(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-01
(54)【発明の名称】ＸＩＸ型コラーゲンのアッセイ
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20230424BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230424BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20230424BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20230424BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18
G01N33/53 D ZNA
G01N33/574 A
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022557131
(86)(22)【出願日】2021-03-22
(85)【翻訳文提出日】2022-09-21
(86)【国際出願番号】 EP2021057319
(87)【国際公開番号】W WO2021191167
(87)【国際公開日】2021-09-30
(31)【優先権主張番号】2004195.0
(32)【優先日】2020-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】503259129
【氏名又は名称】ノルディック・ビオサイエンス・エー／エス
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＲＤＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ Ａ／Ｓ
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ウィルムセン，ニコラス
(72)【発明者】
【氏名】トルラチウス‐ウッシング，イェッペ
【テーマコード（参考）】
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA13
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ＸＩＸ型コラーゲンを標的とするモノクローナル抗体、ならびに前記抗体を用いるイムノアッセイおよびキットに関する。本発明のアッセイは、がんの診断およびモニタリングに用いることができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有するペプチドを特異的に認識し、これと結合するモノクローナル抗体。
【請求項2】
Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有する合成ペプチドに対して生起させたモノクローナル抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項3】
Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮＸ（配列番号２）を有するペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体であって、Ｘがいずれかのアミノ酸を表すモノクローナル抗体。
【請求項4】
Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮＡ（配列番号３）を有するペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない、請求項１から３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項5】
Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧ 配列番号４）を有するペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項6】
Ｃ末端アミノ酸配列ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ（配列番号５）を有するペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない、請求項１から５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項7】
ヒト生体流体試料中のＸＩＸ型コラーゲンを検出するイムノアッセイの方法であって、ヒト生体流体試料を、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有するペプチドを特異的に認識してこれと結合するモノクローナル抗体と接触させることと、前記モノクローナル抗体と前記試料中のペプチドとの間の結合を検出することと、を含む方法。
【請求項8】
検出が定量的である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記イムノアッセイが競合イムノアッセイである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項10】
前記モノクローナル抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有する合成ペプチドに対して生起されたモノクローナル抗体である、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮＸ（配列番号２）を有するペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法であって、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す方法。
【請求項12】
前記抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮＡ（配列番号３）を有するペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧ（配列番号４）を有するペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない、請求項７から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ（配列番号５）を有するペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない、請求項７から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ヒト生体流体試料が、がんを示す医学的徴候または症状を有するヒト患者からのものである、請求項７～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
患者におけるがんの可能性を診断する、および／またはモニタリングする、および／または評価するイムノアッセイ法であって、前記患者から得られた生体流体試料をモノクローナル抗体と接触させることと、前記モノクローナル抗体と前記試料中のペプチドとの間の結合量を検出および決定することと、前記結合量を、通常の健康な被験者に関連する値、および／または既知の疾患重症度に関連する値、および／または以前の時点で前記患者から得た値と相関させることと、を含む、請求項７から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記がんが、乳房、肺、結腸、頭頸部、腎臓、肝臓、膵臓、前立腺、胃、メラノーマ、膀胱、または卵巣のがんである、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項18】
Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有するペプチドを特異的に認識しこれと特異的に結合するモノクローナル抗体と：－ストレプトアビジンコーティングされたウェルプレート；
－Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有するＮ末端ビオチン化ペプチド；および
－Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有する較正用ペプチド
のうちの少なくとも一つと、
を含む、アッセイキット。
【請求項19】
前記モノクローナル抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有する合成ペプチドに対して生起されたモノクローナル抗体である、請求項１８に記載のアッセイキット。
【請求項20】
前記抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮＸ（配列番号２）を有するペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない、請求項２１または請求項２２に記載のアッセイキットであって、Ｘがいずれかのアミノ酸を表すアッセイキット。
【請求項21】
前記抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮＡ（配列番号３）を有するペプチドを特異的には認識しない、請求項１８から２０のいずれか１項に記載のアッセイキット。
【請求項22】
前記抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧ（配列番号４）を有するペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない、請求項１８から２１のいずれか一項に記載のアッセイキット。
【請求項23】
前記抗体が、Ｃ末端アミノ酸配列ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ（配列番号５）を有するペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない、請求項１８から２２のいずれか一項に記載のアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＸＩＸ型コラーゲンを標的とするモノクローナル抗体、ならびに前記抗体を用いるイムノアッセイおよびキットに関する。
【背景技術】
【0002】
緒言
ＸＩＸ型コラーゲンは、基底膜に関連するコラーゲンであり、その特性評価は進んでいない。このコラーゲンは、乳がんの進行時に制御変化を示し、ＮＣ１（ＸＩＸ）ドメインが抗腫瘍性のシグナル伝達特性を示している。しかし、がんにおけるＸＩＸ型コラーゲンのバイオマーカーとしての可能性については、ほとんど知られていない。
ＸＩＸ型コラーゲンは、基底膜に関連するコラーゲンであり、その特性評価は進んでいない。このコラーゲンは、乳がんの進行時に制御変化を示し、ＮＣ１（ＸＩＸ）ドメインが抗腫瘍性のシグナル伝達特性を示している。しかし、がんにおけるＸＩＸ型コラーゲンのバイオマーカーとしての可能性については、ほとんど知られていない。
【0003】
肺がんは、最も多く診断されるがんであり、がんによる死亡の主要原因である（非特許文献１)。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は、肺がんの症例全体の約８５％を占め、腺がん（ＡＣ）および扁平上皮がん（ＳＣＣ）が最も一般的なサブタイプである（非特許文献２，３）。肺がんの症例の多くは末期に診断されるため、全５年生存率が１９％という深刻な結果になっている（非特許文献４）。しかし、ほとんどの患者が外科的切除の恩恵を受けることができる限局期に診断される患者の場合には、５年生存率は５６％である（非特許文献２，４）。したがって、早期発見が、肺がん患者の生存率を向上させる主要な方法の一つである。
【0004】
腫瘍微小環境は、がんの進行を規定する従来の特徴と複雑に関連している（非特許文献５）。腫瘍微小環境の主要な構成要素の一つは、組織の非細胞部分である細胞外マトリクス（ＥＣＭ）であり、実際上これらすべての特徴に影響を与える（非特許文献６）。ＥＣＭ中の最も主要なタンパク質はコラーゲンであり、異なる２８種類が存在する（非特許文献７）。ＸＩＸ型コラーゲンは、３本のα１（ＸＩＸ）鎖が４００ｋＤａのホモトリマーを形成しているマイナーコラーゲンである。各鎖は、五つのコラーゲン性三重らせんドメインと六つの非コラーゲン性ドメインを含んでいる。ＸＩＸ型コラーゲンはその一次配列に基づいて、線維性コラーゲンと他のＥＣＭ構成成分との相互作用を仲介する、断続性三重らせんを有する線維付随性コラーゲン（Ｆｉｂｒｉｌ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｗｉｔｈ Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ Ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｃｅｓ）のファミリーに属している（非特許文献８～１０）。
【0005】
ＸＩＸ型コラーゲンの発現は、発達期のマウスで広く見られるが、成体ではより制限され、そのほとんどが脳組織に蓄積している（非特許文献１１）。成人では、脳、骨格筋、脾臓、前立腺、腎臓、肝臓、胎盤、結腸、皮膚、乳房組織での発現が見出されている（非特許文献１２，１３）。ＸＩＸ型コラーゲンの機能は完全には理解されていないが、発達上の役割を担っていることは実際明らかであると思われる。ＸＩＸ型コラーゲンは、胚性筋の分化や食道の発達に関与している（非特許文献１０，１４，１５）。ＸＩＸ型コラーゲンはまた、海馬におけるシナプスの形成や脊髄神経細胞における軸索の形成にも関与している（非特許文献１６，１７）。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者の筋肉におけるＸＩＸ型コラーゲンの過剰発現も述べられており、予後の悪化と関連している（非特許文献１８，１９）。
【0006】
全体として、ＸＩＸ型コラーゲンタンパク質の組織限局は、ほとんどが血管、神経、筋肉、およびいくつかの上皮の基底膜領域（ＢＭＺ）と関連している（非特許文献１２）。興味深いことに、乳癌の上皮ＢＭＺにおけるＸＩＸ型コラーゲンのタンパク質染色は、限局性管状癌では部分的に失われ、浸潤癌では全く存在していない。この消失は、ＩＶ型コラーゲンやラミニンの消失よりも早く起こることから、ＸＩＸ型コラーゲンレベルの減少は、前浸潤性腫瘍におけるＢＭＺリモデリングの早期の結果であることが示唆されている（非特許文献１３）。
【0007】
ＩＶ型、ＸＶ型、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＮＣ１ドメインからのマトリカインの放出と同様に、ＸＩＸ型コラーゲンのＣ末端ＮＣ１ドメインは、切断され放出される可能性がある。結果として生じるペプチドは、メラノーマの増殖と血管新生をインビボで抑制し、浸潤をインビトロで抑制することができる（非特許文献２０）。ＮＣ１ドメインは、プラスミンプロテアーゼによって切断され、αｖβ３インテグリンと相互作用してＦＡＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を阻害するとともに、ＧＳＫ３βリン酸化を阻害する（非特許文献２１，２２）。興味深いことに、ＮＣ１ドメインは、抑制性神経終末の形成を誘発させるものの、その際、異なるインテグリン受容体であるα５β１と相互作用する（非特許文献２３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｂｒａｙ， Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｇｌｏｂａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２０１８： ＧＬＯＢＯＣＡＮ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｆ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｆｏｒ ３６ ｃａｎｃｅｒｓ ｉｎ １８５ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ． ＣＡ． Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． Ｃｌｉｎ． ６８， ３９４－４２４ （２０１８）．
【非特許文献2】Ｍｏｌｉｎａ， Ｊ． Ｒ．， Ｙａｎｇ， Ｐ．， Ｃａｓｓｉｖｉ， Ｓ． Ｄ．， Ｓｃｈｉｌｄ， Ｓ． Ｅ． ＆ Ａｄｊｅｉ， Ａ． Ａ． Ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ： ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ， ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ， ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖｏｒｓｈｉｐ． Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ． Ｐｒｏｃ． ８３， ５８４－９４ （２００８）．
【非特許文献3】Ｈｅｒｂｓｔ， Ｒ． Ｓ．， Ｍｏｒｇｅｎｓｚｔｅｒｎ， Ｄ． ＆ Ｂｏｓｈｏｆｆ， Ｃ． Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ ５５３， ４４６－４５４ （２０１８）．
【非特許文献4】Ｓｉｅｇｅｌ， Ｒ． Ｌ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｋ． Ｄ． ＆ Ｊｅｍａｌ， Ａ． Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ， ２０１９． ＣＡ． Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． Ｃｌｉｎ． ６９， ７－３４ （２０１９）．
【非特許文献5】Ｈａｎａｈａｎ， Ｄ． ＆ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， Ｒ． Ａ． Ｈａｌｌｍａｒｋｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ： Ｔｈｅ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ １４４， ６４６－６７４ （２０１１）．
【非特許文献6】Ｐｉｃｋｕｐ， Ｍ． Ｗ．， Ｍｏｕｗ， Ｊ． Ｋ． ＆ Ｗｅａｖｅｒ， Ｖ． Ｍ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｈａｌｌｍａｒｋｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ． ＥＭＢＯ Ｒｅｐ． １５， １２４３－１２５３ （２０１４）．
【非特許文献7】Ｒｉｃａｒｄ－Ｂｌｕｍ， Ｓ． Ｔｈｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆａｍｉｌｙ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． Ｂｉｏｌ． ３， ａ００４９７８ （２０１１）．
【非特許文献8】Ｙｏｓｈｉｏｋａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｓｙｎｔｅｎｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｌｏｃｉ ｆｏｒ ａ ｎｏｖｅｌ ＦＡＣＩＴ－ｌｉｋｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｌｏｃｕｓ （Ｄ６Ｓ２２８Ｅ） ａｎｄ α１（ＩＸ） ｃｏｌｌａｇｅｎ （ＣＯＬ９Ａ１） ｏｎ ６ｑ１２－ｑ１４ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３， ８８４-８８６ （１９９２）．
【非特許文献9】Ｉｎｏｇｕｃｈｉ， Ｋ．， Ｙｏｓｈｉｏｋａ， Ｈ．， Ｋｈａｌｅｄｕｚｚａｍａｎ， Ｍ． ＆ Ｎｉｎｏｍｉｙａ， Ｙ． Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｆｏｒ α１（ＸＩＸ） Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｃｈａｉｎ， ａ Ｎｅｗ Ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ＦＡＣＩＴｓ， Ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ Ｌｏｎｇ Ｕｎｕｓｕａｌ ３′ Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｙｓ Ｍａｎｙ Ｕｎｉｑｕｅ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔｓ１． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１７， １３７－１４６ （１９９５）．
【非特許文献10】Ｍｙｅｒｓ， Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｔｒｉｐｌｅ－ｈｅｌｉｃａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｙｐｅ ＸＩＸ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ ｓｕｂｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｌｉｍｉｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ａｌｐｈａ １（ＸＶＩ）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， １８５４９－５７ （１９９４）．
【非特許文献11】Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ， Ｈ．， Ｉｎｏｇｕｃｈｉ， Ｋ．， Ｋｈａｌｅｄｕｚｚａｍａｎ， Ｍ．， Ｎｉｎｏｍｉｙａ， Ｙ． ＆ Ｙｏｓｈｉｏｋａ， Ｈ． Ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ α１（ＸＩＸ） Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｇｅｎｅ （ Ｃｏｌ１９ａ１ ） ｄｕｒｉｎｇ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｂｅｃｏｍｅｓ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｔｏ ａ Ｆｅｗ Ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄｕｌｔ Ｏｒｇａｎｉｓｍ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， １７１０４－１７１１１ （１９９７）．
【非特許文献12】Ｍｙｅｒｓ， Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｙｐｅ ＸＩＸ ｄｅｆｉｎｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｚｏｎｅ ｃｏｌｌａｇｅｎｓ． Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５１， １７２９－４０ （１９９７）．
【非特許文献13】Ａｍｅｎｔａ， Ｐ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｌｏｓｓ ｏｆ ｔｙｐｅｓ ＸＶ ａｎｄ ＸＩＸ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｐｒｅｃｅｄｅｓ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｉｎ ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｍａｌｅ ｂｒｅａｓｔ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １９９， ２９８－３０８ （２００３）．
【非特許文献14】Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ， Ｈ．， Ｌａｕｂ， Ｆ．， Ｙｏｓｈｉｏｋａ， Ｈ． ＆ Ｒａｍｉｒｅｚ， Ｆ． Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ ＸＩＸ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｓ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｎｅｄ ｔｏ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ． Ｄｅｖ． Ｄｙｎ． ２２０， １５５－６２ （２００１）．
【非特許文献15】Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａ ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＩＸ－ｒｉｃｈ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｚｏｎｅ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １６６， ５９１-６００ （２００４）．
【非特許文献16】Ｓｕ， Ｊ．， Ｇｏｒｓｅ， Ｋ．， Ｒａｍｉｒｅｚ， Ｆ． ＆ Ｆｏｘ， Ｍ． Ａ． Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＩＸ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｓｙｎａｐｓｅｓ． Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ５１８， ２２９－２５３ （２０１０）．
【非特許文献17】Ｈｉｌａｒｉｏ， Ｊ． Ｄ．， Ｗａｎｇ， Ｃ． ＆ Ｂｅａｔｔｉｅ， Ｃ． Ｅ． Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＩＸａ１ ｉｓ ｃｒｕｃｉａｌ ｆｏｒ ｍｏｔｏｒ ａｘｏｎ ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ ａｔ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔａｒｇｅｔｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３７， ４２６１－４２６９ （２０１０）．
【非特許文献18】Ｓｈｔｉｌｂａｎｓ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ． Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒ． １２， ２５０－２５６ （２０１１）．
【非特許文献19】Ｃａｌｖｏ， Ａ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＩＸ Ａｌｐｈａ １ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ａｇｉｎｇ Ｄｉｓ． １０， ２７８－２９２ （２０１９）．
【非特許文献20】Ｒａｍｏｎｔ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＮＣ１ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｙｐｅ ＸＩＸ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｅｌａｎｏｍａ ｇｒｏｗｔｈ． Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ６， ５０６－５１４ （２００７）．
【非特許文献21】Ｏｕｄａｒｔ， Ｊ．－Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｓｍｉｎ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＮＣ１ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＩＸ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ６， （２０１５）．
【非特許文献22】Ｏｕｄａｒｔ， Ｊ．－Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ＮＣ１ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＩＸ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ＦＡＫ／ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｔｈｒｏｕｇｈ αｖβ３ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７， １５１６－２８ （２０１６）．
【非特許文献23】Ｓｕ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｔｒｉｃｒｙｐｔｉｎｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｎｅｒｖｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｎｅｏｃｏｒｔｅｘ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２１２， ７２１－７３６ （２０１６）．
【非特許文献24】Ｋｅｈｌｅｔ， Ｓ． Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＳＰＡＲＣ ｒｅｆｌｅｃｔｉｎｇ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｈｏｗｓ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ － ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＰＡＲＣ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． Ｔｈｅｒ． １９， ９０４－９１２ （２０１８）．
【非特許文献25】Ｍｙｅｒｓ， Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｔｙｐｅ ＸＩＸ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｓ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｈａｒｐ Ｋｉｎｋｓ Ｄｅｌｉｎｅａｔｉｎｇ Ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ Ｓｕｂｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｂｙ Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｖｉａ Ｇｌｏｂｕｌａｒ， Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ－ｌｉｎｋｅｄ， ａｎｄ Ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｍｉｎｏ Ｔｅｒｍｉｎｉ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８， ３２０４７－３２０５７ （２００３）．
【非特許文献26】Ｏｕｄａｒｔ， Ｊ． Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＩＸ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ， ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ， ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４３７， １１１－１１７ （２０１３）．
【非特許文献27】Ｍａａｔｔａ， Ｍ．， Ｖｉｒｔａｎｅｎ， Ｉ．， Ｂｕｒｇｅｓｏｎ， Ｒ． ＆ Ａｕｔｉｏ－Ｈａｒｍａｉｎｅｎ， Ｈ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｍｉｎｉｎ Ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｉｎ Ｓｏｍｅ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｔｕｍｏｒｓ： Ｔｈｅ α１ Ｃｈａｉｎ ｏｆ Ｌａｍｉｎｉｎ Ｓｈｏｗｓ ａ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ． Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ４９， ７１１－７２５ （２００１）．
【非特許文献28】Ｓｅｄｇｗｉｃｋ， Ａ． ＆ Ｄ’Ｓｏｕｚａ－Ｓｃｈｏｒｅｙ， Ｃ． Ｗｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｎｖａｓｉｏｎ： Ｄｒａｗｉｎｇ Ｐａｒａｌｌｅｌｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒｓ （Ｂａｓｅｌ）． ８， ８０ （２０１６）．
【非特許文献29】Ｇｉｒｏｕｘ－Ｌｅｐｒｉｅｕｒ， Ｅ．， Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ， Ａ．， Ｄｉｎｇ， Ｖ． ＆ Ｈｅ， Ｂ． Ｈｅｄｇｅｈｏｇ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ： Ｆｒｏｍ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｓｃｉ． １９， ２８３５ （２０１８）．
【非特許文献30】Ｃｈａｆｆｅｒ， Ｃ． Ｌ．， Ｓａｎ Ｊｕａｎ， Ｂ． Ｐ．， Ｌｉｍ， Ｅ． ＆ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， Ｒ． Ａ． ＥＭＴ， ｃｅｌｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ． ３５， ６４５－６５４ （２０１６）．
【非特許文献31】Ｏｕｄａｒｔ， Ｊ．－Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ＮＣ１ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＩＸ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ＦＡＫ／ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｌｐｈａｖｂｅｔａ３ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７， １５１６－１５２８ （２０１６）．
【非特許文献32】Ｃａｃｃａｖａｒｉ， Ｆ．， Ｖａｌｄｅｍｂｒｉ， Ｄ．， Ｓａｎｄｒｉ， Ｃ．， Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ， Ｆ． ＆ Ｓｅｒｉｎｉ， Ｇ． Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｅｌｌ Ａｄｈ． Ｍｉｇｒ． ４， １２４－１２９ （２０１０）．
【非特許文献33】Ｓｉｎｇｈ， Ｂ．， Ｆｕ， Ｃ． ＆ Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ， Ｊ． Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ α ｖ β ３ －ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｎ ｌｕｎｇ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｏｒｇａｎｓ． Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７８， Ｌ２１７－Ｌ２２６ （２０００）．
【非特許文献34】Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ， Ｆ．， Ｒａｙ， Ａ． ＆ Ｄｏｎｔｅｎｗｉｌｌ， Ｍ． Ｉｎｔｅｇｒｉｎ α５β１， ｔｈｅ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ａｓ ａ Ｐｅｒｔｉｎｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ． Ｃａｎｃｅｒｓ （Ｂａｓｅｌ）． ５， ２７－４７ （２０１３）．
【非特許文献35】Ｉｎｆａｎｔｅ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ＬＲＲＫ２－Ｇ２０１９Ｓ ｃａｒｒｉｅｒｓ， ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｃａｓｅｓ， ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｓ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ａｇｉｎｇ ３６， １１０５－１１０９ （２０１５）．
【非特許文献36】Ｃａｌｖｏ， Ａ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ＡＬＳ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ） ｍｉｃｅ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７， ｅ３２６３２ （２０１２）．
【非特許文献37】Ａｎａ， Ｃ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＩＸ Ａｌｐｈａ １ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ａｇｉｎｇ Ｄｉｓ． （２０１８）． ｄｏｉ：１０．１４３３６／ＡＤ．２０１８．０９１７
【非特許文献38】Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ．， Ｔ． Ｔ． Ｗｕ， Ｈ． Ｍ． Ｐｅｒｒｙ， Ｋ． Ｓ． Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ ａｎｄ Ｃ． Ｆｏｅｌｌｅｒ （１９８７）， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．， ｐ． １
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、ＸＩＸ型コラーゲン、特にα１鎖のＣ末端を特異的に認識するモノクローナル抗体；およびイムノアッセイ、詳細には、生体流体試料中のＸＩＸ型コラーゲンを検出する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ法）を開発した。本発明者らは、ＸＩＸ型コラーゲンが、がん検出用のバイオマーカーとして使用できると判断した。詳細には、ＰＲＯ－Ｃ１９が、ＮＳＣＬＣと健康な対照との間の識別に特に優れており、ＮＳＣＬＣの早期発見用のバイオマーカーとして使用することができる。
【0010】
従って、第１の態様では、本発明は、ＸＩＸ型コラーゲンα１鎖のＣ末端（本明細書では標的ペプチドとも称する）を特異的に認識し結合するモノクローナル抗体に関するものであり、Ｃ末端はアミノ酸配列ＳＨＡＨＲＴＧＧＮ（配列番号１）（本明細書では、標的配列とも称する）を有する。
【0011】
好ましくは、モノクローナル抗体は、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有する合成ペプチドに対して生起させたモノクローナル抗体である。抗体を生起させるのに使用される合成ペプチドは、そのＮ末端のところで輸送タンパク質に連結された合成ペプチドであってもよい。例示的な輸送タンパク質には、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などのタンパク質が挙げられるが、これには限定されない。合成ペプチドは、いずれかの好適な連結を介して輸送タンパク質に連結されてもよく、このペプチドは、ペプチドのＮ末端に１つ以上の追加のアミノ酸残基を含んでいてもよい。モノクローナル抗体は、マウスまたは他の哺乳動物を免疫する、免疫された哺乳動物から脾臓細胞を単離してハイブリドーマ細胞と融合させる、次いで、得られたハイブリドーマ細胞を培養してモノクローナル増殖を確保するなどであるがこれらには限定されない、当業者に公知の好適な技術を介して生起させたものであってもよい。
【0012】
好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮＸ（配列番号２）を有するペプチドを特異的には認識せず、またはこれと特異的には結合せず、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。よって、モノクローナル抗体は好ましくは、標的アミノ酸配列をＣ末端のところで一つまたは複数のアミノ酸によって延長させた標的ペプチドの伸長変異体を特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない。好ましくは、モノクローナル抗体は、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮＡ（配列番号３）を有するペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない。
【0013】
好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧ（配列番号４）を有するペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない。よって、モノクローナル抗体は好ましくは、Ｃ末端のところで一つまたは複数のアミノ酸によって標的アミノ酸配列を短縮させた標的ペプチドの短縮変異体を特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない。
【0014】
好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、Ｃ末端アミノ酸配列ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ（配列番号５）を有するペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない。よって、モノクローナル抗体は好ましくは、ナンセンス標準ペプチドを特異的には認識しない、またはこれと特異的には結合しない。
【0015】
第２の態様では、本発明は、ヒト生体流体試料中のＸＩＸ型コラーゲンを検出するイムノアッセイの方法に関するものであり、前記方法は、ヒト生体流体試料を、本発明の第１の態様によるモノクローナル抗体と接触させることと、モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合を検出することと、を含む。
【0016】
好ましくは、検出は定量的である。よって、この方法は、モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を検出し決定することを含んでいてもよい。
【0017】
好ましくは、イムノアッセイは、競合イムノアッセイである。
【0018】
好ましくは、イムノアッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）である。好ましくは、ＥＬＩＳＡは、競合ＥＬＩＳＡである。
【0019】
ヒト生体流体試料は、実例としては、血液、血清、血漿、または尿であってもよい。好ましくは、試料は、血清または血漿である。
【0020】
ヒト生体流体試料は、がんを示す医学的徴候または症状を有するヒト患者からの試料であってもよい。好ましくは、生体流体試料は、膵臓、大腸、腎臓、胃、卵巣、乳房、膀胱、肺、頭頸部、前立腺、または肝臓のがん、またはメラノーマ、好ましくは乳房、肺、または卵巣のがん、詳細には肺がん、特に非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を示す医学的徴候または症状を有するヒト患者からの試料である。
【0021】
本方法は、患者におけるがんの可能性を診断する、および／またはモニタリングする、および／または評価するイムノアッセイ法であってもよく、本方法は、前記患者から得られた生体流体試料をモノクローナル抗体と接触させることと、モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を検出および決定することと、前記結合量を、通常の健康な被験者に関連する値、および／または既知の疾患重症度に関連する値、および／または前記患者から以前の時点で得られた値と相関させることと、を含む。好ましくは、がんは、膵臓、大腸、腎臓、胃、卵巣、乳房、膀胱、肺、頭頸部、前立腺、または肝臓のがん、またはメラノーマ、より好ましくは乳房、肺、または卵巣のがん、詳細には肺がん、特に非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。
【0022】
第２の態様による方法のいくつかの実施形態では、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有するＸＩＸ型コラーゲンペプチドのエピトープに特異的なモノクローナル抗体の結合量は、一つまたは複数の所定のカットオフ値と相関がある。
【0023】
本明細書で使用されるとおり、「カットオフ値」は、がんを有する被験者である可能性が高いことを示すと統計的に決定される結合量を意味する。統計的カットオフ値以上である患者試料におけるバイオマーカー結合の測定値は、がんの存在または可能性の少なくとも７０％確率、好ましくは少なくとも８０％確率、好ましくは少なくとも８５％確率、より好ましくは少なくとも９０％確率、最も好ましくは少なくとも９５％確率に対応する場合がある。「カットオフ値」は、がんと診断された患者と健康な対照から得られた結果を比較することによって計算することができる。
【0024】
Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）に特異的なモノクローナル抗体の結合量に対する所定のカットオフ値は、５０．０～２００．０ｎｇ／ｍＬの範囲内であってもよい。好ましくは、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）に特異的なモノクローナル抗体の結合量に対する所定のカットオフ値は、７５．０～１５０．０ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは９０．０～１２０．０ｎｇ／ｍＬの範囲内、最も好ましくは少なくとも１１８．９ｎｇ／ｍＬである。この点に関して、統計分析の使用を通じて、５０．０～２００．０ｎｇ／ｍＬの範囲内、詳細には少なくとも１１８．９ｎｇ／ｍＬ以上の、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）に特異的なモノクローナル抗体の結合の測定量であれば、がん、詳細には肺がん、例えばＮＳＣＬＣを有する可能性がある患者であることが確定する場合のあることが見出された。５０．０～２００．０ｎｇ／ｍＬの範囲内、詳細には少なくとも１１８．９ｎｇ／ｍＬの統計的カットオフ値があることにより、本発明の方法を利用して、高い信頼度でがん診断の予測を行うことが可能である。詳細には、５０．０～２００．０ｎｇ／ｍＬの範囲内、詳細には少なくとも１１８．９ｎｇ／ｍＬ以上の値で、ＮＳＣＬＣの患者が確定する場合がある。このような統計的カットオフ値を適用することは、独立した診断アッセイという結果が得られるので特に有利である；すなわち診断の結論に達するために、健康な個人および／またはがんであるとわかっている患者とのいかなる直接的な比較の必要性も、これによって取り除かれる。決定的な予測が簡易的になされることにより、患者がさらに早期に治療される結果となる場合があり、それによって今度は、生存の全体的な見込みが改善する、および／または入院のリスクが減少する場合がある。
【0025】
肺がん、詳細にはＮＳＣＬＣと診断された患者において、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）に特異的なモノクローナル抗体の結合量に対する所定のカットオフ値を使用して、がんのステージの指標を提供することができる。Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）に特異的なモノクローナル抗体の結合量に対する所定のカットオフ値は、４０．０～７５．０ｎｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは少なくとも５５．６ｎｇ／ｍＬとすることができる。この点に関して、統計分析の使用を通じて、４０．０～７５．０ｎｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは少なくとも５５．６ｎｇ／ｍＬ以上の、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）に特異的なモノクローナル抗体の結合の測定量であれば、ステージＩＩＩまたはステージＩＶのＮＳＣＬＣにおける末期がんを有する可能性のある患者が確定する場合のあることが見出された。４０．０～７５．０ｎｇ／ｍＬの範囲内、詳細には少なくとも５５．６ｎｇ／ｍＬの統計的カットオフ値があることにより、本発明の方法を利用して、高い信頼度でがんのステージと進行の予測を行うことが可能である。詳細には、４０．０～７５．０ｎｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは少なくとも５５．６ｎｇ／ｍＬ以上の値で、少なくともステージＩＩＩのＮＳＣＬＣの患者が確定する場合がある。決定的な予測が簡易的になされることは、患者におけるがんの進行のモニタリングや、治療の有効性のモニタリングに役立つ場合がある。カットオフ値の使用は、治療体制が奏功しないかどうか、そしてがんが進行しているかどうかを特定するのに役立つ場合があり、その結果、さらに早期で代替治療を探すことができ、それにより今度は、生存の全体的な見込みが改善する場合がある。
【0026】
第３の態様では、本発明は、
本発明の第１の態様によるモノクローナル抗体と：
－ストレプトアビジンコーティングされたウェルプレート；
－Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有する、Ｎ末端ビオチン化ペプチド；および
－Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有する較正用ペプチド
のうちの少なくとも一つと、
を含むアッセイキットに関する。
本発明の第１の態様によるモノクローナル抗体と：
－ストレプトアビジンコーティングされたウェルプレート；
－Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有する、Ｎ末端ビオチン化ペプチド；および
－Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有する較正用ペプチド
のうちの少なくとも一つと、
を含むアッセイキットに関する。
【0027】
キットは、本発明の第２の態様による方法と好ましくは組み合わせて、がんのリスクの診断または予測に使用するためのものであってもよい。好ましくは、がんは、膵臓、大腸、腎臓、胃、卵巣、乳房、膀胱、肺、頭頸部、前立腺、または肝臓のがん、またはメラノーマ、より好ましくは乳房、肺、または卵巣のがん、詳細には肺がん、特に非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。
定義
定義
【0028】
本明細書で使用されるとおり、用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は、同義に使用される。
【0029】
本明細書で使用されるとおり、用語「モノクローナル抗体」は、抗体全体と、その抗体全体の結合特異度を保持するそのフラグメント、例えばＦａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、または当業者に公知の他のそのようなフラグメントなどとの両方を指す。同一の結合特異度を保持する抗体は、同一の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む場合がある。抗体のＣＤＲは、カバットら（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．）［非特許文献３８］によって記載されたものなどの当業者に公知の方法を用いて決定することができる。
【0030】
抗体は、実施例に記載されるとおり、Ｂ細胞クローンから生成することができる。抗体のアイソタイプは、ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＡアイソタイプ、またはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブクラスに特異的なＥＬＩＳＡによって決定することができる。アイソタイプを同定するために、他の好適な方法を用いることができる。
【0031】
生成された抗体のアミノ酸配列は、標準的な技術を用いて決定することができる。例えば、ＲＮＡを細胞から単離し、これを使用して、逆転写によりｃＤＮＡを生成することができる。次いでこのｃＤＮＡを、抗体の重鎖および軽鎖を増幅するプライマーを用いるＰＣＲにかける。例えば、全てのＶＨ（可変重鎖）配列についてリーダー配列に特異的なプライマーを、あらかじめ決定されているアイソタイプの定常領域に位置する配列に結合するプライマーとともに使用することができる。軽鎖は、カッパまたはラムダ鎖の３’末端に結合するプライマーを、ＶカッパまたはＶラムダリーダー配列にアニーリングされるプライマーとともに用いることにより、増幅することができる。全長の重鎖および軽鎖を生成し、配列決定することができる。
【0032】
本明細書で使用されるとおり、用語「Ｃ末端」は、ポリペプチドの先端、すなわちポリペプチドのＣ末端を指し、その一般的な方向の意味としては解釈されない。
【0033】
同様に、用語「Ｎ末端」は、ポリペプチドの先端、すなわち、ポリペプチドのＮ末端を指し、その一般的な方向の意味としては解釈されない。本明細書で使用されるとおり、用語「競合イムノアッセイ」は、抗体への結合に関して、試料中に存在する標的ペプチド（もしあれば）が、既知の量のペプチドの標的（例えば、固定基質に結合している、または標識されているもの）と競合するイムノアッセイを指し、これは当業者に公知の技術である。
【0034】
本明細書で使用されるとおり、用語「ＥＬＩＳＡ」（酵素結合免疫吸着測定法）は、試料中に存在する標的ペプチド（もしあれば）を、酵素、例えばホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）またはアルカリホスファターゼに結合した抗体を用いて検出するイムノアッセイを指す。次いで酵素の活性が、測定可能な生成物を生成する基質とのインキュベーションによって評価される。これにより、試料中の標的ペプチドの存在および／または量を、検出および／または定量することができる。ＥＬＩＳＡは、当業者に公知の技術である。
【0035】
本明細書で使用されるとおり、用語「結合量」は、モノクローナル抗体と標的ペプチドとの間の結合の定量を指し、前記定量は、生体流体試料中の標的ペプチドの測定値を検量線と比較することにより決定され、検量線は、標的ペプチドの既知の濃度の標準試料を用いて作成される。Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有する標的ペプチドを生体流体中で測定する本明細書に開示の特定のアッセイでは、検量線は、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１、（そして特に、アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）からなっていてもよいもの）を有する較正ペプチドの既知の濃度の標準試料を使用して作成される。生体流体試料において測定される値を検量線と比較することにより、試料中の標的ペプチドの実際の量が決定される。
【0036】
本明細書で使用されるとおり、用語「ＰＲＯ－Ｃ１９」は、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）を有するＸＩＸ型コラーゲンを意味する。
【0037】
本発明を、以下の図を参照する以下の実施例において実証する。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】図１は、ＰＲＯ－Ｃ１９アッセイの特異度を示す。標準ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ － 配列番号１）、伸長ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮＡ － 配列番号３）、短縮ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧ － 配列番号４）のみならず、ナンセンス標準ペプチド（ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ － 配列番号５）、およびナンセンスコーターペプチド（ビオチン－ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ）についての阻害曲線である。ペプチドは、抗体結合に向け競合する傾向を評価するために、２倍の希釈系列とした。シグナルは、アッセイバッファーに対応するバックグラウンド吸光度（Ｂ０）の割合として、ペプチド濃度の関数として対数スケールで示した。エラーバーは二重反復測定からの標準偏差を示す。
【図2】図２は、ＰＲＯ－Ｃ１９の平行性を示す。希釈の直線性または平行性を評価するための、標準ペプチドおよび２倍希釈したヒト血清試料の阻害曲線。シグナルは、希釈ステップの関数として、アッセイバッファーに対応するバックグラウンド吸光度（Ｂ０）の割合として示される。エラーバーは二重反復測定からの標準偏差を示す。
【図3】図３は、コホート１におけるＰＲＯ－Ｃ１９を示す。健康な対照（ｎ＝３８）、およびＮＳＣＬＣ（ｎ＝１１）、卵巣（ｎ＝８）、ＳＣＬＣ（ｎ＝７）、乳房（ｎ＝１２）、結腸（ｎ＝７）、膵臓（ｎ＝２）、前立腺（ｎ＝１３）、メラノーマ（ｎ＝６）、胃（ｎ＝９）を含む様々ながん種の血清におけるＰＲＯ－Ｃ１９の定量。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは対数変換し、平均と標準偏差で表示した。ＬＬＭＲ未満と測定された試料には、ＰＲＯ－Ｃ１９の妥当性において決定されたＬＬＭＲの値を与えた。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルの差は、ダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）検定による多重比較のために補正された通常の一元配置ＡＮＯＶＡによって評価した。＊＊＊＊は、０．０００１未満のｐ値を示す。＊＊＊は０．００１未満のｐ値を示す。＊＊は０．０１未満のｐ値を示す。
【図4】図４は、コホート２におけるＰＲＯ－Ｃ１９を示す。健康な対照（ｎ＝２４）およびＮＳＣＬＣ（ｎ＝４０）の血清におけるＰＲＯ－Ｃ１９の定量。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは対数変換し、平均と標準偏差で表示した。ＬＬＭＲ未満と測定された試料には、ＰＲＯ－Ｃ１９の妥当性において決定されたＬＬＭＲの値を与えた。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルの差は、対応なしの両側ｔ検定により評価した。＊＊＊＊は、０．０００１未満のｐ値を示す。
【図5】図５は、コホート２のステージにおけるＰＲＯ－Ｃ１９を示す。健康な対照（ｎ＝２４）、およびＮＳＣＬＣステージＩＩＩ（ｎ＝２０）、およびステージＩＶ（ｎ＝２０）の血清におけるＰＲＯ－Ｃ１９の定量。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは対数変換し、平均と標準偏差で表示した。ＬＬＭＲ未満と測定された試料は、ＰＲＯ－Ｃ１９の妥当性において決定されたＬＬＭＲの値を与えた。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルの差は、ダネット検定による多重比較のために補正された通常の一元配置ＡＮＯＶＡによって評価した。＊＊＊＊は、０．０００１未満のｐ値を示す。
【図6】図６は、コホート３におけるＰＲＯ－Ｃ１９を示す。健康な対照（ｎ＝３０）およびＮＳＣＬＣ（ｎ＝３４）の血清におけるＰＲＯ－Ｃ１９の定量。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは対数変換し、平均と標準偏差で表示した。ＬＬＭＲ未満と測定された試料は、ＰＲＯ－Ｃ１９の妥当性において決定されたＬＬＭＲの値を与えた。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルの差は、対応なしの両側ｔ検定により評価した。＊＊＊＊は、０．０００１未満のｐ値を示す。
【図7】図７は、コホート３のステージにおけるＰＲＯ－Ｃ１９を示す。健康な対照（ｎ＝３０）、ならびにＮＳＣＬＣステージＩ（ｎ＝１０）、ステージＩＩ（ｎ＝１０）、ステージＩＩＩ（ｎ＝９）、およびステージＩＶ（ｎ＝５）の血清におけるＰＲＯ－Ｃ１９の定量。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは対数変換し、平均と標準偏差で表示した。ＬＬＭＲ未満と測定された試料には、ＰＲＯ－Ｃ１９の妥当性において決定されたＬＬＭＲの値を与えた。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルの差は、ダネット検定による多重比較のために補正された通常の一元配置ＡＮＯＶＡによって評価した。＊＊は、０．０１未満のｐ値を示す。
【図8】図８は、コホート４におけるＰＲＯ－Ｃ１９を示す。健康な対照（ｎ＝３３）、ならびに膵臓がん（ｎ＝２０）、大腸がん（ＣＲＣ、ｎ＝２０）、腎臓がん（ｎ＝２０）、胃がん（ｎ＝２０）、卵巣がん（ｎ＝２０）、乳がん（ｎ＝２０）、膀胱がん（ｎ＝２０）、肺がん（ｎ＝２０）、メラノーマ（ｎ＝２０）、頭頸部がん（Ｈ＆Ｎ、ｎ＝２０）、前立腺がん（ｎ＝２０）、および肝臓がん（ｎ＝３）の血清におけるＰＲＯ－Ｃ１９の定量。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは対数変換し、平均と標準偏差で表示した。ＬＬＭＲ未満と測定された試料には、ＰＲＯ－Ｃ１９の妥当性において決定されたＬＬＭＲの値を与えた。がんと健康な対照との間のＰＲＯ－Ｃ１９レベルの差は、ダネット検定による多重比較のために補正された通常の一元配置ＡＮＯＶＡによって評価した。＊＊＊＊は、がんと健康な対照の比較において、０．０００１未満のｐ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【0039】
方法
ＰＲＯ－Ｃ１９のＥＬＩＳＡプロトコル：
ＸＩＸ型コラーゲン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１４９９３）のＣ末端に見いだされる、１０アミノ酸ペプチド１１３３ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ１１４２（配列番号１）をジェンスクリプト社（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州、米国））から購入し、免疫化に使用した。モノクローナル抗体の製造は、別途記載されている（非特許文献２４）。アッセイバッファーの選択、インキュベーションの時間、および温度のみならず、抗体およびペプチドの濃度を含む、いくつかの最適化をＥＬＩＳＡに行った。最終的なＰＲＯ－Ｃ１９プロトコルを、以下のとおり実行した：９６ウェルのストレプトアビジンコーティングされたＥＬＩＳＡプレートは、アッセイバッファー（２５ｍＭのＴＢＳ、１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０（ｗ／ｖ）、２ｇ／ｌのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解させた、１００μｌ／ウェルの２．５ｎｇ／ｍｌビオチン化ＳＨＡＨＲＴＧＧＮペプチドでコーティングし、２０℃で３０分間、３００ＲＰＭで振とうしながらインキュベートした。洗浄バッファー（２５ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で５回洗浄後、２０μｌ／ウェルの試料を２回に分けて加え、次いで、アッセイバッファー中、６０ｎｇ／ｍｌのＨＲＰ標識モノクローナル抗体１００μｌ／ウェルを加え、２０℃で１時間、３００ＲＰＭで振とうしながらインキュベートした。第２の洗浄サイクルの後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを加え、暗所で２０℃、３００ＲＰＭで振とうしながら１５分間インキュベートした。１％のＨ２ＳＯ４、１００μｌ／ウェルを加えて反応を停止させた。吸光度を、６５０ｎｍを基準として４５０ｎｍで測定した。標準曲線を作成するために、２倍希釈系列の５００ｎｇ／ｍｌのＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）ペプチド、２０μｌ／ウェルを、適切なウェルに加え、４パラメータの数学的合わせ込みを用いて、曲線を作成した。各プレートには、アッセイ内およびアッセイ間変動をモニタリングするための、一つのヒト血清、一つのウマ血清、一つのウシ軟骨摘出物、および二つのペプチドインアッセイバッファーの試料を含む、五つの品質管理試料が含まれていた。
ＰＲＯ－Ｃ１９のＥＬＩＳＡプロトコル：
ＸＩＸ型コラーゲン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１４９９３）のＣ末端に見いだされる、１０アミノ酸ペプチド１１３３ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ１１４２（配列番号１）をジェンスクリプト社（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州、米国））から購入し、免疫化に使用した。モノクローナル抗体の製造は、別途記載されている（非特許文献２４）。アッセイバッファーの選択、インキュベーションの時間、および温度のみならず、抗体およびペプチドの濃度を含む、いくつかの最適化をＥＬＩＳＡに行った。最終的なＰＲＯ－Ｃ１９プロトコルを、以下のとおり実行した：９６ウェルのストレプトアビジンコーティングされたＥＬＩＳＡプレートは、アッセイバッファー（２５ｍＭのＴＢＳ、１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０（ｗ／ｖ）、２ｇ／ｌのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解させた、１００μｌ／ウェルの２．５ｎｇ／ｍｌビオチン化ＳＨＡＨＲＴＧＧＮペプチドでコーティングし、２０℃で３０分間、３００ＲＰＭで振とうしながらインキュベートした。洗浄バッファー（２５ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で５回洗浄後、２０μｌ／ウェルの試料を２回に分けて加え、次いで、アッセイバッファー中、６０ｎｇ／ｍｌのＨＲＰ標識モノクローナル抗体１００μｌ／ウェルを加え、２０℃で１時間、３００ＲＰＭで振とうしながらインキュベートした。第２の洗浄サイクルの後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを加え、暗所で２０℃、３００ＲＰＭで振とうしながら１５分間インキュベートした。１％のＨ２ＳＯ４、１００μｌ／ウェルを加えて反応を停止させた。吸光度を、６５０ｎｍを基準として４５０ｎｍで測定した。標準曲線を作成するために、２倍希釈系列の５００ｎｇ／ｍｌのＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）ペプチド、２０μｌ／ウェルを、適切なウェルに加え、４パラメータの数学的合わせ込みを用いて、曲線を作成した。各プレートには、アッセイ内およびアッセイ間変動をモニタリングするための、一つのヒト血清、一つのウマ血清、一つのウシ軟骨摘出物、および二つのペプチドインアッセイバッファーの試料を含む、五つの品質管理試料が含まれていた。
【0040】
ＰＲＯ－Ｃ１９のＥＬＩＳＡの技術的妥当性：
抗体の特異度は、標準ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ － 配列番号１）、伸長ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮＡ － 配列番号３）、短縮ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧ － 配列番号４）のみならず、ナンセンス標準ペプチド（ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ － 配列番号５）、およびナンセンスコーターペプチド（Ｂｉｏｔｉｎ－ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ）の２倍希釈によるシグナル阻害によって試験した。直線性または平行性は、ヒト血清試料を２倍の希釈系系列として、希釈度に対する回収率を計算することによって試験した。精度は、標準ペプチドをヒト血清試料にスパイクし、スパイク試料におけるペプチドの回収率を計算することにより試験した。ヘモグロビン、脂質、およびビオチンを含む一般的な干渉物質の影響は、高濃度または低濃度のいずれかの干渉剤（ヘモグロビン 低＝２．５ｍｇ／ｍｌ、高＝５ｍｇ／ｍｌ； 脂質 低＝１．５ｍｇ／ｍｌ、高＝５ｍｇ／ｍｌ； ビオチン 低＝３ｎｇ／ｍｌ、高＝９ｎｇ／ｍｌ）でスパイクされたヒト血清で評価した。アッセイ干渉は、非スパイク試料に対するスパイク試料の回収率として計算した。アッセイの変動は、二重測定において１０個の品質管理試料のランを用いた１０回の独立したランにより試験した。品質管理試料の五つはヒト血清であり、一つはウマ血清であり、一つはウシ軟骨抽出物であり、三つは様々な濃度のアッセイバッファー中の標準ペプチドであった。アッセイ内変動は、１０回のランのそれぞれの二重測定の平均変動係数（ＣＶ％）として計算した。アッセイ間変動は、１０回のランにわたる全ＣＶ％として計算した。測定範囲の下限および上限（それぞれＬＬＭＲおよびＵＬＭＲ）は、１０回の独立したランにわたって測定され、標準曲線の線形範囲の境界を示す。分析物の安定性は、４または２０℃で２、４、２４、または４８時間、インキュベートされた３種類のヒト血清試料に対して測定した。安定性は、－２０℃で保存した対照試料に対するインキュベーション試料の回収率として計算した。凍結融解安定性は、ヒト血清試料を最高４サイクルまで凍結融解することにより評価した。安定性は、１回の凍結融解サイクルを経た試料に対する融解した試料の回収率として計算した。検出下限は、アッセイバッファーを含む２１個のブランク試料の平均濃度として計算し、３標準偏差を加算した。検出上限は、１０回の独立したランにわたる標準曲線の最高濃度に対応する標準ペプチドの平均濃度として計算し、３標準偏差を減算した。
抗体の特異度は、標準ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ － 配列番号１）、伸長ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮＡ － 配列番号３）、短縮ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧ － 配列番号４）のみならず、ナンセンス標準ペプチド（ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ － 配列番号５）、およびナンセンスコーターペプチド（Ｂｉｏｔｉｎ－ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ）の２倍希釈によるシグナル阻害によって試験した。直線性または平行性は、ヒト血清試料を２倍の希釈系系列として、希釈度に対する回収率を計算することによって試験した。精度は、標準ペプチドをヒト血清試料にスパイクし、スパイク試料におけるペプチドの回収率を計算することにより試験した。ヘモグロビン、脂質、およびビオチンを含む一般的な干渉物質の影響は、高濃度または低濃度のいずれかの干渉剤（ヘモグロビン 低＝２．５ｍｇ／ｍｌ、高＝５ｍｇ／ｍｌ； 脂質 低＝１．５ｍｇ／ｍｌ、高＝５ｍｇ／ｍｌ； ビオチン 低＝３ｎｇ／ｍｌ、高＝９ｎｇ／ｍｌ）でスパイクされたヒト血清で評価した。アッセイ干渉は、非スパイク試料に対するスパイク試料の回収率として計算した。アッセイの変動は、二重測定において１０個の品質管理試料のランを用いた１０回の独立したランにより試験した。品質管理試料の五つはヒト血清であり、一つはウマ血清であり、一つはウシ軟骨抽出物であり、三つは様々な濃度のアッセイバッファー中の標準ペプチドであった。アッセイ内変動は、１０回のランのそれぞれの二重測定の平均変動係数（ＣＶ％）として計算した。アッセイ間変動は、１０回のランにわたる全ＣＶ％として計算した。測定範囲の下限および上限（それぞれＬＬＭＲおよびＵＬＭＲ）は、１０回の独立したランにわたって測定され、標準曲線の線形範囲の境界を示す。分析物の安定性は、４または２０℃で２、４、２４、または４８時間、インキュベートされた３種類のヒト血清試料に対して測定した。安定性は、－２０℃で保存した対照試料に対するインキュベーション試料の回収率として計算した。凍結融解安定性は、ヒト血清試料を最高４サイクルまで凍結融解することにより評価した。安定性は、１回の凍結融解サイクルを経た試料に対する融解した試料の回収率として計算した。検出下限は、アッセイバッファーを含む２１個のブランク試料の平均濃度として計算し、３標準偏差を加算した。検出上限は、１０回の独立したランにわたる標準曲線の最高濃度に対応する標準ペプチドの平均濃度として計算し、３標準偏差を減算した。
【0041】
患者試料：
第１のコホートは、販売業者のアステランド・バイオサイエンス社（Ａｓｔｅｒａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（デトロイト、ミシガン州、米国）から一部入手した。これは、乳房（ｎ＝１２）、結腸（ｎ＝７）、胃（ｎ＝９）、メラノーマ（ｎ＝６）、ＮＳＣＬＣ（ｎ＝１１）、卵巣（ｎ＝８）、膵臓（ｎ＝２）、前立腺（ｎ＝１３）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）（ｎ＝７）を含む７５人のがん患者からの血清とともに、販売業者、バレー・バイオメディカル社（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）（ウィンチェスター、バージニア州、米国）から入手した３８人の健康な対照を含んでいた。
第１のコホートは、販売業者のアステランド・バイオサイエンス社（Ａｓｔｅｒａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（デトロイト、ミシガン州、米国）から一部入手した。これは、乳房（ｎ＝１２）、結腸（ｎ＝７）、胃（ｎ＝９）、メラノーマ（ｎ＝６）、ＮＳＣＬＣ（ｎ＝１１）、卵巣（ｎ＝８）、膵臓（ｎ＝２）、前立腺（ｎ＝１３）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）（ｎ＝７）を含む７５人のがん患者からの血清とともに、販売業者、バレー・バイオメディカル社（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）（ウィンチェスター、バージニア州、米国）から入手した３８人の健康な対照を含んでいた。
【0042】
第２および第３のコホートは、販売業者であるプロテオジェネックス社（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ）（ロサンゼルス、カリフォルニア州、米国）から入手した。第２のコホートは、ＮＳＣＬＣ患者４０人を含み、そのうち２０人はステージＩＩＩ、２０人はステージＩＶであった。これはまた、バレー・バイオメディカル社から入手した２４人の健康な対照も含んでいた。第３のコホートは、３４人のＮＳＣＬＣ患者を含み、そのうち１０人がステージＩ、１０人がステージＩＩ、９人がステージＩＩＩ、５人がステージＩＶであった。これはまた、プロテオジェネックス社とバレー・バイオメディカル社から入手した３０人の健康な対照も含んでいた。
【0043】
第４のコホートは、膵臓、大腸、腎臓、胃、卵巣、乳房、膀胱、肺、メラノーマ、頭頸部、前立腺のがん患者それぞれ２０人を含んでいた。これはまた、３人の肝臓がん患者および３３人の健康な対照も含んでいた。すべてのがん試料は、プロテオジェネックス社から、健康な対照は、ＢｉｏＩＶＴ（ウェストベリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）、ニューヨーク州、米国）から入手した。
【0044】
業者に従い、試料採取は、施設内審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）または独立倫理委員会（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を受け、患者はインフォームドコンセントを受けた。すべての調査は、ヘルシンキ宣言（Ｈｅｌｓｉｎｋｉ Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ）に従って行った。
【0045】
統計学：
ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは対数変換し、ダゴスティーノ‐ピアソン（Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ－Ｐｅａｒｓｏｎ）オムニバス検定で正規性について検定した。健康者とＮＳＣＬＣの間のＰＲＯ－Ｃ１９レベル、およびＮＳＣＬＣサブタイプ間のＰＲＯ－Ｃ１９レベルの比較は、対応なしの、両側ｔ検定により行った。数通りの群にわたるＰＲＯ－Ｃ１９レベルの比較は、ダネット検定を用いる多重比較のために補正された通常の一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。群どうしの間の年齢の差は、対応なしの両側ｔ検定を用いて評価した。性別と民族性の差は、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）の正確検定を使用して評価した。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルとＢＭＩ、年齢、喫煙、および試料採取日の相関は、線形回帰を用いて評価した。診断精度は、受診者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）により検定した。感度および特異度は、ヨーデン指標（Ｙｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘ）に従って推定された最適なカットオフ値のところで決定した。０．０５未満であるｐ値を有意と見なした。アスタリスクは以下の有意水準を示している：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。多重比較検定を行う場合、多重度調整されたｐ値を報告する。統計分析およびグラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ８．２ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ、グラフパッド・ソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）およびＭｅｄＣａｌｃ（ＭｅｄＣａｌｃ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １８．１１．６ （メドカルク・ソフトウェア社（ＭｅｄＣａｌｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｂｖｂａ）、オーステンデ（Ｏｓｔｅｎｄ）、ベルギー； ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｃａｌｃ．ｏｒｇ； ２０１９））を使用した。
ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは対数変換し、ダゴスティーノ‐ピアソン（Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ－Ｐｅａｒｓｏｎ）オムニバス検定で正規性について検定した。健康者とＮＳＣＬＣの間のＰＲＯ－Ｃ１９レベル、およびＮＳＣＬＣサブタイプ間のＰＲＯ－Ｃ１９レベルの比較は、対応なしの、両側ｔ検定により行った。数通りの群にわたるＰＲＯ－Ｃ１９レベルの比較は、ダネット検定を用いる多重比較のために補正された通常の一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。群どうしの間の年齢の差は、対応なしの両側ｔ検定を用いて評価した。性別と民族性の差は、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）の正確検定を使用して評価した。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルとＢＭＩ、年齢、喫煙、および試料採取日の相関は、線形回帰を用いて評価した。診断精度は、受診者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）により検定した。感度および特異度は、ヨーデン指標（Ｙｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘ）に従って推定された最適なカットオフ値のところで決定した。０．０５未満であるｐ値を有意と見なした。アスタリスクは以下の有意水準を示している：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。多重比較検定を行う場合、多重度調整されたｐ値を報告する。統計分析およびグラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ８．２ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ、グラフパッド・ソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）およびＭｅｄＣａｌｃ（ＭｅｄＣａｌｃ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １８．１１．６ （メドカルク・ソフトウェア社（ＭｅｄＣａｌｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｂｖｂａ）、オーステンデ（Ｏｓｔｅｎｄ）、ベルギー； ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｃａｌｃ．ｏｒｇ； ２０１９））を使用した。
【0046】
結果
ＰＲＯ－Ｃ１９アッセイの特異度は、モノクローナル抗体との結合に向け競合するペプチドの熟練度によって評価した。試験されたペプチドは、標準ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ － 配列番号１）、伸長ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮＡ － 配列番号３）、短縮ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧ － 配列番号４）、ナンセンスペプチド（ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ － 配列番号５）、およびナンセンスコーターペプチド（Ｂｉｏｔｉｎ－ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ）を含んでいた。標準ペプチドのみが、用量依存的にシグナルを阻害した（図１は、ＰＲＯ－Ｃ１９アッセイの特異度を示す）。ナンセンスコーターペプチドは、検出可能なシグナルを生じなかった。全てにおいてこれは、アッセイがＸＩＸ型コラーゲンのＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）エピトープに特異的であることを示している。
ＰＲＯ－Ｃ１９アッセイの特異度は、モノクローナル抗体との結合に向け競合するペプチドの熟練度によって評価した。試験されたペプチドは、標準ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ － 配列番号１）、伸長ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮＡ － 配列番号３）、短縮ペプチド（ＳＨＡＨＱＲＴＧＧ － 配列番号４）、ナンセンスペプチド（ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ － 配列番号５）、およびナンセンスコーターペプチド（Ｂｉｏｔｉｎ－ＧＶＡＰＧＩＧＰＧＧ）を含んでいた。標準ペプチドのみが、用量依存的にシグナルを阻害した（図１は、ＰＲＯ－Ｃ１９アッセイの特異度を示す）。ナンセンスコーターペプチドは、検出可能なシグナルを生じなかった。全てにおいてこれは、アッセイがＸＩＸ型コラーゲンのＳＨＡＨＱＲＴＧＧＮ（配列番号１）エピトープに特異的であることを示している。
【0047】
ＰＲＯ－Ｃ１９アッセイの技術的妥当性が、表１に要約されている。希釈の直線性と平行性とは、血清試料が１：４に希釈された時点で許容範囲であり、その後、平均希釈回収率は１０１．７％であった（図２）。血清中のマトリクス精度は許容範囲内であり、１：４の最終希釈でヒト血清試料にスパイクされた標準ペプチドを用いて、平均スパイク回収率が１１８．６％であった。ヘモグロビン、脂質、ビオチンを含め、一般的な干渉剤の影響は観測されなかった。アッセイ間変動は、１０．９％、アッセイ内変動は６．６％であった。測定範囲は、３．３１～２１４．３ｎｇ／ｍｌ、検出限界は１．２３～４４３．５ｎｇ／ｍｌと決定した。分析物の安定性は、４℃で２４時間まで、２０℃で４時間まで許容範囲であった。凍結融解安定性は、４回を上回る凍結融解サイクルで許容範囲内であった。
【0048】
がんの状況でのＰＲＯ－Ｃ１９の有用性を調査するために、ＰＲＯ－Ｃ１９を、１２通りの乳がん試料、７通りの結腸がん、９通りの胃がん、６通りのメラノーマ、１１通りのＮＳＣＬＣ、８通りの卵巣がん、２通りの膵臓がん、１３通りの前立腺がん、７通りのＳＣＬＣのみならず、３８通りの健康な対照を含む様々ながん種からなるコホートにおいて評価した（表２）。がんの群では、ＰＲＯ－Ｃ１９レベルと年齢、ＢＭＩ、または喫煙歴との間に有意な関連は見られなかった。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは、ＮＳＣＬＣ（ｐ＜０．０００１）、ＳＣＬＣ（ｐ＝０．００８１）、乳房（ｐ＝０．０００５）、卵巣（ｐ＜０．０００１）のがんで有意に上昇していた（図３）。結腸と膵臓のがんの群でも、有意ではなかったものの、健康な対照と比較して平均ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは高く、胃がんでは低かった。カットオフ値を６３．３ｎｇ／ｍｌとして、ＰＲＯ－Ｃ１９は、健康者とＮＳＣＬＣを０．９９５のＡＵＲＯＣで識別できる可能性があり、対応する感度は１００％、特異度は９４．７４％である（表５）。ＰＲＯ－Ｃ１９はまた、健康者とＳＣＬＣを５４．３ｎｇ／ｍｌのカットオフ値のところで０．８０８のＡＵＲＯＣで識別できる可能性があり、対応する感度は７１．４％、特異度は８４．２％である。ＰＲＯ－Ｃ１９はまた、健康者と乳がんを４１．８５ｎｇ／ｍｌのカットオフ値のところで０．８１４のＡＵＲＯＣで識別できる可能性があり、対応する感度は７５％、特異度は７８．９％である。最後に、ＰＲＯ－Ｃ１９はまた、健康者と卵巣がんを６０．３１ｎｇ／ｍｌのカットオフ値のところで０．８３９のＡＵＲＯＣで識別できる可能性があり、対応する感度は７５％、特異度は９２．１％である。全体として、ＸＩＸ型コラーゲンの循環血中レベルは、いくつかの異なるがん種で上昇しているように見える。次いで、ＮＳＣＬＣにおけるＰＲＯ－Ｃ１９の役割について調査した。
【0049】
ステージＩＩＩの患者２０人とステージＩＶの患者２０人のみならず、健康な対照２４人を含むＮＳＣＬＣ患者のコホートにおいて、ＰＲＯ－Ｃ１９を評価した（表３）。対照群は、ＮＳＣＬＣ群と比較して、有意に若く、男性の割合が少なく、白人の割合が少なかった。ＮＳＣＬＣ群それ自体の内部では、ＰＲＯ－Ｃ１９レベルと試料採取日、性別、年齢、ＢＭＩ、喫煙歴、腫瘍グレード、または組織学的サブタイプ（ＡＣおよびＳＣＣ）との間に有意な関連性は見られなかった。平均ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは、ＮＳＣＬＣ群の場合には、対照と比較して最高３．５倍まで有意に上昇した（ｐ＜０．０００１）（図４）。５５．６ｎｇ／ｍｌのカットオフ値のところで、ＰＲＯ－Ｃ１９は、健康者とＮＳＣＬＣを０．９８０のＡＵＲＯＣで識別できる可能性があり、対応する感度は９７．５％、特異度は９１．６７％である（表５）。ステージＩＩＩとＩＶに分けると、各ステージのＰＲＯ－Ｃ１９レベルもまた、健康な対照と比較して有意に上昇した（ｐ＜０．０００１）（図５）。これらの結果から、ＮＳＣＬＣ患者の循環血中でＰＲＯ－Ｃ１９レベルが上昇することが確証される。
【0050】
次に、ＮＳＣＬＣのさらに早期におけるＰＲＯ－Ｃ１９の使用を調査した。この目的のために、１０人のステージＩ、１０人のステージＩＩ、９人のステージＩＩＩ、５人のステージＩＶのみならず、３０人の健康な対照を含むＮＳＣＬＣ患者の別個のコホートにおいてＰＲＯ－Ｃ１９を評価した（表４）。対照群は、ＮＳＣＬＣ群と比較して、有意に若く、白人の割合が少なかった。両群の間に性別の有意差はなかった。ＮＳＣＬＣ群の内部では、試料採取日、性別、年齢、ＢＭＩ、喫煙歴、腫瘍グレード、または組織学的サブタイプ（ＡＣまたはＳＣＣ）との間に有意な関連は見られなかった。平均ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは、対照と比較してＮＳＣＬＣでは最高２倍まで有意に上昇した（図６）。１１８．９ｎｇ／ｍｌのカットオフ値のところで、ＰＲＯ－Ｃ１９は、健康者とＮＳＣＬＣを０．８２３のＡＵＲＯＣで識別できる可能性があり、対応する感度は８２．４％、特異度は７６．７％である（表５）。個々のステージを健康な対照と比較すると、ＰＲＯ－Ｃ１９はまた、健康な対照と比較して、ステージＩＩ（ｐ＝０．００１１）、ステージＩＩＩ（ｐ＝０．００１２）、およびステージＩＶ（ｐ＝０．００４１）においても有意に上昇していた（図７）。ステージが上がるほど、平均ＰＲＯ－Ｃ１９レベルが高くなる傾向が見られた。ＮＳＣＬＣの早期発見マーカーとしてのＰＲＯ－Ｃ１９を評価するために、ステージＩ＋ＩＩに対する診断精度を評価した。ＰＲＯ－Ｃ１９は、健康者とステージＩ＋ＩＩのＮＳＣＬＣを１１８．９のカットオフ値のところで０．７６２のＡＵＲＯＣで識別できる可能性があり、対応する感度は７０．０％、特異度は７６．７％である（表５）。９６．７％というさらに高い特異度では、感度は３５％に低下した。
【0051】
最後に、２０人の膵臓がん患者、大腸がん（ＣＲＣ）、腎臓がん、胃がん、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、肺がん、メラノーマ、頭頸部（Ｈ＆Ｎ）がん、前立腺がん、そして最後に３人の肝臓がんの患者のみならず、３３人の健康な対照を含む別個のがんコホートにおいてＰＲＯ－Ｃ１９を評価した（表６）。がんと健康な対照の間で、年齢や性別による有意差は見られなかった。
【0052】
しかし、がんの試料は白人患者からのみであったのに対し、健康な対照は白人、黒人、ヒスパニック系の民族が混在していた。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルと試料採取日、性別、年齢、またはＢＭＩとの間に有意な関連は見られなかった。平均ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは、対照と比較して、全てのがんにおいて有意に上昇していた（図８）。ＰＲＯ－Ｃ１９は概して、全てのがん種において健康者とがんとの間の識別に優れていた。これは、表７にまとめられている。
【0053】
考察
本研究は、ＰＲＯ－Ｃ１９と名付けられたＸＩＸ型コラーゲンのＣ末端を測定するＥＬＩＳＡの技術的妥当性を実証するものである。ＰＲＯ－Ｃ１９は、意図したエピトープに対して特異的であり、技術的に強固であった。ＰＲＯ－Ｃ１９は、生物学的関連性とバイオマーカーとしての可能性とを実証するために、健康な個人とがん患者からの血清試料のパネルで評価された。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは、いくつかのタイプのがんで有意に上昇し、ＮＳＣＬＣと健康な個人の間の識別に優れていることの証明となり、ＮＳＣＬＣの早期において中程度の診断精度を示した。
本研究は、ＰＲＯ－Ｃ１９と名付けられたＸＩＸ型コラーゲンのＣ末端を測定するＥＬＩＳＡの技術的妥当性を実証するものである。ＰＲＯ－Ｃ１９は、意図したエピトープに対して特異的であり、技術的に強固であった。ＰＲＯ－Ｃ１９は、生物学的関連性とバイオマーカーとしての可能性とを実証するために、健康な個人とがん患者からの血清試料のパネルで評価された。ＰＲＯ－Ｃ１９レベルは、いくつかのタイプのがんで有意に上昇し、ＮＳＣＬＣと健康な個人の間の識別に優れていることの証明となり、ＮＳＣＬＣの早期において中程度の診断精度を示した。
【0054】
成人では、臍帯組織の乾燥重量の１０－６％という割合を占めるＸＩＸ型コラーゲンに例示されるとおり、ＸＩＸ型コラーゲンの発現は非常に限定的である可能性がある（非特許文献２５）。しかし、異なる組織抽出物や生物学的流体中のＸＩＸ型コラーゲンを定量する別個の研究により、循環血中で検出可能であることがわかった（非特許文献２６）。このデータから、ＸＩＸ型コラーゲンは健康な成人の循環血中に中程度の量で放出され、循環するＸＩＸ型コラーゲンレベルは、一部のがん種において著しく増加する。ＸＩＸ型コラーゲンはこれまで、乳がんの進行と関連付けられてきた。この状況では、乳房腫瘍の周囲のＢＭＺががんの進行中に破壊されるにつれ、ＸＩＸ型コラーゲンタンパク質の染色性も失われていた（非特許文献１３）。ＸＩＸ型コラーゲンの発現は、一般にＢＭＺと強く関連しており、乳房の上皮および血管のＢＭＺが破壊されることで、ＸＩＸ型コラーゲンが循環血中に放出される可能性がある。このデータから、循環するＸＩＸ型コラーゲンのレベルの増加は、乳がんとも関連付けられる。例えば、異なる腫瘍種のＢＭＺの組織化に明確な差がある可能性がある。上皮ＢＭＺは、乳房の浸潤癌の周囲で破壊される一方、結腸、前立腺、および肺の上皮悪性腫瘍では浸潤腺の周囲で無傷のままである（非特許文献１３，２７）。ＸＩＸ型コラーゲンの定量に対するこの手法の限界は、腫瘍が見つかる組織が要因である可能性が高いものの、その起源組織を決定することができないことである。
【0055】
ＸＩＸ型コラーゲンはまた、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）やパーキンソン病を含む神経変性疾患にも関連付けられる。パーキンソン病患者の末梢血では、ＸＩＸ型コラーゲンの発現が低下している（非特許文献３５）。対照的に、ＡＬＳでは、ＸＩＸ型コラーゲンは、疾患の進行とともに増加し、死亡リスクを増加させる（非特許文献１８，３６，３７）。したがって、ＰＲＯ－Ｃ１９アッセイは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）やパーキンソン病を含む神経変性疾患の検出と診断にも使用できる可能性がある。
【0056】
肺がんに関連するＸＩＸ型コラーゲンの存在は、これまで実証されていない。それは、マウス胚の肺に中程度の量で観察されている一方で、成体では微量しか見られず、これは、肺におけるＸＩＸ型コラーゲンの発達上の役割を示唆している可能性がある（非特許文献１１）。このような発現パターンは、がんの進行に重要ないくつかのタンパク質や経路で見られ、そして実際、ＥＭＴ２８－３０を含め、発達過程のいくつかの側面が腫瘍形成中に再活性化される。よって、発達における役割は、がんにおける役割も示唆している可能性がある。
【0057】
抗腫瘍性はＸＩＸ型コラーゲンによるものとされている。興味深いことに、ＮＣ１ドメインは、一度切断されると、メラノーマにおいて浸潤と血管新生を阻害することができる（非特許文献２２）。これは、インビボマウスモデルで、ＮＣ１（ＸＩＸ）ペプチドが腫瘍成長を阻害し、ＭＭＰ－１４およびＶＥＧＦ阻害による血管新生を阻害したとして実証された（非特許文献２０）。その後、ＮＣ１（ＸＩＸ）シグナル伝達が、αｖβ３インテグリンによって媒介される可能性が高いことが発見された（非特許文献３１）。別個の研究では、ＮＣ１（ＸＩＸ）ペプチドが、α５β１インテグリンを通して抑制性神経終末の形成を促進することが実証された（非特許文献２３）。これらのインテグリン受容体は、上皮および内皮の肺細胞によって発現し、ＮＳＣＬＣにおける役割を果たしているので、肺がんにおけるＮＣ１（ＸＩＸ）ペプチドの効果を見ることは興味深い可能性がある（非特許文献３２～３４）。
【0058】
ＰＲＯ－Ｃ１９アッセイは、プラスミン切断とそれに続くＮＣ１ドメインの放出のさいに生成されるネオエピトープに対して特異的でない。しかし、Ｃ末端エピトープを含有するあらゆるフラグメントを定量することができる。ＸＩＸ型コラーゲンがどのように切断されるのか、そうでなければどのように処理されるのかについての知識が欠けているので、ＰＲＯ－Ｃ１９は仮説の上では、すべてＣ末端エピトープを含有するＸＩＸ型コラーゲンフラグメントの大規模で多様な集団を測定できる可能がある。ＸＩＸ型コラーゲンがどのように処理されるのか、そしていずれのフラグメントも循環血中に定量できるのかどうかについてのさらなる調査が必要である。プラスミン切断時に生成されるネオエピトープに特異的な別個のアッセイが、この点で役立つ可能性がある。
【0059】
診断精度に関して、ＰＲＯ－Ｃ１９は、ＮＳＣＬＣ患者のステージＩとＩＩにおいてはそれほどの性能ではなかった。試料サイズが小さいことを考えると、比較的広い信頼区間に、悪い診断能に対応する０．６２から良い診断能に対応する０．８７にわたるＡＵＣ値が含まれていた。ＰＲＯ－Ｃ１９の診断精度の妥当性を確かめ特定するフォローアップ研究が必要である。加えて、診断検査が通常最も適切である９５％以上の高い特異度では、早期ＮＳＣＬＣにおけるＰＲＯ－Ｃ１９の感度は３５％まで低下した。今後の研究で、ＰＲＯ－Ｃ１９を他のＮＳＣＬＣバイオマーカーと組み合わせて全体的な精度を向上させることを検討することも望まれる。さらに、早期発見に関する今後の研究で、最終的なＮＳＣＬＣ診断の前に、高リスクの個人におけるＰＲＯ－Ｃ１９を評価することも可能である。
【0060】
本研究にはいくつかの大きな限界がある。すなわち、本研究の厳密に調査目的の性質を考えると、いわゆる「便宜的試料（ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ）」の使用とポストホック分析によって偏りが持ち込まれ得る。数字の上で、この偏りは、比較された群の試料サイズ、年齢、性別、民族性の差によって証明されている。また、研究参加者の臨床データも限られているため、さらに隠れた偏りが生じる可能性もある。したがって、この研究の結果と結論は、がんにおけるＸＩＸ型コラーゲンの生物学を探る我々の最初の試みに過ぎない。
【0061】
結論として、ＰＲＯ－Ｃ１９と命名された、ＸＩＸ型コラーゲンのＣ末端を標的とするＥＬＩＳＡが開発されその妥当性が確かめられた。ＰＲＯ－Ｃ１９は、がん患者の血清中のＸＩＸ型コラーゲンを定量するのに使用され、ＸＩＸ型コラーゲンは、健康な対照と比較して、調査された全てのがん種で有意に上昇していた。続いて、２つの別個のＮＳＣＬＣコホートにおいてＰＲＯ－Ｃ１９が評価され、この場合でもＰＲＯ－Ｃ１９は有意に上昇し、早期ＮＳＣＬＣにおいて中程度の診断精度を示した。ＰＲＯ－Ｃ１９とＸＩＸ型コラーゲンは、がんのバイオマーカーとしての可能性を示している。
【0062】
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】