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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-08
(54)【発明の名称】ＢＣＭＡに特異的な抗体およびキメラ抗原受容体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230426BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230426BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230426BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230426BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230426BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230426BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230426BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230426BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20230426BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230426BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230426BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230426BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/12
C07K16/18
C07K19/00
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K14/725
C12N1/15
A61P35/00
A61K35/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022553680
(86)(22)【出願日】2021-03-15
(85)【翻訳文提出日】2022-09-05
(86)【国際出願番号】 KR2021003135
(87)【国際公開番号】W WO2021182929
(87)【国際公開日】2021-09-16
(31)【優先権主張番号】10-2020-0031211
(32)【優先日】2020-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522352373
【氏名又は名称】キュロセル インコーポレーテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＵＲＯＣＥＬＬ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】（Ｓｉｎｓｅｏｎｇ－ｄｏｎｇ）４８，Ｙｕｓｅｏｎｇ－ｄａｅｒｏ １１８４ｂｅｏｎ－ｇｉｌ，Ｙｕｓｅｏｎｇ－ｇｕ，Ｄａｅｊｅｏｎ ３４１０９，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(71)【出願人】
【識別番号】518357128
【氏名又は名称】イファ ユニバーシティ－インダストリー コラボレーション ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】ＥＷＨＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ － ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】５２， Ｅｗｈａｙｅｏｄａｅ－ｇｉｌ Ｓｅｏｄａｅｍｕｎ－ｇｕ Ｓｅｏｕｌ ０３７６０， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100130111
【弁理士】
【氏名又は名称】新保 斉
(72)【発明者】
【氏名】シム、ヒョン ボ
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヒョン チョル
(72)【発明者】
【氏名】キム、ミ ギョン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB63
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA51
4H045FA74
(57)【要約】
抗ＢＣＭＡ結合タンパク質に関し、詳しくは、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗原結合領域を含み、前記抗原結合領域は、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の相補性決定領域１（ＶＨ－ＣＤＲ１）と、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列または配列番号３と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３と、を含む、単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＢＣＭＡに特異的に結合する抗原結合領域を含むＢＣＭＡ結合タンパク質であって、前記抗原結合領域は、
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の相補性決定領域１（ＶＨ－ＣＤＲ１）と、
ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２と、
ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列または配列番号３と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３と、
を含む
ことを特徴とする単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質。
【請求項2】
前記抗原結合領域は、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の相補性決定領域１（ＶＬ－ＣＤＲ１）と、
ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列または配列番号５と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２と、
ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３と、
をさらに含む
請求項１に記載の単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質。
【請求項3】
前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）配列と、
配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、
を含む
請求項１に記載の単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質。
【請求項4】
前記ＢＣＭＡ結合タンパク質はリンカーをさらに含み、前記リンカー、ＶＨおよびＶＬは、Ｎ末端からＣ末端方向へのＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨから選択されるいずれか１つの順序で配列される請求項３に記載の単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質。
【請求項5】
前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質。
【請求項6】
前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、ｉ）ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭから選択される免疫グロブリンと、
ｉｉ）Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨＨ、ＶＮＡＲから選択される天然抗体断片と、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ペンタボディから選択されるエンジニアリング抗体と、
ｉｖ）Ｆｃ、少なくとも１つの重鎖定常領域、多量体化領域、化学リンカー、またはそれらの組み合わせに連結されたｉｉ）またはｉｉｉ）と、
ｖ）抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、からなる群から選択されるいずれか１つである
請求項１に記載の単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質。
【請求項7】
前記抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体は細胞内シグナル伝達領域をさらに含み、前記細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ３ζ、ＦｃγＲ、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－１５Ｒ－α、ＣＤ４０、ＭｙＤ８８、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、ＳＬＡＭタンパク質、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３特異的リガンドから選択されるいずれか１つ以上に由来するシグナル伝達領域を含む
請求項６に記載の単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質。
【請求項8】
前記抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体は膜貫通領域をさらに含み、前記膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、およびＣＤ３１４から選択されるいずれか１つに由来する請求項６に記載の単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質。
【請求項9】
前記抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体はヒンジ領域をさらに含み、前記ヒンジ領域は、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質と膜貫通領域との間に位置し、ＣＤ８、ＦｃγＩＩＩαおよびＩｇＧ１から選択されるいずれか１つに由来する請求項６に記載の単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質。
【請求項10】
前記抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体は、Ｎ末端におけるシグナルペプチドをさらに含み、前記シグナルペプチドは、ＣＤ８、ＩｇＧ１重鎖、ＩｇＫ軽鎖およびＧＭ－ＣＳＦから選択されるいずれか１つに由来する請求項６に記載の単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質。
【請求項11】
前記抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体は、配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む請求項６に記載の単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質。
【請求項12】
請求項１に記載のＢＣＭＡ結合タンパク質をコードすることを特徴とする単離された核酸。
【請求項13】
請求項１２に記載のＢＣＭＡ結合タンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする細胞。
【請求項14】
請求項１に記載のＢＣＭＡ結合タンパク質を発現することを特徴とする細胞。
【請求項15】
請求項１３または１４に記載の細胞を含むことを特徴とする抗がん効果を有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合するタンパク質に関し、より詳しくは、ＢＣＭＡ結合タンパク質、それをコードする核酸、それを含む細胞、および前記細胞を含む、抗がん効果を有する組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
がん治療、特に血液がん（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）に対する優れた効果を示してきた改変Ｔ細胞療法は、標的分子特異的な方法で腫瘍細胞と特異的に結合してそれを殺せるように遺伝子操作されたＴ細胞を用いたがん治療方法である。このような標的化は一般に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする組換えＤＮＡ分子を患者由来のＴ細胞に導入することによって行われる。ＣＡＲは、細胞外標的化領域、膜貫通領域、および１つ以上の細胞内シグナル伝達領域を含む合成受容体である。ほとんどの場合、細胞外標的化領域は、所与の腫瘍関連抗原（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ：ＴＡＡ）などの標的分子に特異的な抗体の一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる。細胞外標的化領域は、ＣＡＲが腫瘍に対する特異性を有するようにし、細胞内シグナル伝達領域はＣＡＲの標的分子結合時にＴ細胞を活性化し、これらの操作されたＴ細胞はがん患者に再注入され、ＣＡＲの標的分子を発現する細胞に特異的に結合してこれを殺す。
【0003】
血液がんにおけるＣＡＲ－Ｔ治療の有効性を報告する多くの臨床研究は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に関するもので、ＣＤ１９またはＣＤ２０を標的化している。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法が効果的な治療法として浮上しているが、ＣＡＲシグナル伝達の最適化、標的抗原の最適化、細胞製造方法の最適化、安全性の向上、ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療可能性を高めるための組み合わせ戦略の最適化などの様々な側面において依然として改善の余地がある。
【0004】
多発性骨髄種（ＭＭ）は、クローン形質細胞の蓄積を特徴とするの蓄積を特徴とするがんである。ＭＭは血液がんの２番目に多く発生し、ＭＭによる死亡はすべてのがんによる死亡の２％を占めている。ＭＭは患者ごとに特性が不均一な疾患であり、攻撃性や治療耐性の程度差が大きい。例えば、一部の患者は診断後１０年以上生存するが、治療に対する耐性が急速に発達し、２年以内に死亡する患者もいる。様々な治療薬が開発されているが、現在、ＭＭに対する治療はあまり効果を期待できない。すなわち、既存の療法がＭＭの寛解を誘導することもあるが、結局、ほぼすべての患者で疾患が再発して死亡に至り、化学療法や放射線療法などの伝統的な治療方法には有毒な副作用がある。したがって、ＭＭを治療するためのより効果的な治療薬が必要とされている。
【0005】
報告されているＭＭの治療の潜在的な標的には、成熟Ｂ細胞上で主に発現する腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーであるＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）がある。ＢＣＭＡは形質細胞の生存を媒介し、健康な個体の体液性免疫を長期的に維持するが、最近、ＢＣＭＡの発現が多くのがん、自己免疫障害および感染性疾患と関連していることが報告されている。ＢＣＭＡの発現が増加したがんには、一部の血液がん、例えば、多発性骨髄腫、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、様々な白血病および膠芽細胞腫が含まれる。したがって、ＢＣＭＡ発現細胞を特異的に標的とする効果的な治療薬が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、上記の要求を解決するために案出されたものであり、本発明は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗原結合領域を含む単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質であって、前記抗原結合領域が、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の相補性決定領域１（ＶＨ－ＣＤＲ１）と、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列または配列番号３と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３と、を含む、単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質を提供する。
【0007】
また、本発明は、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質をコードする単離された核酸を提供する。
【0008】
さらに、本発明は、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質をコードする核酸を含む細胞を提供する。
【0009】
またさらに、本発明は、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質を発現する細胞を提供する。
【0010】
またさらに、本発明は、前記細胞を含む、抗がん効果を有する組成物を提供する。
【0011】
本発明が達成しようとする技術的課題は、上記の技術的課題に限定されるものではなく、言及されていない他の技術的課題は、以下の記載から本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に明確に理解される。
【課題を解決するための手段】
【0012】
上記の技術的課題を達成するために、本発明の一態様による単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗原結合領域を含み、前記抗原結合領域は、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の相補性決定領域１（ＶＨ－ＣＤＲ１）と、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列または配列番号３と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３と、を含む。
【0013】
ここで、前記抗原結合領域は、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の相補性決定領域１（ＶＬ－ＣＤＲ１）と、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列または配列番号５と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３と、をさらに含んでいてもよい。
【0014】
前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）配列と、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含んでいてもよい。前記ＢＣＭＡ結合タンパク質はリンカーをさらに含み、前記リンカー、ＶＨおよびＶＬは、Ｎ末端からＣ末端方向へのＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨから選択されるいずれか１つの順序で配列されてもよい。
【0015】
前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【0016】
前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、ｉ）ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭから選択される免疫グロブリンと、ｉｉ）Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨＨ、ＶＮＡＲから選択される天然抗体断片と、ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ペンタボディから選択されるエンジニアリング抗体と、ｉｖ）Ｆｃ、少なくとも１つの重鎖定常領域、多量体化領域、化学リンカー、またはそれらの組み合わせに連結されたｉｉ）またはｉｉｉ）と、ｖ）抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＩＲ）と、からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。前記抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体は細胞内シグナル伝達領域をさらに含み、前記細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ３ζ、ＦｃγＲ、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－１５Ｒ－α、ＣＤ４０、ＭｙＤ８８、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、ＳＬＡＭタンパク質、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３特異的リガンドから選択されるいずれか１つ以上に由来するシグナル伝達領域を含んでいてもよい。前記抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体は膜貫通領域をさらに含み、前記膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、およびＣＤ３１４から選択されるいずれか１つに由来してもよい。前記抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体はヒンジ領域をさらに含み、前記ヒンジ領域は、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質と膜貫通領域との間に位置し、ＣＤ８、ＦｃγＲＩＩＩαおよびＩｇＧ１から選択されるいずれか１つに由来してもよい。前記抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体は、Ｎ末端におけるシグナルペプチドをさらに含み、前記シグナルペプチドは、ＣＤ８、ＩｇＧ１重鎖、ＩｇＫ軽鎖およびＧＭ－ＣＳＦから選択されるいずれか１つに由来してもよい。前記抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体は、配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【0017】
本発明の他の一態様による単離された核酸は、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質をコードすることを特徴とする。
【0018】
本発明のさらに他の一態様による細胞は、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする。
【0019】
本発明のさらに他の一態様による細胞は、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質を発現することを特徴とする。
【0020】
本発明のさらに他の一態様による抗がん効果を有する組成物は、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質をコードする核酸を含む細胞、または前記ＢＣＭＡ結合タンパク質を発現する細胞を含む。
【0021】
上述した課題を解決する手段は、単に例示的なものであり、本発明を限定しようとするものと解釈されてはならない。上述した例示的な実施形態に加えて、図面及び発明の詳細な説明においてさらなる実施形態が存在することが可能である。
【発明の効果】
【0022】
本発明は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗原結合領域を含むＢＣＭＡ結合タンパク質であって、前記抗原結合領域が、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の相補性決定領域１（ＶＨ－ＣＤＲ１）と、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列または配列番号３と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３と、を含む、単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質を最初に開示する。
【0023】
本発明の一実施形態による前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、ＢＣＭＡに対する特異的結合活性を示すことができる。
【0024】
本発明の一実施形態による前記ＢＣＭＡに特異的に結合する抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫細胞において十分に発現され得る。このように前記ＢＣＭＡに特異的なＣＡＲを発現する免疫細胞は、ＢＣＭＡを発現する細胞に対して特異的な細胞毒性を示す可能性があり、生体内に導入時にＢＣＭＡを発現する腫瘍を効果的に治療することができる。
【0025】
本発明の一実施形態による前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、ＢＣＭＡに関連することが知られている多数のがん、自己免疫障害および感染性疾患などの疾病、特にがん疾患の診断、予防、予後予測および治療などに用いることができる。
【0026】
本発明の効果は、上記した効果に限定されるものではなく、本発明の詳細な説明又は特許請求の範囲に記載された発明の構成から推論可能なすべての効果を含む。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ抗体候補物質のＢＣＭＡ特異的結合を確認するためのＦＡＣＳデータである。
【図2】本発明の一実施形態による抗ＢＣＭＡ ＣＡＲおよびそれを含むベクターの構造模式図である。
【図3】本発明の一実施形態による抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの配列および構造である。
【図4】本発明の一実施形態による抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞発現を、ビオチン化ＢＣＭＡを用いて分析したデータである。
【図5】本発明の一実施形態による抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞発現を、ビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体を用いて分析したデータである。
【図6】本発明の一実施形態による抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌活性分析データである。
【図7】抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）および抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ｓｃＦｖで調製した各抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構成とそのＴ細胞上の発現を示すデータである。
【図8】抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）および抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ｓｃＦｖで調製した各抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔの細胞毒性能を示すデータである。
【図9】抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）および抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ｓｃＦｖで調製した各抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔの生体内抗がん効果を示す代表的なイメージ（ＣＡＲ－Ｔ投与量１×１０６個）である。
【図10】抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）および抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ｓｃＦｖで調製した各抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔの生体内抗がん効果を示す代表的なイメージ（ＣＡＲ－Ｔ投与量０．５×１０６個）である。
【図11】抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）および抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ｓｃＦｖで調製した各抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔの生体内抗がん効果を示す代表的なイメージ（ＣＡＲ－Ｔ投与量０．２５×１０６個）である。
【図12】抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）および抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ｓｃＦｖで調製した各抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔの投与量別生体内抗がん効果を示すデータである。
【発明を実施するための形態】
【0028】
以下、添付した図面を参照して本発明について説明する。しかしながら、本発明は種々の異なる形態に実現でき、したがってここで説明する実施形態に限定されるものではない。そして、図面において本発明を明確に説明するために説明と関係のない部分は省略し、明細書の全体にわたって同一または類似する構成要素に対しては同一の参照符号を付けた。
【0029】
明細書の全般に亘って、ある部分が他の部分と「連結（接続、接触、結合）」されているとしたとき、これは、「直接的に連結」されている場合だけではなく、これらの間に他の部材を挟んで「間接的に連結」されている場合も含む。ある部分がある構成要素を「備える（含む）」としたとき、これは、特に断りのない限り、他の構成要素を除外するものではなく、他の構成要素をさらに備えていてもよいということを意味する。
【0030】
本明細書で使用した用語は、単に特定の実施形態を説明するために使用されたもので、本発明を限定する意図はない。単数の表現は、文脈上明らかに異なるものを意味しない限り、複数の表現を含む。本明細書において、「含む」または「有する」などの用語は、明細書上に記載された特徴、数字、段階、動作、構成要素、部品、またはこれらを組み合わせたものが存在することを指定しようとするものであって、一つまたはそれ以上の他の特徴や数字、段階、動作、構成要素、部品、またはこれらを組み合わせたものの存在または付加の可能性を予め排除しない。
【0031】
本明細書では、「領域（ｄｏｍａｉｎ）」は、機能的または構造的特性を有する単位を指す用語として使用される。例えば、結合領域（ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）は、標的分子（例えば抗原）を認識または相互作用して特異的に結合する機能を有する任意の領域を指す。本発明によるＢＣＭＡ結合タンパク質は、抗原であるＢＣＭＡに特異的な結合領域を含む。本発明による領域は、好ましくはポリペプチドである。このようなポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖であり得、いくつかのポリペプチド鎖の一部を組み合わせることで形成されるモジュールであり得る。前記ポリペプチドは、タンパク質部分および非タンパク質部分を含み得、この場合、前記非タンパク質部分は、例えばグルタルアルデヒドなどの化学的架橋剤または化学的リンカーであり得る。
【0032】
本発明で使用される「ＶＨ」、「ＶＬ」、「ＣＤＲ」、「Ｆｖ」、「Ｆａｂ」、「Ｆａｂ」、「Ｆ（ａｂ’）２」、「Ｆｃ」、「ＶＨＨ」、および「ＶＮＡＲ」はそれぞれ、一般に免疫グロブリンと交換可能な用語として使用される天然抗体の一部（すなわち、断片）である。基本的な４本鎖抗体ユニットは、２本の同一の軽鎖（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎまたはＬ ｃｈａｉｎ）及び２本の同一の重鎖（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎまたはＨ ｃｈａｉｎ）から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合によって重鎖に連結され、２本の重鎖は、重鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結されている。重鎖及び軽鎖はそれぞれ、さらに規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、Ｎ末端からＣ末端への順に可変領域（ＶＨ）とそれに連結された定常領域（ＣＨ）を含み、このとき、哺乳動物免疫グロブリンの場合、α鎖、δ鎖およびγ鎖の各々については３つの定常領域（ＣＨ）、ならびにμ及びεアイソタイプの各々については４つのＣＨを有する。各軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端への順に可変領域（ＶＬ）とそれに連結された定常領域（ＣＬ）を有する。ＶＬは、ＶＨと整合しており、ＣＬは、重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）と整合している。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に界面を形成すると知られており、ＶＨとＶＬとが一緒に対合（ｐａｉｒｉｎｇ）することにより、単一の抗原結合部位を形成する。免疫グロブリンは、含まれる重鎖の種類によって分類でき、例えば、重鎖としてα、δ、ε、γ、μを含む哺乳動物の免疫グロブリンは、それぞれ順にＩｇＡ、ＩＧＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに分類される。一部の系統の動物は、他の形態の免疫グロブリンを有することもある。例えば、鳥類、両生類、脛骨および軟骨魚類では重鎖可変領域の種類および／または個数が異なる免疫グロブリンが見られ、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）動物とサメでは重鎖のみで構成され、定常領域の数がそれぞれ２と５個であり、それぞれＶＨＨおよびＶＮＡＲと呼ばれる重鎖可変領域を含む免疫グロブリンが見られる。
【0033】
前記「可変」は、可変領域のある特定のセグメントが、抗体間で配列が大幅に異なるという事実に関連している。可変領域は、抗原結合を媒介する部分であり、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。このような可変性は、可変領域全体にわたって均等に分布しているわけではなく、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域において、 超可変領域（超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ；ＨＶＲ）または相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）） と呼ばれる３つのセグメントに集中している。これに対して、可変領域上でより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）と呼ばれる。哺乳動物免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ３つのＣＤＲによって連結された４つのＦＲを含む。各鎖において、ＣＤＲはＦＲ領域によって近接して配置されており、これにより他の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合領域を形成する。定常領域は、抗体を抗原に結合することに直接関連するわけではないが、抗体依存性細胞傷害を誘導する際に抗体を認識する部位になるなどの機能を有する。
【0034】
Ｆｖは、抗体の抗原認識および結合部位を完全に含む最小限の断片であり、ＶＨおよびＶＬの二量体からなる。Ｆａｂは、Ｆｖと比較して軽鎖の定常領域およびＣＨ１を含む断片を指し、ＩｇＧ抗体をパパインで処理することにより得ることができる。Ｆａｂ′は、Ｆａｂと比較してヒンジ（ＣＨ１とＣＨ２との間）部の一部をさらに含み、ＩｇＧ抗体をペプシン処理して得られるＦ（ａｂ′）２は、ジスルフィド結合でつながっているヒンジ部を含むので、２価の結合部位を含むことになる。Ｆｃ領域は、抗原特異的結合領域を含まない抗体の結晶化可能な定常領域であり、２つの同一のタンパク質断片からなる。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプにおけるＦｃ領域は、抗体重鎖の第２および第３定常領域（ＣＨ２－ＣＨ３）を含み、ＩｇＭおよびＩｇＥアイソタイプにおけるＦｃ領域は、抗体重鎖の第２、第３および第４定常領域（ＣＨ２－ＣＨ３－ＣＨ４）を含む。
【0035】
本明細書に含まれるアミノ酸配列は、本発明による結合タンパク質の結合特性を維持しつつ配列の相違が生じるように変化した場合、当該配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を含み得る。変化は、幾つかのアミノ酸残基の付加、置換、または欠失から選択されるいずれか１つ以上であり得る。
【0036】
本発明の一態様による単離されたＢＣＭＡ結合タンパク質は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗原結合領域を含み、前記抗原結合領域は、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の相補性決定領域１（ＶＨ－ＣＤＲ１）と、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列または配列番号３と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３と、を含む。好ましくは、ＢＣＭＡ結合タンパク質は、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の相補性決定領域１（ＶＨ－ＣＤＲ１）と、ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３と、を含む。
【0037】
ここで、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の相補性決定領域１（ＶＬ－ＣＤＲ１）と、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列または配列番号５と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３と、をさらに含み得る。好ましくは、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の相補性決定領域１（ＶＬ－ＣＤＲ１）と、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２と、ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３と、をさらに含み得る。
【0038】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーである。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）および増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合する。ＢＣＭＡは、非悪性細胞の中でも主として血漿細胞および成熟Ｂ細胞のサブセットにおいて発現することが報告されている。
【0039】
ＢＣＭＡは、様々なヒトがんで発現または過剰発現している。ＢＣＭＡを発現または過剰発現するがんの例としては、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）リンパ腫、ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫（ＭＭ）などが挙げられる。本発明のＢＣＭＡ結合タンパク質は、ＢＣＭＡを特異的に認識し、それに結合することにより、ＢＣＭＡを発現するがん細胞を標的化することができる。このようなＢＣＭＡ結合タンパク質を含むポリペプチドまたはタンパク質は、ＢＣＭＡ発現がん細胞を検出すること、ＢＣＭＡ発現がん細胞の標的化及び破壊、がん細胞の減少及び除去、免疫細胞及び／又はエフェクター分子の腫瘍部位への浸潤の促進、並びに抗がん反応の増強／延長など、疾患の診断、予防、予後予測および治療のための全過程で利用できると予想できる。前記ＢＣＭＡ結合タンパク質を含むポリペプチドまたはタンパク質は、上記の用途で使用される場合、その有効性を高めるために追加のポリペプチド、タンパク質または化合物などと結合され得る。例えば、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、結晶化可能フラグメント（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ：Ｆｃ）、複合体薬物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｒｕｇｓ）、追跡を容易にできる分子タグ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｇ、例えば蛍光マーカー、タンパク質タグなど）などを単独でまたは組み合わせてさらに含み得る。
【0040】
前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでいてもよく、好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨを含んでいてもよい。前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含んでいてもよく、好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含んでいてもよい。
【0041】
前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含んでいてもよく、好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含んでいてもよい。
【0042】
前記ＢＣＭＡ結合タンパク質はリンカーをさらに含み、前記リンカー、ＶＨ及びＶＬは、Ｎ末端からＣ末端方向へのＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨから選択されるいずれか１つの順序で配列されてもよく、好ましくは、ＶＨ－リンカー－ＶＬの順序で配列されてもよい。ここで、リンカーは、互いに異なる領域（ｄｏｍａｉｎ）を連結する部分であり、２～５００個のアミノ酸を含んでいてもよい。前記リンカーは、グリシンおよびセリンからなってもよく、好ましくは、前記リンカーは、（Ｇｌｙ ｘＳｅｒ ｙ）ｎ（ｘ個のグリシンおよびｙ個のセリンからなる配列がｎ個連結されているもので、ｘ、ｙおよびｎはそれぞれ１以上１０以下の整数）を含んでいてもよく、より好ましくは、（Ｇｌｙ ４－Ｓｅｒ １）ｎ配列を含んでいてもよく、さらに好ましくは、ｎは１、２、３、４、５、または６であってもよく、最も好ましくは、ｎが３または４であるもの、例えば（Ｇｌｙ ４－Ｓｅｒ １）３（すなわち、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）などを含んでいてもよい。
【0043】
前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよく、好ましくは、配列番号９のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【0044】
前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、ｉ）ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭから選択される免疫グロブリンと、ｉｉ）Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨＨ、およびＶＮＡＲから選択される天然抗体断片と、ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびペンタボディから選択される、エンジニアリング抗体と、ｉｖ）Ｆｃ、１つ以上の重鎖定常領域、多量体化領域、化学的リンカー、またはそれらの組み合わせに連結されたｉｉ）またはｉｉｉ）と、ｖ）抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。
【0045】
前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、ＢＣＭＡに対してのみ抗原特異性を有する（すなわち、単一特異性）ものであり得、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質が含むＢＣＭＡ抗原結合領域が結合するエピトープ以外のＢＣＭＡ上の１つ以上のエピトープ；またはＢＣＭＡ以外の１つ以上の抗原；に対して抗原特異性をさらに有する（すなわち、多重特異性）ものであり得る。前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、１つの抗原結合領域を含む（一価）ものであり得、１つ以上の抗原結合領域を含む（多価）ものであり得る。前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、本発明に記載の１つ以上の配列を含む、人為的に操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）抗体であり得る。ｓｃＦｖは抗体のＶＨおよびＶＬをリンカーペプチドで連結したものであり、ｄｓＦｖはジスルフィド結合で安定化されたＦｖであり、ｄｓ－ｓｃＦｖはジスルフィド結合で安定化されたｓｃＦｖであり、（ｓｃＦｖ）２は２つのｓｃＦｖが結合したものである。ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ペンタボディは、それぞれｓｃＦｖが二量体、三量体、四量体、五量体を形成したものである。
【0046】
本発明のＢＣＭＡ結合タンパク質は、当技術分野で公知の任意のタイプの免疫グロブリンであり得る。例えば、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、任意のアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＭなどであり得る。前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、単クローン性（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ：モノクローナル）または多クローン性（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ：ポリクローナル）であり得る。前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなどの動物から単離または精製された天然由来抗体であるか、または天然由来抗体の配列特性を参照して設計および遺伝子合成された合成抗体であり得る。前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、ヒト化抗体またはキメラ性抗体などの操作された抗体であり得る。前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、単量体形態または重合体形態であり得る。前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、化学修飾、例えばジスルフィド結合の付加、グリコシル化、側鎖修飾アミノ酸、メチオニンの酸化、アスパラギンまたはグルタミンの脱アミド化、γ－カルボキシル化、β－ヒドロキシル化、硫酸化などの１つ以上を含み得る。前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、ＢＣＭＡに対して任意のレベルの親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ） または結合力（ａｖｉｄｉｔｙ）を有し得る。前記ＢＣＭＡ結合タンパク質は、マウス、ウサギ、ヒト、ヒト化、またはキメラタンパク質から選択されるいずれか１つであり得る。
【0047】
本発明による抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子は、前述のＢＣＭＡ結合領域に加えて、膜貫通領域および細胞内シグナル伝達領域をさらに含む。
【0048】
一般に、ＣＡＲは、免疫細胞上に発現した場合、このような免疫細胞が細胞（一般的にはがん細胞）上の標的分子を特異的に認識して結合するようにし、このような結合が前記免疫細胞の細胞内シグナル伝達の活性化につながるようにする、ポリペプチドからなるセットである。ＣＡＲは、少なくとも標的抗原を認識する細胞外抗原結合領域、膜貫通領域、および細胞内シグナル伝達領域を含む。前記細胞内シグナル伝達領域は、好ましくは、刺激分子または共刺激分子に由来するものである。前記ポリペプチドからなるセットは、単鎖ポリペプチドの形態であってもよいし、刺激により二量体化または多量体化するスイッチで互いに結合したポリ鎖（ｐｏｌｙ ｃｈａｉｎ）の形態であってもよい。刺激分子とは、抗原特異的な免疫反応を活性化するシグナル伝達に関与する分子をいい、共刺激分子とは、免疫細胞の抗原非特異的な初期シグナルを増幅または減少させる分子をいう。前記細胞内シグナル伝達領域は、刺激分子または共刺激分子に由来する１つ以上のシグナル伝達領域を含み得る。このようなシグナル伝達領域を介して、好ましくはそれを発現する免疫細胞の活性化を誘導することができ、ここで活性化は、細胞の増殖、エフェクター細胞への分化、サイトカイン分泌、細胞毒性物質分泌、食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）、標的細部死滅誘導のうちの１つ以上を開始および／または増加させることを含み得る。ＣＡＲは、前記細胞外抗原結合領域、前記膜貫通領域、および前記細胞内シグナル伝達領域を含む融合タンパク質であり得る。前記ＣＡＲは、Ｎ末端におけるシグナルペプチドまたはリーダー配列をさらに含み得、前記シグナルペプチドは、ＣＡＲの発現および細胞膜への定着中に切り出され得る。
【0049】
前記細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ３ζ、ＦｃγＲ、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－１５Ｒ－α、ＣＤ４０、ＭｙＤ８８、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、ＳＬＡＭタンパク質、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３特異的リガンドから選択されるいずれか１つ以上に由来するシグナル伝達領域を含んでいてもよい。好ましくは、細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ３ζおよび４－１ＢＢのうちから選択されるいずれか１つ以上を含んでいてもよく、最も好ましくは両方を含んでいてもよい。
【0050】
前記細胞内シグナル伝達領域は、配列番号１０のアミノ酸配列又は配列番号１０と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、および、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、から選択されるいずれか１つ以上を含んでいてもよい。好ましくは、細胞内シグナル伝達領域は、配列番号１０のアミノ酸配列および配列番号１１のアミノ酸配列から選択されるいずれか１つ以上を含んでいてもよく、より好ましくは、配列番号１０のアミノ酸配列および配列番号１１のアミノ酸配列のすべてを含んでいてもよい。
【0051】
前記膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８およびＣＤ３１４の中から選択されるいずれか１つに由来し得る。好ましくは、前記膜貫通領域は、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ分子の二量化を促進できるものから選択でき、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８またはＣＤ８に由来し、より好ましくはＣＤ８に由来し、最も好ましくはＣＤ８αに由来し得る。前記膜貫通領域は、配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよく、好ましくは配列番号１２のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【0052】
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ分子はヒンジ領域をさらに含み、前記ヒンジ領域はＢＣＭＡ結合タンパク質と膜貫通領域との間に位置し得る。前記ヒンジ領域は、ＣＤ８、ＦｃγＲＩＩＩα、およびＩｇＧ１から選択されるいずれか１つに由来し、好ましくはＣＤ８に由来し、より好ましくはＣＤ８αに由来し得る。前記ヒンジ領域は、配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【0053】
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ分子は、Ｎ末端におけるシグナルペプチドをさらに含んでいてもよい。シグナルペプチドは、ＣＤ８、ＩｇＧ１重鎖、ＩｇＫ軽鎖およびＧＭ－ＣＳＦから選択されるいずれか１つに由来し、好ましくはＣＤ８に由来し、最も好ましくはＣＤ８αに由来し得る。前記シグナルペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよく、好ましくは配列番号１４のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【0054】
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよく、好ましくは配列番号１５のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【0055】
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、互いに異なる各ペプチドモジュール、領域などの間を連結するリンカーをさらに含み得る。ここで、リンカーは、前述したように２～５００個のアミノ酸を含み得る。前記リンカーは、前述したリンカーおよび下記の表の配列から選択されるいずれか１つであり得る。
【0056】
【表1】
【0057】
本発明の他の態様による単離された核酸は、前述のＢＣＭＡ結合タンパク質をコードすることを特徴とする。前記核酸は、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質をコードする配列に作動可能に連結される細胞内の発現調節配列を含んでいてもよい。前記発現調節配列には、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、イントロン、その他の転写後調節因子などが１つ以上含まれていてもよい。前記発現調節配列は、後述するように、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質をコードする単離された核酸が細胞に含まれて前記ＢＣＭＡ結合タンパク質を発現する場合、当該細胞での発現を調節するのに適したものを選択することができる。
【0058】
前記核酸はベクターの形態で前記細胞に含まれていてもよい。前記ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターから選択されてもよい。好ましくは、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターから選択されてもよいが、これは、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターに含まれる遺伝子が前記免疫細胞のゲノムＤＮＡに挿入されて前記遺伝子を安定的に発現できるようにするためである。最も好ましくはレンチウイルスベクターであり得る。
【0059】
前記核酸を前記のようなベクター形態で使用する場合、ベクター内の変動、すなわち、特定の配列をベクター内に導入するためのクローニングプロセスにおいて生じ得る塩基配列の付加、修飾および欠失や、ベクターの利便性や性能などを高めるための構成要素の変更または導入は、当業者にとって自明であるため、詳細な説明は省略する。
【0060】
本発明のさらに他の態様による細胞は、前述のＢＣＭＡ結合タンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする。
【0061】
本発明のさらに他の態様による細胞は、前述のＢＣＭＡ結合タンパク質を発現することを特徴とする。
【0062】
前記細胞は、酵母、真菌（カビ）、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む真核細胞および原核細胞を含む。例えば、前記細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌であってもよく、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウィア、ピキア・パストリス、カンジダ、トリコデルマ・リーセイ、ニューロスポラ、シュワンニオミセス、クルイベロミセス、ペニシリウム、トリポクラジウムおよびアスペルギルス宿主などの真核微生物であってもよい。前記細胞は、グリコシル化などの翻訳後修飾（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセスが、抗体などの形態で発現されるのにより適した多細胞生物体に由来し得、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質をコードする核酸を含むベクターに適した宿主細胞が選択され得る。例えば、バキュロウイルスベクターを使用する場合、前記細胞は、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ：）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などから適切に選択された生物に由来し得る。前記細胞内で発現したＢＣＭＡ結合タンパク質は、使用のために単離および精製されてもよく、これは、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質を、細胞内発現後に好ましくは細胞の可溶画分から単離し、次いで、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの精製プロセスにより行われてもよいが、これに限定されない。抗体、融合タンパク質等の発現（生合成）、単離及び精製プロセスは当業者にとって自明に選択できるので、これらについての詳細な説明は省略する。
【0063】
前記細胞は好ましくは免疫細胞であり得、前記免疫細胞は、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ：ＮＫ）細胞、ＮＫＴ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ）細胞、Ｂ細胞、単核球、マクロファージおよび樹状細胞から選択されるいずれか１つであり得、より好ましくはＴ細胞であり得、最も好ましくは細胞毒性T細胞であり得る。
【0064】
前記細胞を患者に投与する場合、対象患者に自己由来、同種由来、または異種由来の細胞のいずれか１つを投与してもよく、異種由来の場合、哺乳動物から得られてもよい。免疫拒絶反応の可能性を減らすために、好ましくは同種由来、最も好ましくは自己由来のものを使用することができる。
【0065】
前記細胞は、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質を発現する細胞の活性、適合性、効率および／または安全性を向上させる別の作用剤をさらに含んでいてもよい。前記作用剤は核酸またはタンパク質であり得る。前記作用剤は、前記ＢＣＭＡ結合タンパク質またはそれをコードする核酸とは異なる分子として発現されてもよく、同じ分子に含まれる形態であってもよい。前記作用剤は、例えば追加の１つ以上のＣＡＲであり得、追加のＣＡＲは同じ標的分子を有する、すなわちＢＣＭＡの他のエピトープを標的とし得、異なる標的分子を標的とし得る。前記異なる標的分子は、５Ｔ４、α５β１－インテグリン、７０７－ＡＰ，ＡＦＰ，ＡＲＴ－４，Ｂ７Ｈ４，ＢＡＧＥ，β－カテニン／ｍ，Ｂｃｒ－ａｂｌ，ＭＮ／ＣＩＸ抗原，ＣＡ１２５，ＣＡＭＥＬ，ＣＡＰ－１，ＣＡＳＰ－８，ＣＤ４，ＣＤ７，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２２，ＣＤ２５，ＣＤ３０，ＣＤ３３，ＣＤ３８，ＣＤ４４バリアント ドメイン６，ＣＤ１２３，ＣＤ１３５，ＣＤ１３８，ＣＤ２６９，ＣＤＣ２７／ｍ，ＣＤＫ４／ｍ，ＣＥＡ，ＣＬＥＣ１２Ａ，ＣＴ，Ｃｙｐ－Ｂ，ＤＡＭ，ＥＧＦＲ，ＥｒｂＢ３，ＥＬＦ２Ｍ，ＥＭＭＰＲＩＮ，ＥｐＣａｍ，ＥＴＶ６－ＡＭＬ１，Ｇ２５０，ＧＡＧＥ，ＧｎＴ－Ｖ，Ｇｐ１００，ＨＡＧＥ，ＨＥＲ－２／ｎｅｗ，ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－Ｒ１７０Ｉ，ＨＰＶ－Ｅ７，ＨＳＰ７０－２Ｍ，ＨＳＴ－２，ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ），ｉＣＥ，ＩＧＦ－１Ｒ，ＩＬ－２Ｒ，ＩＬ－５，ＫＩＡＡ０２０５，ＬＡＧＥ，ＬＤＬＲ／ＦＵＴ，ＭＡＧＥ，ＭＡＲＴ－１／ｍｅｌａｎ－Ａ，ＭＡＲＴ－２／Ｓｋｉ，ＭＣ１Ｒ，ミオシン／ｍ，ＭＵＣ１，ＭＵＭ－１，ＭＵＭ－２，ＭＵＭ－３，ＮＡ８８－Ａ，ナチュラルキラーグループ２Ｄ，Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原，ＰＡＰ，プロテイナーゼ－３，ｐ１９０マイナーｂｃｒ－ａｂｌ，Ｐｍｌ／ＲＡＲα，ＰＲＡＭＥ，ＰＳＡ，ＰＳＭ，ＰＳＭＡ，ＲＡＧＥ，ＲＵ１またはＲＵ２，ＳＡＧＥ，ＳＡＲＴ－１，ＳＡＲＴ－３，サバイビン，ＴＥＬ／ＡＭＬ１，ＴＧＦβ，ＴＰＩ／ｍ，ＴＲＰ－１，ＴＲＰ－２，ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２，ＶＥＧＦ，ＷＴ１，ＮＹ－Ｅｓｏ－１およびＮＹ－Ｅｓｏ－Ｂから選択されるものであり、前記患者のＢＣＭＡ発現がんにおいてＢＣＭＡに加えて特異的に発現される更なる分子であり得る。前記作用剤は、免疫細胞機能を調整または調節する１つ以上の作用剤であり得る。前記免疫細胞機能を調整または調節する分子は阻害性分子であり得、前記作用剤は前記分子の発現、機能、またはその両方を減少させる物質であり得る。前記阻害性分子は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３およびＣＥＡＣＡＭ－５など）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータなどを含む。前記作用剤は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどの阻害性核酸、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ：ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性剤様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）などの阻害性タンパク質または系、あるいは、前記阻害性分子に対する抗体もしくは結合部位を含むタンパク質や小分子としての結合を通じて前記阻害性分子を阻害することができる。前記作用剤は前記細胞の生存を調節するができる。例えば、前記細胞を患者に投与する際にサイトカインストームなどの副作用がある場合、特定の物質に応答して、投与された細胞を除去したり、アポトーシス（細胞死滅）を誘導したりできる分子であり得、その例としては、米国消滅特許第５３５８８６６号、米国登録特許第９３９３２９２号及び欧州登録特許第２８３６５１１号などがある。
【0066】
本発明のさらに他の態様による抗がん効果を有する組成物は、前述のＢＣＭＡ結合タンパク質をコードする核酸を含む細胞、または前述のＢＣＭＡ結合タンパク質を発現する細胞を含む。
【0067】
前記組成物は、ＢＣＭＡ発現が増加しているがんの治療に使用することができる。前記組成物は、好ましくは、多発性骨髄腫、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、様々な白血病および膠芽細胞腫の治療に使用することができる。
【0068】
前記抗がん効果を有する組成物に、前記免疫細胞以外にも、薬学的に許容される塩、担体、賦形剤、ビヒクル及び治療効果をさらに高めることができる他の様々な添加剤等を添加できることは、当業者には明らかであるため、これについての詳細な説明は省略する。
【0069】
本発明において好ましい医薬製剤は、意図される投与経路、送達形式、および所望の投与量に応じて、本開示および製剤化技術の一般的な知識に照らして決定することができる。投与方法に関係なく、有効な用量を、患者の体重、体表面積または器官のサイズに基づき計算することができる。本明細書に記載の製剤のそれぞれを含む治療のための適切な投与量を決定するのに必要な計算および更なる精緻化は、当技術分野で日常的に行われるものであり、当技術分野で日常的に行われる作業の範囲内にある。適切な投与量は、適切な用量反応データの使用により確認することができる。
【実施例】
【0070】
以下、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように本発明の実施例について詳細に説明する。しかしながら、本発明は様々な異なる形態にも具現可能であり、ここで説明する実施例に限定されるものではない。
【0071】
実施例１．ｓｃＦｖライブラリーの構築および抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ候補群の導出
＜実施例１－１＞ｓｃＦｖライブラリーの構築
ｓｃＦｖライブラリーは、大韓民国特許第１０－０９６１３９２号に記載された方法により構築した。
＜実施例１－１＞ｓｃＦｖライブラリーの構築
ｓｃＦｖライブラリーは、大韓民国特許第１０－０９６１３９２号に記載された方法により構築した。
【0072】
簡単に説明すると、ヒトのＶＨ３－２３／ＶＬ１－ｇ遺伝子を基にして相補性決定部位（ＣＤＲ）に無作為配列を挿入することでライブラリーを設計し、β－ラクタマーゼ遺伝子を選択マーカーとして有するプラスミドベクターにおいてβ－ラクタマーゼ遺伝子のリーダー配列直後に制限酵素切断配列を導入してｐＦＤＶプラスミドベクターを製造し、ｓｃＦｖ遺伝子ライブラリーを挿入した後、大腸菌をトランスフェクトし、その後、これを培養してライブラリーを構築した。このプロセスにより、ライブラリー内で異常な停止コドン又はフレームシフトを有するｓｃＦｖ遺伝子配列を大部分除去してライブラリーの品質を向上させることが可能である。培養されたライブラリーからエラーが除去された配列をポリメラーゼ連鎖反応で増幅した後、それからｓｃＦｖ遺伝子ライブラリーを組換えてｐＣｏｍｂ３Ｘファージミドベクターに挿入し、ＥＲ２５３７株の大腸菌をトランスフェクトして最終ライブラリーを獲得した。ライブラリーを、カルベニシリンを含むスーパーブロス（ＳＢ）培地４００ｍＬに培養し、６００ナノメートルでの吸光度が０．５になったときに１０１３ＣＦＵのＶＣＳＭ１３補助ファージを加えて８０ｒｐｍで撹拌し、１時間３７℃で感染させた。これに最終７０μｇ／ｍＬのカナマイシン抗生物質を入れ、３０℃、２００ｒｐｍで撹拌し、一晩（オーバーナイト）培養して、ｓｃＦｖが表面提示されたファージを産生した。翌朝、培養液を遠心分離し、培養液中のファージを４％のポリエチレングリコール－８０００と３％の塩化ナトリウムを加えて沈殿させた。沈殿したファージを５０ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液に溶解させ、このような方式で再度沈殿させ、最終的に２ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液に溶解させた。これを遠心分離して異物を除去することによりファージｓｃＦｖライブラリーを得、一般的に、最終ファージライブラリーには１０１３ＣＰＵ／ｍＬ以上のファージ粒子が含まれる。
【0073】
＜実施例１－２＞抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖの選別
免疫試験管に１０μｇ／ｍｌの濃度のＢＣＭＡを添加して１時間試験管表面にタンパク質を吸着させた後、３％スキムミルク溶液を試験管に添加してＢＣＭＡが吸着していない表面を保護した。試験管を空にした後、ここに、３％スキムミルク溶液に分散した１０１２ＣＦＵの抗体ファージライブラリーを入れて抗原と結合させた。非特異的に結合したファージをＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水）溶液で３回洗浄した後、残りの抗原特異的ファージ抗体を、１００ｍＭトリエチルアミン溶液を用いて溶離した。
免疫試験管に１０μｇ／ｍｌの濃度のＢＣＭＡを添加して１時間試験管表面にタンパク質を吸着させた後、３％スキムミルク溶液を試験管に添加してＢＣＭＡが吸着していない表面を保護した。試験管を空にした後、ここに、３％スキムミルク溶液に分散した１０１２ＣＦＵの抗体ファージライブラリーを入れて抗原と結合させた。非特異的に結合したファージをＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水）溶液で３回洗浄した後、残りの抗原特異的ファージ抗体を、１００ｍＭトリエチルアミン溶液を用いて溶離した。
【0074】
溶離したファージを１．０Ｍ濃度のＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８）で中和した後、ＥＲ２５３７大腸菌を３７℃で１時間感染させ、感染した大腸菌を、カルベニシリンを含むルリア－ベルターニ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ：ＬＢ）寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。このように培養された大腸菌を３ｍＬのスーパーブロス（ＳＢ）－カルベニシリン培養液に懸濁し、１５％グリセロールを添加して一部は－８０℃に保管し、残りのうち５０μｌを２０ｍＬのＳＢ－カルベニシリン－２％グルコース溶液に接種し、３７℃で培養した。培養液の６００ナノメートル光線の吸光度が０．５になると遠心分離してバクテリアのみを分離し、これを再び２０ｍＬのＳＢ－カルベニシリン培養液に懸濁した後、１０１２ＰＦＵ（Ｐｌａｑｕｅ－Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ：プラーク形成単位）のＶＣＳＭ１３補助ファージを入れて徐々に攪拌し、３７℃で培養した。
【0075】
１時間後、カナマイシン７０μｇ／ｍｌを添加し、３０℃で急速に撹拌し（２５０ｒｐｍ）、一晩培養した。翌日、培養液を遠心分離した後、ファージ粒子を含む上澄み液１ｍＬをライブラリーとして用い、上記のパニング工程を繰り返すことにより抗原特異的クローンを濃縮した。
【0076】
実施例２．抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ抗体の発現および精製
パニングを３～４回程度繰り返した後、抗原特異的候補クローン４種（ＯＰＡＬ Ａ１、ＯＰＡＬ Ｂ１０、ＯＰＡＬＳ－Ｌ Ａ５およびＯＰＡＬＳ－Ｋ Ｈ６）を確保し、各抗体遺伝子を含む大腸菌を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布、培養して単一のコロニーを得、これを２００μＬのＳＢ－カルベニシリン溶液に接種、培養した後、ＩＰＴＧで誘導してｓｃＦｖタンパク質を大腸菌のペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）で発現させた。大腸菌を４０μＬの１×ＴＥＳ（５０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％のスクロース、ｐＨ８．０）溶液に懸濁した後、これに０．２×ＴＥＳ溶液６０μＬを加えて混合し、４℃で３０分以上処理し、遠心分離して上澄み液でペリプラズムを抽出した。
パニングを３～４回程度繰り返した後、抗原特異的候補クローン４種（ＯＰＡＬ Ａ１、ＯＰＡＬ Ｂ１０、ＯＰＡＬＳ－Ｌ Ａ５およびＯＰＡＬＳ－Ｋ Ｈ６）を確保し、各抗体遺伝子を含む大腸菌を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗布、培養して単一のコロニーを得、これを２００μＬのＳＢ－カルベニシリン溶液に接種、培養した後、ＩＰＴＧで誘導してｓｃＦｖタンパク質を大腸菌のペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）で発現させた。大腸菌を４０μＬの１×ＴＥＳ（５０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％のスクロース、ｐＨ８．０）溶液に懸濁した後、これに０．２×ＴＥＳ溶液６０μＬを加えて混合し、４℃で３０分以上処理し、遠心分離して上澄み液でペリプラズムを抽出した。
【0077】
＜実施例２－１＞ＢＣＭＡに対して選別されたｓｃＦｖ抗体の発現
選別された４種のＢＣＭＡに対するｓｃＦｖ陽性単一コロニークローンを、カルベニシリンを含むＳＢ培地（３０ｇのバクトトリプトン、２０ｇの酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＭＯＰＳバッファー）５ｍｌに培養し、シードカルチャーを開始して一晩培養後、５００ｍｌカルベニシリン含有ＳＢ培地に移し、ＯＤ６００が０．５程度になったとき、ＩＰＴＧを１ｍＭになるように加え、３０℃で一晩培養し、ｓｃＦｖ抗体を大腸菌のペリプラズムで発現させた。翌日、遠心分離により得られた大腸菌を１×ＴＥＳバッファー（５０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％のスクロース，ｐＨ８．０）に懸濁した後、０．２×ＴＥＳを１．５倍添加して混合し、遠心分離してペリプラズムを抽出した。
選別された４種のＢＣＭＡに対するｓｃＦｖ陽性単一コロニークローンを、カルベニシリンを含むＳＢ培地（３０ｇのバクトトリプトン、２０ｇの酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＭＯＰＳバッファー）５ｍｌに培養し、シードカルチャーを開始して一晩培養後、５００ｍｌカルベニシリン含有ＳＢ培地に移し、ＯＤ６００が０．５程度になったとき、ＩＰＴＧを１ｍＭになるように加え、３０℃で一晩培養し、ｓｃＦｖ抗体を大腸菌のペリプラズムで発現させた。翌日、遠心分離により得られた大腸菌を１×ＴＥＳバッファー（５０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％のスクロース，ｐＨ８．０）に懸濁した後、０．２×ＴＥＳを１．５倍添加して混合し、遠心分離してペリプラズムを抽出した。
【0078】
＜実施例２－２＞選別されたｓｃＦｖ抗体の精製
ペリプラズムから抽出したｓｃＦｖ抗体に最終的に５ｍＭのＭｇＳＯ４を加え、これを予めＰＢＳで平衡化したＮｉ－ＮＴＡ ｂｅａｄと混合し、１時間冷蔵で攪拌してＮｉ－ｂｅａｄに結合させた後、アフィニティークロマトグラフィーを行い、結合していないタンパク質をＰＢＳで十分に洗浄した。５ｍＭのイミダゾールを含むバッファーでより十分に洗浄し、次いで結合したｓｃＦｖ抗体を、２００ｍＭのイミダゾールバッファーを用いて溶出した。溶出した抗体は透析して電気泳動により純度を確認し、ＢＣＡ法によりタンパク質を定量して精製抗体量を記録し、その後、一定量を分株して冷凍保管した。
ペリプラズムから抽出したｓｃＦｖ抗体に最終的に５ｍＭのＭｇＳＯ４を加え、これを予めＰＢＳで平衡化したＮｉ－ＮＴＡ ｂｅａｄと混合し、１時間冷蔵で攪拌してＮｉ－ｂｅａｄに結合させた後、アフィニティークロマトグラフィーを行い、結合していないタンパク質をＰＢＳで十分に洗浄した。５ｍＭのイミダゾールを含むバッファーでより十分に洗浄し、次いで結合したｓｃＦｖ抗体を、２００ｍＭのイミダゾールバッファーを用いて溶出した。溶出した抗体は透析して電気泳動により純度を確認し、ＢＣＡ法によりタンパク質を定量して精製抗体量を記録し、その後、一定量を分株して冷凍保管した。
【0079】
＜実施例２－３＞抗ＢＣＭＡｓｃＦｖ選別のためのＦＡＣＳ及びシーケンシング
ペリプラズムから抽出したｓｃＦｖ抗体は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）技術を用いて、ｓｃＦｖ抗体が細胞表面のＢＣＭＡに結合しているかどうかを確認した。ここで使用した細胞は、ＢＣＭＡを発現するものとしてよく知られているＢ細胞リンパ腫細胞株であるＲａｊｉ細胞であり、Ｒａｊｉ細胞をプレートに２×１０６個となるように培養した後、トリプシン処理してプレートから分離後、遠心分離した。このように準備した細胞を、３％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含むＰＢＳで４℃にて１時間ブロッキングし、その後、１×ＰＢＳで１回洗浄し、３分間３０００ｒｐｍで遠心分離した後、各一次抗体と反応させた（各実験群：ＯＰＡＬ Ａ１を６．２μｇ／ｍＬ、ＯＰＡＬ Ｂ１０を１３．２μｇ／ｍＬ、ＯＰＡＬＳ－Ｌ Ａ５を２１μｇ／ｍＬ、ＯＰＡＬＳ－Ｋ Ｈ６を２０μｇ／ｍＬ；陽性対照群：抗ＢＣＭＡポリクローナル抗体（ビオチン化）０．５μｇ／ｍＬ）、１×ＰＢＳで３回洗浄した後、各二次抗体と反応させ（各実験群：抗ＨＡ－ＰＥ；陽性対照群：アビジン－ＦＩＴＣ）１×ＰＢＳで２回洗浄した。これを一定の希釈水で希釈し、ＦＡＣＳで分析した（ＦＡＣＳキャリバー、ＢＤバイオサイエンス）（図１）。
ペリプラズムから抽出したｓｃＦｖ抗体は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）技術を用いて、ｓｃＦｖ抗体が細胞表面のＢＣＭＡに結合しているかどうかを確認した。ここで使用した細胞は、ＢＣＭＡを発現するものとしてよく知られているＢ細胞リンパ腫細胞株であるＲａｊｉ細胞であり、Ｒａｊｉ細胞をプレートに２×１０６個となるように培養した後、トリプシン処理してプレートから分離後、遠心分離した。このように準備した細胞を、３％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含むＰＢＳで４℃にて１時間ブロッキングし、その後、１×ＰＢＳで１回洗浄し、３分間３０００ｒｐｍで遠心分離した後、各一次抗体と反応させた（各実験群：ＯＰＡＬ Ａ１を６．２μｇ／ｍＬ、ＯＰＡＬ Ｂ１０を１３．２μｇ／ｍＬ、ＯＰＡＬＳ－Ｌ Ａ５を２１μｇ／ｍＬ、ＯＰＡＬＳ－Ｋ Ｈ６を２０μｇ／ｍＬ；陽性対照群：抗ＢＣＭＡポリクローナル抗体（ビオチン化）０．５μｇ／ｍＬ）、１×ＰＢＳで３回洗浄した後、各二次抗体と反応させ（各実験群：抗ＨＡ－ＰＥ；陽性対照群：アビジン－ＦＩＴＣ）１×ＰＢＳで２回洗浄した。これを一定の希釈水で希釈し、ＦＡＣＳで分析した（ＦＡＣＳキャリバー、ＢＤバイオサイエンス）（図１）。
【0080】
これから最終的に選別したＢＣＭＡ抗原特異的抗体クローン１種（ＯＰＡＬ Ｂ１０、以下Ｂ１０）を、カルベニシリンを含む１０ｍｌのＳＢ培地で一晩培養し、プラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを抽出した後、キャピラリーシーケンスサービス（マクロジェン社）により塩基配列を得た。これをタンパク質配列に変換した後、Ｋａｂａｔタンパク質配列データベースと国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（ＩＭＧＴ）分析方法に基づいてＣＤＲ配列を分析した。
【0081】
後述する実施例および実験例で使用した細胞株および培養液は、以下の通りである：２９３Ｔ細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが含まれた培養液で培養した。ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＲＰＭＩ ８２２６、Ｕ２６６Ｂ１細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が含まれた培養液で培養した。ＰＢＭＣは、ＡＩＭ－Ｖ培地に５％のＩｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）が含まれた培養液で培養した。
【0082】
実施例３．ｐＬ－Ｂ１０－ＢＢｚプラスミドの調製
Ｂ１０塩基配列を含む遺伝子断片（配列番号1）と遺伝子断片（配列番号２）（表２）とを、インテグレーテッドＤＮＡテクノロジー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に合成注文した。２つの遺伝子断片およびプライマー（配列番号１および２）（表３）を用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。制限酵素Ｘｈｏ１およびＥｃｏＲＶが処理されたＰＣＲ産物を、制限酵素Ｘｈｏ１およびＥｃｏＲＶが処理されたｐＬＶ－ＣＤ１９－ＢＢｚプラスミド（ＰＮＡＳ，２０１６，Ｍａ ＪＳＹ）に挿入してｐＬＶ－Ｂ１０－ＢＢｚを製造した。（図２および図３）
Ｂ１０塩基配列を含む遺伝子断片（配列番号1）と遺伝子断片（配列番号２）（表２）とを、インテグレーテッドＤＮＡテクノロジー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に合成注文した。２つの遺伝子断片およびプライマー（配列番号１および２）（表３）を用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。制限酵素Ｘｈｏ１およびＥｃｏＲＶが処理されたＰＣＲ産物を、制限酵素Ｘｈｏ１およびＥｃｏＲＶが処理されたｐＬＶ－ＣＤ１９－ＢＢｚプラスミド（ＰＮＡＳ，２０１６，Ｍａ ＪＳＹ）に挿入してｐＬＶ－Ｂ１０－ＢＢｚを製造した。（図２および図３）
【0083】
【表2】
【0084】
【表3】
【0085】
実施例４．レンチウイルスベクターの製造
２９３Ｔ細胞をＰｏｌｙ－Ｄ－Ｌｙｓｉｎｅでコーティングされた１５０ｍｍ培養皿（ＳＰＬ）に入れ、２４時間培養した。翌日、新しい２９３Ｔ細胞培養液に交換した後、ｐＭＤＬ ｇ／ｐ（Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現）、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ（Ｒｅｖ発現）、ｐＭＤＧ．１（Ｅｎｖｅｌｏｐｅ発現）、およびｐＬＶ－Ｂ１０－ＢＢｚプラスミドとリポフエクトァミン２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を入れてトランスフェクションを行った。４８時間後に培養液を回収し、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（タカラバイオ社）を用いて生産されたレンチウイルスベクター（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）を濃縮後、濃縮されたレンチウイルスベクターを４％のラクトース溶液中に懸濁した。その後、０．２μｍのシリンジフィルター（ミリポア社）で濾過後、－８０℃で保管した。
２９３Ｔ細胞をＰｏｌｙ－Ｄ－Ｌｙｓｉｎｅでコーティングされた１５０ｍｍ培養皿（ＳＰＬ）に入れ、２４時間培養した。翌日、新しい２９３Ｔ細胞培養液に交換した後、ｐＭＤＬ ｇ／ｐ（Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現）、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ（Ｒｅｖ発現）、ｐＭＤＧ．１（Ｅｎｖｅｌｏｐｅ発現）、およびｐＬＶ－Ｂ１０－ＢＢｚプラスミドとリポフエクトァミン２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を入れてトランスフェクションを行った。４８時間後に培養液を回収し、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（タカラバイオ社）を用いて生産されたレンチウイルスベクター（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）を濃縮後、濃縮されたレンチウイルスベクターを４％のラクトース溶液中に懸濁した。その後、０．２μｍのシリンジフィルター（ミリポア社）で濾過後、－８０℃で保管した。
【0086】
実施例５．Ｔ細胞形質転換及び増幅
凍結したＨｕｍａｎ ＰＢＭＣを解凍後、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＰＢＳ ／ ＥＤＴＡ バッファー（ミルテニーバイオテク社）および０．５％のアルブミン（グリーンクロス社）を含む洗浄液で２回洗浄した。洗浄したＰＢＭＣにＭＡＣＳ ＣＤ４ ＭｉｃｒｏｂｅａｄとＭＡＣＳ ＣＤ８ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ（ミルテニーバイオテク社）を入れて３０分間結合させた後、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳＴＭ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（ミルテニーバイオテク社）によりＴ細胞を分離した。分離されたＴ細胞を洗浄後に培養液に懸濁し、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（ミルテニーバイオテク社）と１００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２（韓国ＢＭＩ社）を入れて活性化した。２４時間後、活性化Ｔ細胞にレンチウイルスベクターをＭＯＩ＝３となるように添加し、一晩培養した。翌日、形質導入されたＴ細胞（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ）を洗浄後、１００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２となるように入れ、Ｇ－Ｒｅｘ ６Ｍ Ｐｌａｔｅ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ社）に入れてＣＡＲ－Ｔ細胞の大量培養を行った。細胞数は、培養液中のグルコース濃度の変化によって確認した。
凍結したＨｕｍａｎ ＰＢＭＣを解凍後、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＰＢＳ ／ ＥＤＴＡ バッファー（ミルテニーバイオテク社）および０．５％のアルブミン（グリーンクロス社）を含む洗浄液で２回洗浄した。洗浄したＰＢＭＣにＭＡＣＳ ＣＤ４ ＭｉｃｒｏｂｅａｄとＭＡＣＳ ＣＤ８ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ（ミルテニーバイオテク社）を入れて３０分間結合させた後、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳＴＭ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（ミルテニーバイオテク社）によりＴ細胞を分離した。分離されたＴ細胞を洗浄後に培養液に懸濁し、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（ミルテニーバイオテク社）と１００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２（韓国ＢＭＩ社）を入れて活性化した。２４時間後、活性化Ｔ細胞にレンチウイルスベクターをＭＯＩ＝３となるように添加し、一晩培養した。翌日、形質導入されたＴ細胞（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ）を洗浄後、１００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２となるように入れ、Ｇ－Ｒｅｘ ６Ｍ Ｐｌａｔｅ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ社）に入れてＣＡＲ－Ｔ細胞の大量培養を行った。細胞数は、培養液中のグルコース濃度の変化によって確認した。
【0087】
実験例１．抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現分析
細胞表面（Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ）のＣＡＲ発現をフローサイトメトリーで確認した。１×１０６個の細胞をＤ－ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｈｕｍａｎ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と混合し、 常温で１０分間反応させた。そして、ＰＥ－Ｃｙ７マウス抗ヒトＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）抗体と共に、ビオチン化ＢＣＭＡ（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＢＣＭＡ）（Ａｒｇｏ社）またはビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体を加えた後、常温で１５分間反応させた。この試料をＤ－ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｏｕｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）とＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を加え、常温で１５分間反応させた。Ｄ－ＰＢＳで２回洗浄後、Ｄ－ＰＢＳで再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（登録商標）フローサイトメーターで分析してＣＡＲ発現を確認した。
細胞表面（Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ）のＣＡＲ発現をフローサイトメトリーで確認した。１×１０６個の細胞をＤ－ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｈｕｍａｎ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と混合し、 常温で１０分間反応させた。そして、ＰＥ－Ｃｙ７マウス抗ヒトＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）抗体と共に、ビオチン化ＢＣＭＡ（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＢＣＭＡ）（Ａｒｇｏ社）またはビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体を加えた後、常温で１５分間反応させた。この試料をＤ－ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｏｕｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）とＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を加え、常温で１５分間反応させた。Ｄ－ＰＢＳで２回洗浄後、Ｄ－ＰＢＳで再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（登録商標）フローサイトメーターで分析してＣＡＲ発現を確認した。
【0088】
ビオチン化ＢＣＭＡを用いた結果は図４と同様であり、ビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体を用いた結果は図５と同様であり、本発明の実施例による抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを含むベクターで形質転換したＴ細胞（Ｂ１０－ＢＢＺ ＣＡＲ－Ｔ）群において前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの発現を確認することができた。
【0089】
実験例２．ＩＦＮ－γ放出アッセイ（Ｒｅｌｅａｓｅ Ａｓｓａｙ）
Ｔ細胞５．０×１０４個を単独培養したり、Ｋ５６２－Ｍｏｃｋ（ＢＣＭＡを発現しないＫ５６２細胞、１：１比）またはＫ５６２－ＢＣＭＡ（ＢＣＭＡを発現するＫ５６２細胞、１：１比）と３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養器で２４時間共培養したりした。各試料の５００×ｇで５分間遠心分離して得られた上澄み液に含まれるＩＦＮ－γの量を、ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ Ａｎｃｉｌｌａｒｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ２（Ｒ＆Ｄシステム社）とＨｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｄｕｏ Ｓｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム社）を用いて測定し、その結果を図６に示した。図６に示すように、データを、単独でＴ細胞のみを培養した場合（単独）；Ｔ細胞を、ＢＣＭＡを発現しないＫ５６２細胞（Ｋ５６２－Ｍｏｃｋ）と共培養した場合；Ｔ細胞に刺激剤（ＰＭＡ／イオノマイシン）処理した場合（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）；Ｔ細胞を、ＢＣＭＡを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ＢＣＭＡ）と共培養した場合；Ｋ－５６２－ＢＣＭＡ群で測定されたＩＦＮ－γ量をＣＡＲ陽性であるＴ細胞の比率で補正した場合（ＣＡＲ＋補正、％ＩＦＮ－γ／Ｖｉａｂｌｅ ＣＡＲ－Ｔ）；に分けて示した。
Ｔ細胞５．０×１０４個を単独培養したり、Ｋ５６２－Ｍｏｃｋ（ＢＣＭＡを発現しないＫ５６２細胞、１：１比）またはＫ５６２－ＢＣＭＡ（ＢＣＭＡを発現するＫ５６２細胞、１：１比）と３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養器で２４時間共培養したりした。各試料の５００×ｇで５分間遠心分離して得られた上澄み液に含まれるＩＦＮ－γの量を、ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ Ａｎｃｉｌｌａｒｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ２（Ｒ＆Ｄシステム社）とＨｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｄｕｏ Ｓｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム社）を用いて測定し、その結果を図６に示した。図６に示すように、データを、単独でＴ細胞のみを培養した場合（単独）；Ｔ細胞を、ＢＣＭＡを発現しないＫ５６２細胞（Ｋ５６２－Ｍｏｃｋ）と共培養した場合；Ｔ細胞に刺激剤（ＰＭＡ／イオノマイシン）処理した場合（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）；Ｔ細胞を、ＢＣＭＡを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ＢＣＭＡ）と共培養した場合；Ｋ－５６２－ＢＣＭＡ群で測定されたＩＦＮ－γ量をＣＡＲ陽性であるＴ細胞の比率で補正した場合（ＣＡＲ＋補正、％ＩＦＮ－γ／Ｖｉａｂｌｅ ＣＡＲ－Ｔ）；に分けて示した。
【0090】
その結果、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを導入した細胞群は、導入していない対照群に比べて、細胞毒性活性の指標であるＩＦＮ－γの分泌が全群で高く、特に前記ＣＡＲの標的分子であるＢＭＣＡに特異結果として、ＩＦＮ－γの分泌が大幅に高まることが確認できた。
【0091】
実験例３．抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）および抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ｓｃＦｖからなるＣＡＲのＴ細胞形質導入の確認。
周知の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ（Ｃ１１Ｄ５．３）と抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ＣＡＲとの機能的違いを評価するために、ＵＳ２０１５００５１２６６Ａ１特許に記載されているＣ１１Ｄ５．３ ｓｃＦｖ塩基配列に基づいて図７のようにＣＡＲを構築した。抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）と抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ｓｃＦｖとからなるＣＡＲの形質導入４日目に、ＬＮＧＦＲ磁気ビーズを用いて、形質導入されたＴ細胞を選別した。選別後６日目、ＡＰＣコンジュゲートＬＮＧＦＲ Ａｂ（ミルテニーバイオテク社、クローン：ＭＥ２０．４－１．Ｈ４，カタログ番号１３０－１１３－４１８）、ビオチン化ヒトＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＦＣ，Ａｖｉｔａｇ（商標），Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰＥ－Ｃｙ７）を用いてＴ細胞を染色した後、フローサイトメーターを用いて、形質導入された細胞のパーセント（％）を確認した。その結果、形質導入されたＴ細胞の純度は７０％以上であり、ＬＮＧＦＲとＣＡＲがほぼ１：１の比率で発現していることが確認できた（図７）。
周知の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ（Ｃ１１Ｄ５．３）と抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ＣＡＲとの機能的違いを評価するために、ＵＳ２０１５００５１２６６Ａ１特許に記載されているＣ１１Ｄ５．３ ｓｃＦｖ塩基配列に基づいて図７のようにＣＡＲを構築した。抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）と抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ｓｃＦｖとからなるＣＡＲの形質導入４日目に、ＬＮＧＦＲ磁気ビーズを用いて、形質導入されたＴ細胞を選別した。選別後６日目、ＡＰＣコンジュゲートＬＮＧＦＲ Ａｂ（ミルテニーバイオテク社、クローン：ＭＥ２０．４－１．Ｈ４，カタログ番号１３０－１１３－４１８）、ビオチン化ヒトＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＦＣ，Ａｖｉｔａｇ（商標），Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰＥ－Ｃｙ７）を用いてＴ細胞を染色した後、フローサイトメーターを用いて、形質導入された細胞のパーセント（％）を確認した。その結果、形質導入されたＴ細胞の純度は７０％以上であり、ＬＮＧＦＲとＣＡＲがほぼ１：１の比率で発現していることが確認できた（図７）。
【0092】
実験例４．抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）と抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ｓｃＦｖとからなるＣＡＲが形質導入されたＴ細胞の細胞毒性能の評価。
ＢＣＭＡ、ＧＦＰを発現する多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＲＰＭＩ８２２６－ＧＬ）１×１０５とＭｏｃｋ Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）ＣＡＲ Ｔ細胞０．５×１０５個、０．１×１０５個を、３７℃、５％ＣＯ２の条件で４８時間共培養した。ＧＦＰ蛍光値を２時間間隔で４８時間測定し、０時間基準で正規化して細胞毒性能を評価した。測定の結果、抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）ＣＡＲ Ｔ細胞と同様の細胞毒性能を示した（図８）。
ＢＣＭＡ、ＧＦＰを発現する多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＲＰＭＩ８２２６－ＧＬ）１×１０５とＭｏｃｋ Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）ＣＡＲ Ｔ細胞０．５×１０５個、０．１×１０５個を、３７℃、５％ＣＯ２の条件で４８時間共培養した。ＧＦＰ蛍光値を２時間間隔で４８時間測定し、０時間基準で正規化して細胞毒性能を評価した。測定の結果、抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）ＣＡＲ Ｔ細胞と同様の細胞毒性能を示した（図８）。
【0093】
実験例５．抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）ＣＡＲ－Ｔと抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ＣＡＲ－Ｔの生体内抗がん効能の評価。
１×１０７個のＲＰＭＩ８２２６－ＧＬをＳ．Ｃｅｈ注入した後１２日目に、１×１０６、０．５×１０６、０．２５×１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を静脈注入し、１週間間隔で腫瘍細胞が発現するルシフェラーゼ活性を測定することで抗がん効能を評価した。実験の結果、注入されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量に依存して細胞毒性能が観察され、抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗がん効能と抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗がん効能とは類似していた（図９～図１２）。
１×１０７個のＲＰＭＩ８２２６－ＧＬをＳ．Ｃｅｈ注入した後１２日目に、１×１０６、０．５×１０６、０．２５×１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を静脈注入し、１週間間隔で腫瘍細胞が発現するルシフェラーゼ活性を測定することで抗がん効能を評価した。実験の結果、注入されたＣＡＲ－Ｔ細胞の量に依存して細胞毒性能が観察され、抗ＢＣＭＡ（Ｃ１１Ｄ５．３）ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗がん効能と抗ＢＣＭＡ（Ｂ１０）ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗がん効能とは類似していた（図９～図１２）。
【0094】
まとめると、これらの結果は、本発明による抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するＴ細胞が、ＢＣＭＡ特異的な高い細胞毒性活性を有し、周知の効能を有する既存のＢＣＭＡ ＣＡＲに匹敵する高いインビトロおよびインビボ抗がん効能を有することを示している。
【0095】
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須特徴を変更することなく他の具体的な形態に容易に変形可能である。よって、以上で記述した実施形態は、全ての面で例示的なものであり、限定的ではない。例えば、単一型に説明されている各構成要素は分散して実施されてもよく、同様に、分散して説明されている構成要素も結合された形態で実施されてもよい。
【0096】
本発明の範囲は、後述する特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び範囲、並びにその均等概念から導出される全ての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】