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▶ ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システムの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-09
(54)【発明の名称】腫瘍治療電場（ＴＴＦｉｅｌｄ）を使用する併用療法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20230427BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230427BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230427BHJP
A61K 41/00 20200101ALI20230427BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P35/00
A61P43/00 111
A61K41/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022558097
(86)(22)【出願日】2021-03-22
(85)【翻訳文提出日】2022-11-21
(86)【国際出願番号】 US2021023393
(87)【国際公開番号】W WO2021194919
(87)【国際公開日】2021-09-30
(31)【優先権主張番号】62/993,603
(32)【優先日】2020-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】508152917
【氏名又は名称】ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(74)【代理人】
【識別番号】100204582
【弁理士】
【氏名又は名称】大栗 由美
(72)【発明者】
【氏名】ストーリー，マイケル ディー．
(72)【発明者】
【氏名】カラナム，ナラシムハ クマール
【テーマコード（参考）】
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZC411
4C084ZC412
4C084ZC751
(57)【要約】
対象におけるがん細胞の生存を低減する方法であって、交流電場をがん細胞に印加するステップ、ならびにＥ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤のうちの少なくとも１種をがん細胞に送達するステップによる、方法が提供される。いくつかの例において、交流電場は、８０～３００ｋＨｚの間の周波数でがん細胞に印加される。いくつかの例において、印加するステップの少なくとも一部は、送達するステップの少なくとも一部と同時に行われる。いくつかの態様において、交流電場は、少なくとも７２時間、がん細胞に印加される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象におけるがん細胞の生存を低減する方法であって、Ｅ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤のうちの少なくとも１種をがん細胞に送達するステップ；ならびに８０～３００ｋＨｚの間の周波数で交流電場をがん細胞に印加するステップを含む、方法。
【請求項2】
印加するステップの少なくとも一部が、送達するステップの少なくとも一部と同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
印加するステップが、少なくとも７２時間の期間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
交流電場の周波数が、１００～２００ｋＨｚの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
交流電場が、がん細胞の少なくともいくつかにおいて、少なくとも１ｖ／ｃｍの電界強度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
がん細胞中のＥ２Ｆ阻害剤の濃度が、約１０μＭ～約５０μＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
がん細胞中のＥ２Ｆ阻害剤の濃度が、約２０μＭ～約４０μＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
がん細胞中のＣＤＫ４／６阻害剤の濃度が、約０．１μＭ～約５μＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
がん細胞中のＣＤＫ４／６阻害剤の濃度が、約０．５μＭ～約２μＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
Ｅ２Ｆ阻害剤が、ＨＬＭ００６４７４、ＭＲＴ０００３３６５９、ＹＫＬ－５－１２４－ＴＦＡ、およびＹＫＬ－５－１２４のうちの１つまたは複数からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
ＣＤＫ４／６阻害剤が、アベマシクリブ、リボシクリブ、トリラシクリブ、イブランス、レロシクリブ、アルボシジブ、ロニシクリブ、リビシクリブ、ミルシクリブ、ＲＧＢ－２８６６３８、ＮＳＮ３１０６７２９、ＰＨＡ－７９３８８７、Ｒ５４７、インジルビン、ＮＵ６１０２、ボヘミン、ＣＤＫ９－ＩＮ－７、ＣＧＰ６０４７４、プルバラノールＡ、ＰＦ－０６８７３６００、ニンボリド、ＦＮ－１５０１、ＡＧ－０２４３２２、ＯＮ１２３３００、Ｇ１Ｔ２８、Ｇ１Ｔ３８、ＡＭＧ９２５、ＳＨＲ－６３９０、ＢＰＩ－１１７８、ＢＰＩ－１６３５０、ＦＣＮ４３７、ビロシクリブ、ＢＥＢＴ－２０９、Ｔｙ－３０２、ＴＱＢ－３６１６、ＨＳ－１０３４２、ＰＦ－０６８４２８７４、ＣＳ－２００２、ＭＭ－Ｄ３７Ｋ、ＣＤＫ４／６－ＩＮ－２、ＳＵ９５１６、およびＡＴ７５１９のうちの１つまたは複数からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
送達するステップが、Ｅ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤を対象に投与するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
Ｅ２Ｆ阻害剤が、ＨＬＭ００６４７４である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
ＣＤＫ４／６阻害剤が、アベマシクリブである、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
Ｅ２Ｆ阻害剤が、ＨＬＭ００６４７４であり、ＣＤＫ４／６阻害剤が、アベマシクリブである、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
がん細胞が、肺がん細胞、乳がん細胞、膵臓がん細胞、神経膠芽腫細胞、前立腺がん細胞、肝臓がん細胞、卵管がん細胞、腹膜がん細胞、皮膚がん細胞、肝臓がん細胞、および卵巣がん細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
がん細胞の生存が、交流電場への曝露を受けておらず、かつＥ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤の送達を受けていないがん細胞と比較して、２０～１００分の１に低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
対象におけるがん細胞を死滅させる方法であって、Ｅ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤のうちの少なくとも１種をがん細胞に送達するステップ；ならびに８０～３００ｋＨｚの間の周波数で交流電場をがん細胞に印加するステップを含む、方法。
【請求項19】
印加するステップの少なくとも一部が、送達するステップの少なくとも一部と同時に行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
印加するステップが、少なくとも７２時間の期間を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
Ｅ２Ｆ阻害剤が、ＨＬＭ００６４７４、ＭＲＴ０００３３６５９、ＹＫＬ－５－１２４－ＴＦＡ、およびＹＫＬ－５－１２４のうちの１つまたは複数からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項22】
ＣＤＫ４／６阻害剤が、アベマシクリブ、リボシクリブ、トリラシクリブ、イブランス、レロシクリブ、アルボシジブ、ロニシクリブ、リビシクリブ、ミルシクリブ、ＲＧＢ－２８６６３８、ＮＳＮ３１０６７２９、ＰＨＡ－７９３８８７、Ｒ５４７、インジルビン、ＮＵ６１０２、ボヘミン、ＣＤＫ９－ＩＮ－７、ＣＧＰ６０４７４、プルバラノールＡ、ＰＦ－０６８７３６００、ニンボリド、ＦＮ－１５０１、ＡＧ－０２４３２２、ＯＮ１２３３００、Ｇ１Ｔ２８、Ｇ１Ｔ３８、ＡＭＧ９２５、ＳＨＲ－６３９０、ＢＰＩ－１１７８、ＢＰＩ－１６３５０、ＦＣＮ４３７、ビロシクリブ、ＢＥＢＴ－２０９、Ｔｙ－３０２、ＴＱＢ－３６１６、ＨＳ－１０３４２、ＰＦ－０６８４２８７４、ＣＳ－２００２、ＭＭ－Ｄ３７Ｋ、ＣＤＫ４／６－ＩＮ－２、ＳＵ９５１６、およびＡＴ７５１９のうちの１つまたは複数からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項23】
Ｅ２Ｆ阻害剤が、ＨＬＭ００６４７４である、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
ＣＤＫ４／６阻害剤が、アベマシクリブである、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
Ｅ２Ｆ阻害剤が、ＨＬＭ００６４７４であり、ＣＤＫ４／６阻害剤が、アベマシクリブである、請求項１８に記載の方法。
【請求項26】
がん細胞が、ＢＲＣＡ経路に欠損を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項27】
がん細胞が、肺がん細胞、乳がん細胞、膵臓がん細胞、神経膠芽腫細胞、前立腺がん細胞、肝臓がん細胞、卵管がん細胞、腹膜がん細胞、皮膚がん細胞、および卵巣がん細胞からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２０年３月２３日に出願された米国仮出願第６２／９９３，６０３号の利益を主張し、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年３月２３日に出願された米国仮出願第６２／９９３，６０３号の利益を主張し、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本明細書で引用されるすべての参考文献、例えば、限定されるものではないが、特許および特許出願は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
肺がんは、２番目に多く見られるがんであり、米国においてがん関連死の主な原因である。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は、最も多く見られるタイプであり、新たな症例のおよそ８０％を占める。肺がんのための数多くの処置の選択肢には、例えば、外科的切除、化学療法、放射線療法、および免疫療法が存在する。ステージＩおよびＩＩのＮＳＣＬＣを有する患者についての５年生存率は、それぞれ、約５０％および３０％である。しかしながら、利用可能な処置の選択肢にもかかわらず、後期のステージＩＩＩＡ、ＩＩＩＢおよびＩＶを有する患者についての５年生存率は、それぞれ、１４％、５％および１％であり、生存率を増加させるための単独でまたは従来の療法と組み合わせて利用することができる新規の治療モダリティについての必要性を強調する。
【0004】
加えて、肺がんを含む多くのがんは、ＤＮＡ修復機構において機能する遺伝子の欠損に関連する。これらの遺伝子は、さまざまながんの発生に関連する遺伝子調節経路（例えば、ＢＲＣＡ経路、ファンコニ貧血（ＦＡ）／ＢＲＣＡ経路）のメンバーである。
【0005】
ＴＴＦｉｅｌｄは、テモゾロミドとの組み合わせでの再発性のおよび新たに診断された多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）のために、および白金系化学療法との組み合わせでの切除不可能な局所進行性のもしくは転移性の悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）のために承認されているがん治療の非侵襲的な物理的モダリティである。肺がん、膵臓がんおよび卵巣がんを含む他のがんについての臨床試験が進行中である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示は、例えば、ＴＴＦｉｅｌｄをＥ２Ｆ阻害剤（例えば、ＨＬＭ００６４７４）および／またはＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、アベマシクリブ）とともに使用する組み合わせ処置による、ＴＴＦｉｅｌｄを利用する既存の処置機構に対する増強および強化を提供する。本開示の実施形態は、ＣＤＫ－ＲＢ－Ｅ２Ｆシグナル伝達経路の特定の態様を標的にする。本開示の実施形態は、ＣＤＫ－ＲＢ－Ｅ２Ｆシグナル伝達経路の態様を、選択的に下方調節および上方調節する。本明細書に記載される態様は、ＴＴＦｉｅｌｄを、特定のＤＮＡ修復経路（例えば、中でも、相同組換え、非相同末端結合、ミスマッチ修復、複製フォーク維持および染色体維持）に依拠する複数の経路を介したＤＮＡ修復能力の低減によりがんを標的にする薬剤と組み合わせる。Ｅ２Ｆは、すべての細胞型における細胞周期の制御、ＤＮＡ修復、および染色体維持ルーチンに関与する普遍的転写因子である。ＴＴＦｉｅｌｄを、例えば、Ｅ２Ｆ阻害剤と組み合わせることによって、本明細書に記載される態様は、広範囲のがんおよび細胞型を標的にする。
【0007】
本明細書に記載される態様は、対象におけるがん細胞の生存を低減する方法であって、Ｅ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤のうちの少なくとも１種をがん細胞に送達するステップ、ならびに８０～３００ｋＨｚの間の周波数で交流電場をがん細胞に印加するステップによる、方法を提供する。
【0008】
本明細書に記載される態様は、対象におけるがん細胞を死滅させる方法であって、Ｅ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤のうちの少なくとも１種をがん細胞に送達するステップ、ならびに８０～３００ｋＨｚの間の周波数で交流電場をがん細胞に印加するステップによる、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】Ｅ２Ｆタンパク質中に存在する保存ドメインを示す図である。
【図2】ＴＴＦｉｅｌｄへの曝露後のプロテオームの例示的なシグナル伝達経路を示す図である。
【図3A】ＴＴＦｉｅｌｄへの曝露後に示されたＥ２Ｆ標的の発現レベルの例示的な変化を示す図である。
【図4】Ｅ２Ｆ－ＲＢ機能障害の例示的な遺伝子シグネチャーマーカーを示す図である。
【図5】本明細書に記載される態様に従って、ＴＴＦｉｅｌｄをＥ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせる効果の例示的な図表示を示す図である。
【図6A】本明細書に記載される態様に従って、ＴＴＦｉｅｌｄ、Ｅ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤の示された組み合わせによる４つの細胞株における例示的なクローン原性生存アッセイの結果を示す図である。
【図6B】図６Ａの続きであり、本明細書に記載される態様に従って、ＴＴＦｉｅｌｄ、Ｅ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤の示された組み合わせによる４つの細胞株における例示的なクローン原性生存アッセイの結果を示す図である。
【図8A】ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の遺伝子についての示された細胞株における経時的なｍＲＮＡ発現レベルおよびタンパク質発現レベルを示す図である。
【図9A】ＴＴＦｉｅｌｄへのがん細胞の曝露後のＦＡ経路遺伝子、細胞周期遺伝子、およびＤＮＡ複製遺伝子の転写活性および遺伝子発現を示す図である。
【図10】本明細書に記載される態様に従って、Ｈ１２９９細胞における、ＴＴＦｉｅｌｄ、ならびにＥ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ阻害剤を含むＴＴＦｉｅｌｄへの曝露の２４、４８および７２時間後のさまざまな薬物の示された組み合わせについてのクローン原性アッセイから得られた例示的な組み合わせ指標値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本開示は、がん細胞の成長および生存能力に関連する経路を標的にするために、治療剤と組み合わせたＴＴＦｉｅｌｄの適用に関する。
【0011】
本開示の実施形態は、がん細胞の複製において積極的な役割を果たすことが公知のＥ２Ｆファミリーのメンバーを調節不全にするために、ＴＴＦｉｅｌｄの適用、およびがん細胞への治療剤の送達を対象とする。例えば、ＴＴＦｉｅｌｄを使用する開示される併用療法は、ＴＴＦｉｅｌｄをＥ２Ｆ阻害剤および／またはＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせて、ＣＤＫ－ＲＢ－Ｅ２Ｆ軸のＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２を下方調節する。加えて、いくつかの実施形態において、併用療法の適用は、ＴＴＦｉｅｌｄをＥ２Ｆ阻害剤および／またはＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせて、ＣＤＫ－ＲＢ－Ｅ２Ｆ軸のＥ２Ｆ６を上方調節する。
【0012】
ＴＴＦｉｅｌｄは、転写因子のＥ２Ｆファミリーを調節不全にし、腫瘍細胞をＲＢ－Ｅ２Ｆ－ＣＤＫ４／６軸を標的にする薬剤に感受性にし、このようにして、ＴＴＦｉｅｌｄ単独の、またはＴＴＦｉｅｌｄとＤＮＡ修復、複製ストレス、およびＲＢ－Ｅ２Ｆ－ＣＤＫ４／６軸によって調節される他の経路を標的にする薬剤との殺腫瘍効果を実質的に増加させる。
【0013】
ＴＴＦｉｅｌｄは、再発性のおよび新たに診断された多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、ならびに胸膜中皮腫のために使用される。ＴＴＦｉｅｌｄは、有糸分裂の破壊、複製ストレスの付加ならびにＤＮＡ修復および細胞周期チェックポイント遺伝子の下方調節により、細胞死を誘導するために使用される。
【0014】
ＴＴＦｉｅｌｄは、固形の治療抵抗性の原発性および再発性腫瘍の処置のために使用されている。ＴＴＦｉｅｌｄ電極は、非侵襲性であり、腫瘍床全体にわたって、低強度（例えば、１～３Ｖ／ｃｍ）の中周波数（例えば、１００～３００ｋＨｚ）の交流電場を送達する。ＴＴＦｉｅｌｄは、より高い電界強度の領域の方への極性分子の誘電泳動移動を誘導する異種細胞内環境を作り出し、重合および他の重要な生化学的機能を効率的に防止する。このようにして、ＴＴＦｉｅｌｄは、細胞増殖の利用によりがん細胞を優先的に標的にし、非分裂正常細胞を効率的に残す。加えて、ＴＴＦｉｅｌｄは、それらの高い周波数のために神経および筋肉を刺激せず、それらの低い強度のために高レベルの熱を発生させない。
【0015】
ＴＴＦｉｅｌｄは、非小細胞肺がん細胞（ＮＳＣＬ細胞株）において、電離放射線（ＩＲ）に対するコンディショナルな脆弱性を誘発する。ＴＴＦｉｅｌｄは、電離放射線に対する感度の増強をもたらすコンディショナルな感受性の状態を誘導し、放射線、ＰＡＲＰ阻害剤、他のＤＮＡ損傷剤、Ｅ２Ｆ阻害剤、およびＣＤＫ４／６阻害剤との併用モダリティ療法としてのＴＴＦｉｅｌｄの使用をサポートする。
【0016】
ＴＴＦｉｅｌｄは、細胞増殖を減少させ、各種のヒトおよびげっ歯動物の腫瘍細胞株にわたって、分裂しているがん細胞において不完全なアポトーシスを誘導する。紡錘体装置の適切な形成の防止および紡錘体チェックポイントの活性化は、ＴＴＦｉｅｌｄが分裂している細胞を死滅させる機構として提案されている。具体的には、ＴＴＦｉｅｌｄの曝露は、微小管の脱重合およびセプチンの誤った局在化を引き起こす。これは、細胞膜の不安定性、および細胞質分裂を破壊するブレブ形成をもたらすことができ、異常な染色体分離、異常な有糸分裂終了、およびその後にアポトーシスを受ける混乱した細胞の生成を引き起こす。
【0017】
本明細書に記載される態様は、対象におけるがん細胞の生存を低減する方法であって、Ｅ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤のうちの少なくとも１種をがん細胞に送達するステップ、ならびに８０～３００ｋＨｚの間の周波数で交流電場をがん細胞に印加するステップによる、方法を提供する。
【0018】
いくつかの例において、印加するステップの少なくとも一部は、送達するステップの少なくとも一部と同時に行われる。いくつかの例において、印加するステップは、少なくとも７２時間の期間を有する。別の例において、印加するステップは、少なくとも２４時間または４８時間の期間を有する。
【0019】
いくつかの例において、交流電場の周波数は、１００～２００ｋＨｚの間である。別の例において、交流電場は、がん細胞の少なくともいくつかにおいて、少なくとも１ｖ／ｃｍの電界強度を有する。
【0020】
がん細胞中のＥ２Ｆ阻害剤の濃度は、約１０μＭ～約５０μＭ、または約２０μＭ～約４０μＭであり得る。がん細胞中のＣＤＫ４／６阻害剤の濃度は、約０．１μＭ～約５μＭ、または約０．５μＭ～約２μＭであり得る。
【0021】
いくつかの例において、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＨＬＭ００６４７４）についてのＩＣ２５値は、約０．５μＭ、約１μＭ、および約１．５μＭであり得る。別の態様において、がん細胞中のＣＤＫ阻害剤の濃度について、約０．５～約１．５μＭが使用され得る。
【0022】
いくつかの例において、Ｅ２Ｆ阻害剤（例えば、ＬＹ２８３５２１９、別名アベマシクリブ）についてのＩＣ２５値は、約２０μＭ、約２５μＭ、または約４０μＭであり得る。別の態様において、がん細胞中のＥ２Ｆ阻害剤の濃度は、約２０μＭ～約４０μＭであり得る。
【0023】
さらに別の例において、Ｅ２Ｆ阻害剤は、ＨＬＭ００６４７４、ＭＲＴ０００３３６５９、ＹＫＬ－５－１２４－ＴＦＡ、およびＹＫＬ－５－１２４のうちの１つまたは複数からなる群から選択される。
【0024】
さらなる例において、ＣＤＫ４／６阻害剤は、アベマシクリブ、リボシクリブ、トリラシクリブ、イブランス、レロシクリブ、アルボシジブ、ロニシクリブ、リビシクリブ、ミルシクリブ、ＲＧＢ－２８６６３８、ＮＳＮ３１０６７２９、ＰＨＡ－７９３８８７、Ｒ５４７、インジルビン、ＮＵ６１０２、ボヘミン、ＣＤＫ９－ＩＮ－７、ＣＧＰ６０４７４、プルバラノールＡ、ＰＦ－０６８７３６００、ニンボリド、ＦＮ－１５０１、ＡＧ－０２４３２２、ＯＮ１２３３００、Ｇ１Ｔ２８、Ｇ１Ｔ３８、ＡＭＧ９２５、ＳＨＲ－６３９０、ＢＰＩ－１１７８、ＢＰＩ－１６３５０、ＦＣＮ４３７、ビロシクリブ、ＢＥＢＴ－２０９、Ｔｙ－３０２、ＴＱＢ－３６１６、ＨＳ－１０３４２、ＰＦ－０６８４２８７４、ＣＳ－２００２、ＭＭ－Ｄ３７Ｋ、ＣＤＫ４／６－ＩＮ－２、ＳＵ９５１６、およびＡＴ７５１９のうちの１つまたは複数からなる群から選択される。
【0025】
いくつかの例において、送達するステップは、Ｅ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤をがん細胞に投与するまたは送達するステップを含む。いくつかの例において、送達するステップは、Ｅ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤を対象に投与するまたは送達するステップを含む。一態様において、Ｅ２Ｆ阻害剤は、ＨＬＭ００６４７４である。さらなる態様において、ＣＤＫ４／６阻害剤は、アベマシクリブである。さらに別の例において、Ｅ２Ｆ阻害剤は、ＨＬＭ００６４７４であり、ＣＤＫ４／６阻害剤は、アベマシクリブである。
【0026】
いくつかの例において、がん細胞は、肺がん細胞、乳がん細胞、膵臓がん細胞、神経膠芽腫細胞、前立腺がん細胞、肝臓がん細胞、卵管がん細胞、腹膜がん細胞、皮膚がん細胞、および卵巣がん細胞からなる群から選択される。
【0027】
Ｅ２Ｆ転写因子は、すべての細胞型において活性であり、例えば、細胞周期の制御、ＤＮＡ修復、および染色体維持ルーチンに関連する。Ｅ２Ｆ阻害剤であるＨＬＭ００６４７４は、すべてのＥ２Ｆ複合体についてＤＮＡ結合を阻害し、乳がんおよび黒色腫モデルにおいて使用されている。ＣＤＫ４／６阻害剤は、神経膠芽腫および転移性乳がんを処置するために使用されている。
【0028】
いくつかの例において、がん細胞の生存は、交流電場への曝露を受けておらず、かつＥ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤の送達を受けていないがん細胞と比較して、２０～１００分の１に低減される。
【0029】
いくつかの例において、がん細胞の生存は、交流電場への曝露を受けておらず、かつＥ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤の送達を受けていないがん細胞と比較して、（ｉ）交流電場へのがん細胞の７２時間曝露、（ｉｉ）１０μＭ～５０μＭの濃度でのＥ２Ｆ阻害剤の送達、および（ｉｉｉ）０．１μＭ～２μＭの濃度でのＣＤＫ４／６阻害剤の送達の後に、約１００分の１に低減される。いくつかの例において、Ｅ２Ｆ阻害剤は、約２０μＭの濃度でがん細胞に送達され、ＣＤＫ４／６阻害剤は、約５μＭの濃度でがん細胞に送達される。
【0030】
本明細書に記載される態様は、対象におけるがん細胞を死滅させる方法であって、Ｅ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤のうちの少なくとも１種をがん細胞に送達するステップ、ならびに８０～３００ｋＨｚの間の周波数で交流電場をがん細胞に印加するステップによる、方法を提供する。
【0031】
いくつかの例において、印加するステップの少なくとも一部は、送達するステップの少なくとも一部と同時に行われる。印加するステップは、少なくとも７２時間の期間を有し得る。別の態様において、印加するステップは、少なくとも２４時間または４８時間の期間を有し得る。
【0032】
Ｅ２Ｆ阻害剤は、ＨＬＭ００６４７４、ＭＲＴ０００３３６５９、ＹＫＬ－５－１２４－ＴＦＡ、およびＹＫＬ－５－１２４のうちの１つまたは複数からなる群から選択され得る。
【0033】
ＣＤＫ４／６阻害剤は、アベマシクリブ、リボシクリブ、トリラシクリブ、イブランス、レロシクリブ、アルボシジブ、ロニシクリブ、リビシクリブ、ミルシクリブ、ＲＧＢ－２８６６３８、ＮＳＮ３１０６７２９、ＰＨＡ－７９３８８７、Ｒ５４７、インジルビン、ＮＵ６１０２、ボヘミン、ＣＤＫ９－ＩＮ－７、ＣＧＰ６０４７４、プルバラノールＡ、ＰＦ－０６８７３６００、ニンボリド、ＦＮ－１５０１、ＡＧ－０２４３２２、ＯＮ１２３３００、Ｇ１Ｔ２８、Ｇ１Ｔ３８、ＡＭＧ９２５、ＳＨＲ－６３９０、ＢＰＩ－１１７８、ＢＰＩ－１６３５０、ＦＣＮ４３７、ビロシクリブ、ＢＥＢＴ－２０９、Ｔｙ－３０２、ＴＱＢ－３６１６、ＨＳ－１０３４２、ＰＦ－０６８４２８７４、ＣＳ－２００２、ＭＭ－Ｄ３７Ｋ、ＣＤＫ４／６－ＩＮ－２、ＳＵ９５１６、およびＡＴ７５１９のうちの１つまたは複数からなる群から選択され得る。
【0034】
いくつかの例において、Ｅ２Ｆ阻害剤は、ＨＬＭ００６４７４である。いくつかの例において、ＣＤＫ４／６阻害剤は、アベマシクリブである。さらに別の例において、Ｅ２Ｆ阻害剤は、ＨＬＭ００６４７４であり、ＣＤＫ４／６阻害剤は、アベマシクリブである。
【0035】
下記に提示される実験データは、ＴＴＦｉｅｌｄおよび併用療法が、細胞周期チェックポイントおよびＤＮＡ修復、ならびに従来の処置システムに対する治療学的な挑戦を提示する他の生存経路に関連する重要な遺伝子を下方調節することができる機構を特定するために、プロテオミクス解析の使用を議論する。
【0036】
本明細書で議論されるように、定量的プロテオミクス実験は、転写活性化因子であるＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２の発現の低減を特定した。加えて、定量的プロテオミクス実験は、転写抑制因子であるＥ２Ｆ６の発現の増加を特定した。したがって、本明細書に記載される併用療法は、ＣＤＫ－ＲＢ－Ｅ２Ｆ軸に影響を及ぼし、Ｅ２Ｆ４およびＥ２Ｆ６シグナル伝達を通してＤＮＡ修復遺伝子（例えば、ＲＡＤ５１、ＢＲＣＡ１、およびＢＲＣＡ２）を調節不全にする。
【0037】
図１は、Ｅ２Ｆタンパク質中に存在する保存ドメイン（すなわち、保存され、指定された機能を有するドメイン）の例示的な概略を提供する。Ｅ２Ｆタンパク質は、８つのファミリーメンバー（Ｅ２Ｆ１～８）からなり、それらの機能に基づいて、転写活性化因子（Ｅ２Ｆ１～Ｅ２Ｆ３ａ）および転写抑制因子（Ｅ２Ｆ３ｂ～Ｅ２Ｆ８）に分けられる。Ｅ２Ｆタンパク質は、細胞周期の進行、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ損傷チェックポイント、およびＤＮＡ修復のために重要な数千もの遺伝子を調節し、細胞増殖において中心的な役割を果たす。活性化タンパク質（Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２およびＥ２Ｆ３Ａ）レベルは、Ｇ１－Ｓ期の移行でピークにし、非定型抑制因子（Ｅ２Ｆ７およびＥ２Ｆ８）レベルは、Ｓ期後期の後半にピークに達するが、古典的抑制因子（Ｅ２Ｆ３Ｂ、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ５およびＥ２Ｆ６）レベルは、細胞周期のすべての段階を通して恒常的に発現されたままである。
【0038】
図示されるように、すべてのＥ２Ｆは、独特の翼状らせんＤＮＡ結合ドメインを共有する。Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ５およびＥ２Ｆ６は、ＤＮＡに結合するために、転写因子二量体化パートナー（ＴＦＤＰ）ファミリーのメンバー（ＴＦＤＰ１またはＴＦＤＰ２）との二量体化を必要とする。この結合は、ロイシンジッパー（ＬＺ）ドメインおよびマークされたボックス（ＭＢ）ドメインからなる二量体化ドメインによって促進される。Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ４およびＥ２Ｆ５に、ポケットタンパク質（ＲＢ、ｐ１０７およびｐ１３０）が、トランス活性化ドメインで結合する。
【0039】
ポケットタンパク質との相互作用のために必要な最小部位は、（ＲＢ）に示される。Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ４およびＥ２Ｆ５すべてにＲＢは結合するが、ｐ１０７およびｐ１３０はＥ２Ｆ４よびＥ２Ｆ５にのみ結合する。Ｅ２Ｆ６は、ポケットタンパク質に結合しないが、代わりに、ポリコーム群のタンパク質によって調節される。いくつかのＥ２Ｆタンパク質はまた、核局在化配列（ＮＬＳ）、核外移行配列（ＮＥＳ）、またはサイクリンＡ（ＣＣＮＡ）調節ドメインを有する。Ｅ２Ｆ７およびＥ２Ｆ８は、二量体化ドメインおよびトランス活性化ドメインを欠き、ＴＦＤＰまたはポケットタンパク質に結合しない。代わりに、それらは、２つのタンデムＤＮＡ結合ドメインを有する。
【0040】
ＴＴＦｉｅｌｄへの細胞の曝露の際に差次的に発現するタンパク質の例示的な上流解析は、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２などの活性化因子が阻害され、Ｅ２Ｆ６などの抑制因子が活性化されることを示した。
【0041】
図２は、ＴＴＦｉｅｌｄへの細胞の曝露後のプロテオームの例示的な上流解析を提供する。プロテオミクスの結果は、ＴＴＦｉｅｌｄ曝露の結果として、転写活性化因子（Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２）が阻害され、抑制因子（Ｅ２Ｆ６）が活性化されることを示唆する。
【0042】
Ｅ２Ｆ－ＲＢ軸は、有糸分裂、ＤＮＡ損傷および修復、ＤＮＡ複製、クロマチンリモデリング、ならびにアポトーシスを含むがん細胞における多くの経路を制御する中心的なジャンクションとしての機能を果たす。遺伝子発現研究および直接機能研究は、Ｅ２Ｆ－ＲＢ経路が、ＦＡ（ファンコニ貧血）経路のメンバーのいくつかを標的にすることを示した。さらに、ＴＴＦｉｅｌｄは、（ＦＡ経路および細胞周期の上流調節因子として作用する）Ｅ２Ｆ－ＲＢの調節不全によってＦＡ経路のメンバーを下方調節する。
【0043】
図３Ａ～３Ｄは、異なるプロテオーム解析に基づいて、ＴＴＦｉｅｌｄに曝露されていない細胞と比較して、ＴＴＦｉｅｌｄへの曝露後の肺がん細胞におけるＥ２Ｆ標的発現アッセイの例示的な結果を提供する。
【0044】
図３Ａ～３Ｄにおいて調べられたＥ２Ｆ標的は、ＦＡ経路のメンバー（例えば、ＢＲＣＡ１、ＦＡＮＣＤ２、ＲＡＤ５１）、複製フォークに関するメンバー（例えば、ＭＣＭ６、ＲＦＣ３、ＲＦＣ４）、および有糸分裂に関するタンパク質（例えば、ＢＵＢ３、ＣＣＮＥ２、ＥＺＨ２）を含む。図３Ａ～３Ｄに図示されるように、発現レベルは、ｌｏｇ発現値によって示されるように、ＴＴＦｉｅｌｄへの曝露の際に変化する。発現レベルの変化は、阻害される、影響を受ける、または活性化されるとしても分類された。
【0045】
図３Ａ～３Ｄに示されるように、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２は、活性化因子であり、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ６は、阻害因子であり、ＴＴＦｉｅｌｄへの曝露の際に、それぞれ、阻害および活性化された。したがって、それらの標的の発現が減少した（例えば、ＢＲＣＡ１、ＭＣＭ６、ＣＣＮＥ２、ＥＺＨ２）。
【0046】
図４は、Ｅ２Ｆ－ＲＢ機能障害の例示的な遺伝子シグネチャーマーカーを提供する。遺伝子シグネチャー解析は、Ｅ２Ｆ－ＲＢの調節不全／喪失によって調節解除される遺伝子の機能群を示した。図４は、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ損傷および修復、アポトーシス、有糸分裂、ならびにクロマチン領域に関連する例示的な遺伝子標的を特定する。
【0047】
図５は、ＴＴＦｉｅｌｄ、Ｅ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤に関して本明細書に記載される例示的な併用療法の図表示を提供する。図示されるように、ＴＴＦｉｅｌｄと一緒の、発明者等がＴＴＦｉｅｌｄの作用機構として観察した細胞周期、ＤＮＡ損傷および複製ストレスの上流調節因子（Ｅ２ＦおよびＣＤＫ４／６）の阻害剤との組み合わせは、非常に有益であろう。本明細書に開示されるように、Ｅ２ＦおよびＣＤＫ４／６の調節因子は、Ｅ２Ｆ阻害剤（例えば、ＨＬＭ００６４７４）およびＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、アベマシクリブ）により標的にされ得る。理論に拘束されないが、図５に図示されるように、がん細胞のＴＴＦｉｅｌｄおよびＥ２Ｆ阻害剤への曝露は、Ｅ２Ｆ遺伝子標的の調節不全を標的にするが、ＣＤＫ４／６阻害剤は、細胞周期の進行を標的にする。この組み合わせは、異常な細胞分裂、ＤＮＡ損傷、複製ストレス、および最終的には細胞死を引き起こし得る。
【0048】
図５に図示されるように、ＴＴＦｉｅｌｄは、Ｅ２Ｆを調節不全にするために、がん細胞に適用することができる。追加のＥ２Ｆ阻害剤（例えば、ＨＬＭ００６４７４）は、抑制因子の発現の増加、活性化因子の発現の減少または阻害を引き起こすＥ２Ｆ標的を調節不全にするために、がん細胞に適用することができる。ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、アベマシクリブ）も、ＣＤＫ４／６活性および細胞周期発現を阻害し、異常な細胞分裂、ＤＮＡ損傷および複製ストレスの増加を引き起こす細胞周期、ＦＡ、ＤＮＡ損傷および複製に関与する遺伝子を標的にするために、適用することができる。これらの効果は、有糸分裂／破局的ながん細胞死の増加をもたらす異常な細胞の増加を引き起こし得る。
【0049】
図６Ａ～６Ｂは、２４、４８および７２時間で、ＴＴＦｉｅｌｄとＥ２Ｆシグナル伝達またはＣＤＫ４／６シグナル伝達を調節不全にする薬剤との組み合わせを試験するさまざまな条件下での４つの肺がん細胞株、Ｈ１２９９、Ａ５４９、Ｈ１５７、およびＨ４００６細胞、における例示的なクローン原性生存アッセイの結果を提供する。Ｈ１２９９およびＡ５４９は、ＴＴＦｉｅｌｄを使用する従来の処置に抵抗性である非小細胞肺がん細胞株である。対照的に、Ｈ１５７およびＨ４００６は、ＴＴＦｉｅｌｄに対してより応答性であることが公知の細胞株である。ＴＴＦｉｅｌｄ単独、またはＴＴＦｉｅｌｄとＥ２Ｆ阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤、もしくはＥ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤の組み合わせと組み合わせた曝露の増加後の細胞生存を示す。
【0050】
図６Ａ～６Ｂに示されるように、より低い用量のＥ２Ｆ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤をＴＴＦｉｅｌｄと組み合わせて使用する場合、ＴＴＦｉｅｌｄ曝露の７２時間後、細胞生存の２０～１００分の１の低減がある。一例において、７２時間のＴＴＦｉｅｌｄ曝露、２０μＭのＥ２Ｆ阻害剤のＨＬＭ００６４７４、および０．５μＭのアベマシクリブの組み合わせは、細胞生存の約１００分の１の低減をもたらした。理論に拘束されないが、細胞生存の予想外の低減は、いくつかの経路の一時の標的化からもたらされたと考えられる。
【0051】
図７Ａ～７Ｂは、図６Ａ～６Ｂに記載される例示的なクローン原性生存アッセイからの組み合わせ指標値（ＣＩ）値を提供する。いくつかの例において、１．０よりも大きいＣＩ値は、相乗効果、または抗腫瘍活性に対し驚いたことに好ましい効果を記載する。図７Ａ～７Ｂに図示されるように、Ｈ１２９９およびＡ５４９細胞株は、ＴＴＦｉｅｌｄがＣＤＫ＋Ｅ２Ｆ阻害剤と組み合わせて適用された７２時間後に著しい相乗効果を示す（例えば、７２時間後のＨ１２９９では１１．６５のＣＩ指標値、および７２時間後のＡ５４９では１３．９１のＣＩ指標値）。
【0052】
いくつかの態様において、併用療法の適用は、ＴＴＦｉｅｌｄの適用を、ＴＴＦｉｅｌｄの適用とともにまたはその直後に、１つまたは複数の治療剤のがん細胞への適用または送達と組み合わせる。
【0053】
いくつかの態様において、併用療法の適用は、ＴＴＦｉｅｌｄの適用を、ＴＴＦｉｅｌｄの適用の所定期間後に、１つまたは複数の治療剤のがん細胞への適用と組み合わせる。所定期間は、ＴＴＦｉｅｌｄが適用された後のがん細胞の観察された脆弱性に基づいて決定され得る。例えば、いくつかの態様において、がん細胞は、ＴＴＦｉｅｌｄが適用されたおよそ２４、４８または７２時間後に、併用療法で処置またはそれに曝露され得る。
【0054】
図８Ａ～８Ｆは、２４、４８、および７２時間のＴＴＦｉｅｌｄへの曝露後、Ｈ４００６、Ｈ１５７、Ａ５４９、Ｈ１２９９、およびＨ１６５０細胞において、ＦＡ－ＢＲＡＣＡ経路（ＢＲＣＡ１、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＡ、およびＲＦＣ３）における遺伝子についてのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの発現に関する例示的なデータを提供する。図８Ａ～８Ｆに示されるように、ＴＴＦｉｅｌｄは、これらの遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質発現を減少させ、７２時間後に発現の最大の減少を示した。
【0055】
図９Ａ～９Ｂは、ＦＡ経路（ＢＲＣＡ１、ＦＡＮＣＤ２、ＭＬＨ１、ＲＢＬ１、ＲＦＣ３、ＲＦＣ４）、有糸分裂／細胞周期（ＣＣＮＥ２、ＤＵＳＰ１、ＥＺＨ２、ＭＡＤ２Ｌ１）、およびＤＮＡ複製（ＣＤＣ４５、ＤＨＦＲ、ＭＣＭ６、ＰＯＬＡ２、ＲＲＭ２）における示された標的遺伝子に関して、転写活性化因子（Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２）および転写抑制因子（Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ６）の例示的な活性を図示する。総合すれば、図９Ａ～９Ｂにおけるデータは、ＴＴＦｉｅｌｄが、これらの３つのクラスの遺伝子について、転写活性化因子（Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２）を阻害し、転写抑制因子（Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ６）を活性化することを示す。
【0056】
図１０は、Ｈ１２９９細胞における、ＴＴＦｉｅｌｄへの曝露の２４、４８および７２時間後のＴＴＦｉｅｌｄおよび薬物のさまざまな組み合わせについての例示的な組み合わせ指標（ＣＩ）データを提供する。組み合わせ指標研究を使用して、薬物の組み合わせの生物学的効果の相加効果または相乗効果を決定する。例えば、Ｃｈｏｕら、Ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｅｒｇｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｈｏｕ－Ｔａｌａｌａｙ ｍｅｔｈｏｄ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２０１０年１月１５日；７０巻（２号）：４４０～６頁を参照されたい。一態様において、７２時間のＴＴＦｉｅｌｄ曝露、２０μＭのＥ２Ｆ阻害剤のＨＬＭ００６４７４、および０．５μＭのアベマシクリブの組み合わせは、８．７２の予想外かつ驚いたことに高い組み合わせ指標をもたらした。
【実施例1】
【0057】
実験の材料および方法
細胞培養
ヒトＮＳＣＬＣ細胞株（Ｈ１５７、Ｈ４００６、Ａ５４９、およびＨ１２９９）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。これらの細胞株はすべて、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｆｌｏｗｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈ、Ｇａ．、ＵＳＡ）およびペニシリン／ストレプトアビジン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、Ｕ２９ＳＡ）が補充されたＲＰＭＩ培地で成長させた。すべての細胞は、５％のＣＯ２を常に供給された加湿インキュベーター中、３７℃で成長させた。
細胞培養
ヒトＮＳＣＬＣ細胞株（Ｈ１５７、Ｈ４００６、Ａ５４９、およびＨ１２９９）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。これらの細胞株はすべて、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｆｌｏｗｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈ、Ｇａ．、ＵＳＡ）およびペニシリン／ストレプトアビジン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、Ｕ２９ＳＡ）が補充されたＲＰＭＩ培地で成長させた。すべての細胞は、５％のＣＯ２を常に供給された加湿インキュベーター中、３７℃で成長させた。
【0058】
腫瘍治療電場
ｉｎｏｖｉｔｒｏシステム（ＮｏｖｏＣｕｒｅ Ｌｔｄ、Ｈａｉｆａ、Ｉｓｒａｅｌ）を使用して、高比誘電率セラミックス（マグネシウムニオブ酸鉛－チタン酸鉛（ｌｅａｄ ｔｉｔａｎｉｔｅ）（ＰＭＮ－ＰＴ））で構成されたペトリ皿の外壁上に垂直に印刷された電極の２つの対を使用してＴＴＦｉｅｌｄを発生させた。トランスデューサーアレイを、培地中、所望の周波数で低強度の電場を発生する正弦波形発生器に接続した。ＴＴＦｉｅｌｄの方向を、１秒ごとに９０°切り替え、このようにして、細胞分裂の方向軸の大部分を網羅した。温度が１９℃で維持されて、ｉｎｏｖｉｔｒｏシステムによって発生した熱を消失させた冷蔵インキュベーターにプレートを入れることによって、プレート温度を３７℃で維持した。温度を、セラミック壁に取り付けられた２つのサーミスタ（Ｏｍｅｇａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．、ＵＳＡ）によって測定した。すべての細胞懸濁液を、ｉｎｏｖｉｔｒｏディッシュ（ＮｏｖｏＣｕｒｅ Ｌｔｄ）内のカバースリップ上で成長させ、図に示される時間、ＴＴＦｉｅｌｄで処理した。
ｉｎｏｖｉｔｒｏシステム（ＮｏｖｏＣｕｒｅ Ｌｔｄ、Ｈａｉｆａ、Ｉｓｒａｅｌ）を使用して、高比誘電率セラミックス（マグネシウムニオブ酸鉛－チタン酸鉛（ｌｅａｄ ｔｉｔａｎｉｔｅ）（ＰＭＮ－ＰＴ））で構成されたペトリ皿の外壁上に垂直に印刷された電極の２つの対を使用してＴＴＦｉｅｌｄを発生させた。トランスデューサーアレイを、培地中、所望の周波数で低強度の電場を発生する正弦波形発生器に接続した。ＴＴＦｉｅｌｄの方向を、１秒ごとに９０°切り替え、このようにして、細胞分裂の方向軸の大部分を網羅した。温度が１９℃で維持されて、ｉｎｏｖｉｔｒｏシステムによって発生した熱を消失させた冷蔵インキュベーターにプレートを入れることによって、プレート温度を３７℃で維持した。温度を、セラミック壁に取り付けられた２つのサーミスタ（Ｏｍｅｇａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．、ＵＳＡ）によって測定した。すべての細胞懸濁液を、ｉｎｏｖｉｔｒｏディッシュ（ＮｏｖｏＣｕｒｅ Ｌｔｄ）内のカバースリップ上で成長させ、図に示される時間、ＴＴＦｉｅｌｄで処理した。
【0059】
細胞成長アッセイ
ヒトＮＳＣＬＣ（Ｈ１５７、Ｈ４００６、Ａ５４９、およびＨ１２９９）細胞株を、２４、４８および７２時間、示されたＴＴＦｉｅｌｄの異なる周波数で処理し、細胞成長を、各試料について三回、Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ｈｉｄ．、ＵＳＡ）を使用してカウントした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ．６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ、ＵＳＡ）を使用して、各時点でカウントされた平均細胞数および所与のＴＴＦｉｅｌｄ周波数を使用して、成長曲線のグラフを描いた。
ヒトＮＳＣＬＣ（Ｈ１５７、Ｈ４００６、Ａ５４９、およびＨ１２９９）細胞株を、２４、４８および７２時間、示されたＴＴＦｉｅｌｄの異なる周波数で処理し、細胞成長を、各試料について三回、Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ｈｉｄ．、ＵＳＡ）を使用してカウントした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ．６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ、ＵＳＡ）を使用して、各時点でカウントされた平均細胞数および所与のＴＴＦｉｅｌｄ周波数を使用して、成長曲線のグラフを描いた。
【0060】
細胞周期解析
特定の時間および処理での細胞を収集し、７５％の氷－冷エタノール中、－２０℃で２４時間固定した。固定された細胞を、ＰＢＳで洗浄し、５００μｌのＰＩ染色溶液、すなわち、１ｍｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０５％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および３０μｇ／ｍｌのＰＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ中、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞周期の分布を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して決定した。試料あたり１０，０００個細胞超をカウントし、結果を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアｖ８．７．１（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ、Ａｓｈｌａｎｄ、Ｏｒｅｇ．、ＵＳＡ）を使用して解析した。
特定の時間および処理での細胞を収集し、７５％の氷－冷エタノール中、－２０℃で２４時間固定した。固定された細胞を、ＰＢＳで洗浄し、５００μｌのＰＩ染色溶液、すなわち、１ｍｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０５％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および３０μｇ／ｍｌのＰＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ中、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞周期の分布を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して決定した。試料あたり１０，０００個細胞超をカウントし、結果を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアｖ８．７．１（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ、Ａｓｈｌａｎｄ、Ｏｒｅｇ．、ＵＳＡ）を使用して解析した。
【0061】
遺伝子発現解析のためのＲＮＡの標識化およびハイブリダイゼーション
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ ＨｕｍａｎＷＧ６ ｖ４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用した。各ＲＮＡ試料（０．５μｇ）を、ビオチンＵＴＰ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡ）標識化を用いるＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｏｔａｌＰｒｅｐ ＲＮＡ増幅キットを使用して増幅した。Ｔ７オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、一本鎖ｃＤＮＡを発生させ、続いて、二本鎖合成で二本鎖ｃＤＮＡを発生させ、次いで、これをカラム精製した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロ転写を行って、ビオチン標識化ｃＲＮＡを合成した。次いで、ｃＲＮＡをカラム精製し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｅｘｐｅｒｉｏｎシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ、ＵＳＡ）を使用して、サイズおよび収率についてチェックした。次いで、ｃＲＮＡ（１．５μｇ）を、検出のために使用されるストレプトアビジン－Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）を用いる標準的なＩｌｌｕｍｉｎａプロトコールを使用して、各アレイについてハイブリダイズした。スライドを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｂｅａｄｓｔａｔｉｏｎ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ）においてスキャンした。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ ＨｕｍａｎＷＧ６ ｖ４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用した。各ＲＮＡ試料（０．５μｇ）を、ビオチンＵＴＰ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡ）標識化を用いるＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｏｔａｌＰｒｅｐ ＲＮＡ増幅キットを使用して増幅した。Ｔ７オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、一本鎖ｃＤＮＡを発生させ、続いて、二本鎖合成で二本鎖ｃＤＮＡを発生させ、次いで、これをカラム精製した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロ転写を行って、ビオチン標識化ｃＲＮＡを合成した。次いで、ｃＲＮＡをカラム精製し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｅｘｐｅｒｉｏｎシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ、ＵＳＡ）を使用して、サイズおよび収率についてチェックした。次いで、ｃＲＮＡ（１．５μｇ）を、検出のために使用されるストレプトアビジン－Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）を用いる標準的なＩｌｌｕｍｉｎａプロトコールを使用して、各アレイについてハイブリダイズした。スライドを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｂｅａｄｓｔａｔｉｏｎ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ）においてスキャンした。
【0062】
差次的遺伝子発現のデータ処理および有意性解析
各プローブセットについての要約された発現値を、ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏ ３．１（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ）を使用して作成した。データを、ＭＢＣＢアルゴリズムを使用して、試料全体にわたって、バックグラウンド減算、および変位値－変位値－正規化した。正規化された遺伝子発現値を使用して、比較のためのプロットを作成した。処置された細胞株において差次的に発現した遺伝子の解析を、ＳＡＭを使用して行った。ＦＤＲ＜０．０５を、統計学的に有意であると見なした。クラスター分析およびヒートマップを、Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｕｉｔｅソフトウェア（Ｐａｒｔｅｋ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）を使用して作成した。遺伝子オントロジーおよび経路解析を、ＩＰＡ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して行った。
各プローブセットについての要約された発現値を、ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏ ３．１（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ）を使用して作成した。データを、ＭＢＣＢアルゴリズムを使用して、試料全体にわたって、バックグラウンド減算、および変位値－変位値－正規化した。正規化された遺伝子発現値を使用して、比較のためのプロットを作成した。処置された細胞株において差次的に発現した遺伝子の解析を、ＳＡＭを使用して行った。ＦＤＲ＜０．０５を、統計学的に有意であると見なした。クラスター分析およびヒートマップを、Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｕｉｔｅソフトウェア（Ｐａｒｔｅｋ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）を使用して作成した。遺伝子オントロジーおよび経路解析を、ＩＰＡ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して行った。
【0063】
免疫ブロット
Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（４×；Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、３０μｇの各タンパク質試料に添加し、混合物を、９５℃で１０分間ボイルした。次いで、タンパク質混合物を、１０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードし、続いて、９０Ｖ、４℃で１時間ＰＶＤＦ膜に移動させた。膜を、ＰＢＳＴ中の５％の無脂肪乳を用いて、室温で１時間ブロッキングし、２％のウシ血清アルブミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）を含有するＰＢＳＴ中の抗（３－アクチン（１：５０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）、抗ＢＲＣＡ１（１：１０００）、抗ＦＡＮＣＤ２（１：２０００）および抗ＦＡＮＣＡ（１：５００；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＬＬＣ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）を用いて、４℃で終夜調べた。膜を、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し（ＴＢＳＴ；それぞれ３×１０分）、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）とコンジュゲートした二次抗体（１：５０００）とともに、室温で１時間インキュベートした。膜を、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ Ｍシステム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ、ＵＳＡ）において、化学発光検出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡ）を使用して、現像した。定量化を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、ＵＳＡ）を使用して行い、対応するアクチン密度を使用して正規化した。
Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（４×；Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、３０μｇの各タンパク質試料に添加し、混合物を、９５℃で１０分間ボイルした。次いで、タンパク質混合物を、１０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードし、続いて、９０Ｖ、４℃で１時間ＰＶＤＦ膜に移動させた。膜を、ＰＢＳＴ中の５％の無脂肪乳を用いて、室温で１時間ブロッキングし、２％のウシ血清アルブミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）を含有するＰＢＳＴ中の抗（３－アクチン（１：５０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）、抗ＢＲＣＡ１（１：１０００）、抗ＦＡＮＣＤ２（１：２０００）および抗ＦＡＮＣＡ（１：５００；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＬＬＣ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）を用いて、４℃で終夜調べた。膜を、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し（ＴＢＳＴ；それぞれ３×１０分）、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）とコンジュゲートした二次抗体（１：５０００）とともに、室温で１時間インキュベートした。膜を、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ Ｍシステム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ、ＵＳＡ）において、化学発光検出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡ）を使用して、現像した。定量化を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、ＵＳＡ）を使用して行い、対応するアクチン密度を使用して正規化した。
【0064】
免疫蛍光法
細胞を、ガラスカバースリップ上に播種し、処理後、細胞を、洗浄し、氷－冷メタノールで固定した。試料を、１０％の正常ヤギ血清を用いて、１時間ブロッキングし、ホスホ－ヒストン－γ－Ｈ２ＡＸ抗体（Ｓｅｒ１３９；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｃａｌｉｆ、ＵＳＡ）およびｐ５３結合タンパク質１（５３ＢＰ１）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともにインキュベートした。試料を、ＰＢＳ中で５分間、３回洗浄し、次いで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗ウサギ抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５コンジュゲート抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）とともに１時間インキュベートした。核を、Ｖｅｃａｔｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆ、ＵＳＡ）に含有されるＤＡＰＩを用いて対比染色した。次いで、染色された細胞を、それぞれ０．２μＭ厚さのｚスタックの５つの切片を用いて、６３倍対物レンズ（油浸、開口数 １．３）を備えた蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡ）下で解析した。各実験からの４０の核の定量的画像解析を、Ｉｍａｒｉｓソフトウェアバージョン８．０（Ｂｉｔｐｌａｎｅ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）における細胞モジュールを使用して行った。
細胞を、ガラスカバースリップ上に播種し、処理後、細胞を、洗浄し、氷－冷メタノールで固定した。試料を、１０％の正常ヤギ血清を用いて、１時間ブロッキングし、ホスホ－ヒストン－γ－Ｈ２ＡＸ抗体（Ｓｅｒ１３９；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｃａｌｉｆ、ＵＳＡ）およびｐ５３結合タンパク質１（５３ＢＰ１）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともにインキュベートした。試料を、ＰＢＳ中で５分間、３回洗浄し、次いで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗ウサギ抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５コンジュゲート抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）とともに１時間インキュベートした。核を、Ｖｅｃａｔｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆ、ＵＳＡ）に含有されるＤＡＰＩを用いて対比染色した。次いで、染色された細胞を、それぞれ０．２μＭ厚さのｚスタックの５つの切片を用いて、６３倍対物レンズ（油浸、開口数 １．３）を備えた蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡ）下で解析した。各実験からの４０の核の定量的画像解析を、Ｉｍａｒｉｓソフトウェアバージョン８．０（Ｂｉｔｐｌａｎｅ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）における細胞モジュールを使用して行った。
【0065】
放射線曝露およびクローン原性細胞生存
ＮＳＣＬＣ細胞に対する放射線感度の効果を研究するために、指数関数的に成長している細胞を、Ｍａｒｋ ＩＩ Ｃｓ照射器（Ｊ Ｌ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を使用して、３．４７Ｇｙ／分の線量率で、ＩＲで処理し、続いて２４、４８および７２時間のＴＴＦｉｅｌｄを即時適用した。次いで、細胞を、６０ｍｍディッシュに再播種し、最長で２週間インキュベートした。５０個以上の細胞を含有するコロニーを、生存と見なした。データは、３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。ＴＴＦｉｅｌｄの放射線増感効果を、下記に示されるようにして、ＣＩを算出することによって、Ｔｈｅ Ｈｉｇｈｅｓｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｇｅｎｔアプローチに従って評価した。
ＮＳＣＬＣ細胞に対する放射線感度の効果を研究するために、指数関数的に成長している細胞を、Ｍａｒｋ ＩＩ Ｃｓ照射器（Ｊ Ｌ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を使用して、３．４７Ｇｙ／分の線量率で、ＩＲで処理し、続いて２４、４８および７２時間のＴＴＦｉｅｌｄを即時適用した。次いで、細胞を、６０ｍｍディッシュに再播種し、最長で２週間インキュベートした。５０個以上の細胞を含有するコロニーを、生存と見なした。データは、３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。ＴＴＦｉｅｌｄの放射線増感効果を、下記に示されるようにして、ＣＩを算出することによって、Ｔｈｅ Ｈｉｇｈｅｓｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｇｅｎｔアプローチに従って評価した。
【0066】
ＣＩ＝（ＳＦＩＲ×ＳＦＴＴＦｉｅｌｄ）／ＳＦＩＲ＋ＴＴＦｉｅｌｄ（式中、ＳＦ＝生存率である）
【0067】
組み合わせ効果は、ＣＩ＞１の場合に増強／相乗的、ＣＩ＝１の場合に相加的と見なした。正の効果についての統計学的有意性を、組み合わせ（ＴＴＦｉｅｌｄとＩＲ）を所与の線量およびＩＲ後の時間について最も高い細胞死滅を示す単一薬剤と比較する二元配置ＡＮＯＶＡ多重比較統計検定のＰ値によって決定した。
【実施例2】
【0068】
ＴＴＦｉｅｌｄに曝露された肺がん細胞のプロテオメトリック解析
いくつかの態様において、腫瘍治療電場に曝露された肺がん細胞のプロテオミクス解析は、Ｅ２Ｆ－Ｒｂ－ＣＤＫ４／６軸の調節不全が、腫瘍細胞を、ＣＤＫ４／６および／またはＥ２Ｆを標的にする記載される新規の併用療法に感受性にすることを特定した。細胞死を誘導するＴＴＦｉｅｌｄについて記載された１つの機構は、有糸分裂の破壊によるが、より最近の検討は、ＴＴＦｉｅｌｄが、複製ストレスを引き起こし、かつＤＮＡ修復および細胞周期チェックポイントの遺伝子を下方調節することを示唆している。しかしながら、ＤＮＡ修復および細胞周期チェックポイントの遺伝子の下方調節の正確な原因は、とらえどころがない。そのような目的で、開示される技術は、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）を使用する相対的な定量的プロテオミクス解析を用いた。すべての試料は、トリプシン消化、および異なるＴＭＴ試薬による標識化を受けた。次いで、それらを混合し、混合物を、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ質量分析装置において処理した。
いくつかの態様において、腫瘍治療電場に曝露された肺がん細胞のプロテオミクス解析は、Ｅ２Ｆ－Ｒｂ－ＣＤＫ４／６軸の調節不全が、腫瘍細胞を、ＣＤＫ４／６および／またはＥ２Ｆを標的にする記載される新規の併用療法に感受性にすることを特定した。細胞死を誘導するＴＴＦｉｅｌｄについて記載された１つの機構は、有糸分裂の破壊によるが、より最近の検討は、ＴＴＦｉｅｌｄが、複製ストレスを引き起こし、かつＤＮＡ修復および細胞周期チェックポイントの遺伝子を下方調節することを示唆している。しかしながら、ＤＮＡ修復および細胞周期チェックポイントの遺伝子の下方調節の正確な原因は、とらえどころがない。そのような目的で、開示される技術は、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）を使用する相対的な定量的プロテオミクス解析を用いた。すべての試料は、トリプシン消化、および異なるＴＭＴ試薬による標識化を受けた。次いで、それらを混合し、混合物を、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ質量分析装置において処理した。
【0069】
ペプチドの定量化は、ＴＭＴレポーターイオンの強度を比較することによって達成した。差次的に発現したタンパク質のＳＴＲＩＮＧ ＤＢ解析は、細胞周期、ＤＮＡ損傷修復および複製、ならびに転写および翻訳調節を含む相互作用ネットワークを明らかにした。細胞周期チェックポイントおよびＤＮＡ修復に関連する重要な遺伝子の上流解析は、転写活性化因子のＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２の発現の低減、ならびに転写抑制因子のＥ２Ｆ６の発現の増加を特定し、ＴＴＦｉｅｌｄがＣＤＫ－ＲＢ－Ｅ２Ｆ軸に影響を及ぼすことを示唆した。例えば、ＲＡＤ５１、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２を含む重要なＤＮＡ修復遺伝子の下方調節は、例えば、転写抑制因子のＥ２Ｆ４およびＥ２Ｆ６（ＢＲＣＡ１の公知の抑制因子）の上方調節により説明することができた。
【0070】
これらのタンパク質は、相同組換え修復およびヌクレオチド除去修復に関与するが、複製フォーク維持、複製フォーク崩壊、および全体的な複製ストレスにも関与し、これらの後者は、細胞死を引き起こす可能性がある。したがって、一例では、ＴＴＦｉｅｌｄをＣＤＫ４／６阻害剤のアベマシクリブありまたはなしで、Ｅ２Ｆ阻害剤のＨＬＭ００６４７４と組み合わせた。いずれかの阻害剤と組み合わせたＴＴＦｉｅｌｄは、ＴＴＦｉｅｌｄ単独と比較して、相乗的に細胞死滅を増強したが、３つの組み合わせは、相乗性を決定するためのクローン原性アッセイとそれに続くＨｉｇｈｅｓｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｇｅｎｔアプローチによって測定されるように、非常に致死的である（７２時間までに＞９０％）ことが見出された。総合すれば、一例において、この結果は、がん治療のためにＴＴＦｉｅｌｄと組み合わせて使用することができる新規の新薬の開発につながるような標的としてＣＤＫ－ＲＢ－Ｅ２Ｆ軸を特定した。
【実施例3】
【0071】
ＴＴＦｉｅｌｄを含む併用療法に対するさらなるゲノミクスおよびプロテオミクスのサポート
標的化なくかつ先入観のない方法で生物学的プロセスの全体像を捕捉し、一連の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）細胞のＴＴＦｉｅｌｄ曝露の際の全体的な遺伝子発現の変化を理解するために、トランスクリプトミクスアプローチが過去の研究グループによって用いられた。ＴＴＦｉｅｌｄ応答性遺伝子のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）の結果は、変更が細胞周期および有糸分裂調節経路において起こることを示唆し、これは、以前の研究と一致するが、ＴＴＦｉｅｌｄ曝露による有意に下方調節されたＢＲＣＡ１ ＤＮＡ損傷応答経路（Ｐ＜０．０５）も明らかにした。しかしながら、正確には何がＤＮＡ修復および細胞周期チェックポイントの遺伝子の下方調節を引き起こすのかは、とらえどころがなかった。
標的化なくかつ先入観のない方法で生物学的プロセスの全体像を捕捉し、一連の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）細胞のＴＴＦｉｅｌｄ曝露の際の全体的な遺伝子発現の変化を理解するために、トランスクリプトミクスアプローチが過去の研究グループによって用いられた。ＴＴＦｉｅｌｄ応答性遺伝子のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）の結果は、変更が細胞周期および有糸分裂調節経路において起こることを示唆し、これは、以前の研究と一致するが、ＴＴＦｉｅｌｄ曝露による有意に下方調節されたＢＲＣＡ１ ＤＮＡ損傷応答経路（Ｐ＜０．０５）も明らかにした。しかしながら、正確には何がＤＮＡ修復および細胞周期チェックポイントの遺伝子の下方調節を引き起こすのかは、とらえどころがなかった。
【0072】
したがって、どのようにしてゲノミクスレベルの発現の変化が、生物活性に対する機能的プレーヤーであるタンパク質発現の変化に翻訳されるかを決定するために、プロテオームレベルの変化を誘導するＴＴＦｉｅｌｄを調べるために、プロテオミクス解析を含む実験を行った。タンデム質量タグ（ＴＭＴ）を使用する相対的な定量的プロテオミクス解析を使用して、Ｈ１２９９細胞における対照およびＴＴＦｉｅｌｄ処理条件のプロテオームを定量化した。ＴＴＦｉｅｌｄ曝露後、それぞれ、２４時間および４８時間で、合計で１０６および５４１の差次的に発現したタンパク質が存在した。差次的に発現したタンパク質のＳＴＲＩＮＧデータベース解析は、細胞周期、ＤＮＡ損傷修復および複製、ミトコンドリア機能障害、ならびに転写および翻訳調節を含む相互作用ネットワークを明らかにした。ＦＡ経路、細胞周期ならびにＤＮＡ損傷および複製経路のメンバーについての発現の変化の同じパターンが、図８Ａ～８Ｆに図示されるように、プロテオミクスからのタンパク質レベルで、およびトランスクリプトミクス解析からのｍＲＮＡレベルで観察された。
【0073】
図８Ａ～８Ｆは、トランスクリプトミクスデータからの一時的なｍＲＮＡレベルの発現の変化、プロテオミクスデータからのタンパク質レベルの発現の変化、ならびに下方調節されたとして特定されたＦＡ経路のメンバーのいくつかについてのウエスタンブロットによるタンパク質レベルの変化の検証を図示し、遺伝子およびタンパク質レベルの両方でＦＡ経路のメンバーについて類似の発現パターンを示唆する。
【0074】
加えて、これらの調節ノードが、調節不全された経路に対する最大限の制御を発揮するが、乱されていない経路に対する最小限の制御を発揮するので、いくつかの下流経路、例えば、細胞周期、ＤＮＡ損傷修復および複製などの発現のための制御ノードとして作用する重要な上流の調節ネットワーク機構を特定するために実験を行った。差次的に発現したタンパク質を誘導するＴＴＦｉｅｌｄのＩＰＡ上流調節因子解析的分析は、上流の転写調節因子、例えば、それぞれ転写活性化因子および転写抑制因子である、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２の発現の低減、ならびにＥ２Ｆ６の発現の増加を特定し、図９Ａ～９Ｂに図示されるように、ＴＴＦｉｅｌｄが、ＣＤＫ－Ｒｂ－Ｅ２Ｆ軸に影響を及ぼし、かつＥ２Ｆ４およびＥ２Ｆ６シグナル伝達ならびに複製フォークに関するタンパク質（ＭＣＭ６、ＲＦＣ３、ＲＦＣ４）、有糸分裂に関するタンパク質（ＢＵＢ３、ＣＣＮＥ２、ＥＺＨ２）により、ＲＡＤ５１、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２を含む重要なＤＮＡ修復タンパク質を調節不全にすることを示唆した。これらのタンパク質は、細胞周期、相同組換え修復、ヌクレオチド除去修復、複製フォーク維持、複製フォーク崩壊、および全体的な複製ストレスに関与する。
【0075】
より詳細には、図９Ａ～９Ｂは、異なるプロテオーム解析からの上流調節因子解析および定量的Ｅ２Ｆ標的発現の変化を図示する。ＴＴＦｉｅｌｄは、転写因子のＥ２Ｆファミリーの、転写活性化因子（Ｅ２Ｆ１～３）を阻害し、転写抑制因子（Ｅ２Ｆ４～８）を増加させる。そのため、ファンコニ貧血（ＢＲＣＡ１、ＦＡＮＣＤ２、ＭＬＨ１、ＲＢＬ１、ＲＦＣ３、ＲＦＣ４）およびＤＮＡ複製経路タンパク質（ＣＤＣ４５、ＤＨＦＲ、ＭＣＭ６、ＰＯＬＡ２、ＲＲＭ２）の発現の減少が存在し、かつ、特異的な標的に対する転写のこれらの活性化因子／阻害剤の複雑さを発明者等に知らせる有糸分裂／細胞周期経路タンパク質（ＣＣＮＥ２、ＤＵＳＰ１、ＥＺＨ２、ＭＡＤ２Ｌ１）に対する異なる影響が存在した。異なる経路タンパク質、および転写因子の方向、および最終標的タンパク質の発現についてのタンパク質発現の変化の比（Ｌｏｇ２）を表に提供する。上流調節因子解析は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ Ｂａｓｅに保存された転写調節因子およびそれらの標的遺伝子の間の予想される効果の以前の知識に基づき、ユーザーのデータセットに存在する各転写調節因子の公知の標的の数を調べ、それらの変化の方向（すなわち、対照と比べたＴＴＦｉｅｌｄ試料の発現）も比較する。
【0076】
トランスクリプトームおよびプロテオームのレベルの変化の比較解析を行い、これは、ＣＤＫ－Ｒｂ－Ｅ２Ｆ軸が、細胞周期、ＤＮＡ損傷修復および複製ストレス経路に関与するＴＴＦｉｅｌｄ曝露で観察された効果についての上流調節ノードとして作用することを示した。ＣＤＫ－Ｒｂ－Ｅ２Ｆ軸は、新薬の開発につながるようなものであり、実際に、現在、がん処置における主要な薬物標的であり、そうすることで、この軸を標的にすることにより、ＤＮＡ修復、細胞周期チェックポイントまたは増殖および生存経路を標的にする従来の放射線および化学療法を増強するであろう統合療法になることを含んで、ＴＴＦｉｅｌｄがゆくゆくはどのように使用されるかを変化させるであろう。
【0077】
図１０は、ＴＴＦｉｅｌｄと一緒の異なる薬剤および電離放射線（ＩＲ）についての組み合わせ指標値の比較を提供する。一例において、結果は、ＣＤＫ阻害剤およびＥ２Ｆ阻害剤の両方をＴＴＦｉｅｌｄと組み合わせて使用してＣＤＫ－Ｅ２Ｆ－ＲＢ軸を遮断することが、個々の薬剤または他の薬剤と比較して、非常に有効であることを示唆する。各組み合わせについてのＰ値を表に提供する。
【0078】
本明細書に記載されるシステムおよび方法は、一次療法が適用された後に、ＴＴＦｉｅｌｄを薬剤と組み合わせて使用し得る。ＴＴＦｉｅｌｄをＲＢ－Ｅ２Ｆ軸の薬剤と組み合わせることにより、統合療法は、放射線、化学療法、またはＤＮＡ修復、細胞周期チェックポイントもしくは増殖および生存経路を標的にする他の療法などの下流の療法を増強し得る。
【0079】
本明細書に記載されるシステムおよび方法は、神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂａｓｔｏｍａ）、中皮腫、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、前立腺がん、皮膚がん、腹膜がんなどの処置および／または緩和のために使用することができる。本明細書のシステムおよび方法は、併用療法によってＴＴＦｉｅｌｄを適用する従来のシステムの際に改善するために使用されてもよい。
【0080】
本発明は、ある特定の実施形態を参照して開示したが、記載される実施形態に対する多数の改変、変更および変化は、添付の特許請求の範囲に定義されるように、本発明の領域および範囲から逸脱することなく可能である。したがって、本発明は、記載される実施形態に限定されるものではなく、下記に列挙される特許請求の範囲の文言およびその等価物によって定義される完全な範囲を有することが意図される。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【国際調査報告】