特表 2023-518415 組換えＡＡＶにおいてＣＡＰおよびＲＥＰ配列の逆パッケージングを低減するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-01

(54)【発明の名称】組換えＡＡＶにおいてＣＡＰおよびＲＥＰ配列の逆パッケージングを低減するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20230424BHJP

   C12N 15/35 20060101ALI20230424BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230424BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230424BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 38/36 20060101ALN20230424BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N15/35 ZNA

C12N5/10

C12N15/12

A61K48/00

A61K35/76

A61P7/04

A61K38/36

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022556039

(86)(22)【出願日】2021-03-19

(85)【翻訳文提出日】2022-11-14

(86)【国際出願番号】 US2021023151

(87)【国際公開番号】W WO2021188892

(87)【国際公開日】2021-09-23

(31)【優先権主張番号】62/991,768

(32)【優先日】2020-03-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513252910

【氏名又は名称】ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】キャンプリン， ブレイディ

(72)【発明者】

【氏名】クレイグ， スチュワート

(72)【発明者】

【氏名】フラー， マシュー スコット

(72)【発明者】

【氏名】ウォズワース， サミュエル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90Y

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA01

4C084AA13

4C084BA44

4C084CA53

4C084DC16

4C084NA10

4C084NA13

4C084ZA53

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA10

4C087NA13

4C087ZA53

(57)【要約】

本開示は、組換え核酸構築物、ベクター、および宿主細胞を含む組成物、ならびに組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の生成においてｃａｐおよび／またはｒｅｐ ＤＮＡ配列の逆パッケージングを低減するためのそれらの使用方法を提供する。本発明の組成物または方法から生成されるｒＡＡＶおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む医薬組成物がまた、提供される。これらの医薬組成物は、被験体における疾患、状態、または障害の防止または処置のための遺伝子治療において有用であり得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含む組換え核酸構築物であって、
ここで前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されており、
ここで前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂである、
組換え核酸構築物。

【請求項2】

前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７、またはその操作されたバリアントのキャプシドタンパク質をコードする、請求項１に記載の組換え核酸構築物。

【請求項3】

前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、ＡＡＶ８の血清型のキャプシドタンパク質をコードする、請求項１に記載の組換え核酸構築物。

【請求項4】

前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、ＡＡＶ９の血清型のキャプシドタンパク質をコードする、請求項１に記載の組換え核酸構築物。

【請求項5】

前記組換え核酸構築物は、プロモーター、ＡＡＶイントロン、および選択マーカーのコード配列から選択される１個またはこれより多くの核酸配列をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項6】

単一の切り取り可能な異種イントロン配列は、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域に挿入される、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項7】

少なくとも２個の切り取り可能な異種イントロン配列は、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域に挿入される、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項8】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、少なくとも１個のスプライスドナーおよび少なくとも１個のスプライスアクセプター部位を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項9】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１．５ｋｂである、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項10】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも２．０ｋｂである、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項11】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも２．５ｋｂである、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項12】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも３．０ｋｂである、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項13】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも３．５ｋｂである、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項14】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも４．０ｋｂである、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項15】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、１．０ｋｂ～５．０ｋｂである、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項16】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、２．０ｋｂ～３．５ｋｂである、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項17】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、約２．０ｋｂである、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項18】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、約２．５ｋｂである、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項19】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、約３．０ｋｂである、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項20】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、約３．５ｋｂである、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項21】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、真核生物翻訳開始因子２、サブユニット１（ＥＩＦ２Ｓ１）；Ｉ型コラーゲンα２鎖（ＣＯＬ１Ａ２）；酸性かつシステインが豊富な分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）；転写のシグナル伝達因子および活性化因子３（ＳＴＡＴ３）；エノラーゼ１（ＥＮＯ１）；ピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ）；アルドラーゼ、フルクトース－ビスホスフェートＡ（ＡＬＤＯＡ）；Ｙボックス結合タンパク質１（ＹＢＸ１）；グアニンヌクレオチド結合タンパク質｛Ｇプロテイン｝、βポリペプチド２様１（ＧＮＢ２Ｌ１）；リボソームタンパク質Ｓ３（ＲＰＳ３）；ＧＮＡＳ複合体遺伝子座（ＧＮＡＳ）；フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）；トランスフェリンレセプター（ＴＦＲＣ）；細胞質性ポリＡ結合タンパク質１（ＰＡＢＰＣ１）；ユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）；カルネキシン（ＣＡＮＸ）；および乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）から選択されるタンパク質をコードする遺伝子に由来するイントロン配列である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項22】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、配列番号５、１～４、または６～３１のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項23】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、配列番号５、１～４、または６～３１から選択される配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項24】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、配列番号５、１～４、または６～３１から選択される配列からなる、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項25】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、ＣＡＧ／Ｇ（配列番号３２）のエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列を有するｃａｐ ＶＰ３の位置において挿入される、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項26】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、ＣＡＧ／ＣＴＧ（配列番号３３）のエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列を有するｃａｐ ＶＰ３の位置において挿入される、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項27】

前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、ＣＡＧ／ＧＴＧ（配列番号３４）のエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列を有するｃａｐ ＶＰ３の位置において挿入される、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【請求項28】

請求項１～２７のいずれかに記載の組換え核酸構築物を含むベクター。

【請求項29】

前記ベクターは、プラスミドである、請求項２８に記載のベクター。

【請求項30】

請求項１～２７のいずれかに記載の組換え核酸構築物を含む宿主細胞。

【請求項31】

前記組換え核酸構築物は、ベクターに存在する、請求項３０に記載の宿主細胞。

【請求項32】

前記ベクターは、プラスミドである、請求項３１に記載の宿主細胞。

【請求項33】

前記宿主細胞は、１個またはこれより多くのアデノウイルスヘルパー遺伝子を含むプラスミドをさらに含む、請求項３０～３２のいずれかに記載の宿主細胞。

【請求項34】

前記宿主細胞は、５’－逆方向末端反復（５’－ＩＴＲ）配列、プロモーター、導入遺伝子コード配列、および３’－逆方向末端反復（３’－ＩＴＲ）配列を含むプラスミドをさらに含む、請求項３０～３３のいずれかに記載の宿主細胞。

【請求項35】

前記宿主細胞は、
ａ． １個またはこれより多くのアデノウイルスヘルパー遺伝子を含むプラスミド；ならびに
ｂ． ５’－逆方向末端反復（５’－ＩＴＲ）配列、プロモーター、導入遺伝子コード配列、および３’－逆方向末端反復（３’－ＩＴＲ）配列を含むプラスミド、
をさらに含む、請求項３０～３２のいずれかに記載の宿主細胞。

【請求項36】

前記導入遺伝子コード配列は、天然のコード配列である、請求項３４～３５のいずれかに記載の宿主細胞。

【請求項37】

前記導入遺伝子コード配列は、コドン最適化されたコード配列である、請求項３４～３５のいずれかに記載の宿主細胞。

【請求項38】

前記導入遺伝子は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、グルコース ６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＡＴＰ７Ｂ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、アルギニノスクシネートシンセターゼ、サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットα（ＰＣＣＡ）、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットβ（ＰＣＣＢ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、α－１－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）、ミオチュブラリン１、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、筋強直性ジストロフィー－プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、線維芽細胞成長因子－４（ＦＧＦ－４）、ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）、カルバモイルシンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノスクシネートリアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ、フマリルアセテートヒドロラーゼ、α－１アンチトリプシン、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、ミニジストロフィン、およびマイクロジストロフィンから選択される、請求項３４～３５のいずれかに記載の宿主細胞。

【請求項39】

前記宿主細胞は、Ｈｅｋ２９３、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＡＲＰＥ－１９、またはＭＲＣ－５細胞から選択される、請求項３０～３８のいずれかに記載の宿主細胞。

【請求項40】

前記宿主細胞は、Ｈｅｋ２９３細胞である、請求項３０～３８のいずれかに記載の宿主細胞。

【請求項41】

組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の調製物を生成するための方法であって、前記方法は、請求項３０～４０のいずれかに記載の宿主細胞を、ｒＡＡＶの生成を促進する適切な条件下で培養するステップを包含する方法。

【請求項42】

前記ｒＡＡＶの調製物は、改変されていないＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して生成されるｒＡＡＶの相当する調製物と比較して、低減されたレベルのｃａｐ ＤＮＡを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記ｒＡＡＶの調製物は、改変されていないＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して生成されるｒＡＡＶの相当する調製物と比較して、低減されたレベルのｒｅｐ ＤＮＡを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項44】

前記ｒＡＡＶの調製物は、改変されていないＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して生成されるｒＡＡＶの相当する調製物と比較して、低減されたレベルのｒｅｐ ＤＮＡおよびｃａｐ ＤＮＡを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項45】

請求項４１～４４のいずれかに記載の方法によって生成されるｒＡＡＶ。

【請求項46】

請求項４５に記載のｒＡＡＶおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物。

【請求項47】

ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含む組換え核酸構築物であって、
ここで前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質をコードし、前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの異種配列の挿入を介して改変されている、および
ここで前記１個またはこれより多くの異種配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂである、および
ここで前記１個またはこれより多くの異種配列は、位置Ｃ－１において挿入された配列番号１４、位置Ｃ－１において挿入された配列番号２、位置Ａ－１１において挿入された配列番号２、位置Ｃ－１において挿入された配列番号５、位置Ａ－１１において挿入された配列番号５、位置Ｃ－１において挿入された配列番号２０、位置Ａ－１１において挿入された配列番号２０、位置Ｃ－１において挿入された配列番号９、位置Ａ－１１において挿入された配列番号９、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、
組換え核酸構築物。

【請求項48】

前記１個またはこれより多くの異種配列は、切り取り可能なイントロン配列である、請求項４７に記載の組換え核酸構築物。

【請求項49】

改変前の前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、配列番号３８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４７または４８に記載の組換え核酸構築物。

【請求項50】

改変前の前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、配列番号３８のヌクレオチド配列を含む、請求項４９に記載の組換え核酸構築物。

【請求項51】

ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含む組換え核酸構築物であって、
ここで前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ９のキャプシドタンパク質をコードし、前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの異種配列の挿入を介して改変されている、
ここで前記１個またはこれより多くの異種配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂである、および
ここで前記１個またはこれより多くの異種配列は、位置Ａ－４において挿入された配列番号１４、位置Ａ－４において挿入された配列番号２、位置Ａ－５において挿入された配列番号２、位置Ａ－４において挿入された配列番号５、Ａ－５において挿入された配列番号５、Ａ－４において挿入された配列番号２０、Ａ－５において挿入された配列番号２０、Ａ－４において挿入された配列番号９、Ａ－５において挿入された配列番号９、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、
組換え核酸構築物。

【請求項52】

前記１個またはこれより多くの異種配列は、切り取り可能なイントロン配列である、請求項５１に記載の組換え核酸構築物。

【請求項53】

改変前の前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、配列番号４２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５１または５２に記載の組換え核酸構築物。

【請求項54】

改変前の前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、配列番号４２のヌクレオチド配列を含む、請求項５３に記載の組換え核酸構築物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１９日出願の米国仮特許出願第６２／９９１，７６８号（その内容全体は、全ての目的のためにそれらの全体において本明細書に参考として援用される）の利益および優先権を主張する。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式において電子提出され、その全体において参考として援用される配列表を含む。上記ＡＳＣＩＩコピー（作成日：２０２１年３月１５日）は、名称ＵＬＰ－００８ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、大きさが約１５６キロバイトである。

【0003】

発明の技術分野
本開示は一般に、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を生成するための組成物および方法に関する。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非病原性の複製欠損性パルボウイルスである。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、遺伝子治療のための送達ベクターとしてそれらを魅力的にしている多くの特有の特徴を有する。特に、ｒＡＡＶベクターは、治療用遺伝子を分裂中のおよび分裂していない細胞に送達することができ、これらの遺伝子は、標的化された細胞のゲノムへの組み込みなしに、長期間にわたって持続し得る。ｒＡＡＶの普及した治療適用を考慮すれば、ｒＡＡＶベクター生成の改善された方法のニーズが継続してある。

【0005】

ｒＡＡＶ製造業者が直面している現在の問題は、宿主細胞およびプラスミドＤＮＡが、ｒＡＡＶのパッケージベクターゲノム（packaged vector genome）へと偶発的に組み込まれてしまう現象である。異常にパッケージされた宿主細胞ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡは、それぞれ、「共パッケージ（ｃｏ－ｐａｃｋａｇｅｄ）」ＤＮＡおよび「逆パッケージ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐａｃｋａｇｅｄ）」ＤＮＡといわれる。ｒＡＡＶ調製物中のこれらの不純物の存在は、免疫系によって認識され得る抗原の持続性の供給源を提供し得、形質導入された細胞の不要なクリアランスをもたらす。従って、異常にパッケージされたＤＮＡの組み込みを減少させることは、ＡＡＶベースの治療用生成物を製造するにあたって未だに優先すべきことである。
ｒｅｐおよびｃａｐプラスミドＤＮＡの逆パッケージングを低減しようとする以前の試みは、当該分野で記載されている。例えば、Ｃａｏおよび同僚らは、イントロンがｒｅｐ遺伝子において挿入された、イントロンが改変されたＡｄヘルパープラスミドの作製を記載する。Ｃａｏら， ２０００， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４（２４）： １１４５６－６３を参照のこと。しかし、このストラテジーは、ゲノム力価を有意に低減させることが見出され、望ましくない複製能のあるＡＡＶの生成を排除するにあたっては有効でなかった。さらに、Ｃａｏらは、全てのパッケージ粒子のうちの比較的高い割合（約０．０２％）が、少なくともいくらかのｒｅｐ ＤＮＡ配列をなお含んでいることを観察した。その一方で、Ｈａｌｂｅｒｔらは、ｃａｐ遺伝子における大きなイントロン（「カプトロン（ｃａｐｔｒｏｎ）」といわれる）を導入することによって、ｃａｐ ＤＮＡの逆パッケージングを成功裡に減少させた。これは、カプトロンプラスミドで作製されたベクターに曝された細胞においてＣａｐ発現を低減することが見出された。Ｈａｌｂｅｒｔら， ２０１１， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８（４）： ４１１－７および米国特許第１０，４１５，０５６号を参照のこと。しかし、このアプローチは、逆パッケージｒｅｐ ＤＮＡを低減することに対して何の効果もないことが示され、堅牢な商業的適用に関する適用可能性を制限した。なぜなら、それは、ＲｅｐおよびＣａｐが異なるプラスミドから発現される４個のプラスミド（四重）トランスフェクションに依拠し、それによって、ＲｅｐおよびＣａｐが単一のプラスミドから発現される旧来の３個のプラスミド（三重）トランスフェクションと比較して、ＧＭＰプラスミドコストを有意に増加させるからである。さらに、Ｈａｌｂｅｒｔらによって記載されるカプトロンストラテジーは、天然のＲｅｐおよびＣａｐスプライス部位を有する本質的に感受性の領域を標的とし、これは、通常のＲｅｐおよびＣａｐスプライシングならびに所望のタンパク質のアイソフォームの生成を妨害する可能性がある。
前述のストラテジーの制限を考慮すれば、ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡの異常なパッケージングを低減し得、ＤＮＡ不純物が減少したｒＡＡＶ調製物の堅牢な生成を可能にする変化のないＲｅｐおよびＣａｐタンパク質発現をなお更に容易にする改善されたアプローチが、必要とされる。本発明は、逆パッケージｒｅｐ配列および逆パッケージｃａｐ配列の両方のレベルを低減し得る改善された核酸構築物（例えば、Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現プラスミド）の開発を介して、このニーズに対処する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許第１０，４１５，０５６号明細書

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｃａｏら， ２０００， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４（２４）： １１４５６－６３

【非特許文献2】Ｈａｌｂｅｒｔら， ２０１１， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８（４）： ４１１－７

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

発明の要旨
本発明は、とりわけ、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の生成においてｃａｐおよび／またはｒｅｐ ＤＮＡ配列の逆パッケージングを低減するための組成物およびそれらの使用方法を提供する。

【0009】

１つの局面において、本開示は、ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含む組換え核酸構築物であって、ここで上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されており、ここで上記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂである、組換え核酸構築物を提供する。

【0010】

別の局面において、本開示は、組換え核酸構築物を含むベクターであって、ここで上記組換え核酸構築物は、ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含み、ここで上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されており、ここで上記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂである、ベクターを提供する。例示的な実施形態において、上記ベクターは、プラスミドである。

【0011】

さらに別の局面において、本開示は、組換え核酸構築物を含む宿主細胞であって、ここで上記組換え核酸構築物は、ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含み、ここで上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されており、ここで上記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂである宿主細胞を提供する。例示的な実施形態において、上記宿主細胞における組換え核酸構築物は、ベクター、例えば、プラスミドに存在する。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、１個またはこれより多くのアデノウイルスヘルパー遺伝子（例えば、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡなど）を含むプラスミド（「Ａｄヘルパー」プラスミド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、５’－逆方向末端反復（５’－ＩＴＲ）配列、プロモーター、導入遺伝子コード配列、および３’－逆方向末端反復（３’－ＩＴＲ）配列を含むプラスミド（「Ｃｉｓ」プラスミド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、（ａ）ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含む組換え核酸構築物を含むプラスミドであって、ここで上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されているプラスミド；（ｂ）Ａｄヘルパープラスミド、ならびに（ｃ）Ｃｉｓプラスミドを含む。ある特定の実施形態において、上記宿主細胞は、Ｈｅｋ２９３、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＡＲＰＥ－１９、またはＭＲＣ－５細胞から選択される。例示的な実施形態において、上記宿主細胞は、Ｈｅｋ２９３細胞である。

【0012】

さらに別の局面において、本開示は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の調製物を生成する方法であって、上記方法は、宿主細胞を、ｒＡＡＶの生成を促進する適切な条件下で培養するステップであって、ここで上記宿主細胞は、ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含む組換え核酸構築物を含み、ここで上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されており、ここで上記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂであるステップを包含する方法を提供する。例示的な実施形態において、上記宿主細胞は、ＡｄヘルパープラスミドおよびＣｉｓプラスミドをさらに含む。例示的な実施形態において、上記宿主細胞は、Ｈｅｋ２９３細胞である。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶの調製物は、改変されていないＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して生成されるｒＡＡＶの相当する調製物と比較して、低減されたレベルのｃａｐ ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶの調製物は、改変されていないＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して生成されるｒＡＡＶの相当する調製物と比較して、低減されたレベルのｒｅｐ ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶの調製物は、改変されていないＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して生成されるｒＡＡＶの相当する調製物と比較して、低減されたレベルのｒｅｐ ＤＮＡおよびｃａｐ ＤＮＡを含む。

【0013】

いくつかの実施形態において、本明細書で記載される組成物または方法を使用して生成されるｒＡＡＶは、タンパク質導入遺伝子のコード配列を含むパッケージベクターゲノムを含む。１つの実施形態において、上記コード配列は、天然のコード配列である。別の実施形態において、上記コード配列は、コドン最適化されたコード配列である。いくつかの実施形態において、コード配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、グルコース ６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＡＴＰ７Ｂ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、アルギニノスクシネートシンセターゼ、サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットα（ＰＣＣＡ）、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットβ（ＰＣＣＢ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、α－１－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）、ミオチュブラリン１、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、筋強直性ジストロフィー－プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、線維芽細胞成長因子－４（ＦＧＦ－４）、ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）、カルバモイルシンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノスクシネートリアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ、フマリルアセテートヒドロラーゼ、α－１アンチトリプシン、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、およびジストロフィン遺伝子産物（例えば、ミニジストロフィンまたはマイクロジストロフィン）から選択されるタンパク質導入遺伝子を発現する。

【0014】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型８、９、１、２、３、４、５、６、７、１０、１１、１２、ｒｈ１０、ｈｕ３７のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７）に由来するキャプシド、またはその操作されたバリアントをコードする。例示的な実施形態において、上記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）キャプシド、ＡＡＶ８バリアントキャプシド、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）キャプシド、ＡＡＶ９バリアントキャプシド、またはＡＡＶ血清型ｈｕ３７（ＡＡＶｈｕ３７）キャプシドである。

【0015】

いくつかの実施形態において、上記組換え核酸構築物は、プロモーター、ＡＡＶイントロン、および選択マーカーのコード配列から選択される１個またはこれより多くの核酸配列をさらに含む。

【0016】

いくつかの実施形態において、単一の切り取り可能な異種イントロン配列は、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域へと挿入される。いくつかの実施形態において、少なくとも２個の（例えば、２個、３個、４個、またはこれより多くの）切り取り可能な異種イントロン配列が、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域へと挿入される。

【0017】

いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロン配列は、少なくとも１個のスプライスドナーおよび少なくとも１個のスプライスアクセプター部位を含む。

【0018】

本明細書で記載される種々の局面において、上記切り取り可能な異種イントロン配列は、少なくとも１ｋｂの長さを有する。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロン配列は、少なくとも１．５ｋｂの長さを有する。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロン配列は、少なくとも１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２．０ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３．０ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、または少なくとも４．０ｋｂの長さを有する。

【0019】

いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、１．０ｋｂ～５．０ｋｂの長さを有する。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、１．５ｋｂ～４．５ｋｂの長さを有する。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、１．８ｋｂ～４．０ｋｂの長さを有する。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、２．０ｋｂ～３．５ｋｂの長さを有する。

【0020】

いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、約１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２．０ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３．０ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、または約４．５ｋｂの長さを有する。

【0021】

いくつかの実施形態において、上記１個またはこれより多くの（例えば、１個、２個、３個、４個、またはこれより多くの）切り取り可能な異種イントロンの全ての合わせたサイズは、約１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２．０ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３．０ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、または約４．５ｋｂである。

【0022】

いくつかの実施形態において、本発明における使用のための上記切り取り可能な異種イントロンは、真核生物翻訳開始因子２、サブユニット１（ＥＩＦ２Ｓ１）；Ｉ型コラーゲンα２鎖（ＣＯＬ１Ａ２）；酸性かつシステインが豊富な分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ）（ＳＰＡＲＣ）；転写のシグナル伝達因子および活性化因子３（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３）（ＳＴＡＴ３）；エノラーゼ１（ＥＮＯ１）；ピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ）；アルドラーゼ、フルクトース－ビスホスフェートＡ（ＡＬＤＯＡ）；Ｙボックス結合タンパク質１（ＹＢＸ１）；グアニンヌクレオチド結合タンパク質｛Ｇプロテイン｝、βポリペプチド２様１（ＧＮＢ２Ｌ１）；リボソームタンパク質Ｓ３（ＲＰＳ３）；ＧＮＡＳ複合体遺伝子座（ＧＮＡＳ）；フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）、トランスフェリンレセプター（ＴＦＲＣ）；細胞質性ポリＡ結合タンパク質１（ＰＡＢＰＣ１）；ユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）；カルネキシン（ＣＡＮＸ）；および乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）から選択されるタンパク質をコードする遺伝子に由来するイントロン配列である。

【0023】

いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0024】

いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、ＣＡＧ／Ｇ（配列番号３２）のエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列を有するｃａｐ ＶＰ３の位置において挿入される。

【0025】

いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、ＣＡＧ／ＣＴＧ（配列番号３３）のエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列を有するｃａｐ ＶＰ３の位置において挿入される。

【0026】

いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、ＣＡＧ／ＧＴＧ（配列番号３４）のエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列を有するｃａｐ ＶＰ３の位置において挿入される。

【0027】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含む組換え核酸構築物であって、ここで上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質をコードし、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの異種配列の挿入を介して改変されている、およびここで上記１個またはこれより多くの異種配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂである、およびここで上記１個またはこれより多くの異種配列は、位置Ｃ－１において挿入された配列番号１４、位置Ｃ－１において挿入された配列番号２、位置Ａ－１１において挿入された配列番号２、位置Ｃ－１において挿入された配列番号５、位置Ａ－１１において挿入された配列番号５、位置Ｃ－１において挿入された配列番号２０、位置Ａ－１１において挿入された配列番号２０、位置Ｃ－１において挿入された配列番号９、位置Ａ－１１において挿入された配列番号９、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、組換え核酸構築物が提供される。いくつかの実施形態において、上記１個またはこれより多くの異種配列は、切り取り可能なイントロン配列である。

【0028】

いくつかの実施形態において、改変前の上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、配列番号３８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、改変前の上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、配列番号３８のヌクレオチド配列を含む。

【0029】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含む組換え核酸構築物であって、ここで上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ９のキャプシドタンパク質をコードし、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの異種配列の挿入を介して改変されている、ここで上記１個またはこれより多くの異種配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂである、およびここで上記１個またはこれより多くの異種配列は、位置Ａ－４において挿入された配列番号１４、位置Ａ－４において挿入された配列番号２、位置Ａ－５において挿入された配列番号２、位置Ａ－４において挿入された配列番号５、Ａ－５において挿入された配列番号５、Ａ－４において挿入された配列番号２０、Ａ－５において挿入された配列番号２０、Ａ－４において挿入された配列番号９、Ａ－５において挿入された配列番号９、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、組換え核酸構築物が提供される。いくつかの実施形態において、上記１個またはこれより多くの異種配列は、切り取り可能なイントロン配列である。

【0030】

いくつかの実施形態において、改変前の上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、配列番号４２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、改変前の上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、配列番号４２のヌクレオチド配列を含む。

【0031】

本開示のこれらおよび他の局面ならびに特徴は、本出願の以下の節において記載される。

【0032】

本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】図１は、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列（配列番号３８）の図示である。下線を付したヌクレオチドは、ＶＰ３コード配列を表す。ＣＡＧ／Ｇ（配列番号３２）（太字）の１４個のエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列は、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列に存在する；これらの１４個（５’から３’へＡ－１～Ａ－１４と称される）のうち、１０個は、ＶＰ３コード配列中に位置する。ＣＡＧ／ＣＴＧ（配列番号３３）の２個のエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列（太字、斜体、およびボックスで囲まれる）は、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列中に存在する；これらの２個（５’から３’にＢ－１～Ｂ－２と称される）のうち、１個は、ＶＰ３コード配列中に位置する。ＣＡＧ／ＧＴＧ（配列番号３４）の１個のエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列（Ｃ－１と称される）は、ＶＰ３コード配列中に位置する（太字、斜体、およびボックスで囲まれ、影が付けられる）。最後３個のヌクレオチド（ＴＡＡ）は、Ｃａｐコード配列終止コドンに相当する。

【0034】

【図2】図２は、ＡＡＶ８ Ｃａｐ ＶＰ３コード配列（配列番号４３）の一部、ならびにＡ－５、Ａ－６、Ｃ－１、Ｂ－２、およびＡ－７と称される挿入位置におけるエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列を示す図示である。図２はまた、ＡＡＶ８ Ｃａｐ ＶＰ３コード配列に相当する翻訳されたアミノ酸配列（配列番号４４）を示す。

【0035】

【図3】図３は、ＡＡＶ８ Ｃａｐ ＶＰ３コード領域、ならびにＡ－５、Ａ－６、Ｃ－１、Ｂ－２、Ａ－７、Ａ－８、Ａ－９、Ａ－１０、Ａ－１１、Ａ－１２、Ａ－１３、およびＡ－１４挿入部位に相当するエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列の位置を示す図示である。

【0036】

【図4】図４は、標準的なＴｒａｎｓプラスミド（陽性対照、ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．）で、Ａｄヘルパープラスミドなしの標準的なＴｒａｎｓプラスミド（Ａｄヘルパーなしの陽性対照、ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．ｎｏ Ａｄ）で、標準的なＴｒａｎｓプラスミドなし（陰性対照、ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）で、またはＡＡＶ８ Ｃａｐ ＶＰ３コード配列中の異種イントロンの挿入を介して改変されたｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミド（ＡＬＤＯＡ－Ｃ１、ＣＯＬ１Ａ２－Ｃ１、ＣＯＬ１Ａ２－Ａ１１、ＳＰＡＲＣ－Ｃ１、ＳＰＡＲＣ－Ａ１１、ＧＮＡＳ２－Ｃ１、ＧＮＡＳ－Ａ１１、ＥＮＯ１－Ｃ１、またはＥＮＯ１－Ａ１１）で作製されたｒＡＡＶ８－ｈＦＩＸ生成物におけるｑＰＣＲによって測定された場合のＡＡＶ８ ｃａｐ ＤＮＡのレベルを示す棒フラフである。ＡＡＶ８ ｃａｐ ＤＮＡにおける２倍～８倍の低減は、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドで作製された９個のｒＡＡＶ８－ｈＦＩＸ生成物のうちの大部分にわたって観察された。

【0037】

【図5】図５は、標準的なＴｒａｎｓプラスミド（陽性対照、ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．）、Ａｄヘルパープラスミドなしの標準的なＴｒａｎｓプラスミド（Ａｄヘルパーなしの陽性対照、ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．ｎｏ Ａｄ）で、標準的なＴｒａｎｓプラスミドなし（陰性対照、ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）で、またはＡＡＶ８ Ｃａｐ ＶＰ３コード配列中の異種イントロンの挿入を介して改変されたｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミド（ＡＬＤＯＡ－Ｃ１、ＣＯＬ１Ａ２－Ｃ１、ＣＯＬ１Ａ２－Ａ１１、ＳＰＡＲＣ－Ｃ１、ＳＰＡＲＣ－Ａ１１、ＧＮＡＳ２－Ｃ１、ＧＮＡＳ－Ａ１１、ＥＮＯ１－Ｃ１、またはＥＮＯ１－Ａ１１）のいずれかで作製したｒＡＡＶ８－ｈＦＩＸ生成物におけるｑＰＣＲによって測定された場合のＡＡＶ８ ｒｅｐ ＤＮＡのレベルを示す棒グラフである。ＡＡＶ８ ｒｅｐ ＤＮＡにおける２倍～８．５倍の低減が、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドで作製された９個のｒＡＡＶ８－ｈＦＩＸ生成物のうちの大部分にわたって観察された。

【0038】

【図6】図６は、標準的なＴｒａｎｓプラスミド（陽性対照、ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．）で、Ａｄヘルパープラスミドなしの標準的なＴｒａｎｓプラスミド（Ａｄヘルパーなしの陽性対照、ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．ｎｏ Ａｄ）で、標準的なＴｒａｎｓプラスミドなし（陰性対照、ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）で、またはＡＡＶ８ Ｃａｐ ＶＰ３コード配列における異種イントロンの挿入を介して改変されたｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミド（ＡＬＤＯＡ－Ｃ１、ＣＯＬ１Ａ２－Ｃ１、ＣＯＬ１Ａ２－Ａ１１、ＳＰＡＲＣ－Ｃ１、ＳＰＡＲＣ－Ａ１１、ＧＮＡＳ２－Ｃ１、ＧＮＡＳ－ Ａ１１、ＥＮＯ１－Ｃ１、またはＥＮＯ１－Ａ１１）で作製されたｒＡＡＶ８－ｈＦＩＸ生成物におけるｑＰＣＲによって測定される場合のパッケージゲノム力価のレベルを示す棒グラフである。パッケージｈＦＩＸベクターゲノムＤＮＡの１．５倍～５倍の増加が、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドで作製された９個のｒＡＡＶ８－ｈＦＩＸ生成物のうちの大部分にわたって観察された。

【0039】

【図7】図７は、標準的なＴｒａｎｓプラスミド（陽性対照、ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．）、Ａｄヘルパープラスミドなしの標準的なＴｒａｎｓプラスミド（Ａｄヘルパーなしの陽性対照、ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．ｎｏ Ａｄ）、標準的なＴｒａｎｓプラスミドなし（陰性対照、ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）で、またはＡＡＶ８ Ｃａｐ ＶＰ３コード配列における異種イントロンの挿入を介して改変されたｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミド（ＡＬＤＯＡ－Ｃ１、ＣＯＬ１Ａ２－Ｃ１、ＣＯＬ１Ａ２－Ａ１１、ＳＰＡＲＣ－Ｃ１、ＳＰＡＲＣ－Ａ１１、ＧＮＡＳ２－Ｃ１、ＧＮＡＳ－ Ａ１１、ＥＮＯ１－Ｃ１、またはＥＮＯ１－Ａ１１）のいずれかで作製されたｒＡＡＶ８－ｈＦＩＸ生成物におけるＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の細胞内ＡＡＶ８キャプシドタンパク質発現の比を試験するウェスタンブロットを示す。そのブロットは、ＡＡＶ８ ＶＰ３ ＯＲＦへの異種イントロンの挿入が、ＡＡＶ８ Ｃａｐタンパク質の発現レベルまたはアイソフォームのスプライシングを有意に変化させないことを示す。

【0040】

【図8】図８は、標準的なＴｒａｎｓプラスミド（対照）で作製したか、またはＡＡＶ８ Ｃａｐ ＶＰ３コード配列における異種イントロンの挿入を介して改変されたｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミド（ＳＰＡＲＣ－Ａ１１またはＧＮＡＳ２－Ｃ１）で作製したかのいずれかの、３種の導入遺伝子 － ｈＦＩＸ、ｅＧＦＰ、またはｍＣｈｅｒｒｙ －のうちの１個を発現するｒＡＡＶ８生成物におけるｑＰＣＲによって測定された場合のＡＡＶ８ ｃａｐ ＤＮＡのレベルを示す棒グラフである。ＡＡＶ８ ｃａｐ ＤＮＡにおける低減は、標準的なＴｒａｎｓプラスミドで作製した相当するｒＡＡＶ８生成物と比較して、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドで作製した全６個のｒＡＡＶ８生成物にわたって観察された。

【0041】

【図9】図９は、標準的なＴｒａｎｓプラスミド（対照）で作製したか、またはＡＡＶ８ Ｃａｐ ＶＰ３コード配列における異種イントロンの挿入を介して改変されたｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミド（ＳＰＡＲＣ－Ａ１１またはＧＮＡＳ２－Ｃ１）で作製したかのいずれかの、３種の導入遺伝子 － ｈＦＩＸ、ｅＧＦＰ、またはｍＣｈｅｒｒｙ － のうちの１個を発現するｒＡＡＶ８生成物におけるｑＰＣＲによって測定された場合のＡＡＶ８ ｒｅｐ ＤＮＡのレベルを示す棒グラフである。ＡＡＶ８ ｒｅｐ ＤＮＡにおける低減は、標準的なＴｒａｎｓプラスミドで作製された相当するｒＡＡＶ８生成物と比較して、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドで作製された全６個のｒＡＡＶ８生成物にわたって観察された。

【0042】

【図10】図１０は、標準的なＴｒａｎｓプラスミド（対照）で作製されたかまたはＡＡＶ８ Ｃａｐ ＶＰ３コード配列における異種イントロンの挿入を介して改変されたｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミド（ＳＰＡＲＣ－Ａ１１またはＧＮＡＳ２－Ｃ１）で作製されたかのいずれかの、３種の導入遺伝子 － ｈＦＩＸ、ｅＧＦＰ、またはｍＣｈｅｒｒｙ － のうちの１つを発現するｒＡＡＶ８生成物におけるｑＰＣＲによって測定される場合のパッケージゲノム力価のレベルを示す棒グラフである。パッケージベクターゲノムＤＮＡの増加は、標準的なＴｒａｎｓプラスミドで作製された相当するｒＡＡＶ８生成物と比較して、ＧＮＡＳイントロンの挿入を含むｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドで作製されたｒＡＡＶ８生成物において観察された。

【0043】

【図11】図１１は、標準的なＴｒａｎｓプラスミド（陽性対照、ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．）で、標準的なＴｒａｎｓプラスミドなし（陰性対照、ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）で、またはＡＡＶ９ Ｃａｐ ＶＰ３コード配列における異種イントロンの挿入を介して改変されたｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミド（ＡＬＤＯＡ－Ａ４、ＣＯＬ１Ａ２－Ａ４、ＣＯＬ１Ａ２－Ａ５、ＳＰＡＲＣ－Ａ４、ＳＰＡＲＣ－Ａ５、ＧＮＡＳ２－Ａ４、ＧＮＡＳ－Ａ５、ＥＮＯ１－Ａ４、またはＥＮＯ１－Ａ５）でのいずれかで作製されたｒＡＡＶ９－ｈＦＩＸ生成物におけるｑＰＣＲによって測定された場合のＡＡＶ９ ｃａｐ ＤＮＡのレベルを示す棒グラフである。ＡＡＶ９ ｃａｐ ＤＮＡの低減は、標準的なＴｒａｎｓプラスミドで作製されたｒＡＡＶ９－ｈＦＩＸ生成物と比較して、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドで作製された全ｒＡＡＶ９－ｈＦＩＸ生成物で観察された。

【0044】

【図12】図１２は、標準的なＴｒａｎｓプラスミド（陽性対照、ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．）で、標準的なＴｒａｎｓプラスミドなし（陰性対照、ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）で、またはＡＡＶ９ Ｃａｐ ＶＰ３コード配列における異種イントロンの挿入を介して改変されたｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミド（ＡＬＤＯＡ－Ａ４、ＣＯＬ１Ａ２－Ａ４、ＣＯＬ１Ａ２－Ａ５、ＳＰＡＲＣ－Ａ４、ＳＰＡＲＣ－Ａ５、ＧＮＡＳ２－Ａ４、ＧＮＡＳ－Ａ５、ＥＮＯ１－Ａ４、またはＥＮＯ１－Ａ５）でのいずれかで作製されたｒＡＡＶ９－ｈＦＩＸ生成物におけるｑＰＣＲによって測定された場合のＡＡＶ９ ｒｅｐ ＤＮＡのレベルを示す棒グラフである。ＡＡＶ９ ｒｅｐ ＤＮＡの低減は、標準的なＴｒａｎｓプラスミドで作製されたｒＡＡＶ９－ｈＦＩＸ生成物と比較して、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドで作製された全ｒＡＡＶ９－ｈＦＩＸ生成物において観察された。

【0045】

【図13】図１３は、標準的なＴｒａｎｓプラスミド（陽性対照、ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．）で、標準的なＴｒａｎｓプラスミドなし（陰性対照、ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）で、またはＡＡＶ９ Ｃａｐ ＶＰ３コード配列における異種イントロンの挿入を介して改変されたｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミド（ＡＬＤＯＡ－Ａ４、ＣＯＬ１Ａ２－Ａ４、ＣＯＬ１Ａ２－Ａ５、ＳＰＡＲＣ－Ａ４、ＳＰＡＲＣ－Ａ５、ＧＮＡＳ２－Ａ４、ＧＮＡＳ－Ａ５、ＥＮＯ１－Ａ４、またはＥＮＯ１－Ａ５）でのいずれかで作製されたｒＡＡＶ９－ｈＦＩＸ生成物におけるｑＰＣＲによって測定された場合のパッケージゲノム力価のレベルを示す棒グラフである。パッケージｈＦＩＸベクターゲノムＤＮＡの増加は、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドで作製された全９個のｒＡＡＶ９－ｈＦＩＸ生成物にわたって観察された。

【発明を実施するための形態】

【0046】

発明の詳細な説明
背景の節において考察されたストラテジーの限界を考慮すれば、ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡの異常なパッケージングを低減し得るが、さらに変化のないＲｅｐおよびＣａｐタンパク質発現を促進し、ＤＮＡ不純物が減少したｒＡＡＶ調製物の堅牢な生成を可能にする改善されたアプローチが必要とされる。本発明は、逆パッケージｒｅｐおよび逆パッケージｃａｐ配列の両方のレベルを低減し得る改善された核酸構築物（例えば、Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現プラスミド）の開発を介して、このニーズに対処する。そして驚くべきことに、逆パッケージｒｅｐおよびｃａｐ配列の有意な低減に付随して、本発明者らは、これらの改善された核酸構築物をｒＡＡＶの生成のための方法において利用する場合に、パッケージベクターゲノムの５倍までのより高いレベルを観察した。

【0047】

本発明は、とりわけ、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の生成においてｃａｐおよび／またはｒｅｐ ＤＮＡ配列の逆パッケージングを低減するための組成物およびそれらの使用方法を提供する。

【0048】

別段注記されなければ、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学において共通する用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ、発行 Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９４（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 発行 Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， １９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ（編）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， 発行 ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， １９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）において見出され得る。

【0049】

本開示の種々の実施形態の検討を促進するために、具体的な用語の以下の説明が提供される：

【0050】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）： ヒトおよびいくらかの他の霊長類の種に感染する、小さな複製欠損性の、エンベロープのないウイルス。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂中の細胞および休止細胞の両方に感染し得、宿主細胞のゲノムへと組み込まれることなく、染色体外状態で持続し得る。これらの特徴は、ＡＡＶを遺伝子治療のための魅力的なウイルスベクターにしている。現在では、１２の認識されているＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～１２）が存在する。

【0051】

投与／投与する： 被験体に任意の効果的な経路によって薬剤（例えば、治療剤（例えば、組換えＡＡＶ））を提供するまたは与えること。例示的な投与経路としては、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、髄腔内、脳室内または静脈内での投与）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻内、膣および吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。

【0052】

コード配列： 「コード配列」とは、適切な調節配列に作動可能に連結される場合に、インビトロまたはインビボでポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を意味する。

【0053】

コドン最適化した： 「コドン最適化した」核酸とは、そのコドンが、特定のシステム（例えば、特定の種または種の群）における発現のために最適であるように変化させた核酸配列に言及する。例えば、核酸配列は、哺乳動物細胞または特定の哺乳動物種（例えば、ヒト細胞）における発現のために最適化され得る。コドン最適化は、そのコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない。

【0054】

切り取り可能な（ｅｘｃｉｓａｂｌｅ）： イントロンを参照して、用語「切り取り可能な」とは、メッセンジャーＲＮＡの翻訳前に除去され得るイントロンに言及する。

【0055】

異種： 用語「異種」とは、比較されている実体に対して外来である、すなわち、遺伝子型として異なる遺伝子、核酸、イントロンなどに言及する。本発明の文脈において、異種イントロンとは、挿入されている実体（例えば、ＡＡＶまたはＡＡＶのエレメント）からは外来である、すなわち、遺伝子型として異なるイントロンに言及する。さらに明確にするために、用語「異種」とは、種々の分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどに言及して使用される場合、天然において所定の実体（例えば、ＡＡＶ）によって通常もしくは天然に見出されないおよび／または生成されない分子に言及する。

【0056】

イントロン： タンパク質のコード情報を含まない遺伝子内のＤＮＡの伸長部。イントロンは、メッセンジャーＲＮＡの翻訳前に除去される。

【0057】

逆位末端反復配列（ＩＴＲ）： 効率的な複製のために必要とされるアデノ随伴ウイルスのゲノムにおける対称的な核酸配列。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ＤＮＡゲノムの各末端に位置する。ＩＴＲは、ウイルスＤＮＡ合成の複製起点として働き、ＡＡＶ組み込みベクターを生成するために必須のＣｉｓ構成要素である。

【0058】

単離された： 「単離された」生物学的構成要素（例えば、核酸分子、タンパク質、ウイルスまたは細胞）は、その構成要素が天然に存在する生物の細胞もしくは組織、または生物自体における他の生物学的構成要素（例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞）から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製法によって精製されたものを含む。上記用語はまた、宿主細胞において組換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク、ならびに化学合成された核酸分子およびタンパク質を含む。

【0059】

作動可能に連結された： 第１の核酸配列は、この第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的な関係性に配置されている場合に、この第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、このプロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合に、そのコード配列に作動可能に連結されている。概して、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、同じリーディングフレームにある。

【0060】

薬学的に受容可能なキャリア： 本開示において有用な薬学的に受容可能なキャリア（ビヒクル）は、従来どおりである。Ｅ． Ｗ． ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， 第１５版（１９７５））は、１またはこれより多くの治療用化合物、分子または薬剤の薬学的送達に適した組成物および製剤を記載する。

【0061】

概して、上記キャリアの性質は、使用されている特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、薬学的におよび生理学的に受容可能な流体（例えば、水、生理食塩水、平衡化塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなど）をビヒクルとして含む注射用流体を含む。固形の組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤の形態）に関しては、従来の非毒性固体キャリアは、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与されるべき医薬組成物は、微量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝化剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート））を含み得る。

【0062】

疾患を防止する、処置する、または改善する： 疾患を「防止する」とは、疾患の完全な発生を阻害することをいう。「処置する」とは、疾患または病的状態が発生し始めた後の疾患または病的状態の徴候または症状を改善する、治療的介入をいう。「改善する」とは、疾患の徴候または症状の数または重篤度の低減をいう。

【0063】

プロモーター： 核酸（例えば、遺伝子）の転写を指示する／開始するＤＮＡの領域。プロモーターは、転写開始部位の近くに必要な核酸配列を含む。多くのプロモーター配列は、当業者に公知であり、さらには、人工核酸分子中に異なるプロモーター配列の組み合わせが可能である。

【0064】

精製された： 用語「精製された」は、絶対的な純度を要求しない；むしろ、それは相対的な用語として意図される。従って、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物は、天然に関連付けられたタンパク質および他の夾雑物から完全にまたは部分的に単離されているものである。ある特定の実施形態において、用語「実質的に精製された」とは、細胞、細胞培養培地、または他の粗製調製物から単離され、その最初の調製物の種々の構成要素（例えば、タンパク質、細胞デブリ、および他の構成要素）を除去するために分画に供された、ペプチド、タンパク質、ウイルスまたは他の活性化合物に言及する。

【0065】

組換え： 組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有するか、または２つの別の方法で分離された配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製される配列を有するものである。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、または核酸分子の単離されたセグメントの人工的な操作によって（例えば、遺伝子工学技術によって）達成され得る。

【0066】

同様に、組換えウイルスは、天然に存在しない配列（例えば、ゲノム配列）または異なる由来の少なくとも２つの配列の人工的組み合わせによって作製される配列を含むウイルスである。用語「組換え」はまた、天然の核酸分子、タンパク質またはウイルスの一部の付加、置換、または欠失によってのみ変更された核酸、タンパク質およびウイルスを含む。本明細書で使用される場合、「組換えＡＡＶ」（「ｒＡＡＶ」）とは、組換え核酸分子（例えば、タンパク質導入遺伝子をコードする組換え核酸分子）がパッケージされたＡＡＶ粒子をいう。

【0067】

配列同一性： ２もしくはこれより多くの核酸配列、または２もしくはこれより多くのアミノ酸配列の間の同一性または類似性は、その配列間の同一性または類似性に関して表される。配列同一性は、パーセンテージ同一性に関して測定され得る；パーセンテージが高いほど、配列はより同一である。配列類似性は、パーセンテージ類似性に関して測定され得る（保存的アミノ酸置換が考慮される）；パーセンテージが高いほど、配列はより類似である。核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的方法を使用して整列される場合、比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。この相同性は、そのオルソログのタンパク質またはｃＤＮＡが、関係性がより遠い種（例えば、ヒト配列およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列）と比較して、関係性がより近い種（例えば、ヒト配列およびマウス配列）に由来する場合により顕著である。

【0068】

比較のための配列のアラインメント法は、当該分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、以下に記載される： Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２， １９８１； Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３， １９７０： Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４， １９８８； Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， Ｇｅｎｅ， ７３：２３７－４４， １９８８； Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ５：１５１－３， １９８９； Ｃｏｒｐｅｔら， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０８８１－９０， １９８８； Ｈｕａｎｇら Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ． ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８， １５５－６５， １９９２：およびＰｅａｒｓｏｎら， Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｒｉｏ． ２４：３０７－３１， １９９４。Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０， １９９０は、配列アラインメント法および相同性計算の詳細な考慮事項を示す。

【0069】

ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０， １９９０）は、配列分析プログラム、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘとともに使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を含むいくつかの情報源から、およびインターネット上で入手可能である。さらなる情報は、ＮＣＢＩウェブサイトで見出され得る。

【0070】

選択マーカー： 「選択マーカー」とは、成功裡に形質転換されたレシピエント宿主細胞（例えば、細菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞など）の選択を可能にする組換え核酸構築物に含まれ得る。レシピエント宿主細胞において発現され得る選択マーカーとしては、レシピエント宿主細胞を、薬物（例えば、アクチノマイシンＣ_１、アクチノマイシンＤ、アンホテリシン、アンピシリン、ブレオマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ジェネティシン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシンＢ、カナマイシン、メトトレキサート、マイトマイシン、ネオマイシン、ノボビオシン、ペニシリン、ピューロマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、およびエリスロマイシン）に対して耐性にする遺伝子が挙げられ得るが、これらに限定されない。選択マーカーはまた、生合成遺伝子（例えば、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシン生合成経路におけるもの）を含み得る。レシピエント宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換の際に、上記細胞は、適切な選択マーカーと接触するようになる。選択マーカーはまた、視覚的なマーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光マーカーまたは化学発光マーカー）を含み得る。

【0071】

血清型： 抗原の特徴的なセットによって区別される、関連性が近い微生物（例えば、ウイルス）の群。

【0072】

Ｓｔｕｆｆｅｒ配列： ２つの核酸特徴の間に（例えば、プロモーターとコード配列との間に）所望の間隔を作り出すために、または核酸分子が所望の長さのものであるように、核酸分子を伸長させるために代表的には使用されるより大きな核酸分子（例えば、ベクター）内部に含まれるヌクレオチドの配列をいう。Ｓｔｕｆｆｅｒ配列は、タンパク質コード情報を含まず、未知／合成由来／および／またはより大きな核酸分子の内部の他の核酸配列に関連しないものであり得る。

【0073】

被験体： 生きている多細胞の脊椎のある生物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリー）。いくつかの実施形態において、上記被験体は、ヒトである。１つの実施形態において、上記ヒト被験体は、成人被験体、すなわち、１８歳齢を超えているヒト被験体である。１つの実施形態において、上記ヒト被験体は、小児被験体、すなわち、０～１８歳齢（両端を含む）のヒト被験体である。

【0074】

合成の： 実験室において人工的手段によって生成される。例えば、合成核酸は、実験室において化学合成され得る。

【0075】

非翻訳領域（ＵＴＲ）： 代表的なｍＲＮＡは、上記コード配列の上流および下流に、それぞれ、５’非翻訳領域（５’ ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ ＵＴＲ）を含む（Ｍｉｇｎｏｎｅ Ｆ．ら， （２００２） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ３：ＲＥＶＩＥＷＳ０００４を参照のこと）。

【0076】

治療上有効な量： 薬剤で処置される被験体において、または細胞において、所望の効果を達成するために十分な、特定の医薬または治療剤（例えば、組換えＡＡＶ）の量。上記薬剤の有効量は、処置されている被験体または細胞、および治療用組成物の投与様式が挙げられるが、これらに限定されないいくつかの要因に依存する。

【0077】

ベクター： ベクターは、ベクターが宿主細胞において複製するおよび／または組み込まれる能力を破壊することなく、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列（例えば、複製起点）を含み得る。ベクターはまた、１またはこれより多くの選択マーカー遺伝子および他の遺伝的エレメントを含み得る。発現ベクターは、挿入された遺伝子の転写および翻訳を可能にするために必要な調節配列を含むベクターである。本明細書中のいくつかの実施形態において、上記ベクターは、ＡＡＶベクターである。

【0078】

別段説明されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「その、この、上記（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明確に示さなければ、複数形への言及を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに関して与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値が、近似値であり、説明のために提供されることは、さらに理解されるべきである。本明細書で記載されるものに類似または等価な方法および材料が本開示の実施または試験において使用され得るものの、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体において参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（用語の説明を含む）が優先する、さらに、上記材料、方法および例は、例証に過ぎず、限定ではないことが意図される。

【0079】

本発明は、とりわけ、種々の組成物、例えば、組換え核酸構築物、ベクター、および宿主細胞、ならびに組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の生成におけるそれらの使用方法を提供する。本明細書で記載される組成物および方法を使用して生成されるｒＡＡＶは、種々の治療的および診断的適用において有用であり得る。

【0080】

組換え核酸構築物
本明細書で提供される例に記載されるように、本発明者らは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の生成においてｃａｐおよび／またはｒｅｐ ＤＮＡ配列の逆パッケージングを低減し得る新規な組換え核酸構築物を作り出した。これらの組換え核酸構築物の使用は、純度が増加したｒＡＡＶ粒子の生成を可能にし、これは、次に、被験体における形質導入後の免疫抑制レジメンのレベルを低減し得るかまたはその必要性を排除し得、形質導入された細胞におけるより長い導入遺伝子発現を可能にし得る。逆パッケージｒｅｐおよびｃａｐ配列の有意な低減に付随して、本発明者らは、これらの新規な核酸構築物の利用が、驚くべきことに、ｒＡＡＶの生成のための方法において使用される場合、ゲノム力価を５倍まで増加させ得ることを観察した。従って、有意な治療的および製造上の利益が、本明細書に記載される組換え核酸構築物から得られ得る。

【0081】

上記のことによれば、第１の局面において、本開示は、ＡＡＶ複製（「Ｒｅｐ」）コード配列およびＡＡＶキャプシド（「Ｃａｐ」）コード配列を含む組換え核酸構築物であって、ここで上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されており、ここで上記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂである組換え核酸構築物を提供する。

【0082】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、天然に存在するＡＡＶ Ｃａｐタンパク質（天然に存在するｃａｐ遺伝子から発現される）をコードする。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、天然に存在するＡＡＶキャプシドタンパク質の遺伝子操作されたバリアント（バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を発現するように操作されたｃａｐ遺伝子から発現される）をコードする。

【0083】

本明細書で記載される種々の実施形態において、本発明の組換え核酸構築物から発現されるＡＡＶキャプシドタンパク質は、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、ｈｕ３７のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７）、ならびにヒトおよび非ヒト霊長類組織から単離された１００を超える天然のバリアントのうちのいずれか１つに由来し得る。例えば、Ｃｈｏｉら， ２００５， Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： ２９９－３１０， ２００５およびＧａｏら， ２００５， Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： ２８５－２９７を参照のこと。

【0084】

前述のキャプシドの他に、１またはこれより多くの有益な治療特性（例えば、選択された組織に対する改善された標的化、免疫応答を逃れる能力の増大、中和抗体の刺激の低減など）を有するように操作されている非天然のバリアントＡＡＶキャプシドを発現し得る組換え核酸構築物が、本発明の範囲内に含まれる。このような操作されたバリアントキャプシドの非限定的な例は、米国特許第９，５０６，０８３号、同第９，５８５，９７１号、同第９，５８７，２８２号、同第９，６１１，３０２号、同第９，７２５，４８５号、同第９，８５６，５３９号、同第９，９０９，１４２号、同第９，９２０，０９７号、同第１０，０１１，６４０号、同第１０，０８１，６５９号、同第１０，１７９，１７６号、同第１０，２０２，６５７号、同第１０，２１４，５６６号、同第１０，２１４，７８５号、同第１０，２６６，８４５号、同第１０，２９４，２８１号、同第１０，３０１，６４８号、同第１０，３８５，３２０号、および同第１０，３９２，６３２号に、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１７／１６５８５９、ＷＯ／２０１８／０２２９０５、ＷＯ／２０１８／１５６６５４、ＷＯ／２０１８／２２２５０３、およびＷＯ／２０１８／２２６６０２（これらの開示は、本明細書に参考として援用される）に記載される。

【0085】

ある特定の例示的実施形態において、本発明の組換え核酸構築物から発現される上記ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質である。

【0086】

上記ＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、米国特許第７，２８２，１９９号、同第７，７９０，４４９号、同第８，３１８，４８０号、同第８，９６２，３３０号、同第８，９６２，３３２号、同第９，４９３，７８８号、同第９，５８７，２５０号、および同第１０，２６６，８４６号に記載される。上記ＡＡＶ８キャプシドは、以下の３種のＡＡＶ８ ＶＰタンパク質：
・ ＶＰ１（例えば、配列番号３５のアミノ酸配列を有するタンパク質（７３８アミノ酸））、
・ ＶＰ２（例えば、ＶＰ１のＡＡｓ １３８～７３８に相当する、配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質（６０１アミノ酸））、および
・ ＶＰ３（例えば、ＶＰ１のＡＡｓ ２０４～７３８に相当する、配列番号３７のアミノ酸配列を有するタンパク質（５３５アミノ酸））、
から構成される自己集合したＡＡＶキャプシドである。

【0087】

ＡＡＶに関して、全３種のキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）が、１個のｍＲＮＡから翻訳される。ＶＰ３は、主要キャプシドタンパク質であり、６０個のキャプシドモノマーのうちのおよそ５０個を占める一方で、キャプシドあたりＶＰ１およびＶＰ２の各々およそ５コピーが存在する（および従って、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３に関しては、１：１：１０の比）。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ８キャプシド」とは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドをいう。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのＡＡＶ８キャプシドは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ８キャプシドは、配列番号３８のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのＡＡＶ８キャプシドは、１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変された配列によってコードされ、改変前の配列は、配列番号３８のヌクレオチド配列である。

【0088】

ある特定の例示的実施形態において、本発明の組換え核酸構築物から発現されるＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質である。

【0089】

上記ＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、米国特許第７，９０６，１１１号および同第１０，２６５，４１７号に記載される。上記ＡＡＶ９キャプシドは、以下の３種のＡＡＶ９ ＶＰタンパク質：
・ ＶＰ１（例えば、配列番号３９のアミノ酸配列を有するタンパク質（７３６アミノ酸））、
・ ＶＰ２（例えば、ＶＰ１のＡＡｓ １３８～７３６に相当する、配列番号４０のアミノ酸配列を有するタンパク質（５９９アミノ酸））、および
・ ＶＰ３（例えば、ＶＰ１のＡＡｓ ２０３～７３６に相当する、配列番号４１のアミノ酸配列を有するタンパク質（５３４アミノ酸））、
から構成される自己集合したＡＡＶキャプシドである。

【0090】

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９キャプシド」とは、配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するＡＡＶキャプシドをいう。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのＡＡＶ９キャプシドは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのＡＡＶ９キャプシドは、配列番号４２のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのＡＡＶ９キャプシドは、１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変された配列によってコードされ、上記改変前の配列は、配列番号４２のヌクレオチド配列である。

【0091】

本明細書で示されるように、本発明に従う組換え核酸構築物は、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ８キャプシドまたはＡＡＶ９キャプシドをコードし得る。しかし、他の実施形態において、別のＡＡＶキャプシドが選択される。組織特異性は、キャプシドタイプによって決定される。適切な標的（例えば、肝臓、筋、肺、またはＣＮＳ）を形質導入するＡＡＶ血清型は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒｌ、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｈｕ３７を含むＡＡＶウイルスベクターのキャプシドの供給源として選択され得る。さらに、未だ発見されていないＡＡＶ、またはそれに基づく組換えＡＡＶが、ＡＡＶキャプシドの供給源として使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される組換え核酸構築物による発現のためのＡＡＶキャプシドは、前述のＡＡＶキャプシドまたはそのコード核酸のうちの一方の変異誘発によって（すなわち、挿入、欠失、または置換によって）生成され得る。

【0092】

本発明のこの第１の局面によれば、１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域に挿入される。例えば、ＡＡＶ８の文脈において、１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列、例えば、配列番号３８の（任意の挿入（複数可）前の）ヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するＣａｐコード配列、または配列番号３８の（任意の挿入（複数可）前の）ヌクレオチド配列を有するＣａｐコード配列に挿入され得る。例証目的で、ＡＡＶ８の文脈において、１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、配列番号３８のＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列のヌクレオチド６１０～２２１４にわたる領域に挿入され得る。

【0093】

別の例として、ＡＡＶ９の文脈において、１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、ＡＡＶ９ Ｃａｐコード配列、例えば、配列番号４２の（任意の挿入（複数可）前の）ヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するＣａｐコード配列、または配列番号４２の（任意の挿入（複数可）前の）ヌクレオチド配列を有するＣａｐコード配列に挿入され得る。さらなる例証のために、ＡＡＶ９の文脈において、１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、配列番号４２のＡＡＶ９ Ｃａｐコード配列のヌクレオチド６０７～２２０８にわたる領域に挿入され得る。

【0094】

本発明は、代表的なＡＡＶ８およびＡＡＶ９のＣａｐコード配列に関連して記載されるが、本開示を授けられた当業者は、本明細書で開示される教示を任意のＡＡＶキャプシドに容易に適用し得る。

【0095】

いくつかの実施形態において、上記組換え核酸構築物は、１個またはこれより多くのプロモーターをさらに含み得る。１つの実施形態において、上記プロモーターは、異種プロモーター、例えば、ＬａｃＺプロモーターである。１つの実施形態において、上記プロモーターは、ＡＡＶプロモーター、例えば、Ｐ５、Ｐ１９、および／またはＰ４０プロモーターである。いくつかの実施形態において、上記組換え核酸構築物は、少なくとも１個の異種プロモーターおよび少なくともＡＡＶプロモーターを含み得る。

【0096】

いくつかの実施形態において、上記組換え核酸構築物は、１個またはこれより多くのＡＡＶイントロン（すなわち、非異種の天然のＡＡＶイントロン）をさらに含み得る。

【0097】

いくつかの実施形態において、上記組換え核酸構築物は、選択マーカーのコード配列をさらに含み得る。１つの実施形態において、上記選択マーカーは、薬物耐性を付与するタンパク質、例えば、カナマイシン耐性のためのタンパク質（例えば、ＫａｎＲ）、アンピシリン耐性のためのタンパク質（例えば、ＡｍｐＲ）、またはピューロマイシン耐性のためのタンパク質（例えば、Ｐａｃ）である。別の実施形態において、上記選択マーカーは、生合成経路タンパク質（例えば、ヒスチジン、トリプトファン、またはロイシン生合成経路において見出されるタンパク質）である。別の実施形態において、上記選択マーカーは、視覚的マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光マーカー）である。例示的な実施形態において、上記組換え核酸構築物は、ＫａｎＲ（ｋａｎＲによってコードされる）のコード配列を含む。これは、カナマイシン耐性を形質転換されたレシピエント宿主細胞にもたらす。

【0098】

本発明のこの第１の局面によれば、いくつかの実施形態において、１個の切り取り可能な異種イントロン配列または２個以上の切り取り可能な異種イントロン配列は、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列（例えば、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列、ＡＡＶ９ Ｃａｐコード配列、または別のＡＡＶ血清型Ｃａｐコード配列）のＶＰ３領域に挿入される。いくつかの実施形態において、単一の切り取り可能な異種イントロン配列は、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列（例えば、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列、ＡＡＶ９ Ｃａｐコード配列、または別のＡＡＶ血清型Ｃａｐコード配列）のＶＰ３領域に挿入される。いくつかの実施形態において、少なくとも２個の（例えば、２個、３個、４個、またはこれより多くの）切り取り可能な異種イントロン配列は、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列（例えば、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列、ＡＡＶ９ Ｃａｐコード配列、または別のＡＡＶ血清型Ｃａｐコード配列）のＶＰ３領域に挿入される。例示的な実施形態において、単一の切り取り可能な異種イントロン配列は、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列（例えば、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列、ＡＡＶ９ Ｃａｐコード配列、または別のＡＡＶ血清型Ｃａｐコード配列）のＶＰ３領域に挿入される。

【0099】

本発明のこの第１の局面によれば、ある特定の実施形態において、上記１個の切り取り可能な異種イントロン配列の長さまたは２個以上の切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂ（すなわち、少なくとも１，０００ヌクレオチド塩基）であり、これは、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列（例えば、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列、ＡＡＶ９ Ｃａｐコード配列、または別のＡＡＶ血清型Ｃａｐコード配列）のＶＰ３領域に挿入され得る。いくつかの実施形態において、上記１個の切り取り可能な異種イントロン配列の長さまたは２個以上の切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２．０ｋｂ、２．１．ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３．０ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂ、４．９ｋｂ、または少なくとも５．０ｋｂであり、これは、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列（例えば、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列、ＡＡＶ９ Ｃａｐコード配列、または別のＡＡＶ血清型Ｃａｐコード配列）のＶＰ３領域に挿入され得る。

【0100】

いくつかの実施形態において、上記１個の切り取り可能な異種イントロン配列の長さまたは２個以上の切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、１．０ｋｂ～５．０ｋｂであり、これは、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列（例えば、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列、ＡＡＶ９ Ｃａｐコード配列、または別のＡＡＶ血清型Ｃａｐコード配列）のＶＰ３領域に挿入され得る。１つの実施形態において、上記１個の切り取り可能な異種イントロン配列の長さまたは２個以上の切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、１．５ｋｂ～４．５ｋｂであり、これは、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列（例えば、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列、ＡＡＶ９ Ｃａｐコード配列、または別のＡＡＶ血清型Ｃａｐコード配列）のＶＰ３領域に挿入され得る。１つの実施形態において、上記１個の切り取り可能な異種イントロン配列の長さまたは２個以上の切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、２．０ｋｂ～４．０ｋｂである。１つの実施形態において、上記１個の切り取り可能な異種イントロン配列の長さまたは２個以上の切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、２．５ｋｂ～３．５ｋｂであり、これは、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列（例えば、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列、ＡＡＶ９ Ｃａｐコード配列、または別のＡＡＶ血清型Ｃａｐコード配列）のＶＰ３領域に挿入され得る。

【0101】

いくつかの実施形態において、上記１個の切り取り可能な異種イントロン配列の長さまたは２個以上の切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、約１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２．０ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３．０ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、または約４．５ｋｂであり、これは、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列（例えば、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列、ＡＡＶ９ Ｃａｐコード配列、または別のＡＡＶ血清型Ｃａｐコード配列）のＶＰ３領域に挿入され得る。

【0102】

例示的な実施形態において、約１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２．０ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３．０ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、または約４．５ｋｂの長さを有する単一の切り取り可能な異種イントロン配列は、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列（例えば、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列、ＡＡＶ９ Ｃａｐコード配列、または別のＡＡＶ血清型Ｃａｐコード配列）のＶＰ３領域に挿入される。

【0103】

本発明における使用のための例示的な切り取り可能な異種イントロンは、以下の表１に示されるイントロンから選択され得る：

【表1】

【0104】

いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0105】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ１のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ１のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0106】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0107】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ３のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ３のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0108】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ４のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ４のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0109】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ５のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ５のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0110】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ６のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ６のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0111】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ７のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ７のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0112】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0113】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ９のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ９のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0114】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ１０のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ１０のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0115】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ１１のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ１１のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0116】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ１２のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ１２のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0117】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶｒｈ１０のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶｒｈ１０のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0118】

いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶｈｕ３７のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９４％、８０％～９３％、８０％～９２％、８０％～９１％、８０％～９０％、８０％～８９％、８０％～８８％、８０％～８７％、８０％～８６％、８０％～８５％、８０％～８４％、８０％～８３％、８０％～８２％、または８０％～８１％同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶｈｕ３７のキャプシドタンパク質をコードし、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、配列番号１～３１から選択される配列からなる。

【0119】

いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロン配列は、少なくとも１個のスプライスドナー部位を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロン配列は、少なくとも１個のスプライスアクセプター部位を含む。いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロン配列は、少なくとも１個のスプライスドナー部位および少なくとも１個のスプライスアクセプター部位を含む。例示的な実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロン配列は、少なくとも１個のスプライスドナー部位および少なくとも１個のスプライスアクセプター部位を天然で含む。他の実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロン配列は、少なくとも１個のスプライスドナーおよび／または少なくとも１個のスプライスアクセプター部位を含むように遺伝的に改変され得る。

【0120】

上記切り取り可能な異種イントロンは、上記Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における任意の適切な位置に置かれ得るが、ただし上記イントロンは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３のキャプシドタンパク質の適切な発現を可能にする位置においてＶＰ３領域内に置かれる。上記組換え核酸構築物は、標準的な分子生物学技術を使用して生成され得、本明細書で記載されるように、ウェスタンブロット分析を使用して、Ｃａｐタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を生成する能力に関して評価され得る。

【0121】

いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、ＣＡＧ／Ｇ（配列番号３２）のエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列を有するｃａｐ ＶＰ３の位置において挿入される。例証目的で、図１は、１４個のこのような部位が、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列に存在し、そのうちの１０個が、ＶＰ３コード配列に位置することを示す。

【0122】

いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、ＣＡＧ／ＣＴＧ（配列番号３３）のエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列を有するｃａｐ ＶＰ３の位置において挿入される。例証目的で、図１は、２個のこのような部位が、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列に存在し、そのうちの１個が、ＶＰ３コード配列に位置することを示す。

【0123】

いくつかの実施形態において、上記切り取り可能な異種イントロンは、ＣＡＧ／ＧＴＧ（配列番号３４）のエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列を有するｃａｐ ＶＰ３の位置において挿入される。例証目的で、図１は、１つのこのような部位が、ＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列に存在し、これは、ＶＰ３コード配列に位置することを示す。

【0124】

この第１の局面に従うさらなる実施形態において、上記ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列はまた、１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変され得る。よって、１つの実施形態において、本開示は、組換え核酸構築物であって、（ａ）１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されているＡＡＶ Ｒｅｐコード配列、および（ｂ）１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されているＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含み、ここで上記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、少なくとも１ｋｂの全長を有し、上記Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域に挿入される、組換え核酸構築物を提供する。

【0125】

組換え核酸構築物を含むベクター
第２の局面において、本開示は、組換え核酸構築物を含むベクターであって、ここで上記組換え核酸構築物は、ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含み、ここで上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されており、ここで上記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂであるベクターを提供する。よって、この局面において、上記組換え核酸構築物は、宿主細胞に送達され得る遺伝的エレメント、すなわち、ベクターの中に含まれる。

【0126】

この第２の局面に従ういくつかの実施形態において、上記ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、エピソーム、非ウイルス性送達ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）、およびウイルスから選択される。例示的な実施形態において、上記ベクターは、プラスミドである。他の実施形態において、上記組換え核酸構築物は、宿主細胞に裸のＤＮＡとして送達され得る。

【0127】

上記選択されたベクターは、任意の適切な方法（トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームベースの送達、および膜融合技術が挙げられる）によって、宿主細胞に送達され得る。例示的な実施形態において、上記ベクターは、トランスフェクションを介して宿主細胞に送達される。標準的なＤＮＡトランスフェクション技術は、ベクターを宿主細胞に送達するために使用され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， ２０００， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第３版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， ＮＹを参照のこと。

【0128】

いくつかの実施形態において、上記ベクター（例えば、プラスミド）は、プロモーター、ＡＡＶイントロン、および選択マーカーのコード配列から選択される１またはこれより多くの核酸配列をさらに含み得る。

【0129】

例示的な実施形態において、上記ベクター（例えば、プラスミド）は、ｒＡＡＶの生成のための三重プラスミドトランスフェクションにおいて有用性を有する「Ｔｒａｎｓ」プラスミドであり得る。本明細書で使用される場合、用語「Ｔｒａｎｓ」プラスミドとは、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を含みかつＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質が発現されるプラスミドをいう。いくつかの実施形態において、上記ベクターは、ＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変される、「ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミド」である（本明細書で使用される場合、用語「標準的なＴｒａｎｓプラスミド」とは、１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されていないＴｒａｎｓプラスミドをいう）。

【0130】

いくつかの実施形態において、上記ベクター（例えば、プラスミド）は、５’－逆方向末端反復（５’－ＩＴＲ）配列、エンハンサー配列、プロモーター配列、イントロン配列、導入遺伝子コード配列、ポリアデニル化シグナル配列、スタッファー核酸配列、および３’－逆方向末端反復（３’－ＩＴＲ）配列から選択される１個またはこれより多くの核酸配列をさらに含み得る。例示的な実施形態において、上記ベクター（例えば、プラスミド）は、少なくとも５’－逆方向末端反復（５’－ＩＴＲ）配列、プロモーター配列、導入遺伝子コード配列、および３’－逆方向末端反復（３’－ＩＴＲ）配列を含む。

【0131】

よって、いくつかの実施形態において、本開示は、（ａ）組換え核酸構築物であって、ここで上記組換え核酸構築物は、ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含み、ここで上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されており、ここで上記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂである組換え核酸構築物；（ｂ）５’－逆方向末端反復（５’－ＩＴＲ）配列；（ｃ）導入遺伝子発現を駆動し得るプロモーター配列；（ｄ）導入遺伝子コード配列；ならびに（ｅ）３’－逆方向末端反復（５’－ＩＴＲ）配列を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、上記ベクターは、エンハンサー配列、パート（ａ）のイントロン配列とは異なるイントロン配列、ポリアデニル化シグナル配列、およびスタッファー核酸配列から選択される少なくとも１個の配列エレメントをさらに含み得る。

【0132】

組換え核酸構築物を含む宿主細胞
第３の局面において、本開示は、組換え核酸構築物を含む宿主細胞であって、ここで上記組換え核酸構築物は、ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含み、ここで上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されており、ここで上記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は少なくとも１ｋｂである、宿主細胞を提供する。例示的な実施形態において、上記宿主細胞中の上記組換え核酸構築物は、ベクター（例えば、プラスミド）に存在する。

【0133】

いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、１個またはこれより多くのアデノウイルスヘルパー遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ ＲＮＡなどのようなアデノウイルスヘルパー遺伝子）を含むプラスミド（本明細書で「Ａｄヘルパー」プラスミドといわれる）をさらに含む。例示的な実施形態において、上記宿主細胞は、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡを含むプラスミドを含む。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞（例えば、Ｈｅｋ２９３宿主細胞）は、上記Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ機能を供給し得る。

【0134】

代替の実施形態において、ヘルパー機能は、ヘルペスウイルスによって供給されてもよい。これらの代替の実施形態において、上記宿主細胞は、１個またはこれより多くのヘルペスウイルス遺伝子（例えば、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ４２、およびＵＬ５２のようなヘルペスウイルス複製遺伝子）を含むプラスミド（本明細書で「ＨＳＶヘルパー」プラスミドといわれる）をさらに含み得る。

【0135】

いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、５’－逆方向末端反復（５’－ＩＴＲ）配列、プロモーター、導入遺伝子コード配列、および３’－逆方向末端反復（３’－ＩＴＲ）配列を含むプラスミド（本明細書で「Ｃｉｓ」プラスミドといわれる）をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記Ｃｉｓプラスミドは、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、およびスタッファー核酸配列から選択される１個またはこれより多くの配列エレメントをさらに含み得る。

【0136】

いくつかの実施形態において、上記Ｃｉｓプラスミドは、ＡＡＶ２に由来する５’－ＩＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｃｉｓプラスミドは、ＡＡＶ２に由来する３’－ＩＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｃｉｓプラスミドは、ＡＡＶ２に由来する５’－ＩＴＲ配列および３’－ＩＴＲ配列を含む。他の実施形態において、上記Ｃｉｓプラスミドは、非ＡＡＶ２供給源に由来する５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列を含む。

【0137】

いくつかの実施形態において、上記Ｃｉｓプラスミドは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、およびα－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーターから選択されるプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、上記Ｃｉｓプラスミドは、遺伝子特異的内因性プロモーターであるプロモーターを含む。

【0138】

少なくとも１個の導入遺伝子のためのプロモーターおよびコード配列に加えて、Ｃｉｓプラスミドは、他の適切な転写開始配列、終止配列、およびエンハンサー配列、ならびに効率的なＲＮＡプロセシングシグナルを含み得る。

【0139】

いくつかの実施形態において、上記Ｃｉｓプラスミドは、１個またはこれより多くのエンハンサー配列を含む。１つの実施形態において、上記エンハンサーは、サイトメガロウイルス最初期遺伝子（ＣＭＶ）エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサー、およびＡｐｏＥエンハンサーから選択される。

【0140】

いくつかの実施形態において、上記Ｃｉｓプラスミドは、１個またはこれより多くのイントロン配列を含む。１つの実施形態において、上記イントロンは、ＳＶ４０ Ｓｍａｌｌ Ｔイントロン、ウサギヘモグロビンサブユニットβ（ｒＨＢＢ）イントロン、ヒトβグロビンＩＶＳ２イントロン、β－グロビン／ＩｇＧキメライントロン、またはｈＦＩＸイントロンから選択される。

【0141】

いくつかの実施形態において、上記Ｃｉｓプラスミドは、ポリアデニル化シグナル配列を含む。１つの実施形態において、上記ポリアデニル化シグナル配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウサギβグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される。

【0142】

この第３の局面に従ういくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、Ｃｉｓプラスミドを含み、ここで上記Ｃｉｓプラスミドは、導入遺伝子タンパク質もしくはそのアイソフォーム、またはその機能的フラグメントもしくは機能的バリアントの部分的なまたは完全なコード配列を含む。

【0143】

１つの実施形態において、導入遺伝子タンパク質の部分的なまたは完全なコード配列は、野生型、すなわち、「天然の」コード配列である。本明細書で使用される場合、用語「野生型」とは、天然に存在する生体ポリマー（例えば、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列）と同じ生体ポリマー（例えば、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列）をいう。

【0144】

１つの実施形態において、導入遺伝子タンパク質の部分的なまたは完全なコード配列は、コドン最適化されたコード配列である。１つの実施形態において、上記部分的なまたは完全なコード配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化される。

【0145】

いくつかの実施形態において、コード配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、グルコース ６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＡＴＰ７Ｂ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、アルギニノスクシネートシンセターゼ、サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットα（ＰＣＣＡ）、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットβ（ＰＣＣＢ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、α－１－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）、ミオチュブラリン１、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、筋強直性ジストロフィー－プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、線維芽細胞成長因子－４（ＦＧＦ－４）、ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）、カルバモイルシンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノスクシネートリアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ、フマリルアセテートヒドロラーゼ、α－１アンチトリプシン、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、およびジストロフィン遺伝子産物（例えば、ミニジストロフィンまたはマイクロジストロフィン）から選択されるタンパク質導入遺伝子を発現する。

【0146】

本発明は、例えば、これらの前述のタンパク質導入遺伝子、ならびにそのフラグメント、バリアント、アイソフォーム、および融合物を送達し得るｒＡＡＶを製造するために使用され得る。

【0147】

この第３の局面によれば、組換え核酸構築物を含む宿主細胞であって、ここで上記組換え核酸構築物は、ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含み、ここで上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されており、ここで上記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は少なくとも１ｋｂである宿主細胞が、本明細書で提供される。具体的な実施形態において、上記宿主細胞は、ＡＡＶの増殖のために適切であり得る。

【0148】

非常に広い範囲の宿主細胞が使用され得る（例えば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物の細胞など）。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、ｒＡＡＶの生成に適した細胞（または細胞株）、例えば、Ｈｅｋ２９３、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＡＲＰＥ－１９、またはＭＲＣ－５細胞であり得る。

【0149】

例示的な実施形態において、上記宿主細胞は、Ｈｅｋ２９３細胞である。任意のクローン性誘導体（例えば、Ｈｅｋ２９３－Ｆ細胞、Ｈｅｋ２９３－Ｔ細胞、またはＨｅｋ－ＥＸＰＩ２９３細胞）が、Ｈｅｋ２９３細胞の意味に含められることは、当業者によって理解されかつ容易に認識される。

【0150】

別の実施形態において、上記宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞である。任意のクローン性誘導体（例えば、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（これは、無血清培地中および懸濁培養において増殖し得るＨｅＬａ細胞株のサブクローンである））が、ＨｅＬａ細胞の意味内に含められることは、当業者によって理解されかつ容易に認識される。

【0151】

上記組換え核酸構築物またはこれを含むベクターは、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して、上記宿主細胞へと送達され得る。例示的な実施形態において、上記組換え核酸構築物またはこれを含むベクターは、トランスフェクションを介して送達される。いくつかの実施形態において、そのゲノムへと挿入される上記組換え核酸構築物またはベクターを有する適切な宿主細胞株が、生成される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される組換え核酸構築物を含む安定な宿主細胞株が生成される。

【0152】

ある特定の例示的実施形態において、宿主細胞は、本発明のＴｒａｎｓプラスミドで、ＡｄヘルパープラスミドおよびＣｉｓプラスミドとともにトランスフェクトされる（例えば、ｒＡＡＶの生成に適した三重トランスフェクション）。１つの実施形態において、上記宿主細胞は、Ｈｅｋ２９３細胞である。

【0153】

組換えＡＡＶを生成するための方法
第４の局面において、本開示は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の調製物を生成する方法であって、上記方法は、宿主細胞を、ｒＡＡＶの生成を促進する適切な条件下で培養するステップであって、ここで上記宿主細胞は、ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含む組換え核酸構築物を含み、ここで上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されており、ここで上記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂであるステップを包含する方法を提供する。例示的な実施形態において、上記宿主細胞は、ＡｄヘルパープラスミドおよびＣｉｓプラスミドをさらに含む。別の例示的な実施形態において、上記宿主細胞は、Ｈｅｋ２９３細胞である。

【0154】

別の局面において、本開示は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）においてｃａｐおよび／またはｒｅｐ ＤＮＡの汚染を低減する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、（ａ）適切な宿主細胞に、本明細書で記載されるとおりの組換え核酸構築物を含むベクターを導入するステップ；（ｂ）ＡｄヘルパープラスミドおよびＣｉｓプラスミドを、上記宿主細胞において発現させるステップ；ならびに（ｃ）上記宿主細胞を培養して、ｒＡＡＶを生成するステップを包含する。

【0155】

遺伝子治療に適したｒＡＡＶを生成するための方法は、当該分野で周知であり（例えば、Ｃｌｅｍｅｎｔら， ２０１６， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｃｌｉｎ． Ｄｅｖ． ３： １６００２、Ｎａｓｏら， ２０１７， ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３１（４）： ３１７－３３４、およびＡｙｕｓｏら， ２０１０， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １０（６）： ４２３－３６を参照のこと）、本明細書で開示される組換え核酸構築物および方法とともに使用され得る。

【0156】

上記のように、選択されたベクターは、任意の適切な方法（トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームベースの送達、および膜融合技術が挙げられる）によって宿主細胞へと送達され得る。例示的な実施形態において、上記ベクターは、トランスフェクションを介して宿主細胞へと送達される。

【0157】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶの調製物は、改変されていないＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して生成されたｒＡＡＶの相当する調製物と比較して、低減されたレベルのｃａｐ ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶの調製物は、改変されていないＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して生成されたｒＡＡＶの相当する調製物と比較して、低減されたレベルのｒｅｐ ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶの調製物は、改変されていないＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して生成されたｒＡＡＶの相当する調製物と比較して、低減されたレベルのｃａｐ ＤＮＡおよびｒｅｐ ＤＮＡを含む。

【0158】

１つの実施形態において、上記ｃａｐ ＤＮＡレベルは、本開示の改変されたＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して調製されるｒＡＡＶ調製物において１．５倍またはこれより大きく低減され得る。いくつかの実施形態において、上記ｃａｐ ＤＮＡレベルは、改変されていないＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して生成されたｒＡＡＶの相当する調製物と比較して、少なくとも１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、または８倍低減され得る。

【0159】

１つの実施形態において、上記ｒｅｐ ＤＮＡレベルは、本開示の改変されたＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して調製されるｒＡＡＶ調製物において１．５倍またはこれより大きく低減され得る。いくつかの実施形態において、上記ｒｅｐ ＤＮＡレベルは、改変されていないＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して生成されたｒＡＡＶ相当する調製物と比較して、少なくとも１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、または８倍低減され得る。

【0160】

ｒＡＡＶ調製物中のｃａｐ ＤＮＡおよびｒｅｐ ＤＮＡのレベルは、当該分野で利用可能な任意の適切な方法によって測定され得る。例えば、Ｓａｎｍｉｇｕｅｌら， ２０１９， Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． １９５０， Ｃｈａｐｔｅｒ ４， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ２０１９を参照のこと。１つのこのような方法は、実施例に記載されるように、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である。別のこのような方法は、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）である。他の方法としては、サザンブロット、ドットブロット、スロットブロット、または標識されたプローブとのハイブリダイゼーションによってＤＮＡを検出するために当該分野で利用される任意の他のこのような方法が挙げられる。

【0161】

組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）および関連の医薬組成物
さらなる局面において、本開示は、組換え核酸構築物を含む宿主細胞から生成されるｒＡＡＶであって、ここで上記組換え核酸構築物は、ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含み、ここで上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、上記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されており、ここで上記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂである、ｒＡＡＶを提供する。

【0162】

この局面に従ういくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、Ｈｅｋ２９３、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＡＲＰＥ－１９、またはＭＲＣ－５細胞から選択される宿主細胞で生成された。例示的な実施形態において、上記宿主細胞は、Ｈｅｋ２９３細胞である。ある特定の例示的実施形態において、上記宿主細胞は、ＡｄヘルパープラスミドおよびＣｉｓプラスミドとともに、本発明のＴｒａｎｓプラスミドでトランスフェクトされている。

【0163】

上記局面に従ういくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、上記ｒＡＡＶの中にキャプシドおよびパッケージベクターゲノムを含み、ここで上記ベクターゲノムは、プロモーター配列およびタンパク質導入遺伝子のコード配列を含む。いくつかの実施形態において、上記コード配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、グルコース ６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＡＴＰ７Ｂ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、アルギニノスクシネートシンセターゼ、サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットα（ＰＣＣＡ）、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットβ（ＰＣＣＢ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、α－１－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）、ミオチュブラリン１、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、筋強直性ジストロフィー－プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、線維芽細胞成長因子－４（ＦＧＦ－４）、ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）、カルバモイルシンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノスクシネートリアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ、フマリルアセテートヒドロラーゼ、α－１アンチトリプシン、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、およびジストロフィン遺伝子産物（例えば、ミニジストロフィンまたはマイクロジストロフィン）から選択されるタンパク質導入遺伝子を発現する。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、もしくはｈｕ３７のＡＡＶ、またはその操作されたバリアントに由来する。例示的な実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８キャプシドを含む。別の例示的な実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９キャプシドを含む。

【0164】

さらなる局面において、本開示は、本発明のｒＡＡＶ（例えば、本明細書で記載される宿主細胞または方法から生成されるｒＡＡＶ）および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｒＡＡＶ（例えば、本明細書で記載される宿主細胞または方法から生成されるｒＡＡＶ）を含む医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、髄腔内、または脳室内投与のために製剤化される。

【0165】

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ヒト被験体における注入に適した緩衝液／キャリア中に製剤化される。上記緩衝液／キャリアは、ｒＡＡＶが注入チューブに貼り付くことを防止するが、インビボでのｒＡＡＶ結合活性に干渉しない構成要素を含むべきである。種々の適切な溶液が、以下のうちの１またはこれより多くを含み得る：緩衝化食塩水、界面活性剤、および約１００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭ 塩化ナトリウムに等しいイオン強度に調節された生理学的に適合性の塩または塩の混合物、または等しいイオン濃度に調節された生理学的に適合性の塩。そのｐＨは、６．５～８．５、または７～８．５、または７．５～８の範囲にあり得る。適切な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは、ポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２本の親水性鎖が隣接したポリオキシプリピレン１０（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノールおよびポリエチレングリコールから選択され得る。

【0166】

例示的な実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ＮａＣｌ（例えば、２００ｍＭ ＮａＣｌ）、ＭｇＣｌ_２（例えば、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、Ｔｒｉｓ（例えば、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ）、ｐＨ ８．０、およびポロキサマー１８８（例えば、０．００５％または０．０１％ ポロキサマー１８８）を含む溶液中に製剤化される。

【0167】

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、少なくとも１種の二価アルコールまたは多価アルコールを含む医薬組成物中に製剤化される。１つの実施形態において、上記二価アルコールまたは多価アルコールは、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールおよびソルビトールからなる群より選択される１種またはこれより多くのアルコールである。

【0168】

例示的な実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ソルビトールを含む医薬組成物中に製剤化される。１つの実施形態において、ソルビトールは、０．５重量％～２０重量％の範囲で上記製剤に存在する。１つの実施形態において、ソルビトールは、１重量％～１０重量％の範囲で上記製剤に存在する。１つの実施形態において、ソルビトールは、約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、または約１０重量％で上記製剤に存在する。

【0169】

例示的な実施形態において、上記ｒＡＡＶは、５重量％ ソルビトールおよびポロキサマー１８８（例えば、０．００５％または０．０１％ ポロキサマー１８８）を含む医薬組成物中に製剤化される。

【0170】

処置方法
さらに別の局面において、本開示は、ヒト被験体において疾患、状態、または障害を防止、処置または改善する方法であって、上記ヒト被験体に、治療上有効な量の、本明細書で開示される少なくとも１種のｒＡＡＶを投与するステップを包含する方法を提供する。

【0171】

任意の適切な方補または経路は、本明細書で記載されるｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ含有組成物を投与するために使用され得る。投与経路としては、例えば、皮下に、皮内に、腹腔内に、髄腔内に、脳室内に、静脈内に、および他の非経口投与経路が挙げられる。例示的な実施形態において、上記ｒＡＡＶは、静脈内に投与される。

【0172】

投与される具体的用量は、各患者に対して均一な用量、患者１名あたり例えば、１．０×１０^１１～１．０×１０^１４ ゲノムコピー（ＧＣ）のウイルスであり得る。あるいは、患者の用量は、上記患者のおおよその体重または表面積に合わせて調節され得る。適切な投与量を決定することにおける他の要因としては、処置または防止される疾患または状態、疾患の重篤度、投与経路、および上記患者の年齢、性別および医学的状態が挙げられ得る。処置に適切な投与量を決定するために必要な計算のさらなる改良は、当業者によって、特に、本明細書で開示される投与量情報およびアッセイに鑑みて慣用的に行われる。上記投与量はまた、適切な用量－応答データとともに使用される投与量を決定するために公知のアッセイの使用を通じて決定され得る。個々の患者の投与量はまた、上記疾患の進行がモニターされるにつれて調節され得る。

【0173】

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ｑＰＣＲまたは液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定されるように、例えば、約１．０×１０^１１ ゲノムコピー／ｋｇ 患者体重（ＧＣ／ｋｇ）～約１×１０^１４ ＧＣ／ｋｇ、約５×１０^１１ ゲノムコピー／ｋｇ 患者体重（ＧＣ／ｋｇ）～約５×１０^１３ ＧＣ／ｋｇ、または約１×１０^１２～約１×１０^１３ ＧＣ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約１×１０^１２～約１×１０^１３ ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約１．１×１０^１１、約１．３×１０^１１、約１．６×１０^１１、約１．９×１０^１１、約２×１０^１１、約２．５×１０^１１、約３．０×１０^１１、約３．５×１０^１１、約４．０×１０^１１、約４．５×１０^１１、約５．０×１０^１１、約５．５×１０^１１、約６．０×１０^１１、約６．５×１０^１１、約７．０×１０^１１、約７．５×１０^１１、約８．０×１０^１１、約８．５×１０^１１、約９．０×１０^１１、約９．５×１０^１１、約１．０×１０^１２、約１．５×１０^１２、約２．０×１０^１２、約２．５×１０^１２、約３．０×１０^１２、約３．５×１０^１２、約４．０×１０^１２、約４．５×１０^１２、約５．０×１０^１２、約５．５×１０^１２、約６．０×１０^１２、約６．５×１０^１２、約７．０×１０^１２、約７．５×１０^１２、約８．０×１０^１２、約８．５×１０^１２、約９．０×１０^１２、約９．５×１０^１２、約１．０×１０^１３、約１．５×１０^１３、約２．０×１０^１３、約２．５×１０^１３、約３．０×１０^１３、約３．５×１０^１３、約４．０×１０^１３、約４．５×１０^１３、約５．０×１０^１３、約５．５×１０^１３、約６．０×１０^１３、約６．５×１０^１３、約７．０×１０^１３、約７．５×１０^１３、約８．０×１０^１３、約８．５×１０^１３、約９．０×１０^１３、または約９．５×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される。上記ｒＡＡＶは、単回用量で、または所望の治療結果にとって必要とされる場合は、複数回用量（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多くの用量）で投与され得る。

【0174】

詳細な説明全体を通じて、組成物が、特定の構成要素を有する、包含する、もしくは含むと記載される場合、またはプロセスおよび方法が、特定の工程を有する、包含する、もしくは含むと記載される場合、さらに、その記載される構成要素から本質的になるかまたはそれからなる本発明の組成物が存在すること、ならびにその記載される処理工程から本質的になるかまたはそれからなる本発明に従うプロセスおよび方法が存在することは、企図される。

【0175】

本開示において、要素または構成要素が、記載される要素または構成要素のリストの中に含まれるおよび／またはリストから選択されるといわれる場合、その要素もしくは構成要素が、その記載される要素もしくは構成要素のうちのいずれか１つであり得るか、またはその要素もしくは構成要素が、その記載される要素もしくは構成要素のうちの２もしくはこれより多くからなる群より選択され得ることは、理解されるべきである。

【0176】

さらに、本明細書で記載される組成物または方法の要素および／または特徴が、本明細書で明示的であろうと暗示的であろうと、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の方法において組み合わされ得ることは、理解されるべきである。例えば、特定の化合物に対して言及がなされる場合、その化合物は文脈から別段理解されなければ、本発明の組成物の種々の実施形態においておよび／または本発明の方法において使用され得る。言い換えると、本開示の中で、実施形態は、明確かつ簡潔な開示が書かれ、描かれることを可能にする方法で記載され、示されているが、実施形態が、本教示および本発明から切り離されることなく、種々に組み合わされてもよいし、分離されてもよいことは、意図され、認識される。例えば、本明細書で記載され、示される全ての特徴が、本明細書で記載され、示される本発明の全ての局面に適用可能であり得ることは、認識される。

【0177】

表現「のうちの少なくとも１」が、文脈および用途から別段理解されなければ、その表現の後に来る記載される物体の各々、およびその記載される物体のうちの２またはこれより多くの種々の実施形態を個々に含むことは、理解されるべきである。３またはこれより多くの記載される物体に関連して、表現「および／または」は、文脈から別段理解されなければ、同じ意味を有することが理解されるべきである。

【0178】

用語「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の使用は、これらの文法上等価なものを含め、概して制限がなくかつ非限定的である、例えば、別段具体的に述べられなければ、または文脈から理解されなければ、さらなる記載されない要素または工程を排除しないと概して理解されるべきである。

【0179】

用語「約」が定量的値の前で使用される場合、本発明はまた、別段具体的に述べられなければ、その特定の定量的値自体を含む。本明細書で使用される場合、用語「約」とは、別段示されなければまたは推測されなければ、名目上の値からの±１０％ 変動に言及する。

【0180】

工程の順序またはある特定の行為を行うための順序は、本発明が実施可能なままである限りにおいて、重要ではないことが理解されるべきである。さらに、２またはこれより多くの工程または行為は、同時と見做されてもよい。

【0181】

任意のおよび全ての例、または例示的な文言、例えば、「のような、例えば（ｓｕｃｈ ａｓ）」または「が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の本明細書での使用は、本発明をよりよく例証することを意図するに過ぎず、別段特許請求されなければ、本発明の範囲に対する限定を課すものではない。本明細書中のいかなる文言も、任意の特許請求されていない要素を本発明の実施に必須として示すと解釈されるべきではない。

【実施例】

【0182】

ここで一般的に記載されている開示は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。実施例は、本開示のある特定の局面および実施形態を例証する目的で含められるに過ぎず、いかなる方法によっても本開示の範囲を限定することは意図されない。

【0183】

実施例１：
この実施例の目的は、ＡＡＶ８キャプシドのＶＰ３ ＯＲＦにおいて潜在的なスプライスドナーおよびアクセプター部位の選択および同定を記載することである。

【0184】

この実施例において、ＡＡＶ８ ＶＰ３ ＯＲＦ内のイントロン性スプライスドナーおよびスプライスアクセプターＤＮＡモチーフに関するインシリコ検索を完了した。具体的には、以前に記載されるとおりの「ＣＡＧ／Ｇ」（配列番号３２によって表される）、「ＣＡＧ／ＣＴＧ」（配列番号３３によって表される）、または「ＣＡＧ／ＧＴＧ」（配列番号３４によって表される）エキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列（Ｓｈａｐｉｒｏ ＆ Ｓｅｎａｐａｔｈｙ， １９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５（１７）； Ｓｈｅｐａｒｄら， ２０１１， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３９（２０）を参照のこと）を含むコンセンサスおよび非常に強いスプライス部位モチーフを、同定した。

【0185】

例証目的で図２に示されるように、３個のこのような「ＣＡＧ／Ｇ」モチーフ（Ａ－５、Ａ－６およびＡ－７と称する）、１個のこのような「ＣＡＧ／ＣＴＧ」モチーフ（Ｂ－２と称する）、および１個のこのような「ＣＡＧ／ＧＴＧ」モチーフ（Ｃ－１と称する）を、示されるＡＡＶ８ ＶＰ３ ＯＲＦのセクション内で同定した。

【0186】

例証目的で図３に示されるように、１０個のこのような「ＣＡＧ／Ｇ」モチーフ（Ａ５－１４と称する）、１個のこのような「ＣＡＧ／ＣＴＧ」モチーフ（Ｂ－２と称する）、および１個のこのような「ＣＡＧ／ＧＴＧ」モチーフ（Ｃ－１と称する）を、完全なＡＡＶ８ ＶＰ３ ＯＲＦ内で同定した。

【0187】

実施例２：
この実施例の目的は、ＡＡＶ８キャプシドのＶＰ３ ＯＲＦへの挿入に適した切り取り可能な異種イントロンの選択を記載することである。

【0188】

この実施例において、以下の基準を利用して、異種イントロン候補を同定した： ＞１０００塩基対の長さ、子宮頸癌細胞における遺伝子特異的ｐｒｅ－ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡの上昇した発現、またはアデノウイルス血清型５に感染した子宮頸癌細胞における遺伝子特異的ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの上昇した発現（文献中に記載されるとおりか、またはＲＮＡ－ＳＥＱ分析によって経験的に決定されるとおりかのいずれか）、ならびに内部コンセンサススプライスアクセプターおよびドナー部位（それぞれ、「ＧＴ」および「ＡＧ」）の存在。

【0189】

上記の段落で記載されるスクリーニングは、配列番号１～３１に示されるイントロンの選択をもたらした。具体的には、ＥＩＦ２Ｓ１イントロン（Ｈａｌｂｅｒｔら， ２０１１， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８（４）： ４１１－７およびＷａｎｇら， ２０１４， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１（４）： ３６３－７０）、ＣＯＬ１Ａ２イントロン（Ｃａｏら， ２０００， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４（２４）： １１４５６－６３）、ＳＰＡＲＣイントロン（Ｓｈｉら， ２０１６， Ｏｎｃｏｌ Ｌｅｔｔ １１（５）： ３２５１－８）、およびＳＴＡＴ３イントロン（Ｓｈｕｋｌａら， ２０１０， Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ９： ２８２）は、以前に文献の中で記載された。配列番号１～３１に示される残りのイントロンを、アデノウイルス血清型５に感染させた子宮頸癌細胞における遺伝子特異的ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの発現を試験するために行ったＲＮＡ－ＳＥＱ分析を使用して同定した。

【0190】

実施例３：
この実施例の目的は、本明細書で記載される作業の実験作業フローを記載することである。

【0191】

その実験作業フローを、異種イントロンの選択に関する堅牢な３層アプローチで開始した。第１層（実施例２に記載されるとおりの初期選択）の後に、異種イントロン候補を、複数回のインシリコ分析（第２層）に供した。具体的には、スプライス部位強度を、最大エントロピーの原理に基づいて、計算して得られた使用確率関数（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｕｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）で概算した（Ｙｅｏ ＆ Ｂｕｒｇｅ， ２００４， Ｊ． ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１（２－３）； Ｓｈｅｐａｒｄら， ２０１１， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３９（２０）；ならびに、それぞれ、ヒト５’スプライス部位およびヒト３’スプライス部位に関してＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｂｕｒｇｅ Ｌａｂ ＭＩＴウェブサイト［ソフトウェアタブ］から入手可能なＭａｘＥｎｔＳｃａｎ：：ｓｃｏｒｅ５ｓｓおよびＭａｘＥｎｔＳｃａｎ：：ｓｃｏｒｅ３ｓｓツールを参照のこと）。十分なスプライス部位強度の異種イントロン候補を、インシリコ分析の最終層 （第３層）としてＲＮＡスプライス部位二次構造に関して分析した（Ｓｈｅｐａｒｄ ＆ Ｈｅｒｔｅｌ， ２００８， ＲＮＡ （１４）； Ｚｕｋｅｒ， ２００３， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１（１３）を参照のこと）。

【0192】

次いで、選択した異種イントロン候補を、当該分野で公知の従来の分子技術を介して、ＡＡＶ８ ＲｅｐおよびＡＡＶ８ Ｃａｐタンパク質を発現するＴｒａｎｓプラスミドのＣａｐ ＶＰ３領域のコード配列内の以前に同定したコンセンサス部位または「非常に強い」スプライス部位に挿入した。

【0193】

いったん生成したら、これらのイントロンが改変されたＴｒａｎｓプラスミドを利用して、Ｈｅｋ２９３細胞へのＣｉｓプラスミド、イントロン改変されたＴｒａｎｓプラスミドおよびｐＡｄＨｅｌｐｅｒプラスミドの三重トランスフェクションを介してｒＡＡＶを生成した。三重トランスフェクションの後に、細胞を、代謝産物およびｐＨ調整を少なくとも２４時間ごとに行って、標準的な条件において３～５日間培養した。細胞上清を、３～５日間の培養後に採取し、標準的な実験用フィルターを使用して清澄にした。いったん清澄にした後、その上清を、捕捉および精製のために、アフィニティー樹脂とともにインキュベートした。次いで、精製ｒＡＡＶを濃縮し、緩衝液交換して、マトリクス効果によるｑＰＣＲ阻害を改善した。

【0194】

ｒＡＡＶ生成およびアフィニティー捕捉の後に、精製ｒＡＡＶベクター物質を、複数の方法によって重要な品質属性に関して分析した。これらの方法は、アルカリ性ゲルＤＮＡ電気泳動によるベクターゲノム完全性の評価、ＳＤＳ－ＰＡＧＥもしくはウェスタンブロットによるベクターキャプシド比の評価、ならびに目的の導入遺伝子またはウイルスゲノムに存在する他の選択された分子特徴を検出するように設計されたプライマー／プローブを利用する定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によってウイルス力価の定量を含み得る。ｑＰＣＲも利用して、精製ウイルス調製物に存在するＲｅｐおよびＣａｐの逆パッケージＤＮＡを定量した。

【0195】

実施例４：
この実施例の目的は、ＴｒａｎｓプラスミドのＡＡＶ８ Ｃａｐコード配列がＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されている場合に、逆パッケージｃａｐ ＤＮＡおよび逆パッケージｒｅｐ ＤＮＡのレベルが低減されることを示すことである（本明細書において「ｐａｃｋｔｒｏｎ」といわれるアプローチ）。さらに、この実施例は、ｒＡＡＶゲノムパッケージングが、ｒＡＡＶの生成のためにｐａｃｋｔｒｏｎプラスミドを使用する場合に、有意にかつ驚くほど増加していることを示す。

【0196】

この実施例において、ｒＡＡＶベクターを、ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）をコードするＣｉｓプラスミド、異種イントロンおよび挿入位置が異なるｐａｃｋｔｒｏｎ ＡＡＶ８ Ｃａｐ Ｔｒａｎｓプラスミドの種々のバージョン、ならびにｐＡｄＨｅｌｐｅｒプラスミドでの、Ｈｅｋ２９３細胞の三重トランスフェクションを介して生成した。トランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を、３～５日間培養し、次いで、細胞上清を採取し、ウイルス粒子を、アフィニティー樹脂捕捉によって精製し、続いて、濃縮および緩衝液交換を行った。次いで、ウイルス粒子を、ＤＮａｓｅで処理して、キャプシド形成されていないＤＮＡを除去し、ＡＡＶ８ ｃａｐ ＤＮＡ、ｒｅｐ ＤＮＡ、またはｈＦＩＸゲノム構築物内の特異的分子エレメントを検出するように設計されたプライマー／プローブを用いるｑＰＣＲによって分析した。

【0197】

この実施例において使用したｐａｃｋｔｒｏｎ ＡＡＶ８ Ｃａｐ Ｔｒａｎｓプラスミドを、以下の異種イントロン挿入で作製した： 位置Ｃ－１においてＡＬＤＯＡ（配列番号１４）、位置Ｃ－１においてＣＯＬ１Ａ２（配列番号２）、位置Ａ－１１においてＣＯＬ１Ａ２（配列番号２）、位置Ｃ－１においてＳＰＡＲＣ（配列番号５）、位置Ａ－１１においてＳＰＡＲＣ（配列番号５）、位置Ｃ－１においてＧＮＡＳ（配列番号２０）、位置Ａ－１１においてＧＮＡＳ（配列番号２０）、位置Ｃ－１においてＥＮＯ１（配列番号９）、および位置Ａ－１１においてＥＮＯ１（配列番号９）。

【0198】

図４に示されるように、逆パッケージＡＡＶ８ ｃａｐ ＤＮＡの２倍～８倍の低減が、標準的なＴｒａｎｓプラスミドで作製したｒＡＡＶ８－ｈＦＩＸ生成物と比較した場合に、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドを使用して作製したｒＡＡＶ８－ｈＦＩＸ生成物の大部分にわたって観察された。逆パッケージｃａｐ ＤＮＡの観察された低減のレベルは、部分的に、利用した特異的異種イントロンおよび挿入されたイントロンの位置に依存するようであった。

【0199】

図５に示されるように、逆パッケージＡＡＶ８ ｒｅｐ ＤＮＡの２倍～８．５倍の低減が、標準的なＴｒａｎｓプラスミドで作製したｒＡＡＶ８－ｈＦＩＸ生成物と比較した場合に、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドを使用して作製したｒＡＡＶ８－ｈＦＩＸ生成物の大部分にわたって観察された。逆パッケージｒｅｐ ＤＮＡの観察された低減のレベルは、部分的に、利用した特異的異種イントロンおよび挿入されたイントロンの位置に依存するようであった。

【0200】

逆パッケージｃａｐおよびｒｅｐ ＤＮＡにおける低減に加えて、本発明者らは、標準的なＴｒａｎｓプラスミドで作製したｒＡＡＶ８－ｈＦＩＸ生成物と比較した場合に、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドを使用して作製したｒＡＡＶ８－ｈＦＩＸ生成物のうちの大部分において、パッケージｈＦＩＸベクターゲノムＤＮＡの１．５倍～５倍の増加を驚くべきことに観察した。図６を参照のこと。パッケージｈＦＩＸ ＤＮＡの観察された増加のレベルは、部分的に、利用した特異的異種イントロンおよび挿入されたイントロンの位置に依存するようであった。

【0201】

この実施例は、ＡＡＶ８ ＶＰ３ ＯＲＦ内で見出されるコンセンサスならびに「非常に強い」スプライスドナーおよびアクセプターモチーフへの異種イントロンの包含が、トランスフェクトされたＴｒａｎｓプラスミドに由来する逆パッケージｃａｐおよびｒｅｐ ＤＮＡ配列のレベルを低減し、パッケージベクターゲノム配列のレベルを増加させることを示す。
実施例５：

【0202】

この実施例の目的は、ｐａｃｋｔｒｏｎプラスミドがｒＡＡＶ生成のために使用される場合に、代表的なＣａｐ発現および化学量論が維持されることを示すことである。

【0203】

この実施例において、ｒＡＡＶベクターを、ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）をコードするＣｉｓプラスミド、異種イントロンおよび挿入の位置が異なるｐａｃｋｔｒｏｎ ＡＡＶ８ Ｃａｐ Ｔｒａｎｓプラスミドの種々のバージョン（前の実施例で示されるとおり）、およびｐＡｄＨｅｌｐｅｒプラスミドでのＨｅｋ２９３細胞の三重トランスフェクションを介して生成した。トランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を、３～５日間培養し、遠心分離でペレットにすることによって、細胞上清から採取した。いったん単離された後、ペレット化したＨｅｋ２９３細胞を溶解し、抗ＡＡＶキャプシド抗体を利用するウェスタンブロットによって分析した。

【0204】

図７に示されるように、各ｐａｃｋｔｒｏｎプラスミドからのＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の細胞内ＡＡＶ８キャプシドタンパク質発現の比は、対照Ｔｒａｎｓプラスミドからのタンパク質発現に類似であることが観察された。これらのデータは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３それぞれ、以前に報告されたキャプシド比 １：１：１０と一致するようである。

【0205】

この実施例は、ＡＡＶ８ ＶＰ３ ＯＲＦへの異種イントロンの挿入が、ＡＡＶ８ Ｃａｐタンパク質のアイソフォームの発現レベルまたはスプライシングを有意に変化させなかったことを示す。

【0206】

実施例６：
この実施例の目的は、ｐａｃｋｔｒｏｎプラスミドが、顕著に異なるゲノム特徴を有する他のｒＡＡＶ８生成物に利益をもたらし得るかどうかを評価することであった。具体的には、異なるサイズ、調節エレメント、および導入遺伝子を有する３種のゲノムを、分析した。

【0207】

この実施例において、ｒＡＡＶベクターを、ｈＦＩＸ、ｅＧＦＰ、またはｍＣｈｅｒｒｙをコードするＣｉｓプラスミド、異種イントロンおよび挿入位置が異なるｐａｃｋｔｒｏｎ ＡＡＶ８ Ｔｒａｎｓプラスミドの２つのバージョン、ならびにｐＡｄＨｅｌｐｅｒプラスミドでのＨｅｋ２９３細胞の三重トランスフェクションを介して生成した。トランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を、３～５日間培養し、次いで、細胞上清を採取し、ウイルス粒子を、アフィニティー樹脂捕捉によって精製し、続いて、濃縮および緩衝液交換を行った。次いで、ウイルス粒子を、ＤＮａｓｅで処理して、キャプシド形成されていないＤＮＡを除去し、ＡＡＶ８ ｃａｐ ＤＮＡ、ｒｅｐ ＤＮＡ、または上記３種のゲノム構築物間で共有される特異的分子エレメントを検出するために設計したプライマー／プローブを用いるｑＰＣＲによって分析した。

【0208】

この実施例において使用したｐａｃｋｔｒｏｎ ＡＡＶ８ Ｃａｐ Ｔｒａｎｓプラスミドを、以下の異種イントロン挿入で作製した： 位置Ａ－１１においてＳＰＡＲＣ（配列番号５）および位置Ｃ－１においてＧＮＡＳ（配列番号２０）。

【0209】

図８に示されるように、逆パッケージＡＡＶ８ ｃａｐ ＤＮＡの低減は、分析した全てのゲノムに関して標準的なＴｒａｎｓプラスミドと比較した場合に、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドの使用で観察された。逆パッケージｃａｐ ＤＮＡの観察された低減のレベルは、部分的に、利用した特異的異種イントロンおよび挿入されたイントロンの位置に依存するようであった。

【0210】

図９に示されるように、逆パッケージＡＡＶ８ ｒｅｐ ＤＮＡの低減は、分析した全てのゲノムに関して標準的なＴｒａｎｓプラスミドと比較した場合に、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドの使用で観察された。逆パッケージｒｅｐ ＤＮＡの観察された低減のレベルは、部分的に、利用した特異的異種イントロンおよび挿入されたイントロンの位置に依存するようであった。

【0211】

図１０に示されるように、パッケージベクターゲノムＤＮＡの増加は、分析した全３種のゲノムに関して標準的なＴｒａｎｓプラスミドと比較した場合に、ＧＮＡＳ２イントロンを含むｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドの使用で観察された。

【0212】

この実施例は、ＡＡＶ８ ＶＰ３ ＯＲＦ内で見出されるコンセンサスならびに「非常に強い」スプライスドナーおよびアクセプターモチーフへの異種イントロンの包含が、トランスフェクトされたＴｒａｎｓプラスミドに由来する逆パッケージｃａｐおよびｒｅｐ配列のレベルを低減し、異なるゲノム特徴を有する３種のｒＡＡＶ８生成物にわたって、パッケージベクターゲノム配列のレベルを増加させ得ることを示す。

【0213】

実施例７：
実施例４および６に記載されるように、ｐａｃｋｔｒｏｎプラスミドの使用は、ｒＡＡＶ８生成物の生成に有益であった。この実施例の目的は、ｐａｃｋｔｒｏｎプラスミドが、ｒＡＡＶ９生成物に類似の利益をもたらし得るかどうかを評価することであった。

【0214】

この実施例において、ＡＡＶ９ Ｃａｐ ＶＰ３ ＯＲＦは、インシリコ分析ならびに実施例１、２および３に記載されるとおりの異種イントロンの挿入を受けた。ｒＡＡＶベクターを、ｈＦＩＸをコードするＣｉｓプラスミド、異種イントロンおよび挿入位置が異なるｐａｃｋｔｒｏｎ ＡＡＶ９ Ｃａｐ Ｔｒａｎｓプラスミドの種々のバージョン、ならびにｐＡｄＨｅｌｐｅｒプラスミドでのＨｅｋ２９３細胞の三重トランスフェクションを介して生成した。トランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を、３～５日間培養し、次いで、細胞上清を採取し、ウイルス粒子を、アフィニティー樹脂捕捉によって精製し、続いて、濃縮および緩衝液交換を行った。次いで、ウイルス粒子を、ＤＮａｓｅで処理して、キャプシド形成されていないＤＮＡを除去し、ＡＡＶ９ ｃａｐ ＤＮＡ、ｒｅｐ ＤＮＡ、またはｈＦＩＸゲノム構築物内の特異的分子エレメントを検出するために設計したプライマー／プローブを用いるｑＰＣＲによって分析した。

【0215】

この実施例において使用したｐａｃｋｔｒｏｎ ＡＡＶ９ Ｃａｐ Ｔｒａｎｓプラスミドを、以下の異種イントロン挿入で作製した： 位置Ａ－４（ＡＡＶ９ ＶＰ３におけるＣＡＧ／Ｇ接合部）におけるＡＬＤＯＡ（配列番号１４）、位置Ａ－４におけるＣＯＬ１Ａ２（配列番号２）、位置Ａ－５（ＡＡＶ９ ＶＰ３におけるＣＡＧ／Ｇ接合部）におけるＣＯＬ１Ａ２（配列番号２）、位置Ａ－４におけるＳＰＡＲＣ（配列番号５）、位置Ａ－５におけるＳＰＡＲＣ（配列番号５）、位置Ａ－４におけるＧＮＡＳ（配列番号２０）、位置Ａ－５におけるＧＮＡＳ（配列番号２０）、位置Ａ－４におけるＥＮＯ１（配列番号９）、および位置Ａ－５におけるＥＮＯ１（配列番号９）。

【0216】

図１１に示されるように、逆パッケージＡＡＶ９ ｃａｐ ＤＮＡの低減は、標準的なＴｒａｎｓプラスミドと比較した場合に、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドの使用を伴う全ｒＡＡＶ９－ｈＦＩＸ生成物にわたって観察された。逆パッケージｃａｐ ＤＮＡの観察された低減のレベルは、部分的に、利用した特異的異種イントロンおよび挿入されたイントロンの位置に依存するようであった。

【0217】

図１２に示されるように、逆パッケージＡＡＶ９ ｒｅｐ ＤＮＡの低減は、標準的なＴｒａｎｓプラスミドと比較した場合に、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドの使用を伴う全てのｒＡＡＶ９－ｈＦＩＸ生成物にわたって観察された。逆パッケージｒｅｐ ＤＮＡの観察された低減のレベルは、部分的に、利用した特異的異種イントロンおよび挿入されたイントロンの位置に依存するようであった。

【0218】

図１３に示されるように、パッケージｈＦＩＸベクターゲノムＤＮＡの増加は、標準的なＴｒａｎｓプラスミドと比較した場合に、ｐａｃｋｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓプラスミドの使用を伴う全てのｒＡＡＶ９－ｈＦＩＸ生成物にわたって観察された。パッケージｈＦＩＸ ＤＮＡの観察された増加のレベルは、部分的に、利用した特異的異種イントロンおよび挿入されたイントロンの位置に依存するようであった。

【0219】

この実施例は、ＡＡＶ９ ＶＰ３ ＯＲＦ内で見出されるコンセンサスならびに「非常に強い」スプライスドナーおよびアクセプターモチーフへの異種イントロンの包含が、トランスフェクトしたＴｒａｎｓプラスミドに由来する逆パッケージＡＡＶ９ ＲｅｐおよびＣａｐ配列のレベルを低減し、パッケージベクターゲノム配列のレベルを増加させることを示す。

【0220】

これらの実施例に記載される発明は、代表的なＡＡＶ８およびＡＡＶ９ Ｃａｐコード配列と合わせて例証されるが、そのアプローチは、本出願の開示を使用して、任意の他のＡＡＶ Ｃａｐコード配列（および従って任意のキャプシド血清型含有ｒＡＡＶ）に適用され得る。

【0221】

番号付けした実施形態
実施形態Ｐ１： ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列およびＡＡＶ Ｃａｐコード配列を含む組換え核酸構築物であって、
ここで前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域における１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の挿入を介して改変されており、
ここで前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１ｋｂである、
組換え核酸構築物。

【0222】

実施形態Ｐ２： 前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７、またはその操作されたバリアントのキャプシドタンパク質をコードする、実施形態Ｐ１に記載の組換え核酸構築物。

【0223】

実施形態Ｐ３： 前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、ＡＡＶ８の血清型のキャプシドタンパク質をコードする、実施形態Ｐ１に記載の組換え核酸構築物。

【0224】

実施形態Ｐ４： 前記ＡＡＶ Ｃａｐコード配列は、ＡＡＶ９の血清型のキャプシドタンパク質をコードする、実施形態Ｐ１に記載の組換え核酸構築物。

【0225】

実施形態Ｐ５： 前記組換え核酸構築物は、プロモーター、ＡＡＶイントロン、および選択マーカーのコード配列から選択される１個またはこれより多くの核酸配列をさらに含む、実施形態Ｐ１～Ｐ４のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0226】

実施形態Ｐ６： 単一の切り取り可能な異種イントロン配列は、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域に挿入される、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0227】

実施形態Ｐ７： 少なくとも２個の切り取り可能な異種イントロン配列は、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列のＶＰ３領域に挿入される、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0228】

実施形態Ｐ８： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、少なくとも１個のスプライスドナーおよび少なくとも１個のスプライスアクセプター部位を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0229】

実施形態Ｐ９： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、少なくとも１個のスプライスドナーおよび少なくとも１個のスプライスアクセプター部位を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0230】

実施形態Ｐ１０： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも１．５ｋｂである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0231】

実施形態Ｐ１１： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも２．０ｋｂである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0232】

実施形態Ｐ１２： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも２．５ｋｂである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0233】

実施形態Ｐ１３： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも３．０ｋｂである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0234】

実施形態Ｐ１４： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも３．５ｋｂである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0235】

実施形態Ｐ１５： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、少なくとも４．０ｋｂである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0236】

実施形態Ｐ１６： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、１．０ｋｂ～５．０ｋｂである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0237】

実施形態Ｐ１７： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、２．０ｋｂ～３．５ｋｂである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0238】

実施形態Ｐ１８： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、約２．０ｋｂである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0239】

実施形態Ｐ１９： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、約２．５ｋｂである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0240】

実施形態Ｐ２０： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、約３．０ｋｂである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0241】

実施形態Ｐ２１： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列の合わせた全長は、約３．５ｋｂである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0242】

実施形態Ｐ２２： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、真核生物翻訳開始因子２、サブユニット１（ＥＩＦ２Ｓ１）、Ｉ型コラーゲンα２鎖（ＣＯＬ１Ａ２）、酸性かつシステインが豊富な分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）、転写のシグナル伝達因子および活性化因子３（ＳＴＡＴ３）、エノラーゼ１（ＥＮＯ１）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ）、アルドラーゼ、フルクトース－ビスホスフェートＡ（ＡＬＤＯＡ）、Ｙボックス結合タンパク質１（ＹＢＸ１）；グアニンヌクレオチド結合タンパク質｛Ｇプロテイン｝、βポリペプチド２様１（ＧＮＢ２Ｌ１）；リボソームタンパク質Ｓ３（ＲＰＳ３）、ＧＮＡＳ複合体遺伝子座（ＧＮＡＳ）、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）、トランスフェリンレセプター（ＴＦＲＣ）、細胞質性ポリＡ結合タンパク質１（ＰＡＢＰＣ１）、ユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）、カルネキシン（ＣＡＮＸ）、および乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）のイントロンから選択される、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0243】

実施形態Ｐ２３： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、配列番号１～３１のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一である配列から選択される、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0244】

実施形態Ｐ２４： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、配列番号１～３１から選択される配列を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0245】

実施形態Ｐ２５： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、配列番号１～３１から選択される配列からなる、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0246】

実施形態Ｐ２６： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、ＣＡＧ／Ｇ（配列番号３２）のスプライスドナー：アクセプター接合部配列を有するｃａｐ ＶＰ３の位置において挿入される、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0247】

実施形態Ｐ２７： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、ＣＡＧ／ＣＴＧ（配列番号３３）のエキソンスプライスドナー／エキソンスプライスアクセプター配列を有するｃａｐ ＶＰ３の位置において挿入される、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0248】

実施形態Ｐ２８： 前記１個またはこれより多くの切り取り可能な異種イントロン配列は、ＣＡＧ／ＧＴＧ（配列番号３４）のスプライスドナー：アクセプター接合部配列を有するｃａｐ ＶＰ３の位置において挿入される、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１項に記載の組換え核酸構築物。

【0249】

実施形態Ｐ２９： 実施形態Ｐ１～Ｐ２８のいずれかに記載の組換え核酸構築物を含むベクター。

【0250】

実施形態Ｐ３０： 前記ベクターは、プラスミドである、実施形態Ｐ２９に記載のベクター。

【0251】

実施形態Ｐ３１： 実施形態Ｐ１～Ｐ２８のいずれかに記載の組換え核酸構築物を含む宿主細胞。

【0252】

実施形態Ｐ３２： 前記組換え核酸構築物は、ベクターに存在する、実施形態Ｐ３１に記載の宿主細胞。

【0253】

実施形態Ｐ３３： 前記ベクターは、プラスミドである、実施形態Ｐ３２に記載の宿主細胞。

【0254】

実施形態Ｐ３４： 前記宿主細胞は、１個またはこれより多くのアデノウイルスヘルパー遺伝子を含むプラスミドをさらに含む、実施形態Ｐ３１～Ｐ３３のいずれかに記載の宿主細胞。

【0255】

実施形態Ｐ３５： 前記宿主細胞は、５’－逆方向末端反復（５’－ＩＴＲ）配列、プロモーター、導入遺伝子コード配列、および３’－逆方向末端反復（３’－ＩＴＲ）配列を含むプラスミドをさらに含む、実施形態Ｐ３１～Ｐ３４のいずれかに記載の宿主細胞。

【0256】

実施形態Ｐ３６： 前記宿主細胞は、以下をさらに含む、実施形態Ｐ３１～Ｐ３３のいずれかに記載の宿主細胞：

【0257】

１個またはこれより多くのアデノウイルスヘルパー遺伝子を含むプラスミド；ならびに

【0258】

５’－逆方向末端反復（５’－ＩＴＲ）配列、プロモーター、導入遺伝子コード配列、および３’－逆方向末端反復（３’－ＩＴＲ）配列を含むプラスミド。

【0259】

実施形態Ｐ３７： 前記導入遺伝子コード配列は、天然のコード配列である、実施形態Ｐ３５～Ｐ３６のいずれかに記載の宿主細胞。

【0260】

実施形態Ｐ３８： 前記導入遺伝子コード配列は、コドン最適化されたコード配列である、実施形態Ｐ３５～Ｐ３６のいずれかに記載の宿主細胞。

【0261】

実施形態Ｐ３９： 前記導入遺伝子は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、グルコース ６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＡＴＰ７Ｂ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、アルギニノスクシネートシンセターゼ、サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットα（ＰＣＣＡ）、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットβ（ＰＣＣＢ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）、イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、α－１－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）、ミオチュブラリン１、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、筋強直性ジストロフィー－プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、線維芽細胞成長因子－４（ＦＧＦ－４）、ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）、カルバモイルシンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノスクシネートリアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ、フマリルアセテートヒドロラーゼ、α－１アンチトリプシン、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、ミニジストロフィン、およびマイクロジストロフィンから選択される、実施形態Ｐ３５～Ｐ３６のいずれかに記載の宿主細胞。

【0262】

実施形態Ｐ４０： 前記宿主細胞は、Ｈｅｋ２９３、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＡＲＰＥ－１９、またはＭＲＣ－５細胞から選択される、実施形態Ｐ３１～Ｐ３９のいずれかに記載の宿主細胞。

【0263】

実施形態Ｐ４１： 前記宿主細胞は、Ｈｅｋ２９３細胞である、実施形態Ｐ３１～Ｐ３９のいずれかに記載の宿主細胞。

【0264】

実施形態Ｐ４２： 組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の調製物を生成するための方法であって、前記方法は、実施形態Ｐ３１～Ｐ４１のいずれかに記載の宿主細胞を、ｒＡＡＶの生成を促進する適切な条件下で培養するステップを包含する方法。

【0265】

実施形態Ｐ４３： 前記ｒＡＡＶの調製物は、改変されていないＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して生成されるｒＡＡＶの相当する調製物と比較して、低減されたレベルのｃａｐ ＤＮＡを含む、実施形態Ｐ４２に記載の方法。

【0266】

実施形態Ｐ４４： 前記ｒＡＡＶの調製物は、改変されていないＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して生成されるｒＡＡＶの相当する調製物と比較して、低減されたレベルのｒｅｐ ＤＮＡを含む、実施形態Ｐ４２に記載の方法。

【0267】

実施形態Ｐ４５： 前記ｒＡＡＶの調製物は、改変されていないＡＡＶ Ｃａｐコード配列を使用して生成されるｒＡＡＶの相当する調製物と比較して、低減されたレベルのｒｅｐ ＤＮＡおよびｃａｐ ＤＮＡを含む、実施形態Ｐ４２に記載の方法。

【0268】

実施形態Ｐ４６： 実施形態Ｐ４２～Ｐ４５のいずれかに記載の方法によって生成されるｒＡＡＶ。

【0269】

実施形態Ｐ４７： 実施形態Ｐ４６に記載のｒＡＡＶおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物。

【0270】

参照による援用
本明細書で言及される特許文書および科学論文の各々の開示全体は、全ての目的のために参照により援用される。

【0271】

均等物
本開示は、その趣旨および本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的形態において具現化され得る。従って、前述の実施形態は、全ての点において、本明細書で記載される開示を限定するのではなく例証であるとみなされるべきである。異なる実施形態の種々の構造的要素および種々の開示される方法の工程は、種々の組み合わせおよび並べ替えにおいて利用され得、全てのこのような改変は、本開示の形態であるとみなされるべきである。本開示の範囲は、従って、前述の説明によるのではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および均等の範囲内に入る全ての変更は、その中に包含されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

2023518415000001.app

【国際調査報告】