知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-02
(54)【発明の名称】パーキンソン病を治療する方法及び薬剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/48 20060101AFI20230425BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230425BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230425BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20230425BHJP
【ＦＩ】
A61K38/48 100
A61P25/16
C07K16/18 ZNA
C12N5/071
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022557660
(86)(22)【出願日】2021-03-24
(85)【翻訳文提出日】2022-11-18
(86)【国際出願番号】 CN2021082715
(87)【国際公開番号】W WO2021190561
(87)【国際公開日】2021-09-30
(31)【優先権主張番号】202010212922.4
(32)【優先日】2020-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518217305
【氏名又は名称】タレンゲン インターナショナル リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＴＡＬＥＮＧＥＮ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110003007
【氏名又は名称】弁理士法人謝国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】李季男
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AC14
4B065CA44
4C084AA02
4C084BA44
4C084DC06
4C084MA13
4C084MA16
4C084MA55
4C084MA58
4C084MA59
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA151
4C084ZA152
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
被験者に治療有効量のプラスミノーゲン活性化経路の成分を投与することを含む、パーキンソン病を予防及び治療する方法が提供される。また、プラスミノーゲン活性化経路の成分を含む、上記の状態を治療するための薬剤、医薬組成物、製品及びキットに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の治療有効量の化合物をパーキンソン病の被験者に投与することを含む、パーキンソン病を予防及び治療する方法。
【請求項2】
前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、プラスミノーゲン、組換えヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、及びｕＰＡから選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの阻害剤、例えば、抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記化合物が、パーキンソン病の被験者に対して、記憶機能の回復促進、認知能力の改善、黒質におけるＤＴＡの発現促進、線条体ニッスル小体の回復促進、黒質におけるＧＬＰ－１Ｒの発現促進、黒質におけるＴＨ陽性細胞の増加、線条体ミエリン鞘の修復促進、脳組織におけるα－シヌクレインの分解促進、線条体ＮＦ発現の促進、軸索損傷修復の促進、線条体ＧＦＡＰ発現の低減、線条体ニューロン損傷の緩和、ＢＤＮＦの形成のための脳組織におけるＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断促進、うつ病や不安の症状の緩和から選択される１つまたは複数の効果を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記化合物がプラスミノーゲンである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記プラスミノーゲンが、ヒト全長プラスミノーゲンまたはその保存的置換変異体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記プラスミノーゲンが、配列２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲンのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記プラスミノーゲンが、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有するタンパク質を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記プラスミノーゲンが、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、またはそれらの、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を保持した変異体から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記プラスミノーゲンが、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列の保存的置換変異体を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記化合物が、１つまたは複数の他の治療方法または薬剤と組み合わせて使用される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記他の治療方法が、細胞療法（幹細胞療法を含む）及び物理的療法を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記他の薬剤が、パーキンソン病の治療のための他の薬剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記化合物が、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈を介して）、または筋肉内に投与される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、臨床症状及び徴候を改善するために、被験者に有効量のプラスミノーゲン活性化経路の成分または関連化合物、例えば、プラスミノーゲン、を投与することを含む、パーキンソン病を治療する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）は一般的な神経変性疾患であり、高齢者に多く、平均発症年齢は６０歳前後であり、４０歳未満で発症する若年性パーキンソン病はまれである。パーキンソン病患者のほとんどは散発性であり、家族歴がある患者は１０％未満である。パーキンソン病における最も重要な病理学的変化は、中脳黒質のドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ，ＤＡ）作動性ニューロンの変性及び死であり、その結果、線条体ＤＡ含有量が大幅に減少し、疾患が引き起こされる。この病理学的変化の正確な原因はまだ不明であるが、遺伝的要因、環境要因、老化、酸化ストレスなど、いずれもＰＤドーパミン作動性ニューロンの変性と死に関与している可能性がある。
【0003】
パーキンソン病の顕著な病理学的変化は、中脳黒質のドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ，ＤＡ）作動性ニューロンの変性及び死、線条体ＤＡ含有量の顕著な減少、及び黒質の残りのニューロンの細胞質における好酸球封入体、すなわちレビー小体（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ）の出現である。パーキンソン病患者では、ドーパミン作動系に加えて、非ドーパミン作動系も著しく損なわれている。例えば、メイナート（Ｍｅｙｎｅｒｔ）基底核のコリン作動性ニューロン、青斑核のノルアドレナリン作動性ニューロン、脳幹の縫線核のセロトニン作動性ニューロン、ならびに大脳皮質、脳幹、脊髄、及び末梢自律神経系のニューロンなどの損傷が挙げられる。線条体のドーパミンレベルの大幅な低下は、パーキンソン病における運動症状の出現と密接に関連している。中脳-辺縁系及び中脳-皮質系におけるドーパミン濃度の有意な低下は、パーキンソン病患者の知能低下及び情動障害と密接に関連している。
【0004】
パーキンソン病の発症は潜行性であり、進行は遅い。最初の症状は、通常、片方の手足の振戦または不器用さであり、その後反対側の手足に影響を与える可能性がある。主な臨床症状は、安静時振戦、運動緩慢、硬直及び姿勢歩行障害である。近年、うつ病、便秘、睡眠障害などの非運動症状もパーキンソン病患者の一般的な愁訴であることがますます注目されており、それらが患者の生活の質に与える影響は、運動症状よりも大きくなっている。
【0005】
パーキンソン病の主な治療法は薬物療法であり、ある程度症状を改善することはできるが、病気の進行を止めることはできず、他の治療法や薬剤を見つける必要がある。
【発明の概要】
【0006】
本発明は研究によって、プラスミノーゲンがパーキンソン病被験者の記憶機能の回復を促進し、認知能力を改善し、黒質におけるＤＴＡの発現を促進し、線条体ニッスル小体の回復を促進し、黒質におけるＧＬＰ－１Ｒの発現を促進し、黒質におけるＴＨ陽性細胞を増加させ、線条体ミエリン鞘の修復を促進し、脳組織におけるα－シヌクレインの分解を促進し、線条体ＮＦ発現を促進し、軸索損傷の修復を促進し、線条体ＧＦＡＰ発現を低減し、線条体ニューロン損傷を緩和し、ＢＤＮＦの形成のための脳組織におけるＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進し、うつ病や不安の症状を改善することができるため、パーキンソン病の治療薬として開発される可能性があることを発見した。
【0007】
具体的には、本発明は下記のことに係る。
【0008】
１、一態様では、本願は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の拮抗剤から選択される１つ以上の治療有効量の化合物をパーキンソン病の被験者に投与することを含む、パーキンソン病を予防及び治療する方法に関する。
【0009】
一態様では、本願は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の化合物の、パーキンソン病を治療する薬剤の調製における使用に関する。
【0010】
一態様では、本願は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の化合物を含む、パーキンソン病を治療する薬剤または医薬組成物に関する。
【0011】
２、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、プラスミノーゲン、組換えヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、及びｕＰＡから選択されるものである、項１に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0012】
３、前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの阻害剤、例えば、抗体である、項１に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0013】
４、前記化合物が、パーキンソン病の被験者に対して、記憶機能の回復促進、認知能力の改善、黒質におけるＤＴＡの発現促進、線条体ニッスル小体の回復促進、黒質におけるＧＬＰ－１Ｒの発現促進、黒質におけるＴＨ陽性細胞の増加、線条体ミエリン鞘の修復促進、脳組織におけるα－シヌクレインの分解促進、線条体ＮＦ発現の促進、軸索損傷修復の促進、線条体ＧＦＡＰ発現の低減、線条体ニューロン損傷の緩和、ＢＤＮＦの形成のための脳組織におけるＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断促進、うつ病や不安の症状の緩和から選択される１つまたは複数の効果を有する、項１～３のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0014】
５、前記化合物がプラスミノーゲンである、項１～４のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0015】
６、前記プラスミノーゲンが、ヒト全長プラスミノーゲンまたはその保存的置換変異体である、項１～５のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0016】
７、前記プラスミノーゲンが、配列２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲンのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有する、項１～５のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0017】
８、前記プラスミノーゲンが、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有するタンパク質を含む、項１～５のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0018】
９、前記プラスミノーゲンがＧｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲンまたはそれらの、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を保持した変異体から選択されるものである、項１～５のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0019】
１０、前記プラスミノーゲンが、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列の保存的置換変異体を含む、項１～５のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0020】
１１、前記化合物が、１つまたは複数の他の治療方法または薬剤と組み合わせて使用される、項１～１０のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0021】
１２、前記他の治療方法が、細胞療法（幹細胞療法を含む）及び物理的療法を含む、項１１に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0022】
１３、前記他の薬剤が、パーキンソン病の治療のための他の薬剤である、項１１に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。
【0023】
１４、前記化合物が、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈を介して）、及び筋肉内に投与される、項１～１３のいずれか一項に記載の方法、使用、薬剤、または医薬組成物。本願の上記いずれか１つの実施形態において、前記プラスミノゲンが配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有し得る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換され、かつ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有するタンパク質である。
【0024】
一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはプラスミノーゲンフラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有するタンパク質である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ－プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性、例えば、タンパク質加水分解活性を保持した変異体である。上記実施形態において、前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンのアミノ酸は配列２、６、８、１０または１２に示される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンである。
【0025】
一部の実施形態において、前記被験者はヒトである。一部の実施形態において、前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している。一部の実施形態において、前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である。
【0026】
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体と、前述の方法で使用するプラスミノーゲンとを含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、（ｉ）前述の方法で使用するプラスミノーゲン、及び（ｉｉ）前記プラスミノーゲンを前記被験者に送達するための部材（ｍｅａｎｓ）を含む、予防または治療キットであり得る。いくつかの実施形態では、前記部材は注射器またはバイアルである。いくつかの実施形態では、前記キットは、前述の方法のいずれかを実施するために前記プラスミノーゲンを前記被験者に投与することを指示するためのラベルまたはプロトコルをさらに含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、前記製品は、ラベルを含む容器と、（ｉ）前述の方法で使用するためのプラスミノーゲンまたはプラスミノーゲンを含む医薬組成物とを含み、前記ラベルは、前述の方法のいずれかを実施するために前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する。
【0028】
いくつかの実施形態では、前記キットまたは製品は、他の薬剤を含む１つまたは複数の追加の部材または容器をさらに含む。
【0029】
前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは全身または局所にて投与され、好ましくは、静脈内、筋肉内、皮下投与によってプラスミノーゲンを投与することで治療する。前記方法のいくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１～２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１～８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～６００ｍｇ／ｋｇ、０．１～４００ｍｇ／ｋｇ、１～２００ｍｇ／ｋｇ、１～１００ｍｇ／ｋｇ、１０～１００ｍｇ／ｋｇ（体重１キロあたりで計算）または０．０００１～２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１～８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１～６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１～４００ｍｇ／ｃｍ２、１～２００ｍｇ／ｃｍ２、１～１００ｍｇ／ｃｍ２、１０～１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量で投与し、好ましくは一回以上繰り返し、好ましくは少なくとも毎日投与する。
【0030】
本発明は、本発明の実施形態に属する技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、これらの組み合わせ後の技術構成は、上記の技術構成が別個に明確に開示されたのと同様に、本出願において明確に開示された。さらに、本発明はまた、各実施形態とそれらの要素との間の組み合わせを明確にカバーし、組み合わせ後の技術構成は、本明細書に明確に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】図１は、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスのオープンフィールド試験における総移動距離の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスは実験中に一定の距離を移動し、プラスミノーゲン投与群のマウスの総運動距離は溶媒対照群よりも有意に短く、その差は統計的に有意であり（＊Ｐ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの総運動距離は、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
【図2】図２は、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスのオープンフィールド試験の境界ゾーンにおける休憩時間率の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスは境界ゾーンで一定の休憩時間の割合を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンでの休憩時間の割合は溶媒対照群より有意に大きく、統計学的な差は非常に有意であり（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、プラスミノーゲン投与群の境界ゾーンでの休憩時間の割合はブランク対照群の値に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
【図3】図３は、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスのオープンフィールド試験の境界ゾーンにおける移動距離の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスが境界ゾーンで一定の移動距離を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンでの移動距離は溶媒対照群よりも有意に小さく、統計的差は有意に近く（Ｐ＝０．０５）、プラスミノーゲン投与群の境界ゾーンの移動距離は、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
【図4】図４は、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスのオープンフィールド試験の境界ゾーンにおける移動距離の割合（％）の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群が境界ゾーンで一定の移動距離の割合を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンでの移動距離の割合は、溶媒対照群より有意に大きく、統計的に差は極めて有意であり（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、プラスミノーゲン投与群マウスの境界ゾーンでの移動距離の割合がブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
【図5】図５は、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスの境界ゾーンにおける徐行時間の割合の計算結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスは境界ゾーンで一定の徐行時間の割合を持っており、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンでの徐行時間の割合は、溶媒対照群よりも有意に低く、統計的差は極めて有意であり（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、プラスミノーゲン投与群の境界ゾーンの徐行時間の割合は、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
【図6】図６は、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスのオープンフィールド試験における境界ゾーン時間の割合の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスが一定の境界ゾーン時間の割合を持っており、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンでの時間の割合は溶媒対照群よりも高く、統計的差は有意に近く（Ｐ＝０．０６）、プラスミノーゲン投与群の境界ゾーンでの時間の割合は、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避行動のレベルを高め、不安を緩和できることを示している。
【図7】図７は、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスのオープンフィールド試験における境界ゾーンエントリ回数の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定の境界ゾーンエントリ回数を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンエントリ回数は溶媒群に比べて有意に少なく、統計学的な差は有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界エントリ回数は、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
【図8】図８は、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスのオープンフィールド実験における中心ゾーンの移動距離の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスは中央ゾーンで一定の移動距離を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの中央ゾーンの移動距離は溶媒対照群のマウスよりも有意に低く、その差は統計学的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの中央ゾーンの移動距離は、ブランク対照群の移動距離に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
【図9】図９は、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスのオープンフィールド実験における中心ゾーンの移動距離の割合（％）の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスは中央ゾーンで一定の移動距離の割合を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの中央ゾーンの移動距離の割合は溶媒対照群のマウスよりも有意に低く、その差は統計学的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの中央ゾーンの移動距離の割合はブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
【図10】図１０は、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスの中心ゾーンにおける最大移動速度の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスは中心ゾーンで一定の最大移動速度を持っており、プラスミノーゲン投与群のマウスの中心ゾーンでの最大移動速度は、溶媒対照群よりも有意に低く、統計的差は極めて有意であり（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、プラスミノーゲン投与群の中心ゾーンの最大移動速度は、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
【図11】図１１は、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスのオープンフィールド試験における中心ゾーン時間の割合の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスが一定の中心ゾーン滞在時間の割合を持っており、プラスミノーゲン投与群のマウスの中心ゾーンでの時間の割合は溶媒対照群よりも有意に低く、統計的差は有意に近く（Ｐ＝０．０６）、プラスミノーゲン投与群の中心ゾーンでの滞在時間の割合は、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避行動のレベルを高め、不安を緩和できることを示している。
【図12】図１２は、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスのオープンフィールド試験における中心ゾーンエントリ回数の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定の中心ゾーンエントリ回数を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの中心ゾーンエントリ回数は溶媒群より有意に少なく、統計学的差は有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの中心ゾーンエントリ回数は、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
【図13】図１３は、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスのオープンフィールド試験における移動軌跡の代表的な写真である。その結果、ブランク対照群のマウスは中心ゾーンの活動がほとんどなく、プラスミノーゲン投与群のマウスは溶媒対照群に比べて中心ゾーンの活動が有意に減少し、ブランク対照群のマウスに近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
【図14】図１４Ａ～Ｃは、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスにおける黒質のＤＴＡ免疫組織化学的結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒対照群、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、ブランク対照群のマウスの黒質のドーパミンニューロンは一定量のＤＴＡを発現し（矢印でマーク）、溶媒群のマウスの黒質のＤＴＡの発現量はブランク対照群よりも低く、プラスミノーゲン投与群のマウスの黒質のＤＴＡの発現量は溶媒群より高く、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるＤＴＡの発現を促進できることを示している。
【図15】図１５Ａ～Ｄは、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスの線条体タールバイオレット染色結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒対照群、Ｃはプラスミノーゲン投与群、Ｄは線条体ニッスル小体の数の分析結果である。その結果、ブランク対照群のマウスの線条体ニューロンに一定数のニッスル小体が存在し（矢印でマーク）、溶媒対照群のマウスの線条体ニューロンにあるニッスル小体の数はブランク対照群よりも有意に多く、統計学的差は有意に近く（Ｐ＝０．０８５）、プラスミノーゲン投与群のマウスの線条体ニューロンのニッスル小体の数は、ブランク対照群に比べて有意な差はなかったが、溶媒対照群より有意に低く、しかもその差は統計学的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体ニッスル小体の数に影響を与える可能性があることを示している。
【図16】図１６Ａ～Ｃは、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスの黒質のタールバイオレット染色結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒対照群、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、ブランク対照群のマウスの黒質に一定量のニッスル小体が存在し（矢印でマーク）、溶媒対照群のマウスの黒質にあるニッスル小体の数はブランク対照群より少なく、プラスミノーゲン投与群のマウスの黒質におけるニッスル小体の数は溶媒群よりも高かった。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるニッスル小体の回復を促進できることを示している。
【図17】図１７Ａ～Ｃは、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるＧＬＰ-１Ｒの免疫組織化学的結果を示す図である。Ａは溶媒ＰＢＳ群、Ｂはプラスミノーゲン投与群、Ｃは平均光学密度の定量解析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群のマウスの黒質におけるＧＬＰ－１Ｒの発現量（矢印でマーク）は、溶媒ＰＢＳ対照群よりも有意に多く、その差は統計学的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるＧＬＰ－１Ｒの発現を促進できることを示している。
【図18】図１８Ａ～Ｄは、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるＴＨ免疫組織化学的結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒ＰＢＳ群、Ｃはプラスミノーゲン投与群、Ｄは定量解析結果である。その結果、ブランク対照群のマウスの黒質には一定量のＴＨ陽性細胞（矢印でマーク）が存在し、溶媒群のマウスの黒質のＴＨ陽性細胞の数が減少し、プラスミノーゲン投与群のマウスの黒質におけるＴＨ陽性細胞の数は溶媒群よりも有意に高かった。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質においてＴＨ陽性細胞を回復できることを示している。
【図19】図１９Ａ～Ｃは、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるＩｂａ-１の免疫組織化学的結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒ＰＢＳ群、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、ブランク対照群のマウスの黒質に一定量のミクログリアが存在し（矢印でマーク）、溶媒群のマウスの黒質にあるミクログリアの数がブランク対照群よりも多く、プラスミノーゲン投与群のマウスの黒質におけるミクログリアの数は溶媒対照群より有意に少なく、ブランク対照群に近かった。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるミクログリアの回復を促進できることを示している。
【図20】図２０Ａ～Ｃは、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスにおける線条体ＬＦＢの免疫組織化学的結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒ＰＢＳ群、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、ブランク対照群のマウスの線条体に一定量のミエリンが存在し、溶媒群のマウスの線条体のミエリンの数がブランク対照群よりも少なく、プラスミノーゲン投与群のマウスの線条体におけるミエリンの数は溶媒群より有意に高かった。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体のミエリンを回復できることを示している。
【図21】図２１Ａ～Ｄは、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるα－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）の免疫組織化学的結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒群、Ｃはプラスミノーゲン投与群、Ｄは平均光学密度の定量解析結果である。その結果、ブランク対照群のマウスの黒質には少量のα－シヌクレインしかなく、溶媒群のマウスの黒質中のα－シヌクレインの量は、ブランク対照群のマウスよりも有意に高かく（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの黒質中のα－シヌクレインの量は溶媒群よりも有意に低く、その差は統計学的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの黒質中のα－シヌクレインの量は、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるα－シヌクレインの発現を低下させ、神経損傷変性を改善できることを示している。
【図22】図２２Ａ～Ｄは、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスにおける線条体ＮＦの免疫組織化学的結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒群、Ｃはプラスミノーゲン投与群、Ｄは平均光学密度の定量解析結果である。その結果、ブランク対照群のマウスの線条体に一定量のＮＦが存在し（矢印でマーク）、溶媒群のマウスの線条体におけるＮＦ量は、ブランク対照群よりも低く、プラスミノーゲン投与群のマウスの線条体中のＮＦ量は溶媒群よりも有意に高く、統計学的な差は極めて有意であった（＊＊はＰ＜０．０１を表す）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体におけるＮＦ発現の回復を促進し、パーキンソン病の線条体軸索損傷を改善できることを示している。
【図23】図２３Ａ～Ｃは、プラスミノーゲン投与１４日後のパーキンソン病モデルマウスの線条体ＧＦＡＰ免疫組織化学的結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒群、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、ブランク対照群のマウスの線条体に少量のＧＦＡＰ発現があり（矢印でマーク）、溶媒群のマウスの線条体におけるＧＦＡＰの発現がブランク対照群より有意に高かく、プラスミノーゲン投与群のマウスの線条体におけるＧＦＡＰの発現は溶媒群より低かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体におけるＧＦＡＰの発現を低下させ、線条体の損傷を軽減できることを示している。
【図24】図２４Ａ～Ｄは、マウスの脳ホモジネートにおけるα－シヌクレインに対するプラスミノーゲンの効果の結果を示す図である。ＡはＴｒｉｃｉｎｅ－ｐａｇｅ、Ｂ、Ｃ、Ｄはそれぞれα－シヌクレイン、重合体ａ、重合体ｂのバンドスキャンの定量分析結果である。その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のα－シヌクレイン量が溶媒対照群に比べて有意に低く（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、その重合体ａ、ｂの量はいずれも溶媒対照群より有意に低く（＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のα－シヌクレインの量は溶媒対照群よりも有意に低く（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、その重合体ａ及びｂの量は溶媒対照群よりも有意に低かった（＊はＰ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウス及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトα－シヌクレイン及びその重合体の分解を効果的に促進できることを示している。
【図25】図２５Ａ～Ｃは、マウスの脳ホモジネート中の組換えヒトα-シヌクレインに対するプラスミノーゲンの効果の結果を示す図である。Ａはウェスタンブロット図、Ｂ及びＣはそれぞれα－シヌクレイン及び重合体のバンドスキャンの定量分析結果である。その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のα－シヌクレイン量が溶媒対照群に比べて有意に低く（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、その重合体の量はいずれも溶媒対照群より有意に低く（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のα－シヌクレインの量は溶媒対照群よりも有意に低く（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、その重合体の量は溶媒対照群よりも有意に低かった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウス及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、組換えヒトα－シヌクレイン及びその重合体の分解を効果的に促進できることを示している。
【図26】図２６Ａ～Ｂは、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネート中の組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。ＡはＳＤＳ－ＰＡＧＥの画像、ＢはＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの定量分析の結果である。その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量が溶媒対照群に比べて有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進できることを示唆している。
【図27】図２７Ａ～Ｃは、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおける組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。Ａはウエスタンブロットの画像であり、ＢはウエスタンブロットにおけるＰｒｏ－ＢＤＮＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果であり、ＣはウェスタンブロットにおけるＢＤＮＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果である。その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量が溶媒対照群に比べて有意に低く、その差が有意であり（＊はＰ＜０．０５、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、プラスミノーゲン投与群のＢＤＮＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は極めて有意であった。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断及び成熟ＢＤＮＦの形成を促進できることを示唆している。
【発明の詳細な説明】
【0032】
線維素溶解系（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）は、線溶系とも呼ばれ、線維素溶解（線溶）の過程に関与する一連の化学物質からなる系であり、主にプラスミノーゲン（ＰＬＧ）、プラスミン、プラスミノーゲン活性化因子、及び線維素溶解阻害剤を含む。プラスミノーゲン活性化因子には、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）、及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ－ＰＡ）が含まれる。ｔ－ＰＡはセリンプロテアーゼであり、血管内皮細胞によって合成される。ｔ－ＰＡはプラスミノーゲンを活性化し、このプロセスは主にフィブリンで行われる。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ－ＰＡ）は、尿細管上皮細胞と血管内皮細胞によって産生され、補因子としてフィブリンを必要とすることなくプラスミノーゲンを直接活性化することができる。プラスミノーゲン（ＰＬＧ）は肝臓で合成される。血液が凝固すると、ＰＬＧはフィブリンネットに大量に吸着され、ｔ－ＰＡまたはｕ－ＰＡの作用によりプラスミンに活性化されて線維素溶解を促進する。プラスミナーゼ（ＰＬ）はセリンプロテアーゼであり、フィブリンとフィブリノーゲンを分解し、様々な凝固因子Ｖ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＩＩなどを加水分解し、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、補体を加水分解するなどの作用がある。線維素溶解阻害剤には、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ）、及びα２－抗チプラスミン（α２－ＡＰ）が含まれる。ＰＡＩには主にＰＡＩ－１とＰＡＩ－２の２つの形態があり、ｔ－ＰＡに１：１の比率で特異的に結合することによってｔ－ＰＡを不活性化すると同時にＰＬＧを活性化することができる。α２－ＡＰは肝臓で合成され、ＰＬと１：１の比率で結合して複合体を形成し、それによってＰＬ活性を阻害する。ＦＸＩＩＩはα２－ＡＰをフィブリンと共有結合させ、それによってＰＬに対するフィブリンの感受性を弱める。インビボでの線維素溶解系の活性を阻害する物質としては、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミン、及びα２－マクログロブリンが挙げられる。
【0033】
本明細書で使用される「プラスミノーゲン活性化経路の成分」という用語は、
１、プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、それらの変異体または類縁体；
２、プラスミン及びそれらの変異体または類縁体;及び
３、プラスミノーゲン活性化剤、例えば、ｔＰＡ及びｕＰＡ、ならびにｔＰＡまたはｕＰＡの１つ以上のドメイン（１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメインなど）を含むｔＰＡまたはｕＰＡ変異体及び類縁体をカバーする。
１、プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、それらの変異体または類縁体；
２、プラスミン及びそれらの変異体または類縁体;及び
３、プラスミノーゲン活性化剤、例えば、ｔＰＡ及びｕＰＡ、ならびにｔＰＡまたはｕＰＡの１つ以上のドメイン（１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメインなど）を含むｔＰＡまたはｕＰＡ変異体及び類縁体をカバーする。
【0034】
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」は、すべての天然に存在するヒトの遺伝的変異体及びこれらのタンパク質の他の哺乳動物型、並びに、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換されてかつ依然としてプラスミノーゲン活性、プラスミン活性、ｔＰＡまたはｕＰＡ活性を有するタンパク質を含む。例えば、プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの「変異体」は、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個の保存的アミノ酸によって置換されて得られるこれらのタンパク質の突然変異体を含む。
【0035】
本発明の「プラスミノゲン変異体」は、配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有するタンパク質をカバーする。例えば、本発明の「プラスミノーゲン変異体」は、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有するタンパク質であり得る。具体的には、本発明のプラスミノーゲン変異体は、すべての天然に存在するヒトの遺伝的変異体及びこれらのタンパク質の他の哺乳動物型、並びに、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を保存的置換によって得られるこれらのタンパク質の突然変異体を含む。
【0036】
本発明のプラスミノーゲンは、霊長類動物またはげ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、リジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を保持した変異体、例えば、配列２、６、８、１０または１２に示されるプラスミノーゲン、例えば、配列２に示されるヒト天然プラスミノーゲンであり得る。
【0037】
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「類縁体」はそれぞれ、プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡと実質的に同様の効果を与える化合物を含む。
【0038】
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のドメイン（例えば、１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」及び「類縁体」をカバーする。例えば、プラスミノーゲンの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のプラスミノーゲンドメイン（例えば、１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むプラスミノーゲン変異体及び類縁体、例えば、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）をカバーする。プラスミンの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のプラスミンドメイン（例えば、１つまたは複数のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）やδ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）などのプラスミンの「変異体」及び「類縁体」をカバーする。
【0039】
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの「変異体」または「類縁体」がそれぞれプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの活性を有するかどうか、またはそれらがプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡと実質的に同様の効果をそれぞれ与えるかどうかは、当技術分野で知られている方法、例えば、ザイモグラフィー（ｅｎｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）及びＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング法）を使用して、活性化されたプラスミン活性のレベルによって測定できる。例えば、次の文献に記載されている方法を参照して測定することができる。Ｎｙ，Ａ．，Ｌｅｏｎａｒｄｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｈａｇｇｌｕｎｄ，Ａ．Ｃ，Ｈａｇｇｌｏｆ，Ｐ．，Ｐｌｏｐｌｉｓ，Ｖ．Ａ．，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ． ａｎｄ Ｎｙ，Ｔ． （１９９９）． Ｏｖｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０，５０３０－５０３５；Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ ＲＬ， Ｌｅｕｎｇ ＬＬ， Ｈａｒｐｅｌ ＰＣ， Ｎａｃｈｍａｎ ＲＬ （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９８４）． “Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ”． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７４ （５）： １６２５-３３；Ｇｒａｖａｎｉｓ Ｉ， Ｔｓｉｒｋａ ＳＥ （Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００８）． “Ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｓｔｒｏｋｅ”． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ． １２ （２）： １５９-７０；Ｇｅｉｇｅｒ Ｍ， Ｈｕｂｅｒ Ｋ， Ｗｏｊｔａ Ｊ， Ｓｔｉｎｇｌ Ｌ， Ｅｓｐａｎａ Ｆ， Ｇｒｉｆｆｉｎ ＪＨ， Ｂｉｎｄｅｒ ＢＲ （Ａｕｇ １９８９）． “Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”． Ｂｌｏｏｄ． ７４ （２）： ７２２-８。
【0040】
本発明の一部の実施形態において、本発明の「プラスミノーゲン活性化経路の成分」はプラスミノーゲンである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト全長プラスミノーゲン、またはそのプラスミノーゲン活性（例えば、そのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性）を保持した保存的突然変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ－プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性（例えば、そのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性）を保持した変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性（例えば、そのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性）を保持した保存的突然変異体若しくはそのフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性を保持した保存的突然変異体若しくはそのフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるようなアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列の保存的置換配列を含む。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンのアミノ酸は配列２、６、８、１０または１２に示される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるプラスミノーゲンの保存的置換変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンまたはその保存的変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは配列２に示されるヒト天然プラスミノーゲンまたはその保存的変異体である。
【0041】
「プラスミノーゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノーゲンを間接に活性化できる化合物」とは、プラスミノーゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノーゲンを間接に活性化できる任意の化合物を指し、例えば、ｔＰＡ、ｕＰＡ、ストレプトキナーゼ、サルプラーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、アニストレプラーゼ、モンテプラーゼ、ラノテプラーゼ、パミテプラーゼ、及びスタフィロキナーゼが挙げられる。
【0042】
本発明の「線維素溶解阻害剤の拮抗薬」は、線維素溶解阻害剤の作用に拮抗し、その作用を弱め、遮断し、阻止する化合物である。前記線維素溶解阻害剤は、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミン、及びα２－マクログロブリンである。前記拮抗剤は、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの抗体、または、例えばＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの発現を遮断またはダウンレギュレートするアンチセンスＲＮＡもしくはミニＲＮＡ、または、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの結合部位を占めるが、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの機能を持たない化合物、または、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの結合ドメイン及び／または活性ドメインをブロックする化合物である。
【0043】
プラスミンはプラスミノゲン活性化系（ＰＡ系）の重要な成分である。それは広スペクトルのプロテアーゼであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の幾つかの成分を加水分解することができ、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む。また、プラスミンは一部のプロマトリックスメタロプロテアーゼ（ｐｒｏ－ＭＭＰｓ）を活性化させて活性のあるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）にすることができる。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子である。プラスミンはプラスミノゲンが二種類の生理性のＰＡ：組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡｓ）をタンパク質加水分解することで形成されるものである。プラスミノゲンは血漿及び他の体液中において、相対的レベルが比較的高く、従来的にはＰＡ系の調節は主にＰＡｓの合成及び活性レベルよって実現されると考えられている。ＰＡ系成分の合成は異なる要素によって厳格な調節を受け、例えばホルモン、成長因子及びサイトカインである。また、この他に、プラスミンとＰＡｓの特定の生理的阻害剤が存在する。プラスミンの主な阻害剤はα２－抗プラスミン（α２－ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）である。ＰＡｓの活性は、ｕＰＡとｔＰＡのプラスミノーゲン活性化剤阻害剤－１（ＰＡＩ－１）に同時に阻害され、ｕＰＡを主に阻害するプラスミノーゲン活性化剤阻害剤－２（ＰＡＩ－２）によって調節される。一部の細胞表面には直接加水分解する活性のあるｕＰＡ特異性細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）がある。
【0044】
プラスミノゲンは単一鎖の糖タンパクであり、７９１個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤａである。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的な由来である。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する：グルタミン酸－プラスミノゲン（Ｇｌｕ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン－プラスミノゲン（Ｌｙｓ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）である。天然的に分泌され及び分解していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端（Ｎ－末端）グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸－プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸－プラスミノゲンはＬｙｓ７６－Ｌｙｓ７７においてリジン－プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸－プラスミノゲンと比較して、リジン－プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡｓによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０－Ｖａｌ５６１ペプチド結合はｕＰＡまたはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって連結された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの相同三環を含み、即ちいわゆるｋｒｉｎｇｌｅｓであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のＫｒｉｎｇｌｅｓはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２－ＡＰの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたプラスミノゲンは３８ｋＤａのフラグメントであり、ｋｒｉｎｇｌｅｌ－４を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントはアンギオスタチン(Angiostatin)と命名され、幾つかのプロテアーゼ加水分解プラスミノゲンから生成される。
【0045】
プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理性血栓の形成を予防するキーポイントである。プラスミンはさらにＥＣＭの幾つかの成分に対する基質特異性を有し、これらの成分はラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びゼラチンを含み、これはプラスミンがＥＣＭ再建において重要な作用を有することを示している。間接的に、プラスミンはさらにＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９を含むいくつかのプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することによりＥＣＭのその他の成分を分解する。そのため、プラスミンは細胞外タンパク加水分解の重要な上流調節因子であることを提唱する人がいる。また、プラスミンはいくつかの潜在的な形の成長因子を活性化させる能力を有する。インビトロで、プラスミンはさらに補体系の成分を加水分解させて走化性の補体フラグメントを放出することができる。
【0046】
「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ－二量体に加水分解する。
【0047】
「プラスミノーゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドを含む天然ヒト由来プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列４）として計算すれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９０ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノーゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１－５）を含む。ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１－Ｇｌｙ１９を含み、ＰＡｐは残基Ｇｌｕ２０－Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３－Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４－Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５－Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７－Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１－Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１－Ａｒｇ８０４を含む。
【0048】
Ｇｌｕ－プラスミノーゲンは天然のフルサイズのヒトプラスミノーゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）。該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。生体内において、さらにＧｌｕ－プラスミノーゲンの７６－７７番目のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ－プラスミノーゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。Ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン（δ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノーゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２－Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず（プロテアーゼドメイン（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ、ＰＤ）とも呼ばれる）、δ－プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノーゲン（Ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３－Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノーゲン（Ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３－Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）と文献が報告し、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１－Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許出願において、マイクロプラスミノーゲンの配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。
【0049】
全長プラスミノーゲンの構造は、Ａｉｓｉｎａらの論文にも記載されている（Ａｉｓｉｎａ Ｒ Ｂ，Ｍｕｋｈａｍｅｔｏｖａ Ｌ Ｉ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ／ｐｌａｓｍｉｎ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，４０（６）：５９０－６０５）。Ａｉｓｉｎａらの前記文章によれば、プラスミノーゲンにはＫｒｉｎｇｌｅ １、２、３、４、５ドメインとセリンプロテアーゼドメイン（プロテアーゼドメイン（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ、ＰＤ）とも呼ばれる）が含まれ、Ｋｒｉｎｇｌｅｓは、プラスミノーゲンが低分子量及び高分子量のリガンドに結合する役割（すなわち、リジン結合活性）を担っており、その結果、プラスミノーゲンがよりオープンな構成に変換され、より活性化しやすくなり、プロテアーゼドメイン（ＰＤ）は、残基Ｖａｌ５６２－Ａｓｎ７９１であり、ｔＰＡとＵＰＡはプラスミノーゲンのＡｒｇ５６１－Ｖａｌ５６２位活性化結合を特異的に切断し、それによってプラスミノーゲンがプラスミンを形成できる。したがって、プロテアーゼドメイン（ＰＤ）は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を付与する領域である。
【0050】
本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノーゲン」と「フィブリンプラスミノーゲン」、「繊維タンパクプラスミノーゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
【0051】
本願において、前記プラスミノーゲンの「不足」とは、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より低く、被験者の正常な生理学的機能に影響を及ぼすのに十分に低いことをいう。前記プラスミノーゲンの「欠乏」の意味は、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より明らかに低く、活性または発現が極微量であり、外部供給によってのみ正常な生理学的機能を維持できることである。
【0052】
当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノーゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用でき、そのため、本発明に記載の技術構成はプラスミノーゲン及びプラスミンをカバーするものである。循環プロセスにおいて、プラスミノーゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションをとるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノーゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ－二量体に加水分解させ、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノーゲンのＰＡｐドメインはプラスミノーゲンを非活性閉鎖コンフォメーションに維持する重要なエピトープを含み、一方ＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できる。プラスミノーゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び凝結因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などを含む。
【0053】
「プラスミノーゲン活性フラグメント」とは、基質のターゲット配列中のリジンに結合する活性（リジン結合活性）フラグメント、またはタンパク質加水分解機能を発揮する活性（タンパク質加水分解活性）フラグメント、またはタンパク質加水分解活性とリジン結合活性との両方を有するフラグメントを指す。本発明のプラスミノーゲンに関する技術構成は、プラスミノーゲンをプラスミノーゲン活性フラグメントに置き換える技術構成を包含する。いくつかの実施形態では、本発明のプラスミノーゲン活性フラグメントは、プラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むか、またはプラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインからなる。一部の実施形態において、本発明のプラスミノーゲン活性フラグメントは、配列１４を含むか、または配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列１４からなり、あるいは配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。一部の実施形態において、本発明のプラスミノーゲン活性フラグメントは、Ｋｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４、及びＫｒｉｎｇｌｅ ５から選択される１つ以上のドメインもしくはその保存的置換変異体を含むか、またはＫｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４、及びＫｒｉｎｇｌｅ ５から選択される１つ以上のドメインまたはその保存的置換変異体からなる。いくつかの実施形態では、本発明のプラスミノーゲンは、上記のプラスミノーゲンの活性フラグメントを含むタンパク質を含む。
【0054】
現在、血液中のプラスミノーゲン及びその活性測定方法は組織プラスミノーゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ－ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ－ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノーゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン－抗プラスミン複合物に対する測定（ＰＡＰ）を含む。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象(被験者)の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のＰＬＧはＳＫの作用下においてＰＬＭとなり、後者は発光基質に作用し、それから分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノーゲンの活性と正比例の関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のプラスミノーゲン活性に対して測定を行うことができる。
【0055】
「オーソログまたはオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは異なる種どうしのホモログであり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含み、直系遺伝子ともいう。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノーゲン活性を有するプラスミノーゲンのオーソログまたはオルソログを含む。
【0056】
「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの所定のアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、アルカリ性、疎水性など）のアミノ酸で親タンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性のアルカリ性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％～９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換バリアント」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素を含み、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然または親タンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
【0057】
「分離された」プラスミノーゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノーゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノーゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になるまで精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノーゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造され、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノーゲンを含む。
【0058】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体を指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するあるいは有しない）を含む融合物；等々である。
【0059】
参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要に応じてギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的としたアライメントは本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は配列をアライメントするための適切なパラメータを決めることができ、該パラメータが比較対象の配列のフルサイズに対して最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ－２により得られるものである。
【0060】
ＡＬＩＧＮ－２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、所定のアミノ酸配列Ａの所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂに対して、と、またはについてのある％のアミノ酸配列同一性を有する又は含む所定のアミノ酸配列Ａともいう）は以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙ×１００
分数Ｘ／Ｙ×１００
【0061】
ここで、Ｘは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２において該プログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。特に断りのない限り、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムによって得られるものである。
【0062】
本文において使用されているように、用語の「治療」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状の発生、発症を完全または一部予防すること、あるいは疾患及び／またはその症状を一部または完全軽減すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。さらに以下を含む：（ａ）疾患が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況であること；（ｂ）疾患を抑制し、その形成を阻害すること；及び（ｃ）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状の減退または消失を引き起こすこと。
【0063】
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。
【0064】
「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）の量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
【0065】
本発明のプラスミノーゲンの調製
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３－２８４ページ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９－２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ Ａ．２００６Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．６：３－１０及びＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡら ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３－８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより小さい不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンとＮ保護を受けている単一のアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と連結する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、その後それを切除する。
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３－２８４ページ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９－２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ Ａ．２００６Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．６：３－１０及びＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡら ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３－８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより小さい不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンとＮ保護を受けている単一のアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と連結する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、その後それを切除する。
【0066】
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノーゲンを生産する。例えば、プラスミノーゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に連結させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーターシステムとすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノーゲンの収集及び精製に適した条件下において宿主を維持する。
【0067】
適切な発現ベクターは通常宿主体内において遊離体または宿主染色体ＤＮＡの組み込む部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、インビトロで所望のＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。
【0068】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は目的抗体をコードするポリヌクレオチドをクローンするための原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と相容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、β－ラクタマーゼプロモーターシステム、またはファージλ由来のプロモーターシステムである。プロモーターは一般的に発現を制御し、必要に応じてオペレーター遺伝子配列において、転写及び翻訳を起動するために、さらにリボソームの結合位置配列などを有してもよい。
【0069】
その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えばサッカロミセス（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３－ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母プロモーターには特にアルコール脱水素酵素、イソチトクロムＣ、及びマルトースとガラクトースの利用のための酵素由来のプロモーターを含む。
【0070】
微生物以外に、哺乳動物細胞（例えばインビトロ細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明の抗－Ｔａｕ抗体（例えばかかる目的抗－Ｔａｕ抗体をコードするポリヌクレオチド）の発現及び生成に用いることができる。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマを含む。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報サイト、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。
【0071】
一旦（化学または組み換え的に）合成されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノーゲンを精製することができる。該プラスミノーゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％～９０％の純度で、少なくとも約９０％～９５％の純度で、または９８％～９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、かかる目的生成物以外の大分子などである。
【0072】
薬物配合剤
所望の純度のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）と必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；ｍ-クレゾール）；低分子量ポリペプチド（約１０個より少ない残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛－タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましい凍結乾燥された抗ＶＥＧＦ抗体製剤は、ＷＯ９７／０４８０１に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
所望の純度のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）と必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；ｍ-クレゾール）；低分子量ポリペプチド（約１０個より少ない残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛－タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましい凍結乾燥された抗ＶＥＧＦ抗体製剤は、ＷＯ９７／０４８０１に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【0073】
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。
【0074】
本発明のプラスミノーゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に内包ことができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたは粗エマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【0075】
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）は必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌濾過膜で濾過することで容易に実現できる。
【0076】
本発明のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）は徐放製剤を調製できる。徐放製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過マトリックスを含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２－ヒドロキシエチル－メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７－２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８－１０５（１９８２））またはポリ（ビニールアルコール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ－グルタミン酸とエチル－Ｌ－グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン－ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｖｉｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン－酢酸エチル及び乳酸－ヒドロキシ酢酸は、持続的に分子を１００日間以上放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ－Ｓ結合を形成することであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現できる。
【0077】
投与及び使用量
異なる方式、例えば鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬や点眼薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば、頸動脈を介して）、筋肉内、及び直腸内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。
異なる方式、例えば鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬や点眼薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば、頸動脈を介して）、筋肉内、及び直腸内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。
【0078】
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ―デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。
【0079】
医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノーゲンの薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１～２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１～５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）とすることができる。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１－５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってに従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量のスケジュール表は連続数日０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において治療効果及び安全性をリアルタイムに評価する必要がある。
【0080】
製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は、プラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）を含む製品または薬物キットに係るものである。前記製品は好ましくひとつの容器、ラベルまたはプロトコールを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）である。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の病症の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これには例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）の組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示することを含む。
本発明の一つの実施形態は、プラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）を含む製品または薬物キットに係るものである。前記製品は好ましくひとつの容器、ラベルまたはプロトコールを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）である。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の病症の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これには例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）の組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示することを含む。
【実施例】
【0081】
以下の実施例で使用されるヒトプラスミノーゲンは、ドナーの血漿に由来し、以下の文書：ＫｅｎｎｅｔｈＣ Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｌｏｕｉｓ Ｓｕｍｍａｒｉａ，Ｄａｖｉｄ Ｅｌｗｙｎ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｒｔｈｅｒ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６５，２４０（１）：５４１－５５０；Ｓｕｍｍａｒｉａ Ｌ，Ｓｐｉｔｚ Ｆ，Ａｒｚａｄｏｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｇｌｕ－ ａｎｄ Ｌｙｓ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｎｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９７６ Ｊｕｎ ２５；２５１（１２）：３６９３－９；ＨＡＧＡＮ ＪＪ，ＡＢＬＯＮＤＩ ＦＢ，ＤＥ ＲＥＮＺＯ ＥＣ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９６０ Ａｐｒ；２３５：１００５－１０に記載された方法に基づき、プロセスを最適化し、ヒトドナー血漿から精製して得られた。プラスミノーゲン単体の純度は９８％を上回った。
【実施例】
【0082】
実施例１は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの自発活動及び回避行動を改善することに関するものである。
１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス２８匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。ブランク対照群のマウスには生理食塩水溶液２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群のマウスには１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ－１，２，３，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，ＭＰＴＰ）溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［１］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、すべてのマウスの体重測定及びオープンフィールド行動試験を実施した。モデル群のマウスを体重及びオープンフィールドの結果に応じてランダムに２群に分け、投与群１０匹、溶媒群１０匹とし、投与を開始し、投与開始日を１日目として記録した。投与群マウスに１ｍｇ／１００μｌ／匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に１００μｌ／匹で溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を注射し、連続して１４日間投与し、投与の１５日目にオープンフィールド試験を行った。
ＭＰＴＰは特定の強力な黒質毒素であり、その代謝産物であるＭＰＰ＋（１－メチル－４－フェニルピリジニウム）はミトコンドリア複合体Ｉ阻害剤であり、血液脳関門を通過し、ミトコンドリアの酸化的呼吸鎖やその他の損傷経路をブロックし、黒質と線条体のドーパミンニューロンを損傷し、ヒトパーキンソン病の症状を模倣することができる［２］。
オープンフィールド実験
実験時、オープンフィールド（４０×４０×４０ｃｍ）の底面中央にマウスを置き、撮影と計時を同時に行い、持続して５分間観察し、各マウスは３回の実験を行った。記録するパラメーターは、総移動距離、境界休憩時間率、境界ゾーンの移動距離、境界ゾーンの移動距離の割合、境界ゾーンの徐行時間率、境界ゾーン時間率、境界ゾーンエントリ回数、中心ゾーン移動距離、中心ゾーン移動距離の割合、中心ゾーンの最大移動速度、中心ゾーン時間率、中央ゾーンエントリ回数、及び移動軌跡を含む。各実験後、匂いの好みを防ぐために７０％のアルコールを使用してボックスを拭いた。
オープンフィールド実験の設計原理は、マウスの回避に基づいている。これは、マウスが開けた場所、未知の場所、潜在的に危険な場所を恐れているため、「壁に張り付く」性質を持っていることを指す。総距離と平均速度は、マウスの自発活動を反映する主なデータと見なされ、回避は、フィールドの周辺領域(４つのコーナーと４つの側面)でのマウスの活動によって評価された。回避を反映した周囲での活動時間から判断すると、時間が短縮することは、マウスがより「冒険的」な傾向にあることを示し、中央ゾーンでの活動時間が大幅に長くなることは、回避と不安(うつ病)のレベルが低いことを示す。
全体的な移動状況
総運動距離
総移動距離は、指定された試験時間内の移動軌跡の長さを指す。
その結果、ブランク対照群のマウスは実験中に一定の距離を移動し、プラスミノーゲン投与群のマウスの総運動距離は溶媒対照群よりも有意に短く、その差は統計的に有意であり（＊Ｐ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの総運動距離は、ブランク対照群に近かった（図１）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの自発活動の行動を回復させることができることを示している。
境界ゾーンでの移動状況
境界ゾーン休憩時間率
境界ゾーンとは、オープンフィールドの周囲（四隅と四つの辺）のことである。境界ゾーン休憩時間率とは、境界ゾーンでの休憩時間と総休憩時間（境界ゾーン休憩時間と中心ゾーン休憩時間とを含む）との比である。その結果、ブランク対照群のマウスは境界ゾーンで一定の休憩時間の割合を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンでの休憩時間の割合は溶媒対照群より有意に大きく、統計学的な差は非常に有意であり（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、プラスミノーゲン投与群の境界ゾーンでの休憩時間の割合はブランク対照群の値に近かった（図２）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
境界ゾーンの移動距離
境界ゾーンの移動距離は、指定された試験時間内における境界ゾーンでの移動軌跡の長さである。その結果、ブランク対照群のマウスが境界ゾーンで一定の移動距離を有し、溶媒対照群マウスの境界ゾーンでの移動距離はプラスミノーゲン投与群よりも長く、統計的差は有意に近く（Ｐ＝０．０５）、プラスミノーゲン投与群の境界ゾーンの移動距離は、ブランク対照群に近かった（図３）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
境界ゾーンの移動距離の割合（％）
境界ゾーンの移動距離の割合とは、境界ゾーンの移動距離と総移動距離（境界ゾーンの移動距離と中央ゾーンの移動距離とを含む）との比である。
その結果、ブランク対照群が境界ゾーンで一定の移動距離の割合を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンでの移動距離の割合は、溶媒対照群より有意に大きく、統計的に差は極めて有意であり（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、プラスミノーゲン投与群マウスの境界ゾーンでの移動距離の割合がブランク対照群に近かった（図４）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
境界ゾーンの徐行時間率
境界ゾーンの徐行時間率とは、試験時間内の境界ゾーンの徐行時間と総試験時間との比である。
その結果、ブランク対照群のマウスは境界ゾーンで一定の徐行時間の割合を持っており、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンでの徐行時間の割合は、溶媒対照群よりも有意に低く、統計的差は極めて有意であり（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、プラスミノーゲン投与群の境界ゾーンの徐行時間の割合は、ブランク対照群に近かった（図５）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
境界ゾーン時間率（％）
境界ゾーン時間率とは、境界ゾーンの時間と総試験時間との比である。
その結果、ブランク対照群のマウスが一定の境界ゾーン時間の割合を持っており、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンでの時間の割合は溶媒対照群よりも高く、統計的差は有意に近く（Ｐ＝０．０６）、プラスミノーゲン投与群の境界ゾーンでの時間の割合は、ブランク対照群に近かった（図６）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避行動のレベルを高め、不安を緩和できることを示している。
境界ゾーンエントリ回数
その結果、ブランク対照群のマウスは一定の境界ゾーンエントリ回数を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンエントリ回数は溶媒対照群に比べて有意に少なく、統計学的な差は有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界エントリ回数は、ブランク対照群に近かった（図７）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
中心ゾーンの移動状況
中心ゾーンの移動距離
中心ゾーンの移動距離とは、試験時間内の中心ゾーンの移動軌跡の長さのことである。
その結果、ブランク対照群のマウスは中央ゾーンで一定の移動距離を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの中央ゾーンの移動距離は溶媒対照群のマウスよりも有意に低く、その差は統計学的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの中央ゾーンの移動距離は、ブランク対照群の移動距離に近かった（図８）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
中心ゾーンの移動距離の割合（％）
中心ゾーンの移動距離の割合とは、試験時間内の中心ゾーンの移動軌跡の長さと総移動距離軌跡の長さとの比である。
その結果、ブランク対照群のマウスは中央ゾーンで一定の移動距離の割合を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの中央ゾーンの移動距離の割合は溶媒対照群のマウスよりも有意に低く、その差は統計学的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの中央ゾーンの移動距離の割合はブランク対照群に近かった（図９）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
中心ゾーンの最大移動速度
中心ゾーンの最大移動速度とは、試験時間内の中心ゾーンの最速の移動速度を指す。
その結果、ブランク対照群のマウスは中心ゾーンで一定の最大移動速度を持っており、プラスミノーゲン投与群のマウスの中心ゾーンでの最大移動速度は、溶媒対照群よりも有意に低く、統計的差は極めて有意であり（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、プラスミノーゲン投与群の中心ゾーンの最大移動速度は、ブランク対照群に近かった（図１０）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
中心ゾーン時間率（％）
中心ゾーン時間率とは、中心ゾーンの移動時間と総試験時間との比である。
その結果、ブランク対照群のマウスが一定の中心ゾーン滞在時間の割合を持っており、プラスミノーゲン投与群のマウスの中心ゾーンでの時間の割合は溶媒対照群よりも有意に低く、統計的差は有意に近く（Ｐ＝０．０６）、プラスミノーゲン投与群の中心ゾーンでの滞在時間の割合は、ブランク対照群に近かった（図１１）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避行動のレベルを高め、不安を緩和できることを示している。
中心ゾーンエントリ回数
その結果、ブランク対照群のマウスはほとんど中央ゾーンに入らず、回避傾向が正常であり、プラスミノーゲン投与群のマウスの中心ゾーンエントリ回数は溶媒群より有意に少なく、統計学的差は有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの中心ゾーンエントリ回数は、ブランク対照群に近かった（図１２）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
移動軌跡
その結果、オープンフィールド試験中、ブランク対照群のマウスは一定の総移動距離を有し、中心ゾーンの活動がほとんどなく、プラスミノーゲン投与群のマウスは溶媒対照群に比べて総移動距離及び中心ゾーンの活動が有意に減少する傾向があり、ブランク対照群のマウスに近かった（図１３）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス２８匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。ブランク対照群のマウスには生理食塩水溶液２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群のマウスには１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ－１，２，３，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，ＭＰＴＰ）溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［１］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、すべてのマウスの体重測定及びオープンフィールド行動試験を実施した。モデル群のマウスを体重及びオープンフィールドの結果に応じてランダムに２群に分け、投与群１０匹、溶媒群１０匹とし、投与を開始し、投与開始日を１日目として記録した。投与群マウスに１ｍｇ／１００μｌ／匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に１００μｌ／匹で溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を注射し、連続して１４日間投与し、投与の１５日目にオープンフィールド試験を行った。
ＭＰＴＰは特定の強力な黒質毒素であり、その代謝産物であるＭＰＰ＋（１－メチル－４－フェニルピリジニウム）はミトコンドリア複合体Ｉ阻害剤であり、血液脳関門を通過し、ミトコンドリアの酸化的呼吸鎖やその他の損傷経路をブロックし、黒質と線条体のドーパミンニューロンを損傷し、ヒトパーキンソン病の症状を模倣することができる［２］。
オープンフィールド実験
実験時、オープンフィールド（４０×４０×４０ｃｍ）の底面中央にマウスを置き、撮影と計時を同時に行い、持続して５分間観察し、各マウスは３回の実験を行った。記録するパラメーターは、総移動距離、境界休憩時間率、境界ゾーンの移動距離、境界ゾーンの移動距離の割合、境界ゾーンの徐行時間率、境界ゾーン時間率、境界ゾーンエントリ回数、中心ゾーン移動距離、中心ゾーン移動距離の割合、中心ゾーンの最大移動速度、中心ゾーン時間率、中央ゾーンエントリ回数、及び移動軌跡を含む。各実験後、匂いの好みを防ぐために７０％のアルコールを使用してボックスを拭いた。
オープンフィールド実験の設計原理は、マウスの回避に基づいている。これは、マウスが開けた場所、未知の場所、潜在的に危険な場所を恐れているため、「壁に張り付く」性質を持っていることを指す。総距離と平均速度は、マウスの自発活動を反映する主なデータと見なされ、回避は、フィールドの周辺領域(４つのコーナーと４つの側面)でのマウスの活動によって評価された。回避を反映した周囲での活動時間から判断すると、時間が短縮することは、マウスがより「冒険的」な傾向にあることを示し、中央ゾーンでの活動時間が大幅に長くなることは、回避と不安(うつ病)のレベルが低いことを示す。
全体的な移動状況
総運動距離
総移動距離は、指定された試験時間内の移動軌跡の長さを指す。
その結果、ブランク対照群のマウスは実験中に一定の距離を移動し、プラスミノーゲン投与群のマウスの総運動距離は溶媒対照群よりも有意に短く、その差は統計的に有意であり（＊Ｐ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの総運動距離は、ブランク対照群に近かった（図１）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの自発活動の行動を回復させることができることを示している。
境界ゾーンでの移動状況
境界ゾーン休憩時間率
境界ゾーンとは、オープンフィールドの周囲（四隅と四つの辺）のことである。境界ゾーン休憩時間率とは、境界ゾーンでの休憩時間と総休憩時間（境界ゾーン休憩時間と中心ゾーン休憩時間とを含む）との比である。その結果、ブランク対照群のマウスは境界ゾーンで一定の休憩時間の割合を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンでの休憩時間の割合は溶媒対照群より有意に大きく、統計学的な差は非常に有意であり（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、プラスミノーゲン投与群の境界ゾーンでの休憩時間の割合はブランク対照群の値に近かった（図２）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
境界ゾーンの移動距離
境界ゾーンの移動距離は、指定された試験時間内における境界ゾーンでの移動軌跡の長さである。その結果、ブランク対照群のマウスが境界ゾーンで一定の移動距離を有し、溶媒対照群マウスの境界ゾーンでの移動距離はプラスミノーゲン投与群よりも長く、統計的差は有意に近く（Ｐ＝０．０５）、プラスミノーゲン投与群の境界ゾーンの移動距離は、ブランク対照群に近かった（図３）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
境界ゾーンの移動距離の割合（％）
境界ゾーンの移動距離の割合とは、境界ゾーンの移動距離と総移動距離（境界ゾーンの移動距離と中央ゾーンの移動距離とを含む）との比である。
その結果、ブランク対照群が境界ゾーンで一定の移動距離の割合を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンでの移動距離の割合は、溶媒対照群より有意に大きく、統計的に差は極めて有意であり（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、プラスミノーゲン投与群マウスの境界ゾーンでの移動距離の割合がブランク対照群に近かった（図４）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
境界ゾーンの徐行時間率
境界ゾーンの徐行時間率とは、試験時間内の境界ゾーンの徐行時間と総試験時間との比である。
その結果、ブランク対照群のマウスは境界ゾーンで一定の徐行時間の割合を持っており、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンでの徐行時間の割合は、溶媒対照群よりも有意に低く、統計的差は極めて有意であり（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、プラスミノーゲン投与群の境界ゾーンの徐行時間の割合は、ブランク対照群に近かった（図５）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
境界ゾーン時間率（％）
境界ゾーン時間率とは、境界ゾーンの時間と総試験時間との比である。
その結果、ブランク対照群のマウスが一定の境界ゾーン時間の割合を持っており、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンでの時間の割合は溶媒対照群よりも高く、統計的差は有意に近く（Ｐ＝０．０６）、プラスミノーゲン投与群の境界ゾーンでの時間の割合は、ブランク対照群に近かった（図６）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避行動のレベルを高め、不安を緩和できることを示している。
境界ゾーンエントリ回数
その結果、ブランク対照群のマウスは一定の境界ゾーンエントリ回数を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界ゾーンエントリ回数は溶媒対照群に比べて有意に少なく、統計学的な差は有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの境界エントリ回数は、ブランク対照群に近かった（図７）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
中心ゾーンの移動状況
中心ゾーンの移動距離
中心ゾーンの移動距離とは、試験時間内の中心ゾーンの移動軌跡の長さのことである。
その結果、ブランク対照群のマウスは中央ゾーンで一定の移動距離を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの中央ゾーンの移動距離は溶媒対照群のマウスよりも有意に低く、その差は統計学的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの中央ゾーンの移動距離は、ブランク対照群の移動距離に近かった（図８）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
中心ゾーンの移動距離の割合（％）
中心ゾーンの移動距離の割合とは、試験時間内の中心ゾーンの移動軌跡の長さと総移動距離軌跡の長さとの比である。
その結果、ブランク対照群のマウスは中央ゾーンで一定の移動距離の割合を有し、プラスミノーゲン投与群のマウスの中央ゾーンの移動距離の割合は溶媒対照群のマウスよりも有意に低く、その差は統計学的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの中央ゾーンの移動距離の割合はブランク対照群に近かった（図９）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
中心ゾーンの最大移動速度
中心ゾーンの最大移動速度とは、試験時間内の中心ゾーンの最速の移動速度を指す。
その結果、ブランク対照群のマウスは中心ゾーンで一定の最大移動速度を持っており、プラスミノーゲン投与群のマウスの中心ゾーンでの最大移動速度は、溶媒対照群よりも有意に低く、統計的差は極めて有意であり（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、プラスミノーゲン投与群の中心ゾーンの最大移動速度は、ブランク対照群に近かった（図１０）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
中心ゾーン時間率（％）
中心ゾーン時間率とは、中心ゾーンの移動時間と総試験時間との比である。
その結果、ブランク対照群のマウスが一定の中心ゾーン滞在時間の割合を持っており、プラスミノーゲン投与群のマウスの中心ゾーンでの時間の割合は溶媒対照群よりも有意に低く、統計的差は有意に近く（Ｐ＝０．０６）、プラスミノーゲン投与群の中心ゾーンでの滞在時間の割合は、ブランク対照群に近かった（図１１）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避行動のレベルを高め、不安を緩和できることを示している。
中心ゾーンエントリ回数
その結果、ブランク対照群のマウスはほとんど中央ゾーンに入らず、回避傾向が正常であり、プラスミノーゲン投与群のマウスの中心ゾーンエントリ回数は溶媒群より有意に少なく、統計学的差は有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群のマウスの中心ゾーンエントリ回数は、ブランク対照群に近かった（図１２）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
移動軌跡
その結果、オープンフィールド試験中、ブランク対照群のマウスは一定の総移動距離を有し、中心ゾーンの活動がほとんどなく、プラスミノーゲン投与群のマウスは溶媒対照群に比べて総移動距離及び中心ゾーンの活動が有意に減少する傾向があり、ブランク対照群のマウスに近かった（図１３）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの回避を強化し、不安を緩和できることを示している。
【実施例】
【0083】
実施例２は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるＤＴＡの発現を促進できることに関するものである。
１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス４０匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で３２匹とした。ブランク対照群のマウスには溶媒溶液２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群のマウスには１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ－１，２，３，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，ＭＰＴＰ）溶液を４０ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［１］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデル群のマウスを体重に応じてランダムに２群に分け、溶媒群と投与群でそれぞれ１６匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。投与群マウスに１ｍｇ／１００μｌ／匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に１００μｌ／匹で溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を注射し、連続して１４日間投与し、投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの黒質を採取して１０％中性ホルムアルデヒド溶液で２４～４８時間固定した。固定された黒質組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）抗体（ａｂ７２６０、Ａｂｃａｍ）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）は神経変性疾患であり、その病理学的特徴として、黒質線条体ドーパミン作動性ニューロンの進行性死、残存ドーパミン作動性ニューロンの細胞質におけるレビー小体の形成、及び大脳基底核におけるドーパミンの欠乏、さらに引き起こすＰＤの典型的なジスキネジア症状の発生を含む。ドーパミントランスポーター（ｄｏｐａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ＤＡＴ）は、ドーパミンニューロンのシナプス前膜に位置し、ドーパミンニューロンのシナプス前機能を反映して、シナプス間隙に放出されたドーパミン伝達物質を再取り込みできる。ＤＡＴの減少は、ＰＤの発生と密接に関連している［３］。
その結果、ブランク対照群（図１４Ａ）のマウスの黒質のドーパミンニューロンは一定量のＤＴＡを発現し（矢印でマーク）、溶媒群（図１４Ｂ）のマウスの黒質のＤＴＡの発現量はブランク対照群よりも低く、プラスミノーゲン投与群（図１４Ｃ）マウスの黒質のＤＴＡの発現量は溶媒群より高かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるＤＴＡの発現を促進できることを示している。
１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス４０匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で３２匹とした。ブランク対照群のマウスには溶媒溶液２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群のマウスには１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ－１，２，３，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，ＭＰＴＰ）溶液を４０ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［１］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデル群のマウスを体重に応じてランダムに２群に分け、溶媒群と投与群でそれぞれ１６匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。投与群マウスに１ｍｇ／１００μｌ／匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に１００μｌ／匹で溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を注射し、連続して１４日間投与し、投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの黒質を採取して１０％中性ホルムアルデヒド溶液で２４～４８時間固定した。固定された黒質組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）抗体（ａｂ７２６０、Ａｂｃａｍ）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）は神経変性疾患であり、その病理学的特徴として、黒質線条体ドーパミン作動性ニューロンの進行性死、残存ドーパミン作動性ニューロンの細胞質におけるレビー小体の形成、及び大脳基底核におけるドーパミンの欠乏、さらに引き起こすＰＤの典型的なジスキネジア症状の発生を含む。ドーパミントランスポーター（ｄｏｐａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ＤＡＴ）は、ドーパミンニューロンのシナプス前膜に位置し、ドーパミンニューロンのシナプス前機能を反映して、シナプス間隙に放出されたドーパミン伝達物質を再取り込みできる。ＤＡＴの減少は、ＰＤの発生と密接に関連している［３］。
その結果、ブランク対照群（図１４Ａ）のマウスの黒質のドーパミンニューロンは一定量のＤＴＡを発現し（矢印でマーク）、溶媒群（図１４Ｂ）のマウスの黒質のＤＴＡの発現量はブランク対照群よりも低く、プラスミノーゲン投与群（図１４Ｃ）マウスの黒質のＤＴＡの発現量は溶媒群より高かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるＤＴＡの発現を促進できることを示している。
【実施例】
【0084】
実施例３は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体ニッスル小体の回復を促進できることに関するものである。
１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス４０匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で３２匹とした。ブランク対照群のマウスには溶媒溶液２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群のマウスには１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ－１，２，３，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，ＭＰＴＰ）溶液を４０ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［１］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデル群のマウスを体重に応じてランダムに２群に分け、溶媒群と投与群でそれぞれ１６匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。投与群マウスに１ｍｇ／１００μｌ／匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に１００μｌ／匹で溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を注射し、連続して１４日間投与し、投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの線条体を採取して１０％中性ホルムアルデヒド溶液で２４～４８時間固定した。固定された線条体組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。０.４％タールバイオレット染色液（ｐＨ＝３）で染色させた。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
ＰＤの主な病理学的変化は、黒質線条体ドーパミン作動性ニューロンの進行性変性及び壊死であり、線条体ドーパミン伝達物質のレベルが低下し、それによって大脳基底核回路全体の機能不全が引き起こされる［３］。クロマチンとも呼ばれるニッスル小体は、神経細胞に特有の構造であり、多くの粗面小胞体とその間に存在する遊離リボソームから構成され、タンパク質を合成する機能を持っており、ニッスル小体の数と分布はニューロンの機能状態と密接に関係しており、神経細胞の生存の指標と見なされている［４］。その結果、ブランク対照群（図１５Ａ）のマウスの線条体ニューロンに一定数のニッスル小体が存在し（矢印でマーク）、溶媒対照群（図１５Ｂ）のマウスの線条体ニューロンにあるニッスル小体の数はブランク対照群よりも有意に多く、統計学的差は有意に近く（Ｐ＝０．０８５）、プラスミノーゲン投与群（図１５Ｃ）のマウスの線条体ニューロンのニッスル小体の数は、ブランク対照群に比べて有意な差はなかったが、溶媒対照群より有意に低く、しかもその差は統計学的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１５Ｄ）。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体ニッスル小体の回復を促進できることを示している。
１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス４０匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で３２匹とした。ブランク対照群のマウスには溶媒溶液２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群のマウスには１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ－１，２，３，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，ＭＰＴＰ）溶液を４０ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［１］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデル群のマウスを体重に応じてランダムに２群に分け、溶媒群と投与群でそれぞれ１６匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。投与群マウスに１ｍｇ／１００μｌ／匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に１００μｌ／匹で溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を注射し、連続して１４日間投与し、投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの線条体を採取して１０％中性ホルムアルデヒド溶液で２４～４８時間固定した。固定された線条体組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。０.４％タールバイオレット染色液（ｐＨ＝３）で染色させた。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
ＰＤの主な病理学的変化は、黒質線条体ドーパミン作動性ニューロンの進行性変性及び壊死であり、線条体ドーパミン伝達物質のレベルが低下し、それによって大脳基底核回路全体の機能不全が引き起こされる［３］。クロマチンとも呼ばれるニッスル小体は、神経細胞に特有の構造であり、多くの粗面小胞体とその間に存在する遊離リボソームから構成され、タンパク質を合成する機能を持っており、ニッスル小体の数と分布はニューロンの機能状態と密接に関係しており、神経細胞の生存の指標と見なされている［４］。その結果、ブランク対照群（図１５Ａ）のマウスの線条体ニューロンに一定数のニッスル小体が存在し（矢印でマーク）、溶媒対照群（図１５Ｂ）のマウスの線条体ニューロンにあるニッスル小体の数はブランク対照群よりも有意に多く、統計学的差は有意に近く（Ｐ＝０．０８５）、プラスミノーゲン投与群（図１５Ｃ）のマウスの線条体ニューロンのニッスル小体の数は、ブランク対照群に比べて有意な差はなかったが、溶媒対照群より有意に低く、しかもその差は統計学的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１５Ｄ）。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体ニッスル小体の回復を促進できることを示している。
【実施例】
【0085】
実施例４は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるニッスル小体の回復を促進できることに関するものである。
１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス２８匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデル群のマウスを体重に応じてランダムに２群に分け、溶媒群と投与群でそれぞれ１０匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。投与群マウスに１ｍｇ／１００μｌ／匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に１００μｌ／匹で溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を注射し、連続して１４日間投与し、投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの黒質を採取して１０％中性ホルムアルデヒド溶液で２４～４８時間固定した。固定された黒質組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。０.４％タールバイオレット染色液（ｐＨ＝３）で染色させた。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図１６Ａ）のマウスの黒質に一定量のニッスル小体が存在し（矢印でマーク）、溶媒対照群（図１６Ｂ）のマウスの黒質におけるニッスル小体の数が減少し、プラスミノーゲン投与群（図１６Ｃ）のマウスの黒質におけるニッスル小体の数は溶媒群よりも高かった。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるニッスル小体の回復を促進できることを示している。
１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス２８匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデル群のマウスを体重に応じてランダムに２群に分け、溶媒群と投与群でそれぞれ１０匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。投与群マウスに１ｍｇ／１００μｌ／匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に１００μｌ／匹で溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を注射し、連続して１４日間投与し、投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの黒質を採取して１０％中性ホルムアルデヒド溶液で２４～４８時間固定した。固定された黒質組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。０.４％タールバイオレット染色液（ｐＨ＝３）で染色させた。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図１６Ａ）のマウスの黒質に一定量のニッスル小体が存在し（矢印でマーク）、溶媒対照群（図１６Ｂ）のマウスの黒質におけるニッスル小体の数が減少し、プラスミノーゲン投与群（図１６Ｃ）のマウスの黒質におけるニッスル小体の数は溶媒群よりも高かった。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるニッスル小体の回復を促進できることを示している。
【実施例】
【0086】
実施例５は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるＧＬＰ－１Ｒの発現を促進できることに関するものである。
９週齢のＣ５７オスマウス１２匹を取り、モデリングの１日前にマウスの体重を測定し、マウスには３０ｍｇ／ｋｇ体重で毎日５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［６～７］。ＭＰＴＰ溶液の調製：シリンジを使用して１０ｍｌの脱イオン水を吸引し、それを１００ｍｇのＭＰＴＰ粉末（ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）に加え、１０ｍｇ／ｍｌの母液を調製し、母液１ｍｌをアンプルに吸引し、次に１ｍｌの脱イオン水を加え、最終濃度が５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、マウスをランダムに２群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群でそれぞれ６匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同量のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１４日間投与した。投与の１５日目にマウスを殺処分し、脳を速やかに採取して４％パラホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された脳組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の黒質を位置付け、切片の厚さは４μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＧＬＰ－１Ｒ抗体（ＮＯＶＵＳ，ＮＢＰ１－９７３０８）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
グルカゴン様ペプチド１受容体（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＬＰ－１Ｒ）は、グルカゴン受容体ファミリーのメンバーの１つであり、インスリン分泌を促進することによって血糖値を調節するＧタンパク質共役受容体である［８～９］。パーキンソン病は、ＧＬＰ－１Ｒも発現する黒質線条体ニューロンにおけるドーパミン作動性シグナル伝達の喪失を特徴としている［１０］。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図１７Ｂ）のマウスの黒質におけるＧＬＰ－１Ｒの発現量（矢印でマーク）は、溶媒ＰＢＳ対照群（図１７Ａ）よりも有意に多く、その差は統計学的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１７Ｃ）。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるＧＬＰ－１Ｒの発現を促進できることを示している。
９週齢のＣ５７オスマウス１２匹を取り、モデリングの１日前にマウスの体重を測定し、マウスには３０ｍｇ／ｋｇ体重で毎日５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［６～７］。ＭＰＴＰ溶液の調製：シリンジを使用して１０ｍｌの脱イオン水を吸引し、それを１００ｍｇのＭＰＴＰ粉末（ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）に加え、１０ｍｇ／ｍｌの母液を調製し、母液１ｍｌをアンプルに吸引し、次に１ｍｌの脱イオン水を加え、最終濃度が５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、マウスをランダムに２群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群でそれぞれ６匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同量のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１４日間投与した。投与の１５日目にマウスを殺処分し、脳を速やかに採取して４％パラホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された脳組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の黒質を位置付け、切片の厚さは４μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＧＬＰ－１Ｒ抗体（ＮＯＶＵＳ，ＮＢＰ１－９７３０８）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
グルカゴン様ペプチド１受容体（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＬＰ－１Ｒ）は、グルカゴン受容体ファミリーのメンバーの１つであり、インスリン分泌を促進することによって血糖値を調節するＧタンパク質共役受容体である［８～９］。パーキンソン病は、ＧＬＰ－１Ｒも発現する黒質線条体ニューロンにおけるドーパミン作動性シグナル伝達の喪失を特徴としている［１０］。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図１７Ｂ）のマウスの黒質におけるＧＬＰ－１Ｒの発現量（矢印でマーク）は、溶媒ＰＢＳ対照群（図１７Ａ）よりも有意に多く、その差は統計学的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１７Ｃ）。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるＧＬＰ－１Ｒの発現を促進できることを示している。
【実施例】
【0087】
実施例６は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるＴＨの発現を促進できることに関するものである。
９週齢のＣ５７オスマウス１２匹を取り、モデリングの１日前にマウスの体重を測定し、マウスには３０ｍｇ／ｋｇ体重で毎日５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［６～７］。ＭＰＴＰ溶液の調製：シリンジを使用して１０ｍｌの脱イオン水を吸引し、それを１００ｍｇのＭＰＴＰ粉末（ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）に加え、１０ｍｇ／ｍｌの母液を調製し、母液１ｍｌをアンプルに吸引し、次に１ｍｌの脱イオン水を加え、最終濃度が５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、マウスをランダムに２群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群でそれぞれ６匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同量のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１４日間投与した。投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの黒質を採取して４％パラホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された黒質をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の黒質を位置付け、切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＴＨ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，２５８５９－１－ＡＰ）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
チロシンヒドロキシラーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，ＴＨ）は、Ｌ－ドーパ（Ｌ－ｄｏｐａ）のチロシン合成の律速酵素であり、細胞質でのみ発現し、ドーパミンニューロンに豊富に存在する。黒質のＴＨ陽性ニューロンのほとんどはドーパミン作動性であるため、ＴＨは黒質のドーパミン作動性ニューロンのマーカーとして使用でき、黒質でのＴＨの発現量はＰＤを検出するための指標になる［１１］。
その結果、ブランク対照群（図１８Ａ）のマウスの黒質には一定量のＴＨ陽性細胞（矢印でマーク）が存在し、溶媒群（図１８Ｂ）のマウスの黒質のＴＨ陽性細胞の数が減少し、プラスミノーゲン投与群（図１８Ｃ）のマウスの黒質におけるＴＨ陽性細胞の数は溶媒群よりも有意に高かった。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質においてＴＨ陽性細胞の数を増加させることができることを示している。
９週齢のＣ５７オスマウス１２匹を取り、モデリングの１日前にマウスの体重を測定し、マウスには３０ｍｇ／ｋｇ体重で毎日５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［６～７］。ＭＰＴＰ溶液の調製：シリンジを使用して１０ｍｌの脱イオン水を吸引し、それを１００ｍｇのＭＰＴＰ粉末（ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）に加え、１０ｍｇ／ｍｌの母液を調製し、母液１ｍｌをアンプルに吸引し、次に１ｍｌの脱イオン水を加え、最終濃度が５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、マウスをランダムに２群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群でそれぞれ６匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同量のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１４日間投与した。投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの黒質を採取して４％パラホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された黒質をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の黒質を位置付け、切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＴＨ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，２５８５９－１－ＡＰ）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
チロシンヒドロキシラーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，ＴＨ）は、Ｌ－ドーパ（Ｌ－ｄｏｐａ）のチロシン合成の律速酵素であり、細胞質でのみ発現し、ドーパミンニューロンに豊富に存在する。黒質のＴＨ陽性ニューロンのほとんどはドーパミン作動性であるため、ＴＨは黒質のドーパミン作動性ニューロンのマーカーとして使用でき、黒質でのＴＨの発現量はＰＤを検出するための指標になる［１１］。
その結果、ブランク対照群（図１８Ａ）のマウスの黒質には一定量のＴＨ陽性細胞（矢印でマーク）が存在し、溶媒群（図１８Ｂ）のマウスの黒質のＴＨ陽性細胞の数が減少し、プラスミノーゲン投与群（図１８Ｃ）のマウスの黒質におけるＴＨ陽性細胞の数は溶媒群よりも有意に高かった。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質においてＴＨ陽性細胞の数を増加させることができることを示している。
【実施例】
【0088】
実施例７は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるミクログリアの数に影響を与えることに関するものである。
９週齢のＣ５７オスマウス１２匹を取り、モデリングの１日前にマウスの体重を測定し、マウスには３０ｍｇ／ｋｇ体重で毎日５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［６～７］。ＭＰＴＰ溶液の調製：シリンジを使用して１０ｍｌの脱イオン水を吸引し、それを１００ｍｇのＭＰＴＰ粉末（ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）に加え、１０ｍｇ／ｍｌの母液を調製し、母液１ｍｌをアンプルに吸引し、次に１ｍｌの脱イオン水を加え、最終濃度が５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、マウスをランダムに２群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群でそれぞれ６匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同量のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１４日間投与した。投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの中脳の黒質を採取して４％パラホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された黒質をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の黒質を位置付け、切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＩｂａ－１抗体（Ａｂｃａｍ）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
ミクログリアは、中枢神経系に固有の自然免疫細胞であり、脳の病変や損傷によって活性化される。活性化されたミクログリアは損傷部位に移動し、死細胞の食作用、炎症誘発性サイトカインの増加などのさまざまな機能を発揮し、さまざまな中枢神経系疾患に関与している［１２～１４］。Ｉｂａ－１（イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｏｎｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｄａｐｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １））は約１７ｋＤａのカルシウム結合タンパク質であり、中枢神経系ミクログリアで特異的に発現し、ミクログリアマーカーとして広く使用されている［１５～１７］。
その結果、ブランク対照群（図１９Ａ）のマウスの黒質に一定量のミクログリアが存在し（矢印でマーク）、溶媒対照群（図１９Ｂ）のマウスの黒質にあるミクログリアの数がブランク対照群よりも多く、プラスミノーゲン投与群（図１９Ｃ）のマウスの黒質におけるミクログリアの数は溶媒対照群より有意に少なく、ブランク対照群に近かった。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるミクログリアの数に影響を与えることを示している。
９週齢のＣ５７オスマウス１２匹を取り、モデリングの１日前にマウスの体重を測定し、マウスには３０ｍｇ／ｋｇ体重で毎日５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［６～７］。ＭＰＴＰ溶液の調製：シリンジを使用して１０ｍｌの脱イオン水を吸引し、それを１００ｍｇのＭＰＴＰ粉末（ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）に加え、１０ｍｇ／ｍｌの母液を調製し、母液１ｍｌをアンプルに吸引し、次に１ｍｌの脱イオン水を加え、最終濃度が５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、マウスをランダムに２群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群でそれぞれ６匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同量のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１４日間投与した。投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの中脳の黒質を採取して４％パラホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された黒質をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の黒質を位置付け、切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＩｂａ－１抗体（Ａｂｃａｍ）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
ミクログリアは、中枢神経系に固有の自然免疫細胞であり、脳の病変や損傷によって活性化される。活性化されたミクログリアは損傷部位に移動し、死細胞の食作用、炎症誘発性サイトカインの増加などのさまざまな機能を発揮し、さまざまな中枢神経系疾患に関与している［１２～１４］。Ｉｂａ－１（イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｏｎｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｄａｐｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １））は約１７ｋＤａのカルシウム結合タンパク質であり、中枢神経系ミクログリアで特異的に発現し、ミクログリアマーカーとして広く使用されている［１５～１７］。
その結果、ブランク対照群（図１９Ａ）のマウスの黒質に一定量のミクログリアが存在し（矢印でマーク）、溶媒対照群（図１９Ｂ）のマウスの黒質にあるミクログリアの数がブランク対照群よりも多く、プラスミノーゲン投与群（図１９Ｃ）のマウスの黒質におけるミクログリアの数は溶媒対照群より有意に少なく、ブランク対照群に近かった。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるミクログリアの数に影響を与えることを示している。
【実施例】
【0089】
実施例８は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体ミエリンの回復を促進できることに関するものである。
９週齢のＣ５７オスマウス１２匹を取り、モデリングの１日前にマウスの体重を測定し、マウスには３０ｍｇ／ｋｇ体重で毎日５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［６～７］。ＭＰＴＰ溶液の調製：シリンジを使用して１０ｍｌの脱イオン水を吸引し、それを１００ｍｇのＭＰＴＰ粉末（ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）に加え、１０ｍｇ／ｍｌの母液を調製し、母液１ｍｌをアンプルに吸引し、次に１ｍｌの脱イオン水を加え、最終濃度が５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、マウスをランダムに２群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群でそれぞれ６匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同量のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１４日間投与した。投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの線条体を採取して１０％中性ホルムアルデヒド溶液で２４～４８時間固定した。固定された線条体をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。０．１％ＬＦＢ色素溶液を使用して染色し、シールして８～１６時間浸漬した。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
神経変性疾患とは、脳と脊髄のニューロンまたはそのミエリンの喪失によって引き起こされる疾患を指す。ＬＦＢ（Ｌｕｘｏｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅ）は、ミエリン損傷を反映できるミエリン特異的染色法である［１８～１９］。
その結果、ブランク対照群（図２０Ａ）のマウスの線条体に一定量のミエリンが存在し、溶媒群（図２０Ｂ）のマウスの線条体のミエリンの染色がブランク対照群よりも少なく、プラスミノーゲン投与群（図２０Ｃ）のマウスの線条体におけるミエリンの染色は溶媒群より有意に高く、しかもブランク対照群に近かった。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体のミエリンをある程度回復させることができることを示している。
９週齢のＣ５７オスマウス１２匹を取り、モデリングの１日前にマウスの体重を測定し、マウスには３０ｍｇ／ｋｇ体重で毎日５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［６～７］。ＭＰＴＰ溶液の調製：シリンジを使用して１０ｍｌの脱イオン水を吸引し、それを１００ｍｇのＭＰＴＰ粉末（ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）に加え、１０ｍｇ／ｍｌの母液を調製し、母液１ｍｌをアンプルに吸引し、次に１ｍｌの脱イオン水を加え、最終濃度が５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、マウスをランダムに２群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群でそれぞれ６匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同量のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１４日間投与した。投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの線条体を採取して１０％中性ホルムアルデヒド溶液で２４～４８時間固定した。固定された線条体をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。０．１％ＬＦＢ色素溶液を使用して染色し、シールして８～１６時間浸漬した。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
神経変性疾患とは、脳と脊髄のニューロンまたはそのミエリンの喪失によって引き起こされる疾患を指す。ＬＦＢ（Ｌｕｘｏｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅ）は、ミエリン損傷を反映できるミエリン特異的染色法である［１８～１９］。
その結果、ブランク対照群（図２０Ａ）のマウスの線条体に一定量のミエリンが存在し、溶媒群（図２０Ｂ）のマウスの線条体のミエリンの染色がブランク対照群よりも少なく、プラスミノーゲン投与群（図２０Ｃ）のマウスの線条体におけるミエリンの染色は溶媒群より有意に高く、しかもブランク対照群に近かった。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体のミエリンをある程度回復させることができることを示している。
【実施例】
【0090】
実施例９は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質α－シヌクレインの発現を減少させることができることに関するものである。
１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス２８匹を取り、モデリングの１日前に体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデル群のマウスを体重に応じてランダムに２群に分け、溶媒群と投与群でそれぞれ１０匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。投与群マウスに１ｍｇ／１００μｌ／匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に１００μｌ／匹で溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を注射し、連続して１４日間投与し、投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの黒質を採取して４％パラホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された黒質（脳組織）をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の黒質を位置付け、切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスα－シヌクレイン抗体（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，１０８４２－１－ＡＰ）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
パーキンソン病は、現在、中脳黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの欠如及びレビー小体の出現によって引き起こされると考えられている。α－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）は、１４０アミノ酸残基から構成されるニューロンタンパク質であり、神経細胞の損傷を引き起こし、中枢神経系の神経変性のプロセスに関与する可能性がある。研究では、神経細胞のレビー小体と神経シナプス内で凝集したα－シヌクレインは、パーキンソン病における脳病変の特徴であることが明らかになった［２０］。
その結果、ブランク対照群（図２１Ａ）のマウスの黒質には少量のα－シヌクレインしかなく、溶媒群（図２１Ｂ）のマウスの黒質中のα－シヌクレインの量は、ブランク対照群のマウスよりも有意に高かく（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群（図２１Ｃ）のマウスの黒質中のα－シヌクレインの量は溶媒群よりも有意に低く、ブランク対照群に近く、その差は統計学的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図２１Ｄ）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるα－シヌクレインの発現を低下させ、神経損傷変性を改善できることを示している。
１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス２８匹を取り、モデリングの１日前に体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデル群のマウスを体重に応じてランダムに２群に分け、溶媒群と投与群でそれぞれ１０匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。投与群マウスに１ｍｇ／１００μｌ／匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に１００μｌ／匹で溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を注射し、連続して１４日間投与し、投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの黒質を採取して４％パラホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された黒質（脳組織）をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の黒質を位置付け、切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスα－シヌクレイン抗体（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，１０８４２－１－ＡＰ）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
パーキンソン病は、現在、中脳黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの欠如及びレビー小体の出現によって引き起こされると考えられている。α－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）は、１４０アミノ酸残基から構成されるニューロンタンパク質であり、神経細胞の損傷を引き起こし、中枢神経系の神経変性のプロセスに関与する可能性がある。研究では、神経細胞のレビー小体と神経シナプス内で凝集したα－シヌクレインは、パーキンソン病における脳病変の特徴であることが明らかになった［２０］。
その結果、ブランク対照群（図２１Ａ）のマウスの黒質には少量のα－シヌクレインしかなく、溶媒群（図２１Ｂ）のマウスの黒質中のα－シヌクレインの量は、ブランク対照群のマウスよりも有意に高かく（＊はＰ＜０．０５を表す）、プラスミノーゲン投与群（図２１Ｃ）のマウスの黒質中のα－シヌクレインの量は溶媒群よりも有意に低く、ブランク対照群に近く、その差は統計学的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図２１Ｄ）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるα－シヌクレインの発現を低下させ、神経損傷変性を改善できることを示している。
【実施例】
【0091】
実施例１０は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体軸索損傷を改善できることに関するものである。
１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス２８匹を取り、モデリングの１日前に体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデル群のマウスを体重に応じてランダムに２群に分け、溶媒群と投与群でそれぞれ１０匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。投与群マウスに１ｍｇ／１００μｌ／匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に１００μｌ／匹で溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を注射し、連続して１４日間投与し、投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの黒質を採取して４％パラホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された黒質をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の黒質を位置付け、切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＮＦ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２０７１７６）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ６７２１）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
パーキンソン病患者の疾患過程には軸索損傷があり、軸索損傷の重症度は疾患経過の延長とともに増加し続ける可能性がある。ニューロフィラメント（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ，ＮＦ）は神経軸索の主要な骨格タンパク質であり、正常なニューロンの形態と軸索輸送を維持する上で重要な役割を果たし、軸索損傷の関連するバイオマーカーとして使用できる［２１］。
その結果、ブランク対照群（図２２Ａ）のマウスの線条体に一定量のＮＦが存在し（矢印でマーク）、溶媒群（図２２Ｂ）のマウスの線条体におけるＮＦ量は、ブランク対照群よりも低く、プラスミノーゲン投与群（図２２Ｃ）のマウスの線条体中のＮＦ量は溶媒群よりも有意に高く、統計学的な差は極めて有意であった（＊＊はＰ＜０．０１を表す）（図２２Ｄ）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体におけるＮＦ発現の回復を促進し、パーキンソン病の線条体軸索損傷を修復できることを示している。
１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス２８匹を取り、モデリングの１日前に体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデル群のマウスを体重に応じてランダムに２群に分け、溶媒群と投与群でそれぞれ１０匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。投与群マウスに１ｍｇ／１００μｌ／匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に１００μｌ／匹で溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を注射し、連続して１４日間投与し、投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの黒質を採取して４％パラホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された黒質をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の黒質を位置付け、切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＮＦ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２０７１７６）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ６７２１）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
パーキンソン病患者の疾患過程には軸索損傷があり、軸索損傷の重症度は疾患経過の延長とともに増加し続ける可能性がある。ニューロフィラメント（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ，ＮＦ）は神経軸索の主要な骨格タンパク質であり、正常なニューロンの形態と軸索輸送を維持する上で重要な役割を果たし、軸索損傷の関連するバイオマーカーとして使用できる［２１］。
その結果、ブランク対照群（図２２Ａ）のマウスの線条体に一定量のＮＦが存在し（矢印でマーク）、溶媒群（図２２Ｂ）のマウスの線条体におけるＮＦ量は、ブランク対照群よりも低く、プラスミノーゲン投与群（図２２Ｃ）のマウスの線条体中のＮＦ量は溶媒群よりも有意に高く、統計学的な差は極めて有意であった（＊＊はＰ＜０．０１を表す）（図２２Ｄ）。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体におけるＮＦ発現の回復を促進し、パーキンソン病の線条体軸索損傷を修復できることを示している。
【実施例】
【0092】
実施例１１は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体ＧＦＡＰ発現を減少させることができることに関するものである。
１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス２８匹を取り、モデリングの１日前に体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデル群のマウスを体重に応じてランダムに２群に分け、溶媒群と投与群でそれぞれ１０匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。投与群マウスに１ｍｇ／１００μｌ／匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に１００μｌ／匹で溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を注射し、連続して１４日間投与し、投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの黒質を採取して４％パラホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された黒質をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の黒質を位置付け、切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＧＦＡＰ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ７２６０）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ６７２１）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
グリア線維性酸性タンパク質（ｇｉｌａＩ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）は、アストロサイトの細胞体コラーゲンを構成する重要な成分であり、アストロサイトのグリア線維中間径フィラメントにのみ存在し、アストロサイト活性化の特徴的なマーカーであり［２２］、ニューロンに炎症性損傷効果をもたらし、ニューロン変性を引き起こし［２３］、それによってパーキンソン病の発生を引き起こす。
その結果、ブランク対照群（図２３Ａ）のマウスの線条体に少量のＧＦＡＰ発現があり（矢印でマーク）、溶媒群（図２３Ｂ）のマウスの線条体におけるＧＦＡＰの発現量がブランク対照群より有意に高かく、プラスミノーゲン投与群（図２３Ｃ）のマウスの線条体におけるＧＦＡＰの発現量は溶媒群より低かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体におけるＧＦＡＰの発現を低下させ、線条体ニューロンの損傷を軽減できることを示している。
１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス２８匹を取り、モデリングの１日前に体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２０匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデル群のマウスを体重に応じてランダムに２群に分け、溶媒群と投与群でそれぞれ１０匹とし、投与を開始し、それを１日目として記録した。投与群マウスに１ｍｇ／１００μｌ／匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に１００μｌ／匹で溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を注射し、連続して１４日間投与し、投与の１５日目にマウスを殺処分し、マウスの黒質を採取して４％パラホルムアルデヒドで２４～４８時間固定した。固定された黒質をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の黒質を位置付け、切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＧＦＡＰ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ７２６０）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ６７２１）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
グリア線維性酸性タンパク質（ｇｉｌａＩ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）は、アストロサイトの細胞体コラーゲンを構成する重要な成分であり、アストロサイトのグリア線維中間径フィラメントにのみ存在し、アストロサイト活性化の特徴的なマーカーであり［２２］、ニューロンに炎症性損傷効果をもたらし、ニューロン変性を引き起こし［２３］、それによってパーキンソン病の発生を引き起こす。
その結果、ブランク対照群（図２３Ａ）のマウスの線条体に少量のＧＦＡＰ発現があり（矢印でマーク）、溶媒群（図２３Ｂ）のマウスの線条体におけるＧＦＡＰの発現量がブランク対照群より有意に高かく、プラスミノーゲン投与群（図２３Ｃ）のマウスの線条体におけるＧＦＡＰの発現量は溶媒群より低かった。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの線条体におけるＧＦＡＰの発現を低下させ、線条体ニューロンの損傷を軽減できることを示している。
【実施例】
【0093】
実施例１２は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおけるα－シヌクレインの分解を促進することに関するものである。
１１～１２週齢、１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス８匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で４匹、モデル群で４匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデリングが成功したかを確認するために、すべてのマウスについてオープンフィールド試験を行なった。全てのマウスを殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分間、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で遠心分離し、上清を取り、新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク対照群、（２）溶媒対照群、（３）プラスミノーゲン投与群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ α－シヌクレイン溶液（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）、ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３７８４０，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬ溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン投与群に２１.５ｍＬ α－シヌクレイン溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１.５時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解した）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャンした。
その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のα－シヌクレイン量が溶媒対照群に比べて有意に低く（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、その重合体ａ、ｂの量はいずれも溶媒対照群より有意に低く（＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のα－シヌクレインの量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は極めて有意であり（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、その重合体ａ及びｂの量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表す）（図２４）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウス及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトα－シヌクレイン及びその重合体を効果的に分解できることを示している。
１１～１２週齢、１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス８匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で４匹、モデル群で４匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデリングが成功したかを確認するために、すべてのマウスについてオープンフィールド試験を行なった。全てのマウスを殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分間、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で遠心分離し、上清を取り、新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク対照群、（２）溶媒対照群、（３）プラスミノーゲン投与群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ α－シヌクレイン溶液（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）、ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３７８４０，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬ溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン投与群に２１.５ｍＬ α－シヌクレイン溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１.５時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解した）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャンした。
その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のα－シヌクレイン量が溶媒対照群に比べて有意に低く（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、その重合体ａ、ｂの量はいずれも溶媒対照群より有意に低く（＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のα－シヌクレインの量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は極めて有意であり（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、その重合体ａ及びｂの量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は有意であった（＊はＰ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表す）（図２４）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウス及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトα－シヌクレイン及びその重合体を効果的に分解できることを示している。
【実施例】
【0094】
実施例１３は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおけるα－シヌクレインの分解を促進することに関するものである。
１１～１２週齢、１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス８匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で４匹、モデル群で４匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデリングが成功したかを確認するために、すべてのマウスについてオープンフィールド試験を行なった。全てのマウスを殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分間、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で遠心分離し、上清を取り、新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）プラスミノーゲン投与群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬの溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ α－シヌクレイン溶液（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）、ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３７８４０，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬ溶媒溶液、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン投与群に２１.５ｍＬ α－シヌクレイン溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で均一に混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１.５時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗ヒトα－シヌクレイン抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、１０８４２－１－ＡＰ）を加えて室温で３時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のα－シヌクレイン量が溶媒対照群に比べて有意に低く（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、その重合体の量はいずれも溶媒対照群より有意に低く（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のα－シヌクレインの量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は極めて有意であり（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、その重合体の量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）（図２５）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウス及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトα－シヌクレイン及びその重合体を効果的に分解できることを示している。
１１～１２週齢、１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス８匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で４匹、モデル群で４匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデリングが成功したかを確認するために、すべてのマウスについてオープンフィールド試験を行なった。全てのマウスを殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分間、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で遠心分離し、上清を取り、新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）プラスミノーゲン投与群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬの溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ α－シヌクレイン溶液（上海強耀生物科技有限公司（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）、ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３７８４０，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬ溶媒溶液、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン投与群に２１.５ｍＬ α－シヌクレイン溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１３２０）の説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で均一に混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで１.５時間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗ヒトα－シヌクレイン抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、１０８４２－１－ＡＰ）を加えて室温で３時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のα－シヌクレイン量が溶媒対照群に比べて有意に低く（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、その重合体の量はいずれも溶媒対照群より有意に低く（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のα－シヌクレインの量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は極めて有意であり（＊＊はＰ＜０．０１を表す）、その重合体の量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）（図２５）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウス及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトα－シヌクレイン及びその重合体を効果的に分解できることを示している。
【実施例】
【0095】
実施例１４は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおけるＰｒｏ－ＢＤＮＦの分解を促進することに関するものである。
１１～１２週齢、１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス４匹を取った。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデリングが成功したかを確認するために、すべてのマウスについてオープンフィールド試験を行なった。全てのマウスを殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分間、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で遠心分離し、上清、すなわち脳ホモジネートを取り、新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）プラスミノーゲン投与群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬの溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎ Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２３５６０，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬ溶媒溶液、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン投与群に２１μＬ Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで４５分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解した）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャン・分析した。
脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）は、分子量１２．３ｋＤの塩基性タンパク質であり、１１９個のアミノ酸残基からなり、３対のジスルフィド結合を含み、生体内で二量体化した形で存在し、ＢＤＮＦ前駆体の形で合成し、ＢＤＮＦ前駆体（Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ）は、酵素加水分解によって切断され、成熟したＢＤＮＦを形成する。Ｐｒｏ－ＢＤＮＦは、切断されて形成した成熟ＢＤＮＦと相反の効果を有することが文献で報告されている。Ｐｒｏ－ＢＤＮＦはニューロンのアポトーシスを促進し、シナプス可塑性を低下させる。成熟したＢＤＮＦ及びその受容体は、中枢神経系に広く分布しており、中枢神経系の発達中のニューロンの生存、分化、成長、発達に重要な役割を果たし、ニューロンが損傷を受けて死滅することを防ぎ、ニューロンの病理学的状態を改善し、損傷したニューロンの再生や分化などの生物学的効果を促進することができ、成熟した中枢神経系及び末梢神経系におけるニューロンの生存と正常な生理学的機能に必要である［２４］。
その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量が溶媒対照群に比べて有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）（図２６）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおいてＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進できることを示唆している。
１１～１２週齢、１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス４匹を取った。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデリングが成功したかを確認するために、すべてのマウスについてオープンフィールド試験を行なった。全てのマウスを殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分間、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で遠心分離し、上清、すなわち脳ホモジネートを取り、新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）プラスミノーゲン投与群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬの溶媒溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２％塩酸アルギニン、３％マンニトール、ｐＨ７．４）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎ Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２３５６０，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬ溶媒溶液、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン投与群に２１μＬ Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで４５分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、１‰のクーマシーブリリアントブルー染色液（１ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、エタノール：氷酢酸：精製水の体積比が５：２：１３の混合液１０００ｍｌに溶解した）に置いて３０分間染色した後、脱色液（精製水：氷酢酸：無水エタノール＝１７：２：１の体積比で混合）を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャン・分析した。
脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）は、分子量１２．３ｋＤの塩基性タンパク質であり、１１９個のアミノ酸残基からなり、３対のジスルフィド結合を含み、生体内で二量体化した形で存在し、ＢＤＮＦ前駆体の形で合成し、ＢＤＮＦ前駆体（Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ）は、酵素加水分解によって切断され、成熟したＢＤＮＦを形成する。Ｐｒｏ－ＢＤＮＦは、切断されて形成した成熟ＢＤＮＦと相反の効果を有することが文献で報告されている。Ｐｒｏ－ＢＤＮＦはニューロンのアポトーシスを促進し、シナプス可塑性を低下させる。成熟したＢＤＮＦ及びその受容体は、中枢神経系に広く分布しており、中枢神経系の発達中のニューロンの生存、分化、成長、発達に重要な役割を果たし、ニューロンが損傷を受けて死滅することを防ぎ、ニューロンの病理学的状態を改善し、損傷したニューロンの再生や分化などの生物学的効果を促進することができ、成熟した中枢神経系及び末梢神経系におけるニューロンの生存と正常な生理学的機能に必要である［２４］。
その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量が溶媒対照群に比べて有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）（図２６）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおいてＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断を促進できることを示唆している。
【実施例】
【0096】
実施例１５は、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおいてＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断及び成熟ＢＤＮＦの形成を促進することに関するものである。
１１～１２週齢、１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス８匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で４匹、モデル群で４匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデリングが成功したかを確認するために、すべてのマウスについてオープンフィールド試験を行なった。全てのマウスを殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分間、３～４回）、ホモジナイズした後、４℃（１２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で遠心分離し、上清、すなわち脳ホモジネートを取り、新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）プラスミノーゲン投与群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎ Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２３５６０，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬの溶媒溶液（クエン酸－クエン酸ナトリウム溶液）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン投与群に２１μＬのＰｒｏ－ＢＤＮＦ（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで４５分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化したＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗ヒトＢＤＮＦ抗体（Ｂｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＰＢ９０７５）を加えて室温で３時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量が溶媒対照群に比べて有意に低く、その差が有意であり（＊はＰ＜０．０５、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、プラスミノーゲン投与群のＢＤＮＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は極めて有意であった（図２７）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断及び成熟ＢＤＮＦの形成を促進できることを示唆している。
参考文献：
[1] M. Sedelis et al. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson’s Disease[J].Beha ioural Brain Research 125 (2001) 109-122.
[2]Meredith G E,Totterdell S,Potashkin J A,et al. Modeling PD pathogenesis in mice advantages of a chronic MPTP protocol[J]. Parkinsonism Relat Disord,2008,14(Suppl 2):S112-S115.
[3]Ken Ikeda, Junya Ebina, Kiyokazu Kawabe and Yasuo Iwasaki. Dopamine Transporter Imaging in Parkinson Disease:Progressive Changes and Therapeutic Modification after Anti-parkinsonian Medications [J].Internal Medicine,2019, 58: 1665-1672.
[4] HEBERT AE, DASH PK. Nonredundant roles for hippocampal and entorhinal cortical plasticity in spatial memory storage [J]. Pharmacology Biochemistry and Behavior, 2004, 79(1) :143-153.
[5] Won-Seok Choi, et al. Conditional deletion of Ndufs4 in dopaminergic neurons promotes Parkinson’s disease-like nonmotor symptoms without loss of dopamine neurons. Scientific Reports.
[6]Vernice Jackson-Lewis1 & Serge Przedborski. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson’s Disease [J]. Nature protocols VOL.2 NO.1, 2007(141).
[7]N. A. Tatton and S. J. Kish. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia aigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labeling and acridine orange staining[J].Neuroscience Vol.77, No.4,pp.1037-1048, 1997.
[8]D J Drucker, J Philippe, S Mojsov et al. Glucagon-like peptide I stimulates insulin gene expression and increases cyclic AMP levels in a rat islet cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 May; 84(10): 3434-3438.
[9]Mojsov S, Weir GC, Habener JF. Insulinotropin: glucagon-like peptide I (7-37) co-encoded in the glucagon gene is a potent stimulator of insulin release in the perfused rat pancreas. J Clin Invest. 1987 Feb;79(2):616-9.
[10]Li Y, Perry T, Kindy M.S, et al. (2009). GLP-1 receptor stimulation preserves primary cortical and dopaminergic neurons in cellular and rodent models of stroke and Parkinsonism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.106, 1285-1290.
[11]Toshiharu Nagatsu, Akria Nakashima, et al. Human tyrosine hydroxylase in Parkinson’s disease and in related disorders. Journal of Neural Transmission, 2019, 126:397-409.
[12]Lee TI, Yang CS, Fang KM, Tzeng SF (2009) Role of ciliary neurotrophic factor in microglial phagocytosis. Neurochem Res 34:109-117.
[13] Liuzzi GM, Latronico T, Rossano R, Viggiani S, Fasano A,Riccio P (2007) .Inhibitory effect of polyunsaturated fatty acids on MMP-9 release from microglial cells-implications for complementary multiple sclerosis treatment. Neurochem Res 32:2184-2193.
[14] Pasquini LA, Calatayud CA, Bertone Una AL, Millet V, Pasquini JM, Soto EF (2007) The neurotoxic effect of cuprizone on oligodendrocytes depends on the presence of pro-inflammatory cytokines secreted by microglia. Neurochem Res 32:279-292.
[15] Hirasawa T, Ohsawa K, Imai Y et al (2005) Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice.J Neurosci Res 81:357-362.
[16] Kalm M, Lannering B, Bjo¨rk-Eriksson T, Blomgren K (2009). Irradiation-induced loss of microglia in the young brain. J Neuroimmunol 206:70-75.
[17] Li ZH, Lu J, Tay SS, Wu YJ, Strong MJ, He BP (2006) Mice with targeted disruption of neurofilament light subunit display formation of protein aggregation in motoneurons and downregulation of complement receptor type 3 alpha subunit in microglia in the spinal cord at their earlier age: a possible feature in preclinical development of neurodegenerative diseases. Brain Res 1113:200-209.
[18]Khodanovich M Y, Sorokina I V, GIazacheva V Y, et a1. Histological validation of fast macromolecular proton fraction mapping as a quantitative myelin imaging method in the cuprizone demyelination mode[J]. Sci Rep, 2017, 7:46686.
[19]Wang C, Sun C, Hu Z, et al. Improved neural regeneration with olfactory ensheathing cell inoculated PLGA scaffolds in spinal cord injury adult rats [J].Neurosignals,2017,25(1):1-14.
[20] KALIA L V, KALIA S K. Alpha-Synuclein and Lewy pathology in Parkinson’s disease[J]. Curr Opin Neurol，2015，28（4）：375-381.
[21]Julien JP, Mushynski WE. Neurofilaments in health and disease[J]. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,1998,61:1-23．
[22]Middeldorp J, Hol E. GFAP in health and disease[J]．Prog Neurobiol, 2011, 93:421-443.
[23]Yokoyama H, Uchida H, Kuroiwa H, et al. Role of glial cells in neurotoxin induced animal models of Parkinson’s disease[J]. Neurol Sci, 2011, 32(1):1-7.
[24] Kowianski P, Lietzau G, Czuba E, Waskow M, Steliga A, Morys J. BDNF: A Key Factor with Multipotent Impact on Brain Signaling and Synaptic Plasticity. Cell Mol Neurobiol. 2018 Apr;38(3):579-593.
１１～１２週齢、１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス８匹を取り、モデリングの１日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で４匹、モデル群で４匹とした。モデリング時間は毎日午前９時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水２００μｌを腹腔内注射により投与し、モデル群には５ｍｇ／ｍｌ ＭＰＴＰ溶液を３５ｍｇ／ｋｇ／匹で腹腔内注射により投与し、５日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した［５］。ＭＰＴＰ溶液の調製：４５ｍｇ ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）を９ｍｌの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度５ｍｇ／ｍｌであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後６日目に、モデリングが成功したかを確認するために、すべてのマウスについてオープンフィールド試験を行なった。全てのマウスを殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳで加え、４℃でホモジナイズし（１分間、３～４回）、ホモジナイズした後、４℃（１２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で遠心分離し、上清、すなわち脳ホモジネートを取り、新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）プラスミノーゲン投与群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， ｃｕｓｔｏｍ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎ Ｐｒｏ－ＢＤＮＦ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２３５６０，１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬの溶媒溶液（クエン酸－クエン酸ナトリウム溶液）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン投与群に２１μＬのＰｒｏ－ＢＤＮＦ（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４.６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、５０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで４５分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化したＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗ヒトＢＤＮＦ抗体（Ｂｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＰＢ９０７５）を加えて室温で３時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＢＤＮＦ量が溶媒対照群に比べて有意に低く、その差が有意であり（＊はＰ＜０．０５、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、プラスミノーゲン投与群のＢＤＮＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は極めて有意であった（図２７）。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、組換えヒトＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断及び成熟ＢＤＮＦの形成を促進できることを示唆している。
参考文献：
[1] M. Sedelis et al. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson’s Disease[J].Beha ioural Brain Research 125 (2001) 109-122.
[2]Meredith G E,Totterdell S,Potashkin J A,et al. Modeling PD pathogenesis in mice advantages of a chronic MPTP protocol[J]. Parkinsonism Relat Disord,2008,14(Suppl 2):S112-S115.
[3]Ken Ikeda, Junya Ebina, Kiyokazu Kawabe and Yasuo Iwasaki. Dopamine Transporter Imaging in Parkinson Disease:Progressive Changes and Therapeutic Modification after Anti-parkinsonian Medications [J].Internal Medicine,2019, 58: 1665-1672.
[4] HEBERT AE, DASH PK. Nonredundant roles for hippocampal and entorhinal cortical plasticity in spatial memory storage [J]. Pharmacology Biochemistry and Behavior, 2004, 79(1) :143-153.
[5] Won-Seok Choi, et al. Conditional deletion of Ndufs4 in dopaminergic neurons promotes Parkinson’s disease-like nonmotor symptoms without loss of dopamine neurons. Scientific Reports.
[6]Vernice Jackson-Lewis1 & Serge Przedborski. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson’s Disease [J]. Nature protocols VOL.2 NO.1, 2007(141).
[7]N. A. Tatton and S. J. Kish. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia aigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labeling and acridine orange staining[J].Neuroscience Vol.77, No.4,pp.1037-1048, 1997.
[8]D J Drucker, J Philippe, S Mojsov et al. Glucagon-like peptide I stimulates insulin gene expression and increases cyclic AMP levels in a rat islet cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 May; 84(10): 3434-3438.
[9]Mojsov S, Weir GC, Habener JF. Insulinotropin: glucagon-like peptide I (7-37) co-encoded in the glucagon gene is a potent stimulator of insulin release in the perfused rat pancreas. J Clin Invest. 1987 Feb;79(2):616-9.
[10]Li Y, Perry T, Kindy M.S, et al. (2009). GLP-1 receptor stimulation preserves primary cortical and dopaminergic neurons in cellular and rodent models of stroke and Parkinsonism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.106, 1285-1290.
[11]Toshiharu Nagatsu, Akria Nakashima, et al. Human tyrosine hydroxylase in Parkinson’s disease and in related disorders. Journal of Neural Transmission, 2019, 126:397-409.
[12]Lee TI, Yang CS, Fang KM, Tzeng SF (2009) Role of ciliary neurotrophic factor in microglial phagocytosis. Neurochem Res 34:109-117.
[13] Liuzzi GM, Latronico T, Rossano R, Viggiani S, Fasano A,Riccio P (2007) .Inhibitory effect of polyunsaturated fatty acids on MMP-9 release from microglial cells-implications for complementary multiple sclerosis treatment. Neurochem Res 32:2184-2193.
[14] Pasquini LA, Calatayud CA, Bertone Una AL, Millet V, Pasquini JM, Soto EF (2007) The neurotoxic effect of cuprizone on oligodendrocytes depends on the presence of pro-inflammatory cytokines secreted by microglia. Neurochem Res 32:279-292.
[15] Hirasawa T, Ohsawa K, Imai Y et al (2005) Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice.J Neurosci Res 81:357-362.
[16] Kalm M, Lannering B, Bjo¨rk-Eriksson T, Blomgren K (2009). Irradiation-induced loss of microglia in the young brain. J Neuroimmunol 206:70-75.
[17] Li ZH, Lu J, Tay SS, Wu YJ, Strong MJ, He BP (2006) Mice with targeted disruption of neurofilament light subunit display formation of protein aggregation in motoneurons and downregulation of complement receptor type 3 alpha subunit in microglia in the spinal cord at their earlier age: a possible feature in preclinical development of neurodegenerative diseases. Brain Res 1113:200-209.
[18]Khodanovich M Y, Sorokina I V, GIazacheva V Y, et a1. Histological validation of fast macromolecular proton fraction mapping as a quantitative myelin imaging method in the cuprizone demyelination mode[J]. Sci Rep, 2017, 7:46686.
[19]Wang C, Sun C, Hu Z, et al. Improved neural regeneration with olfactory ensheathing cell inoculated PLGA scaffolds in spinal cord injury adult rats [J].Neurosignals,2017,25(1):1-14.
[20] KALIA L V, KALIA S K. Alpha-Synuclein and Lewy pathology in Parkinson’s disease[J]. Curr Opin Neurol，2015，28（4）：375-381.
[21]Julien JP, Mushynski WE. Neurofilaments in health and disease[J]. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,1998,61:1-23．
[22]Middeldorp J, Hol E. GFAP in health and disease[J]．Prog Neurobiol, 2011, 93:421-443.
[23]Yokoyama H, Uchida H, Kuroiwa H, et al. Role of glial cells in neurotoxin induced animal models of Parkinson’s disease[J]. Neurol Sci, 2011, 32(1):1-7.
[24] Kowianski P, Lietzau G, Czuba E, Waskow M, Steliga A, Morys J. BDNF: A Key Factor with Multipotent Impact on Brain Signaling and Synaptic Plasticity. Cell Mol Neurobiol. 2018 Apr;38(3):579-593.
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-11-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の治療有効量の化合物を含む、パーキンソン病を予防及び治療する薬剤。
【請求項2】
前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、プラスミノーゲン、組換えヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、及びｕＰＡから選択されるものである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項3】
前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの阻害剤、例えば、抗体である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項4】
前記化合物が、パーキンソン病の被験者に対して、記憶機能の回復促進、認知能力の改善、黒質におけるＤＴＡの発現促進、線条体ニッスル小体の回復促進、黒質におけるＧＬＰ－１Ｒの発現促進、黒質におけるＴＨ陽性細胞の増加、線条体ミエリン鞘の修復促進、脳組織におけるα－シヌクレインの分解促進、線条体ＮＦ発現の促進、軸索損傷修復の促進、線条体ＧＦＡＰ発現の低減、線条体ニューロン損傷の緩和、ＢＤＮＦの形成のための脳組織におけるＰｒｏ－ＢＤＮＦの切断促進、うつ病や不安の症状の緩和から選択される１つまたは複数の効果を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項5】
前記化合物がプラスミノーゲンである、請求項１～４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項6】
前記プラスミノーゲンが、ヒト全長プラスミノーゲンまたはその保存的置換変異体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項7】
前記プラスミノーゲンが、配列２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲンのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項8】
前記プラスミノーゲンが、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有するタンパク質を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項9】
前記プラスミノーゲンが、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、またはそれらの、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を保持した変異体から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項10】
前記プラスミノーゲンが、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列の保存的置換変異体を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項11】
前記化合物が、１つまたは複数の他の治療方法または薬剤と組み合わせて使用される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項12】
前記他の治療方法が、細胞療法（幹細胞療法を含む）及び物理的療法を含む、請求項１１に記載の薬剤。
【請求項13】
前記他の薬剤が、パーキンソン病の治療のための他の薬剤である、請求項１１に記載の薬剤。
【請求項14】
前記化合物が、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈を介して）、または筋肉内に投与される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の薬剤。【国際調査報告】