特表 2023-518566 ＴＲＢＣβ抗体コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-02

(54)【発明の名称】ＴＲＢＣβ抗体コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20230425BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230425BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230425BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230425BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230425BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

A61K47/68

A61K39/395 L

A61P35/02

C12N15/13 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022557873

(86)(22)【出願日】2021-03-24

(85)【翻訳文提出日】2022-11-11

(86)【国際出願番号】 GB2021050719

(87)【国際公開番号】W WO2021191607

(87)【国際公開日】2021-09-30

(31)【優先権主張番号】2004263.6

(32)【優先日】2020-03-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517215973

【氏名又は名称】オートラス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】オヌオハ， シモビ

(72)【発明者】

【氏名】フェラーリ， マテュー

(72)【発明者】

【氏名】アクバル， ズライカ

(72)【発明者】

【氏名】ブグダ， レイサ

(72)【発明者】

【氏名】プーレ， マーティン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF70

4C085AA26

4C085AA27

4C085BB11

4C085BB31

4C085DD62

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA70

4H045BA71

4H045BA72

4H045DA76

(57)【要約】

本開示は、ＴＣＲβ鎖定常領域（ＴＲＢＣ）に特異的に結合する抗体のコンジュゲートであって、この抗体は速い解離速度定数（ｋ_ｄ）を有する、抗体コンジュゲートを提供する。本発明はさらに、本発明の産物を利用する個別化された医療の医療的使用および方法を提供する。本発明は、例えば、ＴＣＲβ鎖定常領域（ＴＲＢＣ）に特異的に結合する抗体コンジュゲートであって、前記抗体は０．００１秒^－１～０．３秒^－１の範囲の解離速度定数（ｋ_ｄ）を有する、抗体コンジュゲートを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＣＲβ鎖定常領域（ＴＲＢＣ）に特異的に結合する抗体コンジュゲートであって、前記抗体は０．００１秒^－１～０．３秒^－１の範囲の解離速度定数（ｋ_ｄ）を有する、抗体コンジュゲート。

【請求項2】

前記抗体が、０．００２秒^－１～０．１秒^－１の範囲のｋ_ｄを有する、請求項１に記載の抗体コンジュゲート。

【請求項3】

前記抗体が、化学療法実体、放射性核種または検出実体にコンジュゲートされる、請求項１または２のいずれかに記載の抗体コンジュゲート。

【請求項4】

前記化学療法実体がチューブリン阻害剤である、請求項３に記載の抗体コンジュゲート。

【請求項5】

前記チューブリン阻害剤がＭＭＡＥである、請求項４に記載の抗体コンジュゲート。

【請求項6】

前記抗体コンジュゲートが、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体の内部移行と比較して、標的細胞への結合の際に増大した内部移行を有する、請求項１～５のいずれかに記載の抗体コンジュゲート。

【請求項7】

前記抗体がＴＲＢＣ１に特異的に結合する、請求項１～６のいずれかに記載の抗体コンジュゲート。

【請求項8】

前記抗体が、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体と比較して、以下の変異または変異の組み合わせ：
－前記ＶＨドメイン中のＧ１０６Ａ；
－前記ＶＨドメイン中のＹ３２Ｆ；
－前記ＶＨドメイン中のＧ３１Ｓ；
－前記ＶＨドメイン中のＧ２６ＰおよびＴ２８Ｋ；または
－前記ＶＨドメイン中のＹ１０２Ｍ
の１つを含む、請求項７に記載の抗体コンジュゲート。

【請求項9】

前記抗体が、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体と比較して、以下の変異：
－前記ＶＨドメイン中のＧ１０６Ａ
を含む、請求項８に記載の抗体コンジュゲート。

【請求項10】

前記抗体がＴＲＢＣ２に特異的に結合する、請求項１～６のいずれかに記載の抗体コンジュゲート。

【請求項11】

前記抗体が、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体と比較して、以下の変異または変異の組み合わせ：
－前記ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２ＬおよびＮ１０３Ｍ、ならびに前記ＶＬドメイン中のＮ３５Ｒ；
－前記ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎ；または
－前記ＶＨドメイン中のＴ２８Ｒ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎ
の１つを含む、請求項１０に記載の抗体コンジュゲート。

【請求項12】

前記抗体が、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体と比較して、以下の変異の組み合わせ：
－前記ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＮ１０３Ｌ、ならびに前記ＶＬドメイン中のＮ３５Ｒ
の１つを含む、請求項１１に記載の抗体コンジュゲート。

【請求項13】

Ｔ細胞リンパ腫または白血病の処置において使用するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。

【請求項14】

対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病の前記処置が、悪性Ｔ細胞と同じＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞と一緒に、前記悪性Ｔ細胞の選択的枯渇を引き起こすが、前記悪性Ｔ細胞によって発現されないＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞の枯渇を引き起こさないようにするために、前記対象に前記抗体コンジュゲートを投与する工程を含む、請求項１３に記載の使用のための抗体コンジュゲート。

【請求項15】

前記方法が、前記対象由来の悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定するために、前記対象由来の悪性Ｔ細胞の前記ＴＣＲβ鎖定常領域（ＴＣＲＢ）を調べる工程をさらに含む、請求項１４に記載の使用のための抗体コンジュゲート。

【請求項16】

前記Ｔ細胞リンパ腫または白血病が、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項１３～１５のいずれかに記載の使用のための抗体コンジュゲート。

【請求項17】

対象中のＴＲＢＣを発現する細胞への化学療法薬の送達を標的とするための方法における使用のための、請求項３～１２のいずれかに記載の抗体コンジュゲート。

【請求項18】

請求項１～１２のいずれかに記載の抗体コンジュゲートと、薬学的に許容され得るキャリア、希釈剤、賦形剤または補助剤とを含む薬学的組成物。

【請求項19】

Ｔ細胞リンパ腫または白血病に罹患している対象を処置するための適切な療法を選択するための方法であって、
ｉ）前記対象から単離された試料中の悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定することと；
ｉｉ）前記悪性Ｔ細胞の前記ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２発現に基づいて、請求項１３～１６のいずれかに記載の使用のための抗体コンジュゲートを選択することと；
を含む、方法。

【請求項20】

請求項１３～１６のいずれかに記載の使用のための抗体コンジュゲートを含む療法を受けるために、Ｔ細胞リンパ腫または白血病に罹患している対象を選択するための方法であって、
ｉ）前記対象から単離された試料中の悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定することと；
ｉｉ）前記悪性Ｔ細胞の前記ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２発現に基づいて、請求項１３～１６のいずれかに記載の使用のための抗体コンジュゲートに基づく療法を受けるために前記対象を選択することと；
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、ＴＣＲβ鎖定常領域（ＴＲＢＣ）に特異的に結合する抗体のコンジュゲートであって、この抗体は速い解離速度定数（ｋｄ）を有する、抗体コンジュゲートに関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
リンパ性悪性腫瘍は、Ｔ細胞またはＢ細胞のいずれかに由来するものに大きく分けることができる。Ｔ細胞悪性腫瘍は、障害の臨床的におよび生物学的に不均一な群であり、合わせて非ホジキンリンパ腫の１０～２０％および急性白血病の２０％を占める。最も一般的に同定される組織学的サブタイプは、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）および未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）である。すべての急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）のうち、約２０％がＴ細胞表現型のものである。

【0003】

これらの症状は、例えばＢ細胞悪性腫瘍と比較して、代表的には侵襲性に挙動し、推定５年生存率はわずか３０％である。Ｔ細胞リンパ腫の場合には、播種性疾患、好ましくない国際予後指標（ＩＰＩ）スコアおよびリンパ節外性疾患の有病率を呈する患者の割合が高い。化学療法単独では通常有効ではなく、患者の３０％未満が現行の処置で治癒する。

【0004】

さらに、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブなどの免疫療法が転帰を劇的に改善させたＢ細胞悪性腫瘍とは異なり、現在、Ｔ細胞悪性腫瘍の処置に対して利用可能な、同等に有効な最小限に毒性の免疫療法薬は存在しない。Ｔ細胞障害のための免疫療法の開発における重要な困難は、クローン性Ｔ細胞と正常Ｔ細胞のマーカー発現におけるかなりの重複であり、クローン性（悪性）細胞を明確に同定することができる単一の抗原は存在しない。

【0005】

Ｔ細胞受容体β鎖定常ドメイン１および２（ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２）の相互排他的発現に基づくターゲティング戦略が報告されている（国際公開第２０１５／１３２５９８号；Ｍａｃｉｏｃｉａら、２０１７，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１４１６－２３）。さらに、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを標的とするＣＡＲは、Ｔ細胞リンパ腫を処置する能力を与える一方で、許容され得る毒性プロファイルを提供する可能性があることが実証されている（Ｍａｃｉｏｃｉａら、２０１７、Ｎａｔ Ｍｅｄ、２３：１４１６－２３；国際公開第２０１５／１３２５９８号）。

【0006】

しかしながら、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、１型（ＨＴＬＶ－１）関連白血病およびリンパ腫などの疾患は、ＴＲＢＣ１／ＴＲＢＣ２標的薬で処置される可能性を有するにもかかわらず、細胞療法にあまり適していない可能性があり得る。これは、細胞ベースの療法はＴ細胞によって媒介される同士討ちの傾向があり得るからである。

【0007】

したがって、当技術分野では、Ｔ細胞リンパ腫および白血病の処置における細胞ベースの療法の潜在的な欠点を克服する代替の標的剤を提供する必要性が存在する。

【0008】

抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、Ｔ細胞リンパ腫を標的とするために使用することができる別の免疫治療の様式を提供する。ＡＤＣは、Ｔ細胞によって媒介される同士討ちになりにくいという点で、細胞ベースの療法を上回るさらなる利点を提供する。さらに、ＡＤＣは、副作用の改善された管理を提供し得る。

【0009】

ＡＤＣ戦略の効率は、癌細胞内への細胞傷害性コンジュゲートの内部移行に大きく依存する。ＴＲＢＣ特異的抗体に基づくＡＤＣは以前に記載されているが（国際公開第２０１５／１３２５９８号）、それらの内部移行特性は未知である。

【0010】

ＡＤＣに適した抗体の重要な特徴は、抗体がＴＲＢＣに特異的に結合することの他、高い内部移行能力を有することである。抗体の内部移行能力は、標的抗原と抗体の両方の特性に依存する。標的の分子構造から内部移行に適した抗原結合部位を予測することまたは抗体の結合強度、物理的特性などから高い内部移行能力を有する抗体を容易に予測することは困難である。したがって、高い効力を有するＡＤＣを開発することにおける重要な課題は、標的抗原に対する高い内部移行能力を有する抗体を得ることである。

【0011】

したがって、当技術分野では、最適な内部移行特性を有するＴＲＢＣ特異的ＡＤＣが必要とされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】国際公開第２０１５／１３２５９８号

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｍａｃｉｏｃｉａら、２０１７，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１４１６－２３

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0014】

発明の局面の概要
本発明者らは、Ｔ細胞への結合時のＴＲＢＣ特異的抗体の内部移行特性を明らかにする目的で、様々な親和性の多数のＴＲＢＣ特異的抗体を使用して、Ｔ細胞リンパ腫および白血病に対するＡＤＣ治療戦略を調査した。得られた結果は、特異的抗体に良好な内部移行特性を付与する結合親和性を同定するのに役立った。予想外にも、本発明者らは、抗体の良好な内部移行を達成するために、速い解離速度定数が重要であることを決定した。これらの結果は、当技術分野で一般的に受け入れられている見解、すなわち、高親和性抗体、したがって遅い解離速度定数を有する抗体は、高い内部移行能力を示すという見解とは対照的である。

【0015】

したがって、第１の局面において、本発明は、ＴＣＲβ鎖定常領域（ＴＲＢＣ）に特異的に結合する抗体コンジュゲートであって、抗体は０．００１秒^－１～０．３秒^－１の範囲の解離速度定数（ｋ_ｄ）を有する、抗体コンジュゲートを提供する。

【0016】

抗体は、０．００２秒^－１～０．１秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。

【0017】

抗体は、化学療法実体、放射性核種または検出実体にコンジュゲートされ得る。

【0018】

化学療法実体は、チューブリン阻害剤であり得る。

【0019】

チューブリン阻害剤はＭＭＡＥであり得る。

【0020】

抗体コンジュゲートは、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体の内部移行と比較して、標的細胞への結合の際に増大した内部移行を有し得る。

【0021】

抗体は、ＴＲＢＣ１に特異的に結合し得る。

【0022】

ＴＲＢＣ１特異的抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体と比較して、以下の変異：
－前記ＶＨドメイン中のＧ１０６Ａ；
－前記ＶＨドメイン中のＹ３２Ｆ；
－前記ＶＨドメイン中のＧ３１Ｓ；
－前記ＶＨドメイン中のＧ２６ＰおよびＴ２８Ｋ；
－前記ＶＨドメイン中のＹ１０２Ｍ
の１つを含み得る。

【0023】

ＴＲＢＣ１特異的抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体と比較して、以下の変異：
－前記ＶＨドメイン中のＧ１０６Ａ
を含み得る。

【0024】

抗体は、ＴＲＢＣ２に特異的に結合し得る。

【0025】

ＴＲＢＣ２特異的抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体と比較して、以下の変異の組み合わせ：
－前記ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２ＬおよびＮ１０３Ｍ、ならびに前記ＶＬドメイン中のＶＬ Ｎ３５Ｒ；
－前記ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ；または
－前記ＶＨドメイン中のＴ２８Ｒ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ
の１つを含み得る。

【0026】

ＴＲＢＣ２特異的抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体と比較して、以下の変異：
－前記ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２ＬおよびＮ１０３Ｍ、ならびに前記ＶＬドメイン中のＶＬ Ｎ３５Ｒ
を含み得る。
第２の局面において、本発明は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の処置において使用するための本発明の第１の局面による抗体コンジュゲートを提供する。

【0027】

対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病の処置は、悪性Ｔ細胞と同じＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞と一緒に、悪性Ｔ細胞の選択的枯渇を引き起こすが、悪性Ｔ細胞によって発現されないＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞の枯渇を引き起こさないようにするために、対象に抗体コンジュゲートを投与する工程を含み得る。

【0028】

方法は、対象由来の悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定するために、対象由来の悪性Ｔ細胞のＴＣＲβ鎖定常領域（ＴＣＲＢ）を調べる工程をさらに含み得る。

【0029】

Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択され得る。

【0030】

第３の局面において、本発明は、対象中のＴＲＢＣを発現する細胞への化学療法薬の送達を標的とするための方法における使用のための本発明の第１の局面の態様による抗体コンジュゲートを提供する。

【0031】

第４の局面において、本発明は、本発明の第１の局面による抗体コンジュゲートと、薬学的に許容され得るキャリア、希釈剤、賦形剤または補助剤とを含む薬学的組成物を提供する。

【0032】

第５の局面において、本発明は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病に罹患している対象を処置するための適切な療法を選択するための方法であって、
ｉ）対象から単離された試料中の悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定することと；
ｉｉ）悪性Ｔ細胞のＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２発現に基づいて、本発明の第２の局面による使用のための抗体コンジュゲートを選択することと；
を含む、方法を提供する。

【0033】

第６の局面において、本発明は、本発明の第２の局面による使用のための抗体コンジュゲートを含む療法を受けるために、Ｔ細胞リンパ腫または白血病に罹患している対象を選択するための方法であって、
ｉ）対象から単離された試料中の悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定することと；
ｉｉ）悪性Ｔ細胞のＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２発現に基づいて、本発明の第２の局面による使用のための抗体コンジュゲートに基づく療法を受けるために対象を選択することと；
を含む、方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】αβＴ細胞受容体／ＣＤ３複合体の概略図。Ｔ細胞受容体は、細胞表面上で発現されるために小胞体内で組み立てられなければならない６つの異なるタンパク質鎖から形成される。ＣＤ３複合体の４つのタンパク質（ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３εおよびＣＤ３δ）が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を覆っている。このＴＣＲが、複合体に特定の抗原の特異性を付与し、ＴＣＲαおよびＴＣＲβという２つの鎖から構成される。各ＴＣＲ鎖は、膜に対して遠位の可変成分と膜に対して近位の定常成分とを有する。ほぼすべてのＴ細胞リンパ腫および多くのＴ細胞白血病は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を発現する。

【図2】Ｔ細胞受容体再構成中のＴ細胞受容体β定常領域（ＴＲＢＣ）－１とＴＲＢＣ２の分離。各ＴＣＲβ鎖は、特定のβ可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）および定常（ＴＲＢＣ）領域のゲノム組換えから形成される。ヒトゲノムは、ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２として知られる２つの極めて類似した機能的に等価なＴＲＢＣ遺伝子座を含有する。ＴＣＲ遺伝子再構成の間に、Ｊ領域はＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかと再結合する。この再構成は恒久的である。Ｔ細胞は、それらの表面上に単一のＴＣＲの多くのコピーを発現し、したがって、各Ｔ細胞は、そのβ鎖定常領域がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかによってコードされるＴＣＲを発現する。

【図3】ＴＣＲβとＴＲＢＣ１特異的抗体Ｊｏｖｉ－１のＦａｂ断片間の構造界面。

【図4】ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ１、ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ２およびＨＰＢ－ＡＬＬ ＫＯ細胞における、ｐＨｒｏｄｏレッドをコンジュゲートしたＪｏｖｉ－１、ＫＦＮおよび抗ＨＥＬ抗体の内部移行プロファイル。

【図5-1】親和性、会合および解離速度を確認するために様々な変異された抗体変異型に対して行われた表面プラズモン共鳴実験

【図5-2】親和性、会合および解離速度を確認するために様々な変異された抗体変異型に対して行われた表面プラズモン共鳴実験

【図5-3】親和性、会合および解離速度を確認するために様々な変異された抗体変異型に対して行われた表面プラズモン共鳴実験

【図5-4】親和性、会合および解離速度を確認するために様々な変異された抗体変異型に対して行われた表面プラズモン共鳴実験

【図6】変異された抗体変異型の結合速度論の分析。非常に類似した会合速度を有するが、異なる解離速度を有するいくつかの結合剤が同定された。

【図7】９時間でのＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ１およびＫＯ細胞におけるａＴＲＢＣ１のｐＨｒｏｄｏグリーンをコンジュゲートした変異体の内部移行プロファイル。ＴＲＢＣ１に対する解離速度を増加させながらクローンを選択した。フローサイトメトリは、内部移行がより速いオフ速度によって影響を受ける前に、最大Ｍｕｔ１３までのより速い解離速度を有する結合剤の改善された内部移行を示す。抗体変異体は、表１および２に記載されている。

【図8】ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ１＋、ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ２＋およびＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＣＲ ＫＯ細胞での最適親和性ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２抗体の内部移行。抗体変異体は、表１および２に記載されている。

【図9A】Ａ．ＭＣ－バリン－シトルリンリンカーを介した抗ＴＣＲ ＰＡＢ－ＭＭＡＥコンジュゲーションの模式的表現。Ｂ．モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）へのＭｕｔ１１およびＭｕｔ１５抗体のコンジュゲーションは、抗体が内部移行される能力を損なわなかった。ＭＦＩ：平均蛍光強度。Ｃ．ＭＭＡＥをコンジュゲートしたＭｕｔ１１、Ｍｕｔ１５および抗ＨＥＬによる、ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ１＋、ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ２＋およびＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＣＲ ＫＯに対する細胞傷害性アッセイ。ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＣＲ ＫＯに対するフィットの比較により＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。抗体変異体は、表１および２に記載されている。

【図9B】Ａ．ＭＣ－バリン－シトルリンリンカーを介した抗ＴＣＲ ＰＡＢ－ＭＭＡＥコンジュゲーションの模式的表現。Ｂ．モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）へのＭｕｔ１１およびＭｕｔ１５抗体のコンジュゲーションは、抗体が内部移行される能力を損なわなかった。ＭＦＩ：平均蛍光強度。Ｃ．ＭＭＡＥをコンジュゲートしたＭｕｔ１１、Ｍｕｔ１５および抗ＨＥＬによる、ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ１＋、ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ２＋およびＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＣＲ ＫＯに対する細胞傷害性アッセイ。ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＣＲ ＫＯに対するフィットの比較により＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。抗体変異体は、表１および２に記載されている。

【図9C】Ａ．ＭＣ－バリン－シトルリンリンカーを介した抗ＴＣＲ ＰＡＢ－ＭＭＡＥコンジュゲーションの模式的表現。Ｂ．モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）へのＭｕｔ１１およびＭｕｔ１５抗体のコンジュゲーションは、抗体が内部移行される能力を損なわなかった。ＭＦＩ：平均蛍光強度。Ｃ．ＭＭＡＥをコンジュゲートしたＭｕｔ１１、Ｍｕｔ１５および抗ＨＥＬによる、ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ１＋、ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ２＋およびＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＣＲ ＫＯに対する細胞傷害性アッセイ。ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＣＲ ＫＯに対するフィットの比較により＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。抗体変異体は、表１および２に記載されている。

【図10】ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構造の概略図。

【発明を実施するための形態】

【0035】

発明の詳細な説明
本発明は、標的細胞に結合したときに優れた内部移行特性を有する、ＴＣＲβ鎖定常領域（ＴＲＢＣ）に特異的に結合する抗体コンジュゲートを提供する。

【0036】

１．ＴＣＲβ鎖定常領域（ＴＲＢＣ）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔリンパ球の表面上に発現され、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合された抗原の認識を担っている。ＴＣＲが抗原性ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と結合すると、関連する酵素、共受容体、特殊なアダプタ分子、および活性化または放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的事象を通じてＴリンパ球が活性化される。

【0037】

ＴＣＲは、通常、インバリアントなＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現される高度に可変性のアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖からなるジスルフィド結合され、膜に固着されたヘテロ二量体である。この受容体を発現するＴ細胞は、α：β（またはαβ）Ｔ細胞（全Ｔ細胞の約９５％）と呼ばれる。少数のＴ細胞は、可変性のガンマ（γ）およびデルタ（δ）鎖によって形成される代替受容体を発現し、γδＴ細胞（全Ｔ細胞の約５％）と呼ばれる。

【0038】

各α鎖およびβ鎖は、いずれも逆平行βシートを形成する免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインである２つの細胞外ドメイン：可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域から構成される。定常領域は細胞膜に近接し、これに膜貫通領域および短い細胞質尾部が続き、一方、可変領域はペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。ＴＣＲの定常領域は、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、２本の鎖間の連結を形成する短い接続配列からなる。

【0039】

ＴＣＲα鎖およびβ鎖の両方の可変ドメインは、３つの超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。β鎖の可変領域は、さらなる超可変領域（ＨＶ４）を有するが、これは通常抗原と接触せず、したがってＣＤＲとは考えられない。

【0040】

ＴＣＲはまた、最大５つのインバリアント鎖γ、δ、ε（ＣＤ３と総称される）およびζを含む。ＣＤ３およびζサブユニットは、αβまたはγδによる抗原の認識後にセカンドメッセンジャーおよびアダプタ分子と相互作用する特定の細胞質ドメインを介してＴＣＲシグナル伝達を媒介する。ＴＣＲ複合体の細胞表面発現には、サブユニットの対を成す集合が先行し、この集合においては、ＴＣＲαおよびβならびにＣＤ３γおよびδの膜貫通ドメインと細胞外ドメインの両方が役割を果たす。

【0041】

したがって、ＴＣＲは一般に、ＣＤ３複合体ならびにＴＣＲα鎖およびβ鎖から構成され、ＴＣＲα鎖およびβ鎖は可変領域および定常領域から構成される（図１）。

【0042】

ＴＣＲβ鎖定常領域（ＴＲＢＣ）を供給する遺伝子座（Ｃｈｒ７：ｑ３４）は、進化の歴史において重複して、２つのほぼ同一の機能的に等価な遺伝子：ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２を産生する（図２）。各ＴＣＲは、相互に排他的な様式でＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを含み、したがって、各αβＴ細胞は、相互に排他的な様式でＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを発現する。

【0043】

本発明者らは、ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２の配列間の類似性にもかかわらず、ＴＲＢＣ１とＴＲＢＣ２を区別することが可能であることを以前に決定した。本発明者らはまた、細胞、例えばＴ細胞の表面上にインサイチュで存在する間に、ＴＲＢＣ１とＴＲＢＣ２のアミノ酸配列を識別することができることを以前に決定した（国際公開第２０１５１３２５９８号）。さらに、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかに特異性を有する多数の抗体が作製されている（国際公開第２０１５１３２５９８号）。

【0044】

２．抗体コンジュゲート
第１の局面において、本発明は、ＴＣＲβ鎖定常領域（ＴＲＢＣ）に特異的に結合する抗体コンジュゲート、以下「本発明の抗体コンジュゲート」であって、前記抗体は０．００１秒^－１～０．５秒^－１の範囲の解離速度定数（ｋ_ｄ）を有する、抗体コンジュゲートを提供する。

【0045】

本明細書で使用される「抗体コンジュゲート」という用語は、化学的リンカーを介して治療実体または搭載物に結合された抗体を含む化合物を指す。細胞の表面上の標的抗原に結合すると、抗体コンジュゲートは内部移行され、リソソームに輸送され、そこで切断可能なリンカーのタンパク質分解によって（例えば、リソソーム中に見出されるカテプシンＢによって）、または非切断性リンカーを介して搭載物に結合されている場合は抗体のタンパク質分解によって、搭載物が放出される。

【0046】

２．１．抗体
本発明の抗体コンジュゲートは、ＴＣＲβ鎖定常領域（ＴＲＢＣ）に特異的に結合する抗体を含む。

【0047】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、少なくとも１つの相補性決定領域またはＣＤＲを含む抗原結合部位を有するポリペプチドを指す。抗体は、３つのＣＤＲを含み得、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、重鎖抗体（ＶＨＨ）またはナノボディの抗原結合部位と同等の抗原結合部位を有し得る（図３ｂ参照）。抗体は、６つのＣＤＲを含み得、古典的な抗体分子の抗原結合部位と同等の抗原結合部位を有し得る。ポリペプチドの残りの部分は、抗原結合部位のための適切な足場を与え、抗原結合部位が抗原を結合するのに適した様式で抗原結合部位を提示する任意の配列であり得る。

【0048】

完全長抗体または免疫グロブリンは、代表的には、４つのポリペプチド：重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一のコピーおよび軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つの同一のコピーからなる。重鎖のそれぞれは１つのＮ末端可変（ＶＨ）領域および３つのＣ末端定常（ＣＨ_１、ＣＨ_２およびＣＨ_３）領域を含有し、各軽鎖は１つのＮ末端可変（ＶＬ）領域および１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域を含有する。軽鎖および重鎖の各対の可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。軽鎖および重鎖の各対の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域によって連結されたフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる比較的保存された領域によって構成される同じ一般的構造を特徴とする（Ｋａｂａｔら、１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５^ｔｈ Ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．；Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－１７）。本明細書で使用される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、抗原の形状を相補する抗体内の領域を指す。したがって、ＣＤＲは、特定の抗原に対するタンパク質の親和性および特異性を決定する。各対の２本の鎖のＣＤＲはフレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープを結合する機能を獲得する。その結果、ＶＨおよびＶＬドメインの場合には、重鎖および軽鎖の両方が、３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３によって特徴付けられる。

【0049】

ＣＤＲのいくつかの定義が一般に使用されている。Ｋａｂａｔの定義は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／参照）。また、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（ＩＭＧＴ）を用いることもできる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ参照）。このシステムによれば、相補性決定領域（ＣＤＲ－ＩＭＧＴ）は、Ｖドメインに対するＩＭＧＴ固有ナンバリングに従って区切られた可変ドメインのループ領域である。可変ドメイン中には３つのＣＤＲ－ＩＭＧＴ：ＣＤＲ１－ＩＭＧＴ（ループＢＣ）、ＣＤＲ２－ＩＭＧＴ（ループＣ’Ｃ’’）およびＣＤＲ３－ＩＭＧＴ（ループＦＧ）が存在する。Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよび接触定義などのＣＤＲの他の定義も開発されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ参照）。

【0050】

本発明の抗体コンジュゲートは、完全長抗体またはその抗原結合断片を含み得る。

【0051】

本発明の抗体コンジュゲートは、完全長抗体を含み得る。完全長抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥであり得る。完全長抗体は、ＩｇＧまたはＩｇＭであり得る。

【0052】

「抗体断片」、「抗原結合断片」、「抗体の機能的断片」および「抗原結合部分」という用語は、本明細書では互換的に使用され、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１またはそれを超える断片または部分を指す。抗体断片は、例えば、１またはそれを超えるＣＤＲ、可変領域（またはその一部）、定常領域（またはその一部）、またはこれらの組み合わせを含み得る。抗体断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体（ｄＡｂまたはＶＨ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ、ナノボディ、ダイアボディ、トリアボディ、トリマーボディおよびモノボディが含まれるが、これらに限定されない。

【0053】

本発明の抗体コンジュゲートは、非免疫グロブリン足場に基づく抗原結合ドメインを含み得る。これらの抗体結合ドメインは、抗体模倣物とも呼ばれる。非免疫グロブリン抗原結合ドメインの非限定的な例としては、アフィボディ、フィブロネクチン人工抗体足場、アンティカリン、アフィリン、ＤＡＲＰｉｎ、ＶＮＡＲ、ｉＢｏｄｙ、アフィマー、フィノマー、アブデュリン／ナノ抗体、センチリン、アルファボディ、ナノフィチンおよびＤドメインが挙げられる。

【0054】

抗体は二機能性であり得る。

【0055】

抗体は、非ヒト、例えばマウス、ラットまたはラクダ類、キメラ、ヒト化または完全ヒトであり得る。抗体は合成であり得る。

【0056】

当技術分野において現在公知であるか、または将来開発されるであろう、半減期を延長し、および／または薬物送達を増強するために使用される様々な抗体フォーマットおよび修飾も本発明の一部を形成する。

【0057】

本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、ＴＲＢＣを特異的に結合する。抗原結合ドメインがＴＲＢＣに特異的に結合する能力は、当技術分野で利用可能な多数のアッセイによって決定することができる。好ましくは、抗原結合ドメインの結合特異性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および競合ＥＬＩＳＡなどのインビトロ結合アッセイによって；免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリなどの免疫蛍光技術によって；または免疫沈降によって決定される。

【0058】

本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを結合し得る。抗体がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２に対して特異的であるかどうかを決定する方法は、国際公開第２０１５／１３２５９８号に記載されている。

【0059】

抗体または抗体断片は、ＴＲＢＣを発現する標的細胞に様々な搭載物を送達することができる。抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の有効性は、抗原への結合親和性および特異性だけでなく、内部移行にも依存する。異なる結合親和性を有するＴＲＢＣ特異的抗体を使用して、本発明者らは、ＴＲＢＣ特異的抗体コンジュゲートの速度論的速度定数が、標的細胞への結合時のＴＲＢＣ特異的抗体コンジュゲートの内部移行特性を決定する因子であることを決定した。驚くべきことに、最良の内部移行は、速い解離を有する抗体を使用して得られる。さらに、本発明者らは、Ｔ細胞上で最適な内部移行特性を示す結合親和性を決定することができた。

【0060】

「内部移行」または「細胞取り込み」という用語は、本発明の文脈において区別なく使用され、本明細書で使用される場合、受容体によって媒介されるエンドサイトーシスとしても知られる過程を指す。エンドサイトーシスは、細胞膜包み込みを介して分子または物質が細胞内に輸送される細胞過程である。内部移行後、抗体コンジュゲート分子はリソソームに輸送され、そこで搭載物が放出される。したがって、抗体コンジュゲート内部移行の速度および程度は、抗体コンジュゲートの有効性にとって極めて重要である。

【0061】

所望の細胞取り込み速度を有する抗体を同定するために、顕微鏡法およびフローサイトメトリを含む多数の技術が使用され得る。免疫蛍光顕微鏡法をベースとするエンドソームタンパク質との共局在化もまた、細胞取り込みをモニターするために使用される。免疫蛍光顕微鏡法とは異なり、蛍光標識された抗体を用いるフローサイトメトリは、抗体内部移行のより迅速かつ定量的な評価を可能にし、潜在的により高い処理量を可能にする。フローサイトメトリをベースとするアッセイでは、インキュベーション期間後にどれほど多くの抗体が表面結合したままであるかを測定するために蛍光標識された二次抗体が使用され得る。あるいは、抗フルオロフォア抗体による細胞表面蛍光消光の前に、蛍光標識された一次抗体で細胞を処理し得る。ＡＤＣが効果的であるためにエンドサイトーシスおよびその後の酸性化を必要とすることを考えると、ｐＨ感受性標識は、抗体コンジュゲートの内部移行を追跡するために非常に有用である。ｐＨ感受性色素の非限定的な例としては、ｐＨが低下するにつれて消光される明るい蛍光を呈するフルオレセイン、および中性ｐＨで極めて低い蛍光を示し、ｐＨがより酸性になるにつれて増加する蛍光を示すｐＨｒｏｄｏ色素が挙げられる。蛍光色素で抗体を標識する方法は、当技術分野で周知である。

【0062】

本明細書で使用される「親和性」という用語は、抗体の抗原結合部位とエピトープとの間の相互作用の強さを指す。親和性は、通常、抗体と抗原の間での解離速度定数（ｋ_ｄまたはｋ_ｏｆｆ）と会合速度定数（ｋ_ａまたはｋ_ｏｎ）の比、すなわちｋ_ｄ／ｋ_ａまたはｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎである平衡解離定数（ＫＤ）として測定される。ＫＤと親和性は逆の関係にある。本明細書で使用される「会合速度定数」または「オン速度」または「ｋ_ａ」または「ｋ_ｏｎ」という用語は、抗体がその標的にどれほど迅速に結合するかを特徴付けるために使用される定数を指す。本明細書で使用される「解離速度定数」または「オフ速度」または「ｋ_ｄ」または「ｋ_ｏｆｆ」という用語は、抗体がその標的にどれほど迅速に結合するかを特徴付けるために使用される定数を指す。ＫＤはＭで測定され、ｋ_ａはＭ^－１秒^－１で測定され、ｋ_ｄは秒^－１で測定される。

【0063】

任意の所与の抗原に対する抗原結合ドメインの親和性は、直接的および間接的ＥＬＩＳＡおよびラジオイムノアッセイ法などの標識依存的方法、ならびに表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）およびバイオレイヤー干渉などのリアルタイムでの相互作用の直接的検出および測定を可能にする無標識方法を含むがこれらに限定されない任意の従来の方法を使用して定量化され得る。

【0064】

本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用される抗体のＫＤおよび速度論的速度定数は、ＳＰＲによって測定され得る。アッセイは、異なるパラメータを使用し、市販されている様々な装置を使用して実施され得る。例えば、ＫＤおよび速度論的速度定数は、ランニングおよび希釈緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）としてＨＢＳＰ１を使用して、２５℃で３０ｍｌ／分の流速でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置で測定され得る。速度論的速度定数は、１：１ラングミュア結合モデルに従うカーブフィッティングによって取得され得る。

【0065】

本発明者らは、抗体が０．００１秒^－１～０．３秒^－１の範囲内の解離速度定数ｋ_ｄを有する場合に、最適な内部移行特性が示されることを決定した。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．００１秒^－１～０．２５秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．００１秒^－１～０．２秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．００１秒^－１～０．１５秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．００１秒^－１～０．１秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．００２秒^－１～０．３秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．００３秒^－１～０．３秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．００４秒^－１～０．３秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．００５秒^－１～０．３秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．００６秒^－１～０．３秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．００７秒^－１～０．３秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．００８秒^－１～０．３秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．００９秒^－１～０．３秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．０１秒^－１～０．３秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．０１秒^－１～０．２秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．０１秒^－１～０．１５秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．０１秒^－１～０．１秒^－１の範囲のｋ_ｄを有し得る。前記抗体が、０．００２秒^－１～０．１秒^－１の範囲のｋ_ｄを有する、請求項１に記載の抗体コンジュゲート。前記抗体が、０．０１７秒^－１～０．０８３秒^－１の範囲のｋ_ｄを有する、請求項１に記載の抗体コンジュゲート。

【0066】

本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、１×１０^２Ｍ^－１～１×１０^６Ｍ^－１の範囲の会合速度定数（ｋ_ａ）をさらに有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、５×１０^２Ｍ^－１～５×１０^５Ｍ^－１の範囲のｋ_ａをさらに有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、１×１０^３Ｍ^－１～５×１０^５Ｍ^－１の範囲のｋ_ａをさらに有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、５×１０^３Ｍ^－１～５×１０^５Ｍ^－１の範囲のｋ_ａをさらに有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、１×１０^４Ｍ^－１～１×１０^５Ｍ^－１の範囲のｋ_ａをさらに有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、５×１０^４Ｍ^－１～１×１０^５Ｍ^－１の範囲のｋ_ａをさらに有し得る。

【0067】

本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、１×１０^ー１０Ｍ～１×１０^ー５Ｍの範囲の親和定数（ＫＤ）をさらに有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、１×１０^－１０Ｍ～５×１０^－６Ｍの範囲のＫＤをさらに有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、５×１０^－１０Ｍ～１×１０^－６Ｍの範囲のＫＤをさらに有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、５×１０^－１０Ｍ～５×１０^－７Ｍの範囲のＫＤをさらに有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、１×１０^－９Ｍ～５×１０^－７Ｍの範囲のＫＤをさらに有し得る。本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、５×１０^－９Ｍ～１×１０^－７Ｍの範囲のＫＤをさらに有し得る。

【0068】

本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、０．００１秒^－１～０．３５秒^－１の範囲のｋ_ｄ、１×１０^２Ｍ^－１～１×１０^６Ｍ^－１の範囲のｋ_ａおよび１×１０^－１０Ｍ～１×１０^－５Ｍの範囲のＫＤを有し得る。

【0069】

本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体の内部移行と比較して、標的細胞への結合の際に増大した内部移行を有し得る。

【0070】

標的細胞への結合時の本発明の抗体コンジュゲートの内部移行は、参照抗体の内部移行より増加し得る。抗体コンジュゲートの内部移行は、標的細胞への結合の際に、参照抗体の内部移行より少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、少なくとも１，０００％、少なくとも５，０００％、または少なくとも１０，０００％増加し得る。抗体コンジュゲートの内部移行を決定および定量化するための方法は、以前に詳細に記載されている。

【0071】

本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、ＴＲＢＣ１に特異的に結合し得る。

【0072】

ＴＲＢＣ１に対して特異的である本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体と比較して、以下の変異または変異の組み合わせ：
－ＶＨドメイン中のＧ１０６Ａ；
－ＶＨドメイン中のＹ３２Ｆ；
－ＶＨドメイン中のＧ３１Ｓ；
－ＶＨドメイン中のＧ２６ＰおよびＴ２８Ｋ；
－ＶＨドメイン中のＹ１０２Ｍ
の１つを含み得る。

【0073】

ＴＲＢＣ１に対して特異的である本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２に示される配列を有するＶＬドメイン、ならびに以下の変異または変異の組み合わせ：
－ＶＨドメイン中のＧ１０６Ａ；
－ＶＨドメイン中のＹ３２Ｆ；
－ＶＨドメイン中のＧ３１Ｓ；
－ＶＨドメイン中のＧ２６ＰおよびＴ２８Ｋ；
－ＶＨドメイン中のＹ１０２Ｍ；
－ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＮ１０３Ｌ、ならびにＶＬドメイン中のＮ３５Ｋ；
－ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎ、ならびにＶＬドメイン中のＮ３５Ｋ；または
－ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＡ１０７Ｓ
の１つからなり得る。

【0074】

ＴＲＢＣ１に対して特異的である本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体と比較して、以下の変異：
－ＶＨドメイン中のＧ１０６Ａ
を含み得る。

【0075】

ＴＲＢＣ１に対して特異的である本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２に示される配列を有するＶＬドメイン、ならびに以下の変異：
－ＶＨドメイン中のＧ１０６Ａ
からなり得る。

【0076】

これらの特異的な組み合わされた変異は、ＡＤＣ治療戦略に有用な様式でＴＲＢＣ１への結合を変化させることが示された（表１参照）。

【表1-1】

【表1-2】

【0077】

本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、ＴＲＢＣ２に特異的に結合し得る。

【0078】

ＴＲＢＣ２に対して特異的である本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体と比較して、以下の変異の組み合わせ：
－ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２ＬおよびＮ１０３Ｍ、ならびにＶＬドメイン中のＮ３５Ｒ；
－ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎ；または
－ＶＨドメイン中のＴ２８Ｒ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎ
の１つを含み得る。

【0079】

ＴＲＢＣ２に対して特異的である本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２に示される配列を有するＶＬドメイン、ならびに以下の変異：
－ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２ＬおよびＮ１０３Ｍ、ならびにＶＬドメイン中のＮ３５Ｒ；
－ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎ；または
－ＶＨドメイン中のＴ２８Ｒ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎ
の１つからなり得る。

【0080】

これらの特異的な組み合わされた変異は、ＡＤＣ治療戦略に有用な様式でＴＲＢＣ２への結合を変化させることが示された（表２参照）。

【表2】

【0081】

ＴＲＢＣ２に対して特異的である本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体と比較して、以下の変異：
－ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＮ１０３Ｌ、ならびにＶＬドメイン中のＮ３５Ｋ
を含み得る。

【0082】

ＴＲＢＣ２に対して特異的である本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２に示される配列を有するＶＬドメイン、ならびに以下の変異：
－ＶＨドメイン中のＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＮ１０３Ｌ、ならびにＶＬドメイン中のＮ３５Ｋ
からなり得る。

【0083】

本明細書で使用される場合、「参照抗体」という用語は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを含むヒト化ＪＯＶＩ－１抗体、すなわちｈＪＯＶＩ－１を指す。マウスＪＯＶＩ－１は、Ｖｉｎｅｙらによって以前に開示されている（Ｖｉｎｅｙら、１９９２、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１１：７０１－１３）。

【化1-1】

【化1-2】

【0084】

本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを含み得る。

【0085】

その特異性および内部移行特性を維持する、本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体の変異型または変異体も、本発明の一部を形成する。本明細書で使用される「変異型」または「変異体」という用語は、例えば組換えＤＮＡ技術を使用してまたはデノボ合成によって作製された、アミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって、具体的に列挙されたポリペプチド、すなわち参照または親ポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。変異型および変異体は、本発明の文脈において区別なく使用される。

【0086】

２．２．治療実体または搭載物
本発明の抗体コンジュゲートは、治療実体または搭載物に結合された抗体を含む。抗体コンジュゲートの内部移行特性を調べる目的で、搭載物は検出実体によって置き換えられ得る。

【0087】

本明細書で使用される「治療実体」または搭載物」という用語は、細胞の機能を阻害または抑制し、および／または細胞の破壊（細胞死）を引き起こし、および／または抗増殖効果を発揮する任意の分子を指す。搭載物は、薬物または放射性核種であり得る。

【0088】

本発明の抗体コンジュゲート中の抗体は、化学療法実体、放射性核種または検出実体にコンジュゲートされ得る。

【0089】

本明細書で使用される「化学療法実体」という用語は、細胞の機能を阻害または抑制し、および／または細胞死を引き起こし、および／または抗増殖効果を発揮する任意の分子を指す。以下では、得られたコンジュゲートは、「本発明の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）」という。化学療法実体は、細胞傷害性薬物または細胞毒であり得る。チューブリン阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤およびＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤を含むが、これらに限定されない多数のクラスの細胞傷害剤は、抗体分子において潜在的な有用性を有することが当技術分野で公知であり、本明細書に記載されるＡＤＣにおいて使用することができる。

【0090】

これまでのところ、微小管は、５つの既知の結合部位：ビンカアルカロイド結合部位、タキサン結合部位、コルヒチン結合部位、マイタンシン結合部位およびラウリマライド結合部位を有する。微小管／チューブリン阻害剤は、それらの作用機序に従って、チューブリン重合を促進し、微小管構造を安定化させる作用物質（タキサン結合部位およびラウリマライド結合部位に結合する作用物質）およびチューブリン重合を阻害し、微小管構造を不安定化させる作用物質（ビンカアルカロイド結合部位、マイタンシン結合部位、コルヒチン結合部位に結合する作用物質）という２つの主要なカテゴリーに分類することができる。ビンカアルカロイド結合部位に結合するチューブリン阻害剤の非限定的な例としては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンフルニン、ハリコンドリンＢ、メシル酸エリブリン、クリプトフィシンおよびドラスタチン、例えば、アウリスタチンＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＰＦ－０６３９０１０１、ＭＭＡＤ、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＷ類似体、アウリスタチンｆ－ＨＰＡ、アンベルスタチン２６９およびＡＧＤ－０１８２が挙げられる。マイタンシン結合部位に結合するチューブリン阻害剤の非限定的な例としては、マイタンシンおよびマイタンシノイド、例えばＤＭ１およびＤＭ４が挙げられる。コルヒチン結合部位に結合するチューブリン阻害剤の非限定的な例としては、コルヒチン、２－メトキシエストラジオール、スルホンアミドおよびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）誘導体が挙げられる。タキサン結合部位に結合するチューブリン阻害剤の非限定的な例としては、パクリタキセル、ドセタキセル、シクロストレプチン、エリュテロビン、ＡＢＩ－００７、イクサベピロン、パツピロンおよびＢＭＳ－３１０７０５が挙げられる。ラウリマリド結合部位に結合するチューブリン阻害剤の非限定的な例としては、ラウリマライドおよびペロルシドＡが挙げられる。

【0091】

ＤＮＡ損傷剤としては、カリケアマイシン（オゾガマイシン）、例えばカリケアマイシンγ１；ピロロベンゾジアゼピン、例えばＰＤＢタリリンおよびＳＧ３２４９；デュオカルマイシン、例えばＤＵＢＡ；カンプトテシン類似体、例えばＳＮ３８およびＤＸ－８９５１；アントラサイクリン；およびドキソルビシン（アドリアマイシン）が挙げられるが、これらに限定されない。アルキル化剤、ニトロソ尿素、エチレンイミン／メチルメラミン、アルキルスルホナート、代謝拮抗物質、ピリミジン類似体、エピポドフィロトキシン、シスプラチンなどの白金配位錯体およびＬ－アスパラギナーゼなどのカルボプラチン酵素も含まれる。

【0092】

トポイソメラーゼＩ阻害剤には、イリノテカン、トポテカンおよびカンプトテシンが含まれるが、これらに限定されない。

【0093】

ＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤には、α－アマニチンなどのアマトキシンが含まれるが、これらに限定されない。

【0094】

ＡＤＣにおける使用に適した細胞毒素は、例えば、国際公開第２０１５／１５５３４５号および国際公開第２０１５／１５７５９２号にも記載されている。

【0095】

化学療法実体は、ＩＦＮα、ＩＬ－２、Ｇ－ＣＳＦおよびＧＭ－ＣＳＦなどの生物学的応答調節剤；アントラセンジオン、ヒドロキシ尿素などの置換された尿素、Ｎ－メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（ｏ，ｐ’－ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤；プレドニゾンおよび同等物、デキサメタゾンおよびアミノグルテチミドなどの副腎皮質ステロイドアンタゴニストを含むホルモンおよびアンタゴニスト；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロールなどのプロゲスチン；ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール同等物などのエストロゲン；タモキシフェンなどの抗エストロゲン；プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／同等物を含むアンドロゲン；フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体およびリュープロリドなどの抗アンドロゲン；ならびにフルタミドなどの非ステロイド性抗アンドロゲンであり得る。

【0096】

本発明の抗体コンジュゲート中の抗体は、放射性核種にコンジュゲートされ得る。以下では、得られるコンジュゲートは、「本発明の抗体放射性核種コンジュゲート（ＡＲＣ）」と称される。放射性免疫複合体は、独特のセラノスティック（すなわち、療法および診断）の可能性を有する。診断目的のために、抗体は、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法または陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）などの画像化手順に適合する放射性核種で標識され得る。治療目的のために、放射性核種の選択は、処置されるべき腫瘍のサイズに大きく依存し、^９０Ｙなどの高エネルギーβ放射体はより大きな腫瘍の療法に適しており、^１３１Ｉおよび^１７７Ｌｕなどの中エネルギーβ放射体はより小さな腫瘍の処置により効果的である。ＡＲＣにおける使用に適した放射性核種は当技術分野で周知であり、他の放射性核種も本発明で企図される。放射免疫療法の主な魅力的な特徴の１つは、クロスファイアーまたはバイスタンダー効果、すなわち抗体局在部位に近接した細胞を損傷する能力である。ほとんどの場合、抗体の放射性標識は、チロシンのヨウ素化によって、またはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）もしくは１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）などの金属キレート剤の抗体分子へのコンジュゲーションによって達成される。

【0097】

検出可能な実体は、蛍光実体、例えば蛍光ペプチドまたは色素または標識であり得る。本明細書で使用される「蛍光実体」という用語は、励起後に検出可能な波長で光を放出する部分を指す。蛍光実体の例としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化されたＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）およびｍＣｈｅｒｒｙが挙げられるが、これらに限定されない。抗体コンジュゲートの内部移行を追跡するためのｐＨ感受性色素または標識が特に有利である。ｐＨ感受性色素の非限定的な例としては、ｐＨが低下するにつれて消光される明るい蛍光を呈するフルオレセイン、および中性ｐＨで極めて低い蛍光を示し、ｐＨがより酸性になるにつれて増加する蛍光を示すｐＨｒｏｄｏ色素が挙げられる。

【0098】

検出可能な実体にコンジュゲートされた本発明の抗体コンジュゲートは、悪性Ｔ細胞のＴＲＢＣを決定するために使用され得る。

【0099】

本発明の抗体コンジュゲートは、これにコンジュゲートされた少なくとも１つの治療用分子または搭載物分子（検出実体を含む）を含み得る。本発明の抗体コンジュゲートは、任意の適切な数を含み得る。所望の治療効果を達成するために、本発明の抗体コンジュゲートは、すなわち、これにコンジュゲートされた１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれを超える搭載物分子を含み得る。

【0100】

２．３．コンジュゲーション化学
本発明の抗体コンジュゲートは、コンジュゲーションまたは化学リンカーを介して化学療法実体、放射性核種または検出実体に結合される抗体を含む。

【0101】

抗体への搭載物の「伝統的な」化学的コンジュゲーションは、溶媒に露出したリジン残基を通じて（スクシンイミドエステル誘導体化を介して）、または鎖間システイン残基を介して（マレイミド化学）起こる。あるいは、抗体への細胞傷害剤の付着部位が正確に定義されている部位特異的コンジュゲーションを得るための様々なアプローチが開発されている。これらの技術は以下の通りである：（ａ）抗体の重鎖のみで部位特異的コンジュゲーションを可能にするＴＨＩＯＭＡＢなどの操作されたシステインを適用する；（ｂ）ｐ－アセチルフェニルアラニンまたはセレノシステインをＩｇＧ１中に組み込むなど、変異誘発を通じて非天然アミノ酸をタンパク質および抗体に導入する；（ｃ）抗体の部位特異的官能化を形成するために、操作されたグリコトランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、トランスペプチダーゼソルターゼまたはホルミルグリシン生成酵素を使用するなど、部位特異的コンジュゲーションを生成するために酵素的方法および化学酵素的方法を使用する；（ｄ）チューブリンタグ標識戦略を使用する。

【0102】

抗体が完全抗体またはモノクローナル抗体である場合、搭載物は、抗体のＦｃ領域中の特定のＫａｂａｔ位置でシステインなどのアミノ酸の側鎖に化学的にコンジュゲートされ得る。部位特異的コンジュゲーションに適したＦｃ領域上の位置は、当技術分野で周知である。あるいは、搭載物は、ヒンジおよび重軽鎖におけるチオール－マレイミド結合を介して抗体にコンジュゲートされ得る。

【0103】

化学リンカーは、全身循環において十分に安定でなければならず、癌細胞内での抗体コンジュゲートの内部移行時に細胞傷害剤を迅速かつ効率的に放出することができなければならない。薬物放出機構によれば、抗体コンジュゲートのためのリンカーは、一般に、切断可能なリンカー（酸不安定性リンカー、プロテアーゼ切断性リンカーおよびジスルフィドリンカー）および非切断性リンカーに分類される（表３）。非切断性リンカーを有する抗体コンジュゲートは、細胞傷害剤を放出するために抗体のリソソーム分解を必要とするが、切断可能なリンカーを有する抗体コンジュゲートは、抗体コンジュゲートが曝される生理学的環境に基づいて細胞傷害性薬物を選択的に放出するために加水分解、酵素反応または還元を伴う。

【表3】

【0104】

３つの主要なタイプの切断可能なリンカー：酸切断可能なリンカー、プロテアーゼ切断可能なリンカーおよびジスルフィドリンカーがＡＤＣにおいてしばしば使用される。ヒドラジンリンカー（ＡｃＢｕｔ）などの酸切断性リンカーは、循環の中性ｐＨで安定であるが、低ｐＨ環境を有するリソソーム内で加水分解されることができるように設計されている。プロテアーゼ切断可能なリンカーはまた、抗体コンジュゲートを全身循環において無傷に保ち、癌細胞内のリソソーム酵素による抗体コンジュゲートからの細胞傷害性薬物の容易な放出を可能にするために使用される。例えば、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）およびフェニルアラニン－リジン（Ｐｈｅ－Ｌｙｓ）は、抗体コンジュゲートに優れた安定性およびＰＫ／ＰＤプロファイルを与える。さらに、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）およびＮ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）などのジスルフィドリンカーとの抗体コンジュゲートは、高い細胞内濃度を有する還元型グルタチオンを利用して、細胞内に遊離薬物を放出する。還元可能なジスルフィドリンカーとの抗体コンジュゲートは、隣接する細胞に拡散し、不均一な腫瘍を死滅させるのに有利であるバイスタンダー死滅を誘発することができる非荷電代謝産物を生成する。

【0105】

非切断性の非限定的な例としては、チオエーテルリンカー（Ｎ－スクシンイミジル－４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシラート［ＭＣＣ］）が挙げられる。

【0106】

他のリンカーとしては、β－グルクロニドリンカー、Ｓｕｌｆｏ－ＳＰＤＢおよびＭａｌ－ＰＥＧ４－ＮＨＳなどの親水性リンカーが挙げられる。

【0107】

３．薬学的組成物
別の局面では、本発明はまた、本発明の抗体コンジュゲートを含有する薬学的組成物、以下「本発明の薬学的組成物」に関する。

【0108】

薬学的組成物は、薬学的に許容され得るキャリア、希釈剤、賦形剤または補助剤をさらに含み得る。薬学的組成物は、必要に応じて、１またはそれを超えるさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。このような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であり得る。

【0109】

「本発明の抗体コンジュゲート」という用語は、本発明の前記局面との関連で詳細に記載されており、その特徴および態様は、本発明のこの局面に対しても等しく適用される。

【0110】

投与
本発明の抗体コンジュゲートの投与は、活性成分を生物学的に利用可能にする様々な経路のいずれをも使用して達成することができる。例えば、作用物質は、経口および非経口経路、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、筋肉内、例えばカテーテルまたはステントによる局所送達を介して投与することができる。

【0111】

代表的には、医師は、個々の対象に最も適した実際の投与量を決定し、実際の投与量は特定の患者の年齢、体重および応答によって変化する。投与量は、悪性クローン性Ｔ細胞の数を低下または枯渇させるのに十分であるようなものである。

【0112】

４．処置の方法
別の局面では、本発明は、医薬において使用するための本発明の抗体コンジュゲートを提供する。

【0113】

別の局面では、本発明は、対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を処置するための方法であって、本発明の抗体コンジュゲートを投与することを必要とする対象に本発明の抗体コンジュゲートを投与する工程を含む、方法、以下「本発明の処置の方法」を提供する。投与工程は、上記の薬学的組成物の形態であり得る。

【0114】

本発明のこの局面は、代替的に、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の処置において使用するための本発明の抗体コンジュゲート、以下「本発明の使用のための抗体コンジュゲート」として製剤化され得る。

【0115】

本発明のこの局面は、代替的に、Ｔ細胞リンパ腫または白血病を処置するための医薬の製造における本発明の抗体コンジュゲートの使用として製剤化され得る。

【0116】

「本発明の抗体コンジュゲート」という用語は、本発明の前記局面との関連で詳細に記載されており、その特徴および態様は、本発明のこれらの局面に対しても等しく適用される。

【0117】

Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病を処置するための方法は、疾患に関連する少なくとも１つの症候を軽減、低減もしくは改善するために、および／または疾患の進行を減速、低減もしくは遮断するために、既存のＴ細胞リンパ腫および／または白血病を有する対象に投与され得る本発明の抗体コンジュゲートの治療的使用に関する。

【0118】

Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病を予防するための方法は、本発明の抗体コンジュゲートの予防的使用に関する。本明細書では、このような抗体コンジュゲートは、疾患の原因を抑制するもしくは減じるために、または疾患に関連する少なくとも１つの症候の発生を軽減もしくは予防するために、Ｔ細胞リンパ腫および／もしくは白血病にまだ罹患していない対象ならびに／またはＴ細胞リンパ腫および／もしくは白血病の任意の症候を示していない対象に投与され得る。対象は、Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病に対する素因を有し得るか、またはＴ細胞リンパ腫および／または白血病を発症するリスクがあると考えられ得る。

【0119】

これらの治療用途は、治療有効量の本発明の抗体コンジュゲートの投与を含む。

【0120】

対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病の処置は、悪性Ｔ細胞と同じＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞と一緒に、悪性Ｔ細胞の選択的枯渇を引き起こすが、悪性Ｔ細胞によって発現されないＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞の枯渇を引き起こさないようにするために、対象に抗体コンジュゲートを投与する工程を含み得る。

【0121】

本発明の文脈で使用される「対象」または「個体」という用語は、哺乳動物種のメンバー、好ましくは任意の年齢または人種の男性または女性のヒトを指す。

【0122】

前記方法は、対象由来の悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定するために、対象由来の悪性Ｔ細胞のＴＣＲβ鎖定常領域（ＴＣＲＢ）を調べる工程も含み得る。この情報は、投与されるべき抗体コンジュゲートの適切なＴＲＢＣ選択性について医療従事者を支援する。

【0123】

本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病の１またはそれを超える症候の認識可能な予防、治癒、遅延、重症度の低下または改善を達成するために必要とされる本発明の抗体コンジュゲートの量を指す。

【0124】

本発明の方法は、Ｔ細胞を処置するために使用され得る。「リンパ腫」は、代表的にはリンパ節において発生するが、脾臓、骨髄、血液および他の器官にも影響を及ぼし得る癌を指すために、その標準的な意味に従って本明細書で使用される。リンパ腫は、代表的にはリンパ系細胞の固形腫瘍として現れる。リンパ腫に関連する主な症候はリンパ節腫脹であるが、二次的（Ｂ）症候には、発熱、寝汗、体重減少、食欲不振、疲労、呼吸窮迫およびかゆみが含まれ得る。

【0125】

本発明の方法は、Ｔ細胞白血病を処置するために使用され得る。「白血病」は、血液または骨髄の癌を指すためにその標準的な意味に従って本明細書で使用される。

【0126】

以下は、本発明の方法によって処置され得る疾患の例示的で非網羅的なリストである。

【0127】

末梢性Ｔ細胞リンパ腫
末梢性Ｔ細胞リンパ腫は比較的まれなリンパ腫であり、全非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の１０％未満を占める。しかしながら、末梢性Ｔ細胞リンパ腫には侵襲性の臨床経過を伴い、ほとんどのＴ細胞リンパ腫の原因および正確な細胞起源はまだ明確に定義されていない。

【0128】

リンパ腫は通常、最初に頸部、脇の下または鼠径部の腫脹として現れる。脾臓などの他のリンパ節が位置する場合、さらなる腫脹が起こり得る。一般に、拡大したリンパ節は、血管、神経または胃の空間に侵入し、それぞれ腕および脚の腫れ、刺痛およびしびれ、または満腹感をもたらし得る。リンパ腫の症候には、発熱、悪寒、原因不明の体重減少、寝汗、嗜眠およびかゆみなどの非特異的な症候も含まれる。

【0129】

末梢性Ｔ細胞リンパ腫についての予後予測的および治療的に意味のある分類を描写するために、ＷＨＯ分類は、臨床的側面およびいくつかの例では遺伝学と併せて形態学的および免疫表現型の特徴を利用する（Ｓｗｅｒｄｌｏｗら；ＷＨＯ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒｓ ｏｆ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ．４ｔｈ ｅｄ．；Ｌｙｏｎ：ＩＡＲＣ Ｐｒｅｓｓ；２００８）。新生物性Ｔ細胞の解剖学的局在は、それらの提案されている正常細胞対応物および機能に部分的に類似しており、したがって、Ｔ細胞リンパ腫はリンパ節および末梢血に関連する。このアプローチは、Ｔ細胞リンパ腫の細胞分布、形態のいくつかの側面、さらには関連する臨床所見を含む、Ｔ細胞リンパ腫の所見のいくつかのより良い理解を可能にする。

【0130】

Ｔ細胞リンパ腫の最も一般的なものは、全体の２５％を占める末梢性Ｔ細胞リンパ腫、非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）であり、これに血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）が続く（１８．５％）。

【0131】

末梢性Ｔ細胞リンパ腫、非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）
ＰＴＣＬ－ＮＯＳは、全末梢性Ｔ細胞リンパ腫およびＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫の２５％超を占め、最も一般的なサブタイプである。ＰＴＣＬ－ＮＯＳは、除外診断によって決定され、現行のＷＨＯ２００８に列挙されている特定の成熟Ｔ細胞リンパ腫実体のいずれにも対応しない。したがって、ＰＴＣＬ－ＮＯＳは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非特定型（ＤＬＢＣＬ－ＮＯＳ）に類似している。

【0132】

ほとんどの患者は成人であり、年齢の中央値が６０歳、男女比が２：１である。症例の大部分はリンパ節起源であるが、患者の約１３％ではリンパ節外性症状は発生し、最も一般的には皮膚および消化管に転移する。

【0133】

細胞学的スペクトルは非常に広く、多形性から単形性に及ぶ。リンパ上皮様（レンネルト）変異型、Ｔゾーン変異型および濾胞性変異型を含む３つの形態学的に定義された変異型が記載されている。ＰＴＣＬのリンパ上皮様変異型は、豊富な背景上皮様組織球を含有し、一般にＣＤ８陽性である。ＰＴＣＬのリンパ上皮様変異型は、より良好な予後と関連している。ＰＴＣＬ－ＮＯＳの濾胞性変異型は、潜在的に異なる臨床病理学的実体として浮上している。

【0134】

ＰＴＣＬ－ＮＯＳの大部分は成熟Ｔ細胞表現型を有し、ほとんどの場合ＣＤ４陽性である。症例の７５％は、少なくとも１つの汎Ｔ細胞マーカー（ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ５またはＣＤ７）の可変的な喪失を示し、ＣＤ７およびＣＤ５はほとんどの場合下方制御されている。ＣＤ３０およびまれにＣＤ１５が発現されることがあり、ＣＤ１５は有害な予後特徴である。ＣＤ５６発現も、まれではあるが、負の予後影響を有する。さらなる有害な病理学的予後因子には、ＫＩ－６７発現に基づく２５％を超える増殖率、および７０％を超える形質転換された細胞の存在が含まれる。これらのリンパ腫の免疫表現型分析は、これらのリンパ腫の生物学への洞察をほとんど提供していない。

【0135】

血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）
ＡＩＴＬは、リンパ節を伴う多形性浸潤物、顕著な高内皮細静脈（ＨＥＶ）および濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）網目構造の血管周囲の拡張を特徴とする全身性疾患である。ＡＩＴＬは、通常は胚中心に見られる濾胞性ヘルパー型（ＴＦＨ）のαβＴ細胞に由来するデノボＴ細胞リンパ腫と考えられる。

【0136】

ＡＩＴＬは、末梢性Ｔ細胞リンパ腫およびＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫の中で２番目に一般的な実体であり、症例の約１８．５％を占める。ＡＩＴＬは、中年から高齢成人に発生し、年齢の中央値は６５歳であり、男性と女性でほぼ等しい発生率である。臨床的には、患者は通常、全身性リンパ節腫脹、肝脾腫および顕著な全身症候を伴う進行期疾患を有する。掻痒を伴う皮疹が一般的に存在する。自己免疫現象に関連する多クローン性高ガンマグロブリン血症がしばしば存在する。

【0137】

ＡＩＴＬには、３つの異なる形態学的パターンが記載されている。ＡＩＴＬの初期病変（パターンＩ）は、通常、特徴的な過形成性濾胞を有する保存された構造を示す。新生物の増殖は、濾胞の周囲に局在する。パターンＩＩでは、結節構造が部分的に消失し、退縮した濾胞の保持はほとんどない。辺縁洞は保存され、拡張されさえする。傍皮質は、分岐するＨＥＶを含有し、Ｂ細胞濾胞を超えるＦＤＣの増殖が存在する。新生物細胞は、サイズが小～中程度であり、細胞学的非定型性は最小限である。新生物細胞は、多くの場合、透明から淡色の細胞質を有し、明確なＴ細胞膜を示し得る。多形性炎症性背景が、通常、明白である。

【0138】

ＡＩＴＬはＴ細胞悪性腫瘍であるが、Ｂ細胞および形質細胞の特徴的な拡大増殖が存在し、これはＴＦＨ細胞としての新生物細胞の機能を反映している可能性がある。ＥＢＶ陽性およびＥＢＶ陰性Ｂ細胞の両方が存在する。時折、非定型的なＢ細胞は形態学的および免疫表現型的にホジキン／リード－シュテルンベルク様細胞に類似することがあり得、時折、その実体との診断的混同をもたらす。ＡＩＴＬにおけるＢ細胞増殖は広範であり得、一部の患者は続発性ＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）または－よりまれに－ＥＢＶ陰性Ｂ細胞腫瘍を発症し、しばしば形質細胞性分化を伴う。

【0139】

ＡＩＴＬの新生物性ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＤ１０およびＣＤ２７９（ＰＤ－１）の強い発現を示し、ＣＸＣＬ１３について陽性である。ＣＸＣＬ１３は、ＨＥＶへの付着を介したリンパ節への増加したＢ細胞動員、Ｂ細胞活性化、形質細胞分化およびＦＤＣ網目構造の拡大をもたらし、これらはすべてＡＩＴＬの形態的および臨床的特徴に寄与する。濾胞周囲腫瘍細胞における著しいＰＤ－１発現は、ＡＩＴＬパターンＩを反応性の濾胞性および傍皮質過形成と区別するのに特に有用である。

【0140】

ＰＴＣＬ－ＮＯＳの濾胞性変異型は、ＴＦＨ表現型を有する別の実体である。ＡＩＴＬとは対照的に、ＰＴＣＬ－ＮＯＳの濾胞性変異型は、顕著なＨＥＶまたはＦＤＣ網目構造の濾胞外拡大を有しない。新生物細胞は濾胞内凝集物を形成し、Ｂ細胞濾胞性リンパ腫に似た症状を示し得るが、濾胞間増殖パターンを有することもあり得、または拡大した外套帯を伴うこともあり得る。患者は部分的なリンパ節転移を伴う早期疾患を呈することがより多く、ＡＩＴＬに伴う全身症候を欠如することがあるので、臨床的には、ＰＴＣＬ－ＮＯＳの濾胞性変異型は、ＡＩＴＬとは異なる。

【0141】

未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）
ＡＬＣＬは、ＡＬＣＬ－未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）＋またはＡＬＣＬ－ＡＬＫ－として細分され得る。

【0142】

ＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫の中で最も明確な実体の１つであり、馬蹄形の核を有し、ＡＬＫおよびＣＤ３０を発現する特徴的な「ホールマーク細胞」を有する。ＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋は、すべての末梢性Ｔ細胞およびＮＫ細胞リンパ腫の約７％を占め、人生の最初の３０年間において最も一般的である。患者はしばしばリンパ節腫脹を呈するが、リンパ節外部位（皮膚、骨、軟組織、肺、肝臓）の転移およびＢ症候が一般的である。

【0143】

ＡＬＣＬ、ＡＬＫ＋は、５つの異なるパターンが記載されている幅広い形態的スペクトルを示すが、すべての変異型はいくつかのホールマーク細胞を含有する。ホールマーク細胞は、偏心性馬蹄形または腎臓形の核、および顕著な核周囲好酸球性ゴルジ領域を有する。腫瘍細胞は、接着性パターンで増殖し、副鼻腔転移が起こりやすい。小細胞変異型では、より小さい腫瘍細胞が支配的であり、リンパ組織球変異型では、豊富な組織球が、その多くは小さい腫瘍細胞の存在を覆い隠す。

【0144】

定義により、すべての症例がＡＬＫおよびＣＤ３０陽性を示し、発現は通常、より小さい腫瘍細胞においてより弱い。汎Ｔ細胞マーカーの喪失がしばしば存在し、症例の７５％はＣＤ３の表面発現を欠いている。

【0145】

ＡＬＫ発現は、キメラタンパク質の発現をもたらす、染色体２ｐ２３上のＡＬＫ遺伝子の多くのパートナー遺伝子の１つへの再構成からなる特徴的な反復性遺伝子変化の結果である。最も一般的なパートナー遺伝子は、症例の７５％で生じる、染色体５ｑ３５上のヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）であり、ｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）をもたらす。異なる転座変異型におけるＡＬＫの細胞分布は、パートナー遺伝子に応じて変動し得る。

【0146】

ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－は、２００８年のＷＨＯ分類に暫定カテゴリーとして含まれる。ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－は、接着性増殖パターンおよびホールマーク細胞の存在を有するが、ＡＬＫタンパク質発現を欠き、形態的にはＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋と区別できないＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ腫として定義される。

【0147】

小児および若年成人でより一般的であるＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋とは対照的に、患者は通常４０歳～６５歳の成人である。ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－は、リンパ節およびリンパ節外組織の両方に存在し得るが、後者はＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋におけるより一般的には見られない。ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－のほとんどの症例は、典型的な「ホールマーク」特徴を有する接着性新生物細胞のシートによるリンパ節構造の消失を示す。ＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋とは対照的に、小細胞形態の変異型は認められない。

【0148】

ＡＬＣＬのＡＬＫ＋対応物とは異なり、ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－は表面Ｔ細胞マーカー発現のより大きな保存を示すが、細胞傷害性マーカーおよび上皮膜抗原（ＥＭＡ）の発現は起こりにくい。遺伝子発現シグネチャおよび反復性染色体不均衡は、ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－およびＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋において異なり、それらが分子レベルおよび遺伝子レベルで別個の実体であることが確認される。

【0149】

ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－は、ＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋およびＰＴＣＬ－ＮＯＳの両方と臨床的に異なり、これらの３つの異なる実体間で予後に著しい差がある。ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－の５年全生存率は４９％と報告されており、これはＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋の５年全生存率（７０％）ほど良好ではないが、同時にＰＴＣＬ－ＮＯＳの５年全生存率（３２％）より著しく良好である。

【0150】

腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）
ＥＡＴＬは、腸の上皮内Ｔ細胞に由来すると考えられる侵襲性の新生物である。Ｉ型（ＥＡＴＬの大部分に相当する）およびＩＩ型（症例の１０～２０％を占める）という形態学的、免疫組織化学的および遺伝学的に異なる２つのタイプのＥＡＴＬが２００８年ＷＨＯ分類で認識されている。

【0151】

Ｉ型ＥＡＴＬは、通常、明白なまたは臨床的に無症候性のグルテン過敏性腸症に関連し、北ヨーロッパ血統の患者の集団でのセリアック病の有病率が高いために、北ヨーロッパ血統の患者においてより多く見られる。

【0152】

最も一般的には、ＥＡＴＬの病変は空腸または回腸に見られ（症例の９０％）、十二指腸、結腸、胃または胃腸管の外側の領域にまれに現れる。腸病変は通常、粘膜潰瘍を伴う多巣性である。ＥＡＴＬの臨床経過は侵襲性であり、ほとんどの患者は１年以内に疾患または疾患の合併症で死亡する。

【0153】

ＥＡＴＬ Ｉ型の細胞学的スペクトルは広く、いくつかの症例は未分化細胞を含有し得る。いくつかの症例で新生物成分を目立たなくし得る多形性の炎症性背景が存在する。腫瘍に隣接する領域中の腸粘膜は、絨毛の鈍化および病変前駆細胞に相当し得る上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の数の増加を伴うセリアック病の特徴をしばしば示す。

【0154】

免疫組織化学により、新生物細胞は、しばしばＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ７＋ＣＤ５－ＣＤ５６－βＦ１＋であり、細胞傷害性顆粒関連タンパク質（ＴＩＡ－１、グランザイムＢ、パーフォリン）を含有する。ＣＤ３０は、ほとんどすべての症例において部分的に発現される。ＥＡＴＬにおいては、粘膜のホーミング受容体であるＣＤ１０３が発現され得る。

【0155】

単形性ＣＤ５６＋腸Ｔ細胞リンパ腫とも呼ばれるＩＩ型ＥＡＴＬは、ＣＤ８およびＣＤ５６の両方を発現する小型から中型の単形性Ｔ細胞から構成される腸腫瘍として定義される。粘膜内での腫瘍の側方への広がりが存在し、炎症性背景が存在しないことが多い。大半の症例はγδＴＣＲを発現するが、αβＴＣＲに関連する症例が存在する。

【0156】

ＩＩ型ＥＡＴＬはＩ型ＥＡＴＬより世界的に広く分布しており、セリアック病がまれであるアジア人またはラテンアメリカ人集団にしばしば見られる。ヨーロッパ系ＥＡＴＬの個体では、ＩＩは腸Ｔ細胞リンパ腫の約２０％に相当し、症例の少なくとも一部集団にはセリアック病の病歴が存在する。臨床経過は侵襲性である。

【0157】

肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）
ＨＳＴＬは、一般に自然免疫系のγδ細胞傷害性Ｔ細胞に由来する侵襲性の全身性新生物であるが、まれな症例ではαβＴ細胞にも由来し得る。ＨＳＴＬは、最もまれなＴ細胞リンパ腫の１つであり、代表的には、青年および若年成人（年齢中央値３５歳）が罹患し、強い男性優位性を有する。

【0158】

節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型
節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型は侵襲性疾患であり、しばしば破壊性正中線病変および壊死を伴う。ほとんどの症例は、ＮＫ細胞由来であるが、いくつかの症例は、細胞傷害性Ｔ細胞に由来する。節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）と普遍的に関連している。

【0159】

皮膚Ｔ細胞リンパ腫
本発明の方法はまた、皮膚Ｔ細胞リンパ腫を処置するために使用され得る。

【0160】

皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は、様々な病変を出現させる悪性Ｔ細胞の皮膚への遊走を特徴とする。これらの病変は、疾患が進行するにつれて形状を変化させ、代表的には、発疹のように見えるものとして始まり、最終的には、身体の他の部分に転移する前に斑および腫瘍を形成する。

【0161】

皮膚Ｔ細胞リンパ腫には、以下の例示的な非網羅的リストで言及されるものが含まれる。菌状息肉症、パジェット様細網症、セザリー症候群、肉芽腫様弛緩皮膚、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、ＣＤ３０＋皮膚Ｔ細胞リンパ腫、続発性皮膚ＣＤ３０＋大細胞型リンパ腫、非菌状息肉症ＣＤ３０－皮膚大細胞型Ｔ細胞リンパ腫、多形性Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、皮下Ｔ細胞リンパ腫および血管中心性リンパ腫。

【0162】

ＣＴＣＬの徴候および症候は特定の疾患に応じて異なり、そのうちの２つの最も一般的なタイプは菌状息肉症およびセザリー症候群である。古典的菌状息肉症は３つの段階に分けられる。
－紅斑（萎縮性または非萎縮性）：非特異性皮膚炎、体幹下部および臀部の紅斑；掻痒症が最小／無し；
－局面：強度に掻痒性の局面、リンパ節腫脹；および
腫瘍：潰瘍形成傾向

【0163】

セザリー症候群は、紅皮症および白血病によって定義される。徴候および症候には、浮腫性皮膚、リンパ節腫脹、手掌および／または足底の過角化症、脱毛症、爪ジストロフィー、眼瞼外反および肝脾腫が含まれる。

【0164】

すべての原発性皮膚リンパ腫のうち、６５％がＴ細胞型である。最も一般的な免疫表現型はＣＤ４陽性である。皮膚Ｔ細胞リンパ腫という用語は多種多様な障害を包含するので、これらの疾患に共通の病態生理は存在しない。

【0165】

皮膚Ｔ細胞リンパ腫（すなわち、菌状息肉症）の発症の主要な病因機構は解明されていない。菌状息肉症に先行して、Ｔ細胞媒介性慢性炎症性皮膚疾患が起こり得、時折、致死性リンパ腫に進行し得る。

【0166】

原発性皮膚ＡＬＣＬ（Ｃ－ＡＬＣＬ）
Ｃ－ＡＬＣＬは、しばしば、形態によってはＡＬＣ－ＡＬＫ－と区別できない。Ｃ－ＡＬＣＬは、７５％を超える細胞がＣＤ３０を発現する未分化、多形性または免疫芽球性の形態を有する大きな細胞の皮膚腫瘍として定義される。Ｃ－ＡＬＣＬは、リンパ腫様丘疹症（ＬｙＰ）と共に、一群として菌状息肉症後の皮膚Ｔ細胞リンパ増殖の２番目に一般的な群を構成する、原発性皮膚ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ増殖性障害の範囲に属する。

【0167】

免疫組織化学的染色プロファイルは、ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－に非常に類似しており、細胞傷害性マーカーについて陽性に染色する症例の割合がより高い。腫瘍細胞の少なくとも７５％がＣＤ３０に対して陽性のはずである。ＣＤ１５も発現され得、リンパ節転移が起こる場合には、古典的ホジキンリンパ腫との識別は困難であり得る。ＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋のまれな症例は、局所的な皮膚病変を呈し得、Ｃ－ＡＬＣＬに類似し得る。

【0168】

Ｔ細胞急性リンパ芽性白血病
Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）は、それぞれ小児コホートおよび成人コホートにおいてＡＬＬの約１５％および２５％を占める。患者は、通常、高い白血球数を有し、臓器肥大、特に縦隔腫大およびＣＮＳ浸潤を呈し得る。

【0169】

本発明の方法は、ＴＲＢＣを含むＴＣＲを発現する悪性Ｔ細胞に関連するＴ－ＡＬＬを処置するために使用され得る。

【0170】

Ｔ細胞性前リンパ球性白血病
Ｔ細胞性前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）は、侵襲性の挙動を有し、血液、骨髄、リンパ節、肝臓、脾臓および皮膚転移の傾向を有する成熟Ｔ細胞白血病である。Ｔ－ＰＬＬは主に３０歳以上の成人に発症する。他の名称としては、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞白血病の「こぶ状」型およびＴ前リンパ球性白血病／Ｔ細胞リンパ球性白血病が挙げられる。

【0171】

末梢血では、Ｔ－ＰＬＬは、単一の核を有する中サイズのリンパ球と、時折小疱または突起を有する好塩基性細胞質とからなる。核は、通常、円形から楕円形の形状であり、時折、患者は、セザリー症候群で見られる脳回状の核形状に類似するより不規則な核の輪郭を有する細胞を有する。小細胞変異型はすべてのＴ－ＰＬＬ症例の２０％を構成し、セザリー細胞様（脳回状）変異型は症例の５％に見られる。

【0172】

Ｔ－ＰＬＬは、成熟（胸腺後）Ｔリンパ球の免疫表現型を有し、新生物細胞は、代表的には、汎－Ｔ抗原ＣＤ２、ＣＤ３およびＣＤ７について陽性であり、ＴｄＴおよびＣＤ１ａについて陰性である。免疫表現型ＣＤ４＋／ＣＤ８－は症例の６０％に存在し、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋免疫表現型は２５％に存在し、ＣＤ４－／ＣＤ８＋免疫表現型は症例の１５％に存在する。

【0173】

処置または予防されるべきＴ細胞リンパ腫または白血病は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択され得る。

【0174】

処置の方法は、本発明の抗体コンジュゲートを投与する工程を含み得る。当業者は、患者に対して治療効果を発揮することができる本発明の抗体コンジュゲートの量を従来の方法によって決定することができるであろう。

【0175】

別の局面において、本発明は、対象中のＴＲＢＣを発現する細胞への化学療法実体、放射性核種または検出実体の送達を標的とするための方法における使用のための本発明の抗体コンジュゲートに関する。

【0176】

「本発明の抗体コンジュゲート」という用語は、本発明の前記局面との関連で詳細に記載されており、その特徴および態様は、本発明のこの局面に対しても等しく適用される。

【0177】

５．個別化された医療の方法
Ｔ細胞悪性腫瘍はクローン性であるので、すべての悪性細胞はすべてＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを発現する。本発明者らは以前に、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを標的とする免疫療法がＴ細胞リンパ腫を処置する能力を提供する一方で、許容され得る毒性プロファイルを潜在的に提供することを実証した（Ｍａｃｉｏｃｉａら、２０１７，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：１４１６－２３；国際公開第２０１５／１３２５９８号）。本発明はまた、本発明の抗体コンジュゲートによる処置に適したＴ細胞リンパ腫または白血病を有する対象を同定するための方法であって、対象からのＴ細胞を含む試料中のＴＲＢＣ１陽性またはＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の割合を決定することを含む方法を提供する。

【0178】

したがって、別の局面において、本発明は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病に罹患している対象を処置するための適切な療法を選択するための方法であって、
ｉ）前記対象から単離された試料中の悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定することと；
ｉｉ）前記悪性Ｔ細胞の前記ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２発現に基づいて、本発明による使用のための抗体コンジュゲートを選択することと；
を含む、方法、以下「本発明の個別化された医療の第１の方法」に関する。

【0179】

「本発明の抗体コンジュゲート」および「対象」という用語は、本発明の前記局面との関連で詳細に記載されており、それらの特徴および態様は、本発明のこの局面に対しても等しく適用される。

【0180】

本発明の個別化された医療の第１の方法では、試料中のＴＲＢＣ１陽性Ｔ細胞の割合が７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％、またはそれを超える場合に、対象は、ＴＲＢＣ１に対して特異的な本発明による使用のためのコンジュゲート化抗体に基づく療法を受けるのに適している。同様に、試料中のＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の割合が７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％、またはそれを超える場合に、対象は、ＴＲＢＣ２に対して特異的な本発明の抗体コンジュゲートでの前記処置に適している。

【0181】

別の局面において、本発明は、本発明による使用のための抗体コンジュゲートを含む療法を受けるために、Ｔ細胞リンパ腫または白血病に罹患している対象を選択するための方法であって、
ｉ）前記対象から単離された試料中の悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定することと；
ｉｉ）前記悪性Ｔ細胞の前記ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２発現に基づいて、本発明による使用のための抗体コンジュゲートに基づく療法を受けるために前記対象を選択することと；
を含む、方法、以下「本発明の個別化された医療の第２の方法」に関する。

【0182】

「本発明の抗体コンジュゲート」および「対象」という用語は、本発明の前記局面との関連で詳細に記載されており、それらの特徴および態様は、本発明のこの局面に対しても等しく適用される。

【0183】

本発明の個別化された医療の第２の方法では、試料中のＴＲＢＣ１陽性Ｔ細胞の割合が７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％、またはそれを超える場合に、対象は、ＴＲＢＣ１に対して特異的な本発明による使用のためのコンジュゲート化抗体に基づく療法を受けるのに適している。同様に、試料中のＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の割合が７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％、またはそれを超える場合に、対象は、ＴＲＢＣ２に対して特異的な本発明の抗体コンジュゲートでの前記処置に適している。

【0184】

本発明の個別化された医療の第１および第２の方法では、生物学的試料などのＴ細胞を含む試料は、試験される対象から取得される。本明細書で使用される「試料」または「生物学的試料」という用語は、Ｔ細胞を含む罹患した器官の異なる種類の生物学的流体または組織の切片を含む。本発明の診断方法において有用な試料の例示的な非限定的な例には、血液、リンパ液および脊髄液などの、Ｔ細胞を含む様々な種類の生物学的流体が含まれる。これらの生物学的流体試料は、当業者に公知の任意の従来の方法によって取得することができる。あるいは、前記試料はまた、例えば生検または外科的切除による任意の従来の方法による他、組織学的目的のために採取された凍結切片から得ることができる、例えばリンパ腺、脾臓、扁桃または胸腺からの罹患器官組織試料の切片であり得る。

【0185】

試料は、血液試料であり得、または血液試料に由来し得る。

【0186】

対象から単離された試料中の悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定する第１の工程（ｉ）は、本発明の第１の局面に記載されているものなどの抗ＴＲＢＣ１および／または抗ＴＲＢＣ２抗体を使用して実施され得る。この第１の工程は、Ｔ細胞の総数を決定するために、ＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体を使用し得る。

【0187】

悪性Ｔ細胞が従来のＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定するために利用可能ないくつかの免疫学的方法が存在する。非限定的な例としては、免疫組織化学およびフローサイトメトリが挙げられる。

【0188】

Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択され得る。

【0189】

６．本発明の他の局面
６．１．ＴＲＢＣ１特異的抗体
さらなる局面において、本発明は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体と比較して、ＶＨドメイン中に以下の変異の組み合わせ：
－ＶＨドメイン中のＧ１０６Ａ；
－ＶＨドメイン中のＹ１０２Ｍ；
－ＶＨドメイン中のＧ２６ＰおよびＴ２８Ｋ；ならびに
－ＶＨドメイン中のＧ３１Ｓ
の１つを含む、ＴＲＢＣ１に特異的に結合する抗体、以下「本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体」を提供する。

【0190】

ＴＲＢＣ２に対して特異的である本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、以下の変異：
－ＶＨドメイン中のＧ１０６Ａ；
－ＶＨドメイン中のＹ１０２Ｍ；
－ＶＨドメイン中のＧ２６ＰおよびＴ２８Ｋ；および
－ＶＨドメイン中のＧ３１Ｓ
と共に、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインからなり得る。

【0191】

「抗体」という用語は、本発明の第１の局面との関連で詳細に記載されており、その特徴および態様は、本発明のこの局面に対しても等しく適用される。

【0192】

本発明の抗体は、ＴＲＢＣ１に特異的に結合する能力を維持する抗体断片であり得る。抗体断片は、ｓｃＦｖまたはＦａｂなどの抗原結合ドメインであり得る。

【0193】

６．２．ＴＲＢＣ２特異的抗体
さらなる局面において、本発明は、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインと配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインとを有する参照抗体と比較して、ＶＨドメイン中に以下の変異：
－ＶＨドメイン中のＴ２８Ｒ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎ
の１つを含む、ＴＲＢＣ１に特異的に結合する抗体、以下「本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体」を提供する。

【0194】

ＴＲＢＣ２に対して特異的である本発明の抗体コンジュゲートにおいて使用するための抗体は、以下の変異：
－ＶＨドメイン中のＴ２８Ｒ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎ
と共に、配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインからなり得る。

【0195】

「抗体」という用語は、本発明の第１の局面との関連で詳細に記載されており、その特徴および態様は、本発明のこの局面に対しても等しく適用される。

【0196】

本発明の抗体は、ＴＲＢＣ１に特異的に結合する能力を維持する抗体断片であり得る。抗体断片は、ｓｃＦｖまたはＦａｂなどの抗原結合ドメインであり得る。

【0197】

６．２．キメラ抗原受容体
別の局面では、本発明は、本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体または本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体、スペーサー、膜貫通ドメインおよびエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、以下「本発明のＣＡＲ」を提供する。

【0198】

「本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体」および「本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体」という用語は、前記局面において詳細に記載されており、それらの特徴および態様は本発明のこの局面に等しく適用される。

【0199】

本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「キメラＴ細胞受容体」または「人工Ｔ細胞受容体」または「キメラ免疫受容体」という用語は、細胞外抗原認識ドメイン（結合剤）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続するキメラＩ型膜貫通タンパク質を指す。結合剤は、代表的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことができる。結合剤を膜から分離し、結合剤に適切な配向を許容するために、スペーサードメインが通常必要である。使用される共通のスペーサードメインはＩｇＧ１のＦｃである。よりコンパクトなスペーサーは、抗原に応じて、例えばＣＤ８αからのストーク、さらには単にＩｇＧ１ヒンジのみで十分であり得る。膜貫通ドメインは、タンパク質を細胞膜に固定し、スペーサーをエンドドメインに接続する。

【0200】

初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１のγ鎖またはＣＤ３ζのいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有していた。その結果、これらの第一世代受容体は免疫学的シグナル１を伝達し、免疫学的シグナル１は、同族標的細胞のＴ細胞殺傷の引き金を引くのに十分であったが、増殖および生存するようにＴ細胞を完全に活性化することができなかった。この制限を克服するために、化合物エンドドメインが構築されている、すなわち、ＣＤ３ζの細胞内部分へのＴ細胞共刺激分子の細胞内部分の融合は、抗原認識後に同時に活性化シグナルおよび共刺激シグナルを伝達することができる第二世代受容体をもたらす。最も一般的に使用される共刺激ドメインはＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給し、Ｔ細胞増殖の引き金を引く。生存シグナルを伝達する密接に関連するＯＸ４０および４－１ＢＢなどのＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメインを含むいくつかの受容体も記載されている。活性化、増殖および生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有する、さらにより強力な第３世代ＣＡＲが現在記載されている。

【0201】

ＣＡＲが標的抗原を結合すると、これは、標的抗原がその上に発現されているＴ細胞への活性化シグナルの伝達をもたらす。したがって、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性を、標的とされる抗原を発現する腫瘍細胞に向けさせる。

【0202】

したがって、ＣＡＲは、代表的には、（ｉ）抗原結合ドメイン；（ｉｉ）スペーサー；（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）シグナル伝達ドメインを含むかまたはシグナル伝達ドメインと会合する細胞内ドメインを含む（図４参照）。
ＣＡＲは、一般構造：
抗原結合ドメイン－スペーサードメイン－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）を有し得る。

【0203】

本発明のＣＡＲは、ＣＡＲがＴ細胞などの細胞内で発現されたときに、新生タンパク質が小胞体に、続いて細胞表面に向けられ、細胞表面において発現されるように、シグナルペプチドを含み得る。

【0204】

シグナルペプチドのコアは、単一のαヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長い連なりを含有し得る。シグナルペプチドは、転位中にポリペプチドの適切なトポロジーを強化するのに役立つ短い正電荷を帯びたアミノ酸の連なりから始まり得る。シグナルペプチドの末端には、代表的には、シグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸の連なりが存在する。シグナルペプチダーゼは、転位の間または転位の完了後に切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離シグナルペプチドは特異的プロテアーゼによって消化される。

【0205】

シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に存在し得る。

【0206】

シグナルペプチドは、配列番号３～５またはシグナルペプチドがタンパク質の細胞表面発現を引き起こすようになお機能することを条件として、５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸変異（挿入、置換または付加）を有するその変異型を含み得る。
配列番号３：MGTSLLCWMALCLLGADHADG

【0207】

配列番号３のシグナルペプチドは、コンパクトで高度に効率的である。末端グリシンの後ろで約９５％の切断を与え、シグナルペプチダーゼによる効率的な除去を与えると予測される。
配列番号４：MSLPVTALLLPLALLLHAARP

【0208】

配列番号４のシグナルペプチドは、ＩｇＧ１に由来する。
配列番号５：MAVPTQVLGLLLLWLTDARC

【0209】

配列番号５のシグナルペプチドは、ＣＤ８に由来する。

【0210】

ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと連結し、抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するためのスペーサー配列を含む。柔軟なスペーサーは、結合を促進するために抗原結合ドメインが異なる方向に配向することを可能にする。

【0211】

本発明のＣＡＲにおいて、スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８ストークまたはマウスＣＤ８ストークを含み得る。あるいは、スペーサーは、ＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメイン間隔特性を有する代替のリンカー配列を含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するために変更され得る。スペーサーは、例えば国際公開第２０１６／１５１３１５号に記載されているように、コイルドコイルドメインを含み得る。

【0212】

本発明のＣＡＲは、配列番号６～１０として示されている配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型から選択される配列を含み得る。

【化2-1】

【化2-2】

【0213】

ＣＯＭＰコイルドコイルドメインをＮ末端で切断し、表面発現を保持することが可能である。したがって、コイルドコイルＣＯＭＰスペーサーは、Ｎ末端で切断された配列番号１８の切断された様式を含み得る、またはＮ末端で切断された配列番号１８の切断された様式からなり得る。切断型ＣＯＭＰは、配列番号１９の５個のＣ末端アミノ酸、すなわち配列ＣＤＡＣＧ（配列番号２０）を含み得る。切断型ＣＯＭＰは、５～４４個のアミノ酸、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のアミノ酸を含み得る。切断型ＣＯＭＰは、配列番号１９のＣ末端に対応し得る。例えば、２０個のアミノ酸を含む切断型ＣＯＭＰは、配列ＱＱＶＲＥＩＴＦＬＫＮＴＶＭＥＣＤＡＣＧ（配列番号２１）を含み得る。切断型ＣＯＭＰは、多量体化に関与するシステイン残基を保持し得る。切断型ＣＯＭＰは、多量体を形成する能力を保持し得る。

【0214】

膜貫通ドメインは、膜にまたがるＣＡＲの配列である。

【0215】

膜貫通ドメインは、膜中で熱力学的に安定である任意のタンパク質構造であり得る。これは、代表的には、いくつかの疎水性残基から構成されるアルファヘリックスである。本発明の膜貫通部分を供給するために、任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを使用することができる。タンパク質の膜貫通ドメインの存在および全長は、当業者によって、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０／）を使用して決定することができる。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造、すなわち、膜を貫通するのに十分な長さの疎水性アルファヘリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列であることを考えると、人工的に設計されたＴＭドメインも使用され得る（米国特許第７０５２９０６ Ｂ１号は合成膜貫通成分を記載する）。

【0216】

膜貫通ドメインは、優れた受容体安定性を与えるＣＤ２８、ＣＤ８ａまたはＴＹＲＰ－１に由来し得る。

【0217】

一態様において、膜貫通ドメインはＣＤ８ａに由来する。
配列番号１１：ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT

【0218】

別の態様において、膜貫通ドメインは、ＴＹＲＰ－１に由来する。
配列番号１２：ＴＹＲＰ－１膜貫通ドメイン
IIAIAVVGALLLVALIFGTASYLI

【0219】

エンドドメインは、ＣＡＲのシグナル伝達部分である。抗原認識後、受容体はクラスタを形成し、天然状態のＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから外され、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３ζのエンドドメイン成分である。これは、抗原が結合された後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３ζは、完全に能力を有する活性化シグナルを提供し得ず、さらなる共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。共刺激ドメインの例としては、増殖／生存シグナルを伝達するためにＣＤ３ζと共に使用することができる、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７およびＩＣＯＳ由来のエンドドメインが挙げられる。

【0220】

一態様において、少なくとも１つの共刺激エンドドメインがＣＤ３ζと共に使用される。特定の態様において、共刺激エンドドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７およびＩＣＯＳ由来のエンドドメインからなる群から選択される。

【0221】

別の態様において、少なくとも２つの共刺激エンドドメインがＣＤ３ζと共に使用される。特定の態様では、２つの共刺激エンドドメインは、任意の組み合わせおよび順序で、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７およびＩＣＯＳ由来のエンドドメインからなる群から選択される。特に適切な組み合わせとしては、ＣＤ２８およびＣＤ３ζ由来のエンドドメイン、ＯＸ４０およびＣＤ３ζのエンドドメイン、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζのエンドドメイン、ＣＤ２８、ＯＸ４０およびＣＤ３ζ由来のエンドドメイン、ならびにＣＤ２８、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζ由来のエンドドメインが挙げられる。

【0222】

活性化エンドドメインを有するＣＡＲの膜貫通および細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）は、配列番号１３～１８として示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。

【化3-1】

【化3-2】

【0223】

配列が有効な膜貫通ドメインおよび有効な細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを提供する限り、変異型配列は、配列番号１３～１８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。

【0224】

２つの抗体様結合ドメインを有するという基本概念に基づく多種多様な分子が開発されている。

【0225】

二重特異性Ｔ細胞誘導分子は、主に抗癌剤としての使用のために開発された二重特異性抗体型分子のクラスである。二重特異性Ｔ細胞誘導分子は、癌細胞などの標的細胞に対する宿主の免疫系、より具体的にはＴ細胞の細胞傷害活性を指示する。これらの分子では、一方の結合ドメインはＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、他方は（腫瘍特異的分子を介して）腫瘍細胞などの標的細胞に結合する。二重特異性分子は、標的細胞およびＴ細胞の両方に結合するので、標的細胞をＴ細胞に近接させ、その結果、Ｔ細胞は、その効果、例えば、癌細胞に対する細胞傷害効果を発揮することができる。Ｔ細胞：二重特異性Ａｂ：癌細胞複合体の形成は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達を誘導し、例えば、細胞傷害性メディエータの放出をもたらす。理想的には、作用物質は、標的細胞の存在下で所望のシグナル伝達を誘導するのみであり、選択的死滅をもたらす。

【0226】

二重特異性Ｔ細胞誘導分子はいくつかの異なる形式で開発されているが、最も一般的なものの１つは、異なる抗体の２つの直列に配置された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる融合物である。これらは、時にＢｉＴＥ（Ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒｓ（二重特異性Ｔ細胞誘導剤））として知られている。

【0227】

６．３．二重特異性Ｔ細胞誘導剤
本発明はまた、ＴＲＢＣ１を選択的に認識し、Ｔ細胞と誘導し、活性化することができる二重特異性分子を企図する。例えば、分子はＢｉＴＥであり得る。

【0228】

したがって、別の局面では、本発明は、本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体または本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体と、Ｔ細胞活性化ドメインとを含む二重特異性Ｔ細胞誘導剤（ＢｉＴＥ）、以下「本発明のＢｉＴＥ」を提供する。

【0229】

「本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体」および「本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体」という用語は、前記局面において詳細に記載されており、それらの特徴および態様は本発明のこの局面に等しく適用される。

【0230】

本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化ドメイン」という用語は、Ｔ細胞を活性化することができる第２のドメインを指す。Ｔ細胞活性化ドメインは、ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖであり得る。本発明の目的に適した抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの例は当技術分野で周知であり、ＯＫＴ３に由来するｓｃＦｖを含むが、これに限定されない。

【0231】

二重特異性分子は、その産生を助けるシグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドは、二重特異性分子を宿主細胞上清から採取することができるように、宿主細胞によって二重特異性分子が分泌されるようにさせ得る。

【0232】

シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に存在し得る。二重特異性分子は、一般式：シグナルペプチド－本発明の変異型抗原結合ドメイン－Ｔ細胞活性化ドメインを有し得る。

【0233】

二重特異性分子は、本発明の変異型抗原結合ドメインとＴ細胞活性化ドメインとを接続し、２つのドメインを空間的に分離するためのスペーサー配列を含み得る。

【0234】

スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークを含み得る。あるいは、リンカーは、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメイン間隔特性を有する代替のリンカー配列を含み得る。

【0235】

６．４．核酸：
別の局面では、本発明はまた、本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体または本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体をコードする核酸配列を提供する。

【0236】

別の局面では、本発明はまた、本発明のＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。

【0237】

別の局面では、本発明はまた、本発明のＢｉＴＥをコードする核酸配列を提供する。

【0238】

「本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体」、「本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体」、「本発明のＣＡＲ」および「本発明のＢｉＴＥ」という用語は、本発明の前記局面との関連で詳細に記載されており、それらの特徴および態様は本発明のこれらの局面に等しく適用される。

【0239】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」という用語は、互いに同義であることを意図している。

【0240】

遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードし得ることが当業者によって理解されるであろう。さらに、ポリペプチドがその中で発現されるべき任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するために、当業者は、日常的な技術を使用して、本明細書に記載されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行い得ることを理解されたい。

【0241】

本発明の核酸配列および構築物は、相同組換えを回避するために、同じまたは類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域中に代替コドンを含有し得る。

【0242】

本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。本発明による核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。本発明による核酸は、それらの中に合成ヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでもあり得る。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なるタイプの修飾が、当技術分野において公知である。これらには、メチルホスホナートおよびホスホロチオアート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書に記載されている使用のために、ポリヌクレオチドは、当技術分野において利用可能な任意の方法によって修飾され得ることを理解されたい。このような修飾は、関心対象のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために行われ得る。

【0243】

ヌクレオチド配列に関する「変異型」、「相同体」または「誘導体」という用語は、配列からのまたは配列への１つ（またはそれを超える）核酸の任意の置換、変動、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。

【0244】

６．５．ベクター
本発明はまた、本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体、本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体、本発明のＣＡＲまたは本発明のＢｉＴＥをコードする１またはそれを超える核酸を含むベクターまたはベクターのキットを提供する。このようなベクターは、宿主細胞が本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体、または本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体、または本発明のＣＡＲ、または本発明のＢｉＴＥを発現するように、核酸配列を宿主細胞中に導入するために使用され得る。

【0245】

「本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体」、「本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体」、「本発明のＣＡＲ」、および「本発明のＢｉＴＥ」という用語、ならびにそれらをコードする核酸は、本発明の前記局面との関連で詳細に記載されており、それらの特徴および態様は本発明のこれらの局面に等しく適用される。

【0246】

ベクターは、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡなどのプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。

【0247】

ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの細胞溶解性免疫細胞を形質移入または形質導入することが可能であり得る。

【0248】

６．６．細胞
本発明の別の局面は、本発明のＣＡＲを含む細胞に関する。

【0249】

細胞は、本発明の核酸またはベクターを含み得る。

【0250】

「本発明のＣＡＲ」、「本発明の核酸」、「本発明のベクター」という用語は、本発明の前記局面との関連で詳細に記載されており、それらの特徴および態様は本発明のこれらの局面に等しく適用される。

【0251】

細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの細胞溶解性免疫細胞であり得る。

【0252】

Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種である。Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球と区別することができる。以下に要約されるように、様々なタイプのＴ細胞が存在する。

【0253】

ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的過程において他の白血球を支援する。ＴＨ細胞は、その表面上にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原を提示されると活性化される。これらの細胞は、異なる種類の免疫応答を促進するために異なるサイトカインを分泌するＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９またはＴＦＨを含むいくつかのサブタイプのうちの１つに分化することができる。

【0254】

細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルスに感染した細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。ＣＴＬはその表面にＣＤ８を発現する。これらの細胞は、すべての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。制御性Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ－１０、アデノシンおよび他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、アネルギー状態に不活性化され得、これにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患が予防される。

【0255】

メモリーＴ細胞は、感染症が消散した後に長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。メモリーＴ細胞は、それらの同族抗原に再曝露されると迅速に多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、したがって過去の感染症に対する「メモリー」を免疫系に提供する。メモリーＴ細胞は、３つのサブタイプ：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、代表的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。

【0256】

以前はサプレッサーＴ細胞として知られていた制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持にとって極めて重要である。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の主な役割は、免疫反応の終了に向けてＴ細胞媒介性免疫を停止させること、および胸腺における負の選択の過程を免れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。

【0257】

ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラス、すなわち天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞が記載されている。

【0258】

天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られる）は胸腺において生じ、ＴＳＬＰで活性化された骨髄系（ＣＤ１１ｃ＋）および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と発達中のＴ細胞との間での相互作用に関連している。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって他のＴ細胞と区別することができる。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、制御性Ｔ細胞の発達を妨げることができ、致命的な自己免疫疾患であるＩＰＥＸを引き起こす。

【0259】

適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られる）は、正常な免疫応答の間に生じ得る。

【0260】

細胞はナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であり得る。ＮＫ細胞は自然免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的な様式でウイルスに感染した細胞からの自然シグナルに対する迅速な応答を提供する

【0261】

ＮＫ細胞（自然リンパ系細胞の群に属する）は、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成するリンパ球系共通前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺において分化および成熟し、その後、循環中に入ることが知られている。

【0262】

本発明の細胞は、上記の細胞型のいずれでもあり得る。一態様において、本発明の細胞はＴ細胞である。別の態様において、本発明の細胞はＮＫ細胞である。

【0263】

本発明のこの局面による細胞は、患者自身の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）もしくは無関係のドナーからの末梢血（第三者）からの造血幹細胞移植の状況でエクスビボで作製され得る。

【0264】

あるいは、本発明のこの局面による細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞の細胞溶解性細胞へのエクスビボ分化から誘導され得る。あるいは、その溶解機能を保持し、治療薬として作用することができる、ＴまたはＮＫ細胞などの不死化した細胞溶解性細胞株が使用され得る。

【0265】

これらのすべての態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡによる形質移入を含む多くの手段のうちの１つによって、キメラポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって作製される。

【0266】

本発明の細胞は、対象由来のエクスビボ細胞であり得る。細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料に由来し得る。細胞、特にＴ細胞またはＮＫ細胞などの細胞溶解性細胞は、本発明のＣＡＲを提供する分子をコードする核酸で形質導入されるより前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理によって、活性化および／または拡大増殖され得る。

【0267】

本発明の細胞は、ＣＡＲをコードする核酸配列を含む本発明のベクターで細胞を形質導入または形質移入する工程を含む方法によって作製され得る。

【0268】

本発明の細胞を作製するための方法は、形質導入または形質移入工程の前に、対象由来または上に列挙した他の供給源由来の細胞含有試料から細胞を単離する工程をさらに含み得る。細胞が細胞溶解性細胞である場合、試料は対象由来の細胞溶解性細胞含有試料である。

【0269】

本発明の文脈で使用される「対象」または「個体」という用語は、哺乳動物種のメンバー、好ましくは任意の年齢または人種の男性または女性のヒトを指す。

【0270】

次いで、本発明の細胞は、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインの発現に基づく選択によって精製され得る。

【0271】

６．７．薬学的組成物
本発明はまた、本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体、または本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体、または本発明の１つの細胞もしくは複数の細胞、または本発明のＢｉＴＥを含有する薬学的組成物に関する。

【0272】

「本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体」、「本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体」、「本発明のＣＡＲ」および「本発明のＢｉＴＥ」という用語は、本発明の前記局面との関連で詳細に記載されており、それらの特徴および態様は本発明のこれらの局面に等しく適用される。

【0273】

本発明の前記局面の薬学的組成物の説明および態様は、本発明のこれらの局面に等しく適用される。当業者は、本発明の前記局面の薬学的組成物をこの局面に適合させるためにどの改変が必要であり得るかを直ちに知るであろう。

【0274】

６．８．処置の方法
別の局面において、本発明は、医療において使用するための、本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体、または本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体、または本発明の１つの細胞もしくは複数の細胞、または本発明のＢｉＴＥを提供する。

【0275】

別の局面では、本発明は、対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を処置するための方法であって、本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体、または本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体、または本発明の１つの細胞もしくは複数の細胞、または本発明のＢｉＴＥを、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。投与工程は、上記の薬学的組成物の形態であり得る。

【0276】

本発明のこの局面は、代替として、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の処置において使用するための、本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体、または本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体、または本発明の１つの細胞もしくは複数の細胞、または本発明のＢｉＴＥとして製剤化され得る。

【0277】

本発明のこの局面は、代替として、Ｔ細胞リンパ腫または白血病を処置するための医薬の製造における本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体、または本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体、または本発明の１つの細胞もしくは複数の細胞、または本発明のＢｉＴＥの使用として製剤化され得る。

【0278】

「本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体」、「本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体」、「本発明のＣＡＲ」および「本発明のＢｉＴＥ」という用語は、本発明の前記局面との関連で詳細に記載されており、それらの特徴および態様は本発明のこれらの局面に等しく適用される。

【0279】

Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病を処置するための方法は、疾患に関連する少なくとも１つの症候を軽減、低減もしくは改善するために、および／または疾患の進行を減速、低減もしくは遮断するために、既存のＴ細胞リンパ腫および／または白血病を有する対象に投与され得る本発明の抗体コンジュゲートの治療的使用に関する。

【0280】

本発明の前記局面の処置の方法の説明および態様は、本発明のこれらの局面に等しく適用される。当業者は、本発明の前記局面の処置の方法をこの局面に適合させるためにどの改変が必要であり得るかを直ちに知るであろう。

【0281】

６．９．診断剤
ＴＲＢＣ１^＋対ＴＲＢＣ２^＋である健康なドナー由来のＴ細胞の割合は３５％対６５％である、すなわち、ＴＲＢＣ１を発現する総Ｔ細胞の百分率の中央値は３５％（範囲、２５～４７％）であることが以前に決定されている（Ｍａｃｉｏｃｉａら、２０１７，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２３：１４１６－２３）。Ｔ細胞リンパ腫または白血病はクローン性癌であるので（Ｍａｃｉｏｃｉａら、２０１７；上記）、Ｔ細胞リンパ腫または白血病に特徴的な悪性Ｔ細胞の調節解除された増殖は、著しく歪んだＴＲＢＣ１^＋またはＴＲＢＣ２^＋Ｔ細胞（すなわち、ＴＲＢＣ２^－またはＴＲＢＣ１^－Ｔ細胞）の割合をもたらす。したがって、ＴＲＢＣ１に特異的に結合し、それ故、ＴＲＢＣ１とＴＲＢＣ２を識別することができることによって、本発明の抗体は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の診断のための有用な作用物質を構成する。

【0282】

したがって、別の局面において、本発明は、本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体または本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体を含む診断剤、以下「本発明の診断剤」を提供する。

【0283】

「本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体」および「本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体」という用語は、本発明の前記局面との関連で詳細に記載されており、それらの特徴および態様は本発明のこの局面に等しく適用される。

【0284】

これらのアッセイにおいて使用されるべき本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体または本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体は、標識され得るか、または非標識であり得る。本明細書で使用される「検出可能な標識」または「標識剤」という用語は、例えば分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段による検出のための適切な手順および機器を使用して、その分子標識が結合している分子の検出、局在化および／または同定を可能にする分子標識を指す。抗体を標識するのに適した標識剤には、放射性核種、酵素、フルオロフォア、化学発光試薬、酵素基質または補因子、酵素阻害剤、粒子、色素および誘導体などが含まれる。当業者が理解するように、標識されていない変異型抗原結合ドメインおよび抗体は、追加の試薬、例えば標識された二次抗体で検出する必要がある。これは、信号が増幅されることを可能にするので、検出方法の感度を増加させるために特に有用である。標識されていない本発明の抗体（一次抗体）および標識されている本発明の抗体（二次抗体）を使用する、本発明において使用することができる広範囲の従来のアッセイが存在し、これらの技術には、ウエスタンブロッティングまたは免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合ＥＩＡ（競合酵素イムノアッセイ）、ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学的および免疫組織化学的技術、本発明の抗体を含むタンパク質マイクロスフェア、バイオチップまたはマイクロアレイの使用に基づくフローサイトメトリまたは多重検出技術が含まれる。本発明の変異型抗原結合ドメインまたは抗体を使用してＴＲＢＣ１を検出および定量する他の方法には、アフィニティークロマトグラフィー技術またはリガンド結合アッセイが含まれる。

【0285】

診断剤は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病を診断するために使用され得る。

【0286】

Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択され得る。

【0287】

６．１０．診断の方法
別の局面において、本発明は、対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を診断するための方法であって、本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体または本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体を前記対象からのＴ細胞を含む試料に接触させる工程を含む、方法を提供する。

【0288】

「本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体」および「本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体」、「対象」および「試料」という用語は、本発明の前記局面との関連で詳細に記載されており、それらの特徴および態様は本発明のこの局面に等しく適用される。

【0289】

本発明の診断方法は、試料中のＴＲＢＣ１陽性Ｔ細胞の総数を決定する工程をさらに含み得る。本発明の診断方法は、試料中のＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の総数を決定する工程をさらに含み得る。本発明の診断方法は、試料中のＴＲＢＣ１陽性Ｔ細胞およびＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の総数を決定する工程をさらに含み得る。

【0290】

本発明の診断方法は、試料中のＴ細胞の総数を決定する工程をさらに含み得る。この工程は、Ｔ細胞の総数を決定するために、ＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体を使用し得る。

【0291】

本発明の診断方法は、試料中のＴＲＢＣ１陽性Ｔ細胞の割合を決定する工程をさらに含み得る。

【0292】

本発明の診断方法の第１の工程によれば、本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体を、当業者に公知の適切な条件下で研究中の対象からの試料と接触させる。

【0293】

本発明の診断方法は、試料中のＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の割合を決定する工程をさらに含み得る。

【0294】

本発明の診断方法の第１の工程によれば、本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体を、当業者に公知の適切な条件下で研究中の対象からの試料と接触させる。

【0295】

当業者は、本発明の診断方法の第２の工程を実施するのに適した、試料中のＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を検出するための多数の従来の方法を使用することができる。免疫学的方法が特に有用である。したがって、本発明の診断剤の使用は、本発明による診断方法を実施するのに特に有用であり得る。本発明の診断剤の特徴および特定の態様は既に定義されており、本発明の診断方法に等しく適用される。

【0296】

本発明の診断方法では、試料中の７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％、またはそれを超えるＴＲＢＣ１陽性Ｔ細胞の割合が、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の存在を示し得る。

【0297】

当業者によって理解されるように、１００％正しいことが好ましいが、予測は、診断または評価される対象の１００％に対して正しい必要はない。しかしながら、この用語は、対象の統計的に有意な部分が所与の転帰を有する可能性が増加したと同定され得ることを必要とする。対象から得られたデータが統計的に有意であるかどうかは、様々な周知の統計評価ツール、例えば、信頼区間の決定、ｐ値決定、交差検証された分類率などを使用して、当業者によって困難なく決定することができる。詳細は、Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８３に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．０１または０．００５またはそれ未満である。

【0298】

さらに、本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体および本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体は、それぞれＴＲＢＣ１陽性Ｔ細胞およびＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞を特異的に結合するそれらの能力を考慮すると、Ｔ細胞リンパ腫または白血病のインビボ診断のためにも使用することができる。例えば、本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体および本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体は、疾患を明らかにする、診断する、または検査することを目指す医学的処置などの臨床目的のために、医療用画像化、すなわち、身体（またはその部分および機能）、例えば人体の画像を作成するために使用される一連の技術および過程において使用することができる。

【0299】

この目的のために、本発明の変異型抗原結合ドメインまたは抗体は、当技術分野で公知の適切な方法によって標識され、例えば、適切な分子、例えば放射性同位体または蛍光色素との結合および／または搭載を用いて、放射免疫診断法、陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）、内視鏡免疫蛍光法などの画像診断法のための作用物質として提供される。本発明の変異型抗原結合ドメインおよび抗体は、ガンマ線放射性同位体に結合され、ガンマカメラまたは単一光子放射型コンピュータ断層撮影法を使用する放射免疫シンチグラフィーにおいて使用され得る。本発明の変異型抗原結合ドメインおよび抗体は、陽電子放射体に結合され、ＰＥＴにおいて使用され得る。本発明の変異型抗原結合ドメインおよび抗体は、Ｃｙ３、Ｃｙ２、Ｃｙ５またはＦＩＴＣなどの蛍光色素に結合され、内視鏡免疫蛍光法において使用され得る。記載されたように修飾された本発明の変異型抗原結合ドメインおよび抗体は、任意の適切な経路によって、例えば静脈内に、個体に対して適切な用量で投与され、ＴＲＢＣ１陽性Ｔ細胞の位置は、当技術分野で周知の過程によって検出され、決定され、または測定される。画像診断を含む本明細書で使用される方法および技術は当業者に公知であり、当業者は適切な用量製剤も提供することができる。

【0300】

診断されるべきＴ細胞リンパ腫または白血病は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、非特定型（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択され得る。

【0301】

試料は、血液試料であり得、または血液試料に由来し得る。

【0302】

６．１１．個別化された医療の方法
別の局面において、本発明は、本発明の細胞、ＴＲＢＣ１特異的抗体、ＴＲＢＣ２特異的抗体またはＢｉＴＥでの処置に適したＴ細胞リンパ腫または白血病を有する対象を同定するための方法であって、前記対象からのＴ細胞を含む試料中のＴＲＢＣ１陽性Ｔ細胞および／またはＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の割合を決定することを含む方法を提供する。

【0303】

したがって、別の局面において、本発明は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病に罹患している対象を処置するための適切な療法を選択するための方法であって、
ｉ）前記対象から単離された試料中の悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定することと；
ｉｉ）前記悪性Ｔ細胞の前記ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２発現に基づいて、本発明による使用のための細胞、ＴＲＢＣ１特異的抗体、ＴＲＢＣ２特異的抗体またはＢｉＴＥを選択することと；
を含む、方法、以下「本発明の個別化された医療の第１の方法」に関する。

【0304】

別の局面において、本発明は、本発明による使用のための細胞、ＴＲＢＣ１特異的抗体、ＴＲＢＣ２特異的抗体またはＢｉＴＥを含む療法を受けるために、Ｔ細胞リンパ腫または白血病に罹患している対象を選択するための方法であって、
ｉ）前記対象から単離された試料中の悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定することと；
ｉｉ）前記悪性Ｔ細胞の前記ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２発現に基づいて、本発明による使用のための細胞、ＴＲＢＣ１特異的抗体、ＴＲＢＣ２特異的抗体またはＢｉＴＥに基づく療法を受けるために前記対象を選択することと；
を含む、方法、以下「本発明の個別化された医療の第２の方法」に関する。

【0305】

「本発明の細胞」、「本発明のＴＲＢＣ１特異的抗体」、「本発明のＴＲＢＣ２特異的抗体」、「本発明のＢｉＴＥ」、「対象」および「Ｔ細胞を含む試料」という用語は、本発明の前記局面との関連で詳細に記載されており、それらの特徴および態様は本発明のこの局面に等しく適用される。

【0306】

本発明の前記局面の個別化された医療の方法の説明および態様は、本発明のこれらの局面に等しく適用される。当業者は、本発明の前記局面の個別化された医療の方法をこの局面に適合させるためにどの改変が必要であり得るかを直ちに知るであろう。

【実施例】

【0307】

実施例
［実施例１］
実施例１：ｈＪＯＶＩ－１およびＫＦＮ抗体の抗体内部移行
ＴＲＢＣ１のみ、ＴＲＢＣ２のみを発現するように操作された、またはＴＲＢＣがノックアウトされた（ＫＯ）ＨＰＢ－ＡＬＬ細胞で、抗ＴＲＢＣ１抗体ｈＪＯＶＩ－１および抗ＴＲＢＣ２抗体ＫＦＮの細胞取り込みを試験した。この目的のために、５６０／５８５ｎｍスペクトルを有するｐＨ感受性フルオロフォアであるＺｅｎｏｎ ｐＨｒｏｄｏ ｉＦＬ ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造業者の推奨に従ってＩｇＧ形式でｈＪＯＶＩ－１およびＫＦＮをコンジュゲートした。無関係な抗ＨＥＬ抗体も、対照として使用するためにコンジュゲートした。ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ１、ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ２およびＨＰＢ－ＡＬＬ ＫＯ細胞と共に、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間、コンジュゲートされた抗体をインキュベートした。１００μｌのＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ中に５×１０^４細胞／ウェルを有する９６ウェルプレート中に５μｇ／ｍｌで、試験抗体ｈＪＯＶＩ－１、ＫＦＮおよび抗ＨＥＬを適用した。２４時間後、細胞を洗浄し、採取し、１：１００ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で１０分間染色した後、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ）を用いてフローサイトメトリによって分析した。

【0308】

図４に示される結果は、抗ＴＲＢＣ抗体であるｈＪＯＶＩ－１およびＫＦＮはいずれも、ＨＰＢ－ＡＬＬ細胞中に良好に内部移行することを実証している。しかしながら、より低い親和性ではあるが同じエピトープでその標的に結合するＫＦＮ抗体は、より高い親和性のｈＪＯＶＩ－１よりも改善された内部移行を示した。ｈＪＯＶＩ－１はＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ１細胞中にのみ内部移行し、ＫＦＮはＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ２細胞中にのみ内部移行したので、ｈＪＯＶＩ－１およびＫＦＮの特異性は抗体コンジュゲートとして維持された。

【0309】

［実施例２］
実施例２：ＴＲＢＣ抗体の親和性および結合速度論
親和性、会合および解離速度を確認するために、ｈＪＯＶＩ－１の抗体変異型のいくつかのに対して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を行った。本特許出願の実施例の節で使用されたこれらの変異型Ｍｕｔ１～Ｍｕｔ１５の配列詳細を表１および表２に示す。これらの抗ＴＲＢＣ抗体変異型は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかに対して特異性を有する。

【0310】

ランニングおよび希釈緩衝液としてＨＢＳＰ１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を使用してＳＰＲ実験を行った。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン２．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をデータ処理のために使用した。結合速度論の決定のために、マウス抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＣＭ５ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合させた。抗ＴＲＢＣ１または抗ＴＲＢＣ２抗体をフローセル上に捕捉し、様々な濃度の相互作用パートナータンパク質（ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２）を２５℃の温度で３０ｍｌ／分の流速でフローセル上に注入した。緩衝液のみを用いて二重参照減算を行った。速度論的速度定数は、１：１ラングミュア結合モデルに従うカーブフィッティングによって取得された。

【0311】

ＳＰＲによって得られた親和定数および速度論的速度定数を図５および表１に示す。

【0312】

ＴＲＢＣ１に対する異なる結合特性を有する様々な変異体を選択して、ＴＲＢＣ１に対するそれらの速度論的プロファイルを比較した（図６）。非常に類似した会合速度を有するが、異なる解離速度を有するいくつかの結合剤が同定され、さらに評価した。

【0313】

［実施例３］
実施例３：抗ＴＲＢＣ１抗体の抗体内部移行
実施例２で選択された抗ＴＲＢＣ１抗体（図６）の内部移行をＨＰＢ－ＡＬＬ細胞（ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２およびＫＯ）で評価した。この目的のために、５０９／５３３ｎｍスペクトルを有するｐＨ感受性フルオロフォアＺｅｎｏｎ ｐＨｒｏｄｏ ｉＦＬグリーン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造業者の推奨に従ってＩｇＧ形式で抗ＴＲＢＣ１抗体をコンジュゲートした。無関係な抗ＨＥＬ抗体も、対照として使用するためにコンジュゲートした。ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ１、ＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ２およびＨＰＢ－ＡＬＬ ＫＯ細胞と共に、３７℃、５％ＣＯ_２で９時間、コンジュゲートされた抗体をインキュベートした。１００μｌのＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ中に５×１０^４細胞／ウェルを有する９６ウェルプレート中に５μｇ／ｍｌで、試験抗体を適用した。９時間後、細胞を洗浄し、採取し、１：１０００の固定可能な生存色素ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で１０分間染色した後、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ）を用いてフローサイトメトリによって分析した。

【0314】

９時間で、細胞をＰＢＳで洗浄し、４００ｇ５分で採取し、１：１０００の固定可能な生存色素ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で１０分間染色した後、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリによって分析した。

【0315】

結果は、すべての抗ＴＲＢＣ１抗体が十分に内部移行されたことを実証した（図７）。これらの変異型の内部移行能力の分析は、減少した親和性および増加した解離速度を有する抗体がより容易に内部移行されることを示した。しかしながら、おそらくは標的抗原結合の欠如を表すある特定の親和性（Ｍｕｔ１４）では、内部移行が損なわれた。以前の報告は、最適な細胞取り込みを達成するためには高い親和性、したがって遅い解離速度が必要とされると主張していたので、これは驚くべきことである。

【0316】

［実施例４］
実施例４：最適なＡＤＣのための抗ＴＲＢＣ１および抗ＴＲＢＣ２抗体の選択
実施例３の知見、すなわち、改善された内部移行はより低い親和性で起こるという知見に基づいて、抗ＴＲＢＣ２クローンＫＦＮの解離プロファイルを模倣するので、抗ＴＲＢＣ１抗体Ｍｕｔ１１をさらなる調査のために選択した。同様に、最適な結合速度論を示すので、ＴＲＢＣ２抗体Ｍｕｔ１５も選択した。

【0317】

Ｍｕｔ１１およびＭｕｔ１５を使用する内部移行実験を実施例３に記載されるように行った。

【0318】

結果は、Ｍｕｔ１１およびＭｕｔ１５の両方が良好に内部移行されたことを示した（図８）。さらに、結果は、これらの２つの抗体で得られた内部移行はｈＪｏｖｉ１の内部移行と比較してはるかに改善されたことを実証した。変異型Ｍｕｔ１１は、抗原特異性を維持しながら、ＴＲＢＣ１細胞で最大の内部移行を示した。同様に、ＫＦＮ変異型Ｍｕｔ１５は、ＴＲＢＣ２細胞に対する最適な内部移行および特異性を示した。

【0319】

［実施例５］
実施例５：ＴＲＢＣ特異的ＡＤＣの作製
ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２ ＡＤＣ分子の有効性を試験するために、Ｍｕｔ１１およびＭｕｔ１５抗体をモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）にコンジュゲートした。対照抗ＨＥＬを使用した。簡潔には、抗体を作製し、高純度に精製した。リンカー搭載物ｍｃ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを使用して抗体薬物複合体を生成した（図９Ａ）。簡潔には、まず、還元剤を使用して、還元された抗体の鎖間ジスルフィド結合から求核性システイン残基を遊離させた。還元されたシステインを薬物－リンカー複合体とコンジュゲートした。所望の薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣを同定するために、複合体形成条件を最適化した。薬物－抗体比は、ＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ－ＮＰＲカラム（２．５μｍ、４．６×１００ｍｍ）での疎水性相互作用クロマトグラフィーによって評価され、Ｍｕｔ１１、Ｍｕｔ１５および抗ＨＥＬについてそれぞれ３．１、３．２および３．３で評価された。

【0320】

モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）へのＭｕｔ１１およびＭｕｔ１５抗体のコンジュゲーションは、抗体が内部移行される能力を損なわなかった（図９Ｂ）。

【0321】

［実施例６］
実施例６：ＴＲＢＣ特異的ＡＤＣの機能的特徴決定
１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７で刺激した５×１０^５細胞／ｍｌでのＨＰＢ－ＡＬＬ ＴＲＢＣ１＋、ＴＲＢＣ２＋およびＴＣＲ ＫＯに対して、インビトロ細胞傷害性アッセイを行った。８μｇ／ｍｌの濃度で、標的細胞と共にＡＤＣ構築物を３７℃で１１６時間インキュベートし、次いで１０％培養体積のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅと共に４時間インキュベートした。５６０／５９０ｎｍ（励起／発光）フィルター設定で上清をプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｃａｎ Ｌｕｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で取得した。非処理細胞（処理×１００／非処理）による標準化として生存率を表した。最大半量の細胞阻害が起こる濃度を決定するために、コンジュゲートされていない対照化合物と共に各試験化合物についてＩＣ５０を測定した。

【0322】

ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２ ＡＤＣ分子の有効性を試験するために、細胞死を誘導するそれらの能力について、ＭＭＡＥをコンジュゲートしたＭｕｔ１１およびＭｕｔ１５抗体を試験した。Ｍｕｔ１１－ＭＭＡＥおよびＭｕｔ１５－ＭＭＡＥがＴＲＢＣ１発現細胞およびＴＲＢＣ２発現細胞に対する細胞死を引き起こす最大半量阻害濃度は、それぞれ０．１４および０．３４μｇ／ｍｌであった（図９Ｃ）。これらの結果は、抗ＴＲＢＣ１および抗ＴＲＢＣ２ ＡＤＣ分子が、細胞死をもたらす内部移行を誘導するのに有効であることを実証する。

【0323】

［実施例７］
実施例７：ｈＪＯＶＩ－１に基づく抗ＴＲＢＣ１ ＣＡＲの作製
第２世代ＣＡＲ構築物（図４）は、ｈＪＯＶＩ１（配列番号１に示される配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２に示される配列を有するＶＬドメインを有する）と比較して以下の変異の組み合わせ：
－ＶＨドメイン中のＧ１０６Ａ；
－ＶＨドメイン中のＹ１０２Ｍ；
－ＶＨドメイン中のＧ２６ＰおよびＴ２８Ｋ；ならびに
－ＶＨドメイン中のＧ３１Ｓ
の１つを含む以下の抗ＴＲＢＣ１抗体に基づいて生成される。

【0324】

これらのＣＡＲ構築物をレトロウイルスベクターにクローニングし、健常ドナーから得られた活性化されたＰＢＭＣを形質導入するために使用する。

【0325】

［実施例８］
実施例８：抗ＴＲＢＣ１ ＣＡＲの機能的特徴決定：サイトカイン産生
ＴＲＢＣ１に対する抗ＴＲＢＣ１変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能的能力を評価するために、ＣＡＲ－Ｔ細胞の添加前にＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を固定化するプレート結合アッセイを使用する。７２時間後、培養上清を回収し、ＩＦＮ－γ産生をＥＬＩＳＡによって測定する。

【0326】

［実施例９］
実施例９：抗ＴＲＢＣ１ ＣＡＲの機能的特徴決定：細胞傷害性アッセイ
抗ＴＲＢＣ１三重変異体がＴＲＢＣ１を標的とする能力を決定するために、標的細胞としてＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを発現するように形質導入され、ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養されたＲａｊｉ細胞を使用して細胞傷害性アッセイを設定する。Ｒａｊｉ ＷＴ、Ｒａｊｉ ＴＲＢＣ１^＋またはＲａｊｉ ＴＲＢＣ２^＋細胞のいずれかと共に、１：１（Ｅ：Ｔ）の比でｈＪｏｖｉ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞または抗ＴＲＢＣ１三重変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞を培養する。培養の７２時間後にフローサイトメトリによって標的細胞の回収を測定し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害能力を確立するために使用する。

【0327】

上記の明細書で言及されたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の記載された方法および系の様々な改変および変形が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい態様に関連して説明されてきたが、権利が請求されている発明はそのような特定の態様に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、分子生物学または関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための記載された形態の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内に属することが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10】

【配列表】

2023518566000001.app

【国際調査報告】