特表 2023-518443 インターロイキン２変異体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-01

(54)【発明の名称】インターロイキン２変異体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20230424BHJP

   C07K 14/55 20060101ALI20230424BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230424BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230424BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230424BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230424BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230424BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230424BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20230424BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230424BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230424BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20230424BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20230424BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20230424BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230424BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K14/55 ZNA

C07K19/00

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/19

C12N5/10

C12P21/02 K

C12P21/08

A61K38/20

A61P37/04

A61P35/00

A61K47/68

A61K39/395 L

A61K39/395 N

A61K9/08

A61K47/02

A61K47/22

C07K16/18

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022556175

(86)(22)【出願日】2021-03-19

(85)【翻訳文提出日】2022-10-24

(86)【国際出願番号】 CN2021081841

(87)【国際公開番号】W WO2021185362

(87)【国際公開日】2021-09-23

(31)【優先権主張番号】202010196689.5

(32)【優先日】2020-03-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519274183

【氏名又は名称】イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】フー フォンケン

(72)【発明者】

【氏名】チョウ ショアイシアン

(72)【発明者】

【氏名】ウー ウェイウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ホー カイチエ

(72)【発明者】

【氏名】リウ チュンチエン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG05

4B064AG27

4B064CA06

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA12

4C076AA94

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC41

4C076DD26Z

4C076DD60Z

4C076EE59

4C076FF63

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA44

4C084DA14

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB09

4C084ZB26

4C085AA14

4C085AA15

4C085AA21

4C085BB01

4C085BB36

4C085BB41

4C085CC23

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA04

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、新規インターロイキン２（ＩＬ－２）変異タンパク質に関する。本発明は、当該ＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質、免疫複合体、および当該ＩＬ－２変異タンパク質をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。本発明は、当該ＩＬ－２変異タンパク質を調製する方法、当該ＩＬ－２変異タンパク質を含む医薬組成物、および当該変異タンパク質の治療的使用をさらに提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩＬ－２変異タンパク質であって、
前記変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２（好ましくはヒトＩＬ－２で、より好ましくは配列番号１の配列を含むＩＬ－２）と比較して、以下の変異を含む：
（ｉ）ＩＬ－２のＣＤ２５との結合界面に、特に位置３５、３７、３８、４１、４２、４３、４５、６１、６８および７２から選択される少なくとも１つの位置に、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性を排除または低減する変異を有し、好ましくは、Ｋ３５Ｄ／Ｅ、Ｔ３７Ｄ／Ｅ、Ｒ３８Ｙ／Ｗ／Ｅ／Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｆ４２Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ａ、Ｋ４３Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｙ、Ｙ４５Ｒ／Ｋ、Ｅ６１Ｒ／Ｋ、Ｅ６８Ｒ／Ｋ、およびＬ７２Ｙ／Ｆの１つまたはその任意の組み合わせから選択され、より好ましくは、Ｋ３５Ｄ／Ｅ、Ｔ３７Ｄ／Ｅ、Ｒ３８Ｗ／Ｅ／Ｄ、Ｔ４１Ｅ、Ｆ４２Ｑ／Ａ、Ｋ４３Ｅ／Ｙ、Ｙ４５Ｋ、Ｅ６１Ｋ、Ｅ６８Ｒ、およびＬ７２Ｆの１つまたはその任意の組み合わせから選択される、前記変異、および
（ｉｉ）短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域（即ち、アミノ酸残基ａａ７２とａａ８４を連結する配列）、好ましくは、１０、９、８、７、６、または５未満のアミノ酸長を有し、且つ好ましくは７アミノ酸長を有し、好ましくは、前記短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域はタンパク質の発現量および／または純度および／またはＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性の改善をもたらす、前記短縮されたループ領域、
ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号１に従って番号付けされる、前記ＩＬ－２変異タンパク質。

【請求項2】

請求項１に記載の変異タンパク質であって、
前記変異（ｉ）は、以下の組み合わせ（１）～（９）から選択される変異の組み合わせであり、特に組み合わせ（１）～（６）から選択される変異の組み合わせであり、

【表1】

好ましくは、前記変異（ｉ）は、以下の組み合わせ（１）～（９）から選択される変異の組み合わせであり、特に組み合わせ（１）～（６）から選択される変異の組み合わせである、
請求項１に記載の変異タンパク質。

【表2】

【請求項3】

変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａを含む、請求項１に記載の変異タンパク質。

【請求項4】

前記変異（ｉｉ）は、
（ａ）Ｂ’Ｃ’ループ領域のａａ７４～ａａ８３に対する置換、例えば、ＩＬ１５のＢ’Ｃ’ループ配列など、４ヘリックス短鎖サイトカインのＩＬファミリーのメンバーからの短いＢ’Ｃ’ループ配列による置換、好ましくは配列ＧＤＡＳＩＨによる置換、または
（ｂ）Ｂ’Ｃ’ループ領域のａａ７４～ａａ８３に対する切断、例えばＣ末端からの１、２、３または４個のアミノ酸の切断、好ましくは配列（Ｑ／Ｇ）Ｓ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｎ（Ｆ／Ｉ）Ｈを形成するための切断、より好ましくは以下から選択される配列を形成するための切断、を含む、
請求項１に記載の変異タンパク質。

【表3】

【請求項5】

野生型ＩＬ－２と比較して、
（ｉ）変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａ、および
（ｉｉ）以下から選択されるＢ’Ｃ’ループ領域配列：
－ＡＱＳＫＮＦＨ、
－ＡＱＳＡＮＦＨ、
－ＡＱＳＤＮＦＨ、
－ＳＧＤＡＳＩＨ、および
－ＡＧＤＡＳＩＨ、
場合により、（ｉｉｉ）変異Ｔ３Ａ、を含む、
請求項１に記載の変異タンパク質。

【請求項6】

野生型ＩＬ－２と比較して、保存的アミノ酸残基変異など、０～５個以下のアミノ酸変異をさらに含む、請求項１～５に記載の変異タンパク質。

【請求項7】

－配列番号２２－２６から選択され、好ましくは配列番号２３と２６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性を有するアミノ酸配列、
－配列番号２２－２６から選択され、好ましくは配列番号２３または２６から選択されるアミノ酸配列、を含む、
請求項１～６に記載の変異タンパク質。

【請求項8】

野生型ＩＬ－２と比較して、前記変異タンパク質は、以下から選択される少なくとも１項、２項または３項すべての特性を有する：
－低減または排除されたＩＬ－２Ｒα結合、
－増強されたＩＬ－２Ｒβ結合、および
－哺乳動物細胞（例えば、２９３細胞またはＣＨＯ細胞）で発現される場合、例えばＦｃ融合タンパク質の形態で発現される場合における改善された発現量および／またはより高い純度に精製されやすいこと（例えば、ワンステップアフィニティークロマトグラフィー後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出により、より高い純度を有する）、
請求項１～７に記載の変異タンパク質。

【請求項9】

請求項１～８に記載の変異タンパク質であって、
野生型ＩＬ－２と比較して、以下の特性の１項または複数項を有する：
－低減された高親和性ＩＬ－２Ｒ受容体（ＩＬ－２Ｒαβγ）への結合親和性を有すること、
－増加された中程度の親和性ＩＬ－２Ｒ受容体（ＩＬ－２Ｒβγ）への結合親和性を有すること、
－ＣＤ２５＋細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞とＴｒｅｇ細胞）に対する活性化の低下、
－ＣＤ２５＋細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞）におけるＩＬ－２媒介性シグナル伝達に対する刺激作用の低減、
－ＣＤ２５＋細胞（例えばＴｒｅｇ細胞）を優先的に活性化するＩＬ－２の偏向性の除去または低減、
－ＩＬ－２誘導性Ｔｒｅｇ細胞による免疫応答のダウンレギュレート作用の低減、
－ＣＤ２５－細胞（例えば、ＣＤ２５－ＣＤ８＋Ｔ細胞）の活性化作用の維持または増強、および
－増加されたＣＤ２５－エフェクターＴ細胞とＮＫ細胞の増殖と活性化をもたらすこと、
場合により、さらに、前記変異タンパク質は、以下の１項または複数項の特性を有する：
－結腸がんに対する抗腫瘍効果など、インビボ抗腫瘍効果、
－例えば、投与後の被験者の体重変化により反映されるように、インビボ投与で有意な毒性がないこと（例えば投与前と比較して、体重の１５％以下または１０％以下または５％以下の減少であり、例えば投与２０日後）、および
－保存安定性を有すること、例えば４０℃でｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液に１４日間保存した後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより検出されたタンパク質純度の降下は２％もしくは１％以下、またはＣＥ－ＳＤＳにより検出されたタンパク質の純度の降下は３％もしくは２％以下である、
請求項１～８に記載の変異タンパク質。

【請求項10】

ＩＬ－２変異タンパク質融合タンパク質であって、
請求項１～９のいずれか一項に記載のＩＬ２変異タンパク質を含み、好ましくはＦｃ抗体断片と融合され、好ましくはＩＬ－２変異タンパク質はリンカーを介してＦｃと融合され、前記リンカーは好ましくはＧＳＧＳ、より好ましくは２ｘ（Ｇ４Ｓ）であり、ここで、好ましくはＦｃはヒトＩｇＧ１ Ｆｃであり、好ましくはＦｃは、ＦｃとＦｃγＲとの結合を低減または排除する変異、例えばＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａを含み、
好ましくは、前記融合タンパク質は、配列番号１５－１９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％または１００％の同一性を有する、
ＩＬ－２変異タンパク質融合タンパク質。

【請求項11】

請求項１～９のいずれか一項に記載のＩＬ２変異タンパク質と抗原結合分子とを含み、好ましくは、前記抗原結合分子は、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、または抗体もしくは抗体断片、特にＦａｂ分子およびｓｃＦｖ分子である、免疫複合体。

【請求項12】

前記抗原結合分子は、腫瘍細胞上または腫瘍環境中に存在する抗原、例えば、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシンＣのＡ１ドメイン（ＴＮＣ Ａ１）、テネイシンＣのＡ２ドメイン（ＴＮＣ Ａ２）、フィブロネクチンの外部ドメインＢ（Ｅｘｔｒａ Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、ＥＤＢ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、および黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）から選択される抗原に特異的に結合する、請求項１１に記載の免疫複合体。

【請求項13】

請求項１～９のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異タンパク質、請求項１０に記載の融合体、または請求項１１もしくは１２に記載の免疫複合体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。

【請求項14】

請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項15】

請求項１３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、哺乳動物細胞であり、特にＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞、または酵母である、前記宿主細胞。

【請求項16】

前記ＩＬ－２変異タンパク質または融合体または免疫複合体の発現に適した条件下で、請求項１５に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、ＩＬ－２変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体を製造する方法。

【請求項17】

請求項１～９のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異タンパク質または請求項１０に記載の融合体または請求項１１もしくは１２に記載の免疫複合体および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物であって、好ましくは、前記組成物はリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液を含み、好ましくは、前記組成物はｐＨ６．０～７．６を有する、前記医薬組成物。

【請求項18】

請求項１～９のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異タンパク質または請求項１０に記載の融合体または請求項１１もしくは１２に記載の免疫複合体または請求項１７に記載の医薬組成物を前記被験者に投与するステップを含む被験者の疾患を治療する方法であって、好ましくは、前記疾患はがんである、被験者の疾患を治療する方法。

【請求項19】

有效量の請求項１～９のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異タンパク質または請求項１０に記載の融合体または請求項１１もしくは１２に記載の免疫複合体を含む医薬組成物を前記被験者に投与するステップを含む、被験者の免疫系を刺激する方法。

【請求項20】

ＩＬ－２変異タンパク質を得るための方法であって、
－ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒａとの結合界面に変異により１つまたは複数の変異を導入し、ＩＬ－２のＢ’Ｃ’ループ領域で変異により当該ループ領域配列を短縮させるステップ、
好ましくは、請求項２に記載の変異の組み合わせおよび／または請求項４に記載のＢ’Ｃ’ループ配列変異を導入するステップ、
－哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞）において、前記ＩＬ－２変異タンパク質を、例えばＦｃ融合体（例えばＦｃＬＡＬＡ融合体）の形態で発現するステップ、
－（ｉ）発現量および／または精製後のタンパク質の純度（例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出による、ワンステップアフィニティークロマトグラフィー後の純度）、（ｉｉ）低減されたＩＬ２Ｒα結合、（ｉｉｉ）増強されたＩＬ２Ｒβ結合の１項または複数項の改善された特性を有する変異タンパク質を同定するステップ、
を含む、前記方法。

【請求項21】

ＩＬ－２タンパク質Ｂ’Ｃ’ループ領域の改造方法であって、
（ａ）Ｂ’Ｃ’ループ領域のａａ７４～ａａ８３に対する置換、例えば、ＩＬ１５のＢ’Ｃ’ループ配列など、４ヘリックス短鎖サイトカインのＩＬファミリーのメンバーからの短いＢ’Ｃ’ループ配列による置換、好ましくは配列ＧＤＡＳＩＨによる置換、または
（ｂ）Ｂ’Ｃ’ループ領域のａａ７３～ａａ８３に対する置換、例えば、ＩＬ１５のＢ’Ｃ’ループ配列など、４ヘリックス短鎖サイトカインのＩＬファミリーのメンバーからの短いＢ’Ｃ’ループ配列による置換、好ましくは配列ＡＧＤＡＳＩＨによる置換、または
（ｃ）Ｂ’Ｃ’ループ領域のａａ７４～ａａ８３に対する切断、例えばＣ末端からの１、２、３または４個のアミノ酸の切断、好ましくは配列（Ｑ／Ｇ）Ｓ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｎ（Ｆ／Ｉ）Ｈを形成するための切断、より好ましくは以下から選択される配列を形成するための切断、を含む、
方法。

【表4】

【請求項22】

請求項２１に記載の方法によって改造して得られる、ＩＬ－２タンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規インターロイキン２（ＩＬ－２）変異タンパク質およびその使用に関する。具体的には、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して、改善された特性、例えば、改善された創薬可能性、低下したＩＬ－２Ｒα受容体結合能力、および／または増加したＩＬ－２Ｒβ受容体結合能力を有するＩＬ－２変異タンパク質に関する。本発明は、当該ＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質、免疫複合体、および当該ＩＬ－２変異タンパク質をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。本発明は、当該ＩＬ－２変異タンパク質を調製およびスクリーニングする方法、当該ＩＬ－２変異タンパク質を含む医薬組成物、および当該変異タンパク質の治療的使用をさらに提供する。

【背景技術】

【0002】

Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）とも呼ばれるインターロイキン－２（ＩＬ－２）は、主に活性化Ｔ細胞、特にＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞によって産生される多能性サイトカインである。真核細胞において、ヒトＩＬ－２（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８）は１５３個のアミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、Ｎ末端の２０個のアミノ酸を除去した後、成熟した分泌性ＩＬ－２を産生する。他の種のＩＬ－２の配列も開示されており、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ Ｎｏ．ＮＰ０３２３９２（マウス）、ＮＰ４４６２８８（ラット）またはＮＰ５１７４２５（チンパンジー）を参照されたい。

【0003】

インターロイキン２は、その機能に不可欠な４次構造を形成する４つの逆平行両親媒性αヘリックスを有する（Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１１６９－７６（１９８８）；Ｂａｚａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，４１０－４１３（１９９２））。ほとんどの場合、ＩＬ－２は、インターロイキン２受容体α（ＩＬ－２Ｒα；ＣＤ２５）、インターロイキン２受容体β（ＩＬ－２Ｒβ；ＣＤ１２２）、およびインターロイキン２受容体γ（ＩＬ－２Ｒγ；ＣＤ１３２）の３つの異なる受容体を介して作用する。ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２ＲγはＩＬ－２のシグナル伝達に非常に重要であるが、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）はシグナル伝達に必須ではないが、ＩＬ－２の受容体への高親和性結合を与えることができる（Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０７，１１９０６－１１（２０１０））。ＩＬ－２Ｒα、β、γを組み合わせて形成される三量体受容体（ＩＬ－２αβγ）はＩＬ－２高親和性受容体（ＫＤが約１０ｐＭ）であり、βとγからなる二量体受容体（ＩＬ－２βγ）は中間親和性受容体（ＫＤが約１ｎＭ）であり、αサブユニットのみから形成されるＩＬ－２受容体は、低親和性受容体である。

【0004】

免疫細胞は二量体または三量体ＩＬ－２受容体を発現する。二量体受容体は細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で発現され、三量体受容体は主に活性化リンパ球とＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）で発現される（Ｂｙｍａｎ，Ｏ．およびＳｐｒｅｎｔ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，１８０－１９０（２０１２））。静止状態のエフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞は、細胞表面上にＣＤ２５を持たないので、ＩＬ－２に対して比較的非感受性である。一方、Ｔｒｅｇ細胞は一貫してインビボで最高レベルのＣＤ２５を発現しているため、通常ＩＬ－２はＴｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激する。

【0005】

ＩＬ－２は、異なる細胞上のＩＬ－２受容体との結合を介して、免疫応答において多重作用を媒介する。一方では、ＩＬ－２は免疫系刺激剤として、Ｔ細胞の増殖と分化を刺激し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成を誘導し、Ｂ細胞の増殖と分化および免疫グロブリンの合成を促進するとともに、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の生産、増殖、活性化を刺激することができるため、免疫治療剤としてがんや慢性ウイルス感染の治療に使用されることが承認されている。他方では、ＩＬ－２は、免疫抑制性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（即ち、Ｔｒｅｇ細胞）の維持を促進する（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１４２－５１（２００５）；Ｄ’ＣｒｕｚおよびＫｌｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１５２－５９（２００５）；ＭａｌｏｙおよびＰｏｗｒｉｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１７１－７２（２００５））とともに、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を媒介し、自己抗原および腫瘍抗原に対する免疫寛容の確立および維持に関与することができ（Ｌｅｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８５８（１９９１））、それにより、患者においてＡＩＣＤによる腫瘍耐性および活性化Ｔｒｅｇ細胞による免疫抑制を引き起こす。なお、高用量ＩＬ－２は、患者において血管漏出症候群（ＶＬＳ）を引き起こす可能性がある。ＩＬ－２は、肺内皮細胞上のＩＬ－２三量体受容体（ＩＬ－２αβγ）に直接結合することによって肺水腫を誘導することが証明されている（Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１０７，１１９０６－１１（２０１０））。

【0006】

ＩＬ－２免疫療法に関連する上記問題を克服するために、ＩＬ－２の異なる受容体に対する選択性または選好性を変化させることにより、ＩＬ－２療法の毒性を低下させ、および／またはその有効性を向上させることが提案されている。例えば、モノクローナル抗体とＩＬ－２との複合物を用いて、ＩＬ－２をＣＤ２５ではなくＣＤ１２２を発現する細胞に標的化することにより、ＣＤ１２２ｈｉｇｈ集団に対する優先的増幅を誘導し、インビボＩＬ－２治療効果を増強することが提案されている（Ｂｏｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１，１９２４－１９２７（２００６））。Ｏｌｉｖｅｒ ＡＳＴ ｅｔ ａｌ．（ＵＳ２０１８／０１４２０３７）は、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する親和性を低下させるために、ＩＬ－２のアミノ酸残基位置４２、４５および７２に三重変異Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇを導入することを提案している。Ａｒｏｎ Ｍ．Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ４８４，ｐ５２９－５３３，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０９７５）は、「ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ」と呼ばれるＩＬ－２変異体ＩＬ－２Ｈ９を提案し、当該変異体は、五重変異Ｌ８０Ｆ／Ｒ８１Ｄ／Ｌ８５Ｖ／Ｉ８６Ｖ／Ｉ９２Ｆを含み、増強されたＩＬ－２Ｒβ結合を有するため、ＣＤ２５－細胞への刺激作用を高めるが、ＣＤ２５への高い結合性が保持される。Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：１５３７３，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５３７３）は、三重変異ヒトＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ－２３Ｘを提案し、当該タンパク質がアミノ酸残基位置３８、４３および６１にそれぞれ残基変異Ｒ３８Ｄ－Ｋ４３Ｅ－Ｅ６１Ｒを有するため、当該変異タンパク質はＩＬ－２Ｒαに結合しないが、当該変異タンパク質はＣＤ２５－細胞を活性化する効果が弱く、ＣＤ２５＋細胞に対する活性化の偏向性が依然として存在する。なお、Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．は、インターロイキン２－Ｆｃ融合体を調製することにより、インターロイキンの薬力学的特性を改善することも提案しているが、当該融合タンパク質の発現量が低く、且つ凝集体を形成しやすい。

【0007】

免疫調節および疾患におけるＩＬ－２の役割を鑑み、改善された特性を有する新規ＩＬ－２分子、特に生産、精製に役立つことを示し、改善された薬力学的特性を有するＩＬ－２分子を開発する必要性が本分野において依然として存在する。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して改善された創薬可能性および／または改善されたＩＬ－２受容体選択性／偏向性を有する新規ＩＬ－２変異タンパク質を提供することにより、上記の要件を満たす。

【0009】

したがって、一態様において、本発明は、新規ＩＬ－２変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、以下の１つまたは複数の特性を有し、好ましくは少なくとも性質（ｉ）および（ｉｉ）を有する：
（ｉ）改善された創薬可能性、特に哺乳動物細胞で発現される場合における改善された発現量および／または精製性能、
（ｉｉ）ＩＬ－２Ｒαとの結合の低減または排除、
（ｉｉｉ）ＩＬ－２Ｒβとの結合の増強。

【0010】

いくつかの実施形態において、本発明は、ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒαとの結合界面で変異を含み、且つ短縮されたＢ’Ｃ’ループ配列を有するＩＬ－２変異タンパク質を提供する。

【0011】

なお、本発明は、ＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質および免疫複合体、医薬組成物および組み合わせ製品、ＩＬ－２変異タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに本発明のＩＬ－変異タンパク質、融合タンパク質および免疫複合体を産生する方法を提供する。

【0012】

さらに、本発明は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質、融合体および免疫複合体を用いて疾患を治療する方法、ならびに被験者の免疫系を刺激する方法および使用も提供する。

【0013】

以下、図面および具体的な実施形態を参照して本発明をさらに説明する。しかし、これらの図面および具体的な実施形態は、本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではなく、当業者が容易に思いつく変更は、本発明の精神および添付される特許請求の範囲に含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαの複合物の結晶構造（ＰＤＢ：１Ｚ９２）を示す。

【図2A】ＩＬ－２結晶構造（ＰＢＤ：２ＥＲＪ）（Ａ）、ヒトＩＬ－２およびヒトＩＬ－１５のＢ’Ｃ’ｌｏｏｐ構造ｓｕｐｅｒｐｏｓｅ（Ｂ）を示す。

【図2B】ＩＬ－２結晶構造（ＰＢＤ：２ＥＲＪ）（Ａ）、ヒトＩＬ－２およびヒトＩＬ－１５のＢ’Ｃ’ｌｏｏｐ構造ｓｕｐｅｒｐｏｓｅ（Ｂ）を示す。

【図3】変異ライブラリーＩＢＹＤＬ０２９構築のためのプライマーを示す。

【図4】変異ライブラリーＩＢＹＤＬ０２９からスクリーニングされたＩＬ－２変異タンパク質およびその配列を示す。

【図5A】選択および構築されたＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ融合タンパク質がＣＤ８＋ＣＤ２５－Ｔ細胞（Ａ）とＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｂ）でｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図5B】選択および構築されたＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ融合タンパク質がＣＤ８＋ＣＤ２５－Ｔ細胞（Ａ）とＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｂ）でｐ－ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。

【図6A】ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ融合タンパク質Ｙ０９２のインビボ抗腫瘍効果（Ａ）および投与後にモニタリングされた動物の体重変化（ＢとＣ）を示す。

【図6B】ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ融合タンパク質Ｙ０９２のインビボ抗腫瘍効果（Ａ）および投与後にモニタリングされた動物の体重変化（ＢとＣ）を示す。

【図6C】ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ融合タンパク質Ｙ０９２のインビボ抗腫瘍効果（Ａ）および投与後にモニタリングされた動物の体重変化（ＢとＣ）を示す。

【図7A】ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ融合タンパク質Ｙ１４４のインビボ抗腫瘍効果（Ａ）および投与後にモニタリングされた動物の体重変化（ＢとＣ）を示す。

【図7B】ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ融合タンパク質Ｙ１４４のインビボ抗腫瘍効果（Ａ）および投与後にモニタリングされた動物の体重変化（ＢとＣ）を示す。

【図7C】ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ融合タンパク質Ｙ１４４のインビボ抗腫瘍効果（Ａ）および投与後にモニタリングされた動物の体重変化（ＢとＣ）を示す。

【図8】野生型ＩＬ－２タンパク質ＩＬ－２ＷＴ（配列番号１）のアミノ酸配列およびそのアミノ酸残基番号付けを示し、且つ変異タンパク質ＩＬ－２３Ｘとの配列アラインメントを示す。

【図9】酵母ディスプレイプラスミドｐＹＤＣ０１１の全配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

別に定義しない限り、本明細書に用いられる全ての技術と科学用語はいずれも、当業者に通常に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の目的のために、以下、下記用語を定義する。

【0016】

「約」という用語は、数字または数値とともに使用される場合、下限として指定された数字または数値より５％小さく、上限として指定された数字または数値より５％大きい範囲内の数字または数値をカバーすることを意味する。

【0017】

「および／または」という用語は選択可能オプションのうちのいずれか１項または選択可能オプションのいずれか２項または複数項の組み合わせを指すと理解すべきである。

【0018】

本明細書で使用されるように、「包含する」または「含む」という用語は、記載される要素、整数またはステップを含むが、任意の他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本明細書において、「包含する」または「含む」という用語を用いる場合、特記しない限り、言及される要素、整数またはステップからなる場合も含まれる。例えば、ある変異または変異の組み合わせを「包含する」または「含む」ＩＬ－２変異タンパク質に言及する場合、前記変異または変異の組み合わせのみを有するＩＬ－２変異タンパク質を包含することも意図される。

【0019】

本明細書において、野生型「インターロイキン－２」または「ＩＬ－２」とは、本発明の変異または変異の組み合わせを導入するテンプレートとしての親ＩＬ－２タンパク質、好ましくは天然に存在するＩＬ－２タンパク質、例えば、未処理（例えば、シグナルペプチドが除されていない）の形態および処理済み（例えば、シグナルペプチドが除去された）の形態を含む、ヒト、マウス、ラット、非ヒト霊長類由来の天然ＩＬ－２タンパク質を指す。シグナルペプチドを含む全長の天然ヒトＩＬ－２配列は配列番号２に示され、その成熟タンパク質の配列は配列番号３に示される。なお、この表現には、天然に存在するＩＬ－２対立遺伝子変異体およびスプライス変異体、アイソタイプ、相同体、および種相同体も含まれる。この表現には、天然ＩＬ－２の変異体も含まれ、例えば、前記変異体は、天然ＩＬ－２と少なくとも９５％～９９％もしくはそれ以上の同一性を有してもよく、または１～１０個以下もしくは１～５個以下のアミノ酸変異（特に保存的アミノ酸置換）を有してもよく、且つ好ましくは、天然ＩＬ－２タンパク質と実質的に同一のＩＬ－２Ｒα結合親和性および／またはＩＬ２Ｒβ結合親和性を有する。したがって、いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ－２は、天然ＩＬ－２タンパク質と比較して、ＩＬ－２受容体へのその結合に影響を及ぼさないアミノ酸変異を含んでもよく、例えば、変異Ｃ１２５Ｓを１２５位に導入した天然ヒトＩＬ－２タンパク質（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８）は、本発明の野生型ＩＬ－２に属する。Ｃ１２５Ｓ変異を含む野生型ヒトＩＬ－２タンパク質の１つの実例は配列番号１に示される。いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ－２配列は、配列番号１または配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９５％、さらには少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する。

【0020】

本明細書において、アミノ酸変異は、アミノ酸置換、欠失、挿入および付加であってもよい。置換、欠失、挿入および付加の任意の組み合わせを行うことで、所望の特性（例えば、低減されたＩＬ－２Ｒα結合親和性および／または改善された創薬可能性）を有する最終的な変異タンパク質構築物を得ることができる。アミノ酸の欠失および挿入は、ポリペプチド配列のアミノ基および／またはカルボキシ基末端での欠失および挿入を含むとともに、ポリペプチド配列内での欠失および挿入も含む。例えば、全長ヒトＩＬ－２位置１でアラニン残基を欠失するか、またはＢ’Ｃ’ループ領域で１つまたは複数のアミノ酸を欠失することで、当該ループ領域の長さを短縮することができる。いくつかの実施形態において、好ましいアミノ酸変異は、単一アミノ酸置換の組み合わせまたはアミノ酸配列セグメントの置換など、アミノ酸置換である。例えば、野生型ＩＬ－２のＢ’Ｃ’ループ領域配列の全体または一部を異なる配列で置換することができ、好ましくは、長さが短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域配列を得ることができる。

【0021】

本発明において、ＩＬ－２タンパク質またはＩＬ２配列セグメントにおけるアミノ酸位置に言及する場合、野生型ヒトＩＬ－２タンパク質（ＩＬ－２ＷＴとも呼ばれる）のアミノ酸配列配列番号１を参照することによって決定される（図８に示す）。配列番号１とのアミノ酸配列アラインメントによって、他のＩＬ－２タンパク質またはポリペプチド（全長配列または切断断片を含む）上の対応するアミノ酸位置を同定することができる。したがって、本発明において、特記しない限り、ＩＬ－２タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号１に従って番号付けされるアミノ酸位置である。例えば、「Ｆ４２」に言及する場合は、配列番号１の第４２位のフェニルアラニン残基Ｆ、または他のＩＬ－２ポリペプチド配列上にアラインメントされた対応する位置のアミノ酸残基を指す。アミノ酸位置決定のために実施される配列アラインメントは、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉから得ることができるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを使用して、デフォルトパラメータを用いて行うことができる。

【0022】

本明細書において、ＩＬ－２変異タンパク質に言及する場合、以下のように単一アミノ酸置換を説明する：［元のアミノ酸残基／位置／置換のアミノ酸残基］。例えば、グルタミン酸による位置３５のリジンの置換は、Ｋ３５Ｅと表すことができる。１つの所定の位置（例えば、Ｋ３５位）に複数の選択可能なアミノ酸置換方式（例えば、Ｄ、Ｅ）があり得る場合、当該アミノ酸置換は、Ｋ３５Ｄ／Ｅと表すことができる。対応的に、個々の単一アミノ酸置換は、プラス記号「＋」または「－」によって連結されて、複数の所定の位置での組み合わせ変異を表すことができる。例えば、位置Ｋ３５Ｅ、Ｔ３７Ｅ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａの組み合わせ変異は、Ｋ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａ、またはＫ３５Ｅ－Ｔ３７Ｅ－Ｒ３８Ｅ－Ｆ４２Ａと表す。

【0023】

本明細書において、「配列同一性パーセント」は、比較ウィンドウ内で２つの最適アラインメント配列を比較することによって決定することができる。好ましくは、配列同一性は、参照配列（例えば、配列番号１）の全長にわたって決定される。比較のための配列アラインメント方法は、当該分野において周知である。配列同一性パーセントを決定するのに適用されるアルゴリズムは、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムを含む（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２，１９７７およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０を参照）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から公的に入手可能である。本願の目的のため、同一性パーセントは、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉから得ることができるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを使用して、デフォルトパラメータを用いて決定することができる。

【0024】

本明細書で使用されるように、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの生物学的機能に悪影響を及ぼさない、または変化させないアミノ酸置換を意味する。例えば、保存的置換は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの当該分野で既知の標準的な技術によって導入することができる。典型的な保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸に置換することを指す。機能的に類似するアミノ酸の保存的置換表は、当該分野でよく知られているものである。本発明において、保存的置換残基は、以下の保存的置換表Ｘ、特に表Ｘにおける好ましい保存的アミノ酸置換残基に由来する。

【0025】

【表1】

【0026】

例えば、野生型ＩＬ－２タンパク質は、配列番号１－３の１つに対して保存的アミノ酸置換を有してもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有してもよい。さらに例えば、本発明の変異ＩＬ－２タンパク質は、本明細書に具体的に示されるＩＬ－２変異タンパク質配列（例えば、配列番号２２－２６のいずれか１つ）に対して保存的アミノ酸置換を有していてもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有していてもよい。

【0027】

「親和性」または「結合親和性」は、結合対のメンバー間の相互作用の内部結合能力を反映するために使用することができる。分子Ｘのその結合パートナーＹに対する親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）によって示されてもよく、平衡解離定数は、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋｄｉｓとｋｏｎである）との比率である。結合親和性は当該分野で既知の常用方法で測定されてもよい。親和性を測定するための１つの具体的な方法は、本明細書のＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定技術である。

【0028】

本明細書において、抗原結合分子は、抗原に特異的に結合し得るポリペプチド分子、例えば免疫グロブリン分子、抗体または抗体断片、例えばＦａｂ断片およびｓｃＦｖ断片である。

【0029】

本明細書において、抗体Ｆｃ断片とは、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ－末端領域であり、且つ天然配列Ｆｃ断片および変異体Ｆｃ断片を含むことができる。天然配列Ｆｃ断片は、様々なＩｇサブタイプおよびそのアロタイプのＦｃ領域など、天然に存在する様々な免疫グロブリンＦｃ配列を含む（Ｇｅｓｔｕｒ Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，２０ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１４．００５２０．）。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ断片は、重鎖のＣｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０からカルボキシ基末端まで延びる。他の実施形態において、Ｆｃ－断片のＣ－末端リジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、存在しなくてもよい。他のいくつかの実施形態において、Ｆｃ断片は変異を含む変異体Ｆｃ断片であり、例えば、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ変異を含む。本明細書に特記しない限り、Ｆｃ断片におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けシステムによるものであり、ＥＵインデックスとも呼ばれる。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２に記載される。

【0030】

本発明の種々の態様は、以下の各セクションにおいてさらに詳細に説明される。

【0031】

１．本発明のＩＬ－２変異タンパク質

【0032】

本発明は、一態様において、改善された創薬可能性および／または改善されたＩＬ－２受容体選択性／選好性を有する新規ＩＬ－２変異タンパク質を提供する。

【0033】

本発明のＩＬ－２変異タンパク質の有利な生物学的特性

【0034】

本発明者らは、ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒα受容体との結合界面に１つまたは複数の特定の変異を導入することにより、ＩＬ－２変異タンパク質のＩＬ－２Ｒαへの結合を低減または排除することができることを見出した。さらに、本発明者らは、ＩＬ－２自体のＢ’Ｃ’ループ配列を、ＩＬ－１５などの他のインターロイキンサイトカイン由来の短いＢ’Ｃ’ループ配列に置換することにより、またはＩＬ－２自体のＢ’Ｃ’ループ配列を切断することにより、ＩＬ－２の発現および／または純度を増加させ、および／またはＩＬ－２Ｒβに対する親和性を増加させることができることも見出した。本発明者らは、前記ＩＬ－２Ｒα受容体との結合界面の変異と前記短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域の変異とを組み合わせることにより、以下の１項または複数項から選択される改善された特性を有するＩＬ－２変異を提供することができることをさらに見出した。（ｉ）改善された発現および／または純度、（ｉｉ）低減または排除されたＩＬ－２Ｒα受容体への結合、および／または（ｉｉｉ）増強されたＩＬ－２Ｒβ受容体への結合。

【0035】

これにより、本発明は、上記の改善された特性（ｉ）～（ｉｉｉ）の１項または複数項を有し、特に改善された特性（ｉ）および（ｉｉ）を同時に有するＩＬ－２変異タンパク質を提供する。

【0036】

改善された創薬可能性

【0037】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、改善された創薬可能性を有する。例えば、Ｈ２９３ＴまたはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞で発現される場合、例えばＦｃ融合タンパク質で発現される場合、以下から選択される１項または複数項の特性を有する。（ｉ）野生型ＩＬ－２タンパク質より優れる発現量、および（ｉｉ）より高いタンパク質の純度に精製されやすいこと。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、さらに保存安定性を有する。例えば、４０℃でｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液に１４日間保存した後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより検出されたタンパク質の純度の降下は５％、２％または１％以下であり、またはＣＥ－ＳＤＳにより検出されたタンパク質の純度の降下は５％、３％または２％以下である。

【0038】

本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して発現レベルの増加を示す。本発明のいくつかの実施形態において、発現の増加は哺乳動物細胞発現系で起こる。発現レベルは、細胞培養上清（好ましくはワンステップアフィニティークロマトグラフィー精製後の上清）中の組換えＩＬ－２タンパク質の量を定量的または半定量的に分析することを可能にする任意の適切な方法によって測定することができる。例えば、試料中の組換えＩＬ－２タンパク質の量は、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって評価することができる。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、哺乳動物細胞における発現量が少なくとも１．１倍、または少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍、３倍もしくは４倍以上、または少なくとも５、６、７、８もしくは９倍、またはさらに１０倍以上増加している。

【0039】

いくつかの実施形態において、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー後の精製タンパク質の純度を測定することによって示されるように、本発明のＩＬ－２変異タンパク質－Ｆｃ融合体は、野生型ＩＬ－２タンパク質融合体と比較して、高い純度を示す。いくつかの実施形態において、タンパク質の純度は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ技術によって検出される。いくつかの好ましい実施形態において、例えば、実施例２に記載されているＩＬ－２融合タンパク質の精製方法に従って、ワンステップタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後、本発明のＩＬ－２変異タンパク質産物の純度は、７０％、または８０％、または９０％以上、好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９８％もしくは９９％以上に達することができる。

【0040】

改善されたＩＬ－２受容体選択性／選好性

【0041】

ＩＬ－２タンパク質は、ＩＬ－２受容体と相互作用することによってシグナル伝達を開始し、機能を発揮する。野生型ＩＬ－２は、異なるＩＬ－２受容体に対して異なる親和性を示す。野生型ＩＬ－２との親和性が低いＩＬ－２βおよびγ受容体は、静止エフェクター細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む）上で発現される。野生型ＩＬ－２との親和性が高いＩＬ－２Ｒαは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）細胞および活性化エフェクター細胞上で発現される。高い親和性のために、野生型ＩＬ－２は、細胞表面のＩＬ－２Ｒαに優先的に結合し、さらにＩＬ－２Ｒβγを動員し、ＩＬ－２Ｒβγを介して下流のｐ－ＳＴＡＴ５シグナルを放出し、Ｔｒｅｇ細胞および活性化エフェクター細胞を刺激する。したがって、理論に束縛されることなく、ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒα受容体に対する親和性を低減または排除すると、ＣＤ２５＋細胞を優先的に活性化するＩＬ－２の偏向性を低減し、ＩＬ－２により媒介されるＴｒｅｇ細胞の免疫ダウンレギュレート作用を低減する。理論に束縛されることなく、ＩＬ－２Ｒβ受容体に対する親和性を維持または増強すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞などのエフェクター細胞に対するＩＬ－２の活性化作用およびそれによるＩＬ－２の免疫刺激作用を保持または増強する。

【0042】

したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、例えば、以下の１項または複数項から選択される改善された特性を有する：
（１）ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性の低減または排除、
（２）ＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性の増強、
（３）高親和性ＩＬ－２Ｒ受容体（ＩＬ－２Ｒαβγ）への結合親和性の低減、
（４）中程度の親和性ＩＬ－２Ｒ受容体（ＩＬ－２Ｒβγ）への結合親和性の増加、
（５）ＣＤ２５＋細胞（特に活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞）においてＩＬ－２シグナル伝達を活性化する、特にＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化する能力の低下、
（６）ＩＬ－２により媒介されるＣＤ２５＋細胞（特に、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞）の活性化および増殖の減少をもたらすこと、
（７）Ｔｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激するＩＬ－２の偏向の低減または排除、
（８）ＩＬ－２誘導下でのＴｒｅｇ細胞の免疫ダウンレギュレート作用の低減、
（９）ＣＤ２５－細胞（特にＣＤ２５－Ｔエフェクター細胞およびＮＫ細胞）に対する活性化作用の保持または増強、特に増強、
（１０）ＩＬ－２により媒介されるエフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞の活性化および増殖の増加をもたらすこと。

【0043】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、上記（１）の特性を有し、好ましくは、（３）および（５）～（８）から選択される１項または複数項、特に全ての特性をさらに有し、より好ましくは、（２）、（４）および（９）もしくは（１０）から選択される１項または複数項、特に全ての特性をさらに有する。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、上記（２）、（４）の特性を有し、好ましくは、（９）もしくは（１０）から選択される１項または複数項、特に全ての特性をさらに有し、より好ましくは、（１）、（３）および（５）～（８）から選択される１項または複数項、特に全ての特性をさらに有する。

【0044】

好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、例えば結腸がんに対する抗腫瘍効果など、インビボ抗腫瘍効果を示す。

【0045】

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、高親和性受容体ＩＬ－２αβγへのＩＬ－２の結合により媒介される低減したインビボ毒性をさらに有する。

【0046】

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、例えば、投与後の被験者の体重変化によって反映されるように、被験者への投与後に有意な毒性がない。例えば、投与前と比較して、例えば、一定期間、例えば２０日間またはそれ以上の時間投与後、体重の１５％以下または１０％以下または５％以下の減少である。

【0047】

いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ－２（例えば、配列番号１に示されるＩＬ－２ＷＴ）と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合親和性が少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２５倍、特に少なくとも３０倍、５０倍もしくは１００倍以上低減した。好ましい実施形態において、本発明の変異タンパク質はＩＬ－２受容体αに結合しない。ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定技術により、Ｆｃ断片と融合された本発明のＩＬ－２変異タンパク質などの本発明のＩＬ－２変異タンパク質と受容体ＩＬ－２Ｒα受容体の平衡解離定数（ＫＤ）を測定することで、結合親和性を測定することができる。

【0048】

いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ－２（例えば、配列番号１に示されるＩＬ－２ＷＴ）と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβ受容体に対する結合親和性が、例えば５～１０倍またはそれ以上増強した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定技術により、Ｆｃ断片と融合された本発明のＩＬ－２変異タンパク質などの本発明のＩＬ－２変異タンパク質と受容体ＩＬ－２Ｒβ受容体の平衡解離定数（ＫＤ）を測定することで、結合親和性を測定することができる。一実施形態において、ＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質の形態で、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定（例えば、実施例に記載のＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定）において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質と受容体ＩＬ－２Ｒβ受容体との二価結合親和性ＫＤ値は、１０．０Ｅ－０９Ｍ未満であり、例えば１．０Ｅ－０９Ｍ～７Ｅ－０９Ｍ、または例えば１．０Ｅ－０９Ｍ未満であり、例えば１．０Ｅ－１０Ｍ～７．０Ｅ－１０Ｍである。

【0049】

一実施形態において、野生型ＩＬ－２と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２により媒介されるＣＤ２５＋細胞の活性化および／または増殖の低下をもたらす。一実施形態において、ＣＤ２５＋細胞はＣＤ２５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態において、ＣＤ２５＋細胞はＴｒｅｇ細胞である。一実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＣＤ２５＋細胞を活性化するＩＬ－２変異タンパク質の能力は、ＩＬ－２変異タンパク質によるＣＤ２５＋細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化シグナルの活性化を検出することによって同定される。例えば、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）は、本出願の実施例に記載されるように、フローサイトメトリーによって細胞中のＳＴＡＴ５リン酸化を分析することによって決定することができる。

【0050】

一実施形態において、野生型ＩＬ－２と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、維持または増強したＩＬ－２により媒介されるＣＤ２５－エフェクター細胞の活性化および／または増殖をもたらす。一実施形態において、ＣＤ２５－細胞はＣＤ８＋エフェクターＴ細胞またはＮＫ細胞である。一実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＣＤ２５－細胞を活性化するＩＬ－２変異タンパク質の能力は、ＣＤ２５－細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＩＬ－２変異タンパク質のＥＣ５０値を検出することによって同定される。一実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において測定されるように、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２タンパク質（例えば、配列番号１のヒトＩＬ－２）と比較して、ＣＤ２５－細胞を活性化する能力が少なくとも１倍、例えば２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍増加した。

【0051】

一実施形態において、野生型ＩＬ－２と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＣＤ２５＋細胞を優先的に活性化するＩＬ－２の偏向性を排除または低減する。一実施形態において、ＣＤ２５＋細胞はＣＤ２５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態において、ＣＤ２５＋細胞はＴｒｅｇ細胞である。一実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＣＤ２５－細胞を活性化するＩＬ－２変異体の能力は、それぞれＣＤ２５－細胞およびＣＤ２５＋細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＩＬ－２変異タンパク質のＥＣ５０値を検出することによって同定される。例えば、ＣＤ２５＋細胞に対するＩＬ－２変異タンパク質の活性化偏向性は、ＣＤ２５－およびＣＤ２５＋Ｔ細胞でＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＥＣ５０値の比率を計算することによって決定される。好ましくは、野生型タンパク質と比較して、ＣＤ２５＋に対する変異タンパク質の偏向性は、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍またはそれ以上低減した。

【0052】

本発明の変異タンパク質

【0053】

ＩＬ－２タンパク質は、４つのαヘリックスバンドル（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）構造を有する短鎖Ｉ型サイトカインファミリーのメンバーに属する。結晶構造（ＰＤＢ：１Ｚ９２）の分析によると、ＩＬ－２は、アミノ酸残基３５－７２領域にＣＤ２５（即ち、ＩＬ－２Ｒα）と相互作用するアミノ酸部位３５、３７、３８、４１、４２、４３、４５、６１、６２、６８、７２を有する。本発明者らは、ＩＬ－２のアミノ酸残基３５－７２領域のＣＤ２５相互作用部位（即ち、部位３５、３７、３８、４１、４２、４３、４５、６１、６２、６８、７２）に、特定の変異を導入することにより、ＩＬ－２ＲαへのＩＬ－２の結合を低減または排除することができることを見出した。本明細書において、当該領域のこれらの部位で発生する変異は、「ＣＤ２５結合領域」変異と略称される。

【0054】

なお、本発明者らは、ＩＬ－２モノマー（ＰＤＢ：１Ｍ４７）と複合物の結晶構造（ＰＤＢ：２ＥＲＪ）を比較することにより、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐが溶液中で非常に活発であり、比較的安定したコンフォメーションを形成できないため、ＩＬ－２モノマーの結晶構造でＢ’Ｃ’ｌｏｏｐが欠失していることを見出した。配列置換または切断などのＢ’Ｃ’ｌｏｏｐの遺伝子工学の改善により、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐの安定性を向上させ、ＩＬ－２の創薬可能性および／またはＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性を改善することができる。本明細書において、当該Ｂ’Ｃ’ループ領域に発生するこれらの配列置換または切断変異は、「Ｂ’Ｃ’ループ領域の変異」と略称される。

【0055】

本発明者らは、ＩＬ－２の特性をさらに改善するために、「ＣＤ２５結合領域」変異と「Ｂ’Ｃ’ループ領域の変異」とを組み合わせできることをさらに見出した。これにより、本発明は、野生型ＩＬ－２（好ましくはヒトＩＬ－２で、より好ましくは配列番号１配列を含むＩＬ－２）と比較して、（ｉ）「ＣＤ２５結合領域」変異、および（ｉｉ）「Ｂ’Ｃ’ループ領域の変異」を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。

【0056】

ＣＤ２５結合領域の変異

【0057】

一態様において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＣＤ２５結合領域で、好ましくは位置３５、３７、３８、４１、４２、４３、４５、６１、６８および７２で、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性を排除または低減する１つまたは複数の変異を含む。

【0058】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＤ２５結合領域の変異は、以下の組み合わせ（１）～（９）の１つから選択される変異の組み合わせを含む：

【0059】

【表2】

【0060】

好ましい実施形態において、本発明のＣＤ２５結合領域の変異は、以下の組み合わせ（１）～（９）の１つから選択される変異の組み合わせ、特に組み合わせ（１）～（６）の１つから選択される変異の組み合わせを含む：

【0061】

【表3】

【0062】

１つの好ましい実施形態において、本発明のＣＤ２５結合領域の変異は、変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａを含むか、または前記変異の組み合わせからなる。

【0063】

好ましい実施形態において、本発明のＣＤ２５結合領域の変異は、排除されたＣＤ２５結合、例えばＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定を使用して検出限界未満のＣＤ２５結合をもたらす。

【0064】

本発明に適用されるＣＤ２５結合領域の変異については、本出願人の同時係属中の出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１０７０５５を参照することもできる。当該出願は、全て参照として本明細書に組み込まれている。

【0065】

Ｂ’Ｃ’ループ領域の変異

【0066】

ＩＬ－２タンパク質は、４つのαヘリックスバンドル（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）構造を有する短鎖Ｉ型サイトカインファミリーのメンバーに属する。本明細書において、「Ｂ’Ｃ’Ｌｏｏｐ」または「Ｂ’Ｃ’ループ領域」または「Ｂ’Ｃ’ループ配列」という用語は互換的に使用されてもよく、ＩＬ－２タンパク質のＢヘリックスとＣヘリックスとの間の連結配列を指す。ＩＬ－２の結晶構造の分析（例えばＰＤＢ：２ＥＲＪ）により、１つのＩＬ－２タンパク質のＢ’Ｃ’ループ配列を決定することができる。本発明の目的のために、配列番号１の番号付けによれば、当該Ｂ’Ｃ’ループ配列は、ＩＬ－２ポリペプチドにおける位置７２の残基と位置８４の残基を連結する配列を指す。配列番号１、２および３の野生型ＩＬ－２タンパク質において、当該連結配列は、Ａ７３－Ｒ８３の合計１１個のアミノ酸を含む。

【0067】

本明細書において、「短縮されたループ領域」または「短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域」という用語は、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、長さが短縮されたＢ’Ｃ’ループ配列を有する変異タンパク質を指し、即ち、配列番号１の番号付けによると、アミノ酸残基ａａ７２とａａ８４との間の連結配列の長さが短縮されている。「短縮されたループ領域」は、ループ配列の置換または切断によって実現することができる。前記置換または切断は、Ｂ’Ｃ’ループ配列の任意の領域または部分で発生することができる。例えば、置換または切断は、ループ領域Ａ７３－Ｒ８３配列の置換または当該配列Ｃ末端の１つまたは複数のアミノ酸残基からの切断であってもよい。さらに、例えば、置換または切断は、ループ領域Ａ７４－Ｒ８３配列の置換または当該配列Ｃ末端の１つまたは複数のアミノ酸残基からの切断であってもよい。前記置換または切断の後、必要に応じて、創薬可能性などの変異タンパク質の特性をさらに改善するために、グリコシル化を排除するためのアミノ酸置換などの単一アミノ酸置換、および／または逆変異をさらにループ領域配列に導入することができる。したがって、本明細書において、変異後の短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域は、変異の導入後、位置７２の残基と位置８４の残基との間の配列を連結することにより説明することができる。

【0068】

一態様において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、Ｂ’Ｃ’ループ領域の変異を含み、好ましくは前記変異はＢ’Ｃ’ループ領域の安定性の向上をもたらし、より好ましくは前記変異は本発明のＩＬ－２変異タンパク質が増加された発現量および／または純度など、改善された創薬可能性を有することをもたらす。

【0069】

いくつかの実施形態において、導入された変異は、野生型ＩＬ－２（好ましくはヒトＩＬ－２で、より好ましくは配列番号１配列を含むＩＬ－２）と比較して、変異タンパク質が短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域（即ち、アミノ酸残基ａａ７２とａａ８４との間の連結配列長が短縮された）を含むことをもたらし、好ましくは、前記短縮されたループ領域は、１０、９、８、７、６または５未満のアミノ酸長を有し、且つ好ましくは７アミノ酸長を有し、ここで、アミノ酸残基は配列番号１に従って番号付けされる。

【0070】

本明細書において、本発明に適用されるＢ’Ｃ’ループ領域の変異はＢ’Ｃ’ループ領域の切断および置換を含む。一実施形態において、前記変異は、Ａ（Ｑ／Ｇ）Ｓ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｎ（Ｆ／Ｉ）Ｈを形成するための切断、またはＳＧＤＡＳＩＨによる置換など、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７３～ａａ８３の切断または置換を含む。他の実施形態において、前記変異は、（Ｑ／Ｇ）Ｓ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｎ（Ｆ／Ｉ）Ｈを形成するための切断、またはＧＤＡＳＩＨによる置換など、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７４～ａａ８３の切断または置換を含む。

【0071】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、Ｂ’Ｃ’ループキメラ変異を含む。野生型ＩＬ－２と比較して、前記変異タンパク質は、他の４ヘリックス短鎖サイトカインファミリーのメンバーからの短いＢ’Ｃ’ループ配列による置換など、ａａ７２～ａａ８４を連結する配列のすべてまたは一部に対する置換を含む。ＩＬ－１５、ＩＬ－４、ＩＬ－２１などの他の４ヘリックス短鎖サイトカインＩＬファミリーのメンバー、または非ヒト種（例えば、マウス）由来のＩＬファミリーのメンバーから、結晶構造のｓｕｐｅｒｐｏｓｅにより、野生型ＩＬ－２を置換するのに適用される短いＢ’Ｃ’ループを同定することができる。一実施形態において、置換のための配列は、インターロイキンＩＬ－１５（特にヒトＩＬ－１５）由来のＢ’Ｃ’ループ配列である。一実施形態において、前記置換は、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７３～ａａ８３の置換を含む。他の実施形態において、前記置換は、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７４～ａａ８３の置換を含む。好ましくは、置換後、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＳＧＤＡＳＩＨまたはＡＧＤＡＳＩＨから選択されるＢ’Ｃ’ループ配列（即ち、ａａ７２～ａａ８４を連結する配列）を有する。

【0072】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、Ｂ’Ｃ’ループ切断変異を含む。野生型ＩＬ－２と比較して、前記変異タンパク質は、ａａ７２～ａａ８４を連結する配列に対する切断を含む。一実施形態において、前記切断は、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７３～ａａ８３の切断を含む。他の実施形態において、前記切断は、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７４～ａａ８３の切断を含む。例えば、Ｃ末端から１、２、３または４個のアミノ酸を切断することができる。好ましくは、切断後、本発明のＩＬ－２変異タンパク質のＢ’Ｃ’ループ領域は配列Ａ（Ｑ／Ｇ）Ｓ（Ｋ／Ａ／Ｄ）Ｎ（Ｆ／Ｉ）Ｈを有する。好ましくは、切断後、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は以下から選択されるＢ’Ｃ’ループ配列（即ち、ａａ７２～ａａ８４を連結する配列）を有する：

【0073】

【表4】

【0074】

１つの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＡＱＳＫＮＦＨ、ＡＱＳＡＮＦＨ、ＡＱＳＤＮＦＨ、またはＳＧＤＡＳＩＨまたはＡＧＤＡＳＩＨから選択されるＢ’Ｃ’ループ領域配列を含む。

【0075】

本発明に適用されるＢ’Ｃ’ループ変異については、本出願人の同時係属中の出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１０７０５４を参照することもできる。当該出願は、全て参照として本明細書に組み込まれている。

【0076】

好ましい例示的な変異の組み合わせ

【0077】

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＢ’Ｃ’ループ変異と本発明のＣＤ２５結合領域の変異との組み合わせによって、（ｉ）低減された（または排除された）ＩＬ－２Ｒα結合、（ｉｉ）増強されたＩＬ－２Ｒα結合、および（ｉｉ）改善された発現レベルと純度の２項または３項すべてから選択される改善された特性を提供する。

【0078】

いくつかの実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して、以下を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する：
（ｉ）以下の組み合わせ（１）～（９）の１つから選択される変異の組み合わせ、特に組み合わせ（１）～（６）の１つから選択される変異の組み合わせ：

【0079】

【表5】

【0080】

および（ｉｉ）以下から選択されるＢ’Ｃ’ループ領域配列：

【0081】

【表6】

【0082】

特に、ＡＱＳＫＮＦＨ、ＡＱＳＡＮＦＨ、ＡＱＳＤＮＦＨまたはＳＧＤＡＳＩＨまたはＡＧＤＡＳＩＨから選択されるＢ’Ｃ’ループ領域配列。
好ましくは、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して、以下を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する：
（ｉ）変異の組み合わせＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａ、および
（ｉｉ）ＡＱＳＫＮＦＨ、ＡＱＳＡＮＦＨ、ＡＱＳＤＮＦＨ、ＳＧＤＡＳＩＨ、およびＡＧＤＡＳＩＨから選択されるＢ’Ｃ’ループ領域配列。

【0083】

したがって、一実施形態において、本発明は、アミノ酸配列において配列番号１－３の１つに列挙された野生型ＩＬ－２タンパク質の成熟領域と少なくとも８５％または９０％の同一性を有する成熟領域を有し、且つアミノ酸の位置７２と８４との間にＡＧＤＡＳＩＨ、ＳＧＤＡＳＩＨ、ＡＱＳＫＮＦＨ、ＡＱＳＡＮＦＨ、ＡＱＳＤＮＦＨ、ＡＧＳＫＮＦＨ、ＡＱＳＡＮＦＨ、およびＡＱＳＡＮＩＨから選択される連結配列を含み、且つＫ３５Ｅ＋Ｔ３７Ｅ＋Ｒ３８Ｅ＋Ｆ４２Ａの変異の組み合わせを有するＩＬ－２変異タンパク質を提供する。

【0084】

いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号２２、２３、２４、２５および２６の１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、前記変異タンパク質は、配列番号２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。

【0085】

好ましくは、変異の組み合わせは、ＩＬ－２が低減されたＣＤ２５＋Ｔ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴＡ５シグナル伝達を優先的に刺激する偏向性を有すること、且つ増強されたＣＤ２５－Ｔ細胞におけるシグナル伝達を刺激する特性を有することをもたらす。

【0086】

その他の変異

【0087】

上記「ＣＤ４５結合」領域および「Ｂ’Ｃ’ループ領域」における変異を除いて、本発明のＩＬ－２変異タンパク質の上記の１つまたは複数の有益な特性を保持すれば、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、他の領域または位置に１つまたは複数の変異をさらに有してもよい。例えば、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、発現または均質性または安定性の改善などのさらなる利点を提供するために、位置１２５での置換、例えばＣ１２５Ｓ、Ｃ１２５Ａ、Ｃ１２５Ｔ、またはＣ１２５Ｖをさらに含むことができる（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号参照）。さらに、例えば、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ２のＮ末端でのＯ糖修飾を除去するために、Ｔ３Ａなど、位置３での置換をさらに含むことができる。さらに、例えば、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、Ｔ細胞活性化の活性を増強するために、Ｋ７６Ｄ／Ａなど、位置７６での置換をさらに含むことができる。当業者は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質に組み込むことができる追加の変異をどのように決定するかを知っている。

【0088】

ＩＬ－２変異タンパク質と野生型タンパク質との間の配列の相違は、配列同一性によって、または両者の間の異なるアミノ酸の数によって表すことができる。一実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質と野生型タンパク質との間に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、好ましくは９５％であるが、好ましくは９７％以下、より好ましくは９６％以下の同一性を有する。他の実施形態において、本発明の上記ＣＤ２５領域の変異およびＢ’Ｃ’ループ領域の変異の両方を除いて、ＩＬ－２変異タンパク質と野生型タンパク質との間に、１５個以下、例えば１～１０個、または１～５個の変異、例えば、０、１、２、３、４個の変異を有してもよい。一実施形態において、前記残りの変異は保存的置換であってもよい。一実施形態において、前記残りの変異はＣＤ２５領域とＢ’Ｃ’ループ領域以外で発生する。

【0089】

２．融合タンパク質および免疫複合体

【0090】

本発明は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質をさらに提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、改善された薬物動態特性を付与することができる別のポリペプチド、例えばアルブミン、より好ましくは抗体Ｆｃ断片と融合される。一実施形態において、Ｆｃ断片は、エフェクター機能を低減または排除する変異、例えば、Ｆｃγ受容体に対する結合を低減するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異またはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａを含む。好ましくは、Ｆｃを含む融合タンパク質は、増加した血清半減期を有する。１つの好ましい実施形態において、Ｆｃを含む融合タンパク質はさらに、低減されたＦｃ領域により媒介されるエフェクター機能、例えば低減または排除されたＡＤＣＣまたはＡＤＣＰまたはＣＤＣエフェクター機能を同時に有する。

【0091】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質と融合されるＦｃ断片は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ ＦｃまたはヒトＩｇＧ４ ＦｃなどのヒトＩｇＧ Ｆｃである。一実施形態において、Ｆｃ断片は、アミノ酸配列配列番号７を含むか、またはそれと少なくとも９０％の同一性、例えば９５％、９６％、９７％、９９％またはそれ以上の同一性を有する。

【0092】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質は、リンカーによってＦｃ領域と融合される。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５－Ｔ細胞に対するＦｃ融合タンパク質の活性化作用を向上させるために、リンカーを選択することができる。一実施形態において、リンカーはＧＳＧＳであり、より好ましくは２ｘ（Ｇ４Ｓ）である。

【0093】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１５－１９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は配列番号１５－１９の配列からなる。

【0094】

本発明は、本発明のＩＬ２変異タンパク質および抗原結合分子を含む免疫複合体をさらに提供する。好ましくは、抗原結合分子は、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、または抗体もしくは抗体断片、特にＦａｂ分子およびｓｃＦｖ分子である。いくつかの実施形態において、前記抗原結合分子は、腫瘍細胞上または腫瘍環境中に存在する抗原、例えば、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシンＣのＡ１ドメイン（ＴＮＣ Ａ１）、テネイシンＣのＡ２ドメイン（ＴＮＣ Ａ２）、フィブロネクチンの外部ドメインＢ（Ｅｘｔｒａ Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、ＥＤＢ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、および黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）から選択される抗原に特異的に結合する。したがって、本発明の免疫複合体は、被験者への投与後に腫瘍細胞または腫瘍環境を標的にすることができ、さらなる治療上の利点、例えば、より低い用量での治療の可能性およびそれによる副作用の低減、抗腫瘍効果の増強などを提供する。

【0095】

本発明の融合タンパク質および免疫複合体において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、別の分子または抗原結合分子に直接またはリンカーを介して結合することができ、且ついくつかの実施形態において、タンパク質加水分解切断部位が両者の間に含まれる。

【0096】

３．ポリヌクレオチド、ベクターと宿主

【0097】

本発明は、上記ＩＬ－２変異タンパク質または融合体または複合体のいずれかをコードする核酸を提供する。本発明の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当該分野で周知の方法により、新規固相ＤＮＡ合成、または野生型ＩＬ－２をコードする既存の配列のＰＣＲ変異誘発によって産生することができる。なお、本発明のポリヌクレオチドおよび核酸は、分泌シグナルペプチドをコードするセグメントを含んでもよく、本発明の変異タンパク質をコードするセグメントに操作可能に連結されて、本発明の変異タンパク質の分泌発現を誘導することができる。

【0098】

本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは、例えば真核発現ベクターなどの発現ベクターである。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターはｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターである。

【0099】

本発明はまた、前記核酸または前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。変異ＩＬ－２タンパク質または融合体または免疫複合体の発現を複製および支持するのに適用される宿主細胞は、当該分野で周知である。特定の発現ベクターでこのような細胞をトランスフェクションまたは形質導入することができるとともに、ベクターを含む多くの細胞を大規模な発酵槽に接種するために増殖させることができ、臨床的使用のための十分な量のＩＬ－２変異体または融合体または免疫複合体が得られる。一実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞もしくは２９３細胞）から選択される。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化を必要としない場合、細菌中で生成することができる。発現後、可溶性画分においてポリペプチドを細菌細胞ペーストから単離して、さらに精製することができる。原核生物の他、糸状菌または酵母などのような真核微生物は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローンまたは発現宿主であり、グリコシル化経路が既に「ヒト化」される真菌と酵母菌株を含み、その結果、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成を引き起こす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ２２，１４０９－１４１４（２００４）およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ２４，２１０－２１５（２００６）が参照される。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓系（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ３６，５９（１９７７）に記載された２９３または２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ（ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，ＢｉｏｌＲｅｐｒｏｄ２３，２４３－２５１（１９８０）に記載されたＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、ｂｕｆｆａｌｏラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．ＡｃａｄＳｃｉ３８３，４４－６８（１９８２）に記載された）、ＭＲＣ５細胞およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７７，４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。一実施形態において、宿主細胞は真核生物細胞であり、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ球（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳動物細胞である。

【0100】

４．調製方法

【0101】

さらなる態様において、本発明は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質または融合体または複合体を調製する方法を提供し、前記方法は、ＩＬ－２変異タンパク質または融合体または複合体の発現に適した条件下で、前記タンパク質または融合体または複合体をコードする核酸を含む上記で提供されるような宿主細胞を培養するステップと、場合により前記宿主細胞（または宿主細胞培地）から前記タンパク質または融合体または複合体を回収するステップとを含む。

【0102】

５．測定方法

【0103】

当該分野で既知の様々な測定方法を利用して、本明細書により提供されるＩＬ－２変異タンパク質に対して同定、スクリーニング、またはその物理的／化学的特性および／または生物学的活性の特性評価を行うことができる。

【0104】

一態様において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質に対してＩＬ－２受容体へのその結合活性を測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットなどのような当該分野で既知の方法、または本明細書の実施例に開示されている例示的な方法によって、ヒトＩＬ－２Ｒαまたはβタンパク質との結合を測定することができる。例えば、細胞表面上で変異タンパク質を発現するようにトランスフェクションされた酵母ディスプレイ細胞などの細胞を、標識された（例えばビオチン標識された）ＩＬ－２Ｒαまたはβタンパク質と反応させるフローサイトメトリーによって測定することができる。あるいは、結合動力学（例えばＫＤ値）を含めて、変異タンパク質の受容体への結合は、組換え変異タンパク質－Ｆｃ融合体を使用してＦｏｒｔｅＢｉｏ測定法において測定することができる。

【0105】

さらなる態様において、受容体結合の下流で起こるシグナル伝達および／または免疫賦活効果を測定することによって、ＩＬ－２変異タンパク質のＩＬ－２受容体に結合する能力を間接的に測定することができる。

【0106】

したがって、いくつかの実施形態において、生物学的活性を有する変異ＩＬ－２タンパク質を同定するための測定法を提供する。生物学的活性は、例えば、ＩＬ－２受容体を有するＴおよび／またはＮＫ細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導する能力、ＩＬ－２受容体を有するＴおよび／またはＮＫ細胞および／またはＴｒｅｇ細胞におけるＩＬ－２シグナル伝達を誘導する能力、低下したＴ細胞におけるアポトーシスを誘導する能力、腫瘍の退縮を誘導するおよび／または生存を改善する能力、ならびに低下した血管透過性などの低下したインビボ毒性特性を含んでもよい。本発明は、インビボおよび／またはインビトロにこのような生物学的活性を有する変異ＩＬ－２タンパク質も提供する。

【0107】

当該分野で周知の様な方法は、ＩＬ－２の生物学的活性を測定するために使用することができる。例えば、ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの生成を刺激する本発明のＩＬ－２変異タンパク質の能力を試験するための適切な測定法は、培養されたＮＫ細胞を本発明の変異ＩＬ－２タンパク質または融合体または免疫複合体とインキュベートし、その後、ＥＬＩＳＡによって培地中のＩＦＮ－γ濃度を測定するステップを含むことができる。ＩＬ－２シグナル伝達は、いくつかのシグナル伝達経路を誘導し、ＪＡＫ（Ｊａｎｕｓキナーゼ）およびＳＴＡＴ（シグナル伝達物質および転写活性化因子）シグナル伝達分子に関与する。

【0108】

ＩＬ－２と受容体βおよびγサブユニットとの相互作用は、受容体およびＪＡＫ１とＪＡＫ３（βおよびγサブユニットとそれぞれ結合する）のリン酸化をもたらす。次に、ＳＴＡＴ５はリン酸化受容体と結合し、それ自体が非常に重要なチロシン残基上でリン酸化される。これによりＳＴＡＴ５が受容体から解離し、ＳＴＡＴ５が二量体化され、ＳＴＡＴ５二量体が細胞核に移行し、当該位置に標的遺伝子の転写を促進する。したがって、ＩＬ－２受容体を介してシグナル伝達を誘導する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの能力は、例えばＳＴＡＴ５のリン酸化を測定することによって評価することができる。この方法の詳細は、実施例に開示されている。例えば、ＰＢＭＣを本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または免疫複合体で処理し、リン酸化ＳＴＡＴ５のレベルをフローサイトメトリーによって測定することができる。

【0109】

さらに、腫瘍成長および生存に対する変異ＩＬ－２の影響は、当該分野で既知の様々な動物腫瘍モデルにおいて評価することができる。例えば、がん細胞系の異種移植片を免疫不全マウスに移植し、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または免疫複合体で処理することができる。腫瘍抑制率（例えば、アイソタイプ対照抗体と比較して計算される）に基づいて、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチド、融合体および免疫複合体のインビボ抗腫瘍効果を検出することができる。なお、動物の体重変化（例えば、投与前と比較して、絶対体重の変化または体重変化パーセント）に基づいて、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチド、融合体および免疫複合体のインビボ毒性を測定することができる。死亡率、生存期間観察（行動、体重、体温などの有害作用の目に見える症状）および臨床的および解剖学的病理学（例えば、血液化学値の測定および／または組織病理学的分析）に基づいて、前記インビボ毒性を測定することもできる。

【0110】

さらなる態様において、当該分野で既知の方法によって、発現量と製品の純度などの本発明の変異タンパク質の創薬可能性を特徴付けることができる。発現量の測定について、変異タンパク質が培養細胞から分泌され、培養上清で発現される場合、遠心分離により収集された細胞培養液のタンパク質含有量を測定することができる。あるいは、収集された細胞培養液のワンステップの精製後に、例えばワンステップアフィニティークロマトグラフィー精製後に、測定することができる。製品純度の測定について、得られた生産細胞の培養上清に対してワンステップアフィニティークロマトグラフィー精製を実施した後、純度を測定して、変異タンパク質の精製性能を検出することができる。好ましくは、本発明の変異タンパク質は、このワンステップアフィニティークロマトグラフィーによる精製後、野生型タンパク質よりも有意に優れた純度を有し、本発明の変異タンパク質がより良好な精製性能を有することを示している。純度測定法は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法を含むが、これに限定されない、当該分野で既知の任意の従来の方法であってもよい。

【0111】

さらなる態様において、当該分野で既知の方法によって、本発明の変異ＩＬ－２タンパク質の保存安定性を検出することもできる。本発明において、「安定した」抗体は、緩衝液に調製された抗体が、特定の条件下での保存後に許容可能な程度の物理的安定性および／または化学的安定性を保持するものを指す。一実施形態において、緩衝液はｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液である。他の実施形態において、緩衝液はｐＨ６．５のヒスチジン緩衝液である。一実施形態において、４０℃で、２週間またはそれ以上の時間など、一定の期間保存した後、抗体の安定性を検出する。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法またはＣＥ－ＳＤＳ法により、保存後の抗体の純度の降下程度を検出して抗体の安定性を決定することができる。

【0112】

６．スクリーニング方法

【0113】

さらなる態様において、本発明は、改善された特性を有するＩＬ－２変異タンパク質を得るための方法およびこの方法により得られたＩＬ－２変異タンパク質を提供する。

【0114】

一実施形態において、本発明の方法は、
（１）ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒａとの結合界面に変異により１つまたは複数の変異を導入し、ＩＬ－２のＢ’Ｃ’ループ領域で変異により当該ループ領域配列を短縮させるステップ、
好ましくは、前述のＣＤ２５結合領域の変異の組み合わせおよび／または前述のＢ’Ｃ’ループ配列のキメラまたは切断変異を導入するステップ、
（２）哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞）において、ＩＬ－２変異タンパク質を、例えばＦｃ融合体（例えばＦｃＬＡＬＡ融合体）の形態で発現するステップ、
－（ｉ）発現量および／または精製後のタンパク質の純度（例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出による、ワンステップアフィニティークロマトグラフィー後の純度）、（ｉｉ）低減されたＩＬ２Ｒα結合、（ｉｉｉ）増強されたＩＬ２Ｒβ結合の１項または複数項の改善された特性を有する変異タンパク質を同定するステップ、を含む。

【0115】

一実施形態において、前記方法は、ステップ（１）の変異の組み合わせを行う前に、創薬可能性（例えば、発現量および／または製品安定性および／または均質性、例えば、ワンステップＦｃアフィニティークロマトグラフィー純度）が改善されたＩＬ－２変異を同定するステップを含む。１つの好ましい実施形態において、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐループを短縮されたＢ’Ｃ’ｌｏｏｐループに置換または切断することにより、変異タンパク質の創薬可能性を改善する。

【0116】

一実施形態において、前記方法は、ステップ（１）の変異の組み合わせを行う前に、野生型ＩＬ－２と比較して、低減された（好ましくは排除された）ＩＬ－２Ｒａ結合能力を付与するＩＬ－２変異を同定するステップを含む。一実施形態において、ＣＤ２５結合領域における部位に対してアミノ酸置換または組み合わせ置換を行うことにより、ＣＤ２５結合親和性を低減または排除する。

【0117】

当業者には明らかなように、これらの変異を、さらに改善された創薬可能性または他の改良された特性を付与する変異と組み合わせて、複数の改良された特性を有するＩＬ－２変異タンパク質を得ることができる。

【0118】

一実施形態において、（例えば既知の）ＩＬ２Ｒａ結合の低減をもたらすＣＤ２５領域の変異を、（例えば既知の）創薬可能性が改善されたＢ’Ｃ’ループ領域の長さの切断および／または置換変異と組み合わせて、ＩＬ－２タンパク質に導入して特性を同定する。１つの好ましい実施形態において、前記同定は、野生型ＩＬ－２と比較して、低減されたＩＬ－２Ｒａ結合および改善された創薬可能性（例えば改善された発現および／または純度、および／または製品安定性および／または均質性）、場合により、基本的に変化しないかまたは弱体化されたかまたは増強されたＩＬ－２Ｒβ結合親和性を含む。

【0119】

いくつかの実施形態において、変異テンプレートとして使用される親野生型ＩＬ－２タンパク質は、好ましくは、配列番号１と少なくとも８５％、または少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、より好ましくは、ヒト由来のＩＬ－２タンパク質である。

【0120】

７．医薬組成物と医薬製剤

【0121】

本発明は、ＩＬ－２変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体を含む組成物（医薬組成物または医薬製剤を含む）、およびＩＬ－２変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物をさらに含む。これらの組成物はまた、当該分野で既知の薬学的に許容可能な担体、緩衝剤を含む薬学的に許容可能な賦形剤などの適切な薬学的に許容可能な補助材料を必要に応じて含んでもよい。

【0122】

本発明に適用される薬学的に許容可能な担体は、水、および石油とピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ごま油などの動物もしくは植物に由来するまたは合成されたものを含む、油などの滅菌液体であってもよい。医薬組成物を静脉内に投与する場合、水はベクターとして好ましい。さらに、生理塩水溶液、水性デキストロースとグリセリン溶液を液体ベクターとして、特に注射可能な溶液に用いることができる。適切な薬学的に許容可能な賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、ジオール、水、エタノールなどを含む。賦形剤の使用およびその用途に関しては、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」，５ｔｈ ｅｄｉｔｏｎ，Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ，Ｐ．Ｊ．ＳｅｓｋｅｙおよびＳ．Ｃ．Ｏｗｅｎ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈｉｃａｇｏも参照される。必要に応じて、前記組成物は少量の湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤をさらに含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、持続性放出製剤などの形態を採用することができる。経口製剤は、薬用マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンなどの標準的なベクターを含んでもよい。

【0123】

所望の純度を有する本発明のＩＬ－２変異タンパク質、融合体または免疫複合体を任意の１つまたは複数の薬学的に許容可能な補助材料（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｏｓｏｌ，Ａ．（１９８０））と混合することによって、本発明を含む医薬製剤を調製し、好ましくは凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製する。例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６，１７１，５８６号およびＷＯ２００６／０４４９０８に記載されるものを含み、後者の製剤はヒスチジン－アセテート緩衝剤を含む。なお、持続性放出製剤を調製することができる。持続性放出製剤の適切な実例は、タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、前記マトリックスは、フィルムまたはマイクロカプセルの形態などのように成形品である。

【0124】

一実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＰＢＳ緩衝液またはヒスチジン緩衝液など、ｐＨ６～８の緩衝液を含む。一実施形態において、ＰＢＳ緩衝液は、例えば、約ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液である。一実施形態において、ヒスチジン緩衝液は、例えば、１０ｍＭのヒスチジン、５％のソルビトール、および０．０２％のポリソルベート８０を含む、約ｐＨ６．５のヒスチジン緩衝液である。本発明の医薬組成物は、好ましくは、前記緩衝液において保存安定性が維持されている。

【0125】

本発明の医薬組成物または製剤は、１種または複数種の他の活性成分をさらに含んでもよく、前記活性成分は、特定の適応症の治療に必要であり、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的な活性を有する活性成分である。例えば、化学療法剤、免疫チェックポイント阻害剤などの他の抗がん活性成分をさらに提供することが理想的である。前記活性成分は、意図した目的のために有効な量で適切に組み合わせた形態で存在する。

【0126】

８．組み合わせ製品

【0127】

一態様において、本発明は、本発明の変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体、および１種または複数種の他の治療剤（例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害剤、ワクチン、抗感染症剤など）を含む組み合わせ製品をさらに提供する。本発明の組み合わせ製品は、本発明の治療方法において使用できる。

【0128】

いくつかの実施形態において、本発明は、組み合わせ製品を提供し、ここで、前記他の治療剤が、例えば、免疫応答を刺激して被験者の免疫応答をさらに増強、刺激または上方制御するのに有効な、抗体などの治療剤である。

【0129】

いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品はがんの予防または治療に用いられる。いくつかの実施形態において、がんは、例えば、直腸がん、結腸がん、結腸直腸がんなどの胃腸管のがんである。いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品は、例えば細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、原生動物感染などの感染の予防または治療に用いられる。

【0130】

９．治療方法と使用

【0131】

本明細書において、「個体」または「被験者」という用語は、互換的に使用されてもよく、哺乳動物を指す。哺乳動物は、家畜（例えば、乳牛、綿羊、ネコ、イヌとウマ）、霊長類（例えば、ヒトとサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギおよびげっ歯類（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。特に、被験者はヒトである。

【0132】

本明細書において、「治療」という用語は、治療を受けている個体における疾病の天然過程を変化させようとする臨床的介入を指す。所望の治療效果は、疾病の発生または再発の防止、症状の軽減、疾病の如何なる直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、病状進展速度の低減、疾病の状態の改善または緩和、および予後の緩和または改善を含むが、これらに限定されない。

【0133】

一態様において、本発明は、有效量の本発明のＩＬ－２変異タンパク質または融合体または免疫複合体を含む医薬組成物を被験者に投与するステップを含む、被験者の免疫系を刺激する方法を提供する。本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＣＤ２５－ＣＤ１２２＋エフェクター細胞（細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞）に対して高い活性および選択性を有し、且つ低減されたＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞に対する刺激作用を有する。したがって、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、被験者の免疫系を刺激するために低用量で使用することができる。

【0134】

したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、有効量の本明細書に記載の任意のＩＬ－２変異タンパク質、またはその融合体または免疫複合体を被験者に投与するステップを含む、被験者の身体の免疫応答を増強する方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体を、腫瘍を有する被験者に投与し、抗腫瘍免疫応答を刺激する。別のいくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合部分を、感染を有する被験者に投与し、抗感染免疫応答を刺激する。

【0135】

別の態様において、本発明は、有効量の本明細書に記載の任意のＩＬ－２変異タンパク質、またはその融合体または免疫複合体を前記被験者に投与するステップを含む、がんなどの被験者の疾患を治療する方法に関する。がんは、早期、中期もしくは末期にあるがんまたは転移性がんであってもよい。いくつかの実施形態において、がんは、例えば、直腸がん、結腸がん、結腸直腸がんなどの胃腸管のがんであってもよい。

【0136】

別の態様において、本発明は、有効量の本明細書に記載の任意のＩＬ－２変異タンパク質またはその断片、または前記抗体もしくは断片を含む免疫複合体、多重特異性抗体、または医薬組成物を前記被験者に投与するステップを含む、慢性感染などの被験者の感染性疾患を治療する方法に関する。一実施形態において、前記感染はウイルス感染である。

【0137】

本発明の変異タンパク質（およびそれを含む医薬組成物またはその融合体または免疫複合体、および任意の他の治療剤）は、非経口投与、肺内投与、鼻腔内投与を含む任意の適切な方法により投与されてもよく、且つ、局所治療に必要な場合、病巣内に投与されてもよい。非経口注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与を含む。投与が短期であるか長期であるかによってある程度決まり、投与は、例えば、静脈内注射投与または皮下注射投与などの注射を含む任意の適切な経路によることができる。本明細書において、非限定的であるが、単回投与または複数の時刻での複数回投与、ボーラス投与、パルス注入などの様々な投与スケジュールが含まれる。

【0138】

疾患を予防または治療するために、本発明の変異タンパク質の適切な用量（単独で投与される場合または１種または複数種の他の治療剤と組み合わせて投与される場合）が、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度とその進行、予防目的の投与か治療目的の投与か、過去の治療、患者の臨床病歴および前記抗体に対する応答、主治医の判断によって決定される。前記抗体は、単回の治療で、または一連の治療にわたって患者に適切に投与される。

【0139】

さらなる態様において、本発明はまた、上記の方法に使用される（例えば治療のため）薬物の調製における、本発明のＩＬ－２変異タンパク質、組成物、免疫複合体、融合体の使用を提供する。

【0140】

本発明の理解を補助するために、以下の実施例を説明する。如何なる方法によっても、実施例を、本発明の請求範囲を制限するものと解釈する意図はなく、そうすべきでもない。

【実施例】

【0141】

実施例１：インターロイキン２点変異ライブラリーの設計と構築

【0142】

インターロイキン２点変異ライブラリーの設計

【0143】

インターロイキン２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２、ＩＬ－２と略称）とそのα受容体ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒαと略称）複合物の結晶構造（ＰＤＢ：１Ｚ９２）（図１に示す）に基づいて、相互作用部位のＩＬ－２残基を表１に示されるように変異させた。各部位の元のアミノ酸は５０％の割合を占め、残りの５０％の割合は表１の「変異アミノ酸」で均等に分割された。ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαの相互結合部位に対して設計されたライブラリーの理論的多様性は、３×８×８×９×６×６×３×６×６×５×６≒２．０×１０８であり、ライブラリーはＩＢＹＤＬ０２９（Ｉｎｎｏｖｅｎｔｂｉｏ Ｙｅａｓｔ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｙ）と命名された。

【0144】

【表7】

【0145】

インターロイキン２点変異ライブラリーの構築

【0146】

野生型ＩＬ－２（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８，ａａ２１－１５３，Ｃ１２５Ｓ，ＩＬ－２ＷＴと略称）を酵母ディスプレイプラスミドｐＹＤＣ０１１（プラスミドの全配列は図９に示す）の２つのＢａｍＨＩ酵素切断部位の間に配置した。ＩＬ－２ＷＴの配列は、本出願において、ジスルフィド架橋ＩＬ－２二量体の形成を回避するために１２５位にＣ１２５Ｓ変異が導入された配列番号１に示されている。プラスミド構築の具体的なステップは以下のとおりである：

【0147】

１．プライマーＡＭＰ０２１０およびＡＭＰ０２１１を使用して、ＩＬ－２ＷＴ遺伝子をテンプレートとして増幅したこと（プライマー配列は図３に示す）、

【0148】

２．プラスミドｐＹＤＣ０１１をＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ，製品番号：Ｒ３１３６Ｖ）で酵素切断した後、ゲル（ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．２８７０４）で回収したこと、

【0149】

３．１％のアガロースゲルで増幅産物および酵素切断産物を回収したこと、

【0150】

４．回収した後、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｖａｚｙｍｅ製品番号：Ｃ１１３－０２）でインビトロ相同組換えを行ったこと、

【0151】

５．組換え後、産物を大腸菌Ｔｏｐ１０コンピテントセル（天根，製品番号：ＣＢ１０４－０２）に移し、アンピシリン耐性を含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養したこと、

【0152】

６．成長したモノクローナルコロニーを配列決定した後、正しいプラスミドをｐＹＤＣ０３５と命名したこと。

【0153】

既存の文献によると、ＩＬ－２変異体ＩＬ－２３ＸはＩＬ－２Ｒαに結合せず、ＩＬ－２Ｒβへの結合力が一定に維持された（Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：１５３７３，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５３７３）。ＩＬ－２３Ｘを酵母表面にディスプレイし、対照として使用した。ＩＬ－２３Ｘの配列は配列番号４に示され、当該タンパク質はＩＬ－２ＷＴと同様に、Ｃ１２５Ｓ変異も含む。

【0154】

表１のライブラリー構築プロトコルに従って、所望のプライマー（図３に示す）を設計し、蘇州金唯智生物科技有限公司によって合成した。

【0155】

ＩＢＹＤＬ０２９ライブラリーＤＮＡ増幅：１．ｐＹＤＣ０３５をテンプレートとし、プライマーＡＭＰ０１９１、ＡＭＰ０２００を用いて断片０２９－Ｆを増幅し、２．ｐＹＤＣ０３５をテンプレートとし、プライマーＡＭＰ０２０１、ＡＭＰ０１９９を用いて断片０２９－Ｒを増幅し、３．断片０２９－Ｆ、０２９－Ｒをゲルで回収してＰＣＲ増幅テンプレートとし、プライマーＡＭＰ０１９１とＡＭＰ０１９９を用いて全長断片０２９を増幅した。

【0156】

１００μｇのプラスミドｐＹＤＣ０１１をＢａｍＨＩで酵素切断し、酵素切断後にＰＣＲ産物回収キット（ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．２８１０４）で回収し、十分な量の線状化プラスミドを得た。線状化プラスミドとライブラリーＤＮＡを４μｇ：１２μｇで混合し、既存の方法（Ｌｏｒｅｎｚｏ Ｂｅｎａｔｕｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌ．２３ ｎｏ．４ ｐｐ．１５５-１５９，２０１０）でライブラリーＤＮＡと線状化プラスミドとの混合物をＥＢＹ１００酵母菌株に電気的に導入した。電気的に導入した後、ライブラリーを勾配希釈してＳＤ－Ｔｒｐ（ＴＡＫＡＲＡ、製品番号：６３０３０９）のプレートに塗布し、成長したコロニーの数を統計した。得られたライブラリーの実際の多様性はＩＢＹＤＬ０２９：４．２×１０８であり、ライブラリーの理論的多様性よりも大きかった。

【0157】

実施例２：ＩＬ－２点変異ライブラリーのスクリーニングおよび同定

【0158】

ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβタンパク質の調製およびビオチン標識

【0159】

発現プラスミドの構築およびトランスフェクション

【0160】

ＩＬ－２受容体ＩＬ－２Ｒα（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１５８９，ａａ２２－２１７）およびＩＬ－２Ｒβ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１４７８４，ａａ２７－２４０）は配列のＣ末端にａｖｉタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、当該タグペプチドはＢｉｒＡ酵素によって触媒されてビオチン化することができる）および６つのヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）を連結し、ｐＴＴ５ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）にそれぞれ構築し、ＩＬ－２ＲαおよびＩＬ－２Ｒβタンパク質の発現に用いた。構築によって産生された受容体の配列は配列番号５および６に示されている。

【0161】

化学トランスフェクション試薬であるポリエチレンイミン（ＰＥＩと略称、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，製品番号：２３９６６）を使用して、製造業者によって提供されたプロトコルに従って、培養されたＨＥＫ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，製品番号：Ｒ７９００７）細胞を、上記で構築した発現プラスミドベクターで一過性トランスフェクションした。

【0162】

タンパク質の発現および精製

【0163】

ＩＬ－２ＲαおよびＩＬ－２Ｒβタンパク質を発現する細胞培養液を４５００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心分離し、細胞を捨てた。上清を０．２２μｍのフィルターで濾過し、さらに精製した。簡単に言えば、精製に使用したニッケルカラム（５ｍＬ Ｈｉｓｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ，ＧＥ，１７－３７１２－０６）を０．１ＭのＮａＯＨで２ｈ浸漬した後、５～１０倍カラム体積の超純水ですすぎ、アルカリ液を除去した。精製前に５倍カラム体積の結合緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４，３００ｍＭのＮａＣｌ）で精製カラムを平衡化し、細胞上清を平衡化したカラムに通し、１０倍カラム体積の洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４，３００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのｉｍｉｄａｚｏｌｅ）でカラムを洗浄し、非特異的に結合するヘテロタンパク質を除去し、次いで目的のタンパク質を３～５倍カラム体積の溶出液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４，３００ｍＭのＮａＣｌ，１００ｍＭのｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で溶出した。収集したタンパク質を限外濾過によって濃縮してＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，７００１１－０４４）に交換した後、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥ，１０／３００ＧＬ，１０２４５６０５）でさらに単離して精製し、単量体の溶出ピークを収集し、カラムの平衡化および溶出緩衝液はＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，７００１１－０４４）であった。１００μｇの精製後のタンパク質試料を取り、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムＳＷ３０００（ＴＯＳＯＨ製品番号：１８６７５）でタンパク質の純度を測定した。

【0164】

ＩＬ－２ＲαとＩＬ－２Ｒβタンパク質のビオチン化標識

【0165】

酵素触媒法によるＩＬ－２ＲαとＩＬ－２Ｒβタンパク質のビオチン標識方法は、以下のとおりである。上記のように発現および精製された適量のＩＬ－２ＲαとＩＬ－２Ｒβタンパク質溶液に、１／１０（ｍ／ｍ）質量のＨｉｓ－ＢｉｒＡタンパク質（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０６７０９）を加え、同時に最終濃度が２ｍＭのＡＴＰ（ｓｉｇｍａ製品番号：Ａ２３８３－１０Ｇ）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＤ－ビオチン（ＡＶＩＤＩＴＹ製品番号：Ｋ０７１７）を加え、３０℃で１ｈインキュベートし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥ，１０／３００ＧＬ，１０２４５６０５）により精製し、余分なビオチンとＨｉｓ－ＢｉｒＡを除去し、精製後の試料をＦｏｒｔｅｂｉｏのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＳＡ）センサ（ＰＡＬＬ，１８－５０１９）により検証し、ビオチン標識の成功を確認した。本実施例で得られたビオチン標識されたＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ ＩＨタンパク質は、それぞれＩＬ－２Ｒα－ＢｉｏｔｉｎおよびＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎと略称される。

【0166】

ＩＬ－２変異ライブラリーによるＩＬ－２ｍｕｔａｎｔのスクリーニングおよび染色による同定

【0167】

ＩＬ－２Ｒαには結合しないがＩＬ－２Ｒβには結合するＩＬ－２ｍｕｔａｎｔのスクリーニング

【0168】

酵母ベースのＩＬ－２ｍｕｔａｎｔディスプレイライブラリーＩＢＹＤＬ０２９から、２．０×１０９の酵母細胞を取って培養および誘導し、ライブラリーの多様性は２．０×１０８であった。ＩＢＹＤＬ０２９ライブラリーの多様性が比較的大きいため、１回目のスクリーニングにおいて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社のＭＡＣＳシステムを利用して磁気ビーズ細胞選別を行った。まず、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、１％のウシ血清アルブミン含有）において、２×１０９の酵母細胞を室温で３０ｍｉｎインキュベートし、緩衝液にビオチン標識されたＩＬ－２Ｒβ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎビオチン標識，ＩＬ－２Ｒβ－Ｂｉｏｔｉｎと略称）が５００ｎＭ含有された。５０ｍＬの予め冷却されたＦＡＣＳ洗浄緩衝液で１回洗浄し、次に１０ｍＬの同じ洗浄緩衝液で細胞を再懸濁し、ストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、製品番号：１３０－０９０－４８５）を４０μｌ加えて４℃で１５ｍｉｎインキュベートした。３０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して上清を捨てた後、１０ｍＬのＦＡＣＳ洗浄緩衝液で細胞を再懸濁し、細胞溶液をＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムに加えた。添加が完了した後、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液でカラムを３回洗浄し、各回に３ｍＬのＦＡＣＳ洗浄緩衝液を使用した。磁気領域からＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムを取り外し、５ｍＬの成長培地で溶出し、溶出した酵母細胞を収集して３０℃で一晩成長させた。

【0169】

１回のスクリーニング後に得られたライブラリー細胞を２０℃下で２４ｈ振とう誘導してＩＬ－２ｍｕｔａｎｔをディスプレイし、フローサイトメトリーを用いて２回目の選別を行った。簡単に言えば、ライブラリーからの３×１０７の酵母細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、ＩＬ－２Ｒβ－Ｂｉｏｔｉｎ（３００ｎＭ）およびＡｎｔｉ Ｆｌａｇ抗体を含有するＦＡＣＳ緩衝液に加え、室温で３０ｍｉｎインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ洗浄緩衝液で２回洗浄した後、細胞とＳＡ－ＰＥ（フィコエリスリンで標識されたストレプトアビジン，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，製品番号：１２－４３１７－８７）およびヤギ抗マウスＩｇＧ結合Ａｌｅｘ Ｆｌｏｕｒ－６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，製品番号：Ａ２１２３５）を含有するＦＡＣＳ洗浄緩衝液とを混合し、４℃下で遮光で１５ｍｉｎインキュベートした。予め冷却されたＦＡＣＳ洗浄緩衝液で２回洗浄し、１ｍＬの緩衝液に再懸濁し、細胞をフィルター付きの分離管に移した。ＭｏＦｌｏ＿ＸＤＰを使用して細胞を選別し、選別後の酵母細胞を３０℃で一晩成長させた。３回目の選別プロトコルは２回目と同じで、３回のスクリーニングを経た後、モノクロナールを選んで配列決定した。

【0170】

ＩＬ－２Ｒβ－Ｂｉｏｔｉｎを使用して、３回のスクリーニングによりライブラリーＩＢＹＤＬ０２９から５３個の変異配列が得られた。

【0171】

ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ染色同定

【0172】

配列決定後の単一変異配列を含む酵母細胞を２０℃で２４ｈ振とう誘導してＩＬ－２ｍｕｔａｎｔをディスプレイし、その受容体ＩＬ－２Ｒα－Ｂｉｏｔｉｎ、ＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎとそれぞれ染色し、具体的なステップは以下のとおりである。

【0173】

Ｉ． ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔによりディスプレイされた酵母細胞とＩＬ－２Ｒα－Ｂｉｏｔｉｎ染色分析：

【0174】

１． 各試料からの１×１０６の細胞を遠心分離により上清を捨ててＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した後に使用に備えた。

【0175】

２． ５０ｎＭのＩＬ－２Ｒα－ＢｉｏｔｉｎとＡｎｔｉ Ｆｌａｇ抗体を含むＦＡＣＳ緩衝液を１００μＬ加えて室温で３０ｍｉｎインキュベートした。

【0176】

３． 予め冷却されたＦＡＣＳ緩衝液を使用して、３０００ｒｐｍで４℃で３ｍｉｎ遠心分離して２回洗浄した。

【0177】

４． ＳＡ－ＰＥ、ヤギ抗マウス結合Ａｌｅｘ Ｆｌｏｕｒ－６４７を含むＦＡＣＳ緩衝液を１００μＬ加え、氷上で遮光で２０ｍｉｎインキュベートした。

【0178】

５． 予め冷却されたＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞を１００μＬの緩衝液で再懸濁し、フローアナライザー（ＢＤ，ＡＣＣＵＲＩ Ｃ６）でＩＬ－２ｍｕｔａｎｔとＩＬ－２Ｒαの結合レベルを分析した。

【0179】

ＩＩ． ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔによりディスプレイされた酵母細胞とＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎ染色分析：

【0180】

１． 各試料からの１×１０６の細胞を遠心分離により上清を捨ててＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した後に使用に備えた。

【0181】

２． ＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎ（３０ｎＭ～１００ｎＭ）とＡｎｔｉ Ｆｌａｇ抗体を含むＦＡＣＳ緩衝液を１００μＬ加えて室温で３０ｍｉｎインキュベートした。

【0182】

３． ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔとＩＬ－２Ｒβとの結合レベルを、ステップ３～５と同様にして分析した。

【0183】

フロー染色の結果から分かるように、ライブラリーＩＢＹＤＬ０２９からスクリーニングして得られた５３個のＩＬ－２ｍｕｔａｎｔの、ＩＬ－２Ｒαとの結合の平均蛍光シグナル強度はＩＬ－２３Ｘに近く、即ち、いずれも結合せず、ＩＬ－２Ｒβとの結合の平均蛍光シグナル強度はＩＬ－２３Ｘよりも強かった。

【0184】

ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ融合タンパク質の発現および受容体との親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）の測定

【0185】

発現プラスミドの構築

【0186】

ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ融合タンパク質を発現するために、ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ配列を２つのＧＧＧＧＳを介してＦｃＬＡＬＡに連結するとともに、ｐＣＤＮＡ３．１（Ａｄｄｇｅｎｅ）のベクターに構築した。

【0187】

なお、対照として、ＩＬ－２ＷＴ－ＦＣおよびＩＬ－２３Ｘ－ＦＣ融合タンパク質を発現するために、ＩＬ－２ＷＴ、ＩＬ－２３Ｘ遺伝子配列を２つのＧＧＧＧＳを介してＦｃＬＡＬＡに連結するとともに、ｐＣＤＮＡ３．１に構築した。本実施例およびその後の実施例で使用されるＦｃは、変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１のＦｃ（ＦｃＬＡＬＡと略称、配列番号７）を指す。

【0188】

ＩＬ－２およびＦＣ融合タンパク質の発現および精製

【0189】

化学トランスフェクション法によって上記融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した。化学トランスフェクション試薬ＰＥＩを使用して、製造業者によって提供されたプロトコルに従って培養されたＨＥＫ２９３細胞を一過性トランスフェクションした。まず超クリーンベンチでプラスミドＤＮＡとトランスフェクション試薬を準備し、３ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製品番号：３１９８５－０７０）を５０ｍＬの遠心管に入れ、対応するプラスミドのＤＮＡを３０μｇ加え、プラスミドを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を０．２２μｍのフィルターヘッドで濾過し、続いて９０μｇのＰＥＩ（１ｇ／Ｌ）を加え、２０ｍｉｎ静置した。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を２７ｍＬのＨＥＫ２９３細胞に緩やかに注入して均一に混合し、３７℃、８％のＣＯ２の条件下で２０ｈ培養した後、最終濃度が２ｍＭおよび２％（ｖ／ｖ）のＦｅｅｄになるまでＶＰＡを追加し、引き続き６日間培養した。

【0190】

細胞培養後、１３０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、プレ充填カラムＨｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅを用いて上清を精製した。操作は以下のとおりである。精製前に５倍カラム体積の平衡液（２０ｍＭのＴｒｉｓ，１５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で充填カラムを平衡化し、収集した上清をカラムに通し、さらに１０倍カラム体積の平衡液で充填カラムを洗浄し、非特異的に結合するタンパク質を除去し、５倍カラム体積の溶出緩衝液（１Ｍのｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ３．５）で充填剤をすすぎ、溶出液を収集し、溶出液１ｍＬあたり８０μＬのＴｒｉｓ（２ＭのＴｒｉｓ）を加え、限外濾過濃縮管を用いてＰＢＳ緩衝液に交換し、濃度を測定した。１００μｇの精製後のタンパク質を濃度が１ｍｇ／ｍＬになるまで調整し、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムでＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質の純度を測定した。結果は表２に示される。図４は、表２にリストされた本発明のＩＬ－２変異体の配列を示す。

【0191】

【表8】

【0192】

ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣとその受容体との親和性測定

【0193】

バイオレイヤー干渉（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）測定法を使用して本発明のＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣとその受容体の平衡解離定数（ＫＤ）を測定した。

【0194】

ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は従来の方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ，２０１３．５（２）：ｐ．２７０－８）に従って行われた。簡単に言えば、候補ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣのＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβのそれぞれとの親和性を次のように測定した。センサを分析緩衝液でオフラインで２０ｍｉｎ平衡化し、次にオンラインで１２０秒検出してベースラインを確立した。ヒトビオチン化標識されたＩＬ－２ＲαまたはＩＬ－２ＲβをＳＡセンサ（ＰＡＬＬ，１８－５０１９）にロードしてＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定を行った。プラトー段階になるまで、ＩＬ－２Ｒα－ＢｉｏｔｉｎまたはＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎをロードしたセンサを、１００ｎＭのＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣを含む溶液に配置した後、結合と解離の速度を測定するために、センサを分析緩衝液に移して少なくとも２ｍｉｎ解離した。１：１結合モデルを利用して動力学的分析を行った。

【0195】

上記の測定法で行われった実験において、ＨＥＫ２９３－Ｆで発現されたＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣとその受容体との親和性ＫＤ値は表３に示される。対照として、同じ方法で測定されたＩＬ－２ＷＴ－ＦＣおよびＩＬ－２３Ｘ－ＦＣ融合タンパク質の親和性ＫＤ値も表３に示される。

【0196】

【表9】

【0197】

親和性データから分かるように、ＩＢＹＤＬ０２９ライブラリーから得られた上記変異体は、いずれもＩＬ－２Ｒαへの結合を遮断すると同時に、ＩＬ－２Ｒβへの結合を維持する。

【0198】

実施例３：ＩＬ－２キメラおよび切断変異体の構築、スクリーニングおよび同定

【0199】

ＩＬ－２ Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ体と切断体の設計

【0200】

Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐ：ＩＬ－２のＢ ｈｅｌｉｘとＣ ｈｅｌｉｘとの連結配列（図２Ａ）であり、Ａ７３－Ｒ８３の合計１１個のアミノ酸を含む。

【0201】

ＩＬ－２モノマー（ＰＤＢ：１Ｍ４７）と複合物の結晶構造（ＰＤＢ：２ＥＲＪ）を比較したところ、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐが溶液中で非常に活発であり、比較的安定したコンフォメーションを形成できないため、ＩＬ－２モノマーの結晶構造でＢ’Ｃ’ｌｏｏｐが欠失していることが見出された。

【0202】

Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐを遺伝子操作することによって、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐの安定性を向上させ、ＩＬ－２の安定性およびＩＬ－２Ｒβとの親和性を向上させる。したがって、ヒトＩＬ１５結晶構造（ＰＤＢ：２Ｚ３Ｑ）をアラインメントし、そのＢ’Ｃ’ｌｏｏｐが短くて安定であることを見出した（図２Ｂ）。したがって、１つのＩＬ－２キメラ分子（Ｌ０１７）と４つの切断分子（Ｌ０５７～Ｌ０６０）を設計した（表４に示す）。

【0203】

【表10】

【0204】

発現プラスミドの構築

【0205】

野生型ＩＬ－２（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８，ａａ２１－１５３，Ｃ１２５Ｓ，ＩＬ－２ＷＴと略称）、およびＩＬ－２変異体ＩＬ－２３Ｘ（Ｒ３８Ｄ、Ｋ４３Ｅ、Ｅ６１Ｒ）、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ体および切断体を、ＧＳＧＳ連結配列を介してヒトＩｇＧ１のＦｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ，ＦｃＬＡＬＡと略称され、配列番号７）に連結するとともに、ｐＴＴ５のベクターに構築し、以下のタンパク質を発現した：

【0206】

【表11】

【0207】

Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ体（Ｙ０１７）または切断体（Ｙ０５７）をライブラリーからスクリーニングして得られた変異体Ｙ３０Ｅ１（Ｋ３５Ｅ、Ｔ３７Ｅ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ）と組み合わせて、２つのＧＧＧＧＳを介してＦｃＬＡＬＡに連結するとともに、ｐＣＤＮＡ３．１のベクターに構築し、以下のタンパク質を発現した。ここで、Ｙ０９２は、キメラＢ’Ｃ’ｌｏｏｐループ配列ＡＧＤＡＳＩＨを有し、Ｙ０１７の７１－７３位のアミノ酸残基ＮＬＳによって引き起こされた潜在的なＮ糖修飾を除去した。Ｙ０９３とＹ０９４は、Ｂ’Ｃ’ループ切断体のＴ細胞活性化の活性を向上させるために、Ｙ０８９をもとに切断されたループ配列にアミノ酸置換Ｋ７６ＡまたはＫ７６Ｄをさらに導入した。Ｙ１４４は、ＩＬ２のＮ末端のＯ糖修飾を除去するために、Ｙ０９２をもとにＴ３Ａを増加した。

【0208】

【表12】

【0209】

なお、ＩＬ－２ＷＴおよびＩＬ－２３Ｘを２つのＧＧＧＧＳを介してＦｃＬＡＬＡに連結するとともに、ｐＣＤＮＡ３．１のベクターに構築し、以下のタンパク質を発現した。

【0210】

【表13】

【0211】

上記タンパク質分子の具体的な配列情報は配列表に示す。

【0212】

ＩＬ－２融合タンパク質の発現および精製

【0213】

上記タンパク質分子は、それぞれ２９３細胞とＣＨＯ細胞で発現された。ＨＥＫ２９３細胞での発現は、ＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質の発現に用いられる実施例２の方法に従って行われた。ＣＨＯ細胞での発現は、以下のように行われた。

【0214】

必要な細胞体積に応じて、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を継代し、トランスフェクションの前日に細胞密度を３．５×１０６個の細胞／ｍＬに調整した。トランスフェクションの当日に細胞密度（約８～１０×１０６個の細胞／ｍＬ）を検出し、生存率は９５％以上に達した。ＥｘｐｉＣＨＯ^TM Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ製品番号：Ａ２９１００－０１）で細胞密度を６×１０６個の細胞／ｍＬに調整した。最終体積の８％（ｖ／ｖ）のＯｐｔｉＰＲＯＴＭ ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ製品番号：１２３０９－０１９）をトランスフェクション緩衝液として、対応する量（０．８μｇ／ｍＬ細胞）のプラスミドを加え、均一に混合し、０．２２μｍの濾過膜で濾過して除菌し、３．２μＬ／ｍＬの細胞比でＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ，製品番号：Ａ２９１３０）におけるｒｅａｇｅｎｔを加えた。トランスフェクション試薬とプラスミドＤＮＡによって形成された複合物を室温で１～５ｍｉｎインキュベートした後、細胞に徐々に加え、３７℃、８％のＣＯ２の条件下で１８ｈ培養した後、０．６％（ｖ／ｖ）のＥｎｈａｎｃｅｒおよび３０％（ｖ／ｖ）のＦｅｅｄを加え、引き続き６日間培養した。

【0215】

細胞を培養した後、細胞培養液を１３０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、プレ充填カラムＨｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ，１１－００３４－９５）で上清を精製した。操作は以下のとおりである。精製前に５倍カラム体積の平衡液（２０ｍＭのＴｒｉｓ，１５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で充填カラムを平衡化し、収集した上清をカラムに通し、さらに１０倍カラム体積の平衡液で充填カラムを洗浄し、非特異的に結合するタンパク質を除去し、５倍カラム体積の溶出緩衝液（１００ｍＭのｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ ３．５）で充填剤をすすぎ、溶出液を収集した。溶出液１ｍＬあたり８０μＬのＴｒｉｓ（２ＭのＴｒｉｓ）を加え、限外濾過濃縮管（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、製品番号：ＵＦＣ９０１０９６）を用いてＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、製品番号：７００１１－０４４）に交換し、濃度を測定した。１００μｇの精製後のタンパク質を濃度が１ｍｇ／ｍＬになるまで調整し、ゲル濾過クロマトグラフィーカラムＳＷ３０００（ＴＯＳＯＨ製品番号：１８６７５）でタンパク質の純度を測定した。

【0216】

Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ体（Ｙ０１７）および切断体（Ｙ０５７／０５８／０５９）の融合タンパク質は、野生型ＩＬ－２の融合タンパク質（Ｙ００１）と比較して、ＨＥＫ２９３細胞での発現量およびワンステップアフィニティークロマトグラフィー純度がすべて有意に向上した。結果は下記の表５に示される。

【0217】

【表14】

【0218】

Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ体（Ｙ０９２／１４４）、切断体（Ｙ０８９／０９３／０９４）およびさらなる変異Ｙ３０Ｅ１を含む融合タンパク質は、野生型ＩＬ－２の融合タンパク質（Ｙ０４５）と比較して、ＣＨＯ細胞での発現量およびワンステップアフィニティークロマトグラフィー純度も有意に向上した。結果は下記の表６に示される。

【0219】

【表15】

【0220】

ＩＬ－２変異体Ｆｃ融合タンパク質とその受容体との親和性測定

【0221】

実施例２で記載されるＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定方法に従って、以下の変異タンパク質の親和性ＫＤ値を測定した。結果は下記の表７に示される。

【0222】

【表16】

【0223】

上記データをまとめて分かるように、１）酵母ライブラリーからスクリーニングされたＹ３０Ｅ１などの点変異分子は、ＩＬ－２Ｒαへの結合を遮断することができる。２）Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ分子と切断分子は、分子の発現量と純度を増加させるだけでなく、分子とＩＬ－２Ｒβとの親和性をさらに増加させた。３）Ｙ３０Ｅ１とＢ’Ｃ’ｌｏｏｐ変異体との組み合わせ分子は、ＩＬ－２Ｒαを遮断するとともに、分子の発現量と純度を増加させ、同時にＩＬ－２Ｒβとの結合活性を向上させた。

【0224】

実施例４：ＩＬ－２変異体のインビトロ機能実験

【0225】

ＩＬ－２ＷＴのＩＬ－２Ｒαとの親和性はＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγより高く、細胞表面のＩＬ－２Ｒαに優先的に結合し、ＩＬ－２Ｒβγを動員し、ＩＬ－２Ｒβγを介して下流ｐ－ＳＴＡＴ５シグナルを放出し、Ｔ細胞とＮＫ細胞の増殖を刺激する。Ｔｒｅｇ細胞表面にＩＬ－２Ｒαがあり、エフェクターＴ細胞とＮＫ細胞表面にＩＬ－２Ｒαがないため、正常な場合にＩＬ－２ＷＴはＴｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激し、免疫応答をダウンレギュレートさせる。ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔはＩＬ－２Ｒαに結合せず、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激する選好を解消し、同時にＴ細胞とＮＫ細胞の増殖を刺激し、エフェクターＴ細胞とＮＫ細胞の数を効果的に増加させ、抗腫瘍効果を高める。

【0226】

本実施例は各ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣによる初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５シグナルの活性化を検出することにより、各変異体のＣＤ２５＋細胞に対する活性化偏向性の除去を検証し、ＣＤ２５－細胞に対する活性化作用が強い変異体をスクリーニングした。具体的なステップは以下のとおりである：

【0227】

１． ＰＢＭＣ細胞の蘇生：

【0228】

ａ） 液体窒素からＰＢＭＣ細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ製品番号：ＰＢ００５Ｆ，１００Ｍ装）を取り出し、３７℃の水浴釜中にすばやく入れ、ＰＢＭＣ細胞を蘇生させた。

【0229】

ｂ） 細胞を予熱した５％のヒトＡＢ血清（ＧｅｍＣｅｌｌ製品番号：１００－５１２）と１‰のＤＮＡ酵素（ＳＴＲＭＣＥＬＬ製品番号：０７９００）を含む１０ｍＬのＸ－ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ製品番号：０４－４１８Ｑ）培地に加え、４００Ｇ、２５℃で１０ｍｉｎ遠心分離して（その後の遠心分離はいずれもこの条件）１回洗浄した。

【0230】

ｃ） ２０ｍＬの培地を加えて細胞を再懸濁し、３７℃の二酸化炭素インキュベーターに入れて静置して一晩培養した。

【0231】

２． ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の精製：

【0232】

ａ） ステップ１の懸濁細胞液を吸引し、遠心分離して上清を捨てた。

【0233】

ｂ） １ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ 製品番号：２０１０４）と１００μＬのヒトＡＢ血清および１００μＬのヒトＣＤ８＋Ｔ細胞精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 製品番号：１１３４８Ｄ）に加えて抗体混合液を陰性スクリーニングして細胞を再懸濁した。

【0234】

ｃ） 均一に混合した後、４℃で２０ｍｉｎインキュベートし、５ｍｉｎごとに１回振とうした。

【0235】

ｄ） インキュベートした後、１０ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加え、遠心分離して２回洗浄した。

【0236】

ｅ） 同時に、１ｍＬの磁性微小球（ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞精製キット）に７ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加えて磁気スタンドに１ｍｉｎ置いて上清を捨て、磁性微小球を予備洗浄した。

【0237】

ｆ） それぞれ１ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加えてそれぞれ微小球と細胞を再懸濁し、均一に混合した後に室温で３０ｍｉｎ回転インキュベートした。

【0238】

ｇ） インキュベートした後、６ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加え、磁気スタンドに１ｍｉｎ置き、上清を収集した。

【0239】

ｈ） 収集液を再び磁気スタンドに１ｍｉｎ置き、上清を収集した。

【0240】

ｉ） 遠心分離して上清を捨て、予熱したＴ培地で再懸濁し、密度を１×１０６／ｍＬに調整した。

【0241】

ｊ） 細胞の１／３を採取して後に必要の場合にＣＤ２５発現を刺激し、残りの細胞を３７℃の二酸化炭素インキュベーターに入れて静置して一晩培養した。

【0242】

３． ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ２５を発現するように刺激した：

【0243】

ａ） ステップ２で精製したＣＤ８＋Ｔ細胞の１／３に抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８抗体の磁性微小球（ＧＩＢＣＯ製品番号：１１１３１Ｄ）を加え、細胞と微小球の割合は３：１であった。

【0244】

ｂ） ３７℃の二酸化炭素インキュベーターに入れて３日間静置した。

【0245】

ｃ） １０ｍＬの培地を加えて２回洗浄した。

【0246】

ｄ） 培地を加え、細胞密度が１×１０６／ｍＬになるまで調整し、３７℃の二酸化炭素インキュベーターに入れて静置して２日間培養した。

【0247】

４． 細胞の純度と発現レベルの検出：

【0248】

ａ） 抗ヒトＣＤ８－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品番号：１２－００８６－４２）、抗ヒトＣＤ２５－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製品番号：１２－０２５９－４２）、アイソタイプ対照抗体（ＢＤ製品番号：５５６６５３）を用いて細胞のＣＤ８とＣＤ２５を検出した。

【0249】

ｂ） ステップ２における細胞はＣＤ８＋ＣＤ２５－Ｔ細胞であり、ステップ３における細胞はＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞であった。

【0250】

５． 各ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣによるＣＤ８＋ＣＤ２５－Ｔ細胞に対するｐ－ＳＴＡＴ５シグナル活性化のＥＣ５０の検出：

【0251】

ａ） ＣＤ８＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を１ウェルあたり１×１０５細胞で９６ウェルＵ底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ製品番号：ＣＬＳ３７９９－５０ＥＡ）に敷いた。

【0252】

ｂ） １００μＬの各ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ、市販ＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ製品番号：２０２－ＩＬ－５００）、ＩＬ－２ＷＴ－ＦＣ、ＩＬ－２３Ｘ－ＦＣを加え、最高濃度は２６６．７ｎＭから始めて４倍勾配希釈し、合計１２個の勾配であり、３７℃のインキュベーターで２０ｍｉｎインキュベートした。

【0253】

ｃ） ４．２％のホルムアルデヒド溶液を５５．５μＬ加え、室温で１０ｍｉｎ固定した。

【0254】

ｄ） 遠心分離して上清を捨て、２００μＬの氷メタノール（Ｆｉｓｈｅｒ製品番号：Ａ４５２－４）を加えて細胞を再懸濁し、４℃の冷蔵庫で３０ｍｉｎインキュベートした。

【0255】

ｅ） 上清を遠心分離し、２００μＬの染色緩衝液（ＢＤ製品番号：５５４６５７）で３回洗浄した。

【0256】

ｆ） 抗ｐ－ＳＴＡＴ５－ＡｌｅｘＦｌｏｕｒ６４７（ＢＤ製品番号：５６２０７６、１：２００希釈）を含む透過処理／固定用緩衝液（ＢＤ製品番号：５１－２０９１ＫＺ）を２００μＬ加え、室温で遮光で３ｈインキュベートした。

【0257】

ｇ） 染色緩衝液で３回洗浄し、１００μＬの染色緩衝液で細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー検出を行った。

【0258】

ｈ） ＩＬ－２分子の濃度を横軸として、ＡｌｅｘＦｌｏｕｒ６４７中間蛍光値を縦軸として、ｐ－ＳＴＡＴ５シグナルのＥＣ５０値を作成し、結果は図５Ａおよび表８に示される。

【0259】

６． 各ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣによるＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞に対するｐ－ＳＴＡＴ５シグナル活性化のＥＣ５０の検出：

【0260】

ａ） ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を１ウェルあたり１×１０５細胞で９６ウェルＵ底培養プレートに敷いた。

【0261】

ｂ） ステップ５におけるｂ－ｈと同様にして、ｐ－ＳＴＡＴ５シグナルのＥＣ５０値を作成し、結果は図５Ｂおよび表８に示される。

【0262】

【表17】

【0263】

実験結果から明らかなように、１）Ｙ３０Ｅ１のＢ’Ｃ’ｌｏｏｐ変異体Ｙ０８９、Ｙ０９２、Ｙ０９３およびＹ０９４は、ＣＤ２５－ＣＤ８＋Ｔ細胞においてｐ－ＳＴＡＴ５シグナルを活性化するＥＣ５０がいずれもＹ３０Ｅ１より低く、最適化されたＢ’Ｃ’ｌｏｏｐは、ＣＤ２５－ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する分子の活性化を向上させることができることが示され、これはＩＬ－２Ｒβ親和性データと一致する。２）ＣＤ２５－ ＥＣ５０／ＣＤ２５＋ ＥＣ５０倍数の結果から、Ｙ０４５（ＩＬ－２ＷＴ－Ｆｃ）と比較して、変異タンパク質Ｙ３０Ｅ１、Ｙ０８９、Ｙ０９２、Ｙ０９３およびＹ０９４は、ＣＤ２５＋細胞の活性化への偏向性を有意に低減し、Ｙ３０Ｅ１変異がＣＤ２５への結合を安全に遮断することが示される。

【0264】

実施例５：ＩＬ－２変異体の安定性

【0265】

Ｙ０８９、Ｙ０９２およびＹ０９４をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４，Ｇｉｂｃｏ，製品番号：１００１０－０２３）またはヒスチジン緩衝液（１０ｍＭのヒスチジン，５％のソルビトール，０．０２％のポリソルベート８０，塩酸でｐＨ６．５に調整）に保存し、４０℃の恒温インキュベーター（志誠ＳＨＰ－１５０）にそれぞれ７日間と１４日間保存した安定性を評価した。検出指標は、それぞれＳＥＣ－ＨＰＬＣとＣＥ－ＳＤＳによって測定されたＩＬ－２変異タンパク質の純度であった。

【0266】

【表18】

【0267】

【表19】

【0268】

結果により、Ｙ０８９、Ｙ０９２およびＹ０９４はＰＢＳ緩衝液およびヒスチジン緩衝液で１４日間放置した後、いずれも優れた安定性が示された。

【0269】

実施例６：ＩＬ－２変異分子のインビボ抗腫瘍効果

【0270】

ＩＬ－２変異分子のインビボでの有効性を証明するために、ＣＴ２６細胞（マウス結腸がん細胞系，ＡＴＣＣ）を使用してＢａｌｂ／ｃマウスに接種し、本発明のＩＬ－２変異分子（Ｙ０９２）の抗腫瘍効果を測定した。実験にはＳＰＦグレードの雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（１８～２０ｇ，浙江維通利華実験動物技術有限公司から購入）を使用し、合格証明書の番号はＮＯ．１８１１２３００１１であった。

【0271】

ＣＴ２６細胞を定期的に継代培養してその後のインビボ実験に使用した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳ（１×）でＣＴ２６細胞を分散させ、細胞濃度が２．５×１０６個の細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。０日目に０．２ｍＬの細胞懸濁液をＢａｌｂ／ｃマウスの右腹部に皮下接種してＣＴ２６担がんマウスモデルを確立した。

【0272】

腫瘍細胞接種の７日後に、各マウスの腫瘍体積を検出し、群分けを行い（１群あたり６匹のマウス）、投与量および投与方式は表１０に示される。

【0273】

【表20】

【0274】

＊：ｈ－ＩｇＧはアイソタイプ対照抗体であり、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏから購入し、ロット番号は１６１２０６－０６５６であった。

【0275】

ｈ－ＩｇＧとＹ０９２の使用濃度は、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬと６．４ｍｇ／ｍＬであり、７日ごとに、合計２回投与された（Ｑ７Ｄ×２）。ＣＴ２６細胞接種後の７日目、１４日目にそれぞれ投与し、図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに示すように、マウスの腫瘍体積と体重を週に２～３回モニタリングし、２１日後にモニタリングを終了した。接種後の２１日目に、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を計算した。計算式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）であった。腫瘍体積の測定：ノギスを用いて腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は下記式：Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２に従って計算された。電子天びんを用いて体重を測定した。

【0276】

腫瘍抑制率の結果は表１１に示される。接種後の２１日目に、ｈ－ＩｇＧと比較して、Ｙ０９２、０．００４ｍｇ／ｋｇ、Ｙ０９２、０．０２ｍｇ／ｋｇ、Ｙ０９２、０．１ｍｇ／ｋｇ、Ｙ０９２、０．５ｍｇ／ｋｇの単剤抑制率は、それぞれ３．７％、１６．２％、４３．８％、５３．５％であった。結果から、改善後のＩＬ２分子（Ｙ０９２）は抗腫瘍作用を有し、且つ用量効果を有することが示された。同時に、マウス体重の検出結果（図６Ｂ～６Ｃ）から、接種開始から２１日まで、高用量群（Ｙ０９２，０．５ｍｇ／ｋｇ）で１０％を超えた体重降下があり、他の群のマウスの体重降下は、５％を超えなかったことが示された。各投与群のマウスはすべて、死亡しなかった。

【0277】

【表21】

【0278】

実施例７：ＩＬ－２変異体分子のインビボ抗腫瘍効果

【0279】

さらに、分子Ｙ０９２を変異させ（Ｔ３Ａ）、その分子のグリコシル化を減らした。ＩＬ－２変異分子のインビボでの有効性を証明するために、ＭＣ３８細胞（マウス結腸がん細胞系，ＡＴＣＣ）を使用してＣ５７マウスに接種し、本発明のＩＬ－２変異分子（Ｙ１４４）の抗腫瘍効果を測定した。実験にはＳＰＦグレードの雌Ｃ５７マウス（１５～１８ｇ、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）を使用し、合格証明書の番号はＮＯ．１１００１１１９１１０７０４９７であった。

【0280】

ＭＣ３８細胞を定期的に継代培養してその後のインビボ実験に使用した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳ（１×）でＭＣ３８細胞を再懸濁し、細胞濃度が５×１０６個の細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。０日目に０．２ｍＬの細胞懸濁液をＣ５７マウスの右腹部に皮下接種してＭＣ３８担がんマウスモデルを確立した。

【0281】

腫瘍細胞接種の７日後、各マウスの腫瘍体積を検出し、群分けを行い（１群あたり６匹のマウス）。投与量および投与方式は表１２に示される。

【0282】

【表22】

【0283】

＊：ｈ－ＩｇＧはアイソタイプ対照抗体であり、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏから購入し、ロット番号は１６１２０６－０６５６であった。

【0284】

ｈ－ＩｇＧとＹ１４４の使用濃度は、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬと０．５ｍｇ／ｍＬであり、７日ごとに、合計３回投与された（Ｑ７Ｄ×３）。ＭＣ３８細胞接種後の７日目、１４日目、２１日目にそれぞれ投与し、図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃに示すように、マウスの腫瘍体積と体重を週に２回モニタリングし、２４日後にモニタリングを終了した。接種後の２４日目に、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を計算した。計算式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）であった。腫瘍体積の測定：ノギスを用いて腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は下記式：Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２に従って計算された。電子天びんを用いて体重を測定した。

【0285】

腫瘍抑制率の結果は表１３に示される。接種後の２４日目に、ｈ－ＩｇＧ、１ｍｇ／ｋｇ群と比較して、Ｙ１４４の単剤抑制率は３０．０５％であった。同時に、マウス体重の検出結果（図７Ｃ）から、接種後の２４日目に、マウスの体重は有意差がないことが示された。

【0286】

配列表の説明

【0287】

【表23-1】

【表23-2】

【表23-3】

【表23-4】

【表23-5】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9】

【配列表】

2023518443000001.app

【国際調査報告】