特表 2023-518434 インターロイキン２変異体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-01

(54)【発明の名称】インターロイキン２変異体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20230424BHJP

   C07K 14/55 20060101ALI20230424BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230424BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230424BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230424BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230424BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230424BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230424BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230424BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230424BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230424BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230424BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230424BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230424BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20230424BHJP

   C07K 1/22 20060101ALN20230424BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K14/55 ZNA

C07K19/00

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/19

C12N5/10

C12P21/02 K

C12P21/08

A61P37/02

A61P35/00

A61P37/04

A61K38/20

A61K47/68

A61K39/395 N

A61K39/395 L

C07K16/18

C07K1/22

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022556114

(86)(22)【出願日】2021-03-19

(85)【翻訳文提出日】2022-10-24

(86)【国際出願番号】 CN2021081840

(87)【国際公開番号】W WO2021185361

(87)【国際公開日】2021-09-23

(31)【優先権主張番号】202010197740.4

(32)【優先日】2020-03-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202110266549.5

(32)【優先日】2021-03-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519274183

【氏名又は名称】イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】ホー カイチエ

(72)【発明者】

【氏名】フー フォンケン

(72)【発明者】

【氏名】チョウ ショアイシアン

(72)【発明者】

【氏名】ウー ウェイウェイ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG05

4B064AG27

4B064CA06

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA94

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C076FF63

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA44

4C084CA18

4C084DA14

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB07

4C084ZB09

4C084ZB26

4C085AA14

4C085AA15

4C085AA21

4C085BB36

4C085BB41

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA04

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、新規インターロイキン２（ＩＬ－２）変異タンパク質に関する。本発明は、当該ＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質、二量体分子、免疫複合体、およびそれらをコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにそれらを含む医薬組成物と治療的使用をさらに提供する。本発明は、当該ＩＬ－２変異タンパク質、融合タンパク質、二量体分子、免疫複合体の調製方法をさらに提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩＬ－２変異タンパク質であって、
前記変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２（好ましくはヒトＩＬ－２で、より好ましくは配列番号１配列を含むＩＬ－２）と比較して、以下の変異を含む：
（ｉ）ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒαとの結合界面に、特に位置３５、３７、３８、４１、４２、４３、４５、６１、６８および７２から選択される少なくとも１つの位置に、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合親和性を変化（例えば排除または低減）させる変異、
および／または
（ｉｉ）短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域（即ち、アミノ酸残基ａａ７２とａａ８４を連結する配列）、好ましくは、１０、９、８、７、６、または５未満のアミノ酸長を有し、且つ好ましくは７アミノ酸長を有し、好ましくは、前記短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域はタンパク質の発現量および／または純度の改善をもたらす、前記短縮されたループ領域、
且つ以下の変異を含む：
（ｉｉｉ）ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒβγとの結合界面に、特に位置１２、１５、１６、１９、２０、８４、８７、８８、９１、９２、９５、および１２６から選択される少なくとも１つの位置に、ＩＬ－２Ｒβγ受容体に対する結合を弱体化する変異、
ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号１に従って番号付けされ、
好ましくは、前記変異タンパク質は、変異（ｉ）と（ｉｉｉ）を含むか、または変異（ｉｉ）と（ｉｉｉ）を含むか、または変異（ｉ）、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）を含み、
より好ましくは、前記変異タンパク質は、変異（ｉｉ）と（ｉｉｉ）を含むが、変異（ｉ）を含まない、
前記ＩＬ－２変異タンパク質。

【請求項2】

請求項１に記載の変異タンパク質であって、
前記ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異（ｉｉｉ）は、
Ｌ１２Ｒ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｅ、Ｌ１２Ｑ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ１５Ｒ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｙ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｅ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｒ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｄ２０Ｎ、Ｄ２０Ｑ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｒ、Ｄ２０Ｓ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｆ、Ｄ８４Ｌ、Ｄ８４Ｋ、Ｄ８４Ｈ、Ｓ８７Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｓ８７Ｋ、Ｓ８７Ｌ、Ｓ８７Ｍ、Ｓ８７Ｈ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｔ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｋ、Ｎ８８Ｈ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｌ、Ｖ９１Ｉ、Ｖ９１Ｌ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｎ、Ｖ９１Ｑ、Ｖ９１Ｓ、Ｖ９１Ｈ、Ｉ９２Ｅ、Ｉ９２Ｔ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、Ｉ９２Ｌ、Ｅ９５Ｑ、Ｅ９５Ｇ、Ｅ９５Ｄ、Ｅ９５Ｎ、Ｑ１２６Ｅ、Ｑ１２６Ｄ、Ｑ１２６Ａ、Ｑ１２６Ｓ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｅ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｔ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｑ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉから選択される変異を含み、
好ましくは、前記ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異（ｉｉｉ）は、
Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ９５Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｎ＋Ｄ８４Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、Ｖ９１Ｉから選択される変異を含み、
さらに好ましくは、前記ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異（ｉｉｉ）は、
－Ｄ８４Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎから選択される変異、または
－Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉから選択される変異、または
－Ｄ８４Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、およびＤ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑから選択される変異、または
－Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、およびＨ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑから選択される変異、または
－Ｄ８４ＮおよびＤ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑから選択される変異、を含み、
さらに好ましくは、前記ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異（ｉｉｉ）は、Ｎ８８ＤまたはＤ２０ＮまたはＮ８８Ｒを含む、
請求項１に記載の変異タンパク質。

【請求項3】

前記変異（ｉ）は、変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａ、または変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ、または変異Ｆ４２Ａを含み、
好ましくは、前記変異（ｉ）は、変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａを含む、
前記請求項のいずれか１項に記載の変異タンパク質。

【請求項4】

前記変異（ｉｉ）は、以下を含む：
（ａ）Ｂ’Ｃ’ループ領域のａａ７４～ａａ８３に対する置換、例えば、ＩＬ１５のＢ’Ｃ’ループ配列など、４ヘリックス短鎖サイトカインのＩＬファミリーのメンバーからの短いＢ’Ｃ’ループ配列による置換、好ましくは配列ＧＤＡＳＩＨによる置換、または
（ｂ）Ｂ’Ｃ’ループ領域のａａ７４～ａａ８３に対する切断、例えばＣ末端からの１、２、３または４個のアミノ酸の切断、好ましくは配列（Ｑ／Ｇ）ＳＫＮ（Ｆ／Ｉ）Ｈを形成するための切断、より好ましくは以下から選択される配列を形成するための切断：
前記請求項のいずれか１項に記載の変異タンパク質。

【表1】

【請求項5】

野生型ＩＬ－２と比較して、
（ｉ）変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａ、
（ｉｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＡＱＳＫＮＦＨまたはＡＧＤＡＳＩＨまたはＳＧＤＡＳＩＨ、
（ｉｉｉ）Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ９５Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｎ＋Ｄ８４Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、およびＶ９１Ｉから選択されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異を含み、
より好ましくは、前記ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異は、
－Ｄ８４Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎから選択されるか、または
－Ｄ８４Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、およびＤ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑから選択されるか、または
－Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、およびＨ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑから選択され、
および、場合により、（ｉｖ）変異Ｔ３Ａを含む、
前記請求項のいずれか１項に記載の変異タンパク質。

【請求項6】

野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合が維持され、且つ
（ｉｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＡＱＳＫＮＦＨまたはＡＧＤＡＳＩＨまたはＳＧＤＡＳＩＨ、特にＡＧＤＡＳＩＨ、
（ｉｉｉ）Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ９５Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｎ＋Ｄ８４Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、およびＶ９１Ｉから選択されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異、
より好ましくは、前記ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異は、Ｄ２０Ｎ、Ｎ８８ＤおよびＮ８８Ｒから選択され、
および、場合により、（ｉｖ）変異Ｔ３Ａ、を含む、
前記請求項のいずれか１項に記載の変異タンパク質。

【請求項7】

野生型ＩＬ－２と比較して、０～５個以下のアミノ酸変異をさらに含み、好ましくは、前記変異タンパク質はＣ１２５ＳまたはＣ１２５Ａ変異を含む、請求項１～６に記載の変異タンパク質。

【請求項8】

－配列番号３７－６３８（特に配列番号１４８もしくは１９７または配列番号４８９、５１３、５１６）から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性を有するアミノ酸配列、
－配列番号３７－６３８（特に配列番号１４８もしくは１９７または配列番号４８９、５１３、５１６）から選択されるアミノ酸配列、を含む、
請求項１～７に記載の変異タンパク質。

【請求項9】

変異（ｉｉｉ）を導入して弱体化する前のタンパク質と比較して、低減されたＩＬ－２Ｒβγ受容体に対する結合親和性を有し、
且つ前記変異タンパク質は、以下から選択される少なくとも１項または２項の特性を有する：
－野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα結合を維持すること、または
－野生型ＩＬ－２と比較して、哺乳動物細胞（例えば２９３細胞またはＣＨＯ細胞）で発現される場合、例えばＦｃ融合タンパク質の形態で発現される場合における改善された発現量および／またはより高い純度に精製されやすいこと（例えば、ワンステップアフィニティークロマトグラフィー後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出により、より高い純度を有する）、
請求項１～８に記載の変異タンパク質。

【請求項10】

請求項１～９に記載のＩＬ２変異タンパク質を含む、ＩＬ－２変異タンパク質融合タンパク質。

【請求項11】

前記ＩＬ－２変異タンパク質は、Ｆｃ抗体断片（例えばヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）と融合され、
好ましくは、前記ＩＬ－２変異タンパク質は、リンカーを介してＦｃと融合され、前記リンカーは、好ましくはＧＳＧＳであり、より好ましくは（Ｇ４Ｓ）₂であり、
好ましくは、前記Ｆｃ断片は、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａなど、ＦｃとＦｃγＲとの結合を低減または排除する変異を含み、
好ましくは、前記Ｆｃ断片は、配列番号１２と少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、
請求項１０に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

前記Ｆｃ断片は、変異Ｔ３６６ＷとＳ３５４ＣなどのＫｎｏｂ変異を含み、または前記Ｆｃ断片は、変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶなどのＨｏｌｅ変異を含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。

【請求項13】

ＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質であって、
請求項１１もしくは１２に記載のＩＬ－２変異タンパク質融合タンパク質を含み、
好ましくは、前記二量体タンパク質は、野生型ＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質を含む対応する二量体タンパク質と比較して、以下の特性の１項または複数項を有する：
－哺乳動物細胞（例えばＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞）で発現される場合における発現量および／または純度の増加、
－例えば、投与後の動物の体重または体重変化の測定により決定される、インビボで投与される場合における低い毒性、
－より優れた抗腫瘍効果、
ＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質。

【請求項14】

ホモ二量体であり、そのうち、第１のモノマーと第２のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端まで、ｉ）ＩＬ－２変異タンパク質、ｉｉ）リンカー、およびｉｉｉ）Ｆｃ断片を含み、
好ましくは、各モノマーは、Ｃ末端でリンカー（Ｇ４Ｓ）２を介して配列番号１２アミノ酸配列に連結する、配列番号３７－６３８から選択されるＩＬ－２変異タンパク質を含む、
請求項１３に記載のＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質。

【請求項15】

ヘテロ二量体であり、
ａ）Ｎ末端からＣ末端まで、ｉ）ＩＬ－２変異タンパク質、ｉｉ）リンカー、およびｉｉｉ）第１のＦｃ断片を含む第１のモノマーと、
ｂ）第２のＦｃ断片および場合によりＩｇＧ１ヒンジ領域を含む第２のモノマーと、を含み、
好ましくは、第１のＦｃ断片と第２のＦｃ断片はそれぞれ、第１のモノマーと第２のモノマーがヘテロ二量体を形成することを促進する第１と第２のヘテロ二量体化変異を含み、
好ましくは、第１と第２のヘテロ二量体化変異は、Ｋｎｏｂ：Ｈｏｌｅ変異の組み合わせＴ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ：Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを含み、
好ましくは、第１のＦｃ断片における第１のヘテロ二量体変異はＫｎｏｂ変異を含み、第２のＦｃ断片における第２のヘテロ二量体変異はＨｏｌｅ変異を含み、または、第１のＦｃ断片における第１のヘテロ二量体変異はＨｏｌｅ変異を含み、第２のＦｃ断片における第２のヘテロ二量体変異はＫｎｏｂ変異を含み、
好ましくは、第１のモノマーは、Ｃ末端でリンカー（Ｇ４Ｓ）２を介して配列番号９アミノ酸配列に連結する、配列番号３７－６３８から選択されるＩＬ－２変異タンパク質を含み、且つ第２のモノマーは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、
請求項１３に記載のＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質。

【請求項16】

請求項１～９のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異タンパク質と抗原結合分子とを含み、好ましくは、前記抗原結合分子は、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、または抗体もしくは抗体断片、特にＦａｂ分子もしくはｓｃＦｖ分子である、免疫複合体。

【請求項17】

請求項１～９のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異タンパク質または請求項１０～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１３～１５のいずれか一項に記載のＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質または請求項１６に記載の免疫複合体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。

【請求項18】

請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項19】

請求項１７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１８に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、哺乳動物細胞であり、特にＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞、または酵母である、前記宿主細胞。

【請求項20】

前記ＩＬ－２変異タンパク質または融合タンパク質またはＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質または免疫複合体の発現に適した条件下で、請求項１９に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異タンパク質または請求項１０～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１３～１５のいずれか一項に記載のＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質または請求項１６に記載の免疫複合体を製造するための方法。

【請求項21】

請求項１～９のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異タンパク質または請求項１０～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１３～１５のいずれか一項に記載のＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質または請求項１６に記載の免疫複合体および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。

【請求項22】

請求項１～９のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異タンパク質または請求項１０～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１３～１５のいずれか一項に記載のＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質または請求項１６に記載の免疫複合体または請求項２１に記載の医薬組成物を前記被験者に投与するステップを含む被験者の疾患を治療する方法であって、好ましくは、前記疾患はがんまたは自己免疫疾患である、被験者の疾患を治療する方法。

【請求項23】

有效量の請求項１～９のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異タンパク質または請求項１０～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１３～１５のいずれか一項に記載のＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質または請求項１６に記載の免疫複合体または請求項２１に記載の医薬組成物を前記被験者に投与するステップを含む、被験者の免疫系を刺激する方法。

【請求項24】

ＩＬ－２変異タンパク質を得るための方法であって、
－ＩＬ－２のＢ’Ｃ’ループ領域で変異により当該ループ領域配列を短縮させ、および、場合によりＩＬ－２のＩＬ－２Ｒβγとの結合界面に１つもしくは複数の変異を導入し、および／またはＩＬ－２のＩＬ－２Ｒａとの結合界面に１つもしくは複数の変異を導入するステップと、
－哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞）において、ＩＬ－２変異タンパク質を、例えばＦｃ融合体（例えばＦｃＬＡＬＡ融合体）の形態で発現するステップと、を含み、
または、前記方法は
－ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒβγとの結合界面に１つもしくは複数の変異を導入し、および、場合によりＩＬ－２のＢ’Ｃ’ループ領域で変異により当該ループ領域配列を短縮させ、および／またはＩＬ－２のＩＬ－２Ｒａとの結合界面に１つもしくは複数の変異を導入し、好ましくはＩＬ－２のＩＬ－２Ｒａとの結合界面に変異を導入しないステップと、
－哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞）において、ＩＬ－２変異タンパク質を、例えばＦｃ融合体（例えばＦｃＬＡＬＡ融合体）の形態で発現するステップと、を含み、
好ましくは、前記短縮されたループ領域は１０、９、８、７、６、または５未満のアミノ酸長を有し、且つ好ましくは７アミノ酸長を有し、
より好ましくは、前記Ｂ’Ｃ’ループ領域の変異は、以下を含む：
（ａ）Ｂ’Ｃ’ループ領域のａａ７４～ａａ８３に対する置換、例えば、ＩＬ１５のＢ’Ｃ’ループ配列など、４ヘリックス短鎖サイトカインのＩＬファミリーのメンバーからの短いＢ’Ｃ’ループ配列による置換、好ましくは配列ＧＤＡＳＩＨによる置換、または
（ｂ）Ｂ’Ｃ’ループ領域のａａ７４～ａａ８３に対する切断、例えばＣ末端からの１、２、３または４個のアミノ酸の切断、好ましくは配列（Ｑ／Ｇ）ＳＫＮ（Ｆ／Ｉ）Ｈを形成するための切断、より好ましくは以下から選択される配列を形成するための切断：

【表2】

好ましくは、前記ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異は、請求項１もしくは２に記載のＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異を含み、
好ましくは、前記ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異は、請求項１もしくは３に記載のＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を含み、
好ましくは、前記変異タンパク質は、（ｉ）改善された発現量および／またはタンパク質の純度（例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出による、ワンステップアフィニティークロマトグラフィー後の純度）、（ｉｉ）弱体化されたＩＬ２Ｒβ結合および／または（ｉｉｉ）変化したＩＬ－２Ｒａ結合という改善された特性の１つまたはその任意の組み合わせを有し、好ましくは（ｉ）と（ｉｉ）の特性を有する、
前記方法。

【請求項25】

ＩＬ－２タンパク質Ｂ’Ｃ’ループ領域の改造方法であって、
（ａ）Ｂ’Ｃ’ループ領域のａａ７４～ａａ８３に対する置換、例えば、ＩＬ１５のＢ’Ｃ’ループ配列など、４ヘリックス短鎖サイトカインのＩＬファミリーのメンバーからの短いＢ’Ｃ’ループ配列による置換、好ましくは配列ＧＤＡＳＩＨによる置換、または
（ｂ）Ｂ’Ｃ’ループ領域のａａ７３～ａａ８３に対する置換、例えば、ＩＬ１５のＢ’Ｃ’ループ配列など、４ヘリックス短鎖サイトカインのＩＬファミリーのメンバーからの短いＢ’Ｃ’ループ配列による置換、好ましくは配列ＡＧＤＡＳＩＨによる置換、または
（ｃ）Ｂ’Ｃ’ループ領域のａａ７４～ａａ８３に対する切断、例えばＣ末端からの１、２、３または４個のアミノ酸の切断、好ましくは配列（Ｑ／Ｇ）Ｓ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｎ（Ｆ／Ｉ）Ｈを形成するための切断、より好ましくは以下から選択される配列を形成するための切断、を含む、
前記方法。

【表3】

【請求項26】

請求項２５に記載の方法によって改造して得られる、ＩＬ－２タンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規インターロイキン２（ＩＬ－２）変異タンパク質およびその使用に関する。具体的には、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して、改善された特性、例えば、改善されたＩＬ－２受容体結合特性および改善された創薬可能性を有するＩＬ－２変異タンパク質に関する。本発明は、当該ＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質、二量体、免疫複合体、および当該ＩＬ－２変異タンパク質、二量体、免疫複合体をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。本発明は、当該ＩＬ－２変異タンパク質、融合タンパク質、二量体および免疫複合体の調製方法、それを含む医薬組成物および治療的使用をさらに提供する。

【背景技術】

【0002】

Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）とも呼ばれるインターロイキン－２（ＩＬ－２）は、主に活性化Ｔ細胞、特にＣＤ４⁺Ｔヘルパー細胞によって産生される多能性サイトカインである。真核細胞において、ヒトＩＬ－２（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８）は１５３個のアミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、Ｎ末端の２０個のアミノ酸を除去した後、成熟した分泌性ＩＬ－２を産生する。他の種のＩＬ－２の配列も開示されており、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ Ｎｏ．ＮＰ０３２３９２（マウス）、ＮＰ４４６２８８（ラット）またはＮＰ５１７４２５（チンパンジー）を参照されたい。

【0003】

インターロイキン２は、その機能に不可欠な４次構造を形成する４つの逆平行両親媒性αヘリックスを有する（Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１１６９－７６（１９８８）；Ｂａｚａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，４１０－４１３（１９９２））。ほとんどの場合、ＩＬ－２は、インターロイキン２受容体α（ＩＬ－２Ｒα；ＣＤ２５）、インターロイキン２受容体β（ＩＬ－２Ｒβ；ＣＤ１２２）、およびインターロイキン２受容体γ（ＩＬ－２Ｒγ；ＣＤ１３２）の３つの異なる受容体を介して作用する。ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２ＲγはＩＬ－２のシグナル伝達に非常に重要であるが、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）はシグナル伝達に必須ではないが、ＩＬ－２の受容体への高親和性結合を与えることができる（Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０７，１１９０６－１１（２０１０））。ＩＬ－２Ｒα、β、γを組み合わせて形成される三量体受容体（ＩＬ－２αβγ）はＩＬ－２高親和性受容体（ＫＤが約１０ｐＭ）であり、βとγからなる二量体受容体（ＩＬ－２βγ）は中間親和性受容体（ＫＤが約１ｎＭ）であり、αサブユニットのみから形成されるＩＬ－２受容体は、低親和性受容体である。

【0004】

免疫細胞は二量体または三量体ＩＬ－２受容体を発現する。二量体受容体は細胞傷害性ＣＤ８⁺Ｔ細胞とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で発現され、三量体受容体は主に活性化リンパ球とＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３⁺抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）で発現される（Ｂｙｍａｎ，Ｏ．およびＳｐｒｅｎｔ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，１８０－１９０（２０１２））。静止状態のエフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞は、細胞表面上にＣＤ２５を持たないので、ＩＬ－２に対して比較的非感受性である。一方、Ｔｒｅｇ細胞は一貫してインビボで最高レベルのＣＤ２５を発現しているため、通常ＩＬ－２はＴｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激する。

【0005】

ＩＬ－２は、異なる細胞上のＩＬ－２受容体との結合を介して、免疫応答において多重作用を媒介する。一方では、ＩＬ－２は免疫系刺激作用を有し、Ｔ細胞とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖と分化を刺激することができる。したがって、ＩＬ－２は、免疫治療剤としてがんや慢性ウイルス感染の治療に使用されることが承認されている。他方では、ＩＬ－２は、免疫抑制性ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺制御性Ｔ細胞（即ち、Ｔｒｅｇ細胞）の維持を促進することもでき（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１４２－５１（２００５）；Ｄ’ＣｒｕｚおよびＫｌｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１５２－５９（２００５）；ＭａｌｏｙおよびＰｏｗｒｉｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１７１－７２（２００５））、患者において活性化Ｔｒｅｇ細胞による免疫抑制を引き起こす。

【0006】

なお、長年の臨床実践経験により、高用量のＩＬ－２は、黒色腫や腎臓がんなどのがんの治療において有意な臨床効果をもたらすことができるが、同時に、血管漏出症候群や低血圧などの心血管系毒性を含む薬物関連の重度の毒性と副作用を引き起こす可能性もあることが見出された。研究によると、これらの毒性は、リンパ球（特にＴ細胞とＮＫ細胞）に対するＩＬ－２の過剰な活性化によって、炎症性因子の放出を刺激することが原因である可能性が高いことが示されている。例えば、これは血管内皮細胞を収縮させ、細胞間の隙間を大きくし、組織液の流出を引き起こし、それにより血管漏出の副作用を引き起こす可能性がある。

【0007】

ＩＬ－２の臨床使用に関する別の制限的な問題は、その半減期が非常に短いため、投与が困難になることである。ＩＬ－２の分子量はわずか１５ＫＤａであるため、主に糸球体の濾過作用によって除去され、ヒト半減期はわずか１時間程度である。十分に高いヒトへの曝露量を達成するために、臨床的には８時間ごとに高用量のＩＬ－２を注入する必要がある。しかし、頻繁な投与は、患者に大きな負担をかけるだけでなく、さらに重要なことにＩＬ－２の高用量注入は非常に高いピーク血中濃度（Ｃｍａｘ）を引き起こし、これは薬物毒性を引き起こす別の要因である可能性が高い。Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：１５３７３，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５３７３）は、インターロイキン２－Ｆｃ融合体を調製することにより、インターロイキンの薬力学的特性を改善することを提案しているが、当該融合タンパク質の発現量が低く、且つ凝集体を形成しやすい。

【0008】

ＩＬ－２の生産において、天然のＩＬ－２分子は、そのアミノ酸配列の特性のため、哺乳動物細胞（ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３）における発現が非常に困難であり、分子の安定性も比較的悪い。したがって、現在市販が承認されたＩＬ－２分子Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎは、原核細菌発現系において生産されている。しかし、ＩＬ２－Ｆｃ融合タンパク質は細菌系で発現することができない。したがって、当該分野では、哺乳動物細胞におけるＩＬ－２分子およびＩＬ－２－Ｆｃ分子の発現を改善する必要がある。

【0009】

当該分野では、ＩＬ－２分子の操作方法が提案されている。例えば、Ｈｅｌｅｎ Ｒ．Ｍｏｔｔ ｅｔ ａｌは、排除されたＩＬ－２Ｒα結合能力を有するヒトＩＬ－２の変異タンパク質Ｆ４２Ａを開示している。Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：１５３７３，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５３７３）は、排除されたＩＬ－２Ｒα結合能力を有する三重変異ヒトＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ－２^3Xも提案し、当該タンパク質はアミノ酸残基位置３８、４３および６１にそれぞれ残基変異Ｒ３８Ｄ＋Ｋ４３Ｅ＋Ｅ６１Ｒを有する。ＣＮ１３０９７０５Ａは、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβγとの結合の低下をもたらす、位置Ｄ２０、Ｎ８８およびＱ１２６の変異を開示している。これらの変異タンパク質は、薬物動態学的および／または薬力学的特性に依然として欠陥があり、且つ哺乳動物細胞で発現される場合、発現量が低い、および／または分子安定性が比較的悪いという問題も存在する。

【0010】

ＩＬ－２免疫治療および生産に関連する上記の問題を鑑み、当該分野は、依然として、改善された特性を有する新規ＩＬ－２分子、特に生産、精製に役立つことを示し、改善された薬物動態学的および薬力学的特性を有するＩＬ－２分子をさらに開発する必要がある。

【発明の概要】

【0011】

本発明は、改善された創薬可能性および／または改善されたＩＬ－２受容体結合特性を有する長時間作用型ＩＬ－２変異タンパク質分子を提供することにより、上記の要件を満たす。

【0012】

したがって、一態様において、本発明は、新規ＩＬ－２変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、以下の１つまたは複数の特性を有し、好ましくは少なくとも性質（ｉ）および（ｉｉ）を有する：
（ｉ）改善された創薬可能性、特に哺乳動物細胞で発現される場合における改善された発現量および／または精製性能、
（ｉｉ）ＩＬ－２Ｒβγとの結合の弱体化、
（ｉｉｉ）ＩＬ－２Ｒαとの結合の低減または排除。

【0013】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、特性（ｉ）および（ｉｉ）を有し、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、ＩＬ－２Ｒαとの結合が維持されている。他のいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、特性（ｉ）～（ｉｉｉ）を有する。

【0014】

いくつかの実施形態において、本発明は、ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異を含み、且つＩＬ－２Ｒα結合界面の変異および／または短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域をさらに含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異および短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域を含むが、ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を含まないＩＬ－２変異タンパク質を提供する。

【0015】

なお、本発明は、ＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質、二量体タンパク質、免疫複合体、医薬組成物および組み合わせ製品、それらをコードする核酸、前記核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに本発明のＩＬ－２変異タンパク質、融合タンパク質、二量体タンパク質および免疫複合体の産生方法を提供する。

【0016】

さらに、本発明は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質、融合タンパク質、二量体タンパク質および免疫複合体を用いて疾患を治療する方法、ならびに被験者の免疫系を刺激する方法および使用も提供する。

【0017】

以下、図面および具体的な実施形態を参照して本発明をさらに説明する。しかし、これらの図面および具体的な実施形態は、本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではなく、当業者が容易に思いつく変更は、本発明の精神および添付される特許請求の範囲に含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαの複合物の結晶構造（ＰＤＢ：１Ｚ９２）を示す。

【図2A】ＩＬ－２結晶構造（ＰＢＤ：２ＥＲＪ）（Ａ）、ヒトＩＬ－２およびヒトＩＬ１５のＢ’Ｃ’ｌｏｏｐ構造ｓｕｐｅｒｐｏｓｅ（Ｂ）を示す。

【図2B】ＩＬ－２結晶構造（ＰＢＤ：２ＥＲＪ）（Ａ）、ヒトＩＬ－２およびヒトＩＬ１５のＢ’Ｃ’ｌｏｏｐ構造ｓｕｐｅｒｐｏｓｅ（Ｂ）を示す。

【図3】変異ライブラリーＩＢＹＤＬ０２９からスクリーニングされたＩＬ－２変異タンパク質およびその配列を示す。

【図4】ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβγの結晶構造（ＰＢＤ：２ＥＲＪ）およびそれらの接触界面を示す。

【図5】ＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質の分子模式図を示す。

【図6】本発明のいくつかの例示的なＩＬ－２弱体化分子の構造を示す。

【図7A】選択および構築されたＩＬ－２^mutant－Ｆｃ二量体タンパク質が活性化されていない正常なＴリンパ球ＣＤ４⁺Ｔ細胞とＣＤ８⁺Ｔ細胞（Ａ－Ｅ）で、および活性化されたＴリンパ球ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞（Ｆ）でｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図7B】選択および構築されたＩＬ－２^mutant－Ｆｃ二量体タンパク質が活性化されていない正常なＴリンパ球ＣＤ４⁺Ｔ細胞とＣＤ８⁺Ｔ細胞（Ａ－Ｅ）で、および活性化されたＴリンパ球ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞（Ｆ）でｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図7C】選択および構築されたＩＬ－２^mutant－Ｆｃ二量体タンパク質が活性化されていない正常なＴリンパ球ＣＤ４⁺Ｔ細胞とＣＤ８⁺Ｔ細胞（Ａ－Ｅ）で、および活性化されたＴリンパ球ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞（Ｆ）でｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図7D】選択および構築されたＩＬ－２^mutant－Ｆｃ二量体タンパク質が活性化されていない正常なＴリンパ球ＣＤ４⁺Ｔ細胞とＣＤ８⁺Ｔ細胞（Ａ－Ｅ）で、および活性化されたＴリンパ球ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞（Ｆ）でｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図7E】選択および構築されたＩＬ－２^mutant－Ｆｃ二量体タンパク質が活性化されていない正常なＴリンパ球ＣＤ４⁺Ｔ細胞とＣＤ８⁺Ｔ細胞（Ａ－Ｅ）で、および活性化されたＴリンパ球ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞（Ｆ）でｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図7F】選択および構築されたＩＬ－２^mutant－Ｆｃ二量体タンパク質が活性化されていない正常なＴリンパ球ＣＤ４⁺Ｔ細胞とＣＤ８⁺Ｔ細胞（Ａ－Ｅ）で、および活性化されたＴリンパ球ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞（Ｆ）でｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図8A】対照ｒｈＩＬ－２タンパク質と比較して、弱体化ＩＬ－２^mutant－Ｆｃ二量体タンパク質が異なるリンパ球サブセットでｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図8B】対照ｒｈＩＬ－２タンパク質と比較して、弱体化ＩＬ－２^mutant－Ｆｃ二量体タンパク質が異なるリンパ球サブセットでｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図8C】対照ｒｈＩＬ－２タンパク質と比較して、弱体化ＩＬ－２^mutant－Ｆｃ二量体タンパク質が異なるリンパ球サブセットでｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図8D】対照ｒｈＩＬ－２タンパク質と比較して、弱体化ＩＬ－２^mutant－Ｆｃ二量体タンパク質が異なるリンパ球サブセットでｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図8E】対照ｒｈＩＬ－２タンパク質と比較して、弱体化ＩＬ－２^mutant－Ｆｃ二量体タンパク質が異なるリンパ球サブセットでｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図8F】対照ｒｈＩＬ－２タンパク質と比較して、弱体化ＩＬ－２^mutant－Ｆｃ二量体タンパク質が異なるリンパ球サブセットでｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図8G】対照ｒｈＩＬ－２タンパク質と比較して、弱体化ＩＬ－２^mutant－Ｆｃ二量体タンパク質が異なるリンパ球サブセットでｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図9A】担がんＣ５７マウスへ投与する場合における、ＣＤ２５結合親和性が低減された弱体化ＩＬ－２^mutant分子により構築されたＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質の、腫瘍の体積に対する影響（Ａ）、および動物の体重と体重変化に対する影響（ＢとＣ）を示す。

【図9B】担がんＣ５７マウスへ投与する場合における、ＣＤ２５結合親和性が低減された弱体化ＩＬ－２^mutant分子により構築されたＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質の、腫瘍の体積に対する影響（Ａ）、および動物の体重と体重変化に対する影響（ＢとＣ）を示す。

【図9C】担がんＣ５７マウスへ投与する場合における、ＣＤ２５結合親和性が低減された弱体化ＩＬ－２^mutant分子により構築されたＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質の、腫瘍の体積に対する影響（Ａ）、および動物の体重と体重変化に対する影響（ＢとＣ）を示す。

【図10A】担がんＣ５７マウスへ投与する場合における、ＣＤ２５結合親和性が維持された弱体化ＩＬ－２^mutant分子により構築されたＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質の、腫瘍の体積に対する影響（Ａ）、および動物の体重と体重変化に対する影響（ＢとＣ）を示す。

【図10B】担がんＣ５７マウスへ投与する場合における、ＣＤ２５結合親和性が維持された弱体化ＩＬ－２^mutant分子により構築されたＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質の、腫瘍の体積に対する影響（Ａ）、および動物の体重と体重変化に対する影響（ＢとＣ）を示す。

【図10C】担がんＣ５７マウスへ投与する場合における、ＣＤ２５結合親和性が維持された弱体化ＩＬ－２^mutant分子により構築されたＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質の、腫瘍の体積に対する影響（Ａ）、および動物の体重と体重変化に対する影響（ＢとＣ）を示す。

【図11A】ＩＬ－２^mutantＦｃ二量体タンパク質の投与前および投与後の３日目と７日目におけるマウスの体重と体重変化の検出結果（Ａ和Ｂ）、および血液中Ｔｒｅｇ、ＮＫ、ＣＤ４⁺、およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の検出結果（Ｃ－Ｆ）を示す。

【図11B】ＩＬ－２^mutantＦｃ二量体タンパク質の投与前および投与後の３日目と７日目におけるマウスの体重と体重変化の検出結果（Ａ和Ｂ）、および血液中Ｔｒｅｇ、ＮＫ、ＣＤ４⁺、およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の検出結果（Ｃ－Ｆ）を示す。

【図11C】ＩＬ－２^mutantＦｃ二量体タンパク質の投与前および投与後の３日目と７日目におけるマウスの体重と体重変化の検出結果（Ａ和Ｂ）、および血液中Ｔｒｅｇ、ＮＫ、ＣＤ４⁺、およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の検出結果（Ｃ－Ｆ）を示す。

【図11D】ＩＬ－２^mutantＦｃ二量体タンパク質の投与前および投与後の３日目と７日目におけるマウスの体重と体重変化の検出結果（Ａ和Ｂ）、および血液中Ｔｒｅｇ、ＮＫ、ＣＤ４⁺、およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の検出結果（Ｃ－Ｆ）を示す。

【図11E】ＩＬ－２^mutantＦｃ二量体タンパク質の投与前および投与後の３日目と７日目におけるマウスの体重と体重変化の検出結果（Ａ和Ｂ）、および血液中Ｔｒｅｇ、ＮＫ、ＣＤ４⁺、およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の検出結果（Ｃ－Ｆ）を示す。

【図11F】ＩＬ－２^mutantＦｃ二量体タンパク質の投与前および投与後の３日目と７日目におけるマウスの体重と体重変化の検出結果（Ａ和Ｂ）、および血液中Ｔｒｅｇ、ＮＫ、ＣＤ４⁺、およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の検出結果（Ｃ－Ｆ）を示す。

【図12】野生型ＩＬ－２タンパク質ＩＬ－２^WT（配列番号１）のアミノ酸配列およびそのアミノ酸残基番号付けを示し、且つ変異タンパク質ＩＬ－２^3Xとの配列アラインメントを示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

別に定義しない限り、本明細書に用いられる全ての技術と科学用語はいずれも、当業者に通常に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の目的のために、以下、下記用語を定義する。

【0020】

「約」という用語は、数字または数値とともに使用される場合、下限として指定された数字または数値より５％小さく、上限として指定された数字または数値より５％大きい範囲内の数字または数値をカバーすることを意味する。

【0021】

「および／または」という用語は選択可能オプションのうちのいずれか１項または選択可能オプションのいずれか２項または複数項の組み合わせを指すと理解すべきである。

【0022】

本明細書で使用されるように、「包含する」または「含む」という用語は、記載される要素、整数またはステップを含むが、任意の他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本明細書において、「包含する」または「含む」という用語を用いる場合、特記しない限り、言及される要素、整数またはステップからなる場合も含まれる。例えば、ある変異または変異の組み合わせを「包含する」または「含む」ＩＬ－２変異タンパク質に言及する場合、前記変異または変異の組み合わせのみを有するＩＬ－２変異タンパク質を包含することも意図される。

【0023】

本明細書において、野生型「インターロイキン－２」または「ＩＬ－２」とは、本発明の変異または変異の組み合わせを導入するテンプレートとしての親ＩＬ－２タンパク質、好ましくは天然に存在するＩＬ－２タンパク質、例えば、未処理（例えば、シグナルペプチドが除されていない）の形態および処理済み（例えば、シグナルペプチドが除去された）の形態を含む、ヒト、マウス、ラット、非ヒト霊長類由来の天然ＩＬ－２タンパク質を指す。シグナルペプチドを含む全長の天然ヒトＩＬ－２配列は配列番号２に示され、その成熟タンパク質の配列は配列番号３に示される。なお、この表現には、天然に存在するＩＬ－２対立遺伝子変異体およびスプライス変異体、アイソタイプ、相同体、および種相同体も含まれる。この表現には、天然ＩＬ－２の変異体も含まれ、例えば、前記変異体は、天然ＩＬ－２と少なくとも９５％～９９％もしくはそれ以上の同一性を有してもよく、または１～１０個以下もしくは１～５個以下のアミノ酸変異（例えば、保存的置換）を有してもよく、且つ好ましくは、天然ＩＬ－２タンパク質と基本的に同一のＩＬ－２Ｒα結合親和性および／またはＩＬ２Ｒβγ結合親和性を有する。したがって、いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ－２は、天然ＩＬ－２タンパク質と比較して、ＩＬ－２受容体へのその結合に影響を及ぼさないアミノ酸変異を含んでもよく、例えば、変異Ｃ１２５Ｓを１２５位に導入した天然ヒトＩＬ－２タンパク質（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８）は、本発明の野生型ＩＬ－２に属する。Ｃ１２５Ｓ変異を含む野生型ヒトＩＬ－２タンパク質の１つの実例は配列番号１に示される。いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ－２配列は、配列番号１または配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９５％、さらには少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する。

【0024】

本明細書において、アミノ酸変異は、アミノ酸置換、欠失、挿入および付加であってもよい。置換、欠失、挿入および付加の任意の組み合わせを行うことで、所望の特性（例えば、低減されたＩＬ－２Ｒα結合親和性および／または改善された創薬可能性および／または弱体化されたＩＬ－２Ｒβγ）を有する最終的な変異タンパク質構築物を得ることができる。アミノ酸の欠失および挿入は、ポリペプチド配列のアミノ基および／またはカルボキシ基末端での欠失および挿入を含むとともに、ポリペプチド配列内での欠失および挿入も含む。例えば、全長ヒトＩＬ－２位置１でアラニン残基を欠失するか、またはＢ’Ｃ’ループ領域で１つまたは複数のアミノ酸を欠失することで、当該ループ領域の長さを短縮することができる。いくつかの実施形態において、好ましいアミノ酸変異は、単一アミノ酸置換の組み合わせまたはアミノ酸配列セグメントの置換など、アミノ酸置換である。例えば、野生型ＩＬ－２のＢ’Ｃ’ループ領域配列の全体または一部を異なる配列で置換することができ、好ましくは、長さが短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域配列を得ることができる。

【0025】

本発明において、ＩＬ－２タンパク質またはＩＬ－２配列セグメントにおけるアミノ酸位置に言及する場合、野生型ヒトＩＬ－２タンパク質（ＩＬ－２^WTとも呼ばれる）のアミノ酸配列配列番号１を参照することによって決定される（図８に示す）。配列番号１とのアミノ酸配列アラインメントによって、他のＩＬ－２タンパク質またはポリペプチド（全長配列または切断断片を含む）上の対応するアミノ酸位置を同定することができる。したがって、本発明において、特記しない限り、ＩＬ－２タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号１に従って番号付けされるアミノ酸位置である。例えば、「Ｆ４２」に言及する場合は、配列番号１の第４２位のフェニルアラニン残基Ｆ、または他のＩＬ－２ポリペプチド配列上にアラインメントされた対応する位置のアミノ酸残基を指す。アミノ酸位置決定のために実施される配列アラインメントは、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉから得ることができるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを使用して、デフォルトパラメータを用いて行うことができる。

【0026】

本明細書において、ＩＬ－２変異タンパク質に言及する場合、以下のように単一アミノ酸置換を説明する：［元のアミノ酸残基／位置／置換のアミノ酸残基］。例えば、グルタミン酸による位置３５のリジンの置換は、Ｋ３５Ｅと表すことができる。１つの所定の位置（例えば、Ｋ３５位）に複数の選択可能なアミノ酸置換方式（例えば、Ｄ、Ｅ）があり得る場合、当該アミノ酸置換は、Ｋ３５Ｄ／Ｅと表すことができる。対応的に、個々の単一アミノ酸置換は、プラス記号「＋」または「－」によって連結されて、複数の所定の位置での組み合わせ変異を表すことができる。例えば、位置Ｋ３５Ｅ、Ｔ３７Ｅ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａの組み合わせ変異は、Ｋ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａ、またはＫ３５Ｅ－Ｔ３７Ｅ－Ｒ３８Ｅ－Ｆ４２Ａと表すことができる。

【0027】

本明細書において、「配列同一性パーセント」は、比較ウィンドウ内で２つの最適アラインメント配列を比較することによって決定することができる。好ましくは、配列同一性は、参照配列（例えば、配列番号１）の全長にわたって決定される。比較のための配列アラインメント方法は、当該分野において周知である。配列同一性パーセントを決定するのに適用されるアルゴリズムは、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムを含む（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２，１９７７およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０を参照）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から公的に入手可能である。本願の目的のため、同一性パーセントは、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉから得ることができるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを使用して、デフォルトパラメータを用いて決定することができる。

【0028】

本明細書で使用されるように、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの生物学的機能に悪影響を及ぼさない、または変化させないアミノ酸置換を意味する。例えば、保存的置換は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの当該分野で既知の標準的な技術によって導入することができる。典型的な保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸に置換することを指す。機能的に類似するアミノ酸の保存的置換表は、当該分野でよく知られているものである。本発明において、保存的置換残基は、以下の保存的置換表Ｘ、特に表Ｘにおける好ましい保存的アミノ酸置換残基に由来する。

【0029】

【表1】

【0030】

例えば、野生型ＩＬ－２タンパク質は、配列番号１－３の１つに対して保存的アミノ酸置換を有してもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有してもよく、且つ１つの好ましい実施形態において、保存的置換は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の残基など、１０個以下のアミノ酸残基を有する。さらに例えば、本発明の変異ＩＬ－２タンパク質は、本明細書に具体的に示されるＩＬ－２変異タンパク質配列（例えば配列番号３７－６３８のいずれか１つ）に対して保存的アミノ酸置換を有してもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有してもよく、且つ１つの好ましい実施形態において、保存的置換は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の残基など、１０個以下のアミノ酸残基を有する。

【0031】

「親和性」または「結合親和性」は、結合対のメンバー間の相互作用の内部結合能力を反映するために使用することができる。分子Ｘのその結合パートナーＹに対する親和性は、平衡解離定数（Ｋ_D）によって示されてもよく、平衡解離定数は、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋ_disとｋ_onである）との比率である。結合親和性は当該分野で既知の常用方法で測定されてもよい。親和性を測定するための１つの具体的な方法は、本明細書のＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定技術である。

【0032】

本明細書において、抗原結合分子は、抗原に特異的に結合し得るポリペプチド分子、例えば免疫グロブリン分子、抗体または抗体断片、例えばＦａｂ断片およびｓｃＦｖ断片である。

【0033】

本明細書において、抗体Ｆｃ断片とは、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ－末端領域であり、且つ天然配列Ｆｃ断片および変異体Ｆｃ断片を含むことができる。天然配列Ｆｃ断片は、様々なＩｇサブタイプおよびそのアロタイプのＦｃ領域など、天然に存在する様々な免疫グロブリンＦｃ配列を含む（Ｇｅｓｔｕｒ Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，２０ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１４．００５２０．）。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ断片は、重鎖のＣｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０からカルボキシ基末端まで延びる。他の実施形態において、Ｆｃ－断片のＣ－末端リジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、存在しなくてもよい。他のいくつかの実施形態において、Ｆｃ断片は変異を含む変異体Ｆｃ断片であり、例えば、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ変異を含む。本明細書に特記しない限り、Ｆｃ断片におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けシステムによるものであり、ＥＵインデックスとも呼ばれる。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２に記載される。いくつかの実施形態において、抗体Ｆｃ断片は、Ｎ末端にＩｇＧ１ヒンジ配列またはＩｇＧ１ヒンジ配列の一部、例えばＥＵ番号付けによる配列Ｅ２１６からＴ２２５または配列Ｄ２２１からＴ２２５を有することができる。前記ヒンジ配列に変異が含まれ得る。

【0034】

ＩＬ－２タンパク質は、４つのαヘリックスバンドル（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）構造を有する短鎖Ｉ型サイトカインファミリーのメンバーに属する。本明細書において、「Ｂ’Ｃ’Ｌｏｏｐ」または「Ｂ’Ｃ’ループ領域」または「Ｂ’Ｃ’ループ配列」という用語は互換的に使用されてもよく、ＩＬ－２タンパク質のＢヘリックスとＣヘリックスとの間の連結配列を指す。ＩＬ－２の結晶構造の分析（例えばＰＤＢ：２ＥＲＪ）により、１つのＩＬ－２タンパク質のＢ’Ｃ’ループ配列を決定することができる。本発明の目的のために、配列番号１の番号付けによれば、当該Ｂ’Ｃ’ループ配列は、ＩＬ－２ポリペプチドにおける位置７２の残基と位置８４の残基を連結する配列を指す。配列番号１、２および３の野生型ＩＬ－２タンパク質において、当該連結配列は、Ａ７３－Ｒ８３の合計１１個のアミノ酸を含む。対応的には、本明細書において、「短縮されたループ領域」または「短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域」という用語は、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、長さが短縮されたＢ’Ｃ’ループ配列を有する変異タンパク質を指し、即ち、配列番号１の番号付けによると、アミノ酸残基ａａ７２とａａ８４との間の連結配列の長さが短縮されている。「短縮されたループ領域」は、ループ配列の置換または切断によって実現することができる。前記置換または切断は、Ｂ’Ｃ’ループ配列の任意の領域または部分で発生することができる。例えば、置換または切断は、ループ領域Ａ７３－Ｒ８３配列の置換または当該配列Ｃ末端の１つまたは複数のアミノ酸残基からの切断であってもよい。さらに、例えば、置換または切断は、ループ領域Ｑ７４－Ｒ８３配列の置換または当該配列Ｃ末端の１つまたは複数のアミノ酸残基からの切断であってもよい。前記置換または切断の後、必要に応じて、創薬可能性などの変異タンパク質の特性をさらに改善するために、グリコシル化を排除するためのアミノ酸置換などの単一アミノ酸置換、および／または逆変異をさらにループ領域配列に導入することができる。したがって、本明細書において、変異後の短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域は、変異の導入後、位置７２の残基と位置８４の残基との間の配列を連結することにより説明することができる。

【0035】

本明細書において、「ＩＬ－２Ｒα結合界面」変異は、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒα（即ち、ＣＤ２５）が相互作用するアミノ酸部位で発生する変異を指す。ＩＬ－２およびその受容体複合物の結晶構造（例えばＰＤＢ：１Ｚ９２）を分析することにより、これらの相互作用部位を決定することができる。いくつかの実施形態において、前記変異は、特にＩＬ－２のアミノ酸残基３５－７２領域での変異を指し、特にアミノ酸部位３５、３７、３８、４１、４２、４３、４５、６１、６２、６８、７２での変異を指す。好ましくは、前記変異を導入する前の対応するタンパク質と比較して、前記変異を含むＩＬ－２タンパク質は、低減または排除されたＩＬ－２Ｒα結合を有する。

【0036】

本明細書において、「ＩＬ－２βγ結合界面」変異は、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβγ（即ち、ＣＤ１２２とＣＤ１３２）が相互作用するアミノ酸部位で発生する変異を指す。ＩＬ－２およびその受容体複合物の結晶構造（例えばＰＤＢ：２ＥＲＪ）を分析することにより、これらの相互作用部位を決定することができる。いくつかの実施形態において、前記変異は、特にＩＬ－２のアミノ酸残基１２－２０、アミノ酸残基８４－９５、おおびアミノ酸残基１２６領域での変異を指し、特にアミノ酸部位１２、１５、１６、１９、２０、８４、８７、８８、９１、９２、９５、１２６での変異を指す。好ましくは、前記変異を導入する前の対応するタンパク質と比較して、前記変異を含むＩＬ－２タンパク質は、弱められたＩＬ－２Ｒβγ結合を有する。

【0037】

本明細書において、ＩＬ－２Ｒβγ受容体結合に関しては、ＩＬ－２タンパク質分子の「弱体化」は、ＩＬ－２Ｒβγ結合界面に変異を導入することを指し、ここでこの変異の導入前の対応するＩＬ－２タンパク質と比較して、上記変異は、ＩＬ－２Ｒβγ受容体に対する結合親和性の低減をもたらす。さらに好ましくは、対応するタンパク質と比較して、前記弱体化分子は、低減されたＴ細胞（例えばＣＤ２５－Ｔ細胞またはＣＤ２５＋Ｔ細胞）および／またはＮＫ細胞を活性化する活性を有する。例えば、前記弱体化分子と対応するタンパク質のＴ細胞ｐＳＴＡＴ５シグナルを活性化するＥＣ５０値の比率を検出することにより、減少する倍数は例えば５倍以上、例えば１０倍以上、または５０倍以上、または１００倍以上、またはさらに１０００倍以上に達することができる。例えば、対応するタンパク質と比較して、弱体化分子のＴ細胞を活性化する活性は、１０～５０倍、または５０～１００倍、または１００～１０００倍、またはそれ以上の倍数減少することができる。したがって、本発明において、いくつかの実施形態において、本発明の弱体化分子は、「弱体化」したＩＬ－２Ｒβγ受容体への結合親和性および「弱体化」したＴ細胞活性化活性を有する。

【0038】

本発明の種々の態様は、以下の各セクションにおいてさらに詳細に説明される。

【0039】

１．本発明のＩＬ－２変異タンパク質

【0040】

本発明のＩＬ－２変異タンパク質の有利な生物学的特性

【0041】

本発明者らは、長期の研究を通じて、以下の分子変異および改造を組み合わせて実施することにより、同時にＩＬ－２の薬効を改善し、ＩＬ－２の毒性と副作用を低減し、および良好な生産性能を実現することができることを見出した。

【0042】

（ｉ）ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒβγ受容体との結合界面に特定の残基変異を導入し、ＩＬ－２Ｒβγ受容体との結合を弱体化し、ＩＬ－２の活性をある程度ダウンレギュレートする。ＩＬ－２Ｒβγ受容体結合を弱体化するこのような変異を含むことにより、本発明のＩＬ－２変異タンパク質はリンパ球を活性化して腫瘍を殺傷すると同時に、リンパ球の過剰な活性化によって引き起こされる大量の炎症性因子の放出、およびそれによってもたらした薬物関連毒性を回避することができる。なお、当該弱体化変異は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質の、リンパ球に広く存在するＩＬ－２受容体との結合親和性を低減することにより、ＩＬ－２受容体によって媒介されるＩＬ－２変異タンパク質のクリアランスを減少させ、ＩＬ－２変異タンパク質の作用持続時間を遅延することができる。

【0043】

（ｉｉ）本発明の変異ＩＬ－２タンパク質をＩＬ－２－Ｆｃ二量体に構築する。当該二量体の形成は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質の分子量を増加させ、腎クリアランスを大幅に減少させ、且つインビボでのＦｃＲｎ媒介リサイクルを通じて、ＩＬ２－Ｆｃ融合タンパク質の半減期をさらに延長することができる。それにより、ＩＬ－２の短い半減期および高頻度と高用量の投与によって引き起こされる高いピーク血中濃度の問題を克服する。

【0044】

（ｉｉｉ）ＩＬ－２のＢ’Ｃ’ｌｏｏｐ構造を改造し、例えば、それぞれＩＬ－１５分子のｌｏｏｐで置換するまたはＩＬ－２分子Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐを切断する。当該Ｂ’Ｃ’ループ変異は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質におけるＢ’Ｃ’ｌｏｏｐ構造の安定性を有意に増強し、有意に向上した発現量と純度などの、ＩＬ－２変異タンパク質およびそれによって構築されるＩＬ－２－Ｆｃ二量体分子の生産性能を有意に向上させることができる。

【0045】

また、本発明者らは、本発明の変異タンパク質において、上記優れた特性を維持すると同時に、抗腫瘍または自己免疫疾患の治療などの多くの側面におけるＩＬ－２の異なる薬物形成要件を満たすために、必要に応じて、ＩＬ－２変異タンパク質のＩＬ－２Ｒαとの結合活性を調節することもでき、それにより、本発明の変異タンパク質に優れた薬力学的特性をさらに付与することを見出した。

【0046】

例えば、本発明の変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と実質的に同等のＩＬ－２Ｒα結合活性を保持することができるか、または、（ｉｖ）ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒα受容体との結合界面での１つまたは複数の特定の変異をさらに組み合わせて、ＩＬ－２変異タンパク質のＩＬ－２Ｒαへの結合性能を変化させることができる。

【0047】

それにより、本発明のＩＬ２－Ｆｃシリーズ分子は、配列を改造することにより、その受容体ＩＬ２Ｒβ／γへの結合親和性を弱体化し、より優れた薬物動態学実験結果および薬効結果を達成する一方で、タンパク質の発現量と純度などの創薬可能性の面で大幅に向上する。

【0048】

したがって、本発明は、改善された創薬可能性および改善されたＩＬ－２受容体結合特性を有するＩＬ－２変異タンパク質を提供する。本発明のＩＬ－２変異タンパク質を含むＩＬ－２－Ｆｃ分子は、リンパ球の強力な刺激によって引き起こされる炎症性因子の過剰な放出を効果的に回避することができ、より安定して長時間作用する薬物動態特性を有する。したがって、比較的低い単回投与量によって、Ｃｍａｘが高すぎることによる薬物関連毒性を回避するのに十分に高いヒト薬物曝露量を達成することができる。なお、より有意義なことに、本発明の長時間作用型ＩＬ－２－Ｆｃ分子は、天然ＩＬ－２と比較して弱体化したリンパ球免疫刺激活性を有するが、薬物動態特性が有意に改善されるため、本発明の分子のインビボ有効薬物濃度の持続時間がより長く、リンパ球に対する比較的長時間の連続刺激を発揮し、天然ＩＬ－２分子と同等であるか、またはそれよりも優れた薬力学的効果を達成し、動物において、より優れた抗腫瘍効果と耐性を達成することができる。

【0049】

改善された創薬可能性

【0050】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、改善された創薬可能性を有する。例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞で発現される場合、特にＦｃ融合タンパク質で発現される場合、以下から選択される１項または複数項の特性を有する。（ｉ）野生型ＩＬ－２タンパク質より優れる発現量、および（ｉｉ）より高いタンパク質の純度に精製されやすいこと。

【0051】

本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して発現レベルの増加を示す。本発明のいくつかの実施形態において、発現の増加は哺乳動物細胞発現系で起こる。発現レベルは、細胞培養上清（好ましくはワンステップアフィニティークロマトグラフィー精製後の上清）中の組換えＩＬ－２タンパク質の量を定量的または半定量的に分析することを可能にする任意の適切な方法によって測定することができる。例えば、試料中の組換えＩＬ－２タンパク質の量は、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって評価することができる。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、哺乳動物細胞における発現量が少なくとも１．１倍、または少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍、３倍もしくは４倍以上、または少なくとも５、６、７、８もしくは９倍、またはさらに約１０、１５、２０、２５、３０および３５倍など、１０倍以上増加している。

【0052】

いくつかの実施形態において、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー後の精製タンパク質の純度を測定することによって示されるように、本発明のＩＬ－２変異タンパク質－Ｆｃ融合体は、野生型ＩＬ－２タンパク質融合体と比較して、高い純度を示す。いくつかの実施形態において、タンパク質の純度は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ技術によって検出される。いくつかの好ましい実施形態において、ワンステップタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後、本発明のＩＬ－２変異タンパク質－Ｆｃ融合体の純度は、７０％、または８０％、または９０％以上、好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９８％もしくは９９％以上に達することができる。

【0053】

いくつかの実施形態において、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー後の精製タンパク質の純度を測定することによって示されるように、本発明のＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質は、野生型ＩＬ－２タンパク質によって形成された対応するＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質と比較して、より高い純度を示す。いくつかの実施形態において、タンパク質の純度は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ技術によって検出される。いくつかの好ましい実施形態において、ワンステップタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後、本発明のＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質の純度は、７０％、または８０％、または９０％以上、好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９８％もしくは９９％以上に達することができる。

【0054】

弱体化したＩＬ－２βγ受容体結合性

【0055】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒβγ結合界面に変異を導入することにより、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、前記変異を導入する前の対応するタンパク質と比較して、弱体化したＩＬ－２βγ結合親和性を有する。

【0056】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異を導入して弱体化する前のタンパク質と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβおよび／またはＩＬ－２Ｒβγ受容体への結合親和性が低減している。いくつかの実施形態において、弱体化する前のタンパク質と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性が低減し、例えば、いくつかの実施形態におけるＩＬ－２Ｒβ受容体への結合の除去を含めて、１～２０倍またはそれ以上低減する。いくつかの実施形態において、弱体化する前のタンパク質と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβγ受容体への結合親和性が低減し、例えば１～１００倍またはそれ以上低減する。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβ受容体と結合しないが、それでもＩＬ－２Ｒβγ受容体と結合することができ、好ましくは、前記ＩＬ－２Ｒβγ受容体との結合は、弱体化する前のタンパク質と比較して、例えば、約２０～８０倍など、１～１００倍低減することができる。ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定技術により、Ｆｃ断片と融合された本発明のＩＬ－２変異タンパク質またはその二量体分子などの本発明のＩＬ－２変異タンパク質と受容体ＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒβγ受容体の平衡解離定数（Ｋ_D）を測定することで、結合親和性を決定することができる。

【0057】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒβγ結合界面に変異を導入することにより、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、前記変異を導入する前の対応するタンパク質と比較して、以下の少なくとも１項から選択されるＩＬ－２活性など、弱体化したＩＬ－２活性を有する：
－弱体化する前のタンパク質と比較して、Ｔ細胞（例えばＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋／ＣＤ８＋ＣＤ２５－Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞）に対する活性化の低減、
－弱体化する前のタンパク質と比較して、ＮＫ細胞に対する活性化の低減、
－弱体化する前のタンパク質と比較して、ＩＬ－２によって刺激されるＴ細胞／ＮＫ細胞の炎症性因子の放出の低減。

【0058】

一実施形態において、弱体化する前のタンパク質と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２により媒介されるリンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）の活性化および／または増殖の低下をもたらす。一実施形態において、リンパ球は、ＣＤ２５^-Ｔ細胞などのＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞である。一実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するＩＬ－２変異タンパク質の能力は、ＩＬ－２変異タンパク質によるＴ細胞またはＮＫ細胞などのリンパ球におけるＳＴＡＴ５リン酸化シグナルの活性化を検出することによって同定される。例えば、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）は、本出願の実施例に記載されるように、フローサイトメトリーによって細胞中のＳＴＡＴ５リン酸化を分析することによって決定することができる。例えば、前記の本発明のＩＬ－２弱体化分子と対応するタンパク質の、Ｔ細胞のＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＥＣ５０値の比率を検出することにより、本発明のＩＬ－２変異分子は「弱体化」したＴ細胞活性化活性を有する。当該比率に基づき、本発明のＩＬ－２変異分子のＴ細胞活性化活性は、例えば５倍以上、例えば１０倍以上、または５０倍以上、または１００倍以上、またはさらに１０００倍以上減少することができる。例えば、対応するタンパク質と比較して、本発明のＩＬ－２変異分子のＴ細胞活性化活性は、１０～５０倍、または５０～１００倍、または１００～１０００倍、またはそれ以上の倍数減少することができる。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、低減された細胞表面ＩＬ－２受容体により媒介されるＩＬ－２のクリアランスを有し、増加したインビボ半減期を示す。

【0059】

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、低減されたＩＬ－２およびその受容体により媒介されるインビボ毒性を有する。

【0060】

維持または変化したＩＬ－２Ｒα受容体結合

【0061】

ＩＬ－２タンパク質は、ＩＬ－２受容体と相互作用することによってシグナル伝達を開始し、機能を発揮する。野生型ＩＬ－２は、異なるＩＬ－２受容体に対して異なる親和性を示す。野生型ＩＬ－２との親和性が低いＩＬ－２βおよびγ受容体は、静止エフェクター細胞（ＣＤ８⁺Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む）上で発現される。野生型ＩＬ－２との親和性が高いＩＬ－２Ｒαは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）細胞および活性化エフェクター細胞上で発現される。高い親和性のために、野生型ＩＬ－２は、細胞表面のＩＬ－２Ｒαに優先的に結合し、さらにＩＬ－２Ｒβγを動員し、ＩＬ－２Ｒβγを介して下流のｐ－ＳＴＡＴ５シグナルを放出し、Ｔｒｅｇ細胞および活性化エフェクター細胞を刺激する。理論にされることなく、ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒα受容体に対する親和性を変化させると、ＣＤ２５⁺細胞を優先的に活性化するＩＬ－２の偏向性を変化させ、ＩＬ－２により媒介されるＴｒｅｇ細胞の免疫ダウンレギュレート作用を変化させる。

【0062】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、維持または変化したＩＬ－２Ｒα受容体結合能力を有する。

【0063】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合が維持される。本明細書において、「ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合の維持」という表現は、ＩＬ－２変異タンパク質が野生型ＩＬ－２タンパク質と比較してＩＬ－２Ｒα受容体と同等の結合活性を有することを指す。好ましくは、「同等の結合活性」は、同じ測定方法によって測定する場合、ＩＬ－２変異タンパク質と野生型ＩＬ－２タンパク質との結合活性の値（例えば結合親和性Ｋ_D）の間の比率が１：２０～２０：１の間にあり、好ましくは、１：１０～１０：１の間にある。好ましくは、ＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を有さない。

【0064】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、弱体化ＩＬ－２変異分子であり、且つＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合が維持される。さらなるいくつかの実施形態において、本発明の弱体化ＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を有さない。好ましくは、前記弱体化ＩＬ－２変異分子は、改善されたＴｒｅｇ選択性および／または改善されたＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３^-ＣＤ５６⁺ＮＫ細胞）選択性を有する。一実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、リンパ球に対するＩＬ－２変異タンパク質の選択性は、ＩＬ－２変異タンパク質によるＴｒｅｇ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞など、異なるリンパ球におけるＳＴＡＴ５リン酸化シグナルの活性化を検出することによって同定される。一実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＩＬ－２変異タンパク質の選択性は、他のリンパ球を実質的に活性化することなく、特定（１種または複数種）のリンパ球を選択的に活性化するＩＬ－２変異タンパク質用量ウィンドウによって反映することができる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の弱体化ＩＬ－２変異タンパク質は、ＣＤ２５^-/lowＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋エフェクターＴリンパ球などのエフェクターＴ細胞と比較して、改善されたＴｒｅｇ選択性および／または改善されたＮＫ細胞（ＣＤ３^-ＣＤ５６⁺ＮＫ細胞）選択性を示すことができる。さらなるいくつかの実施形態において、改善された選択性は、ＩＬ－２変異タンパク質の低い薬物関連毒性によって反映することができる。

【0065】

他のいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２変異タンパク質がＩＬ－２Ｒα受容体結合を低減または排除するＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を導入する。

【0066】

さらなるいくつかの実施形態において、本発明の当該ＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＣＤ２５⁺細胞を優先的に活性化するＩＬ－２の偏向性を低減する。さらなるいくつかの実施形態において、本発明の当該ＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２により媒介されるＴｒｅｇ細胞の免疫ダウンレギュレート作用を低減する。

【0067】

他のいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、免疫ダウンレギュレート作用を有する。さらなるいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、自己免疫疾患の治療に用いることができる。

【0068】

したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、例えば、以下の１項または複数項から選択される改善された特性を有する：
－野生型ＩＬ－２と比較して、高い親和性ＩＬ－２Ｒ受容体（ＩＬ－２Ｒαβγ）に対する結合親和性の維持または変化（例えば、低減または増加）、
－野生型ＩＬ－２と比較して、ＣＤ２５＋細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞とＴｒｅｇ細胞）に対する活性化の維持または変化（例えば、低減または増加）、
－野生型ＩＬ－２と比較して、ＣＤ２５＋細胞（例えばＴｒｅｇ細胞）を優先的に活性化するＩＬ－２の偏向性の維持または変化（例えば、除去もしくは低減、または増加）、
－野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２により誘導されるＴｒｅｇ細胞による免疫反応のダウンレギュレート作用の維持または変化（例えば、低減または増加）。

【0069】

いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ－２（例えば、配列番号１に示されるＩＬ－２^WT）と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合親和性が少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２５倍、特に少なくとも３０倍、５０倍もしくは１００倍以上低減した。好ましい実施形態において、本発明の変異タンパク質はＩＬ－２受容体αに結合しない。ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定技術により、Ｆｃ断片と融合された本発明のＩＬ－２変異タンパク質またはその二量体分子などの本発明のＩＬ－２変異タンパク質と受容体ＩＬ－２Ｒα受容体の平衡解離定数（Ｋ_D）を測定することで、結合親和性を決定することができる。

【0070】

一実施形態において、野生型ＩＬ－２と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２により媒介されるＣＤ２５⁺細胞の活性化および／または増殖の低下をもたらす。一実施形態において、ＣＤ２５⁺細胞はＣＤ２５⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞である。別の実施形態において、ＣＤ２５⁺細胞はＴｒｅｇ細胞である。一実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＣＤ２５⁺細胞を活性化するＩＬ－２変異タンパク質の能力は、ＩＬ－２変異タンパク質によるＣＤ２５⁺細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化シグナルの活性化を検出することによって同定される。例えば、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）は、本出願の実施例に記載されるように、フローサイトメトリーによって細胞中のＳＴＡＴ５リン酸化を分析することによって決定することができる。

【0071】

一実施形態において、野生型ＩＬ－２と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＣＤ２５⁺細胞を優先的に活性化するＩＬ－２の偏向性を排除または低減する。一実施形態において、ＣＤ２５⁺細胞はＣＤ２５⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞である。別の実施形態において、ＣＤ２５⁺細胞はＴｒｅｇ細胞である。一実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＣＤ２５^-細胞を活性化するＩＬ－２変異体の能力は、それぞれＣＤ２５^-細胞およびＣＤ２５⁺細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＩＬ－２変異タンパク質のＥＣ５０値を検出することによって同定される。例えば、ＣＤ２５⁺細胞に対するＩＬ－２変異タンパク質の活性化偏向性は、ＣＤ２５^-およびＣＤ２５⁺Ｔ細胞でＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＥＣ５０値の比率を計算することによって決定される。好ましくは、野生型タンパク質と比較して、ＣＤ２５⁺に対する変異タンパク質の偏向性は、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍またはそれ以上低減した。

【0072】

本発明の変異タンパク質

【0073】

一態様において、本発明は、野生型ＩＬ－２（好ましくはヒトＩＬ－２で、より好ましくは配列番号１配列を含むＩＬ－２）と比較して、以下の変異を含むＩｌ－２変異タンパク質を提供する：
（ｉ）ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒαとの結合界面に、特に位置３５、３７、３８、４１、４２、４３、４５、６１、６８および７２から選択される少なくとも１つの位置に、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合親和性を排除または低減する変異、
および／または
（ｉｉ）短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域（即ち、アミノ酸残基ａａ７２とａａ８４を連結する配列）、好ましくは、１０、９、８、７、６、または５未満のアミノ酸長を有し、且つ好ましくは７アミノ酸長を有し、好ましくは、前記短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域はタンパク質の発現量および／または純度の改善をもたらす、前記短縮されたループ領域、
且つ以下の変異を含む：
（ｉｉｉ）ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒβγとの結合界面に、特に位置１２、１５、１６、１９、２０、８４、８７、８８、９１、９２、９５、および１２６から選択される少なくとも１つの位置に、ＩＬ－２Ｒβγ受容体に対する結合を弱体化する変異、
ここで、アミノ酸の位置は配列番号１に従って番号付けされ、
好ましくは、前記変異タンパク質は、変異（ｉ）と（ｉｉｉ）を含むか、または変異（ｉｉ）と（ｉｉｉ）を含むか、または（ｉ）、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）を含む。

【0074】

ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異

【0075】

本発明の変異タンパク質に適用されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異は、本発明の他の変異と組み合わせるとともに、ＩＬ－２Ｒβγ結合親和性の弱体化および／またはリンパ球（例えばＴ細胞／ＮＫ細胞）を活性化する活性の弱体化をもたらすことができる任意の変異であってもよい。

【0076】

このような変異の例は、ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒβγとの結合界面で、特に位置１２、１５、１６、１９、２０、８４、８７、８８、９１、９２、９５、１２６から選択される少なくとも１つの位置に、ＩＬ－２Ｒβγ受容体結合の弱体化をもたらす変異を含むが、これらに限定されない。

【0077】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異は、
Ｌ１２Ｒ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｅ、Ｌ１２Ｑ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ１５Ｒ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｙ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｅ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｒ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｄ２０Ｎ、Ｄ２０Ｑ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｒ、Ｄ２０Ｓ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｆ、Ｄ８４Ｌ、Ｄ８４Ｋ、Ｄ８４Ｈ、Ｓ８７Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｓ８７Ｋ、Ｓ８７Ｌ、Ｓ８７Ｍ、Ｓ８７Ｈ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｔ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｋ、Ｎ８８Ｈ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｌ、Ｖ９１Ｉ、Ｖ９１Ｌ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｎ、Ｖ９１Ｑ、Ｖ９１Ｓ、Ｖ９１Ｈ、Ｉ９２Ｅ、Ｉ９２Ｔ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、Ｉ９２Ｌ、Ｅ９５Ｑ、Ｅ９５Ｇ、Ｅ９５Ｄ、Ｅ９５Ｎ、Ｑ１２６Ｅ、Ｑ１２６Ｄ、Ｑ１２６Ａ、Ｑ１２６Ｓ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｅ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｔ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｑ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉから選択される変異を含む。

【0078】

いくつかの好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異は、
Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ９５Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｎ＋Ｄ８４Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、Ｖ９１Ｉから選択される変異を含む。

【0079】

さらなるいくつかの好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異は、
－Ｄ８４Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎから選択される変異、または
－Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉから選択される変異、または
－Ｄ８４Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、およびＤ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑから選択される変異、または
－Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、およびＨ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑから選択される変異、または
さらなるいくつかの好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異は、Ｄ２０Ｎ、Ｎ８８ＤおよびＮ８８Ｒから選択される変異を含む。

【0080】

Ｂ’Ｃ’ループ領域の変異

【0081】

一態様において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、Ｂ’Ｃ’ループ領域の変異を含み、好ましくは前記変異はＢ’Ｃ’ループ領域の安定性の向上をもたらし、より好ましくは前記変異は本発明のＩＬ－２変異タンパク質が増加された発現量および／または純度など、改善された創薬可能性を有することをもたらす。

【0082】

いくつかの実施形態において、導入された変異は、野生型ＩＬ－２（好ましくはヒトＩＬ－２、より好ましくは配列番号１配列を含むＩＬ－２）と比較して、変異タンパク質が短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域（即ち、アミノ酸残基ａａ７２とａａ８４との間の連結配列長が短縮された）を含むことをもたらす。

【0083】

好ましくは、前記短縮されたループ領域は、１０、９、８、７、６または５未満のアミノ酸長を有し、且つ好ましくは７アミノ酸長を有し、ここで、アミノ酸残基は配列番号１に従って番号付けされる。

【0084】

本明細書において、本発明に適用されるＢ’Ｃ’ループ領域の変異はＢ’Ｃ’ループ領域の切断および置換を含む。一実施形態において、前記変異は、Ａ（Ｑ／Ｇ）ＳＫＮ（Ｆ／Ｉ）Ｈを形成するための切断、またはＳＧＤＡＳＩＨによる置換など、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７３～ａａ８３の切断または置換を含む。他の実施形態において、前記変異は、（Ｑ／Ｇ）ＳＫＮ（Ｆ／Ｉ）Ｈを形成するための切断、またはＧＤＡＳＩＨによる置換など、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７４～ａａ８３の切断または置換を含む。

【0085】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、Ｂ’Ｃ’ループキメラ変異を含む。野生型ＩＬ－２と比較して、前記変異タンパク質は、他の４ヘリックス短鎖サイトカインファミリーのメンバーからの短いＢ’Ｃ’ループ配列による置換など、ａａ７２～ａａ８４を連結する配列のすべてまたは一部に対する置換を含む。ＩＬ－１５、ＩＬ－４、ＩＬ－２１などの他の４ヘリックス短鎖サイトカインＩＬファミリーのメンバー、または非ヒト種（例えば、マウス）由来のＩＬファミリーのメンバーから、結晶構造のｓｕｐｅｒｐｏｓｅにより、野生型ＩＬ－２を置換するのに適用される短いＢ’Ｃ’ループを同定することができる。一実施形態において、置換のための配列は、インターロイキンＩＬ－１５（特にヒトＩＬ－１５）由来のＢ’Ｃ’ループ配列である。一実施形態において、前記置換は、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７３～ａａ８３の置換を含む。他の実施形態において、前記置換は、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７４～ａａ８３の置換を含む。好ましくは、置換後、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＳＧＤＡＳＩＨまたはＡＧＤＡＳＩＨから選択されるＢ’Ｃ’ループ配列（即ち、ａａ７２～ａａ８４を連結する配列）を有する。

【0086】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、Ｂ’Ｃ’ループ切断変異を含む。野生型ＩＬ－２と比較して、前記変異タンパク質は、ａａ７２～ａａ８４を連結する配列に対する切断を含む。一実施形態において、前記切断は、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７３～ａａ８３の切断を含む。他の実施形態において、前記切断は、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７４～ａａ８３の切断を含む。例えば、Ｃ末端から１、２、３または４個のアミノ酸を切断することができる。好ましくは、切断後、本発明のＩＬ－２変異タンパク質のＢ’Ｃ’ループ領域は配列Ａ（Ｑ／Ｇ）ＳＫＮ（Ｆ／Ｉ）Ｈを有する。好ましくは、切断後、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は以下から選択されるＢ’Ｃ’ループ配列（即ち、ａａ７２～ａａ８４を連結する配列）を有する：

【0087】

【表2】

【0088】

１つの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＡＱＳＫＮＦＨまたはＳＧＤＡＳＩＨまたはＡＧＤＡＳＩＨから選択されるＢ’Ｃ’ループ領域配列（即ち、ａａ７２～ａａ８４を連結する配列）を含む。

【0089】

本発明に適用されるＢ’Ｃ’ループ変異については、本出願人の同時係属中の出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１０７０５４を参照することもできる。当該出願は、全て参照として本明細書に組み込まれている。

【0090】

ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異

【0091】

一態様において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα結合界面で、好ましくは位置３５、３７、３８、４１、４２、４３、４５、６１、６８および７２で、１つまたは複数の変異を含む。好ましくは、前記変異は、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合親和性を排除または低減する。

【0092】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２Ｒα結合界面の変異は、以下の組み合わせ（１）～（９）の１つから選択される変異の組み合わせを含む：

【0093】

【表3】

【0094】

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２Ｒα結合界面の変異は、変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａを含むか、または前記変異の組み合わせからなる。

【0095】

他のいくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２Ｒα結合界面の変異は、変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅを含むか、または前記変異の組み合わせからなる。

【0096】

他のいくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２Ｒα結合界面の変異は、変異Ｆ４２Ａを含むか、または前記変異からなる。

【0097】

他のいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を含む本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定による変化したＩＬ－２Ｒα結合など、変化したＩＬ－２Ｒα結合を有する。

【0098】

本発明に適用されるＩＬ－２Ｒα結合界面の変異については、本出願人の同時係属中の出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１０７０５５を参照することもできる。当該出願は、全て参照として本明細書に組み込まれている。

【0099】

好ましい例示的な変異の組み合わせ

【0100】

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、弱体化したＩＬ－２Ｒβγ結合を有し、且つ（ｉ）低減された（または排除された）ＩＬ－２Ｒα結合、および（ｉｉ）改善された発現レベルと純度の１項またはすべて２項から選択される改善された特性を有する。

【0101】

いくつかの実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して、
（ａ）変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａ、
（ｂ）Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ９５Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｎ＋Ｄ８４Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、およびＶ９１Ｉから選択されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異、
および、場合により、（ｉｖ）変異Ｔ３Ａ、を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。

【0102】

いくつかの実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して、
（ａ）変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ、
（ｂ）Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ９５Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｎ＋Ｄ８４Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、およびＶ９１Ｉから選択されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異、
および、場合により、（ｉｖ）変異Ｔ３Ａ、を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。

【0103】

いくつかの実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して、
（ａ）変異Ｆ４２Ａ、
（ｂ）Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ９５Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｎ＋Ｄ８４Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、およびＶ９１Ｉから選択されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異、
および、場合により、（ｉｖ）変異Ｔ３Ａ、を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。

【0104】

いくつかの実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して、
（ａ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＡＱＳＫＮＦＨ、
（ｂ）Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ９５Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｎ＋Ｄ８４Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、およびＶ９１Ｉから選択されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異、
および、場合により、（ｉｖ）変異Ｔ３Ａ、を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。好ましくは、前記ＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、ＩＬ－２Ｒα受容体結合能力が維持される。

【0105】

いくつかの実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して、
（ａ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＳＧＤＡＳＩＨまたはＡＧＤＡＳＩＨ、
（ｂ）Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ９５Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｎ＋Ｄ８４Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、およびＶ９１Ｉから選択されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異、
および、場合により、（ｉｖ）変異Ｔ３Ａ、を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。好ましくは、前記ＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、ＩＬ－２Ｒα受容体結合が維持される。

【0106】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、
（ｉ）変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａ、または変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ、または変異Ｆ４２Ａ、
（ｉｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＡＱＳＫＮＦＨまたはＳＧＤＡＳＩＨまたはＡＧＤＡＳＩＨ、
（ｉｉｉ）Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ９５Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｎ＋Ｄ８４Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、およびＶ９１Ｉから選択されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異、
および、場合により、（ｉｖ）変異Ｔ３Ａ、を含む。

【0107】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、
（ｉ）変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａ、
（ｉｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＡＱＳＫＮＦＨ、
（ｉｉｉ）Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ９５Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｎ＋Ｄ８４Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、およびＶ９１Ｉから選択されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異、
および、場合により、（ｉｖ）変異Ｔ３Ａ、を含む。

【0108】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、
（ｉ）変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａ、
（ｉｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＳＧＤＡＳＩＨまたはＡＧＤＡＳＩＨ、
（ｉｉｉ）Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ９５Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｎ＋Ｄ８４Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、およびＶ９１Ｉから選択されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異、
および、場合により、（ｉｖ）変異Ｔ３Ａ、を含む。

【0109】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、
（ｉ）変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ、
（ｉｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＡＱＳＫＮＦＨ、
（ｉｉｉ）Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ９５Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｎ＋Ｄ８４Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、およびＶ９１Ｉから選択されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異、
および、場合により、（ｉｖ）変異Ｔ３Ａ、を含む。

【0110】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、
（ｉ）変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ、
（ｉｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＳＧＤＡＳＩＨまたはＡＧＤＡＳＩＨ、
（ｉｉｉ）Ｄ２０Ｎ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、Ｄ８４Ｎ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｄ８４Ｎ＋Ｖ９１Ｉ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｈ１６Ｔ、Ｄ８４Ｔ＋Ｑ１２６Ｅ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ９５Ｎ、Ｅ９５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｎ＋Ｄ８４Ｎ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｔ＋Ｄ８４Ｑ、Ｈ１６Ｔ＋Ｖ９１Ｉ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、およびＶ９１Ｉから選択されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異、
および、場合により、（ｉｖ）変異Ｔ３Ａ、を含む。

【0111】

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、
（ｉ）変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａ、
（ｉｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＳＧＤＡＳＩＨまたはＡＧＤＡＳＩＨ、
（ｉｉｉ）ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異Ｄ８４ＮまたはＤ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑ、
および、場合により、（ｉｖ）変異Ｔ３Ａ、を含む。より好ましくは、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、（ｉ）変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａ、（ｉｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨ、（ｉｉｉ）ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異Ｄ８４Ｎ＋Ｅ９５Ｑを含む。

【0112】

さらなるいくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合が維持され、且つ
（ｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＡＱＳＫＮＦＨ、ＳＧＤＡＳＩＨまたはＡＧＤＡＳＩＨ、
（ｉｉ）Ｄ２０Ｎ、Ｎ８８Ｒ、およびＮ８８Ｄから選択されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異、
および、場合により、（ｉｉｉ）変異Ｔ３Ａ、を含む。好ましくは、ＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を有さない。

【0113】

他のいくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合が維持され、且つ
（ｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＳＧＤＡＳＩＨまたはＡＧＤＡＳＩＨ、
（ｉｉ）ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異Ｄ２０Ｎ、またはＮ８８Ｒ、またはＮ８８Ｄ、
および、場合により、（ｉｉｉ）変異Ｔ３Ａ、を含む。好ましくは、ＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を有さない。

【0114】

他のいくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合が維持され、且つ
（ｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨ、
（ｉｉ）ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異Ｄ２０Ｎ、またはＮ８８Ｒ、またはＮ８８Ｄ、
および、場合により、（ｉｉｉ）変異Ｔ３Ａ、を含む。好ましくは、ＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を有さない。

【0115】

さらなるいくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２（例えば配列番号１）と比較して、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合が維持され、且つ
（ｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨ、
（ｉｉ）ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異Ｎ８８Ｒ、
および、（ｉｉｉ）変異Ｔ３Ａ、を含む。好ましくは、ＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を有さない。一実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、アミノ酸配列において配列番号１－３の１つに列挙された野生型ＩＬ－２タンパク質の成熟領域と少なくとも８５％または９０％の同一性を有する成熟領域を有する。

【0116】

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、配列番号３７－６３８（特に配列番号４６９－５５３または５５４－６３８、好ましくは配列番号１４８または１９７、より好ましくは配列番号４８９、５１３、５１６）の１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記変異タンパク質は、配列番号３７－６３８から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。いくつかの好ましい実施形態において、前記変異タンパク質は、配列番号４６９－５５３または５５４－６３８、好ましくは配列番号１４８または１９７、より好ましくは配列番号４８９、５１３、５１６から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。

【0117】

その他の変異

【0118】

上記「ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異」、「Ｂ’Ｃ’ループ領域の変異」および「ＩＬ－２Ｒα結合界面変異」を除いて、本発明のＩＬ－２変異タンパク質の上記の１つまたは複数の有益な特性を保持すれば、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、他の領域または位置に１つまたは複数の変異をさらに有してもよい。例えば、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、発現または均質性または安定性の改善などのさらなる利点を提供するために、位置１２５での置換、例えばＣ１２５Ｓ、Ｃ１２５Ａ、Ｃ１２５Ｔ、またはＣ１２５Ｖをさらに含むことができる（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号参照）。さらに、例えば、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ２のＮ末端でのＯ糖修飾を除去するために、Ｔ３Ａなど、位置３での置換をさらに含むことができる。当業者は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質に組み込むことができる追加の変異をどのように決定するかを知っている。

【0119】

ＩＬ－２変異タンパク質と野生型タンパク質との間の配列の相違は、配列同一性によって、または両者の間の異なるアミノ酸の数によって表すことができる。一実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質と野生型タンパク質との間に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、好ましくは９５％であるが、好ましくは９７％以下、より好ましくは９６％以下の同一性を有する。他の実施形態において、本発明の上記の３種類の変異を除いて、ＩＬ－２変異タンパク質と野生型タンパク質との間に、１５個以下、例えば１～１０個、または１～５個の変異、例えば、０、１、２、３、４個の変異を有してもよい。一実施形態において、前記残りの変異は保存的置換であってもよい。

【0120】

２．融合タンパク質とＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質

【0121】

一態様において、本発明は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質をさらに提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、改善された薬物動態特性を付与することができる別のポリペプチド、例えばアルブミン、より好ましくは抗体Ｆｃ断片と融合される。

【0122】

一実施形態において、本発明は、抗体Ｆｃ断片と融合される本発明のＩＬ－２変異タンパク質を含むＩＬ－２変異タンパク質融合タンパク質を提供する。

【0123】

本発明に使用されるＦｃ断片は、エフェクター機能を低減または排除する変異を含むことができる。１つの好ましい実施形態において、Ｆｃ断片は、低減されたＦｃ領域により媒介されるエフェクター機能を有し、例えば低減または排除されたＡＤＣＣまたはＡＤＣＰまたはＣＤＣエフェクター機能を有する。例えば、いくつかの特別な実施形態において、本発明に使用されるＦｃ断片は、Ｆｃγ受容体に対する結合を低減するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異またはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａを有する。

【0124】

さらなる好ましい実施形態において、Ｆｃ断片は、血清半減期を増加する変異、例えばＦｃ断片とＦｃＲｎとの結合を改善する変異を有してもよい。

【0125】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質と融合されるＦｃ断片は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ ＦｃまたはヒトＩｇＧ４ ＦｃなどのヒトＩｇＧ Ｆｃである。一実施形態において、Ｆｃ断片は、アミノ酸配列配列番号１２を含むか、またはそれと少なくとも９０％の同一性、例えば９５％、９６％、９７％、９９％またはそれ以上の同一性を有する。

【0126】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質は、リンカーによってＦｃ領域と融合される。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５^-Ｔ細胞に対するＦｃ融合タンパク質の活性化作用を向上させるために、リンカーを選択することができる。一実施形態において、リンカーはＧＳＧＳであり、より好ましくは（Ｇ４Ｓ）₂である。

【0127】

さらなる態様において、本発明はまた、Ｆｃ断片と融合される本発明のＩＬ－２変異タンパク質を含む二量体分子を提供する。このような二量体分子は、分子量を６０～８０ＫＤａに増加させ、腎クリアランスを大幅に減少させ、且つインビボでのＦｃＲｎ媒介リサイクルを通じて、ＩＬ２－Ｆｃ融合タンパク質の半減期をさらに延長することができる。好ましくは、前記二量体分子は、野生型ＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質を含む対応する二量体分子と比較して、以下の特性の１項または複数項を有する：
－哺乳動物細胞（例えばＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞）で発現される場合における発現量および／または純度の増加、
－ＩＬ－２によるリンパ球の過剰な活性化および／または炎症性因子の放出の低減または回避、
－例えば遅延するインビボ半減期など、より優れた薬物動態特性、
－低い心血管系毒性（例えば、低い血管漏出の副作用）など、インビボで投与される時の低毒性。

【0128】

好ましくは、本発明のＩＬ－２変異タンパク質の二量体分子は、動物において投与される場合、良好な抗腫瘍効果と耐性を示す。抗腫瘍効果は、実施例に記載されている担がん動物実験での腫瘍抑制率の測定によって決定することができる。耐性は、実施例に記載されている投与後の動物モデルの体重およびその体重変化状況の検出によって決定することができる。

【0129】

いくつかの実施形態において、本発明により提供されるＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質は、ホモ二量体であり、そのうち、第１のモノマーと第２のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端まで、ｉ）ＩＬ－２変異タンパク質、ｉｉ）リンカー、およびｉｉｉ）Ｆｃ断片を含む。

【0130】

他のいくつかの実施形態において、本発明により提供されるＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質は、ヘテロ二量体であり、
ａ）Ｎ末端からＣ末端まで、ｉ）ＩＬ－２変異タンパク質、ｉｉ）リンカー、およびｉｉｉ）第１のＦｃ断片を含む第１のモノマーと、
ｂ）第２のＦｃ断片を含む第２のモノマーと、を含む。

【0131】

いくつかの実施形態において、第１のＦｃ断片と第２のＦｃ断片はそれぞれ、第１のモノマーと第２のモノマーがヘテロ二量体を形成することを促進する第１と第２のヘテロ二量体化変異を含む。いくつかの好ましい実施形態において、第１と第２のヘテロ二量体化変異は、例えば変異の組み合わせＴ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ：Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖなど、Ｋｎｏｂ：Ｈｏｌｅ変異の組み合わせを含む。

【0132】

いくつかの好ましい実施形態において、第１のＦｃ断片における第１のヘテロ二量体変異はＫｎｏｂ変異を含み、第２のＦｃ断片における第２のヘテロ二量体変異はＨｏｌｅ変異を含み、または、第１のＦｃ断片における第１のヘテロ二量体変異はＨｏｌｅ変異を含み、第２のＦｃ断片における第２のヘテロ二量体変異はＫｎｏｂ変異を含む。

【0133】

当業者に理解されるように、本発明に適用される融合タンパク質と二量体分子のＦｃ断片は任意の抗体Ｆｃ断片であってもよい。一実施形態において、本発明のＦｃ断片は、エフェクター機能サイレントである。

【0134】

一実施形態において、Ｆｃ領域のエフェクター機能とＦｃ領域の補体活性化機能から選択される１つまたは複数の特性でＦｃ断片を修飾する。一実施形態において、前記エフェクター機能または補体活性化機能は、同じアイソタイプの野生型Ｆｃ領域と比較して、低減または排除されている。一実施形態において、Ｆｃ領域のグリコシル化を低減すること、低減または排除されたエフェクター機能を天然に有するＦｃアイソタイプを使用すること、およびＦｃ領域を修飾することなどの方法によって、エフェクター機能を低減または排除する。

【0135】

一実施形態において、Ｆｃ領域のグリコシル化を低減することによってエフェクター機能を低減または排除する。一実施形態において、野生型のグリコシル化を許容しない環境で本発明の融合タンパク質または二量体分子を生産すること、Ｆｃ領域ですでに存在する炭水化物基を除去すること、および野生型のグリコシル化が起こらないようにＦｃ領域を修飾することなどの方法によって、Ｆｃ領域のグリコシル化を低減する。一実施形態において、野生型のグリコシル化が起こらないように修飾する方法によって、Ｆｃ領域のグリコシル化を低減し、例えば、下記位置の野生型アスパラギン残基が当該位置のグリコシル化に干渉する別のアミノ酸で置換されるように、Ｆｃ領域の位置２９７で変異、例えばＮ２９７Ａ変異を含む。

【0136】

一実施形態において、少なくとも１つのＦｃ領域の修飾によって、エフェクター機能を低減または排除する。一実施形態において、少なくとも１つのＦｃ領域の修飾は、位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８および４３９から選択され、１つまたは複数のＦｃ受容体との結合を破壊するＦｃ領域の点変異、位置２７０、３２２、３２９および３２１から選択され、Ｃ１ｑとの結合を破壊するＦｃ領域の点変異、およびＣＨ１構造ドメインの位置１３２の点変異から選択される。一実施形態において、前記修飾は、位置２７０、３２２、３２９および３２１から選択され、Ｃ１ｑとの結合を破壊するＦｃ領域の点変異である。別の実施形態において、前記修飾は、いくつかのＦｃ領域を排除する。

【0137】

当業者に理解されるように、本発明のヘテロ二量体の形成を促進するために、本発明の二量体分子のＦｃ断片は、第１のモノマーと第２のモノマーの二量体化に有利な変異を含むことができる。好ましくは、Ｋｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅ技術に基づいて、第１のモノマーと第２のモノマーに対応するＫｎｏｂ変異とＨｏｌｅ変異を導入する。

【0138】

したがって、一実施形態において、本発明の二量体分子は以下を含む：
ｉ）場合により、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ－領域、または
ｉｉ）場合により、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを有する、ヒトＩｇＧ４サブクラスのホモ二量体Ｆｃ－領域、または
ｉｉｉ）ヘテロ二量体Ｆｃ－領域であって、そのうち
ａ） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｗを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、または
ｂ） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＳ３５４Ｃを含み、または
ｃ） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ－領域、
または
ｉｖ）ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ－領域であって、そのうち、２つのＦｃ－領域ポリペプチドはいずれも、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含み、且つ
ａ） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｗを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、または
ｂ） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＳ３５４Ｃを含み、または
ｃ） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含む、ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ－領域、
または
ｖ）ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ－領域であって、そのうち、２つのＦｃ－領域ポリペプチドはいずれも、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを含み、且つ
ａ） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｗを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、または
ｂ） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＳ３５４Ｃを含み、または
ｃ） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含む、ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ－領域。

【0139】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ヘテロ二量体の精製に有利な他の変異をさらに含む。例えば、タンパク質Ａを使用したヘテロ二量体の精製を容易にするために、Ｈ４３５Ｒ変異（Ｅｒｉｃ Ｊ．Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：１７９４３ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１７９４３）をヘテロ二量体のＦｃ領域の１つ（例えば、Ｈｏｌｅ変異を持つＦｃ領域）に導入することができる。他のいくつかの実施形態において、ヒンジ領域を含むヘテロ二量体モノマーに関しては、ヘテロ二量体の形成を容易にするために、ヒンジ領域にＣ２２０Ｓなどの変異を導入することもできる。

【0140】

当業者には明らかなように、本発明に適用される融合タンパク質と二量体分子においてＩＬ－２変異タンパク質とＦｃ断片を連結するリンカーは、当該分野で既知の任意のリンカーであってもよい。いくつかの実施形態において、リンカーはＩｇＧ１ヒンジを含んでもよく、または（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ａｎｄ（ＧＧＧＳ）ｎから選択されるリンカー配列を含んでもよく、そのうち、ｎは少なくとも１の整数である。好ましくは、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）２、即ちＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含む。

【0141】

したがって、１つの好ましい実施形態において、本発明の二量体における各モノマーはいずれも、Ｃ末端でリンカー（Ｇ４Ｓ）２を介して配列番号１２アミノ酸配列に連結する、配列番号３７－６３８（特に配列番号４６９－５５３または５５４－６３８、好ましくは配列番号４８９、５１３、５１６）から選択されるＩＬ－２変異タンパク質を含む。いくつかの好ましい実施形態において、二量体分子の第１のモノマーは、Ｃ末端でリンカー（Ｇ４Ｓ）２を介して配列番号９アミノ酸配列に連結する、配列番号３７－６３８（特に配列番号４６９－５５３または５５４－６３８、好ましくは配列番号４８９、５１３、５１６）から選択されるＩＬ－２変異タンパク質を含み、且つ第２のモノマーは配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

【0142】

３．免疫複合体

【0143】

本発明は、本発明のＩＬ２変異タンパク質および抗原結合分子を含む免疫複合体をさらに提供する。好ましくは、抗原結合分子は、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、または抗体もしくは抗体断片、特にＦａｂ分子およびｓｃＦｖ分子である。いくつかの実施形態において、前記抗原結合分子は、腫瘍細胞上または腫瘍環境中に存在する抗原、例えば、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシンＣのＡ１ドメイン（ＴＮＣ Ａ１）、テネイシンＣのＡ２ドメイン（ＴＮＣ Ａ２）、フィブロネクチンの外部ドメインＢ（Ｅｘｔｒａ Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、ＥＤＢ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、および黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）から選択される抗原に特異的に結合する。したがって、本発明の免疫複合体は、被験者への投与後に腫瘍細胞または腫瘍環境を標的にすることができ、さらなる治療上の利点、例えば、より低い用量での治療の可能性およびそれによる副作用の低減、抗腫瘍効果の増強などを提供する。

【0144】

本発明の免疫複合体において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、別の分子または抗原結合分子に直接またはリンカーを介して結合することができ、且ついくつかの実施形態において、タンパク質加水分解切断部位が両者の間に含まれる。

【0145】

４．ポリヌクレオチド、ベクターと宿主

【0146】

本発明は、前記の任意のＩＬ－２変異タンパク質または融合タンパク質または二量体分子または複合体をコードする核酸を提供する。本発明の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当該分野で周知の方法により、新規固相ＤＮＡ合成、または野生型ＩＬ－２をコードする既存の配列のＰＣＲ変異誘発によって産生することができる。なお、本発明のポリヌクレオチドおよび核酸は、分泌シグナルペプチドをコードするセグメントを含んでもよく、本発明の変異タンパク質をコードするセグメントに操作可能に連結されて、本発明の変異タンパク質の分泌発現を誘導することができる。

【0147】

本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは、例えば真核発現ベクターなどの発現ベクターである。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターはｐＹＤＯ＿０１７発現ベクターである。

【0148】

本発明はまた、前記核酸または前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。変異ＩＬ－２タンパク質または融合体または二量体または免疫複合体の発現を複製および支持するのに適用される宿主細胞は、当該分野で周知である。特定の発現ベクターでこのような細胞をトランスフェクションまたは形質導入することができるとともに、ベクターを含む多くの細胞を大規模な発酵槽に接種するために増殖させることができ、臨床的使用のための十分な量のＩＬ－２変異体または融合体または二量体または免疫複合体が得られる。一実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞もしくは２９３細胞）から選択される。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓系（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ３６，５９（１９７７）に記載された２９３または２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ（ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，ＢｉｏｌＲｅｐｒｏｄ２３，２４３－２５１（１９８０）に記載されたＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、ｂｕｆｆａｌｏラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．ＡｃａｄＳｃｉ３８３，４４－６８（１９８２）に記載された）、ＭＲＣ５細胞およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７７，４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。一実施形態において、宿主細胞は真核生物細胞であり、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ球（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳動物細胞である。

【0149】

５．調製方法

【0150】

さらなる態様において、本発明は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質または融合体または二量体または複合体を調製する方法を提供し、前記方法は、ＩＬ－２変異タンパク質または融合体または二量体または複合体の発現に適した条件下で、前記タンパク質または融合体または二量体または複合体をコードする核酸を含む上記で提供されるような宿主細胞を培養するステップと、場合により前記宿主細胞（または宿主細胞培地）から前記タンパク質または融合体または二量体または複合体を回収するステップとを含む。

【0151】

６．測定方法

【0152】

当該分野で既知の様々な測定方法を利用して、本明細書により提供されるＩＬ－２変異タンパク質に対して同定、スクリーニング、またはその物理的／化学的特性および／または生物学的活性の特性評価を行うことができる。

【0153】

一態様において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質に対してＩＬ－２受容体へのその結合活性を測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットなどのような当該分野で既知の方法、または本明細書の実施例に開示されている例示的な方法によって、ヒトＩＬ－２Ｒαまたはβタンパク質またはＩＬ－２ＲβγまたはＩＬ－２Ｒαβγとの結合を測定することができる。例えば、細胞表面上で変異タンパク質を発現するようにトランスフェクションされた酵母ディスプレイ細胞などの細胞を、標識された（例えばビオチン標識された）ＩＬ－２Ｒαまたはβタンパク質またはＩＬ－２ＲβγまたはＩＬ－２Ｒαβγ複合物と反応させるフローサイトメトリーによって測定することができる。あるいは、結合動力学（例えばＫ_D値）を含めて、変異タンパク質の受容体への結合は、ＩＬ－２－Ｆｃ融合体または二量体分子の形態を使用してＦｏｒｔｅＢｉｏ測定法において測定することができる。

【0154】

さらなる態様において、受容体結合の下流で起こるシグナル伝達および／または免疫賦活効果を測定することによって、ＩＬ－２変異タンパク質のＩＬ－２受容体に結合する能力を間接的に測定することができる。

【0155】

したがって、いくつかの実施形態において、生物学的活性を有する変異ＩＬ－２タンパク質を同定するための測定法を提供する。生物学的活性は、例えば、ＩＬ－２受容体を有するＴおよび／またはＮＫ細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導する能力、ＩＬ－２受容体を有するＴおよび／またはＮＫ細胞および／またはＴｒｅｇ細胞におけるＩＬ－２シグナル伝達を誘導する能力、低下したＴ細胞におけるアポトーシスを誘導する能力、腫瘍の退縮を誘導するおよび／または生存を改善する能力、ならびに低下した血管透過性などの低下したインビボ毒性特性を含んでもよい。本発明は、インビボおよび／またはインビトロにこのような生物学的活性を有する変異ＩＬ－２タンパク質、そのＦｃ融合体およびそれを含む二量体分子も提供する。

【0156】

当該分野で周知の様な方法は、ＩＬ－２の生物学的活性を測定するために使用することができる。例えば、（例えば、二量体分子の形態で）ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの生成を刺激する本発明のＩＬ－２変異タンパク質の能力を試験するための適切な測定法は、培養されたＮＫ細胞を本発明の変異ＩＬ－２タンパク質とインキュベートし、その後、ＥＬＩＳＡによって培地中のＩＦＮ－γ濃度を測定するステップを含むことができる。ＩＬ－２シグナル伝達は、いくつかのシグナル伝達経路を誘導し、ＪＡＫ（Ｊａｎｕｓキナーゼ）およびＳＴＡＴ（シグナル伝達物質および転写活性化因子）シグナル伝達分子に関与する。

【0157】

ＩＬ－２と受容体βおよびγサブユニットとの相互作用は、受容体およびＪＡＫ１とＪＡＫ３（βおよびγサブユニットとそれぞれ結合する）のリン酸化をもたらす。次に、ＳＴＡＴ５はリン酸化受容体と結合し、それ自体が非常に重要なチロシン残基上でリン酸化される。これによりＳＴＡＴ５が受容体から解離し、ＳＴＡＴ５が二量体化され、ＳＴＡＴ５二量体が細胞核に移行し、当該位置に標的遺伝子の転写を促進する。したがって、ＩＬ－２受容体を介してシグナル伝達を誘導する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの能力は、例えばＳＴＡＴ５のリン酸化を測定することによって評価することができる。この方法の詳細は、実施例に開示されている。例えば、ＰＢＭＣを本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または二量体または免疫複合体で処理し、リン酸化ＳＴＡＴ５のレベルをフローサイトメトリーによって測定することができる。

【0158】

さらに、腫瘍成長および生存に対する変異ＩＬ－２の影響は、当該分野で既知の様々な動物腫瘍モデルにおいて評価することができる。例えば、がん細胞系の異種移植片を免疫不全マウスに移植し、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または二量体または免疫複合体で処理することができる。腫瘍抑制率（例えば、アイソタイプ対照抗体と比較して計算される）に基づいて、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチド、融合体、二量体および免疫複合体のインビボ抗腫瘍効果を検出することができる。なお、動物の体重変化（例えば、投与前と比較して、絶対体重の変化または体重変化パーセント）に基づいて、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチド、融合体、二量体分子および免疫複合体のインビボ毒性を測定することができる。死亡率、生存期間観察（行動、体重、体温などの有害作用の目に見える症状）および臨床的および解剖学的病理学（例えば、血液化学値の測定および／または組織病理学的分析）に基づいて、前記インビボ毒性を測定することもできる。

【0159】

さらなる態様において、当該分野で既知の方法によって、発現量と製品の純度などの本発明の変異タンパク質の創薬可能性を特徴付けることができる。発現量の測定について、変異タンパク質が培養細胞から分泌され、培養上清で発現される場合、遠心分離により収集された細胞培養液のタンパク質含有量を測定することができる。あるいは、収集された細胞培養液のワンステップの精製後に、例えばワンステップアフィニティークロマトグラフィー精製後に、測定することができる。製品純度の測定について、得られた生産細胞の培養上清に対してワンステップアフィニティークロマトグラフィー精製を実施した後、純度を測定して、変異タンパク質の精製性能を検出することができる。好ましくは、本発明の変異タンパク質は、このワンステップアフィニティークロマトグラフィーによる精製後、野生型タンパク質よりも有意に優れた純度を有し、本発明の変異タンパク質がより良好な精製性能を有することを示している。純度測定法は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法を含むが、これに限定されない、当該分野で既知の任意の従来の方法であってもよい。

【0160】

さらなる態様において、当該分野で既知の方法によって、本発明の変異タンパク質、融合体および二量体分子の半減期などの薬物動態特性を特徴付けることができる。

【0161】

７．ＩＬ－２タンパク質の改造方法

【0162】

一態様において、本発明は、改善された特性を有するＩＬ－２変異タンパク質を得るための方法およびこの方法により得られたＩＬ－２変異タンパク質を提供する。

【0163】

一実施形態において、本発明の方法は、
（１）ＩＬ－２のＢ’Ｃ’ループ領域で変異により当該ループ領域配列を短縮させ、および、場合によりＩＬ－２のＩＬ－２Ｒβγとの結合界面に１つまたは複数の変異を導入し、および／またはＩＬ－２のＩＬ－２Ｒａとの結合界面に１つまたは複数の変異を導入するステップと、
（２）哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞）において、ＩＬ－２変異タンパク質を、例えばＦｃ融合体（例えばＦｃＬＡＬＡ融合体）の形態で発現するステップ、を含む。

【0164】

さらなる実施形態において、本発明の方法は、
（１）ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒβγとの結合界面に１つまたは複数の変異を導入し、および、場合によりＩＬ－２のＢ’Ｃ’ループ領域で変異により当該ループ領域配列を短縮させ、および／またはＩＬ－２のＩＬ－２Ｒａとの結合界面に１つまたは複数の変異を導入し、好ましくは一実施形態において、ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒａとの結合界面に変異を導入しないステップと、
（２）哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞）において、ＩＬ－２変異タンパク質を、例えばＦｃ融合体（例えばＦｃＬＡＬＡ融合体）の形態で発現するステップ、を含む。

【0165】

上記の任意の実施形態において、好ましくは、前記短縮されたループ領域は１０、９、８、７、６、または５未満のアミノ酸長を有し、且つ好ましくは７アミノ酸長を有し、
より好ましくは、前記Ｂ’Ｃ’ループ領域の変異は、以下を含む：
（ａ）Ｂ’Ｃ’ループ領域のａａ７４～ａａ８３に対する置換、例えば、ＩＬ１５のＢ’Ｃ’ループ配列など、４ヘリックス短鎖サイトカインのＩＬファミリーのメンバーからの短いＢ’Ｃ’ループ配列による置換、好ましくは配列ＧＤＡＳＩＨによる置換、または
（ｂ）Ｂ’Ｃ’ループ領域のａａ７４～ａａ８３に対する切断、例えばＣ末端からの１、２、３または４個のアミノ酸の切断、好ましくは配列（Ｑ／Ｇ）ＳＫＮ（Ｆ／Ｉ）Ｈを形成するための切断、より好ましくは以下から選択される配列を形成するための切断：

【0166】

【表4】

【0167】

好ましくは、前記ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異は、上記ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異を含み、
好ましくは、前記ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異は、上記ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を含み、
好ましくは、前記変異タンパク質は、（ｉ）改善された発現量および／またはタンパク質の純度（例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出による、ワンステップアフィニティークロマトグラフィー後の純度）、および、場合により、（ｉｉ）弱体化されたＩＬ２Ｒβ結合および／または（ｉｉｉ）変化したＩＬ－２Ｒａ結合という改善された特性を有する。

【0168】

一実施形態において、本発明の方法は、ステップ（１）と（２）の後に、（ｉ）発現量および／または精製後のタンパク質の純度（例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出による、ワンステップアフィニティークロマトグラフィー後の純度）、および、場合により、（ｉｉ）弱体化されたＩＬ２Ｒβ結合、および／または（ｉｉｉ）変化したＩＬ２Ｒα結合という変異タンパク質の特性を同定するステップをさらに含む。さらなる実施形態において、本発明の方法は、ステップ（１）と（２）の後に、（ｉ）発現量および／または精製後のタンパク質の純度（例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出による、ワンステップアフィニティークロマトグラフィー後の純度）、および（ｉｉ）弱体化されたＩＬ２Ｒβ結合、且つ好ましくは維持されたＩＬ２Ｒα結合という変異タンパク質の特性を同定するステップをさらに含む。

【0169】

一実施形態において、前記方法は、ステップ（１）の変異の組み合わせを行う前に、創薬可能性（例えば、発現量および／または製品安定性および／または均質性、例えば、ワンステップＦｃアフィニティークロマトグラフィー純度）が改善されたＩＬ－２変異を同定するステップを含む。１つの好ましい実施形態において、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐループを短縮されたＢ’Ｃ’ｌｏｏｐループに置換または切断することにより、変異タンパク質の創薬可能性を改善する。

【0170】

一実施形態において、前記方法は、ステップ（１）の変異の組み合わせを行う前、野生型ＩＬ－２と比較して、弱体化されたＩＬ２Ｒβ結合および／または変化したＩＬ－２Ｒａ結合の能力を付与するＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異および／またはＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を同定するステップを含む。

【0171】

当業者には明らかなように、これらの変異を、さらに改善された創薬可能性または他の改良された特性を付与する変異と組み合わせて、複数の改良された特性を有するＩＬ－２変異タンパク質を得ることができる。

【0172】

一実施形態において、（例えば既知の）ＩＬ－２Ｒβγ結合の弱体化をもたらすＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異を、（例えば既知の）創薬可能性が改善されたＢ’Ｃ’ループ領域の変異と組み合わせて、ＩＬ－２タンパク質に導入して特性を同定する。１つの好ましい実施形態において、前記同定は、野生型ＩＬ－２と比較して、弱体化されたＩＬ－２Ｒβγ結合および改善された創薬可能性（例えば改善された発現および／または純度、および／または製品安定性および／または均質性）、場合により、基本的に変化しないかまたは弱体化されたか増強されたＩＬ－２Ｒα結合親和性を含む。

【0173】

いくつかの実施形態において、変異テンプレートとして使用される親野生型ＩＬ－２タンパク質は、好ましくは、配列番号１と少なくとも８５％、または少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、より好ましくは、ヒト由来のＩＬ－２タンパク質である。

【0174】

８．医薬組成物と医薬製剤

【0175】

本発明は、ＩＬ－２変異タンパク質またはその融合体または二量体または免疫複合体を含む組成物（医薬組成物または医薬製剤を含む）、およびＩＬ－２変異タンパク質またはその融合体または二量体または免疫複合体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物をさらに含む。これらの組成物はまた、当該分野で既知の薬学的に許容可能な担体、緩衝剤を含む薬学的に許容可能な賦形剤などの適切な薬学的に許容可能な補助材料を必要に応じて含んでもよい。

【0176】

９．組み合わせ製品

【0177】

一態様において、本発明は、本発明の変異タンパク質またはその融合体または二量体または免疫複合体、および１種または複数種の他の治療剤（例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害剤、ワクチン、抗感染症剤など）を含む組み合わせ製品をさらに提供する。本発明の組み合わせ製品は、本発明の治療方法において使用できる。

【0178】

いくつかの実施形態において、本発明は、組み合わせ製品を提供し、ここで、前記他の治療剤が、例えば、免疫応答を刺激して被験者の免疫応答をさらに増強、刺激または上方制御するのに有効な、抗体などの治療剤である。

【0179】

いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品はがんの予防または治療に用いられる。いくつかの実施形態において、がんは、例えば、直腸がん、結腸がん、結腸直腸がんなどの胃腸管のがんである。いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品は、例えば細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、原生動物感染などの感染の予防または治療に用いられる。

【0180】

１０．治療方法と使用

【0181】

本明細書において、「個体」または「被験者」という用語は、互換的に使用されてもよく、哺乳動物を指す。哺乳動物は、家畜（例えば、乳牛、綿羊、ネコ、イヌとウマ）、霊長類（例えば、ヒトとサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギおよびげっ歯類（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。特に、被験者はヒトである。

【0182】

本明細書において、「治療」という用語は、治療を受けている個体における疾病の天然過程を変化させようとする臨床的介入を指す。所望の治療效果は、疾病の発生または再発の防止、症状の軽減、疾病の如何なる直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、病状進展速度の低減、疾病の状態の改善または緩和、および予後の緩和または改善を含むが、これらに限定されない。

【0183】

一態様において、本発明は、有効量の本発明のＩＬ－２変異タンパク質または融合体または二量体または免疫複合体を含む医薬組成物を被験者に投与するステップを含む、被験者の免疫系を刺激する方法を提供する。

【0184】

本発明の弱体化されたＩＬ－２－Ｆｃ分子は、リンパ球の強力な刺激によって引き起こされる炎症性因子の過剰な放出を効果的に回避することができ、より安定して長時間作用する薬物動態特性を有する。したがって、一実施形態において、比較的低い単回投与量によって、Ｃｍａｘが高すぎることによる薬物関連毒性を回避するのに十分に高いヒト薬物曝露量を達成することができる。

【0185】

したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、有効量の本明細書に記載の任意のＩＬ－２変異タンパク質、またはその融合体または免疫複合体を被験者に投与するステップを含む、被験者の身体の免疫応答を増強する方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体を、腫瘍を有する被験者に投与し、抗腫瘍免疫応答を刺激する。別のいくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合部分を、感染を有する被験者に投与し、抗感染免疫応答を刺激する。

【0186】

別の態様において、本発明は、有効量の本明細書に記載の任意のＩＬ－２変異タンパク質、またはその融合体または免疫複合体を前記被験者に投与するステップを含む、がんなどの被験者の疾患を治療する方法に関する。がんは、早期、中期もしくは末期にあるがんまたは転移性がんであってもよい。いくつかの実施形態において、がんは、例えば、直腸がん、結腸がん、結腸直腸がんなどの胃腸管のがんであってもよい。

【0187】

別の態様において、本発明は、有効量の本明細書に記載の任意のＩＬ－２変異タンパク質またはその断片、または前記抗体もしくは断片を含む免疫複合体、多重特異性抗体、または医薬組成物を前記被験者に投与するステップを含む、慢性感染などの被験者の感染性疾患を治療する方法に関する。一実施形態において、前記感染はウイルス感染である。

【0188】

別の態様において、本発明は、有効量の本明細書に記載の任意のＩＬ－２変異タンパク質またはその断片、または前記抗体もしくは断片を含む免疫複合体、多重特異性抗体、または医薬組成物を前記被験者に投与するステップを含む、対象におけるＴｒｅｇ調節関連疾患の治療方法に関する。一実施形態において、前記疾患は、ＩＬ－２により媒介されるＴｒｅｇ細胞を介する免疫ダウンレギュレートに関連する。一実施形態において、前記疾患は、自己免疫性疾患である。

【0189】

本発明の変異タンパク質（およびそれを含む医薬組成物またはその融合体または二量体または免疫複合体、任意の他の治療剤）は、非経口投与、肺内投与、鼻腔内投与を含む任意の適切な方法により投与されてもよく、且つ、局所治療に必要な場合、病巣内に投与されてもよい。非経口注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与を含む。投与が短期であるか長期であるかによってある程度決まり、投与は、例えば、静脈内注射投与または皮下注射投与などの注射を含む任意の適切な経路によることができる。本明細書において、非限定的であるが、単回投与または複数の時刻での複数回投与、ボーラス投与、パルス注入などの様々な投与スケジュールが含まれる。

【0190】

疾患を予防または治療するために、本発明の変異タンパク質の適切な用量（単独で投与される場合または１種または複数種の他の治療剤と組み合わせて投与される場合）が、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度とその進行、予防目的の投与か治療目的の投与か、過去の治療、患者の臨床病歴および前記抗体に対する応答、主治医の判断によって決定される。前記抗体は、単回の治療で、または一連の治療にわたって患者に適切に投与される。

【0191】

さらなる態様において、本発明はまた、上記の方法に使用される（例えば治療のため）薬物の調製における、本発明のＩＬ－２変異タンパク質、組成物、免疫複合体、融合体、二量体分子の使用を提供する。

【0192】

本発明の理解を補助するために、以下の実施例を説明する。如何なる方法によっても、実施例を、本発明の請求範囲を制限するものと解釈する意図はなく、そうすべきでもない。

【実施例】

【0193】

実施例１：インターロイキン２のＩＬ－２Ｒα結合界面変異体の設計と構築

【0194】

インターロイキン２変異ライブラリーの設計と構築

【0195】

変異ライブラリーの設計

【0196】

インターロイキン２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２、ＩＬ－２と略称）とそのα受容体ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒαと略称）複合物の結晶構造（ＰＤＢ：１Ｚ９２）（図１に示す）に基づいて、相互作用部位のＩＬ－２残基を表１に示されるように変異させた。野生型ＩＬ－２（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８，ａａ２１－１５３，Ｃ１２５Ｓ、ＩＬ－２^WTと略称）は、変異ライブラリー構築のテンプレートとした。各部位の元のアミノ酸は５０％の割合を占め、残りの５０％の割合は、表１の「変異アミノ酸」で均等に分割されるように、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαの相互結合部位に対する酵母ベースの、ＩＢＹＤＬ０２９（Ｉｎｎｏｖｅｎｔｂｉｏ Ｙｅａｓｔ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｙ）と命名されたＩＬ－２^mutantディスプレイライブラリーを設計および産生した。フローサイトメトリーＦＡＣＳにより、ライブラリーからＩＬ－２Ｒαと結合しないＩＬ－２変異体をスクリーニングした。

【0197】

【表5】

【0198】

ＩＬ－２^WTの配列は、本出願において、ジスルフィド架橋ＩＬ－２二量体の形成を回避するために１２５位にＣ１２５Ｓ変異が導入された配列番号１に示されている。

【0199】

既存の文献によると、ＩＬ－２変異体ＩＬ－２^3XはＩＬ－２Ｒαに結合せず、ＩＬ－２Ｒβへの結合力が一定に維持された（Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：１５３７３，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５３７３）。ＩＬ－２^3Xを酵母表面にディスプレイし、対照として使用した。ＩＬ－２^3Xの配列は配列番号４に示され、当該タンパク質はＩＬ－２^WTと同様に、Ｃ１２５Ｓ変異も含む。

【0200】

ＩＬ－２Ｒα結合界面変異体の同定

【0201】

ＩＬ－２受容体の発現と精製

【0202】

ベクターの構築

【0203】

ＩＬ－２受容体ＩＬ－２Ｒα（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１５８９，ａａ２２－２１７）およびＩＬ－２Ｒβ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１４７８４，ａａ２７－２４０）は配列のＣ末端にａｖｉタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、当該タグペプチドはＢｉｒＡ酵素によって触媒されてビオチン化することができる）および６つのヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）を連結し、ｐＴＴ５ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）にそれぞれ構築した。構築によって産生された受容体の配列は配列番号５および６に示されている。

【0204】

ＩＬ－２受容体βγ複合物はＫｎｏｂｓ ｉｎ ｈｏｌｅｓに基づいたＦｃヘテロ二量体であり、ＩＬ－２Ｒβの配列はＦｃ－ＫｎｏｂのＮ末端（配列番号７）に構築され、ＩＬ－２Ｒγの配列はＦｃ－ＨｏｌｅのＮ末端（配列番号８）に構築され、それぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクターに構築された後、Ｅｘｐｉ２９３細胞で共発現された。

【0205】

プラスミドのトランスフェクション

【0206】

必要なトランスフェクション体積に応じて、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を継代し、トランスフェクションの前日に細胞密度を１．５×１０⁶個の細胞／ｍＬに調整した。トランスフェクションの当日に細胞密度は約３×１０⁶個の細胞／ｍＬであった。最終体積の１／１０（ｖ／ｖ）のＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製品番号：３１９８５－０７０）をトランスフェクション緩衝液として、上記で構築した発現プラスミドを加え、均一に混合し、０．２２μｍのフィルターヘッドで濾過して使用に備えた。前のステップのプラスミドに適量のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，２３９６６）を加え（プラスミドとＰＥＩの質量比率が１：３）、均一に混合してから室温で１０ｍｉｎインキュベートし、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を得た。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物をＨＥＫ２９３細胞に緩やかに注入して均一に混合し、３７℃、８％のＣＯ₂の条件下で２４ｈ培養した後、最終濃度が２ｍＭおよび２％（ｖ／ｖ）のＦｅｅｄ（１ｇ／Ｌ Ｐｈｙｔｏｎｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ＋１ｇ／Ｌ Ｄｉｆｃｏ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｈｙｔｏｎｅ）になるまでＶＰＡ（Ｓｉｇｍａ，製品番号：Ｐ４５４３－１００Ｇ）を追加し、引き続き６日間培養した。

【0207】

ＩＬ－２Ｒα－ＨｉｓとＩＬ－２Ｒβ－Ｈｉｓタンパク質の精製

【0208】

精製前に、収集した培地を４５００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心分離して、細胞を捨てた。次に上清を０．２２μｍのフィルターで濾過した。精製に使用したニッケルカラム（５ｍＬ Ｈｉｓｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ，ＧＥ，１７－３７１２－０６）を０．１ＭのＮａＯＨで２ｈ浸漬した後、５～１０倍カラム体積の超純水ですすぎ、アルカリ液を除去した。精製前に５倍カラム体積の結合緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ ７．４，３００ｍＭのＮａＣｌ）で精製カラムを平衡化し、細胞上清を平衡化したカラムに通し、１０倍カラム体積の洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ７．４，３００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのｉｍｉｄａｚｏｌｅ）をカラムに通し、非特異的に結合するヘテロタンパク質を除去し、次いで目的のタンパク質を３～５倍カラム体積の溶出液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ７．４，３００ｍＭのＮａＣｌ，１００ｍＭのｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で溶出した。収集したタンパク質を限外濾過によって濃縮してＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，７００１１－０４４）に交換した後、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥ，１０／３００ＧＬ，１０２４５６０５）でさらに単離して精製し、単量体の溶出ピークを収集し、カラムの平衡化および溶出緩衝液はＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，７００１１－０４４）であった。１００μｇの精製後のタンパク質試料を取り、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムＳＷ３０００（ＴＯＳＯＨ製品番号：１８６７５）でタンパク質の純度を測定した。

【0209】

ＩＬ－２受容体βγタンパク質の精製

【0210】

細胞を培養した後、１３０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、プレ充填カラムＨｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ，１１－００３４－９５）で上清を精製した。操作は以下のとおりである。精製前に５倍カラム体積の平衡液（０．２ＭのＴｒｉｓ，１．５ＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で充填カラムを平衡化し、収集した上清をカラムに通し、さらに１０倍カラム体積の平衡液で充填カラムを洗浄し、非特異的に結合するタンパク質を除去し、５倍カラム体積の溶出緩衝液（１Ｍのｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ３．５）で充填剤をすすぎ、溶出液を収集し、収集したタンパク質を限外濾過によって濃縮してＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，７００１１－０４４）に交換し、その後ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥ，１０／３００ＧＬ，１０２４５６０５）を用いてさらに単離して精製し、単一の溶出ピークを収集し、カラムの平衡化および溶出緩衝液はＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，７００１１－０４４）であった。１００μｇの精製後のタンパク質試料を取り、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムＳＷ３０００（ＴＯＳＯＨ製品番号：１８６７５）でタンパク質の純度を測定した。

【0211】

ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒβγタンパク質のビオチン化標識

【0212】

酵素触媒法によるビオチンの標識方法は、以下のとおりである。上記のように発現および精製された適量のＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒβγタンパク質溶液の各々に、１／１０（ｍ／ｍ）質量のＨｉｓ－ＢｉｒＡタンパク質（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０６７０９）を加え、同時に最終濃度が２ｍＭのＡＴＰ（ｓｉｇｍａ製品番号：Ａ２３８３－１０Ｇ）、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭのＤ－ビオチン（ＡＶＩＤＩＴＹ製品番号：Ｋ０７１７）を加え、３０℃で１ｈインキュベートし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥ，１０／３００ＧＬ，１０２４５６０５）により精製し、余分なビオチンとＨｉｓ－ＢｉｒＡを除去し、精製後の試料をＦｏｒｔｅｂｉｏのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＳＡ）センサ（ＰＡＬＬ、１８－５０１９）により検証し、ビオチン標識の成功を確認した。

【0213】

ＩＬ－２^mutant－ＦＣ融合タンパク質の発現、精製および同定

【0214】

発現プラスミドの構築

【0215】

フローサイトメトリーＦＡＣＳを使用して、酵母ベースのＩＬ－２^mutantディスプレイライブラリーＩＢＹＤＬ０２９からＩＬ－２Ｒαに結合しないＩＬ－２^mutantをスクリーニングした。ＩＬ－２^mutant－ＦＣ融合タンパク質を発現するために、ライブラリーからスクリーニングされたＩＬ－２^mutant配列を２つのＧＧＧＧＳを介してＦｃＬＡＬＡに連結するとともに、ｐＣＤＮＡ３．１（Ａｄｄｇｅｎｅ）のベクターに構築した。

【0216】

なお、対照として、ＩＬ－２^WT－ＦＣおよびＩＬ－２^3X－ＦＣ融合タンパク質を発現するために、ＩＬ－２^WT、ＩＬ－２^3X遺伝子配列を２つのＧＧＧＧＳを介してＦｃＬＡＬＡに連結するとともに、ｐＣＤＮＡ３．１に構築した。本実施例で使用されるＦｃは、変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１のＦｃ（ＦｃＬＡＬＡと略称、配列番号１２）を指す。

【0217】

ＩＬ－２およびＦＣ融合タンパク質の発現および精製

【0218】

化学トランスフェクション法によって融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した。化学トランスフェクション試薬ＰＥＩを使用して、製造業者によって提供されたプロトコルに従って培養されたＨＥＫ２９３細胞を一過性トランスフェクションした。まず超クリーンベンチでプラスミドＤＮＡとトランスフェクション試薬を準備し、３ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製品番号：３１９８５－０７０）を５０ｍＬの遠心管に入れ、対応するプラスミドのＤＮＡを３０μｇ加え、プラスミドを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を０．２２μｍのフィルターヘッドで濾過し、続いて９０μｇのＰＥＩ（１ｇ／Ｌ）を加え、２０ｍｉｎ静置した。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を２７ｍＬのＨＥＫ２９３細胞に緩やかに注入して均一に混合し、３７℃、８％のＣＯ₂の条件下で２０ｈ培養した後、最終濃度が２ｍＭおよび２％（ｖ／ｖ）のＦｅｅｄになるまでＶＰＡを追加し、引き続き６日間培養した。

【0219】

細胞培養後、１３０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、プレ充填カラムＨｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅを用いて上清を精製した。操作は以下のとおりである。精製前に５倍カラム体積の平衡液（０．２ＭのＴｒｉｓ， １．５ＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で充填カラムを平衡化し、収集した上清をカラムに通し、さらに１０倍カラム体積の平衡液で充填カラムを洗浄し、非特異的に結合するタンパク質を除去し、５倍カラム体積の溶出緩衝液（１Ｍのｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ３．５）で充填剤をすすぎ、溶出液を収集し、溶出液１ｍＬあたり８０μＬのＴｒｉｓ（２ＭのＴｒｉｓ）を加え、限外濾過濃縮管を用いてＰＢＳ緩衝液に交換し、濃度を測定した。１００μｇの精製後のタンパク質を濃度が１ｍｇ／ｍＬになるまで調整し、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムでＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質の純度を測定した。結果は表２に示される。図３は、表２にリストされた本発明のＩＬ－２変異体の配列を示す。

【0220】

【表6】

【0221】

ＩＬ－２^mutant－ＦＣとその受容体との親和性測定

【0222】

バイオレイヤー干渉（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）測定法を使用して本発明のＩＬ－２^mutant－ＦＣとその受容体の平衡解離定数（Ｋ_D）を測定した。

【0223】

ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は従来の方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ，２０１３．５（２）：ｐ．２７０－８）に従って行われた。簡単に言えば、候補ＩＬ－２^mutant－ＦＣのＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβのそれぞれとの親和性を次のように測定した。センサを分析緩衝液でオフラインで２０ｍｉｎ平衡化し、次にオンラインで１２０秒検出してベースラインを確立した。ヒトビオチン化標識されたＩＬ－２ＲαまたはＩＬ－２ＲβをＳＡセンサ（ＰＡＬＬ，１８－５０１９）にロードしてＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定を行った。プラトー段階になるまで、ビオチン化標識されたＩＬ－２ＲαまたはＩＬ－２Ｒβをロードしたセンサを、１００ｎＭのＩＬ－２^mutant－ＦＣを含む溶液に配置した後、結合と解離速度を測定するために、センサを分析緩衝液に移して少なくとも２ｍｉｎ解離した。１：１結合モデルを利用して動力学的分析を行った。

【0224】

上記の測定法で行われた実験において、ＨＥＫ２９３－Ｆで発現されたＩＬ－２^mutant－ＦＣとその受容体との親和性Ｋ_D値は表３に示される。対照として、同じ方法で測定されたＩＬ－２^WT－ＦＣおよびＩＬ－２^3X－ＦＣ融合タンパク質の親和性Ｋ_D値も表３に示される。

【0225】

【表7】

【0226】

親和性データから分かるように、ＩＢＹＤＬ０２９ライブラリーから得られた上記変異体は、いずれもＩＬ－２Ｒαへの結合を遮断する。

【0227】

実施例２：ＩＬ－２キメラおよび切断変異体の構築、スクリーニングおよび同定

【0228】

ＩＬ－２ Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ体と切断体の設計

【0229】

Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐ：ＩＬ－２のＢ ｈｅｌｉｘとＣ ｈｅｌｉｘとの連結配列（図２Ａ）であり、Ａ７３－Ｒ８３の合計１１個のアミノ酸を含む。

【0230】

ＩＬ－２モノマー（ＰＤＢ：１Ｍ４７）と複合物の結晶構造（ＰＤＢ：２ＥＲＪ）を比較したところ、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐが溶液中で非常に活発であり、比較的安定したコンフォメーションを形成できないため、ＩＬ－２モノマーの結晶構造でＢ’Ｃ’ｌｏｏｐが欠失していることが見出された。

【0231】

Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐを遺伝子操作することによって、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐの安定性を向上させ、ＩＬ－２の安定性を向上させた。したがって、ヒトＩＬ１５結晶構造（ＰＤＢ：２Ｚ３Ｑ）をアラインメントし、そのＢ’Ｃ’ｌｏｏｐが短くて安定であることを見出した（図２Ｂ）。したがって、１つのＩＬ－２キメラ分子（Ｌ０１７）と４つの切断分子（Ｌ０５７～Ｌ０６０）を設計した（表４に示す）。

【0232】

【表8】

【0233】

発現プラスミドの構築

【0234】

野生型ＩＬ－２（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８，ａａ２１－１５３，Ｃ１２５Ｓ，ＩＬ－２^WTと略称）、およびＩＬ－２変異体ＩＬ－２^3X（Ｒ３８Ｄ、Ｋ４３Ｅ、Ｅ６１Ｒ）、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ体および切断体を、ＧＳＧＳ連結配列を介してヒトＩｇＧ１のＦｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ，ＦｃＬＡＬＡと略称され，配列番号１２）に連結するとともに、ｐＴＴ５のベクターに構築し、以下のタンパク質を発現した：

【0235】

【表9】

【0236】

Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ体（Ｙ０１７）または切断体（Ｙ０５７）をライブラリーからスクリーニングして得られた変異体Ｙ３０Ｅ１（Ｋ３５Ｅ、Ｔ３７Ｅ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ）と組み合わせて、２つのＧＧＧＧＳを介してＦｃＬＡＬＡに連結するとともに、ｐＣＤＮＡ３．１のベクターに構築し、以下のタンパク質を発現した。ここで、Ｙ０９２は、キメラＢ’Ｃ’ｌｏｏｐループ配列ＡＧＤＡＳＩＨを有し、Ｙ１４４は、ＩＬ－２のＮ末端のＯ糖修飾を除去するために、Ｙ０９２をもとにＴ３Ａアミノ酸置換を増加した。

【0237】

【表10】

【0238】

なお、ＩＬ－２^WTおよびＩＬ－２^3Xを２つのＧＧＧＧＳを介してＦｃＬＡＬＡに連結するとともに、ｐＣＤＮＡ３．１のベクターに構築し、以下のタンパク質を発現した。

【0239】

【表11】

【0240】

上記タンパク質分子の具体的な配列情報は配列表に示す。

【0241】

融合タンパク質の発現および精製

【0242】

上記タンパク質分子は、それぞれ２９３細胞とＣＨＯ細胞で発現された。ＨＥＫ２９３細胞での発現は、ＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質の発現に用いられる実施例１の方法に従って行われた。ＣＨＯ細胞での発現は、以下のように行われた。

【0243】

必要な細胞体積に応じて、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を継代し、トランスフェクションの前日に細胞密度を３．５×１０⁶個の細胞／ｍＬに調整した。トランスフェクションの当日に細胞密度（約８～１０×１０⁶個の細胞／ｍＬ）を検出し、生存率は９５％以上に達した。ＥｘｐｉＣＨＯ^TM Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ製品番号：Ａ２９１００－０１）で細胞密度を６×１０⁶個の細胞／ｍＬに調整した。最終体積の８％（ｖ／ｖ）のＯｐｔｉＰＲＯ^TM ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ製品番号：１２３０９－０１９）をトランスフェクション緩衝液として、対応する量（０．８μｇ／ｍＬ細胞）のプラスミドを加え、均一に混合し、０．２２μｍの濾過膜で濾過して除菌し、３．２μＬ／ｍＬの細胞比でＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ，製品番号：Ａ２９１３０）におけるｒｅａｇｅｎｔを加えた。トランスフェクション試薬とプラスミドＤＮＡによって形成された複合物を室温で１～５ｍｉｎインキュベートした後、細胞に徐々に加え、３７℃、８％のＣＯ₂の条件下で１８ｈ培養した後、０．６％（ｖ／ｖ）のＥｎｈａｎｃｅｒおよび３０％（ｖ／ｖ）のＦｅｅｄを加え、引き続き６日間培養した。

【0244】

細胞を培養した後、細胞培養液を１３０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、プレ充填カラムＨｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ，１１－００３４－９５）で上清を精製した。操作は以下のとおりである。精製前に５倍カラム体積の平衡液（２０ｍＭのＴｒｉｓ，１５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で充填カラムを平衡化し、収集した上清をカラムに通し、さらに１０倍カラム体積の平衡液で充填カラムを洗浄し、非特異的に結合するタンパク質を除去し、５倍カラム体積の溶出緩衝液（１００ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ ３．５）で充填剤をすすぎ、溶出液を収集した。溶出液１ｍＬあたり８０μＬのＴｒｉｓ（２ＭのＴｒｉｓ）を加え、限外濾過濃縮管（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、製品番号：ＵＦＣ９０１０９６）を用いてＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、製品番号：７００１１－０４４）に交換し、濃度を測定した。１００μｇの精製後のタンパク質を濃度が１ｍｇ／ｍＬになるまで調整し、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムＳＷ３０００（ＴＯＳＯＨ製品番号：１８６７５）でタンパク質の純度を測定した。

【0245】

Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ体（Ｙ０１７）および切断体（Ｙ０５７／０５８／０５９）の融合タンパク質は、野生型ＩＬ－２の融合タンパク質（Ｙ００１）と比較して、ＨＥＫ２９３細胞での発現量およびワンステップアフィニティークロマトグラフィー純度がすべて有意に向上した。結果は下記の表５に示される。

【0246】

【表12】

【0247】

Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ体（Ｙ０９２とＹ１４４）、切断体（Ｙ０８９）およびさらなる変異Ｙ３０Ｅ１を含む融合タンパク質は、野生型ＩＬ－２の融合タンパク質（Ｙ０４５）と比較して、ＣＨＯ細胞での発現量およびワンステップアフィニティークロマトグラフィー純度も有意に向上した。結果は下記の表６に示される。

【0248】

【表13】

【0249】

上記データをまとめて分かるように、１）酵母ライブラリーからスクリーニングされたＹ３０Ｅ１などの点変異分子は、ＩＬ－２Ｒαへの結合を遮断することができる。２）Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ分子と切断分子は、分子の発現量と純度を増加させた。３）Ｙ３０Ｅ１とＢ’Ｃ’ｌｏｏｐ変異体との組み合わせ分子は、ＩＬ－２Ｒαを遮断するとともに、分子の発現量と純度を向上させた。

【0250】

変異体のインビトロ機能実験

【0251】

各ＩＬ－２^mutant－ＦＣによる初代ヒトＣＤ８⁺Ｔ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５シグナルの活性化を検出することにより、各変異体のＣＤ２５⁺細胞とＣＤ２５^-細胞に対する活性化を確認した。具体的なステップは以下のとおりである：

【0252】

１． ＰＢＭＣ細胞の蘇生：
ａ） 液体窒素からＰＢＭＣ細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ製品番号：ＰＢ００５Ｆ，１００Ｍ装）を取り出し、３７℃の水浴釜中にすばやく入れ、ＰＢＭＣ細胞を蘇生させた。
ｂ） 細胞を予熱した５％のヒトＡＢ血清（ＧｅｍＣｅｌｌ製品番号：１００－５１２）と１‰のＤＮＡ酵素（ＳＴＲＭＣＥＬＬ製品番号：０７９００）を含む１０ｍＬのＸ－ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ製品番号：０４－４１８Ｑ）培地に加え、４００Ｇ、２５℃で１０ｍｉｎ遠心分離して（その後の遠心分離はいずれもこの条件）１回洗浄した。
ｃ） ２０ｍＬの培地を加えて細胞を再懸濁し、３７℃の二酸化炭素インキュベーターに入れて静置して一晩培養した。

【0253】

２． ヒトＣＤ８⁺Ｔ細胞の精製：
ａ） ステップ１の懸濁細胞液を吸引し、遠心分離して上清を捨てた。
ｂ） １ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ 製品番号：２０１０４）と１００μＬのヒトＡＢ血清および１００μＬのヒトＣＤ８⁺Ｔ細胞精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 製品番号：１１３４８Ｄ）に加えて抗体混合液を陰性スクリーニングして細胞を再懸濁した。
ｃ） 均一に混合した後、４℃で２０ｍｉｎインキュベートし、５ｍｉｎごとに１回振とうした。
ｄ） インキュベートした後、１０ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加え、遠心分離して２回洗浄した。
ｅ） 同時に、１ｍＬの磁性微小球（ヒトＣＤ８⁺Ｔ細胞精製キット）に７ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加えて磁気スタンドに１ｍｉｎ置いて上清を捨て、磁性微小球を予備洗浄した。
ｆ） それぞれ１ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加えてそれぞれ微小球と細胞を再懸濁し、均一に混合した後に室温で３０ｍｉｎ回転インキュベートした。
ｇ） インキュベートした後、６ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加え、磁気スタンドに１ｍｉｎ置き、上清を収集した。
ｈ） 収集液を再び磁気スタンドに１ｍｉｎ置き、上清を収集した。
ｉ） 遠心分離して上清を捨て、予熱したＴ培地で再懸濁し、密度を１×１０⁶／ｍＬに調整した。
ｊ） 細胞の１／３を採取して後に必要の場合にＣＤ２５発現を刺激し、残りの細胞を３７℃の二酸化炭素インキュベーターに入れて静置して一晩培養した。

【0254】

３． ＣＤ８⁺Ｔ細胞を、ＣＤ２５を発現するように刺激した：
ａ） ステップ２で精製したＣＤ８⁺Ｔ細胞の１／３に抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８抗体の磁性微小球（ＧＩＢＣＯ製品番号：１１１３１Ｄ）を加え、細胞と微小球の割合は３：１であった。
ｂ） ３７℃の二酸化炭素インキュベーターに入れて３日間静置した。
ｃ） １０ｍＬの培地を加えて２回洗浄した。
ｄ） 培地を加え、細胞密度が１×１０⁶／ｍＬになるまで調整し、３７℃の二酸化炭素インキュベーターに入れて静置して２日間培養した。

【0255】

４． 細胞の純度と発現レベルの検出：
ａ） 抗ヒトＣＤ８－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品番号：１２－００８６－４２）、抗ヒトＣＤ２５－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製品番号：１２－０２５９－４２）、アイソタイプ対照抗体（ＢＤ製品番号：５５６６５３）を用いて細胞のＣＤ８とＣＤ２５を検出した。
ｂ） ステップ２における細胞はＣＤ８⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞であり、ステップ３における細胞はＣＤ８⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞であった。

【0256】

５． 各ＩＬ－２^mutant－ＦＣによるＣＤ８⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞に対するｐ－ＳＴＡＴ５シグナル活性化のＥＣ₅₀の検出：
ａ） ＣＤ８⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞を１ウェルあたり１×１０⁵細胞で９６ウェルＵ底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ製品番号：ＣＬＳ３７９９－５０ＥＡ）に敷いた。
ｂ） １００μＬの各ＩＬ－２^mutant－ＦＣ、市販ＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ製品番号：２０２－ＩＬ－５００）、ＩＬ－２^WT－ＦＣ、ＩＬ－２^3X－ＦＣを加え、最高濃度は２６６．７ｎＭから始めて４倍勾配希釈し、合計１２個の勾配であり、３７℃のインキュベーターで２０ｍｉｎインキュベートした。
ｃ） ４．２％のホルムアルデヒド溶液を５５．５μＬ加え、室温で１０ｍｉｎ固定した。
ｄ） 遠心分離して上清を捨て、２００μＬの氷メタノール（Ｆｉｓｈｅｒ製品番号：Ａ４５２－４）を加えて細胞を再懸濁し、４℃の冷蔵庫で３０ｍｉｎインキュベートした。
ｅ） 上清を遠心分離し、２００μＬの染色緩衝液（ＢＤ製品番号：５５４６５７）で３回洗浄した。
ｆ） 抗ｐ－ＳＴＡＴ５－ＡｌｅｘＦｌｏｕｒ６４７（ＢＤ製品番号：５６２０７６、１：２００希釈）を含む透過処理／固定用緩衝液（ＢＤ製品番号：５１－２０９１ＫＺ）を２００μＬ加え、室温で遮光で３ｈインキュベートした。
ｇ） 染色緩衝液で３回洗浄し、１００μＬの染色緩衝液で細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー検出を行った。
ｈ） ＩＬ－２分子の濃度を横軸として、ＡｌｅｘＦｌｏｕｒ６４７中間蛍光値を縦軸として、ｐ－ＳＴＡＴ５シグナルのＥＣ₅₀値を作成し、結果は下記の表７に示される。

【0257】

６． 各ＩＬ－２^mutant－ＦＣによるＣＤ８⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞に対するｐ－ＳＴＡＴ５シグナル活性化のＥＣ₅₀の検出：
ａ） ＣＤ８⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞を１ウェルあたり１×１０⁵細胞で９６ウェルＵ底培養プレートに敷いた。
ｂ） ステップ５におけるｂ－ｈと同様にして、ｐ－ＳＴＡＴ５シグナルのＥＣ₅₀値を作成し、結果は表７に示される。

【0258】

【表14】

【0259】

実施例３：ＩＬ－２弱体化変異体の設計

【0260】

ＩＬ－２弱体化分子の設計

【0261】

ＩＬ－２変異体の薬物動態（ＰＫ）をさらに改善し、分子の半減期を延長すると同時に、分子の毒性を低減した。ＩＬ－２複合物の結晶構造の分析（図４）（ＰＤＢ：２ＥＲＪ）に基づいて、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβの接触界面のアミノ酸を選択して変異させ、それらの間の親和性を低下させた。

【0262】

ＩＬ－２Ｒαの結合界面のアミノ酸変異、ＩＬ－２Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐの最適化およびＩＬ－２Ｒβγの結合界面のアミノ酸変異に基づいて、且つ２つのｆｏｒｍａｔフォーマットに基づいて検証し、分子の設計は表８に示される。場合により、これらの分子は、ＩＬ２のＮ末端のＯ糖修飾を除去するために、Ｔ３Ａ変異をさらに含んでもよい。

【0263】

【表15】

【0264】

上記設計に基づいて、Ｆｏｒｍａｔ １分子を発現および産生するために、具体的に以下の配列構造（Ｎ末端からＣ末端まで）を有するＩＬ－２^mutantを構築した：
－アミノ酸配列配列番号３７－６３８を有するＩＬ－２変異配列、
－リンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、
－配列番号１２のＦｃ配列。

【0265】

上記設計に基づいて、Ｆｏｒｍａｔ ２分子を発現および産生するために、具体的に以下の配列構造（Ｎ末端からＣ末端まで）を有するＩＬ－２^mutant－Ｆｃ．ＫｎｏｂおよびＦｃ．Ｈｏｌｅを構築した：
（１）ＩＬ－２^mutant－Ｆｃ．Ｋｎｏｂ
－アミノ酸配列配列番号３７－６３８を有するＩＬ－２変異配列、
－リンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、
－配列番号９のＦｃ．Ｋｎｏｂ配列、および
（２）Ｆｃ．Ｈｏｌｅ
－配列番号１０のＦｃ．Ｈｏｌｅ配列。

【0266】

ＩＬ－２弱体化変異体の発現と精製およびその受容体との親和性の測定

【0267】

Ｆｏｒｍａｔ１は、ＩＬ－２変異体を２つのＧ４Ｓを介してＩｇＧ１ＦｃＬＡＬＡのＮ末端に連結し、二価のＩＬ－２変異体分子を構築することであった。Ｆｏｒｍａｔ２は、Ｋｎｏｂ ｉｎ ｈｏｌｅのＩｇＧ１ＦｃＬＡＬＡに基づいたヘテロ二量体であり、ここで、ＩＬ－２変異体分子は２つのＧ４Ｓを介してＩｇＧ１ＦｃＬＡＬＡ－ＫｎｏｂのＮ末端に連結し、一価のＩＬ－２変異体分子を構築する。すべての配列はｐｃＤＮＡ３．１のベクターに構築した。

【0268】

タンパク質の発現および精製：実験方法は実施例２と同じであった。

【0269】

バイオレイヤー干渉（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）測定法を使用して本発明の上記ＩＬ－２変異体とその受容体の平衡解離定数（ＫＤ）を測定した。

【0270】

ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は従来の方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．Ｍａｂｓ，２０１３．５（２）：ｐ．２７０－８）に従って行われた。候補分子のＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒβγのそれぞれとの親和性の測定：センサを分析緩衝液でオフラインで２０ｍｉｎ平衡化し、次にオンラインで１２０秒検出してベースラインを確立した。ヒトビオチン化標識されたＩＬ－２ＲαまたはＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２ＲγをＳＡセンサ（ＰＡＬＬ，１８－５０１９）にロードしてＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定を行った。プラトー段階になるまで、ＩＬ－２受容体をロードしたセンサを、１００ｎＭのＩＬ－２変異体分子を含む溶液に配置した後、結合と解離速度を測定するために、センサを分析緩衝液に移して少なくとも２ｍｉｎ解離した。１：１結合モデルを利用して動力学的分析を行った。

【0271】

実験結果は表９に示される。野生型（Ｙ０４５）と比較して、ＩＬ－２変異体は発現量と純度がいずれも向上し、同時にＩＬ－２Ｒβγ結合界面のアミノ酸変異を導入することにより、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒβγとの親和性は異なる程度で低減した。下記の表中の分子構造は図６に示される。

【0272】

【表16-1】

【表16-2】

注：「－」は未検出を表し、「Ｎ．Ｂ．」は非結合を表す

【0273】

実施例４：ＩＬ－２変異体のインビトロ機能実験

【0274】

ヒトＴリンパ球におけるＩＬ－２変異体のｐＳＴＡＴ５シグナルの検出

【0275】

ＩＬ－２のＴ細胞表面ＩＬ－２ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合は、ヒトＴリンパ球のＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル経路を活性化し、ここで、ＳＴＡＴ５リン酸化レベルは、当該シグナル経路の活性化レベルを評価する重要な指標であった。正常なＴリンパ球は基本的にＩＬ－２Ｒαを発現しなかった。Ｔリンパ球に対するＩＬ－２変異体分子のｐＳＴＡＴ５シグナルを検出することにより、異なるＩＬ－２変異体分子のヒトＴ細胞を活性化する活性の強弱を評価した。

【0276】

実験材料と方法：

【0277】

実験方法：

【0278】

１．ＰＢＭＣ細胞の蘇生

【0279】

（１）、液体窒素でＰＢＭＣ細胞（Ａｌｌ Ｃｅｌｌｓ，製品番号ＰＢ００４Ｆ－Ｃ，番号ＬＰ１９１０１１Ａ／ＬＰ１９０５２９）を凍結保存し、３７℃ですばやく振って融解した。

【0280】

（２）、細胞を１０ｍＬのＣＴＳ培地（Ｇｉｂｃｏ，製品番号Ａ３０２１００２，ロット番号１９８９８２３，３７℃で予熱し、１００ｕｌのＤＮＡ酵素を含有）に緩やかに加えた。

【0281】

（３）、３００ｇ／８ｍｉｎで遠心分離し、上清を除去した。

【0282】

（４）、１０ｍＬのＣＴＳで再懸濁し、Ｔ７５培養フラスコ（ＮＵＮＣ，製品番号１５６４９９）に移し、３７℃で５％のインキュベーターで一晩安定した。

【0283】

２．ｐＳＴＡＴ５実験

【0284】

（１）、ＰＢＭＣで懸濁細胞を一晩培養し、細胞を９６ウェルＵ型プレート（Ｃｏｒｎｎｉｎｇ，製品番号ＣＬＳ３７９９－５０ＥＡ）に敷いて、細胞数は５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌであった。

【0285】

（２）、異なる希釈した検出抗体をそれぞれ９６ウェルプレートに加え、検出抗体を細胞とともに３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。

【0286】

（３）、４００ｇ／５ｍｉｎで遠心分離し、上清を除去した。

【0287】

（４）、２００ｕｌ／ウェルで、４％の組織細胞固定液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ，製品番号：Ｐ１１１０）を加え、常温で４００ｇ／３０ｍｉｎで遠心分離した。

【0288】

（５）、２００ｕｌ／ウェルで、透過化溶液（ＢＤ，製品番号：５５８０５０）を加え、４℃で３０ｍｉｎ静置し、４００ｇ／１０ｍｉｎで遠心分離した。

【0289】

（６）、２００ｕｌ／ウェルで、ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ，製品番号５５８０５０，ロット番号７２７１６０５）を加え、細胞を合計２回洗浄した。

【0290】

（７）、抗体染色液を調製し、ｐＳＴＡＴ５抗体（ＢＤ，製品番号５６２０７６，ロット番号９１４１８７２）の量は３ｕｌ／１００ｕｌのｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／ｗｅｌｌであり、ＢＶ４２１ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，製品番号３００４３４，ロット番号：Ｂ２７１３０２）、ＦＴＩＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，製品番号３００５０６，ロット番号：Ｂ２８３９３５）およびＡＦ７００ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，製品番号３００９２４，ロット番号：Ｂ２５３９６７）はそれぞれ１ｕｌ／１００ｕｌのｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／ｗｅｌｌであり、室温で１．５ｈインキュベートし、ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。

【0291】

（８）、１５０ｕｌのｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／ｗｅｌｌで再懸濁し、フローサイトメトリーを行った。

【0292】

実験結果：

【0293】

正常なＴリンパ球（ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ，ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ）におけるＩＬ－２変異分子のｐＳＴＡＴ５有効性の検出結果は、図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄおよび図７Ｅに示される。

【0294】

ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞のリン酸化レベルは、細胞の増殖能力と細胞の活性を表した。図７および表１０から分かるように、変異ＩＬ－２Ｒβ結合界面の１つまたは複数のアミノ酸によって、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２Ｒβ結合界面の変異していない分子Ｙ－１４４（ｆｏｒｍａｔ１）および２６８８（ｆｏｒｍａｔ２）と比較して、Ｔ細胞に対するリン酸化レベルが異なる程度で低減した。

【0295】

【表17】

【0296】

活性化Ｔリンパ球におけるＩＬ－２変異体のｐＳＴＡＴ５シグナルの検出

【0297】

ＩＬ－２のＴ細胞表面ＩＬ－２受容体との結合は、Ｔリンパ球のＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル経路を活性化し、ここで、ＳＴＡＴ５リン酸化レベルは、当該シグナル経路の活性化程度を評価する重要な指標であった。Ｔリンパ球が活性化された後、Ｔ細胞表面のＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）存在度は有意に増加した。

【0298】

実験方法：

【0299】

１．ＰＢＭＣ細胞の蘇生

【0300】

（１）、液体窒素でＰＢＭＣ細胞（Ａｌｌ Ｃｅｌｌｓ，製品番号ＰＢ００４Ｆ－Ｃ，番号ＬＰ１９１０１１Ａ）を凍結保存し、３７℃ですばやく振って融解した。

【0301】

（２）、細胞を１０ｍＬのＣＴＳ培地（Ｇｉｂｃｏ，製品番号Ａ３０２１００２，ロット番号１９８９８２３，３７℃で予熱し、１００ｕｌのＤＮＡ酵素を含有）に緩やかに加えた。

【0302】

（３）、３００ｇ／８ｍｉｎで遠心分離し、上清を除去した。

【0303】

（４）、１０ｍＬのＣＴＳで再懸濁し、Ｔ７５培養フラスコ（ＮＵＮＣ，製品番号１５６４９９）に移し、３７℃で５％のインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ，製品番号３１１１）で一晩安定した。

【0304】

２．Ｔリンパ球の活性化と静止

【0305】

（１）、一晩培養したＰＢＭＣから懸濁細胞を取り出し、細胞をカウントし、細胞の数と同等のＣＤ３／ＣＤ２８ Ｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，製品番号１１１３１Ｄ、ロット番号：００７８３２１６）を加え、４８ｈ活性化して刺激した。

【0306】

（２）、Ｂｅａｄｓと培地を除去し、活性化細胞を洗浄した。

【0307】

（３）、活性化細胞をＴ７５培養フラスコに移し、３７℃、５％で４８ｈ静止した。

【0308】

３．ｐＳＴＡＴ５実験

【0309】

（１）、細胞を９６ウェルＵ型プレート（Ｃｏｒｎｎｉｎｇ，製品番号ＣＬＳ３７９９－５０ＥＡ）に敷いて、細胞数は５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌであった。

【0310】

（２）、異なる希釈した検出抗体をそれぞれ９６ウェルプレートに加え、検出抗体を細胞とともに３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。

【0311】

（３）、４００ｇ／５ｍｉｎで遠心分離し、上清を除去した。

【0312】

（４）、２００ｕｌ／ウェルで、４％の組織細胞固定液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ，製品番号：Ｐ１１１０）を加え、常温で４００ｇ／３０ｍｉｎで遠心分離した。

【0313】

（５）、２００ｕｌ／ウェルで、透過化溶液（ＢＤ、製品番号：５５８０５０）を加え、４℃で３０ｍｉｎ静置し、４００ｇ／１０ｍｉｎで遠心分離した。

【0314】

（６）、２００ｕｌ／ウェルで、ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ，製品番号５５８０５０，ロット番号７２７１６０５）を加え、細胞を合計２回洗浄した。

【0315】

（７）、抗体染色液を調製し、ｐＳＴＡＴ５抗体（ＢＤ、製品番号５６２０７６，ロット番号９１４１８７２）の量は３ｕｌ／１００ｕｌのｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／ｗｅｌｌであり、ＢＶ４２１ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，製品番号３００４３４，ロット番号：Ｂ２７１３０２）、ＦＴＩＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，製品番号３００５０６，ロット番号：Ｂ２８３９３５）およびＡＦ７００ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，製品番号３００９２４，ロット番号：Ｂ２５３９６７）はそれぞれ１ｕｌ／１００ｕｌのｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／ｗｅｌｌであり、室温で１．５ｈインキュベートし、ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。

【0316】

（８）、１５０ｕｌのｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／ｗｅｌｌで再懸濁し、フローサイトメトリーを行った。

【0317】

実験結果

【0318】

ＣＤ８⁺Ｔ細胞、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞、ＮＫ細胞（ＣＤ３^-ＣＤ５６⁺）およびＴｒｅｇ細胞（ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺）におけるＩＬ－２変異分子のｐＳＴＡＴ５有効性の検出結果は、図８Ａ～Ｇおよび表１１～１２に示される。結果から分かるように、リンパ球に対する本研究のＩＬ－２変異体のｐＳＴＡＴ５活性は、いずれもヒト野生型ＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，製品番号：２０２－ＩＬ）より弱く、同時に他のリンパ球と比較して、本研究のＩＬ－２変異体分子はＴｒｅｇ細胞に対して非常に大きい選択性が示した。

【0319】

【表18】

【0320】

【表19】

【0321】

実施例５：ＩＬ－２変異分子のインビボ抗腫瘍効果

【0322】

ＩＬ－２変異分子のインビボ抗腫瘍効果を証明するために、ＭＣ３８細胞を使用してＣ５７マウスに接種し、本発明のＩＬ－２変異分子（Ｙ１４４、２１１３、２１６２）の抗腫瘍効果を測定した（分子２１１３と２１６２の構造は図６に示す）。実験にはＳＰＦグレードの雌Ｃ５７マウス（１４～１７ｇ，北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）を使用し、合格証明書の番号はＮＯ．１１００１１２０１１０９４９９９６１であった。

【0323】

ＭＣ３８細胞を定期的に継代培養してその後のインビボ実験に使用した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳ（１×）でＭＣ３８細胞を分散させ、細胞濃度が５×１０⁶個の細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。０日目に０．２ｍＬの細胞懸濁液をＣ５７マウスの右腹部に皮下接種してＭＣ３８担がんマウスモデルを確立した。

【0324】

腫瘍細胞接種の７日後に、各マウスの腫瘍体積を検出し、群分けを行い（１群あたり６匹のマウス）、投与量および投与方式は表１４に示される。接種後の７日目、１４日目、２１日目にそれぞれ投与し、図９Ａおよび９Ｂに示すように、マウスの腫瘍体積と体重を週に２～３回モニタリングし、２５日後にモニタリングを終了する。接種後の２５日目に、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を計算した。計算式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）であった。腫瘍体積の測定：ノギスを用いて腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は下記式：Ｖ＝Ｌ×Ｗ²／２に従って計算された。電子天びんを用いて体重を測定した。

【0325】

【表20】

【0326】

腫瘍体積の検出は図９Ａに示される。接種後の２５日目に、ｈ－ＩｇＧと比較して、弱体化ＩＬ－２分子２１１３（３ｍｇ／ｋｇ）、２１６２（３ｍｇ／ｋｇ）の単剤抑制率はそれぞれ７１．４％、３３．８％であった。結果から、改造後のＩＬ２分子（２１１３、２１６２）は抗腫瘍作用を有し、且つ用量効果を有することが示された。同時にマウスの体重を検出し、結果は図９Ｂ、９Ｃに示され、分子２１１３（１ｍｇ／ｋｇ）、２１６２（１ｍｇ／ｋｇ）、２１６２（３ｍｇ／ｋｇ）群のマウスの体重は有意差がなかった。対照的に、弱体化されていない分子Ｙ１４４を投与した群では、マウスはそれに不耐性を示し、２５日間のモニタリング期間が終了する前に死亡した。

【0327】

別の１つのＭＣ３８腫瘍モデルでは、他のいくつかのＩＬ－２変異分子（Ｙ０４５、２４７８、２４５４）のインビボ抗腫瘍効果を証明した（分子２４７８と２４５４の構造は図６に示す）。この実験ＭＣ３８担がんマウスの実験にはＳＰＦグレードの雌Ｃ５７マウス（１４～１７ｇ，北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）を使用し、合格証明書の番号はＮＯ．１１００１１２０１１０９４９９８２６であった。実験は基本的に上記のように行われた。

【0328】

腫瘍細胞接種の７日後に、各マウスの腫瘍体積を検出し、群分けを行い（１群あたり７匹のマウス）、投与量および投与方式は表１３、１４に示される。接種後の７日目、１４日目、２１日目にそれぞれ投与し、図１０Ａおよび１０Ｂに示すように、マウスの腫瘍体積と体重を週に２回モニタリングし、２５日後にモニタリングを終了する。接種後の２５日目に、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を計算した。計算式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）であった。腫瘍体積の測定：ノギスを用いて腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は下記式：Ｖ＝Ｌ×Ｗ²／２に従って計算された。電子天びんを用いて体重を測定した。

【0329】

【表21】

【0330】

腫瘍抑制率の結果は表１５に示される。接種後の２５日目に、ｈ－ＩｇＧと比較して、分子Ｙ０４５（１ｍｇ／ｋｇ）、２４７８（１ｍｇ／ｋｇ）、２４５４（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｙ０４５（３ｍｇ／ｋｇ）、２４７８（３ｍｇ／ｋｇ）、２４５４（３ｍｇ／ｋｇ）の単剤抑制率はそれぞれ５．３％、３９．１％、１５．６％、１９．８％、５２．６％、２３．０％であった。結果から、改造されていないＩＬ２分子（Ｙ０４５）は抗腫瘍作用を有するとともに用量効果を有し、改造された弱体化ＩＬ２分子（２４７８、２４５４）は抗腫瘍効果を有するとともに用量効果を有するが、薬効は改造されていないＩＬ２分子（Ｙ０４５）より優れることが示された。同時にマウスの体重を検出し、結果は図１０Ｂ、１０Ｃに示され、マウスの体重は有意差がなかった。

【0331】

【表22】

【0332】

実施例６：自己免疫におけるＩＬ－２変異体分子のインビボ研究

【0333】

自己免疫におけるＩＬ－２弱体化分子の潜在力を証明するために、Ｃ５７マウスを使用して、投与前および投与後の３日目、７日目に採血し、本発明のＩＬ－２弱体化分子の免疫細胞に対する影響を測定した。実験にはＳＰＦグレードの雌Ｃ５７マウス（１４～１７ｇ，北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）を使用し、合格証明書の番号はＮＯ．１１００１１２０１１０９５０００７６であった。

【0334】

３０匹のＣ５７マウスをランダムに群分けを行い（１群あたり６匹のマウス）、投与量および投与方式は表１６に示される。単回投与し、図１１Ａおよび１１Ｂに示すように、マウスの体重を週に２回モニタリングし、７日後にモニタリングを終了する。投与前、投与後の３日目、７日目にマウスを採血し、ＣＤ４５⁺Ｔリンパ球の総数における血液中のＴｒｅｇ、ＮＫ、ＣＤ４Ｔ ｃｏｎｖ（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－）、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の割合変化状況を検出し、図１１ｃ、１１ｄ、１１ｅ、１１ｆに示される。

【0335】

測定される分子２６０２は、野生型ＩＬ－２^WT配列配列番号１を含むＦｏｒｍａｔ ２型ＩＬ－２－Ｆｃ二量体分子であり、弱体化分子３０７９、３０５５および３０８２の構造は図６に示し、いずれもＦｏｒｍａｔ ２型ＩＬ－２－Ｆｃ二量体分子であった。

【0336】

結果から分かるように、この研究のＩＬ－２変異分子はＩＬ－２Ｒβへの結合を弱めることにより、ＩＬ－２変異分子による炎症誘発性ＮＫ細胞の増殖の刺激が野生型ＩＬ－２分子２６０２（ＩＬ－２^WT）より弱いが、依然として免疫抑制細胞であるＴｒｅｇ細胞の増幅が維持され、Ｔｒｅｇに対するＩＬ－２変異分子の増殖の幅が類似した。また、ＩＬ－２変異分子は、ＣＤ４Ｔ ｃｏｎｖおよびＣＤ８Ｔ細胞に対して、明らかな増殖作用をもたらさなかった。この結果は、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβの結合部位を変異させることにより、Ｔｒｅｇと他の免疫細胞への選択性を大幅に向上させることができることを示唆した。

【0337】

【表23】

【0338】

配列表の説明

【0339】

【表24-1】

【表24-2】

【0340】

本発明が構築するＩＬ－２二量体分子の具体的な説明は下記の表に示される。ここで、「ＩＬ－２配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ」欄は分子のＩＬ－２部分のアミノ酸配列を示し、「ＩＬ－２部分の注釈」欄は「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：」欄のアミノ酸配列および「変異」欄の変異によって、前記分子のＩＬ－２アミノ酸配列が前記変異を有する前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：アミノ酸配列からなることを説明した。「ｆｏｒｍａｔ １」は、分子がホモ二量体であり、各モノマー（Ｎ末端からＣ末端まで）が示されたＩＬ－２アミノ酸配列、リンカー配列（Ｇ４Ｓ）２および配列番号１２により順に連結して形成されることを表した。「ｆｏｒｍａｔ ２」は、分子がヘテロ二量体であり、１つのモノマー（Ｎ末端からＣ末端まで）が示されたＩＬ－２アミノ酸配列、リンカー配列（Ｇ４Ｓ）２および配列番号９により順に連結して形成され、別のモノマーが配列番号１０からなることを表した。

【0341】

【表25-1】

【表25-2】

【0342】

【表26-1】

【表26-2】

【表26-3】

【0343】

【表27-1】

【表27-2】

【0344】

【表28】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図12】

【配列表】

2023518434000001.app

【国際調査報告】