特表 2023-519089 増強された蛍光バイオアッセイのための超高輝度蛍光ナノコンポジット構造体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-10

(54)【発明の名称】増強された蛍光バイオアッセイのための超高輝度蛍光ナノコンポジット構造体

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/64 20060101AFI20230428BHJP

   G01N 33/566 20060101ALI20230428BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20230428BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20230428BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230428BHJP

【ＦＩ】

G01N21/64 F

G01N33/566

G01N33/483 C

C12Q1/04

G01N21/64 G

G01N33/53 K

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022546721

(86)(22)【出願日】2021-01-29

(85)【翻訳文提出日】2022-07-29

(86)【国際出願番号】 US2021015750

(87)【国際公開番号】W WO2021155181

(87)【国際公開日】2021-08-05

(31)【優先権主張番号】62/968,314

(32)【優先日】2020-01-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522305210

【氏名又は名称】オーラジェント バイオサイエンス エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ケルヒャー、クレア

(72)【発明者】

【氏名】チアン、チーション

(72)【発明者】

【氏名】クリック、スコット、エル．

【テーマコード（参考）】

2G043

2G045

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G043AA01

2G043BA16

2G043EA01

2G043EA14

2G045CA18

2G045FA11

2G045GC15

4B063QA01

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QR56

4B063QS39

4B063QX02

(57)【要約】

本明細書には、蛍光ナノコンポジットが記載される。蛍光ナノコンポジット構造体は、少なくとも１つの局在表面プラズモン共鳴波長（λＬＳＰＲ）を有するプラズモンナノ構造体、少なくとも１つのスペーサコーティング、最大励起波長（λＥＸ）を有する少なくとも１つの蛍光剤、および少なくとも１つのペプチド負荷主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（ｐＭＨＣ）を含み得る。蛍光ナノコンポジット構造体は、少なくとも１つの蛍光剤単独の蛍光強度よりも少なくとも５００倍大きい蛍光強度を有する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

蛍光ナノコンポジット構造体であって、
少なくとも１つの局在表面プラズモン共鳴波長（λＬＳＰＲ）を有するプラズモンナノ構造体と、
少なくとも１つのスペーサコーティングと、
最大励起波長（λＥＸ）を有する少なくとも１つの蛍光剤と、
少なくとも１つのペプチド負荷主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（ｐＭＨＣ）と、を含み、
前記蛍光ナノコンポジット構造体は、前記少なくとも１つの蛍光剤単独の蛍光強度よりも少なくとも５００倍大きい蛍光強度を有する、蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項2】

前記少なくとも１つのλＬＳＰＲと前記λＥＸとの間の差は、７５ｎｍ未満である、請求項１に記載の蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項3】

前記プラズモンナノ構造体は、銀でコーティングされた金ナノロッド（ＡｕＮＲ＠Ａｇ）である、請求項１に記載の蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項4】

前記少なくとも１つの蛍光剤は、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、または少なくとも約５００の蛍光剤を含む、請求項１に記載の蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項5】

前記スペーサコーティングは、約１ｎｍ～約２０ｎｍの厚さを有する、請求項１に記載の蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項6】

ビオチン結合分子をさらに含む、請求項１に記載の蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項7】

前記少なくとも１つのビオチン結合分子は、少なくとも約２個、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、または少なくとも約５０個のビオチン結合分子を含む、請求項６に記載の蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項8】

前記ビオチン結合分子は、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはアビジンである、請求項６に記載の蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項9】

前記少なくとも１つのｐＭＨＣ分子は、少なくとも約２個、少なくとも約４個、少なくとも約８個、少なくとも約１２個、少なくとも約１６個、少なくとも約２０個、少なくとも約２４個、少なくとも約２８個、少なくとも約３２個、少なくとも約３６個、少なくとも約４０個、または少なくとも約４８個のｐＭＨＣ分子を含む、請求項１に記載の蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項10】

前記少なくとも１つのｐＭＨＣ分子は、ビオチン化されている、請求項６に記載の蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項11】

前記スペーサコーティングを覆うスキャフォルド層をさらに含む、請求項１に記載の蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項12】

蛍光ナノコンポジット構造体であって、
少なくとも１つの局在表面プラズモン共鳴波長（λＬＳＰＲ）を有するプラズモンナノ構造体と、
少なくとも１つのスペーサコーティングと、
第１の最大励起波長（λＥＸ１）および第１の最大発光波長（λＥＭ１）を有する少なくとも１つの蛍光剤と、
第２の最大励起波長（λＥＸ２）および第２の最大発光波長（λＥＭ２）を有する少なくとも１つの蛍光剤と、を含み、
前記蛍光ナノコンポジット構造体は、λＥＸ１の光で励起され、λＥＭ２の光を放出することができ、
λＥＭ２での発光の強度は、λＥＭ１での発光の強度よりも大きい、蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項13】

前記少なくとも１つのλＬＳＰＲと前記λＥＸ１との間の差は、７５ｎｍ未満である、請求項１２に記載の蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項14】

λＥＸ１を有する前記少なくとも１種の蛍光剤は、ＦＲＥＴアクセプターとして機能するλＥＸ２を有する前記少なくとも１種の蛍光剤に対するＦＲＥＴドナーである、請求項１２に記載の蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項15】

第３の最大励起波長（λＥＸ３）および第３の最大発光波長（λＥＭ３）を有する少なくとも１種の蛍光剤をさらに含み、前記蛍光ナノコンポジット構造体は、λＥＸ１の光で励起され、λＥＭ３の光を放出することができ、λＥＭ３の発光強度は、λＥＭ１またはλＥＭ２の発光強度より大きい、請求項１２に記載の蛍光ナノコンポジット構造体。

【請求項16】

特異的Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞を同定する方法であって、前記方法は、
Ｔ細胞を含有する試料を提供することと、
ペプチドが負荷された少なくとも１つの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（ｐＭＨＣ）を含む蛍光ナノコンポジット構造体に、Ｔ細胞を含有する前記試料を接触させることであって、前記ｐＭＨＣは、前記ペプチドに特異的な受容体を含有するＴ細胞に特異的に結合することができる、接触させることと、
前記Ｔ細胞を空間的に分離することと、
蛍光発光を誘導する光の波長で前記蛍光ナノコンポジット構造体を励起することと、
前記蛍光ナノコンポジット構造体で標識された前記Ｔ細胞を検出することと、を含む、方法。

【請求項17】

前記蛍光ナノコンポジット構造体は、
少なくとも１つの局在表面プラズモン共鳴波長（λＬＳＰＲ）を有するプラズモンナノ構造体と、
少なくとも１つのスペーサコーティングと、
最大励起波長を有する少なくとも１つの蛍光剤と、を含み、
前記蛍光ナノコンポジット構造体は、前記少なくとも１つの蛍光剤単独の蛍光強度よりも少なくとも５００倍大きい蛍光強度を有する、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記Ｔ細胞は、フローサイトメトリーを使用して空間的に分離される、請求項１６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月３１日に出願された米国特許出願第６２／９６８，３１４号の優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、増強された蛍光バイオアッセイのための超高輝度蛍光ナノコンポジット構造体に関する。

【背景技術】

【0003】

生物学的流体および組織中の種々の生体分子の検出および定量化は、成分分子を正確かつ定量的に調べることを伴わずに複雑な非線形生化学系を完全に特徴付けることが不可能であることから、生物医学研究および臨床診断において根本的に重要である。この問題は、生物医学研究のすべての領域にわたって遍在するものであり、健康、老化、および疾患を完全に理解するための大きな障壁となっている。特に、核酸についてのＰＣＲのような増幅スキームを有さないタンパク質およびペプチドの場合、がん、心疾患、および神経変性のような疾患に関連する分子の関連濃度は、ｆｇ／ｍＬレベルからｍｇ／ｍＬまで何桁もの濃度範囲に及ぶ可能性があるため、この問題は、決して些細な問題ではない。同じ分子であっても、生理学的状態（例えば、健康対疾患）または試料環境（例えば、血液対脳脊髄液）に依存して、存在量が桁違いに変動する場合がある。最後に、研究機関にとって特に重要なことは、試料が非常に貴重であり、時には利用可能な量が極端に制限されることである。蛍光プローブおよび蛍光測定アプローチは、生物医学研究において、細胞および種々の亜細胞種の位置および動態ならびに細胞および組織における分子相互作用を可視化するための撮像ツールとしてだけでなく、分子バイオマーカーの検出および定量化のための蛍光イムノアッセイにおける標識／レポーターとしても用いられている。蛍光ベースの技術は、疾患の発症、進行、および治療に対する応答のゲノム、トランスクリプトーム、およびプロテオミクスシグネチャーを解明し、生物学および生命科学に根本的な変化をもたらしている。しかしながら、蛍光に依存する一連の検出および撮像技術においては、「シグナルが微弱であること」が永続的かつ繰り返し起こる問題であった。すべての蛍光ベースの生物分析技術では、最終的に、レポーターとして機能する個々の蛍光種から調査期間中に収集され得る光の量によって、その検出感度が制限されている。概して、個々のレポーターフルオロフォアからの弱い蛍光シグナルおよび関連する不十分なシグナル対ノイズ比により、現在、蛍光ベースのアッセイの最終的な感度は制限されている。

【0004】

この問題に対処する１つの手法は、より高い開口数の光学システムに結合されたより感度の高い検出器を使用することにより、検出機器を改善することである。このアプローチの欠点として、１）検出機器および光学システムに多大な費用を要すること、および２）高い開口数により、視野が著しく制限され、アッセイ読み出しが非常に長くなることがある。さらに、バイオアッセイで使用される典型的なフルオロフォアは、それらが光退色する前に光子を放出し得る使用可能な寿命が限られている。

【0005】

蛍光により、比色ＥＬＩＳＡまたは化学発光などのアッセイ検出スキームを上回る複数の利点（多重化、高ダイナミックレンジ、広いプラットフォーム適用性（すなわち、細胞内、細胞上、組織、プレート、ビーズ、溶液などで使用され得る）を含む）が得られるが、蛍光は、不十分なシグナルのため基本的に制限される。プレートベースのアッセイでは、改善された蛍光検出感度を達成するために、ポリ－ＨＲＰ、ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ、アビジン－ビオチン複合体（ＡＢＣ）ＥＬＩＳＡ、およびチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）のような複雑なスキームが用いられる。これらのすべては、より複雑でより高価であり、概して、それらが置き換わるアッセイのバージョンよりもダイナミックレンジが劣っている。非常に高い検出感度を得るには、デジタルＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ Ｓｉｍｏａ Ｓｙｓｔｅｍ）または電気化学発光（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）などの複雑な技術が必要となるが、それぞれ、特殊な基板、機器、およびワークフローが必要となる。

【0006】

スペクトル的に多重化された蛍光アッセイでは、異なる種がスペクトル的に異なる蛍光プローブで標識され、利用可能な固有のフルオロフォアが多いほど、アッセイはより高度に多重化される可能性がある。特に、励起スペクトルおよび発光スペクトルの固有の組み合わせを有することが重要となっている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

一態様では、少なくとも１つの局在表面プラズモン共鳴波長（λＬＳＰＲ）を有するプラズモンナノ構造体と、少なくとも１つのスペーサコーティングと、最大励起波長（λＥＸ）を有する少なくとも１つの蛍光剤と、少なくとも１つのペプチド負荷主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（ｐＭＨＣ）とを含む蛍光ナノ構築物構造体が本明細書に開示される。蛍光ナノコンポジット構造体は、少なくとも１つの蛍光剤単独の蛍光強度よりも少なくとも５００倍大きい蛍光強度を有する。

【0008】

一部の態様では、ナノ構築物は、３５０ｎｍを超える少なくとも１つの局在表面プラズモン共鳴波長（λＬＳＰＲ）を有する銀コーティングされた金ナノロッド（ＡｕＮＲ＠Ａｇ）プラズモンナノ構造体と、少なくとも１つのスペーサコーティングと、最大に励起される波長（λＥＸ）を有する少なくとも１つの蛍光剤と、少なくとも１つの生体認識要素とを含み得る。ＡｕＮＲ＠Ａｇを形成するために使用される金ナノロッド（ＡｕＮＲ）は、銀でコーティングする前に、６５０ｎｍより大きい少なくとも１つの局在表面プラズモン共鳴波長を有する。蛍光ナノ構築物は、同様の照明および検出条件下で、少なくとも１つの蛍光剤単独の蛍光強度よりも少なくとも５００倍大きい蛍光強度を有する。

【0009】

一態様では、蛍光ナノ構築物を作製する方法が本明細書に開示される。この方法は、概して、ＡｕＮＲ＠Ａｇプラズモンナノ構造体を提供することであって、ＡｕＮＲ＠Ａｇを形成するために使用される金ナノロッド（ＡｕＮＲ）は、６５０ｎｍより大きい少なくとも１つの局在表面プラズモン共鳴波長を有する、提供することと、ＡｕＮＲ＠Ａｇプラズモンナノ構造体を少なくとも１つのスペーサコーティングでコーティングすることと、少なくとも１つの蛍光剤をスペーサコーティングにコンジュゲートすることと、スペーサ層を機能層でコーティングすることと、生体認識要素を少なくとも１つのスペーサコーティングまたは機能層のうちの１つにコンジュゲートすることと、を含む。

【0010】

一態様では、少なくとも１つの局在表面プラズモン共鳴波長（λＬＳＰＲ）を有するプラズモンナノ構造体と、少なくとも１つのスペーサコーティングと、第１の最大励起波長（λＥＸ１）および第１の最大発光波長（λＥＭ１）を有する少なくとも１つの蛍光剤と、第２の最大励起波長（λＥＸ２）および第２の最大発光波長（λＥＭ２）を有する少なくとも１つの蛍光剤とを含む蛍光ナノコンポジット構造体が本明細書でさらに開示される。蛍光ナノコンポジット構造体は、λＥＸ１の光で励起され、λＥＭ２の光を放出することができ、λＥＭ２の発光強度は、λＥＭ１の発光強度よりも大きい。

【0011】

一態様では、長いストークスシフトを有する蛍光ナノ構築物が本明細書に開示される。ナノ構築物は、概して、少なくとも１つの局在表面プラズモン共鳴波長（λＬＳＰＲ）を有するプラズモンナノ構造体と、少なくとも１つのスペーサコーティングと、最大に励起される波長（λＥＸ＿Ｄ）を有するフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナーとして機能する少なくとも１つの蛍光剤、および最大に放出する波長（λＥＭ＿Ａ）を有するＦＲＥＴアクセプターとして機能する少なくとも１つの蛍光剤とを含み、ＦＲＥＴドナーとして機能する蛍光剤は、プラズモンナノ構造体のλＬＳＰＲの少なくとも１つである５０ｎｍ以内のλＥＸ＿Ｄを有し、蛍光ナノ構築物は、λＥＸ＿Ｄで励起され、λＥＭ＿Ａで光を放出することができる。

【0012】

一態様では、複数のペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）分子で機能化され、ＭＨＣに結合したペプチドに特異的なＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を認識することができる蛍光ナノ構築物が本明細書に開示される。ｐＭＨＣで機能化された蛍光構築物は、現在の標準蛍光試薬である蛍光標識ストレプトアビジンに結合したｐＭＨＣと比較して、非常に高い検出感度を可能にする。これは、本明細書に開示される蛍光ナノ構築物が、蛍光ストレプトアビジンとは異なり、複合体当たり４つを超えるＭＨＣ分子のコンジュゲーションを可能にし、スペクトル的に等価なフルオロフォアで標識されたストレプトアビジンよりも非常に明るいという事実による。本明細書に開示されるｐＭＨＣ修飾蛍光ナノ構築物は、複数のＴＣＲが低い細胞表面密度で存在する場合であっても、複数のＴＣＲに付着することができる。

【0013】

別の態様において、本明細書に開示されるのは、特異的Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞を同定する方法である。この方法は、Ｔ細胞を含有する試料を提供することと、Ｔ細胞を含有する試料を、ペプチドに特異的な受容体を含有するＴ細胞に特異的に結合し得るペプチド（ｐＭＨＣ）が負荷された少なくとも１つの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を含む蛍光ナノコンポジット構造体と接触させることと、Ｔ細胞を空間的に分離することと、蛍光発光を誘導する光の波長で蛍光ナノコンポジット構造体を励起することと、蛍光ナノコンポジット構造体で標識されたＴ細胞を検出することとを含み得る。

【0014】

追加の実施形態および特徴は、以下の説明において部分的に記載され、本明細書を検討することによって当業者に明らかになるか、または開示された主題の実施によって習得され得る。本開示の性質および利点のさらなる理解は、本開示の一部を形成する明細書および図面の残りの部分を参照することによって実現され得る。

【0015】

本明細書は、本開示の種々の実施形態として提示され、本開示の範囲の完全な記述として解釈されるべきではない以下の図およびデータグラフを参照してより完全に理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】プラズモン蛍光体を生成するために使用される固有のプラズモンコアナノ粒子を生成するための概略図の例示的な実施形態である。この概略図では、８１０ｎｍを超えるλＬＳＰＲを有するコアＡｕＮＲを銀でコーティングして、６５０ｎｍ～８００ｎｍの主要なλＬＳＰＲを有するＡｕＮＲ＠Ａｇを作製することができ、または６６０ｎｍを超え８００ｎｍ未満のλＬＳＰＲを有するコアＡｕＮＲを使用して、４５０ｎｍ～６５０の主要なλＬＳＰＲを有するＡｕＮＲ＠Ａｇを作製することができる。

【図2】Ｃｙ２、ＦＩＴＣ、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８などの４６０～５００ｎｍの光によって励起され得る蛍光剤を増強するのに適したＡｕＮＲ＠Ａｇプラズモン粒子の例示的な実施形態について、その最大値で１に正規化された吸光スペクトルである。

【図3】ＴＲＩＴＣ、Ｃｙ３、ＭＢ５４３、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２などの４８０～５４０ｎｍの光によって励起され得る蛍光剤を増強するのに適したＡｕＮＲ＠Ａｇプラズモン粒子の例示的な実施形態について、その最大値で１に正規化された吸光スペクトルである。

【図4】Ｃｙ５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３、およびＩＲ Ｄｙｅ６５０などの６２０～６５０ｎｍの光によって励起され得る蛍光剤を増強するのに適したＡｕＮＲ＠Ａｇプラズモン粒子の例示的な実施形態について、その最大値で１に正規化された吸光スペクトルである。

【図5】Ｃｙ５．５、ＩＲ Ｄｙｅ６８０ＬＴ、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０などの６５０～６８０ｎｍの光によって励起され得る蛍光剤を増強するのに適したＡｕＮＲ＠Ａｇプラズモン粒子の例示的な実施形態について、その最大値で１に正規化された吸光スペクトルである。

【図6】Ｃｙ７．５、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０などの７５０～７９０ｎｍの光によって励起され得る蛍光剤を増強するのに適したＡｕＮＲ＠Ａｇプラズモン粒子の例示的な実施形態について、その最大値で１に正規化された吸光スペクトルである。

【図7】長いストークスシフトを示すプラズモン蛍光体の例示的な実施形態である。２つの例がここに示されており、一方は単一のＦＲＥＴペア（ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア）を含み、もう一方は中間フルオロフォア（ドナー２／アクセプター１）が最初のドナーフルオロフォア（ドナー１）と最後のアクセプターフルオロフォア（アクセプター２）との間の架橋として機能するＦＲＥＴトリプルを含む。いずれの場合も、得られたプラズモン蛍光体は、最短波長ドナーフルオロフォア（λＥＸ＿Ｄ）を励起し、最長波長アクセプターフルオロフォア（λＥＭ＿Ａ）の最大発光波長で最大発光する波長で励起することができる。

【図8】４７０ｎｍの光によって励起された長いストークスシフトのプラズモン蛍光体の２つの例示的な実施形態の発光スペクトルのプロットであり、一方のプラズモン蛍光体はＦＲＥＴペアＦＩＴＣ－Ｃｙ３でコーティングされ、他方のプラズモン蛍光体はＦＲＥＴトリプルＦＩＴＣ－Ｃｙ３－Ｃｙ５でコーティングされている。両方の場合において、最長波長アクセプター分子（ＦＩＴＣ－Ｃｙ３ペアにおけるＣｙ３およびＦＩＴＣ－Ｃｙ３－Ｃｙ５トリプルにおけるＣｙ５）から有意な蛍光が見られ、ドナー分子の蛍光は抑制され、効率的なＦＲＥＴを示している。

【図9】ＡｕＮＲ＠Ａｇプラズモンコア粒子を使用してプラズモン蛍光体を構築する例示的な実施形態である。ＡｕＮＲ＠Ａｇプラズモンコア粒子はスペーサ層でコーティングされ、その後、スペーサ層に蛍光色素分子がコンジュゲートされる。次いで、この色素－スペーサ層を、機能層（この実施例では、ビオチン化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および遊離ＢＳＡの組み合わせ）でコーティングする。任意選択で、このビオチン化プラズモン蛍光体は、ストレプトアビジンを結合することによってさらに修飾され得、次いで、任意選択で、ビオチン化抗体で修飾され得る。

【図10】ＡｕＮＲ＠Ａｇプラズモンコア粒子を使用してプラズモン蛍光体を構築する例示的な実施形態であり、ＡｕＮＲ＠Ａｇプラズモンコア粒子はスペーサ層でコーティングされ、その後、スペーサ層に蛍光色素分子がコンジュゲートされる。次いで、この色素－スペーサ層を、機能層、この例ではトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）ＢＳＡおよび遊離ＢＳＡの組み合わせでコーティングする。任意選択で、このＴＣＯコンジュゲートされたプラズモン蛍光体をテトラジン（ＴＺ）結合抗体とさらに反応させることができる。ＴＣＯおよびＴＺは、「クリック」化学ペアの単なる一例であるが、任意のクリックペアが機能する。

【図11】ｐＭＨＣ修飾プラズモン蛍光体およびそれを作製する方法の例示的な実施形態である。ストレプトアビジンコンジュゲートされたプラズモン蛍光体を使用して、過剰のビオチン化ｐＭＨＣを含有する溶液にストレプトアビジンコンジュゲートされたプラズモン蛍光体を添加することによって、ｐＭＨＣ修飾プラズモン蛍光体を作製することができる。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本開示は、以下に記載される図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによって理解され得る。説明を明確にするために、種々の図面における特定の要素は、一定の縮尺で描かれていない場合があることに留意されたい。デバイスのいくつかの変形例が、本明細書に提示される。異なる変形例の種々の構成要素、部品、および特徴は、一緒に組み合わせられてもよく、かつ／または互いに交換されてもよく、すべての変形例および特定の変形例が図面に示されていなくても、それらのすべてが本出願の範囲内であることを理解されたい。種々の変形例間の特徴、要素、および／または機能の混合および整合は、本明細書で明示的に企図され、したがって、当業者は、本開示から、別段の記載がない限り、１つの変形例の特徴、要素、および／または機能が別の変形例に適宜組み込まれ得ることを諒解することも理解されたい。

【0018】

ここで、本開示全体を通して適用されるいくつかの定義を提示する。本明細書で使用される場合、「約」は、明示的に示されているか否かにかかわらず、整数、分数、パーセントなどを含む数値を指す。「約」という用語は、概して、例えば、同じ機能または結果を有する、列挙された値と同等であると考えられる、列挙された値の±０．５～１％、±１～５％または±５～１０％などの数値の範囲を指す。

【0019】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含むが、必ずしもそれに限定されない」ことを意味し、具体的には、そのように記載された組み合わせ、群、シリーズなどにおけるオープンエンドの包含またはメンバーシップを示す。本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、包括的かつ／またはオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素または方法プロセスを除外しない。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」よりも限定的であるが、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」ほど限定的ではない。具体的には、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、指定された材料またはステップ、および特許請求される発明の本質的な特徴に実質的に影響を及ぼさないものへの帰属関係を限定する。

【0020】

本明細書で使用される場合、「プラズモン蛍光体」または「蛍光ナノ構築物」という用語は、少なくとも、そのコアにおけるプラズモンナノ構造体と、プラズモンナノ構造体をコーティングするスペーサ層と、その表面にコンジュゲートされた少なくとも１つの蛍光剤とを有するコンポジット構造体を意味する。一部の変形例では、「プラズモン蛍光体」または「蛍光ナノ構築物」は、スキャフォルド層および／または生体認識要素（例えば、ＭＨＣ、ｐＭＨＣ、ストレプトアビジンなど）をさらに含み得る。

【0021】

本明細書で使用される場合、「蛍光剤」という用語は、励起時に蛍光発光を生成することができる色素、蛍光プローブ、またはフルオロフォアを意味する。

【0022】

本明細書で提供されるのは、新規な銀含有プラズモンナノ構造体に基づく超高輝度蛍光ナノ構築物、プラズモン蛍光体（ＰＦ）である。さらに、本明細書に開示されるのは、大きなストークスシフト、フルオロフォアの励起スペクトルの最大位置と発光スペクトルの最大位置との間の差を示す新規なプラズモン蛍光体である。プラズモン蛍光体は、１つ以上の生体認識要素にコンジュゲートされ、既存の生物学的アッセイを増強するために使用され得る。さらに、これらのプラズモン蛍光体は、その優れた輝度により、新規な生物学的アッセイを可能にし得る。本明細書に開示されるプラズモン蛍光体技術は、それらが典型的な有機フルオロフォアよりも非常に明るい（すなわち、それらは所与の期間に多くの光子を放出する）ので、機器の要件を緩和することができる。

【0023】

プラズモン蛍光体は、励起と発光との間の有意な分離を可能にする長いストークスシフトを示し、超高輝度である。これにより、より長波長の検出を伴う広帯域励起源（例えば、ＬＥＤ）を使用することで、より単純でより安価な蛍光検出システムが可能となり得る。さらに、同じ励起源で多くの異なるフルオロフォアを励起し、異なるバンドパスフィルタまたはさらにはモノクロメータを使用して、それぞれを特異的に検出することが可能であり得る。これは、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学／免疫細胞化学などの高度に多重化された蛍光アッセイにおいて特に重要であり、ここで、一部のフルオロフォアは、細胞集団を特異的に同定するために使用され、他のフルオロフォアは、これらの集団内で発現されるタンパク質についての情報を提供するために使用される。

【0024】

プラズモン蛍光体は表面積が比較的大きいため、多くの生体認識要素を機能化することができる。生体認識要素としては、ＭＨＣ、ｐＭＨＣ、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはアビジンが挙げられるが、これらに限定されない。これは、単離された生体認識要素よりも見かけ上の親和性（またはアビディティ）が高い構造をもたらす。これは、抗原特異的Ｔ細胞の同定のための主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）アッセイなどにおいて、標的に対して親和性は低いが複数の標的が存在する複合体を標的としたい場合に特に重要である。ペプチド負荷ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）分子で官能化されたプラズモン蛍光体は、Ｔ細胞受容体の認識に利用可能な最も感度の高い試薬を表す。これは、それらの驚異的な明るさだけでなく、大量のｐＭＨＣが高密度で負荷される能力によるものである。

【0025】

本開示は、超高輝度蛍光ナノコンポジットまたはプラズモン蛍光体に関する。蛍光ナノコンポジットは、少なくとも１つの局在表面プラズモン共鳴波長（λＬＳＰＲ）を有するプラズモンナノ構造体、少なくとも１つのスペーサコーティング、最大励起波長（λＥＸ）を有する少なくとも１つの蛍光剤、および少なくとも１つのペプチド負荷主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（ｐＭＨＣ）を含み得る。蛍光ナノコンポジット構造体は、少なくとも１つの蛍光剤単独の蛍光強度よりも少なくとも５００倍大きい蛍光強度を有する。

【0026】

一部の例では、プラズモンナノ構造体は、超高輝度蛍光ナノ構築物におけるコア粒子として使用される銀コーティングされた金ナノロッドナノ構造体（ＡｕＮＲ＠Ａｇ）である。典型的には、金は、６００ｎｍを上回る主要ＬＳＰＲピークを有するナノ構造体（例えば、金ナノロッド（ＡｕＮＲ））のために選択される金属であり、６００ｎｍ未満の主要ＬＳＰＲピークについては、銀が好ましいと考えられる。プラズモン増強蛍光ナノ粒子を作成する目的では、銀は、金よりも強いプラズモンを有し、複数のプラズモンモードをサポートできるため、一般に金よりも好ましい場合がある。本明細書では、約３９０ｎｍ～約８００ｎｍの調整可能なＬＳＰＲピークを有するプラズモンコア粒子（ＡｕＮＲ＠Ａｇ）を示しており、表面上の金属として銀を有し、中心に金ナノロッドを有する。銀は、金よりも強いプラズモンを有しており、このようにプラズモン蛍光体に組み込むことで、結果として高い蛍光を得ることができる。ＡｕＮＲ上の銀コーティングは、元のＡｕＮＲの主要ＬＳＰＲピークに対して、得られた主要ＬＳＰＲピークを青色にシフトさせる。概して、得られるＡｕＮＲ＠Ａｇの標的主要ＬＳＰＲピークよりも１００ｎｍ～４００ｎｍ長い主要ＬＳＰＲ波長を有するＡｕＮＲが選択される。ＡｕＮＲ＠Ａｇナノ構造体は、銀によって複数のプラズモンモードを有するので、本明細書では、これらの非支配的なプラズモンモードであっても、コンジュゲートされたフルオロフォアの蛍光を増強するために使用され得ることが実証される。

【0027】

図１に示すように、ＡｕＮＲ＠Ａｇコア粒子は、より高いＬＳＰＲ波長を有する金ナノロッドを銀でコーティングすることによって、４６０ｎｍ～８００ｎｍに主要ＬＳＰＲピークを有する金ナノロッド（ＡｕＮＲ）から作製することができる。例えば、７５０～８００ｎｍに主要ＬＳＰＲピークを有するＡｕＮＲ＠Ａｇを作製するために、１０５０～１２００ｎｍのＬＳＰＲを有するＡｕＮＲから開始することになる。別の例は、８５０～９５０ｎｍのＬＳＰＲを有するＡｕＮＲを使用して、５１０ｎｍ～６８０ｎｍに主要ＬＳＰＲピークを有するＡｕＮＲ＠Ａｇを作製することである。別の例は、６４０ｎｍ～７００ｎｍの主要ＬＳＰＲピークを有するＡｕＮＲを使用して、４６０ｎｍ～５１０ｎｍに主要ＬＳＰＲピークを有するＡｕＮＲ＠Ａｇを作製することである。主要ＬＳＰＲピークに加えて、３９５ｎｍという低い波長に現れる有意なマイナーなＬＳＰＲピークが存在する。

【0028】

一実施形態では、少なくとも１つのλＬＳＰＲとλＥＸとの間の差は、７５ｎｍ未満である。少なくとも１つの例では、ＡｕＮＲ＠Ａｇの主要ＬＳＰＲピークは、増強されるフルオロフォアの励起極大値から５０ｎｍ以内である。同定された支配的なピークを有する吸光スペクトルの例および得られたプラズモン蛍光体を作製するために使用されるフルオロフォアの例を図２～６に示す。別の実施形態では、ＡｕＮＲ＠Ａｇの有意なＬＳＰＲピークは、増強されるフルオロフォアの励起極大値から５０ｎｍ以内である。例えば、図２～５に示されるスペクトルに対応するＡｕＮＲ＠Ａｇナノ構造体は、３９０ｎｍ～４１０ｎｍの範囲におけるこれらの構造の非支配的ＬＳＰＲピークを利用して、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅなどの４０５ｎｍレーザで励起される色素を増強するために使用することができる。

【0029】

ＵＶ－ＶＩＳスペクトルが図２～６に示されているＡｕＮＲ＠Ａｇナノ構造体の合成は、銀オーバーグロースステップにおいて硝酸銀と金ナノロッドとの比を調整することによって達成される。図６に示されるような７５０～８００ｎｍの間の支配的な（主要な）ピークを有するＡｕＮＲ＠Ａｇを合成するための例示的な手順として、１０５０ｎｍのＬＳＰＲを有するＡｕＮＲに対して０．２２８の吸光度を有する１０ｍＭ塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）中の３８０ｍＬのＡｕＮＲ溶液から開始して、１５．２ｍＬの１０ｍＭ硝酸銀を添加する。この混合物を６０℃に加熱し、３．８ｍＬの１００ｍＭアスコルビン酸を添加し、急速に混合し、６０℃で少なくとも６時間インキュベートする。異なるＬＳＰＲピークを伴うＡｕＮＲ＠Ａｇを作製するには、得られるＡｕＮＲ＠Ａｇの標的主要ＬＳＰＲピークよりも１００ｎｍ～４００ｎｍ長い主要ＬＳＰＲ波長を伴うＡｕＮＲから開始しながら、化学成分（金ナノロッド、ＣＴＡＣ、硝酸銀、およびアスコルビン酸）の比に変更を加えるだけで、上記の手順に従えばよい。図２～６は、銀オーバーグロース手順を使用して作製された約３９０ｎｍ～約８００ｎｍの範囲のＬＳＰＲピークを有するＡｕＮＲ＠Ａｇのスペクトルを示す。通常、表面に銀を含有するナノ粒子は、水溶液中で酸化されやすく、プラズモン特性を劣化させる可能性がある。蛍光ナノ構造体（プラズモン蛍光体）を作製するために使用されるＡｕＮＲ＠Ａｇは、１週間以内に後述するように調製し、スペーサ層でコーティングすることにより、ＡｕＮＲ＠Ａｇを酸化から保護することができる。これらの粒子は水溶液中で６ヶ月超保存され、顕著な酸化またはプラズモン特性の変化はなかった。

【0030】

プラズモン蛍光体においてコアプラズモン微粒子としてＡｕＮＲ＠Ａｇを使用することの利点は、その合成の容易さ、その強いプラズモン、および概して使用される蛍光色素の領域におけるそのＬＳＰＲ波長の調整可能性であるが、プラズモン蛍光体はまた、金ナノロッド、銀ナノキューブ、銀または金ナノスフェア、バイメタルナノ構造、金コア銀シェルナノキューボイド、金または銀ナノチューブ、金ナノロッド、銀ナノキューブ、銀ナノスフェア、鋭い先端を持つナノ構造、ナノスター、中空ナノ構造、ナノケージ、ナノラトル、ナノバイピラミッド、ナノプレート、ナノラズベリーを含むがこれらに限定されない、適切な波長においてプラズモン共鳴を支持することができる一部の他の構造を使用して作製することもできることに留意されたい。

【0031】

一実施形態では、ＡｕＮＲ＠Ａｇナノ構造体は、プラズモン蛍光体のための中心コアとして機能する。次いで、ＡｕＮＲ＠Ａｇナノ構造体は、少なくとも１つのスペーサコーティングまたはスペーサ層でコーティングすることができる。例えば、ＡｕＮＲ＠Ａｇナノ構造体は、図９および図１０に示すように、スペーサ層でコーティングされてもよい。このスペーサ層は、ＡｕＮＲ＠Ａｇ構造上にコーティングすることができ、精密に制御可能な厚さを有する任意の誘電体材料であってもよい。一部の実施形態では、スペーサコーティングは、約０．５ｎｍ～約２０ｎｍ、約１ｎｍ～約１０ｎｍ、または約２～約５ｎｍの厚さを有する。

【0032】

スペーサ層は、蛍光色素分子のコンジュゲーションを可能にする反応性基を有し、コーティング後、溶液中で安定なままであることが理想的である。例示的なスペーサ層は、銀表面に結合し、追加のシラン層の成長を可能にする（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）を使用する開始層と、トリメトキシ（プロピル）シラン（ＴＭＰＳ）および（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）の混合物を含有する成長層とからなる。ＴＭＰＳ対ＡＰＴＭＳの比を変更して、コーティングされたナノ構造体のゼータ電位および表面上の反応性基の密度を調整することができる。図６に示されるスペクトルに対応するＡｕＮＲ＠Ａｇ粒子を最適なスペーサ厚さでコーティングするために、例えば、最初に４００マイクロリットルのＭＰＴＭＳを１ｍＭ ＣＴＡＣ中のＡｕＮＲ＠Ａｇの４００ｍＬ溶液に添加する。ここで、ＡｕＮＲ＠Ａｇは約７６０ｎｍの主要ＬＳＰＲピークおよび６～１０の吸光度を有する。この混合物を穏やかに振盪しながら、２０℃で１時間インキュベートすることができる。１時間後、２ｍＬのＡＰＴＭＳおよび２ｍＬのＴＭＰＳを添加し、混合し、この溶液を穏やかに振盪しながら２０℃で４時間インキュベートする。次いで、これらのスペーサコーティングしたＡｕＮＲ＠Ａｇ粒子を遠心分離し、１ｍＭ ＣＴＡＣ中に再懸濁して、スペーサコーティング反応を停止させる。別の例として、図３に示されるスペクトルに対応するＡｕＮＲ＠Ａｇ粒子をコーティングするために、上記の正確な手順に従いつつ、約５１０ｎｍの主要ＬＳＰＲピークおよび４５～５０の吸光度を有するＡｕＮＲ＠Ａｇを使用する。シランをベースとしたスペーサ層を使用することは、反応物の化学量論的な調整だけで簡単に厚さを寸法制御できるのが魅力的である。

【0033】

スペーサコーティングＡｕＮＲ＠Ａｇナノ構造体は、図９および図１０の第２のステップに示されるように、少なくとも１つの蛍光剤に直接コンジュゲートすることができる。種々の例において、少なくとも１つの蛍光剤は、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、または少なくとも約５００の蛍光剤を含んでもよい。スペーサ成長層としてＴＭＰＳおよびＡＰＴＭＳを使用することで、一級アミン基が溶媒に露出され、このアミン基は、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、イソチオシアネート、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、またはペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）を含有するものなどのアミン反応性蛍光染料で容易に官能化される。プラズモン蛍光体の合成のために、概して、蛍光色素の励起極大値がプラズモンナノ構造体の有意なＬＳＰＲピークから約５０ｎｍ以内であるように、単一の種類の蛍光色素および適切なプラズモンナノ構造体コアを選択する。一例として、吸光度２０で０．５Ｘリン酸緩衝生理食塩水を含む１ｍＭ ＣＴＡＣに溶解した図６のスペクトルに対応する１ｍＬのスペーサコーティングＡｕＮＲ＠Ａｇナノ構造体を標識するために、５ｍｇ／ｍＬの濃度でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した４マイクロリットルのＮＨＳ－スルホ－シアニン７．５を添加し、室温で１２時間インキュベートする。別の例として、吸光度２０で０．５×リン酸緩衝生理食塩水を含む１ｍＭ ＣＴＡＣに溶解した図３のスペクトルに対応する１ｍＬのスペーサコーティングＡｕＮＲ＠Ａｇナノ構造体を標識するために、５ｍｇ／ｍＬの濃度でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した２マイクロリットルの色素ＮＨＳ－ＭＢ５４３を添加し、室温で１２時間インキュベートする。最適な標識条件は、各色素／ナノ構造体の組み合わせについて経験的に見出され得るが、色素濃度の関数としての粒子当たりの蛍光が最大化されるように選択されるべきである。

【0034】

複数の異なるタイプの色素分子をプラズモン蛍光体に組み込むことによって、大きなストークスシフトを有するスペクトル的に固有のプラズモン蛍光体を生成することができる。図７に示すように、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与し得る色素分子をプラズモン蛍光体に組み込むことによって、大きなストークスシフトを有するプラズモン蛍光体を作製することが可能である。具体的には、ＦＲＥＴペア、ＦＲＥＴトリプレット、ＦＲＥＴクアドルプレット、またはさらにＦＲＥＴクインテットを形成する蛍光色素／薬剤を組み込むことができる。好ましい実施形態において、適切なナノ構造体コアは、ＦＲＥＴ鎖における第１のドナー色素分子（すなわち、最も低い励起波長を有する色素分子）の励起極大値の近傍および励起のために使用される光源の近傍において、高いモル吸光度を有し、従って、局在化共鳴プラズモンモードを有する。

【0035】

一実施形態では、蛍光ナノコンポジット構造体は、少なくとも１つの局在表面プラズモン共鳴波長（λＬＳＰＲ）を有するプラズモンナノ構造体と、少なくとも１つのスペーサコーティングと、第１の最大励起波長（λＥＸ１）および第１の最大発光波長（λＥＭ１）を有する少なくとも１つの蛍光剤と、第２の最大励起波長（λＥＸ２）および第２の最大発光波長（λＥＭ２）を有する少なくとも１つの蛍光剤とを含み得る。蛍光ナノコンポジット構造体は、λＥＸ１の光で励起され、λＥＭ２の光を放出することができ、そのためλＥＭ２の発光強度は、λＥＭ１の発光強度よりも大きい。したがって、λＥＸ１を有する少なくとも１種の蛍光剤は、ＦＲＥＴアクセプターとして機能するλＥＸ２を有する少なくとも１種の蛍光剤に対するＦＲＥＴドナーである。一部の例では、少なくとも１つのλＬＳＰＲとλＥＸ１との間の差は、１００ｎｍ未満、７５ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、２５ｎｍ未満、または１５ｎｍ未満である。

【0036】

一部の実施形態では、蛍光ナノコンポジットは、ＦＲＥＴトリプル、クアドラプル、またはクインタプルをさらに収容することができる。例えば、ＦＲＥＴトリプルの場合、蛍光ナノコンポジットは、第３の最大励起波長（λＥＸ３）および第３の最大発光波長（λＥＭ３）を有する少なくとも１つの蛍光剤をさらに含んでもよい。蛍光ナノコンポジット構造体は、λＥＸ１の光で励起され、λＥＭ３の光を放出することができ、そのためλＥＭ３の発光強度は、λＥＭ１またはλＥＭ２の発光強度よりも大きい。

【0037】

図７に示すように、ＦＲＥＴ色素は、厚さが１ｎｍ～１０ｎｍ、好ましくは２～５ｎｍの同じスペーサ層にコンジュゲートさせることができる。あるいは、図７に示されるように、ＦＲＥＴ色素は、異なるスペーサ層にコンジュゲートされ得、ここで、最も短い波長のドナー色素は、第１のスペーサ層にコンジュゲートされ、アクセプター色素は、第１のスペーサ層を覆い、１ｎｍ～３ｎｍの厚さを有する第２のスペーサ層にコンジュゲートされる。このレイヤーバイレイヤー方式は、ＦＲＥＴトリプル、クアドラプル、クインタプルに対応するように拡張することができる。さらに、混合スキームをレイヤーバイレイヤー方式と組み合わせることができる。例えば、第１の層をドナー色素のみでコーティングし、第２の層を、ドナー色素に対するＦＲＥＴアクセプターとして機能する別の色素対と、より長い波長のアクセプター色素に対するドナーとの混合物でコーティングしてもよい。

【0038】

一例として、図３に示されるスペクトルに対応するスペーサコーティングＡｕＮＲ＠Ａｇナノ構造体は、ＦＲＥＴペアＦＩＴＣおよびＣｙ３を用いて１：１の化学量論比でコーティングされる。図８に、４７０ｎｍで励起された際のこのプラズモン蛍光体の得られた発光スペクトルを示している。４７０ｎｍで励起された場合、このプラズモン蛍光体は、５２０ｎｍ付近のＦＩＴＣの発光極大値における抑制された発光、および５７０ｎｍ付近のＣｙ３の発光極大値付近における強い発光を示しており、これらは両方とも効率的なＦＲＥＴの指標である。ドナー分子として機能するＦＩＴＣの非存在下では、Ｃｙ３のみを含有する同じプラズモン蛍光体は、４７０ｎｍの光によって最小限に励起される。さらなる例として、図３に示されるスペクトルに対応するスペーサコーティングＡｕＮＲ＠Ａｇナノ構造体は、ＦＲＥＴトリプレットＦＩＴＣ、Ｃｙ３、およびＣｙ５を用いて１：１：１の化学量論比でコーティングされる。図８はまた、４７０ｎｍで励起された際のこのプラズモン蛍光体の得られた発光スペクトルを示している。この実施形態では、ＦＩＴＣおよびＣｙ３蛍光の両方が抑制され、Ｃｙ５蛍光が増強される。ＦＩＴＣの非存在下では、Ｃｙ３－Ｃｙ５粒子の蛍光は、４７０ｎｍで励起した場合に最小となる。Ｃｙ３の非存在下では、ＦＩＴＣ蛍光は最小限に抑制され、Ｃｙ５の蛍光は、ＦＩＴＣがドナーとして機能するＦＲＥＴ効率が低いため、最小限に抑えられ得る。最適な標識化学量論は、ドナー色素蛍光を最小にしながら、最終的なアクセプター（すなわち、最も長い発光波長を有する色素）の蛍光を最大にするように選択される。適切なナノ構造体（すなわち、最短波長ドナーの励起極大値（λＥＸ＿Ｄ）および励起源の近傍に有意なＬＳＰＲモードを有するもの）を適合させ、共鳴エネルギー移動を容易にするために適切なＦＲＥＴ色素鎖を選択し、ドナー色素の蛍光を抑制しながら、標識化学量論を最適化してＦＲＥＴ色素鎖中の最長波長アクセプター色素の最大発光波長（λＥＭ＿Ａ）でプラズモン蛍光体の蛍光を最大化することによって、スペクトル的に固有の長いストークスシフトのプラズモン蛍光体を複数作り出すことができる。以下の表１は、列１に与えられる励起および発光波長を有する固有のプラズモン蛍光体を作成するために使用され得る色素鎖の組み合わせの例を提供する。これらは非限定的な例であり、スペクトル的に類似した色素（すなわち、以下に列挙される色素の１５ｎｍ以内に励起極大値および発光極大値を有する）が、同じ効果を達成するために置換され得ることが、当業者によって認識されるはずである。例えば、Ａｌｅｘａ４８８は、標識化学量論が最適化される場合、有意差なしにＦＩＴＣまたはＣｙ２で置換することができる。別の例として、Ａｌｅｘａ５４６は、ＭＢ５４３、テトラメチルローダミン、またはＣｙ３で置換することができる。別の例として、Ａｌｅｘａ６３３をＣｙ５またはＩＲＤｙｅ ６５０で置換することができる。

【0039】

【表1-1】

【0040】

【表1-2】

【0041】

一部の実施形態では、プラズモン蛍光体は、スキャフォルド層をさらに含み得る。一例では、蛍光染料でコーティングした後、プラズモン蛍光体の調製における次のステップは、スキャフォルド層を追加することであってもよい。スキャフォルド層は、適切なブロッキング試薬を使用した場合、イムノアッセイにおける非特異的吸着を防止すること、蛍光色素標識プラズモン蛍光体を安定化させること、およびビオチン、ストレプトアビジン、核酸、または抗体などの生体認識に使用される標的化要素を容易にコンジュゲートすることができるベースとして役立つことなど、いくつかの目的を果たす。これらの標的化要素をスペーサ層に直接付着させることが可能であるので、スキャフォルド層は絶対的に必須ではないが、スキャフォルド層は、さらなる標識汎用性を提供し、プラズモン蛍光体の安定化を改善する。スキャフォルド層としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して、抗体コーティングされたプラズモン蛍光体を作製するためのプロセスの一例を図９に示す。このプロセスでは、蛍光色素標識されたプラズモン蛍光体を、溶液中のビオチン化ＢＳＡおよび天然ＢＳＡの混合物とともに、約３０分間超音波処理しながらインキュベートする。標識密度は、天然ＢＳＡに対するビオチン化ＢＳＡの比を１００％ビオチン化ＢＳＡから１％ビオチン化ＢＳＡに変えることによって容易に調整することができる。さらに、ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチンなどのアミン反応性ビオチン化試薬を使用して、ビオチン化ＢＳＡの標識度を１～１０ビオチンに変更することができる。天然ＢＳＡに対するビオチン化ＢＳＡの両方の標識比の調整と、ビオチン化の程度の調整との組み合わせにより、プラズモン蛍光体の表面上のビオチンの密度および分布を自在に制御することができる。グルタルアルデヒドまたは別の適切な架橋剤を用いて安定性を増加させて、ＢＳＡスキャフォルド層をさらに架橋することができる。

【0042】

一実施形態では、プラズモン蛍光体は、スペーサコーティングおよび／またはスキャフォルド層上に、少なくとも１つのビオチン結合分子をさらに含み得る。例えば、少なくとも１つのビオチン結合分子は、少なくとも約２、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、または少なくとも約５０個のビオチン結合分子を含む。ビオチン結合分子の非限定的な例としては、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、およびアビジンが挙げられる。例えば、ＢＳＡ／ビオチン化ＢＳＡスキャフォルド層でコーティングした後、プラズモン蛍光体は、ストレプトアビジンに対して機能的に反応性であってもよく、生物学的アッセイにおいてストレプトアビジンを特異的に検出するために使用することができる。また、ストレプトアビジンでコーティングされて、ストレプトアビジン官能化プラズモン蛍光体を生成し、これを使用して、生物学的アッセイにおいてビオチン化試薬を特異的に検出することができる。これらのストレプトアビジンでコーティングされたプラズモン蛍光体は、図９に示すように、別のビオチン化試薬、例えば抗体でさらに修飾することができる。別の例として、ビオチン化ＢＳＡは、「クリック」化学反応性部分、例えば、ＮＨＳ－ＴＣＯ試薬を介してＢＳＡに結合したトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）またはＮＨＳ－テトラジンを介してＢＳＡに結合したテトラジン（Ｔｚ）で官能化されたＢＳＡで置き換えることができ、スキャフォルド層は、図１０に示すように、ＢＳＡ：ＢＳＡ－ＴＣＯまたはＢＳＡ－Ｔｚの混合物を使用して形成することができる。当業者は、銅触媒クリック反応におけるアジド－アルキン対を含むがこれに限定されない任意のクリック反応対を、ＴＣＯ／ＴＺの代わりに使用できることを認識するであろう。さらに、図１０に示すように、クリック官能化プラズモン蛍光体を、相補的クリック部分で標識された標的化要素とともにインキュベートすることによって、標的化要素（例えば、ストレプトアビジン、抗体、核酸など）をクリック官能化プラズモン蛍光体にコンジュゲートすることが可能である。

【0043】

一実施形態では、プラズモン蛍光体は、その外表面上に少なくとも１つのペプチド負荷ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）分子をさらに含み得る。種々の例において、ｐＭＨＣ分子は、ビオチン化されてもよく、ビオチン化ｐＭＨＣは、スペーサコーティングおよび／またはスキャフォルド層上のビオチン結合分子に付着されてもよい。少なくとも１つのビオチン化ｐＭＨＣ分子は、少なくとも約２個、少なくとも約４個、少なくとも約８個、少なくとも約１２個、少なくとも約１６個、少なくとも約２０個、少なくとも約２４個、少なくとも約２８個、少なくとも約３２個、少なくとも約３６個、少なくとも約４０個、または少なくとも約４８個のｐＭＨＣ分子を含み得る。ｐＭＨＣとコンジュゲートしたプラズモン蛍光体は、ｐＭＨＣに負荷されたペプチドを特異的に認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含有する抗原特異的Ｔ細胞の同定に使用されるＭＨＣテトラマーアッセイまたはテトラマー染色に非常に魅力的なプラットフォームを表す。いわゆるＭＨＣ－テトラマーアッセイ（テトラマー染色としても知られる）において抗原特異的Ｔ細胞を同定するために使用される標準試薬は、４つのビオチン化ｐＭＨＣ分子に結合した蛍光標識ストレプトアビジンである。単一のｐＭＨＣ－受容体複合体は、比較的弱い親和性を有するので、４つのｐＭＨＣ分子をストレプトアビジンを介して連結して単一の複合体中に組み合わせることによって、アビディティ、従って見かけの親和性が増加する。この概念は、これらのＭＨＣ四量体分子を複数連結して、例えばｐＭＨＣ十二量体を作製することによってさらに拡張されている。別の代替法は、ｐＭＨＣを蛍光標識されたデキストランに付着させて、いわゆるデキストラマーを作製することである。多くの、好ましくは８～４０個以上のＭＨＣ分子で修飾されたプラズモン蛍光体を作製するための方法および組成物が本明細書に開示される。

【0044】

得られる組成物は、既存の材料に対して、以下のいくつかの利点を有する。１）プラズモン蛍光体自体は、ＰＥを含む従来のフルオロフォアよりも少なくとも５０倍明るく、より高いシグナルをもたらす。２）複数のｐＭＨＣ分子（少なくとも１２個）の存在は、非常に高いアビディティ／見かけの親和性を有するｐＭＨＣ修飾プラズモン蛍光体を提供する。また、３）ｐＭＨＣ修飾プラズモン蛍光体の物理的サイズ（最長寸法＞５０ｎｍ）は、より広い面積にわたる細胞表面受容体の結合を可能にし、これは、より低密度の受容体を有するＴ細胞が検出され得ることを意味する。一部の実施形態では、プラズモン蛍光体は、蛍光剤単独の蛍光強度よりも少なくとも５０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、少なくとも２００倍大きい、少なくとも３００倍大きい、少なくとも４００倍大きい、または少なくとも５００倍大きい蛍光強度を有する。

【0045】

例示的な実施形態において、ストレプトアビジンでコーティングされたプラズモン蛍光体をモル過剰のビオチン化ｐＭＨＣ分子を含有する溶液に添加することで、ストレプトアビジンコンジュゲートされたプラズモン蛍光体をビオチン化ｐＭＨＣと組み合わせることにより、ｐＭＨＣ修飾プラズモン蛍光体を組み立てることができる。ここで、モル過剰は、図１１に示すように、ストレプトアビジンコンジュゲートされたプラズモン蛍光体を含有する溶液中のストレプトアビジンのモル濃度に対して決定される。ｐＭＨＣで装飾されたプラズモン蛍光体は、遠心分離によって遊離ｐＭＨＣから分離することができる。反応後、遠心分離前に過剰の遊離ビオチンを添加して、すべてのビオチン結合部位が占有されるようにし、それにより、起こり得る架橋および凝集を最小限に抑えることができる。この設計におけるプラズモン蛍光体の表面上のｐＭＨＣの密度は、プラズモン蛍光体の調製において使用されるＢＳＡに対するビオチン化ＢＳＡの比を単に変更することによって、またはＢＳＡのビオチン化の程度を変更することによって、またはその両方によって、容易に変更することができる。これは、最終的に、プラズモン蛍光体の表面上に存在するストレプトアビジンの数を変化させる効果を有する。この文脈におけるＢＳＡコーティングは、スキャフォルドとして機能し、多くの異なるタンパク質および類似の機能を果たし得る他のポリマーの代わりに使用され得ることを認識する必要がある。さらに、ビオチンは、（例えば、ビオチン－ＰＥＧ－シラン）を使用してシランスペーサ層に直接組み込まれ得るか、またはビオチン－ＰＥＧ－ｎｈｓエステルは、蛍光色素がコンジュゲートされる方法と同様に、曝露されたアミンを介して付加され得る。このシナリオにおいて、ストレプトアビジンは、これらのビオチンを介して直接コンジュゲートすることができ、スキャフォルドは不要となる。

【0046】

別の実施形態では、反応性クリック化学部分を含有するプラズモン蛍光体を、相補的クリック部分で標識されたｐＭＨＣ（例えば、ＴＣＯ－ＰＥＧ－ＮＨＳエステルで標識されたプラズモン蛍光体およびテトラジン－ＰＥＧ－ＮＨＳエステルで標識されたｐＭＨＣ）と組み合わせることによって、ｐＭＨＣ修飾プラズモン蛍光体を組み立てることができる。このシナリオにおいて、ＰＥＧは、コンジュゲーション効率を改善するためのスペーサとして作用するが、省略されてもよい。ＰＥＧは、２～２４モノマー単位長であり得る）。この「クリックされた」ｐＭＨＣの実施形態において、プラズモン蛍光体は、最初に、ＴＣＯ標識ＢＳＡおよび遊離ＢＳＡの混合物でコーティングされ、ここで、ＴＣＯ－ＢＳＡの割合は、１００％～約５％の範囲であり得、理想的には、８０％～約１０％である。次いで、このＴＣＯ－プラズモン蛍光体をモル過剰のテトラジン標識ｐＭＨＣ分子とともにインキュベートすることができる。プラズモン蛍光体の表面上のｐＭＨＣの密度は、単にＴＣＯ－ＢＳＡ対ＢＳＡの比を変えることによって変更することができる。別の実施形態では、ＭＨＣ分子は、Ｃ末端または溶媒露出ループに不対システインを有するように操作され、反応性クリック部分は、スルフヒドリル反応性試薬（例えば、マレイミド－ＰＥＧ－Ｔｚまたはマレイミド－ＰＥＧ－ＴＣＯ）を介してＭＨＣ分子に付加される。次いで、これを相補的官能化プラズモン蛍光体にコンジュゲートさせることができる。

【0047】

通常、ＭＨＣ分子は細菌培養物中で発現され、ＢＳＰまたはＡｖｉＴａｇなどのビオチン化タグを含む。ＭＨＣ分子の精製およびリフォールディングの後、このタグはＢｉｒＡなどのビオチンリガーゼで修飾され、ビオチンリガーゼはビオチン分子を部位特異的に付加する。プラズモン蛍光体のクリックバージョンを用いて、適切に修飾されたＭＨＣ分子を直接連結することが可能である。遺伝子コード拡張技術を用いて、非標準アミノ酸をタンパク質に部位特異的に導入することが可能である。このストラテジを使用して、例えばＣ末端領域のＭＨＣ分子中の少なくとも１つの天然アミノ酸を、クリック反応性部分を含有する非標準アミノ酸で置換することができる。Ｔｚ官能化プラズモン蛍光体と反応し得る例示的なアミノ酸は、ＴＣＯ^＊－Ｌ－リジン（ＴＣＯ^＊－Ｌｙｓ）であるが、プラズモン蛍光体が適切な相補的反応性単位で官能化される場合、アジド含有アミノ酸またはアルキン含有アミノ酸などのクリック官能基を有する任意のアミノ酸を使用することができる。クリック反応性アミノ酸をＭＨＣ分子に組み込むために、所望の修飾部位の天然コドンを、稀なコドン、例えばアンバー（ＴＡＧ）終止コドンで単純に置換し、宿主翻訳機構に直交する追加のｔＲＮＡ－ｔＲＮＡシンテターゼ対（ｔＲＮＡ－ＲＳ）とともにタンパク質を発現させる。ｔＲＮＡシンテターゼ酵素の活性部位は、レアコドンを認識するｔＲＮＡに組み込まれる特定のクリック官能化非標準アミノ酸のみを受容するように操作される。クリック官能化非標準アミノ酸は、単に増殖培地に添加され、それによって、特定の部位でＭＨＣタンパク質に組み込まれる。このアプローチの利点は、ＭＨＣへのビオチンリガーゼ認識配列の付加の排除、およびビオチンリガーゼを使用するライゲーション反応の排除である。この同じアプローチを、クリック官能化抗体および他の生物学的に発現された分子に適用して、その後、それらを相補的クリック官能化プラズモン蛍光体にコンジュゲートすることができる。

【0048】

特異的Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞を同定する方法が、本明細書においてさらに提供される。一実施形態では、本方法は、Ｔ細胞を含有する試料を提供することと、Ｔ細胞を含有する試料を蛍光ナノコンポジット構造体と接触させることと、Ｔ細胞を空間的に分離することと、蛍光発光を誘導する光の波長で蛍光ナノコンポジット構造体を励起することと、蛍光ナノコンポジット構造体で標識されたＴ細胞を検出することとを含み得る。一部の例において、Ｔ細胞は、フローサイトメトリーを使用して空間的に分離され得る。

【0049】

蛍光ナノコンポジット構造体は、ペプチドに特異的な受容体を含有するＴ細胞に特異的に結合することができるペプチド（ｐＭＨＣ）が負荷された少なくとも１つの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を含有し得る。一部の実施形態では、蛍光ナノコンポジット構造体は、少なくとも１つの局在表面プラズモン共鳴波長（λＬＳＰＲ）を有するプラズモンナノ構造体と、少なくとも１つのスペーサコーティングと、最大励起波長を有する少なくとも１つの蛍光剤とを含む。蛍光ナノコンポジット構造体は、少なくとも１つの蛍光剤単独の蛍光強度よりも少なくとも５００倍大きい蛍光強度を有する。

【実施例】

【0050】

実施例１：ストレプトアビジン官能化プラズモン蛍光体の調製
１ｍＬのＬＳＰＲ波長における吸光度２０の蛍光剤で標識されたプラズモン蛍光体を遠心分離してペレットを形成した。９９０μＬの上清を除去した。別のマイクロ遠心分離管において、２００μＬのビオチン化ＢＳＡ溶液（コーティングされるプラズモン蛍光体に対して少なくとも１００倍モル過剰）を適切な緩衝液（例えば、ｐＨ９の５０ｍＭ炭酸－重炭酸緩衝液）に添加した。プラズモン蛍光体ペレットの全体をビオチン化ＢＳＡの溶液に移し、水浴中で３０分間超音波処理した。これを音波水浴から取り出し、溶液を４℃で１５時間インキュベートした。ビオチン化ＢＳＡでコーティングされたプラズモン蛍光体の溶液を遠心分離してペレットを形成し、次いで１０μＬ以外のすべての上清を除去した。別のマイクロ遠心分離管において、２００μＬのストレプトアビジン溶液（コーティングされるプラズモン蛍光体に対して少なくとも５０倍モル過剰）を適切な緩衝液（例えば、ｐＨ９の５０ｍＭ炭酸－重炭酸緩衝液）に添加した。ペレットビオチン化ＢＳＡコーティングプラズモン蛍光体の全体をストレプトアビジン溶液に移し、２時間インキュベートした。この溶液を遠心分離してペレットを形成し、上清を除去した。それを適切な緩衝液（例えば、１％ＢＳＡを含むｐＨ９の５０ｍＭ炭酸－重炭酸緩衝液）溶液に再懸濁した。これをさらに２回繰り返して、未結合ストレプトアビジンを除去した。

【0051】

実施例２：ｐＭＨＣ官能化プラズモン蛍光体の構築
実施例１と同様のストレプトアビジン官能化プラズモン蛍光体（Ｓｔｒｅｐ－ＰＦ）を、そのＬＳＰＲ波長で２０の吸光度に調整し、１ｍＬを取り出し、マイクロ遠心分離管に入れた。この溶液を遠心分離してＳｔｒｅｐ－ＰＦをペレット化し、約９９０μＬの上清を除去した。別のマイクロ遠心分離管において、４００μＬの８μＭ（３６８μｇ／ｍＬペプチド－ＭＨＣ Ｉ複合体または２３２μｇ／ｍＬペプチド－ＭＨＣ ＩＩ）溶液を、適合性緩衝液、例えば、１Ｘ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４中に氷上で添加した。遠心分離したＳｔｒｅｐ－ＰＦペレットの全体をＭＨＣ－ペプチド複合体溶液に移し、これを１０秒間ボルテックスし、次いで４℃で２時間インキュベートした。この反応は、直接使用され得るか、または任意選択で、モル過剰のビオチンを添加することによってブロックされ得、次いで使用され得る。

【0052】

実施例３：プラズモン蛍光体がｐＭＨＣで官能化されていることを確認するプレートベースのアッセイ
プラズモン蛍光体がｐＭＨＣとコンジュゲートしていることを確認するための簡単な方法は、ＭＨＣ部分に対するイムノアッセイを行うことであった。これは、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬ濃度のＭＨＣ部分に特異的な抗体（抗β２－ミクログロブリンまたは抗ＭＨＣクラス特異的抗体のいずれか）でマイクロタイタープレートをコーティングすることによって行われた。次いで、プレートを適切なブロッキング剤（例えば、１Ｘ ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）でブロッキングし、適切な洗浄剤（例えば、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１Ｘ ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、ｐＭＨＣにコンジュゲートされたプラズモン蛍光体を含有する特定量の溶液をプレート中で１０分間インキュベートし、除去し、プレートを適切な洗浄剤で洗浄した。次いで、プレート表面上のプラズモン蛍光体蛍光を、適切なリーダーを使用して検出し、ＭＨＣ部分に特異的な抗体でコーティングされていないマイクロタイタープレートの対照ウェルと比較した。ペプチドが結合していない場合、ＭＨＣ複合体は迅速に解離するので、この手順は、ｐＭＨＣ複合体が機能的に活性であることが確認された。

【0053】

実施例４：特異的ペプチドを認識することができるＴ細胞集団の同定
目的の細胞（例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞）を調製し、２×１０^６個の細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルのマイクロ遠心分離管に添加した。適切な細胞染色緩衝液（例えば、５％ウシ胎児血清を含む１Ｘ ＰＢＳ）で２００μＬに調整した。２μＬのｐＭＨＣ官能化プラズモン蛍光体溶液を、ｐＭＨＣが目的のペプチドを含有する実施例２と同様に添加し、暗所で氷上で３０分間インキュベートした。細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、２００μＬの染色緩衝液に再懸濁した。細胞を、使用したプラズモン蛍光体の特異的蛍光シグナルを検出するための適切な設定を有するフローサイトメーターを使用して分析した。ｐＭＨＣ官能化プラズモン蛍光体の濃度の滴定は、最適な性能のために必要であり得る。

【0054】

いくつかの実施形態を説明してきたが、当業者であれば、本発明の趣旨から逸脱することなく、種々の修正形態、代替構成、および均等物を使用することができることを認識するであろう。さらに、本発明を不必要に不明瞭にすることを避けるために、一部の周知のプロセスおよび要素は説明されていない。したがって、上記の説明は、例示として解釈されるべきであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。以下の特許請求の範囲は、本明細書に記載のすべての一般的および特定の特徴、ならびに言語の問題としてそれらの間にあると言われる可能性がある本発明の方法および組成物の範囲のすべての陳述を網羅することを意図している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【国際調査報告】