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▶ ツェヴェック ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-08
(54)【発明の名称】ＡＡＶを産生する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20230426BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230426BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N7/01 ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022569478
(86)(22)【出願日】2021-11-23
(85)【翻訳文提出日】2022-11-15
(86)【国際出願番号】 EP2021082615
(87)【国際公開番号】W WO2022112218
(87)【国際公開日】2022-06-02
(31)【優先権主張番号】20209811.7
(32)【優先日】2020-11-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517238400
【氏名又は名称】ツェヴェック ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】コロネル ジュリアナ
(72)【発明者】
【氏名】ヴィッシンク ジルケ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065BA01
4B065BC25
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株を準備する工程であって、ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする少なくとも幾つかの又は全ての遺伝子が、細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、工程と、ＡＡＶ産生工程の間（すなわち、Ｎ工程の間）に上記細胞を灌流培養で培養する工程であって、上記灌流培養が、使用済培地の新鮮な培地との連続的な置換を包含し、使用済培地の新鮮な培地との上記連続的な置換がＡＡＶ産生の誘導後に続く、工程とを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株を準備する工程であって、ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする少なくとも幾つかの又は全ての遺伝子が、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、工程と、（ｂ）ＡＡＶ産生工程の間（すなわち、Ｎ工程の間）に前記細胞を灌流培養で培養する工程であって、前記灌流培養が、使用済培地の新鮮な培地との連続的な置換を包含し、使用済培地の新鮮な培地との前記連続的な置換がＡＡＶ産生の誘導後に続く、工程と、
を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法。
【請求項2】
少なくとも以下の遺伝子：ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードする遺伝子、並びに、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子、
が前記宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
少なくとも以下の遺伝子：ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードする遺伝子、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子、並びに、
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、
が前記宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶｒｈ１０、２つ以上の異なる前記血清型の混成物及びＡＡＶ血清型の向性を変化させる突然変異を有する前記血清型からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする全ての遺伝子が前記宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする遺伝子が、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ２Ａ及びＶＡ－ＲＮＡをコードする遺伝子；Ａｄ５ヘルパー遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする遺伝子；並びにＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
以下の更なる遺伝子：ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８とＲｅｐ６８との両方をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２とＲｅｐ４０との両方をコードする遺伝子、及び、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂのいずれか一方又は両方をコードする１つの遺伝子又は複数の遺伝子、
が、前記宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株が、ＣＡＰ細胞、ＡＧＥ１．ｈｎ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳＯ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ１細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、Ｗ１３８細胞及びＨｅｐＧ２細胞からなる群から選択される細胞株である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
灌流培養が、撹拌槽バイオリアクター（ＳＴＲ）、軌道振盪バイオリアクター（ＯＳＢ）、ロッキングベッドバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、管状バイオリアクター、中空糸バイオリアクター（ＨＦＢＲ）、固定床バイオリアクター又は流動床バイオリアクター中で実施される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
灌流培養に使用される灌流デバイスが、ＴＦＦ（接線流濾過）モード又はＡＴＦ（交互接線流）モードで使用される中空糸フィルター；浮遊膜、スピンフィルター、回転筒状フィルター、回転ディスクフィルター、遠心分離機、重力沈降機、ラメラ沈降機、小型細胞沈降機、アコースティック沈降機又は液体サイクロンである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
灌流培養のために使用される前記灌流デバイスがＡＴＦモードで使用される中空糸フィルターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
使用済培地の新鮮な培地との前記連続的な置換が、ＡＡＶ産生の誘導後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間又は少なくとも７２時間にわたって、及び／又はＡＡＶの回収まで続く、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）が約０．０１ｎＬ／細胞／日～約０．２０ｎＬ／細胞／日である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記灌流速度が約１ｖｖｄ（新鮮な培地の量／リアクターの作業量／日）～約２０ｖｖｄである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記灌流培養の播種時の細胞密度が約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ＡＡＶ産生の誘導時点の細胞密度が約２０×１０６細胞／ｍＬ以上である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記灌流培養の保持液からＡＡＶを回収する工程を更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株を準備する工程であって、ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする少なくとも幾つかの又は全ての遺伝子が、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、工程と、ＡＡＶ産生工程の間（すなわち、Ｎ工程の間）に上記細胞を灌流培養で培養する工程であって、上記灌流培養が、使用済培地の新鮮な培地との連続的な置換を包含し、使用済培地の新鮮な培地との上記連続的な置換がＡＡＶ産生の誘導後に続く、工程とを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
最近、ＡＡＶ由来のベクターに基づく遺伝子療法の治験及び製品の数が急速に増加している。遺伝子療法におけるＡＡＶベクターの利点は、優れた安全性プロファイル、そのようなベクターは病原性でない、すなわち、あらゆる疾患と関係がないという事実、導入遺伝子の長期の発現、並びに分裂細胞及び非分裂細胞を形質導入する可能性である。しかし、この有望な研究を臨床開発に移行させるための主な課題は、かなりの量のＡＡＶウイルスベクターを高品質で送達するという課題である。
【0003】
組換えＡＡＶの産生は、トランスで供給される組換えウイルスの産生のために、通常ＡＡＶゲノムにコードされるＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質の発現を特に必要とする。さらに、異なるヘルパーウイルスに由来し得るヘルパー遺伝子が使用され、最も一般的なものは、アデノウイルス（ＡＶ）から得られるヘルパーウイルス遺伝子、例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６又はＶＡ ＲＮＡである。さらに、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含むトランスファーベクターが必要とされる。
【0004】
ＡＡＶの現在の産生システムは、以下の技術に大抵依拠するが、幾つかの欠点がある。
【0005】
組換えＡＡＶを産生する最も一般的なシステムは、ＡＡＶ産生に必要である全ての遺伝子を一過性トランスフェクションによって産生細胞中に導入することに依拠する。一過性トランスフェクションは、通常、２つ又は３つのプラスミドシステム：目的の遺伝子を含むトランスファーベクター；アデノウイルスのヘルパー機能を有するｐＨｅｌｐｅｒ；並びにカプシド及びレプリカーゼ機能を供給するｐＡＡＶ－Ｒｅｐ２ＣａｐＸ（ＣａｐＸ＝異なるＡＡＶ血清型のカプシド機能）を必要とする。しかし、このアプローチには幾つかの欠点がある。特に、一過性トランスフェクション工程が理由で、この方法は、高費用のプラスミドＤＮＡを必要とし、十分な拡大縮小性、頑強性及び再現性を欠く。
【0006】
また、一過性トランスフェクションの工程は、大規模な培地及び供給最適化、並びにｐＨ、温度又は細胞密度のようなプロセスパラメーターの産生中の変動のような、他の組換え型生物学的製剤の産生でよく見られる生成物の力価又は生成物の品質を高めるための或る特定のプロセス最適化工程を妨害する。特に、後者は、全体的な生成物の力価を高めるための有望なアプローチである。より高い細胞密度は、一般に、細胞特異的生産性が低下しない限り、力価が高まることにつながる（「細胞密度効果」）。特に、一過性トランスフェクションを使用している間は、細胞密度を高めると同時に細胞特異的生産性が低下する場合がある。これは、特に、ウイルスベクターの産生についても記載されている。
【0007】
ＡＡＶの産生は、特定の産生プロセスとは無関係に、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接するパッケージングされた目的の遺伝子（ＧＯＩ）を意味する完全なＡＡＶ粒子と、パッケージングされたＧＯＩを含まない空粒子との混合物を常にもたらす。例えばＨＥＫ２９３細胞等の哺乳動物懸濁細胞の一過性トランスフェクションによって達成されるＡＡＶの力価は、プロセスに応じて、１×１０１３ｖｇ／Ｌ（ウイルスゲノム／Ｌ）～１×１０１５ｖｇ／Ｌの範囲である。一過性トランスフェクションによって、完全な粒子の割合は最大で約３０％の完全な粒子と報告されたが、通常は１０％～１８％の範囲である。これは、８２％～９０％が望ましくない空粒子であることを意味する。空粒子は治療的に不活性であり、患者の免疫応答を高める可能性がある。したがって、産生後の精製プロセスにおいて、これらの空粒子は、できるだけ効率的に除去されなければならない。これは、有効であるが、拡大縮小可能ではないプロセスである遠心分離を介するか又はクロマトグラフィー法によるかのいずれかで達成することができる。後者は、大量産生にも利用可能であるが、完全な粒子の倍数濃縮は通常たった約３倍～６倍の範囲である。したがって、例えば、およそ１０％の完全な粒子をともなう試料の濃縮は、たった約３０％～６０％の完全な粒子という最終的な割合をもたらす。
【0008】
既に安定して組み込みこまれた目的の遺伝子を有する、いわゆるプロデューサー細胞株は、ＨＥＫ細胞又はＨｅＬａ細胞に大抵基づく。しかし、これらは、ヘルパーウイルス、例えばアデノウイルスによる更なる感染を必要とする。ＡＡＶ産生中のヘルパーウイルスのこの追加は、対応するヘルパーウイルスの最初の産生の後に、産生されたＡＡＶベクターの大規模な精製により最終的な生成物からヘルパーウイルスを除去すること、及び費用をかけてヘルパーウイルスが存在しないことを証明することを必要とする。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベースのシステムにも同じことが当てはまる。さらに、バキュロウイルスベースのシステムは、十分な拡大縮小性及び頑強性を欠き、昆虫宿主細胞タンパク質及び免疫原性の昆虫細胞特異的グリコシル化構造物が混入する危険性を加える。
【0009】
したがって、現在のＡＡＶ産生システムは、拡大縮小性、頑強性、再現性、使いやすさ及び費用効率に関してだけでなく、生成物の品質に関しても制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、特に、生成物の力価及び／又は細胞特異的収率及びさらにいっそう重要なことに、特に完全な粒子の割合の点から生成物の品質を高めることを目的として、一過性トランスフェクション又はヘルパーウイルスを必要とせず、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの頑強な、産業的及び拡大縮小可能な産生、並びに大規模な上流プロセスの開発の最適化を可能にする、ＡＡＶベクターを安定して産生する拡大縮小可能なシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
上記の技術的課題の解決は、特許請求の範囲を特徴とする実施の形態によって達成される。
【0012】
特に、第１の態様において、本発明は、
（ａ）安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株を準備する工程であって、ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする少なくとも幾つかの又は全ての遺伝子が、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、工程と、
（ｂ）ＡＡＶ産生工程の間（すなわち、Ｎ工程の間）に上記細胞を灌流培養で培養する工程であって、上記灌流培養が、使用済培地の新鮮な培地との連続的な置換を包含し、使用済培地の新鮮な培地との上記連続的な置換がＡＡＶ産生の誘導後に続く、工程とを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法に関する。
（ａ）安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株を準備する工程であって、ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする少なくとも幾つかの又は全ての遺伝子が、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、工程と、
（ｂ）ＡＡＶ産生工程の間（すなわち、Ｎ工程の間）に上記細胞を灌流培養で培養する工程であって、上記灌流培養が、使用済培地の新鮮な培地との連続的な置換を包含し、使用済培地の新鮮な培地との上記連続的な置換がＡＡＶ産生の誘導後に続く、工程とを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法に関する。
【0013】
本発明のＡＡＶは特定のＡＡＶ血清型に限定されない。したがって、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶｒｈ１０、２つ以上の異なる上記血清型の混成物及びＡＡＶ血清型の向性を変化させる突然変異を有する上記血清型からなる群から選択することができる。好ましくは、ＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９からなる群から選択され、ここでは、ＡＡＶ８が特に好ましい。
【0014】
本発明によれば、ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする少なくとも幾つかの又は全ての遺伝子が、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる。好ましくは、上記遺伝子の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ又は全てが、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる。より好ましくは、上記遺伝子の全てが宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる。
【0015】
この文脈では、本発明によれば、ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする遺伝子は、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ２Ａ及びＶＡ－ＲＮＡをコードする遺伝子；Ａｄ５ヘルパー遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする遺伝子；並びにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）からなる群から選択される。好ましくは、ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする遺伝子は、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８をコードする遺伝子、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６をコードする遺伝子；並びにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含む。特定の実施の形態においては、ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする遺伝子は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ又は全て；並びにアデノウイルスのヘルパー機能Ｅ２Ａ及びＶＡ－ＲＮＡをコードする遺伝子；並びにＡｄ５ヘルパー遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする遺伝子を更に含む。
【0016】
したがって、特定の実施の形態においては、本発明の方法の工程（ａ）で準備される安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株では、以下の遺伝子：
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードする遺伝子、並びに、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子、
が宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる。
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードする遺伝子、並びに、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子、
が宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる。
【0017】
他の特定の実施の形態においては、本発明の方法の工程（ａ）で準備される安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株では、以下の遺伝子：
ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードする遺伝子、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子、並びに、
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、
が宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる。
ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードする遺伝子、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子、並びに、
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、
が宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる。
【0018】
更に特定の実施の形態においては、本発明の方法の工程（ａ）で準備される安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株では、以下の遺伝子：
ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８のいずれか一方又は両方をコードする１つの遺伝子又は複数の遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０のいずれか一方又は両方をコードする１つの遺伝子又は複数の遺伝子、
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、並びに、
場合により、アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ又は全てをコードする１つの遺伝子又は複数の遺伝子、
が宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる。
ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８のいずれか一方又は両方をコードする１つの遺伝子又は複数の遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０のいずれか一方又は両方をコードする１つの遺伝子又は複数の遺伝子、
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、並びに、
場合により、アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ又は全てをコードする１つの遺伝子又は複数の遺伝子、
が宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる。
【0019】
関連した特定の実施の形態においては、本発明の方法の工程（ａ）で準備される安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株では、以下の遺伝子：
（ｉ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２若しくはＲｅｐ４０をコードする遺伝子；並びにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、又は、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２若しくはＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６をコードする遺伝子；並びにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、又は、
（ｉｉｉ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２若しくはＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子；並びにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、又は、
（ｉｖ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２若しくはＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子；並びにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、又は、
（ｖ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子；並びにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、又は、
（ｖｉ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子；並びにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、
が宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる。
（ｉ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２若しくはＲｅｐ４０をコードする遺伝子；並びにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、又は、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２若しくはＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６をコードする遺伝子；並びにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、又は、
（ｉｉｉ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２若しくはＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子；並びにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、又は、
（ｉｖ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２若しくはＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子；並びにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、又は、
（ｖ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子；並びにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、又は、
（ｖｉ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子；並びにＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、
が宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる。
【0020】
特定の一実施の形態においては、本発明によるＡＡＶを産生する方法は、
（ａ）安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株を準備する工程であって、ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする少なくとも幾つかの又は全ての遺伝子が、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、工程と、
（ｂ）ＡＡＶ産生工程の間（すなわち、Ｎ工程の間）に上記細胞を灌流培養で培養する工程であって、上記灌流培養が、使用済培地の新鮮な培地との連続的な置換を包含し、使用済培地の新鮮な培地との上記連続的な置換がＡＡＶ産生の誘導後に続く、工程とを含み、
ここで、少なくとも以下の遺伝子：
ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードする遺伝子、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子、並びに、
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、
が宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる。
（ａ）安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株を準備する工程であって、ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする少なくとも幾つかの又は全ての遺伝子が、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、工程と、
（ｂ）ＡＡＶ産生工程の間（すなわち、Ｎ工程の間）に上記細胞を灌流培養で培養する工程であって、上記灌流培養が、使用済培地の新鮮な培地との連続的な置換を包含し、使用済培地の新鮮な培地との上記連続的な置換がＡＡＶ産生の誘導後に続く、工程とを含み、
ここで、少なくとも以下の遺伝子：
ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードする遺伝子、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子、並びに、
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、
が宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる。
【0021】
この特定の実施の形態においては、以下の更なる遺伝子：
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８とＲｅｐ６８との両方をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２とＲｅｐ４０との両方をコードする遺伝子、及び、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂのいずれか一方又は両方をコードする１つの遺伝子又は複数の遺伝子、
を宿主細胞ゲノム中に安定して組み込むことができる。
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８とＲｅｐ６８との両方をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２とＲｅｐ４０との両方をコードする遺伝子、及び、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂのいずれか一方又は両方をコードする１つの遺伝子又は複数の遺伝子、
を宿主細胞ゲノム中に安定して組み込むことができる。
【0022】
本発明の文脈において使用されるＧＯＩは特に限定されず、例えば、眼疾患、失明疾患、筋疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ＧＭ２ガングリオシドーシス及び脊髄小脳失調型、ＡＬＳ、ハンチントン病、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（Ｘ－ＳＣＩＤ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）、中枢神経系疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、肝疾患、肝臓酵素オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、レーバー先天黒内障、血友病、β－サラセミア、癌疾患、頭頸部癌、転移性黒色腫、心疾患、肺疾患又は嚢胞性線維症、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）及び重症リポタンパク質リパーゼ欠損障害（ＬＰＬＤ）感染症、重症複合免疫不全症候群、ＨＩＶ感染症、ニーマン・ピック病Ｃ型及びオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症をはじめとする希少疾患の治療のための、ＡＡＶベクターの受容者へのその移行が目的である任意の遺伝子を含む。
【0023】
本発明で使用される安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株は、当該技術分野で既知の任意の適切な細胞株に由来し得る。しかし、好ましい実施の形態においては、上記細胞株は、ＣＡＰ細胞、ＡＧＥ１．ｈｎ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳＯ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ１細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、Ｗ１３８細胞及びＨｅｐＧ２細胞からなる群から選択される細胞株に由来するか、又はこれらの細胞からなる群から選択される細胞株であり、ここでは、ＣＡＰ細胞及びＨＥＫ２９３細胞が特に好ましい。特定の態様においては、上記の細胞株はＣＡＰ細胞に由来するか又はＣＡＰ細胞株である。別の特定の実施の形態においては、上記の細胞株はＨＥＫ２９３細胞に由来するか又はＨＥＫ２９３細胞株である。この文脈では、用語「安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株は細胞株Ｘに由来する」は、上記安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株が、上記で示されるそれぞれの遺伝子を細胞株Ｘの細胞中に安定して組み込むことによって生成されることを示す。したがって、上記の用語は、前述のように、安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株が細胞株Ｘであることを明確に包含する。この文脈では、用語「安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株は細胞株Ｘに由来する」は、「安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株は細胞株Ｘに基づく」と読み取ることができ、それぞれの用語は本明細書において互換的に使用することができる。
【0024】
本発明によるＡＡＶ産生のスケールは、産生の実行あたり、ミリリットル範囲の小量から中程度の量を超えて例えば、２０００Ｌ又は２５０００Ｌの量を用いる大規模な量まで変動し得る。
【0025】
本発明の方法の工程（ｂ）の灌流培養は、当該技術分野で既知の任意の適切な培養容器又はシステムで行うことができる。この点において使用することができる異なるタイプのバイオリアクターには、撹拌槽バイオリアクター（ＳＴＲ）、軌道振盪バイオリアクター（ＯＳＢ）、ロッキングベッドバイオリアクター（例えば、ＷＡＶＥ、Ｒｏｃｋｉｎｇ Ｍｏｔｉｏｎ）、エアリフトバイオリアクター又は管状バイオリアクターが含まれる。これらのバイオリアクタータイプのいずれについても、ガラス、ステンレス鋼又は使い捨てのバイオリアクター容器を使用することができる。また、灌流デバイスに連結されたハイスループットバイオリアクターを含めて、妥当なマルチパラレルバイオリアクターを使用することができる。接着細胞用に設計された灌流バイオリアクター、例えば、中空糸バイオリアクター（ＨＦＢＲ）、固定床バイオリアクター（例えば、充填床バイオリアクター）及び流動床バイオリアクターも使用することができる。
【0026】
灌流培養の操作モードには、特に限定されないが、当該技術分野で既知のように、標準的な灌流（連続的）、濃縮灌流（連続的）、ハイブリッド灌流／フェドバッチ、量を拡大した灌流及び２段階連続プロセスが含まれる。灌流デバイスには、ＴＦＦ（接線流濾過）及びＡＴＦ（交互接線流）等のストラテジーの下で操作される中空糸フィルター、浮遊膜、スピンフィルター及び回転筒状フィルター（別名、渦流フィルター又は外部スピンフィルター）並びに回転ディスクフィルター（別名、制御剪断（controlled-shear）フィルター）が含まれ、ここでは、ＡＴＦ灌流培養が特に好ましい。ペリスタルティックポンプ、ダイヤフラムポンプ又は磁気浮上に基づく遠心ポンプ（例えば、Ｌｅｖｉｔｒｏｎｉｘ）を用いて操作する中空系ベースの又は管状の膜モジュール等の他のタイプの濾過デバイスも使用することができる。また更なる灌流デバイスには、当該技術分野で既知のように、重力沈降機（ラメラ沈降機、小型細胞沈降機（compact cell settlers））、アコースティック沈降機（acoustic settlers）（別名、アコースティックフィルター（acoustic filter））、遠心分離機及び液体サイクロンが含まれる。
【0027】
本発明によれば、灌流培養は、使用済培地の新鮮な培地との連続的な置換（すなわち、連続的培地交換）を包含し、ここでは、使用済培地の新鮮な培地との上記連続的な置換がＡＡＶ産生の誘導後に続く。好ましい実施の形態においては、使用済培地の新鮮な培地との上記連続的な置換は、誘導後少なくとも２４時間、誘導後少なくとも４８時間、誘導後少なくとも７２時間にわたって、及び／又はＡＡＶの回収まで続く。当該技術分野で既知のように、用語「使用済培地の新鮮な培地との連続的な置換」又は「連続的培地交換」は、使用済培地の新鮮な培地との間断なく行われる置換（すなわち、間断なく行われる培地交換）を必ずしも必要とせず、当該技術分野で既知のように、１日数回間隔をあけて上記置換を休止することも可能である。例として、置換又は培地交換の可能な休止は、例えば、１日１回、２回、３回、４回、５回若しくは６回の１時間まで若しくは２時間までの休止であり、又は例えば、１日１回若しくは２回の６時間まで若しくは１２時間までの休止である。
【0028】
好ましい実施の形態においては、灌流培養の間の細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）は、約０．０１ｎＬ／細胞／日～約０．２０ｎＬ／細胞／日である。さらに、灌流速度は、好ましくは約１ｖｖｄ（新鮮な培地の量／リアクターの作業量／日）～約２０ｖｖｄである。
【0029】
本発明によれば、方法は、約０．１×１０６細胞／ｍＬ～約２．０×１０６細胞／ｍＬの範囲の低い生存細胞密度（ＶＣＤ）又は約２．０×１０６細胞／ｍＬ～約２０×１０６細胞／ｍＬの範囲の高いＶＣＤの播種時の細胞密度で開始することができる。好ましい実施の形態においては、灌流培養の播種時の細胞密度は約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬである。
【0030】
さらに、ＡＡＶ産生の誘導時点の細胞密度は、約１．０×１０６細胞／ｍＬ～約１０×１０６細胞／ｍＬの範囲の低いＶＣＤ、約１０×１０６細胞／ｍＬ～約１００×１０６細胞／ｍＬの範囲の高いＶＣＤ又は約１００×１０６細胞／ｍＬ～約２００×１０６細胞／ｍＬの範囲の非常に高いＶＣＤであり得る。好ましい実施の形態においては、ＡＡＶ産生の誘導時点の細胞密度は約２０×１０６細胞／ｍＬ以上である。
【0031】
特定の実施の形態においては、本発明の方法は、灌流培養の保持液からＡＡＶを回収する工程を含むことができる。
【0032】
本発明の方法では、播種後からＡＡＶ産生の誘導までのプロセス時間は０日～２１日の範囲であり得る。さらに、誘導後のプロセス時間は誘導後２日～１０日の範囲であり得る。
【0033】
ＡＡＶの最大力価を達成するために、当該技術分野で既知のように、プロセスパラメーター、例えば、播種細胞密度、温度、撹拌速度、ｐＨ、ＤＯ（溶存酸素）、モル浸透圧濃度及び／又はバイオリアクターの作業量等を産生プロセスの間に変えることができる。また、当該技術分野で既知のように、或る特定のアミノ酸、サッカリド、有機酸、補助因子、ビタミン、ミネラル及び／又は他の要素の欠乏を回避するために、不足している成分を細胞培養に補充することは、産生プロセスの一部であり得る。
【0034】
第２の態様においては、本発明は、上記で定義された本発明による方法によって得ることができるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に関する。
【0035】
本明細書において使用する場合、用語「含む」（"comprising"/"comprises"）は、用語「から本質的になる」（"consisting essentially of"/"consists essentially of"）及び「からなる」（"consisting of"/"consists of"）を明確に含み、すなわち、上記用語の全ては互いに互換的である。
【0036】
本明細書において使用する場合、用語「約」は、特定の値の±１０％、好ましくは±７％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％又は±０．５％の変動である。例として、本明細書において使用する場合、用語「約１０」は９～１１の範囲を指すことができる。
【0037】
本発明では、十分に安定なＡＡＶプロデューサー細胞株は、ＡＡＶベクターの大規模製造のための有効な方法を提示する。これらの十分に安定なＡＡＶプロデューサー細胞は、例えば、カプシド遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）、調節遺伝子（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０）、アデノウイルスのヘルパー機能（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ２Ａ及びＶＡ－ＲＮＡ）並びにＩＴＲ隣接性導入遺伝子（目的の遺伝子；ＧＯＩ）の安定な組み込みを有する細胞からなる。このシステムでは、４つのｒｅｐタンパク質並びにヘルパー機能Ｅ２Ａ及びＥ４ｏｒｆ６の発現は誘導性システムの制御下にある。誘導因子の添加によって、前述のタンパク質が発現し、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターが産生される。
【0038】
この安定なシステムは、一過性トランスフェクション工程又はヘルパー感染工程を必要としないため、幾つかの利点を有する。したがって、プラスミド費用又はヘルパーウイルスの産生のための更なる費用が省かれるので、物品の費用が低減する。本システムは拡大縮小可能で、非常に再現性があり、バッチ間変動がごくわずかであるか又はない。
【0039】
最も重要なことに、一過性トランスフェクション又はウイルス感染の必要がない、本発明で使用される安定なＡＡＶ産生細胞株は、例えば、ウイルス力価収率（容積生産性及び／又は細胞特異的ウイルス収率）を高めるために、及び／又は特に完全な粒子の割合の点から、生成物の品質を高めるために、大規模な上流細胞培養プロセスの開発及び最適化も可能にする。
【0040】
一般に、上流細胞培養プロセスは、バッチで、フェドバッチで、連続的に、又は細胞再循環（灌流）モードをともなって連続的に、又は混成モード（例えば、灌流とフェドバッチとの混成型）で操作され得る。操作モードによって、増殖プロファイル及び産生動態が決定される。
【0041】
灌流モードでは、新鮮な培地の供給（入口）及び使用済培地の除去（出口）は、通常、入口及び出口で同じ流速を使用して行われ、その結果、バイオリアクター量が一定に維持される。細胞は、細胞保持（又は灌流）デバイスを使用して、産生システム（バイオリアクター）中に保持される。したがって、高い細胞密度を得ることができる。典型的には、灌流によって、他の操作モードと比較して、より少ない設置面積（footprints）でより高い容積生産性が可能になる。
【0042】
細胞分離のための様々なメカニズム：沈降（重力又は遠心力場の下）、超音波場下の凝集（それに続く沈降）及び濾過を使用した、様々な灌流デバイスを使用することができる。したがって、分離効率はデバイスの選択に依存する。例は、遠心分離機、重力沈降機（ラメラ沈降機、小型細胞沈降機）、アコースティック沈降機（別名、アコースティックフィルター）、遠心分離機、液体サイクロン及びフィルターである。濾過は以下の様々なストラテジー下で操作される：ＴＦＦ（接線流濾過）及びＡＴＦ（交互接線流）、浮遊膜、スピンフィルター及び回転筒状フィルター（別名、渦流フィルター又は外部スピンフィルター）並びに回転ディスクフィルター（別名、制御剪断フィルター）。様々なタイプのフィルターの中で、ＴＦＦ及びＡＴＦが灌流のために一般に使用される。両方の場合で、フィルター膜を備える中空糸モジュールが使用される。ＡＴＦの場合には、ダイヤフラムポンプを介して二方向の流れが得られる。現在では、ＡＴＦは、組換えタンパク質産生（生物製剤）に大抵使用される細胞保持デバイスである。灌流は生物製剤製造プロセスについては十分に確立されているが、ウイルスベクターの拡大縮小可能な製造にはまだ利用可能でない。
【0043】
要約すると、本発明によるｒＡＡＶ産生の灌流プロセスによって、安定なＡＡＶプロデューサー細胞を用いた従来のバッチプロセスと比較して、より高い力価（ｖｇ／Ｌ）及びより高い細胞特異的ウイルス収率（ｖｇ／細胞）が可能になった。予想外に、安定なＡＡＶ産生システムで灌流を適用すると、従来のバッチプロセスと比較して、完全なウイルス粒子と空ウイルス粒子との比が劇的に増加した。また、ＡＡＶウイルスベクターの回収は、透過液の代わりに保持液（バルクでバイオリアクターから収集された全細胞懸濁液）から行うことができ、これは、引き続くＡＡＶ精製プロセスの量を劇的に低減させた。これにより、全体的なプロセスがより効率的になる。
【0044】
本発明で記載される十分に安定なＡＡＶプロデューサープラットフォームの利用は、完全に一過性のアプローチと比較して、完全な粒子について同様のパーセンテージをもたらす。しかし、これは、バッチ又はフェドバッチアプローチにおけるＡＡＶ粒子の製造にしか当てはまらない。予想外に、灌流を利用する十分に安定なプロデューサー細胞システムを用いたＡＡＶウイルスベクターの製造は、好都合なことに、参照バッチプロセスと比較して、完全な粒子のパーセンテージを最大で約１０倍まで劇的に増加させる。したがって、例えばＡＥＸクロマトグラフィーを利用することによる、引き続く完全な粒子の濃縮工程において、完全な粒子について７５％以上という最終的な割合を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【0045】
【図1】疑似灌流モードでの振盪フラスコ（ＳＦ）における安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサーの増殖を示すグラフである。Ａ）高細胞密度までの振盪フラスコ（ＳＦ）１及び２（生物学的複製物）における培養の細胞増殖及び生存率。Ｂ）生物学的複製物の平均ＶＣＤを用いて計算した細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）。
【図2】ｒＡＡＶ産生のためのＡＴＦベースの灌流プロセスの概略図である。新鮮な培地の連続的添加（供給）及び使用済培地の除去（透過）が行われる。ＡＴＦ（交互接線流）を灌流デバイスとして示す。
【図3】安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー細胞を用いたｒＡＡＶ産生のためのＡＴＦベースの灌流プロセスを示すグラフである。灌流バイオリアクターにおけるＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー細胞株の生細胞密度（ＶＣＤ、実線）及び生存率（破線）。３回の独立の培養：実行１（◆）、２（◇）及び３（●）。灌流モードは、接種後３日目（灰色の垂直線）に開始する。ｒＡＡＶの産生は、接種後７日目（垂直破線）に開始する。産生フェーズは、誘導後５日目まで行う。
【図4】安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー細胞を用いたｒＡＡＶ産生のための従来のバッチプロセスを示すグラフである。バッチモードでのバイオリアクターにおけるＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー細胞株の生細胞密度（ＶＣＤ、実線）及び生存率（破線）。２回の独立の培養：実行１（■）及び２（□）。ｒＡＡＶの産生は、接種後３日目（垂直破線）に開始する。
【図5】安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー細胞を用いた、バッチプロセスと比較した灌流モードでのｒＡＡＶの産生を示すグラフである。ＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー細胞株を用いて、灌流モードでの３回の実行及びバッチモードでの２回の実行を行った。Ａ）ｑＰＣＲによって決定したＡＡＶ８のゲノム力価。Ｂ）ＥＬＩＳＡによって決定したカプシドの濃度。データは、誘導後５日目の２回のバッチプロセスの平均値に対して正規化される。
【図6】安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー細胞を用いた灌流モードでの全カプシドのより高いパーセンテージを示すグラフである。バッチ参照プロセスとの比較。ゲノム力価（図５Ａ）対カプシド力価（図５Ｂ）の比として、パーセンテージを計算した。データは、バッチの実行に対して正規化される。Ａ）灌流モード（ｎ＝３）及びバッチモード（ｎ＝２）でのプロセスのタイムコース。ｎは生物学的反復の数を表す。Ｂ）全カプシドのデータは、生物学的反復の平均±標準偏差として表す。
【図7】安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー細胞を用いた灌流モードでの細胞特異的ウイルス収率（ＣＳＶＹ）の増加を示すグラフである。バッチ参照プロセスとの比較。回収時のゲノム力価対誘導時の生細胞密度の比として、収率を計算した。データは、生物学的反復の平均±標準偏差として表す（灌流：ｎ＝３、バッチ：ｎ＝２）。データは、誘導後５日目のバッチに対して正規化される。
【図8】灌流及びバッチで産生中のＣＡＰ由来ＡＡＶ粒子の感染力を示すグラフである。データは、各産生の実行の誘導後３日目に対して正規化される。
【図9】ＡＡＶ産生フェーズの間のＡＴＦベースの灌流プロセスの中断が誘導後の生細胞密度及び細胞生存率の低下をもたらすことを示すグラフである。生細胞密度（ＶＣＤ、実線）及び生存率（破線）。灌流モードは、接種後３日目（灰色の垂直線）に開始する。ｒＡＡＶの産生は、接種後８日目（垂直破線）に開始する。産生フェーズは、誘導後４日目までバッチモードで行う。
【図10】ＡＡＶ産生フェーズの間のＡＴＦベースの灌流プロセスの中断がＡＡＶの力価の劇的な低下をもたらすことを示すグラフである。ｑＰＣＲによって決定したＡＡＶ８のゲノム力価。回収時に測定した高細胞密度（ＨＣＤ）バッチの力価。データは、誘導後５日目の従来の低細胞密度（ＬＣＤ）バッチに対して正規化される。
【図11】安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープール細胞を用いた、安定なｒＡＡＶ産生のためのＡＴＦベースの灌流プロセスを示すグラフである。灌流バイオリアクター（◆）における安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープールの生細胞密度（ＶＣＤ、実線）及び生存率（破線）。灌流は、接種後３日目（灰色の垂直線）に開始する。ｒＡＡＶの産生は、接種後６日目（垂直破線）に開始する。産生フェーズは誘導後４日目まで続く。
【図12】バッチモードで安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープール細胞を用いた、安定なｒＡＡＶ産生を示すグラフである。バッチ振盪フラスコ（□）における安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープールの生細胞密度（ＶＣＤ、実線）及び生存率（破線）。バッチモードでの産生は接種後３日目（垂直破線）に開始し、誘導後５日目まで行う。
【図13】安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープール細胞を用いた灌流モードでのｒＡＡＶの産生を示すグラフである。灌流モードでの１回の実行及びバッチモードでの１回の実行。Ａ）ｑＰＣＲによって決定したＡＡＶ８のゲノム力価。Ｂ）ＥＬＩＳＡによって決定したカプシドの濃度。データは、バッチ対照の誘導後３日目に対して正規化される。
【図14】安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープール細胞を用いた灌流モードでの細胞特異的ウイルス収率（ＣＳＶＹ）の増加を示すグラフである。ピークゲノム力価対誘導時の生細胞密度の比として、収率を計算した。結果は、バッチ対照に対して正規化される。
【図15】安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープール細胞を用いた灌流モードでの全カプシドのより高いパーセンテージを示すグラフである。正規化したゲノム力価（図１３Ａ）対正規化したカプシド力価（図１３Ｂ）の比として、パーセンテージを計算した。データは、バッチ対照に対して正規化される。
【図16】ＡＥＸの実行の様々な画分からのＡＡＶ粒子のＳｙｐｒｏＲｕｂｙ染色によって約１：１：１０のＶＰ１対ＶＰ２対ＶＰ３の比が明らかになることを示す写真である。２回の異なるＡＥＸの実行の様々な画分からのカプシドをＳｙｐｒｏＲｕｂｙ染色によって可視化した。
【図17】ＡＥＸ精製後の完全対空の比を示すグラフである。ＥＬＩＳＡによるウイルス粒子及びｑＰＣＲによるウイルスゲノム力価の決定後、ＡＴＦ灌流を利用するＡＡＶ産生からの２回のＡＥＸの実行に由来する様々な画分の完全粒子対空粒子の比を計算した。
【発明を実施するための形態】
【0046】
本発明は、以下のヌクレオチド配列に関する：
配列番号１
ＳＶ４０ポリＡフォワードプライマー
ＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡ
配列番号２
ＳＶ４０ポリＡリバースプライマー
ＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴ
配列番号３
ＳＶ４０ポリＡプローブ
ＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣ
配列番号４
ＧＦＰフォワードプライマー
ＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣ
配列番号５
ＧＦＰリバースプライマー
ＡＡＧＴＣＧＡＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣ
配列番号６
ＧＦＰプローブ
ＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡ
配列番号１
ＳＶ４０ポリＡフォワードプライマー
ＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡ
配列番号２
ＳＶ４０ポリＡリバースプライマー
ＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴ
配列番号３
ＳＶ４０ポリＡプローブ
ＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣ
配列番号４
ＧＦＰフォワードプライマー
ＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣ
配列番号５
ＧＦＰリバースプライマー
ＡＡＧＴＣＧＡＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣ
配列番号６
ＧＦＰプローブ
ＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡ
【0047】
以下の実施例によって本発明を更に説明するが、本発明はそれらに限定されない。
【実施例】
【0048】
実験手順
プロデューサー細胞株：
ＡＡＶの産生に必要な全ての成分を有する安定なＡＡＶプロデューサー細胞株を灌流プロセスの開発のために選択した。（１）ＣＡＰ細胞に基づく細胞株及び（２）ＨＥＫ２９３細胞に基づく細胞株の２つの細胞株を使用した。
（１）血清型特異的カプシド（ＡＡＶ８）の誘導因子Ｔｅｔ３Ｇ、誘導性レプリカーゼ、誘導性ヘルパー（Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６）、ＶＡ－ＲＮＡ、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３並びにＩＴＲ隣接性の目的の遺伝子（ＧＯＩ）ＧＦＰに対する配列を含む、安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー単一細胞クローン。また、Ａｄ５ヘルパー遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂは、ＣＡＰ細胞がこれらによって既に不死化されていたように、ＣＡＰ細胞に既に安定して組み込みこまれている。
（２）血清型特異的カプシド（ＡＡＶ８）の誘導因子Ｔｅｔ３Ｇ、誘導性レプリカーゼ、誘導性ヘルパー（Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６）、ＶＡ－ＲＮＡ、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３並びにＩＴＲ隣接性の目的の遺伝子（ＧＯＩ）ＧＦＰ－ルシフェラーゼに対する配列を含む、安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープール。また、Ａｄ５ヘルパー遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂは、ＨＥＫ細胞がこれらによって既に不死化されていたように、ＨＥＫ細胞に既に安定して組み込みこまれている。
プロデューサー細胞株：
ＡＡＶの産生に必要な全ての成分を有する安定なＡＡＶプロデューサー細胞株を灌流プロセスの開発のために選択した。（１）ＣＡＰ細胞に基づく細胞株及び（２）ＨＥＫ２９３細胞に基づく細胞株の２つの細胞株を使用した。
（１）血清型特異的カプシド（ＡＡＶ８）の誘導因子Ｔｅｔ３Ｇ、誘導性レプリカーゼ、誘導性ヘルパー（Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６）、ＶＡ－ＲＮＡ、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３並びにＩＴＲ隣接性の目的の遺伝子（ＧＯＩ）ＧＦＰに対する配列を含む、安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー単一細胞クローン。また、Ａｄ５ヘルパー遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂは、ＣＡＰ細胞がこれらによって既に不死化されていたように、ＣＡＰ細胞に既に安定して組み込みこまれている。
（２）血清型特異的カプシド（ＡＡＶ８）の誘導因子Ｔｅｔ３Ｇ、誘導性レプリカーゼ、誘導性ヘルパー（Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６）、ＶＡ－ＲＮＡ、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３並びにＩＴＲ隣接性の目的の遺伝子（ＧＯＩ）ＧＦＰ－ルシフェラーゼに対する配列を含む、安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープール。また、Ａｄ５ヘルパー遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂは、ＨＥＫ細胞がこれらによって既に不死化されていたように、ＨＥＫ細胞に既に安定して組み込みこまれている。
【0049】
細胞培養：
（１）通常の培養については、振盪インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２及び１２０ｒｐｍ～１８５ｒｐｍで、非バッフル振盪フラスコにおいて、４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Gibco）が補充されたタンパク質発現培地（ＰＥＭ）（Life Technologies／Gibco）中でＣＡＰ細胞を培養した。３日～４日ごとに、０．５×１０６細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬの生細胞密度にするように、新鮮な培地でルーチン的に細胞を継代した。
（２）通常の培養については、振盪インキュベーターにおいて、３７℃、５％ＣＯ２及び１７０ｒｐｍ～２００ｒｐｍで、非バッフル振盪フラスコにおいて、４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Gibco）が補充されたタンパク質発現培地（ＰＥＭ）（Life Technologies／Gibco）中で、ＨＥＫ２９３細胞を培養した。２日～３日ごとに、０．３×１０６細胞／ｍＬ～０．５×１０６細胞／ｍＬの生細胞密度にするように、新鮮な培地でルーチン的に細胞を継代した。
（１）通常の培養については、振盪インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２及び１２０ｒｐｍ～１８５ｒｐｍで、非バッフル振盪フラスコにおいて、４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Gibco）が補充されたタンパク質発現培地（ＰＥＭ）（Life Technologies／Gibco）中でＣＡＰ細胞を培養した。３日～４日ごとに、０．５×１０６細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬの生細胞密度にするように、新鮮な培地でルーチン的に細胞を継代した。
（２）通常の培養については、振盪インキュベーターにおいて、３７℃、５％ＣＯ２及び１７０ｒｐｍ～２００ｒｐｍで、非バッフル振盪フラスコにおいて、４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Gibco）が補充されたタンパク質発現培地（ＰＥＭ）（Life Technologies／Gibco）中で、ＨＥＫ２９３細胞を培養した。２日～３日ごとに、０．３×１０６細胞／ｍＬ～０．５×１０６細胞／ｍＬの生細胞密度にするように、新鮮な培地でルーチン的に細胞を継代した。
【0050】
安定なＡＡＶ産生プラットフォームを利用するＡＡＶの産生：
培養へのドキシサイクリンの添加により、ＡＡＶ産生を誘導した。
培養へのドキシサイクリンの添加により、ＡＡＶ産生を誘導した。
【0051】
ウイルス力価を決定するためのｑＰＣＲ：
ＳＶ４０ポリＡ又はＧＯＩ（ＧＦＰ）に対する以下のプライマー／二重標識プローブの組合せ（MWG、Eurofins；表１）を使用して、ウイルス力価を測定した。
ＳＶ４０ポリＡ又はＧＯＩ（ＧＦＰ）に対する以下のプライマー／二重標識プローブの組合せ（MWG、Eurofins；表１）を使用して、ウイルス力価を測定した。
【0052】
【表1】
【0053】
標準として、定義されたコピー数を有する直鎖状導入遺伝子プラスミドを使用した。ｑＰＣＲ反応は以下の成分を含んでいた：２×Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Agilent）、ヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ（Thermo Fisher Scientific）、プライマー／プローブ混合物及び試料／標準物質。ｑＰＣＲは、製造者の指示書に従ってＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３００５Ｐで実行した。
【0054】
アセンブルされたカプシドに対するＥＬＩＳＡ：
アセンブルされたカプシドに対して特異的なＥＬＩＳＡは、製造者の指示書に従って市販のＥＬＩＳＡキット（Progen）を用いて行った。
アセンブルされたカプシドに対して特異的なＥＬＩＳＡは、製造者の指示書に従って市販のＥＬＩＳＡキット（Progen）を用いて行った。
【0055】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳｙｐｒｏＲｕｂｙ染色：
カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の比を決定するために、カプシドタンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥで分離し、ＳｙｐｒｏＲｕｂｙ染色によって可視化した。手短に言えば、試料を４×ＬＤＳ緩衝液と混合し、次いで、ドライヒートブロック中にて１０分間７０℃でインキュベートした。チューブを遠沈し、１０μＬの試料をウェルにロードした。ＭＥＳ ＳＤＳ緩衝液中にて２００Ｖで４０分間、４％～１２％ビス－トリスゲルを流した。ＳｙｐｒｏＲｕｂｙ染色は、染色溶液中での一晩のインキュベーション、それに続く、１０％メタノール、７％酢酸中での３０分間の洗浄工程及びｄｄＨ２Ｏ中での最終的な洗浄によって行った。
カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の比を決定するために、カプシドタンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥで分離し、ＳｙｐｒｏＲｕｂｙ染色によって可視化した。手短に言えば、試料を４×ＬＤＳ緩衝液と混合し、次いで、ドライヒートブロック中にて１０分間７０℃でインキュベートした。チューブを遠沈し、１０μＬの試料をウェルにロードした。ＭＥＳ ＳＤＳ緩衝液中にて２００Ｖで４０分間、４％～１２％ビス－トリスゲルを流した。ＳｙｐｒｏＲｕｂｙ染色は、染色溶液中での一晩のインキュベーション、それに続く、１０％メタノール、７％酢酸中での３０分間の洗浄工程及びｄｄＨ２Ｏ中での最終的な洗浄によって行った。
【0056】
陰イオン交換クロマトグラフィーによる完全なＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子の分離：
全細胞懸濁可溶化液からのＡＡＶ粒子をクロマトグラフィーによって濃縮した。完全対空の分離は、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを利用することによって達成した。
全細胞懸濁可溶化液からのＡＡＶ粒子をクロマトグラフィーによって濃縮した。完全対空の分離は、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを利用することによって達成した。
【0057】
実施例１：
疑似灌流実験（細胞増殖）
大抵の細胞培養培地を使用した場合、細胞生存率を維持し、細胞増殖を持続するために、細胞密度が高いほど速い灌流速度を必要とする。細胞密度は産生プロセスの間に変化するので、細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）は、細胞密度に基づいた、全プロセス中の灌流速度の決定要因である。
疑似灌流実験（細胞増殖）
大抵の細胞培養培地を使用した場合、細胞生存率を維持し、細胞増殖を持続するために、細胞密度が高いほど速い灌流速度を必要とする。細胞密度は産生プロセスの間に変化するので、細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）は、細胞密度に基づいた、全プロセス中の灌流速度の決定要因である。
【0058】
ＣＳＰＲは、連続プロセスにおける１日ごとの細胞あたりの栄養素供給を示す：
ＣＳＰＲ＝Ｐ／ＶＣＤ
式中、Ｐ＝灌流速度（１／日）であり、ＶＣＤ＝生細胞密度（１×１０６細胞／ｍＬ）である。
ＣＳＰＲ＝Ｐ／ＶＣＤ
式中、Ｐ＝灌流速度（１／日）であり、ＶＣＤ＝生細胞密度（１×１０６細胞／ｍＬ）である。
【0059】
灌流バイオリアクタープロセスについてＣＳＰＲを決定するために、安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー（単一細胞クローン）を、非バッフル振盪フラスコにおいて４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＰＥＭ中で振盪フラスコにて培養した。培養３日目から毎日培地を交換した。遠心分離してから、使用済培地を捨てた。次いで、等量の新鮮な培地に細胞ペレットを再懸濁した、すなわち、生存率の低下が観察されるまで灌流速度を１ｖｖｄで維持した。
【0060】
指数関数的な細胞増殖及び高い生存率（９０％超）が７日目まで観察され、これらは、２０×１０６細胞／ｍＬのＶＣＤ及び約０．０５ｎＬ／細胞／日のＣＳＰＲに対応した（図１）。これらのパラメーターを、灌流バイオリアクターに対するスケールアップの目標として選択した。灌流培地として補充されるＰＥＭ培地を使用してより高い細胞密度を持続するために、より速い灌流速度が適用されるべきである。
【0061】
実施例２：
安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー単一細胞を使用した灌流モードでのＡＡＶ産生
従来のバッチプロセスと比較してＡＴＦベースの灌流を使用する利点を評価するために、バッチプロセスで又はＡＴＦベースの灌流プロセスとしてのいずれかで、安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー細胞を用いたＡＡＶ産生を行った。制御条件下の撹拌槽バイオリアクター中で両方とも行った。
安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー単一細胞を使用した灌流モードでのＡＡＶ産生
従来のバッチプロセスと比較してＡＴＦベースの灌流を使用する利点を評価するために、バッチプロセスで又はＡＴＦベースの灌流プロセスとしてのいずれかで、安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー細胞を用いたＡＡＶ産生を行った。制御条件下の撹拌槽バイオリアクター中で両方とも行った。
【0062】
従来のバッチプロセス：
細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての１０ｃ容器（Eppendorf）容器、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸが補充されたＰＥＭ培地中の匹敵する低細胞密度（０．５×１０６細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬ）でバイオリアクターに接種した。このプロセスはバッチモードで操作した。ＡＡＶ産生のための目標生細胞密度に細胞が増殖した後（典型的には、播種後３日目）、１μｇ／ｍＬドキシサイクリンを用いてＡＡＶ産生の産生を開始した。
細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての１０ｃ容器（Eppendorf）容器、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸが補充されたＰＥＭ培地中の匹敵する低細胞密度（０．５×１０６細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬ）でバイオリアクターに接種した。このプロセスはバッチモードで操作した。ＡＡＶ産生のための目標生細胞密度に細胞が増殖した後（典型的には、播種後３日目）、１μｇ／ｍＬドキシサイクリンを用いてＡＡＶ産生の産生を開始した。
【0063】
灌流の構成：
ＡＴＦベースの灌流の構成は、ＡＴＦユニットに接続された撹拌槽バイオリアクターからなっていた。細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての３ｃ容器（Eppendorf）容器、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。
ＡＴＦベースの灌流の構成は、ＡＴＦユニットに接続された撹拌槽バイオリアクターからなっていた。細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての３ｃ容器（Eppendorf）容器、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。
【0064】
灌流ベースのＡＡＶプロセス：
４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸが補充されたＰＥＭ培地中の匹敵する低細胞密度（０．５×１０６細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬ）でバイオリアクターに接種した。このプロセスはバッチモードで３日間操作した。その後、約０．０５ｎＬ／細胞／日～約０．１０ｎＬ／細胞／日の細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）に従って、灌流を開始し、補充されたＰＥＭ培地を供給した。細胞が約２０×１０６生細胞／ｍＬに増殖した後（７日目）、１μｇ／ｍＬドキシサイクリンを用いてＡＡＶ産生を誘導した。産生フェーズの間、灌流速度を約１ｖｖｄでほぼ一定に維持した。
４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸが補充されたＰＥＭ培地中の匹敵する低細胞密度（０．５×１０６細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬ）でバイオリアクターに接種した。このプロセスはバッチモードで３日間操作した。その後、約０．０５ｎＬ／細胞／日～約０．１０ｎＬ／細胞／日の細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）に従って、灌流を開始し、補充されたＰＥＭ培地を供給した。細胞が約２０×１０６生細胞／ｍＬに増殖した後（７日目）、１μｇ／ｍＬドキシサイクリンを用いてＡＡＶ産生を誘導した。産生フェーズの間、灌流速度を約１ｖｖｄでほぼ一定に維持した。
【0065】
３回の灌流の実行において２０×１０６細胞／ｍＬへの頑強な細胞増殖が観察された（図３）。灌流バイオリアクターにおける細胞増殖は、振盪フラスコにおける半灌流実験（図１）に匹敵した。バッチプロセスと比較して、誘導時のＶＣＤのおよそ５倍の増加が観察された（図４）。
【0066】
灌流モードでは、ゲノム力価（ｖｇ／ｍＬ）が異常に高かった（図５）。最大力価を考慮すれば、参照バッチプロセス（２回の独立の培養の平均）と比較して、ＣＡＰ灌流プロセスで４２倍の増加が得られた（３回の独立の培養の平均）。これは、より高いＶＣＤが部分的な理由であるが、更に重要なことに、灌流で平均して９倍高い、細胞特異的ウイルス収率（ｖｇ／細胞）の有意な増加が理由である（図７）。
【0067】
予想外に、完全な粒子の割合もバッチプロセスと比較して灌流プロセスで有意に増加した（図６）。灌流における完全な粒子の最大パーセンテージ（およそ４ｄ．ｐ．ｉ．）は、同じ時点の参照バッチプロセスで得られた値と比較して約１０倍高かった。３回の灌流の実行と２回のバッチの実行のデータを比較すると、平均して、完全なＡＡＶ粒子の最大パーセンテージは灌流の実行について９．３倍高かった。灌流環境がより良好なＡＡＶベクターＤＮＡ増幅に、又はＡＡＶ粒子中へのウイルスゲノムのパッケージングの増加に寄与することが、考えられる説明であり得る。
【0068】
形質導入アッセイによって感染性ＡＡＶ粒子を決定した。形質導入単位（ＴＵ）対ウイルスゲノム（ＶＧ）の比を計算した（ＴＵ：ＶＧ）。バッチの実行２については、誘導後３日目～６日目（ｄ．ｐ．ｉ．）にＴＵ：ＶＧを決定した。最大値は３ｄ．ｐ．ｉ．に得られた。灌流の実行１及び２についても、最大値は３ｄ．ｐ．ｉ．に得られた。したがって、各実施について、各試料のＴＵ：ＶＧの比を３ｄ．ｐ．ｉ．に対して正規化した。
【0069】
結果（図８）は、バッチと比較して、灌流モードにおいてより高い感染力が経時的に維持されたことを示唆する。誘導後３日目～５日目の間に、バッチでは感染性ＡＡＶ粒子の約３０％が感染力を失ったが、灌流モード（１ｖｖｄ）では、同じ期間で１８％未満の喪失であった。
【0070】
実施例３：
高細胞密度ＣＡＰプロデューサー細胞培養の生成のためのＡＴＦ灌流の利用
細胞特異的生産性の有意な増加、容積力価（volumetric titer）の増加及び完全な粒子のパーセンテージの増加が主にＡＡＶ産生の誘導前の灌流モードによるものであったかどうかを確認するために、以下の実験を行った。２０×１０６細胞／ｍＬの目標生細胞密度が達成されるまで、実施例２に記載されているように、Ｎバイオリアクター中にて灌流モードで細胞を培養した。しかし、ドキシサイクリン誘導によるＡＡＶ産生の誘導の直後に、灌流を止め、バッチモードで産生フェーズを操作した。これは、更なる培地交換が産生フェーズで行われなかったことを意味する。
高細胞密度ＣＡＰプロデューサー細胞培養の生成のためのＡＴＦ灌流の利用
細胞特異的生産性の有意な増加、容積力価（volumetric titer）の増加及び完全な粒子のパーセンテージの増加が主にＡＡＶ産生の誘導前の灌流モードによるものであったかどうかを確認するために、以下の実験を行った。２０×１０６細胞／ｍＬの目標生細胞密度が達成されるまで、実施例２に記載されているように、Ｎバイオリアクター中にて灌流モードで細胞を培養した。しかし、ドキシサイクリン誘導によるＡＡＶ産生の誘導の直後に、灌流を止め、バッチモードで産生フェーズを操作した。これは、更なる培地交換が産生フェーズで行われなかったことを意味する。
【0071】
灌流の構成：
ＡＴＦベースの灌流の構成は、ＡＴＦユニットに接続された撹拌槽バイオリアクターからなっていた。細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての３ｃ容器（Eppendorf）容器、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。
ＡＴＦベースの灌流の構成は、ＡＴＦユニットに接続された撹拌槽バイオリアクターからなっていた。細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての３ｃ容器（Eppendorf）容器、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。
【0072】
灌流／バッチＡＡＶプロセス：
４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸが補充されたＰＥＭ培地中の匹敵する低細胞密度（０．５×１０６細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬ）でバイオリアクターに接種した。このプロセスはバッチモードで３日間操作した。その後、約０．０５ｎＬ／細胞／日～約０．１０ｎＬ／細胞／日の細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）に従って、灌流を開始し、補充されたＰＥＭ培地を供給した。細胞が約２０×１０６生細胞／ｍＬに増殖した後、１μｇ／ｍＬドキシサイクリンを用いてＡＡＶ産生を誘導した。誘導後、灌流を止めた。
４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸが補充されたＰＥＭ培地中の匹敵する低細胞密度（０．５×１０６細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬ）でバイオリアクターに接種した。このプロセスはバッチモードで３日間操作した。その後、約０．０５ｎＬ／細胞／日～約０．１０ｎＬ／細胞／日の細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）に従って、灌流を開始し、補充されたＰＥＭ培地を供給した。細胞が約２０×１０６生細胞／ｍＬに増殖した後、１μｇ／ｍＬドキシサイクリンを用いてＡＡＶ産生を誘導した。誘導後、灌流を止めた。
【0073】
灌流培養は以前の実行（図３）と同じ増殖プロファイルに従い、誘導の時点で２．０×１０６細胞／ｍＬに達した（図９）。操作モードをバッチに変えた後、細胞濃度は誘導後２４時間の間維持された。続いて、細胞濃度及び生存率の激しい低下があった。興味深いことに、容積生産性及び細胞特異的生産性は極度に低く、誘導後４日目のゲノム力価は参照バッチプロセスと比較して約４０倍低かった（図１０）。この結果は、単に誘導前の灌流モードだけでなく、したがって、誘導時点の生細胞密度の増加が、前述の容積生産性、細胞特異的生産性の驚くべき増加、及び完全なＡＡＶ粒子のパーセンテージの増加に関与することを示す（実施例２）。
【0074】
本実施例（実施例３）の結果は、灌流モードが誘導後更に、したがって、全産生フェーズの間続けられる場合のみ、細胞の持続可能性が確かなものとなり、高い細胞特異的ウイルス収率及び完全なＡＡＶ粒子のパーセンテージの増加をともなう効率的なＡＡＶ産生が得られることを明白に示す。
【0075】
実施例４：
ＡＡＶ産生のために安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサー細胞を使用した灌流モード
細胞特異的ウイルス収率、容積生産性及び完全なＡＡＶ粒子のパーセンテージの増加に関する灌流プロセスの有益効果は、安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー細胞（実施例２）に限定されるのではなくて、他のＡＡＶ産生システムに移行させることができることを実証するために、本実験を行った。したがって、安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープールについて同様の灌流プロセスを開発した。さらに、内部対照として、振盪フラスコ中で培養し、バッチモードで操作するＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープール細胞を使用して、ＡＡＶを産生した。
ＡＡＶ産生のために安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサー細胞を使用した灌流モード
細胞特異的ウイルス収率、容積生産性及び完全なＡＡＶ粒子のパーセンテージの増加に関する灌流プロセスの有益効果は、安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー細胞（実施例２）に限定されるのではなくて、他のＡＡＶ産生システムに移行させることができることを実証するために、本実験を行った。したがって、安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープールについて同様の灌流プロセスを開発した。さらに、内部対照として、振盪フラスコ中で培養し、バッチモードで操作するＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープール細胞を使用して、ＡＡＶを産生した。
【0076】
バッチプロセス：
細胞は、３０ｍＬの培養量で１２５ｍＬの非バッフル振盪フラスコ中で培養した。４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸが補充されたＰＥＭ培地中の匹敵する低細胞密度（０．５×１０６細胞／ｍＬ～１．０×１０６細胞／ｍＬ）で培養物に接種した。このプロセスはバッチモードで操作した。３日間の細胞増殖期間後、１μｇ／ｍＬドキシサイクリンを用いてＡＡＶ産生の産生を開始した。
細胞は、３０ｍＬの培養量で１２５ｍＬの非バッフル振盪フラスコ中で培養した。４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸが補充されたＰＥＭ培地中の匹敵する低細胞密度（０．５×１０６細胞／ｍＬ～１．０×１０６細胞／ｍＬ）で培養物に接種した。このプロセスはバッチモードで操作した。３日間の細胞増殖期間後、１μｇ／ｍＬドキシサイクリンを用いてＡＡＶ産生の産生を開始した。
【0077】
灌流の構成：
ＡＴＦベースの灌流の構成は、ＡＴＦユニットに接続された撹拌槽バイオリアクターからなっていた。細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての３ｃ容器（Eppendorf）容器、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。
ＡＴＦベースの灌流の構成は、ＡＴＦユニットに接続された撹拌槽バイオリアクターからなっていた。細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての３ｃ容器（Eppendorf）容器、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。
【0078】
灌流ベースのＡＡＶプロセス：
４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸが補充されたＰＥＭ培地中の匹敵する低細胞密度（０．５×１０６細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬ）でバイオリアクターに接種した。このプロセスはバッチモードで３日間操作した。その後、約０．０５ｎＬ／細胞／日～約０．１０ｎＬ／細胞／日の細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）に従って、灌流を開始し、補充されたＰＥＭ培地を供給した。細胞が約２０×１０６生細胞／ｍＬに増殖した後（７日目）、１μｇ／ｍＬドキシサイクリンでＡＡＶ産生を誘導した。産生フェーズの間、灌流速度を約１．２５ｖｖｄでほぼ一定に維持した。
４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸが補充されたＰＥＭ培地中の匹敵する低細胞密度（０．５×１０６細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬ）でバイオリアクターに接種した。このプロセスはバッチモードで３日間操作した。その後、約０．０５ｎＬ／細胞／日～約０．１０ｎＬ／細胞／日の細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）に従って、灌流を開始し、補充されたＰＥＭ培地を供給した。細胞が約２０×１０６生細胞／ｍＬに増殖した後（７日目）、１μｇ／ｍＬドキシサイクリンでＡＡＶ産生を誘導した。産生フェーズの間、灌流速度を約１．２５ｖｖｄでほぼ一定に維持した。
【0079】
【0080】
実施例２において安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー単一細胞について既に見られたように、全産生フェーズ（すなわち、ＡＡＶ産生の誘導の前後）の間、安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープール細胞を灌流モードで培養することによって、約３０倍という容積生産性の莫大な増加（図１３）を達成することができた。再度、容積生産性の増加は、誘導時点の生細胞数の増加がたったおよそ６倍であったので、単に誘導時点の生細胞数の増加によるものではない。したがって、全体的な力価の増加は、バッチモードと比較して、灌流モードにおいて５倍高い細胞特異的ウイルス収率によって達成された（図１４）。
【0081】
安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー単一細胞について見られるように（実施例２）、安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサープール細胞を用いた灌流プロセスは、バッチプロセスと比較して、完全なＡＡＶ粒子の割合をおよそ４倍増加させる（図１５）。ＣＡＰ灌流プロセスと比較した場合の安定なＨＥＫ２９３灌流プロセスに関するより低い倍数増加は、ＨＥＫ２９３プロセスについては多クローン性のプールが利用され、一方でＣＡＰ灌流プロセスについては単クローン性の単一細胞クローンが利用されたという事実による可能性が最も高い。
【0082】
実施例５：
ＡＥＸを介した灌流材料からの完全なＡＡＶ粒子の濃縮
予想外に、十分に安定なＡＡＶプロデューサーＣＡＰ細胞株を用いたＡＡＶ粒子の産生にＡＴＦ灌流を適用することで、従来のバッチプロセスと比較して、完全な粒子の比において有意な約９倍の増加を達成することができることが見出された。
ＡＥＸを介した灌流材料からの完全なＡＡＶ粒子の濃縮
予想外に、十分に安定なＡＡＶプロデューサーＣＡＰ細胞株を用いたＡＡＶ粒子の産生にＡＴＦ灌流を適用することで、従来のバッチプロセスと比較して、完全な粒子の比において有意な約９倍の増加を達成することができることが見出された。
【0083】
既により高いパーセンテージの完全な粒子から始めて、ＡＥＸクロマトグラフィーを利用した完全な粒子の更なる濃縮も達成することができるかどうかを試験するために、以下の実験を行った。
【0084】
安定なＣＡＰ ＡＡＶプロデューサー細胞を用いた灌流の実行の保持液由来の細胞懸濁液（実施例２）を溶解し、クロマトグラフィーによってＡＡＶ粒子を濃縮した。次いで、ＡＡＶ粒子を含むプール画分を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。溶出勾配において、灌流ＡＥＸ実行１の画分２及び灌流ＡＥＸ実行２の画分５～画分７に完全なＡＡＶ粒子が濃縮された（図１６）。
【0085】
図１６に示すように、灌流プロセスからの材料の分離は、最大で７８％までの完全な粒子のパーセンテージをもたらした。
【0086】
カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の比を決定するために、２回の別々のＡＥＸ実験からの様々な画分をＳＤＳ ＰＡＧＥで分離し、ＳｙｐｒｏＲｕｂｙ染色によって可視化した。図１７に示すように、両方の実験の全ての画分にわたって、３種のカプシドタンパク質は、約１：１：１０という期待される比を示し、これは、灌流プロセスがＡＡＶカプシドの組成を変化させていないことを証明する。
【0087】
要約すると、これは、ＡＴＦ灌流を用いて開発されたプロセスが、最終的な生成物において完全なＡＡＶ粒子の高いパーセンテージを保証するための傑出した方法であることを証明する。
【0088】
考察：
本発明は、細胞特異的ウイルス収率が、バッチプロセスと比較して、本発明による灌流プロセスで有意に増加したことを明確に示す（図７）。これは、本発明で見られる力価の増加は、誘導時点の生細胞密度の増加が理由だけでなく、細胞あたりの力価の増加も理由であることを証明する。
本発明は、細胞特異的ウイルス収率が、バッチプロセスと比較して、本発明による灌流プロセスで有意に増加したことを明確に示す（図７）。これは、本発明で見られる力価の増加は、誘導時点の生細胞密度の増加が理由だけでなく、細胞あたりの力価の増加も理由であることを証明する。
【0089】
さらに、実施例３並びに図９及び図１０は、灌流プロセスによるドキシサイクリンを介したＡＡＶ産生の誘導の前に生細胞密度が増加したが、誘導直後に灌流プロセスを止めた灌流プロセスを示す。したがって、ＡＡＶの産生は高細胞密度のバッチプロセスの状態にあり、これは、生産性の増加は、誘導時点の高細胞密度によるだけでなく、その後の灌流プロセスも理由であったことを証明する。
【0090】
さらに、実施例４及び図１１～図１５は、安定なＨＥＫ２９３ ＡＡＶプロデューサー細胞を用いた本発明による灌流プロセスを示し、これは、ＡＡＶ生産性（容積及び細胞特異的）の増加並びにより高い完全対空の比によるＡＡＶの品質の向上は、ＣＡＰ細胞に限定されず、別の細胞株、すなわちＨＥＫ２９３でも再現性があることを証明する。
【0091】
したがって、本発明は、好都合なことに、本発明の方法における細胞特異的生産性の増加だけでなく、完全なＡＡＶ粒子対空のＡＡＶ粒子の増加も提供し、これらの両方とも予想外であり、驚くべきことである。これらの有利な特性は、図９及び図１０に示すように単なる全細胞数の増加によるものではなく、誘導後の灌流の継続に起因するものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-07-06
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株を準備する工程であって、ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする少なくとも幾つかの又は全ての遺伝子が、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、工程と、（ｂ）ＡＡＶ産生工程の間（すなわち、Ｎ工程の間）に前記細胞を灌流培養で培養する工程であって、前記灌流培養が、使用済培地の新鮮な培地との連続的な置換を包含し、使用済培地の新鮮な培地との前記連続的な置換がＡＡＶ産生の誘導後に続く、工程と、
を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法であって、
少なくとも以下の遺伝子：
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードする遺伝子、並びに、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子、
が前記宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、方法。
【請求項2】
少なくとも以下の遺伝子：ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードする遺伝子、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子、並びに、
ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、
が前記宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶｒｈ１０、２つ以上の異なる前記血清型の混成物及びＡＡＶ血清型の向性を変化させる突然変異を有する前記血清型からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする遺伝子が、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ２Ａ及びＶＡ－ＲＮＡをコードする遺伝子；Ａｄ５ヘルパー遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする遺伝子；並びにＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
以下の更なる遺伝子：ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８とＲｅｐ６８との両方をコードする遺伝子、
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２とＲｅｐ４０との両方をコードする遺伝子、及び、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂのいずれか一方又は両方をコードする１つの遺伝子又は複数の遺伝子、
が、前記宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株が、ＣＡＰ細胞、ＡＧＥ１．ｈｎ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳＯ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ１細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、Ｗ１３８細胞及びＨｅｐＧ２細胞からなる群から選択される細胞株である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
灌流培養が、撹拌槽バイオリアクター（ＳＴＲ）、軌道振盪バイオリアクター（ＯＳＢ）、ロッキングベッドバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、管状バイオリアクター、中空糸バイオリアクター（ＨＦＢＲ）、固定床バイオリアクター又は流動床バイオリアクター中で実施される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
灌流培養に使用される灌流デバイスが、ＴＦＦ（接線流濾過）モード又はＡＴＦ（交互接線流）モードで使用される中空糸フィルター；浮遊膜、スピンフィルター、回転筒状フィルター、回転ディスクフィルター、遠心分離機、重力沈降機、ラメラ沈降機、小型細胞沈降機、アコースティック沈降機又は液体サイクロンである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
灌流培養のために使用される前記灌流デバイスがＡＴＦモードで使用される中空糸フィルターである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
使用済培地の新鮮な培地との前記連続的な置換が、ＡＡＶ産生の誘導後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間又は少なくとも７２時間にわたって、及び／又はＡＡＶの回収まで続く、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）が約０．０１ｎＬ／細胞／日～約０．２０ｎＬ／細胞／日である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記灌流速度が約１ｖｖｄ（新鮮な培地の量／リアクターの作業量／日）～約２０ｖｖｄである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記灌流培養の播種時の細胞密度が約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ＡＡＶ産生の誘導時点の細胞密度が約２０×１０６細胞／ｍＬ以上である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記灌流培養の保持液からＡＡＶを回収する工程を更に含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】2022-12-20
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0022】
本発明の文脈において使用されるＧＯＩは特に限定されず、例えば、眼疾患、失明疾患、筋疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ＧＭ２ガングリオシドーシス及び脊髄小脳失調型、ＡＬＳ、ハンチントン病、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（Ｘ－ＳＣＩＤ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）、中枢神経系疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、肝疾患、肝臓酵素オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、レーバー先天黒内障、血友病、β－サラセミア、癌疾患、頭頸部癌、転移性黒色腫、心疾患、肺疾患又は嚢胞性線維症、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）及び重症リポタンパク質リパーゼ欠損障害（ＬＰＬＤ）、感染症、重症複合免疫不全症候群、ＨＩＶ感染症、ニーマン・ピック病Ｃ型及びオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症をはじめとする希少疾患の治療のための、ＡＡＶベクターの受容者へのその移行が目的である任意の遺伝子を含む。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0042】
細胞分離のための様々なメカニズム：沈降（重力又は遠心力場の下）、超音波場下の凝集（それに続く沈降）及び濾過を使用した、様々な灌流デバイスを使用することができる。したがって、分離効率はデバイスの選択に依存する。例は、遠心分離機、重力沈降機（ラメラ沈降機、小型細胞沈降機）、アコースティック沈降機（別名、アコースティックフィルター）、液体サイクロン及びフィルターである。濾過は以下の様々なストラテジー下で操作される：ＴＦＦ（接線流濾過）及びＡＴＦ（交互接線流）、浮遊膜、スピンフィルター及び回転筒状フィルター（別名、渦流フィルター又は外部スピンフィルター）並びに回転ディスクフィルター（別名、制御剪断フィルター）。様々なタイプのフィルターの中で、ＴＦＦ及びＡＴＦが灌流のために一般に使用される。両方の場合で、フィルター膜を備える中空糸モジュールが使用される。ＡＴＦの場合には、ダイヤフラムポンプを介して二方向の流れが得られる。現在では、ＡＴＦは、組換えタンパク質産生（生物製剤）に大抵使用される細胞保持デバイスである。灌流は生物製剤製造プロセスについては十分に確立されているが、ウイルスベクターの拡大縮小可能な製造にはまだ利用可能でない。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0062】
従来のバッチプロセス：
細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての１０ｃ容器（Eppendorf）、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸが補充されたＰＥＭ培地中の匹敵する低細胞密度（０．５×１０６細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬ）でバイオリアクターに接種した。このプロセスはバッチモードで操作した。ＡＡＶ産生のための目標生細胞密度に細胞が増殖した後（典型的には、播種後３日目）、１μｇ／ｍＬドキシサイクリンを用いてＡＡＶ産生を開始した。
細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての１０ｃ容器（Eppendorf）、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸが補充されたＰＥＭ培地中の匹敵する低細胞密度（０．５×１０６細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬ）でバイオリアクターに接種した。このプロセスはバッチモードで操作した。ＡＡＶ産生のための目標生細胞密度に細胞が増殖した後（典型的には、播種後３日目）、１μｇ／ｍＬドキシサイクリンを用いてＡＡＶ産生を開始した。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0063】
灌流の構成：
ＡＴＦベースの灌流の構成は、ＡＴＦユニットに接続された撹拌槽バイオリアクターからなっていた。細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての３ｃ容器（Eppendorf）、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。
ＡＴＦベースの灌流の構成は、ＡＴＦユニットに接続された撹拌槽バイオリアクターからなっていた。細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての３ｃ容器（Eppendorf）、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0071】
灌流の構成：
ＡＴＦベースの灌流の構成は、ＡＴＦユニットに接続された撹拌槽バイオリアクターからなっていた。細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての３ｃ容器（Eppendorf）、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。
ＡＴＦベースの灌流の構成は、ＡＴＦユニットに接続された撹拌槽バイオリアクターからなっていた。細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての３ｃ容器（Eppendorf）、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0076】
バッチプロセス：
細胞は、３０ｍＬの培養量で１２５ｍＬの非バッフル振盪フラスコ中で培養した。４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸが補充されたＰＥＭ培地中の匹敵する低細胞密度（０．５×１０６細胞／ｍＬ～１．０×１０６細胞／ｍＬ）で培養物に接種した。このプロセスはバッチモードで操作した。３日間の細胞増殖期間後、１μｇ／ｍＬドキシサイクリンを用いてＡＡＶ産生を開始した。
細胞は、３０ｍＬの培養量で１２５ｍＬの非バッフル振盪フラスコ中で培養した。４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸが補充されたＰＥＭ培地中の匹敵する低細胞密度（０．５×１０６細胞／ｍＬ～１．０×１０６細胞／ｍＬ）で培養物に接種した。このプロセスはバッチモードで操作した。３日間の細胞増殖期間後、１μｇ／ｍＬドキシサイクリンを用いてＡＡＶ産生を開始した。
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0077】
灌流の構成：
ＡＴＦベースの灌流の構成は、ＡＴＦユニットに接続された撹拌槽バイオリアクターからなっていた。細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての３ｃ容器（Eppendorf）、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。
ＡＴＦベースの灌流の構成は、ＡＴＦユニットに接続された撹拌槽バイオリアクターからなっていた。細胞は、撹拌槽バイオリアクター、例えば、使い捨ての３ｃ容器（Eppendorf）、ＢｉｏＦｌｏ３２０システム（Eppendorf）中で培養した。
【国際調査報告】