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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-08
(54)【発明の名称】免疫抑制癌の処置
(51)【国際特許分類】
A61K 47/62 20170101AFI20230426BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230426BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230426BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230426BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20230426BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230426BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20230426BHJP
A61K 47/56 20170101ALI20230426BHJP
A61K 47/59 20170101ALI20230426BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230426BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230426BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20230426BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230426BHJP
A61K 33/00 20060101ALI20230426BHJP
【ＦＩ】
A61K47/62
A61P37/04
A61P43/00 121
A61P35/00
A61P35/04
A61K45/00
A61K47/69
A61K47/56
A61K47/59
A61K47/68
A61K39/395 C
A61K39/395 L
A61K38/19
A61K35/17
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K39/395 G
A61K39/395 U
A61K33/00 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022559317
(86)(22)【出願日】2021-03-29
(85)【翻訳文提出日】2022-10-27
(86)【国際出願番号】 EP2021058146
(87)【国際公開番号】W WO2021191464
(87)【国際公開日】2021-09-30
(31)【優先権主張番号】2004514.2
(32)【優先日】2020-03-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511115734
【氏名又は名称】インスティテュート デ メディシナ モレキュラー ジョアオ ロボ アントゥネス
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｊｏａｏ Ｌｏｂｏ Ａｎｔｕｎｅｓ
【住所又は居所原語表記】Ｆａｃｕｌｄａｄｅ ｄｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ ｄｅ Ｌｉｓｂｏａ， Ａｖｅｎｉｄａ ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｅｇａｓ Ｍｏｎｉｚ，１６４９－０２８ Ｌｉｓｂｏｎ，Ｐｏｒｔｕｇｕｅｓｅ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ
(71)【出願人】
【識別番号】522380619
【氏名又は名称】ファクルダーデ デ メディシナ ダ ウニベルシダーデ デ リスボア
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ラバオ アルピアルサ ソウサ デ アルメイダ カルロス ディオゴ
(72)【発明者】
【氏名】ロペス ベルナルデス ゴンサロ ジョゼ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC07
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA44
4C084DA01
4C084MA02
4C084NA05
4C084ZB021
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB261
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085AA26
4C085BB01
4C085BB12
4C085BB50
4C085CC03
4C085CC31
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE03
4C086AA01
4C086AA02
4C086HA08
4C086HA09
4C086HA10
4C086HA11
4C086HA21
4C086HA28
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA13
4C086ZB02
4C086ZB09
4C086ZB26
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087CA04
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA13
4C087ZB03
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZC75
(57)【要約】
本発明は、種々の態様及び実施形態において、がん処置において免疫調節効果（たとえば、免疫チェックポイント分子の発現及び抑制性マクロファージのレベルの減少）を及ぼすためにＣＯ放出分子（たとえば、腫瘍選択的リガンドと一酸化炭素（ＣＯ）を放出することができる基とを含む複合体）を用いることを伴う。これは、腫瘍組織における免疫抑制を減らすことができ、また、たとえば免疫抑制癌の処置またはがん免疫療法と組み合わせたがんの処置において有用である可能性がある。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
腫瘍免疫抑制を低減する方法であって、１つ以上の一酸化炭素放出基と腫瘍選択的リガンドとを含む複合体をそれを必要としている個体に投与し、任意選択でがん免疫療法を投与することを含む、前記方法。
【請求項2】
がん免疫療法を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記がんは免疫抑制癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記免疫抑制癌は、免疫チェックポイントタンパク質介在のＴ細胞機能の阻害を特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記免疫チェックポイントタンパク質はＣＴＬＡ－４である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記免疫チェックポイントタンパク質はＰＤ－１である、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記免疫抑制癌は、前記個体の腫瘍組織内のＴ細胞抑制細胞の存在を特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項8】
前記Ｔ細胞抑制細胞は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記一酸化炭素放出基は金属カルボニル基である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記金属カルボニル基は、モノ、ジ、トリ、テトラ、またはペンタカルボニル金属基である請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記一酸化炭素放出基は、ルテニウム、モリブデン、コバルト、レニウム、及び鉄から選択される金属原子を含む請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記金属原子はルテニウムまたはモリブデンである請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記複合体は、化学式リガンド－［金属（ＣＯ）ｎ１］ｎ２を有し、ｎ１は１～５であり、ｎ２は１～３０である、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記一酸化炭素放出基はルテニウムカルボニル基である、請求項９～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記複合体は、化学式リガンド－［Ｒｕ（ＣＯ）２］ｎを有し、ｎは１～１６である請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記一酸化炭素放出基はＲｕＩＩ（ＣＯ）２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記複合体は２つ以上の一酸化炭素放出基を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記複合体は、前記一酸化炭素放出基をカプセル化するナノ粒子であり、前記腫瘍選択的リガンドは前記ナノ粒子の表面に結合されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ナノ粒子は、ポリマーまたは無機コアまたはシェルを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ナノ粒子は、ＰＥＧを含むブロックコポリマーを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ナノ粒子はＰＥＧブロックコポリマーを含み、腫瘍選択的リガンドが前記ＰＥＧ末端に結合されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記腫瘍選択的リガンドは、バイオポリマー、合成ポリマー、ペプチド、アプタマー、または小分子である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記腫瘍選択的リガンドはタンパク質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記腫瘍選択的リガンドは血漿タンパク質である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記腫瘍選択的リガンドは、抗体、アルブミン、グロブリン、リポタンパク質、またはトランスフェリンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記腫瘍選択的リガンドは、血清アルブミンまたはその断片である、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記血漿タンパク質はヒト血清アルブミンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記腫瘍選択的リガンドは、抗体またはその抗原結合部分を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記抗体またはその抗原結合部分は腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記抗体またはその抗原結合部分はＰＤ－１またはＣＴＬＡ４に特異的に結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
前記一酸化炭素放出基は、前記タンパク質内のヒスチジン残基に付与共有結合によって付着している、請求項２３～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記複合体は、前記タンパク質を１つ以上の金属カルボニル基を含むＣＯ放出分子と反応させて、前記タンパク質の１つ以上のヒスチジン残基を前記金属カルボニル基によって金属化することによって生成される請求項２３～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記複合体は、前記タンパク質をＣＯＲＭ－３と反応させて、前記タンパク質の１つ以上のヒスチジン残基をルテニウムジカルボニル基によって金属化することによって生成される、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記がんは、固形癌、たとえば肉腫、癌腫、またはリンパ腫である請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記がんは、皮膚癌、黒色腫、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮癌、口腔癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、食道癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、胃癌、精巣癌、前記胆嚢及び胆道の癌、甲状腺癌、胸腺癌、及び骨肉腫である、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記がんは原発腫瘍である、請求項３４または請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記がんは転移性である、請求項３４または請求項３５に記載の方法。
【請求項38】
前記複合体を、週に１回か２回または月に１回か２回、投与する請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記複合体を少なくとも４週間の間、投与する、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記ＣＯ放出複合体を静脈内投与する、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
複合体をがん免疫療法と組み合わせて前記個体に投与する、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
前記がん免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤療法、サイトカイン療法、免疫共刺激療法、及び養子細胞療法から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記がん免疫療法は、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体、及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体から選択される免疫チェックポイント阻害剤である、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項44】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、及びアベルマブである、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記がん免疫療法は、任意選択でＣＤ２８アゴニストまたはＯＸ４０アゴニストである免疫共刺激療法である、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項46】
前記がん免疫療法は養子細胞療法である、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項47】
前記がん免疫療法はＴ細胞養子細胞療法である、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記がん免疫療法はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法である、請求項４６または請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
治療レジメンは、免疫療法レジメンを開始する前、１～４週間の間、前記複合体を投与することを含む、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項50】
前記治療レジメンは、がん免疫療法レジメンが終了した後に１週間以上または１ヶ月以上、前記複合体を投与することを含む、請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
前記複合体及び免疫療法を、併用療法を含むレジメンにおいて投与する、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
前記患者は以前は、任意選択でチェックポイント阻害剤療法である免疫療法に対して、無反応であったか、部分的にのみ反応していたか、または耐性になっていた請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項53】
前記患者はＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１遮断療法に抵抗性である、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
免疫抑制癌の処置方法、がんの処置方法、または請求項１～５３のいずれか１項に記載の腫瘍免疫抑制を低減する処置方法で用いる１つ以上の一酸化炭素放出基及び腫瘍選択的リガンドを含む、複合体。
【請求項55】
免疫抑制癌の処置方法、がんの処置方法、または請求項１～５３のいずれか１項に記載の腫瘍免疫抑制を低減する処置方法で用いる薬物の製造における腫瘍選択的リガンドに付着した１つ以上の一酸化炭素放出基を含む、複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は免疫抑制癌の処置に関する。
【背景技術】
【0002】
がんは世界的に死亡の主な原因の１つであり、罹患率は時間とともに体系的に増加している［１］。がん研究の進歩によって、腫瘍発生に対する宿主保護に対して免疫系が果たす役割についての我々の理解が広がった。免疫系は、外来生物または成分に由来する極めて多量の抗原を認識できるだけでなく、腫瘍細胞も標的とする［２］。しかし、がん細胞は、免疫細胞を介した認識及び破壊を覆して回避する免疫回避の多くのメカニズムを有している。腫瘍免疫のメカニズムを目標にすることで、臨床試験において有望な結果をもたらしている新規な治療アプローチの開発につながった。免疫療法は、免疫系を利用して腫瘍細胞を特異的に標的とするがん処置における有望なアプローチである［２～４］。しかし、免疫療法はすべてのがん患者において効果的なわけではなく、完全または永続的な臨床反応が得られないことが多い［５、６］。したがって、抗腫瘍免疫応答を促進する新しい戦術が望まれている。
【0003】
一酸化炭素（ＣＯ）は、いくつかのがんモデルにおいて有用な特性を有することが観察されているいくつかの多面的効果を伴うガス状メディエーターである［７～１０］。しかし、これらの観察は一貫して観察されてはおらず、いくつかのモデルではＣＯは腫瘍増殖または進行にも関連付けられている［６５］。さらに、ＣＯの毒性性質は、ＣＯを標的組織に、正確かつ制御された方法で、生物学的に適切な用量で送達しなくてはいけないことを意味する。しかしながら、これらの研究の大部分はがん細胞におけるその直接効果に焦点を当てているため、がん免疫におけるＣＯの役割は事実上分かっていない。
【0004】
高濃度のＣＯにさらすと著しく有毒であるため、ＣＯの外因性送達は厳密に制御して非常に低い用量で与えなければならない。より高い治療用量の全身投与のためにＣＯ放出分子またはＣＯＲＭが開発された。種々の疾患モデルにおいてＣＯＲＭがテストされた［７～１０］。免疫系に対する及び腫瘍増殖におけるＣＯの効果の背後にある分子機構は、完全には理解されていない。ＣＯＲＭには、組織または細胞の選択性がなく、潜在的にＣＯを循環で放出する場合があり、タンパク質または抗体キャリアと結合すると、特定組織へのより制御された送達が可能になる場合がある。たとえば、光ＣＯＲＭは市販のマウス抗体と以前に結合した［１１］。しかし、その潜在的な抗癌効果はがん細胞において直接研究されたのみであり、免疫細胞との共培養またはインビボでは研究されていない。
【0005】
免疫抑制癌に対する新しい改善された特定の処置が求められており、ならびに腫瘍を処置するためのＣＯの効果的な送達をもたらす組成が求められている。
【発明の概要】
【0006】
本発明者らは、ＣＯ放出分子（たとえば、腫瘍選択的リガンドと一酸化炭素（ＣＯ）を放出することができる基とを含む複合体）が、免疫調節効果（たとえば、免疫チェックポイント分子の発現及び抑制性マクロファージのレベルの減少）を及ぼすことを予想外に見出した。これは、腫瘍組織における免疫抑制を減らすことができ、たとえば、免疫抑制癌の処置またはがん免疫療法と組み合わせたがんの処置において有用である可能性がある。
【0007】
本発明の第１の態様によって、免疫抑制癌を処置するかまたは腫瘍免疫抑制を低減する方法であって、腫瘍選択的リガンドに付着した一酸化炭素（ＣＯ）放出基を含む複合体をそれを必要としている個体に投与することを含む方法が提供される。
【0008】
本発明の第２の態様によって、がん患者を処置する方法であって、一酸化炭素放出基及び腫瘍選択的リガンドを含む複合体を投与することと、がん免疫療法を投与することと、を含む方法が提供される。
【0009】
本発明の第３の態様によって、免疫抑制癌を処置するかもしくは腫瘍免疫抑制を低減する方法またはがんを処置する方法（たとえば、第１または第２の態様の方法）で用いる腫瘍選択的リガンドに共有結合した一酸化炭素放出基を含む複合体が提供される。
【0010】
本発明の第４の態様によって、免疫抑制癌を処置するかもしくは腫瘍免疫抑制を低減する方法またはがん免疫療法と組み合わせてがんを処置する方法（たとえば、第１または第２の態様の方法）で用いる薬物の製造における腫瘍選択的リガンドに共有結合した一酸化炭素放出基を含む複合体の使用が提供される。
【0011】
一酸化炭素放出基は、カルボニル金属錯体、たとえばモノ、ジ、トリ、テトラまたはペンタカルボニル金属錯体、たとえばモノ、ジ、トリ、テトラ、またはペンタカルボニルルテニウム錯体であってもよい。たとえば、一酸化炭素放出基は化学式Ｍ（ＣＯ）２の錯体であってもよい。ここで、Ｍは金属原子、たとえばＲｕ、Ｍｏ、またはＦｅである。いくつかの実施形態では、ＭはＲｕである。
【0012】
第１の～第４の態様のいくつかの実施形態では、腫瘍選択的リガンドは血清アルブミン、好ましくはヒト血清アルブミンである。
【0013】
第１の～第４の態様のいくつかの実施形態では、複合体は化学式リガンド－［金属（ＣＯ）ｎ１］ｎ２を有していてもよい。ここで、ｎ１は１～５であり、ｎ２は１～３０である。
【0014】
たとえば、複合体は化学式ＨＳＡ－［Ｒｕ（ＣＯ）２］ｎを有していてもよい。ここで、ＨＳＡはヒト血清アルブミンであり、ｎは１～１６である。
【0015】
第１の～第４の態様のいくつかの実施形態では、複合体は、一酸化炭素放出基をカプセル化するナノ粒子または微小粒子であり、腫瘍選択的リガンドはナノ粒子の表面に結合されている。
【0016】
第１の～第４の態様のいくつかの実施形態では、複合体をがん免疫療法（たとえば免疫チェックポイント阻害剤、たとえばＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ－４阻害剤である）と組み合わせて個体に投与してもよい。いくつかの実施形態では、複合体を細胞療法（たとえば、養子Ｔ細胞療法またはＣＡＲ－Ｔ療法）と組み合わせて個体に投与してもよい。さらに他の実施形態では、複合体を細胞傷害性化学療法と組み合わせて個体に投与する。
【0017】
本発明の他の態様及び実施形態について以下でより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】ａ及びｂは、（ａ）結合戦略の概略図、（ｂ）ネイティブｒＨＳＡ（リコンブミン）及びｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ（リコンブミン－Ｒｕ（ＣＯ）２）の質量スペクトルを示す図である。
【図2】ａ及びｂは、骨髄由来マクロファージ細胞（ＢＭＤＭ）及び結腸直腸がん細胞（ＣＴ２６）におけるＣＯ放出を示す図である。（ａ）ＣＯＰ－１の微視的画像及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＢＭＤＭ細胞内でＣＯＰ－１付与後、０、３０、及び６０分。（ｂ）（ａ）と同じだがＣＴ２６細胞内である。細胞は以前に、１μＭのｒＨＳＡ－ＣＯＲＭまたはｒＨＳＡ－ＤＭＳＯによって３０分間培養した。垂直方向の破線は、細胞へのＣＯＰ－１付加のタイミングを表す。
【図3】マウス内でのＣＯ生体内分布、及びｒＨＳＡ－ＣＯＲＭの静脈注射後の循環３０分間におけるカルボキシヘモグロビン（ＣＯ－Ｈｂ）レベルを示す図である。
【図4-1】ＣＯがＣＴ２６及びＭＣ３８腫瘍の生存期間を延ばし、腫瘍増殖を弱めることを示す図である。（ａ）実験の概略図。（ｂ）ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ処置（ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ、ｎ＝８）または対照処置（ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ、ｎ＝８）後のＣＴ２６（結腸癌）腫瘍の生存曲線及び腫瘍増殖。（ｃ）１３日目における腫瘍及び鼡径リンパ節（ｉＬＮ）。
【図4-2】ＣＯがＣＴ２６及びＭＣ３８腫瘍の生存期間を延ばし、腫瘍増殖を弱めることを示す図である。（ｄ）ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭまたは対照を伴う処置後のＭＣ３８細胞を伴う結腸がんモデルにおける腫瘍重量。プリズム８を用いて統計分析を行った。特に断らない限り、統計的検定に対して、Ｐ値が０．０５未満であるとき、有意であると考えられる。腫瘍増殖結果を有意である場合に（９５％信頼区間）、一元配置分散分析によって分析した。担癌マウスの生存期間の比較を、ログランクマンテルコックス検定（９５％信頼区間）を用いて行った。
【図5】ＣＯが免疫不全マウスにおける生存期間にも腫瘍増殖にも影響しないこと（適切で機能する免疫系なしで）を示す図である。毎日のｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ処置後のＮＳＧマウスの全生存期間及びＣＴ２６腫瘍体積を示す（ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ、ｎ＝６；ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ、ｎ＝６）。
【図6】ａは、ＣＯ処置されたマウスが、腫瘍浸潤Ｔ細胞における免疫チェックポイントマーカーＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１の発現の減少を示すことを示す。ｂは、ＴＮＦα及びＩＦＮγを発現する細胞の存在量の増加を示す。（ＣＯＲＭ、ｎ＝４；ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ、ｎ＝４）。
【図7-1】ａは、腫瘍内の異なるサイトカイン及びケモカインの産生にＣＯが影響することを示す図である。ＩＬ－２０の産生は、ＣＯ処置によって完全に抑止されているように見える。ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ処置（ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ、ｎ＝３；ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ、ｎ＝３）後の腫瘍におけるサイトカイン（左）及びケモカイン（右）のタンパク質定量化。
【図7-2】ｂは、担癌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＤ４及びＣＤ８枯渇後の腫瘍サイズを示す図である。ｃは、αＰＤ－１、αＣＴＬＡ－４、及びｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ間での併用療法による生存を示す図である（ｎ＝８）。
【図7-3】ｄは、ｃからの生存マウスにおけるＣＴ２６再チャレンジ（ナイーブ、ｎ＝８；ＩＣＢ、ｎ＝１；ＣＯＭＢＯ、ｎ＝４）の概略図及び腫瘍増殖曲線を示す図である。
【図8】ＣＯ処置によって腫瘍における単球及びＴＡＭの存在量が減ることを示す図である（ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ、ｎ＝４；ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ、ｎ＝４）。
【図9-1】マクロファージの枯渇がＣＴ２６腫瘍におけるＣＯ処置の効果を模倣することを示す図である（ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ、ｎ＝４；ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ、ｎ＝４；ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ＋Ｃｌｏｄ Ｌｉｐ、ｎ＝４；ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ＋Ｃｌｏｄ Ｌｉｐ、ｎ＝４）。概略図（ａ）、腫瘍体積（ｂ）、マクロファージ枯渇を示すフローサイトメトリープロット（ｃ）、ＤＣ及びＴＡＭレベル（ｄ）を示す。（ｅ）は、マクロファージにおけるＫｉ－６７発現とＩＬ－２０の産生とを示す。
【図9-2】マクロファージの枯渇がＣＴ２６腫瘍におけるＣＯ処置の効果を模倣することを示す図である（ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ、ｎ＝４；ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ、ｎ＝４；ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ＋Ｃｌｏｄ Ｌｉｐ、ｎ＝４；ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ＋Ｃｌｏｄ Ｌｉｐ、ｎ＝４）。（ｅ）は、マクロファージにおけるＫｉ－６７発現とＩＬ－２０の産生とを示す。
【図10】ａ～ｈは、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ処置が骨髄由来マクロファージの生存能力及び分極に影響を与えることを示す図である。（ａ）実験の概略図。（ｂ）単球マクロファージ分化の２日目及び６日目におけるＢＭＤＭのＦＡＣＳプロット（ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ、ｎ＝３；ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ、ｎ＝３）。（ｃ）マクロファージ分化後の細胞の絶対数（６日目）。（ｄ）（ｂ）から得られた単球（Ｍｏｎｏ）、移行単球（Ｍｏｎｏ／Ｍφ）、及びマクロファージ（Ｍφ）の相対存在量。（ｅ）分化の２日目及び６日目におけるマクロファージのＫｉ－６７染色。（ｆ）分化の２日目及び６日目におけるマクロファージ内の生存染色及びアネキシンＶ。（ｇ）ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭまたはｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ（ＣＴＲＬ）条件での分極後のＢＭＤＭの細胞生存能力。（ｈ）それらの個々の特定マーカーによる各分極状態のＦＡＣＳプロット。
【図11】ａ、ｂは、細胞生存能力は単球からマクロファージへの移行中に影響を受け、マクロファージ分化後ではないことを示す図であり、その理由は、細胞は移行後ではなく移行中に複合体がある場合にのみ死ぬためであることを示す図である。
【図12】ａ～ｃは、種々の組織に対するｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ及びｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ処置したマウスに対する毒性学の結果を示す図である。ｄは、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭは転移を刺激しなかったことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明は、ＣＯ放出複合体が、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１発現を下方制御し、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）のレベルを下げることによって、腫瘍における免疫抑制を軽減するという発見に部分的に基づいている。したがって、腫瘍選択的ＣＯＲＭ（たとえば、ＣＯＲＭ複合体）は、がん（たとえば、免疫抑制癌）の処置において（任意選択で、他のがん免疫療法とともに）有用であり得る。
【0020】
本明細書で説明するＣＯ放出複合体は、腫瘍選択的リガンドに結合された一酸化炭素放出基を含む。
【0021】
一酸化炭素放出基は、インビボ投与後に一酸化炭素（ＣＯ）を放出することができる化学部分である。
【0022】
いくつかの実施形態では、一酸化炭素放出基は、たとえば、共有結合または他の結合によって、金属原子などの別の原子に配位結合されるかまたは化学的に結合された１つ以上のＣＯ基を含んでいてもよい。投与後に、他の原子へのＣＯ基の結合が破壊されて、ＣＯ基が放出される。たとえば、一酸化炭素放出基を含む複合体を水溶液に入れたときに、ＣＯが自発的に放出されてもよい。複合体によるＣＯの放出によって、個体中の腫瘍の部位におけるＣＯのレベルが増加して、本明細書で説明するように免疫調節効果を及ぼす。
【0023】
好適なＣＯ放出基としては、１つ以上のＣＯ部分が金属原子に配位結合された金属カルボニル錯体が挙げられる。好適な金属カルボニル錯体としては、モノ、ジ、トリ、テトラ、またはペンタカルボニル金属錯体が挙げられる。たとえば、化学式Ｍ（ＣＯ）ｎ１の錯体。ここで、Ｍは金属原子であり、ｎ１は１、２、３、４、または５、好ましくは２または３である。
【0024】
好適な金属としては、鉄、モリブデン、コバルト、レニウム、及びルテニウムを挙げてもよい。
【0025】
いくつかの実施形態では、金属はルテニウムである。たとえば、ＣＯ放出基は、化学式ＲｕＩＩ（ＣＯ）２のルテニウムジカルボニル基であってもよい。
【0026】
典型的なＣＯ放出基及び分子は、米国特許第７，９６４，２２０号、米国特許第９，０２３，４０２号、米国特許第９，０６２，０８９号、及び米国特許第９，１６３，０４４号に開示されている。これらは、その全体において参照により本明細書に組み込まれている。
【0027】
他の好ましい実施形態では、たとえば、ＵＳ９，１６３，０４４に記載されるように、ＣＯ放出基としてはモリブデン金属原子が挙げられる。このような実施形態では、ＣＯ放出基には、Ｍｏ金属原子から放出可能な３つのＣＯ部分が含まれる。
【0028】
本明細書で説明するＣＯ放出複合体では、腫瘍選択的リガンドは、ＣＯ放出基またはＣＯ放出基を含む粒子に直接または間接的に結合されている。腫瘍選択的リガンドは、インビボで投与されたときに腫瘍内に選択的に蓄積するかまたはＣＯ放出基（複数可）を蓄積させる分子である。すなわち、がんを伴う個体に投与後の腫瘍選択的リガンドの濃度は、個体の非腫瘍組織と比べて腫瘍組織内の方が大きい。
【0029】
いくつかの実施形態では、複合体は化学式リガンド－［金属（ＣＯ）ｎ１］ｎ２を有し、ここでｎ１は１～５であり、ｎ２は１～３０である。
【0030】
腫瘍選択的リガンドによって、ＣＯ放出複合体は個体内の腫瘍組織を選択的に標的とするかまたは腫瘍組織内に蓄積することができる。腫瘍選択的リガンドは循環において安定である。さらに、複合体の腫瘍選択的リガンドは腫瘍組織内に選択的に蓄積する。すなわち、非腫瘍組織と比べて腫瘍組織内での濃度の増加を示す。腫瘍組織内に腫瘍選択的リガンドが蓄積すると、ＣＯＲＭは、非腫瘍組織（すなわち、腫瘍選択的リガンドが蓄積しない非癌組織）と比べて腫瘍組織内で選択的に作用して、たとえば、腫瘍組織内でＣＯを放出し、免疫調節効果（たとえば、抗免疫抑制効果）を及ぼすことができる。このように、ＣＯ放出は腫瘍組織を標的とし、ＣＯ－Ｈｂの基底レベルを著しく変化させることはしない。
【0031】
腫瘍選択的リガンドは腫瘍にＣＯ放出基を標的とする。腫瘍選択的リガンドに結合されたＣＯ放出基は、非結合ＣＯ放出分子と比べて個体の腫瘍組織内での蓄積の増加を示し得る。すなわち、腫瘍選択的リガンドに結合されたＣＯ放出基の腫瘍組織内での濃度は、非結合ＣＯ放出分子と比べて増加し得る。これにより、腫瘍組織内でのＣＯ放出複合体によるＣＯの選択的な放出が可能になり、放出されたＣＯが腫瘍組織内に蓄積する。
【0032】
好適な腫瘍選択的リガンドとしては、ナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリマー（バイオポリマー、たとえばポリサッカライドまたは合成ポリマー、たとえばポリエチレングリコール）、アプタマー、または小分子が挙げられる。
【0033】
いくつかの好ましい実施形態では、腫瘍選択的リガンドは、好ましくは血漿タンパク質、好ましくはヒトの血漿タンパク質である。血漿タンパク質は血清中に見出されるタンパク質である。好適な血漿タンパク質としては、抗体、アルブミン、グロブリン、たとえばガンマグロブリン及びアルファ－２マクログロブリン、フィブリノゲン、リポタンパク質、トランスフェリン、制御因子、たとえばホルモン、及び凝固因子、たとえばプロトロンビンを挙げてもよい。他の腫瘍選択的リガンドとしては、大きな流体力学半径を提供して錯体の循環半減期を増加させ、腎臓ろ過を回避するアミノ酸配列が挙げられる。たとえば、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）（米国特許第８，３３４，２５７号を参照。この文献は参照により本明細書に組み込まれている）及び非構造化ポリマー、たとえば、ＵＳ７，８５５，２７９に記載されたもの（なおこの文献はその全体において参照により本明細書に組み込まれている）である。
【0034】
好ましくは、腫瘍選択的リガンドは血清アルブミンであってもよい。血清アルブミン（ＡＬＢ；遺伝子ＩＤ：２１３）は人血中で最も豊富なタンパク質である。血清アルブミンは、血漿の膠質浸透圧を調節して、血清中の広範囲の内因性分子に対する運搬体タンパク質として働く。血清アルブミンは、血管外漏出と新生児Ｆｃ受容体（ＦＣＲＮ）のターゲティングとに起因して及び／または血管透過性滞留性亢進（ＥＰＲ）効果に起因して、腫瘍組織内に蓄積する。放射性標識アルブミン誘導体の注射用量の２０％が２４時間後にラット皮下腫瘍内に蓄積することが以前に示されている。［６４］。したがって、いくつかの実施形態では、腫瘍選択的リガンドはヒト血清アルブミンである。ヒト血清アルブミンは、ＮＣＢＩデータベースエントリＮＰ＿０００４６８．１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の参照アミノ酸配列を有し得るか、またはこれらのうちのいずれか１つの変異体であり得て、ＮＭ＿０００４７７．７またはその変異体の参照ヌクレオチド配列によってエンコードされ得る。ヒト血清アルブミンは腫瘍微小環境への指向性を有する場合があり、薬物の血清半減期を増やす場合がある［１２］。
【0035】
いくつかの実施形態では、アルブミンアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１によって規定される参照アルブミン配列と、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。種々の実施形態では、アルブミンアミノ酸配列は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、たとえばヒトＦｃＲｎに結合する。アルブミンアミノ酸配列は野生型ＨＳＡの変異体であり得る（たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１によって表されるような）。種々の実施形態では、変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に関して、１から２０まで、または１から１０までのアミノ酸の欠失、置換、または挿入を有し得る。いくつかの実施形態では、アルブミンアミノ酸配列は任意の哺乳類アルブミンアミノ酸配列である。
【0036】
いくつかの実施形態では、アルブミンアミノ酸配列またはドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１によって表されるように、全長アルブミンの断片である。用語「断片」は、アルブミンとの関連で用いるときは、対応する非結合のＣＯ放出基または錯体と比べて、それが結合されるＣＯ放出基またはそれを含む錯体の半減期を延ばす全長アルブミンまたはその変異体の任意の断片を指す。キャリアとして機能するその能力を拡張するアルブミン配列に対する種々の変更が知られており、このような変更は本発明とともに用いることができる。アルブミンアミノ酸配列に対する典型的な変更は、ＵＳ８，７４８，３８０、ＵＳ１０，２３３，２２８、及びＵＳ１０，５０１，５２４に記載されている。これらの文献はそれぞれその全体において参照により本明細書に組み込まれている。
【0037】
参照アルブミン配列の変異体は、参照アミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有し得る。たとえば、本明細書で説明するタンパク質の変異体は、参照アミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を、参照アミノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0038】
配列同一性は一般に、アルゴリズムＧＡＰ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧＣＧ ｐａｃｋａｇｅ，Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＵＳＡ）を参照して規定される。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ&Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムを用いて、一致の数を最大にしギャップの数を最小限にする２つの完全な配列を並べる。全般的に、ギャップ生成ペナルティ＝１２及びギャップ延長ペナルティ＝４のデフォルトパラメータが用いられる。ＧＡＰを用いることが好ましい場合があるが、他のアルゴリズムを用いてもよい。たとえば、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ２１５：４０５～４１０の方法を用いる）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ８５：２４４４～２４４８の類似法を用いる）、または局地的相同性スミスウォーターマンアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１４７：１９５～１９７）、またはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）上記のプログラムＴＢＬＡＳＴＮ（全般的にデフォルトパラメータを用いる）である。詳細には、ｐｓｉ－ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いてもよい（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９７）２５３３８９～３４０２）。これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＰＡＳＴＡ、及びＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実施態様が利用可能であり、公表されたコンピュータソフトウェアを用いてもよい。たとえば、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ（Ｓｏｄｉｎｇ，Ｊ ２００５，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２１，９５１～９６０）、Ｔ－ｃｏｆｆｅｅ（Ｎｏｔｒｅｄａｍｅら２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ（２０００）３０２，２０５～２１７）、Ｋａｌｉｇｎ（Ｌａｓｓｍａｎｎ及びＳｏｎｎｈａｍｍｅｒ２００５，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，６（２９８））、Ｇｅｎｏｍｅｑｕｅｓｔ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ－ＩＴ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ ＭＡ ＵＳＡ）及びＭＡＦＦＴ（Ｋａｔｏｈ及びＳｔａｎｄｌｅｙ２０１３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，３０（４）７７２～７８０ソフトウェア。このようなソフトウェアを用いるとき、デフォルトパラメータ（たとえば、ギャップペナルティ及び延長ペナルティに対するもの）を用いることが好ましい。パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮｕｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９～３４０２（１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０（１９９０）に、それぞれ記載されている）である。
【0039】
配列比較を好ましくは、本明細書に記載した関連する配列の全長にわたって行う。
【0040】
好適な腫瘍選択的リガンドタンパク質（たとえば、ヒト血清アルブミン）を、標準的な組換え型技術を用いて生成してもよい。
【0041】
いくつかの実施形態では、腫瘍選択的リガンドは抗体、またはその抗原結合部分である。抗体分子は、抗体抗原結合部位を含むポリペプチドまたはタンパク質である。この用語は、天然または部分的もしくは全体的に合成的に生成されたかどうかにかかわらず、任意の免疫グロブリンを包含する。抗体分子は天然源からの精製によって単離または取得することができ、あるいは、遺伝子組換えによって、または化学合成によって得ることができ、非天然アミノ酸を含み得る。
【0042】
腫瘍選択的リガンドとして用いるのに適した抗体には、全抗体及びその断片が含まれていてもよい。全抗体の断片は、抗原を結合する機能を実行することができる。断片を結合する例は以下のとおりである。（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（ナノボディ（Ｎｂ）とも言われる）（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１，５４４～５４６；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２～５５４；Ｈｏｌｔら（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２１，４８４～４９０）（モノマーＶＨドメインまたはモノマーＶＬドメインのいずれかからなる）；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの結合されたＦａｂ断片を含む二価の断片（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、２つのドメインを結合させて抗原結合部位を形成するペプチドリンカーによって結合される（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３～４２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５，５８７９～５８８３）；（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖダイマ－（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、及び（ｉｘ）「ダイアボディ」、遺伝子融合によって構成される多価または多特異的断片（ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３ａ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０ ６４４４～６４４８）。
【0043】
Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｓｄＡｂ、及び他の抗体分子を、ジスルフィド架橋の組み込み（たとえば、ＶＨ及びＶＬドメインを結合する）によって安定させてもよい。（Ｒｅｉｔｅｒら（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９～１２４５）ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含むミニボディを形成してもよい（Ｈｕら（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５６（１３）：３０５５～６１）。断片を結合する他の例は、Ｆａｂ’（重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端にいくつかの残留物が付加されている点でＦａｂ断片とは異なり、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む）、及びＦａｂ’－ＳＨ（定常ドメインのシステイン残留物（複数可）が遊離チオール基を有する断片Ｆａｂ’）である。
【0044】
本明細書で説明する使用に適した抗体は、腫瘍抗原と特異的に結合してもよい。
【0045】
他の標的結合リガンド及び抗体ミメティックを腫瘍選択的リガンドとして用いてもよく、当該技術分野で知られている。これらには以下が含まれる。シングルドメイン抗体、組換え重鎖抗体（ＶＨＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、サメ重鎖抗体（ＶＮＡＲ）、マイクロプロテイン（たとえばシステインノットタンパク質、ノッチン）、ＤＡＲＰｉｎ、テトラネクチン、アフィボディ；トランスボディ、アンチカリン、アドネクチン、アフィリン、マイクロボディ、フィロマー、ストラドボディ、マキシボディ、エビボディ、フィノマー、アルマジロリピートタンパク質、クニッツドメイン、アビマー、アトリマー、プロボディ、免疫ボディ、トリオマブ、トロイボディ、ペップボディ、ワクチボディ、ユニボディ、及びデュオボディ。このようなリガンドは以下の参考文献に説明されている。米国特許または特許公報第ＵＳ７，４１７，１３０、ＵＳ２００４／１３２０９４、ＵＳ５，８３１，０１２、ＵＳ２００４／０２３３３４、ＵＳ７，２５０，２９７、ＵＳ６，８１８，４１８、ＵＳ２００４／２０９２４３、ＵＳ７，８３８，６２９、ＵＳ７，１８６，５２４、ＵＳ６，００４，７４６、ＵＳ５，４７５，０９６、ＵＳ２００４／１４６９３８、ＵＳ２００４／１５７２０９、ＵＳ６，９９４，９８２、ＵＳ６，７９４，１４４、ＵＳ２０１０／２３９６３３、ＵＳ７，８０３，９０７、ＵＳ２０１０／１１９４４６、及び／またはＵＳ７，１６６，６９７。なお、これらの文献の内容はその全体において参照により本明細書に組み込まれている。
【0046】
いくつかの実施形態では、腫瘍選択的リガンドはナノ粒子の表面に結合していてもよい。ナノ粒子はさらに、ＣＯ放出基をカプセル化（またはその表面に存在）していてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＯ放出基は生分解性ナノ材料に結合していてもよい。典型的なナノ粒子にはポリマーナノ粒子が含まれ、これにはＰＥＧによるブロックコポリマーが含まれていてもよい。たとえば、ＰＥＧ鎖の末端は、腫瘍選択的リガンド及び／またはＣＯ放出基に対する官能基結合を有していてもよい。典型的なポリマーナノ粒子形式には、ＷＯ２０１７／１００５９７及びＵＳ２０１８／０３３９０２４に記載されたものが含まれる。なおこれらの文献は、その全体において参照により本明細書に組み込まれている。典型的なナノ粒子としては以下を挙げてもよい。ポリマー、たとえばポリ（乳酸グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ベータアミノエステル）（ＰＢＡＥ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ－３ヒドロキシブチレート（Ｐ３ＨＢ）、及びポリ（ヒドロキシブチレート－コ－ヒドロキシバレレート）（それらの組み合わせを含む）、またＰＥＧによる前述のいずれかのブロックコポリマーが挙げられる。他の実施形態では、一酸化炭素放出基（複数可）は、無機材料に結合されるかまたは無機材料によってカプセル化される。ＣＯＲＭＳに対するナノ材料送達戦略について説明されている［６６］。
【0047】
１つ以上の抗原（すなわち、腫瘍抗原）の発現によって、個体中の正常な体細胞からがん細胞を区別し得る。個体中の正常な体細胞は、１つ以上の抗原を発現しない場合があるか、または異なる組織内で及び／または異なる発生段階において異なる方法（たとえば、より低いレベル）でそれらを発現する場合がある。したがって、腫瘍抗原を用いて、キメラペプチド交換タンパク質をがん細胞に特異的に標的化してもよい。がん細胞によって発現される好適な腫瘍抗原としては、たとえば、癌生殖細胞遺伝子によってエンコードされる癌精巣（ＣＴ）抗原を挙げてもよい。たとえば、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ゲージ－Ｉ、ゲージ－２、ゲージ－３、ゲージ－４、ゲージ－５、ゲージ－６、ゲージ－７、ゲージ－８、ＢＡＧＥ－Ｉ、ＲＡＧＥ－１、ＬＢ３３／ＭＵＭ－１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ－Ｘｐ２（ＭＡＧＥ－Ｂ２）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ３（ＭＡＧＥ－Ｂ３）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ４（ＭＡＧＥ－Ｂ４）、ＭＡＧＥ－Ｃ１／ＣＴ７、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＮＹ－ＥＳＯ－Ｉ、ＬＡＧＥ－Ｉ、ＳＳＸ－Ｉ、ＳＳＸ－２（ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０）、ＳＳＸ－３、ＳＳＸ－４、ＳＳＸ－５、ＳＣＰ－Ｉ、及びＸＡＧＥ、ならびにその免疫原性断片（Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ（２００５）５、６１５～６２５、Ｇｕｒｅら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００５）１１、８０５５～８０６２；Ｖｅｌａｚｑｕｅｚら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ（２００７）７、１１；Ａｎｄｒａｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ（２００８）８、２；Ｔｉｎｇｕｅｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）；Ｎａｐｏｌｅｔａｎｏら、Ａｍ Ｊ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎ（２００８）１９８、９９ｅ９１～９７）。
【0048】
いくつかの好ましい実施形態では、本明細書で説明する使用に適した抗体は、免疫チェックポイントタンパク質（たとえば、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ４）に特異的に結合してもよい。
【0049】
腫瘍選択的リガンドとしての使用に適した小分子には、小さな化学分子（たとえば、分子量が９００ダルトン以下の非ポリマー有機化合物）が含まれる。好ましい実施形態では、腫瘍選択的リガンドとしての使用に適した小分子は、分子量が９００ダルトン以下であってもよく、腫瘍組織内に選択的に蓄積してもよい。好適な小分子リガンドにはアセタゾラミドが含まれる。アセタゾラミドは、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）（腫瘍組織内で優先的に発現する）に選択的に結合する。
【0050】
いくつかの実施形態では、ＣＯ放出基は腫瘍選択的リガンドに結合している。結合は共有結合であってもよく、すなわち、ＣＯ放出基及び腫瘍選択的リガンドを共有結合（たとえば、付与共有結合または配位結合）によって直接結合してもよい。
【0051】
結合に対して任意の好適な化学反応を用いてもよい。
【0052】
いくつかの実施形態では、腫瘍選択的リガンド上に存在する基は、ＣＯ放出基に直接結合できてもよい。たとえば、腫瘍選択的リガンドがペプチドまたはタンパク質であるとき、腫瘍選択的リガンド上のアミノ酸残基が、ＣＯ放出複合体を形成するためにＣＯ放出基に直接結合してもよい。他の実施形態では、リンカーを用いてＣＯ放出基を腫瘍選択的リガンドに結合してもよく、それによって、リンカーはＣＯ放出基及び腫瘍選択的リガンドの両方と共有結合を形成して、ＣＯ放出複合体を形成する。
【0053】
いくつかの実施形態では、ＣＯ放出基は、ＣＯ放出分子（ＣＯＲＭ）を腫瘍選択的リガンドと反応させることによって、腫瘍選択的リガンドに結合してもよい。ＣＯＲＭには、ＣＯ放出基（たとえば、金属カルボニル錯体）が含まれていてもよい。ＣＯ放出分子（ＣＯＲＭ）の金属原子を腫瘍選択的リガンドと反応させることによって、ＣＯＲＭのＣＯ放出基をリガンドに結合してもよい。たとえば、金属原子は、腫瘍選択的リガンドのアミノ酸残基（たとえば、腫瘍選択的リガンドタンパク質におけるヒスチジン、システイン、リシン、またはメチオニン残基）と共有結合を形成してもよい。
【0054】
いくつかの実施形態では、金属化反応を用いてもよい。腫瘍選択的リガンドをＣＯ放出分子（ＣＯＲＭ）の金属原子によって金属化することによって、ＣＯＲＭのＣＯ放出基をリガンドに結合してもよい。金属化反応は、金属原子と腫瘍選択的リガンド上のヒスチジン残基との間であってもよい。たとえば、金属原子がヒスチジン残基のイミダゾール基と共有結合を形成して、ＣＯ放出基をリガンドに結合してもよい。
【0055】
金属原子は遷移金属であってもよい。いくつかの実施形態では、金属化反応は、ルテニウムカルボニル錯体（たとえば、Ｒｕ（ＣＯ）２錯体）を含むＣＯＲＭのルテニウム原子と、腫瘍選択的リガンドタンパク質上に存在するヒスチジンとの間である。好適なＣＯＲＭにはＣＯＲＭ－３が含まれる。たとえば、ルテニウムカルボニル錯体を含むＣＯＲＭのルテニウム原子は、ヒト血清アルブミン内の１つ以上のヒスチジン残基と共有結合してもよい。好ましくは、金属化反応は、［ＲｕＣｌ（κ２－Ｈ２ＮＣＨ２ＣＯ２）（ＣＯ）３］錯体（すなわちＣＯＲＭ－３）とヒト血清アルブミン上に存在するヒスチジンとの間である。
【0056】
他の実施形態では、リンカーを用いて、ＣＯ放出基を腫瘍選択的リガンドに結合する。
【0057】
たとえば、ＣＯ放出分子は、金属カルボニル錯体であるＣＯ放出基を含んでいてもよく、リンカーは、金属カルボニル錯体を配位結合するのに適した第１の反応性部分と、腫瘍選択的リガンドと共有結合を形成するのに適した第２の反応性部分とを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、リンカーはＰＥＧリンカーである。
【0058】
第１の反応性部分は、たとえば、金属リガンド（たとえば、モノ－、トリ、またはテトラデンテート金属リガンド）であってもよい。
【0059】
いくつかの実施形態では、第２の反応性部分は、たとえば、腫瘍選択的リガンド上のチオール基との結合（すなわち、チオール結合）に適したチオール反応性部分であってもよい。チオール反応性部分は、チオール基との共有結合を形成するのに適した任意の基であってもよく、このような基には、ハロアセチル基、マレイミド、アジリジン、カルボニルアクリル基、ハロピリダジンジオン、ビニルスルホン、ジスルフィド、及びチオールが含まれる。これらの実施形態のうちのいくつかでは、腫瘍選択的リガンドはタンパク質であり、チオール基はアミノ酸残基（たとえば、システイン）である。
【0060】
他の実施形態では、第２の反応性部分は、腫瘍選択的リガンド上のクリックハンドルとのクリック反応を受けるのに適したクリック反応性部分であってもよい。クリック反応性部分は、腫瘍選択的リガンド上の対応するクリックハンドルとのクリック反応を受けるのに適した任意の基であってもよい。好適なクリック反応の組み合わせとしては、以下が挙げられる。銅（Ｉ）触媒によるアジドアルキン付加環化反応（ＣｕＡＡＣ）；歪み促進型アジドアルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）；歪み促進型アルキンニトロン付加環化（ＳＰＡＮＣ）；アルケン及びアジド［３＋２］付加環化；及びアルケンテトラジン逆電子要求ディールスアルダー。これらの実施形態のうちのいくつかでは、腫瘍選択的リガンドはタンパク質であり、これらの実施形態では、好適なクリックハンドルにはアジド及びアルキン（歪みアルキン及び線形アルキンを含む）が含まれる。このような好適なクリックハンドルを、突然変異誘発によって（たとえば、クリックハンドルを含む非天然アミノ酸残基の導入によって）腫瘍選択的リガンドタンパク質に導入してもよい。アミノ酸を含む典型的なクリックハンドルとしては、アジドアラニン、アジドフェニルアラニン、プロパルギルグリシン、プロパルギルアラニン、プロピニルプロリンが挙げられる。代替的に、クリックハンドルを含む基を、腫瘍選択的リガンドタンパク質上のアミノ酸に結合してもよい。
【0061】
いくつかの実施形態では、リンカーを最初にＣＯＲＭに配位結合し、そして、配位結合されたＣＯＲＭを腫瘍選択的リガンドに（たとえば、チオール結合またはクリック反応によって）結合する。他の実施形態では、リンカーを最初に腫瘍選択的リガンドに（たとえば、チオール結合またはクリック反応によって）結合し、そして、ＣＯＲＭをリンカー腫瘍選択的リガンド複合体によって配位結合する。
【0062】
いくつかの実施形態では、ＣＯ放出複合体には複数のＣＯ放出基が含まれていてもよい。たとえば、ＣＯ放出複合体には、２～約２０のＣＯ放出基、たとえば約５～約２０、または約１０～約２０、または約２～約１０、または約２～約５のＣＯ放出基が含まれていてもよい。ＣＯ放出複合体には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれ以上のＣＯ放出基が含まれていてもよい。
【0063】
ＣＯ放出基を同じ腫瘍選択的リガンドに結合してもよい。たとえば、２つ以上のＣＯ放出基を腫瘍選択的リガンドに結合してもよい。
【0064】
いくつかの実施形態では、ＣＯ放出複合体には、ヒト血清アルブミンであって、その１つ以上のヒスチジン残基にＣＯ放出基が結合されたヒト血清アルブミンが含まれていてもよい。たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、またはそれ以上のＣＯ放出基が、たとえば付与共有結合によって、ヒト血清アルブミンのヒスチジン残基に結合していてもよい。いくつかの実施形態では、８～約１６のＣＯ放出基がヒト血清アルブミンに結合されている。
【0065】
本明細書で説明するＣＯ放出複合体を、任意の好都合な方法によって生成してもよい。当該技術分野において好適な方法が利用可能である（たとえば［１１］を参照）。たとえば、ＣＯ放出複合体を、ヒト血清アルブミンを二酸化炭素放出分子（ＣＯＲＭ）と反応させることによって生成してもよい。ＣＯＲＭの例としては、遷移金属ＣＯＲＭ、光ＣＯＲＭ、酵素トリガー（ＥＴ）ＣＯＲＭ、及び有機ＣＯＲＭが挙げられる。遷移金属ＣＯＲＭは、主に鉄、モリブデン、ルテニウム、コバルト、及びレニウム上に基づく遷移金属錯体である。Ｒｕ（グリシネート）Ｃｌ（ＣＯ）３（ＣＯＲＭ３）は、遷移金属ＣＯＲＭの例である。
【0066】
たとえば、ＣＯ放出複合体を、ヒト血清アルブミンをＣＯＲＭと反応させることによって生成してもよい。好ましい実施形態では、ＣＯ放出複合体を、ヒト血清アルブミンをＲｕ（グリシネート）Ｃｌ（ＣＯ）３（ＣＯＲＭ３）と反応させて生成して、ヒト血清アルブミンの１つ以上のヒスチジン残基がルテニウムジカルボニル基によって金属化されるようにしてもよい。
【0067】
好適な反応条件が、当該技術分野において良く知られており、たとえば、ヒト血清アルブミンを、生理的ｐＨ（たとえば、ｐＨ７．４）のＰＢＳ中で約１時間、室温で約５０当量のＣＯＲＭ－３によって処置することである。
【0068】
本明細書で説明するＣＯ放出複合体を単独で個体に投与することは可能であるが、化合物を医薬組成物または製剤で示すことが好ましい。医薬組成物としては、本明細書で説明するＣＯ放出複合体に加えて、１つ以上の薬学的に許容されるキャリア、補助剤、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、安定剤、保存料、潤滑剤、または当業者に良く知られた他の材料を挙げてもよい。このような材料は、無毒でなければならず、活性化合物の有効性を妨げてはならない。キャリアまたは他の材料の正確な性質は、投与経路（後述するように、ボーラス、浸出、注射または任意の他の好適な経路による場合がある）に依存する。好適な材料は無菌でパイロジェンフリーであり、好適な等張性及び安定性を伴っている。例としては、無菌生理食塩水（たとえば０．９％ＮａＣｌ）、水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、またはそれらの組み合わせが挙げられる。組成にはさらに、補助物質（たとえば、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤など）が含まれていてもよい。
【0069】
好適なキャリア、添加剤などを、標準的な医薬品テキスト（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、１９９０）に見出すことができる。
【0070】
用語「薬学的に許容される」は、本明細書で用いる場合、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく対象者（たとえば、ヒト）の組織と接触して使用するのに適しており、妥当な利益／リスク比と見合っている化合物、材料、組成、及び／または剤形に関する。また各キャリア、添加剤などは、製剤の他の成分と共存できるという意味で「許容可能」でなければならない。
【0071】
製剤は単位剤形で示し得るため好都合であり、薬学の技術分野で良く知られた任意の方法によって調製してもよい。このような方法には、活性化合物を、１つ以上の副成分を構成するキャリアと会合させるステップが含まれる。全般的に、製剤は、活性化合物を、液体キャリアもしくは微粉固体キャリアまたは両方と均一かつ緊密に会合させ、そして必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【0072】
製剤は、液体、溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル剤、シロップ剤、錠剤、薬用ドロップ、粒剤、粉末、カプ細胞、カシェ剤、ピル、アンプル、座薬、ペッサリー、軟膏、ゲル、ペースト、クリーム、スプレー、ミスト、発泡体、ローション、オイル、ボーラス、舐剤、またはエアロゾルの形態であってもよい。
【0073】
本明細書で説明するＣＯ放出複合体、またはＣＯ放出複合体を含む医薬組成物を、全身／末梢または非経口を含む所望の作用の部位かどうかの任意の好都合な投与経路によって、たとえば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、腫瘍内、心臓内、髄腔内、脊髄内の、嚢内、被膜下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、クモ膜下、及び胸骨内を含む注射によって、デポーのインプラントによって、たとえば、皮下または筋肉内で、対象者に投与してもよい。投与は好ましくは、静脈内、または所望の作用の部位において（たとえば、腫瘍内の注射）である。多くの適応症（たとえば、結腸直腸癌）に対して静脈内が好ましいが、いくつかの適応症（たとえば、膠芽腫または膀胱癌）に対しては、所望の作用の部位での投与が好ましい場合がある。
【0074】
本明細書で説明する化合物を含む医薬組成物は、意図する投与経路に適した投与単位処方で処方してもよい。
【0075】
非経口的投与（たとえば、皮膚、皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内などの注射による）に適した製剤には、以下が含まれる。抗酸化剤、緩衝剤、保存料、安定剤、静菌薬、及び溶質であって、製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水溶性及び非水性の等張、パイロジェンフリー、無菌注射液；ならびに懸濁化剤及び増粘剤、及びリポソームまたは他の微粒子系であって、化合物を血液成分または１つ以上の臓器に標的化するようにデザインされたものを含み得る水溶性及び非水性無菌懸濁液。このような製剤内で用いるための好適な等張溶媒の例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル溶液、または乳酸リンゲル注射液が挙げられる。通常は、溶液中の活性化合物の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０ｇ／ｍｌ、たとえば、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１ｇ／ｍｌである。製剤は、単位用量または複数用量の密閉容器（たとえば、アンプル及びバイアル瓶）で与えてもよく、使用直前に無菌液体キャリア（たとえば、注射用水）を加えるだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存してもよい。即席の注射液及び懸濁液を滅菌粉末、粒剤、及び錠剤から調製してもよい。製剤は、活性化合物をマクロファージまたは脂肪組織に標的化するようにデザインされるリポソームまたは他の微粒子系の形態であってもよい。
【0076】
任意選択で、他の治療薬または予防薬が医薬組成物または製剤内に含まれていてもよい。
【0077】
本明細書で説明するＣＯ放出複合体は、たとえば、腫瘍組織における免疫チェックポイントタンパク質の発現及び／または腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の量を低減することによって、腫瘍組織における免疫抑制を減少させるのに有用であり得る。たとえば、ＣＯ放出複合体は、免疫抑制癌の処置及び／またはがん免疫療法の増強に有用であり得る。
【0078】
がんは悪性がん細胞の異常増殖を特徴とする。免疫抑制癌は、個体の免疫系が腫瘍組織内で、すなわち腫瘍及びその微小環境内（たとえば、血液及びリンパ管、細胞外マトリックス、宿主細胞、たとえば線維芽細胞、神経内分泌（ＮＥ）細胞、脂肪細胞、及び免疫炎症細胞、ならびに腫瘍を囲む分泌因子）で抑制されるがんである。この免疫抑制は、がん細胞に対する宿主の免疫応答を減らすかまたは阻止する。
【0079】
免疫抑制癌は、腫瘍内でのがん細胞に対する免疫応答を抑制するか、減らすか、または阻止する腫瘍を特徴とし得る。たとえば、腫瘍の微小環境は免疫抑制及びＴ細胞抑制タンパク質である場合があり、及び／または免疫応答を抑制するＴ細胞抑制細胞が腫瘍微小環境内に存在する場合がある。
【0080】
いくつかの実施形態では、腫瘍による免疫応答の抑制はＴ細胞の阻害に起因する場合があり、すなわち腫瘍及び／またはその微小環境内のＴ細胞が活性の低下を示す場合がある。
【0081】
Ｔ細胞の阻害は、１つ以上の免疫チェックポイントタンパク質（たとえば、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４）によって媒介される場合がある。免疫チェックポイントタンパク質は免疫系の制御因子であり、自己免疫寛容（免疫系が細胞を無差別に攻撃するのを防ぐ）に対して不可欠である。しかし、悪性細胞による免疫チェックポイントタンパク質の発現によって、抗腫瘍免疫が調節不全になり、がん細胞の増殖及び拡大が促進される［１３］。
【0082】
免疫抑制癌は、免疫チェックポイントタンパク質の発現、または非がん細胞と比べて免疫チェックポイントタンパク質の発現または活性のレベルの増加を特徴とし得る。チェックポイントタンパク質の発現レベルまたは活性は、当該技術分野で知られている良く知られた方法（たとえば、質量分析法、フローサイトメトリー、ｑＰＣＲ、及びＲＮＡシーケンシング）によって決定され得る。
【0083】
免疫チェックポイントタンパク質にはＰＤ－１が含まれ得る。プログラム細胞死タンパク質１（遺伝子ＩＤ５１３３；ＰＤ－１またはＣＤ２７９（分化２７９のクラスタ）としても知られる）は、Ｔ細胞の表面上に見られるＴ細胞抑制タンパク質である。ＰＤ－１の役割は、免疫系を下方制御することによって免疫系の応答を調整し、Ｔ細胞活性を抑制することによって自己免疫寛容を促進することである。しかし、これは免疫系ががん細胞を死滅させることを妨げる場合がある。ＰＤ－１は、ＮＣＢＩデータベースエントリＮＰ＿００５００９．２の参照アミノ酸配列を有する場合があり、ＮＣＢＩデータベースエントリＮＭ＿００５０１８．３の参照ヌクレオチド配列によってエンコードされる場合がある。
【0084】
Ｔ細胞上のＰＤ－１と、免疫抑制腫瘍のがん細胞上（ならびに樹状細胞及びマクロファージ上）のそのリガンドＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との相互作用によって、Ｔ細胞の活性を抑制する可能性があり、がん細胞が宿主免疫応答を回避することを可能にする可能性がある。本明細書で説明するＣＯ放出複合体を用いてＴ細胞上のＰＤ－１の発現を減少させることによって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２相互作用を減少させるかまたは抑制する場合があり、その結果、がん細胞による宿主免疫系の回避を防ぐかまたは減少させる場合がある。
【0085】
必要に応じて、ＰＤ－１定量化を、任意の好都合な方法（たとえば、ＡＲＩＯＬシステムを用いる、各単離されたＴ細胞または腫瘍細胞に対するピクセルあたりの平均蛍光強度の免疫蛍光検出［６１］）によって、フローサイトメトリーによって、またはウェスタンブロットによって行ってもよい。
【0086】
免疫チェックポイントタンパク質にはＣＴＬＡ－４が含まれ得る。細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（遺伝子ＩＤ番号：１４９３；ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ－４、またはＣＤ１５２（分化１５２のクラスタ）としても知られる）は、免疫チェックポイントとして機能し免疫応答を下方制御するＴ細胞抑制タンパク質である。ＣＴＬＡ－４は制御性Ｔ細胞内で構成的に発現され、活性化後に従来のＴ細胞内で上方制御される。がん（たとえば、免疫抑制癌）内でのＣＴＬＡ－４の上方制御によって、免疫系ががん細胞を死滅させることが妨げられ得る。ＣＴＬＡ－４は、ＮＣＢＩデータベースエントリＮＰ＿００５２０５．２の参照アミノ酸配列を有する場合があり、ＮＣＢＩデータベースエントリＮＭ＿００５２１４．５の参照ヌクレオチド配列によってエンコードされる場合がある。
【0087】
Ｔ細胞上のＣＴＬＡ－４とがん細胞上のそのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６との相互作用によって、Ｔ細胞活性の阻害が生じ、がん細胞が宿主免疫応答を回避する場合がある。本明細書で説明するＣＯ放出複合体を用いてＴ細胞上のＣＴＬＡ－４の発現を減少させることによって、ＣＴＬＡ－４／リガンド相互作用を減少させるかまたは妨げる場合があり、その結果、Ｔ細胞の阻害及びがん細胞による宿主免疫系の回避を防ぐかまたは減少させる場合がある。
【0088】
必要に応じて、ＣＴＬＡ－４定量化を、任意の好都合な方法（たとえば、ＡＲＩＯＬシステムを用いる、各単離されたＴ細胞または腫瘍細胞に対するピクセルあたりの平均蛍光強度の免疫蛍光検出［６１］）によって、フローサイトメトリーによって、またはウェスタンブロットによって行ってもよい。
【0089】
他の実施形態では、免疫抑制癌は、Ｔ細胞抑制細胞（たとえば、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及び／またはＴＡＭ前駆体）の存在、または非がん細胞と比べてＴＡＭ及び／またはＴＡＭ前駆体の数の増加を特徴とし得る。
【0090】
腫瘍微小環境におけるＴ細胞抑制細胞（たとえば、制御性Ｔ細胞、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、及びそれらの前駆体）の存在は、Ｔ細胞阻害及び免疫抑制を引き起こすかまたはこれらに寄与する場合がある。たとえば、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は腫瘍微小環境に住み、一般にＭ２マクロファージ様表現型を示す。ＴＡＭは、抗腫瘍免疫応答を抑制し、制御性Ｔ細胞の持続的な蓄積及び脈管構造の調節不全（ケモカイン及びアミノ酸分解酵素（たとえば、アルギナーゼ１及びインドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ））の発現に起因する）［１３］などの機能を伴う腫瘍発生を促進する。個体中の腫瘍の微小環境におけるＴＡＭの蓄積は、がん治療への耐性及び臨床予後不良に関連している。
【0091】
個体中の腫瘍の微小環境におけるＴＡＭの蓄積は、Ｔ細胞活性の阻害及び腫瘍に対する免疫応答の抑制に至る場合がある。本明細書で説明するＣＯ放出複合体を用いて腫瘍の微小環境におけるＴＡＭＳの量を減少させることによって、Ｔ細胞の阻害及びがん細胞による宿主免疫系の回避を妨げるかまたは減らす場合がある。
【0092】
免疫抑制癌は任意のがんタイプであってもよい。たとえば、固形癌、たとえば、肉腫、癌、及びリンパ腫、たとえば、皮膚癌、黒色腫、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮癌、口腔癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、食道癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、胃癌、精巣癌、胆嚢及び胆道の癌、甲状腺癌、胸腺癌、及び骨肉腫である。
【0093】
免疫抑制癌には、以下のうちのいずれか１つ以上を含めることができる。急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、血液癌、骨肉腫、脳腫瘍、乳癌、女性生殖器系の癌、男性生殖器系の癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児横紋筋肉腫、小児肉腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸及び直腸癌、結腸癌、子宮内膜癌、子宮内膜肉腫、食道癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌、胃腸管癌、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、下咽頭癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、白血病、白血病、肝臓癌、肺癌、悪性繊維性組織球腫、悪性胸腺腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経系癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺の癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、前立腺癌、直腸癌、呼吸器系、網膜芽細胞腫、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、胃癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、泌尿器系癌、子宮肉腫、膣癌、血管系、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍。
【0094】
がんは特定のタイプであってもよい。がんのタイプの例としては以下が挙げられる。星状細胞腫、がん（たとえば腺癌、肝細胞癌、髄様癌、乳頭状癌、扁平上皮細胞癌）、神経膠腫、リンパ腫、髄芽細胞腫、黒色腫、骨髄腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、肉腫（たとえば血管肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫）。
【0095】
いくつかの実施形態では、がんは原発腫瘍であるかまたは転移性がんである。「転移」は、がんが身体内の原発部位から他の場所へ広がることをを指す。がん細胞は、原発腫瘍から離れて、リンパ管及び血管内に侵入し、血流を通って循環して、身体中の他の場所にある正常組織内の離れた病巣において増殖する（転移する）ことができる。転移は局所的または遠隔的である可能性がある。種々の実施形態では、原発性または転移性がんは、黒色腫、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、尿路上皮癌、胃癌、頭頸部癌、膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、膀胱癌、及び前立腺癌（たとえば、ホルモン抵抗性）である。いくつかの実施形態では、がんは進行性、局所進行性、または転移性がんである。いくつかの実施形態では、がんは転移性黒色腫であり、再発性であり得る。いくつかの実施形態では、転移性黒色腫はステージＩＩＩまたはＩＶである。転移は局所または遠隔であり得る。
【0096】
いくつかの実施形態では、免疫抑制癌は、免疫チェックポイント阻害剤による処置に対する承認を受けたがんタイプ、たとえばＣＴＬＡ－４阻害剤及び／またはＰＤ－１阻害剤による処置に対する承認を受けたがんタイプであってもよい（たとえば、［２０］～［６０］を参照）。いくつかの好ましい実施形態では、免疫抑制癌としては、黒色腫、扁平上皮細胞癌、結腸直腸癌、肺癌、たとえば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、及び尿路上皮癌を挙げてもよい。
【0097】
免疫抑制腫瘍は、腫瘍遺伝子変位量（ＴＭＢ）の増加（［５２～５５］）及び／または他のがんと比べた腫瘍浸潤リンパ球（［５６、５７］）の数の増加を特徴とし得る。
【0098】
免疫抑制癌は、標準的な診断基準を用いる個体において特定し得る。このような臨床基準の例は、医学の教科書（たとえば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５版、Ｆａｕｃｉ ＡＳら編集、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）において見ることができる。
【0099】
用語「処置」は、状態を処置するという文脈で本明細書で用いる場合、全般的に、何らかの所望の治療効果（たとえば、状態の進行の抑制）が実現される処置及び療法に関し、進行速度の低下、進行速度の停止及び状態の回復、ならびに状態の治癒を含む。種々の実施形態では、処置は、全生存期間の増加、無憎悪生存期間の増加、または安定した疾患もしくは腫瘍退縮、または無がんの指定となる可能性がある。
【0100】
個体は、免疫抑制癌を有すると以前に特定されているか、または免疫抑制癌を発症するリスクがある場合がある。他の実施形態では、方法は、患者が投与前に免疫抑制癌を有するかまたは発症するリスクがあると特定することを含み得る。
【0101】
前述した処置に適した個体は、哺乳動物、たとえば、げっ歯動物（たとえば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科（たとえば、マウス）、イヌ科動物（たとえば、犬）、ネコ科動物（たとえば猫）、ウマ（たとえば馬）、霊長類、サル（たとえば、モンキーまたはエイプ）、モンキー（たとえば、マーモセット、ヒヒ）、エイプ（たとえば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）、またはヒトであってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、個体はヒトである。他の好ましい実施形態では、非ヒト哺乳動物、特に、ヒト（たとえば、マウス、霊長類、ブタ、イヌ科動物、またはウサギ科の動物）における治療有効性を実証するためのモデルとして従来、用いられている哺乳動物を用いてもよい。
【0102】
処置はヒトであれ動物であれ（たとえば、獣医応用における）、何らかの所望の治療効果が実現される任意の処置及び療法であってもよい。所望の処置効果は、たとえば、状態の進行の抑制または遅延であり、たとえば、進行速度の低下、進行速度の停止、状態の回復、状態の治癒または寛解（部分的であれ全体であれ）、状態の１つ以上の症状及び／もしくは徴候の予防、遅延、軽減、もしくは停止、または処置がない場合に予想されるもの以上に対象者または患者の生存期間を延長することである。
【0103】
予防措置としての処置（すなわち、予防法）も含まれる。たとえば、免疫抑制癌の発生または再発を受けやすいかまたはそのリスクがある個体を、本明細書で説明するように処置してもよい。このような処置によって、個体中のがんの発生または再発を防ぐかまたは遅らせる場合がある。詳細には、処置には、がん増殖の抑制（完全ながんの寛解を含む）及び／またはがんの転移の抑制が含まれ得る。がん増殖は全般的に、より発達した形態へのがん内の変化を示す多くの指標のいずれか１つを指す。したがって、がん増殖の抑制を測定するための指標には、がん細胞生存の低下、腫瘍体積またはモルフォロジーの減少（たとえば、コンピュータトモグラフィ（ＣＴ）、超音波検査、または他の画像化法を用いて決定される）、腫瘍増殖の遅延、腫瘍血管系の破壊、遅延型過敏皮膚試験の性能向上、がん細胞の細胞溶解活性の増加、及び腫瘍特異的抗原のレベルの低下が含まれる。
【0104】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する処置に適した個体は、最初のがん処置の後に微小残存病変（ＭＲＤ）を有し得る。
【0105】
本明細書で説明するＣＯ放出複合体を、治療有効量で、本明細書で説明するように投与してもよい。用語「治療有効量」は、本明細書で用いる場合、活性化合物、または活性化合物を含む組み合わせ、材料、組成、または剤形の量であって、何らかの所望の治療効果を生成するのに効果的であり、妥当な利益／リスク比と見合っている量に関する。
【0106】
本明細書で説明するＣＯ放出複合体の適切な用量は個体ごとに変わり得る。最適用量を決定することには全般的に、投与の任意のリスクまたは有害な副作用に対する治療効果のレベルのバランシングが伴う。選択した用量レベルは、種々の要因に依存する。たとえば、限定することなく、投与経路、投与の時間、活性化合物、組み合わせて用いる他の薬物、化合物、及び／または材料の排泄速度、ならびに個体の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、及び既往歴である。活性化合物の量及び投与経路は最終的には医師の裁量であるが、全般的に、用量は、実質的な有害または有毒な副作用を引き起こすことなく、活性化合物の治療剤血漿濃度を実現するためのものである。
【0107】
全般的に、活性化合物の好適な用量は、一日あたり対象者のキログラム体重あたり約１００μｇ～約４００ｍｇ、好ましくは、一日あたり対象者のキログラム体重あたり２００μｇ～約２００ｍｇの範囲である。活性化合物が塩、エステル、プロドラッグなどの場合、投与量は親化合物に基づいて計算するため、用いるべき実際の重量は比例して増加する。
【0108】
インビボ投与を、１回の投与量で、連続的に、または断続的に（たとえば、適切な間隔で分割した用量で）行うことができる。
【0109】
投与の最も有効な手段及び用量を決定する方法は、当該技術分野において良く知られており、治療に対して用いる製剤、治療の目的、処置している標的細胞、及び処置している対象者とともに変わる。単一または複数の投与を、医師が選択している用量レベル及びパターンで行うことができる。
【0110】
本明細書で説明するＣＯ放出複合体を含む化合物の複数の用量を投与してもよく、たとえば２、３、４、５、または５を超える用量を投与してもよい。本明細書で説明するＣＯ放出複合体を含む化合物の投与を、持続した期間、続けてもよい。たとえば、本明細書で説明するＣＯ放出複合体を含む化合物による処置を、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月、または少なくとも２ヶ月、または少なくとも３ヶ月の間、続けてもよい。本明細書で説明するＣＯ放出複合体を含む化合物による処置を、免疫抑制を減らすのに必要な限り続けてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＯ放出複合体を週に１回か２回または月に１回か２回、投与する（たとえば、２～１２ヶ月または２～８ヶ月の間）。いくつかの実施形態では、ＣＯ放出複合体を静脈内投与する。
【0111】
本明細書で説明するＣＯ放出複合体を含む化合物を、単独でまたは他の処置と組み合わせて、個々の状況に依存して同時にまたは順次に、投与してもよい。たとえば、本明細書で説明するＣＯ放出複合体を含む化合物を、１つ以上のさらなる活性化合物と組み合わせて投与してもよい。
【0112】
本明細書で説明するＣＯ放出複合体を含む化合物を、１つ以上の他のがん治療、たとえば、免疫療法（たとえばチェックポイント阻害剤療法、Ｔ細胞共刺激療法、またはサイトカイン療法）、細胞療法、細胞傷害性化学療法、または放射線療法と組み合わせて投与してもよい。
【0113】
たとえば、ＣＯＲＭ複合体を、サイトカイン療法、Ｔ細胞共刺激療法、または免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与してもよい。サイトカイン療法はがん患者の免疫系を活性化させる。インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）が、完全切除した高リスク黒色腫患者及びいくつかの抵抗性悪性腫瘍の補助療法に対して承認されている。高用量インターロイキン－２（ＩＬ－２）が、転移性腎臓細胞癌及び黒色腫の処置に対して承認されている。免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質（たとえば、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１）のリガンド結合または活性を抑制する分子または化合物である。好適な免疫チェックポイント阻害剤としては以下が挙げられる。抗ＣＴＬＡ－４抗体、たとえばイピリムマブ（ＢＭＳ）、及びトレメリムマブ（ＡＺ）；抗ＰＤ－１抗体、たとえばニボルマブ（ＢＭＳ）、及びペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）；及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体、たとえばデュルバルマブ（ＡＺ）、アテゾリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、及びアベルマブ（Ｍｅｒｃｋ Ｋｇａ／Ｐｆｉｚｅｒ）。Ｔ細胞共刺激療法には、たとえば、ＣＤ２８に対するアゴニストまたはＯＸ４０アゴニストを含めることができる。
【0114】
治療薬をさらなる治療薬と組み合わせて用いるとき、化合物を任意の好都合な経路によって順次にまたは同時に投与してもよい。治療薬を、同じ疾患に対して活性なさらなる治療薬と組み合わせて用いるとき、組み合わせにおける各薬剤の用量は、治療薬を単独で用いる場合とは異なっていてもよい。適切な用量は、当業者であれば容易に理解する。
【0115】
本明細書で説明するように、治療薬の投与は、処置の過程の全体を通して、１回の投与量で、連続的に、または断続的に（たとえば、適切な間隔で分割した用量で）行うことができる。投与の最も有効な手段及び用量を決定する方法は、当業者に良く知られており、治療に対して用いる製剤、治療の目的、処置している標的細胞、及び処置している対象者とともに変わる。単一または複数の投与を、処置する医師が選択している用量レベル及びパターンで行うことができる。
【0116】
種々の実施形態では、複合体をがん免疫療法によるレジメンとして投与する。種々の実施形態では、複合体を、がん免疫療法レジメンの前、の間、及び／または後に、患者に投与する。たとえば、がん免疫療法は、免疫チェックポイント分子（たとえば、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、及びＴＩＧＩＴから選択される分子）をブロックする抗体またはその抗原結合部分であってもよい。いくつかの実施形態では、がん免疫療法は、免疫共刺激分子（たとえば、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＴＭＩＧＤ２、及びＴＮＦＲＳＦ２５から選択される分子）のアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、がん免疫療法はＴＬＲ９アゴニストである。実施形態、アゴニストは、抗体もしくはその抗原結合部分（二重特異性抗体を含む）または小分子である。典型的な薬剤としては、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、及びピディリズマブが挙げられる。
【0117】
いくつかの実施形態では、がん免疫療法は養子細胞療法である。これには、Ｔ細胞養子細胞療法（腫瘍抗原を認識して結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する組換え型Ｔ細胞を含む）を含めることができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＴはＣＤ１９に標的化される。
【0118】
他の実施形態では、免疫療法には骨髄移植または造血幹細胞の投与が含まれる。
【0119】
種々の実施形態では、複合体は、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、及び／または抗ＣＴＬＡ４抗体のレジメンとともにがん患者に投与される。
【0120】
種々の実施形態では、治療レジメンには、免疫療法レジメン（たとえば、免疫チェックポイント阻害剤療法または養子細胞療法）の開始前の１～４週間の間、複合体を投与して、がん免疫療法に対して患者を状態調整することが含まれる。さらに他の実施形態では、治療レジメンには、がん免疫療法レジメンの終了後に１週間以上または１ヶ月以上の間、複合体を投与して、有効性及び／または効果の持続時間を改善することが含まれる。いくつかの実施形態では、複合体及び免疫療法を、併用療法を含むレジメンにおいて投与する。
【0121】
種々の実施形態では、患者は以前に、チェックポイント阻害剤療法（たとえば、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１、または抗ＰＤ－Ｌ１、及び／または抗ＰＤ－Ｌ２薬剤）に対して、無反応であったか、部分的にのみ反応していたか、または耐性になっていた。たとえば、患者は、このような免疫チェックポイント阻害剤療法、または本明細書で説明する他の免疫療法の以前のレジメンを受けた場合があるが、前記治療に対して無反応であったか、または部分的にのみ反応していた。このような抵抗性患者は、任意選択で、本明細書で説明するような別の免疫療法とともに、ＣＯ放出基複合体から利益を得ることができる。
【0122】
本発明の他の態様及び実施形態によって、用語「含む」を用語「～からなる」と置き換えた前述した態様及び実施形態と、用語「含む」を用語「本質的に～からなる」と置き換えた前述した態様及び実施形態とが提供される。
【0123】
当然のことながら、本出願は、文脈上別の意味が求められる場合を除き、前述した上記態様及び実施形態のうちのいずれかの相互のすべての組み合わせを開示する。同様に、本出願は、文脈上別の意味が求められる場合を除き、開示する好ましい特徴部及び／または任意的な特徴部のすべての組み合わせを、単独でまたは他の態様のうちのいずれかとともに開示する。
【0124】
前述の実施形態の変更、さらなる実施形態及びその変更は、本開示を読めば当業者にとって明らかであり、したがって、それらは本発明の範囲内である。
【0125】
本明細書で述べたすべての文献及び配列データベースエントリは、すべての目的に対してその全体において参照により本明細書に組み込まれている。
【0126】
「及び／または」は、本明細書で用いる場合、２つの指定した特徴部またはコンポーネントのそれぞれの特定の開示であると解釈すべきであり、他方の有無にかかわらない。たとえば「Ａ及び／またはＢ」は、まるで本明細書においてそれぞれを別個に述べたかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの特定の開示であると解釈すべきである。
【0127】
本明細書で用いる場合、用語「約」は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、関連する数の±１０％を意味する。
【0128】
実験
ガス状メディエーターは、複数の生理学的役割を伴う小分子であり、免疫細胞に有益な手がかりを伝えることができる。この実験的な研究では、人工的なアルブミン金属タンパク質（ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ）が、腫瘍に、それが進行を抑える場合に、著しい量のＣＯを特異的に送達できることを示す。その場で、ＣＯは、免疫チェックポイント分子の発現と免疫回避を促進する腫瘍関連マクロファージの数とを減少させ、抗腫瘍免疫応答の生成を開放する。特に、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ及び免疫チェックポイント阻害薬（ＩＣＢ）が相乗作用して腫瘍を取り除き、免疫記憶を促す。これらの結果、ＣＯＲＭ及びそのタンパク質複合体の、がん治療における処置レジメンとしての可能性が強調される。
ガス状メディエーターは、複数の生理学的役割を伴う小分子であり、免疫細胞に有益な手がかりを伝えることができる。この実験的な研究では、人工的なアルブミン金属タンパク質（ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ）が、腫瘍に、それが進行を抑える場合に、著しい量のＣＯを特異的に送達できることを示す。その場で、ＣＯは、免疫チェックポイント分子の発現と免疫回避を促進する腫瘍関連マクロファージの数とを減少させ、抗腫瘍免疫応答の生成を開放する。特に、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ及び免疫チェックポイント阻害薬（ＩＣＢ）が相乗作用して腫瘍を取り除き、免疫記憶を促す。これらの結果、ＣＯＲＭ及びそのタンパク質複合体の、がん治療における処置レジメンとしての可能性が強調される。
【0129】
免疫療法（免疫系を利用して腫瘍細胞を特異的に標的にする処置戦略）は、種々のタイプのがんに対する治療の標準になることによって、がん患者に対する見通しを完全に変えた。しかし、過去数十年にわたってなされた大きな成果にもかかわらず、がん細胞は免疫認識及び破壊よりも上手に立ち回るため、免疫療法はすべての患者に効果的というわけではない。［５］。そのため、抗腫瘍免疫応答を促進する上での新しい戦術が求められている。ＣＯは、免疫調節から細胞保護作用まで及ぶ生物学的機能を伴う低分子量ガスである。環境に自然に存在し、その生理活性を変換する特定のタンパク質内に存在する遷移金属と選択的に反応する。ＣＯ生物学に関する以前の研究では主に、インビトロでのその直接的な効果に焦点を当てていた。がん免疫におけるＣＯの役割は実質的に分かっていない。高濃度のＣＯにさらすことは著しく有毒であるために、デケージングシステムたとえばＣＯ放出分子（ＣＯＲＭ）によって、より高い治療用量が安全に提供される。しかし、ＣＯＲＭには組織または細胞選択性がなく、したがって特定組織へのより制御された送達を可能にするキャリアが必要である。本明細書では、ＣＯＲＭ（たとえば、ＣＯＲＭ－３）の抗腫瘍可能性を、組換え型ヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の腫瘍標的化能力と結合して［１４］、単一薬剤にする治療戦略について説明する。インビボがんモデルを用いて、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ処置が、腫瘍の増殖を弱めること及び免疫依存的にマウスの全生存期間を延ばすことに効果的であることを観察し、抗がん免疫療法剤としてのその有望さが示された。重要なことに、ＣＯ処置されたマウスは、免疫チェックポイントマーカーであるＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１の発現の減少と、免疫抑制を促進する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の頻度の減少とを示した。ＩＣＢとの併用療法によって、完全な腫瘍退縮及び免疫記憶が可能になった。注目すべきことに、これらの結果は、現時点で実施されている治療の有効性をＣＯＲＭの投与によって高めることで、がんにおける免疫回避を逆転させられることを示している。
【0130】
材料及び方法
結合及び精製
ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で組換え型ヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を５０当量のＣＯＲＭ－３（Ｓｉｇｍａ）と、室温で１時間反応させることで、液体クロマトグラフィーＭＳ（ＬＣ－ＭＳ）によって検出されるｒＨＳＡの金属化の成功に対応する単一ピークが形成された。
結合及び精製
ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で組換え型ヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を５０当量のＣＯＲＭ－３（Ｓｉｇｍａ）と、室温で１時間反応させることで、液体クロマトグラフィーＭＳ（ＬＣ－ＭＳ）によって検出されるｒＨＳＡの金属化の成功に対応する単一ピークが形成された。
【0131】
腫瘍の動物研究及び細胞単離
０日目に、５×１０５ＣＴ２６細胞（結腸癌）を、ＢＡＬＢ／ｃ（またはＮＳＧ）マウスの腹部に、ダルベッコ改変イーグル培地とマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）との５０μｌの１：１混合物により、皮下注射した。Ｃ５７ＢＬ／ｃマウスにおいて、１ｘ１０６ＭＣ３８（結腸腺癌）細胞を代わりに用いて、同じプロトコルを適用した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達したら、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ及びｒＨＳＡ－ＤＭＳＯを、５０μｌＰＢＳでの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射（３０ｍｇｋｇ－１）によって毎日投与した。腫瘍体積が１ｃｍ３に達したときに、マウスを安楽死させた。
０日目に、５×１０５ＣＴ２６細胞（結腸癌）を、ＢＡＬＢ／ｃ（またはＮＳＧ）マウスの腹部に、ダルベッコ改変イーグル培地とマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）との５０μｌの１：１混合物により、皮下注射した。Ｃ５７ＢＬ／ｃマウスにおいて、１ｘ１０６ＭＣ３８（結腸腺癌）細胞を代わりに用いて、同じプロトコルを適用した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達したら、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ及びｒＨＳＡ－ＤＭＳＯを、５０μｌＰＢＳでの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射（３０ｍｇｋｇ－１）によって毎日投与した。腫瘍体積が１ｃｍ３に達したときに、マウスを安楽死させた。
【0132】
異所性腫瘍の誘発後に、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、分析まで、ＣＯ複合体によって毎日処置した。１３日目に、腫瘍を切除して、刻んで、温浸することを、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、及びＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）の混合物を振とう器内で２０分間、２５０ｒ．ｐ．ｍ．、３７℃で用いて行った。温浸後に、サンプルを１００μｍ細胞ろ過器に通した。そしてそれを、冷却した完全ＲＰＭＩ１６４０培地に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μＭの２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充し、１％の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％のＧｌｕＴＡＭＡＸ補助剤、及び１０％の加熱不活性化ＦＢＳ（ＨＩ ＦＢＳ）を補足したものの中で、再懸濁した。細胞を、２％のＦＢＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ内で再懸濁して、ＣＤ４５－ＡＰＣに対して室温で１５分間、染色した後、ＭｏｊｏＳｏｒｔ（商標）マウス抗ＡＰＣナノビーズ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によって室温で１５分間、染色した。染色及びサンプルを室温に維持して、好中球破壊を防いだ。３サイクルの正の選択を磁気スタンドを用いて行って、フローサイトメトリー解析用の種々のマーカーを評価するために細胞を染色した。
【0133】
ＣＯレベル判定
Ｖｒｅｍａｎ及び共同研究者によって説明される方法を用いて［１８］、組織及び血液内でのＣＯレベルを測定した。ＣＯ放出を、骨髄由来マクロファージ細胞（ＢＭＤＭ）及び結腸直腸がん細胞（ＣＴ２６）内で評価した。マウス内のＣＯ生体内分布と循環におけるカルボキシヘモグロビン（ＣＯ－Ｈｂ）レベルとを、３ｍｇｋｇ１のｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ－３またはｒＨＳＡを単独で静脈注射した後に、３０分間、評価した。
Ｖｒｅｍａｎ及び共同研究者によって説明される方法を用いて［１８］、組織及び血液内でのＣＯレベルを測定した。ＣＯ放出を、骨髄由来マクロファージ細胞（ＢＭＤＭ）及び結腸直腸がん細胞（ＣＴ２６）内で評価した。マウス内のＣＯ生体内分布と循環におけるカルボキシヘモグロビン（ＣＯ－Ｈｂ）レベルとを、３ｍｇｋｇ１のｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ－３またはｒＨＳＡを単独で静脈注射した後に、３０分間、評価した。
【0134】
ＣＴ２６細胞及びＢＭＤＭにおけるＣＯ放出のライブ画像化
前述した方法に続いて、ＣＯ放出の読み取りとして共焦点顕微鏡を用いたＣＯＰ－１の検出を行った［９］。簡単に言えば、４０Ｘ水対物レンズ及び開口数１．３のＺｅｉｓｓＬＳＭ８８０焦点レーザポイント走査型顕微鏡用いて、画像を得た。ＣＯＰ－１を４８８ｎｍアルゴンレーザを用いて励起して、蛍光が波長範囲５００～５５０ｎｍで検出された。１．５ｘ１０４ＣＴ２６細胞またはＢＭＤＭを、実験の２日前に、２００ｕＬの８チャンバー＃１．０ボロシリケートカバーガラス（Ｌａｂ－Ｔｅｋ）プレートにおいて播種した。細胞を、１．５μＭのｒＨＳＡ－ＣＯＲＭまたはｒＨＳＡ－ＤＭＳＯのいずれかで３０分間培養し、取得前にＰＢＳによって３回洗浄した。顕微鏡で１μＭのＣＯＰ－１を添加する前後に対照画像を撮影した。プローブを加えた後に５分ごとに最大で６０分間画像を撮影した。細胞がｚ軸に沿って完全に画像化されることを確実にするために、画像取得をＺスタックにおいて行った。取得は３７℃の下で５％ＣＯ２で行った。
前述した方法に続いて、ＣＯ放出の読み取りとして共焦点顕微鏡を用いたＣＯＰ－１の検出を行った［９］。簡単に言えば、４０Ｘ水対物レンズ及び開口数１．３のＺｅｉｓｓＬＳＭ８８０焦点レーザポイント走査型顕微鏡用いて、画像を得た。ＣＯＰ－１を４８８ｎｍアルゴンレーザを用いて励起して、蛍光が波長範囲５００～５５０ｎｍで検出された。１．５ｘ１０４ＣＴ２６細胞またはＢＭＤＭを、実験の２日前に、２００ｕＬの８チャンバー＃１．０ボロシリケートカバーガラス（Ｌａｂ－Ｔｅｋ）プレートにおいて播種した。細胞を、１．５μＭのｒＨＳＡ－ＣＯＲＭまたはｒＨＳＡ－ＤＭＳＯのいずれかで３０分間培養し、取得前にＰＢＳによって３回洗浄した。顕微鏡で１μＭのＣＯＰ－１を添加する前後に対照画像を撮影した。プローブを加えた後に５分ごとに最大で６０分間画像を撮影した。細胞がｚ軸に沿って完全に画像化されることを確実にするために、画像取得をＺスタックにおいて行った。取得は３７℃の下で５％ＣＯ２で行った。
【0135】
腫瘍サイズ及び生存分析
腫瘍サイズを、次の式：体積＝長さ×幅×幅×０．５を用いてデジタルキャリパーによって毎日測定した。マウスを接種後にモニタリングして、生存率を計算した。腫瘍増殖の結果を、有意である場合（９５％信頼区間）に、一元配置分散分析によって分析した。担癌マウスの生存期間の比較を、ログランクマンテルコックス検定（９５％信頼区間）を用いて行った。
腫瘍サイズを、次の式：体積＝長さ×幅×幅×０．５を用いてデジタルキャリパーによって毎日測定した。マウスを接種後にモニタリングして、生存率を計算した。腫瘍増殖の結果を、有意である場合（９５％信頼区間）に、一元配置分散分析によって分析した。担癌マウスの生存期間の比較を、ログランクマンテルコックス検定（９５％信頼区間）を用いて行った。
【0136】
質量分析
２０μＬのＢＳＡ及びＢＳＡＲｕＩＩ（ＣＯ）２サンプルを、マイクロバイオスピン６カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、２００ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝剤（ｐＨ７）に緩衝液交換した。質量スペクトルを、高質量Ｑ－ＴＯＦタイプの装置ＸｅｖｏＧ２－Ｓ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）上で得た。質量分析実験を、キャピラリ電圧１５００Ｖ、コーン電圧２００Ｖ、及びソースオフセット電圧１５０Ｖで行った。スペクトルをＭａｓｓＬｙｎｘＶ４．１（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて処理した。
２０μＬのＢＳＡ及びＢＳＡＲｕＩＩ（ＣＯ）２サンプルを、マイクロバイオスピン６カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、２００ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝剤（ｐＨ７）に緩衝液交換した。質量スペクトルを、高質量Ｑ－ＴＯＦタイプの装置ＸｅｖｏＧ２－Ｓ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）上で得た。質量分析実験を、キャピラリ電圧１５００Ｖ、コーン電圧２００Ｖ、及びソースオフセット電圧１５０Ｖで行った。スペクトルをＭａｓｓＬｙｎｘＶ４．１（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて処理した。
【0137】
細胞の培養
ＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ）を、加湿培養器内で３７℃、５％のＣＯ２下で日常的に増殖させて、週に２度、コンフルエンスに達する前に、ＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓを用いて分割した。ＣＴ２６細胞を、ＤＭＥＭ培地に１０％の加熱不活性化ＦＢＳ、１％のグルタマックス、１％のピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮＥＡＡ、２００ユニット／ｍＬのペニシリン、及び２００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したものの上で増殖させた。特に明記しない限り、すべての試薬は、Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＵＳＡ）から購入した。
ＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ）を、加湿培養器内で３７℃、５％のＣＯ２下で日常的に増殖させて、週に２度、コンフルエンスに達する前に、ＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓを用いて分割した。ＣＴ２６細胞を、ＤＭＥＭ培地に１０％の加熱不活性化ＦＢＳ、１％のグルタマックス、１％のピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮＥＡＡ、２００ユニット／ｍＬのペニシリン、及び２００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したものの上で増殖させた。特に明記しない限り、すべての試薬は、Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＵＳＡ）から購入した。
【0138】
免疫応答の評価
全細胞を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから輸入した８～１４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの腫瘍から採取した。切除した腫瘍を刻んで、温浸することを、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）及びＤｎａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）の混合物を振とう器内で２０分間、２５０ｒｐｍ、３７℃で用いて行った。温浸後に、サンプルを１００μｍ細胞ろ過器に通した。そしてそれを、冷却した完全ＲＰＭＩ１６４０培地に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μＭの２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇの／ｍｌストレプトマイシンを補充し、１％の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％のＧｌｕＴＡＭＡＸ補助剤、及び１０％の加熱不活性化ＦＢＳ（ＨＩ ＦＢＳ）を補足したものの中で、再懸濁した。細胞を、２％のＦＢＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ内で再懸濁して、細胞外マーカーに対して４５分間、４℃で染色した。そして細胞懸濁液を固定し、透過処理して、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｘｐ３転写因子染色緩衝剤セットを用いて、細胞内マーカーに対して染色した。サンプルを、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを備えたＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータにおいて分析し、データをフロージョーｖ．１０ソフトウェアにおいて分析した。結腸癌実験において用いた抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）は以下のとおりであった。ＣＤ４５－ＢＶ５１０（３０－Ｆ１１）、ＣＤ３－ＢＶ７１１（１７Ａ２）、ＣＤ４９ｂ－ＦＩＴＣ（ＤＸ５）、ＣＤ４－ＢＶ６０５（ＲＭ４－５）、ＣＤ８－ＰＥＣｙ７（５３－６．７）、ＣＤ１５２－ＰＥＣｙ７（ＣＴＬＡ－４、ＵＣ１０－４Ｂ９）、ＣＤ２７９－ＰＥ（ＰＤ－１、２９Ｆ１Ａ１２）、ＴＮＦα－ＰＥ（ＭＰ６－ＸＴ２２）、ＩＦＮγ－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＸＭＧ１．２）、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ－ＰＥ（ＭＨＣ－ＩＩ、Ｍ５／１１４．１５．２）、Ｆ４／８０－ＰＥＣｙ７（ＢＭ８）、Ｌｙ６Ｇ－ＢＶ６０５（１Ａ８）、Ｌｙ６Ｃ－ＦＩＴＣ（ＨＫ１．４）、ＣＤ１１ｃ－ＢＶ７１１（Ｎ４１８）、ＴＥＲ１１９－ＡＰＣ、ＣＤ１９－ＡＰＣ（６Ｄ５）、Ｋｉ－６７－ＢＶ６０５（１６Ａ８）、ＣＤ２７４－ＢＶ４２１（Ｂ７－Ｈ１、ＰＤ－Ｌ１、１０Ｆ９Ｇ２）、ＣＤ２０６－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｃ０６８Ｃ２）。用いた抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、ｉＮＯＳ－ＰＥ（ＣＸＮＦＴ）及びＩＣＡＭ－１－ＦＩＴＣ（ＹＮ１／１．７．４）であった。Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて死細胞を除外した。動物は、Ｄｉｒｅｃａｏ Ｇｅｒａｌ ｄｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ ａｎｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｊｏａｏ Ｌｏｂｏ Ａｎｔｕｎｅｓ倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って維持した。
全細胞を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから輸入した８～１４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの腫瘍から採取した。切除した腫瘍を刻んで、温浸することを、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）及びＤｎａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）の混合物を振とう器内で２０分間、２５０ｒｐｍ、３７℃で用いて行った。温浸後に、サンプルを１００μｍ細胞ろ過器に通した。そしてそれを、冷却した完全ＲＰＭＩ１６４０培地に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μＭの２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇの／ｍｌストレプトマイシンを補充し、１％の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％のＧｌｕＴＡＭＡＸ補助剤、及び１０％の加熱不活性化ＦＢＳ（ＨＩ ＦＢＳ）を補足したものの中で、再懸濁した。細胞を、２％のＦＢＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ内で再懸濁して、細胞外マーカーに対して４５分間、４℃で染色した。そして細胞懸濁液を固定し、透過処理して、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｘｐ３転写因子染色緩衝剤セットを用いて、細胞内マーカーに対して染色した。サンプルを、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを備えたＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータにおいて分析し、データをフロージョーｖ．１０ソフトウェアにおいて分析した。結腸癌実験において用いた抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）は以下のとおりであった。ＣＤ４５－ＢＶ５１０（３０－Ｆ１１）、ＣＤ３－ＢＶ７１１（１７Ａ２）、ＣＤ４９ｂ－ＦＩＴＣ（ＤＸ５）、ＣＤ４－ＢＶ６０５（ＲＭ４－５）、ＣＤ８－ＰＥＣｙ７（５３－６．７）、ＣＤ１５２－ＰＥＣｙ７（ＣＴＬＡ－４、ＵＣ１０－４Ｂ９）、ＣＤ２７９－ＰＥ（ＰＤ－１、２９Ｆ１Ａ１２）、ＴＮＦα－ＰＥ（ＭＰ６－ＸＴ２２）、ＩＦＮγ－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＸＭＧ１．２）、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ－ＰＥ（ＭＨＣ－ＩＩ、Ｍ５／１１４．１５．２）、Ｆ４／８０－ＰＥＣｙ７（ＢＭ８）、Ｌｙ６Ｇ－ＢＶ６０５（１Ａ８）、Ｌｙ６Ｃ－ＦＩＴＣ（ＨＫ１．４）、ＣＤ１１ｃ－ＢＶ７１１（Ｎ４１８）、ＴＥＲ１１９－ＡＰＣ、ＣＤ１９－ＡＰＣ（６Ｄ５）、Ｋｉ－６７－ＢＶ６０５（１６Ａ８）、ＣＤ２７４－ＢＶ４２１（Ｂ７－Ｈ１、ＰＤ－Ｌ１、１０Ｆ９Ｇ２）、ＣＤ２０６－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｃ０６８Ｃ２）。用いた抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、ｉＮＯＳ－ＰＥ（ＣＸＮＦＴ）及びＩＣＡＭ－１－ＦＩＴＣ（ＹＮ１／１．７．４）であった。Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて死細胞を除外した。動物は、Ｄｉｒｅｃａｏ Ｇｅｒａｌ ｄｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ ａｎｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｊｏａｏ Ｌｏｂｏ Ａｎｔｕｎｅｓ倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って維持した。
【0139】
マクロファージ枯渇分析
インビボでのＣＴ２６腫瘍誘発の前述したプロトコルに従って、マクロファージ枯渇を、６００μｇ／ｋｇの抗ＣＣＲ２抗体（ＭＣ－２１）の毎日の静脈注射と、クロドロネートリポソームの週２回の静脈注射とによって行い、マクロファージの枯渇に対して、ＣＴ２６細胞の皮下注射後の９日目に開始している。１６日目にマウスを屠殺し、細胞を単離して、フローサイトメトリーを通して評価した。フローサイトメトリー分析は前述したように行った。
インビボでのＣＴ２６腫瘍誘発の前述したプロトコルに従って、マクロファージ枯渇を、６００μｇ／ｋｇの抗ＣＣＲ２抗体（ＭＣ－２１）の毎日の静脈注射と、クロドロネートリポソームの週２回の静脈注射とによって行い、マクロファージの枯渇に対して、ＣＴ２６細胞の皮下注射後の９日目に開始している。１６日目にマウスを屠殺し、細胞を単離して、フローサイトメトリーを通して評価した。フローサイトメトリー分析は前述したように行った。
【0140】
骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）培養システム
ＢＭ細胞を、８週齢のＣ５７ＢＬ／ｃマウスの大腿骨から単離して、６ウェルプレートに入れた。６ウェルプレートは、８００μのＬＲＰＭＩ１６４０培地（ウェルあたり）に、１０％の加熱不活性化ＦＢＳ（ＨＩＦＢＳ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２０Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び２０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補充され、１％のＧｌｕＴＡＭＡＸが補足されたものを収容している。さらに、Ｍ－ＣＳＦ産生Ｌ９２９線維芽細胞の上清２００μＬを各ウェルに添加した。細胞を、準全マクロファージ分化のために、３７℃及び５％ＣＯ２の加湿培養器内で６日間、維持した。ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭまたはｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ複合体を、播種から２４ｈ後に添加し、３日目にウェルあたり２５０μＬのＬ９２９上澄みとともに再び添加した。６日目に、細胞を２ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ内で約１０分、培養して、引っかくことによって機械的に取り除き、１２のウェルプレートにおいて再播種した。マクロファージ分極を、ＢＭＤＭを２４ｈ、以下の条件で培養することによって実現した。Ｍ０：２０％のＬ９２９（または１０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ）、Ｍ１：１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγ、Ｍ２ａ：１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１３、Ｍ２ｃ：１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１０＋０．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β。細胞を、前述のようにプレートから採取し、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ装置においてフローサイトメトリーによって分析した。
ＢＭ細胞を、８週齢のＣ５７ＢＬ／ｃマウスの大腿骨から単離して、６ウェルプレートに入れた。６ウェルプレートは、８００μのＬＲＰＭＩ１６４０培地（ウェルあたり）に、１０％の加熱不活性化ＦＢＳ（ＨＩＦＢＳ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２０Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び２０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補充され、１％のＧｌｕＴＡＭＡＸが補足されたものを収容している。さらに、Ｍ－ＣＳＦ産生Ｌ９２９線維芽細胞の上清２００μＬを各ウェルに添加した。細胞を、準全マクロファージ分化のために、３７℃及び５％ＣＯ２の加湿培養器内で６日間、維持した。ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭまたはｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ複合体を、播種から２４ｈ後に添加し、３日目にウェルあたり２５０μＬのＬ９２９上澄みとともに再び添加した。６日目に、細胞を２ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ内で約１０分、培養して、引っかくことによって機械的に取り除き、１２のウェルプレートにおいて再播種した。マクロファージ分極を、ＢＭＤＭを２４ｈ、以下の条件で培養することによって実現した。Ｍ０：２０％のＬ９２９（または１０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ）、Ｍ１：１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγ、Ｍ２ａ：１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１３、Ｍ２ｃ：１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１０＋０．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β。細胞を、前述のようにプレートから採取し、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ装置においてフローサイトメトリーによって分析した。
【0141】
【0142】
ＣＯ放出及び分布
ＣＯがＣＴ２６細胞内の複合体から効果的に放出されたか否かを判定するために、ＣＯＰ－１という名前のＣＯ感受性色素を用いたライブ画像化を通してＣＯレベルを遮蔽した［６７］。予想どおり、ＣＯは時間とともに腫瘍細胞内に蓄積することができた（図２ｂ）。さらに、ＣＯは、ヘモグロビンに対する親和性が酸素よりも高く、組織の酸素化を防ぎ得るため、カルボキシヘモグロビン（ＣＯ－Ｈｂ）の血中含有量を推定して、マウスにおける潜在的なＣＯ中毒を評価した。ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭの静脈内投与によるＣＯ－Ｈｂ種の形成の何らかの増加は観察されず、組織内の毒性の何らかの所与の徴候も検出されなかった（図３の左、図１２ａ～ｃ）。図３にＣＯ生体内分布を示す。さらに、処置による鼡径リンパ節（ｉＬＮ）に隣接する腫瘍において何らかの膨潤が観察された。これは、その部位における免疫細胞動員の増加を意味する可能性がある（図４ｃ）。ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ処置マウスの臓器において腫瘍細胞が検出されなかったため、種々の組織における組織学的スコアによって、転移がｉＬＮ腫脹の根底にある可能性も除外された（図１２ｄ）。図２ａに、ＢＭＤＭにおけるＣＯ放出も示す。
ＣＯがＣＴ２６細胞内の複合体から効果的に放出されたか否かを判定するために、ＣＯＰ－１という名前のＣＯ感受性色素を用いたライブ画像化を通してＣＯレベルを遮蔽した［６７］。予想どおり、ＣＯは時間とともに腫瘍細胞内に蓄積することができた（図２ｂ）。さらに、ＣＯは、ヘモグロビンに対する親和性が酸素よりも高く、組織の酸素化を防ぎ得るため、カルボキシヘモグロビン（ＣＯ－Ｈｂ）の血中含有量を推定して、マウスにおける潜在的なＣＯ中毒を評価した。ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭの静脈内投与によるＣＯ－Ｈｂ種の形成の何らかの増加は観察されず、組織内の毒性の何らかの所与の徴候も検出されなかった（図３の左、図１２ａ～ｃ）。図３にＣＯ生体内分布を示す。さらに、処置による鼡径リンパ節（ｉＬＮ）に隣接する腫瘍において何らかの膨潤が観察された。これは、その部位における免疫細胞動員の増加を意味する可能性がある（図４ｃ）。ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ処置マウスの臓器において腫瘍細胞が検出されなかったため、種々の組織における組織学的スコアによって、転移がｉＬＮ腫脹の根底にある可能性も除外された（図１２ｄ）。図２ａに、ＢＭＤＭにおけるＣＯ放出も示す。
【0143】
腫瘍サイズ及び生存
ＣＯ処置が、腫瘍増殖を弱めること及びマウスの全生存期間を延ばすことに効果的であることが示された。図４ａに実験の概略図を示す。図４ｂは、ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ処置と比べたときに、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭによる処置の結果として生存が著しく改善されることを、明らかに示している（ｐ＝０．００３４）。また図４ｂは、ＣＴ２６腫瘍の増殖が、ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ処置と比べたときに、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭによって遅くなっていることを示している。このことはさらに図４ｃに示されている。図４ｃでは、１３日目において、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ処置された腫瘍がｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ処置された腫瘍よりもかなり小さい。図４ｄに腫瘍重量を図式的に示す。図４ｃではまた、１３日目における鼡径リンパ節（ｉＬＮ）が、ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ処置と比べたときに、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭによる処置後の方が大きかったことも示している。これは、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ処置されたマウスの方が、より強い免疫応答を腫瘍細胞に対して開始したことを示唆し得る。
ＣＯ処置が、腫瘍増殖を弱めること及びマウスの全生存期間を延ばすことに効果的であることが示された。図４ａに実験の概略図を示す。図４ｂは、ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ処置と比べたときに、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭによる処置の結果として生存が著しく改善されることを、明らかに示している（ｐ＝０．００３４）。また図４ｂは、ＣＴ２６腫瘍の増殖が、ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ処置と比べたときに、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭによって遅くなっていることを示している。このことはさらに図４ｃに示されている。図４ｃでは、１３日目において、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ処置された腫瘍がｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ処置された腫瘍よりもかなり小さい。図４ｄに腫瘍重量を図式的に示す。図４ｃではまた、１３日目における鼡径リンパ節（ｉＬＮ）が、ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ処置と比べたときに、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭによる処置後の方が大きかったことも示している。これは、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ処置されたマウスの方が、より強い免疫応答を腫瘍細胞に対して開始したことを示唆し得る。
【0144】
ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭは、Ｃ５７ＢＬ／ｃマウスにおけるＭＣ３８細胞を用いた結腸癌の別のマウスモデルにおいても同様に有効であった。
【0145】
ＣＯを介した効果が実際に免疫系に依存しているか否かを評価するために、免疫不全マウス（ＮＳＧ）おいて同じ腫瘍を誘発した。処置群間のわずかな違いもＣＴ２６細胞内の直接的な細胞毒性も観察できなかったため（図５）、ＣＯを介した抗腫瘍効果は免疫依存性であると結論づけられた。図５に示すように、免疫不全ＮＳＧマウスにおけるｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ及びｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ処置の間で、腫瘍サイズ、生存、または細胞生存能力に有意差はない。これは、ＣＯＲＭ複合体処置が免疫抑制癌に対して最も適切であることを示唆している。
【0146】
炎症反応及び免疫応答の分析
図６ａ、ｂに、ＣＯ処置されたマウスが、腫瘍浸潤Ｔ細胞における免疫チェックポイントマーカーＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１の発現の減少を示したこと（図６ａ）、またＣＯ処置によって、ＴＮＦα及びＩＦＮγを発現している細胞の存在量が増加すること（図６ｂ）を示す。これは、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１が両方ともＴ細胞作用を抑制するため、ＣＯ処置が、Ｔ細胞応答の低下を特徴とする免疫抑制癌において効果的である可能性があることを示している。
図６ａ、ｂに、ＣＯ処置されたマウスが、腫瘍浸潤Ｔ細胞における免疫チェックポイントマーカーＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１の発現の減少を示したこと（図６ａ）、またＣＯ処置によって、ＴＮＦα及びＩＦＮγを発現している細胞の存在量が増加すること（図６ｂ）を示す。これは、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１が両方ともＴ細胞作用を抑制するため、ＣＯ処置が、Ｔ細胞応答の低下を特徴とする免疫抑制癌において効果的である可能性があることを示している。
【0147】
図７ａに、ＣＯが腫瘍内の種々のサイトカイン及びケモカインの産生に影響することを示す。特に、ＣＯ処置はＩＬ－２０のレベルの劇的な減少を示した。（Ａ）ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ処置後の腫瘍におけるサイトカイン（左）及びケモカイン（右）のタンパク質定量化（ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ、ｎ＝３；ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ、ｎ＝３）。
【0148】
図６ａ、ｂに示すように、腫瘍浸潤リンパ球の存在量に差はないにもかかわらず、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１（抑制及び消耗のマーカー）の発現がＴ細胞において減少したことが観察され、一方で、腫瘍抑制ＴＮＦα及びＩＦＮγ産生ＣＤ８及びＮＫ細胞の増加が処置後に観察された。このような結果は、免疫応答が強すぎるのを防ぐチェックポイントタンパク質の発現をＣＯがどのように減らすことができるのかを明らかにしている。これらの効果がどの種類のＴ細胞サブセットに依存するのかを判定するために、枯渇抗体を用いてＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞をインビボで取り除いた。ＣＤ４ Ｔ細胞はＣＯ処置にとって冗長であるが、ＣＤ８ Ｔ細胞が枯渇するとｒＨＳＡ－ＣＯＲＭの効果が逆転することが観察された。これは、ＣＯを介した効果はＣＤ８依存性であることを示唆している（図７ｂ）。さらに、ＣＯがＩＣＭの発現にわずかに影響したため、ＩＣＢはｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ処置と相乗効果を示し、抗腫瘍応答がさらに増強されると仮定された。実際には、ＩＣＢ単独よりも併用治療（ＣＯＭＢＯ）を受けたマウスの方が多くの腫瘍が退縮したため、生存数が改善された（図７ｃ）。マウスが腫瘍を完全に取り除いた後で、反対側の側腹部において同じ腫瘍細胞を再チャレンジした。際だったことに、ＩＣＢ及びｒＨＳＡ－ＣＯＲＭを用いて以前に処置したマウスは、腫瘍を発症しなかった（図７ｄ）。
【0149】
ＣＯに対するマクロファージ応答
骨髄コンパートメント、特に腫瘍関連マクロファージ及び単球におけるＣＯを介した効果を評価した。ＭＨＣ－ＩＩ＋細胞（たとえば、マクロファージ）は、Ｔ細胞に抗原を示す役割を有する。しかし、腫瘍の状況では、ＴＡＭはＴ細胞を活性化するのではなくＴ細胞を抑制するように歪むため、これらのマクロファージはがん処置において有害となる［２］。ＴＡＭは、Ｔ細胞抗腫瘍免疫を抑制して腫瘍発生を促進する。
骨髄コンパートメント、特に腫瘍関連マクロファージ及び単球におけるＣＯを介した効果を評価した。ＭＨＣ－ＩＩ＋細胞（たとえば、マクロファージ）は、Ｔ細胞に抗原を示す役割を有する。しかし、腫瘍の状況では、ＴＡＭはＴ細胞を活性化するのではなくＴ細胞を抑制するように歪むため、これらのマクロファージはがん処置において有害となる［２］。ＴＡＭは、Ｔ細胞抗腫瘍免疫を抑制して腫瘍発生を促進する。
【0150】
図８に、ＣＯ処置によって腫瘍における単球及びＴＡＭの存在量が減ることを示す（ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ、ｎ＝４；ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ、ｎ＝４）。興味深いことに、ＣＯ処置によって好中球の存在量が増加することも観察された。これは、可能性として免疫性能の改善を示している（図８）。さらに、図９ａ～ｄに、マクロファージの枯渇がＣＴ２６腫瘍におけるＣＯ処置の効果を模倣することを示す（ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ、ｎ＝４；ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ、ｎ＝４；ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ＋Ｃｌｏｄ Ｌｉｐ、ｎ＝４；ｒＨＳＡ－ＤＭＳＯ＋Ｃｌｏｄ Ｌｉｐ、ｎ＝４）。これらのマクロファージは、Ｋｉ－６７発現の減少が示すように、増殖性がより低く（図９ｅ）、クロドロネートリポソームを用いた枯渇は、腫瘍の増殖を妨げるＣＯの同類を模倣した（図９ｂ）。この結果、ＣＯ処置が、Ｔ細胞応答の低下を特徴とする免疫抑制癌の処置に対して有用であることを示すさらなる証拠が得られる。
【0151】
またＣＯ処置後の腫瘍におけるＩＬ－２０産生の完全な抑止も見られた（図７ａ及び９ｅ）。ＩＬ－２０は、がんの進行に関連するＩＬ－１０ファミリーからの炎症誘発性サイトカインであり、単球及びマクロファージはその主な産生者である。したがって、ＣＯを介した抗がん効果はマクロファージの枯渇に依存し得る。
【0152】
この考え方に従って、ＣＯがマクロファージの恒常性に関与しているか否かを判定しようとした。絶対細胞数の減少の原因がマクロファージ増殖またはアポトーシスにおける効果に起因するのか否かを判定するために、細胞をＫｉ－６７及びアネキシンＶに対してそれぞれマーキングした。以前にインビボで観察されたものとは反対に、マクロファージの増殖において違いは観察されなかった（図１０ｅ）。さらに、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭに対してアポトーシスの減少が観察された。これは、アネキシンＶ及び生存性色素（図１０ｆ）の併用染色に見られるように、ＣＯを介した細胞数の減少と一致しない。したがって、ＣＯは、この濃度ではマクロファージではなく、分化前の前駆体の生存能力に影響する可能性がある。
【0153】
マクロファージを骨髄（骨髄由来のマクロファージ、「ＢＭＤＭ」）からインビトロで分化して、ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭまたはｒＨＳＡ－ＤＭＳＯによって培養した（図１０ａ）。ｒＨＳＡ－ＣＯＲＭ加える前に単球を定着させて分化を開始させたときに、総細胞数の違いにもかかわらず、単球からマクロファージへの分化に関して違いは生じなかった（図１０ｂ－ｄ）。したがって、ＣＯは、このような低濃度（１μＭ）ではマクロファージではなく、分化前の前駆体の生存能力に影響し得ると考えた。
【0154】
分化したＢＭＤＭの細胞毒性アッセイによって、マクロファージは単球よりも耐性の閾値が高く、８０μＭのＧＩ５０を示すことが示されている。これに対し、５または１０μＭ程度に低い濃度を用いると、化合物をＢＭ細胞と同時に加えた場合に、培養においてほぼ完全な細胞死となった（図１１ａ）。したがって、ＣＯはマクロファージ分化を損なわず、むしろＢＭ前駆体の生存能力を弱めて、マクロファージの数の減少を引き起こすように見える。さらに、ＣＯは、Ｍ１、Ｍ２ａ、及びＭ２ｃ系統マーカーの発現を減少させることによってマクロファージ分極に影響した（図１０ｈ）。しかし、これらの効果は、分極にとっては二次的であり、マクロファージの生存能力の減少が原因である場合がある。
【0155】
まとめると、これらの結果は、ＣＯが、腫瘍増殖を弱めること及び免疫依存的にマウスの全生存期間を延ばすことに効果的であることを示しており、免疫抑制癌の処置としてのその有望さを示している。現時点で利用可能な免疫療法戦略は、がんに対して常に効果的なわけではなく、処置の最初に取り組んでも再発することがある。ＣＯは、免疫チェックポイント阻害剤の効果を再現し得るだけでなく、腫瘍の免疫抑制的な環境を助長する細胞を枯渇させ得る新しい多目的抗がん剤として出現している。その結果、ＣＯは従来の処置に代わる優れた治療法として存在し得る。
【0156】
参考文献
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［１４］Ｍａｒｉｎ－Ａｃｅｖｅｄｏ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；１１：３９．
［１５］Ｎｏｗｉｃｋｉ Ｔ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１８ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；２４（１）：４７－５３．
［１６］Ｒｏｗｓｈａｎｒａｖａｎ Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１８ Ｊａｎ ４；１３１（１）：５８－６７．
［１７］Ａｒｄｏｌｉｎｏ Ｌ．及びＪｏｓｈｕａ Ａ．Ａｕｓｔ Ｐｒｅｓｃｒ．２０１９ Ａｐｒ；４２（２）：６２－６７．
［１８］Ｉｓｍａｉｌｏｖａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ Ａｐｐｌ．２０１８；２０１８：８５４７３６４．
［１９］Ｖｒｅｍａｎ ＨＪ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００５；３４１：２８０－２８９．
［２０］Ｈｏｄｉ ＦＳ，Ｏ’Ｄａｙ ＳＪ，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ＤＦ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０；３６３：７１１～７２３．
［２１］Ｗｅｂｅｒ ＪＳ，Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ ＳＰ，Ｍｉｎｏｒ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１５；１６：３７５～３８４．
［２２］Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ，Ｌｏｎｇ ＧＶ，Ｂｒａｄｙ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１５；３７２：３２０～３３０．
［２３］Ｒｉｂａｓ Ａ，Ｐｕｚａｎｏｖ Ｉ，Ｄｕｍｍｅｒ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１５；１６：９０８～９１８．
［２４］Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ Ｊ，Ｌｏｎｇ ＧＶ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１５；３７２：２５２１～２５３２．
［２５］Ｇａｒｏｎ ＥＢ，Ｒｉｚｖｉ ＮＡ，Ｈｕｉ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１５；３７２：２０１８～２０２８．
［２６］Ｈｅｒｂｓｔ ＲＳ，Ｂａａｓ Ｐ，Ｋｉｍ ＤＷ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１６；３８７：１５４０～１５５０．
［２７］Ｒｅｃｋ Ｍ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ａｂｒｅｕ Ｄ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＡＧ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１６；３７５：１８２３～１８３３．
［２８］Ｃｈｅｎ Ｒ，Ｚｉｎｚａｎｉ ＰＬ，Ｆａｎａｌｅ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１７；３５：２１２５～２１３２．
［２９］Ｃｈｏｗ ＬＱＭ，Ｈａｄｄａｄ Ｒ，Ｇｕｐｔａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１６；３４：３８３８～３８４５．
［３０］Ｂｅｌｌｍｕｎｔ Ｊ，ｄｅ Ｗｉｔ Ｒ，Ｖａｕｇｈｎ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１７；３７６：１０１５～１０２６．
［３１］Ｚｈｕ ＡＸ，Ｆｉｎｎ ＲＳ，Ｅｄｅｌｉｎｅ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；１９：９４０～９５２．
［３２］Ｚｉｎｚａｎｉ ＰＬ，Ｔｈｉｅｂｌｅｍｏｎｔ Ｃ，Ｍｅｌｎｉｃｈｅｎｋｏ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１３０（Ｓｕｐｐｌ １）：２８３３．
［３３］Ｂｏｒｇｈａｅｉ Ｈ，Ｐａｚ－Ａｒｅｓ Ｌ，Ｈｏｒｎ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１５；３７３：１６２７～１６３９．
［３４］Ｃｈｕｎｇ ＨＣ，Ｓｃｈｅｌｌｅｎｓ ＪＨＭ，Ｄｅｌｏｒｄ Ｊ－Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；３６（１５＿ｓｕｐｐｌ）：５５２２．
［３５］Ｆｕｃｈｓ ＣＳ，Ｄｏｉ Ｔ，Ｊａｎｇ ＲＷ，ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；４：ｅ１８００１３．
［３６］Ｐｒａｓａｄ Ｖ，Ｋａｅｓｔｎｅｒ Ｖ，Ｍａｉｌａｎｋｏｄｙ Ｓ．ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；４：１５７～１５８．
［３７］Ｎｇｈｉｅｍ ＰＴ，Ｂｈａｔｉａ Ｓ，Ｌｉｐｓｏｎ ＥＪ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１６；３７４：２５４２～２５５２．
［３８］Ｂｒａｈｍｅｒ Ｊ，Ｒｅｃｋａｍｐ ＫＬ，Ｂａａｓ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１５；３７３：１２３～１３５．
［３９］Ｍｏｔｚｅｒ ＲＪ，Ｅｓｃｕｄｉｅｒ Ｂ，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ＤＦ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１５；３７３：１８０３～１８１３．
［４０］Ｓｈａｒｍａ Ｐ，Ｒｅｔｚ Ｍ，Ｓｉｅｆｋｅｒ－Ｒａｄｔｋｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１７；１８：３１２～３２２．
［４１］Ｅｌ－Ｋｈｏｕｅｉｒｙ ＡＢ，Ｓａｎｇｒｏ Ｂ，Ｙａｕ Ｔ，ｅｔ ａｌ．２０１７；３８９：２４９２～２５０２．
［４２］Ｏｖｅｒｍａｎ ＭＪ，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ Ｒ，Ｌｅａｃｈ ＪＬ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１７；１８：１１８２～１１９１．
［４３］Ｙｏｕｎｅｓ Ａ，Ｓａｎｔｏｒｏ Ａ，Ｓｈｉｐｐ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１６；１７：１２８３～１２９４．
［４４］Ｒｅａｄｙ Ｎ，Ｆａｒａｇｏ ＡＦ，ｄｅ Ｂｒａｕｄ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ．２０１９；１４：２３７～２４４．
［４５］Ｍｉｇｄｅｎ ＭＲ，Ｒｉｓｃｈｉｎ Ｄ，Ｓｃｈｍｕｌｔｓ ＣＤ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１８；３７９：３４１～３５１．
［４６］Ｐｏｗｌｅｓ Ｔ，Ｄｕｒａｎ Ｉ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｊｄｅｎ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１８；３９１：７４８～７５７．
［４７］Ｒｉｔｔｍｅｙｅｒ Ａ，Ｂａｒｌｅｓｉ Ｆ，Ｗａｔｅｒｋａｍｐ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１７；３８９：２５５～２６５．
［４８］Ｋａｕｆｍａｎ ＨＬ，Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｊ，Ｈａｍｉｄ Ｏ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１６；１７：１３７４～１３８５．
［４９］Ｐａｔｅｌ ＭＲ，Ｅｌｌｅｒｔｏｎ Ｊ，Ｉｎｆａｎｔｅ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；１９：５１～６４．
［５０］Ａｎｔｏｎｉａ ＳＪ，Ｖｉｌｌｅｇａｓ Ａ，Ｄａｎｉｅｌ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１７；３７７：１９１９～１９２９．
［５１］Ｐｏｗｌｅｓ Ｔ，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ＰＨ，Ｍａｓｓａｒｄ Ｃ，ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ．２０１７；３：ｅ１７２４１１．
［５２］Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ＴＮ，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ＲＤ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３４８：６９～７４．
［５３］Ｒｉｚｖｉ ＮＡ，Ｈｅｌｌｍａｎｎ ＭＤ，Ｓｎｙｄｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３４８：１２４～１２８．
［５４］Ｒｉｚｖｉ Ｈ，Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｖｅｇａ Ｆ，Ｌａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；３６：６３３～６４１．
［５５］Ｙａｒｃｈｏａｎ Ｍ，Ｈｏｐｋｉｎｓ Ａ，Ｊａｆｆｅｅ ＥＭ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１７；３７７：２５００～２５０１．
［５６］Ｔｕｍｅｈ ＰＣ，Ｈａｒｖｉｅｗ ＣＬ，Ｙｅａｒｌｅｙ ＪＨ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１４；５１５：５６８～５７１．
［５７］Ｖａｎ Ａｌｌｅｎ ＥＭ，Ｍｉａｏ Ｄ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３５０：２０７～２１１．
［５８］Ｆａｒｅｓ ＣＭ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ ３９．１４７～１６４．
［５９］Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬ，Ｈｏｄｉ ＦＳ，Ｂｒａｈｍｅｒ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１２；３６６：２４４３～２４５４．
［６０］Ｍａｒｔｉｎ ＡＭ，Ｎｉｒｓｃｈｌ ＴＲ，Ｎｉｒｓｃｈｌ ＣＪ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓ．２０１５；１８：３２５～３３２．
［６１］Ｋａｌｌｅｒｇｉ，Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ．２０１８，１０：１－１１．
［６２］Ｇｏｍｅｚ－Ｒｏｃａ ＣＡ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１９．３０（８）：１３８１～１３９２．
［６３］Ｂｅｒｃｏｖｉｃｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９；１０：１５６３．
［６４］Ｗｕｎｄｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．１９９７ Ｓｅｐ；１１（３）：４９７～５０７
［６５］Ｌｏｂｏｄａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５；７４：１１～２２．
［６６］Ｙａｎ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｓｍａｌｌ（２０１９）１５，１９０４３８２．
［６７］Ｍｉｃｈｅｌ ＢＷ，Ｌｉｐｐｅｒｔ ＡＲ，Ｃｈａｎｇ ＣＪ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１２ Ｓｅｐ ２６；１３４（３８）：１５６６８～７１．
配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（ヒト血清アルブミン）
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
［１］．Ｂｒａｙ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．ＣＡＣａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．６８：３９４～４２４（２０１８）．
［２］．Ｇａｊｅｗｓｋｉ，Ｔ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４，１０１４－２２（２０１３）．
［３］．Ｆａｒｋｏｎａ，Ｓ．Ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｍｅｄ．１４，７３（２０１６）．
［４］．Ｋｈａｌｉｌ，Ｄ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３，２７３－２９０（２０１６）．
［５］．Ｋｅｒｓｔｅｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６，（２０１５）．
［６］．Ｐｉｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４，１２５５－１２６９（２０１６）．
［７］．Ａｍａｎｏ，Ｍ．Ｔ．&Ｃａｍａｒａ，Ｎ．Ｏ．Ｍｅｄ．Ｇａｓ．Ｒｅｓ．３，１（２０１３）．
［８］．Ｍｏｔｔｅｒｌｉｎｉ，Ｒ．&Ｏｔｔｅｒｂｅｉｎ，Ｌ．Ｅ．Ｎａｔ．ｖｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．９，７２８－７４３（２０１０）．
［９］．Ｃｈａｖｅｓ－Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１１７２－１１７５（２０１４）．
［１０］．Ｓｚａｂｏ，Ｃ．ＮａｖｅｒＲｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１５，１８５－２０３（２０１５）．
［１１］．Ｋａｗａｈａｒａ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１，４６７～４７３（２０２０）
［１２］．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｅｚｅｍ，Ｅ．Ｎ．&Ｄｕｖａｌｌ Ｃ．Ｌ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．１３０ ７３～８９（２０１８）．
［１３］Ａ Ｘｉａ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９；１０：１７１９．
［１４］Ｍａｒｉｎ－Ａｃｅｖｅｄｏ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；１１：３９．
［１５］Ｎｏｗｉｃｋｉ Ｔ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１８ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；２４（１）：４７－５３．
［１６］Ｒｏｗｓｈａｎｒａｖａｎ Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１８ Ｊａｎ ４；１３１（１）：５８－６７．
［１７］Ａｒｄｏｌｉｎｏ Ｌ．及びＪｏｓｈｕａ Ａ．Ａｕｓｔ Ｐｒｅｓｃｒ．２０１９ Ａｐｒ；４２（２）：６２－６７．
［１８］Ｉｓｍａｉｌｏｖａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ Ａｐｐｌ．２０１８；２０１８：８５４７３６４．
［１９］Ｖｒｅｍａｎ ＨＪ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００５；３４１：２８０－２８９．
［２０］Ｈｏｄｉ ＦＳ，Ｏ’Ｄａｙ ＳＪ，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ＤＦ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０；３６３：７１１～７２３．
［２１］Ｗｅｂｅｒ ＪＳ，Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ ＳＰ，Ｍｉｎｏｒ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１５；１６：３７５～３８４．
［２２］Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ，Ｌｏｎｇ ＧＶ，Ｂｒａｄｙ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１５；３７２：３２０～３３０．
［２３］Ｒｉｂａｓ Ａ，Ｐｕｚａｎｏｖ Ｉ，Ｄｕｍｍｅｒ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１５；１６：９０８～９１８．
［２４］Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ Ｊ，Ｌｏｎｇ ＧＶ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１５；３７２：２５２１～２５３２．
［２５］Ｇａｒｏｎ ＥＢ，Ｒｉｚｖｉ ＮＡ，Ｈｕｉ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１５；３７２：２０１８～２０２８．
［２６］Ｈｅｒｂｓｔ ＲＳ，Ｂａａｓ Ｐ，Ｋｉｍ ＤＷ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１６；３８７：１５４０～１５５０．
［２７］Ｒｅｃｋ Ｍ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ａｂｒｅｕ Ｄ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＡＧ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１６；３７５：１８２３～１８３３．
［２８］Ｃｈｅｎ Ｒ，Ｚｉｎｚａｎｉ ＰＬ，Ｆａｎａｌｅ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１７；３５：２１２５～２１３２．
［２９］Ｃｈｏｗ ＬＱＭ，Ｈａｄｄａｄ Ｒ，Ｇｕｐｔａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１６；３４：３８３８～３８４５．
［３０］Ｂｅｌｌｍｕｎｔ Ｊ，ｄｅ Ｗｉｔ Ｒ，Ｖａｕｇｈｎ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１７；３７６：１０１５～１０２６．
［３１］Ｚｈｕ ＡＸ，Ｆｉｎｎ ＲＳ，Ｅｄｅｌｉｎｅ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；１９：９４０～９５２．
［３２］Ｚｉｎｚａｎｉ ＰＬ，Ｔｈｉｅｂｌｅｍｏｎｔ Ｃ，Ｍｅｌｎｉｃｈｅｎｋｏ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１３０（Ｓｕｐｐｌ １）：２８３３．
［３３］Ｂｏｒｇｈａｅｉ Ｈ，Ｐａｚ－Ａｒｅｓ Ｌ，Ｈｏｒｎ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１５；３７３：１６２７～１６３９．
［３４］Ｃｈｕｎｇ ＨＣ，Ｓｃｈｅｌｌｅｎｓ ＪＨＭ，Ｄｅｌｏｒｄ Ｊ－Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；３６（１５＿ｓｕｐｐｌ）：５５２２．
［３５］Ｆｕｃｈｓ ＣＳ，Ｄｏｉ Ｔ，Ｊａｎｇ ＲＷ，ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；４：ｅ１８００１３．
［３６］Ｐｒａｓａｄ Ｖ，Ｋａｅｓｔｎｅｒ Ｖ，Ｍａｉｌａｎｋｏｄｙ Ｓ．ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；４：１５７～１５８．
［３７］Ｎｇｈｉｅｍ ＰＴ，Ｂｈａｔｉａ Ｓ，Ｌｉｐｓｏｎ ＥＪ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１６；３７４：２５４２～２５５２．
［３８］Ｂｒａｈｍｅｒ Ｊ，Ｒｅｃｋａｍｐ ＫＬ，Ｂａａｓ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１５；３７３：１２３～１３５．
［３９］Ｍｏｔｚｅｒ ＲＪ，Ｅｓｃｕｄｉｅｒ Ｂ，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ＤＦ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１５；３７３：１８０３～１８１３．
［４０］Ｓｈａｒｍａ Ｐ，Ｒｅｔｚ Ｍ，Ｓｉｅｆｋｅｒ－Ｒａｄｔｋｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１７；１８：３１２～３２２．
［４１］Ｅｌ－Ｋｈｏｕｅｉｒｙ ＡＢ，Ｓａｎｇｒｏ Ｂ，Ｙａｕ Ｔ，ｅｔ ａｌ．２０１７；３８９：２４９２～２５０２．
［４２］Ｏｖｅｒｍａｎ ＭＪ，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ Ｒ，Ｌｅａｃｈ ＪＬ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１７；１８：１１８２～１１９１．
［４３］Ｙｏｕｎｅｓ Ａ，Ｓａｎｔｏｒｏ Ａ，Ｓｈｉｐｐ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１６；１７：１２８３～１２９４．
［４４］Ｒｅａｄｙ Ｎ，Ｆａｒａｇｏ ＡＦ，ｄｅ Ｂｒａｕｄ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ．２０１９；１４：２３７～２４４．
［４５］Ｍｉｇｄｅｎ ＭＲ，Ｒｉｓｃｈｉｎ Ｄ，Ｓｃｈｍｕｌｔｓ ＣＤ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１８；３７９：３４１～３５１．
［４６］Ｐｏｗｌｅｓ Ｔ，Ｄｕｒａｎ Ｉ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｊｄｅｎ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１８；３９１：７４８～７５７．
［４７］Ｒｉｔｔｍｅｙｅｒ Ａ，Ｂａｒｌｅｓｉ Ｆ，Ｗａｔｅｒｋａｍｐ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１７；３８９：２５５～２６５．
［４８］Ｋａｕｆｍａｎ ＨＬ，Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｊ，Ｈａｍｉｄ Ｏ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１６；１７：１３７４～１３８５．
［４９］Ｐａｔｅｌ ＭＲ，Ｅｌｌｅｒｔｏｎ Ｊ，Ｉｎｆａｎｔｅ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；１９：５１～６４．
［５０］Ａｎｔｏｎｉａ ＳＪ，Ｖｉｌｌｅｇａｓ Ａ，Ｄａｎｉｅｌ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１７；３７７：１９１９～１９２９．
［５１］Ｐｏｗｌｅｓ Ｔ，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ＰＨ，Ｍａｓｓａｒｄ Ｃ，ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ．２０１７；３：ｅ１７２４１１．
［５２］Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ＴＮ，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ＲＤ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３４８：６９～７４．
［５３］Ｒｉｚｖｉ ＮＡ，Ｈｅｌｌｍａｎｎ ＭＤ，Ｓｎｙｄｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３４８：１２４～１２８．
［５４］Ｒｉｚｖｉ Ｈ，Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｖｅｇａ Ｆ，Ｌａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；３６：６３３～６４１．
［５５］Ｙａｒｃｈｏａｎ Ｍ，Ｈｏｐｋｉｎｓ Ａ，Ｊａｆｆｅｅ ＥＭ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１７；３７７：２５００～２５０１．
［５６］Ｔｕｍｅｈ ＰＣ，Ｈａｒｖｉｅｗ ＣＬ，Ｙｅａｒｌｅｙ ＪＨ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１４；５１５：５６８～５７１．
［５７］Ｖａｎ Ａｌｌｅｎ ＥＭ，Ｍｉａｏ Ｄ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３５０：２０７～２１１．
［５８］Ｆａｒｅｓ ＣＭ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ ３９．１４７～１６４．
［５９］Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬ，Ｈｏｄｉ ＦＳ，Ｂｒａｈｍｅｒ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１２；３６６：２４４３～２４５４．
［６０］Ｍａｒｔｉｎ ＡＭ，Ｎｉｒｓｃｈｌ ＴＲ，Ｎｉｒｓｃｈｌ ＣＪ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓ．２０１５；１８：３２５～３３２．
［６１］Ｋａｌｌｅｒｇｉ，Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ．２０１８，１０：１－１１．
［６２］Ｇｏｍｅｚ－Ｒｏｃａ ＣＡ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１９．３０（８）：１３８１～１３９２．
［６３］Ｂｅｒｃｏｖｉｃｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９；１０：１５６３．
［６４］Ｗｕｎｄｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．１９９７ Ｓｅｐ；１１（３）：４９７～５０７
［６５］Ｌｏｂｏｄａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５；７４：１１～２２．
［６６］Ｙａｎ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｓｍａｌｌ（２０１９）１５，１９０４３８２．
［６７］Ｍｉｃｈｅｌ ＢＷ，Ｌｉｐｐｅｒｔ ＡＲ，Ｃｈａｎｇ ＣＪ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１２ Ｓｅｐ ２６；１３４（３８）：１５６６８～７１．
配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（ヒト血清アルブミン）
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】