲ ＢＩＯＦＵＥＬＳ ２０１４，７：３３に概説されているように、Ｏ2が光合成系においてエチレンと同時生成される場合、Ｏ2の存在下でのエチレンの引火性に関する安全上の重要な課題があり、リスクを軽減するための工学的設計が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】米国特許第７，８０７，４２７号明細書
【特許文献2】米国特許第９，３０９，５４１号明細書
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｂｉｏｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＦＯＲ ＢＩＯＦＵＥＬＳ ２０１４，７：３３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の１つ又は複数の実施形態は、（ｉ）１体積％を超える二酸化炭素を含むガス流を提供することと、（ｉｉ）水を提供することと、（ｉｉｉ）前記二酸化炭素及び前記水を、光の存在下で有機中間体及び酸素ガスに変換することと、（ｉｖ）前記有機中間体から前記酸素ガスを分離することと、（ｖ）前記有機中間体から前記酸素ガスを分離する前記工程の後に、前記有機中間体をエチレン及び二酸化炭素に変換することと、を含む方法を提供する。
【0010】
本発明のさらに他の実施形態は、エチレンを生成するためのシステムを提供し、前記システムは、（ｉ）二酸化炭素を有機中間体に変換する光合成微生物を含む第１のバイオリアクタであって、二酸化炭素入口及び有機中間体用出口を有する、第１のバイオリアクタと、（ｉｉ）第１のバイオリアクタと流体連通し、第１のバイオリアクタで生成された有機中間体をエチレンに変換する微生物を含む第２のバイオリアクタであって、エチレンを含むガス状材料のための出口を有し、未反応の有機中間体を含む流体材料のための出口を有する、第２のバイオリアクタと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】本発明の実施形態を実施するためのシステムの概略図である。
【0012】
【図2】本発明の実施形態における、二酸化炭素を送達するためのサブシステムの概略図である。
【0013】
【図3】本発明の実施形態を実施するための第２の光合成バイオリアクタを含む代替システムの概略図である。
【0014】
【図4】本発明の実施形態を実施するための酸素－燃料燃焼システムを含むシステムの概略図である。
【0015】
【図5】本発明の実施形態を実施するための上流の二酸化炭素の精製を含むシステムの概略図である。
【0016】
【図6】本発明の１つ又は複数の実施形態に適用可能なエチレン精製及び圧縮のスキームの概略図である。
【0017】
【図7】本発明の１つ又は複数の実施形態を実施するための二酸化炭素の膜分離を含む代替システムの概略図である。
【0018】
【図8】本発明の実施形態を実施するための単一のバイオリアクタを含む代替システムの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明の実施形態は、工業的に有意なレベルで二酸化炭素からエチレンを生合成する方法の開示されたものに、少なくとも部分的に基づいている。本発明の実施形態によれば、二酸化炭素は、最初に、酸素ガスの副生成物の生成と共に、有機中間体に光合成的に変換される。次いで、副生成物の酸素ガスは有機中間体から分離され、次いで、有機中間体は、副生成物の酸素ガスが明らかに存在しない状態で、生物学的にエチレンに変換される。エチレンの生合成に関連する現在の技術では一段階合成に焦点が当てられているが、本発明の２段階法は、工業的に有意なレベルでのエチレン及び酸素ガスの同時生成に関連する安全性の懸念に対処するものである。また、有機中間体のエチレンへの生物変換により副生成物の二酸化炭素が生成され、このことが全体的な炭素効率に影響を与える。さらに、エチレン生成物流中の二酸化炭素の量は、ほとんどの二酸化炭素投入流（例えば煙道ガス）に対してかなり多く、したがって、エチレン生成物流内の二酸化炭素は、適切に管理されれば貴重な資源となり得る。したがって、本発明の実施形態は、副生成物の二酸化炭素のための管理方法を提供し、その方法は、これに限定されるものではないが、二酸化炭素を有機中間体に光合成的に変換することを含み、その有機中間体は、有機中間体を生物学的にエチレンに変換する工程に再循環させることができる。またさらに、有機中間体をエチレンに生物学的に変換する工程は、定常状態又は定常状態付近で運転する連続撹拌槽反応器などの工業用反応器を使用することによって、商業規模で効率的に実現することができ、その定常状態が、有機中間体の不完全な消費、炭素効率の損失、及び貴重な原料の損失に影響を与える。したがって、本発明の実施形態は、有機中間体がエチレンに変換される反応器からの流出流を適切に管理することによって、これらの問題に対する解決策を提供する。
【0020】
方法及びシステムの概要
本発明の実施形態は、二酸化炭素をエチレンに変換するためのシステム２０を示す図１を参照して説明することができる。当該システムは、第１のバイオリアクタ２１と、それに直列で続く第２のバイオリアクタ４１とを含む。第１のバイオリアクタ２１は、中間生成物導管３１を介して第２のバイオリアクタ４１と直接的又は間接的に流体連通している。第２のバイオリアクタ４１はまた、中間体の再循環導管３３を介して第１のバイオリアクタ２１と流体連通している。二酸化炭素分離器６１が第２のバイオリアクタ４１の下流にあり、導管５１を介して第２のバイオリアクタ４１と直接的又は間接的に流体連通している。二酸化炭素分離器６１はまた、二酸化炭素の再循環導管５３を介して、直接的又は間接的に第１のバイオリアクタ２１と流体連通してもよい。
本発明の実施形態は、二酸化炭素をエチレンに変換するためのシステム２０を示す図１を参照して説明することができる。当該システムは、第１のバイオリアクタ２１と、それに直列で続く第２のバイオリアクタ４１とを含む。第１のバイオリアクタ２１は、中間生成物導管３１を介して第２のバイオリアクタ４１と直接的又は間接的に流体連通している。第２のバイオリアクタ４１はまた、中間体の再循環導管３３を介して第１のバイオリアクタ２１と流体連通している。二酸化炭素分離器６１が第２のバイオリアクタ４１の下流にあり、導管５１を介して第２のバイオリアクタ４１と直接的又は間接的に流体連通している。二酸化炭素分離器６１はまた、二酸化炭素の再循環導管５３を介して、直接的又は間接的に第１のバイオリアクタ２１と流体連通してもよい。
【0021】
本発明の実施形態によれば、第１のバイオリアクタ２１は、バイオリアクタ２１に送給される二酸化炭素及び水を有機中間体に変換する光合成生物培養物（すなわち光合成微生物）を含む。この変換は、第１のバイオリアクタ２１に供給される光エネルギーの存在下で行われる。有機中間体の合成は、反応媒体として作用する余剰水の存在下で行われ、余剰水は中間生成物流の担体として作用する。１つ又は複数の実施形態において、有機中間体は水に可溶性である。当業者が認識するように、光合成生物培養物は、接種反応器２３からバイオリアクタ２１に供給することができる。
【0022】
バイオリアクタ２１内で有機中間体が形成される間に、副生成物として酸素ガスが生成される。本発明の態様によれば、酸素ガスは、中間生成物流が第２のバイオリアクタ４１に導入される前に、有機中間体から分離される。例えば、第１のバイオリアクタ２１から、その反応器内の窒素ガスなどの他の揮発性物質と共に酸素ガスを放出することができる。
【0023】
有機中間体は、中間生成物流内で、直接的又は間接的に、第１の反応器２１から中間生成物導管３１を介して第２のバイオリアクタ４１に移される。１つ又は複数の実施形態において、中間生成物流を、その流れがバイオリアクタ２１を出る際に濾過することができる。運転中、前記流れがバイオリアクタ２１を出る際の中間生成物流の濾過によって、光合成微生物を固定化するために使用されるいかなる媒体の移動も防ぐことができ、それによって第１のバイオリアクタ２１から第２のバイオリアクタ４１への微生物の移動を防ぐことに役立つ。
【0024】
前記流れがバイオリアクタ２１を出る際に中間生成物流を濾過することに加えて、又はその代わりに、バイオリアクタ２１とバイオリアクタ４１との間に配置された１つ又は複数の中間ユニットで、中間生成物流を濾過及び／又は滅菌することができる。例えば、図２を参照すると、第１のバイオリアクタ２１と第２のバイオリアクタ４１との間に、任意選択の滅菌ユニット３５を配置することができる。ユニット３５は濾過ユニットを含んでもよい。濾過ユニットに加えて、又はその代わりに、ユニット３５は遠心分離ユニットを含んでもよい。又は、他の実施形態において、ユニット３５は、濾過又は遠心分離に加えて、又はその代わりに、浄化ユニット（例えば沈殿槽）を含んでもよい。濾過、遠心分離、及び／又は浄化の代わりに、又はそれに加えて、ユニット３５は滅菌ユニットを含んでもよい。例えば、滅菌ユニットにより、ＵＶ滅菌、熱、又はガンマ線を利用して中間生成物流が処理されてもよく、これは、第１のバイオリアクタ２１から第２のバイオリアクタ４１へ、いかなる生きた微生物の導入も防ぐために行われてもよい。
【0025】
１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタ４１は、有機中間体をエチレンに変換するエチレン生成生物培養物（すなわちエチレン生成生物）を含む。
【0026】
当業者が認識しているように、微生物培養物をそれぞれのバイオリアクタに導入するために、いくつかのサブシステムを設計することができる。当業者なら、これらの目的を達成するために適切なシステムを容易に設計することができる。例えば、複数の図を参照すると、接種反応器２３とも呼ばれ得る接種ユニット２３から、バイオリアクタ２１及び／又はバイオリアクタ４１に適切な微生物群を供給することができる。接種ユニット２３は、それぞれの微生物のための別個のチャンバ又は容器を含んでもよく、又はそれぞれの微生物のために別個のユニットが設けられてもよい。さらに、１つ又は複数のバイオリアクタからバイオマスを取り出すことが望ましい場合がある。１つ又は複数の実施形態において、本発明のシステムは、バイオリアクタのいずれか又は両方から得られたバイオマスを任意の固定化支持媒体から取り出し、システムから取り出すことができるバイオマス消化ユニット２５を含んでもよい。運転中、バイオマス消化ユニット２５を、バイオリアクタ２１、４１のいずれか又は両方と流体連通させることができ、又は、バイオマスを（任意選択で固定化材料と共に）手動で、それぞれの反応器から取り出すことができる。１つ又は複数の実施形態において、バイオマスをアミノ酸などの栄養素に変換し、微生物の栄養源としてバイオリアクタに戻すことができる。あるいは、バイオマスをシステムから取り出し、肥料などの他の用途に宛てることができる。
【0027】
バイオリアクタ４１内ではエチレン合成の副生成物として二酸化炭素が生成され、ガス状生成物流としてエチレン及び二酸化炭素が第２のバイオリアクタ４１から取り出される。液体流出流もまた、第２のバイオリアクタ４１を出る。この液体流出流は、水及び未反応の有機中間体を含んでもよく、この流れは、有機中間体の再循環導管３３を介して第１のバイオリアクタ２１に送り戻すことができる。図２に最もよく示されているように、水及び未反応の有機中間体を含む液体流出流は、濾過／滅菌ユニット３７で濾過及び／又は滅菌を受けることができる。この濾過及び／又は滅菌は、ユニット３５と同じ種類の技術を利用してもよく、したがって、ユニット３５に関する上記の解説がここに組み込まれる。当業者が認識しているように、エチレン生成微生物が第１のバイオリアクタ２１に決して移動しないようにすることが有用であり得る。
【0028】
第２のバイオリアクタ４１を出るガス状生成物流は、第２のバイオリアクタ４１の下流で、導管５１を介して直接的又は間接的に、二酸化炭素分離ユニット６１とも呼ばれ得る二酸化炭素分離器６１に送られる。分離器システム６１とも呼ばれ得る分離器６１内では、二酸化炭素がガス状生成物流から分離されて、導管５３によって運ばれる、エチレン濃厚流とも呼ばれ得る濃縮エチレン流を提供する。このエチレン濃厚流を下流の精製加圧ユニット１００に送ることができ、これについては本明細書でより詳細に説明する。分離器６１はまた、精製二酸化炭素流とも呼ばれ得る濃縮二酸化炭素流を生成し、この濃縮二酸化炭素流を、導管５５を介して第１のバイオリアクタ２１に送り戻すことができる。
【0029】
図３を参照して説明し得る代替の実施形態において、二酸化炭素分離器６１によって生成された精製二酸化炭素流を、導管５７を介して、二酸化炭素を有機中間体及び酸素ガスに光合成的に変換する光合成生物培養物を含む中間のバイオリアクタ７１（第２の光合成バイオリアクタ７１と呼ばれ得る）に送ることができる。有利には、バイオリアクタ７１への二酸化炭素送給流は、（二酸化炭素分離器６１を介した）精製二酸化炭素流であるため、第２の光合成バイオリアクタ７１を出るガス状副生成物流は比較的純粋な酸素ガス流を含み、その酸素ガス流は導管７５を介して送ることができる。比較的純粋な酸素流は、窒素ガス及びアルゴンガスを実質的に含まない流れを含んでおり、窒素ガス及びアルゴンガスが含まれればそれらを酸素ガスから分離するために複雑でかつ高価なプロセス（例えば空気分離技術）が必要であることを、本発明の文脈において当業者なら認識するであろう。しかし、本明細書で規定される比較的純粋な酸素ガス流の中の二酸化炭素の存在は有害ではなく、したがって、特に明記しない限り、二酸化炭素は、酸素ガス流からより容易に分離することができるため、比較的純粋な酸素ガス流内に存在してもよい。第１のバイオリアクタ２１と矛盾することなく、中間のバイオリアクタ７１は流出流を生成し、その流出流は、有機中間体及び水を含んでもよく、導管７９を介して第１のバイオリアクタ２１及び／又は第２のバイオリアクタ４１に送り戻すことができる。一般に示されるように、この流出流は、図２を参照して説明したように、ユニット３７で濾過及び／又は滅菌を受けてもよい。
【0030】
図面全体を通して示されるように、第２のバイオリアクタ４１を出、導管５１を介して送られるガス流は、ユニット６１での二酸化炭素分離の前に、任意選択で１つ又は複数の処理又は操作を受けることができる。例えば、圧縮ユニット４３でその流れを加圧することができる。加圧に加えて、又はその代わりに、ガス流は、任意選択で、酸素取出しユニット４５で酸素を取り出すための処理を受けることができる。酸素取出しユニット４５で二酸化炭素が作り出され得るので、ユニット４５で生成された二酸化炭素を取り出すことができる二酸化炭素分離ユニット６１の上流に酸素取出しユニット４５を配置することが有益であり得る。
【0031】
本発明のさらに別の実施形態は、図８を参照して説明することができる。示されるように、プロセス１２０は、上記の他のシステムに関して示された２つのバイオリアクタ２１、４１の代わりに、統合バイオリアクタ１２１とも呼ばれ得る単一の容器１２１を含む。運転中、バイオリアクタ１２１に供給される光エネルギーは、明サイクル及び暗サイクルを生成する形で制御される。運転中、統合バイオリアクタ１２１内の光合成微生物が、明サイクル中に二酸化炭素を有機中間体に変換し、次いで暗サイクル中に、統合バイオリアクタ１２１内のエチレン形成微生物が、暗サイクル中に有機中間体をエチレンに変換する。明サイクル中での酸素の生成中に、バイオリアクタ１２１から酸素を取り出すことができ、暗サイクル中でのエチレンの生成中に、バイオリアクタ１２１からエチレンを取り出すことができる。他の実施形態と矛盾することなく、エチレンが二酸化炭素と同時生成されてもよく、エチレン及び二酸化炭素は、上記の下流プロセスにおいて（例えば二酸化炭素スクラバ６１で）分離することができる。
【0032】
図２に戻り、本発明の方法は、二酸化炭素投入流の調整（すなわち、バイオリアクタ２１に前記流れを提供する前の前記流れの調整）を含んでもよい。１つ又は複数の実施形態において、導管１１によって運ばれる二酸化炭素投入流は、圧縮機１３で加圧されてもよい。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素投入流内の不活性ガス（例えば窒素）が最終的に反応器のヘッドスペースに入ることができるように、その投入流の（例えば圧縮機１３内での）加圧により、第１のバイオリアクタ２１内の対抗力に打ち勝つのに十分な圧力が獲得される。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素投入流は、約２～約２０ｐｓｉｇ、他の実施形態では約３～約１８ｐｓｉｇ、他の実施形態では約５～約１５ｐｓｉｇの圧力に加圧される。
【0033】
また、図２に最もよく示されているように、二酸化炭素投入流を、導管１７を介してバイオリアクタ２１に送達する前に、急冷器１５で冷却することができる。当業者が認識するように、急冷器１５は、冷却水ループ１５’を含む水冷ユニットを含んでもよく、冷却水ループ１５’は、水を冷却するための１つ又は複数の熱交換器を含んでもよい。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素投入流は、バイオリアクタ２１内の微生物培養物に有害な影響を及ぼす温度より低い温度に冷却される。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素投入流は、バイオリアクタ２１への送達前に、約１０～約８０℃、他の実施形態では約２０～約６０℃、他の実施形態では約３０～約５０℃の温度に冷却される。
【0034】
１つ又は複数の実施形態の二酸化炭素投入流はかなりの量の水を含んでもよく、その水の少なくとも一部が急冷器１５で冷却サイクルを介して凝縮されることになるので、かなりの量の水を消費する第１のバイオリアクタ２１に、急冷器１５からの水を送給することができる。１つ又は複数の実施形態において、急冷器１５で用いられる水、及び／又は第１のバイオリアクタ２１に送られる水流を苛性物質で処理して、水のｐＨを調整することができる。１つ又は複数の実施形態において、急冷器１５で用いられる水、及び／又は急冷器１５から第１のバイオリアクタ２１に送られる水は、５．５を超えるｐＨに、他の実施形態では６．０を超えるｐＨに、他の実施形態では６．５を超えるｐＨ（例えば、５．５～８．０又は６．０～７．５の範囲）に調整される。水の苛性処理によって、炭酸ナトリウムなどの炭酸塩が形成されることが予想され、これはｐＨ制御に関して第１のバイオリアクタ２１のためになるだけでなく、炭酸ナトリウム及び／又は重炭酸ナトリウムの形態の追加的な二酸化炭素源ももたらされる。当業者なら、炭酸ナトリウムと重炭酸ナトリウムとの間の望ましいバランスを得るために、条件を容易に調整し、かつ／又は追加的な成分（例えば塩酸）を提供することができる。特定の実施形態において、急冷器１５内の冷却水に提供される苛性ソーダは、本発明の実施態様に統合することができる他のプロセスに由来する。例えば、エチレン精製で苛性ソーダを使用することができ、かつ／又は、エチレン精製で、急冷器１５に取り込ませることができる炭酸ナトリウムを作り出すことができる。
【0035】
さらに他の実施形態において、他の実施形態に関して説明したように、第２のバイオリアクタ４１を出る液体流出流は、第１のバイオリアクタ２１に送り戻すことができ、任意選択で急冷器１５に送ることができる。１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタ４１を出る液体流出流は、まず、急冷器１５に送る前に滅菌ステーション３７で処理される。
【0036】
第１のバイオリアクタへの二酸化炭素供給流
本発明の方法は、有利には、二酸化炭素投入流と呼ばれ得る様々なガス源からの二酸化炭素を、エチレンに変換し得る有用な中間体に変換することができる。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素は、１％体積を超える、他の実施形態では３％体積を超える、他の実施形態では５％体積を超える、また他の実施形態では１０％体積を超える二酸化炭素を含む二酸化炭素投入流によって、システムに提供される。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素投入流は、燃焼プロセスの排気流（すなわち煙道ガス流）であるか、又はそれに由来する。当業者が認識しているように、排気流の組成は、燃焼プロセスの設計、及び燃焼プロセスで燃やされる燃料を含むいくつかの要因に基づいて変化し得る。例えば、煙道ガス流は、石炭燃焼炉、ガス燃焼炉、タービン発電機、及び酸素燃料燃焼プロセスに由来し得る。
本発明の方法は、有利には、二酸化炭素投入流と呼ばれ得る様々なガス源からの二酸化炭素を、エチレンに変換し得る有用な中間体に変換することができる。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素は、１％体積を超える、他の実施形態では３％体積を超える、他の実施形態では５％体積を超える、また他の実施形態では１０％体積を超える二酸化炭素を含む二酸化炭素投入流によって、システムに提供される。１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素投入流は、燃焼プロセスの排気流（すなわち煙道ガス流）であるか、又はそれに由来する。当業者が認識しているように、排気流の組成は、燃焼プロセスの設計、及び燃焼プロセスで燃やされる燃料を含むいくつかの要因に基づいて変化し得る。例えば、煙道ガス流は、石炭燃焼炉、ガス燃焼炉、タービン発電機、及び酸素燃料燃焼プロセスに由来し得る。
【0037】
１つ又は複数の実施形態において、二酸化炭素投入流は、酸素燃焼（ｏｘｙｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ）とも呼ばれ得る酸素燃料燃焼（ｏｘｙ－ｆｕｅｌ ｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ）プロセスの排気流に由来し得る。当業者なら、これらの方法が、窒素及びアルゴンが実質的に存在しない状態での燃料（例えば炭化水素）の燃焼を含むことを認識している。例えば、これらのプロセスは、実質的に純粋な酸素（すなわち、窒素及びアルゴンガスを実質的に含まない）、又は純粋な酸素と再循環煙道ガスとの混合物が燃焼プロセスに供給される燃焼プロセスを含んでもよい。結果として、燃焼生成物はほとんどが二酸化炭素及び水であり、窒素副生成物又はアルゴンが実質的に少ない。有利には、酸素燃焼プロセスからの二酸化炭素投入流はかなりのレベルの二酸化炭素を含み、窒素及び酸素を実質的に含まないので、光合成バイオリアクタからのガス状副生成物流は、未反応の二酸化炭素があればそれと共に、実質的に高濃度の酸素ガスを含むことになる。次いで、光合成バイオリアクタからのガス状副生成物流は、酸素燃焼プロセス内の燃料として酸素燃焼ユニットに再循環させることができ、その際、未反応の二酸化炭素があれば酸素燃焼プロセスは冷却される。
【0038】
例えば、図４を参照すると、本発明の一実施形態は、酸素燃焼ユニット１８からの二酸化炭素投入流を含む。先の実施形態と同様に、二酸化炭素は、第１のバイオリアクタ２１で、副生成物の酸素ガスを伴って有機中間体に光合成的に変換される。酸素ガス及び未反応の二酸化炭素を含む副生成物の酸素ガス流は、導管２２を介して酸素燃焼ユニット１８に送られる。また、示されていないものの、酸素燃焼ユニット１８からの二酸化炭素投入流は、他の実施形態に関して上で記載したように、冷却及び加圧することができる（例えば図２を参照されたい）。第１のバイオリアクタ２１で生成された中間生成物は、他の実施形態と矛盾しない形で、第２のバイオリアクタ４１に向けて下流に送られる。
【0039】
さらに他の実施形態において、比較的純粋な二酸化炭素流を第１のバイオリアクタ２１に供給することができる。比較的純粋な二酸化炭素流は、いくつかの供給源から得ることができ、一般に、９０体積％を超える、他の実施形態では９５体積％を超える、他の実施形態では９９体積％を超える二酸化炭素を含有する流れを含む。上で説明したように、比較的純粋な二酸化炭素流が使用される場合、本発明の方法は、第１のバイオリアクタ２１からの副生成物の流出物として、比較的純粋な（すなわち、窒素又はアルゴンガスが実質的にない）酸素ガス流を生成する。これらの比較的純粋な酸素ガス流は、例えば、エチレンのオキシ塩素化などの工業用途に使用することができる。
【0040】
１つ又は複数の実施形態において、本発明の工程として比較的純粋な二酸化炭素流が生成され、投入流として使用される。例えば、二酸化炭素を含有する投入流を第１のバイオリアクタ２１に導入する前に、その流れを精製及び／又は濃縮することができる。１つ又は複数の実施形態において、例えばアミンスクラビング及びストリッピングの技術を用いることによって、二酸化炭素投入流を精製することができる。先の実施形態のうちの１つ又は複数と同様に、精製二酸化炭素流を第１のバイオリアクタに提供することによって、第１のバイオリアクタを出る副生成物流として比較的高品位の酸素ガス流を生成することができる。二酸化炭素流を精製及び／又は濃縮するために、アミンスクラビング及びストリッピングの技術に加えて、又はその代わりに、様々な二酸化炭素の取出し及び分離の技術を用いることができると当業者なら認識するであろう。これらの技術としては、以下に限定されるものではないが、膜分離、固体吸着剤、及び炭酸カリウムなどの他の溶媒化学作用（ｓｏｌｖｅｎｔ ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）の使用が挙げられる。
【0041】
図５を参照して例示的な実施形態を説明することができ、図５は、二酸化炭素精製ユニット１６から二酸化炭素投入流を受け取る第１のバイオリアクタ２１を含むシステム５０を示している。精製ユニット１６は、導管１１’を介して第１のバイオリアクタ２１に導入される精製二酸化炭素流を生成する。示されていないものの、燃焼ユニットからの二酸化炭素投入流は、他の実施形態に関して上で記載したように、冷却及び加圧することができる（例えば図２を参照されたい）。二酸化炭素は、バイオリアクタ２１において、副生成物の酸素ガスを伴って有機中間体に光合成的に変換される。副生成物の酸素ガスは、導管２４を介して直接的又は間接的に、例えば、比較的高純度の酸素を必要とする工業プロセス２６に送られる。１つ又は複数の実施形態において、バイオリアクタ４１で生成されたエチレンを工業プロセス２６に送ることもできる。図５には示されていないものの、第２のバイオリアクタ４１からのエチレン流は、酸素ガス変換、二酸化炭素の取出し（及び光合成バイオリアクタへの再循環）、並びにエチレン精製を含むがこれらに限定されない、他の実施形態に関して説明した下流の処理を受けることが認識されよう。
【0042】
やはり、光合成バイオリアクタによって比較的純粋な二酸化炭素流の使用に由来することができる比較的純粋な酸素の副生成物流が得られる実施形態においては、比較的純粋な酸素流を工業用途に使用することができる。１つ又は複数の実施形態において、光合成バイオリアクタを出るガス流は、酸素ガス流中に未反応の二酸化炭素があれば取り出すために、二酸化炭素取出し処理を受けることができる。次いで、酸素ガス流を所望の工業用途に送ることができる。例えば、これらの実施形態からの酸素ガス流をオキシ塩素化ユニットに送ることができ、そこでエチレンは酸素ガスの存在下で塩酸と反応する。この例では、エチレンはエチレン生成バイオリアクタに由来し得る。エチレン生成バイオリアクタからのエチレン流は、他の実施形態に関して説明したように、二酸化炭素取出し処理及びエチレン精製を受けることが認識されよう。
【0043】
二酸化炭素の分離
１つ又は複数の実施形態において、下流の（例えば二酸化炭素分離ユニット６１での）二酸化炭素の分離は、従来のアミンスクラビング／ストリッピングを用いることによって行われてもよい。様々な他の二酸化炭素分離技術を用いることができ、二酸化炭素分離技術としては、以下に限定されるものではないが、炭酸カリウムを使用した溶媒分離、膜分離、及び固体吸着剤分離が挙げられる。
１つ又は複数の実施形態において、下流の（例えば二酸化炭素分離ユニット６１での）二酸化炭素の分離は、従来のアミンスクラビング／ストリッピングを用いることによって行われてもよい。様々な他の二酸化炭素分離技術を用いることができ、二酸化炭素分離技術としては、以下に限定されるものではないが、炭酸カリウムを使用した溶媒分離、膜分離、及び固体吸着剤分離が挙げられる。
【0044】
当業者が認識しているように、アミンスクラビング及びストリッピングの技術又は方法には、一般に、水担体内の有機アミンによる二酸化炭素の吸収（すなわちスクラビング）、及びそれに続く有機アミンからの二酸化炭素の再生又は放出（すなわちストリッピング）が含まれる。これらのシステム及びそれらを使用するための技術は、米国特許出願公開第２００９／００３８３１４号明細書、同第２００９／０１５６６９６号明細書及び同第２０１３／０２４４３１２号明細書に記載されているように当技術分野で周知であり、それらは参照により本明細書に組み込まれる。また、エンジニアリング・データ・ブック（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄａｔａ Ｂｏｏｋ）、第ＩＩ巻第１７－２６節、ガス処理業者協会（Ｇａｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓ Ｓｕｐｐｌｉｅｒｓ Ａｓｓｏｃ．）（１９９４）も参照されたい。
【0045】
アミンスクラビング／ストリッピングの代わりに、又はそれに加えて、膜分離技術を用いてもよい。当業者が認識しているように、これらの膜には、二酸化炭素が透過物を通過することが可能であるポリマー又は無機微多孔膜が含まれてもよい。これらの膜及びそれらを使用するための技術は、米国特許出願公開第２００８／０１７３１７９号明細書及び同第２０１３／０３１２６０４号明細書に記載されているように周知であり、それらは参照により本明細書に組み込まれる。本発明の実施において、アミンスクラビング／ストリッピングの技術の代わりに膜分離を使用する場合、残留エチレンを取り出すことが望ましい場合がある。残留エチレンは、透過流の中に移る可能性があり、そのため取り出さなければ固定反応器（すなわち第１のバイオリアクタ）に送り戻され、そして最終的に酸素流中に移ることになる。これに関して、図７を参照すると、導管７３を介してエチレン処理ユニット７５に向けて下流に送られる二酸化炭素の透過流を有する膜分離ユニット６１’を含む代替システム２０’が示されており、エチレン処理ユニット７５は、透過流が導管５１’を介してバイオリアクタ２１に送り戻される前に、透過流内に残留エチレンがあれば（例えば触媒燃焼により）取り出すために、前記流れを触媒作用的に処理するように適合されてもよい。
【0046】
エチレン精製
上記のように、第２のバイオリアクタ４１のエチレン含有生成物流の（例えば分離器６１内での）二酸化炭素分離により、導管５３によって運ばれるエチレン濃厚流が生成される。このエチレン濃厚流は、後の使用及びサブプロセス１００内の任意選択の輸送のために精製及び任意選択の圧縮を受けることができ、これは図６を参照して最もよく説明される。１つ又は複数の実施形態において、サブプロセス１００では、導管５３を介して提供されるエチレン濃厚流が、１つ又は複数の技術を用いて処理される。例えば、エチレン濃厚流は、任意選択の酸素ガス取出しユニット１０１で酸素ガス取出し処理を受けてもよい。このユニット内では、エチレン濃厚流内の残留酸素ガスが、例えば、エチレンの一部の触媒燃焼によって消費される。１つ又は複数の実施形態において、サブプロセス１００は、残留二酸化炭素があれば取り出す（例えば、二酸化炭素のレベルを１０ｐｐｍ未満、又は５ｐｐｍ未満、又は３ｐｐｍ未満に低減する）苛性洗浄ユニット１０３で、エチレン流のポリッシングを含んでもよい。苛性洗浄ユニット１０３の下流で、エチレン濃厚流は除水ユニット１０５で除水処理を受けてもよく、除水ユニット１０５は、分子ふるいを使用した脱水ユニットを含んでもよい。除水処理後、エチレン濃厚流を凝縮器１０７で凝縮することができ、凝縮器１０７は、プロピレン冷蔵ユニット１０８によって冷却することができる。当業者なら、様々な精製工程の順序が、複数の要因に応じて変更され得ることを認識するであろう。また、当業者なら、精製プロセスの様々な工程が、使用又は（例えばパイプラインを介した）輸送に必要とされ得る所望の圧力を獲得する目的で行われてもよいことを認識するであろう。この目的のために、エチレン濃厚流は、２つ以上の精製工程の前、後、又はその間に加圧されてもよい。例えば、図６に示すように、前記流れは圧縮ユニット９９で加圧されてもよい。同様に、エチレン生成物ポンプ１０９でさらに加圧を行うことができる。
上記のように、第２のバイオリアクタ４１のエチレン含有生成物流の（例えば分離器６１内での）二酸化炭素分離により、導管５３によって運ばれるエチレン濃厚流が生成される。このエチレン濃厚流は、後の使用及びサブプロセス１００内の任意選択の輸送のために精製及び任意選択の圧縮を受けることができ、これは図６を参照して最もよく説明される。１つ又は複数の実施形態において、サブプロセス１００では、導管５３を介して提供されるエチレン濃厚流が、１つ又は複数の技術を用いて処理される。例えば、エチレン濃厚流は、任意選択の酸素ガス取出しユニット１０１で酸素ガス取出し処理を受けてもよい。このユニット内では、エチレン濃厚流内の残留酸素ガスが、例えば、エチレンの一部の触媒燃焼によって消費される。１つ又は複数の実施形態において、サブプロセス１００は、残留二酸化炭素があれば取り出す（例えば、二酸化炭素のレベルを１０ｐｐｍ未満、又は５ｐｐｍ未満、又は３ｐｐｍ未満に低減する）苛性洗浄ユニット１０３で、エチレン流のポリッシングを含んでもよい。苛性洗浄ユニット１０３の下流で、エチレン濃厚流は除水ユニット１０５で除水処理を受けてもよく、除水ユニット１０５は、分子ふるいを使用した脱水ユニットを含んでもよい。除水処理後、エチレン濃厚流を凝縮器１０７で凝縮することができ、凝縮器１０７は、プロピレン冷蔵ユニット１０８によって冷却することができる。当業者なら、様々な精製工程の順序が、複数の要因に応じて変更され得ることを認識するであろう。また、当業者なら、精製プロセスの様々な工程が、使用又は（例えばパイプラインを介した）輸送に必要とされ得る所望の圧力を獲得する目的で行われてもよいことを認識するであろう。この目的のために、エチレン濃厚流は、２つ以上の精製工程の前、後、又はその間に加圧されてもよい。例えば、図６に示すように、前記流れは圧縮ユニット９９で加圧されてもよい。同様に、エチレン生成物ポンプ１０９でさらに加圧を行うことができる。
【0047】
光合成微生物
上で述べたように、第１のバイオリアクタは、光エネルギーの存在下で二酸化炭素及び水を有機中間体に変換する１種又は複数種の光合成微生物を含有する光合成生物培養物を含有する。様々な実施形態において、光合成微生物は天然起源であってもよい。他の実施形態において、光合成微生物は、所望の有機中間体の生成を向上させるために遺伝子改変されてもよい。１つ又は複数の実施形態において、第１のバイオリアクタで利用される光合成微生物には、シアノバクテリアなどの光合成細菌が含まれてもよい。当業者が認識しているように、光合成細菌は、光の存在下で二酸化炭素及び水を消費して炭素を固定する。有利には、好気性条件におけるシアノバクテリアの代謝経路の主な生成物は、酸素、及び糖などの有機中間体である。当業者は、所望の有機中間体を生成するために、過度の実験をせずに適切な光合成微生物を選択することができるであろう。
上で述べたように、第１のバイオリアクタは、光エネルギーの存在下で二酸化炭素及び水を有機中間体に変換する１種又は複数種の光合成微生物を含有する光合成生物培養物を含有する。様々な実施形態において、光合成微生物は天然起源であってもよい。他の実施形態において、光合成微生物は、所望の有機中間体の生成を向上させるために遺伝子改変されてもよい。１つ又は複数の実施形態において、第１のバイオリアクタで利用される光合成微生物には、シアノバクテリアなどの光合成細菌が含まれてもよい。当業者が認識しているように、光合成細菌は、光の存在下で二酸化炭素及び水を消費して炭素を固定する。有利には、好気性条件におけるシアノバクテリアの代謝経路の主な生成物は、酸素、及び糖などの有機中間体である。当業者は、所望の有機中間体を生成するために、過度の実験をせずに適切な光合成微生物を選択することができるであろう。
【0048】
１つ又は複数の実施形態において、所望の有機中間体は、スクロース、デキストロース、キシロース、グルコース、フルクトース、アルファ－ケトグルタル酸、又はそれらの混合物を含む。
【0049】
例示的な光合成微生物としては、限定されずに、シアノバクテリア、藻類及び紅色細菌が挙げられる。有用な種類のシアノバクテリアとしては、酸素産生光合成を行う光合成原核生物が挙げられる。本明細書で概説する目的に有用なシアノバクテリアは、当技術分野で一般に周知である。（例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ出版（１９９４）の、Ｄｏｎａｌｄ ＢｒｙａｎｔによるＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａを参照されたい）。代表的な例としては、シネココッカス・リビドゥス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄｕｓ）及びシネココッカス・エロンガトゥス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）などのシネココッカス属のシアノバクテリア、並びにシネコシスティス・ミネルバエ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｅｒｖａｅ）及びシンコシスティス・エスピー（Ｓｙｎｃｈｏｃｙｓｔｉｓ Ｓｐ）ＰＣＣ ６８０３などのシネコシスティス属のシアノバクテリアが挙げられる。これに関して、米国特許第７，８０７，４２７号明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。使用することができる合成微生物の例としては、米国特許第１０，１９６，６２７号明細書に開示されているものが挙げられ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに他の例としては、米国特許第９，９１４，９４７号明細書及び同第９，３０９，５４１号明細書に開示されている微生物が挙げられ、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【0050】
１つ又は複数の実施形態において、シアノバクテリアは、目的有機中間体の生成を増強する１つ又は複数の酵素をコード化する１つ又は複数の外来遺伝子を発現するように遺伝子改変される。１つ又は複数の実施形態において、目的有機中間体には、スクロース、デキストロース、キシロース、グルコース、フルクトース及びアルファ－ケトグルタル酸が含まれる。当業者に明らかなように、シアノバクテリア（及び生成される酵素）のゲノムに付加される特定の遺伝子は、特定の目的有機中間体によって決まる。
【0051】
１つ又は複数の実施形態において、改変光合成微生物は、二酸化炭素からアルファケトグルタル酸を形成する酵素を生成する改変ヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、この改変光合成微生物は、非天然のアルファ－ケトグルタル酸透過酵素タンパク質（ａｌｐｈａ－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＫＧＰ）形成ヌクレオチド配列を発現することにより、ＡＫＧＰを発現する。１つ又は複数の実施形態において、改変微生物は、改変ヌクレオチド配列を欠く対照微生物によって生成されるよりも多い量の酵素を生成する。この量は、改変ヌクレオチド配列を欠く対照微生物によって生成される量の１％を超え、他の実施形態では５０％を超え、他の実施形態では７５％を超えてもよい。
【0052】
１つ又は複数の実施形態において、イソクエン酸脱水素酵素（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＩＣＤ）によるイソクエン酸の酸化的脱炭酸によって、又はグルタミン酸脱水素酵素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＤＨ）によるグルタミン酸の酸化的脱アミノによって、アルファ－ケトグルタル酸（（ａｌｐｈａ－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ：ａＫＧ）を生成することができる。シアノバクテリアにおけるクローニング及びａＫＧ生成のための目的酵素には、ＩＣＤ酵素：１．１．１．４２、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ：Ｐ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＣＤのコード配列（配列番号１、配列番号２）、ＩＣＤ酵素：１．１．１．４２、シネココッカス・エロンガトゥスＰＣＣ７９４のコード配列（配列番号３、配列番号４）、及びＧＤＨ酵素：１．４．１．２、Ｐ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのコード配列（配列番号５、配列番号６）が含まれてもよい。
【0053】
１つ又は複数の実施形態において、アルファ－ケトグルタル酸を形成するための酵素は、イソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤ）タンパク質、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＤＨ）タンパク質、又はそれらの組合せから選択される。
【0054】
ある実施形態において、改変光合成微生物は、配列番号２と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を有する改変ＩＣＤタンパク質ヌクレオチド配列を発現することによって、配列番号１と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を有するＩＣＤタンパク質を発現する。ある実施形態において、改変光合成微生物は、配列番号４と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を有する改変ＩＣＤタンパク質ヌクレオチド配列を発現することによって、配列番号３と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を有するＩＣＤタンパク質を発現する。ある実施形態において、改変微生物は、配列番号６と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を有する改変ＧＤＨタンパク質ヌクレオチド配列を発現することによって、配列番号５と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を有するＧＤＨタンパク質を発現する。
【0055】
１つ又は複数の実施形態において、有機中間体はスクロースである。これらの実施形態のいくつかにおいて、例えば、シアノバクテリア（シネココッカス・エロンガトゥス、シネコシスティス）を、エチレン生成微生物の増殖のための基質として働くスクロースを生成するように操作することができる。スクロースを生成するためのシネココッカス・エロンガトゥスＰＣＣ７９４２の様々な操作方法には、１つの遺伝子（ｃｓｃＢ）の活性化及び１つの遺伝子（ＧｌｇＣ）の欠失が含まれ得る。
【0056】
これらの実施形態の１つ又は複数において、改変光合成微生物は、スクロース合成酵素タンパク質を発現する。１つ又は複数の実施形態において、スクロース合成酵素タンパク質は、配列番号１０と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を有する改変スクロース合成酵素タンパク質ヌクレオチド配列を発現することによって、配列番号９と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を有する。これらの実施形態の１つ又は複数において、改変微生物は、スクロースリン酸合成酵素タンパク質を発現する。１つ又は複数の実施形態において、スクロースリン酸合成酵素タンパク質は、配列番号１２と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を有する改変スクロースリン酸合成酵素タンパク質ヌクレオチド配列を発現することによって、配列番号１１と少なくとも９８％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を有する。
【0057】
本明細書で使用される場合、配列の同一性とは、配列を比較することによって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係である。配列の同一性又は類似性は、概して、それぞれの配列の全長にわたって比較される。当業者なら、「同一性」が、場合によってはアミノ酸配列又は核酸配列の文字列の間の一致性によって決定される、アミノ酸配列又は核酸配列の間の配列関連性の程度を指すことを認識している。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を、別のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。当業者なら、「同一性」及び「類似性」を様々な既知の方法によって容易に計算することができる。例えば、同一性及び類似性を決定する方法は、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）、ＢＬＡＳＴＮ（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）、ＮＣＢＩ及び他の情報源（ＢＬＡＳＴ．ＲＴＭ．Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４）から公表されているＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）、及びＥＭＢＯＳＳ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ）などの、公表されているコンピュータプログラムに成文化されている。
ＥＭＢＯＳＳを使用したアミノ酸配列比較のための例示的なパラメータは、ｇａｐ ｏｐｅｎ １０．０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ０．５、ブロックアミノ酸置換行列（ＢＬＯｃｋｓ ＳＵｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ）である。ＥＭＢＯＳＳを使用した核酸配列比較のための例示的なパラメータは、ｇａｐ ｏｐｅｎ １０．０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ０．５、ＤＮＡ完全行列（ＤＮＡ ｆｕｌｌ ｍａｔｒｉｘ）（ＤＮＡ同一性行列（ＤＮＡ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ））である。当業者が理解しているように、異なる種の間のＤＮＡ／タンパク質の配列を比較して、Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ、ＫＥＧ、ＢＬＡＳＴ及びＥｎｓｅｍｂｌｅなどのオンラインデータを使用して配列の相同性を決定することができる。当業者はまた、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れてもよい。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンである。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換変異体は、開示された配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸の変化は保存的である。天然起源のアミノ酸のそれぞれについての好ましい保存的置換は以下の通りである。すなわち、Ａｌａからｓｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ、ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ；及びＶａｌからｉｌｅ又はｌｅｕへの置換である。
ＥＭＢＯＳＳを使用したアミノ酸配列比較のための例示的なパラメータは、ｇａｐ ｏｐｅｎ １０．０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ０．５、ブロックアミノ酸置換行列（ＢＬＯｃｋｓ ＳＵｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ）である。ＥＭＢＯＳＳを使用した核酸配列比較のための例示的なパラメータは、ｇａｐ ｏｐｅｎ １０．０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ０．５、ＤＮＡ完全行列（ＤＮＡ ｆｕｌｌ ｍａｔｒｉｘ）（ＤＮＡ同一性行列（ＤＮＡ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ））である。当業者が理解しているように、異なる種の間のＤＮＡ／タンパク質の配列を比較して、Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ、ＫＥＧ、ＢＬＡＳＴ及びＥｎｓｅｍｂｌｅなどのオンラインデータを使用して配列の相同性を決定することができる。当業者はまた、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れてもよい。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンである。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換変異体は、開示された配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸の変化は保存的である。天然起源のアミノ酸のそれぞれについての好ましい保存的置換は以下の通りである。すなわち、Ａｌａからｓｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ、ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ；及びＶａｌからｉｌｅ又はｌｅｕへの置換である。
【0058】
特に明記しない限り、「適合された」又は「コドン適合された」という用語は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの「コドン最適化」を指し、そのポリヌクレオチドの配列は天然若しくは非天然であってもよく、又は他の微生物における発現に適合されてもよい。コドン最適化により、コード化されたポリペプチドに対するコドン使用が、そのポリペプチドが発現される生物のコドンバイアスに適合される。コドン最適化は、一般に、宿主細胞におけるコード化されたポリペプチドの生成レベルを増加させるのに役立つ。
【0059】
ある実施形態において、改変光合成微生物は、グルコース－１－リン酸アデニル酸転移酵素タンパク質の発現を欠くデルタ－ｇｌｇｃ（Δｇｌｇｃ）変異微生物を含む。同様に、機能性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ酵素を欠くシアノバクテリア細胞は、米国特許第９，３０９，５４１号明細書及び同第９，３０９，５４１号明細書に記載されているように既知であり、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0060】
エチレン生成微生物
上記のように、エチレン生成生物には、光合成バイオリアクタで生成された有機中間体を消費することによってエチレンを天然に生成するか、又はエチレンを生成するように遺伝子改変された生物が含まれる。１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタで利用される微生物には、エチレン形成酵素（ｅｆｅ）遺伝子を発現するか、又は発現するように遺伝子改変された微生物が含まれる。これらの微生物は、本明細書ではｅｆｅ形成微生物と呼ぶ場合がある。エチレンを生成するか、又はエチレンを生成するように改変された微生物は当技術分野で周知であり、記載された反応条件下で目的有機中間体からエチレンを生成することができる任意の微生物が使用されてもよい。１つ又は複数の実施形態において、所望の微生物は、生成されれば本明細書に記載の方法を妨害する可能性がある他のものは生成しない。
上記のように、エチレン生成生物には、光合成バイオリアクタで生成された有機中間体を消費することによってエチレンを天然に生成するか、又はエチレンを生成するように遺伝子改変された生物が含まれる。１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタで利用される微生物には、エチレン形成酵素（ｅｆｅ）遺伝子を発現するか、又は発現するように遺伝子改変された微生物が含まれる。これらの微生物は、本明細書ではｅｆｅ形成微生物と呼ぶ場合がある。エチレンを生成するか、又はエチレンを生成するように改変された微生物は当技術分野で周知であり、記載された反応条件下で目的有機中間体からエチレンを生成することができる任意の微生物が使用されてもよい。１つ又は複数の実施形態において、所望の微生物は、生成されれば本明細書に記載の方法を妨害する可能性がある他のものは生成しない。
【0061】
例示的なｅｆｅ形成微生物としては、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス・シリンガエ ｐｖ．グリシニア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．Ｇｌｙｃｉｎｉａ）、及びペニシリウム・ジギタタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）が挙げられ、これらはすべて天然にｅｆｅを発現する。他の実施形態において、第２の反応器内の微生物には、シュードモナス・シリンガエ又はペニシリウム・ジギタタムに天然に見られる遺伝子などのｅｆｅ遺伝子を発現又は過剰発現する改変微生物が含まれる。これらの実施形態において、１つ又は複数のコピーの１つ又は複数のｅｆｅ遺伝子を遺伝子導入するための当技術分野で既知の多数の方法のいずれか１つを用いて、宿主微生物に遺伝子導入する。有用な宿主微生物には、限定されずに、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）及びトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が含まれてもよい。
【0062】
１つ又は複数の実施形態において、ｅｆｅを生成するための改変微生物は、Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，’’Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｓｅｒｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｇｅｎｅ（ｅｆｅ）ａｔ ｔｈｅ １６ Ｓ ｒＤＮＡ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ ２４４０’’Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２０１０）１０１：６４０４－６４０９に記載されているように生成されてもよく、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの実施形態において、ｅｆｅ遺伝子をＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｅａ ＩＣＭＰ２１８９からクローニングし、二重交差組換えを用いてシュードモナス・プジタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｄｉｔａ）ＫＴ ２４４０宿主の１つ又は複数の１６Ｓ ｒＤＮＡ部位に挿入する。
【0063】
上で述べたように、１つ又は複数の実施形態において、ｅｆｅ酵素を生成する微生物は、遺伝子操作された微生物を含む。１つ又は複数の実施形態において、ｅｆｅ形成微生物は、発現された場合にｅｆｅを生成する１つ又は複数の外来ヌクレオチド配列を、そのＤＮＡ内に含む改変微生物である。１つ又は複数の実施形態において、改変微生物は、改変ヌクレオチド配列を欠く対照微生物によって生成されるよりも多い量のｅｆｅ酵素を生成する。この量は、改変ヌクレオチド配列を欠く対照微生物によって生成される量の５％を超え、他の実施形態では５０％を超え、他の実施形態では７５％を超えてもよい。様々な実施形態において、遺伝子改変された微生物は、発現された場合にｅｆｅを生成する外来ヌクレオチド配列の２つ以上のコピーを含むように改変され、エチレン生成がさらに向上する。
【0064】
１つ又は複数の実施形態において、シュードモナス・サバスタノイ ｐｖ．ファセオリコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｖａｓｔａｎｏｉ ｐｖ．Ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ）ｅｆｅタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＰＢ ４４７２７．１、配列番号８）をコードするポリヌクレオチドは、ｐＥＴ－３０ａ（＋）ベクタープラスミドにクローニングすることができる。対応するヌクレオチド配列はまた、大腸菌（配列番号７）での発現に適合させ、かつ終止コドン及びＨｉｎｄＩＩＩ部位が続く、Ｃ末端の任意選択のＨｉｓタグを含むように適合させたコドンとすることができる。５プライム末端でのクローニングにＮｄｅＩ部位も使用することができ、この場合、ＮｄｅＩ部位はＡＴＧ開始コドンを含む。様々な実施形態において、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を組換えプラスミドで形質転換することができる。
【0065】
いくつかの実施形態において、ＬａｃＩ遺伝子の存在下でイソプロピルチオガラクトシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ：ＩＰＴＧ）誘導性プロモータ（ｐＴｒｃ）によってアンピシリンカセットを活性化することができ、ＬａｃＩ遺伝子は、ＬａｃＩｑプロモータ（配列番号１３）によって制御することができる。
【0066】
ある実施形態において、エチレンを形成する組換え微生物は、配列番号８と少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列を有する非天然のｅｆｅタンパク質ヌクレオチド配列を発現することによって、配列番号７と少なくとも９５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するｅｆｅタンパク質を発現する。
【0067】
当業者なら、収率を高め、プロセス内の微生物の管理を支援する（例えば、微生物を生成物流又は反応媒体から分離するのを支援する）ために、微生物を固定化することが有益であり得ることを認識している。１つ又は複数の実施形態において、微生物は、これに限定されるものではないが、高表面積支持媒体などの支持媒体に固定化される。有用な高表面積支持材料には、スポンジ、繊維状材料、バイオボール、セラミックフィルタなどが含まれてもよい。
【0068】
第１のバイオリアクタ（光合成バイオリアクタ）
再び図を参照すると、第１のバイオリアクタ２１は、単一の反応容器を含んでもよく、又は相補的に運転してもよい複数（すなわち２つ以上）の反応容器を含んでもよい。例えば、所望の光合成反応を促すために、２つ以上の反応容器を並列又は直列で運転してもよい。
再び図を参照すると、第１のバイオリアクタ２１は、単一の反応容器を含んでもよく、又は相補的に運転してもよい複数（すなわち２つ以上）の反応容器を含んでもよい。例えば、所望の光合成反応を促すために、２つ以上の反応容器を並列又は直列で運転してもよい。
【0069】
当業者なら、一般に、微生物を持続させ、所望の光合成反応を促進するために、第１のバイオリアクタ２１で維持するべき適切な条件について認識している。１つ又は複数の実施形態において、水は反応物であるだけでなく、第１のバイオリアクタ２１内の反応媒体としても働く。
【0070】
１つ又は複数の実施形態において、光合成バイオリアクタ内の反応器媒体は、温度が約２５～約７０℃、他の実施形態では約３５～約６０℃、他の実施形態では約４０～約５０℃に維持される。これら又は他の実施形態において、光合成バイオリアクタ内の反応媒体は、ｐＨが約５．０～約８．５、他の実施形態では約５．５～約８．０、他の実施形態では約６．０～約７．０に維持される。
【0071】
１つ又は複数の実施形態において、光合成バイオリアクタは、ｅｆｅ遺伝子を生成する又は生成するように適合された微生物を実質的に含まない。
【0072】
１つ又は複数の実施形態において、第１のバイオリアクタは、少なくとも反応物（例えば二酸化炭素）をバイオリアクタに導入するための少なくとも１つの入口を含む。これら又は他の実施形態において、第１のバイオリアクタは、少なくとも１つの生成物又は少なくとも１つの副生成物をバイオリアクタから取り出すための少なくとも１つの出口を含む。１つ又は複数の実施形態において、第１のバイオリアクタ２１は、ガス状生成物／副生成物のための出口、及び液体流出物のための出口を含む。１つ又は複数の実施形態において、バイオリアクタ２１は、入口及び出口を除いて閉鎖系である。他の実施形態において、バイオリアクタ２１は開放系である。１つ又は複数の実施形態において、第１のバイオリアクタは、連続撹拌槽反応器、ガスリフト反応器、ループ反応器、及び流動床反応器から選択される。１つ又は複数の実施形態において、第１のバイオリアクタは、容量が１０，０００ガロンを超え、他の実施形態では１００，０００ガロンを超え、他の実施形態では１，０００，０００ガロン超える。
【0073】
第２のバイオリアクタ（エチレン生成バイオリアクタ）
再び図を参照すると、第２のバイオリアクタ４１は、単一の反応容器を含んでもよく、又は相補的に運転してもよい複数（すなわち２つ以上）の反応容器を含んでもよい。例えば、中間体をエチレンに変換する所望の反応を促すために、２つ以上の反応容器を並列又は直列で運転してもよい。
再び図を参照すると、第２のバイオリアクタ４１は、単一の反応容器を含んでもよく、又は相補的に運転してもよい複数（すなわち２つ以上）の反応容器を含んでもよい。例えば、中間体をエチレンに変換する所望の反応を促すために、２つ以上の反応容器を並列又は直列で運転してもよい。
【0074】
当業者なら、一般に、微生物を持続させ、所望のエチレン形成反応を促進するために、第２のバイオリアクタで維持するべき適切な条件について認識している。１つ又は複数の実施形態において、水は、第２の反応器における反応媒体として働く。
【0075】
１つ又は複数の実施形態において、エチレン形成バイオリアクタ内の反応器媒体は、温度が約２５～約７０℃、他の実施形態では約３５～約６０℃、他の実施形態では約４０～約５０℃に維持される。これら又は他の実施形態において、エチレン形成バイオリアクタ内の反応媒体は、ｐＨが約６．０～約９．５、他の実施形態では約６．５～約９．０、他の実施形態では約７．０～約８．０に維持される。
【0076】
１つ又は複数の実施形態において、エチレン形成バイオリアクタは、酸素を生成するか又は酸素を生成するように適合された微生物を実質的に含まない。例えば、第２のバイオリアクタは、光合成微生物（例えば、カルビン回路によって機能する微生物）を含まないか、又は実質的に含まない。
【0077】
１つ又は複数の実施形態において、エチレン形成バイオリアクタは、嫌気性条件下で維持される。１つ又は複数の実施形態において、エチレン形成バイオリアクタは、光エネルギーが実質的に存在しない状態に維持される。
【0078】
１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタは、有機中間生成物流をバイオリアクタに導入するための少なくとも１つの入口を含む。これら又は他の実施形態において、第２のバイオリアクタは、第２のバイオリアクタから生成物及び少なくとも１つの副生成物（例えば二酸化炭素）を取り出すための少なくとも１つの出口（例えば、エチレンガスのためのガス出口）を含む。１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタはまた、液体流出物（例えば、水及び未反応の有機中間体）を取り出すための流出物出口を含む。１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタは、連続撹拌槽反応器、ループ反応器、及び流動床反応器から選択される。１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタは、容量が１０，０００ガロンを超え、他の実施形態では１００，０００ガロンを超え、他の実施形態では１，０００，０００ガロンを超える。１つ又は複数の実施形態において、第２のバイオリアクタは、反応物の入口、及び生成物又は副生成物の出口を除いて、閉鎖系を提供するように適合される。
【0079】
１つ又は複数の実施形態において、第２の反応器内の微生物の濃度は、反応器の単位体積あたりの乾燥細胞重量に基づいて定量化されてもよい。例えば、１つ又は複数の実施形態において、第２の反応器における微生物の濃度は、１リットルあたり１０グラムを超える、他の実施形態では５０グラムを超える、他の実施形態では１００グラムを超える乾燥細胞重量である。
【0080】
組換え微生物を形成するための技術
ある実施形態において、中間体形成酵素又はｅｆｅを発現させるためのヌクレオチド配列が、微生物発現ベクターに挿入される。様々な実施形態において、微生物発現ベクターは、細菌ベクタープラスミド、相同組換えシステムのヌクレオチドガイド、抗生物質耐性システム、タンパク質の精製及び検出のための補助システム、ＣＲＩＳＰＲ ＣＡＳシステム、ファージ・ディスプレイ・システム、又はそれらの組合せを含んでもよい。
ある実施形態において、中間体形成酵素又はｅｆｅを発現させるためのヌクレオチド配列が、微生物発現ベクターに挿入される。様々な実施形態において、微生物発現ベクターは、細菌ベクタープラスミド、相同組換えシステムのヌクレオチドガイド、抗生物質耐性システム、タンパク質の精製及び検出のための補助システム、ＣＲＩＳＰＲ ＣＡＳシステム、ファージ・ディスプレイ・システム、又はそれらの組合せを含んでもよい。
【0081】
上で述べたように、１つ又は複数の実施形態において、複数のコピーのｅｆｅ発現ヌクレオチド配列が、エチレン形成微生物に挿入されてもよい。同様に、複数のコピーの中間体酵素発現ヌクレオチド配列が、光合成微生物に挿入されてもよい。ベクター及び／又は宿主ゲノムに挿入された遺伝子のコピーの数は、本明細書では「コピー数」と呼ばれる。ある実施形態において、ｅｆｅ発現ヌクレオチド配列は、微生物発現ベクターにおけるコピー数が１を超え、他の実施形態では１０を超え、他の実施形態では１００を超え、また他の実施形態では２５０を超える。明らかなように、複数のコピーのｅｆｅ発現ヌクレオチド配列の発現によってエチレン収率を増加させることができるため、商業規模でのエチレン生成の体積及びコストを低減することができる。
【0082】
ある実施形態において、微生物発現ベクターは、少なくとも１つの微生物発現プロモータを含む。当業者によって理解されるように、微生物発現プロモータは、通常は隣接する後のＤＮＡ配列の転写を開始するヌクレオチド配列であり、恒常的又は誘導的であってもよい。ある実施形態において、少なくとも１つの微生物発現プロモータは、限定されずに、光感受性プロモータ、化学感受性プロモータ、温度感受性プロモータ、Ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ＣｓｐＡプロモータ、ラムダＰＬプロモータ、ラムダＣＬプロモータ、連続生成プロモータ、ｐｓｂＡプロモータ、又はそれらの組合せを含んでもよい。ある実施形態において、少なくとも１つのプロモータ誘導因子をバイオリアクタ又はバイオリアクタ内の反応媒体に加えて、有機中間体の量及び／又は生成されるエチレンの量を制御してもよい。ある実施形態において、プロモータ誘導因子は、ラクトース、キシロース、ＩＰＴＧ、低温ショック、熱ショック、又はそれらの組合せを含む。
【0083】
１つ又は複数の実施形態において、ＩＣＤ遺伝子及びＧＤＨ遺伝子は、ｐＳｙｎ６プラスミド構築物（ｐＳｙｎ６＿ＩＣＤ及びｐＳｙｎ６＿ＧＤＨ）にクローニングされたｇＢｌｏｃｋｓ（商標）遺伝子断片を使用して合成されてもよい。ｐＳｙｎ６プラスミドへのクローニングのために、Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＩＣＤコード配列は、Ｎ末端ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位及びＣ末端ＢａｍＨＩ認識部位（配列番号４）に隣接している。プラスミド構築物を使用して、ＩＣＤ遺伝子及びＧＤＨ遺伝子を未改変のＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ又はＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓΔｇｌｇｃ変異株にクローニングすることができる（実施例２を参照されたい）。１～３個のコピーの標的遺伝子を形質転換してもよい。ＩＣＤ遺伝子及びＧＣＨ遺伝子のクローニングは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）及び配列決定法によって確認することができる。ａＫＧの合成及び定量化は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、ウエスタンブロット及びエチレン生成アッセイによって評価することができる。
【0084】
１つ又は複数の実施形態において、シアノバクテリアのグリコーゲン変異株を作製することにより、その細菌の経路を変化させて、ａＫＧなどのケト酸をより高い濃度で生成させ、また分泌もさせる。グリコーゲン変異シアノバクテリアは、ｇｌｇｃ遺伝子（Δｇｌｇｃ）の変異を介してグリコーゲン欠損株を作製することによって作り出すことができる。例えば、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）遺伝子を、ｇＢｌｏｃｋｓ（商標）を使用して合成し、プラスミド構築物に組み込むことができる。そのプラスミド構築物を、野生型シアノバクテリア（例えば、シネコシスティス、シネココッカス・エロンガトゥス２９７３、シネココッカス・エロンガトゥス２４３４）に形質転換することができる。次いで、野生型ｇｌｇｃ遺伝子の一部をＡｍｐＲ遺伝子で置き換えて、変異株を作製することができる。Δｇｌｇｃ変異株は、ＡｍｐＲ含有培地中で増殖させた後に、ＰＣＲ及び配列決定法によって確認することができる。
【0085】
揮発ガスのレベルの維持
１つ又は複数の実施形態において、第２の反応器は、安全なレベルの酸素ガスを含む。特に、第２の反応器のヘッドスペース及び第２の反応器のガス状出口流は、エチレンに対して安全なレベルの酸素ガスを含む。当業者が認識しているように、エチレン流内の酸素ガスの商業的に許容可能なレベルは、存在するエチレンのレベルを考慮に入れた爆発下限（ｌｏｗｅｒ ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ ｌｉｍｉｔ：ＬＥＬ）によって規定することができる。１つ又は複数の実施形態において、第２の反応器内（すなわち、反応器のヘッドスペース内又はガス状出口流中）の酸素の量は、許容可能なＬＥＬ未満であり、他の実施形態では、許容可能なＬＥＬの８０％未満であり、他の実施形態では、許容可能なＬＥＬの５０％未満である。
１つ又は複数の実施形態において、第２の反応器は、安全なレベルの酸素ガスを含む。特に、第２の反応器のヘッドスペース及び第２の反応器のガス状出口流は、エチレンに対して安全なレベルの酸素ガスを含む。当業者が認識しているように、エチレン流内の酸素ガスの商業的に許容可能なレベルは、存在するエチレンのレベルを考慮に入れた爆発下限（ｌｏｗｅｒ ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ ｌｉｍｉｔ：ＬＥＬ）によって規定することができる。１つ又は複数の実施形態において、第２の反応器内（すなわち、反応器のヘッドスペース内又はガス状出口流中）の酸素の量は、許容可能なＬＥＬ未満であり、他の実施形態では、許容可能なＬＥＬの８０％未満であり、他の実施形態では、許容可能なＬＥＬの５０％未満である。
【0086】
プロセス特性
本明細書に記載されるように、本発明の方法は、生合成プロセスを用いることによって、エチレン及び酸素の同時生成に関連する安全性の懸念に対処しながら、高い炭素効率で二酸化炭素をエチレンに変換するのに有効である。
本明細書に記載されるように、本発明の方法は、生合成プロセスを用いることによって、エチレン及び酸素の同時生成に関連する安全性の懸念に対処しながら、高い炭素効率で二酸化炭素をエチレンに変換するのに有効である。
【0087】
１つ又は複数の実施形態において、本発明の方法により、生成率が１００μｍｏｌ／ｇＣＤＷ／時を超えて、他の実施形態では５００μｍｏｌ／ｇＣＤＷ／時を超えて、他の実施形態では１０００μｍｏｌ／ｇＣＤＷ／時を超えて、他の実施形態では１５００μｍｏｌ／ｇＣＤＷ／時を超えて、他の実施形態では２０００μｍｏｌ／ｇＣＤＷ／時を超えて、また他の実施形態では２５００μｍｏｌ／ｇＣＤＷ／時を超えてエチレンが生成される。ここで、ＣＤＷは細胞乾燥重量（ｃｅｌｌ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ）を指す。
【0088】
本発明の範囲及び趣旨から逸脱しない様々な修正及び変更が、当業者には明らかになるであろう。本発明は、本明細書で述べた例証的な実施形態に正式に限定されるものではない。
【0089】
配列表
配列番号１－
配列番号２－
配列番号３－
配列番号４－
配列番号５－
配列番号６－
配列番号７－
配列番号８－
配列番号９－
配列番号１０－
配列番号１１－
配列番号１２－
配列番号１３－
配列番号１－
【数1】
【数2】
【数3】
【数4】
【数5】
【数6】
【数7】
【数8】
【数9】
【数10】
【数11】
【数12】
【数13】
【配列表フリーテキスト】
【0090】
以下の情報は数字識別子＜２２３＞の下でのフリーテキストを含んでいる配列のために提供される。
【表1】
【国際調査報告】