▶ ボストン サイエンティフィック サイムド，インコーポレイテッドの特許一覧 ▶ リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミネソタの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-01
(54)【発明の名称】腫瘍併用治療
(51)【国際特許分類】
A61K 47/32 20060101AFI20230424BHJP
A61K 9/16 20060101ALI20230424BHJP
A61K 41/00 20200101ALI20230424BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230424BHJP
【ＦＩ】
A61K47/32
A61K9/16
A61K41/00
A61P35/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022556078
(86)(22)【出願日】2021-03-17
(85)【翻訳文提出日】2022-09-28
(86)【国際出願番号】 US2021022705
(87)【国際公開番号】W WO2021188630
(87)【国際公開日】2021-09-23
(31)【優先権主張番号】62/991,298
(32)【優先日】2020-03-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506192652
【氏名又は名称】ボストン サイエンティフィック サイムド，インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＯＳＴＯＮ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＳＣＩＭＥＤ，ＩＮＣ．
(71)【出願人】
【識別番号】513112245
【氏名又は名称】リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミネソタ
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＮＮＥＳＯＴＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(72)【発明者】
【氏名】フォーサイス、ブルース アール．
(72)【発明者】
【氏名】ワン、チュン
(72)【発明者】
【氏名】ハンソン、サミュエル
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA31
4C076AA51
4C076AA99
4C076BB32
4C076CC50
4C076EE12A
4C076EE13
4C076FF02
4C084AA11
4C084MA11
4C084MA41
4C084MA67
4C084NA14
4C084ZB261
(57)【要約】
いくつかの態様において、本開示は、（ａ）膜活性剤が組織体積に局所的に放出されるように、放出可能な膜活性剤を含む移植可能な組成物を標的部位に投与することと、（ｂ）組織体積へのパルス電界の印加によって不可逆的、可逆的および／または熱的処理を実施することと、を含む組織体積を治療する方法に関する。他の態様において、本開示は、放出可能な膜活性剤を含む塞栓組成物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
放出可能な膜活性剤を含む塞栓組成物。
【請求項2】
前記膜活性剤は、カチオン性分子、両親媒性分子およびアニオン性分子から選択される、請求項１に記載の塞栓組成物。
【請求項3】
前記膜活性剤は、カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマーおよび両親媒性ポリマーから選択される、請求項１に記載の塞栓組成物。
【請求項4】
前記膜活性剤は、第一級、第二級、第三級および／または第四級アミン基を有する天然または合成のカチオン性ポリマーである、請求項１に記載の塞栓組成物。
【請求項5】
前記膜活性剤は、アミノアルキルアクリレートホモポリマー、アミノアルキルアクリレートコポリマー、アミノアルキルメタクリレートホモポリマーおよびアミノアルキルメタクリレートコポリマーから選択される、請求項１に記載の塞栓組成物。
【請求項6】
前記膜活性剤は、ポリ（６－アミノヘキシルメタクリレート）、ポリ（アミノエチル－コ－ブチルメタクリレート）、およびポリ（２－ヘキサメチレンイミノ）エチルメタクリレートから選択される、請求項１に記載の塞栓組成物。
【請求項7】
前記塞栓組成物が、体内への導入時に固体塞栓組成物になる液体組成物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の塞栓組成物。
【請求項8】
前記塞栓組成物が、固体塞栓組成物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の塞栓組成物。
【請求項9】
前記固体塞栓組成物が少なくとも部分的に生体安定性であるか、または生体吸収性である、請求項８に記載の塞栓組成物。
【請求項10】
前記固体塞栓組成物が移植可能な粒子である、請求項８～９のいずれか一項に記載の塞栓組成物。
【請求項11】
前記固体塞栓組成物が足場である、請求項８～９のいずれか一項に記載の塞栓組成物。
【請求項12】
前記足場がディスク、ロッド、ステント、コイル、基準マーカ、プレート、チューブ、または半透過性織物メッシュから選択される、請求項１１に記載の塞栓組成物。
【請求項13】
前記膜活性剤が、前記固体塞栓組成物の全体に存在するか、または前記固体塞栓組成物の一部のみに存在する、請求項８～１２のいずれか一項に記載の塞栓組成物。
【請求項14】
前記膜活性剤は前記固体塞栓組成物の表面に存在するが前記固体塞栓組成物の大部分には存在しない、前記膜活性剤は前記固体塞栓組成物の大部分に存在するが前記固体塞栓組成物の表面には存在しない、前記膜活性剤は前記固体塞栓組成物中に均質に存在する、前記膜活性剤は前記固体塞栓組成物中に濃度勾配を有して存在する、前記膜活性剤は下層の基材材料上に配置された１つ以上の層に存在する、前記膜活性剤は封入材料内に封入される、前記膜活性剤はマトリックス材料内に分散される、あるいは前記膜活性剤はマトリックス材料にコンジュゲートされる、請求項８～１３のいずれか一項に記載の塞栓組成物。
【請求項15】
対象における前記塞栓組成物の移植時に、前記膜活性剤は、バースト放出プロファイル、持続放出プロファイル、またはバースト放出プロファイルおよび持続放出プロファイルの組み合わせで局所的に放出される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の塞栓組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、腫瘍治療のための方法および腫瘍治療に使用するための組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
がんなどの異常な生体組織の治療には、熱アブレーション、冷凍アブレーション、超音波アブレーション、化学アブレーション、ＲＦ電気アブレーションおよび不可逆的エレクトロポレーションを含む様々なモダリティが使用されている。
【0003】
生物学的組織の破壊への新しい異なるアプローチが望まれている。本開示は、不可逆的エレクトロポレーションを使用した組織破壊のための新規な組成物および組み合わせアプローチを記載する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
いくつかの態様において、本発明は、（ａ）膜活性剤（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が組織体積（ｔｉｓｓｕｅ ｖｏｌｕｍｅ）に局所的に放出されるように、放出可能な膜活性剤を含む移植可能な組成物を標的部位に投与することと、（ｂ）組織体積へのパルス電界（ｐｕｌｓｅｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ）の印加によって組織体積の治療を実施することと、を含む組織体積の治療方法を開示している。例えば、不可逆的エレクトロポレーション、可逆的エレクトロポレーションおよび／または熱処理は、パルス電界の印加によって実施されてもよい。
【0005】
本明細書で使用する場合、「膜活性剤」は、カチオン性または両親媒性またはアニオン性分子などの細胞膜の構造および動力学に影響を与える薬剤または分子として定義される。カチオン性分子は、電荷－電荷引力を介して細胞膜に結合する。両親媒性分子は、荷電している官能基を介して細胞膜に結合し、疎水性相互作用を介して細胞膜の脂質に結合する。アニオン性分子は、プロトン化されると疎水性になり、細胞膜脂質と相互作用する可能性がある。本明細書で使用する「膜溶解剤（ｍｅｍｂｒａｎｏｌｙｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」は膜活性剤のサブセットであり、膜の完全性を破壊する薬剤または分子を意味する。膜活性剤は、十分に高い濃度で存在すると、しばしば膜溶解剤となる。
【0006】
いくつかの実施形態において、組織体積は、腫瘍および／または（血管系を介してマージンを形成するための）腫瘍を囲む健康な組織の全てまたは一部に相当する。腫瘍の例としては、膵臓、乳房、肺、前立腺、肝臓、腎臓、脳、子宮、卵巣、胃、十二指腸または皮膚の腫瘍が挙げられる。
【0007】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、移植可能な組成物は、放出可能な膜活性剤を含む塞栓組成物であり、塞栓組成物は、組織体積に血液を供給する１つまたは複数の血管に投与され、または塞栓組成物は注射によって経皮的または内視鏡的に投与される。
【0008】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、移植可能な組成物は、体内への導入時に固体移植物となる液体組成物である。例えば、移植可能な組成物は、液体として投与され、活性化または体液との接触により固体に変化する粘弾性特性を有するゲルであってもよい。
【0009】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、投与された移植可能な組成物は、少なくとも部分的に生体安定性であるか、または生体吸収性である。
【0010】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、移植可能な組成物は、固体の移植可能な組成物である。
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、固体の移植可能な組成物は移植可能な粒子である。これらの実施形態のいくつかにおいて、粒子は、最大断面寸法が１０ｎｍ～１０ｍｍ（例えば、１０ｎｍから、１００ｎｍまで、１０００ｎｍまで、１０ミクロン（１０μｍ）まで、１００ミクロン（１００μｍ）まで、１０００ミクロン（１０００μｍ）まで、１０ｍｍまで）の範囲であってよい。
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、固体の移植可能な組成物は移植可能な粒子である。これらの実施形態のいくつかにおいて、粒子は、最大断面寸法が１０ｎｍ～１０ｍｍ（例えば、１０ｎｍから、１００ｎｍまで、１０００ｎｍまで、１０ミクロン（１０μｍ）まで、１００ミクロン（１００μｍ）まで、１０００ミクロン（１０００μｍ）まで、１０ｍｍまで）の範囲であってよい。
【0011】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、固体の塞栓組成物は足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）であってよい。足場の例としては、例えば、ディスク、ロッド、ステント、コイル、基準マーカ（ｆｉｄｕｃｉａｌ ｍａｒｋｅｒ）、プレート、チューブ、または半透過性織物メッシュが挙げられる。
【0012】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、膜活性剤は、固体の移植可能な組成物の全体に存在するか、または膜活性剤は、固体の移植可能な組成物の一部のみに存在する。
【0013】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、膜活性剤は固体の移植可能な組成物の表面に存在するが固体の移植可能な組成物の大部分（ａ ｂｕｌｋ ｏｆ）には存在しない、または膜活性剤は固体の移植可能な組成物の大部分に存在するが固体の移植可能な組成物の表面には存在しない、または膜活性剤は固体の移植可能な組成物に均質に存在する、または膜活性剤は濃度勾配にて固体の移植可能な組成物に存在する。
【0014】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、膜活性剤は、下層の（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ）基材材料上に配置された１つ以上の層中に存在するか、膜活性剤は封入材料内に封入されているか、または膜活性剤はマトリックス材料中に分散している。
【0015】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、膜活性剤は、塞栓ビーズ上にコーティングされるか、塞栓ビーズに注入されるか、または共有結合を介して塞栓ビーズにコンジュゲートされている。
【0016】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、膜活性剤は、カチオン性分子、両親媒性分子およびアニオン性分子から選択される。例えば、膜活性剤は、カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマーおよび両親媒性ポリマーから選択され得る。
【0017】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、膜活性剤は、バースト放出プロファイルで組織体積に局所的に放出されてもよく、膜活性剤は、持続放出プロファイルで組織体積に局所的に放出されてもよく、または膜活性剤は、バースト放出プロファイルと持続放出プロファイルの組み合わせで、組織体積に局所的に放出されてもよい。
【0018】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、膜活性剤の放出は、電気パルス、超音波、磁場変動、または熱入力（ｔｈｅｒｍａｌ ｉｎｐｕｔｓ）によってトリガされる。
【0019】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、治療は、移植可能な組成物の投与と同じ手順（ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）で実施される。
【0020】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、治療は、移植可能な組成物の投与に続く手順で実施される。
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、治療は、移植可能な組成物の投与後、同日、翌日、または２日目から、１週間まで、２週間まで、３０日までの範囲の時間において、手順にて実施される。
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、治療は、移植可能な組成物の投与後、同日、翌日、または２日目から、１週間まで、２週間まで、３０日までの範囲の時間において、手順にて実施される。
【0021】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、治療のための１つ以上の電極が、組織体積内または組織体積に隣接して配置される。
【0022】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、（ａ）１つまたは複数の治療用の電極が、皮膚上の１つまたは複数の位置で組織体積に隣接して配置される、（ｂ）１つまたは複数の治療用の電極が、組織体積内または組織体積に隣接して経皮的に配置される、（ｃ）治療用の電極が、１つまたは複数の天然の（ｎａｔｕｒａｌ）体管腔に挿入するデバイスを介して組織体積内または組織体積に隣接して配置される、あるいは（ｄ）前述の配置技術のいずれか２つまたは３つ全てを組み合わせたもの。
【0023】
本開示の他の態様は、放出可能な膜活性剤を含む塞栓組成物に関する。
これらの実施形態のいくつかにおいて、塞栓組成物は固体塞栓組成物である。
これらの実施形態のいくつかにおいて、塞栓組成物は、体内への導入時に固体塞栓組成物となる液体組成物である。例えば、塞栓組成物は、液体として投与され、活性化または体液の接触により固体に変化する粘弾性特性を有するゲルであってもよい。
これらの実施形態のいくつかにおいて、塞栓組成物は固体塞栓組成物である。
これらの実施形態のいくつかにおいて、塞栓組成物は、体内への導入時に固体塞栓組成物となる液体組成物である。例えば、塞栓組成物は、液体として投与され、活性化または体液の接触により固体に変化する粘弾性特性を有するゲルであってもよい。
【0024】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、固体塞栓組成物は、少なくとも部分的に生体安定性であるか、または生体吸収性である。
【0025】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、固体塞栓組成物は、移植可能な粒子である。これらの実施形態のいくつかにおいて、粒子は、最大断面寸法が１０ｎｍ～１０ｍｍの範囲であってよい。
【0026】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、固体塞栓組成物は足場である。
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、膜活性剤は固体塞栓組成物の全体に存在するか、または膜活性剤は固体塞栓組成物の一部のみに存在する。
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、膜活性剤は固体塞栓組成物の全体に存在するか、または膜活性剤は固体塞栓組成物の一部のみに存在する。
【0027】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、膜活性剤は固体塞栓組成物の表面に存在するが固体塞栓組成物の大部分には存在しない、膜活性剤は固体塞栓組成物の大部分に存在するが固体塞栓組成物の表面には存在しない、膜活性剤は固体塞栓組成物中に均質に存在する、または膜活性剤は固体塞栓組成物中に濃度勾配を有して存在する。
【0028】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、膜活性剤は下層の基材材料上に配置された１つ以上の層中に存在するか、膜活性剤は封入材料内に封入されているか、膜活性剤はマトリックス材料内に分散されているか、または膜活性剤はマトリックス材料にコンジュゲートされている。
【0029】
上記の態様および実施形態のいずれかと組み合わせて使用され得るいくつかの実施形態において、膜活性剤は、カチオン性分子、両親媒性分子およびアニオン性分子から選択される。例えば、膜活性剤は、カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマーおよび両親媒性ポリマーから選択され得る。
【0030】
上記の態様および実施形態のいずれかと併せて使用され得るいくつかの実施形態において、対象における塞栓組成物の移植時に、膜活性剤は、バースト放出プロファイル、持続放出プロファイル、またはバースト放出プロファイルおよび持続放出プロファイルの組み合わせで局所的に放出される。
【0031】
本開示のさらなる態様および実施形態は、後に続く詳細な説明を検討すれば、当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】図１Ａ～１Ｄは、蛍光標識されたＰＡＨＭでコーティングされたマイクロスフェアを示す。（図１Ａ）異なる量のＰＡＨＭ（μｇ ＰＡＨＭ／ｍｇ ＰＭＭＡ）でコーティングされたマイクロスフェアの代表的な蛍光顕微鏡画像。（図１Ｂ）個々のマイクロスフェア上のＰＡＨＭコーティングの蛍光強度。（図１Ｃ）異なる方法によりＰＡＨＭでコーティングされたマイクロスフェアの代表的な蛍光顕微鏡画像。（図１Ｄ）異なる方法によるコーティング後の個々のマイクロスフェア上のＰＡＨＭの蛍光強度。データは平均＋／－ＳＤ（Ａ）（ｎ＝１６－６３）（Ｂ）（ｎ＝１６５－１８６）として示されている。テューキーＨＳＤ検定を用いた分散分析（ＡＮＯＶＡ）（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図3】図３は、３７℃の細胞培養培地中のコーティングされたマイクロスフェアからのＰＡＨＭの放出動力学を示す。データは平均＋／－ＳＤ（ｎ＝４）として示され、２相指数関連モデル（ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ）に適合している。
【図4】図４Ａ～４Ｂは、別々に適用されたＩＲＥ（図４Ａ）またはＰＡＨＭ（図４Ｂ）処理後の細胞生存率を示す。データは平均＋／－ＳＤ（図４Ａ）（ｎ＝４－６）（図４Ｂ）（ｎ＝９－１３）として示されている。テューキーＨＳＤ検定を用いた分散分析（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図5】図５Ａ～５Ｆは、１５分間（図５Ａ）、４時間（図５Ｂ）、２４時間（図５Ｃ）のＰＡＨＭ曝露と組み合わせたＩＲＥ処理後の細胞生存率を示す。データは平均＋／－ＳＤ（ｎ＝３－１２）として示されている。テューキーＨＳＤ検定を用いた分散分析（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（図５Ｄ）組み合わせインデックス分析（ＣＩ＜１、＝０．９－１（破線）、＞１はそれぞれ、相乗作用、相加作用に近い作用、拮抗作用を示す）。ＩＲＥ（図５Ｅ）およびＰＡＨＭ（図５Ｆ）についての用量（Ｄｏｓｅ）減少指数分析（ＤＲＩ＜１、＝１（破線）、＞１は、好ましくない用量減少、用量減少なし、好ましい用量減少をそれぞれ示す）。
【図6】図６Ａ～６Ｂは、平均直径が７１μｍ（図６Ａ）、１００μｍ（図６Ｂ）のコーティングされたマイクロスフェアから放出されたＰＡＨＭへの曝露後の細胞生存率を示す。データは平均＋／－ＳＤ（ｎ＝６－１２）として示されている、テューキーＨＳＤ検定を用いた分散分析（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図8】図８Ａ～８Ｆは、コーティングされたマイクロスフェアから放出されたＰＡＨＭへの曝露と組み合わせたＩＲＥ処理後の細胞生存率を示す：（図８Ａ）１５分間（図８Ｂ）４時間（図８Ｃ）２４時間。データは平均＋／－ＳＤ（ｎ＝３－９）として示されている。テューキーＨＳＤ検定を用いた分散分析（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（図８Ｄ）組み合わせインデックス分析（ＣＩ＜１、＝０．９－１（破線）、＞１はそれぞれ、相乗作用、相加作用に近い作用、拮抗作用を示す）。ＩＲＥ（図８Ｅ）およびマイクロスフェアコーティングＰＡＨＭ（図８Ｆ）についての用量減少指数分析（ＤＲＩ＜１、＝１（破線）、＞１は、好ましくない用量減少、用量減少なし、好ましい用量減少をそれぞれ示す）。
【発明を実施するための形態】
【0033】
エレクトロポレーションは、生体細胞が細胞膜の孔を開くことによって電界に応答する現象である。低電界強度では細胞膜に孔は形成されない。エレクトロポレーション閾値を超えると、孔が可逆的に形成され始める。可逆的エレクトロポレーションは、そうでなければ細胞膜を通過することができない物質を生物細胞に導入するために長い間使用されてきた。例えば、化学療法で使用される遺伝物質または大きな分子を細胞の内部に導入することができる。電界を除去した後、誘導された孔は「過渡的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）」または「可逆的」エレクトロポレーションで閉じる。
【0034】
比較的高い振幅のエレクトロポレーション線量（ｄｏｓｅｓ）では、印加された電界に応答して形成される孔は、細胞膜が回復できないほど広範囲になることがある。細胞膜が回復しなければ、細胞は「不可逆的な」エレクトロポレーションとして知られているこのエレクトロポレーションのために死に至る。不可逆的エレクトロポレーションの閾値（ＩＲＥ）は、細胞の大きさおよび形状、全体的な組織構造、および細胞間液の特徴によって変化する。閾値自体は、局所的な電界強度および持続時間によって定義することができ、例えば、より短い持続時間ではより高い振幅電圧が必要であり、より長い持続時間ではより低い振幅電圧が必要である。
【0035】
本開示において、組織体積を治療する方法は、（ａ）膜活性剤が組織体積に局所的に放出されるように、放出可能な膜活性剤を含む移植可能な組成物を標的部位に投与する工程と、（ｂ）組織体積に対してＩＲＥを実施する工程とを含むことが記載されている。
【0036】
本開示に従うエレクトロポレーション治療の間、電圧が、治療される組織体積の内部または隣接して配置される２つ以上の電極にわたって印加され、それによって、組織体積内に電界が形成される。ＩＲＥで調整できるパラメータには、電圧の大きさ、電圧の持続時間（パルス長）、パルスの数、電極の数、電極の間隔が含まれる。
【0037】
本開示に従う不可逆的エレクトロポレーション治療が適用され得る組織体積は、良性および悪性の腫瘍体積、ならびに境界付けられた腫瘍体積を構成する生存可能に機能する細胞を含む灌流された、または健康な組織体積を含む。腫瘍体積の例としては、膵臓腫瘍、食道腫瘍、膀胱腫瘍、胆管腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、脳腫瘍、子宮筋腫を含む子宮腫瘍、卵巣腫瘍、後腹膜腫瘍、四肢腫瘍、骨盤腫瘍、ならびに神経内分泌腫瘍または前癌性過形成性細胞クラスターまたは新生物構造に存在するものが挙げられる。
【0038】
広範囲の不可逆的エレクトロポレーション設定を、本開示の不可逆的エレクトロポレーション治療と組み合わせて使用することができ、これには、２５０～２５００Ｖ／ｃｍ、より典型的には３７５～１７５０Ｖ／ｃｍの範囲の電界強度、１～５０００の範囲のパルス数、より典型的には５～３００の範囲のパルス数、０．５～１０００μｓの範囲のパルス幅、より典型的には１～２５０μｓの範囲のパルス幅、０．２５～１０Ｈｚの範囲のパルス周波数、および０．１～２ｃｍの範囲の電極間隔を提供する電圧が含まれる。電極は、複数の電極の組み合わせまたはプローブにわたって、モノポーラ・モード、バイポーラ・モードまたは多重化構成で操作され得る。
【0039】
電極は、（ａ）皮膚の１つまたは複数の位置への１つまたは複数の電極の配置（戻り電極配置を含む）、（ｂ）１つまたは複数の組織の位置への１つまたは複数の電極の経皮的配置、（ｃ）１つまたは複数の天然の体管腔（例えば、血管、消化管、胆管、リンパ管、尿路、肺気道、尿道腔、膀胱、または他の体管腔）内へのまたは同体管腔に隣接した１つまたは複数の電極の配置、または（ｄ）これらの配置技術のうちの任意の２つまたは３つすべての組み合わせを含む、様々な方法を使用して、不可逆的エレクトロポレーションによって処理されるべき組織体積内にまたは同組織体積に隣接して配置されてもよい。
【0040】
１つ以上の電極を天然の体管腔内にまたは同体管腔に隣接して配置することに関して、カテーテル、内視鏡、気管支鏡、十二指腸鏡、または同様の最小侵襲性、単回使用または再使用可能な直接可視化プローブなどのデバイスを体管腔に進めてもよく、その場合、１つ以上の電極をデバイス上に配置して内腔壁と接触させてもよく、または１つ以上の電極をデバイスから挿入して、デバイスに近接する内腔壁を通して、内腔壁を取り囲む組織内に挿入してもよい。
【0041】
既に明記したように、本開示において、組織体積を治療する方法は、（ａ）膜活性剤が組織体積に局所的に放出されるように、放出可能な膜活性剤を含む移植可能な組成物を標的部位に投与する工程と、（ｂ）組織体積に対してＩＲＥを実施する工程とを含むことが記載されている。この点に関して、膜活性剤は、所与の電界強度で死滅される細胞の数を増加させ、および／または所与の数の細胞を死滅させるのに必要な電界強度を減少させるために使用され得る。
【0042】
膜活性剤放出移植可能組成物は、少なくとも部分的に生体安定性である膜活性剤放出移植可能組成物、および生体吸収性である膜活性剤放出移植可能組成物から選択され得る。
いくつかの実施形態において、膜活性剤放出移植可能組成物は、膜活性剤を含む塞栓組成物であり得、塞栓組成物は、組織体積に血液を供給する１つ以上の血管に投与されてもよく、それによって塞栓／閉塞を形成し得る。このようにして、本開示の方法は、膜活性剤増強ＩＲＥによって細胞を死滅させることに加えて、細胞の血液供給を遮断することによって細胞を死滅させることができる。
いくつかの実施形態において、膜活性剤放出移植可能組成物は、膜活性剤を含む塞栓組成物であり得、塞栓組成物は、組織体積に血液を供給する１つ以上の血管に投与されてもよく、それによって塞栓／閉塞を形成し得る。このようにして、本開示の方法は、膜活性剤増強ＩＲＥによって細胞を死滅させることに加えて、細胞の血液供給を遮断することによって細胞を死滅させることができる。
【0043】
膜活性剤の例には、カチオン性分子、両親媒性分子、およびアニオン性分子が含まれる。
膜活性カチオン分子は、第一級、第二級、第三級または第四級アミン基を有する天然および合成のカチオン性ポリマーから選択することができる。
膜活性カチオン分子は、第一級、第二級、第三級または第四級アミン基を有する天然および合成のカチオン性ポリマーから選択することができる。
【0044】
天然カチオンポリマーとしては、カチオン性ポリペプチド（ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチンなど）、カチオン性ポリアミン（スペルミジン、スペルミンおよびそれらの誘導体など）、カチオン性多糖類（キトサン、カチオン性ゼラチンなど）、リジンおよびアルギニンを含むカチオン性アミノ酸に富むカチオン性ペプチド（セクロピンＡ、マガイニン、ダーマセプチン、ボンビニン、メリチン、カテリシジン、ヒトディフェンシン、ラクトフェリシン、ヒスタチン、インドリシジン、トリトリプチシン、ホロトリシン、コレオプテリシン、ピルホコリシンなど）、が挙げられる。
【0045】
合成カチオン性ポリマーは、第一級、第二級、第三級または第四級アミン基を含有するポリマーである。これらのポリマーは、直鎖状、ブロック状、グラフト状、分枝状、樹枝状およびネットワーク状の構造の分子セグメントを含むことができる。これらのカチオン性ポリマーは、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアミド、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリ（ベータ－アミノエステル）、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリアミドアミン、ポリノルボルネン、およびそれらのコポリマーのクラスから選択することができる。これらは、フリーラジカル重合、開環重合、重付加および重縮合反応によって合成することができる。合成カチオン性ポリマーはまた、細胞膜に結合することができる非天然配列を有するカチオン性ペプチドを含む。このようなカチオン性ペプチドはリシンおよびアルギニンに富み、この分野でよく知られている固相法を用いて合成することができる。
【0046】
膜溶解性両親媒性分子は、疎水基および、例えば、飽和および不飽和Ｃ－Ｃ結合を含有する直鎖状、分枝状、環状、芳香族炭化水素のような構造で修飾された上記の天然および合成カチオン性ポリマーを含む。膜活性両親媒性分子はまた、疎水性アミノ酸（アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、フェノアラニン、チロシン、トリプトファンなど）または疎水性構造（ヒドロカルボーン（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｅ）など）を含有する前記カチオン性ペプチドを含む。
【0047】
膜活性アニオン性分子には、特定のカルボン酸含有合成ポリマー（ポリアルキルアクリル酸など）およびペプチド（“ＧＡＬＡ”：ＷＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＨＬＡＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡなど）が含まれる。これらのポリマーおよびペプチドは酸性ｐＨでプロトン化され、疎水性になり、細胞脂質膜との相互作用を促進するコンホメーションをとる。
【0048】
膜溶解剤は、細胞膜破壊を引き起こす特別な膜活性剤である。例としては、アミノ－Ｃ２～Ｃ１０アルキルアクリレートなどのアミノアルキルアクリレート、アミノ－Ｃ２～Ｃ１０アルキルメタクリレートなどのアミノアルキルメタクリレート、およびアミノアルキルアクリレートとアルキルアクリレートとのコポリマー、およびアミノアルキルメタクリレートとアルキルメタクリレートとのコポリマーが挙げられる。膜溶解性アミノアルキルメタクリレートの例としては、ポリ（６－アミノヘキシルメタクリレート）（ＰＡＨＭ）、ポリ（アミノエチル－コ－ブチルメタクリレート）およびポリ（２－ヘキサメチレンイミノ）エチルメタクリレートが挙げられる。
【0049】
種々の実施形態において、膜活性剤放出移植可能組成物は、体内に導入されると固体膜活性剤放出移植物となる液体組成物であり得る（例えば、組成物は、液体塞栓組成物の形態であってもよい）。
【0050】
種々の実施形態において、膜活性剤放出移植可能組成物は固体組成物であってもよい。膜活性剤は、固体組成物全体または固体組成物の一部のみに位置し得る。例えば、膜活性剤は、下層の基材材料上の１つ以上の層に存在してもよく（例えば、層は、完全に膜活性剤から形成されてもよく、または膜活性剤が放出される１つ以上のさらなる生体吸収性または生体安定性マトリックス材料と混合されてもよい）、膜活性剤は、封入材料（例えば、生体吸収性封入材料または膜活性剤に透過性である生体安定性封入材料）内に封入されてもよく、膜活性剤は、基材材料内に（例えば、基材材料の膜活性剤を既に存在する基材材料に浸漬することによって、基材を膜活性剤を含むマトリックスとして形成することによって、など）分散されてもよく、膜活性剤は、膜活性剤が放出される共有結合（アミド、エステル、エーテル、チオールエステル、ジチオール、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を介して１つ以上の固体組成物に結合されてもよく、膜活性剤は、膜活性剤が放出される非共有結合（ビオチン－アビジン、金属キレート、電荷－電荷静電相互作用、ポリエチレングリコール／シクロデキストリン、アダマンタン／シクロデキストリンなどのホスト－ゲスト複合体）を介して１つ以上の固体組成物に結合されてもよく、あるいは膜活性剤から完全に固体組成物を形成することによる。
【0051】
したがって、膜活性剤に加えて、本開示の移植可能な組成物は、基材材料、マトリックス材料、および生体吸収性および／または生体安定性であり得る封入材料を含み得る。生体吸収性および／または生体安定性材料の例には、生体吸収性および／または生体安定性ポリマー、生体吸収性および／または生体安定性金属および金属合金、ならびに生体吸収性および／または生体安定性セラミックおよびガラス材料が含まれる。
【0052】
本明細書で使用するための生体吸収性および生体安定性ポリマー、ならびにポリマー膜活性剤には、ホモポリマーおよびコポリマーが含まれる。本明細書で使用される場合、「ホモポリマー」は、単一の構成単位の複数のコピーを含むポリマーである。「コポリマー」は、少なくとも２つの異なる構成単位の複数のコピーを含むポリマーであり、その例には、ランダム、統計的、勾配、周期的（例えば、交互）およびブロック（例えば、ジブロック、トリブロックなど）コポリマーが含まれる。本開示で使用するためのポリマーは、直鎖状または分枝状であり得る。分枝配置には、星形配置（例えば、１つの分岐点から３つ以上の鎖が出ている構成）、櫛状配置（例えば、主鎖と複数の側鎖とを有する構成）、樹枝状配置（例えば、樹枝状および超分枝状ポリマー）など、が含まれる。
【0053】
生体吸収性ポリマーおよび生体安定性ポリマーの具体例は、例えば、以下のものから選択することができる：ポリアクリル酸を含むポリカルボン酸ホモポリマーおよびコポリマー、ポリ（メチルメタクリレート－ｂ－ｎ－ブチルアクリレート－ｂ－メチルメタクリレート）およびポリ（スチレン－ｂ－ｎ－ブチルアクリレート－ｂ－スチレン）トリブロックコポリマーを含むアルキルアクリレートおよびアルキルメタクリレートホモポリマーおよびコポリマー、ナイロン６，６、ナイロン１２を含むポリアミド、ポリエーテル－ブロック－ポリアミドコポリマー（例えば、Ｐｅｂａｘ（登録商標）樹脂）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ塩化ビニルなどのポリビニルハライド、エチレン－酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡ）などのビニルホモポリマーおよびコポリマー、ポリスチレン、スチレン－無水マレイン酸コポリマーなどのビニル芳香族ホモポリマーおよびコポリマー、スチレン－ブタジエンコポリマー、スチレン－エチレン－ブチレンコポリマー（例えば、Ｋｒａｔｏｎ（登録商標）Ｇシリーズポリマーとして入手可能なポリ（スチレン－ｂ－エチレン／ブチレン－ｂ－スチレン（ＳＥＢＳ））コポリマー）、スチレン－イソプレンコポリマー（例えば、ポリ（スチレン－ｂ－イソプレン－ｂ－スチレン）、アクリロニトリル－スチレンコポリマー、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレンコポリマー、スチレン－ブタジエンコポリマーおよびスチレン－イソブチレンコポリマー（例えば、ポリイソブチレン－ポリスチレンブロックコポリマー、例えばポリ（スチレン－ｂ－イソブチレン－ｂ－スチレン）またはＳＩＢＳ、これは、例えばＰｉｎｃｈｕｋらの米国特許第６，５４５，０９７号明細書に記載されている）を含むビニル芳香族アルケンコポリマー、アイオノマー、ポリエチレンテレフタレートおよびラクチド（ｄ－，ｌ－およびメソ－ラクチドを含む）（ポリ（Ｌ－ラクチド）およびポリ（ｄ，ｌ－ラクチド））のホモポリマーおよびコポリマーなどの脂肪族ポリエステルを含むポリエステル、グリコリド（グリコール酸）、およびε－カプロラクトン、ポリ（ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）およびポリ（ｄ，ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）のようなポリラクチドコ－グリコリドを含む、トリメチレンカーボネート（およびそのアルキル誘導体）を含むポリカーボネート、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）およびポリエーテルエーテルケトンなどのポリアルキレンオキシドポリマーを含むポリエーテルホモポリマーおよびコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン（ポリブタ－１－エンおよびポリイソブチレンなど）などのポリアルキレンを含むポリオレフィンホモポリマーおよびコポリマー、ポリオレフィンエラストマー（例えば、サントプレン）およびエチレンプロピレンジエンモノマー（ＥＰＤＭ）ゴム、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリ（テトラフルオロエチレン－コ－ヘキサフルオロプロペン）（ＦＥＰ）、変性エチレン－テトラフルオロエチレンコポリマー（ＥＴＦＥ）およびポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を含むフッ化ホモポリマーおよびコポリマー、ポリジメチルシロキサンを含むシリコーンのホモポリマーおよびコポリマー、ポリウレタン、ポリペプチド、タンパク質、多糖類、フィブリン、フィブリノーゲン、コラーゲン、エラスチン、キトサン、ゼラチン、デンプン、ヒアルロン酸などのグリコサミノグリカンなどのバイオポリマー、ならびに上記のブレンドおよびさらなるコポリマー。
【0054】
本開示で使用するための生体安定性ポリマーの例はまた、例えば、フッ素化オレフィンモノマーを含むオレフィンモノマー、アクリレートモノマー、メタクリレートモノマー、ビニルモノマー、ジアルキルシロキサンモノマーおよびそれらの組み合わせの１つ以上を含有するホモポリマーおよびコポリマー、ならびにポリウレタン、ポリウレア、ナイロンを含むポリアミド、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリ（エーテルケトン）（ＰＥＥＫ）およびポリ（アリーレンエーテルケトン）ＰＡＥＫなどの種々の他のポリマー、から選択され得る。
【0055】
本開示で使用するための生体吸収性ポリマーの例はまた、生分解性ポリエステルホモポリマーおよびコポリマー、ポリ（オルトエステル）ホモポリマーおよびコポリマー、ポリ無水物ホモポリマーおよびコポリマー、チロシン系ポリマーを含むアミノ酸系ホモポリマーおよびコポリマー、ならびにポリエチレングリコールホモポリマーおよびコポリマーから選択され得る。
【0056】
膜活性剤は、拡散、溶解、生分解、加水分解（共有結合を介する）などの任意の種類の化学反応を含む、または結合の酵素的開裂、イオン化および脱イオン化、あるいは上記のいずれかの組み合わせによって、移植可能な組成物から放出され得る。
【0057】
膜活性剤は、バースト放出プロファイル（例えば、０～６時間の期間内）、持続放出プロファイル（例えば、６時間～３ヶ月の範囲の期間にわたって）、脈動放出（ｐｕｌｓａｔｉｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ）プロファイル、二相性または多相性放出プロファイル、または前述の組み合わせで移植可能な組成物から放出され得る。
【0058】
膜活性剤は、トリガ可能な放出機構を介して、例えば、電気パルス（例えば、対応する相転移の有無にかかわらず、移植可能な組成物を加熱し、電気移動によって移植可能な組成物から膜活性剤を駆動するため、など）、超音波（例えば、移植可能な組成物を加熱するためまたは膜活性剤を含むカプセルを破裂させてそれにより膜活性剤を放出させるため、など）、磁場変動（例えば、磁性粒子が移植可能な組成物中に提供され、例えば、移植可能な組成物を加熱することによって、膜活性剤を含むカプセルを破裂させることによって、膜活性剤を放出するために振動させ得る）、化学物質の注入（例えば、酸または塩基、低張力塩または高張力塩を注入し、膜活性剤と移植用組成物の間の結合を破壊して膜活性剤の放出を引き起こす、など）、熱励起による拡散速度または膜輸送の変化、化学結合の弱化および放出の変更、または上記の組み合わせ、の結果として、移植可能な組成物から放出され得る。
【0059】
膜活性剤放出移植可能組成物は、例えば、膜活性剤放出粒子の形態であってもよい。そのような粒子は、球状および細長い形状を含む様々な形状になり得る。そのような粒子は、最大断面寸法（例えば、球体における直径）が１０ｎｍ～１０ｍｍの範囲であってもよい。
【0060】
膜活性剤放出移植可能組成物は、例えば、膜活性剤放出足場の形態であってもよい。そのような足場は、ディスク、ロッド、ステント、コイル、基準マーカ、織物メッシュおよびチューブなどの様々な形態であってもよい。このような足場は、０．１ｎｍ～１ｍｍの範囲の孔を含んでいてもよいし、全く多孔性でなくてもよい。
【0061】
膜活性剤放出移植可能組成物は、移植可能な組成物の経皮的配置、１つ以上の天然の体管腔（例えば、血流を塞ぐための遠位毛細血管または過血管病変を含む血管、胃腸管、胆管、リンパ管、尿路、または他の体管腔）内または同体管腔に隣接した移植可能な組成物の配置、あるいはそれらの組み合わせを含む任意の適切な移植方法を用いて標的組織に移植され得る。天然の体管腔内または同体管腔に隣接する１つ以上の移植可能な組成物の配置は、カテーテル、内視鏡、マイクロカテーテル、針、または体管腔を開いた状態に維持する他の柔軟なプローブなどのデバイスを使用して実施され得る。
【0062】
既に明記したように、本開示の様々な態様において、組織体積を治療する方法であって、（ａ）膜活性剤が組織体積に局所的に放出されるように、膜活性剤放出移植可能組成物を標的部位に投与することと、（ｂ）組織体積にＩＲＥを実施することと、を含む方法が記載されている。
【0063】
いくつかの実施形態において、同じ手順で、移植可能な組成物を標的部位に投与し、かつ組織体積に対してＩＲＥを実施することができる。例えば、移植可能な組成物は標的部位に投与されてもよく、移植可能な組成物から組織体積へのバースト放出が生じるのに十分な時間（例えば、３０秒～１８０分の範囲）を与えた後に、ＩＲＥが組織体積に実施されてもよい。
【0064】
いくつかの実施形態において、ＩＲＥは、移植可能な組成物が標的部位に投与される手順に続く１つ以上の手順において、組織体積に対して実施されてもよい。例えば（例えば、移植可能な組成物が徐放性組成物である場合）、１つ以上の後続の手順は、移植可能な組成物を標的部位に投与してから０．１日～６週間の範囲の時点において実施されてもよい。
【0065】
上記から分かるように、本開示の組成物および方法の利点は、所望とされる膜活性剤放出のための本質的に任意の時間経過および所望とされる本質的に任意のＩＲＥスケジュールを確立でき、これは腫瘍生物学に基づいて調整できるという点にある。
【実施例】
【0066】
材料。ロズウェル・パーク・メモリアル研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＲＰＭＩ）１６４０培地、牛胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ；１０，０００μｇ／ｍＬ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）（ＭＴＴ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール（２００プルーフ（ｐｒｏｏｆ））、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒはサーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州、Ｗａｌｔｈａｍ）より購入した。塩酸ヒドロキシラミンおよびＰＤ－１０脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ－２５媒体；排除限界：Ｍｒ５０００）はミリポア・シグマ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、米国マサチューセッツ州、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）から購入した。エレクトロポレーションキュベット（４ｍｍギャップ）は、ハーバード・アパレイタス（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、米国マサチューセッツ州、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ）から得た。ＵＶ透明キュベット（セミマイクロ、１．５ｍＬ）は、ＵＳＡサイエンティフィック（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国フロリダ州、Ｏｃａｌａ）から購入した。
【0067】
薬物相乗効果のＣＯＭＰＵＳＹＮモデリング。各治療組み合わせの組み合わせ指数（ＣＩ）および用量減少指数（ｄｏｓｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）（ＤＲＩ）を、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェアプログラム（コンボシン（ＣｏｍｂｏＳｙｎ）社、米国ニュージャージー州、Ｐａｒａｍｕｓ）を用いてＣｈｏｕ－Ｔａｌａｌａｙ法により算出した（Ｃｈｏｕ，Ｔ．－Ｃ．、「Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ ａｎｄ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ（薬物併用試験における相乗作用と拮抗作用の理論的根拠、実験計画、およびコンピュータによるシミュレーション）」、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．、５８、６２１－６８１（２００６））。ＣＩ値は薬物相互作用を無次元で数値化したもので、ＣＩ＝１は相加作用、ＣＩ＜１は相乗作用、ＣＩ＞１は拮抗作用を示す。ＤＲＩは、あるＦａで併用した場合、各薬剤の投与量を各薬剤単独で投与した場合と比較してどれだけ減らすことができるかを示す指標で、ＤＲＩ＝１は投与量の減少なし、ＤＲＩ＞１は好ましい投与量の減少、ＤＲＩ＜１は好ましくない投与量の減少を意味する。
【0068】
統計解析。分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキー（Ｔｕｋｅｙ）ＨＳＤ検定による多重比較により、異なる処理群間の細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の差の有意性を判定した。分散分析およびテューキーＨＳＤ検定による多重比較により、コーティングされたマイクロスフェアのＰＡＨＭの蛍光強度の差の有意性を判定した。ＰＡＨＭ放出プロファイルは、２相の指数関数関連モデルで適合させた。すべての分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ、バージョン９．０．０（グラフパッド・ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ）社、米国カリフォルニア州、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用いて行った。
【0069】
実施例１：ポリ（６－アミノヘキシルメタクリレート）（ＰＡＨＭ）の合成
ポリ（６－アミノヘキシルメタクリレート）（ＰＡＨＭ）の次のように合成した：Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノヘキシルメタクリレート（ｔＢｏｃＡＨＭ）は、最初に、Ｚｈｕ，Ｃ．他、「Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｔｅｒｔｉａｒｙ ａｍｉｎｏ ｓｉｄｅ ｇｒｏｕｐｓ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｖｉａ ＲＡＦＴ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ＤＮＡ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（第１級および第３級アミノ基を側鎖に有するカチオン性メタクリレートコポリマー：ＲＡＦＴ重合による制御された合成、ＤＮＡ縮合、およびインビトロでの遺伝子導入）」、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ Ａ Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．、（２０１０）．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｏｌａ．２４０６４、に記載されているように合成した。次に、ＰＡＨＭを、Ｊｉ， Ｗ．他、「Ｐｏｌｙ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ） ｗｉｔｈ Ｗｅｌｌ－Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ（ポリ（２－アミノエチルメタクリレート）の鎖長制御による樹状細胞へのＤＮＡワクチン導入）」、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１２、４３７３－４３８５（２０１１）、によって報告された方法に基づいて、ｔＢｏｃＡＨＭの原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、続いてｔＢｏｃ側鎖の脱保護を経由して合成した。このポリマーを、Ｊｉ，Ｗ．の「Ｊｉ，Ｗ．、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｗｅｌｌ－ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ（ＤＮＡワクチン送達および癌治療のための明確な構造を有する合成ポリマー）」（ミネソタ大学博士論文、２０１３年１１月）に記載されているように、１Ｈ ＮＭＲおよびゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて特性決定した。ＰＡＨＭの数平均分子量（Ｍｎ）は２．０８×１０４、分散度（Ｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ）（Ｄ）は１．２６、平均重合度（ＤＰ）は１００であった。
ポリ（６－アミノヘキシルメタクリレート）（ＰＡＨＭ）の次のように合成した：Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノヘキシルメタクリレート（ｔＢｏｃＡＨＭ）は、最初に、Ｚｈｕ，Ｃ．他、「Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｔｅｒｔｉａｒｙ ａｍｉｎｏ ｓｉｄｅ ｇｒｏｕｐｓ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｖｉａ ＲＡＦＴ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ＤＮＡ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（第１級および第３級アミノ基を側鎖に有するカチオン性メタクリレートコポリマー：ＲＡＦＴ重合による制御された合成、ＤＮＡ縮合、およびインビトロでの遺伝子導入）」、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ Ａ Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．、（２０１０）．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｏｌａ．２４０６４、に記載されているように合成した。次に、ＰＡＨＭを、Ｊｉ， Ｗ．他、「Ｐｏｌｙ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ） ｗｉｔｈ Ｗｅｌｌ－Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ（ポリ（２－アミノエチルメタクリレート）の鎖長制御による樹状細胞へのＤＮＡワクチン導入）」、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１２、４３７３－４３８５（２０１１）、によって報告された方法に基づいて、ｔＢｏｃＡＨＭの原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、続いてｔＢｏｃ側鎖の脱保護を経由して合成した。このポリマーを、Ｊｉ，Ｗ．の「Ｊｉ，Ｗ．、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｗｅｌｌ－ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ（ＤＮＡワクチン送達および癌治療のための明確な構造を有する合成ポリマー）」（ミネソタ大学博士論文、２０１３年１１月）に記載されているように、１Ｈ ＮＭＲおよびゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて特性決定した。ＰＡＨＭの数平均分子量（Ｍｎ）は２．０８×１０４、分散度（Ｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ）（Ｄ）は１．２６、平均重合度（ＤＰ）は１００であった。
【0070】
実施例２：ビーズ形成（Ｂｅａｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）
加水分解されていないポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）ビーズ（直径９０～１０６μｍ）を、膜活性剤、具体的にはポリ（６－アミノヘキシルメタクリレート）（ＰＡＨＭ）、
加水分解されていないポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）ビーズ（直径９０～１０６μｍ）を、膜活性剤、具体的にはポリ（６－アミノヘキシルメタクリレート）（ＰＡＨＭ）、
【0071】
【化1】
【0072】
（式中、ｎは整数）で、さらに以下に詳述されるように、エタノール中のＰＡＨＭでビーズをインキュベートし、続いてエタノールを蒸発さることにより、でコーティングした。
【0073】
実施例３：ＰＡＨＭの蛍光標識
ＰＡＨＭは、製造業者のプロトコルに従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）（λｅｘ／λｅｍ：４９４／５１７ｎｍ；吸光係数＝７１，０００ｃｍ－１Ｍ－１）のＮＨＳエステルで蛍光標識した。理論上の標識度は供給比率に基づいて１％であり、標識効率は２５～３３％であった（製造業者あたり）。ＰＤ－１０脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ－２５媒体；排除限界：Ｍｒ５０００）（ミリポア・シグマ）を用いたゲル濾過によって未反応色素を除去した。精製した蛍光標識ＰＡＨＭ溶液を－８０℃で一晩凍結し、Ｍａｘｉｍａ（商標）Ｃ Ｐｌｕｓ真空ポンプ（Ｍ８ｃ型、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）を装備したＦｒｅｅＺｏｎｅ（登録商標）凍結乾燥システム（ラブコンコ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）、ミズーリ州カンザスシティ）中で０．０２０ｍＢａｒ（０．００２ｋＰａ）下で４日間凍結乾燥した。乾燥したポリマーは、使用するまで室温で（光から保護された）真空デシケータ内に保存した。
ＰＡＨＭは、製造業者のプロトコルに従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）（λｅｘ／λｅｍ：４９４／５１７ｎｍ；吸光係数＝７１，０００ｃｍ－１Ｍ－１）のＮＨＳエステルで蛍光標識した。理論上の標識度は供給比率に基づいて１％であり、標識効率は２５～３３％であった（製造業者あたり）。ＰＤ－１０脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ－２５媒体；排除限界：Ｍｒ５０００）（ミリポア・シグマ）を用いたゲル濾過によって未反応色素を除去した。精製した蛍光標識ＰＡＨＭ溶液を－８０℃で一晩凍結し、Ｍａｘｉｍａ（商標）Ｃ Ｐｌｕｓ真空ポンプ（Ｍ８ｃ型、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）を装備したＦｒｅｅＺｏｎｅ（登録商標）凍結乾燥システム（ラブコンコ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）、ミズーリ州カンザスシティ）中で０．０２０ｍＢａｒ（０．００２ｋＰａ）下で４日間凍結乾燥した。乾燥したポリマーは、使用するまで室温で（光から保護された）真空デシケータ内に保存した。
【0074】
実施例４：塞栓性マイクロスフェアをＰＡＨＭでコーティングする最適化方法
平均直径７１μｍまたは１００μｍのＰＭＭＡマイクロスフェアは、ボストン・サイエンティフィック・コーポレーション（Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（米国、ミネソタ州メイプルグローブ）によって提供された。ＰＭＭＡマイクロスフェアを溶媒蒸発法によりＰＡＨＭでコーティングした。蛍光標識したＰＡＨＭおよび非標識ＰＡＨＭ（標識：非標識比１：８）の混合物を、総濃度０．１ｍｇ／ｍＬまたは０．５ｍｇ／ｍＬでエタノール（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）に溶解した。ガラスバイアル中で、１ｍＬのＰＡＨＭ溶液を５０ｍｇのＰＭＭＡマイクロスフェア（直径１００μｍ）に添加した。バイアルは、エタノールを蒸発させるために、室温で３日間、オービタルシェーカー（ラブ－ライン・インスツルメンツ（Ｌａｂ－Ｌｉｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、米国イリノイ州Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｐａｒｋ）上に露出させた。供給比率に応じて、乾燥後、マイクロスフェアを２μｇ／ｍｇまたは１０μｇ／ｍｇ（μｇＰＡＨＭ／ｍｇＰＭＭＡ）の濃度のＰＡＨＭでコーティングした。コーティングされたマイクロスフェアを、使用するまで、真空デシケータ中、室温で（光から保護して）保存した。
平均直径７１μｍまたは１００μｍのＰＭＭＡマイクロスフェアは、ボストン・サイエンティフィック・コーポレーション（Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（米国、ミネソタ州メイプルグローブ）によって提供された。ＰＭＭＡマイクロスフェアを溶媒蒸発法によりＰＡＨＭでコーティングした。蛍光標識したＰＡＨＭおよび非標識ＰＡＨＭ（標識：非標識比１：８）の混合物を、総濃度０．１ｍｇ／ｍＬまたは０．５ｍｇ／ｍＬでエタノール（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）に溶解した。ガラスバイアル中で、１ｍＬのＰＡＨＭ溶液を５０ｍｇのＰＭＭＡマイクロスフェア（直径１００μｍ）に添加した。バイアルは、エタノールを蒸発させるために、室温で３日間、オービタルシェーカー（ラブ－ライン・インスツルメンツ（Ｌａｂ－Ｌｉｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、米国イリノイ州Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｐａｒｋ）上に露出させた。供給比率に応じて、乾燥後、マイクロスフェアを２μｇ／ｍｇまたは１０μｇ／ｍｇ（μｇＰＡＨＭ／ｍｇＰＭＭＡ）の濃度のＰＡＨＭでコーティングした。コーティングされたマイクロスフェアを、使用するまで、真空デシケータ中、室温で（光から保護して）保存した。
【0075】
コーティングプロセスを最適化かつ高速化するために、ＰＭＭＡマイクロスフェアを３つの異なる溶媒蒸発法を用いてＰＡＨＭでコーティングした。蛍光標識したＰＡＨＭおよび非標識ＰＡＨＭ（標識：非標識比１：８）の混合物を、総濃度０．８ｍｇ／ｍＬでエタノールに溶解した。０．５ｍＬのＰＡＨＭ溶液をガラスバイアル中の１００ｍｇのＰＭＭＡマイクロスフェア（直径１００μｍ）に添加した。コーティング方法１では、エタノールを上記のように蒸発させた（ゆっくり回転するオービタルシェーカー上で３日間）。コーティング方法２では、カバーされていないバイアルを、ゆっくりと回転するオービタルシェーカーの上の真空デシケータ内に１２時間置いた。コーティング方法３では、エタノールを圧縮空気で１０分間蒸発させた。コーティングされたマイクロスフェアを、使用するまで室温で（光から保護された）真空デシケータ中に保存した。
【0076】
ＰＡＨＭコーティングを可視化するために、コーティングしたマイクロスフェアの蛍光および明視野画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ（登録商標）ＤＰ７２カメラおよびＸ－Ｃｉｔｅ １２０広視野蛍光顕微鏡励起光源（エクセリタス・テクノロジーズ（Ｅｘｃｅｌｉｔａｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）を装備したＯｌｙｍｐｕｓ（登録商標）ＩＸ７０倒立蛍光顕微鏡を用いて取得した。蛍光標識ＰＡＨＭを４８０±５０ｎｍの励起波長と５３５±５０ｎｍの発光波長を用いて可視化した。個々のコーティングされたマイクロスフェアのＰＡＨＭの蛍光強度は、米国国立衛生研究所および光学計算機器研究所（ウィスコンシン大学ＬＯＣＩ校）で開発されたオープンソースのＪａｖａ（登録商標）ベース画像処理プログラムであるＩｍａｇｅＪを用いて定量化した。
【0077】
塞栓マイクロスフェア（直径１００μｍ）を溶媒蒸発法により蛍光標識ＰＡＨＭでコーティングした。代表的な蛍光顕微鏡写真（図１Ａ）は、１０μｇ／ｍｇ（μｇＰＡＨＭ／ｍｇＰＭＭＡ）でコーティングされたマイクロスフェアが２μｇ／ｍｇ（μｇＰＡＨＭ／ｍｇＰＭＭＡ）でコーティングされたマイクロスフェアよりも１０．５倍明るい蛍光を示したように、ＰＡＨＭの濃度の増加がより厚いコーティングをもたらすことを示す（図１Ｂ）。
【0078】
コーティングプロセスを最適化するために、塞栓性マイクロスフェア（直径１００μｍ）を、３つの異なる溶媒蒸発法により、４μｇ／ｍｇ（μｇＰＡＨＭ／ｍｇＰＭＭＡ）の蛍光標識ＰＡＨＭでコーティングした。３つの方法によってコーティングされたマイクロスフェアの代表的な蛍光顕微鏡写真を図１Ｃに示し、蛍光強度の定量化を図１Ｄに示す。方法３では、エタノールは１０分以内で迅速に蒸発され、明るく、比較的均一なコーティングを得た（図１Ｃ）。方法２では、１２時間にわたるエタノールの遅い蒸発は、方法３と比較して１．２倍明るい蛍光によって示されるように、マイクロスフェア上にコーティングされたＰＡＨＭの量がわずかに増加したように見えた（図１Ｄ）しかしながら、方法３で蒸発をさらに３日間まで遅くすると、コーティングはずっと薄暗くなった（ｄｉｍｍｅｒ）（図１Ｃ、Ｄ）。その後のすべての実験では方法３を用いてマイクロスフェアをコーティングすることを選択したが、これは良好なコーティングを生成しながら高速であったためである。
【0079】
その後のすべての実験（ＰＡＨＭ放出動力学（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）および細胞毒性アッセイ）は、濃度１０μｇ／ｍｇ（μｇＰＡＨＭ／ｍｇＰＭＭＡ）の非標識ＰＡＨＭでコーティングされたマイクロスフェアを使用した。ＰＡＨＭを１ｍｇ／ｍＬの濃度でエタノールに溶解した。ガラスバイアル中で、１ｍＬのＰＡＨＭ溶液を１００ｍｇのマイクロスフェア（７１μｍまたは１００μｍ）に添加した。上記の方法１を用いてエタノールを蒸発させた。
【0080】
実施例５：コーティングされたマイクロスフェアのインビトロ放出動力学
１２ウェルプレートにおいて、２５ｍｇのコーティングされたマイクロスフェア（直径７１μｍまたは１００μｍ）を１ｍＬの細胞培養培地（フェノールレッドなし）に懸濁し、５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿環境中で１週間インキュベートした。特定の時点で、７５０μＬの上清をサンプリングし、新鮮な培地と交換した。次に、サンプリングした上清を、透明なＵＶキュベット（セミマイクロ、１．５ｍＬ）（ＵＳＡサイエンティフィック、米国フロリダ州Ｏｃａｌａ）中の０．７５ｍＬ放出培地（最終体積：１．５ｍＬ）で希釈した。上清中のＰＡＨＭの量を、Ｃａｒｙ１００ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国カリフォルニア州Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）を用いて２４５ｎｍでの吸光度を測定することによって測定した。図２Ａおよび２Ｂは、細胞培養培地中のＰＡＨＭの定量を示す。図２Ａは、異なるＰＡＨＭ濃度のＵＶ－Ｖｉｓ吸収スペクトルを示す。図２Ｂは、ＰＡＨＭ濃度に対する２４５ｎｍでの吸光度の較正曲線を示す。
１２ウェルプレートにおいて、２５ｍｇのコーティングされたマイクロスフェア（直径７１μｍまたは１００μｍ）を１ｍＬの細胞培養培地（フェノールレッドなし）に懸濁し、５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿環境中で１週間インキュベートした。特定の時点で、７５０μＬの上清をサンプリングし、新鮮な培地と交換した。次に、サンプリングした上清を、透明なＵＶキュベット（セミマイクロ、１．５ｍＬ）（ＵＳＡサイエンティフィック、米国フロリダ州Ｏｃａｌａ）中の０．７５ｍＬ放出培地（最終体積：１．５ｍＬ）で希釈した。上清中のＰＡＨＭの量を、Ｃａｒｙ１００ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国カリフォルニア州Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）を用いて２４５ｎｍでの吸光度を測定することによって測定した。図２Ａおよび２Ｂは、細胞培養培地中のＰＡＨＭの定量を示す。図２Ａは、異なるＰＡＨＭ濃度のＵＶ－Ｖｉｓ吸収スペクトルを示す。図２Ｂは、ＰＡＨＭ濃度に対する２４５ｎｍでの吸光度の較正曲線を示す。
【0081】
放出動力学プロファイルは、経時的に放出された累積パーセンテージとして表され、図３に示されている。最初の４時間以内の最初のバースト放出の後、ＰＡＨＭの持続放出は１週間にわたって継続した。ＰＡＨＭは１００μｍよりも７１μｍのＰＭＭＡマイクロスフェアからわずかに速く放出された。最初の一時間以内に、ＰＡＨＭの５１％および３８％が７１μｍおよび１００μｍのＰＭＭＡマイクロスフェアから放出された。４時間後、ＰＡＨＭの６９％および５９％が７１μｍおよび１００μｍのＰＭＭＡマイクロスフェアから放出された。ＰＡＨＭの２０％以上は２日目～７日目の間に両サイズのマイクロスフェアから放出された。
【0082】
実施例６：細胞培養
ヒト膵臓腺癌細胞株ＡｓＰＣ－１をＡＴＣＣから得た。ＡｓＰＣ－１細胞を、２ｇ／Ｌのグルコース、２ｍＭのＬ－グルタミン、２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）を含む、ロズウェル・パーク・メモリアル研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、米国マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）からなる培地で培養した。ＡｓＰＣ－１細胞を組織培養フラスコで培養し、５％ＣＯ２の３７℃の加湿環境でインキュベートした。細胞が約８０％のコンフルエントに達したとき、培地を除去し、細胞を回収し、１：３～１：６に分割して培養を継続するか、または細胞毒性実験のために直ちに使用した。
ヒト膵臓腺癌細胞株ＡｓＰＣ－１をＡＴＣＣから得た。ＡｓＰＣ－１細胞を、２ｇ／Ｌのグルコース、２ｍＭのＬ－グルタミン、２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）を含む、ロズウェル・パーク・メモリアル研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、米国マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）からなる培地で培養した。ＡｓＰＣ－１細胞を組織培養フラスコで培養し、５％ＣＯ２の３７℃の加湿環境でインキュベートした。細胞が約８０％のコンフルエントに達したとき、培地を除去し、細胞を回収し、１：３～１：６に分割して培養を継続するか、または細胞毒性実験のために直ちに使用した。
【0083】
実施例７：遊離ＰＡＨＭまたはコーティングしたマイクロスフェアから放出したＰＡＨＭと組み合わせたＩＲＥの細胞毒性
採取した細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを細胞培養培地（フェノールレッドなし）に再懸濁し、６７５，０００細胞／ｍＬの密度に希釈し、１ｍＬアリコートを２ｍＬマイクロ遠心管に分注した。
採取した細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを細胞培養培地（フェノールレッドなし）に再懸濁し、６７５，０００細胞／ｍＬの密度に希釈し、１ｍＬアリコートを２ｍＬマイクロ遠心管に分注した。
【0084】
遊離ＰＡＨＭを細胞培養培地に溶解して初期濃度２５０μｇ／ｍＬとし、種々の濃度に希釈した。１ｍＬの細胞懸濁液に、０．５ｍＬのＰＡＨＭ希釈液を加えて、０～５０μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。コーティングされたマイクロスフェア（直径７１μｍまたは１００μｍ）およびコーティングされていないマイクロスフェアを、細胞培養培地中に懸濁して初期濃度２５ｍｇ／ｍＬとし、様々の濃度に希釈した。１ｍＬの細胞懸濁液に、０．５ｍＬのコーティングされたマイクロスフェア希釈液を添加して、０～５ｍｇ／ｍＬの最終濃度（０～５０μｇ／ｍＬのマイクロスフェアコーティングＰＡＨＭに相当）を得た。
【0085】
１５分間インキュベーションした後、Ｓｈａｏ，Ｑ．他の「Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ．（膵癌の不可逆的エレクトロポレーションの物理的および化学的増強および適応抵抗性。）」、Ａｎｎ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、４６、２５－３６（２０１８）に記載されているように、細胞をＩＲＥで処理した。簡単に述べると、４００μＬの調製した細胞懸濁液を、２つのアルミニウムプレート電極（４ｍｍ離れている）の間のエレクトロポレーションキュベット（ＢＴＸ４５－０１２６、ハーバード・アパレイタス、マサチューセッツ州Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ）にピペットで注入した。キュベットを、１５０、２２５、３００、３７５または４５０Ｖ（３７５、５６２．５、７５０、９３７．５または１１２５Ｖ／ｃｍの電界強度に対応）で５０個の電気パルス（パルス持続時間１００μｓ、周波数１Ｈｚ）を送達する電気パルス発生器（ＢＴＸ ＥＣＭ 矩形波エレクトロポレーションシステム、ＢＴＸモデルＮｏ．８３０、ハーバード・アパレイタス、米国マサチューセッツ州Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ）によって生成された外部電界内に配置した。
【0086】
曝露時間が１５分間のサンプルについて、４００μＬの処理した細胞懸濁液をマイクロ遠心管に移し、遠心分離し、上清を廃棄した。ＰＡＨＭを１ｍＬのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）で細胞から洗い流した（２回）。細胞ペレットを１ｍＬの細胞培養培地に再懸濁し、１２ウェルプレート（１８０，０００細胞／ウェル）にプレーティングした。曝露時間が４時間および２４時間のサンプルについて、４００μＬの処理した細胞懸濁液を１２ウェルプレート（１８０，０００細胞／ウェル）にプレーティングし、６００μＬの遊離ＰＡＨＭまたはコーティングされたマイクロスフェア希釈液を添加して、適切なＰＡＨＭ用量を維持した。５％ＣＯ２の３７℃の加湿環境において４時間または２４時間インキュベーションした後、細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで洗浄し（２回）、１ｍＬの新鮮な細胞培養培地を与えた。
【0087】
細胞生存率は、ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチル－チアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）アッセイ（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．、「Ｒａｐｉｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ．（細胞増殖と生存のための迅速比色アッセイ：増殖と細胞毒性アッセイへの応用）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５、５５－６３（１９８３））を用いて評価した。各ウェルに、１００μＬのＭＴＴ溶液（ＤＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）を添加した。５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿環境で４時間インキュベーションした後、８５０μＬの培地を各ウェルから除去した。ホルマザン結晶を１ｍＬのＤＭＳＯ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）に溶解し、Ｂｉｏ Ｔｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ（商標）３細胞イメージングマルチモードリーダー（Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ）（バイオテック・インスツルメンツ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、バーモンド州Ｗｉｎｏｏｓｋｉ）を用いて５４０ｎｍで吸光度を測定した。細胞生存率は、未処理細胞の吸光度によって正規化することによって決定した（同じ曝露時間を用いて）。
【0088】
ＩＲＥまたはＰＡＨＭへの曝露後のＡｓＰＣ－１細胞の生存率を図４Ａ～４Ｂに示す。より高い電界強度はＩＲＥ単独後の細胞生存率を低下させたが、細胞生存率の低下は比較的緩やかであった（図４Ａ）。７５０Ｖ／ｃｍ以下に曝露した細胞では、７０％以上の細胞が生存していた。最も高い電界強度（１１２５Ｖ／ｃｍ）でも、１５分、４時間および２４時間の時点で細胞の４６％、５０％および６８％を死滅させた。これとは異なり、ＰＡＨＭのみは、はるかに著しい細胞死滅効果を示した（図４Ｂ）。２５μｇ／ｍＬ以上の用量でのＰＡＨＭで処理した細胞では、１５分、４時間および２４時間連続してＰＡＨＭに曝露した場合、４５％、９０％、８５％を超える細胞が死滅した。４０μｇ／ｍＬまたは５０μｇ／ｍＬのＰＡＨＭで２４時間処理すると、細胞の１００％が死滅した。
【0089】
ＩＲＥ処理後、４または２４時間細胞をインキュベートしても細胞生存率に影響を及ぼさないように思われることから、ＩＲＥの細胞死滅効果は時間依存性がほとんどないことがわかった（図４Ａ）。１１２５Ｖ／ｃｍに曝露した場合にのみ、細胞を２４時間インキュベートすると、細胞生存率が低下した。ＩＲＥとは異なり、ＰＡＨＭによる細胞死は曝露時間に依存した。興味深いことに、細胞をＰＡＨＭで４時間処理すると、細胞を２４時間処理するよりも細胞生存率が低下するようである。ＰＡＨＭ用量≦２０μｇ／ｍＬでは、４時間の曝露時間で細胞生存率の有意な低下が認められたが、細胞は２４時間後に何らかの回復を示した。ＰＡＨＭの用量が２５μｇ／ｍＬ以上では、４時間および２４時間の曝露時間で細胞生存率に統計的有意差が認められなかったため、この回復は認められなかった。
【0090】
ＩＲＥによる細胞死滅効果を増強するＰＡＨＭの能力を評価するために、２つの電界強度を３つのＰＡＨＭ用量と組み合わせた（図５Ａ～５Ｃ）。全ての曝露時間に対して、ＰＡＨＭとＩＲＥの併用は有意に多くの細胞死をもたらした。細胞をＰＡＨＭで１５分間のみ処理した場合、５６２．５Ｖ／ｃｍに曝露された細胞の生存率は、５μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬおよび２５μｇ／ｍＬのＰＡＨＭで９５％から６４％、４８％および３３％に低下した（図５Ａ）。ＰＡＨＭへの４時間の曝露では、５６２．５Ｖ／ｃｍに曝露された細胞の生存率は、５μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、および２５μｇ／ｍＬのＰＡＨＭで８６％から３７％、１０％、および２％に低下した（図５Ｂ）。ＰＡＨＭ単独処理と同様に、ＩＲＥおよびＰＡＨＭで２４時間処理した細胞では、ある程度の細胞生存率の回復がみられる；しかしながら、５６２．５Ｖ／ｃｍに曝露された細胞の生存率は、５μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬおよび２５μｇ／ｍＬのＰＡＨＭでは９１％から７２％、１７％および３％に低下した（図５Ｃ）。
【0091】
ＩＲＥの有効性を増強するＰＡＨＭの能力を調べるために、ＩＲＥとＰＡＨＭの各併用に対する併用指数（ＣＩ）と用量減少指数（ＤＲＩ）を、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェアプログラム（コンボシン社、ニュージャージー州Ｐａｒａｍｕｓ）を用いたＣｈｏｕ－Ｔａｌａｌａｙ法によって算出した。ＣＩは、図５ＤのＩＲＥおよび遊離ＰＡＨＭの特定の組み合わせによって阻害される細胞増殖の画分である、画分影響（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ａｆｆｅｃｔ）（Ｆａ）に対してプロットされる。１５分間のＰＡＨＭ曝露では、大部分のＣＩが１．１２より大きいため、ＩＲＥと遊離ＰＡＨＭの併用はわずかに拮抗的であると思われる。より長いＰＡＨＭ曝露では、ＣＩはＦａが高くなると低下する傾向があった。４時間のＰＡＨＭ曝露では、３つの最高Ｆａとの組み合わせは相乗的であると思われる。２４時間のＰＡＨＭ暴露では、低Ｆａとの併用は軽度から中等度の拮抗作用を示した；しかしながら、より高いＦａとの組み合わせは、ほとんど相加的であるか、または中程度の相乗効果を示す。ＩＲＥ電界強度およびＰＡＨＭ用量（ｄｏｓｅ）のＤＲＩを図５Ｅおよび図５Ｆに示す。ＩＲＥのＤＲＩは全ての３つの曝露時間でＦａと共に増加する傾向があり、全てのＤＲＩは１より大きい。このことは、ＰＡＨＭとのいかなる組合せに対しても、より低い電界強度はより高い電界強度単独と同等の割合の細胞を死滅させることができることを示している。ＰＡＨＭのＤＲＩは、１つを除く全ての組み合わせで１より大きく、ＰＡＨＭの用量も組み合わせて使用すると低下できることを示す。１５分および２４時間の暴露では、ＤＲＩはＦａとともに低下する傾向がある；しかしながら、ＤＲＩはＰＡＨＭへの４時間の曝露でＦａと共に増加する傾向があった。
【0092】
１０μｇ／ｍｇ（μｇＰＡＨＭ／ｍｇＰＭＭＡ）でコーティングされたマイクロスフェア（直径７１μｍまたは１００μｍ）への曝露後のＡｓＰＣ－１細胞の生存率を図６Ａ～６Ｂに示す。ＰＭＭＡマイクロスフェア単独（コーティングなし）は毒性をほとんどまたは全く示さないので（図７）、全ての細胞死滅はコーティングされたマイクロスフェアから放出されたＰＡＨＭに起因する。遊離ＰＡＨＭと同様に、７１μｍのコーティングされたマイクロスフェアから放出されたＰＡＨＭへの曝露時間は、細胞生存率に有意な影響を示した（図６Ａ）。最高用量（５０μｇ／ｍＬのマイクロスフェアコーティングＰＡＨＭ）でさえ細胞の４７％しか死滅させなかったように、７１μｍのコーティングされたマイクロスフェアへの１５分の曝露後に、中程度の細胞死滅のみが生じた。７１μｍのコーティングされたマイクロスフェアへの４時間曝露は細胞生存率を大きく低下させた。２０μｇ／ｍＬ以上のマイクロスフェアコーティングＰＡＨＭでは、生存細胞は１３％未満であった。細胞は７１μｍコーティングマイクロスフェアに２４時間曝露後、１５分曝露後に見られる生存性と同様に生存性の多くを回復した。５０μｇ／ｍＬのマイクロスフェアコーティングＰＡＨＭ（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ－ｃｏａｔｅｄ ＰＡＨＭ）でのみ、２４時間の曝露では１５分の曝露よりも統計的に有意に多くの細胞が死滅した。同様の結果は、１００μｍのコーティングされたマイクロスフェアで１５分または２４時間処理された細胞についても見られた；しかしながら、４時間の曝露では、細胞毒性はほとんど認められなかった（図６Ｂ）。５０μｇ／ｍＬのマイクロスフェアコーティングＰＡＨＭでも、１９％の細胞生存率が１００μｍのコーティングされたマイクロスフェアへの４時間の曝露後に残った。２５μｇ／ｍＬ以上のマイクロスフェアコーティングＰＡＨＭについてのみ、より長い曝露時間が１５分曝露よりも有意に低い細胞生存率をもたらした。
【0093】
実施例８：コーティングされたマイクロスフェアから放出されたＰＡＨＭと併用したＩＲＥの細胞毒性
ＰＡＨＭのより遅い放出および４時間と２４時間の曝露時間の間の細胞生存率のはるかに小さな差のため、１００μｍのコーティングされたマイクロスフェアを選択して、コーティングされたマイクロスフェアから放出されたＰＡＨＭのＩＲＥを増強する能力を調べた（図８Ａ～８Ｆ）。放出されたＰＡＨＭは１５分後、特に４時間後にＩＲＥの細胞死滅効果を増強した；しかしながら、２４時間の曝露時間は、細胞生存率を有意には低下しなかった。１５分間の曝露では、コーティングされたマイクロスフェアを添加した場合、９１２．５Ｖ／ｃｍに曝露された細胞の生存率は９５％から４０～５４％に低下した；しかしながら、３つのマイクロスフェア用量間には統計的有意差はなかった（図８Ａ）。５６２．５Ｖ／ｃｍに曝露された細胞の生存率が５μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、および２５μｇ／ｍＬのマイクロスフェアコーティングＰＡＨＭで８６％から６５％、５６％、および１９％に減少したことから（図８Ｂ）、１００μｍのコーティングされたマイクロスフェアへの４時間の曝露で最も実質的なＩＲＥ増強が見られた。この増強は２４時間曝露後にはほとんど消失した。ＩＲＥ単独と比較した場合、細胞生存率を有意に低下させる唯一の組み合わせは、５６２．５Ｖ／ｃｍの電界強度と２５μｇ／ｍＬのマイクロスフェアコーティングＰＡＨＭであった（図８Ｃ）。この減少もＩＲＥ単独の９１％から併用の７５％へと比較的緩やかであった。
ＰＡＨＭのより遅い放出および４時間と２４時間の曝露時間の間の細胞生存率のはるかに小さな差のため、１００μｍのコーティングされたマイクロスフェアを選択して、コーティングされたマイクロスフェアから放出されたＰＡＨＭのＩＲＥを増強する能力を調べた（図８Ａ～８Ｆ）。放出されたＰＡＨＭは１５分後、特に４時間後にＩＲＥの細胞死滅効果を増強した；しかしながら、２４時間の曝露時間は、細胞生存率を有意には低下しなかった。１５分間の曝露では、コーティングされたマイクロスフェアを添加した場合、９１２．５Ｖ／ｃｍに曝露された細胞の生存率は９５％から４０～５４％に低下した；しかしながら、３つのマイクロスフェア用量間には統計的有意差はなかった（図８Ａ）。５６２．５Ｖ／ｃｍに曝露された細胞の生存率が５μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、および２５μｇ／ｍＬのマイクロスフェアコーティングＰＡＨＭで８６％から６５％、５６％、および１９％に減少したことから（図８Ｂ）、１００μｍのコーティングされたマイクロスフェアへの４時間の曝露で最も実質的なＩＲＥ増強が見られた。この増強は２４時間曝露後にはほとんど消失した。ＩＲＥ単独と比較した場合、細胞生存率を有意に低下させる唯一の組み合わせは、５６２．５Ｖ／ｃｍの電界強度と２５μｇ／ｍＬのマイクロスフェアコーティングＰＡＨＭであった（図８Ｃ）。この減少もＩＲＥ単独の９１％から併用の７５％へと比較的緩やかであった。
【0094】
ＩＲＥおよびコーティングＰＭＭＡマイクロスフェアの組み合わせに対するＣＩとＤＲＩも計算した。図８ＤのＣＩによって示されるように、コーティングされたマイクロスフェアから放出されたＰＡＨＭへの１５分間の曝露とＩＲＥとの組み合わせは、低Ｆａでは強く拮抗的であるが、中間Ｆａでは相乗的になる。４時間暴露では、ほとんどのＣＩは０．９～１．１の範囲内（またはそれに近い）であり、ほぼ相加的な影響を示している。全ての２４時間曝露時間の組み合わせは、１．１以上のＣＩを示した。低Ｆａではこの組合せは強い拮抗作用を示したが、Ｆａと共に拮抗作用は減少した。ＩＲＥ電界強度およびマイクロスフェアコーティングＰＡＨＭ用量のＤＲＩを図１１Ｅおよび図１１Ｆに示す。ＩＲＥのＤＲＩは３つの曝露時間の全てでＦａと共に増加する傾向があり、Ｆａ＞０．１ではＩＲＥのＤＲＩは全て１より大きい。マイクロスフェアコーティングＰＡＨＭのＤＲＩは、１５分と２４時間の曝露時間についてはＦａと共に増加する傾向があったが、４時間の曝露時間についてはＦａと共に低下した。Ｆａ＞０．２の場合、マイクロスフェアコーティングＰＡＨＭのＤＲＩは１より大きい。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】