特表2023-518519マイクロエマルションに基づくワクチン送達システム、その製造方法及び使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-01
(54)【発明の名称】マイクロエマルションに基づくワクチン送達システム、その製造方法及び使用
(51)【国際特許分類】
A61K 9/107 20060101AFI20230424BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20230424BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230424BHJP
A61K 39/118 20060101ALI20230424BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20230424BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230424BHJP
【ＦＩ】
A61K9/107
A61K47/02
A61K39/00 H
A61K39/00 J
A61K39/00 Z
A61K39/118
A61K39/12
A61P37/04
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022557987
(86)(22)【出願日】2021-04-12
(85)【翻訳文提出日】2022-09-22
(86)【国際出願番号】 CN2021086642
(87)【国際公開番号】W WO2021208860
(87)【国際公開日】2021-10-21
(31)【優先権主張番号】202010283350.9
(32)【優先日】2020-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507389842
【氏名又は名称】四川大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】孫 遜
(72)【発明者】
【氏名】陳 正軍
(72)【発明者】
【氏名】▲ゴン▼ 濤
(72)【発明者】
【氏名】張 志榮
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C076AA17
4C076AA95
4C076CC07
4C076DD01F
4C076DD02F
4C076DD07F
4C076DD12F
4C076DD16F
4C076DD21
4C076DD26
4C076DD30
4C076FF16
4C076FF36
4C076GG41
4C085AA03
4C085BA45
4C085BA46
4C085BA47
4C085BA48
4C085BA51
4C085CC01
4C085CC07
4C085CC08
4C085CC21
4C085EE01
(57)【要約】
マイクロエマルションに基づくワクチン送達システム、その製造方法及び使用を提供する。マイクロエマルションは、一連の金属イオン化合物を吸着させ、製造の過程で抗原を加えることにより、抗原封入を達成し、安定なワクチン製剤を得ることができる。製造されたワクチンは、抗原提示細胞に効率よく取り込まれ、リンパ節に効率よく送達され、抗原特異的免疫反応を誘導することができ、幅広い使用が有望である。
【選択図】図８ａ
【選択図】図８ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムであって、前記マイクロエマルションは、水相、油相、乳化剤、金属イオン化合物、及び抗原を含み、
前記金属イオン化合物は、マイクロエマルションの表面に吸着されていると同時に、抗原を封入し、前記マイクロエマルションのｐＨは４．０～１０．０の間であり、
前記マイクロエマルションの油相及び乳化剤は、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基、硫酸基、亜硫酸基、フェノール性水酸基、エノール基、ホウ酸基の１種又は複数種を含有し、これらの一部又は全部がイオン化してアニオンを発生させ、
金属イオン化合物は、金属カチオンを含有し、当該金属カチオンは、マイクロエマルションの表面のアニオンと反応してマイクロエマルションの表面に付着する、ことを特徴とするマイクロエマルションに基づくワクチン送達システム。
【請求項2】
各成分の重量部が、油相０．０１％～５０％、乳化剤０．００１％～１０％、前記金属イオン化合物０．０００１％～１％、前記抗原０．０００１％～１％である、ことを特徴とする請求項１に記載のマイクロエマルションに基づくワクチン送達システム。
【請求項3】
前記金属イオン化合物中の金属イオンが、アルミニウム、鉄、ジルコニウム、カルシウム、マンガン、カドミウム、マグネシウム、セリウム、カドミウム、コバルト、ガリウム又は亜鉛から選択される１種又は複数種であり、前記金属イオン化合物は無機塩又は有機複合体の形態である、ことを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載のマイクロエマルションに基づくワクチン送達システム。
【請求項4】
前記金属イオン化合物は、水酸化アルミニウム、水酸化鉄、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム又は水酸化亜鉛の１種又は複数種である、ことを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載のマイクロエマルションに基づくワクチン送達システム。
【請求項5】
前記油相は、化粧品的又は薬学的に許容されるいずれかの油である、ことを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載のマイクロエマルションに基づくワクチン送達システム。
【請求項6】
前記乳化剤は、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤から選択される１種又は１種以上の組み合わせである、ことを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載のマイクロエマルションに基づくワクチン送達システム。
【請求項7】
前記マイクロエマルション粒子径が１０００ｎｍ未満である、ことを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載のマイクロエマルションに基づくワクチン送達システム。
【請求項8】
前記マイクロエマルション粒子径が３００ｎｍ未満である、ことを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載のマイクロエマルションに基づくワクチン送達システム。
【請求項9】
前記マイクロエマルション粒子径が２００ｎｍ未満である、ことを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載のマイクロエマルションに基づくワクチン送達システム。
【請求項10】
前記マイクロエマルションは、防腐剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、有機溶媒、キレート剤、酸化防止剤、充填剤、着色剤の１種又は複数種を含む添加剤をさらに含有する、ことを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載のマイクロエマルションに基づくワクチン送達システム。
【請求項11】
前記抗原は、タンパク質、ポリペプチド、核酸、オリゴ糖、多糖、腫瘍細胞溶解物、腫瘍細胞膜小胞抗原、細菌溶解物、細菌細胞膜、マイコプラズマ細胞膜、クラミジア細胞壁、スピロヘータ、リケッチア微小莢膜、ウイルスエンベロープ、エクソソーム、ウイルス溶解液抗原、細菌外膜小胞抗原から選択される１種又は１種以上の組み合わせである、ことを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載のマイクロエマルションに基づくワクチン送達システム。
【請求項12】
親油性乳化剤を油相に溶解し、親水性乳化剤を水相に溶解し、両者を十分に混合してマイクロエマルションを形成するステップ（１）と、前記マイクロエマルションにｐＨ緩衝液及び／又は金属イオン化合物のアニオン部分を加えるステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた混合物に、金属イオン化合物のカチオン部分を加えるステップ（３）と、
ステップ（２）又はステップ（３）で得られた混合物に抗原を加えて、均一に混合すると完成するステップ（４）とを含む、ことを特徴とする請求項１～１１のいずれか１項に記載のマイクロエマルションに基づくワクチン送達システムの製造方法。
【請求項13】
親油性乳化剤を油相に溶解し、親水性乳化剤を水相に溶解し、両者を十分に混合してマイクロエマルションを形成するステップ（１）と、前記マイクロエマルションに金属イオン化合物のカチオン部分を加えるステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた混合物に、ｐＨ緩衝液及び／又は金属イオン化合物のアニオン部分を加えるステップ（３）と、
ステップ（２）又はステップ（３）で得られた混合物に抗原を加えて、均一に混合すると完成するステップ（４）とを含む、ことを特徴とする請求項１～１１のいずれか１項に記載のマイクロエマルションに基づくワクチン送達システムの製造方法。
【請求項14】
請求項１～１１のいずれか１項に記載のマイクロエマルションに基づくワクチン送達システム、又は請求項１２～１３のいずれか１項に記載の製造方法によって製造されるワクチン送達システムの、予防的及び／又は治療的免疫薬の製造での適用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システム及びその製造方法に関し、医薬技術の分野に属する。
【0002】
＜関連出願の相互参照＞
本開示は、２０２０年４月１３日に中国特許庁に提出された、出願番号が２０２０１０２８３３５０．９、名称が「マイクロエマルションに基づくワクチン送達システム、その製造方法及び使用」である中国特許出願の優先権を主張しており、その全内容は引用によって本開示に組み込まれている。
本開示は、２０２０年４月１３日に中国特許庁に提出された、出願番号が２０２０１０２８３３５０．９、名称が「マイクロエマルションに基づくワクチン送達システム、その製造方法及び使用」である中国特許出願の優先権を主張しており、その全内容は引用によって本開示に組み込まれている。
【背景技術】
【0003】
ワクチン接種は現代医学の最も偉大な発明の一つであり、多くの疾患を予防、根絶するのに有効な手段でもあり、多くの感染性疾患の抑制に用いられている。ワクチン発展の３つの重要な方向には、新規抗原の発見、新規アジュバント技術及び新規ベクタープラットフォームが含まれる。
【0004】
従来の弱毒化生ワクチン及び不活化ワクチンは、本質的に自然アジュバント成分を含むことがあり、その中には、粒子形態のタンパク質、脂質及びオリゴヌクレオチドが含まれることがある。しかし、これらの弱毒化ワクチン及び不活化ワクチン自体のいくつかの制限性、例えば弱毒化された病原微生物が病原性の強い微生物に突然変異したり、不活化ワクチンは製造中に完全に不活化されていなかったりする場合、これらのワクチンが生体に作用すると、生体の発症を直接引き起こす恐れがある。サブユニットワクチンとは、化学分解、組換え発現などの手段により、病原微生物の免疫活性を持つ断片を抽出して製造されたワクチンを指す。不活化ワクチン及び弱毒化生ワクチンに対し、サブユニットワクチンは安全性がより高く、安定性がより良く、量産が可能であるなどの優位性を持ち、現代のワクチンの開発及び使用の主なトレンドとなっている。しかし、サブユニットワクチンにも免疫原性が弱く、保護作用の時間が短く、効果が遅いなどの欠点があり、サブユニットワクチンのこれらの欠点を補うため、サブユニットワクチンにはアジュバントが広く使用されている。ワクチン送達ベクターを使用することにより、免疫応答レベルを向上させ、ワクチン製剤の安定性を向上させることができる。過去１０年間、リポソーム、ＩＳＣＯＭＳ、ポリマー、及び分解可能なナノスフェア、ナノ粒子などのナノサイズ（１０００ｎｍ未満）の材料は、ワクチン抗原の送達ベクターとして注目されており、このベクターは、ワクチン抗原を安定化し、抗原の分解を回避することができ、それ自体もアジュバント効果があり、体内での抗原の免疫応答レベルを向上させることができる。
【0005】
エマルジョンはヒト及び動物用ワクチンのアジュバントとして長い歴史がある。１９３５年にアメリカ系ハンガリー人細菌学者Ｆｒｅｕｎｄが研究したフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）は、鉱物油（パラフィン）とマイコバクテリウムとの組み合わせにアジュバント効果があることを初めて証明し、このアジュバントは「完全フロイントアジュバント」と呼ばれている。一方、細菌を含まない油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョン（不完全フロイントアジュバント）は、その後、獣医用ワクチンに使用される。不完全フロイントアジュバントのようなエマルジョンは、インフルエンザワクチンなど、ヒトでも使用されていたが、副作用を起こしやすい。鉱物油の代わりに分解可能な油相スクアレンを用いた水中油型エマルションＭＦ５９をアジュバント化したインフルエンザワクチンは１９９７年にＥＵで承認され、これまでに３０カ国以上で承認されている。現在、米国及び欧州で臨床使用が承認されているエマルジョン型アジュバントには、ＡＳ０３及びＡＦ０３も含まれている。
【0006】
金属イオン化合物類アジュバントは極めて広い用途を有しており、アルミニウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、鉄塩、及びジルコニウム塩が抗原吸着剤としてよく用いられている。アルミニウム塩アジュバントはワクチンで広く使用されているアジュバントであり、硫酸カリウムアルミニウム、リン酸アルミニウム及び水酸化アルミニウムなどを含み、このアジュバントは抗原を滞留させて徐放し、そして局部炎症反応を引き起こし、活性リンパ細胞を吸引し、免疫応答を増強し、また補体系を増強することができ、アルミニウムアジュバントは主に細胞免疫応答ではなく体液免疫応答を引き起こし、フランスでは、リン酸カルシウムアジュバントはすでに白百破、小児麻痺、ＢＣＧ苗、麻疹、黄熱病、Ｂ型肝炎、ＨＩＶの糖タンパク質などのワクチンの調製に用いられ、そのアジュバントの作用はアルミアジュバントと似ているかもしれないが、カルシウムは人体の天然構成成分であり、生体はそれに対して非常に高い耐性があり、水酸化鉄アジュバントは生体の体液免疫と細胞免疫反応の両方を増強することができ、そのため、将来、ワクチンの免疫アジュバントとして有望であり、水酸化亜鉛コロイド単独又はＡＴＰとの併用は狂犬病ウイルス抗原に対する免疫応答をある程度増強でき、また、亜鉛元素の毒性や副作用が極めて低いので、その開発や応用も極めて期待できる。
【0007】
ここでは、金属イオン化合物をマイクロエマルションの表面に吸着させたものは、比表面積を大幅に増加させ、表面反応性が高く、活性中心が多く、吸着能が高いなどの特性を持ち、同じ金属イオン化合物の含有量であれば、より多くの抗原を吸着させることができ、これにより、ワクチン送達用のナノレベルの粒子が製造される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的の１つは、金属イオン化合物、抗原及びマイクロエマルションから形成され、金属イオン化合物がマイクロエマルションに吸着されたワクチン送達システムを提供することである。本発明は、高圧均質化、超音波、高速撹拌などの方法でマイクロエマルションを製造し、エマルジョン表面に金属イオン化合物を吸着させ、さらに異なる抗原成分を加えてワクチンを製造する。本発明により製造されたワクチンは、抗原をリンパ節に輸送し、抗原提示細胞に効率よく取り込まれ、抗原特異的免疫反応を誘導することができる。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明では、ｐＨ値が４．０～１０．０である条件下で、エマルジョン中の油相及び乳化剤中に含まれるカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基、硫酸基、亜硫酸基、フェノール性水酸基、エノール基などの基の一部又は全部がイオン化してアニオンを発生させ、金属カチオンがマイクロエマルションの表面のアニオンと反応してマイクロエマルションの表面に付着し、金属カチオンがさらに金属イオン化合物のアニオン部分を吸着させることにより、金属イオン化合物が吸着されたマイクロエマルションを製造する。これにより、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化鉄、リン酸カルシウムなどの異なる種類の金属イオン化合物をマイクロエマルションの表面に吸着させることができる。金属イオン化合物が吸着されたマイクロエマルションは本来のマイクロエマルションの安定性に影響を与えず、分散性が良く、取り扱い易く、臨床での使用が容易である。
【0010】
「マイクロエマルション」という用語は、分散体と、液滴と、水不溶性油相が水相と混合されたときに、疎水性により非極性残基（すなわち、長い炭化水素鎖）が水から離れて、極性頭部基が水に向かうことによって形成される他の脂質構造とを含む。これらの脂質構造は、単層、オリゴ層及び多層脂質小胞、ミセル、及び層状構造を含むが、これらに限定されない。
【0011】
「金属イオン化合物」という用語は、当業者の一般的な理解では、金属のカチオンとアニオンからなる化合物を指す。本発明に記載の金属イオンは、アルミニウム、鉄、ジルコニウム、カルシウム、マンガン、カドミウム、マグネシウム、セリウム、カドミウム、コバルト、ガリウム又は亜鉛から選択される１種又は複数種であり、前記金属イオン化合物は無機塩又は有機複合体の形態であり、好ましくは、前記金属イオン化合物は、金属イオンの水酸化物又はリン酸化物であり、特に好ましくは、前記金属イオン化合物は水酸化アルミニウム、水酸化鉄、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、又は水酸化亜鉛の１種又は複数種である。
【0012】
「界面活性剤」という用語は、極性頭部基（エネルギー的に水溶媒和の傾向がある）と疎水性尾部（水溶媒和の程度が悪い）の両方を持つ分子を指す。「カチオン性界面活性剤」という用語は、カチオン性頭部基を有する界面活性剤を指す。「アニオン性界面活性剤」という用語は、アニオン性頭部基を有する界面活性剤を指す。「ノニオン性界面活性剤」という用語は、帯電していない頭部基を有する界面活性剤を指す。「両性イオン界面活性剤」とは、カチオン基とアニオン基の両方を有する界面活性剤を指す。
【0013】
「薬学的に許容される」という用語は、宿主（例えば、動物又はヒト）に投与した場合に、実質的に好ましくないアレルギー反応又は免疫反応を起こさない成分を指す。このような製剤は、薬学的に許容される任意の剤形を含む。このような薬学的に許容される剤形の例には、浸漬、噴霧、外用、注射、及び凍結乾燥剤形が含まれるが、これらに限定されない。
【0014】
前記マイクロエマルションにおいて、前記水相は、水（例えば、水、蒸留水、精製水、注射用水、脱イオン水、水道水）及び溶液（例えば、ＨＥＰＥＳ溶液）を含むがこれに限定されない任意のタイプの水相を含んでもよく、水相は、さらに無菌化され、熱原性を有しないようにしてもよい。好ましくは、前記水相は注射用水である。
【0015】
前記マイクロエマルションにおいて、前記油相は、化粧品的又は薬学的に許容される任意の油であってもよく、好ましくは、前記油相は、動物油、植物油、天然油、合成油、炭化水素油、シリコーンオイル、それらの半合成誘導体及びそれらの組み合わせから選択されてもよい。
【0016】
より好ましくは、前記マイクロエマルションに適用できる油としては、鉱物油、スクアレン油、Ｃ６～Ｃ３０脂肪、その芳香酸及びアルコール類、大豆油、中鎖トリグリセリド、エッセンシャルオイル、シリコーンオイル、精油、水不溶性ビタミン、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸セチル、ベヘン酸トリデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジオクチル、フタル酸メンチル、カプリル酸セチル、サリチル酸オクチル、ミリスチン酸イソプロピル、ネオペンチルグリコール二酢酸セチルアルコール、Ｃｅｒａｐｈｙｌｓ（登録商標）、オレイン酸デシル、アジピン酸ジイソプロピル、乳酸Ｃ１２～１５アルキル、乳酸セチル、乳酸ラウリル、ピバリン酸イソステアリル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸イソステアリル、ステアリン酸オクチル、炭化水素油、イソプレン、流動パラフィン、イソドデカン、ワセリン、アルガンオイル、菜種油、チリ（Ｃｈｉｌｅ）油、ヤシ油、コーン油、綿実油、亜麻仁油、ブドウ種子油、マスタード油、オリーブオイル、パーム油、パーム仁油、落花生油、松実油、ケシ油、カボチャ種子油、米ぬか油、ベニバナ油、ティーオイル、トリュフオイル、植物油、アーモンドオイル、ホホバオイル（ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ種子油）、グレープオイル、マカダミアナッツオイル、小麦胚芽油、アーモンドオイル、キャノーラ油、ペポカボチャオイル、大豆油、ごま油、ヘーゼルナッツ油、コーンオイル、ひまわりオイル、大麻油、ボア（Ｂｏｉｓ）油、ビターアーモンド核油、アボカド油、クルミ油、魚油、ベリー油、ピメンタリーフオイル、ジュニパーベリーオイル、シードオイル、アーモンドシードオイル、アニスシード油、セロリ種子油、クミンシード油、ナツメグ種子油、リーフオイル、バジルリーフオイル、ベイ油、桂皮葉油、セージ葉油、ユーカリ葉油、レモングラスオイル、カユプテ葉油、オレガノ葉油、パチョリ葉油、ペパーミント葉オイル、松葉油、ローズマリー葉油、スペアミント葉油、茶葉油、タイムオイル、ヒメコウジ葉油、フラワーオイル、カモミールオイル、セージオイル、クローブ油、ゼラニウム花油、ヒソップ花油、ジャスミン花油、ラベンダー花油、マヌカ花油、マーホラム（Ｍａｒｈｏｒａｍ）花油、オレンジ花油、バラ花油、イランイラン花油、樹皮油、桂皮油、シナモン樹皮油、サッサフラス樹皮油、木油、クスノキ木油、セダーウッド木油、シタン木油、ビャクダン木油、根茎（ショウガ）木油、樹脂油、オリバナム油、ミルラ油、果皮油、ベルガモット果皮油、グレープフルーツ果皮油、レモン果皮油、ライム果皮油、オレンジ果皮油、オレンジ果皮油、根茎油、吉草油、オレイン酸、リノール酸、イソステアリルアルコール、メチルフェニルポリシロキサン、シメチコン、ジメチルシロキサン、フェニルトリメチルシロキサン（又はその有機変性物）、ポリシロキサンのアルキル化誘導体、セチルジメチルシロキサン、ドデシルトリメチルシロキサン、ポリシロキサンのヒドロキシル化誘導体、揮発性シリコーンオイル、環状・線状シリコーンオイル、シクロメチルシリコーンオイル、シクロメチルシリコーンオイル、ヘキサメチルシクロトリシリコーンオイル、オクタメチルシクロテトラシリコーンオイル、デカメチルシクロペンタンシリコーンオイル、揮発性線状ジメチルシリコーンオイル、イソセタン、イソエイコサン、イソ四酢酸、ポリイソブチレン、イソオクタン、イソドデカン、テルペン、モノテルペン、セスキテルペン、カーマイン、アズレン、メントール、カンフル、重楼、チモール、ネロール、リナロール、リモネン、ゲラニオール、ペリリルアルコール、ネロール、ファルネオール、イランゲン、ビサボロール、ファルネセン、アスカリドール、ケノポジ油、シトロネラール、シトラール、シトロネロール、カマズレン、セイヨウノコギリソウ、グアイエン、カモミール、それらの半合成誘導体又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【0017】
特に好ましくは、前記油相はスクアレン、大豆油、中鎖トリグリセリド、オレイン酸の１種又は１種以上の組み合わせである。
【0018】
本発明のマイクロエマルションに基づくワクチン送達システムにおける界面活性剤は、薬学的に許容されるイオン界面活性剤、薬学的に許容されるノニオン界面活性剤、薬学的に許容されるカチオン界面活性剤、薬学的に許容されるアニオン界面活性剤、又は薬学的に許容される両性界面活性剤であってもよい。界面活性剤の例示的な使用については、『Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ』を参照すればよい。（Ｔｈａｒｗａｔ Ｆ． Ｔａｄｒｏｓ， Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ ８ ２００５ ＷＩＬＥＹ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧａＡ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ＩＳＢＮ： ３－５２７－３０６２９－３）は特に引用により組み込まれている。
【0019】
また、界面活性剤は、薬学的に許容されるイオン重合性界面活性剤、薬学的に許容されるノニオン重合性界面活性剤、薬学的に許容されるカチオン重合性界面活性剤、薬学的に許容されるアニオン重合性界面活性剤、又は薬学的に許容される両性イオン重合性界面活性剤であってもよい。重合性界面活性剤の例としては、複数（少なくとも１つ）のポリエチレングリコール（ＰＥＯ）側鎖を有するポリ（メチルメタクリレート）主鎖のグラフト共重合体、ポリヒドロキシステアリン酸、アルコキシ化アルキルフェノールホルムアルデヒド縮合物、脂肪酸を有するポリアルキレンエチレングリコール変性ポリエステル、ポリエステル、それらの半合成誘導体、又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【0020】
界面活性成分又は界面活性剤は、非極性疎水性部分（通常直鎖又は分岐鎖炭化水素化合物又は８～１８個の炭素原子を含むフルオロカーボン鎖）からなる両親媒性分子であり、極性又はイオン性の親水性部分に付着した。親水性部分は、ノニオン性、イオン性又は両性イオン性であってもよい。水環境では、炭化水素鎖と水分子との相互作用は弱く、極性又はイオンの頭部基は双極子又はイオン双極子相互作用により水分子との相互作用が強い。界面活性剤は、親水基の性質により、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤、重合体界面活性剤に分けられる。
【0021】
好ましくは、前記マイクロエマルション中の好適な界面活性剤としては、エトキシ化ノニルフェノール、エトキシ化ウンデカノール、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ソルビタン脂肪酸エステル類（スパン類）、エトキシル化硬化ヒマシ油、ラウリル硫酸ナトリウム、エトキシ・プロポキシジブロック共重合体、エチレンオキシド－プロピレンオキシドブロック共重合体、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドに基づく４官能ブロック共重合体、モノグリセリド、カプロン酸グリセリド、カプリル酸グリセリド、コカ酸グリセリル、エルカ酸グリセリド、ヒドロキシエステルグリセリド、イソステアリン酸グリセリド、バニリン酸グリセリド、ラウリン酸グリセリド、リノール酸グリセリド、ミリスチン酸グリセリド、オレイン酸グリセリド、ＰＡＢＡグリセリド、パルミチン酸グリセリド、リシノール酸グリセリド、ステアリン酸グリセリド、チオグリコール酸グリセリド、ジラウリン酸グリセリド、ジオレイン酸グリセリド、ミリスチン酸グリセリド、グリセリンテトラオレイン酸エステル、ステアリン酸グリセリド、グリセリルステアリン酸エステル、ジラウリン酸ジグリセリド、ジオレイン酸ジグリセリド、ジアシルグリセロール、グリセリン酸ジグリセリド、テトラオレイン酸グリセリド、ステアリン酸グリセリド、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチシン、ステロイド、コレステロール、β－ステロール、ビスフェノールアルコール、アルコール脂肪酸エステル、ミリスチン酸イソプロピル、脂肪酸イソプロピル、ｎ－酪酸イソプロピル、ヘキサン酸イソプロピル、ｎ－カプリン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オクチルドデシルミリスチン酸エステル、アルコキシル化アルコール、アルコキシル化酸、アルコキシ化アミド、アルコキシ化糖誘導体、天然油及びワックスのアルコキシル化誘導体、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体、ノニルオキシアルコール－１４、ＰＥＧ－８ラウリン酸エステル、ＰＥＧ－６コカミド、ＰＥＧ－２０メチルグルコースセスキラクトビオン酸エステル、ＰＥＧ－４０ラノリン、ＰＥＧ－４０ヒマシ油、ＰＥＧ－４０硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、ジグリセリド、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチシン、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ジラウリン酸グリセリド、ジステアリン酸グリセリド、ラウリン酸グリセリド、ミリスチン酸グリセリド、ジラウリン酸グリセリド、それらの半合成誘導体及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【0022】
その中で、前記ノニオン性界面活性剤は、ポロキサマー、ポリエチレングリコールコレステロール、ポリエチレングリコールポリ乳酸（ＰＥＧ－ＰＬＡ）、ポリエチレングリコールポリヒドロキシ酢酸（ＰＥＧ－ＰＬＧ）、ポリエチレングリコールポリ乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体（ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコールビタミンＥコハク酸エステル（ＴＰＧＳ）、ポリエチレングリコール６６０－１２－ヒドロキシステアリン酸エステル（ＨＳ－１５）、ポリオキシエチレン－８－カプリル酸／カプリン酸グリセリド（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、ポリエチレングリコール－ジステアロイルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、エチレングリコールモノエチルエーテル（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、エトキシル化界面活性剤、エトキシル化アルコール、エトキシ化アルキルフェノール、エトキシル化脂肪酸、エトキシル化モノアルコールアミド、エトキシル化ソルビトールエステル、エトキシル化脂肪族アミン、エチレンオキシド－プロピレンオキシド共重合体、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾリルカルボニル］）、ノニルオキシアルコール－９、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾリルカルボニル］）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）５６、Ｂｒｉｊ（登録商標）７２、Ｂｒｉｊ（登録商標）７６、Ｂｒｉｊ（登録商標）９２Ｖ、Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８Ｐ、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ、デカンジオールモノドデシルエーテル、Ｎ－デカノイル－Ｎ－メチルグルコサミン、Ｎ－デカノイル－α－Ｄ－ピラノシド、デシルβ－Ｄ－マルトピラノシド、Ｎ－ドデシル－Ｎ－メチルグルコサミド、Ｎ－ドデシルα－Ｄ－マルトシド、ｎ－ドデシルβ－Ｄ－マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、ｎ－セチルβ－Ｄ－マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノステアリルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノステアリルエーテルモノテトラデシルエーテル、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０、メチル－６－Ｏ－（Ｎ－ヘプチルアミノ）－α－Ｄ－グルコピラノシド、非エチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチルグルコサミン、Ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチルグルコサミン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクチルエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクチルエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチルβ－Ｄ－ピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノセチルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリコールエーテルＷ－１、ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン１００ステアリン酸エステル、ポリオキシエチレン２０イソセチルエーテル、ポリオキシエチレン２０オレイン酸エーテル、ポリオキシエチレン４０ステアリン酸エステル、ポリオキシエチレン５０ステアリン酸エステル、ポリオキシエチレン８ステアリン酸エステル、ポリオキシエチレンビス（イミダゾリルカルボニル）、ポリオキシエチレン２５－プロパンジオールステアリン酸エステル、キラヤ樹皮からのサポニン、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）４０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）６５、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、Ｓｐａｎ（登録商標）８５、１５－Ｓ－１２型Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、１５－Ｓ－３０型Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、１５－Ｓ－５型Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、１５－Ｓ－７型Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、１５－Ｓ－９型Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、ＮＰ－１０型Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、ＮＰ－４型Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、ＮＰ－４０型Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、ＮＰ－７型Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、ＮＰ－９型Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、ＴＭＮ－１０型Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、ＴＭＮ－６型Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、テトラデシルβ－Ｄ－マルトシド、テトラエチレングリコールモノデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、トリエチレングリコールモノデシルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、トリエチレングリコールモノオクチルエーテル、トリエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ－２１、Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ－３２、Ｔｒｉｔｏｎ ＤＦ－１２、Ｔｒｉｔｏｎ ＤＦ－１６、Ｔｒｉｔｏｎ ＧＲ－５Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ ＱＳ－１５、Ｔｒｉｔｏｎ ＱＳ－４４、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１０２、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１５１、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－２００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－２０７、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１６５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－３０５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－４０５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－４５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－７０５－７０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２１、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６１、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６５、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８１、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５、Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ、ｎ－ウンデシルβ－Ｄ－ピラノシド、それらの半合成誘導体又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0023】
前記カチオン界面活性剤は、４級アンモニウム化合物、塩化アルキルトリメチルアンモニウム化合物、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム化合物、カチオン性ハロゲン含有化合物、例えば塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルセチルアンモニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化ベンジルドデシルジメチルアンモニウム、ベンジルトリメチルアンモニウムテトラクロロヨーデート、臭化ジメチルオクタデシルアンモニウム、臭化ドデシルジメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルジメチルアンモニウム、ギラード試薬Ｔ、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ポリオキシエチレン（１０）－Ｎ－タロウ－１，３－ジアミノプロパン、臭化トンゾニウム、臭化トリメチル（テトラデシル）アンモニウム、１，３，５－トリアジン－１，３，５（２Ｈ，４Ｈ，６Ｈ）－トリエタノールアミン、１－デカナミニウム、Ｎ－デシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－クロライド、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化２－（２－（ｐ－（ジイソブチル）メトキシ）エトキシ）エチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化２－（２－（ｐ－（ジイソブチル）フェノキシ）エトキシ）エチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキル１又は３ベンジル－１－（２－ヒドロキシエチル）－２－イミダゾリン、塩化アルキルビス（２－ヒドロキシエチル）ベンジルアンモニウム、塩化アルキルデメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチル３，４－ジクロロベンジルアンモニウム（１００％Ｃ１２）、塩化アルキルジメチル３，４－ジクロロベンジルアンモニウム（５０％Ｃ１４、４０％Ｃ１２、１０％Ｃ１６）、塩化アルキルジメチル３，４－ジクロロベンジルアンモニウム（５５％Ｃ１４、２３％Ｃ１２、２０％Ｃ１６）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（１００％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（１００％Ｃ１６）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（４１％Ｃ１４、２８％Ｃ１２）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（４７％Ｃ１２、１８％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（５５％Ｃ１６、２０％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（５８％Ｃ１４、２８％Ｃ１６）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（６０％Ｃ１４、２５％Ｃ１２）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（６１％Ｃ１１、２３％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（６１％Ｃ１２、２３％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（６５％Ｃ１２、２５％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（６７％Ｃ１２、２４％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（６７％Ｃ１２、２５％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（９０％Ｃ１４、５％Ｃ１２）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（９３％Ｃ１４、４％Ｃ１２）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（９５％Ｃ１６、５％Ｃ１８）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジデシルジメチルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（Ｃ１２～１６）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（Ｃ１２～１８）、塩化ジアルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、臭化アルキルジメチルエチルアンモニウム（９０％Ｃ１４、５％Ｃ１６、５％Ｃ１２）、臭化アルキルジメチルエチルアンモニウム（大豆脂肪酸中の混合アルキルとアルケニル油）、塩化アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム（６０％Ｃ１４）、塩化アルキルジメチルイソプロピルベンジルアンモニウム（５０％Ｃ１２、３０％Ｃ１４、１７％Ｃ１６、３％Ｃ１８）、塩化アルキルトリメチルアンモニウム（５８％Ｃ１８、４０％Ｃ１６、１％Ｃ１４、１％Ｃ１２）、塩化アルキルトリメチルアンモニウム（９０％Ｃ１８、１０％Ｃ１６）、塩化アルキルジメチル（エチルベンジル）アンモニウム（Ｃ１２～１８）、塩化ジ－（Ｃ８～１０）－アルキルジメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ジアルキルメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ジイソデシルジメチルアンモニウム、塩化ジイソオクチルジメチルアンモニウム、塩化水素ドデシルビス（２－ヒドロキシエチル）オクチルアンモニウム、塩化ドデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ドデシルカルバミルメチルジエチルベンジルアンモニウム、ヘプタアルキルヒドロキシエチルイミダゾリン塩化物、塩化ヘキサヒドロ－１，３，５－トリス（２－ヒドロキシエチル）－ｓ－トリアジン、ヘキサヒドロ－１，３，５－トリス（２－ヒドロキシエチル）－ｓ－トリアジン、塩化ミリスチルアンモニウム（及び）第４級アンモニウム塩１４、塩化Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ヒドロキシプロピルアンモニウム重合体、塩化Ｎ－テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム一水和物、塩化オクチルデシルジメチルアンモニウム、塩化オクチルドデシルジメチルアンモニウム、塩化オクチルフェノキシエトキシエチルジメチルベンジルアンモニウム、オキシジエチルビス（アルキルジメチルアンモニウムクロライド）第４級アンモニウム化合物、ジクロロアルキルジメチル塩化物、塩化トリメトキシシリルプロピルジメチルオクタデシルアンモニウム、トリメトキシシリル第４級アンモニウム塩、塩化トリメトキシドデシルベンジルアンモニウム、それらの半合成誘導体及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0024】
好適なアニオン界面活性剤は、カルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ホスファチジン酸、ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸ナトリウム塩、コール酸、ウシ又はヒツジの胆汁、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、デオキシコール酸メチル、ジゴキシン、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド、ラウリン酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、グリココール酸水和物、グリココール酸一水和物、硫酸３－グリココール酸二ナトリウム塩、グリココール酸エチル、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ－ラウロイルサルコシン溶液、Ｎ－ラウロイルサルコシン溶液、ドデシル硫酸リチウム、Ｌμｇｏｌ溶液、４型Ｎｉａｐｒｏｏｆ、１－オクタンスルホン酸ナトリウム、１－ブタンスルホン酸ナトリウム、１－デカンスルホン酸ナトリウム、１－デカンスルホン酸ナトリウム、１－ドデカンスルホン酸ナトリウム、１－ヘプタンスルホン酸ナトリウム無水物、１－ヘプタンスルホン酸ナトリウム無水物、１－ノナンスルホン酸ナトリウム、１－プロパンスルホン酸ナトリウム、２－ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム水和物、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ヘキサンスルホン酸ナトリウム無水物、オクチル硫酸ナトリウム、ペンタンスルホン酸ナトリウム無水物、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物、タウロコール酸３－硫酸塩二ナトリウム塩、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）ラウリル硫酸塩、ウルソデオキシコール酸、Ｃ６－Ｃ３０脂肪及びそれらの芳香酸の塩、それらの半合成誘導体及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0025】
前記両性界面活性剤は、Ｎ－アルキルベタイン、ドデシルアミノプロピルジメチルベタイン、アルキルジメチルグリシン塩、Ｎ－アルキルアミノプロピオン酸塩、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、３－（デシルジメチルアミノ）プロパンスルホン酸塩分子内塩、３－（ドデシルジメチルアミノ）プロパンスルホン酸塩分子内塩、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアミン）プロパンスルホン酸塩、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタデシルアミノ）プロパンスルホン酸塩、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルオクチルアミノ）プロパンスルホン酸塩分子内塩、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルパルミチルアミノ）プロパンスルホン酸塩、大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジルグリセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、それらの半合成誘導体及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。より好ましくは、前記乳化剤はトウェイン８０、ポリエチレングリコール－ジステアロイルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、卵黄レシチン、スパン８５の１種又は１種以上の組み合わせである。
【0026】
本発明の目的の１つは、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、前記マイクロエマルションの油相及び乳化剤中にカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基、硫酸基、亜硫酸基、フェノール性水酸基、エノール基、ホウ酸基の１種又は１種以上の組み合わせが含まれ、上記油相及び乳化剤は、Ｃ６～Ｃ３０脂肪及びそれらの芳香酸、オレイン酸、リノール酸、イソ四酢酸、チモール、ビスフェノールアルコール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤を含むが、これらに限定されないことを特徴とする。
【0027】
本発明の目的の１つは、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、前記マイクロエマルション粒子径が１０００ｎｍ未満、好ましくは３００ｎｍ未満、特に好ましくは２００ｎｍ未満である、ことを特徴とする。
【0028】
本発明の目的の１つは、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、前記マイクロエマルションのｐＨ値が４．０～１０．０の間、好ましくはｐＨ値が５．０～９．０の間、特に好ましくはｐＨ値が６．０～８．０の間である、ことを特徴とする。
【0029】
本発明のマイクロエマルションワクチンに使用するのに適した添加剤は、１種又は複数種の溶媒、例えば薬学的に許容される防腐剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、有機溶媒、キレート剤、酸化防止剤、充填剤、着色剤、賦形剤などを含むが、これらに限定されるものではなく、前記添加剤は、予め乳化されたマイクロエマルションにブレンドされるか、又は前記追加化合物は、前記元の混合物に添加されて乳化されてもよい。
【0030】
本発明の目的の１つは、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、前記防腐剤は、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロヘキシジン、イミダゾリル尿素、フェノール、ソルビン酸カリウム、安息香酸、クレゾール、クロロクレゾール、ｐ－安息香酸エステル、フェノキシエタノール、ソルビン酸、α－トコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビン酸エステル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、アスコルビン酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸、エデト酸、それらの半合成誘導体、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されないことを特徴とする。前記防腐剤は、ベンジルアルコール、クロロヘキシジン（ビス（ｐ－クロロフェニルジグアニジル）ヘキサン）、クロルフェニラミン（３－（－４－クロロオキシ）－プロパン－１，２－ジオール）、ケーソンＣＧ（メチル及びメチルクロロイソチアゾロン）、パラベン（安息香酸メチル、安息香酸エチル、安息香酸プロピル、安息香酸ブチル）、フェノキシエタノール（２－フェノキシエタノール）、Ｐｈｅｎｏｎｉｐ（フェノキシエタノール、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エチル、ｐ－ヒドロキシ安息香酸ブチル、ｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピル）、Ｐｈｅｎｏｒｏｃ、 Ｌｉｑｕｉｐａｒ Ｏｉｌ、 Ｌｉｑｕｉｐａｒ ＰＥ、 Ｎｉｐａｇｕａｒｄ ＭＰＡ、パラベンポリスルホン酸メチル（プロピレングリコール、ヒドロキシ安息香酸メチル及びヒドロキシ安息香酸プロピル）、パラベンペプチド（ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸エチル及びヒドロキシ安息香酸プロピル）、パラベンエステル（ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸ブチル、ヒドロキシ安息香酸エチル及びヒドロキシ安息香酸プロピル）、Ｅｌｅｓｔａｂ ３８８及びＫｉｌｌｉｔｏｌの１種又は複数種を含むが、これらに限定されない。
【0031】
本発明の目的の１つは、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、前記ｐＨ調整剤は、ＨＥＰＥＳ、ジエタノールアミン、乳酸、モノエタノールアミン、トリエチルアミン、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、それらの半合成誘導体、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、ことを特徴とする。さらに、前記マイクロエマルションは、キレート剤を含んでいてもよく、前記キレート剤の例としては、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、フィチン酸、ポリリン酸、クエン酸、グルコン酸、酢酸、乳酸、及びジメルカプトプロパノールの１種又は複数種が含まれるが、これらに限定されない。
【0032】
本発明の目的の１つは、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、前記緩衝剤は、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、Ｌ－（＋）－酒石酸、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酢酸、酢酸アンモニウム溶液、炭酸水素アンモニウム溶液、クエン酸二アンモニウム溶液、ギ酸アンモニウム溶液、シュウ酸アンモニウム一水和物、リン酸二アンモニウム溶液、リン酸一アンモニウム溶液、リン酸二ナトリウム四水和物溶液、硫酸アンモニウム溶液、酒石酸アンモニウム二塩基酸塩溶液、ＢＥＳ緩衝塩水溶液、ＢＩＣＩＮＥ緩衝液、ＢＩＳ－ＴＲＩＳ、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、酢酸カルシウム水和物、クエン酸塩の濃溶液、クエン酸、ジエタノールアミン、ＥＰＰＳ、ギ酸水溶液、グリシン－グリシン－グリシン、グリシン－グリシン、グリシン、ＨＥＰＥＳ緩衝塩水、イミダゾール緩衝液、リポタンパク質リフォールディング緩衝液、酢酸リチウム二水和物、クエン酸リチウム三塩基四水和物、ＭＥＳ溶液、ＭＯＰＳ、酢酸マグネシウム溶液、クエン酸マグネシウム三塩基非水和物、ギ酸マグネシウム溶液、リン酸マグネシウム二塩基三水和物、シュウ酸二水和物、ＰＩＰＥＳ、リン酸塩緩衝塩、ペルオキシダーゼ結合体洗浄緩衝液、ピペラジン、Ｄ－酒石酸カリウム、酢酸カリウム溶液、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム一塩基酸塩、クエン酸カリウム三塩基酸塩溶液、ギ酸カリウム溶液、シュウ酸カリウム一水和物、リン酸二水素カリウム、フタル酸カリウム、酒石酸カリウムナトリウム溶液、酒石酸カリウムナトリウム四水和物、四ホウ酸カリウム四水和物、四シュウ酸カリウム二水和物、プロピオン酸溶液、ＳＴＥ緩衝液、５，５－ジエチルバルビタールナトリウム、酢酸ナトリウム溶液、重炭酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム一水和物、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム溶液、ギ酸ナトリウム溶液、シュウ酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム溶液、リン酸二水素ナトリウム溶液、リン酸ナトリウム溶液、ピロリン酸ナトリウム二元溶液、ピロリン酸ナトリウム四元十水合物溶液、酒石酸ナトリウム二元溶液、四ホウ酸ナトリウム十水和物、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、ＴＭ緩衝液、ＴＮＴ緩衝液、トリグリシン緩衝液、三酢酸ジエチルＥＤＴＡ緩衝液、トリグリシンドデシル硫酸ナトリウム緩衝液、三リン酸エチレンジアミン四酢酸緩衝液、トリアジン、トリエタノールアミン、トリエチルアミン、酢酸トリエチルアミン緩衝液、リン酸トリエチルアンモニウム溶液、酢酸トリメチルアンモニウム溶液、リン酸トリメチルアンモニウム溶液、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）酢酸塩、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基が含まれるが、これらに限定されない、ことを特徴とする。
【0033】
本発明の目的の１つは、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、前記有機溶媒は、Ｃ１～Ｃ１２アルコール、ジオール、トリオール、リン酸ジアルキル、リン酸トリアルキル（例えば、リン酸トリｎ－ブチル）、エタノール、メタノール、イソプロパノール、グリセリン、中鎖トリグリセリド、エチルエーテル、酢酸エチル、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸、ｎ－ブタノール、ブタンジオール、香料アルコール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール、ギ酸、プロピレングリコール、ソルビトール、工業用メチル化酒類、トリアセチン、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、クロロホルム、１，４－ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ギ酸、それらの半合成誘導体、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、ことを特徴とする。
【0034】
本発明の目的の１つは、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、マイクロエマルションは添加剤をさらに含み、前記添加剤は、酸化防止剤（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥなど）、矯味剤（例えば、グルコース、キシリトールなど）、浸透圧調整剤（例えば、グリセリンなど）、増粘剤（例えば、カラギーナン、ペクチンなど）、充填剤（例えば、澱粉など）、着色剤（レモンイエロー、サンセットイエローなど）、賦形剤（アラビアガム、シロップなど）などを含むがこれらに限定されない、ことを特徴とする。
本発明の目的の１つは、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、マイクロエマルションが金属イオン化合物を吸着させ、さらに表面吸着又は疎水性相互作用などにより抗原とワクチンを直接形成する、ことを特徴とする。
本発明の目的の１つは、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、マイクロエマルションが金属イオン化合物を吸着させ、さらに表面吸着又は疎水性相互作用などにより抗原とワクチンを直接形成する、ことを特徴とする。
【0035】
本発明の目的の１つは、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、前記抗原は、タンパク質、ポリペプチド、核酸、オリゴ糖、多糖類、腫瘍細胞分解物、細菌分解物、細菌細胞膜、マイコプラズマ細胞膜、クラミジア細胞壁、スピロヘータ、リケッチア微莢膜、ウイルスエンベロープ、エクソソーム、ウイルス又は細菌分解液抗原、ウイルス又は細菌外膜小胞抗原、腫瘍細胞膜小胞抗原、腫瘍細胞エクソソーム抗原、モデル抗原であるオボアルブミン（ＯＶＡ）などの１種又は１種以上の組み合わせを含むが、これらに限定されない、ことを特徴とする。
【0036】
好ましくは、前記抗原は、モデル抗原であるオボアルブミン（ＯＶＡ）、メラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）の１種又は１種以上の組み合わせである。
【0037】
本発明の目的の１つは、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、金属イオン化合物が吸着されたマイクロエマルション自体がアジュバント作用を有し、さらに異なるアジュバントを加えて併用することにより、免疫反応をさらに向上させることができ、前記追加のアジュバントには、抗原関連分子パターン類アジュバントと、例えばペプチドグリカン、リポテイコ酸、ＭＰＬＡ、イミキモド、レシキモド、ＣｐＧ－ＯＤＮ、細菌鞭毛タンパク質、Ｐｏｌｙ Ｉ：ＣのようなＴｏｌｌ様受容体アゴニストと、と、例えば３ｐＲＮＡ、短二本鎖ＲＮＡのようなＲＩＧ－Ｉ様受容体アゴニストと、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－（＋）－グルコサミンのようなＮＯＤ様受容体アゴニスト、例えばβ－グルカン、トレハロース二ホウ酸塩のようなＣ－型レクチン受容体と、例えばｃＧＡＭＰのようなＳＴＩＮＧアゴニストと、例えばコレラ毒素（ＣＴ）、大腸菌非耐熱性エンテロトキシン（ＬＴ）、コレラ毒素Ｂサブユニットのような細菌毒素及びその誘導体と、例えばＱＳ２１、トマチン、Ｑｕｉｌ－Ａのようなサポニン類と、例えばＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、Ｆｌｔ－３、リンパ球ケモカインのようなサイトカインと、例えば熱ショックタンパク質、Ａ１５１、ＧＴＰ－ＧＤＰ、フッ化ナトリウム、アルキルポリアクリレート多量体、ジメチルビスオクタデシル第４級アンモニウムブロマイド（ＤＤＡ）のようなその他のアジュバントとの１種又は１種以上の組み合わせを含むが、これらに限定されない、ことを特徴とする。好ましくは、前記追加のアジュバントは、ＣｐＧ １８２６、Ａ１５１の１種又は１種以上の組み合わせである。
【0038】
本発明の１つの目的は、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、前記マイクロエマルションは、重量部で、適量の水相、油相０．０１％～５０％、乳化剤０．００１％～１０％、金属イオン化合物０．０００１％～１％、抗原１％～０．０００１％を成分として含む、ことを特徴とする。
【0039】
好ましくは、前記マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムにおいては、前記マイクロエマルションは、重量部で、適量の水相、油相０．１％～５％、乳化剤０．０１％～２％、金属イオン化合物０．００１％～１％、重量部で抗原０．１％～０．０００１％を成分として含むことを特徴とする。
【0040】
好ましくは、前記マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムは、前記マイクロエマルションは、重量部で、適量の注射用水、スクアレン０．１％～５％、トウェイン８０ ０．０１％～２％、スパン８５ ０．０１％～２％、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ ０．０１％～２％、水酸化アルミニウム０．０１％～１％、モデル抗原であるオボアルブミンＯＶＡ ０．１％～０．００１％を成分として含むことを特徴とする。
【0041】
好ましくは、前記マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムは、前記マイクロエマルションは、重量部で、適量の注射用水、大豆油０．１％～５％、中鎖トリグリセリド０．１％～５％、卵黄レシチン０．０１％～２％、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ ０．０１％～２％、水酸化鉄０．１％～０．００１％、メラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００ ０．０１％～０．０００１％を成分として含むことを特徴とする。
【0042】
より好ましくは、前記マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムは、前記マイクロエマルションは、重量部で、適量の注射用水、スクアレン０．１％～２％、トウェイン８０ ０．１％～２％、サイクリン８５ ０．１％～２％、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ ０．１％～２％、水酸化アルミニウム０．０１％～０．１％、モデル抗原であるオボアルブミンＯＶＡ ０．１％～０．０１％を成分として含むことを特徴とする。
【0043】
より好ましくは、前記マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムは、前記マイクロエマルションは、重量部で、適量の注射用水、大豆油０．１％～２％、中鎖トリグリセリド０．１％～２％、卵黄レシチン０．１％～２％、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ ０．１％～２％、水酸化鉄０．０１％～０．００１％、メラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００ ０．０１％～０．００１％を成分として含むことを特徴とする。
【0044】
好ましくは、前記マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムは、追加のアジュバントとしてＣｐＧ １８２６、Ａ１５１の１種又は複数種をさらに含み、その含有量が０．１％～０．００１％であることを特徴とする。
【0045】
本発明の目的の１つは、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、前記マイクロエマルションの製造方法は、
親油相乳化剤を油相に溶解し、親水性乳化剤を水相に溶解し、両者を十分に混合してマイクロエマルションを形成するステップ（１）と、
前記マイクロエマルションにｐＨ緩衝液及び／又は金属イオン化合物のアニオン部分を加えるステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた混合物に、金属イオン化合物のカチオン部分を加えるステップ（３）と、
ステップ（２）又はステップ（３）で得られた混合物に抗原を加えて、均一に混合すると完成するステップ（４）とを含むことを特徴とする。
親油相乳化剤を油相に溶解し、親水性乳化剤を水相に溶解し、両者を十分に混合してマイクロエマルションを形成するステップ（１）と、
前記マイクロエマルションにｐＨ緩衝液及び／又は金属イオン化合物のアニオン部分を加えるステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた混合物に、金属イオン化合物のカチオン部分を加えるステップ（３）と、
ステップ（２）又はステップ（３）で得られた混合物に抗原を加えて、均一に混合すると完成するステップ（４）とを含むことを特徴とする。
【0046】
好ましくは、前記マイクロエマルションの製造方法は、
親油相乳化剤を油相に溶解し、親水性乳化剤を水相に溶解し、両者を混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンをさらに十分に混合して、例えば高圧均質化、超音波又は高速撹拌などの混合方法でマイクロエマルションを形成するステップ（１）と、
前記マイクロエマルションにｐＨ緩衝液及び／又は金属イオン化合物のアニオン部分を加えるステップ（２）と、
ボルテックス、撹拌、超音波の条件下で、又は微量シリンジポンプにより、金属イオン化合物のカチオン部分をステップ（２）で得られた混合物に加えるステップ（３）と、
ステップ（２）又はステップ（３）で得られた混合物に抗原を加えると完成するステップ（４）とを含むことを特徴とする。
親油相乳化剤を油相に溶解し、親水性乳化剤を水相に溶解し、両者を混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンをさらに十分に混合して、例えば高圧均質化、超音波又は高速撹拌などの混合方法でマイクロエマルションを形成するステップ（１）と、
前記マイクロエマルションにｐＨ緩衝液及び／又は金属イオン化合物のアニオン部分を加えるステップ（２）と、
ボルテックス、撹拌、超音波の条件下で、又は微量シリンジポンプにより、金属イオン化合物のカチオン部分をステップ（２）で得られた混合物に加えるステップ（３）と、
ステップ（２）又はステップ（３）で得られた混合物に抗原を加えると完成するステップ（４）とを含むことを特徴とする。
【0047】
本発明の目的の１つは、マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムを提供することであり、前記マイクロエマルションの製造方法は、
親油相乳化剤を油相に溶解し、親水性乳化剤を水相に溶解し、両者を十分に混合してマイクロエマルションを形成するステップ（１）と、
前記マイクロエマルションに金属イオン化合物のカチオン部分を加えるステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた混合物に、ｐＨ緩衝液及び／又は金属イオン化合物のアニオン部分を加えるステップ（３）と、
ステップ（２）又はステップ（３）で得られた混合物に抗原を加えて、均一に混合すると完成するステップ（４）とを含むことを特徴とする。
親油相乳化剤を油相に溶解し、親水性乳化剤を水相に溶解し、両者を十分に混合してマイクロエマルションを形成するステップ（１）と、
前記マイクロエマルションに金属イオン化合物のカチオン部分を加えるステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた混合物に、ｐＨ緩衝液及び／又は金属イオン化合物のアニオン部分を加えるステップ（３）と、
ステップ（２）又はステップ（３）で得られた混合物に抗原を加えて、均一に混合すると完成するステップ（４）とを含むことを特徴とする。
【0048】
好ましくは、前記マイクロエマルションの製造方法は、
親油相乳化剤を油相に溶解し、親水性乳化剤を水相に溶解し、両者を混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンをさらに十分に混合して、例えば高圧均質化、超音波又は高速撹拌などの混合方法でマイクロエマルションを形成するステップ（１）と、
前記マイクロエマルションに金属イオン化合物カチオン部分を加えるステップ（２）と、
ボルテックス、撹拌、超音波の条件下で、又は微量シリンジポンプにより、ｐＨ緩衝液及び／又は金属イオン化合物のアニオン部分をステップ（２）で得られた混合物に加えるステップ（３）と、
ステップ（２）又はステップ（３）で得られた混合物に抗原を加えると完成するステップ（４）とを含む。
親油相乳化剤を油相に溶解し、親水性乳化剤を水相に溶解し、両者を混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンをさらに十分に混合して、例えば高圧均質化、超音波又は高速撹拌などの混合方法でマイクロエマルションを形成するステップ（１）と、
前記マイクロエマルションに金属イオン化合物カチオン部分を加えるステップ（２）と、
ボルテックス、撹拌、超音波の条件下で、又は微量シリンジポンプにより、ｐＨ緩衝液及び／又は金属イオン化合物のアニオン部分をステップ（２）で得られた混合物に加えるステップ（３）と、
ステップ（２）又はステップ（３）で得られた混合物に抗原を加えると完成するステップ（４）とを含む。
【0049】
本発明では、ＯＶＡをモデル抗原として、インビボ及びインビボ実験を行った結果、該ワクチンベクターは抗原特異的体液免疫及び細胞免疫を誘導することができることが明らかになる。本発明では、モデル抗原としてＯＶＡ又はメラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）、モデルアジュバントとしてＣｐＧ １８２６又はＡ１５１を用いて、インビトロ実験を行った結果、該ワクチンベクターは抗原と核酸アジュバントとの共担持が可能であることが明らかになる。本発明の好ましい実施形態の１つとして、製造されたワクチンベクターは、ＤＣ２．４抗原提示細胞に効率よく取り込まれ得る。本発明のワクチン送達システムは、マイクロエマルションで金属イオン化合物を吸着させることにより、より安定性が高く、凝集しにくく、良好な分散性を有し、臨床使用により適している。本発明のワクチン送達システムは、２００ｎｍ未満の粒子径を有し、リンパ節への送達の要件を満たし、リンパ節を効率よく標的化し、ワクチンの標的化送達を達成することができる。本発明のワクチンベクターは、抗原提示細胞に効率よく取り込まれ、次の免疫応答の発生に有利である。従来のアルミニウムゲルアジュバントは注射部位の肉芽腫を引き起こしやすく、腎臓機能不全などの特殊な場合に体内に蓄積しやすく、生体内の高量のアルミニウムはまず脳や骨組織に影響し、深刻な神経症候群や透析性認知症を引き起こす。アルミニウム毒性は、また筋萎縮性脊髄側索硬化症やアルツハイマー病とも関連している。本発明では、アルミニウムを含むマイクロエマルションワクチンを製造する際に、本発明のワクチンのアルミニウム含有量は、市販されているアルミニウムゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）２％、米国ＩｎｖｉｖｏＧｅｎｅ社）よりもはるかに低く、これにより、金属イオン蓄積の危険性及び局所的な副作用を低減することができ、毒性が低く、患者の適応性を向上させることができる。
【発明の効果】
【0050】
従来技術と比較して、本発明は以下の利点を有する。
【0051】
１、本発明では、金属イオン化合物をエマルジョンの表面に吸着させることにより、エマルジョンに金属イオン化合物を吸着させるための一般的な製造方法が提供される。
【0052】
２、本発明では、金属イオン化合物をワクチンベクターとしてエマルジョンの表面に吸着させることにより、エマルジョンの分散性が良く、安定性が高く、粒子径制御範囲が広く、高分子抗原を封入することでリンパへの送達を可能とする。
【0053】
３、本発明では、親水性抗原及び疎水性抗原を同一ベクターに封入することができ、これにより、性質の異なる複数の抗原の共送達を実現し、病原体に対する生体の包括的かつ有効な免疫応答の発生を誘導することができる。
【0054】
４、本発明では、安全性が高く、安価で入手が容易であり、工業的生産に適しているＦＤＡによって承認された補助材料を用いて製造することができ、また、製造方法が簡単で迅速であり、条件が温和であり、有機試薬の添加がなく、このため、抗原タンパク質の変性を引き起こすことがなく、抗原タンパク質の立体配座と活性を効果的に維持することができる。
【0055】
５、本発明の方法は、簡単で、高圧均質化、超音波又は高速撹拌などの混合方法でマイクロエマルションを製造し、ボルテックス、撹拌、超音波の条件下で、又は微量シリンジポンプにより、金属イオン化合物のカチオン又はアニオン部分及び抗原を加えることができ、これにより、量産が可能であり、工業化に有利であり、応用の将来性や市場の将来性が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0056】
以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
【図1】遊離ＣｐＧ １８２６（ＣｐＧ １８２６）、水酸化アルミニウムマイクロエマルション２０μｌにＣｐＧ １８２６ ２μｇを封入したもの（ＮＥ－８０μｇ／ｍｌ）、水酸化アルミニウムマイクロエマルション２０μｌにＣｐＧ １８２６ ４．８μｇを封入したもの（ＮＥ－１６０μｇ／ｍｌ）のグルカンゲル電気泳動図を示す。
【図2】遊離Ａ１５１（Ａ１５１）、水酸化鉄マイクロエマルション２０μｌにＡ１５１ ３．０μｇを封入した水酸化鉄マイクロエマルション（ＮＥ－Ａ１５１）のグルカンゲル電気泳動図を示す。
【図3】実施例１で製造された水酸化アルミニウムマイクロエマルションの電子顕微鏡像である。
【図4】実施例９で製造されたメラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００を担持した水酸化鉄マイクロエマルションの電子顕微鏡像である。
【図5】遊離ＦＩＴＣ標識ＯＶＡ（Ｆｒｅｅ ＯＶＡ）とＦＩＴＣ標識ＯＶＡを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルション（ＮＥ－ＯＶＡ）のＤＣ２．４細胞での取り込み結果を示す。
【図6】遊離ＦＩＴＣ標識ＧＰ１００（Ｆｒｅｅ－ＧＰ１００）とＦＩＴＣ標識ＧＰ１００を担持した水酸化鉄マイクロエマルション（ＮＥ＠Ｆｅ－ＧＰ１００）のＤＣ２．４細胞での取り込み結果を示す。
【図7】遊離ＯＶＡ（ＯＶＡ）、ＯＶＡを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルション（ＮＥ－ＯＶＡ）、遊離ＯＶＡとＣｐＧ（ＯＶＡ＋ＣｐＧ）で動物を免疫した後のＣＴＬ結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0057】
以下の実施例は、本発明のさらなる説明であるが、本発明の範囲を限定するものではない。以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明するが、当業者は、本発明がこれらの実施例及び使用される製造方法に限定されるものではないことを理解すべきである。さらに、当業者は、本発明の説明に基づいて、本発明に対して同等置換、組み合わせ、改良、又は修飾を行うことができるが、これらは全て本発明の範囲内に含まれるものとする。
【0058】
（実施例１）
水酸化アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
スパン８５ ０．２ｇをスクアレン０．５ｇに溶解し、トウェイン８０ ０．２ｇを注射用水に溶解し、混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンを高圧均質化してマイクロエマルション４０ｍｌとし、マイクロエマルション１ｍｌにＤＳＰＥ－ＰＥＧ粉末５ｍｇを加えて、撹拌して溶解し、３７．５ｍＭ硫酸アルミニウム水溶液３１２．５μｌを加えて、ボルテックスしながら１００ｍＭ ｐＨ８のＨＥＰＥＳ緩衝液１．７５ｍｌを加えて中性に調整すると、水酸化アルミニウムマイクロエマルションを得た。
水酸化アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
スパン８５ ０．２ｇをスクアレン０．５ｇに溶解し、トウェイン８０ ０．２ｇを注射用水に溶解し、混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンを高圧均質化してマイクロエマルション４０ｍｌとし、マイクロエマルション１ｍｌにＤＳＰＥ－ＰＥＧ粉末５ｍｇを加えて、撹拌して溶解し、３７．５ｍＭ硫酸アルミニウム水溶液３１２．５μｌを加えて、ボルテックスしながら１００ｍＭ ｐＨ８のＨＥＰＥＳ緩衝液１．７５ｍｌを加えて中性に調整すると、水酸化アルミニウムマイクロエマルションを得た。
【0059】
（実施例２）
水酸化アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
卵黄レシチン０．３５ｇとトウェン８０ ０．０１ｇを注射用水に溶解し、スクアレン０．５ｇと混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンを高圧均質化してマイクロエマルション４０ｍｌとした。以上のエマルション１ｍｌに３７．５ｍＭ硫酸アルミニウム水溶液１２３μｌを加えて、ボルテックスしながら１００ｍＭ ｐＨ８のＨＥＰＥＳ緩衝液６１５μｌを加えて中性に調整すると、水酸化アルミニウムマイクロエマルションを得た。
水酸化アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
卵黄レシチン０．３５ｇとトウェン８０ ０．０１ｇを注射用水に溶解し、スクアレン０．５ｇと混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンを高圧均質化してマイクロエマルション４０ｍｌとした。以上のエマルション１ｍｌに３７．５ｍＭ硫酸アルミニウム水溶液１２３μｌを加えて、ボルテックスしながら１００ｍＭ ｐＨ８のＨＥＰＥＳ緩衝液６１５μｌを加えて中性に調整すると、水酸化アルミニウムマイクロエマルションを得た。
【0060】
（実施例３）
水酸化アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
オレイン酸０．１ｇとスパン８５ ０．２ｇをスクアレン０．５ｇに溶解し、トウェン８０ ０．２ｇを注射用水に溶解し、混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンを高圧均質化してマイクロエマルション４０ｍｌとした。以上のエマルション１ｍｌに３７．５ｍＭ硫酸アルミニウム水溶液１００μｌを加えて、ボルテックスしながら１００ｍＭ ｐＨ８のＨＥＰＥＳ緩衝液５５０μｌを加えて中性に調整すると、水酸化アルミニウムマイクロエマルションを得た。
水酸化アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
オレイン酸０．１ｇとスパン８５ ０．２ｇをスクアレン０．５ｇに溶解し、トウェン８０ ０．２ｇを注射用水に溶解し、混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンを高圧均質化してマイクロエマルション４０ｍｌとした。以上のエマルション１ｍｌに３７．５ｍＭ硫酸アルミニウム水溶液１００μｌを加えて、ボルテックスしながら１００ｍＭ ｐＨ８のＨＥＰＥＳ緩衝液５５０μｌを加えて中性に調整すると、水酸化アルミニウムマイクロエマルションを得た。
【0061】
（実施例４）
リン酸アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
スパン８５ ０．２ｇをスクアレン０．５ｇに溶解し、トウェイン８０ ０．２ｇを注射用水に溶解し、混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンを高圧均質化してマイクロエマルション４０ｍｌとし、マイクロエマルション１ｍｌにＤＳＰＥ－ＰＥＧ粉末５ｍｇを加えて、撹拌して溶解し、５ｍＭ硫酸アルミニウム水溶液１ｍｌを加えて、ボルテックスしながら１０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液１ｍｌを加えると、リン酸アルミニウムマイクロエマルションを得た。
リン酸アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
スパン８５ ０．２ｇをスクアレン０．５ｇに溶解し、トウェイン８０ ０．２ｇを注射用水に溶解し、混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンを高圧均質化してマイクロエマルション４０ｍｌとし、マイクロエマルション１ｍｌにＤＳＰＥ－ＰＥＧ粉末５ｍｇを加えて、撹拌して溶解し、５ｍＭ硫酸アルミニウム水溶液１ｍｌを加えて、ボルテックスしながら１０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液１ｍｌを加えると、リン酸アルミニウムマイクロエマルションを得た。
【0062】
（実施例５）
リン酸カルシウムマイクロエマルションの製造方法
スパン８５ ０．２ｇをスクアレン０．５ｇに溶解し、トウェイン８０ ０．２ｇを注射用水に溶解し、混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンを高圧均質化してマイクロエマルション４０ｍｌとし、マイクロエマルション１ｍｌにＤＳＰＥ－ＰＥＧ粉末５ｍｇを加えて、撹拌して溶解し、１０ｍＭ塩化カルシウム水溶液１ｍｌを加えて、ボルテックスしながら６．６ｍＭリン酸ナトリウム水溶液１ｍｌを加えると、リン酸カルシウムマイクロエマルションを得た。
リン酸カルシウムマイクロエマルションの製造方法
スパン８５ ０．２ｇをスクアレン０．５ｇに溶解し、トウェイン８０ ０．２ｇを注射用水に溶解し、混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンを高圧均質化してマイクロエマルション４０ｍｌとし、マイクロエマルション１ｍｌにＤＳＰＥ－ＰＥＧ粉末５ｍｇを加えて、撹拌して溶解し、１０ｍＭ塩化カルシウム水溶液１ｍｌを加えて、ボルテックスしながら６．６ｍＭリン酸ナトリウム水溶液１ｍｌを加えると、リン酸カルシウムマイクロエマルションを得た。
【0063】
（実施例６）
ＯＶＡを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
実施例１で製造された水酸化アルミニウム含有マイクロエマルション１８０μｌに２ｍｇ／ｍｌのＯＶＡ水溶液２０μｌを加えて、３７℃で３０分インキュベートすると、ＯＶＡを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを得た。
ＯＶＡを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
実施例１で製造された水酸化アルミニウム含有マイクロエマルション１８０μｌに２ｍｇ／ｍｌのＯＶＡ水溶液２０μｌを加えて、３７℃で３０分インキュベートすると、ＯＶＡを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを得た。
【0064】
（実施例７）
ＯＶＡとＣｐＧ １８２６を担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
実施例１で製造された水酸化アルミニウム含有マイクロエマルション１６０μｌに２ｍｇ／ｍｌ ＯＶＡ水溶液２０μｌと２００μｇ／ｍｌ ＣｐＧ １８２６水溶液２０μｌを加えて、３７℃で３０分インキュベートすると、ＯＶＡとＣｐＧ １８２６を担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを得た。
ＯＶＡとＣｐＧ １８２６を担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
実施例１で製造された水酸化アルミニウム含有マイクロエマルション１６０μｌに２ｍｇ／ｍｌ ＯＶＡ水溶液２０μｌと２００μｇ／ｍｌ ＣｐＧ １８２６水溶液２０μｌを加えて、３７℃で３０分インキュベートすると、ＯＶＡとＣｐＧ １８２６を担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを得た。
【0065】
（実施例８）
卵白リゾチームを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
スパン８５ ０．２ｇをスクアレン０．５ｇに溶解し、トウェイン８０ ０．２ｇを注射用水に溶解し、混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンを高圧均質化してマイクロエマルション４０ｍｌとし、マイクロエマルション１ｍｌにＤＳＰＥ－ＰＥＧ粉末５ｍｇを加えて、撹拌して溶解し、１００ｍＭ ｐＨ８のＨＥＰＥＳ緩衝液１．７５ｍｌを加えて、４ｍｇ／ｍｌ卵白リゾチーム水溶液１００μｌを加えて、ボルテックスしながら３７．５ｍＭ硫酸アルミニウム水溶液３１２．５μｌを加えると、卵白リゾチームを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを得た。
卵白リゾチームを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
スパン８５ ０．２ｇをスクアレン０．５ｇに溶解し、トウェイン８０ ０．２ｇを注射用水に溶解し、混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンを高圧均質化してマイクロエマルション４０ｍｌとし、マイクロエマルション１ｍｌにＤＳＰＥ－ＰＥＧ粉末５ｍｇを加えて、撹拌して溶解し、１００ｍＭ ｐＨ８のＨＥＰＥＳ緩衝液１．７５ｍｌを加えて、４ｍｇ／ｍｌ卵白リゾチーム水溶液１００μｌを加えて、ボルテックスしながら３７．５ｍＭ硫酸アルミニウム水溶液３１２．５μｌを加えると、卵白リゾチームを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを得た。
【0066】
（実施例９）
メラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００を担持した水酸化鉄マイクロエマルションの製造方法
大豆油０．５ｇ、中鎖トリグリセリド０．５ｇ、卵黄レシチン０．５ｇを均一に混合し、注射用水を加えて、混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンを高圧均質化してマイクロエマルション４０ｍｌとし、マイクロエマルション１ｍｌにＤＳＰＥ－ＰＥＧ粉末５ｍｇを加えて、撹拌して溶解し、（２００ｍＭ）三塩化鉄水溶液３μｌを加えて、（０．１Ｍ）水酸化ナトリウム溶液約２０μｌを加えてｐＨを中性まで調整し、７ｍｇ／ｍｌメラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）水溶液１０μｌを加えて、均一に混合すると、メラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００を担持した水酸化鉄マイクロエマルションを得た。
メラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００を担持した水酸化鉄マイクロエマルションの製造方法
大豆油０．５ｇ、中鎖トリグリセリド０．５ｇ、卵黄レシチン０．５ｇを均一に混合し、注射用水を加えて、混合して一次エマルジョンを形成し、一次エマルジョンを高圧均質化してマイクロエマルション４０ｍｌとし、マイクロエマルション１ｍｌにＤＳＰＥ－ＰＥＧ粉末５ｍｇを加えて、撹拌して溶解し、（２００ｍＭ）三塩化鉄水溶液３μｌを加えて、（０．１Ｍ）水酸化ナトリウム溶液約２０μｌを加えてｐＨを中性まで調整し、７ｍｇ／ｍｌメラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）水溶液１０μｌを加えて、均一に混合すると、メラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００を担持した水酸化鉄マイクロエマルションを得た。
【0067】
（実施例１０）
ＯＶＡとヌクレオチドＣｐＧ １８２６を担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
実施例６で製造された水酸化アルミニウム含有マイクロエマルション２０μｌに、配列が５’－ＴＣＣＡＴＧＡＣ ＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ－３’であるＣｐＧ １８２６ ２．４μｇ又は４．８μｇを含有する水溶液１０μｌを加え、３０分振とうしてＯＶＡとヌクレオチドＣｐＧ １８２６を担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを製造し、次に、デキストランゲル電気泳動実験を行い、マイクロエマルションの核酸に対する封入能力を検出した。その結果、図１に示すように、マイクロエマルション２０μｌはＣｐＧ １８２６ ２．４μｇを封入することができた。図においては、ＣｐＧ １８２６は遊離ＣｐＧ １８２６を示し、ＮＥ－８０μｇ／ｍｌはマイクロエマルション２０μｌにＣｐＧ １８２６ ２．４μｇを封入し、最終濃度を８０μｇ／ｍｌとしたものを示し、ＮＥ－１６０μｇ／ｍｌはマイクロエマルション２０μｌにＣｐＧ １８２６ ４．８μｇを封入し、最終濃度を１６０μｇ／ｍｌとしたものことを示す。
ＯＶＡとヌクレオチドＣｐＧ １８２６を担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションの製造方法
実施例６で製造された水酸化アルミニウム含有マイクロエマルション２０μｌに、配列が５’－ＴＣＣＡＴＧＡＣ ＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ－３’であるＣｐＧ １８２６ ２．４μｇ又は４．８μｇを含有する水溶液１０μｌを加え、３０分振とうしてＯＶＡとヌクレオチドＣｐＧ １８２６を担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを製造し、次に、デキストランゲル電気泳動実験を行い、マイクロエマルションの核酸に対する封入能力を検出した。その結果、図１に示すように、マイクロエマルション２０μｌはＣｐＧ １８２６ ２．４μｇを封入することができた。図においては、ＣｐＧ １８２６は遊離ＣｐＧ １８２６を示し、ＮＥ－８０μｇ／ｍｌはマイクロエマルション２０μｌにＣｐＧ １８２６ ２．４μｇを封入し、最終濃度を８０μｇ／ｍｌとしたものを示し、ＮＥ－１６０μｇ／ｍｌはマイクロエマルション２０μｌにＣｐＧ １８２６ ４．８μｇを封入し、最終濃度を１６０μｇ／ｍｌとしたものことを示す。
【0068】
（実施例１１）
ヌクレオチドＡ１５１とメラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００を担持した水酸化鉄マイクロエマルションの製造方法
実施例９で製造された水酸化鉄マイクロエマルション２０μｌに、配列がＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧであるヌクレオチドＡ１５１ ３μｇを加え、３０分振とうしてヌクレオチドＡ１５１とメラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００を担持した水酸化鉄マイクロエマルションを製造し、次に、デキストランゲル電気泳動実験を行い、マイクロエマルションの核酸に対する封入能力を検出した。その結果、図２に示すように、マイクロエマルション２０μｌはＡ１５１ ３μｇを封入することができた。図においては、Ａ１５１は遊離Ａ１５１を示し、ＮＥ－Ａ１５１はマイクロエマルション２０μｌにＡ１５１ ３μｇを封入したものを示す。
ヌクレオチドＡ１５１とメラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００を担持した水酸化鉄マイクロエマルションの製造方法
実施例９で製造された水酸化鉄マイクロエマルション２０μｌに、配列がＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧであるヌクレオチドＡ１５１ ３μｇを加え、３０分振とうしてヌクレオチドＡ１５１とメラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００を担持した水酸化鉄マイクロエマルションを製造し、次に、デキストランゲル電気泳動実験を行い、マイクロエマルションの核酸に対する封入能力を検出した。その結果、図２に示すように、マイクロエマルション２０μｌはＡ１５１ ３μｇを封入することができた。図においては、Ａ１５１は遊離Ａ１５１を示し、ＮＥ－Ａ１５１はマイクロエマルション２０μｌにＡ１５１ ３μｇを封入したものを示す。
【0069】
（実施例１２）
マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムのマイクロエマルションの粒子径測定
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０レーザー粒度分析計を使用して実施例１～９の金属イオン化合物を含むマイクロエマルション又は抗原を封入したワクチン送達システムの粒度分布を測定し、実施例１～９のマイクロエマルション溶液をそれぞれ０．１ｍｌ取り、純水溶液０．９ｍｌを加えて希釈し、サンプルをサンプルセルに入れ、測定温度を２５℃と設定した。表１に示す結果のように、ナノ粒子の粒子径は１００～１５０ｎｍであり、ＰＤＩは要件を満たし、分布が均一であった。
マイクロエマルションに基づくワクチン送達システムのマイクロエマルションの粒子径測定
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０レーザー粒度分析計を使用して実施例１～９の金属イオン化合物を含むマイクロエマルション又は抗原を封入したワクチン送達システムの粒度分布を測定し、実施例１～９のマイクロエマルション溶液をそれぞれ０．１ｍｌ取り、純水溶液０．９ｍｌを加えて希釈し、サンプルをサンプルセルに入れ、測定温度を２５℃と設定した。表１に示す結果のように、ナノ粒子の粒子径は１００～１５０ｎｍであり、ＰＤＩは要件を満たし、分布が均一であった。
【0070】
【表1】
【0071】
（実施例１３）
水酸化アルミニウムマイクロエマルションの透過型電子顕微鏡による観察
実施例１で製造された水酸化アルミニウムマイクロエマルションサンプルを銅網上に置き、５ｍｉｎ静置した後、リンタングステン酸で１ｍｉｎ染色し、その後、銅網上の余分な染色液をろ紙で吸引し、室温でサンプルを乾燥し、２００ｋｖの条件下で、透過型電子顕微鏡でサンプルを観察した。その結果、図３に示すように、実験結果から、マイクロエマルションは丸みを帯びた粒子であり、粒子径は１００ｎｍ以下であることが分かった。
水酸化アルミニウムマイクロエマルションの透過型電子顕微鏡による観察
実施例１で製造された水酸化アルミニウムマイクロエマルションサンプルを銅網上に置き、５ｍｉｎ静置した後、リンタングステン酸で１ｍｉｎ染色し、その後、銅網上の余分な染色液をろ紙で吸引し、室温でサンプルを乾燥し、２００ｋｖの条件下で、透過型電子顕微鏡でサンプルを観察した。その結果、図３に示すように、実験結果から、マイクロエマルションは丸みを帯びた粒子であり、粒子径は１００ｎｍ以下であることが分かった。
【0072】
（実施例１４）
メラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００を担持した水酸化鉄マイクロエマルションの透過型電子顕微鏡による観察
実施例９で製造されたメラノーマ抗原ペプチドを担持した水酸化鉄マイクロエマルションサンプルを銅網上に置き、５ｍｉｎ静置した後、リンタングステン酸で１ｍｉｎ染色し、その後、銅網上の余分な染色液をろ紙で吸引し、室温でサンプルを乾燥し、２００ｋｖの条件で、透過型電子顕微鏡でサンプルを観察した。その結果、図４に示すように、実験結果から、マイクロエマルションは丸みを帯びた粒子であり、粒子径は１００ｎｍ以下であることが分かった。
メラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００を担持した水酸化鉄マイクロエマルションの透過型電子顕微鏡による観察
実施例９で製造されたメラノーマ抗原ペプチドを担持した水酸化鉄マイクロエマルションサンプルを銅網上に置き、５ｍｉｎ静置した後、リンタングステン酸で１ｍｉｎ染色し、その後、銅網上の余分な染色液をろ紙で吸引し、室温でサンプルを乾燥し、２００ｋｖの条件で、透過型電子顕微鏡でサンプルを観察した。その結果、図４に示すように、実験結果から、マイクロエマルションは丸みを帯びた粒子であり、粒子径は１００ｎｍ以下であることが分かった。
【0073】
（実施例１５）
水酸化アルミニウムマイクロエマルションワクチンシステムのＤＣ２．４細胞での取り込み
１２ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０６個のＤＣ２．４細胞を播種し、インキュベータに入れて４～６時間インキュベーションし、細胞が壁に接着されると、１ウェルあたりＦＩＴＣ標識ＯＶＡ ５μｇ、又は実施例６により製造された同量のＦＩＴＣ標識ＯＶＡを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを加えた。３７℃の条件下で１．５時間摂取した後、上清を捨て、ＰＢＳで細胞表面を軽く２回洗浄し、さらにＰＢＳで直接ピペッティングし、２０００ｒｐｍで細胞を３ｍｉｎ、２回遠心洗浄し、最後にＰＢＳ ４００μｌで細胞を再懸濁させ、フローサイトメーターで検出した。その結果、図５に示すように、遊離ＯＶＡはＤＣ２．４細胞にはほとんど取り込まれないが、本発明のワクチン送達システムのＤＣ２．４細胞での取り込み率は約７０％であり、遊離ＯＶＡよりもはるかに高く、有意差があり（＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）、この送達システムにより抗原を包み込むことで免疫細胞の抗原取り込み効率が著しく向上することがわかった。図においては、Ｆｒｅｅ ＯＶＡは遊離ＦＩＴＣ標識ＯＶＡを示し、ＮＥ－ＯＶＡはＦＩＴＣ標識ＯＶＡを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを示す。
水酸化アルミニウムマイクロエマルションワクチンシステムのＤＣ２．４細胞での取り込み
１２ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０６個のＤＣ２．４細胞を播種し、インキュベータに入れて４～６時間インキュベーションし、細胞が壁に接着されると、１ウェルあたりＦＩＴＣ標識ＯＶＡ ５μｇ、又は実施例６により製造された同量のＦＩＴＣ標識ＯＶＡを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを加えた。３７℃の条件下で１．５時間摂取した後、上清を捨て、ＰＢＳで細胞表面を軽く２回洗浄し、さらにＰＢＳで直接ピペッティングし、２０００ｒｐｍで細胞を３ｍｉｎ、２回遠心洗浄し、最後にＰＢＳ ４００μｌで細胞を再懸濁させ、フローサイトメーターで検出した。その結果、図５に示すように、遊離ＯＶＡはＤＣ２．４細胞にはほとんど取り込まれないが、本発明のワクチン送達システムのＤＣ２．４細胞での取り込み率は約７０％であり、遊離ＯＶＡよりもはるかに高く、有意差があり（＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）、この送達システムにより抗原を包み込むことで免疫細胞の抗原取り込み効率が著しく向上することがわかった。図においては、Ｆｒｅｅ ＯＶＡは遊離ＦＩＴＣ標識ＯＶＡを示し、ＮＥ－ＯＶＡはＦＩＴＣ標識ＯＶＡを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを示す。
【0074】
（実施例１６）
水酸化鉄マイクロエマルションワクチンシステムのＤＣ２．４細胞での取り込み
１２ウェルプレートに１孔当たり１×１０６個のＤＣ２．４細胞を播種し、インキュベータに入れて４～６時間インキュベーションし、細胞が壁に接着されると、１ウェルあたりＦＩＴＣ標識メラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）２μｇ、又は実施例９によって製造された同量のＦＩＴＣ標識メラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）を担持した水酸化鉄マイクロエマルションを加えた。３７℃の条件下で、１．５時間摂取した後、上清を捨て、ＰＢＳで細胞表面を軽く２回洗浄し、さらにＰＢＳで直接ピペッティングし、２０００ｒｐｍで細胞を３ｍｉｎ、２回遠心洗浄し、最後にＰＢＳ４００μｌで細胞を再懸濁させ、フローサイトメーターで検出した。その結果、図６に示すように、遊離メラノーマ抗原ペプチドはＤＣ２．４細胞にはほとんど取り込まれないが、本発明のワクチン送達システムのＤＣ２．４細胞での取り込み率は約６０％であり、遊離ポリペプチドよりもはるかに高く、有意差があり（＊＊＊、Ｐ＜０．００１）、このマイクロエマルションにより抗原を包み込むことで免疫細胞の抗原取り込み効率が著しく向上することがわかった。図においては、Ｆｒｅｅ－ＧＰ１００は遊離ＦＩＴＣ標識ＧＰ１００を示し、ＮＥ＠Ｆｅ－ＧＰ１００はＦＩＴＣ標識ＧＰ１００を担持した水酸化鉄マイクロエマルションを表す。
水酸化鉄マイクロエマルションワクチンシステムのＤＣ２．４細胞での取り込み
１２ウェルプレートに１孔当たり１×１０６個のＤＣ２．４細胞を播種し、インキュベータに入れて４～６時間インキュベーションし、細胞が壁に接着されると、１ウェルあたりＦＩＴＣ標識メラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）２μｇ、又は実施例９によって製造された同量のＦＩＴＣ標識メラノーマ抗原ペプチドＧＰ１００（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）を担持した水酸化鉄マイクロエマルションを加えた。３７℃の条件下で、１．５時間摂取した後、上清を捨て、ＰＢＳで細胞表面を軽く２回洗浄し、さらにＰＢＳで直接ピペッティングし、２０００ｒｐｍで細胞を３ｍｉｎ、２回遠心洗浄し、最後にＰＢＳ４００μｌで細胞を再懸濁させ、フローサイトメーターで検出した。その結果、図６に示すように、遊離メラノーマ抗原ペプチドはＤＣ２．４細胞にはほとんど取り込まれないが、本発明のワクチン送達システムのＤＣ２．４細胞での取り込み率は約６０％であり、遊離ポリペプチドよりもはるかに高く、有意差があり（＊＊＊、Ｐ＜０．００１）、このマイクロエマルションにより抗原を包み込むことで免疫細胞の抗原取り込み効率が著しく向上することがわかった。図においては、Ｆｒｅｅ－ＧＰ１００は遊離ＦＩＴＣ標識ＧＰ１００を示し、ＮＥ＠Ｆｅ－ＧＰ１００はＦＩＴＣ標識ＧＰ１００を担持した水酸化鉄マイクロエマルションを表す。
【0075】
（実施例１７）
水酸化アルミニウムマイクロエマルションワクチンシステムの細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）実験と免疫抗体の検出
０日目、７日目、１４日目に免疫し、実施例６で製造されたＯＶＡを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルション、実施例７で製造されたＯＶＡとＣｐＧを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルション、遊離ＯＶＡ又はＯＶＡ５μｇとＣｐＧ０．５μｇを含む遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧ ２５μｌをマウスの足裏に注射し、２１日目にＣＦＳＥ染色法によりインビボのＣＴＬ反応を検出した。その結果、図７に示すように、遊離ＯＶＡとＯＶＡの水酸化アルミニウムマイクロエマルションは抗原特異的細胞免疫反応を誘導できないが、ＯＶＡとＣｐＧを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションは強い抗原特異的細胞免疫反応を発生させ、そのＣＴＬは遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧ群より顕著に高く、有意差があった（＊、Ｐ＜０．０５）。その結果、本発明のワクチンシステムは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答を顕著に向上させることができ、腫瘍、ウイルス感染などの分野での幅広い使用が有望であることが明らかになった。図においては、ＯＶＡは遊離ＯＶＡを示し、ＮＥ－ＯＶＡはＯＶＡを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを示し、ＯＶＡ＋ＣｐＧは遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧを示し、ＮＥ－ＯＶＡ－ＣｐＧはＯＶＡとＣｐＧを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを示す。
水酸化アルミニウムマイクロエマルションワクチンシステムの細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）実験と免疫抗体の検出
０日目、７日目、１４日目に免疫し、実施例６で製造されたＯＶＡを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルション、実施例７で製造されたＯＶＡとＣｐＧを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルション、遊離ＯＶＡ又はＯＶＡ５μｇとＣｐＧ０．５μｇを含む遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧ ２５μｌをマウスの足裏に注射し、２１日目にＣＦＳＥ染色法によりインビボのＣＴＬ反応を検出した。その結果、図７に示すように、遊離ＯＶＡとＯＶＡの水酸化アルミニウムマイクロエマルションは抗原特異的細胞免疫反応を誘導できないが、ＯＶＡとＣｐＧを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションは強い抗原特異的細胞免疫反応を発生させ、そのＣＴＬは遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧ群より顕著に高く、有意差があった（＊、Ｐ＜０．０５）。その結果、本発明のワクチンシステムは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答を顕著に向上させることができ、腫瘍、ウイルス感染などの分野での幅広い使用が有望であることが明らかになった。図においては、ＯＶＡは遊離ＯＶＡを示し、ＮＥ－ＯＶＡはＯＶＡを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを示し、ＯＶＡ＋ＣｐＧは遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧを示し、ＮＥ－ＯＶＡ－ＣｐＧはＯＶＡとＣｐＧを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを示す。
【0076】
（実施例１８）
水酸化アルミニウムマイクロエマルションワクチンシステムの免疫抗体の検出
０日目、７日目、１４日目に免疫し、実施例７で製造されたＯＶＡとＣｐＧを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルション、ＯＶＡ ５μｇとＣｐＧ０．５μｇを含む遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧ ２５μｌをマウスの足裏に注射し、２１日目に眼窩から採血し、血清中のＯＶＡ特異性抗体を検出した。その結果、図８ａ～図８ｃに示すように、図８ａ、図８ｂ及び図８ｃは、ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの抗体検出結果であり、実験結果から、水酸化アルミニウムマイクロエマルションワクチンシステムは、強い抗原特異的免疫反応を生じさせることができ、ＩｇＧレベルは遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧ群よりも遥かに高く、有意差があり（＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）、Ｔｈ２型免疫応答を表すＩｇＧ１も遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧ群よりもはるかに高く、有意差があり（＊＊＊＊、すなわちＰ＜０．０００１）、Ｔｈ１型免疫応答を表すＩｇＧ２ａレベルは遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧ群よりも遥かに高く、有意差があり（＊＊＊、すなわちＰ＜０．００１）、このことから、本発明のワクチンシステムは抗原免疫原性を有意に向上させるという利点を有することが明らかになった。図においては、ＯＶＡ＋ＣｐＧは遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧを示し、ＮＥ－ＯＶＡ－ＣｐＧはＯＶＡとＣｐＧを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを示す。
水酸化アルミニウムマイクロエマルションワクチンシステムの免疫抗体の検出
０日目、７日目、１４日目に免疫し、実施例７で製造されたＯＶＡとＣｐＧを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルション、ＯＶＡ ５μｇとＣｐＧ０．５μｇを含む遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧ ２５μｌをマウスの足裏に注射し、２１日目に眼窩から採血し、血清中のＯＶＡ特異性抗体を検出した。その結果、図８ａ～図８ｃに示すように、図８ａ、図８ｂ及び図８ｃは、ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの抗体検出結果であり、実験結果から、水酸化アルミニウムマイクロエマルションワクチンシステムは、強い抗原特異的免疫反応を生じさせることができ、ＩｇＧレベルは遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧ群よりも遥かに高く、有意差があり（＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）、Ｔｈ２型免疫応答を表すＩｇＧ１も遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧ群よりもはるかに高く、有意差があり（＊＊＊＊、すなわちＰ＜０．０００１）、Ｔｈ１型免疫応答を表すＩｇＧ２ａレベルは遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧ群よりも遥かに高く、有意差があり（＊＊＊、すなわちＰ＜０．００１）、このことから、本発明のワクチンシステムは抗原免疫原性を有意に向上させるという利点を有することが明らかになった。図においては、ＯＶＡ＋ＣｐＧは遊離ＯＶＡ＋ＣｐＧを示し、ＮＥ－ＯＶＡ－ＣｐＧはＯＶＡとＣｐＧを担持した水酸化アルミニウムマイクロエマルションを示す。
【0077】
以上は、本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明をいかなる形で限定するものではなく、本発明は、好ましい実施例をもって上記のように開示されているが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の技術的解決手段を逸脱しない範囲で、上述の開示された技術的内容を利用していくつかの変更又は修飾を加えて同等変化の等価実施例とすることができるが、本発明の技術的解決手段の内容から逸脱していない場合、本発明の技術的本質に基づいて上記の実施例に対して行われたいかなる簡単な修正、同等の変化及び修飾は、全て本発明の技術的解決手段の範囲内に属するものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【国際調査報告】