▶ エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-10
(54)【発明の名称】制御性Ｔ細胞を活性化する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20230428BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230428BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230428BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230428BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230428BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230428BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20230428BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20230428BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20230428BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230428BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230428BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20230428BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230428BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230428BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20230428BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230428BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230428BHJP
A61P 27/12 20060101ALI20230428BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230428BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230428BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230428BHJP
A61P 17/14 20060101ALI20230428BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230428BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20230428BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20230428BHJP
A61P 23/02 20060101ALI20230428BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230428BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230428BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230428BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20230428BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20230428BHJP
C07K 14/55 20060101ALN20230428BHJP
C07K 16/36 20060101ALN20230428BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20230428BHJP
C12N 15/26 20060101ALN20230428BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230428BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230428BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
A61K35/17
A61P43/00
A61P29/00
A61P25/28
A61P9/00
A61P43/00 105
A61P1/18
A61P27/06
A61P9/12
A61P11/00
A61P1/04
A61P19/00
A61P27/02
A61P19/02
A61P19/08
A61P3/10
A61P9/10
A61P27/12
A61P13/12
A61P1/16
A61P17/02
A61P17/14
A61P25/16
A61P19/10
A61P25/14
A61P23/02
A61P31/00
A61P17/06
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 Y
C07K16/28
C07K19/00
C07K14/55
C07K16/36
C12N15/62 Z
C12N15/26
C12N15/13
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022548639
(86)(22)【出願日】2021-02-11
(85)【翻訳文提出日】2022-09-30
(86)【国際出願番号】 US2021017620
(87)【国際公開番号】W WO2021163298
(87)【国際公開日】2021-08-19
(31)【優先権主張番号】62/975,141
(32)【優先日】2020-02-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/981,944
(32)【優先日】2020-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521087117
【氏名又は名称】エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】ウォン ヒン シー．
(72)【発明者】
【氏名】シュレスタ ニラジ
(72)【発明者】
【氏名】ジョージ バーギーズ
(72)【発明者】
【氏名】ディー マイケル
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065BB19
4B065CA44
4B065CA46
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB36
4C085CC22
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB64
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZA15
4C087ZA16
4C087ZA18
4C087ZA33
4C087ZA36
4C087ZA37
4C087ZA42
4C087ZA45
4C087ZA55
4C087ZA59
4C087ZA66
4C087ZA68
4C087ZA75
4C087ZA81
4C087ZA89
4C087ZA92
4C087ZA96
4C087ZA97
4C087ZB11
4C087ZB32
4C087ZC02
4C087ZC35
4C087ZC52
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA04
4H045DA65
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法、当該方法によって生成されたＴｒｅｇ細胞の集団を含む組成物、および当該組成物を使用して対象を治療する方法が本明細書に提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Ｔｒｅｇ細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、前記液体培養培地が、
ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤と、
第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、前記第１の標的結合ドメインおよび前記第２の標的結合ドメインがＩＬ－２受容体に結合する、単鎖キメラポリペプチドと
を含む、方法。
【請求項2】
前記液体培養培地が、前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＩｇＧ１抗体構築物が、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記重鎖可変ドメインが配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記重鎖可変ドメインが配列番号７２を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号７３を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記第１の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとが互いに直接隣接している、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記単鎖キメラポリペプチドが、前記第１の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記可溶性組織因子ドメインと前記第２の標的結合ドメインとが互いに直接隣接している、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記単鎖キメラポリペプチドが、前記可溶性組織因子ドメインと前記第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記第１の標的結合ドメインおよび前記第２の標的結合ドメインが同じアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記第１の標的結合ドメインおよび前記第２の標的結合ドメインが可溶性ＩＬ－２を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記可溶性ＩＬ－２がヒト可溶性ＩＬ－２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記第１の標的結合ドメインおよび前記第２の標的結合ドメインが各々、配列番号１と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記第１の標的結合ドメインおよび前記第２の標的結合ドメインが各々、配列番号１と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記第１の標的結合ドメインおよび前記第２の標的結合ドメインが各々、配列番号１の配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記可溶性組織因子ドメインが可溶性ヒト組織因子ドメインである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２の配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記可溶性組織因子ドメインが、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記可溶性組織因子ドメインが、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちのいずれも含まない、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記可溶性組織因子ドメインが、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちの１つ以上を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記可溶性組織因子ドメインが血液凝固を開始しない、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記単鎖キメラポリペプチドが血液凝固を開始しない、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号３と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項26】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号３の配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号４と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号４と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号４の配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記液体培養培地が約１０ｎＭ～約５００ｎＭの前記単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記液体培養培地が約５０ｎＭ～約１５０ｎＭの前記単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤が抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズである、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記液体培養培地が前記抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを約１：１～約６：１のビーズ／細胞比で含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記液体培養培地が前記抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを約３：１～約５：１のビーズ／細胞比で含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤が、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む追加の単鎖キメラポリペプチドであり、前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記液体培養培地が、前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記ＩｇＧ１抗体構築物が、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記重鎖可変ドメインが配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記重鎖可変ドメインが配列番号７２を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号７３を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとが互いに直接隣接している、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドが、前記第１の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインと前記第２の標的結合ドメインとが互いに直接隣接している、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドが、前記可溶性組織因子ドメインと前記第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記ＣＤ３がヒトＣＤ３である、請求項３６～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインが配列番号５と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインが配列番号５と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインが配列番号５の配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記ＣＤ２８がヒトＣＤ２８である、請求項３６～４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインが配列番号６と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインが配列番号６と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインが配列番号６の配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが可溶性ヒト組織因子ドメインである、請求項３６～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２の配列を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる、請求項３６～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
前記可溶性組織因子ドメインが、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちのいずれも含まない、請求項３６～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記可溶性組織因子ドメインが、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちの１つ以上を含む、請求項３６～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが血液凝固を開始しない、請求項３６～５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドが血液凝固を開始しない、請求項３６～６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドが配列番号７と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項63】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドが配列番号７と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドが配列番号７の配列を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドが配列番号８と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドが配列番号８と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドが配列番号８の配列を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
前記液体培養培地が約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの前記追加の単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項３６～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
前記液体培養培地が約５０ｎＭ～約３００ｎＭの前記追加の単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
前記ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤が多鎖キメラポリペプチドであり、前記多鎖キメラポリペプチドが、
（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、
（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および
（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメイン
を含む、第１のキメラポリペプチド、ならびに
（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメイン、および
（ｉｉ）第２の標的結合ドメイン
を含む、第２のキメラポリペプチド
を含み、
前記第１のキメラポリペプチドと前記第２のキメラポリペプチドが、前記一対の親和性ドメインの前記第１のドメインと前記第２のドメインとの結合を介して会合し、
前記第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合しかつ前記第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合するか、または前記第１の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合しかつ前記第２の標的結合ドメインがＣＤ３に結合する、
請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
前記液体培養培地が、前記多鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項72】
前記ＩｇＧ１抗体構築物が、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
前記重鎖可変ドメインが配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
前記重鎖可変ドメインが配列番号７２を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号７３を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項75】
前記第１のキメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとが互いに直接隣接している、請求項７０～７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項76】
前記第１のキメラポリペプチドが、前記第１の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項７０～７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項77】
前記第２のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインと前記第２の標的結合ドメインとが互いに直接隣接している、請求項７０～７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項78】
前記第２のキメラポリペプチドが、前記可溶性組織因子ドメインと前記第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項７０～７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項79】
前記ＣＤ３がヒトＣＤ３である、請求項７０～７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項80】
前記第１のキメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインが配列番号５と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項81】
前記第１のキメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインが配列番号５と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
前記第１のキメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインが配列番号５の配列を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが可溶性ヒト組織因子ドメインである、請求項７０～８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項84】
前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項85】
前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項86】
前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２の配列を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項87】
前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる、請求項７０～８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項88】
前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちのいずれも含まない、請求項７０～８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項89】
前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちの１つ以上を含む、請求項７０～８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項90】
前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが血液凝固を開始しない、請求項７０～８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項91】
前記第１のキメラポリペプチドが配列番号１０２と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項92】
前記第１のキメラポリペプチドが配列番号１０２と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項93】
前記第１のキメラポリペプチドが配列番号１０２の配列を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項94】
前記第１のキメラポリペプチドが配列番号１０４と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項95】
前記第１のキメラポリペプチドが配列番号１０４と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項96】
前記第１のキメラポリペプチドが配列番号１０４の配列を含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項97】
前記ＣＤ２８がヒトＣＤ２８である、請求項７０～９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項98】
前記第２のキメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインが配列番号６と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項99】
前記第２のキメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインが配列番号６と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項100】
前記第２のキメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインが配列番号６の配列を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項101】
前記第２のキメラポリペプチドが配列番号１０６と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項102】
前記第２のキメラポリペプチドが配列番号１０６と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項103】
前記第２のキメラポリペプチドが配列番号１０６の配列を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項104】
前記第２のキメラポリペプチドが配列番号１０８と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項105】
前記第２のキメラポリペプチドが配列番号１０８と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項106】
前記第２のキメラポリペプチドが配列番号１０８の配列を含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項107】
前記多鎖キメラポリペプチドが血液凝固を開始しない、請求項７０～１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項108】
前記液体培養培地が約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの前記多鎖キメラポリペプチドを含む、請求項７０～１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項109】
前記液体培養培地が約５０ｎＭ～約３００ｎＭの前記多鎖キメラポリペプチドを含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項110】
前記液体培養培地がｍＴＯＲ阻害剤をさらに含む、請求項１～１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項111】
前記ｍＴＯＲ阻害剤がラパマイシンである、請求項１１０に記載の方法。
【請求項112】
前記液体培養培地が約１０ｎＭ～約５００ｎＭの前記ｍＴＯＲ阻害剤を含む、請求項１１０または１１１に記載の方法。
【請求項113】
前記液体培養培地が約５０ｎＭ～約１５０ｎＭの前記ｍＴＯＲ阻害剤を含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項114】
前記液体培養培地がｍＴＯＲ阻害剤を含まない、請求項１～１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項115】
前記期間の開始後３６時間～約６０時間毎に前記液体培養培地に前記単鎖キメラポリペプチドを定期的に添加することをさらに含む、請求項１～１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項116】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記定期的な添加が、前記液体培養培地中に約１０ｎＭ～約５００ｎＭの濃度の前記単鎖キメラポリペプチドをもたらすように行われる、請求項１１５に記載の方法。
【請求項117】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記定期的な添加が、前記液体培養培地中に約５０ｎＭ～約１５０ｎＭの濃度の前記単鎖キメラポリペプチドをもたらすように行われる、請求項１１６に記載の方法。
【請求項118】
前記期間の開始後約６日～約８日毎に前記液体培養培地に前記ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤を定期的に添加することをさらに含む、請求項１～１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項119】
前記期間が約７日間～約５６日間である、請求項１～１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項120】
前記期間が約１５日間～約２５日間である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項121】
前記培養する工程の前に、対象から得られた試料から前記Ｔｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む、請求項１～１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項122】
前記培養する工程の後に、対象から得られた試料から前記Ｔｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む、請求項１～１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項123】
前記単離する工程が蛍光支援細胞選別の使用を含む、請求項１２１または１２２に記載の方法。
【請求項124】
前記Ｔｒｅｇ細胞が、末梢血または臍帯血から単離された、自己Ｔｒｅｇ細胞、ハプロタイプ一致Ｔｒｅｇ細胞、または同種異系Ｔｒｅｇ細胞である、請求項１～１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項125】
前記Ｔｒｅｇ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞である、請求項１～１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項126】
前記Ｔｒｅｇ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ細胞である、請求項１～１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項127】
前記Ｔｒｅｇ細胞がキメラ抗原受容体を含む、請求項１～１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項128】
請求項１～１２７のいずれか一項に記載の方法によって生成されたＴｒｅｇ細胞の集団。
【請求項129】
請求項１２８に記載のＴｒｅｇ細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項130】
治療を必要とする対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項１２９に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項131】
前記対象が加齢性疾患または炎症性疾患を有すると特定または診断されている、請求項１３０に記載の方法。
【請求項132】
前記加齢性疾患が、アルツハイマー病、動脈瘤、嚢胞性線維症、膵炎における線維症、緑内障、高血圧症、特発性肺線維症、炎症性腸疾患、椎間板変性、黄斑変性、骨関節炎、２型真性糖尿病、脂肪萎縮、リポジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、白内障、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症、腎移植不全、肝線維症、骨量喪失、心筋梗塞、サルコペニア、創傷治癒、脱毛症、心筋細胞肥大、骨関節炎、パーキンソン病、加齢性肺組織弾性喪失、黄斑変性、悪液質、糸球体硬化症、肝硬変、ＮＡＦＬＤ、骨粗しょう症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、多発性硬化症、神経変性、発作、認知症、血管疾患、易感染性、慢性炎症、および腎機能障害からなる群より選択される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項133】
前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病性腎症、ＣＮＳ損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、乾癬、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および気分障害からなる群より選択される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項134】
（ｉ）ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤と、（ｉｉ）第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、前記第１の標的結合ドメインおよび前記第２の標的結合ドメインがＩＬ－２受容体に結合する、単鎖キメラポリペプチドと、
（ｉｉｉ）ｍＴＯＲ阻害剤と
を含む、キット。
【請求項135】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む、請求項１３４に記載のキット。
【請求項136】
前記ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤が抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズである、請求項１３４または１３５に記載のキット。
【請求項137】
前記ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤が、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む追加の単鎖キメラポリペプチドであり、前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する、請求項１３４または１３５に記載のキット。
【請求項138】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む、請求項１３７に記載のキット。
【請求項139】
前記ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤が多鎖キメラポリペプチドであり、前記多鎖キメラポリペプチドが、
（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、
（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および
（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメイン
を含む、第１のキメラポリペプチド、ならびに
（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメイン、および
（ｉｉ）第２の標的結合ドメイン
を含む、第２のキメラポリペプチド
を含み、
前記第１のキメラポリペプチドと前記第２のキメラポリペプチドが、前記一対の親和性ドメインの前記第１のドメインと前記第２のドメインとの結合を介して会合し、
前記第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合しかつ前記第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合するか、または前記第１の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合しかつ前記第２の標的結合ドメインがＣＤ３に結合する、
請求項１３４または１３５に記載のキット。
【請求項140】
前記液体培養培地が、前記多鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む、請求項１３９に記載の方法。
【請求項141】
Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Ｔｒｅｇ細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、前記液体培養培地が、
ＩＬ－２受容体活性化剤と、
第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドと
を含み、
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する、方法。
【請求項142】
前記液体培養培地が、前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項143】
前記ＩｇＧ１抗体構築物が、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項144】
前記重鎖可変ドメインが配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項145】
前記重鎖可変ドメインが配列番号７２を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号７３を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項146】
前記第１の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとが互いに直接隣接している、請求項１４１～１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項147】
前記単鎖キメラポリペプチドが、前記第１の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項１４１～１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項148】
前記可溶性組織因子ドメインと前記第２の標的結合ドメインとが互いに直接隣接している、請求項１４１～１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項149】
前記単鎖キメラポリペプチドが、前記可溶性組織因子ドメインと前記第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項１４１～１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項150】
前記ＣＤ３がヒトＣＤ３である、請求項１４１～１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項151】
前記第１の標的結合ドメインが配列番号５と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項152】
前記第１の標的結合ドメインが配列番号５と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１５１に記載の方法。
【請求項153】
前記第１の標的結合ドメインが配列番号５の配列を含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項154】
前記ＣＤ２８がヒトＣＤ２８である、請求項１４１～１５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項155】
前記第２の標的結合ドメインが配列番号６と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１５４に記載の方法。
【請求項156】
前記第２の標的結合ドメインが配列番号６と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１５５に記載の方法。
【請求項157】
前記第２の標的結合ドメインが配列番号６の配列を含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項158】
前記可溶性組織因子ドメインが可溶性ヒト組織因子ドメインである、請求項１４１～１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項159】
前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１５８に記載の方法。
【請求項160】
前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１５９に記載の方法。
【請求項161】
前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２の配列を含む、請求項１６０に記載の方法。
【請求項162】
前記可溶性組織因子ドメインが、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる、請求項１４１～１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項163】
前記可溶性組織因子ドメインが、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちのいずれも含まない、請求項１４１～１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項164】
前記可溶性組織因子ドメインが、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちの１つ以上を含む、請求項１４１～１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項165】
前記可溶性組織因子ドメインが血液凝固を開始しない、請求項１４１～１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項166】
前記単鎖キメラポリペプチドが血液凝固を開始しない、請求項１４１～１６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項167】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号７と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項168】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号７と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１６７に記載の方法。
【請求項169】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号７の配列を含む、請求項１６８に記載の方法。
【請求項170】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号８と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１６９に記載の方法。
【請求項171】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号８と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１７０に記載の方法。
【請求項172】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号８の配列を含む、請求項１７１に記載の方法。
【請求項173】
前記液体培養培地が約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの前記単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項１４１～１７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項174】
前記液体培養培地が約５０ｎＭ～約３００ｎＭの前記単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項１７３に記載の方法。
【請求項175】
前記ＩＬ－２受容体活性化剤が可溶性ＩＬ－２である、請求項１４１～１７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項176】
前記可溶性ＩＬ－２がヒト可溶性ＩＬ－２である、請求項１７５に記載の方法。
【請求項177】
前記ヒト可溶性ＩＬ－２が配列番号１と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項178】
前記ヒト可溶性ＩＬ－２が配列番号１と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１７７に記載の方法。
【請求項179】
前記ヒト可溶性ＩＬ－２が配列番号１の配列を含む、請求項１７８に記載の方法。
【請求項180】
前記液体培養培地が約１００ＩＵ／ｍＬ～約８００ＩＵ／ｍＬの前記ヒト可溶性ＩＬ－２を含む、請求項１７６～１７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項181】
前記液体培養培地が約４００ＩＵ／ｍＬ～約６００ＩＵ／ｍＬの前記ヒト可溶性ＩＬ－２を含む、請求項１８０に記載の方法。
【請求項182】
前記液体培養培地がｍＴＯＲ阻害剤をさらに含む、請求項１４１～１８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項183】
前記ｍＴＯＲ阻害剤がラパマイシンである、請求項１８２に記載の方法。
【請求項184】
前記液体培養培地が約１０ｎＭ～約５００ｎＭの前記ｍＴＯＲ阻害剤を含む、請求項１８２または１８３に記載の方法。
【請求項185】
前記液体培養培地が約５０ｎＭ～約１５０ｎＭの前記ｍＴＯＲ阻害剤を含む、請求項１８４に記載の方法。
【請求項186】
前記液体培養培地がｍＴＯＲ阻害剤を含まない、請求項１４１～１８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項187】
前記期間の開始後３６時間～約６０時間毎に前記液体培養培地に前記ＩＬ－２受容体活性化剤を定期的に添加することをさらに含む、請求項１４１～１８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項188】
前記液体培養培地中に約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの濃度の前記ＩＬ－２受容体活性化剤をもたらすように前記ＩＬ－２受容体活性化剤の前記定期的な添加が行われる、請求項１８７に記載の方法。
【請求項189】
前記液体培養培地中に約５０ｎＭ～約１５０ｎＭの濃度の前記ＩＬ－２受容体活性化剤をもたらすように前記ＩＬ－２受容体活性化剤の前記定期的な添加が行われる、請求項１８８に記載の方法。
【請求項190】
前記期間の開始後約６日～約８日毎に前記液体培養培地に前記単鎖キメラポリペプチドを定期的に添加することをさらに含む、請求項１４１～１８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項191】
前記期間が約７日間～約５６日間である、請求項１４１～１９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項192】
前記請求項の期間が約１５日間～約２５日間である、請求項１９１に記載の方法。
【請求項193】
前記培養する工程の前に、対象から得られた試料から前記Ｔｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む、請求項１４１～１９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項194】
前記培養する工程の後に、対象から得られた試料から前記Ｔｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む、請求項１４１～１９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項195】
前記単離する工程が蛍光支援細胞選別の使用を含む、請求項１９３または１９４に記載の方法。
【請求項196】
前記Ｔｒｅｇ細胞が、末梢血または臍帯血から単離された、自己Ｔｒｅｇ細胞、ハプロタイプ一致Ｔｒｅｇ細胞、または同種異系Ｔｒｅｇ細胞である、請求項１４１～１９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項197】
前記Ｔｒｅｇ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞である、請求項１４１～１９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項198】
前記Ｔｒｅｇ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ細胞である、請求項１４１～１９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項199】
前記Ｔｒｅｇ細胞がキメラ抗原受容体を含む、請求項１４１～１９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項200】
請求項１４１～１９９のいずれか一項に記載の方法によって生成されたＴｒｅｇ細胞の集団。
【請求項201】
請求項２００に記載のＴｒｅｇ細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項202】
治療を必要とする対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項２０１に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項203】
前記対象が加齢性疾患または炎症性疾患を有すると特定または診断されている、請求項２０２に記載の方法。
【請求項204】
前記加齢性疾患が、アルツハイマー病、動脈瘤、嚢胞性線維症、膵炎における線維症、緑内障、高血圧症、特発性肺線維症、炎症性腸疾患、椎間板変性、黄斑変性、骨関節炎、２型真性糖尿病、脂肪萎縮、リポジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、白内障、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症、腎移植不全、肝線維症、骨量喪失、心筋梗塞、サルコペニア、創傷治癒、脱毛症、心筋細胞肥大、骨関節炎、パーキンソン病、加齢性肺組織弾性喪失、黄斑変性、悪液質、糸球体硬化症、肝硬変、ＮＡＦＬＤ、骨粗しょう症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、多発性硬化症、神経変性、発作、認知症、血管疾患、易感染性、慢性炎症、および腎機能障害からなる群より選択される、請求項２０３に記載の方法。
【請求項205】
前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病性腎症、ＣＮＳ損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、乾癬、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および気分障害からなる群より選択される、請求項２０３に記載の方法。
【請求項206】
（ｉ）インターロイキン－２受容体活性化剤と、（ｉｉ）第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、前記第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、前記第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する、単鎖キメラポリペプチドと、
（ｉｉｉ）ｍＴＯＲ阻害剤と
を含む、キット。
【請求項207】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む、請求項２０６に記載のキット。
【請求項208】
Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Ｔｒｅｇ細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、前記液体培養培地が、
ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤と、
多鎖キメラポリペプチドであって、
（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、
（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および
（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメイン
を含む、第１のキメラポリペプチド、ならびに
（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメイン、および
（ｉｉ）第２の標的結合ドメイン
を含む、第２のキメラポリペプチド
を含み、
前記第１のキメラポリペプチドと前記第２のキメラポリペプチドが、前記一対の親和性ドメインの前記第１のドメインと前記第２のドメインとの結合を介して会合する、
多鎖キメラポリペプチドと
を含む、方法。
【請求項209】
前記液体培養培地が、前記多鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む、請求項２０８に記載の方法。
【請求項210】
前記ＩｇＧ１抗体構築物が、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項２０９に記載の方法。
【請求項211】
前記重鎖可変ドメインが配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項212】
前記重鎖可変ドメインが配列番号７２を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号７３を含む、請求項２１１に記載の方法。
【請求項213】
前記第１の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとが、前記第１のキメラポリペプチド内で互いに直接隣接している、請求項２０８～２１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項214】
前記第１のキメラポリペプチドが、前記第１のキメラポリペプチド内の前記第１の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項２０８～２１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項215】
前記可溶性組織因子ドメインと前記一対の親和性ドメインの前記第１のドメインとが、前記第１のキメラポリペプチド内で互いに直接隣接している、請求項２０８～２１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項216】
前記第１のキメラポリペプチドが、前記第１のキメラポリペプチド内の前記可溶性組織因子ドメインと前記一対の親和性ドメインの前記第１のドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項２０８～２１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項217】
前記一対の親和性ドメインの前記第２のドメインと前記第２の標的結合ドメインとが、前記第２のキメラポリペプチド内で互いに直接隣接している、請求項２０８～２１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項218】
第２のキメラポリペプチドが、前記第２のキメラポリペプチド内の前記一対の親和性ドメインの前記第２のドメインと前記第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項２０８～２１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項219】
前記第１の標的結合ドメインおよび前記第２の標的結合ドメインが同じ抗原に特異的に結合する、請求項２０８～２１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項220】
前記第１の標的結合ドメインおよび前記第２の標的結合ドメインが異なる抗原に特異的に結合する、請求項２０８～２１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項221】
前記第１の標的結合ドメインおよび前記第２の標的結合ドメインの一方または両方が抗原結合ドメインである、請求項２０８～２２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項222】
前記第１の標的結合ドメインおよび前記第２の標的結合ドメインの一方または両方が、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１、ＶＥＧＦ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＰＤＬ－１、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦα、ＣＤ２６、ＣＤ３６、ＵＬＢＰ２、ＣＤ３０、ＣＤ２００、ＩＧＦ－１Ｒ、ＭＵＣ４ＡＣ、ＭＵＣ５ＡＣ、Ｔｒｏｐ－２、ＣＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、Ｂ７Ｈ３、ＥＰＣＡＭ、ＢＣＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ５、ＵＬ１６結合タンパク質、ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＬＬ４、ＴＹＲＯ３、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＣＤ１２２、ＣＤ１５５、ＰＤＧＦ－ＤＤ、ＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴＧＦ－βＲＩＩ）リガンド、ＴＧＦ－βＲＩＩＩリガンド、ＤＮＡＭ－１リガンド、ＮＫｐ４６リガンド、ＮＫｐ４４リガンド、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＫｐ３０リガンド、ｓｃＭＨＣＩリガンド、ｓｃＭＨＣＩＩリガンド、ｓｃＴＣＲリガンド、ＩＬ－１受容体、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－３受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－８受容体、ＩＬ－１０受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、ＩＬ－１７受容体、ＩＬ－１８受容体、ＩＬ－２１受容体、ＰＤＧＦ－ＤＤ受容体、幹細胞因子（ＳＣＦ）受容体、幹細胞様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）受容体、ＭＩＣＡ受容体、ＭＩＣＢ受容体、ＵＬＰ１６結合タンパク質受容体、ＣＤ１５５受容体、ＣＤ１２２受容体、およびＣＤ２８受容体からなる群より選択される標的に特異的に結合する、請求項２０８～２２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項223】
前記第１の標的結合ドメインおよび前記第２の標的結合ドメインの一方または両方が可溶性インターロイキンまたはサイトカインタンパク質である、請求項２０８～２２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項224】
前記可溶性インターロイキン、サイトカイン、またはリガンドタンパク質が、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＰＤＧＦ－ＤＤ、ＳＣＦ、およびＦＬＴ３Ｌからなる群より選択される、請求項２２３に記載の方法。
【請求項225】
前記第１の標的結合ドメインおよび前記第２の標的結合ドメインの一方または両方が可溶性インターロイキンまたはサイトカイン受容体である、請求項２０８～２２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項226】
前記可溶性受容体が、可溶性ＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴＧＦ－βＲＩＩ）、可溶性ＴＧＦ－βＲＩＩＩ、可溶性ＮＫＧ２Ｄ、可溶性ＮＫｐ３０、可溶性ＮＫｐ４４、可溶性ＮＫｐ４６、可溶性ＤＮＡＭ－１、ｓｃＭＨＣＩ、ｓｃＭＨＣＩＩ、ｓｃＴＣＲ、可溶性ＣＤ１５５、または可溶性ＣＤ２８である、請求項２２５に記載の方法。
【請求項227】
前記第１のキメラポリペプチドが１つ以上の追加の標的結合ドメインをさらに含む、請求項２０８～２２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項228】
前記第２のキメラポリペプチドが１つ以上の追加の標的結合ドメインをさらに含む、請求項２０８～２２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項229】
前記一対の親和性ドメインが、ヒトＩＬ－１５受容体アルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）由来のｓｕｓｈｉドメイン、および可溶性ＩＬ－１５である、請求項２０８～２２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項230】
前記可溶性ＩＬ－１５がＤ８ＮまたはＤ８Ａアミノ酸置換を有する、請求項２２９に記載の方法。
【請求項231】
前記一対の親和性ドメインが、バルナーゼとバルンスター（ｂａｒｎｓｔａｒ）、ＰＫＡとＡＫＡＰ、変異ＲＮａｓｅ Ｉ断片に基づくアダプター／ドッキングタグモジュール、ならびにタンパク質シンタキシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン、およびＳＮＡＰ２５の相互作用に基づくＳＮＡＲＥモジュールからなる群より選択される、請求項２０８～２２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項232】
前記可溶性組織因子ドメインが可溶性ヒト組織因子ドメインである、請求項２０８～２３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項233】
前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項２３２に記載の方法。
【請求項234】
前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２３３に記載の方法。
【請求項235】
前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２の配列を含む、請求項２３４に記載の方法。
【請求項236】
前記可溶性組織因子ドメインが、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる、請求項２０８～２３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項237】
前記可溶性組織因子ドメインが、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちのいずれも含まない、請求項２０８～２３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項238】
前記可溶性組織因子ドメインが、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちの１つ以上を含む、請求項２０８～２３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項239】
前記可溶性組織因子ドメインが血液凝固を開始しない、請求項２０８～２３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項240】
前記多鎖キメラポリペプチドが血液凝固を開始しない、請求項２０８～２３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項241】
前記ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤が抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズである、請求項２０８～２４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項242】
前記液体培養培地が前記抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを約１：１～約６：１のビーズ／細胞比で含む、請求項２４１に記載の方法。
【請求項243】
前記液体培養培地が前記抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを約３：１～約５：１のビーズ／細胞比で含む、請求項２４２に記載の方法。
【請求項244】
前記ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤が、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであり、前記単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、前記単鎖キメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する、請求項２０８～２４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項245】
前記液体培養培地が、前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む、請求項２４４に記載の方法。
【請求項246】
前記ＩｇＧ１抗体構築物が、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項２４５に記載の方法。
【請求項247】
前記重鎖可変ドメインが配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２４６に記載の方法。
【請求項248】
前記重鎖可変ドメインが配列番号７２を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号７３を含む、請求項２４７に記載の方法。
【請求項249】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとが互いに直接隣接している、請求項２４４～２４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項250】
前記単鎖キメラポリペプチドが、前記第１の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項２４４～２４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項251】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインと前記第２の標的結合ドメインとが互いに直接隣接している、請求項２４４～２５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項252】
前記単鎖キメラポリペプチドが、前記可溶性組織因子ドメインと前記第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項２４４～２５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項253】
前記ＣＤ３がヒトＣＤ３である、請求項２４４～２５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項254】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインが配列番号５と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項２５３に記載の方法。
【請求項255】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインが配列番号５と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２５４に記載の方法。
【請求項256】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインが配列番号５の配列を含む、請求項２５５に記載の方法。
【請求項257】
前記ＣＤ２８がヒトＣＤ２８である、請求項２４４～２５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項258】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインが配列番号６と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項２５７に記載の方法。
【請求項259】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインが配列番号６と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２５８に記載の方法。
【請求項260】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインが配列番号６の配列を含む、請求項２５９に記載の方法。
【請求項261】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが可溶性ヒト組織因子ドメインである、請求項２４４～２６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項262】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項２６１に記載の方法。
【請求項263】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２６２に記載の方法。
【請求項264】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２の配列を含む、請求項２６３に記載の方法。
【請求項265】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる、請求項２４４～２６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項266】
前記可溶性組織因子ドメインが、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちのいずれも含まない、請求項２４４～２６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項267】
前記可溶性組織因子ドメインが、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちの１つ以上を含む、請求項２４４～２６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項268】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが血液凝固を開始しない、請求項２４４～２６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項269】
前記単鎖キメラポリペプチドが血液凝固を開始しない、請求項２４４～２６８に記載の方法。
【請求項270】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号７と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項２４４に記載の方法。
【請求項271】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号７と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２７０に記載の方法。
【請求項272】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号７の配列を含む、請求項２７１に記載の方法。
【請求項273】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号８と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項２７２に記載の方法。
【請求項274】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号８と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２７３に記載の方法。
【請求項275】
前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号８の配列を含む、請求項２７４に記載の方法。
【請求項276】
前記液体培養培地が約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの前記単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項２４４～２７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項277】
前記液体培養培地が約５０ｎＭ～約３００ｎＭの前記単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項２７６に記載の方法。
【請求項278】
前記ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤が追加の多鎖キメラポリペプチドであり、前記追加の多鎖キメラポリペプチドが、
（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、
（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および
（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメイン
を含む、第１のキメラポリペプチド、ならびに
（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメイン、および
（ｉｉ）第２の標的結合ドメイン
を含む、第２のキメラポリペプチド
を含み、
前記第１のキメラポリペプチドと前記第２のキメラポリペプチドが、前記一対の親和性ドメインの前記第１のドメインと前記第２のドメインとの結合を介して会合し、
前記第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合しかつ前記第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合するか、または前記第１の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合しかつ前記第２の標的結合ドメインがＣＤ３に結合する、
請求項２０８～２４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項279】
前記液体培養培地が、前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む、請求項２７８に記載の方法。
【請求項280】
前記ＩｇＧ１抗体構築物が、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項２７９に記載の方法。
【請求項281】
前記重鎖可変ドメインが配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２８０に記載の方法。
【請求項282】
前記重鎖可変ドメインが配列番号７２を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号７３を含む、請求項２８１に記載の方法。
【請求項283】
前記第１のキメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインと前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインとが互いに直接隣接している、請求項２７８～２８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項284】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドが、前記第１の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項２７８～２８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項285】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第２のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインと前記第２の標的結合ドメインとが互いに直接隣接している、請求項２７８～２８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項286】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第２のキメラポリペプチドが、前記可溶性組織因子ドメインと前記第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項２７８～２８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項287】
前記ＣＤ３がヒトＣＤ３である、請求項２７８～２８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項288】
前記第１のキメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインが配列番号５と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項２８７に記載の方法。
【請求項289】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインが配列番号５と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２８８に記載の方法。
【請求項290】
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインが配列番号５の配列を含む、請求項２８９に記載の方法。
【請求項291】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが可溶性ヒト組織因子ドメインである、請求項２７８～２９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項292】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項２９１に記載の方法。
【請求項293】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２９２に記載の方法。
【請求項294】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号２の配列を含む、請求項２９３に記載の方法。
【請求項295】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる、請求項２７８～２９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項296】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちのいずれも含まない、請求項２７８～２９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項297】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちの１つ以上を含む、請求項２７８～２９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項298】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが血液凝固を開始しない、請求項２７８～２９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項299】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドが配列番号１０２と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項２７８に記載の方法。
【請求項300】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドが配列番号１０２と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２９９に記載の方法。
【請求項301】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドが配列番号１０２の配列を含む、請求項３００に記載の方法。
【請求項302】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドが配列番号１０４と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項２７８に記載の方法。
【請求項303】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドが配列番号１０４と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３０２に記載の方法。
【請求項304】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第１のキメラポリペプチドが配列番号１０４の配列を含む、請求項３０３に記載の方法。
【請求項305】
前記ＣＤ２８がヒトＣＤ２８である、請求項２７８～３０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項306】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第２のキメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインが配列番号６と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項３０５に記載の方法。
【請求項307】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第２のキメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインが配列番号６と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３０６に記載の方法。
【請求項308】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第２のキメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインが配列番号６の配列を含む、請求項３０７に記載の方法。
【請求項309】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第２のキメラポリペプチドが配列番号１０６と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項２７８に記載の方法。
【請求項310】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第２のキメラポリペプチドが配列番号１０６と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３０９に記載の方法。
【請求項311】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第２のキメラポリペプチドが配列番号１０６の配列を含む、請求項３１０に記載の方法。
【請求項312】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第２のキメラポリペプチドが配列番号１０８と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項３１１に記載の方法。
【請求項313】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第２のキメラポリペプチドが配列番号１０８と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３１２に記載の方法。
【請求項314】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第２のキメラポリペプチドが配列番号１０８の配列を含む、請求項３１３に記載の方法。
【請求項315】
前記追加の多鎖キメラポリペプチドが血液凝固を開始しない、請求項２７８～３１４に記載の方法。
【請求項316】
前記液体培養培地が約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの前記追加の多鎖キメラポリペプチドを含む、請求項２７８～３１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項317】
前記液体培養培地が約５０ｎＭ～約３００ｎＭの前記追加の多鎖キメラポリペプチドを含む、請求項３１６に記載の方法。
【請求項318】
前記液体培養培地がｍＴＯＲ阻害剤をさらに含む、請求項２０８～３１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項319】
前記ｍＴＯＲ阻害剤がラパマイシンである、請求項３１８に記載の方法。
【請求項320】
前記液体培養培地が約１０ｎＭ～約５００ｎＭの前記ｍＴＯＲ阻害剤を含む、請求項３１８または３１９に記載の方法。
【請求項321】
前記液体培養培地が約５０ｎＭ～約１５０ｎＭの前記ｍＴＯＲ阻害剤を含む、請求項３２０に記載の方法。
【請求項322】
前記液体培養培地がｍＴＯＲ阻害剤を含まない、請求項２０８～３１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項323】
前記期間の開始後３６時間～約６０時間毎に前記液体培養培地に前記多鎖キメラポリペプチドを定期的に添加することをさらに含む、請求項２０８～３２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項324】
前記多鎖キメラポリペプチドの前記定期的な添加が、前記液体培養培地中に約１０ｎＭ～約５００ｎＭの濃度の前記多鎖キメラポリペプチドをもたらすように行われる、請求項３２３に記載の方法。
【請求項325】
前記多鎖キメラポリペプチドの前記定期的な添加が、前記液体培養培地中に約５０ｎＭ～約１５０ｎＭの濃度の前記多鎖キメラポリペプチドをもたらすように行われる、請求項３２４に記載の方法。
【請求項326】
前記期間の開始後約６日～約８日毎に前記液体培養培地に前記ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤を定期的に添加することをさらに含む、請求項２０８～３２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項327】
前記期間が約７日間～約５６日間である、請求項２０８～３２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項328】
前記請求項の期間が約１５日間～約２５日間である、請求項３２７に記載の方法。
【請求項329】
前記培養する工程の前に、対象から得られた試料から前記Ｔｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む、請求項２０８～３２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項330】
前記培養する工程の後に、対象から得られた試料から前記Ｔｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む、請求項２０８～３２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項331】
前記単離する工程が蛍光支援細胞選別の使用を含む、請求項３２９または３３０に記載の方法。
【請求項332】
前記Ｔｒｅｇ細胞が、末梢血または臍帯血から単離された、自己Ｔｒｅｇ細胞、ハプロタイプ一致Ｔｒｅｇ細胞、または同種異系Ｔｒｅｇ細胞である、請求項２０８～３３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項333】
前記Ｔｒｅｇ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞である、請求項２０８～３３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項334】
前記Ｔｒｅｇ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ細胞である、請求項２０８～３３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項335】
前記Ｔｒｅｇ細胞がキメラ抗原受容体を含む、請求項２０８～３３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項336】
請求項２０８～３３５のいずれか一項に記載の方法によって生成されたＴｒｅｇ細胞の集団。
【請求項337】
請求項３３６に記載のＴｒｅｇ細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項338】
治療を必要とする対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項３３７に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項339】
前記対象が加齢性疾患または炎症性疾患を有すると特定または診断されている、請求項３３８に記載の方法。
【請求項340】
前記加齢性疾患が、アルツハイマー病、動脈瘤、嚢胞性線維症、膵炎における線維症、緑内障、高血圧症、特発性肺線維症、炎症性腸疾患、椎間板変性、黄斑変性、骨関節炎、２型真性糖尿病、脂肪萎縮、リポジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、白内障、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症、腎移植不全、肝線維症、骨量喪失、心筋梗塞、サルコペニア、創傷治癒、脱毛症、心筋細胞肥大、骨関節炎、パーキンソン病、加齢性肺組織弾性喪失、黄斑変性、悪液質、糸球体硬化症、肝硬変、ＮＡＦＬＤ、骨粗しょう症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、多発性硬化症、神経変性、発作、認知症、血管疾患、易感染性、慢性炎症、および腎機能障害からなる群より選択される、請求項３３９に記載の方法。
【請求項341】
前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病性腎症、ＣＮＳ損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、乾癬、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および気分障害からなる群より選択される、請求項３３９に記載の方法。
【請求項342】
ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤と、多鎖キメラポリペプチドであって、
（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、
（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および
（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメイン
を含む、第１のキメラポリペプチド、ならびに
（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメイン、および
（ｉｉ）第２の標的結合ドメイン
を含む、第２のキメラポリペプチド
を含み、
前記第１のキメラポリペプチドと前記第２のキメラポリペプチドが、前記一対の親和性ドメインの前記第１のドメインと前記第２のドメインとの結合を介して会合する、
多鎖キメラポリペプチドと、
ｍＴＯＲ阻害剤と
を含む、キット。
【請求項343】
前記多鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む、請求項３４２に記載のキット。
【請求項344】
前記ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤が抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズである、請求項３４２または３４３に記載のキット。
【請求項345】
前記ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤が、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであり、前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する、請求項３４２または３４３に記載のキット。
【請求項346】
前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む、請求項３４５に記載のキット。
【請求項347】
前記ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤が追加の多鎖キメラポリペプチドであり、前記追加の多鎖キメラポリペプチドが、
（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、
（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および
（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメイン
を含む、第１のキメラポリペプチド、ならびに
（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメイン、および
（ｉｉ）第２の標的結合ドメイン
を含む、第２のキメラポリペプチド
を含み、
前記第１のキメラポリペプチドと前記第２のキメラポリペプチドが、前記一対の親和性ドメインの前記第１のドメインと前記第２のドメインとの結合を介して会合し、
前記第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合しかつ前記第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合するか、または前記第１の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合しかつ前記第２の標的結合ドメインがＣＤ３に結合する、
請求項３４２または３４３に記載のキット。
【請求項348】
前記液体培養培地が、前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む、請求項３４７に記載の方法。
【請求項349】
対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する方法であって、そのＣＤ３９発現に基づいて前記試料から前記Ｔｒｅｇ細胞を分離し、それにより、前記Ｔｒｅｇ細胞を単離することを含む、方法。
【請求項350】
前記Ｔｒｅｇ細胞を単離する前に前記試料を液体培養培地中で培養することによってＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させることを含む、請求項３４９に記載の方法。
【請求項351】
前記試料と、ＣＤ３９に結合することができる抗体またはリガンドとを、ＣＤ３９を発現するＴｒｅｇ細胞への前記抗体またはリガンドの結合を可能にする条件下で混合することと、前記抗体またはリガンドに結合した前記Ｔｒｅｇ細胞を前記試料中の他の成分から分離し、それにより、前記Ｔｒｅｇ細胞を単離することと
を含む、請求項３４９または３５０に記載の方法。
【請求項352】
前記抗体が、マウス、ヒト化、もしくはヒト抗体もしくはその抗原結合断片であり、かつ／または前記抗体または前記リガンドが、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、もしくは蛍光色素のうちの少なくとも１つで標識されているか、または粒子、ビーズ、樹脂、もしくは固体支持体に結合している、
請求項３５１に記載の方法。
【請求項353】
前記分離が、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、遠心分離、またはカラム、プレート、粒子、もしくはビーズベース方法の使用を含む、請求項３５１に記載の方法。
【請求項354】
前記試料と、ＣＤ３９に結合することができるビオチン化抗体またはリガンドとを、前記Ｔｒｅｇ細胞への前記抗体または前記リガンドの結合を可能にする条件下で混合することと、ストレプトアビジン被覆磁性粒子を使用して、前記ビオチン化抗体またはリガンドに結合した前記Ｔｒｅｇ細胞を捕捉することと、
磁石を使用して前記磁性粒子に結合したＴｒｅｇ細胞を分離することと、
前記磁石粒子に結合したＴｒｅｇ細胞を洗浄して、前記試料中の他の成分を除去することと、
前記磁性粒子に結合したＴｒｅｇ細胞を前記磁石から溶液中に放出し、それにより、前記Ｔｒｅｇ細胞を単離することと
をさらに含む、請求項３４９に記載の方法。
【請求項355】
前記Ｔｒｅｇ細胞が、新鮮または凍結された末梢血、臍帯血、末梢血単核細胞、リンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＴｒｅｇ細胞を含む試料から単離された、自己Ｔｒｅｇ細胞、ハプロタイプ一致Ｔｒｅｇ細胞、または同種異系Ｔｒｅｇ細胞である、請求項３４９～３５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項356】
前記Ｔｒｅｇ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞である、請求項３４９～３５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項357】
前記Ｔｒｅｇ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ細胞である、請求項３４９～３５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項358】
前記Ｔｒｅｇ細胞がキメラ抗原受容体を含む、請求項３４９～３５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項359】
前記Ｔｒｅｇ細胞がインビトロおよびインビボで免疫抑制性である、請求項３４９～３５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項360】
請求項３４９～３５９のいずれか一項に記載の方法によって生成された単離されたＴｒｅｇ細胞の集団。
【請求項361】
請求項３６０に記載の単離されたＴｒｅｇ細胞の集団を増大させる方法であって、前記単離されたＴｒｅｇ細胞の増殖を可能にする条件下で、前記単離されたＴｒｅｇ細胞の集団を培養する工程を含む、方法。
【請求項362】
前記単離されたＴｒｅｇ細胞の集団は、７０％超がＣＤ３９＋細胞である、請求項３６０に記載の単離されたＴｒｅｇ細胞の集団。
【請求項363】
請求項３６０または３６２に記載の単離されたＴｒｅｇ細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項364】
治療を必要とする対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項３６３に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項365】
前記対象が加齢性疾患または炎症性疾患を有すると特定または診断されている、請求項３６４に記載の方法。
【請求項366】
前記加齢性疾患が、アルツハイマー病、動脈瘤、嚢胞性線維症、膵炎における線維症、緑内障、高血圧症、特発性肺線維症、炎症性腸疾患、椎間板変性、黄斑変性、骨関節炎、２型真性糖尿病、脂肪萎縮、リポジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、白内障、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症、腎移植不全、肝線維症、骨量喪失、心筋梗塞、サルコペニア、創傷治癒、脱毛症、心筋細胞肥大、骨関節炎、パーキンソン病、加齢性肺組織弾性喪失、黄斑変性、悪液質、糸球体硬化症、肝硬変、ＮＡＦＬＤ、骨粗しょう症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、多発性硬化症、神経変性、発作、認知症、血管疾患、易感染性、慢性炎症、および腎機能障害からなる群より選択される、請求項３６５に記載の方法。
【請求項367】
前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病性腎症、ＣＮＳ損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、乾癬、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および気分障害からなる群より選択される、請求項３６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／９８１，９４４号および２０２０年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９７５，１４１号に対する優先権を主張する。
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／９８１，９４４号および２０２０年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９７５，１４１号に対する優先権を主張する。
【0002】
技術分野
本開示は、バイオテクノロジーおよび免疫学の分野に関し、より具体的には、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法に関する。
本開示は、バイオテクノロジーおよび免疫学の分野に関し、より具体的には、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
約４６ｋＤａの分子量を有する２６３アミノ酸内在性膜糖タンパク質であり、かつ外因性血液凝固経路のトリガータンパク質である組織因子（ＴＦ）は、インビボでの凝固の主要な開始因子である。通常、循環血液と接触していない組織因子は、循環凝固セリンプロテアーゼ因子への曝露時に凝固カスケードを開始する。血管損傷は、組織因子を発現する内皮下細胞を露出させ、既存の血漿因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）とのカルシウム依存性高親和性複合体の形成をもたらす。セリンプロテアーゼＦＶＩＩａの組織因子への結合は、ＦＸからＦＸａおよびＦＩＸからＦＩＸａへの迅速な切断を促進する。その後、結果として生じたＦＸａおよび活性膜表面のタンパク質分解活性は、少量のプロトロンビンを非効率的にトロンビンに変換する。ＦＸａによって生成されたトロンビンは、血小板活性化を開始し、微量のプロ補因子である第Ｖ因子（ＦＶ）および第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を活性化して、活性補因子である第Ｖａ因子（ＦＶａ）および第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）になる。ＦＩＸａは、血小板表面でＦＶＩＩＩａと複合体を形成して、内因性テナーゼ複合体を形成し、これにより、ＦＸａが急速に生成される。ＦＸａは、ＦＶａと複合体を形成して、活性化された血小板表面にプロトロンビナーゼ複合体を形成し、これにより、プロトロンビンがトロンビンに迅速に切断される。
約４６ｋＤａの分子量を有する２６３アミノ酸内在性膜糖タンパク質であり、かつ外因性血液凝固経路のトリガータンパク質である組織因子（ＴＦ）は、インビボでの凝固の主要な開始因子である。通常、循環血液と接触していない組織因子は、循環凝固セリンプロテアーゼ因子への曝露時に凝固カスケードを開始する。血管損傷は、組織因子を発現する内皮下細胞を露出させ、既存の血漿因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）とのカルシウム依存性高親和性複合体の形成をもたらす。セリンプロテアーゼＦＶＩＩａの組織因子への結合は、ＦＸからＦＸａおよびＦＩＸからＦＩＸａへの迅速な切断を促進する。その後、結果として生じたＦＸａおよび活性膜表面のタンパク質分解活性は、少量のプロトロンビンを非効率的にトロンビンに変換する。ＦＸａによって生成されたトロンビンは、血小板活性化を開始し、微量のプロ補因子である第Ｖ因子（ＦＶ）および第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を活性化して、活性補因子である第Ｖａ因子（ＦＶａ）および第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）になる。ＦＩＸａは、血小板表面でＦＶＩＩＩａと複合体を形成して、内因性テナーゼ複合体を形成し、これにより、ＦＸａが急速に生成される。ＦＸａは、ＦＶａと複合体を形成して、活性化された血小板表面にプロトロンビナーゼ複合体を形成し、これにより、プロトロンビンがトロンビンに迅速に切断される。
【0004】
組織因子－ＦＶＩＩａ複合体に加えて、最近の研究では、組織因子－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ複合体がＦＶＩＩＩを活性化することができ、これにより、開始段階で追加のレベルのＦＶＩＩＩａが提供されることが示された。外因性経路が限られた量のトロンビンの活性化により凝固を開始する際に最も重要である一方で、内因性経路は、初期シグナルの劇的な増幅により凝固を維持する。
【0005】
細胞表面に発現する組織因子の多くは「暗号化」されており、凝固に完全に関与するには「暗号解読」されなければならない。細胞表面組織因子の「暗号解読」のメカニズムは、現時点では依然として不明であるが、アニオン性リン脂質の曝露がこのプロセスで主要な役割を果たしている。健常細胞は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）などのアニオン性リン脂質を原形質膜の内側の小葉に能動的に隔離する。細胞損傷、活性化、または細胞質Ｃａ２＋レベルの増加後、この二層非対称性が失われ、外側の小葉にＰＳ曝露が増加し、これにより、細胞表面組織因子－ＦＶＩＩａ複合体の比活性が増加する。ＰＳ曝露が組織因子－ＦＶＩＩａ複合体によるＦＩＸおよびＦＸの活性化の見かけのＫｍを低下させることで知られているが、追加のメカニズムには、組織因子または組織因子－ＦＶＩＩａの立体配座再配置およびその後の基質結合部位の曝露が含まれ得る。
【0006】
養子免疫療法または細胞療法は、対象に投与して戻す前に、インビボで対象から得られた免疫細胞の培養（および任意選択的にキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を発現するための免疫細胞の遺伝子操作）を必要とする。対象において治療効果を提供するためには、十分な数の免疫細胞が必要である。多くの例において、対象から得られた免疫細胞は、治療上有効な数の免疫細胞が得ることができる前に、３週間以上培養する必要がある。さらに、インビトロで対象から得られた免疫細胞を培養する多くの方法は、フィーダー細胞の層を必要とし、これは、対象に投与して戻す前に、免疫細胞のその後の精製または単離を必要とする。
【発明の概要】
【0007】
概要
Ｔｒｅｇ細胞を投与された患者において優れた安全性プロファイルが示されている（Ｅｓｅｎｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４２（６）：１７１０－１７１８，２０１８）。初期臨床研究では、Ｔｒｅｇ細胞を使用した急性および慢性移植片対宿主病（Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１７（３）：１０６１－１０７０，２０１１、Ｄｉ Ｉａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１７（１４）：３９２１－３９２８，２０１１、Ｍａｒｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２４（４）：６３８－６４４，２０１４、Ｔｈｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １７（４）：４７３－４８６，２０１５、Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２７（８）：１０４４－１０５１，２０１６）、自己免疫疾患、および神経変性疾患（Ｔｈｏｎｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍ ５（４）：ｅ４６５，２０１８、Ｄａｌｌ’Ｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ７１（３）：４３１－４４０，２０１９）の予防および治療において有望な結果が示された。
Ｔｒｅｇ細胞を投与された患者において優れた安全性プロファイルが示されている（Ｅｓｅｎｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４２（６）：１７１０－１７１８，２０１８）。初期臨床研究では、Ｔｒｅｇ細胞を使用した急性および慢性移植片対宿主病（Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１７（３）：１０６１－１０７０，２０１１、Ｄｉ Ｉａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１７（１４）：３９２１－３９２８，２０１１、Ｍａｒｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２４（４）：６３８－６４４，２０１４、Ｔｈｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １７（４）：４７３－４８６，２０１５、Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２７（８）：１０４４－１０５１，２０１６）、自己免疫疾患、および神経変性疾患（Ｔｈｏｎｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍ ５（４）：ｅ４６５，２０１８、Ｄａｌｌ’Ｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ７１（３）：４３１－４４０，２０１９）の予防および治療において有望な結果が示された。
【0008】
Ｔｒｅｇ細胞を含むＴ細胞ベースの養子療法を使用するために、エクスビボ細胞刺激ステップがＧＭＰ製造設定に必要である。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体被覆磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）は、ＩＬ－２と組み合わせて細胞刺激および増殖に最も一般的に使用されている（Ｈｉｇｈｆｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｍａｌｉｇ Ｒｅｐ １４（４）：２６９－２７７，２０１９）。このアプローチを使用する場合、培養物収集時および患者への注入前にＴ細胞が「ビーズフリー」であることを確実にする方法が開発されなければならない。この研究では、我々は、ラパマイシンの使用なしでのＴ細胞の刺激および増大のために、２ｔ２および３ｔ１５＊－２８ｓを用いて、それぞれ、ＩＬ－２および抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズを効果的に置き換える方法について説明する。３ｔ１５＊－２８ｓは、可溶性融合タンパク質複合体であり、これは簡単な洗浄ステップで培養物から簡単に除去できるため、ビーズの除去が不要になり、時間および処理コストが節約され、細胞回収が増強される。加えて、我々は、細胞刺激および増殖の前または後のＴｒｅｇ細胞の単離または精製時に抗ＣＤ３９抗体を使用する分離ステップを含めることにより、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏおよびＣＤ３９ｈｉＴｒｅｇ細胞を濃縮することができ、これにより、純度、一貫性、およびエフェクター機能が増加したＴｒｅｇ細胞がもたらされることも実証した。
【0009】
ヒトの老化は、全身性炎症の増加と関連している（Ｆｅｒｒｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０５（６）：２２９４－２２９９，２００５、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ８３（２）：４４７Ｓ－４５５Ｓ，２００６））。炎症と老化を結び付ける過程は、炎症老化（ｉｎｆｌａｍｍ－ａｇｉｎｇ）と呼ばれている（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９０８：２４４－２５４，２０００）。老化の過程は、免疫系に影響を及ぼし、かつ様々な加齢性病態を引き起こす大きな変化と関連している。
【0010】
免疫系の機能は、組織への損傷または病原性微生物の侵入を検出し、それに対応することである。感染に対する防御の第一線である自然免疫細胞は、微生物に特有の保存された病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識する生殖細胞系列にコードされたパターン認識受容体（ＰＲＲ）を発現する（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ ５４ Ｐｔ １：１－１３，１９８９、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０（２）：９５－１１２，２０２０）。罹患または損傷した細胞によって放出される危険信号も損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）受容体によって認識される（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０（２）：９５－１１２，２０２０）。ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰはいずれも、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）などの古典的なＰＲＲ、およびＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）様受容体（ＲＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、および細胞内ＤＮＡセンサーなどの複数の生殖細胞系列にコードされた受容体の活性化により自然免疫応答を開始することができる（Ｃａｏ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６（１）：３５－５０，２０１６）。ＤＡＭＰは、いくつかの他の受容体によっても感知され得る。これらには、終末糖化産物（ＲＡＧＥ）受容体（Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ ６９：３４９－３６４，２０１８、Ｔｅｉｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ ２０（３）：２７９－３０１，２０１９）、骨髄細胞で発現するトリガー受容体（ＴＲＥＭ）（Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１（１）：３８－４６，２００９）、いくつかのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）（Ｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ５４：２２７－２４９，２０１４、Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３９（１０）：８１５－８２９，２０１８）、およびイオンチャネル（Ｅｉｓｅｎｈｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ ４６１（４）：４０１－４２１，２０１１）が含まれる。
【0011】
ＤＡＭＰによって開始される炎症反応は、病原体感染とは無関係であるため、無菌性炎症と称される（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０（１２）：８２６－８３７，２０１０）。ＤＡＭＰは、非免疫細胞および自然免疫細胞の両方を活性化することができる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０（１２）：８２６－８３７，２０１０）。これらの細胞の活性化によりサイトカインおよびケモカインの産生がもたらされ、次いで、それらが炎症細胞を動員し、適応免疫応答を活性化する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０（１２）：８２６－８３７，２０１０）。いくつかのＤＡＭＰは、適応免疫細胞を直接活性化することも知られている（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０２（９）：１１７１－１１７７，２００５、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９（１）：７２－８１，２０１７）。無菌性炎症は、有害な傷害後に組織止血を再確立するために組織修復および再生において重要な役割を果たすが、繰り返される組織損傷に起因するか、または組織に存在する自然免疫トリガーの過多に応答する解決されていない慢性炎症は、宿主に有害であり、がん、代謝性疾患（例えば、糖尿病）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）、および自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）を含む無菌性炎症性疾患を引き起こし得る（Ｒｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｅ Ｎｅｔｗ １８（４）：ｅ２７，２０１８）。
【0012】
インフラマソームは、細胞質パターン認識受容体、カスパーゼ動員ドメイン（ＡＳＣ）を含むアダプタータンパク質アポトーシス関連Ｓｐｅｃｋ様タンパク質、およびカスパーゼ－１を含む大きい多量体タンパク質複合体である（Ｌａｍｋａｎｆｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５７（５）：１０１３－１０２２，２０１４）。自然免疫細胞および他の細胞におけるそれらの集合は、様々な刺激によって引き起こされ、カスパーゼ－１の活性化に至り、その後、それがプロＩＬ－１βをＩＬ－１βに切断する（Ｌａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３（６）：３９７－４１１，２０１３、Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １５（２）：８４－９７，２０１４）。これまでに、多様なインフラマソームが発見されている。特定された様々なインフラマソームの中で、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメインロイシンリッチリピート含有受容体（ＮＬＲ）ファミリーのパイリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）インフラマソームが最もよく特徴付けられている（Ｓｗａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９（８）：４７７－４８９，２０１９）。ＮＬＲは、病原体および危険信号の重要なセンサーとして認識されている。ＮＬＲＰ３インフラマソームは、二段階活性化機構である、プロＩＬ－１βおよびＮＬＲＰ３の誘導を伴う「プライミング」と、ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰの取り込み後に機能的インフラマソーム複合体が組み立てられる「活性化」とを有する。アルツハイマー病（Ｈｅｎｅｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９３（７４３４）：６７４－６７８，２０１３）、パーキンソン病（Ｈｅｎｅｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９（１０）：６１０－６２１，２０１８）、およびアテローム性動脈硬化症（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃ ８（１２）：ｅ０１２２１９，２０１９）を含む様々な疾患の病理は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの過剰活性化に関連している。
【0013】
無菌性炎症は老化細胞の蓄積からも起こる可能性がある。細胞老化は、細胞ストレスに応答して起こり、かつ次世代への欠陥の伝播を阻止する不可逆的細胞周期停止として定義されている（Ｃｏｌｌａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １０（１）：５１－５７，２０１０、ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２１７（１）：６５－７７，２０１８）。細胞老化は、発達、組織止血、および創傷治癒の過程で重要な保護的役割を果たす（Ｍｕｎｏｚ－Ｅｓｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５５（５）：１１０４－１１１８，２０１３、Ｓｔｏｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５５（５）：１１１９－１１３０，２０１３、Ｄｅｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ３１（６）：７２２－７３３，２０１４、Ｙｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ ４，２０１５）。細胞老化は、炎症誘発性表現型を伴う。この表現型は、老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）と称される（ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２１７（１）：６５－７７，２０１８）。ＳＡＳＰは、炎症性サイトカイン、ケモカイン、成長因子、およびプロテアーゼの放出を特徴とする。これは、オートクリンおよびパラクリンシグナル伝達により細胞老化を強化し、免疫細胞を動員して老化細胞を排除するように指示する。したがって、細胞老化とＳＡＳＰは、細胞レベル、組織レベル、および臓器レベルで恒常性を維持する非常に重要な生理学的反応である。しかしながら、損傷が持続的に起こる際または老化が進む過程で、老化細胞排除が損なわれ、機能不全細胞が蓄積する。これらの排除されずに蓄積された老化細胞由来のＳＡＳＰは、炎症性微小環境を作り出す炎症性因子の持続的な長期発生源であり、結果として様々な病理学的兆候が引き起こされる（Ｍｕｎｏｚ－Ｅｓｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５（７）：４８２－４９６，２０１４、ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ ５０９（７５０１）：４３９－４４６，２０１４、ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２１７（１）：６５－７７，２０１８）。加えて、ＳＡＳＰ因子のうちのいくつかは、インフラマソーム含有細胞を刺激し、これにより、長期インフラマソーム活性化を刺激して無菌性炎症を誘発するリスクが高まる。
【0014】
制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、自己抗原および非自己抗原に対する末梢寛容および宿主における全体的な免疫調節能の必須メディエーターである（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３３（５）：７７５－７８７，２００８、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３８：５４１－５６６，２０２０）。Ｔｒｅｇ細胞は、複数の抑制機構によりこの免疫調節制御を実現する。これらには、ＩＬ－２の剥奪、抑制性サイトカイン（すなわち、ＩＬ－１０およびＴＧＦ－β）の分泌、およびＣＴＬＡ－４への高親和性結合による抗原提示細胞からの共刺激分子の獲得が含まれる（Ｏｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７９（６）：３５７８－３５８７，２００７、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９（３）：２３９－２４４，２００８、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８１（３）：１６８３－１６９１，２００８）。アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）－アデノシン経路も自然免疫および適応免疫の重要なモジュレーターとして制御性Ｔｒｅｇによって利用される。ＣＤ３９は、免疫細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）、内皮細胞、および腫瘍細胞で広範に発現する主要なエクトヌクレオチダーゼであり、ＡＴＰおよびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）に加水分解する（Ｍｏｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０（１２）：７３９－７５５，２０２０）。その後、ＡＭＰがＣＤ７３によってアデノシンに加水分解される。アデノシンは、免疫細胞に提示されるその受容体Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３に結合する。Ａ２Ａ受容体およびＡ２Ｂ受容体（Ａ２ＡＲおよびＡ２ＢＲ）は、細胞内ｃＡＭＰおよびＰＫＡレベルを増加させるＧｓ共役受容体であり、ｃＡＭＰ依存的様式でアデノシン誘導性免疫抑制において主要な役割を果たす。Ａ１受容体およびＡ３受容体（Ａ１ＲおよびＡ３Ｒ）は、細胞活性化に有利な細胞内ｃＡＭＰを減少させるＧｉ／ｏ共役受容体であり、それ故に、一般に免疫促進アデノシン受容体とみなされる。ヒトでは、Ａ１Ｒ、Ａ２ＡＲ、およびＡ３Ｒがアデノシンに対して高い親和性を呈するが、Ａ２ＢＲは有意に低い親和性を有する。Ａ２ＡおよびＡ２ＢＲは免疫細胞で発現する（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔ ２０：１１０，２０２０）。最近になって、ヒトＣＤ３９ｈｉ制御性Ｔ細胞が炎症性条件下でより強い安定性、より高いＦｏｘｐ３発現、および抑制能力を呈することが示された（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４（６）：５２１－５２８，２０１７）。Ｔｒｅｇ細胞の発達、恒常性、または機能の変化により、これらの細胞が、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、がん、および免疫療法に対する反応などの様々な病状にかかりやすくなる可能性がある（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３８：５４１－５６６，２０２０）。現在の研究は、サイトカインおよび低分子量薬物の使用によりインビボでＴｒｅｇ細胞機能を増強して内因性Ｔｒｅｇ細胞増殖または活性化を支持する新規療法、自己免疫状況下で免疫調節を促進する自己養子細胞療法（ＡＣＴ）におけるエクスビボで操作されたＴｒｅｇ細胞、またはアレルギー性炎症への耐性を強化するキメラ抗原受容体Ｔｒｅｇ（ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ）細胞などの抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞の開発に焦点を当てている（Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １８（１０）：７４９－７６９，２０１９）。本発明は、Ｔｒｅｇ細胞を使用してインフラマソームを不活性化し、その後、１つ以上の免疫療法によって活性化された免疫細胞を使用して個体に蓄積された老化細胞を減少させて、炎症老化および／または任意の老化関連病態を治療する方法である。インフラマソーム関連疾患を抑制し、かつ老化関連疾患を抑制する方法が提供される。Ｔｒｅｇ細胞は、ＡＣＴ状況下で使用されるインビボで強化された内因性Ｔｒｅｇ細胞またはエクスビボで操作されたＴｒｅｇ細胞であり得る。老化細胞排除のための免疫細胞は、インビボで免疫療法によって活性化され得るか、またはＡＣＴ投与を支持するためのエクスビボ刺激および増殖法によって生成され得る。本発明は、可溶性組織因子ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドまたは可溶性組織因子ドメインを含む多鎖キメラポリペプチドが、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤またはＩＬ－２受容体活性化剤と組み合わせて、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させるのに効果的であるという発見に基づく。この発見に基づいて、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Ｔｒｅｇ細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、液体培養培地が、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤と、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインがＩＬ－２受容体に結合する、単鎖キメラポリペプチドとを含む、方法が本明細書に提供される。
【0015】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインと第２の標的結合ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、可溶性組織因子ドメインと第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは、同じアミノ酸配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは、可溶性ＩＬ－２を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性ＩＬ－２は、ヒト可溶性ＩＬ－２である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは各々、配列番号１と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは各々、配列番号１と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは各々、配列番号１を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちのいずれも含まない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの１つ以上を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号３と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号３の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号４と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号４の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約５００ｎＭの単鎖キメラポリペプチドを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約５０ｎＭ～約１５０ｎＭの単鎖キメラポリペプチドを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを約１：１～約６：１のビーズ／細胞比で含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを約３：１～約５：１のビーズ／細胞比で含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む追加の単鎖キメラポリペプチドであり、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、追加の単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインと第２の標的結合ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、可溶性組織因子ドメインと第２の標的結合ドメイ
ンとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、ヒトＣＤ２８である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちのいずれも含まない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの１つ以上を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの追加の単鎖キメラポリペプチドを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約５０ｎＭ～約３００ｎＭの追加の単鎖キメラポリペプチドを含む。
ンとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、ヒトＣＤ２８である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちのいずれも含まない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの１つ以上を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの追加の単鎖キメラポリペプチドを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約５０ｎＭ～約３００ｎＭの追加の単鎖キメラポリペプチドを含む。
【0016】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は多鎖キメラポリペプチドであり、多鎖キメラポリペプチドは、（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメインおよび（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合し、第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合するか、または第１の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ３に結合する。
【0017】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、多鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３を含む。
【0018】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインと第２の標的結合ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、可溶性組織因子ドメインと第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。
【0019】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５の配列を含む。
【0020】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる。
【0021】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの可溶組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちのいずれも含まない。
【0022】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの１つ以上を含む。
【0023】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０２と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０２と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０２の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０４と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０４と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０４の配列を含む。
【0024】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、ヒトＣＤ２８である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０６と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０６と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０６の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０８と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０８と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０８の配列を含む。
【0025】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、多鎖キメラポリペプチドは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの多鎖キメラポリペプチドを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約５０ｎＭ～約３００ｎＭの多鎖キメラポリペプチドを含む。
【0026】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、ｍＴＯＲ阻害剤をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約５００ｎＭのｍＴＯＲ阻害剤を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約５０ｎＭ～約１５０ｎＭのｍＴＯＲ阻害剤を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、ｍＴＯＲ阻害剤を含まない。
【0027】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、前記期間の開始後３６時間～約６０時間毎に液体培養培地に単鎖キメラポリペプチドを定期的に添加することをさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの定期的な添加は、液体培養培地中に約１０ｎＭ～約５００ｎＭの濃度の単鎖キメラポリペプチドをもたらすように行われる。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの定期的な添加は、液体培養培地中に約５０ｎＭ～約１５０ｎＭの濃度の単鎖キメラポリペプチドをもたらすように行われる。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、前記期間の開始後約６日～約８日毎に液体培養培地にＣＤ３／ＣＤ２８結合剤を定期的に添加することをさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ある期間は、約７日間～約５６日間である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、請求項の期間は、約１５日間～約２５日間である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、培養する工程の前に、対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、培養する工程の後に、対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む。
【0028】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単離は、蛍光支援細胞選別の使用を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、末梢血または臍帯血から単離された、自己Ｔｒｅｇ細胞、ハプロタイプ一致Ｔｒｅｇ細胞、または同種異系Ｔｒｅｇ細胞である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ細胞である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、キメラ抗原受容体を含む。
【0029】
別の態様では、本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかによって生成されたＴｒｅｇ細胞の集団が本明細書に提供される。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかによって生成されたＴｒｅｇ細胞の集団のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物が本明細書に提供される。治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかによって生成されたＴｒｅｇ細胞の集団のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物のうちのいずれかの治療有効量を投与する工程を含む、方法も本明細書に提供される。治療を必要とする対象を治療する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、加齢性疾患または炎症性疾患を有すると特定または診断されている。治療を必要とする対象を治療する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、加齢性疾患は、アルツハイマー病、動脈瘤、嚢胞性線維症、膵炎における線維症、緑内障、高血圧症、特発性肺線維症、炎症性腸疾患、椎間板変性、黄斑変性、骨関節炎、２型真性糖尿病、脂肪萎縮、リポジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、白内障、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症、腎移植不全、肝線維症、骨量喪失、心筋梗塞、サルコペニア、創傷治癒、脱毛症、心筋細胞肥大、骨関節炎、パーキンソン病、加齢性肺組織弾性喪失、黄斑変性、悪液質、糸球体硬化症、肝硬変、ＮＡＦＬＤ、骨粗しょう症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、多発性硬化症、神経変性、発作、認知症、血管疾患、易感染性、慢性炎症、および腎機能障害からなる群より選択される。治療を必要とする対象を治療する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、炎症性疾患は、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病性腎症、ＣＮＳ損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、乾癬、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および気分障害からなる群より選択される。
【0030】
別の態様では、（ｉ）ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤と、（ｉｉ）第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインがＩＬ－２受容体に結合する、単鎖キメラポリペプチドと、（ｉｉｉ）ｍＴＯＲ阻害剤と、を含むキットが本明細書に提供される。本明細書に記載のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。本明細書に記載のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズである。本明細書に記載のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む追加の単鎖キメラポリペプチドであり、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、追加の単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する。本明細書に記載のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。
【0031】
本明細書に記載のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は多鎖キメラポリペプチドであり、多鎖キメラポリペプチドは、（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメインおよび（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合し、第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合するか、または第１の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ３に結合する。本明細書に記載のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、多鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。
【0032】
別の態様では、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Ｔｒｅｇ細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、液体培養培地が、ＩＬ－２受容体活性化剤と、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、追加の単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する、単鎖キメラポリペプチドとを含む、方法が本明細書に提供される。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインと第２の標的結合ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、可溶性組織因子ドメインと第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインは、配列番号５の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、ヒトＣＤ２８である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の標的結合ドメインは、配列番号６の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちのいずれも含まない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの１つ以上を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの単鎖キメラポリペプチドを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約５０ｎＭ～約３００ｎＭの単鎖キメラポリペプチドを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＬ－２受容体活性化剤は、可溶性ＩＬ－２である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性ＩＬ－２は、ヒト可溶性ＩＬ－２である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ヒト可溶性ＩＬ－２は、配列番号１と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ヒト可溶性ＩＬ－２は、配列番号１と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ヒト可溶性ＩＬ－２は、配列番号１の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１００ＩＵ／ｍＬ～約８００ＩＵ／ｍＬのヒト可溶性ＩＬ－２を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬ～約６００ＩＵ／ｍＬのヒト可溶性ＩＬ－２を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、ｍＴＯＲ阻害剤をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約５００ｎＭのｍＴＯＲ阻害剤を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約５０ｎＭ～約１５０ｎＭのｍＴＯＲ阻害剤を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、ｍＴＯＲ阻害剤を含まない。
【0033】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、前記期間の開始後３６時間～約６０時間毎に液体培養培地にＩＬ－２受容体活性化剤を定期的に添加することをさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＬ－２受容体活性化剤の定期的な添加は、液体培養培地中に約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの濃度のＩＬ－２受容体活性化剤をもたらすように行われる。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＬ－２受容体活性化剤の定期的な添加は、液体培養培地中に約５０ｎＭ～約１５０ｎＭの濃度のＩＬ－２受容体活性化剤をもたらすように行われる。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、前記期間の開始後約６日～約８日毎に液体培養培地に単鎖キメラポリペプチドを定期的に添加することをさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ある期間は、約７日間～約５６日間である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、請求項の期間は、約１５日間～約２５日間である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、培養する工程の前に、対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、培養する工程の後に、対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む。
【0034】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単離は、蛍光支援細胞選別の使用を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、末梢血または臍帯血から単離された、自己Ｔｒｅｇ細胞、ハプロタイプ一致Ｔｒｅｇ細胞、または同種異系Ｔｒｅｇ細胞である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ細胞である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、キメラ抗原受容体を含む。
【0035】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかによって生成されたＴｒｅｇ細胞の集団が本明細書に提供される。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかによって生成されたＴｒｅｇ細胞の集団のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物が本明細書に提供される。治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかによって生成されたＴｒｅｇ細胞の集団のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物のうちのいずれかの治療有効量を投与する工程を含む、方法も本明細書に提供される。本明細書に記載の治療を必要とする対象を治療する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、加齢性疾患または炎症性疾患を有すると特定または診断されている。本明細書に記載の治療を必要とする対象を治療する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、加齢性疾患は、アルツハイマー病、動脈瘤、嚢胞性線維症、膵炎における線維症、緑内障、高血圧症、特発性肺線維症、炎症性腸疾患、椎間板変性、黄斑変性、骨関節炎、２型真性糖尿病、脂肪萎縮、リポジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、白内障、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症、腎移植不全、肝線維症、骨量喪失、心筋梗塞、サルコペニア、創傷治癒、脱毛症、心筋細胞肥大、骨関節炎、パーキンソン病、加齢性肺組織弾性喪失、黄斑変性、悪液質、糸球体硬化症、肝硬変、ＮＡＦＬＤ、骨粗しょう症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、多発性硬化症、神経変性、発作、認知症、血管疾患、易感染性、慢性炎症、および腎機能障害からなる群より選択される。本明細書に記載の治療を必要とする対象を治療する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、炎症性疾患は、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病性腎症、ＣＮＳ損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、乾癬、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および気分障害からなる群より選択される。
【0036】
別の態様では、（ｉ）インターロイキン－２受容体活性化剤と、（ｉｉ）第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する、単鎖キメラポリペプチドと、（ｉｉｉ）ｍＴＯＲ阻害剤と、を含むキットが本明細書に提供される。本明細書に記載のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。
【0037】
別の態様では、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Ｔｒｅｇ細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、液体培養培地が、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤と、多鎖キメラポリペプチドであって、（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメイン、および（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合する、多鎖キメラポリペプチドとを含む、方法が本明細書に提供される。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、多鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインは、第１のキメラポリペプチド内で互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、第１のキメラポリペプチド内の第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインと一対の親和性ドメインの第１のドメインは、第１のキメラポリペプチド内で互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、第１のキメラポリペプチド内の可溶性組織因子ドメインと一対の親和性ドメインの第１のドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインの第２のドメインと第２の標的結合ドメインは、第２のキメラポリペプチド内で互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、第２のキメラポリペプチド内の一対の親和性ドメインの第２のドメインと第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは、同じ抗原に特異的に結合する。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは、異なる抗原に特異的に結合する。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインの一方または両方が抗原結合ドメインである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインの一方または両方が、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１、ＶＥＧＦ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＰＤＬ－１、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦα、ＣＤ２６、ＣＤ３６、ＵＬＢＰ２、ＣＤ３０、ＣＤ２００、ＩＧＦ－１Ｒ、ＭＵＣ４ＡＣ、ＭＵＣ５ＡＣ、Ｔｒｏｐ－２、ＣＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、Ｂ７Ｈ３、ＥＰＣＡＭ、ＢＣＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ５、ＵＬ１６結合タンパク質、ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＬＬ４、ＴＹＲＯ３、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＣＤ１２２、ＣＤ１５５、ＰＤＧＦ－ＤＤ、ＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴＧＦ－βＲＩＩ）リガンド、ＴＧＦ－βＲＩＩＩリガンド、ＤＮＡＭ－１リガンド、ＮＫｐ４６リガンド、ＮＫｐ４４リガンド、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＫｐ３０リガンド、ｓｃＭＨＣＩリガンド、ｓｃＭＨＣＩＩリガンド、ｓｃＴＣＲリガンド、ＩＬ－１受容体、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－３受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－８受容体、ＩＬ－１０受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、ＩＬ－１７受容体、ＩＬ－１８受容体、ＩＬ－２１受容体、ＰＤＧＦ－ＤＤ受容体、幹細胞因子（ＳＣＦ）受容体、幹細胞様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）受容体、ＭＩＣＡ受容体、ＭＩＣＢ受容体、ＵＬＰ１６結合タンパク質受容体、ＣＤ１５５受容体、ＣＤ１２２受容体、およびＣＤ２８受容体からなる群より選択される標的に特異的に結合する。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインの一方または両方が可溶性インターロイキンまたはサイトカインタンパク質である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性インターロイキン、サイトカイン、またはリガンドタンパク質は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＰＤＧＦ－ＤＤ、ＳＣＦ、およびＦＬＴ３Ｌからなる群より選択される。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインの一方または両方が可溶性インターロイキンまたはサイトカイン受容体である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性受容体は、可溶性ＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴＧＦ－βＲＩＩ）、可溶性ＴＧＦ－βＲＩＩＩ、可溶性ＮＫＧ２Ｄ、可溶性ＮＫｐ３０、可溶性ＮＫｐ４４、可溶性ＮＫｐ４６、可溶性ＤＮＡＭ－１、ｓｃＭＨＣＩ、ｓｃＭＨＣＩＩ、ｓｃＴＣＲ、可溶性ＣＤ１５５、または可溶性ＣＤ２８である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、１つ以上の追加の標的結合ドメインをさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、１つ以上の追加の標的結合ドメインをさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインは、ヒトＩＬ－１５受容体アルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）由来のｓｕｓｈｉドメイン、および可溶性ＩＬ－１５である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性ＩＬ－１５は、Ｄ８ＮまたはＤ８Ａアミノ酸置換を有する。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインは、バルナーゼとバルンスター（ｂａｒｎｓｔａｒ）、ＰＫＡとＡＫＡＰ、変異ＲＮａｓｅ Ｉ断片に基づくアダプター／ドッキングタグモジュール、ならびにタンパク質シンタキシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン、およびＳＮＡＰ２５の相互作用に基づくＳＮＡＲＥモジュールからなる群より選択される。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちのいずれも含まない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生
型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの１つ以上を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、多鎖キメラポリペプチドは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを約１：１～約６：１のビーズ／細胞比で含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを約３：１～約５：１のビーズ／細胞比で含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであり、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインと第２の標的結合ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、可溶性組織因子ドメインと第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、ヒトＣＤ２８である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちのいずれも含まない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの１つ以上を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの単鎖キメラポリペプチドを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約５０ｎＭ～約３００ｎＭの単鎖キメラポリペプチドを含む。
型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの１つ以上を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、多鎖キメラポリペプチドは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを約１：１～約６：１のビーズ／細胞比で含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを約３：１～約５：１のビーズ／細胞比で含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであり、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインと第２の標的結合ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、可溶性組織因子ドメインと第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、ヒトＣＤ２８である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちのいずれも含まない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの１つ以上を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの単鎖キメラポリペプチドを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約５０ｎＭ～約３００ｎＭの単鎖キメラポリペプチドを含む。
【0038】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は追加の多鎖キメラポリペプチドであり、追加の多鎖キメラポリペプチドが、（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメインおよび（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合し、第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合するか、または第１の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ３に結合する。
【0039】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、追加の多鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３を含む。
【0040】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドは、第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインと第２のキメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第２のキメラポリペプチドは、可溶性組織因子ドメインと第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。
【0041】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５の配列を含む。
【0042】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる。
【0043】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドの可溶組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちのいずれも含まない。
【0044】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの１つ以上を含む。
【0045】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、血液凝固を開始しない。
【0046】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０２と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０２と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０２の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０４と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０４と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０４の配列を含む。
【0047】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、ヒトＣＤ２８である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第２のキメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第２のキメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第２のキメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６の配列を含む。
【0048】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０６と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０６と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０６の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０８と少なくとも８０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０８と少なくとも９０％同一の配列を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドの第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０８の配列を含む。
【0049】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の多鎖キメラポリペプチドは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの追加の多鎖キメラポリペプチドを含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約５０ｎＭ～約３００ｎＭの追加の多鎖キメラポリペプチドを含む。
【0050】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、ｍＴＯＲ阻害剤をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンである。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約５００ｎＭのｍＴＯＲ阻害剤を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約５０ｎＭ～約１５０ｎＭのｍＴＯＲ阻害剤を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、前記期間の開始後３６時間～約６０時間毎に液体培養培地に多鎖キメラポリペプチドを定期的に添加することをさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、多鎖キメラポリペプチドの定期的な添加は、液体培養培地中に約１０ｎＭ～約５００ｎＭの濃度の多鎖キメラポリペプチドをもたらすように行われる。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、多鎖キメラポリペプチドの定期的な添加は、液体培養培地中に約５０ｎＭ～約１５０ｎＭの濃度の多鎖キメラポリペプチドをもたらすように行われる。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、前記期間の開始後約６日～約８日毎に液体培養培地にＣＤ３／ＣＤ２８結合剤を定期的に添加することをさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ある期間は、約７日間～約５６日間である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、請求項の期間は、約１５日間～約２５日間である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、培養する工程の前に、対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、培養する工程の後に、対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む。
【0051】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単離は、蛍光支援細胞選別の使用を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、末梢血または臍帯血から単離された、自己Ｔｒｅｇ細胞、ハプロタイプ一致Ｔｒｅｇ細胞、または同種異系Ｔｒｅｇ細胞である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ細胞である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、キメラ抗原受容体を含む。
【0052】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかによって生成されたＴｒｅｇ細胞の集団が本明細書に提供される。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかによって生成されたＴｒｅｇ細胞の集団のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物も本明細書に提供される。治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかによって生成されたＴｒｅｇ細胞の集団のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物のうちのいずれかの治療有効量を投与する工程を含む、方法が本明細書に提供される。本明細書に記載の治療を必要とする対象を治療する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、加齢性疾患または炎症性疾患を有すると特定または診断されている。本明細書に記載の治療を必要とする対象を治療する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、加齢性疾患は、アルツハイマー病、動脈瘤、嚢胞性線維症、膵炎における線維症、緑内障、高血圧症、特発性肺線維症、炎症性腸疾患、椎間板変性、黄斑変性、骨関節炎、２型真性糖尿病、脂肪萎縮、リポジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、白内障、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症、腎移植不全、肝線維症、骨量喪失、心筋梗塞、サルコペニア、創傷治癒、脱毛症、心筋細胞肥大、骨関節炎、パーキンソン病、加齢性肺組織弾性喪失、黄斑変性、悪液質、糸球体硬化症、肝硬変、ＮＡＦＬＤ、骨粗しょう症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、多発性硬化症、神経変性、発作、認知症、血管疾患、易感染性、慢性炎症、および腎機能障害からなる群より選択される。本明細書に記載の治療を必要とする対象を治療する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、炎症性疾患は、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病性腎症、ＣＮＳ損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、乾癬、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および気分障害からなる群より選択される。
【0053】
別の態様では、キットであって、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤と、多鎖キメラポリペプチドであって、（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチド、ならびに（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメインおよび（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合する、多鎖キメラポリペプチドと、ｍＴＯＲ阻害剤とを含む、キットが本明細書に提供される。本明細書に記載のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、多鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。本明細書に記載のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズである。本明細書に記載のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであり、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、追加の単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する。本明細書に記載のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。
【0054】
本明細書に記載のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は追加の多鎖キメラポリペプチドであり、追加の多鎖キメラポリペプチドが、（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメインおよび（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合し、第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合するか、または第１の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ３に結合する。
【0055】
本明細書に記載のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、追加の多鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。
【0056】
別の態様では、対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する方法であって、そのＣＤ３９発現に基づいて試料からＴｒｅｇ細胞を分離し、それにより、Ｔｒｅｇ細胞を単離することを含む、方法が本明細書に提供される。
【0057】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞を単離する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、試料と、ＣＤ３９に結合することができる抗体またはリガンドとを、ＣＤ３９を発現するＴｒｅｇ細胞への当該抗体またはリガンドの結合を可能にする条件下で混合することと、抗体またはリガンドに結合したＴｒｅｇ細胞を試料中の他の成分から分離し、それにより、Ｔｒｅｇ細胞を単離することとを含む。
【0058】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞を単離する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、マウス、ヒト化、もしくはヒト抗体もしくはその抗原結合断片であり、かつ／または抗体もしくはリガンドは、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、もしくは蛍光色素のうちの少なくとも１つで標識されているか、または粒子、ビーズ、樹脂、もしくは固体支持体に結合している。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞を単離する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、分離は、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、遠心分離、またはカラム、プレート、粒子、もしくはビーズベースの方法の使用を含む。
【0059】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞を単離する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、試料と、ＣＤ３９に結合することができるビオチン化抗体またはリガンドとを、当該抗体またはリガンドのＴｒｅｇ細胞への結合を可能にする条件下で混合することと、ストレプトアビジン被覆磁性粒子を使用してビオチン化抗体またはリガンドに結合したＴｒｅｇ細胞を捕捉することと、磁石を使用して磁性粒子に結合したＴｒｅｇ細胞を分離することと、磁石粒子に結合したＴｒｅｇ細胞を洗浄して、試料中の他の成分を除去することと、磁性粒子に結合したＴｒｅｇ細胞を磁石から溶液中に放出し、それにより、Ｔｒｅｇ細胞を単離することとをさらに含む。
【0060】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞を単離する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、新鮮または凍結された末梢血、臍帯血、末梢血単核細胞、リンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＴｒｅｇ細胞を含む試料から単離された、自己Ｔｒｅｇ細胞、ハプロタイプ一致Ｔｒｅｇ細胞、または同種異系Ｔｒｅｇ細胞である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞を単離する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞を単離する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ細胞である。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞を単離する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、キメラ抗原受容体を含む。本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞を単離する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、インビトロおよびインビボで免疫抑制性である。
【0061】
別の態様では、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって生成された単離されたＴｒｅｇ細胞の集団が本明細書に提供される。本明細書に記載の単離されたＴｒｅｇ細胞の集団のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単離されたＴｒｅｇ細胞の集団は、７０％超がＣＤ３９＋細胞である。本明細書に記載の単離されたＴｒｅｇ細胞の集団のうちのいずれかを増大させる方法であって、単離されたＴｒｅｇ細胞の増殖を可能にする条件下で、単離されたＴｒｅｇ細胞の集団を培養する工程を含む、方法も提供される。
【0062】
本明細書に記載の単離されたＴｒｅｇ細胞の集団のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物も本明細書に提供される。
【0063】
治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの治療有効量を投与する工程を含む、方法も本明細書に提供される。本明細書に記載の治療を必要とする対象を治療する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、加齢性疾患または炎症性疾患を有すると特定または診断されている。本明細書に記載の治療を必要とする対象を治療する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、加齢性疾患は、アルツハイマー病、動脈瘤、嚢胞性線維症、膵炎における線維症、緑内障、高血圧症、特発性肺線維症、炎症性腸疾患、椎間板変性、黄斑変性、骨関節炎、２型真性糖尿病、脂肪萎縮、リポジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、白内障、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症、腎移植不全、肝線維症、骨量喪失、心筋梗塞、サルコペニア、創傷治癒、脱毛症、心筋細胞肥大、骨関節炎、パーキンソン病、加齢性肺組織弾性喪失、黄斑変性、悪液質、糸球体硬化症、肝硬変、ＮＡＦＬＤ、骨粗しょう症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、多発性硬化症、神経変性、発作、認知症、血管疾患、易感染性、慢性炎症、および腎機能障害からなる群より選択される。本明細書に記載の治療を必要とする対象を治療する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、炎症性疾患は、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病性腎症、ＣＮＳ損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、乾癬、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および気分障害からなる群より選択される。
【0064】
本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、元来２つの異なる源（例えば、同じ種または異なる種由来の、例えば、２つの異なる天然に存在するタンパク質）に由来するアミノ酸配列（例えば、ドメイン）を含むポリペプチドを指す。例えば、キメラポリペプチドは、少なくとも２つの異なる天然に存在するヒトタンパク質由来のドメインを含み得る。いくつかの例では、キメラポリペプチドは、合成配列であるドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）および天然に存在するタンパク質（例えば、天然に存在するヒトタンパク質）に由来するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、合成配列である少なくとも２つの異なるドメイン（例えば、２つの異なるｓｃＦｖ）を含み得る。
【0065】
「抗原結合ドメイン」とは、１つ以上の異なる抗原に特異的に結合することができる１つ以上のタンパク質ドメイン（例えば、単一のポリペプチド由来のアミノ酸から形成されるか、または２つ以上のポリペプチド（例えば、同じまたは異なるポリペプチド）由来のアミノ酸から形成される）である。いくつかの例では、抗原結合ドメインは、天然に存在する抗体と同様の特異性および親和性で抗原またはエピトープに結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体またはその断片であり得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、代替足場を含み得る。抗原結合ドメインの非限定的な例が本明細書に記載されている。抗原結合ドメインの追加の例が当該技術分野で既知である。
【0066】
「可溶性組織因子ドメイン」とは、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを欠く野生型哺乳類組織因子タンパク質（例えば、野生型ヒト組織因子タンパク質）のセグメントと少なくとも７０％の同一性（例えば、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％同一性）を有するポリペプチドを指す。可溶性組織因子ドメインの非限定的な例が本明細書に記載されている。
【0067】
「抗体」という用語は、本明細書でその最も広い意味で使用され、抗原またはエピトープに特異的に結合する１つ以上の抗原結合ドメインを含むある特定のタイプの免疫グロブリン分子を含む。抗体には、具体的には、例えば、インタクトな抗体（例えば、インタクトな免疫グロブリン）、抗体断片、および多重特異性抗体が含まれる。抗原結合ドメインの一例は、ＶＨ－ＶＬ二量体によって形成された抗原結合ドメインである。抗体の追加の例が本明細書に記載されている。抗体の追加の例は当該技術分野で既知である。
【0068】
「親和性」とは、抗原結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原またはエピトープ）との間の非共有相互作用の合計の強さを指す。別途指示されない限り、本明細書で使用される場合、「親和性」とは、抗原結合ドメインのメンバーと抗原またはエピトープとの間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離平衡定数（ＫＤ）で表され得る。解離平衡定数に寄与する動力学的成分は、以下でより詳細に記載される。親和性は、本明細書に記載の方法を含む、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定され得る。親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））または生体層干渉法（例えば、ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標））を使用して決定され得る。抗原結合ドメインおよびその対応する抗原またはエピトープに対する親和性を決定するための追加の方法は、当該技術分野で既知である。
【0069】
本明細書で使用される「単鎖ポリペプチド」とは、単一のタンパク質鎖を指す。
【0070】
本明細書で使用される「多鎖ポリペプチド」とは、２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のタンパク質鎖（例えば、少なくとも第１のキメラポリペプチドおよび第２のポリペプチド）を含むポリペプチドを指し、２つ以上のタンパク質鎖が非共有結合を介して結合して、四次構造を形成する。
【0071】
「エピトープ」という用語は、抗原結合ドメインに特異的に結合する抗原の一部を意味する。エピトープは、例えば、表面接触可能アミノ酸残基および／または糖側鎖からなり得、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有し得る。立体配座エピトープおよび非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合が失われる可能性があるが、後者への結合が失われる可能性がないという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含み得る。抗原結合ドメインが結合するエピトープを特定するための方法は、当該技術分野で既知である。
【0072】
「治療」という用語は、障害の少なくとも１つの症状を改善することを意味する。いくつかの例では、治療される障害はがんであり、がんの少なくとも１つの症状を改善することは、異常な増殖、遺伝子発現、シグナル伝達、翻訳、および／または因子の分泌を減少させることを含む。一般に、治療方法は、かかる治療を必要とするか、またはかかる治療を必要とすると決定された対象に、治療有効量の障害の少なくとも１つの症状を軽減する組成物を投与することを含む。
【0073】
「ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤」という用語は、哺乳類細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞などのＴ細胞）の表面上のＣＤ３およびＣＤ２８の両方に特異的に結合し、かつその哺乳類細胞に下流シグナル伝達を誘導する薬剤を意味する。ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤の非限定的な例は、本明細書に記載されている。
【0074】
「ＩＬ－２受容体活性化剤」という用語は、哺乳類細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞などのＴ細胞）の表面に存在するＩＬ－２受容体に特異的に結合し、かつその哺乳類細胞に下流シグナル伝達を誘導する薬剤を意味する。ＩＬ－２受容体活性化剤の非限定的な例は、本明細書に記載されている。
【0075】
「ＩｇＧ１抗体構築物」という用語は、可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインうちののいずれか）に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、少なくとも１つのＩｇＧ１ Ｆｃドメインとを含む単鎖ポリペプチドまたは多鎖ポリペプチドを意味する。ＩｇＧ１抗体構築物の非限定的な例は、本明細書に記載されている。
【0076】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明で使用するために本明細書に記載されており、当該技術分野で周知である他の好適な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。本明細書に記載のすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書が制御するものとする。
【0077】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0078】
【図1】（１）２ｔ２、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、およびラパマイシン、または（２）組換えヒトＩＬ－２、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、およびラパマイシンのいずれかを使用したＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増大を示す図である。
【図2】図２Ａ～図２Ｉは、（１）２ｔ２、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、およびラパマイシン、または（２）組換えヒトＩＬ－２、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、およびラパマイシンでＴｒｅｇ細胞を刺激した後のＨｅｌｉｏｓ＋、ＣＴＬＡ－４＋、ＣＤ３９＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１０３＋、ＣＤ６９＋、ＰＤ１＋、およびＣＤ４９ｂ＋マーカーの増加を示す図である。
【図3】図３Ａ～図３Ｄは、（１）２ｔ２、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、およびラパマイシン、または（２）組換えヒトＩＬ－２、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、およびラパマイシンでヒトＴｒｅｇ細胞を活性化した際のグルコース代謝レベルを示す図である。図３Ａは、Ｔｒｅｇ細胞の解糖レベルを示す。図３Ｂは、Ｔｒｅｇ細胞の解糖能レベルを示す。図３Ｃは、Ｔｒｅｇ細胞の解糖予備能レベルを示す。図３Ｄは、Ｔｒｅｇ細胞の非解糖酸性化レベルを示す。
【図4】（１）２ｔ２、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、およびラパマイシン、または（２）組換えヒトＩＬ－２、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、およびラパマイシンで事前に刺激したＴｒｅｇ細胞による自己レスポンダーＴ細胞の抑制を示す図である。
【図5】Ｔｒｅｇ細胞を（１）ラパマイシンの存在下もしくは不在下での２ｔ２およびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、または（２）ラパマイシンの存在下もしくは不在下での組換えヒトＩＬ－２およびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズのいずれかで事前に刺激したレスポンダーＴ細胞抑制アッセイにおけるＴｒｅｇ細胞によるＩＬ－１０分泌レベルを示す図である。
【図6】図６Ａ～図６Ｂは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／ＩＬ１５Ｄ８Ｎ変異体（３ｔ１５＊）および抗ＣＤ２８ｓｃＦｖ／ＩＬ１５ＲαＳｕ（２８ｓ）融合タンパク質を含む生成された融合タンパク質の例示的な図を示す。
【図7】イムノアフィニティークロマトグラフィーによる抗ＴＦ抗体アフィニティーカラムからの３ｔ１５＊－２８ｓ精製溶出を示すグラフである。
【図8】３ｔ１５＊－２８ｓのサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。
【図9】抗ＴＦ抗体アフィニティークロマトグラフィーで精製した３ｔ１５＊－２８ｓのＳＤＳゲルを示す。レーン１：３ｔ１５＊－２８ｓ、レーン２：ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ ２ Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ（左側の数字はキロダルトン単位の分子量を示す）。
【図11】２ｔ２および３ｔ１５＊－２８ｓを含む培地中でのＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の増大を示すグラフである。
【図12】抗ＴＦ抗体の存在下または不在下で２ｔ２および３ｔ１５＊－２８ｓを含む培地中でインキュベートした後のヒト免疫細胞の増殖レベルを示すグラフである。
【図13】図１３Ａは、異なる精製スキームを用いて単離したＣＤ３９＋制御性Ｔ細胞の純度を示すフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図１３Ｂは、抗ＣＤ３９抗体試薬を使用して単離したＣＤ３９＋制御性Ｔ細胞の純度を示すフローサイトメトリーヒストグラムを示す。
【図14】異なる方法を用いて単離した制御性Ｔ細胞とインキュベートした後のレスポンダーＴ細胞増殖レベルを表す棒グラフを示す。
【図15】異なる方法を用いて単離した制御性Ｔ細胞とインキュベートした後のレスポンダーＴ細胞増殖（ＩＬ－１０レベルによって評価したもの）を示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【0079】
詳細な説明
Ｔｒｅｇ細胞（例えば、本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞のうちのいずれか）の増殖を刺激するまたは増加させる方法、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して生成されたＴｒｅｇ細胞の集団、それらのＴｒｅｇ細胞の集団のうちのいずれかを含む組成物、およびそれらのＴｒｅｇ細胞の集団または組成物のうちのいずれかを投与することを含む対象を治療する方法が本明細書に提供される。
Ｔｒｅｇ細胞（例えば、本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞のうちのいずれか）の増殖を刺激するまたは増加させる方法、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して生成されたＴｒｅｇ細胞の集団、それらのＴｒｅｇ細胞の集団のうちのいずれかを含む組成物、およびそれらのＴｒｅｇ細胞の集団または組成物のうちのいずれかを投与することを含む対象を治療する方法が本明細書に提供される。
【0080】
組織因子
ヒト組織因子は、以下の３つのドメイン：（１）２１９アミノ酸Ｎ末端細胞外ドメイン（残基１～２１９）、（２）２２アミノ酸膜貫通ドメイン（残基２２０～２４２）、および（３）２１アミノ酸細胞質Ｃ末端尾部（残基２４２～２６３）（（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子番号：Ｐ１３７２６）を含む２６３アミノ酸膜貫通タンパク質である。細胞質尾部は、Ｓｅｒ２５３およびＳｅｒ２５８に２つのリン酸化部位を含み、Ｃｙｓ２４５に１つのＳ－パルミトイル化部位を含む。細胞質ドメインの欠失または変異が組織因子凝固活性に影響を及ぼすことは見出されなかった。組織因子は、Ｃｙｓ２４５のタンパク質の細胞内ドメイン内に１つのＳ－パルミトイル化部位を有する。Ｃｙｓ２４５は、細胞内ドメインのアミノ酸末端に位置し、膜表面の近くにある。組織因子膜貫通ドメインは、単一膜貫通α－ヘリックスで構成されている。
ヒト組織因子は、以下の３つのドメイン：（１）２１９アミノ酸Ｎ末端細胞外ドメイン（残基１～２１９）、（２）２２アミノ酸膜貫通ドメイン（残基２２０～２４２）、および（３）２１アミノ酸細胞質Ｃ末端尾部（残基２４２～２６３）（（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子番号：Ｐ１３７２６）を含む２６３アミノ酸膜貫通タンパク質である。細胞質尾部は、Ｓｅｒ２５３およびＳｅｒ２５８に２つのリン酸化部位を含み、Ｃｙｓ２４５に１つのＳ－パルミトイル化部位を含む。細胞質ドメインの欠失または変異が組織因子凝固活性に影響を及ぼすことは見出されなかった。組織因子は、Ｃｙｓ２４５のタンパク質の細胞内ドメイン内に１つのＳ－パルミトイル化部位を有する。Ｃｙｓ２４５は、細胞内ドメインのアミノ酸末端に位置し、膜表面の近くにある。組織因子膜貫通ドメインは、単一膜貫通α－ヘリックスで構成されている。
【0081】
２つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインで構成されている組織因子の細胞外ドメインは、６アミノ酸リンカーを介して膜貫通ドメインに連結されている。このリンカーは、組織因子細胞外ドメインをその膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインから分離するために立体配座可動性を提供する。各組織因子フィブロネクチンＩＩＩ型モジュールは、２つの重複βシートで構成されており、上部のシートドメインには３つの逆平行βストランドが含まれており、下部のシートには４つのβストランドが含まれている。βストランドは、ストランドβＡとβＢ、βＣとβＤ、およびβＥとβＦの間のβループによって連結されており、これらのすべての立体配座が２つのモジュール内で保存されている。βストランドを連結する３つの短いα－ヘリックスセグメントが存在する。組織因子の特有の特徴は、フィブロネクチンスーパーファミリーの共通要素ではないストランドβ１０とストランドβ１１との間の１７アミノ酸β－ヘアピンである。Ｎ末端ドメインには、β６Ｆとβ７Ｇとの間に１２アミノ酸ループも含まれており、これは、Ｃ末端ドメインには存在せず、組織因子に特有のものである。かかるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン構造は、免疫グロブリン様タンパク質ファミリー折り畳みの特徴であり、多種多様な細胞外タンパク質間で保存されている。
【0082】
チモーゲンＦＶＩＩは、それが組織に結合して活性組織因子－ＦＶＩＩａ複合体を形成すると、タンパク質限定分解によってＦＶＩＩａに迅速に変換される。およそ０．１ｎＭ（血漿ＦＶＩＩの１％）の濃度で酵素として循環するＦＶＩＩａも、組織因子に直接結合することができる。組織因子－ＦＶＩＩａ複合体上の組織因子とＦＶＩＩａの間のアロステリック相互作用は、ＦＶＩＩａの酵素活性を大幅に増加させ、小さい発色性ペプチジル基質の加水分解速度をおよそ２０～１００倍増加させ、天然高分子基質ＦＩＸおよびＦＸの活性化速度をほぼ１００万倍増加させる。組織因子への結合時のＦＶＩＩａの活性部位のアロステリック活性化と協調して、リン脂質二重層上での組織因子－ＦＶＩＩａ複合体の形成（すなわち、膜表面上のホスファチジル－Ｌ－セリンの曝露時）は、Ｃａ２＋依存的様式でＦＩＸまたはＦＸの活性化速度をさらに１，０００倍増加させる。遊離ＦＶＩＩａと比較した組織因子－ＦＶＩＩａ－リン脂質複合体によるＦＸ活性化のおよそ１００万倍の全体的な増加は、凝固カスケードの臨界調節点である。
【0083】
ＦＶＩＩは、約５０ｋＤａの単鎖ポリペプチドであり、４０６個のアミノ酸残基からなり、Ｎ末端γ－カルボキシグルタミン酸リッチ（ＧＬＡ）ドメイン、２つの上皮成長因子様ドメイン（ＥＧＦ１およびＥＦＧ２）、およびＣ末端セリンプロテアーゼドメインを有する。ＦＶＩＩは、ＥＧＦ２とプロテアーゼドメインとの間の短いリンカー領域におけるＩｌｅ－１５４－Ａｒｇ１５２結合の特異的タンパク質分解切断によってＦＶＩＩａに活性化される。この切断により、軽鎖および重鎖がＣｙｓ１３５およびＣｙｓ２６２の単一ジスルフィド結合によって一緒に保持されるようになる。ＦＶＩＩａは、そのＮ末端ＧＬＡドメインを介してＣａ２＋依存的様式でリン脂質膜に結合する。ＧＬＡドメインのすぐＣ末端側に、芳香族スタックおよび２つのＥＧＦドメインが存在する。芳香族スタックは、ＧＬＡドメインを、単一のＣａ２＋イオンに結合するＥＧＦ１ドメインに連結する。このＣａ２＋結合部位の占有により、ＦＶＩＩａアミド分解活性および組織因子会合が増加する。触媒トライアドは、Ｈｉｓ１９３、Ａｓｐ２４２、およびＳｅｒ３４４からなり、ＦＶＩＩａプロテアーゼドメイン内での単一のＣａ２＋イオンの結合は、その触媒活性に不可欠である。ＦＶＩＩのＦＶＩＩａへのタンパク質分解活性は、Ｉｌｅ１５３で新たに形成されたアミノ末端を解放して、折り返し、活性化ポケットに挿入されて、Ａｓｐ３４３のカルボン酸塩と塩橋を形成して、オキシアニオンホールを生成する。この塩橋の形成は、ＦＶＩＩａ活性に不可欠である。しかしながら、オキシアニオンホールの形成は、タンパク質分解活性化時に遊離ＦＶＩＩａでは生じない。結果として、ＦＶＩＩａは、血漿プロテアーゼ阻害剤によってほとんど認識されないチモーゲン様状態で循環し、それがおよそ９０分の半減期で循環することを可能にする。
【0084】
膜表面上でのＦＶＩＩａ活性部位の組織因子媒介性位置付けは、同族基質に対するＦＶＩＩａに重要である。遊離ＦＶＩＩａは、その活性部位が膜表面の約８０Å上に位置付けられた膜に結合すると、安定した拡張構造をとる。ＦＶＩＩａが組織因子に結合すると、ＦＶａ活性部位は、膜に約６Å近づいて再位置付けされる。この調節は、ＦＶＩＩａ触媒トライアドの標的基質切断部位との適切な整列を助け得る。ＧＬＡドメインレスＦＶＩＩａを使用して、活性部位が依然として膜上から同様の距離で位置付けられたことが示されており、組織因子がＦＶＩＩａ－膜相互作用の不在下でさえもＦＶＩＩａ活性部位位置付けを完全に支援することができることを示す。追加のデータは、組織因子細胞外ドメインが何らかの方法で膜表面に繋留されている限り、組織因子が完全なＦＶＩＩａタンパク質分解活性を支援することを示した。しかしながら、ＦＶＩＩａの活性部位を膜表面から８０Å超えて上昇させることにより、組織因子－ＦＶＩＩａ複合体がＦＸを活性化する能力が大幅に低下したが、組織因子－ＦＶＩＩａアミド分解活性は低下しなかった。
【0085】
アラニンスキャニング変異誘発は、ＦＶＩＩａとの相互作用のための組織因子細胞外ドメインにおける特定のアミノ酸側鎖の役割を評価するために使用されている（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３（４７）：１４００３－１４０１０，１９９４、Ｓｃｈｕｌｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９（３０）：１９３９９－１９４０３，１９９４）。アラニン置換は、アラニン置換がＦＶＩＩａ結合に対して５～１０倍低い親和性を引き起こす限定された数の残基位置を特定した。これらの残基側鎖の大半が、高分子リガンド相互作用と調和して、結晶構造における溶媒に十分に曝露されることが見出された。ＦＶＩＩａリガンド結合部位は、２つのモジュール間の境界の広範な領域にわたって位置する。Ｃ－モジュールにおいて、突出したＢ－Ｃループ上に位置する残基Ａｒｇ１３５およびＰｈｅ１４０は、ＦＶＩＩａとの独立した接触を提供する。Ｌｅｕ１３３は、指様の構造の基部に位置し、２つのモジュール間の隙間にパッキングされている。これにより、Ｌｙｓ２０、Ｔｈｒ６０、Ａｓｐ５８、およびＩｌｅ２２からなる重要な結合残基の主要なクラスターに連続性が提供される。Ｔｈｒ６０は、部分的にのみ溶媒に曝露されており、リガンドと有意に接触するのではなく、局所的な構造的役割を果たし得る。結合部位は、Ｇｌｕ２４およびＧｌｎ１１０、ならびに潜在的により遠位の残基Ｖａｌ２０７を含むモジュール間角度の凹面側に伸びている。結合領域は、Ａｓｐ５８から、Ｌｙｓ４８、Ｌｙｓ４６、Ｇｌｎ３７、Ａｓｐ４４、およびＴｒｐ４５によって形成された凸面領域に伸びている。Ｔｒｐ４５およびＡｓｐ４４は、ＦＶＩＩａと独立して相互作用せず、Ｔｒｐ４５位での変異効果が、隣接するＡｓｐ４４およびＧｌｎ３７側鎖の局所的パッキングのためのこの側鎖の構造的重要性を反映し得ることを示す。相互作用領域は、Ｎ－モジュール内に疎水性クラスターの一部を形成する２つの表面露出芳香族残基Ｐｈｅ７６およびＴｙｒ７８をさらに含む。
【0086】
組織因子－ＦＶＩＩａの既知の生理学的基質は、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、およびＦＸ、ならびにある特定のプロテイナーゼ活性化受容体である。変異分析により、変異すると、小さいペプチジル基質に対する完全なＦＶＩＩａアミド分解活性を支援するが、高分子基質（すなわち、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、およびＦＸ）の活性化を支援する能力を欠くいくつかの残基が特定されている（Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７（３１）：２２２０６－２２２１０，１９９２、Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７（９）：６３７５－６３８１，１９９２、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１（３６）：２１７５２－２１７５７，１９９６、Ｋｉｒｃｈｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（２５）：７３８０－７３８７，２０００）。残基１５９～１６５の組織因子ループ領域、およびこの可動性ループ内のまたはそれに隣接する残基が、組織因子－ＦＶＩＩａ複合体のタンパク質分解活性に不可欠であることが示されている。これは、ＦＶＩＩａ活性部位からかなり離れた組織因子の提案された基質結合エキソサイト領域を定義する。グリシン残基をわずかによりかさばったアラニン残基で置換することにより、組織因子－ＦＶＩＩａのタンパク質分解活性が著しく損なわれる。これは、グリシンによってもたらされる可動性が組織因子高分子基質認識のための残基１５９～１６５のループに不可欠であることを示唆する。
【0087】
残基Ｌｙｓ１６５およびＬｙｓ１６６が基質認識および結合に重要であることも実証されている。これらの残基のいずれかをアラニンに変異させることにより、組織因子補因子機能が大幅に低下する。Ｌｙｓ１６５とＬｙｓ１６６は互いに外方に向いており、Ｌｙｓ１６５は、大半の組織因子－ＦＶＩＩａ構造内でＦＶＩＩａの方を指し、Ｌｙｓ１６６は、結晶構造内の基質結合エキソサイト領域を指している。ＦＶＩＩａのＬｙｓ１６５とＦＶＩＩａのＧｌａ３５との間の推定塩橋形成は、組織因子のＦＶＩＩａのＧＬＡドメインとの相互作用が基質認識を調節するという概念を支持するであろう。これらの結果は、組織因子外部ドメインのＣ末端部分が、ＦＩＸおよびＦＸのＧＬＡドメイン、隣接する可能性のあるＥＧＦ１ドメインと直接相互作用し、ＦＶＩＩａ ＧＬＡドメインの存在がこれらの相互作用を直接または間接的のいずれかで調節し得ることを示唆する。
【0088】
多鎖キメラポリペプチド
細胞活性化剤の非限定的な例は、多鎖キメラポリペプチドであり、多鎖キメラポリペプチドは、（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメインおよび（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合している。
細胞活性化剤の非限定的な例は、多鎖キメラポリペプチドであり、多鎖キメラポリペプチドは、（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメインおよび（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合している。
【0089】
本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の第１の標的結合ドメインのうちのいずれか）と可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）は、第１のキメラポリペプチド内で互いに直接隣接している。本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、第１のキメラポリペプチド内の第１の標的結合ドメイン（本明細書に記載の例示的な第１の標的結合ドメインのうちのいずれか）と可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）との間にリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。
【0090】
本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）と一対の親和性ドメインの第１のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの例示的な第１のドメインのうちのいずれか）は、第１のキメラポリペプチド内で互いに直接隣接している。本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、第１のキメラポリペプチド内の可溶性組織因子ドメイン（本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）と一対の親和性ドメインの第１のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの例示的な第１のドメインのうちのいずれか）との間にリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。
【0091】
本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインの第２のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの例示的な第２のドメインのうちのいずれか）と第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の標的結合ドメインのうちのいずれか）は、第２のキメラポリペプチド内で互いに直接隣接している。本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、第２のキメラポリペプチド内の一対の親和性ドメインの第２のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの例示的な第２のドメインのうちのいずれか）と第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の標的結合ドメインのうちのいずれか）との間にリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。
【0092】
本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）および第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）の一方または両方が、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１、ＶＥＧＦ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＰＤＬ－１、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦα、ＣＤ２６、ＣＤ３６、ＵＬＢＰ２、ＣＤ３０、ＣＤ２００、ＩＧＦ－１Ｒ、ＭＵＣ４ＡＣ、ＭＵＣ５ＡＣ、Ｔｒｏｐ－２、ＣＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、Ｂ７Ｈ３、ＥＰＣＡＭ、ＢＣＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ５、ＵＬ１６結合タンパク質、ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＬＬ４、ＴＹＲＯ３、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＣＤ１２２、ＣＤ１５５、ＰＤＧＦ－ＤＤ、ＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴＧＦ－βＲＩＩ）リガンド、ＴＧＦ－βＲＩＩＩリガンド、ＤＮＡＭ１リガンド、ＮＫｐ４６リガンド、ＮＫｐ４４リガンド、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＫｐ３０リガンド、ｓｃＭＨＣＩリガンド、ｓｃＭＨＣＩＩリガンド、ｓｃＴＣＲリガンド、ＩＬ－１受容体、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－３受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－８受容体、ＩＬ－１０受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、ＩＬ－１７受容体、ＩＬ－１８受容体、ＩＬ－２１受容体、ＰＤＧＦ－ＤＤ受容体、幹細胞因子（ＳＣＦ）受容体、幹細胞様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）受容体、ＭＩＣＡ受容体、ＭＩＣＢ受容体、ＵＬＰ１６結合タンパク質受容体、ＣＤ１５５受容体、ＣＤ１２２受容体、およびＣＤ２８受容体からなる群より選択される標的に特異的に結合する。
【0093】
本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）および第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）の一方または両方が、可溶性インターロイキンまたはサイトカインタンパク質である。可溶性インターロイキンタンパク質および可溶性サイトカインタンパク質の非限定的な例には、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＰＤＧＦ－ＤＤ、およびＳＣＦが挙げられる。
【0094】
本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）の一方または両方が、可溶性インターロイキンまたはサイトカイン受容体である。可溶性インターロイキン受容体および可溶性サイトカイン受容体の非限定的な例には、可溶性ＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴＧＦ－βＲＩＩ）、可溶性ＴＧＦ－βＲＩＩＩ、可溶性ＮＫＧ２Ｄ、可溶性ＮＫＰ３０、可溶性ＮＫｐ４４、可溶性ＮＫｐ４６、可溶性ＤＮＡＭ－１、ｓｃＭＨＣＩ、ｓｃＭＨＣＩＩ、ｓｃＴＣＲ、可溶性ＣＤ１５５、可溶性ＣＤ１２２、可溶性ＣＤ３、または可溶性ＣＤ２８が挙げられる。
【0095】
本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインの一方または両方が、可溶性インターロイキンまたはサイトカイン受容体である。本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性受容体は、可溶性ＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴＧＦ－βＲＩＩ）、可溶性ＴＧＦ－βＲＩＩＩ、可溶性ＴＮＦα受容体、可溶性ＩＬ－４受容体、または可溶性ＩＬ－１０受容体である。
【0096】
可溶性組織因子ドメイン
いくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、シグナル配列、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを欠く野生型組織因子ポリペプチドであり得る。いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、組織因子変異体であり得、野生型組織因子ポリペプチドが、シグナル配列、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを欠き、選択されたアミノ酸でさらに修飾されている。いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインであり得る。いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性マウス組織因子ドメインであり得る。いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性ラット組織因子ドメインであり得る。可溶性ヒト組織因子ドメイン、可溶性マウス組織因子ドメイン、可溶性ラット組織因子ドメイン、および変異体可溶性組織因子ドメインの非限定的な例が以下に示される。
いくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、シグナル配列、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを欠く野生型組織因子ポリペプチドであり得る。いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、組織因子変異体であり得、野生型組織因子ポリペプチドが、シグナル配列、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを欠き、選択されたアミノ酸でさらに修飾されている。いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインであり得る。いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性マウス組織因子ドメインであり得る。いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性ラット組織因子ドメインであり得る。可溶性ヒト組織因子ドメイン、可溶性マウス組織因子ドメイン、可溶性ラット組織因子ドメイン、および変異体可溶性組織因子ドメインの非限定的な例が以下に示される。
【0097】
例示的な可溶性ヒト組織因子ドメイン（配列番号２）
ＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＫＴＩＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＤＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＲＲＮＮＴＦＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥ
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【0098】
可溶性ヒト組織因子ドメインをコードする例示的な核酸（配列番号１３）
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【0099】
例示的な可溶性マウス組織因子ドメイン（配列番号１４）
ａｇｉｐｅｋａｆｎｌｔｗｉｓｔｄｆｋｔｉｌｅｗｑｐｋｐｔｎｙｔｙｔｖｑｉｓｄｒｓｒｎｗｋｎｋｃｆｓｔｔｄｔｅｃｄｌｔｄｅｉｖｋｄｖｔｗａｙｅａｋｖｌｓｖｐｒｒｎｓｖｈｇｄｇｄｑｌｖｉｈｇｅｅｐｐｆｔｎａｐｋｆｌｐｙｒｄｔｎｌｇｑｐｖｉｑｑｆｅｑｄｇｒｋｌｎｖｖｖｋｄｓｌｔｌｖｒｋｎｇｔｆｌｔｌｒｑｖｆｇｋｄｌｇｙｉｉｔｙｒｋｇｓｓｔｇｋｋｔｎｉｔｎｔｎｅｆｓｉｄｖｅｅｇｖｓｙｃｆｆｖｑａｍｉｆｓｒｋｔｎｑｎｓｐｇｓｓｔｖｃｔｅｑｗｋｓｆｌｇｅ
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【0100】
例示的な可溶性ラット組織因子ドメイン（配列番号１５）
Ａｇｔｐｐｇｋａｆｎｌｔｗｉｓｔｄｆｋｔｉｌｅｗｑｐｋｐｔｎｙｔｙｔｖｑｉｓｄｒｓｒｎｗｋｙｋｃｔｇｔｔｄｔｅｃｄｌｔｄｅｉｖｋｄｖｎｗｔｙｅａｒｖｌｓｖｐｗｒｎｓｔｈｇｋｅｔｌｆｇｔｈｇｅｅｐｐｆｔｎａｒｋｆｌｐｙｒｄｔｋｉｇｑｐｖｉｑｋｙｅｑｇｇｔｋｌｋｖｔｖｋｄｓｆｔｌｖｒｋｎｇｔｆｌｔｌｒｑｖｆｇｎｄｌｇｙｉｌｔｙｒｋｄｓｓｔｇｒｋｔｎｔｔｈｔｎｅｆｌｉｄｖｅｋｇｖｓｙｃｆｆａｑａｖｉｆｓｒｋｔｎｈｋｓｐｅｓｉｔｋｃｔｅｑｗｋｓｖｌｇｅ
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【0101】
例示的な変異体可溶性ヒト組織因子ドメイン（配列番号１６）
ＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＡＴＡＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＡＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＡＲＮＮＴＡＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥ
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【0102】
例示的な変異体可溶性ヒト組織因子ドメイン（配列番号１７）
ＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＡＴＡＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＡＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＡＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＡＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＡＲＮＮＴＡＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥ
ＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＡＴＡＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＡＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＡＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＡＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＡＲＮＮＴＡＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥ
【0103】
いくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、配列番号２、１４、１５、１６、または１７と少なくとも７０％同一、少なくとも７２％同一、少なくとも７４％同一、少なくとも７６％同一、少なくとも７８％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、１～２０個のアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸）がそのＮ末端から除去された、および／または１～２０個のアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸）がそのＣ末端から除去された、配列番号２、１４、１５、１６、または１７の配列を含み得る。
【0104】
当該技術分野で理解され得るように、当業者であれば、異なる哺乳類種間で保存されているアミノ酸の変異がタンパク質の活性および／または構造的安定性を低下させる可能性が高い一方で、異なる哺乳類種間で保存されていないアミノ酸の変異がタンパク質の活性および／または構造的安定性を低下させる可能性が低いことを理解するであろう。
【0105】
いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、第ＶＩＩａ因子に結合することができない。いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、不活性第Ｘ因子を第Ｘａ因子に変換しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれも、哺乳類における血液凝固を刺激しない。
【0106】
いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性マウス組織因子ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性ラット組織因子ドメインであり得る。
【0107】
いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、または７つ）を含まない。
【0108】
いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちのいずれも含まない。
【0109】
いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの１つ以上を含む。
【0110】
いくつかの実施形態では、変異体可溶性組織因子は、配列番号１６または配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
【0111】
いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、配列番号１３と少なくとも７０％同一、少なくとも７２％同一、少なくとも７４％同一、少なくとも７６％同一、少なくとも７８％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一の配列を含む核酸によってコードされ得る。
【0112】
いくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、約２０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約２０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約２０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約２０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約２０アミノ酸～約２００アミノ酸、約２０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１００アミノ酸、約２０アミノ酸～約９５アミノ酸、約２０アミノ酸～約９０アミノ酸、約２０アミノ酸～約８５アミノ酸、約２０アミノ酸～約８０アミノ酸、約２０アミノ酸～約７５アミノ酸、約２０アミノ酸～約７０アミノ酸、約２０アミノ酸～約６０アミノ酸、約２０アミノ酸～約５０アミノ酸、約２０アミノ酸～約４０アミノ酸、約２０アミノ酸～約３０アミノ酸、約３０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約３０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約３０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約３０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約３０アミノ酸～約２００アミノ酸、約３０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１００アミノ酸、約３０アミノ酸～約９５アミノ酸、約３０アミノ酸～約９０アミノ酸、約３０アミノ酸～約８５アミノ酸、約３０アミノ酸～約８０アミノ酸、約３０アミノ酸～約７５アミノ酸、約３０アミノ酸～約７０アミノ酸、約３０アミノ酸～約６０アミノ酸、約３０アミノ酸～約５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約４０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約４０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約４０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約４０アミノ酸～約２００アミノ酸、約４０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１００アミノ酸、約４０アミノ酸～約９５アミノ酸、約４０アミノ酸～約９０アミノ酸、約４０アミノ酸～約８５アミノ酸、約４０アミノ酸～約８０アミノ酸、約４０アミノ酸～約７５アミノ酸、約４０アミノ酸～約７０アミノ酸、約４０アミノ酸～約６０アミノ酸、約４０アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約５０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約５０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約５０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約５０アミノ酸～約２００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１００アミノ酸、約５０アミノ酸～約９５アミノ酸、約５０アミノ酸～約９０アミノ酸、約５０アミノ酸～約８５アミノ酸、約５０アミノ酸～約８０アミノ酸、約５０アミノ酸～約７５アミノ酸、約５０アミノ酸～約７０アミノ酸、約５０アミノ酸～約６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約６０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約６０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約６０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約６０アミノ酸～約２００アミノ酸、約６０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１００アミノ酸、約６０アミノ酸～約９５アミノ酸、約６０アミノ酸～約９０アミノ酸、約６０アミノ酸～約８５アミノ酸、約６０アミノ酸～約８０アミノ酸、約６０アミノ酸～約７５アミノ酸、約６０アミノ酸～約７０アミノ酸、約７０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約７０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約７０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約７０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約７０アミノ酸～約２００アミノ酸、約７０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１００アミノ酸、約７０アミノ酸～約９５アミノ酸、約７０アミノ酸～約９０アミノ酸、約７０アミノ酸～約８５アミノ酸、約７０アミノ酸～約８０アミノ酸、約８０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約８０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約８０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約８０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約８０アミノ酸～約２００アミノ酸、約８０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１００アミノ酸、約８０アミノ酸～約９５アミノ酸、約８０アミノ酸～約９０アミノ酸、約９０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約９０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約９０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約９０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約９０アミノ酸～約２００アミノ酸、約９０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１００アミノ酸、約１００アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１００アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１００アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１００アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１００アミノ酸～約２００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１２５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１１５ア
ミノ酸～約１８０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１５５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１５５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１６０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１６０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１６５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１６５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１７０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１７０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１７５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１７５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１７５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１７５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１７５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１７５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１７５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１７５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１７５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１８０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１８０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１８０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１８０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１８５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１８５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１８５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１８５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１８５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１８５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１８５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１９０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１９０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１９０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１９０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１９０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１９０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１９５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１９５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１９５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１９５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１９５アミノ酸～約２００アミノ酸、約２００アミノ酸～約２２０アミノ酸、約２００アミノ酸～約２１５アミノ酸、約２００アミノ酸～約２１０アミノ酸、約２００アミノ酸～約２０５アミノ酸、約２０５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約２０５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約２０５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約２１０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約２１０アミノ酸～約２１５アミノ酸、または約２１５アミノ酸～約２２０アミノ酸の全長を有し得る。
ミノ酸～約１８０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１５５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１５５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１６０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１６０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１６５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１６５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１７０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１７０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１７５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１７５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１７５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１７５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１７５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１７５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１７５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１７５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１７５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１８０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１８０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１８０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１８０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１８５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１８５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１８５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１８５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１８５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１８５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１８５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１９０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１９０アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１９０アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１９０アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１９０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１９０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１９５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１９５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約１９５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約１９５アミノ酸～約２０５アミノ酸、約１９５アミノ酸～約２００アミノ酸、約２００アミノ酸～約２２０アミノ酸、約２００アミノ酸～約２１５アミノ酸、約２００アミノ酸～約２１０アミノ酸、約２００アミノ酸～約２０５アミノ酸、約２０５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約２０５アミノ酸～約２１５アミノ酸、約２０５アミノ酸～約２１０アミノ酸、約２１０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約２１０アミノ酸～約２１５アミノ酸、または約２１５アミノ酸～約２２０アミノ酸の全長を有し得る。
【0113】
いくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性野生型ヒト組織因子（またはそれ由来の任意の配列）を含むか、またはそれからなり得る。
【0114】
リンカー配列
いくつかの実施形態では、リンカー配列は、可動性リンカー配列であり得る。使用され得るリンカー配列の非限定的な例は、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１０，ｐｐ．３２５－３３０，２０１４、Ｐｒｉｙａｎｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，２０１３ Ｆｅｂ；２２（２）：１５３－１６７に記載されている。いくつかの例では、リンカー配列は、合成リンカー配列である。
いくつかの実施形態では、リンカー配列は、可動性リンカー配列であり得る。使用され得るリンカー配列の非限定的な例は、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１０，ｐｐ．３２５－３３０，２０１４、Ｐｒｉｙａｎｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，２０１３ Ｆｅｂ；２２（２）：１５３－１６７に記載されている。いくつかの例では、リンカー配列は、合成リンカー配列である。
【0115】
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のリンカー配列（例えば、同じまたは異なるリンカー配列、例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）を含み得る。本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のリンカー配列（例えば、同じまたは異なるリンカー配列、例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）を含み得る。
【0116】
本明細書に記載の第１のキメラポリペプチドおよび／または第２のキメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のリンカー配列（例えば、同じまたは異なるリンカー配列、例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）を含み得る。本明細書に記載の第１のキメラポリペプチドおよび／または第２のキメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のリンカー配列（例えば、同じまたは異なるリンカー配列、例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）を含み得る。
【0117】
いくつかの実施形態では、リンカー配列は、１アミノ酸～約１００アミノ酸、１アミノ酸～約９０アミノ酸、１アミノ酸～約８０アミノ酸、１アミノ酸～約７０アミノ酸、１アミノ酸～約６０アミノ酸、１アミノ酸～約５０アミノ酸、１アミノ酸～約４５アミノ酸、１アミノ酸～約４０アミノ酸、１アミノ酸～約３５アミノ酸、１アミノ酸～約３０アミノ酸、１アミノ酸～約２５アミノ酸、１アミノ酸～約２４アミノ酸、１アミノ酸～約２２アミノ酸、１アミノ酸～約２０アミノ酸、１アミノ酸～約１８アミノ酸、１アミノ酸～約１６アミノ酸、１アミノ酸～約１４アミノ酸、１アミノ酸～約１２アミノ酸、１アミノ酸～約１０アミノ酸、１アミノ酸～約８アミノ酸、１アミノ酸～約６アミノ酸、１アミノ酸～約４アミノ酸、約２アミノ酸～約１００アミノ酸、約２アミノ酸～約９０アミノ酸、約２アミノ酸～約８０アミノ酸、約２アミノ酸～約７０アミノ酸、約２アミノ酸～約６０アミノ酸、約２アミノ酸～約５０アミノ酸、約２アミノ酸～約４５アミノ酸、約２アミノ酸～約４０アミノ酸、約２アミノ酸～約３５アミノ酸、約２アミノ酸～約３０アミノ酸、約２アミノ酸～約２５アミノ酸、約２アミノ酸～約２４アミノ酸、約２アミノ酸～約２２アミノ酸、約２アミノ酸～約２０アミノ酸、約２アミノ酸～約１８アミノ酸、約２アミノ酸～約１６アミノ酸、約２アミノ酸～約１４アミノ酸、約２アミノ酸～約１２アミノ酸、約２アミノ酸～約１０アミノ酸、約２アミノ酸～約８アミノ酸、約２アミノ酸～約６アミノ酸、約２アミノ酸～約４アミノ酸、約４アミノ酸～約１００アミノ酸、約４アミノ酸～約９０アミノ酸、約４アミノ酸～約８０アミノ酸、約４アミノ酸～約７０アミノ酸、約４アミノ酸～約６０アミノ酸、約４アミノ酸～約５０アミノ酸、約４アミノ酸～約４５アミノ酸、約４アミノ酸～約４０アミノ酸、約４アミノ酸～約３５アミノ酸、約４アミノ酸～約３０アミノ酸、約４アミノ酸～約２５アミノ酸、約４アミノ酸～約２４アミノ酸、約４アミノ酸～約２２アミノ酸、約４アミノ酸～約２０アミノ酸、約４アミノ酸～約１８アミノ酸、約４アミノ酸～約１６アミノ酸、約４アミノ酸～約１４アミノ酸、約４アミノ酸～約１２アミノ酸、約４アミノ酸～約１０アミノ酸、約４アミノ酸～約８アミノ酸、約４アミノ酸～約６アミノ酸、約６アミノ酸～約１００アミノ酸、約６アミノ酸～約９０アミノ酸、約６アミノ酸～約８０アミノ酸、約６アミノ酸～約７０アミノ酸、約６アミノ酸～約６０アミノ酸、約６アミノ酸～約５０アミノ酸、約６アミノ酸～約４５アミノ酸、約６アミノ酸～約４０アミノ酸、約６アミノ酸～約３５アミノ酸、約６アミノ酸～約３０アミノ酸、約６アミノ酸～約２５アミノ酸、約６アミノ酸～約２４アミノ酸、約６アミノ酸～約２２アミノ酸、約６アミノ酸～約２０アミノ酸、約６アミノ酸～約１８アミノ酸、約６アミノ酸～約１６アミノ酸、約６アミノ酸～約１４アミノ酸、約６アミノ酸～約１２アミノ酸、約６アミノ酸～約１０アミノ酸、約６アミノ酸～約８アミノ酸、約８アミノ酸～約１００アミノ酸、約８アミノ酸～約９０アミノ酸、約８アミノ酸～約８０アミノ酸、約８アミノ酸～約７０アミノ酸、約８アミノ酸～約６０アミノ酸、約８アミノ酸～約５０アミノ酸、約８アミノ酸～約４５アミノ酸、約８アミノ酸～約４０アミノ酸、約８アミノ酸～約３５アミノ酸、約８アミノ酸～約３０アミノ酸、約８アミノ酸～約２５アミノ酸、約８アミノ酸～約２４アミノ酸、約８アミノ酸～約２２アミノ酸、約８アミノ酸～約２０アミノ酸、約８アミノ酸～約１８アミノ酸、約８アミノ酸～約１６アミノ酸、約８アミノ酸～約１４アミノ酸、約８アミノ酸～約１２アミノ酸、約８アミノ酸～約１０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１００アミノ酸、約１０アミノ酸～約９０アミノ酸、約１０アミノ酸～約８０アミノ酸、約１０アミノ酸～約７０アミノ酸、約１０アミノ酸～約６０アミノ酸、約１０アミノ酸～約５０アミノ酸、約１０アミノ酸～約４５アミノ酸、約１０アミノ酸～約４０アミノ酸、約１０アミノ酸～約３５アミノ酸、約１０アミノ酸～約３０アミノ酸、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸、約１０アミノ酸～約２４アミノ酸、約１０アミノ酸～約２２アミノ酸、約１０アミノ酸～約２０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１８アミノ酸、約１０アミノ酸～約１６アミノ酸、約１０アミノ酸～約１４アミノ酸、約１０アミノ酸～約１２アミノ酸、約１２アミノ酸～約１００アミノ酸、約１２アミノ酸～約９０アミノ酸、約１２アミノ酸～約８０アミノ酸、約１２アミノ酸～約７０アミノ酸、約１２アミノ酸～約６０アミノ酸、約１２アミノ酸～約５０アミノ酸、約１２アミノ酸～約４５アミノ酸、約１２アミノ酸～約４０アミノ酸、約１２アミノ酸～約３５アミノ酸、約１２アミノ酸～約３０アミノ酸、約１２アミノ酸～約２５アミノ酸、約１２アミノ酸～約２４アミノ酸、約１２アミノ酸～約２２アミノ酸、約１２アミノ酸～約２０アミノ酸、約１２アミノ酸～約１８アミノ酸、約１２アミノ酸～約１６アミノ酸、約１２アミノ酸～約１４アミノ酸、約１４アミノ酸～約１００アミノ酸、約１４アミノ酸～約９０アミノ酸、約１４アミノ酸～約８０アミノ酸、約１４アミノ酸～約７０アミノ酸、約１４アミノ酸～約６０アミノ酸、約１４アミノ酸～約５０アミノ酸、約１４アミノ酸～約４５アミノ酸、約１４アミノ酸～約４０アミノ酸、約１４アミノ酸～約３５アミノ酸、約１４アミノ酸～約３０アミノ酸、約１４アミノ酸～約２５アミノ酸、約１４アミノ酸～約２４アミノ酸、約１４アミノ酸～約２２アミノ酸、約１４アミノ酸～約２０アミノ酸、約１４アミノ酸～約１８アミノ酸、約１４アミノ酸～約１６アミノ酸、約１６アミノ酸～約１００アミノ酸、約１６アミノ酸～約９０アミノ酸、約１６アミノ酸～約８０アミノ酸、約１６アミノ酸～約７０アミノ酸、約１６アミノ酸～約６０アミノ酸、約１６アミノ酸～約５０アミノ酸、約１６アミノ酸～約４５アミノ酸、約１６アミノ酸～約４０アミノ酸、約１６アミノ酸～約３５アミノ酸、約１６アミノ酸～約３０アミノ酸、約１６アミノ酸～約２５アミノ酸、約１６アミノ酸～約２４アミノ酸、約１６アミノ酸～約２２アミノ酸、約１６アミノ酸～約２０アミノ酸、約１６アミノ酸～約１８アミノ酸、約１８アミノ酸～約１００アミノ酸、約１８アミノ酸～約９０アミノ酸、約１８アミノ酸～約８０アミノ酸、約１８アミノ酸～約７０アミノ酸、約１８アミノ酸～約６０アミノ酸、約１８アミノ酸～約５０アミノ酸、約１８アミノ酸～約４５アミノ酸、約１８アミノ酸～約４０アミノ酸、約１８アミノ酸～約３５アミノ酸、約１８アミノ酸～約３０アミノ酸、約１８アミノ酸～約２５アミノ酸、約１８アミノ酸～約２４アミノ酸、約１８アミノ酸～約２２アミノ酸、約１８アミノ酸～約２０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１００アミノ酸、約２０アミノ酸～約９０アミノ酸、約２０アミノ酸～約８０アミノ酸、約２０アミノ酸～約７０アミノ酸、約２０アミノ酸～約６０アミノ酸、約２０アミノ酸～約５０アミノ酸、約２０アミノ酸～約４５アミノ酸、約２０アミノ酸～約４０アミノ酸、約２０アミノ酸～約３５アミノ酸、約２０アミノ酸～約３０アミノ酸、約２０アミノ酸～約２５アミノ酸、約２０アミノ酸～約２４アミノ酸、約２０アミノ酸～約２２アミノ酸、約２２アミノ酸～約１００アミノ酸、約２２アミノ酸～約９０アミノ酸、約２２アミノ酸～約８０アミノ酸、約２２アミノ酸～約７０アミノ酸、約２２アミノ酸～約６０アミノ酸、約２２アミノ酸～約５０アミノ酸、約２２アミノ酸～約４５アミノ酸、約２２アミノ酸～約４０アミノ酸、約２２アミノ酸～約３５アミノ酸、約２２アミノ酸～約３０アミノ酸、約２２アミノ酸～約２５アミノ酸、約２２アミノ酸～約２４アミノ酸、約２５アミノ酸～約１００アミノ酸、約２５アミノ酸～約９０アミノ酸、約２５アミノ酸～約８０アミノ酸、約２５アミノ酸～約７０アミノ酸、約２５アミノ酸～約６０アミノ酸、約２５アミノ酸～約５０アミノ酸、約２５アミノ酸～約４５アミノ酸、約２５アミノ酸～約４０アミノ酸、約２５アミノ酸～約３５アミノ酸、約２５アミノ酸～約３０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１００アミノ酸、約３０アミノ酸～約９０アミノ酸、約３０アミノ酸～約８０アミノ酸、約３０アミノ酸～約７０アミノ酸、約３０アミノ酸～約６０アミノ酸、約３０アミノ酸～約５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約４５アミノ酸、約３０アミノ酸～約４０アミノ酸、約３０アミノ酸～約３５アミノ酸、約３５アミノ酸～約１００アミノ酸、約３５アミノ酸～約９０アミノ酸、約３５アミノ酸～約８０アミノ酸、約３５アミノ酸～約７０アミノ酸、約３５アミノ酸～約６０アミノ酸、約３５アミノ酸～約５０アミノ酸、約３５アミノ酸～約４５アミノ酸、約３５アミノ酸～約４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１００アミノ酸、約４０アミノ酸～約９０アミノ酸、約４０アミノ酸～約８０アミノ酸、約４０アミノ酸～約７０アミノ酸、約４０アミノ酸～約６０アミノ酸、約４０アミノ酸～約５０アミノ酸、約４０アミノ酸～約４５アミノ酸、約４５アミノ酸～約１００アミノ酸、約４５アミノ酸～約９０アミノ酸、約４５アミノ酸～約８０アミノ酸、約４５アミノ酸～約７０アミノ酸、約４５アミノ酸～約６０アミノ酸、約４５アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１００アミノ酸、約５０アミノ酸～約９０アミノ酸、約５０アミノ酸～約８０アミノ酸、約５０アミノ酸～約７０アミノ酸、約５０アミノ酸～約６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１００アミノ酸、約６０アミノ酸～約９０アミノ酸、約６０アミノ酸～約８０アミノ酸、約６０アミノ酸～約７０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１００アミノ酸、約７０アミノ酸～約９０アミノ酸、約７０アミノ酸～約８０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１００アミノ酸、約８０アミノ酸～約９０アミノ酸、または約９０アミノ酸～約１００アミノ酸の全長を有し得る。
【0118】
いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）残基に富む。いくつかの実施形態では、リンカーは、セリン（ＳｅｒまたはＳ）残基に富む。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン残基およびセリン残基に富む。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上のグリシン－セリン残基対（ＧＳ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＧＳ対を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上のＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＳ）配列、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＧＧＧＳ配列を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上のＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＧＳ）配列、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＧＧＧＧＳ配列を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上のＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（ＧＧＳＧ）配列、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＧＧＳＧ配列を有する。
【0119】
いくつかの実施形態では、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８）を含み得るか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、ＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴ（配列番号１９）を含むかまたはそれからなる核酸によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２０）を含み得るか、またはそれからなり得る。
【0120】
標的結合ドメイン
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および／または追加の１つ以上の標的結合ドメインは、抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な抗原結合ドメインのうちのいずれか）、可溶性インターロイキンまたはサイトカインタンパク質（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性インターロイキンタンパク質または可溶性サイトカインタンパク質のうちのいずれか）、および可溶性インターロイキンまたはサイトカイン受容体（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性インターロイキン受容体または可溶性サイトカイン受容体のうちのいずれか）であり得る。
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および／または追加の１つ以上の標的結合ドメインは、抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な抗原結合ドメインのうちのいずれか）、可溶性インターロイキンまたはサイトカインタンパク質（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性インターロイキンタンパク質または可溶性サイトカインタンパク質のうちのいずれか）、および可溶性インターロイキンまたはサイトカイン受容体（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性インターロイキン受容体または可溶性サイトカイン受容体のうちのいずれか）であり得る。
【0121】
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および／または１つ以上の追加の標的結合ドメインは各々独立して、約５アミノ酸～約１０００アミノ酸、約５アミノ酸～約９５０アミノ酸、約５アミノ酸～約９００アミノ酸、約５アミノ酸～約８５０アミノ酸、約５アミノ酸～約８００アミノ酸、約５アミノ酸～約７５０アミノ酸、約５アミノ酸～約７００アミノ酸、約５アミノ酸～約６５０アミノ酸、約５アミノ酸～約６００アミノ酸、約５アミノ酸～約５５０アミノ酸、約５アミノ酸～約５００アミノ酸、約５アミノ酸～約４５０アミノ酸、約５アミノ酸～約４００アミノ酸、約５アミノ酸～約３５０アミノ酸、約５アミノ酸～約３００アミノ酸、約５アミノ酸～約２８０アミノ酸、約５アミノ酸～約２６０アミノ酸、約５アミノ酸～約２４０アミノ酸、約５アミノ酸～約２２０アミノ酸、約５アミノ酸～約２００アミノ酸、約５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約５アミノ酸～約１１５アミノ酸、約５アミノ酸～約１１０アミノ酸、約５アミノ酸～約１０５アミノ酸、約５アミノ酸～約１００アミノ酸、約５アミノ酸～約９５アミノ酸、約５アミノ酸～約９０アミノ酸、約５アミノ酸～約８５アミノ酸、約５アミノ酸～約８０アミノ酸、約５アミノ酸～約７５アミノ酸、約５アミノ酸～約７０アミノ酸、約５アミノ酸～約６５アミノ酸、約５アミノ酸～約６０アミノ酸、約５アミノ酸～約５５アミノ酸、約５アミノ酸～約５０アミノ酸、約５アミノ酸～約４５アミノ酸、約５アミノ酸～約４０アミノ酸、約５アミノ酸～約３５アミノ酸、約５アミノ酸～約３０アミノ酸、約５アミノ酸～約２５アミノ酸、約５アミノ酸～約２０アミノ酸、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約５アミノ酸～約１０アミノ酸の総アミノ酸数を有し得る。
【0122】
本明細書に記載の標的結合ドメインのうちのいずれも、１×１０－７Ｍ未満、１×１０－８Ｍ未満、１×１０－９Ｍ未満、１×１０－１０Ｍ未満、１×１０－１１Ｍ未満、１×１０－１２Ｍ未満、または１×１０－１３Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）でその標的に結合することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗原結合タンパク質構築物は、１×１０－３Ｍ～約１×１０－５Ｍ、約１×１０－４Ｍ～約１×１０－６Ｍ、約１×１０－５Ｍ～約１×１０－７Ｍ、約１×１０－６Ｍ～約１×１０－８Ｍ、約１×１０－７Ｍ～約１×１０－９Ｍ、約１×１０－８Ｍ～約１×１０－１０Ｍ、または約１×１０－９Ｍ～約１×１０－１１Ｍ（その上限および下限も含む）のＫＤで特定の抗原に結合することができる。
【0123】
本明細書に記載の標的結合ドメインのうちのいずれも、約１ｐＭ～約３０ｎＭ（例えば、約１ｐＭ～約２５ｎＭ、約１ｐＭ～約２０ｎＭ、約１ｐＭ～約１５ｎＭ、約１ｐＭ～約１０ｎＭ、約１ｐＭ～約５ｎＭ、約１ｐＭ～約２ｎＭ、約１ｐＭ～約１ｎＭ、約１ｐＭ～約９５０ｐＭ、約１ｐＭ～約９００ｐＭ、約１ｐＭ～約８５０ｐＭ、約１ｐＭ～約８００ｐＭ、約１ｐＭ～約７５０ｐＭ、約１ｐＭ～約７００ｐＭ、約１ｐＭ～約６５０ｐＭ、約１ｐＭ～約６００ｐＭ、約１ｐＭ～約５５０ｐＭ、約１ｐＭ～約５００ｐＭ、約１ｐＭ～約４５０ｐＭ、約１ｐＭ～約４００ｐＭ、約１ｐＭ～約３５０ｐＭ、約１ｐＭ～約３００ｐＭ、約１ｐＭ～約２５０ｐＭ、約１ｐＭ～約２００ｐＭ、約１ｐＭ～約１５０ｐＭ、約１ｐＭ～約１００ｐＭ、約１ｐＭ～約９０ｐＭ、約１ｐＭ～約８０ｐＭ、約１ｐＭ～約７０ｐＭ、約１ｐＭ～約６０ｐＭ、約１ｐＭ～約５０ｐＭ、約１ｐＭ～約４０ｐＭ、約１ｐＭ～約３０ｐＭ、約１ｐＭ～約２０ｐＭ、約１ｐＭ～約１０ｐＭ、約１ｐＭ～約５ｐＭ、約１ｐＭ～約４ｐＭ、約１ｐＭ～約３ｐＭ、約１ｐＭ～約２ｐＭ）のＫＤでその標的に結合することができる。
【0124】
本明細書に記載の標的結合ドメインのうちのいずれも、約１ｎＭ～約１０ｎＭ（例えば、約１ｎＭ～約９ｎＭ、約１ｎＭ～約８ｎＭ、約１ｎＭ～約７ｎＭ、約１ｎＭ～約６ｎＭ、約１ｎＭ～約５ｎＭ、約１ｎＭ～約４ｎＭ、約１ｎＭ～約３ｎＭ、約１ｎＭ～約２ｎＭ、約２ｎＭ～約１０ｎＭ、約２ｎＭ～約９ｎＭ、約２ｎＭ～約８ｎＭ、約２ｎＭ～約７ｎＭ、約２ｎＭ～約６ｎＭ、約２ｎＭ～約５ｎＭ、約２ｎＭ～約４ｎＭ、約２ｎＭ～約３ｎＭ、約３ｎＭ～約１０ｎＭ、約３ｎＭ～約９ｎＭ、約３ｎＭ～約８ｎＭ、約３ｎＭ～約７ｎＭ、約３ｎＭ～約６ｎＭ、約３ｎＭ～約５ｎＭ、約３ｎＭ～約４ｎＭ、約４ｎＭ～約１０ｎＭ、約４ｎＭ～約９ｎＭ、約４ｎＭ～約８ｎＭ、約４ｎＭ～約７ｎＭ、約４ｎＭ～約６ｎＭ、約４ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約５ｎＭ～約９ｎＭ、約５ｎＭ～約８ｎＭ、約５ｎＭ～約７ｎＭ、約５ｎＭ～約６ｎＭ、約６ｎＭ～約１０ｎＭ、約６ｎＭ～約９ｎＭ、約６ｎＭ～約８ｎＭ、約６ｎＭ～約７ｎＭ、約７ｎＭ～約１０ｎＭ、約７ｎＭ～約９ｎＭ、約７ｎＭ～約８ｎＭ、約８ｎＭ～約１０ｎＭ、約８ｎＭ～約９ｎＭ、および約９ｎＭ～約１０ｎＭ）のＫＤでその標的に結合することができる。
【0125】
当該技術分野で既知の様々な異なる方法を使用して、本明細書に記載の抗原結合タンパク質構築物のうちのいずれのＫＤ値も決定することができる（例えば、電気泳動移動度シフトアッセイ、フィルター結合アッセイ、表面プラズモン共鳴、および生体分子結合反応速度アッセイ等）。
【0126】
抗原結合ドメイン
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは、同じ抗原に特異的に結合する。これらの単鎖または多鎖キメラポリペプチドのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは、同じエピトープに特異的に結合する。これらの単鎖または多鎖キメラポリペプチドのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは、同じアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは、同じ抗原に特異的に結合する。これらの単鎖または多鎖キメラポリペプチドのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは、同じエピトープに特異的に結合する。これらの単鎖または多鎖キメラポリペプチドのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは、同じアミノ酸配列を含む。
【0127】
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは、異なる抗原に特異的に結合する。
【0128】
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインの一方または両方が、抗原結合ドメインである。本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは各々、抗原結合ドメインである。本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体（例えば、ＶａＨＨまたはＶＮＡＲドメイン）を含むか、またはそれである。
【0129】
いくつかの例では、抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメインのうちのいずれか）は、ＣＤ１６ａ（例えば、米国特許第９，０３５，０２６号に記載のものを参照のこと）、ＣＤ２８（例えば、米国特許第７，７２３，４８２号に記載のものを参照のこと）、ＣＤ３（例えば、米国特許第９，２２６，９６２号に記載のものを参照のこと）、ＣＤ３３（例えば、米国特許第８，７５９，４９４号に記載のものを参照のこと）、ＣＤ２０（例えば、ＷＯ２０１４／０２６０５４に記載のものを参照のこと）、ＣＤ１９（例えば、米国特許第９，７０１，７５８号に記載のものを参照のこと）、ＣＤ２２（例えば、ＷＯ２００３／１０４４２５に記載のものを参照のこと）、ＣＤ１２３（例えば、ＷＯ２０１４／１３０６３５に記載のものを参照のこと）、ＩＬ－１Ｒ（例えば、米国特許第８，７４１，６０４号に記載のものを参照のこと）、ＩＬ－１（例えば、ＷＯ２０１４／０９５８０８に記載のものを参照のこと）、ＶＥＧＦ（例えば、米国特許第９，０９０，６８４号に記載のものを参照のこと）、ＩＬ－６Ｒ（例えば、米国特許第７，４８２，４３６号に記載のものを参照のこと）、ＩＬ－４（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１７１１９７号に記載のものを参照のこと）、ＩＬ－１０（例えば、米国特許出願公開２０１６／０３４０４１３第号に記載のものを参照のこと）、ＰＤＬ－１（例えば、Ｄｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．９４：６０－６６，２０１４に記載のものを参照のこと）、ＴＩＧＩＴ（例えば、米国特許出願公開第２０１７／０１９８０４２号に記載のものを参照のこと）、ＰＤ－１（例えば、米国特許第７，４８８，８０２号に記載のものを参照のこと）、ＴＩＭ３（例えば、米国特許第８，５５２，１５６号に記載のものを参照のこと）、ＣＴＬＡ４（例えば、ＷＯ２０１２／１２０１２５に記載のものを参照のこと）、ＭＩＣＡ（例えば、ＷＯ２０１６／１５４５８５に記載のものを参照のこと）、ＭＩＣＢ（例えば、米国特許第８，７５３，６４０号に記載のものを参照のこと）、ＩＬ－６（例えば、Ｇｅｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １１（４）：１２１－１２９，２００２に記載のものを参照のこと）、ＩＬ－８（例えば、米国特許第６，１１７，９８０号に記載のものを参照のこと）、ＴＮＦα（例えば、Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．６２（３）：３７７－３８５，２０１５に記載のものを参照のこと）、ＣＤ２６（例えば、ＷＯ２０１７／１８９５２６に記載のものを参照のこと）、ＣＤ３６（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２９号に記載のものを参照のこと）、ＵＬＢＰ２（例えば、米国特許第９，２７３，１３６号に記載のものを参照のこと）、ＣＤ３０（例えば、Ｈｏｍａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４８（５）：４９７－５０１，１９９８に記載のものを参照のこと）、ＣＤ２００（例えば、米国特許第９，０８５，６２３号に記載のものを参照のこと）、ＩＧＦ－１Ｒ（例えば、米国特許出願公開第２０１７／００５１０６３号に記載のものを参照のこと）、ＭＵＣ４ＡＣ（例えば、ＷＯ２０１２／１７０４７０に記載のものを参照のこと）、ＭＵＣ５ＡＣ（例えば、米国特許第９，２３８，０８４号に記載のものを参照のこと）、Ｔｒｏｐ－２（例えば、ＷＯ２０１３／０６８９４６に記載のものを参照のこと）、ＣＭＥＴ（例えば、Ｅｄｗａｒｄｒａｊａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０６（３）：３６７－３７５，２０１０に記載のものを参照のこと）、ＥＧＦＲ（例えば、Ａｋｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１２７：８－１５，２０１６に記載のものを参照のこと）、ＨＥＲ１（例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２７４４４６号に記載のものを参照のこと）、ＨＥＲ２（例えば、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３７（７）：１３４７－１３５４，２０１５に記載のものを参照のこと）、ＨＥＲ３（例えば、米国特許第９，５０５，８４３号に記載のものを参照のこと）、ＰＳＭＡ（例えば、Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８９（２）：１３６－１４５，２０１３に記載のものを参照のこと）、ＣＥＡ（例えば、ＷＯ１９９５／０１５３４１に記載のものを参照のこと）、Ｂ７Ｈ３（例えば、米国特許第９，３７１，３９５号に記載のものを参照のこと）、ＥＰＣＡＭ（例えば、ＷＯ２０１４／１５９５３１に記載のものを参照のこと）、ＢＣＭＡ（例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２６（６）：１４４７－１４５６，２０１８に記載のものを参照のこと）、Ｐ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（例えば、米国特許第７，４５２，５３７号に記載のものを参照のこと）、ＣＥＡＣＡＭ５（例えば、米国特許第９，６１７，３４５号に記載のものを参照のこと）、ＵＬ１６結合タンパク質（例えば、ＷＯ２０１７／０８３６１２に記載のものを参照のこと）、ＨＬＡ－ＤＲ（例えば、Ｐｉｓｔｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１４（２）：１２３－１３０，１９９７を参照のこと）、ＤＬＬ４（例えば、ＷＯ２０１４／００７５１３に記載のものを参照のこと）、ＴＹＲＯ３（例えば、ＷＯ２０１６／１６６３４８に記載のものを参照のこと）、ＡＸＬ（例えば、ＷＯ２０１２／１７５６９２に記載のものを参照のこと）、ＭＥＲ（例えば、ＷＯ２０１６／１０６２２１に記載のものを参照のこと）、ＣＤ１２２（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０３６７６６４号に記載のものを参照のこと）、ＣＤ１５５（例えば、ＷＯ２０１７／１４９５３８に記載のものを参照のこと）、またはＰＤＧＦ－ＤＤ（例えば、米国特許第９，４４１，０３４号に記載のものを参照のこと）のうちのいずれか１つに特異的に結合することができる。
【0130】
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかに存在する抗原結合ドメインは各々独立して、ＶＨＨドメイン、ＶＮＡＲドメイン、およびｓｃＦｖからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合ドメインのうちのいずれかは、ＢｉＴｅ、（ｓｃＦｖ）２、ナノボディ、ナノボディ－ＨＳＡ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ－ＣＨ３、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、ＨＳＡｂｏｄｙ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ－ＨＡＳ、またはタンデム－ｓｃＦｖである。単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかで使用することができる抗原結合ドメインの追加の例は、当該技術分野で既知である。
【0131】
ＶＨＨドメインは、ラクダ科動物に見られ得る単一単量体可変抗体ドメインである。ＶＮＡＲドメインは、軟骨魚に見られ得る単一単量体可変抗体ドメインである。ＶＨＨドメインおよびＶＮＡＲドメインの非限定的な態様は、例えば、Ｃｒｏｍｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１５：２５４３－２５５７，２０１６、Ｄｅ Ｇｅｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１８７－１９８，２００６、Ｄｅ Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：２６３－２７０，２０１４、Ｋｉｊａｎｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １０：１６１－１７４，２０１５、Ｋｏｖａｌｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：１５２７－１５３９，２０１４、Ｋｒａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．３８：２１－２８，２０１６、Ｍｕｊｉｃ－Ｄｅｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．３５：２４７－２５５，２０１４、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７－３０２，２００１、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０－２３５，２００１、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８２：７７５－７９７，２０１３、Ｒａｈｂａｒｉｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．４０：２９９－３３８，２０１１、Ｖａｎ Ａｕｄｅｎｈｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ８：４０－４８，２０１６、Ｖａｎ Ｂｏｃｋｓｔａｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ １０：１２１２－１２２４，２００９、Ｖｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９１１：１５－２６，２０１２、およびＷｅｓｏｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８：１５７－１７４，２００９に記載されている。
【0132】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチド内の抗原結合ドメインは各々、いずれもＶＨＨドメインであるか、または少なくとも１つの抗原結合ドメインがＶＨＨドメインである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチド内の抗原結合ドメインは各々、いずれもＶＮＡＲドメインであるか、または少なくとも１つの抗原結合ドメインがＶＮＡＲドメインである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドの抗原結合ドメインは各々、いずれもｓｃＦｖドメインであるか、または少なくとも１つの抗原結合ドメインがｓｃＦｖドメインである。
【0133】
いくつかの実施形態では、単鎖または多鎖キメラポリペプチドに存在する２つ以上のポリペプチドは、集合して（例えば、非共有結合的に集合して）、本明細書に記載の抗原結合ドメインのうちのいずれか、例えば、抗体の抗原結合断片（例えば、本明細書に記載の抗体の抗原結合断片のうちのいずれか）、ＶＨＨ－ｓｃＡｂ、ＶＨＨ－Ｆａｂ、二重ｓｃＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、ｃｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（ツーインワン）、ＤＡＦ（フォーインワン）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ－ＩｇＧ、ノブ・イン・ホール共通軽鎖、ノブ・イン・ホール集合体、電荷対、Ｆａｂアーム交換、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、ＬＵＺ－Ｙ、Ｆｃａｂ、κλ－ボディ、直交Ｆａｂ、ＤＶＤ－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ（Ｈ）－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ、Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、Ｚｙｂｏｄｙ、ＤＶＩ－ＩｇＧ、ダイアボディ－ＣＨ３、トリプルボディ、ミノ抗体、ミニボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃダイアボディ－Ｆｃ、ダイアボディ－Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、イントラボディ、ドック・アンド・ロック、ｌｍｍＴＡＣ、ＩｇＧ－ＩｇＧコンジュゲート、Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ、およびｓｃＦｖ１－ＰＥＧ－ｓｃＦｖ２を形成することができる。これらの要素の説明については、例えば、全体が本明細書に組み込まれるＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７：９５－１０６，２０１５を参照されたい。抗体の抗原結合断片の非限定的な例には、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦａｂ’断片が挙げられる。抗体の抗原結合断片の追加の例は、ＩｇＧの抗原結合断片（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の抗原結合断片）（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ、例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の抗原結合断片）、ＩｇＡの抗原結合断片（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２の抗原結合断片）（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＡ、例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＡ１またはＩｇＡ２の抗原結合断片）、ＩｇＤの抗原結合断片（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＤの抗原結合断片）、ＩｇＥの抗原結合断片（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＥの抗原結合断片）、またはＩｇＭの抗原結合断片（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＭの抗原結合断片）である。
【0134】
「Ｆｖ」断片は、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインを有する非共有結合二量体を含む。
【0135】
「Ｆａｂ」断片は、Ｆｖ断片の重鎖および軽鎖可変ドメインに加えて、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。
【0136】
「Ｆ（ａｂ’）２」断片には、ヒンジ領域の近くでジスルフィド結合によって結合された２つのＦａｂ断片が含まれる。
【0137】
「二重可変ドメイン免疫グロブリン」または「ＤＶＤ－Ｉｇ」とは、例えば、各々参照により全体が組み込まれる、ＤｉＧｉａｍｍａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９９：１４５－１５６，２０１２、Ｊａｋｏｂ ｅｔ ａｌ．，ＭＡＢｓ ５：３５８－３６３，２０１３、および米国特許第７，６１２，１８１号、同第８，２５８，２６８号、同第８，５８６，７１４号、同第８，７１６，４５０号、同第８，７２２，８５５号、同第８，７３５，５４６号、および同第８，８２２，６４５号に記載の多価および多重特異性結合タンパク質を指す。
【0138】
ＤＡＲＴは、例えば、Ｇａｒｂｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １３：７９９－８０１，２０１４に記載されている。
【0139】
本明細書に記載の抗原結合ドメインのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、タンパク質、炭水化物、脂質、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される抗原に結合することができる。
【0140】
抗原結合ドメインの追加の例および態様は、当該技術分野で既知である。
【0141】
可溶性インターロイキンまたはサイトカインタンパク質
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインの一方または両方が、可溶性インターロイキンタンパク質または可溶性サイトカインタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、可溶性インターロイキンまたは可溶性サイトカインタンパク質は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＰＤＧＦ－ＤＤ、ＳＣＦ、およびＦＬＴ３Ｌの群から選択される。可溶性ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＰＤＧＦ－ＤＤ、ＳＣＦ、およびＦＬＴ３Ｌの非限定的な例を以下に提供する。
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインの一方または両方が、可溶性インターロイキンタンパク質または可溶性サイトカインタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、可溶性インターロイキンまたは可溶性サイトカインタンパク質は、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＰＤＧＦ－ＤＤ、ＳＣＦ、およびＦＬＴ３Ｌの群から選択される。可溶性ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＰＤＧＦ－ＤＤ、ＳＣＦ、およびＦＬＴ３Ｌの非限定的な例を以下に提供する。
【0142】
ヒト可溶性ＩＬ－２（配列番号７５）
【0143】
ヒト可溶性ＩＬ－３（配列番号７６）
【0144】
ヒト可溶性ＩＬ－７（配列番号７７）
【0145】
ヒト可溶性ＩＬ－８（配列番号７８）
【0146】
ヒト可溶性ＩＬ－１０（配列番号７９）
【0147】
ヒト可溶性ＩＬ－１５（配列番号８０）
【0148】
ヒト可溶性ＩＬ－１５ Ｄ８Ｎ変異体（配列番号９９）
ＮＷＶＮＶＩＳＮＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
ＮＷＶＮＶＩＳＮＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
【0149】
ヒト可溶性ＩＬ－１５ Ｄ８Ｎ変異体（配列番号１００）
ＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＡＡＧＡＴＴＴＡＡＴＴＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＡＴＡＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＴＴＴＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＡＣＣＣＣＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＴＡＴＣＴＣＴＴＴＡＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＡＴＡＡＣＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＣＣＧＧＣＴＧＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＴＴＴＧＴＧＣＡＣＡＴＴＧＴＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＡＴＣＡＡＴＡＣＣＴＣＣ
ＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＡＡＧＡＴＴＴＡＡＴＴＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＡＴＡＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＴＴＴＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＡＣＣＣＣＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＴＡＴＣＴＣＴＴＴＡＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＡＴＡＡＣＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＣＣＧＧＣＴＧＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＴＴＴＧＴＧＣＡＣＡＴＴＧＴＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＡＴＣＡＡＴＡＣＣＴＣＣ
【0150】
ヒト可溶性ＩＬ－１７（配列番号８１）
【0151】
ヒト可溶性ＩＬ－１８（配列番号８２）
【0152】
ヒト可溶性ＰＤＧＦ－ＤＤ（配列番号８３）
【0153】
ヒト可溶性ＳＣＦ（配列番号８４）
【0154】
ヒト可溶性ＦＬＴ３Ｌ（配列番号８５）
【0155】
可溶性ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６の非限定的な例が以下に提供される。
【0156】
ヒト可溶性ＭＩＣＡ（配列番号８６）
【0157】
ヒト可溶性ＭＩＣＢ（配列番号８７）
【0158】
ヒト可溶性ＵＬＢＰ１（配列番号８８）
【0159】
ヒト可溶性ＵＬＢＰ２（配列番号８９）
【0160】
ヒト可溶性ＵＬＢＰ３（配列番号９０）
【0161】
ヒト可溶性ＵＬＢＰ４（配列番号９１）
【0162】
ヒト可溶性ＵＬＢＰ５（配列番号９２）
【0163】
ヒト可溶性ＵＬＢＰ６（配列番号９３）
【0164】
可溶性インターロイキンタンパク質および可溶性サイトカインタンパク質の追加の例は、当該技術分野で既知である。
【0165】
可溶性受容体
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインの一方または両方が、可溶性インターロイキン受容体または可溶性サイトカイン受容体である。いくつかの実施形態では、可溶性受容体は、可溶性ＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴＧＦ－β ＲＩＩ）である（例えば、Ｙｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９４（９）：１１４０－１１５１，２０１６に記載のものを参照のこと）、可溶性ＴＧＦ－βＲＩＩＩ（例えば、Ｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｃｅｎｔａ ５７：３２０，２０１７に記載のものを参照のこと）、可溶性ＮＫＧ２Ｄ（例えば、Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４（２）：１２３－１３３，２００１、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ １１５０，Ｍａｙ ２９，２０１８、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０１１５０を参照のこと）、可溶性ＮＫｐ３０（例えば、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ １１５０，Ｍａｙ ２９，２０１８、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０１１５０を参照のこと）、可溶性ＮＫｐ４４（例えば、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ １１５０，Ｍａｙ ２９，２０１８、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０１１５０に記載のものを参照のこと）、可溶性ＮＫｐ４６（例えば、Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：１０５５－１０６０，２００１、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ １１５０，Ｍａｙ ２９，２０１８、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０１１５０を参照のこと）、可溶性ＤＮＡＭ１（例えば、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ １１５０，Ｍａｙ ２９，２０１８、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０１１５０に記載のものを参照のこと）、ｓｃＭＨＣＩ（例えば、Ｗａｓｈｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（３）：ｅ１８４３９，２０１１に記載のものを参照のこと）、ｓｃＭＨＣＩＩ（例えば、Ｂｉｓｈｗａｊｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（１）：２５－３３，１９９６に記載のものを参照のこと）、ｓｃＴＣＲ（例えば、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５６（６３７２）：７９３－７９６，１９９２に記載のものを参照のこと）、可溶性ＣＤ１５５（例えば、Ｔａｈａｒａ－Ｈａｎａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（４）：５３３－５３８，２００４に記載のものを参照のこと）、または可溶性ＣＤ２８（例えば、Ｈｅｂｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：３８８－３９２，２００４を参照のこと）。可溶性インターロイキン受容体および可溶性サイトカイン受容体の追加の例は、当該技術分野で既知である。
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインの一方または両方が、可溶性インターロイキン受容体または可溶性サイトカイン受容体である。いくつかの実施形態では、可溶性受容体は、可溶性ＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴＧＦ－β ＲＩＩ）である（例えば、Ｙｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９４（９）：１１４０－１１５１，２０１６に記載のものを参照のこと）、可溶性ＴＧＦ－βＲＩＩＩ（例えば、Ｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｃｅｎｔａ ５７：３２０，２０１７に記載のものを参照のこと）、可溶性ＮＫＧ２Ｄ（例えば、Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４（２）：１２３－１３３，２００１、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ １１５０，Ｍａｙ ２９，２０１８、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０１１５０を参照のこと）、可溶性ＮＫｐ３０（例えば、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ １１５０，Ｍａｙ ２９，２０１８、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０１１５０を参照のこと）、可溶性ＮＫｐ４４（例えば、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ １１５０，Ｍａｙ ２９，２０１８、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０１１５０に記載のものを参照のこと）、可溶性ＮＫｐ４６（例えば、Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：１０５５－１０６０，２００１、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ １１５０，Ｍａｙ ２９，２０１８、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０１１５０を参照のこと）、可溶性ＤＮＡＭ１（例えば、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ １１５０，Ｍａｙ ２９，２０１８、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０１１５０に記載のものを参照のこと）、ｓｃＭＨＣＩ（例えば、Ｗａｓｈｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（３）：ｅ１８４３９，２０１１に記載のものを参照のこと）、ｓｃＭＨＣＩＩ（例えば、Ｂｉｓｈｗａｊｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（１）：２５－３３，１９９６に記載のものを参照のこと）、ｓｃＴＣＲ（例えば、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５６（６３７２）：７９３－７９６，１９９２に記載のものを参照のこと）、可溶性ＣＤ１５５（例えば、Ｔａｈａｒａ－Ｈａｎａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（４）：５３３－５３８，２００４に記載のものを参照のこと）、または可溶性ＣＤ２８（例えば、Ｈｅｂｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：３８８－３９２，２００４を参照のこと）。可溶性インターロイキン受容体および可溶性サイトカイン受容体の追加の例は、当該技術分野で既知である。
【0166】
一対の親和性ドメイン
いくつかの実施形態では、多鎖キメラポリペプチドは、１）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む第１のキメラポリペプチドと、２）一対の親和性ドメインの第２のドメインを含む第２のキメラポリペプチドとを含み、これにより、第１のキメラポリペプチドおよび第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインおよび第２のドメインの結合を介して会合するようになる。いくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインは、ヒトＩＬ－１５受容体アルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）由来のｓｕｓｈｉドメイン、および可溶性ＩＬ－１５である。ｓｕｓｈｉドメイン、別名、ショートコンセンサスリピートまたは１型糖タンパク質モチーフは、タンパク質－タンパク質相互作用の一般的なモチーフである。ｓｕｓｈｉドメインは、補体成分Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｈ因子、Ｃ２ｍ、ならびに非免疫学的分子第ＸＩＩＩ因子およびβ２－糖タンパク質を含むいくつかのタンパク質結合分子上で特定されている。典型的なｓｕｓｈｉドメインは、およそ６０個のアミノ酸残基を有し、４つのシステインを含む（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ，Ｐａｃ．Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．２０００：１５５－６７）。第１のシステインは第３のシステインとジスルフィド結合を形成することができ、第２のシステインは第４のシステインとジスルフィド架橋を形成することができる。一対の親和性ドメインの一方のメンバーが可溶性ＩＬ－１５であるいくつかの実施形態では、可溶性ＩＬ１５は、Ｄ８ＮまたはＤ８Ａアミノ酸置換を有する。一対の親和性ドメインの一方のメンバーがヒトＩＬ－１５受容体アルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）であるいくつかの実施形態では、ヒトＩＬ１５Ｒαは、成熟全長ＩＬ１５Ｒαである。いくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインは、バルナーゼとバルンスターである。いくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインは、ＰＫＡとＡＫＡＰである。いくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインは、変異ＲＮａｓｅ Ｉ断片に基づくアダプター／ドッキングタグモジュール（Ｒｏｓｓｉ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０３：６８４１－６８４６，２００６、Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：５２８２－５２９０，２００８、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．３３：４７４－４８１，２０１２）、またはタンパク質シンタキシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン、およびＳＮＡＰ２５の相互作用に基づくＳＮＡＲＥモジュール（Ｄｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４８６－１４９２，２００３）である。
いくつかの実施形態では、多鎖キメラポリペプチドは、１）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む第１のキメラポリペプチドと、２）一対の親和性ドメインの第２のドメインを含む第２のキメラポリペプチドとを含み、これにより、第１のキメラポリペプチドおよび第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインおよび第２のドメインの結合を介して会合するようになる。いくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインは、ヒトＩＬ－１５受容体アルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）由来のｓｕｓｈｉドメイン、および可溶性ＩＬ－１５である。ｓｕｓｈｉドメイン、別名、ショートコンセンサスリピートまたは１型糖タンパク質モチーフは、タンパク質－タンパク質相互作用の一般的なモチーフである。ｓｕｓｈｉドメインは、補体成分Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｈ因子、Ｃ２ｍ、ならびに非免疫学的分子第ＸＩＩＩ因子およびβ２－糖タンパク質を含むいくつかのタンパク質結合分子上で特定されている。典型的なｓｕｓｈｉドメインは、およそ６０個のアミノ酸残基を有し、４つのシステインを含む（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ，Ｐａｃ．Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．２０００：１５５－６７）。第１のシステインは第３のシステインとジスルフィド結合を形成することができ、第２のシステインは第４のシステインとジスルフィド架橋を形成することができる。一対の親和性ドメインの一方のメンバーが可溶性ＩＬ－１５であるいくつかの実施形態では、可溶性ＩＬ１５は、Ｄ８ＮまたはＤ８Ａアミノ酸置換を有する。一対の親和性ドメインの一方のメンバーがヒトＩＬ－１５受容体アルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）であるいくつかの実施形態では、ヒトＩＬ１５Ｒαは、成熟全長ＩＬ１５Ｒαである。いくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインは、バルナーゼとバルンスターである。いくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインは、ＰＫＡとＡＫＡＰである。いくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインは、変異ＲＮａｓｅ Ｉ断片に基づくアダプター／ドッキングタグモジュール（Ｒｏｓｓｉ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０３：６８４１－６８４６，２００６、Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：５２８２－５２９０，２００８、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．３３：４７４－４８１，２０１２）、またはタンパク質シンタキシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン、およびＳＮＡＰ２５の相互作用に基づくＳＮＡＲＥモジュール（Ｄｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４８６－１４９２，２００３）である。
【0167】
いくつかの実施形態では、多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドは、一対の親和性ドメインの第１のドメインを含み、多鎖キメラポリペプチドの第２のキメラポリペプチドは、一対の親和性ドメインの第２のドメインを含み、一対の親和性ドメインの第１のドメインと一対の親和性ドメインの第２のドメインは、１×１０－７Ｍ未満、１×１０－８Ｍ未満、１×１０－９Ｍ未満、１×１０－１０Ｍ未満、１×１０－１１Ｍ未満、１×１０－１２Ｍ未満、または１×１０－１３Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）で互いに結合する。いくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインの第１のドメインと一対の親和性ドメインの第２のドメインは、約１×１０－４Ｍ～約１×１０－６Ｍ、約１×１０－５Ｍ～約１×１０－７Ｍ、約１×１０－６Ｍ～約１×１０－８Ｍ、約１×１０－７Ｍ～約１×１０－９Ｍ、約１×１０－８Ｍ～約１×１０－１０Ｍ、約１×１０－９Ｍ～約１×１０－１１Ｍ、約１×１０－１０Ｍ～約１×１０－１２Ｍ、約１×１０－１１Ｍ～約１×１０－１３Ｍ、約１×１０－４Ｍ～約１×１０－５Ｍ、約１×１０－５Ｍ～約１×１０－６Ｍ、約１×１０－６Ｍ～約１×１０－７Ｍ、約１×１０－７Ｍ～約１×１０－８Ｍ、約１×１０－８Ｍ～約１×１０－９Ｍ、約１×１０－９Ｍ～約１×１０－１０Ｍ、約１×１０－１０Ｍ～約１×１０－１１Ｍ、約１×１０－１１Ｍ～約１×１０－１２Ｍ、または約１×１０－１２Ｍ～約１×１０－１３Ｍ（その上限および下限も含む）のＫＤで互いに結合する。当該技術分野で既知の様々な異なる方法のうちのいずれかを使用して、一対の親和性ドメインの第１のドメインおよび一対の親和性ドメインの第２のドメインの結合のＫＤ値を決定することができる（例えば、電気泳動移動度シフトアッセイ、フィルター結合アッセイ、表面プラズモン共鳴、および生体分子結合反応速度アッセイ等）。
【0168】
いくつかの実施形態では、多鎖キメラポリペプチドの第１のキメラポリペプチドは、一対の親和性ドメインの第１のドメインを含み、多鎖キメラポリペプチドの第２のキメラポリペプチドは、一対の親和性ドメインの第２のドメインを含み、一対の親和性ドメインの第１のドメイン、一対の親和性ドメインの第２のドメイン、またはそれらの両方が、約１０～１００アミノ酸長である。例えば、一対の親和性ドメインの第１のドメイン、一対の親和性ドメインの第２のドメイン、またはそれらの両方は、約１０～１００アミノ酸長、約１５～１００アミノ酸長、約２０～１００アミノ酸長、約２５～１００アミノ酸長、約３０～１００アミノ酸長、約３５～１００アミノ酸長、約４０～１００アミノ酸長、約４５～１００アミノ酸長、約５０～１００アミノ酸長、約５５～１００アミノ酸長、約６０～１００アミノ酸長、約６５～１００アミノ酸長、約７０～１００アミノ酸長、約７５～１００アミノ酸長、約８０～１００アミノ酸長、約８５～１００アミノ酸長、約９０～１００アミノ酸長、約９５～１００アミノ酸長、約１０～９５アミノ酸長、約１０～９０アミノ酸長、約１０～８５アミノ酸長、約１０～８０アミノ酸長、約１０～７５アミノ酸長、約１０～７０アミノ酸長、約１０～６５アミノ酸長、約１０～６０アミノ酸長、約１０～５５アミノ酸長、約１０～５０アミノ酸長、約１０～４５アミノ酸長、約１０～４０アミノ酸長、約１０～３５アミノ酸長、約１０～３０アミノ酸長、約１０～２５アミノ酸長、約１０～２０アミノ酸長、約１０～１５アミノ酸長、約２０～３０アミノ酸長、約３０～４０アミノ酸長、約４０～５０アミノ酸長、約５０～６０アミノ酸長、約６０～７０アミノ酸長、約７０～８０アミノ酸長、約８０～９０アミノ酸長、約９０～１００アミノ酸長、約２０～９０アミノ酸長、約３０～８０アミノ酸長、約４０～７０アミノ酸長、約５０～６０アミノ酸長、またはそれらの間の任意の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインの第１のドメイン、一対の親和性ドメインの第２のドメイン、またはそれらの両方が、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸長である。
【0169】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される一対の親和性ドメインの第１および／または第２のドメインのうちのいずれかは、一対の親和性ドメインの第１および／または第２のドメインの機能が損なわれないままである限り、そのＮ末端および／またはＣ末端に１つ以上の追加のアミノ酸（例えば、１、２、３、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸）を含み得る。例えば、ヒトＩＬ－１５受容体アルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）由来のｓｕｓｈｉドメインは、可溶性ＩＬ－１５に結合する能力を依然として保持しながら、Ｎ末端および／またはＣ末端に１つ以上の追加のアミノ酸を含むことができる。加えてまたはあるいは、可溶性ＩＬ－１５は、ヒトＩＬ－１５受容体アルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）由来のｓｕｓｈｉドメインに結合する能力を依然として保持しながら、Ｎ末端および／またはＣ末端に１つ以上の追加のアミノ酸を含むことができる。
【0170】
ＩＬ－１５受容体アルファ鎖（ＩＬ１５Ｒα）由来のｓｕｓｈｉドメインの非限定的な例は、ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲ（配列番号９４）に少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５Ｒαのアルファ鎖由来のｓｕｓｈｉドメインは、ＡＴＴＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＣＡＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＧＴＡＴＡＴＣＴＧＴＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣＧＡＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＴＴＴＡＡＡＧＴＧＣＡＴＣＣＧＧ（配列番号９５）を含む核酸によってコードされ得る。
【0171】
いくつかの実施形態では、可溶性ＩＬ－１５は、ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ（配列番号９６）と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＩＬ－１５は、ＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＡＡＧＡＴＴＴＡＡＴＴＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＡＴＡＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＴＴＴＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＡＣＣＣＣＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＴＡＴＣＴＣＴＴＴＡＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＡＴＡＡＣＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＣＣＧＧＣＴＧＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＴＴＴＧＴＧＣＡＣＡＴＴＧＴＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＡＴＣＡＡＴＡＣＣＴＣＣ（配列番号９７）の配列を含む核酸によってコードされ得る。
【0172】
単鎖キメラポリペプチド
単鎖キメラポリペプチドは、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の標的結合ドメインのうちのいずれか）、可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）、および第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の標的結合ドメインのうちのいずれか）を含む。
単鎖キメラポリペプチドは、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の標的結合ドメインのうちのいずれか）、可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）、および第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の標的結合ドメインのうちのいずれか）を含む。
【0173】
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）と可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）は、互いに直接隣接している。本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）と可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）との間にリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）および第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）は、互いに直接隣接している。本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）と第２の標的結合ドメイン（本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）との間にリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。
【0174】
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）と第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）は、互いに直接隣接している。本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）と第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）との間にリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）と可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）は、互いに直接隣接している。本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）と可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）との間にリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。
【0175】
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの例では、単鎖キメラポリペプチドは、約５０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約５０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約５０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約５０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約５０アミノ酸～約４８０アミノ酸、約５０アミノ酸～約４６０アミノ酸、約５０アミノ酸～約４４０アミノ酸、約５０アミノ酸～約４２０アミノ酸、約５０アミノ酸～約４００アミノ酸、約５０アミノ酸～約３８０アミノ酸、約５０アミノ酸～約３６０アミノ酸、約５０アミノ酸～約３４０アミノ酸、約５０アミノ酸～約３２０アミノ酸、約５０アミノ酸～約３００アミノ酸、約５０アミノ酸～約２８０アミノ酸、約５０アミノ酸～約２６０アミノ酸、約５０アミノ酸～約２４０アミノ酸、約５０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約５０アミノ酸～約２００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１００アミノ酸、約１００アミノ酸～約３０００アミノ酸、約１００アミノ酸～約２５００アミノ酸、約１００アミノ酸～約２０００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約１００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約９００アミノ酸、約１００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約８００アミノ酸、約１００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約７００アミノ酸、約１００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約６００アミノ酸、約１００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約５００アミノ酸、約１００アミノ酸～約４８０アミノ酸、約１００アミノ酸～約４６０アミノ酸、約１００アミノ酸～約４４０アミノ酸、約１００アミノ酸～約４２０アミノ酸、約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、約１００アミノ酸～約３８０アミノ酸、約１００アミノ酸～約３６０アミノ酸、約１００アミノ酸～約３４０アミノ酸、約１００アミノ酸～約３２０アミノ酸、約１００アミノ酸～約３００アミノ酸、約１００アミノ酸～約２８０アミノ酸、約１００アミノ酸～約２６０アミノ酸、約１００アミノ酸～約２４０アミノ酸、約１００アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１００アミノ酸～約２００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約４８０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約４６０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約４４０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約４２０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約４００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約３８０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約３６０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約３４０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約３２０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約３００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２８０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２６０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２４０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２２０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２００アミノ酸、約２００アミノ酸～約３０００アミノ酸、約２００アミノ酸～約２５００アミノ酸、約２００アミノ酸～約２０００アミノ酸、約２００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約２００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約２００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約９００アミノ酸、約２００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約８００アミノ酸、約２００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約７００アミノ酸、約２００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約６００アミノ酸、約２００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約５００アミノ酸、約２００アミノ酸～約４８０アミノ酸、約２００アミノ酸～約４６０アミノ酸、約２００アミノ酸～約４４０アミノ酸、約２００アミノ酸～約４２０アミノ酸、約２００アミノ酸～約４００アミノ酸、約２００アミノ酸～約３８０アミノ酸、約２００アミノ酸～約３６０アミノ酸、約２００アミノ酸～約３４０アミノ酸、約２００アミノ酸～約３２０アミノ酸、約２００アミノ酸～約３００アミノ酸、約２００アミノ酸～約２８０アミノ酸、約２００アミノ酸～約２６０アミノ酸、約２００アミノ酸～約２４０アミノ酸、約２００アミノ酸～約２２０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約２２０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約２２０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約２２０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約２２０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約２２０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約９００アミノ酸、約２２０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約８００アミノ酸、約２２０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約７００アミノ酸、約２２０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約６００アミノ酸、約２２０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約５００アミノ酸、約２２０アミノ酸～約４８０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約４６０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約４４０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約４２０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約４００アミノ酸、約２２０アミノ酸～約３８０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約３６０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約３４０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約３２０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約３００アミノ酸、約２２０アミノ酸～約２８０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約２６０アミノ酸、約２２０アミノ酸～約２４０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約２４０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約２４０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約２４０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約２４０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約２４０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約９００アミノ酸、約２４０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約８００アミノ酸、約２４０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約７００アミノ酸、約２４０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約６００アミノ酸、約２４０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約５００アミノ酸、約２４０アミノ酸～約４８０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約４６０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約４４０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約４２０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約４００アミノ酸、約２４０アミノ酸～約３８０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約３６０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約３４０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約３２０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約３００アミノ酸、約２４０アミノ酸～約２８０アミノ酸、約２４０アミノ酸～約２６０アミノ酸、約２６０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約２６０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約２６０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約２６０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約２６０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約２６０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約２６０アミノ酸～約９００アミノ酸、約２６０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約２６０アミノ酸～約８００アミノ酸、約２６０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約２６０アミノ酸～約７００アミノ酸、約２６０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約２６０アミノ酸～約６００アミノ酸、約２６０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約２６０アミノ酸～約５００アミノ酸、約２６０アミノ酸～約４８０アミノ酸、約２６０アミノ酸～約４６０アミノ酸、約２６０アミノ酸～約４４０アミノ酸、約２６０アミノ酸～約４２０アミノ酸、約２６０アミノ酸～約４００アミノ酸、約２６０アミノ酸～約３８０アミノ酸、約２６０アミノ酸～約３６０アミノ酸、約２６０アミノ酸～約３４０アミノ酸、約２６０アミノ酸～約３２０アミノ酸、約２６０アミノ酸～約３００アミノ酸、約２６０アミノ酸～約２８０アミノ酸、約２８０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約２８０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約２８０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約２８０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約２８０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約２８０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約２８０アミノ酸～約９００アミノ酸、約２８０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約２８０アミノ酸～約８００アミノ酸、約２８０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約２８０アミノ酸～約７００アミノ酸、約２８０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約２８０アミノ酸～約６００アミノ酸、約２８０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約２８０アミノ酸～約５００アミノ酸、約２８０アミノ酸～約４８０アミノ酸、約２８０アミノ酸～約４６０アミノ酸、約２８０アミノ酸～約４４０アミノ酸、約２８０アミノ酸～約４２０アミノ酸、約２８０アミノ酸～約４００アミノ酸、約２８０アミノ酸～約３８０アミノ酸、約２８０アミノ酸～約３６０アミノ酸、約２８０アミノ酸～約３４０アミノ酸、約２８０アミノ酸～約３２０アミノ酸、約２８０アミノ酸～約３００アミノ酸、約３００アミノ酸～約３０００アミノ酸、約３００アミノ酸～約２５００アミノ酸、約３００アミノ酸～約２０００アミノ酸、約３００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約３００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約３００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約９００アミノ酸、約３００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約８００アミノ酸、約３００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約７００アミノ酸、約３００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約６００アミノ酸、約３００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約５００アミノ酸、約３００アミノ酸～約４８０アミノ酸、約３００アミノ酸～約４６０アミノ酸、約３００アミノ酸～約４４０アミノ酸、約３００アミノ酸～約４２０アミノ酸、約３００アミノ酸～約４００アミノ酸、約３００アミノ酸～約３８０アミノ酸、約３００アミノ酸～約３６０アミノ酸、約３００アミノ酸～約３４０アミノ酸、約３００アミノ酸～約３２０アミノ酸、約３２０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約３２０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約３２０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約３２０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約３２０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約３２０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約３２０アミノ酸～約９００アミノ酸、約３２０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約３２０アミノ酸～約８００アミノ酸、約３２０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約３２０アミノ酸～約７００アミノ酸、約３２０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約３２０アミノ酸～約６００アミノ酸、約３２０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約３２０アミノ酸～約５００アミノ酸、約３２０アミノ酸～約４８０アミノ酸、約３２０アミノ酸～約４６０アミノ酸、約３２０アミノ酸～約４４０アミノ酸、約３２０アミノ酸～約４２０アミノ酸、約３２０アミノ酸～約４００アミノ酸、約３２０アミノ酸～約３８０アミノ酸、約３２０アミノ酸～約３６０アミノ酸、約３２０アミノ酸～約３４０アミノ酸、約３４０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約３４０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約３４０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約３４０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約３４０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約３４０アミノ
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酸～約９５０アミノ酸、約３４０アミノ酸～約９００アミノ酸、約３４０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約３４０アミノ酸～約８００アミノ酸、約３４０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約３４０アミノ酸～約７００アミノ酸、約３４０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約３４０アミノ酸～約６００アミノ酸、約３４０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約３４０アミノ酸～約５００アミノ酸、約３４０アミノ酸～約４８０アミノ酸、約３４０アミノ酸～約４６０アミノ酸、約３４０アミノ酸～約４４０アミノ酸、約３４０アミノ酸～約４２０アミノ酸、約３４０アミノ酸～約４００アミノ酸、約３４０アミノ酸～約３８０アミノ酸、約３４０アミノ酸～約３６０アミノ酸、約３６０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約３６０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約３６０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約３６０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約３６０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約３６０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約３６０アミノ酸～約９００アミノ酸、約３６０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約３６０アミノ酸～約８００アミノ酸、約３６０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約３６０アミノ酸～約７００アミノ酸、約３６０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約３６０アミノ酸～約６００アミノ酸、約３６０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約３６０アミノ酸～約５００アミノ酸、約３６０アミノ酸～約４８０アミノ酸、約３６０アミノ酸～約４６０アミノ酸、約３６０アミノ酸～約４４０アミノ酸、約３６０アミノ酸～約４２０アミノ酸、約３６０アミノ酸～約４００アミノ酸、約３６０アミノ酸～約３８０アミノ酸、約３８０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約３８０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約３８０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約３８０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約３８０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約３８０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約３８０アミノ酸～約９００アミノ酸、約３８０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約３８０アミノ酸～約８００アミノ酸、約３８０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約３８０アミノ酸～約７００アミノ酸、約３８０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約３８０アミノ酸～約６００アミノ酸、約３８０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約３８０アミノ酸～約５００アミノ酸、約３８０アミノ酸～約４８０アミノ酸、約３８０アミノ酸～約４６０アミノ酸、約３８０アミノ酸～約４４０アミノ酸、約３８０アミノ酸～約４２０アミノ酸、約３８０アミノ酸～約４００アミノ酸、約４００アミノ酸～約３０００アミノ酸、約４００アミノ酸～約２５００アミノ酸、約４００アミノ酸～約２０００アミノ酸、約４００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約４００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約４００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約９００アミノ酸、約４００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約８００アミノ酸、約４００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約７００アミノ酸、約４００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約６００アミノ酸、約４００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約５００アミノ酸、約４００アミノ酸～約４８０アミノ酸、約４００アミノ酸～約４６０アミノ酸、約４００アミノ酸～約４４０アミノ酸、約４００アミノ酸～約４２０アミノ酸、約４２０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約４２０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約４２０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約４２０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約４２０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約４２０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約４２０アミノ酸～約９００アミノ酸、約４２０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約４２０アミノ酸～約８００アミノ酸、約４２０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約４２０アミノ酸～約７００アミノ酸、約４２０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約４２０アミノ酸～約６００アミノ酸、約４２０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約４２０アミノ酸～約５００アミノ酸、約４２０アミノ酸～約４８０アミノ酸、約４２０アミノ酸～約４６０アミノ酸、約４２０アミノ酸～約４４０アミノ酸、約４４０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約４４０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約４４０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約４４０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約４４０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約４４０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約４４０アミノ酸～約９００アミノ酸、約４４０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約４４０アミノ酸～約８００アミノ酸、約４４０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約４４０アミノ酸～約７００アミノ酸、約４４０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約４４０アミノ酸～約６００アミノ酸、約４４０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約４４０アミノ酸～約５００アミノ酸、約４４０アミノ酸～約４８０アミノ酸、約４４０アミノ酸～約４６０アミノ酸、約４６０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約４６０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約４６０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約４６０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約４６０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約４６０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約４６０アミノ酸～約９００アミノ酸、約４６０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約４６０アミノ酸～約８００アミノ酸、約４６０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約４６０アミノ酸～約７００アミノ酸、約４６０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約４６０アミノ酸～約６００アミノ酸、約４６０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約４６０アミノ酸～約５００アミノ酸、約４６０アミノ酸～約４８０アミノ酸、約４８０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約４８０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約４８０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約４８０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約４８０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約４８０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約４８０アミノ酸～約９００アミノ酸、約４８０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約４８０アミノ酸～約８００アミノ酸、約４８０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約４８０アミノ酸～約７００アミノ酸、約４８０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約４８０アミノ酸～約６００アミノ酸、約４８０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約４８０アミノ酸～約５００アミノ酸、約５００アミノ酸～約３０００アミノ酸、約５００アミノ酸～約２５００アミノ酸、約５００アミノ酸～約２０００アミノ酸、約５００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約５００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約５００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約９００アミノ酸、約５００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約８００アミノ酸、約５００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約７００アミノ酸、約５００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約６００アミノ酸、約５００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約６００アミノ酸～約３０００アミノ酸、約６００アミノ酸～約２５００アミノ酸、約６００アミノ酸～約２０００アミノ酸、約６００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約６００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約６００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約９００アミノ酸、約６００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約８００アミノ酸、約６００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約７００アミノ酸、約６００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約７００アミノ酸～約３０００アミノ酸、約７００アミノ酸～約２５００アミノ酸、約７００アミノ酸～約２０００アミノ酸、約７００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約７００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約７００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約７００アミノ酸～約９００アミノ酸、約７００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約７００アミノ酸～約８００アミノ酸、約７００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約８００アミノ酸～約３０００アミノ酸、約８００アミノ酸～約２５００アミノ酸、約８００アミノ酸～約２０００アミノ酸、約８００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約８００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約８００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約８００アミノ酸～約９００アミノ酸、約８００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約８５０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約８５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約９００アミノ酸～約３０００アミノ酸、約９００アミノ酸～約２５００アミノ酸、約９００アミノ酸～約２０００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約９００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約３０００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約２５００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約２０００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約３０００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約２５００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約２０００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１５００アミノ酸～約３０００アミノ酸、約１５００アミノ酸～約２５００アミノ酸、約１５００アミノ酸～約２０００アミノ酸、約２０００アミノ酸～約３０００アミノ酸、約２０００アミノ酸～約２５００アミノ酸、または約２５００アミノ酸～約３０００アミノ酸の全長を有し得る。
【0176】
単鎖キメラポリペプチドである例示的なＩＬ－２受容体活性化剤
いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、ＩＬ－２受容体活性化剤であり得る。かかる実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび／または第２の標的結合ドメインの一方または両方が、ＩＬ－２受容体（例えば、ヒトＩＬ－２受容体）に結合する。
いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、ＩＬ－２受容体活性化剤であり得る。かかる実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび／または第２の標的結合ドメインの一方または両方が、ＩＬ－２受容体（例えば、ヒトＩＬ－２受容体）に結合する。
【0177】
ＩＬ－２受容体活性化剤である単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび／または第２の標的結合ドメインは、ＩＬ－２受容体（例えば、ヒトＩＬ－２受容体）に特異的に結合するアゴニスト抗原結合ドメインであり得る（例えば、Ｇａｕｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．３６（１）：１８－２９，１９８５）に記載のものを参照のこと）。
【0178】
ＩＬ－２受容体活性化剤である単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインの一方または両方が、可溶性インターロイキン２（ＩＬ－２）タンパク質であり得る。可溶性ＩＬ－２の例示的な配列が以下に提供される。
【0179】
ヒト可溶性ＩＬ－２（配列番号１）
【0180】
これらの単鎖キメラポリペプチドのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインは、可溶性ヒトＩＬ－２タンパク質である。ＩＬ－２受容体に特異的に結合するＩＬ－２タンパク質の非限定的な例は、配列番号１と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含み得る。
【0181】
いくつかの実施形態では、可溶性ヒトＩＬ－２タンパク質は、ＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＴＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＡＡＣＴ（配列番号３１）と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列によってコードされ得る。
【0182】
いくつかの実施形態では、可溶性ヒトＩＬ－２タンパク質は、ＧＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＴＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣＡＧＴＧＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＡＡＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣ（配列番号３２）と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列によってコードされ得る。
【0183】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２受容体活性化剤である単鎖キメラポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＫＴＩＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＤＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＲＲＮＮＴＦＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３）と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含み得る。
【0184】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２受容体活性化剤である単鎖キメラポリペプチドは、ＧＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＴＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣＡＧＴＧＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＡＡＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＡＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＧＴＣＧＣＴＧＣＣＴＡＴＡＡＣＣＴＣＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＣＣＡＴＣＣＴＣＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣＧＴＴＡＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＡＡＴＧＴＴＴＣＴＡＴＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＡＧＴＧＣＧＡＴＣＴＣＡＣＣＧＡＴＧＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＴＡＣＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＧＴＴＴＡＧＣＴＡＣＣＣＣＧＣＣＧＧＣＡＡＴＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＣＴＴＴＡＴＡＣＧＡＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＡＴＴＴＡＣＣＣＣＴＴＡＣＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＧＡＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＧＧＡＣＴＴＴＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＴＴＴＡＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＧＧＡＴＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＣＡＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＧＴＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＴＡＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＴＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＡＡＣＴ（配列番号１１）と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含み得る。
【0185】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２受容体活性化剤である単鎖キメラポリペプチドは、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＫＴＩＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＤＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＲＲＮＮＴＦＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４）と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含み得る。
【0186】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２受容体活性化剤である単鎖キメラポリペプチドは、ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＴＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣＡＧＴＧＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＡＡＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＡＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＧＴＣＧＣＴＧＣＣＴＡＴＡＡＣＣＴＣＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＣＣＡＴＣＣＴＣＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣＧＴＴＡＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＡＡＴＧＴＴＴＣＴＡＴＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＡＧＴＧＣＧＡＴＣＴＣＡＣＣＧＡＴＧＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＴＡＣＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＧＴＴＴＡＧＣＴＡＣＣＣＣＧＣＣＧＧＣＡＡＴＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＣＴＴＴＡＴＡＣＧＡＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＡＴＴＴＡＣＣＣＣＴＴＡＣＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＧＡＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＧＧＡＣＴＴＴＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＴＴＴＡＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＧＧＡＴＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＣＡＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＧＴＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＴＡＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＴＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＡＡＣＴ（配列番号１２）と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含み得る。
【0187】
単鎖キメラポリペプチドである例示的なＣＤ３／ＣＤ３８結合剤
単鎖キメラポリペプチドがＣＤ３／ＣＤ２８結合剤であるいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインは、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３δ（例えば、ヒトＣＤ３Λ）、ＣＤ３Μ（例えば、ヒトＣＤ３Μ）、ＣＤ３Κ（例えば、ヒト ＣＤ３Κ）、およびＣＤ３Ν（例えば、ヒトＣＤ３Ν）のうちの１つ以上）に特異的に結合し、第２の標的結合ドメインは、ＣＤ２８（例えば、ヒトＣＤ２８）に特異的に結合する。
単鎖キメラポリペプチドがＣＤ３／ＣＤ２８結合剤であるいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインは、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３δ（例えば、ヒトＣＤ３Λ）、ＣＤ３Μ（例えば、ヒトＣＤ３Μ）、ＣＤ３Κ（例えば、ヒト ＣＤ３Κ）、およびＣＤ３Ν（例えば、ヒトＣＤ３Ν）のうちの１つ以上）に特異的に結合し、第２の標的結合ドメインは、ＣＤ２８（例えば、ヒトＣＤ２８）に特異的に結合する。
【0188】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３δ（例えば、ヒトＣＤ３Λ）、ＣＤ３Μ（例えば、ヒトＣＤ３Μ）、ＣＤ３Κ（例えば、ヒト ＣＤ３Κ）、およびＣＤ３Ν（例えば、ヒトＣＤ３Ν）のうちの１つ以上）に特異的に結合する第１の標的結合ドメインは、抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な抗原結合ドメインのうちのいずれか、例えば、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ）である。
【0189】
いくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメインは、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖであり得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号２１）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む重鎖可変ドメイン、および／またはＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲ（配列番号２２）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む軽鎖可変ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ（例えば、本明細書に記載のｓｃＦｖのうちのいずれか）は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間にリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）を含み得る。
【0190】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＣＴＣＧＣＴＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＴＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＧＧＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＡＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＡＴＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＴＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＡＣＴＡＣＧＡＣＧＡＴＣＡＴＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＣ（配列番号２３）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む核酸によってコードされる重鎖可変ドメイン、および／またはＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＴＴＡＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＣＣＣＧＧＴＧＡＡＡＡＧＧＴＧＡＣＴＡＴＧＡＣＡＴＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＴＧＡＧＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＧＡＧＧＡＴＧＣＣＧＣＴＡＣＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＡＴＴＡＡＴＣＧＴ（配列番号２４）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む核酸によってコードされる軽鎖可変ドメインを含み得る。
【0191】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号５）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、配列番号５に存在する６つのＣＤＲを含み得る。
【0192】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＴＴＡＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＣＣＣＧＧＴＧＡＡＡＡＧＧＴＧＡＣＴＡＴＧＡＣＡＴＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＴＧＡＧＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＧＡＧＧＡＴＧＣＣＧＣＴＡＣＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＡＴＴＡＡＴＣＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＡＧＣＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＣＴＣＧＣＴＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＴＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＧＧＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＡＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＡＴＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＴＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＡＣＴＡＣＧＡＣＧＡＴＣＡＴＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＣ（配列番号２５）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の核酸配列によってコードされる配列を含み得る。
【0193】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２８（例えば、ヒトＣＤ２８）に特異的に結合する第２の標的結合ドメインは、抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な抗原結合ドメインのいずれか、例えば、抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖ）である。
【0194】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖは、ＤＩＥＭＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＦＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＣＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＰＲＦＳＧＳＧＳＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＦＣＨＱＹＨＲＳＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＴＫＲ（配列番号２６）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む重鎖可変ドメイン、および／またはＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＱＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＮＰＹＮＤＹＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＩＴＡＹＭＥＦＳＳＬＴＳＥＤＳＡＬＹＹＣＡＲＷＧＤＧＮＹＷＧＲＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号２７）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む軽鎖可変ドメインを含み得る。
【0195】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖは、ＧＡＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＴＴＴＡＧＧＡＧＡＡＣＧＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＡＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＴＴＴＡＧＣＴＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＴＡＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＣＧＧ（配列番号２８）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む核酸によってコードされる重鎖可変ドメイン、および／またはＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＡＣＧＴＣＡＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＴＴＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＣＴＴＴＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧＧＧＧＣＧＡＴＧＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＡＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣ（配列番号２９）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む核酸によってコードされる軽鎖可変ドメインを含み得る。
【0196】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖは、ＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＱＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＮＰＹＮＤＹＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＩＴＡＹＭＥＦＳＳＬＴＳＥＤＳＡＬＹＹＣＡＲＷＧＤＧＮＹＷＧＲＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＥＭＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＦＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＣＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＰＲＦＳＧＳＧＳＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＦＣＨＱＹＨＲＳＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＴＫＲ（配列番号６）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖは、配列番号６に存在する６つのＣＤＲを含み得る。
【0197】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖは、ＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＡＣＧＴＣＡＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＴＴＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＣＴＴＴＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧＧＧＧＣＧＡＴＧＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＡＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＴＴＴＡＧＧＡＧＡＡＣＧＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＡＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＴＴＴＡＧＣＴＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＴＡＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＣＧＧ（配列番号３０）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の核酸配列によってコードされる配列を含み得る。
【0198】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤である単鎖キメラポリペプチドは、ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＫＴＩＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＤＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＲＲＮＮＴＦＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＱＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＮＰＹＮＤＹＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＩＴＡＹＭＥＦＳＳＬＴＳＥＤＳＡＬＹＹＣＡＲＷＧＤＧＮＹＷＧＲＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＥＭＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＦＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＣＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＰＲＦＳＧＳＧＳＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＦＣＨＱＹＨＲＳＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＴＫＲ（配列番号７）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含み得る。
【0199】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤である単鎖キメラポリペプチドは、ＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＣＣＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＴＴＣＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＣＴＣＧＴＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＡＴＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＴＡＡＡＧＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＡＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＧＧＴＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＡＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＡＡＣＣＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＡＧＴＧＴＧＡＴＴＴＡＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＡＡＡＣＣＴＡＴＣＴＧＧＣＴＣＧＧＧＴＣＴＴＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＴＣＴＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＴＡＴＴＴＡＧＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＣＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＡＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＴＡＣＣＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＴＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＣＣＣＧＡＡＣＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＣＧＧＴＧＣＴＴＣＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＴＡＴＧＴＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＣＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＡＣＧＡＣＴＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＡＡＧＧＧＡＡＡＧＧＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＣＴＣＣＧＡＣＡＡＡＡＧＣＴＣＣＡＴＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＴＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＴＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＴＧＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＣＡＡＣＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＴＣＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＴＡＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＴＣＡＣＡＡＴＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＴＴＣＣＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＧＴＧＣＡＴＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣＴＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＴＡＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＴＴＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＧＧ（配列番号９）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む核酸によってコードされる
【0200】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤である単鎖キメラポリペプチドは、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＫＴＩＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＤＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＲＲＮＮＴＦＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＱＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＮＰＹＮＤＹＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＩＴＡＹＭＥＦＳＳＬＴＳＥＤＳＡＬＹＹＣＡＲＷＧＤＧＮＹＷＧＲＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＥＭＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＦＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＣＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＰＲＦＳＧＳＧＳＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＦＣＨＱＹＨＲＳＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＴＫＲ（配列番号８）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含み得る。
【0201】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤である単鎖キメラポリペプチドは、ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＡＴＴＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＣＣＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＴＴＣＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＣＴＣＧＴＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＡＴＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＴＡＡＡＧＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＡＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＧＧＴＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＡＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＡＡＣＣＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＡＧＴＧＴＧＡＴＴＴＡＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＡＡＡＣＣＴＡＴＣＴＧＧＣＴＣＧＧＧＴＣＴＴＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＴＣＴＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＴＡＴＴＴＡＧＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＣＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＡＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＴＡＣＣＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＴＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＣＣＣＧＡＡＣＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＣＧＧＴＧＣＴＴＣＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＴＡＴＧＴＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＣＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＡＣＧＡＣＴＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＡＡＧＧＧＡＡＡＧＧＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＣＴＣＣＧＡＣＡＡＡＡＧＣＴＣＣＡＴＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＴＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＴＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＴＧＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＣＡＡＣＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＴＣＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＴＡＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＴＣＡＣＡＡＴＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＴＴＣＣＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＧＴＧＣＡＴＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣＴＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＴＡＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＴＴＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＧＧ（配列番号１０）と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む核酸によってコードされる。
【0202】
追加の抗原結合ドメイン
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態は、そのＮ末端および／またはＣ末端に１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）をさらに含み得る。
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態は、そのＮ末端および／またはＣ末端に１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）をさらに含み得る。
【0203】
いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、そのＮ末端に１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）を含み得る。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドのＮ末端の１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの１つは、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、または可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）に直接隣接し得る。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、単鎖キメラポリペプチドのＮ末端の少なくとも１つの追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの１つと、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、または可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）との間に、リンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。
【0204】
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、そのＣ末端に１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）を含む。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドのＣ末端の１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの１つは、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、または可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）に直接隣接している。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、単鎖キメラポリペプチドのＣ末端の少なくとも１つの追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの１つと、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、または可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）との間に、リンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。
【0205】
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、そのＮ末端およびそのＣ末端に１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）を含む。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドのＮ末端の１つ以上の追加の抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの１つは、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、または可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）に直接隣接している。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、Ｎ末端の１つ以上の追加の抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの１つと、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、または可溶性組織因子ドメイン（例えば、例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）との間に、リンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端の１つ以上の追加の抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの１つは、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、または可溶性組織因子ドメイン（例えば、例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）に直接隣接している。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、Ｃ末端の１つ以上の追加の抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの１つと、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、または可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）との間に、リンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。
【0206】
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、および１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０）は、同じ抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、および１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０）は、同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、および１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０）は、同じアミノ酸配列を含む。
【0207】
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、および１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）は各々、同じ抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、および１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）は各々、同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の追加の標的結合ドメインは各々、同じアミノ酸配列を含む。
【0208】
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、および１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）は、異なる抗原に特異的に結合する。
【0209】
単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および１つ以上の標的結合ドメインのうちの１つ以上が、抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）である。本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および１つ以上の追加の標的結合ドメインは各々、抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）である。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体を含み得る。
【0210】
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、および１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）が、ＣＤ２８、ＣＤ３、またはＩＬ－２受容体に特異的に結合する。
【0211】
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）、および１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの１つ以上が、可溶性ＩＬ－２である。
【0212】
多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）をさらに含み、１つ以上の追加の抗原結合ドメインのうちの少なくとも１つが、可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）と一対の親和性ドメインの第１のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの例示的な第１のドメインのうちのいずれか）との間に位置付けられている。いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）と１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの少なくとも１つとの間にリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）、および／または１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの少なくとも１つと一対の親和性ドメインの第１のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの本明細書に記載の例示的な第１のドメインのうちのいずれか）との間にリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含み得る。
【0213】
本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、第１のキメラポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の追加の標的結合ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの少なくとも１つは、第１のキメラポリペプチド内の一対の親和性ドメインの第１のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの本明細書に記載の例示的な第１のドメインのうちのいずれか）に直接隣接している。いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの少なくとも１つと一対の親和性ドメインの第１のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの本明細書に記載の例示的な第１のドメインのうちのいずれか）との間にリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの少なくとも１つは、第１のキメラポリペプチド内の第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）に直接隣接している。いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの少なくとも１つと第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）との間にリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。
【0214】
本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの少なくとも１つは、第１のキメラポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に配置されており、１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの少なくとも１つは、第１のキメラポリペプチド内の可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）と一対の親和性ドメインの第１のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの例示的な第１のドメインのうちのいずれか）との間に位置付けられている。いくつかの実施形態では、Ｎ末端に配置された１つ以上の追加の標的結合ドメインのうちの少なくとも１つの追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）は、第１のキメラポリペプチド内の第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）または一対の親和性ドメインの第１のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの本明細書に記載の例示的な第１のドメインのうちのいずれか）に直接隣接している。いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、第１のキメラポリペプチド内の少なくとも１つの追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）と第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）または一対の親和性ドメインの第１のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの本明細書に記載の例示的な第１のドメインのうちのいずれか）との間に配置されたリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知のリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端に配置された１つ以上の追加の標的結合ドメインのうちの少なくとも１つの追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）は、第１のキメラポリペプチド内の第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）または一対の親和性ドメインの第１のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの例示的な第１のドメインのうちのいずれか）に直接隣接している。いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、第１のキメラポリペプチド内の少なくとも１つの追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）と第１の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）または一対の親和性ドメインの第１のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの本明細書に記載の例示的な第１のドメインのうちのいずれか）との間に配置されたリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。いくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）と一対の親和性ドメインの第１のドメイン（例えば、本明細書に記載の第１のドメインのうちのいずれかまたは本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれか）との間に位置付けられた１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの少なくとも１つは、可溶性組織因子ドメインおよび／または一対の親和性ドメインの第１のドメインに直接隣接している。いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、（ｉ）可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子のうちのいずれか）と、可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性組織因子のうちのいずれか）と一対の親和性ドメインの第１のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの例示的な第１のドメインのうちのいずれか）との間に位置付けられた１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの少なくとも１つとの間、および／または（ｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインと、可溶性組織因子ドメインと一対の親和性ドメインの第１のドメインとの間に位置付けられた１つ以上の追加の標的結合ドメインのうちの少なくとも１つとの間に配置されたリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。
【0215】
本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、第２のキメラポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの少なくとも１つは、第２のキメラポリペプチド内の一対の親和性ドメインの第２のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの例示的な第２のドメインのうちのいずれか）に直接隣接している。いくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、第２のキメラポリペプチド内の１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの少なくとも１つと一対の親和性ドメインの第２のドメイン（例えば、本明細書に記載の例示的な一対の親和性ドメインのうちのいずれかの本明細書に記載の例示的な第２のドメインのうちのいずれか）との間にリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの少なくとも１つは、第２のキメラポリペプチド内の第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の標的結合ドメインのうちのいずれか）に直接隣接している。いくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、第２のキメラポリペプチド内の１つ以上の追加の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）のうちの少なくとも１つと第２の標的結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか）との間にリンカー配列（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的なリンカー配列のうちのいずれか）をさらに含む。
【0216】
本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および１つ以上の追加の標的結合ドメインのうちの２つ以上（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、またはそれ以上）が、同じ抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および１つ以上の追加の標的結合ドメインのうちの２つ以上（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、またはそれ以上）が、同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および１つ以上の追加の標的結合ドメインのうちの２つ以上（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、またはそれ以上）が、同じアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および１つ以上の追加の標的結合ドメインは各々、同じ抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および１つ以上の追加の標的結合ドメインは各々、同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および１つ以上の追加の標的結合ドメインは各々、同じアミノ酸配列を含む。
【0217】
本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および１つ以上の追加の標的結合ドメインは、異なる抗原に特異的に結合する。本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および１つ以上の追加の標的結合ドメインのうちの１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、またはそれ以上）が、抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の標的結合ドメイン、第２の標的結合ドメイン、および１つ以上の追加の標的結合ドメインは各々、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体）である。
【0218】
シグナル配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、そのＮ末端にシグナル配列をさらに含み得る。当業者に理解されるように、シグナル配列は、タンパク質を分泌経路に指向するいくつかの内因的に産生されたタンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸配列である（例えば、タンパク質は、ある特定の細胞内オルガネラに存在するか、細胞膜に存在するか、または細胞から分泌されるように指示される）。シグナル配列は不均一であり、それらの一次アミノ酸配列が大きく異なる。しかしながら、シグナル配列は、典型的には、１６～３０アミノ酸長であり、親水性の通常は正に帯電したＮ末端領域、中央の疎水性ドメイン、およびシグナルペプチダーゼの切断部位を含むＣ末端領域を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、そのＮ末端にシグナル配列をさらに含み得る。当業者に理解されるように、シグナル配列は、タンパク質を分泌経路に指向するいくつかの内因的に産生されたタンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸配列である（例えば、タンパク質は、ある特定の細胞内オルガネラに存在するか、細胞膜に存在するか、または細胞から分泌されるように指示される）。シグナル配列は不均一であり、それらの一次アミノ酸配列が大きく異なる。しかしながら、シグナル配列は、典型的には、１６～３０アミノ酸長であり、親水性の通常は正に帯電したＮ末端領域、中央の疎水性ドメイン、およびシグナルペプチダーゼの切断部位を含むＣ末端領域を含む。
【0219】
いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、アミノ酸配列ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ（配列番号３３）を有するシグナル配列を含み得る。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、核酸配列：
ＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＡＣＴＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＣ（配列番号３４）、
ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＡＣＡＴＴＴＡＴＣＴＣＴＴＴＡＣＴＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣ（配列番号３５）、
ＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＡＣＴＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＣ（配列番号３６）、または
ＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣ（配列番号１０１）
によってコードされるシグナル配列を含み得る。
ＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＡＣＴＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＣ（配列番号３４）、
ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＡＣＡＴＴＴＡＴＣＴＣＴＴＴＡＣＴＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣ（配列番号３５）、
ＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＡＣＴＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＣ（配列番号３６）、または
ＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣ（配列番号１０１）
によってコードされるシグナル配列を含み得る。
【0220】
いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、アミノ酸配列ＭＫＣＬＬＹＬＡＦＬＦＬＧＶＮＣ（配列番号３７）を有するシグナル配列を含み得る。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、アミノ酸配列ＭＧＱＩＶＴＭＦＥＡＬＰＨＩＩＤＥＶＩＮＩＶＩＩＶＬＩＩＩＴＳＩＫＡＶＹＮＦＡＴＣＧＩＬＡＬＶＳＦＬＦＬＡＧＲＳＣＧ（配列番号３８）を有するシグナル配列を含み得る。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、アミノ酸配列ＭＰＮＨＱＳＧＳＰＴＧＳＳＤＬＬＬＳＧＫＫＱＲＰＨＬＡＬＲＲＫＲＲＲＥＭＲＫＩＮＲＫＶＲＲＭＮＬＡＰＩＫＥＫＴＡＷＱＨＬＱＡＬＩＳＥＡＥＥＶＬＫＴＳＱＴＰＱＮＳＬＴＬＦＬＡＬＬＳＶＬＧＰＰＶＴＧ（配列番号３９）を有するシグナル配列を含み得る。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、アミノ酸配列ＭＤＳＫＧＳＳＱＫＧＳＲＬＬＬＬＬＶＶＳＮＬＬＬＣＱＧＶＶＳ（配列番号４０）を有するシグナル配列を含み得る。当業者であれば、単鎖キメラポリペプチドでの使用に適切な他のシグナル配列を認識しているであろう。
【0221】
いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、約１０～１００アミノ酸長のシグナル配列を含み得る。例えば、シグナル配列は、約１０～１００アミノ酸長、約１５～１００アミノ酸長、約２０～１００アミノ酸長、約２５～１００アミノ酸長、約３０～１００アミノ酸長、約３５～１００アミノ酸長、約４０～１００アミノ酸長、約４５～１００アミノ酸長、約５０～１００アミノ酸長、約５５～１００アミノ酸長、約６０～１００アミノ酸長、約６５～１００アミノ酸長、約７０～１００アミノ酸長、約７５～１００アミノ酸長、約８０～１００アミノ酸長、約８５～１００アミノ酸長、約９０～１００アミノ酸長、約９５～１００アミノ酸長、約１０～９５アミノ酸長、約１０～９０アミノ酸長、約１０～８５アミノ酸長、約１０～８０アミノ酸長、約１０～７５アミノ酸長、約１０～７０アミノ酸長、約１０～６５アミノ酸長、約１０～６０アミノ酸長、約１０～５５アミノ酸長、約１０～５０アミノ酸長、約１０～４５アミノ酸長、約１０～４０アミノ酸長、約１０～３５アミノ酸長、約１０～３０アミノ酸長、約１０～２５アミノ酸長、約１０～２０アミノ酸長、約１０～１５アミノ酸長、約２０～３０アミノ酸長、約３０～４０アミノ酸長、約４０～５０アミノ酸長、約５０～６０アミノ酸長、約６０～７０アミノ酸長、約７０～８０アミノ酸長、約８０～９０アミノ酸長、約９０～１００アミノ酸長、約２０～９０アミノ酸長、約３０～８０アミノ酸長、約４０～７０アミノ酸長、約５０～６０アミノ酸長、またはそれらの間の任意の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸長である。
【0222】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるシグナル配列のうちのいずれかは、シグナル配列の機能が損なわれないままである限り、そのＮ末端および／またはＣ末端に１つ以上の追加のアミノ酸（例えば、１、２、３、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸）を含み得る。例えば、アミノ酸配列ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ（配列番号３３）を有するシグナル配列は、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドを分泌経路に指向する能力を依然として保持しながら、Ｎ末端またはＣ末端に１つ以上の追加のアミノ酸を含むことができる。
【0223】
いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドを細胞外空間に指向するシグナル配列を含み得る。かかる実施形態は、単離および／または精製が比較的容易な単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、およびは第２のキメラポリペプチドを生成するのに有用である。
【0224】
ペプチドタグ
いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、（例えば、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に）ペプチドタグを含み得る。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、２つ以上のペプチドタグを含む。
いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、（例えば、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に）ペプチドタグを含み得る。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、２つ以上のペプチドタグを含む。
【0225】
単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドに含まれ得る例示的なペプチドタグには、ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、配列番号４１）、カルモジュリンタグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ、配列番号４２）、ポリグルタミン酸タグ（ＥＥＥＥＥＥ、配列番号４３）、Ｅタグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ、配列番号４４）、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号４５）、ＨＡタグ、血球凝集素由来のペプチド（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号４６）、ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨ（配列番号４７）、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号４８）、ＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号４９）、ＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号５０）、ＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号５１）、またはＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号５２））、ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号５３）、ＮＥタグ（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ、配列番号５４）、Ｓタグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ、配列番号５５）、ＳＢＰタグ（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ、配列番号５６）、Ｓｏｆｔａｇ １（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ、配列番号５７）、Ｓｏｆｔａｇ ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ、配列番号５８）、Ｓｐｏｔタグ（ＰＤＲＶＲＡＶＳＨＷＳＳ、配列番号５９）、Ｓｔｒｅｐタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号６０）、ＴＣタグ（ＣＣＰＧＣＣ、配列番号６１）、Ｔｙタグ（ＥＶＨＴＮＱＤＰＬＤ、配列番号６２）、Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ、配列番号６３）、ＶＳＶタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ、配列番号６４）、およびＸｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ、配列番号６５）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組織因子タンパク質は、ペプチドタグである。
【0226】
単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドに含まれ得るペプチドタグは、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドに関連する様々な用途のうちのいずれかに使用され得る。例えば、ペプチドタグは、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドの精製に使用され得る。１つの非限定的な例として、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、ｍｙｃタグを含み得、ｍｙｃタグを認識する抗体を使用して精製され得る。ｍｙｃタグを認識する抗体の１つの非限定的な例は、非営利Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋから入手可能な９Ｅ１０である。別の非限定的な例として、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、ヒスチジンタグを含み得、ニッケルまたはコバルトキレートを使用して精製され得る。当業者であれば、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドの精製における使用に好適なそれらのタグに結合する他のタグおよび薬剤を認識しているであろう。いくつかの実施形態では、ペプチドタグは、精製後に、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドから除去される。いくつかの実施形態では、ペプチドタグは、精製後に、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドから除去されない。
【0227】
単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドに含まれ得るペプチドタグは、例えば、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドの免疫沈降、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドの画像化（例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、および／または免疫細胞化学による）、および／または単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドの可溶化に使用され得る。
【0228】
いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドは、約１０～１００アミノ酸長のペプチドタグを含み得る。例えば、ペプチドタグは、約１０～１００アミノ酸長、約１５～１００アミノ酸長、約２０～１００アミノ酸長、約２５～１００アミノ酸長、約３０～１００アミノ酸長、約３５～１００アミノ酸長、約４０～１００アミノ酸長、約４５～１００アミノ酸長、約５０～１００アミノ酸長、約５５～１００アミノ酸長、約６０～１００アミノ酸長、約６５～１００アミノ酸長、約７０～１００アミノ酸長、約７５～１００アミノ酸長、約８０～１００アミノ酸長、約８５～１００アミノ酸長、約９０～１００アミノ酸長、約９５～１００アミノ酸長、約１０～９５アミノ酸長、約１０～９０アミノ酸長、約１０～８５アミノ酸長、約１０～８０アミノ酸長、約１０～７５アミノ酸長、約１０～７０アミノ酸長、約１０～６５アミノ酸長、約１０～６０アミノ酸長、約１０～５５アミノ酸長、約１０～５０アミノ酸長、約１０～４５アミノ酸長、約１０～４０アミノ酸長、約１０～３５アミノ酸長、約１０～３０アミノ酸長、約１０～２５アミノ酸長、約１０～２０アミノ酸長、約１０～１５アミノ酸長、約２０～３０アミノ酸長、約３０～４０アミノ酸長、約４０～５０アミノ酸長、約５０～６０アミノ酸長、約６０～７０アミノ酸長、約７０～８０アミノ酸長、約８０～９０アミノ酸長、約９０～１００アミノ酸長、約２０～９０アミノ酸長、約３０～８０アミノ酸長、約４０～７０アミノ酸長、約５０～６０アミノ酸長、またはそれらの間の任意の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドタグは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸長である。
【0229】
単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドに含まれるペプチドタグは、任意の好適な長さのものであり得る。例えば、ペプチドタグは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。単鎖キメラポリペプチド、第１のキメラポリペプチド、または第２のキメラポリペプチドが２つ以上のペプチドタグを含む実施形態では、２つ以上のペプチドタグは、同じ長さまたは異なる長さのものであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチドタグのうちのいずれかは、ペプチドタグの機能が損なわれないままである限り、Ｎ末端および／またはＣ末端に１つ以上の追加のアミノ酸（例えば、１、２、３、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸）を含み得る。例えば、アミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号５３）を有するｍｙｃタグは、抗体（例えば、９Ｅ１０）によって結合される能力を依然として保持しながら、（例えば、ペプチドタグのＮ末端および／またはＣ末端）に１つ以上の追加のアミノ酸を含み得る。
【0230】
ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤
１つ以上のＣＤ３／ＣＤ２８結合剤の使用を含む方法が本明細書に提供される。ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、例えば、単鎖キメラポリペプチド、多鎖キメラポリペプチド、二重特異性抗体、または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズであり得る。
１つ以上のＣＤ３／ＣＤ２８結合剤の使用を含む方法が本明細書に提供される。ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、例えば、単鎖キメラポリペプチド、多鎖キメラポリペプチド、二重特異性抗体、または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズであり得る。
【0231】
単鎖キメラポリペプチド
ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤の非限定的な例は、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであり、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する。ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤である単鎖キメラポリペプチドの非限定的な例は、本明細書に記載されている。
ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤の非限定的な例は、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであり、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する。ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤である単鎖キメラポリペプチドの非限定的な例は、本明細書に記載されている。
【0232】
多鎖キメラポリペプチド
ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤の非限定的な例は、多鎖キメラポリペプチドであり、多鎖キメラポリペプチドが、（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチドと、（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメインおよび（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合し、第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合するか、または第１の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ３に結合する。
ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤の非限定的な例は、多鎖キメラポリペプチドであり、多鎖キメラポリペプチドが、（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチドと、（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメインおよび（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合し、第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合するか、または第１の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ３に結合する。
【0233】
いくつかの実施形態では、液体培養培地は、多鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、配列番号６６、６７または７４、および６８のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号６９、７０、および７１のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２と少なくとも９０％同一の配列番号を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３と少なくとも９０％同一の配列番号を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号７２を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７３を含む。
【0234】
いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインは、互いに直接隣接している。いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、第１の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインと第２のキメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、互いに直接隣接している。いくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、可溶性組織因子ドメインと第２の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。
【0235】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３である。いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインは、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む。
【0236】
いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインである。いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる。
【0237】
いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちのいずれも含まない。
【0238】
いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２０位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸２２位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸４５位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸５８位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸９４位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１３５位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸１４０位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの１つ以上を含む。
【0239】
いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、血液凝固を開始しない。いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む。
【0240】
いくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、ヒトＣＤ２８である。いくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインは、配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、多鎖キメラポリペプチドは、血液凝固を開始しない。
【0241】
いくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約１０００ｎＭ（または本明細書に記載の範囲の下位範囲のうちのいずれか）の多鎖キメラポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、約５０ｎＭ～約３００ｎＭ（または本明細書に記載の範囲の下位範囲のうちのいずれか）の多鎖キメラポリペプチドを含む。
【0242】
例示的な成熟した第１のキメラポリペプチド（配列番号１０２）
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＫＴＩＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＤＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＲＲＮＮＴＦＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥＮＷＶＮＶＩＳＮＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＫＴＩＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＤＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＲＲＮＮＴＦＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥＮＷＶＮＶＩＳＮＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
【0243】
成熟した第１のキメラポリペプチドをコードする例示的なＤＮＡ（配列番号１０３）
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【0244】
例示的な前駆体第１のキメラポリペプチド（配列番号１０４）
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前駆体第１のキメラポリペプチドをコードする例示的なＤＮＡ（配列番号１０５）
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【0246】
例示的な成熟した第２のキメラポリペプチド（配列番号１０６）
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【0247】
成熟した第２のキメラポリペプチドをコードする例示的なＤＮＡ（配列番号１０７）
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例示的な前駆体第２のキメラポリペプチド（配列番号１０８）
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【0249】
前駆体第２のキメラポリペプチドをコードする例示的なＤＮＡ（配列番号１０９）
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ＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＡＣＧＴＣＡＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＴＴＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＣＴＴＴＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧＧＧＧＣＧＡＴＧＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＡＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＴＴＴＡＧＧＡＧＡＡＣＧＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＡＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＴＴＴＡＧＣＴＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＴＡＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＣＧＧＡＴＴＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＣＡＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＧＴＡＴＡＴＣＴＧＴＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣＧＡＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＴＴＴＡＡＡＧＴＧＣＡＴＣＣＧＧ
【0250】
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ
いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズであり得る。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズは、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片および抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片を含み得、これらはいずれもビーズに共有結合的にまたは非共有結合的に連結される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（例えば、本明細書に記載の例示的な抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのうちの１つ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖ（例えば、本明細書に記載の任意の抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖ）である。ビーズは、当該技術分野で既知の任意の好適な球状ポリマー粒子であり得る。ビーズの平均直径は、約０．５～約２０マイクロメートル（例えば、約０．５～約１０、約０．８～約８、または約１～約５マイクロメートル）であり得る。いくつかの実施形態では、ビーズは、ダイナビーズなどであるが、これに限定されない、１つ以上の常磁性材料を含み得る。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズの非限定的な例には、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｉｂｃｏ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって開発されたものなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ダイナビーズが挙げられる。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズのさらなる商業的供給源は、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズであり得る。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズは、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片および抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片を含み得、これらはいずれもビーズに共有結合的にまたは非共有結合的に連結される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（例えば、本明細書に記載の例示的な抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのうちの１つ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖ（例えば、本明細書に記載の任意の抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖ）である。ビーズは、当該技術分野で既知の任意の好適な球状ポリマー粒子であり得る。ビーズの平均直径は、約０．５～約２０マイクロメートル（例えば、約０．５～約１０、約０．８～約８、または約１～約５マイクロメートル）であり得る。いくつかの実施形態では、ビーズは、ダイナビーズなどであるが、これに限定されない、１つ以上の常磁性材料を含み得る。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズの非限定的な例には、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｉｂｃｏ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって開発されたものなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ダイナビーズが挙げられる。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズのさらなる商業的供給源は、当該技術分野で既知である。
【0251】
ＩＬ－２受容体活性化剤
１つ以上のＩＬ－２受容体活性化剤の使用を含む方法が本明細書に提供される。ＩＬ－２受容体活性化剤の非限定的な例には、単鎖キメラポリペプチド、多鎖キメラポリペプチド、可溶性ＩＬ－２（例えば、組換えヒトＩＬ－２）、およびＩＬ－２受容体（例えば、ヒトＩＬ－２受容体）に特異的に結合するアゴニスト抗体が挙げられる。
１つ以上のＩＬ－２受容体活性化剤の使用を含む方法が本明細書に提供される。ＩＬ－２受容体活性化剤の非限定的な例には、単鎖キメラポリペプチド、多鎖キメラポリペプチド、可溶性ＩＬ－２（例えば、組換えヒトＩＬ－２）、およびＩＬ－２受容体（例えば、ヒトＩＬ－２受容体）に特異的に結合するアゴニスト抗体が挙げられる。
【0252】
単鎖キメラポリペプチド
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２受容体活性化剤は、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであり、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインがＩＬ－２受容体に結合する。ＩＬ－２受容体活性化剤である単鎖キメラポリペプチドの非限定的な例は、本明細書に記載されている。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２受容体活性化剤は、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであり、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインがＩＬ－２受容体に結合する。ＩＬ－２受容体活性化剤である単鎖キメラポリペプチドの非限定的な例は、本明細書に記載されている。
【0253】
可溶性ＩＬ－２
いくつかの例では、ＩＬ－２受容体活性化剤は、可溶性ＩＬ－２（例えば、本明細書に記載の可溶性ＩＬ－２タンパク質のうちのいずれか）であり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＩＬ－２タンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一の配列を含み得る。
いくつかの例では、ＩＬ－２受容体活性化剤は、可溶性ＩＬ－２（例えば、本明細書に記載の可溶性ＩＬ－２タンパク質のうちのいずれか）であり得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＩＬ－２タンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一の配列を含み得る。
【0254】
アゴニスト抗体
いくつかの例では、ＩＬ－２受容体活性化剤は、ＩＬ－２受容体（例えば、ヒトＩＬ－２受容体）に特異的に結合するアゴニスト抗体（例えば、Ｇａｕｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３６（１）：１８－２９，１９８５に記載のもの）またはその抗原結合断片であり得る
いくつかの例では、ＩＬ－２受容体活性化剤は、ＩＬ－２受容体（例えば、ヒトＩＬ－２受容体）に特異的に結合するアゴニスト抗体（例えば、Ｇａｕｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３６（１）：１８－２９，１９８５に記載のもの）またはその抗原結合断片であり得る
【0255】
ＩｇＧ１抗体構築物
ＩｇＧ１抗体構築物は、ＩｇＧ１抗体（例えば、可溶性組織因子ドメイン、例えば、本明細書に記載の可溶性組織因子ドメインのうちのいずれかに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナルＩｇＧ１抗体）であり得る。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域）を含む抗体または抗体断片であり得る。当該技術分野で知られているように、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、ＣＤ１６ａ（ＦｃＲガンマＩＩＩ）（例えば、ヒトＣＤ１６ａ）に結合し、その細胞内シグナル伝達を誘導する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、Ｆｃ領域を含み、かつ可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する単鎖または多鎖ポリペプチドであり得、このＦｃ領域は、ＣＤ１６ａ（ＦｃＲガンマＩＩＩ）（例えば、ヒトＣＤ１６ａ）に特異的に結合することができ、ナチュラルキラー細胞（例えば、ヒトナチュラルキラー細胞）にその細胞内シグナル伝達を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、Ｆｃ領域を含み、かつ可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する単鎖または多鎖ポリペプチドであり得、このＦｃ領域は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（例えば、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、例えば、配列番号９８）と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）の配列を含み、ＣＤ１６ａ（ＦｃＲガンマＩＩＩ）（例えば、ヒトＣＤ１６ａ）に特異的に結合することができ、ナチュラルキラー細胞（例えば、ヒトナチュラルキラー細胞）にその細胞内シグナル伝達を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）に特異的に結合し、非ヒトＦｃ領域（例えば、非ヒト抗体由来のＦｃ領域）を含み、この非ヒトＦｃ領域は、非ヒトＦｃ領域がヒトＣＤ１６ａ（ヒトＦｃＲガンマＩＩＩ）に結合し、かつナチュラルキラー細胞（例えば、ヒトナチュラルキラー細胞）にその細胞内シグナル伝達を誘導することができるように、（例えば、野生型非ヒトＦｃ領域内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を置換することにより）改変されている。
ＩｇＧ１抗体構築物は、ＩｇＧ１抗体（例えば、可溶性組織因子ドメイン、例えば、本明細書に記載の可溶性組織因子ドメインのうちのいずれかに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナルＩｇＧ１抗体）であり得る。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域）を含む抗体または抗体断片であり得る。当該技術分野で知られているように、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、ＣＤ１６ａ（ＦｃＲガンマＩＩＩ）（例えば、ヒトＣＤ１６ａ）に結合し、その細胞内シグナル伝達を誘導する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、Ｆｃ領域を含み、かつ可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する単鎖または多鎖ポリペプチドであり得、このＦｃ領域は、ＣＤ１６ａ（ＦｃＲガンマＩＩＩ）（例えば、ヒトＣＤ１６ａ）に特異的に結合することができ、ナチュラルキラー細胞（例えば、ヒトナチュラルキラー細胞）にその細胞内シグナル伝達を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、Ｆｃ領域を含み、かつ可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する単鎖または多鎖ポリペプチドであり得、このＦｃ領域は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（例えば、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、例えば、配列番号９８）と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）の配列を含み、ＣＤ１６ａ（ＦｃＲガンマＩＩＩ）（例えば、ヒトＣＤ１６ａ）に特異的に結合することができ、ナチュラルキラー細胞（例えば、ヒトナチュラルキラー細胞）にその細胞内シグナル伝達を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、可溶性組織因子ドメイン（例えば、本明細書に記載の可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか）に特異的に結合し、非ヒトＦｃ領域（例えば、非ヒト抗体由来のＦｃ領域）を含み、この非ヒトＦｃ領域は、非ヒトＦｃ領域がヒトＣＤ１６ａ（ヒトＦｃＲガンマＩＩＩ）に結合し、かつナチュラルキラー細胞（例えば、ヒトナチュラルキラー細胞）にその細胞内シグナル伝達を誘導することができるように、（例えば、野生型非ヒトＦｃ領域内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を置換することにより）改変されている。
【0256】
野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（配列番号９８）
ＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0257】
いくつかの例では、ＩｇＧ１抗体構築物は、ヒト化または完全ヒト抗組織因子抗体である（例えば、米国特許第７，９６８，０９４号および米国特許第８，００７，７９５に記載の抗組織因子抗体を参照のこと）。
【0258】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、以下のＣＤＲ配列セット：ＤＹＮＶＹ（配列番号６６）を含むＣＤＲ１、ＹＩＤＰＹＮＧＩＴＩＹＤＱＮＦＫＧ（配列番号６７）を含むＣＤＲ２、およびＤＶＴＴＡＬＤＦ（配列番号６８）を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインを含み得る。
【0259】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、以下のＣＤＲ配列セット：ＤＹＮＶＹ（配列番号６６）を含むＣＤＲ１、ＹＩＤＰＹＮＧＩＴＩＹＤＱＮＬＫＧ（配列番号７４）を含むＣＤＲ２、およびＤＶＴＴＡＬＤＦ（配列番号６８）を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインを含み得る。
【0260】
例示的な重鎖可変ドメイン（配列番号７２）
ＱＩＱＬＶＱＳＧＧＥＶＫＫＰＧＡＳＶＲＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＮＶＹＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＤＰＹＮＧＩＴＩＹＤＱＮＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＤＶＴＴＡＬＤＦＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＱＩＱＬＶＱＳＧＧＥＶＫＫＰＧＡＳＶＲＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＮＶＹＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＤＰＹＮＧＩＴＩＹＤＱＮＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＤＶＴＴＡＬＤＦＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【0261】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、配列番号７２と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）の配列を含む重鎖可変ドメインを含み得る。
【0262】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、以下のＣＤＲ配列セット：ＬＡＳＱＴＩＤＴＷＬＡ（配列番号６９）を含むＣＤＲ１、ＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号７０）を含むＣＤＲ２、およびＱＱＶＹＳＳＰＦＴ（配列番号７１）を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含み得る。
【0263】
例示的な軽鎖可変ドメイン（配列番号７３）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＬＡＳＱＴＩＤＴＷＬＡＷＹＬＱＫＰＧＫＳＰＱＬＬＩＹＡＡＴＮＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＶＹＳＳＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＬＡＳＱＴＩＤＴＷＬＡＷＹＬＱＫＰＧＫＳＰＱＬＬＩＹＡＡＴＮＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＶＹＳＳＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
【0264】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１抗体構築物は、配列番号７３と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）の配列を含む軽鎖可変ドメインを含み得る。
【0265】
ＩｇＧ１抗体構築物の非限定的な例には、配列番号７２と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）の配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号７３と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）の配列を含む軽鎖可変ドメインが挙げられ得る。
【0266】
ｍＴＯＲ阻害剤
ｍＴＯＲ阻害剤の非限定的な例には、ラパマイシン（別名、シロリムス）、ゾルトレス（別名、エベロリムスおよびＲＡＤ００１）、トリセル（別名、テムシロリムスおよびＣＣＩ－７７９）、アフィニトール（エベロリムス）、ダクトリシブ（別名、ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５）、ＧＳＫ２１２６４５８、ＸＬ７６５、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８（別名、ＭＬＮ０１２８）、ＯＳＩ０２７、およびＲａｐａＬｉｎｋｓが挙げられる。
ｍＴＯＲ阻害剤の非限定的な例には、ラパマイシン（別名、シロリムス）、ゾルトレス（別名、エベロリムスおよびＲＡＤ００１）、トリセル（別名、テムシロリムスおよびＣＣＩ－７７９）、アフィニトール（エベロリムス）、ダクトリシブ（別名、ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５）、ＧＳＫ２１２６４５８、ＸＬ７６５、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８（別名、ＭＬＮ０１２８）、ＯＳＩ０２７、およびＲａｐａＬｉｎｋｓが挙げられる。
【0267】
Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる例示的な方法
Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Ｔｒｅｇ細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、液体培養培地が、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤（例えば、本明細書に記載の例示的なＣＤ３／ＣＤ２８結合剤のうちのいずれか）と、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインがＩＬ－２受容体に結合する、単鎖キメラポリペプチドとを含む、方法が本明細書に提供される。いくつかの例では、液体培養培地は、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物（例えば、本明細書に記載の例示的なＩｇＧ１抗体構築物のうちのいずれか）をさらに含む。いくつかの例では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの例では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。
Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Ｔｒｅｇ細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、液体培養培地が、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤（例えば、本明細書に記載の例示的なＣＤ３／ＣＤ２８結合剤のうちのいずれか）と、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインがＩＬ－２受容体に結合する、単鎖キメラポリペプチドとを含む、方法が本明細書に提供される。いくつかの例では、液体培養培地は、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物（例えば、本明細書に記載の例示的なＩｇＧ１抗体構築物のうちのいずれか）をさらに含む。いくつかの例では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの例では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。
【0268】
いくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約５００ｎＭ（例えば、約１０ｎＭ～約４５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約４００ｎＭ、約１０ｎＭ～約３５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約３００ｎＭ、約１０ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１０ｎＭ～約１５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、約１０ｎＭ～約５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約５００ｎＭ、約５０ｎＭ～約４５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約４００ｎＭ、約５０ｎＭ～約３５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約３００ｎＭ、約５０ｎＭ～約２５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約２００ｎＭ、約５０ｎＭ～約１５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１００ｎＭ、約１００ｎＭ～約５００ｎＭ、約１００ｎＭ～約４５０ｎＭ、約１００ｎＭ～約４００ｎＭ、約１００ｎＭ～約３５０ｎＭ、約１００ｎＭ～約３００ｎＭ、約１００ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１００ｎＭ～約２００ｎＭ、約１００ｎＭ～約１５０ｎＭ、約１５０ｎＭ～約５００ｎＭ、約１５０ｎＭ～約４５０ｎＭ、約１５０ｎＭ～約４００ｎＭ、約１５０ｎＭ～約３５０ｎＭ、約１５０ｎＭ～約３００ｎＭ、約１５０ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１５０ｎＭ～約２００ｎＭ、約２００ｎＭ～約５００ｎＭ、約２００ｎＭ～約４５０ｎＭ、約２００ｎＭ～約４００ｎＭ、約２００ｎＭ～約３５０ｎＭ、約２００ｎＭ～約３００ｎＭ、約２００ｎＭ～約２５０ｎＭ、約２５０ｎＭ～約５００ｎＭ、約２５０ｎＭ～約４５０ｎＭ、約２５０ｎＭ～約４００ｎＭ、約２５０ｎＭ～約３５０ｎＭ、約２５０ｎＭ～約３００ｎＭ、約３００ｎＭ～約５００ｎＭ、約３００ｎＭ～約４５０ｎＭ、約３００ｎＭ～約４００ｎＭ、約３００ｎＭ～約３５０ｎＭ、約３５０ｎＭ～約５００ｎＭ、約３５０ｎＭ～約４５０ｎＭ、約３５０ｎＭ～約４００ｎＭ、約４００ｎＭ～約５００ｎＭ、約４００ｎＭ～約４５０ｎＭ、または約４５０ｎＭ～約５００ｎＭ）の単鎖キメラポリペプチドを含む。
【0269】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズのうちのいずれか）である。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを約１：１～約６：１のビーズ／細胞比（例えば、約１：１～約５：１、約１：１～約４：１、約１：１～約３：１、約１：１～約２：１、約２：１～約６：１、約２：１～約５：１、約２：１～約４：１、約２：１～約３：１、約３：１～約６：１、約３：１～約５：１、約３：１～約４：１、約４：１～約６：１、約４：１～約５：１、約５：１～約６：１のビーズ／細胞比）で含む。
【0270】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、第１の抗原結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む追加の単鎖キメラポリペプチドであり、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインがＣＤ３に特異的に結合し、追加の単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物（例えば、本明細書に記載の例示的なＩｇＧ１抗体構築物のうちのいずれか）をさらに含む。
【0271】
いくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約１０００ｎＭ（例えば、約１０ｎＭ～約９５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約９００ｎＭ、約１０ｎＭ～約８５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約８００ｎＭ、約１０ｎＭ～約７５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約７００ｎＭ、約１０ｎＭ～約６５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約６００ｎＭ、約１０ｎＭ～約５５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約５００ｎＭ、約１０ｎＭ～約４５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約４００ｎＭ、約１０ｎＭ～約３５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約３００ｎＭ、約１０ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１０ｎＭ～約１５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、約１０ｎＭ～約５０ｎＭ、約２５ｎＭ～約１０００ｎＭ、約２５ｎＭ～約９５０ｎＭ、約２５ｎＭ～約９００ｎＭ、約２５ｎＭ～約８５０ｎＭ、約２５ｎＭ～約８００ｎＭ、約２５ｎＭ～約７５０ｎＭ、約２５ｎＭ～約７００ｎＭ、約２５ｎＭ～約６５０ｎＭ、約２５ｎＭ～約６００ｎＭ、約２５ｎＭ～約５５０ｎＭ、約２５ｎＭ～約５００ｎＭ、約２５ｎＭ～約４５０ｎＭ、約２５ｎＭ～約４００ｎＭ、約２５ｎＭ～約３５０ｎＭ、約２５ｎＭ～約３００ｎＭ、約２５ｎＭ～約２５０ｎＭ、約２５ｎＭ～約２００ｎＭ、約２５ｎＭ～約１５０ｎＭ、約２５ｎＭ～約１００ｎＭ、約２５ｎＭ～約５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１０００ｎＭ、約５０ｎＭ～約９５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約９００ｎＭ、約５０ｎＭ～約８５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約８００ｎＭ、約５０ｎＭ～約７５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約７００ｎＭ、約５０ｎＭ～約６５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約６００ｎＭ、約５０ｎＭ～約５５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約５００ｎＭ、約５０ｎＭ～約４５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約４００ｎＭ、約５０ｎＭ～約３５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約３００ｎＭ、約５０ｎＭ～約２５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約２００ｎＭ、約５０ｎＭ～約１５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１００ｎＭ、約１００ｎＭ～約１０００ｎＭ、約１００ｎＭ～約９５０ｎＭ、約１００ｎＭ～約９００ｎＭ、約１００ｎＭ～約８５０ｎＭ、約１００ｎＭ～約８００ｎＭ、約１００ｎＭ～約７５０ｎＭ、約１００ｎＭ～約７００ｎＭ、約１００ｎＭ～約６５０ｎＭ、約１００ｎＭ～約６００ｎＭ、約１００ｎＭ～約５５０ｎＭ、約１００ｎＭ～約５００ｎＭ、約１００ｎＭ～約４５０ｎＭ、約１００ｎＭ～約４００ｎＭ、約１００ｎＭ～約３５０ｎＭ、約１００ｎＭ～約３００ｎＭ、約１００ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１００ｎＭ～約２００ｎＭ、約１００ｎＭ～約１５０ｎＭ、約１５０ｎＭ～約１０００ｎＭ、約１５０ｎＭ～約９５０ｎＭ、約１５０ｎＭ～約９００ｎＭ、約１５０ｎＭ～約８５０ｎＭ、約１５０ｎＭ～約８００ｎＭ、約１５０ｎＭ～約７５０ｎＭ、約１５０ｎＭ～約７００ｎＭ、約１５０ｎＭ～約６５０ｎＭ、約１５０ｎＭ～約６００ｎＭ、約１５０ｎＭ～約５５０ｎＭ、約１５０ｎＭ～約５００ｎＭ、約１５０ｎＭ～約４５０ｎＭ、約１５０ｎＭ～約４００ｎＭ、約１５０ｎＭ～約３５０ｎＭ、約１５０ｎＭ～約３００ｎＭ、約１５０ｎＭ～約２５０ｎＭ、約１５０ｎＭ～約２００ｎＭ、約２００ｎＭ～約１０００ｎＭ、約２００ｎＭ～約９５０ｎＭ、約２００ｎＭ～約９００ｎＭ、約２００ｎＭ～約８５０ｎＭ、約２００ｎＭ～約８００ｎＭ、約２００ｎＭ～約７５０ｎＭ、約２００ｎＭ～約７００ｎＭ、約２００ｎＭ～約６５０ｎＭ、約２００ｎＭ～約６００ｎＭ、約２００ｎＭ～約５５０ｎＭ、約２００ｎＭ～約５００ｎＭ、約２００ｎＭ～約４５０ｎＭ、約２００ｎＭ～約４００ｎＭ、約２００ｎＭ～約３５０ｎＭ、約２００ｎＭ～約３００ｎＭ、約２００ｎＭ～約２５０ｎＭ、約２５０ｎＭ～約１０００ｎＭ、約２５０ｎＭ～約９５０ｎＭ、約２５０ｎＭ～約９００ｎＭ、約２５０ｎＭ～約８５０ｎＭ、約２５０ｎＭ～約８００ｎＭ、約２５０ｎＭ～約７５０ｎＭ、約２５０ｎＭ～約７００ｎＭ、約２５０ｎＭ～約６５０ｎＭ、約２５０ｎＭ～約６００ｎＭ、約２５０ｎＭ～約５５０ｎＭ、約２５０ｎＭ～約５００ｎＭ、約２５０ｎＭ～約４５０ｎＭ、約２５０ｎＭ～約４００ｎＭ、約２５０ｎＭ～約３５０ｎＭ、約２５０ｎＭ～約３００ｎＭ、約３００ｎＭ～約１０００ｎＭ、約３００ｎＭ～約９５０ｎＭ、約３００ｎＭ～約９００ｎＭ、約３００ｎＭ～約８５０ｎＭ、約３００ｎＭ～約８００ｎＭ、約３００ｎＭ～約７５０ｎＭ、約３００ｎＭ～約７００ｎＭ、約３００ｎＭ～約６５０ｎＭ、約３００ｎＭ～約６００ｎＭ、約３００ｎＭ～約５５０ｎＭ、約３００ｎＭ～約５００ｎＭ、約３００ｎＭ～約４５０ｎＭ、約３００ｎＭ～約４００ｎＭ、約３００ｎＭ～約３５０ｎＭ、約３５０ｎＭ～約１０００ｎＭ、約３５０ｎＭ～約９５０ｎＭ、約３５０ｎＭ～約９００ｎＭ、約３５０ｎＭ～約８５０ｎＭ、約３５０ｎＭ～約８００ｎＭ、約３５０ｎＭ～約７５０ｎＭ、約３５０ｎＭ～約７００ｎＭ、約３５０ｎＭ～約６５０ｎＭ、約３５０ｎＭ～約６００ｎＭ、約３５０ｎＭ～約５５０ｎＭ、約３５０ｎＭ～約５００ｎＭ、約３５０ｎＭ～約４５０ｎＭ、約３５０ｎＭ～約４００ｎＭ、約４００ｎＭ～約１０００ｎＭ、約４００ｎＭ～約９５０ｎＭ、約４００ｎＭ～約９００ｎＭ、約４００ｎＭ～約８５０ｎＭ、約４００ｎＭ～約８００ｎＭ、約４００ｎＭ～約７５０ｎＭ、約４００ｎＭ～約７００ｎＭ、約４００ｎＭ～約６５０ｎＭ、約４００ｎＭ～約６００ｎＭ、約４００ｎＭ～約５５０ｎＭ、約４００ｎＭ～約５００ｎＭ、約４００ｎＭ～約４５０ｎＭ、約４５０ｎＭ～約１０００ｎＭ、約４５０ｎＭ～約９５０ｎＭ、約４５０ｎＭ～約９００ｎＭ、約４５０ｎＭ～約８５０ｎＭ、約４５０ｎＭ～約８００ｎＭ、約４５０ｎＭ～約７５０ｎＭ、約４５０ｎＭ～約７００ｎＭ、約４５０ｎＭ～約６５０ｎＭ、約４５０ｎＭ～約６００ｎＭ、約４５０ｎＭ～約５５０ｎＭ、約４５０ｎＭ～約５００ｎＭ、約５００ｎＭ～約１０００ｎＭ、約５００ｎＭ～約９５０ｎＭ、約５００ｎＭ～約９００ｎＭ、約５００ｎＭ～約８５０ｎＭ、約５００ｎＭ～約８００ｎＭ、約５００ｎＭ～約７５０ｎＭ、約５００ｎＭ～約７００ｎＭ、約５００ｎＭ～約６５０ｎＭ、約５００ｎＭ～約６００ｎＭ、約５００ｎＭ～約５５０ｎＭ、約５５０ｎＭ～約１０００ｎＭ、約５５０ｎＭ～約９５０ｎＭ、約５５０ｎＭ～約９００ｎＭ、約５５０ｎＭ～約８５０ｎＭ、約５５０ｎＭ～約８００ｎＭ、約５５０ｎＭ～約７５０ｎＭ、約５５０ｎＭ～約７００ｎＭ、約５５０ｎＭ～約６５０ｎＭ、約５５０ｎＭ～約６００ｎＭ、約６００ｎＭ～約１０００ｎＭ、約６００ｎＭ～約９５０ｎＭ、約６００ｎＭ～約９００ｎＭ、約６００ｎＭ～約８５０ｎＭ、約６００ｎＭ～約８００ｎＭ、約６００ｎＭ～約７５０ｎＭ、約６００ｎＭ～約７００ｎＭ、約６００ｎＭ～約６５０ｎＭ、約６５０ｎＭ～約１０００ｎＭ、約６５０ｎＭ～約９５０ｎＭ、約６５０ｎＭ～約９００ｎＭ、約６５０ｎＭ～約８５０ｎＭ、約６５０ｎＭ～約８００ｎＭ、約６５０ｎＭ～約７５０ｎＭ、約６５０ｎＭ～約７００ｎＭ、約７００ｎＭ～約１０００ｎＭ、約７００ｎＭ～約９５０ｎＭ、約７００ｎＭ～約９００ｎＭ、約７００ｎＭ～約８５０ｎＭ、約７００ｎＭ～約８００ｎＭ、約７００ｎＭ～約７５０ｎＭ、約７５０ｎＭ～約１０００ｎＭ、約７５０ｎＭ～約９５０ｎＭ、約７５０ｎＭ～約９００ｎＭ、約７５０ｎＭ～約８５０ｎＭ、約７５０ｎＭ～約８００ｎＭ、約８００ｎＭ～約１０００ｎＭ、約８００ｎＭ～約９５０ｎＭ、約８００ｎＭ～約９００ｎＭ、約８００ｎＭ～約８５０ｎＭ、約８５０ｎＭ～約１０００ｎＭ、約８５０ｎＭ～約９５０ｎＭ、約８５０ｎＭ～約９００ｎＭ、約９００ｎＭ～約１０００ｎＭ、約９００ｎＭ～約９５０ｎＭ、または約９５０ｎＭ～約１０００ｎＭ）の追加の単鎖キメラポリペプチドを含む。
【0272】
いくつかの実施例では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は多鎖キメラポリペプチドであり、多鎖キメラポリペプチドが、（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチドと、（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメインおよび（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合し、第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合するか、または第１の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、多鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物（例えば、本明細書に記載の例示的なＩｇＧ１抗体構築物のうちのいずれか）をさらに含む。
【0273】
いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０２と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０４と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０６と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０８と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約１０００ｎＭ（例えば、または本明細書に記載の範囲の下位範囲のうちのいずれか）の多鎖キメラポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、本明細書に記載のｍＴＯＲ阻害剤のうちのいずれか、例えば、ラパマイシン）をさらに含む。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約５００ｎＭ（例えば、または本明細書に記載の範囲の下位範囲のうちのいずれか）のｍＴＯＲ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、ｍＴＯＲ阻害剤を含まない。
【0274】
いくつかの実施形態は、前記期間の開始後３６時間～約６０時間（例えば、約３６～約５６時間、約３６～約５２時間、約３６～約４８時間、約３６～約４４時間、約３６～約４０時間、約４０～約６０時間、約４０～約５６時間、約４０～約５２時間、約４０～約４８時間、約４０～約４４時間、約４４～約６０時間、約４４～約５６時間、約４４～約５２時間、約４４～約４８時間、約４８～約６０時間、約４８～約５６時間、約４８～約５２時間、約５２～約６０時間、約５２～約５６時間、または約５６～約６０時間）毎に液体培養培地に単鎖キメラポリペプチド（例えば、本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれか）を定期的に添加することをさらに含む。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの定期的な添加は、液体培養培地中に約１０ｎＭ～約５００ｎＭ（例えば、または本明細書に記載のこの範囲の下位範囲のうちのいずれか）の濃度の単鎖キメラポリペプチドをもたらすように行われる。
【0275】
いくつかの実施形態は、前記期間の開始後約４日～約１０日毎（例えば、約４日～約９日毎、約４日～約８日毎、約４日～約７日毎、約４日～約６日毎、約４日～約５日毎、約５日～約１０日毎、約５日～約９日毎、約５日～約８日毎、約５日～約７日毎、約５日～約６日毎、約６日～約１０日毎、約６日～約９日毎、約６日～約８日毎、約６日～約７日毎、約７日～約１０日毎、約７日～約９日毎、約７日～約８日毎、約８日～約１０日毎、約８日～約９日毎、または約９日～約１０日毎）に液体培養培地にＣＤ３／ＣＤ２８結合剤を定期的に添加することをさらに含む。
【0276】
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、本明細書に記載のｍＴＯＲ阻害剤のうちのいずれか）をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約５００ｎＭ（例えば、または本明細書に記載の範囲の下位範囲のうちのいずれか）のｍＴＯＲ阻害剤（例えば、本明細書に記載のｍＴＯＲ阻害剤のうちのいずれか）を含む。
【0277】
これらの方法のいくつかの例では、液体培養培地は、無血清液体培養培地である。本明細書に記載の方法のうちのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、化学的に定義された液体培養培地である。
【0278】
いくつかの実施形態では、ある期間は、約７日間～約５６日間（例えば、約７日間～約５６日間、約７日間～約５４日間、約７日間～約４６日間、約７日間～約３８日間、約７日間～約３２日間、約７日間～約２８日間、約７日間～約２５日間、約７日間～約２３日間、約７日間～約２１日間、約７日間～約１９日間、約７日間～約１７日間、約７日間～約１５日間、約７日間～約１３日間、約７日間～約１１日間、約７日間～約９日間、約９日間～約５６日間、約９日間～約５４日間、約９日間～約４６日間、約９日間～約３８日間、約９日間～約３２日間、約９日間～約２８日間、約９日間～約２５日間、約９日間～約２３日間、約９日間～約２１日間、約９日間～約１９日間、約９日間～約１７日間、約９日間～約１５日間、約９日間～約１３日間、約９日間～約１１日間、約１１日間～約５６日間、約１１日間～約５４日間、約１１日間～約４６日間、約１１日間～約３８日間、約１１日間～約３２日間、約１１日間～約２８日間、約１１日間～約２５日間、約１１日間～約２３日間、約１１日間～約２１日間、約１１日間～約１９日間、約１１日間～約１７日間、約１１日間～約１５日間、約１１日間～約１３日間、約１３日間～約５６日間、約１３日間～約５４日間、約１３日間～約４６日間、約１３日間～約３８日間、約１３日間～約３２日間、約１３日間～約２８日間、約１３日間～約２５日間、約１３日間～約２３日間、約１３日間～約２１日間、約１３日間～約１９日間、約１３日間～約１７日間、約１３日間～約１５日間、約１５日間～約５６日間、約１５日間～約５４日間、約１５日間～約４６日間、約１５日間～約３８日間、約１５日間～約３２日間、約１５日間～約２８日間、約１５日間～約２５日間、約１５日間～約２３日間、約１５日間～約２１日間、約１５日間～約１９日間、約１５日間～約１７日間、約１７日間～約５６日間、約１７日間～約５４日間、約１７日間～約４６日間、約１７日間～約３８日間、約１７日間～約３２日間、約１７日間～約２８日間、約１７日間～約２５日間、約１７日間～約２３日間、約１７日間～約２１日間、約１７日間～約１９日間、約１９日間～約５６日間、約１９日間～約５４日間、約１９日間～約４６日間、約１９日間～約３８日間、約１９日間～約３２日間、約１９日間～約２８日間、約１９日間～約２５日間、約１９日間～約２３日間、約１９日間～約２１日間、約２１日間～約５６日間、約２１日間～約５４日間、約２１日間～約４６日間、約２１日間～約３８日間、約２１日間～約３２日間、約２１日間～約２８日間、約２１日間～約２５日間、約２１日間～約２３日間、約２３日間～約５６日間、約２３日間～約５４日間、約２３日間～約４６日間、約２３日間～約３８日間、約２３日間～約３２日間、約２３日間～約２８日間、約２３日間～約２５日間、約２５日間～約５６日間、約２５日間～約５４日間、約２５日間～約４６日間、約２５日間～約３８日間、約２５日間～約３２日間、約２５日間～約２８日間、約２８日間～約５６日間、約２８日間～約５４日間、約２８日間～約５０日間、約２８日間～約４６日間、約２８日間～約３８日間、約２８日間～約３２日間、約３２日間～約５６日間、約３２日間～約５４日間、約３２日間～約４６日間、約３２日間～約３８日間、約３８日間～約５６日間、約３８日間～約５４日間、約３８日間～約４６日間、約４６日間～約５６日間、約４６日間～約５４日間、約５４日間～約５６日間）である。
【0279】
いくつかの実施形態は、培養する工程の前に、（例えば、本明細書に記載の単離する方法のうちのいずれかを使用して）対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む。
【0280】
Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる例示的な方法
また、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Ｔｒｅｇ細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、液体培養培地が、ＩＬ－２受容体活性化剤（例えば、本明細書に記載のＩＬ－２受容体活性化剤のうちのいずれか）と、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する、単鎖キメラポリペプチドと、を含む方法も提供される。いくつかの例では、液体培養培地は、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物（例えば、本明細書に記載の例示的なＩｇＧ１抗体構築物のうちのいずれか）をさらに含む。
また、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Ｔｒｅｇ細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、液体培養培地が、ＩＬ－２受容体活性化剤（例えば、本明細書に記載のＩＬ－２受容体活性化剤のうちのいずれか）と、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する、単鎖キメラポリペプチドと、を含む方法も提供される。いくつかの例では、液体培養培地は、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物（例えば、本明細書に記載の例示的なＩｇＧ１抗体構築物のうちのいずれか）をさらに含む。
【0281】
いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。
【0282】
いくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約１０００ｎＭ（例えば、または本明細書に記載の範囲の下位範囲のうちのいずれか）の単鎖キメラポリペプチド（例えば、本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれか）を含む。
【0283】
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２受容体活性化剤は、可溶性ＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、ヒト可溶性ＩＬ－２は、配列番号１と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１００ＩＵ／ｍＬ～約８００ＩＵ／ｍＬ（例えば、約１００ＩＵ／ｍＬ～約８００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ～約７００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ～約６００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ～約４００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ～約２００ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ～約８００ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ～約７００ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ～約６００ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ～約４００ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ～約８００ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ～約７００ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ～約６００ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ～約４００ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ～約８００ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ～約７００ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ～約６００ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬ、約５００ＩＵ／ｍＬ～約８００ＩＵ／ｍＬ、約５００ＩＵ／ｍＬ～約７００ＩＵ／ｍＬ、約５００ＩＵ／ｍＬ～約６００ＩＵ／ｍＬ、約６００ＩＵ／ｍＬ～約８００ＩＵ／ｍＬ、約６００ＩＵ／ｍＬ～約７００ＩＵ／ｍＬ、または約７００ＩＵ／ｍＬ～約８００ＩＵ／ｍＬ）のヒト可溶性ＩＬ－２を含む。
【0284】
いくつかの実施形態では、液体培養培地は、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、本明細書に記載の例示的なｍＴＯＲ阻害剤のうちのいずれか、例えば、ラパマイシン）をさらに含む。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約５００ｎＭ（例えば、または本明細書に記載の範囲の下位範囲のうちのいずれか）のｍＴＯＲ阻害剤を含む。
【0285】
これらの方法のいくつかの実施形態は、前記期間の開始後３６時間～約６０時間（例えば、約３６～約５６時間、約３６～約５２時間、約３６～約４８時間、約３６～約４４時間、約３６～約４０時間、約４０～約６０時間、約４０～約５６時間、約４０～約５２時間、約４０～約４８時間、約４０～約４４時間、約４４～約６０時間、約４４～約５６時間、約４４～約５２時間、約４４～約４８時間、約４８～約６０時間、約４８～約５６時間、約４８～約５２時間、約５２～約６０時間、約５２～約５６時間、または約５６～約６０時間）毎に液体培養培地にＩＬ－２受容体活性化剤（例えば、本明細書に記載のＩＬ－２受容体活性化剤のうちのいずれか）を定期的に添加することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２受容体活性化剤の定期的な添加は、液体培養培地中に約１０ｎＭ～約１０００ｎＭ（例えば、または本明細書に記載のこの範囲の下位範囲のうちのいずれか）の濃度のＩＬ－２受容体活性化剤をもたらすように行われる。
【0286】
これらの方法のいくつかの実施形態は、前記期間の開始後約４日～約１０日毎（例えば、約４日～約９日毎、約４日～約８日毎、約４日～約７日毎、約４日～約６日毎、約４日～約５日毎、約５日～約１０日毎、約５日～約９日毎、約５日～約８日毎、約５日～約７日毎、約５日～約６日毎、約６日～約１０日毎、約６日～約９日毎、約６日～約８日毎、約６日～約７日毎、約７日～約１０日毎、約７日～約９日毎、約７日～約８日毎、約８日～約１０日毎、約８日～約９日毎、または約９日～約１０日毎）に液体培養培地に単鎖キメラポリペプチド（例えば、本明細書に記載の例示的な単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれか）を定期的に添加することをさらに含む。
【0287】
これらの方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ある期間は、約７～約５６日間（例えば、または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）である。
【0288】
いくつかの実施形態は、培養する工程の前に、（例えば、本明細書に記載の単離する方法のうちのいずれかを使用して）対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む。
【0289】
Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる例示的な方法
Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Ｔｒｅｇ細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、液体培養培地が、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤（例えば、本明細書に記載のＣＤ３／ＣＤ２８結合剤のうちのいずれか）と、多鎖キメラポリペプチド（例えば、本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれか）であって、（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメイン、および（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合する、多鎖キメラポリペプチドとを含む、方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、多鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物（例えば、本明細書に記載のＩｇＧ１抗体構築物のうちのいずれか）をさらに含む。
Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Ｔｒｅｇ細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、液体培養培地が、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤（例えば、本明細書に記載のＣＤ３／ＣＤ２８結合剤のうちのいずれか）と、多鎖キメラポリペプチド（例えば、本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれか）であって、（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメイン、および（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合する、多鎖キメラポリペプチドとを含む、方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、多鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物（例えば、本明細書に記載のＩｇＧ１抗体構築物のうちのいずれか）をさらに含む。
【0290】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（例えば、本明細書に記載の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズのうちのいずれか）である。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを約１：１～約６：１のビーズ／細胞比（例えば、約１：１～約５：１、約１：１～約４：１、約１：１～約３：１、約１：１～約２：１、約２：１～約６：１、約２：１～約５：１、約２：１～約４：１、約２：１～約３：１、約３：１～約６：１、約３：１～約５：１、約３：１～約４：１、約４：１～約６：１、約４：１～約５：１、約５：１～約６：１のビーズ／細胞比）で含む。
【0291】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチド（例えば、本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれか）であり、単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約１０００ｎＭ（例えば、または本明細書に記載の範囲の下位範囲のうちのいずれか）の単鎖キメラポリペプチドを含む。
【0292】
いくつかの実施例では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は多鎖キメラポリペプチドであり、多鎖キメラポリペプチドが、（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチドと、（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメインおよび（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合し、第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合するか、または第１の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、多鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物（例えば、本明細書に記載の例示的なＩｇＧ１抗体構築物のうちのいずれか）をさらに含む。
【0293】
いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０２と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のキメラポリペプチドは、配列番号１０４と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０６と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のキメラポリペプチドは、配列番号１０８と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約１０００ｎＭ（例えば、または本明細書に記載の範囲の下位範囲のうちのいずれか）の多鎖キメラポリペプチドを含む。
【0294】
いくつかの実施形態では、液体培養培地は、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、本明細書に記載のｍＴＯＲ阻害剤のうちのいずれか、例えば、ラパマイシン）をさらに含む。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、約１０ｎＭ～約５００ｎＭ（例えば、または本明細書に記載の範囲の下位範囲のうちのいずれか）のｍＴＯＲ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、ｍＴＯＲ阻害剤を含まない。
【0295】
これらの方法のいくつかの実施形態は、前記期間の開始後３６時間～約６０時間（例えば、約３６～約５６時間、約３６～約５２時間、約３６～約４８時間、約３６～約４４時間、約３６～約４０時間、約４０～約６０時間、約４０～約５６時間、約４０～約５２時間、約４０～約４８時間、約４０～約４４時間、約４４～約６０時間、約４４～約５６時間、約４４～約５２時間、約４４～約４８時間、約４８～約６０時間、約４８～約５６時間、約４８～約５２時間、約５２～約６０時間、約５２～約５６時間、または約５６～約６０時間）毎に液体培養培地に多鎖キメラポリペプチド（例えば、本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれか）を定期的に添加することをさらに含む。いくつかの実施形態では、多鎖キメラポリペプチドの定期的な添加は、液体培養培地中に約１０ｎＭ～約５００ｎＭ（例えば、または本明細書に記載のこの範囲の下位範囲のうちのいずれか）の濃度の多鎖キメラポリペプチドをもたらすように行われる。
【0296】
これらの方法のいくつかの実施形態は、前記期間の開始後約４日～約１０日毎（例えば、約４日～約９日毎、約４日～約８日毎、約４日～約７日毎、約４日～約６日毎、約４日～約５日毎、約５日～約１０日毎、約５日～約９日毎、約５日～約８日毎、約５日～約７日毎、約５日～約６日毎、約６日～約１０日毎、約６日～約９日毎、約６日～約８日毎、約６日～約７日毎、約７日～約１０日毎、約７日～約９日毎、約７日～約８日毎、約８日～約１０日毎、約８日～約９日毎、または約９日～約１０日毎）に液体培養培地にＣＤ３／ＣＤ２８結合剤（例えば、本明細書に記載の例示的なＣＤ３／ＣＤ２８結合剤のうちのいずれか）を定期的に添加することをさらに含む。
【0297】
これらの方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ある期間は、約７～約５６日間（例えば、または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）である。
【0298】
いくつかの実施形態は、培養する工程の前に、（例えば、本明細書に記載の単離する方法のうちのいずれかを使用して）対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む。
【0299】
試料からＴｒｅｇ細胞を分離する方法
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれも、培養する工程の前に、対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む。
本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれも、培養する工程の前に、対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する工程をさらに含む。
【0300】
試料は、血液試料（例えば、末梢血試料または臍帯血試料）、リンパ組織、または胸腺試料（例えば、小児胸腺試料）であり得る。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、対象から試料を得ることをさらに含む。
【0301】
対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）および／または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、マーカー発現に基づいてＴｒｅｇ細胞を単離することができる。ＦＡＣＳ機器の非限定的な例には、ＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＸ５００フルイディクスセルソーター（Ｓｏｎｙ）、およびＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｔｙｔｏセルソーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）が挙げられる。試料からＴｒｅｇ細胞を単離するための例示的な細胞表面タンパク質には、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７が含まれる。Ｔｒｅｇ細胞の細胞内マーカーは、Ｆｏｘｐ３である。例えば、ＣＤ４およびＣＤ２５の発現レベルを使用して、試料（例えば、臍帯血試料）からＴｒｅｇ細胞を単離することができる。ＣＤ１２７の発現レベルは、試料（例えば、末梢血試料）からＴｒｅｇ細胞を単離するための追加のマーカーとして使用することができる。いくつかの事例では、試料からのＴｒｅｇ細胞の単離は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋および／またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍであるＴｒｅｇ細胞の選別を含む。Ｔｒｅｇ細胞を単離するためのキットは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ制御性Ｔ細胞単離キットＩＩ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を含む。Ｔｒｅｇ細胞を単離するための追加のキットは、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗ、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット）、および Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット）から市販されている。
【0302】
ＣＤ３９の発現に基づいて試料からＴｒｅｇ細胞を分離し、それにより、Ｔｒｅｇ細胞を単離することを含む、対象から得られた試料からＴｒｅｇ細胞を単離する方法も本明細書に提供される。これらの方法のいくつかの実施形態は、試料と、ＣＤ３９に結合することができる抗体またはリガンドとを、ＣＤ３９を発現するＴｒｅｇ細胞への当該抗体またはリガンドの結合を可能にする条件下で混合することと、抗体またはリガンドに結合したＴｒｅｇ細胞を試料中の他の成分から分離し、それにより、Ｔｒｅｇ細胞を単離することとを含む。これらの方法のいくつかの実施形態では、抗体は、マウス、ヒト化、もしくはヒト抗体もしくはその抗原結合断片であり、かつ／または抗体もしくはリガンドは、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、もしくは蛍光色素のうちの少なくとも１つで標識されているか、または粒子、ビーズ、樹脂、もしくは固体支持体に結合している。これらの方法のいくつかの実施形態では、分離は、フフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、遠心分離、またはカラム、プレート、粒子、もしくはビーズベースの方法の使用を含む。これらの方法のいくつかの実施形態は、試料と、ＣＤ３９に結合することができるビオチン化抗体またはリガンドとを、当該抗体またはリガンドのＴｒｅｇ細胞への結合を可能にする条件下で混合することと、ストレプトアビジン被覆磁性粒子を使用してビオチン化抗体またはリガンドに結合したＴｒｅｇ細胞を捕捉することと、磁石を使用して磁性粒子に結合したＴｒｅｇ細胞を分離することと、磁石粒子に結合したＴｒｅｇ細胞を洗浄して、試料中の他の成分を除去することと、磁性粒子に結合したＴｒｅｇ細胞を磁石から溶液中に放出し、それにより、Ｔｒｅｇ細胞を単離することとをさらに含む。
【0303】
いくつかの例では、Ｔｒｅｇ細胞は、新鮮または凍結された末梢血、臍帯血、末梢血単核細胞、リンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＴｒｅｇ細胞を含む試料から単離された、自己Ｔｒｅｇ細胞、ハプロタイプ一致Ｔｒｅｇ細胞、または同種異系Ｔｒｅｇ細胞である。いくつかの例では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞である。いくつかの例では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ細胞である。いくつかの例では、Ｔｒｅｇ細胞は、キメラ抗原受容体を含む。いくつかの例では、Ｔｒｅｇ細胞は、インビトロおよびインビボで免疫抑制性である。
【0304】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して生成および／または単離された単離されたＴｒｅｇ細胞の集団も本明細書に提供される。いくつかの例では、単離されたＴｒｅｇ細胞の集団は、７０％超（例えば、７５％超、８０％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、または９９％超）がＣＤ３９＋細胞である。いくつかの例では、本明細書に提供される単離されたＴｒｅｇ細胞または単離されたＴｒｅｇ細胞の集団は、インビトロでさらに増大される。本明細書に記載の単離されたＴｒｅｇ細胞の集団のうちのいずれかを増大させる方法であって、単離されたＴｒｅｇ細胞の増殖を可能にする条件下で、単離されたＴｒｅｇ細胞の集団を培養する工程を含む、方法も提供される。
【0305】
本明細書に記載の単離されたＴｒｅｇ細胞の集団のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物も本明細書に提供される。治療を必要とする対象を治療する方法であって、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法も本明細書に提供される。いくつかの例では、対象は、加齢性疾患または炎症性疾患を有すると特定または診断されている。いくつかの例では、加齢性疾患は、アルツハイマー病、動脈瘤、嚢胞性線維症、膵炎における線維症、緑内障、高血圧症、特発性肺線維症、炎症性腸疾患、椎間板変性、黄斑変性、骨関節炎、２型真性糖尿病、脂肪萎縮、リポジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、白内障、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症、腎移植不全、肝線維症、骨量喪失、心筋梗塞、サルコペニア、創傷治癒、脱毛症、心筋細胞肥大、骨関節炎、パーキンソン病、加齢性肺組織弾性喪失、黄斑変性、悪液質、糸球体硬化症、肝硬変、ＮＡＦＬＤ、骨粗しょう症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、多発性硬化症、神経変性、発作、認知症、血管疾患、易感染性、慢性炎症、および腎機能障害の群から選択される。いくつかの例では、炎症性疾患は、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病性腎症、ＣＮＳ損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、乾癬、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および気分障害の群から選択される。
【0306】
Ｔｒｅｇ細胞
本明細書に記載の方法、組成物、およびキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、末梢血または臍帯血から単離された、自己Ｔｒｅｇ細胞、ハプロタイプ一致Ｔｒｅｇ細胞、または同種異系Ｔｒｅｇ細胞であり得る。本明細書に記載の方法、組成物、およびキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞であり得る。本明細書に記載の方法、組成物、およびキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ細胞であり得る。
本明細書に記載の方法、組成物、およびキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、末梢血または臍帯血から単離された、自己Ｔｒｅｇ細胞、ハプロタイプ一致Ｔｒｅｇ細胞、または同種異系Ｔｒｅｇ細胞であり得る。本明細書に記載の方法、組成物、およびキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞であり得る。本明細書に記載の方法、組成物、およびキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ細胞であり得る。
【0307】
本明細書に記載の方法、組成物、およびキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、キメラ抗原受容体または組換えＴ細胞受容体を含み得る。いくつかの例では、Ｔｒｅｇ細胞は、キメラ抗原受容体または組換えＴ細胞受容体を発現するようにあらかじめ遺伝子修飾されている。いくつかの例では、Ｔｒｅｇ細胞は、標的組織または共刺激分子（例えば、ＩＣＯＳ）において目的とするペプチドを認識する組換えＴ細胞受容体を発現するようにあらかじめ遺伝子修飾されている。
【0308】
これらの方法のいくつかの実施形態は、培養する工程の後に、キメラ抗原受容体または組換えＴ細胞受容体をコードする核酸をＴｒｅｇ細胞に導入することをさらに含み得る。これらの方法のいくつかの実施形態は、培養する工程の後に、共刺激分子（例えば、ＩＣＯＳ）をコードする核酸をＴｒｅｇ細胞に導入することをさらに含み得る。
【0309】
これらの方法のいくつかの実施形態は、培養する工程の前に、キメラ抗原受容体または組換えＴ細胞受容体をコードする核酸をＴｒｅｇ細胞に導入することをさらに含み得る。これらの方法のいくつかの実施形態は、培養する工程の前に、共刺激分子（例えば、ＩＣＯＳ）をコードする核酸をＴｒｅｇ細胞に導入することをさらに含み得る。
【0310】
Ｔｒｅｇ細胞の増殖の検出は、当該技術分野で既知の方法、例えば、サイトメトリー（例えば、蛍光支援フローサイトメトリー）、顕微鏡法、および免疫蛍光顕微鏡法を使用して行うことができる。例えば、Ｔｒｅｇ細胞の増殖は、色素（例えば、トリパンブルー）で染色し、かつ生存細胞の数をカウントすることによって決定することができる。いくつかの例では、Ｔｒｅｇ細胞の増殖および／または活性化は、Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ３９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＣＤ１０３、ＣＤ６９、ＰＤ１、およびＣＤ４９ｂなどであるが、これらに限定されないＴｒｅｇ細胞上の表面マーカーのレベルを検出することによって決定することができる。これらの表面マーカーの検出は、ＦＡＣＳを使用して行うことができる。Ｔｒｅｇ細胞の活性化は、Ｔｒｅｇ細胞におけるグルコース代謝レベルを検出することによって決定することもできる。いくつかの例では、グルコース代謝は、非解糖酸性化段階（薬物なし）、解糖段階（グルコースの添加）、解糖能段階（オリゴマイシンの添加）、および解糖予備能段階（２－デオキシグルコースの添加）を含む細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を測定することによって決定することができる。細胞外フラックスアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）をＥＣＡＲの測定に使用することができる。
【0311】
いくつかの例では、Ｔｒｅｇ細胞の増殖および／または活性化は、ＩＬ－１０分泌レベルの増加を検出することによって決定することができる。例えば、本明細書に提供される方法により、（例えば、前記期間の開始時と比較して前記期間の終了時に）Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ－１０分泌レベルの約１％～約８００％（例えば、約１％～約７５０％、約１％～約７００％、約１％～約６５０％、約１％～約６００％、約１％～約５５０％、約１％～約５００％、約１％～約４５０％、約１％～約４００％、約１％～約３５０％、約１％～約３００％、約１％～約２８０％、約１％～約２６０％、約１％～約２４０％、約１％～約２２０％、約１％～約２００％、約１％～約１８０％、約１％～約１６０％、約１％～約１４０％、約１％～約１２０％、約１％～約１００％、約１％～約９０％、約１％～約８０％、約１％～約７０％、約１％～約６０％、約１％～約５０％、約１％～約４５％、約１％～約４０％、約１％～約３５％、約１％～約３０％、約１％～約２５％、約１％～約２０％、約１％～約１５％、約１％～約１０％、約１％～約５％、約５％～約８００％、約５％～約７５０％、約５％～約７００％、約５％～約６５０％、約５％～約６００％、約５％～約５５０％、約５％～約５００％、約５％～約４５０％、約５％～約４００％、約５％～約３５０％、約５％～約３００％、約５％～約２８０％、約５％～約２６０％、約５％～約２４０％、約５％～約２２０％、約５％～約２００％、約５％～約１８０％、約５％～約１６０％、約５％～約１４０％、約５％～約１２０％、約５％～約１００％、約５％～約９０％、約５％～約８０％、約５％～約７０％、約５％～約６０％、約５％～約５０％、約５％～約４５％、約５％～約４０％、約５％～約３５％、約５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、約５％～約１０％、約１０％～約８００％、約１０％～約７５０％、約１０％～約７００％、約１０％～約６５０％、約１０％～約６００％、約１０％～約５５０％、約１０％～約５００％、約１０％～約４５０％、約１０％～約４００％、約１０％～約３５０％、約１０％～約３００％、約１０％～約２８０％、約１０％～約２６０％、約１０％～約２４０％、約１０％～約２２０％、約１０％～約２００％、約１０％～約１８０％、約１０％～約１６０％、約１０％～約１４０％、約１０％～約１２０％、約１０％～約１００％、約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４５％、約１０％～約４０％、約１０％～約３５％、約１０％～約３０％、約１０％～約２５％、約１０％～約２０％、約１０％～約１５％、約１５％～約８００％、約１５％～約７５０％、約１５％～約７００％、約１５％～約６５０％、約１５％～約６００％、約１５％～約５５０％、約１５％～約５００％、約１５％～約４５０％、約１５％～約４００％、約１５％～約３５０％、約１５％～約３００％、約１５％～約２８０％、約１５％～約２６０％、約１５％～約２４０％、約１５％～約２２０％、約１５％～約２００％、約１５％～約１８０％、約１５％～約１６０％、約１５％～約１４０％、約１５％～約１２０％、約１５％～約１００％、約１５％～約９０％、約１５％～約８０％、約１５％～約７０％、約１５％～約６０％、約１５％～約５０％、約１５％～約４５％、約１５％～約４０％、約１５％～約３５％、約１５％～約３０％、約１５％～約２５％、約１５％～約２０％、約２０％～約８００％、約２０％～約７５０％、約２０％～約７００％、約２０％～約６５０％、約２０％～約６００％、約２０％～約５５０％、約２０％～約５００％、約２０％～約４５０％、約２０％～約４００％、約２０％～約３５０％、約２０％～約３００％、約２０％～約２８０％、約２０％～約２６０％、約２０％～約２４０％、約２０％～約２２０％、約２０％～約２００％、約２０％～約１８０％、約２０％～約１６０％、約２０％～約１４０％、約２０％～約１２０％、約２０％～約１００％、約２０％～約９０％、約２０％～約８０％、約２０％～約７０％、約２０％～約６０％、約２０％～約５０％、約２０％～約４５％、約２０％～約４０％、約２０％～約３５％、約２０％～約３０％、約２０％～約２５％、約２５％～約８００％、約２５％～約７５０％、約２５％～約７００％、約２５％～約６５０％、約２５％～約６００％、約２５％～約５５０％、約２５％～約５００％、約２５％～約４５０％、約２５％～約４００％、約２５％～約３５０％、約２５％～約３００％、約２５％～約２８０％、約２５％～約２６０％、約２５％～約２４０％、約２５％～約２２０％、約２５％～約２００％、約２５％～約１８０％、約２５％～約１６０％、約２５％～約１４０％、約２５％～約１２０％、約２５％～約１００％、約２５％～約９０％、約２５％～約８０％、約２５％～約７０％、約２５％～約６０％、約２５％～約５０％、約２５％～約４５％、約２５％～約４０％、約２５％～約３５％、約３５％～約８００％、約３５％～約７５０％、約３５％～約７００％、約３５％～約６５０％、約３５％～約６００％、約３５％～約５５０％、約３５％～約５００％、約３５％～約４５０％、約３５％～約４００％、約３５％～約３５０％、約３５％～約３００％、約３５％～約２８０％、約３５％～約２６０％、約３５％～約２４０％、約３５％～約２２０％、約３５％～約２００％、約３５％～約１８０％、約３５％～約１６０％、約３５％～約１４０％、約３５％～約１２０％、約３５％～約１００％、約３５％～約９０％、約３５％～約８０％、約３５％～約７０％、約３５％～約６０％、約３５％～約５０％、約３５％～約４５％、約３５％～約４０％、約４０％～約８００％、約４０％～約７５０％、約４０％～約７００％、約４０％～約６５０％、約４０％～約６００％、約４０％～約５５０％、約４０％～約５００％、約４０％～約４５０％、約４０％～約４００％、約４０％～約３５０％、約４０％～約３００％、約４０％～約２８０％、約４０％～約２６０％、約４０％～約２４０％、約４０％～約２２０％、約４０％～約２００％、約４０％～約１８０％、約４０％～約１６０％、約４０％～約１４０％、約４０％～約１２０％、約４０％～約１００％、約４０％～約９０％、約４０％～約８０％、約４０％～約７０％、約４０％～約６０％、約４０％～約５０％、約４０％～約４５％、約４５％～約８００％、約４５％～約７５０％、約４５％～約７００％、約４５％～約６５０％、約４５％～約６００％、約４５％～約５５０％、約４５％～約５００％、約４５％～約４５０％、約４５％～約４００％、約４５％～約３５０％、約４５％～約３００％、約４５％～約２８０％、約４５％～約２６０％、約４５％～約２４０％、約４５％～約２２０％、約４５％～約２００％、約４５％～約１８０％、約４５％～約１６０％、約４５％～約１４０％、約４５％～約１２０％、約４５％～約１００％、約４５％～約９０％、約４５％～約８０％、約４５％～約７０％、約４５％～約６０％、約４５％～約５０％、約５０％～約８００％、約５０％～約７５０％、約５０％～約７００％、約５０％～約６５０％、約５０％～約６００％、約５０％～約５５０％、約５０％～約５００％、約５０％～約４５０％、約５０％～約４００％、約５０％～約３５０％、約５０％～約３００％、約５０％～約２８０％、約５０％～約２６０％、約５０％～約２４０％、約５０％～約２２０％、約５０％～約２００％、約５０％～約１８０％、約５０％～約１６０％、約５０％～約１４０％、約５０％～約１２０％、約５０％～約１００％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約５０％～約６０％、約６０％～約８００％、約６０％～約７５０％、約６０％～約７００％、約６０％～約６５０％、約６０％～約６００％、約６０％～約５５０％、約６０％～約５００％、約６０％～約４５０％、約６０％～約４００％、約６０％～約３５０％、約６０％～約３００％、約６０％～約２８０％、約６０％～約２６０％、約６０％～約２４０％、約６０％～約２２０％、約６０％～約２００％、約６０％～約１８０％、約６０％～約１６０％、約６０％～約１４０％、約６０％～約１２０％、約６０％～約１００％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８００％、約７０％～約７５０％、約７０％～約７００％、約７０％～約６５０％、約７０％～約６００％、約７０％～約５５０％、約７０％～約５００％、約７０％～約４５０％、約７０％～約４００％、約７０％～約３５０％、約７０％～約３００％、約７０％～約２８０％、約７０％～約２６０％、約７０％～約２４０％、約７０％～約２２０％、約７０％～約２００％、約７０％～約１８０％、約７０％～約１６０％、約７０％～約１４０％、約７０％～約１２０％、約７０％～約１００％、約７０％～約９０％、約７０％～約８０％、約８０％～約８００％、約８０％～約７５０％、約８０％～約７００％、約８０％～約６５０％、約８０％～約６００％、約８０％～約５５０％、約８０％～約５００％、約８０％～約４５０％、約８０％～約４００％、約８０％～約３５０％、約８０％～約３００％、約８０％～約２８０％、約８０％～約２６０％、約８０％～約２４０％、約８０％～約２２０％、約８０％～約２００％、約８０％～約１８０％、約８０％～約１６０％、約８０％～約１４０％、約８０％～約１２０％、約８０％～約１００％、約８０％～約９０％、約９０％～約８００％、約９０％～約７５０％、約９０％～約７００％、約９０％～約６５０％、約９０％～約６００％、約９０％～約５５０％、約９０％～約５００％、約９０％～約４５０％、約９０％～約４００％、約９０％～約３５０％、約９０％～約３００％、約９０％～約２８０％、約９０％～約２６０％、約９０％～約２４０％、約９０％～約２２０％、約９０％～約２００％、約９０％～約１８０％、約９０％～約１６０％、約９０％～約１４０％、約９０％～約１２０％、約９０％～約１００％、約１００％～約８００％、約１００％～約７５０％、約１００％～約７００％、約１００％～約６５０％、約１００％～約６００％、約１００％～約５５０％、約１００％～約５００％、約１００％～約４５０％、約１００％～約４００％、約１００％～約３５０％、約１００％～約３００％、約１００％～約２８０％、約１００％～約２６０％、約１００％～約２４０％、約１００％～約２２０％、約１００％～約２００％、約１００％～約１８０％、約１００％～約１６０％、約１００％～約１４０％、約１００％～約１２０％、約１２０％～約８００％、約１２０％～約７５０％、約１２０％～約７００％、約１２０％～約６５０％、約１２０％～約６００％、約１２０％～約５５０％、約１２０％～約５００％、約１２０％～約４５０％、約１２０％～約４００％、約１２０％～約３５０％、約１２０％～約３００％、約１２０％～約２８０％、約１２０％～約２６０％、約１２０％～約２４０％、約１２０％～約２２０％、約１２０％～約２００％、約１２０％～約１８０％、約１２０％～約１６０％、約１２０％～約１４０％、約１４０％～約８００％、約１４０％～約７５０％、約１４０％～約７００％、約１４０％～約６５０％、約１４０％～約６００％、約１４０％～約５５０％、約１４０％～約５００％、約１４０％～約４５０％、約１４０％～約４００％、約１４０％～約３５０％、約１４０％～約３００％、約１４０％～約２８０％、約１４０％～約２６０％、約１４０％～約２４０％、約１４０％～約２２０％、約１４０％～約２００％、約１４０％～約１８０％、約１４０％～約１６０％、約１６０％～約８００％、約１６０％～約７５０％、約１６０％～約７００％、約１６０％～約６５０％、約１６０％～約６００％、約１６０％～約５５０％、約１６０％～約５００％、約１６０％～約４５０％、約１６０％～約４００％、約１６０％～約３５０％、約１６０％～約３００％、約１６０％～約２８０％、約１６０％～約２６０％、約１６０％～約２
４０％、約１６０％～約２２０％、約１６０％～約２００％、約１６０％～約１８０％、約１８０％～約８００％、約１８０％～約７５０％、約１８０％～約７００％、約１８０％～約６５０％、約１８０％～約６００％、約１８０％～約５５０％、約１８０％～約５００％、約１８０％～約４５０％、約１８０％～約４００％、約１８０％～約３５０％、約１８０％～約３００％、約１８０％～約２８０％、約１８０％～約２６０％、約１８０％～約２４０％、約１８０％～約２２０％、約１８０％～約２００％、約２００％～約８００％、約２００％～約７５０％、約２００％～約７００％、約２００％～約６５０％、約２００％～約６００％、約２００％～約５５０％、約２００％～約５００％、約２００％～約４５０％、約２００％～約４００％、約２００％～約３５０％、約２００％～約３００％、約２００％～約２８０％、約２００％～約２６０％、約２００％～約２４０％、約２００％～約２２０％、約２２０％～約８００％、約２２０％～約７５０％、約２２０％～約７００％、約２２０％～約６５０％、約２２０％～約６００％、約２２０％～約５５０％、約２２０％～約５００％、約２２０％～約４５０％、約２２０％～約４００％、約２２０％～約３５０％、約２２０％～約３００％、約２２０％～約２８０％、約２２０％～約２６０％、約２２０％～約２４０％、約２４０％～約８００％、約２４０％～約７５０％、約２４０％～約７００％、約２４０％～約６５０％、約２４０％～約６００％、約２４０％～約５５０％、約２４０％～約５００％、約２４０％～約４５０％、約２４０％～約４００％、約２４０％～約３５０％、約２４０％～約３００％、約２４０％～約２８０％、約２４０％～約２６０％、約２６０％～約８００％、約２６０％～約７５０％、約２６０％～約７００％、約２６０％～約６５０％、約２６０％～約６００％、約２６０％～約５５０％、約２６０％～約５００％、約２６０％～約４５０％、約２６０％～約４００％、約２６０％～約３５０％、約２６０％～約３００％、約２６０％～約２８０％、約２８０％～約８００％、約２８０％～約７５０％、約２８０％～約７００％、約２８０％～約６５０％、約２８０％～約６００％、約２８０％～約５５０％、約２８０％～約５００％、約２８０％～約４５０％、約２８０％～約４００％、約２８０％～約３５０％、約２８０％～約３００％、約３００％～約８００％、約３００％～約７５０％、約３００％～約７００％、約３００％～約６５０％、約３００％～約６００％、約３００％～約５５０％、約３００％～約５００％、約３００％～約４５０％、約３００％～約４００％、約３００％～約３５０％、約３５０％～約８００％、約３５０％～約７５０％、約３５０％～約７００％、約３５０％～約６５０％、約３５０％～約６００％、約３５０％～約５５０％、約３５０％～約５００％、約３５０％～約４５０％、約３５０％～約４００％、約４００％～約８００％、約４００％～約７５０％、約４００％～約７００％、約４００％～約６５０％、約４００％～約６００％、約４００％～約５５０％、約４００％～約５００％、約４００％～約４５０％、約４５０％～約８００％、約４５０％～約７５０％、約４５０％～約７００％、約４５０％～約６５０％、約４５０％～約６００％、約４５０％～約５５０％、約４５０％～約５００％、約５００％～約８００％、約５００％～約７５０％、約５００％～約７００％、約５００％～約６５０％、約５００％～約６００％、約５００％～約５５０％、約５５０％～約８００％、約５５０％～約７５０％、約５５０％～約７００％、約５５０％～約６５０％、約５５０％～約６００％、約６００％～約８００％、約６００％～約７５０％、約６００％～約７００％、約６００％～約６５０％、約６５０％～約８００％、約６５０％～約７５０％、約６５０％～約７００％、約７００％～約８００％、約７００％～約７５０％、または約７５０％～約８００％）の増加がもたらされ得る。
４０％、約１６０％～約２２０％、約１６０％～約２００％、約１６０％～約１８０％、約１８０％～約８００％、約１８０％～約７５０％、約１８０％～約７００％、約１８０％～約６５０％、約１８０％～約６００％、約１８０％～約５５０％、約１８０％～約５００％、約１８０％～約４５０％、約１８０％～約４００％、約１８０％～約３５０％、約１８０％～約３００％、約１８０％～約２８０％、約１８０％～約２６０％、約１８０％～約２４０％、約１８０％～約２２０％、約１８０％～約２００％、約２００％～約８００％、約２００％～約７５０％、約２００％～約７００％、約２００％～約６５０％、約２００％～約６００％、約２００％～約５５０％、約２００％～約５００％、約２００％～約４５０％、約２００％～約４００％、約２００％～約３５０％、約２００％～約３００％、約２００％～約２８０％、約２００％～約２６０％、約２００％～約２４０％、約２００％～約２２０％、約２２０％～約８００％、約２２０％～約７５０％、約２２０％～約７００％、約２２０％～約６５０％、約２２０％～約６００％、約２２０％～約５５０％、約２２０％～約５００％、約２２０％～約４５０％、約２２０％～約４００％、約２２０％～約３５０％、約２２０％～約３００％、約２２０％～約２８０％、約２２０％～約２６０％、約２２０％～約２４０％、約２４０％～約８００％、約２４０％～約７５０％、約２４０％～約７００％、約２４０％～約６５０％、約２４０％～約６００％、約２４０％～約５５０％、約２４０％～約５００％、約２４０％～約４５０％、約２４０％～約４００％、約２４０％～約３５０％、約２４０％～約３００％、約２４０％～約２８０％、約２４０％～約２６０％、約２６０％～約８００％、約２６０％～約７５０％、約２６０％～約７００％、約２６０％～約６５０％、約２６０％～約６００％、約２６０％～約５５０％、約２６０％～約５００％、約２６０％～約４５０％、約２６０％～約４００％、約２６０％～約３５０％、約２６０％～約３００％、約２６０％～約２８０％、約２８０％～約８００％、約２８０％～約７５０％、約２８０％～約７００％、約２８０％～約６５０％、約２８０％～約６００％、約２８０％～約５５０％、約２８０％～約５００％、約２８０％～約４５０％、約２８０％～約４００％、約２８０％～約３５０％、約２８０％～約３００％、約３００％～約８００％、約３００％～約７５０％、約３００％～約７００％、約３００％～約６５０％、約３００％～約６００％、約３００％～約５５０％、約３００％～約５００％、約３００％～約４５０％、約３００％～約４００％、約３００％～約３５０％、約３５０％～約８００％、約３５０％～約７５０％、約３５０％～約７００％、約３５０％～約６５０％、約３５０％～約６００％、約３５０％～約５５０％、約３５０％～約５００％、約３５０％～約４５０％、約３５０％～約４００％、約４００％～約８００％、約４００％～約７５０％、約４００％～約７００％、約４００％～約６５０％、約４００％～約６００％、約４００％～約５５０％、約４００％～約５００％、約４００％～約４５０％、約４５０％～約８００％、約４５０％～約７５０％、約４５０％～約７００％、約４５０％～約６５０％、約４５０％～約６００％、約４５０％～約５５０％、約４５０％～約５００％、約５００％～約８００％、約５００％～約７５０％、約５００％～約７００％、約５００％～約６５０％、約５００％～約６００％、約５００％～約５５０％、約５５０％～約８００％、約５５０％～約７５０％、約５５０％～約７００％、約５５０％～約６５０％、約５５０％～約６００％、約６００％～約８００％、約６００％～約７５０％、約６００％～約７００％、約６００％～約６５０％、約６５０％～約８００％、約６５０％～約７５０％、約６５０％～約７００％、約７００％～約８００％、約７００％～約７５０％、または約７５０％～約８００％）の増加がもたらされ得る。
【0312】
本明細書に提供される方法により、（例えば、前記期間の開始時と比較して前記期間の終了時に）Ｔｒｅｇ細胞の濃度または数の増加（例えば、約１％～約８００％の増加、または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）がもたらされ得る。
【0313】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法により、（例えば、前記期間の開始時と比較して前記期間の終了時に）Ｔｒｅｇ細胞の濃度または数の増加（例えば、約０．１倍増加～約１００倍増加、約０．１倍増加～約９０倍増加、約０．１倍増加～約８０倍増加、約０．１倍増加～約７０倍増加、約０．１倍増加～約６０倍増加、約０．１倍増加～約５０倍増加、約０．１倍増加～約４５倍増加、約０．１倍増加～約４０倍増加、約０．１倍増加～約３５倍増加、約０．１倍増加～約３０倍増加、約０．１倍増加～約２５倍増加、約０．１倍増加～約２０倍増加、約０．１倍増加～約１５倍増加、約０．１倍増加～約１０倍増加、約０．１倍増加～約８倍増加、約０．１倍増加～約６倍増加、約０．１倍増加～約４倍増加、約０．１倍増加～約２倍増加、約０．１倍増加～約１．５倍増加、約０．１倍増加～約１倍増加、約０．１倍増加～約０．５倍増加、約０．５倍増加～約１００倍増加、約０．５倍増加～約９０倍増加、約０．５倍増加～約８０倍増加、約０．５倍増加～約７０倍増加、約０．５倍増加～約６０倍増加、約０．５倍増加～約５０倍増加、約０．５倍増加～約４５倍増加、約０．５倍増加～約４０倍増加、約０．５倍増加～約３５倍増加、約０．５倍増加～約３０倍増加、約０．５倍増加～約２５倍増加、約０．５倍増加～約２０倍増加、約０．５倍増加～約１５倍増加、約０．５倍増加～約１０倍増加、約０．５倍増加～約８倍増加、約０．５倍増加～約６倍増加、約０．５倍増加～約４倍増加、約０．５倍増加～約２倍増加、約０．５倍増加～約１．５倍増加、約０．５倍増加～約１倍増加、約１倍増加～約１００倍増加、約１倍増加～約９０倍増加、約１倍増加～約８０倍増加、約１倍増加～約７０倍増加、約１倍増加～約６０倍増加、約１倍増加～約５０倍増加、約１倍増加～約４５倍増加、約１倍増加～約４０倍増加、約１倍増加～約３５倍増加、約１倍増加～約３０倍増加、約１倍増加～約２５倍増加、約１倍増加～約２０倍増加、約１倍増加～約１５倍増加、約１倍増加～約１０倍増加、約１倍増加～約８倍増加、約１倍増加～約６倍増加、約１倍増加～約４倍増加、約１倍増加～約２倍増加、約１倍増加～約１．５倍増加、約１．５倍増加～約１００倍増加、約１．５倍増加～約９０倍増加、約１．５倍増加～約８０倍増加、約１．５倍増加～約７０倍増加、約１．５倍増加～約６０倍増加、約１．５倍増加～約５０倍増加、約１．５倍増加～約４５倍増加、約１．５倍増加～約４０倍増加、約１．５倍増加～約３５倍増加、約１．５倍増加～約３０倍増加、約１．５倍増加～約２５倍増加、約１．５倍増加～約２０倍増加、約１．５倍増加～約１５倍増加、約１．５倍増加～約１０倍増加、約１．５倍増加～約８倍増加、約１．５倍増加～約６倍増加、約１．５倍増加～約４倍増加、約１．５倍増加～約２倍増加、約２倍増加～約１００倍増加、約２倍増加～約９０倍増加、約２倍増加～約８０倍増加、約２倍増加～約７０倍増加、約２倍増加～約６０倍増加、約２倍増加～約５０倍増加、約２倍増加～約４５倍増加、約２倍増加～約４０倍増加、約２倍増加～約３５倍増加、約２倍増加～約３０倍増加、約２倍増加～約２５倍増加、約２倍増加～約２０倍増加、約２倍増加～約１５倍増加、約２倍増加～約１０倍増加、約２倍増加～約８倍増加、約２倍増加～約６倍増加、約２倍増加～約４倍増加、約４倍増加～約１００倍増加、約４倍増加～約９０倍増加、約４倍増加～約８０倍増加、約４倍増加～約７０倍増加、約４倍増加～約６０倍増加、約４倍増加～約５０倍増加、約４倍増加～約４５倍増加、約４倍増加～約４０倍増加、約４倍増加～約３５倍増加、約４倍増加～約３０倍増加、約４倍増加～約２５倍増加、約４倍増加～約２０倍増加、約４倍増加～約１５倍増加、約４倍増加～約１０倍増加、約４倍増加～約８倍増加、約４倍増加～約６倍増加、約６倍増加～約１００倍増加、約６倍増加～約９０倍増加、約６倍増加～約８０倍増加、約６倍増加～約７０倍増加、約６倍増加～約６０倍増加、約６倍増加～約５０倍増加、約６倍増加～約４５倍増加、約６倍増加～約４０倍増加、約６倍増加～約３５倍増加、約６倍増加～約３０倍増加、約６倍増加～約２５倍増加、約６倍増加～約２０倍増加、約６倍増加～約１５倍増加、約６倍増加～約１０倍増加、約６倍増加～約８倍増加、約８倍増加～約１００倍増加、約８倍増加～約９０倍増加、約８倍増加～約８０倍増加、約８倍増加～約７０倍増加、約８倍増加～約６０倍増加、約８倍増加～約５０倍増加、約８倍増加～約４５倍増加、約８倍増加～約４０倍増加、約８倍増加～約３５倍増加、約８倍増加～約３０倍増加、約８倍増加～約２５倍増加、約８倍増加～約２０倍増加、約８倍増加～約１５倍増加、約８倍増加～約１０倍増加、約１０倍増加～約１００倍増加、約１０倍増加～約９０倍増加、約１０倍増加～約８０倍増加、約１０倍増加～約７０倍増加、約１０倍増加～約６０倍増加、約１０倍増加～約５０倍増加、約１０倍増加～約４５倍増加、約１０倍増加～約４０倍増加、約１０倍増加～約３５倍増加、約１０倍増加～約３０倍増加、約１０倍増加～約２５倍増加、約１０倍増加～約２０倍増加、約１０倍増加～約１５倍増加、約１５倍増加～約１００倍増加、約１５倍増加～約９０倍増加、約１５倍増加～約８０倍増加、約１５倍増加～約７０倍増加、約１５倍増加～約６０倍増加、約１５倍増加～約５０倍増加、約１５倍増加～約４５倍増加、約１５倍増加～約４０倍増加、約１５倍増加～約３５倍増加、約１５倍増加～約３０倍増加、約１５倍増加～約２５倍増加、約１５倍増加～約２０倍増加、約２０倍増加～約１００倍増加、約２０倍増加～約９０倍増加、約２０倍増加～約８０倍増加、約２０倍増加～約７０倍増加、約２０倍増加～約６０倍増加、約２０倍増加～約５０倍増加、約２０倍増加～約４５倍増加、約２０倍増加～約４０倍増加、約２０倍増加～約３５倍増加、約２０倍増加～約３０倍増加、約２０倍増加～約２５倍増加、約２５倍増加～約１００倍増加、約２５倍増加～約９０倍増加、約２５倍増加～約８０倍増加、約２５倍増加～約７０倍増加、約２５倍増加～約６０倍増加、約２５倍増加～約５０倍増加、約２５倍増加～約４５倍増加、約２５倍増加～約４０倍増加、約２５倍増加～約３５倍増加、約２５倍増加～約３０倍増加、約３０倍増加～約１００倍増加、約３０倍増加～約９０倍増加、約３０倍増加～約８０倍増加、約３０倍増加～約７０倍増加、約３０倍増加～約６０倍増加、約３０倍増加～約５０倍増加、約３０倍増加～約４５倍増加、約３０倍増加～約４０倍増加、約３０倍増加～約３５倍増加、約３５倍増加～約１００倍増加、約３５倍増加～約９０倍増加、約３５倍増加～約８０倍増加、約３５倍増加～約７０倍増加、約３５倍増加～約６０倍増加、約３５倍増加～約５０倍増加、約３５倍増加～約４５倍増加、約３５倍増加～約４０倍増加、約４０倍増加～約１００倍増加、約４０倍増加～約９０倍増加、約４０倍増加～約８０倍増加、約４０倍増加～約７０倍増加、約４０倍増加～約６０倍増加、約４０倍増加～約５０倍増加、約４０倍増加～約４５倍増加、約４５倍増加～約１００倍増加、約４５倍増加～約９０倍増加、約４５倍増加～約８０倍増加、約４５倍増加～約７０倍増加、約４５倍増加～約６０倍増加、約４５倍増加～約５０倍増加、約５０倍増加～約１００倍増加、約５０倍増加～約９０倍増加、約５０倍増加～約８０倍増加、約５０倍増加～約７０倍増加、約５０倍増加～約６０倍増加、約６０倍増加～約１００倍増加、約６０倍増加～約９０倍増加、約６０倍増加～約８０倍増加、約６０倍増加～約７０倍増加、約７０倍増加～約１００倍増加、約７０倍増加～約９０倍増加、約７０倍増加～約８０倍増加、約８０倍増加～約１００倍増加、約８０倍増加～約９０倍増加、または約９０倍増加～約１００倍増加）がもたらされ得る。
【0314】
組成物およびキット
本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されるＴｒｅｇ細胞の集団も本明細書に提供される。本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたＴｒｅｇ細胞または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたＴｒｅｇ細胞の集団を含む組成物（例えば、医薬組成物）も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）を含み得る。本組成物は、治療を必要とする対象（例えば、本明細書に記載の例示的な対象のうちのいずれか）を治療するために使用することができる。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されるＴｒｅｇ細胞の集団も本明細書に提供される。本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたＴｒｅｇ細胞または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたＴｒｅｇ細胞の集団を含む組成物（例えば、医薬組成物）も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）を含み得る。本組成物は、治療を必要とする対象（例えば、本明細書に記載の例示的な対象のうちのいずれか）を治療するために使用することができる。
【0315】
医薬組成物の単回または複数回投与は、例えば、対象によって必要とされ、かつ許容される投薬量および頻度に応じて、それを必要とする対象に与えられ得る。製剤は、対象における状態、疾患、または症状を効果的に治療、予防、または改善するのに十分な量のＴｒｅｇ細胞を提供すべきである。
【0316】
キットであって、（ｉ）ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤（例えば、本明細書に記載のＣＤ３／ＣＤ２８結合剤のうちのいずれか）と、（ｉｉ）第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチド（例えば、本明細書に記載のかかる単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれか）であって、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインがＩＬ－２受容体に結合する、単鎖キメラポリペプチドと、（ｉｉｉ）ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、本明細書に記載のいずれかのｍＴＯＲ阻害剤）と、を含むキットも本明細書に提供される。これらのキットのいくつかの実施形態は、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物（例えば、本明細書に記載の例示的なＩｇＧ１抗体構築物のうちのいずれか）をさらに含み得る。これらのキットのいくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（例えば、本明細書に記載の例示的な抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズのうちのいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む追加の単鎖キメラポリペプチド（例えば、本明細書に記載のかかる単鎖キメラポリペプチドの例のうちのいずれか）であり、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、追加の単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態では、キットは、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物（例えば、本明細書に記載の例示的なＩｇＧ１抗体構築物のうちのいずれか）をさらに含み得る。
【0317】
キットであって、（ｉ）インターロイキン－２受容体活性化剤（例えば、本明細書に記載のインターロイキン－２受容体活性化剤のうちのいずれか）と、（ｉｉ）第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチド（例えば、本明細書に記載のかかる単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれか）であって、第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合するか、または第１の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合しかつ第２の標的結合ドメインがＣＤ３に結合する、単鎖キメラポリペプチドと、（ｉｉｉ）ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、本明細書に記載のいずれかのｍＴＯＲ阻害剤）と、を含むキットも本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、キットは、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物（例えば、本明細書に記載の例示的なＩｇＧ１抗体構築物のうちのいずれか）をさらに含み得る。
【0318】
キットであって、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤（例えば、本明細書に記載のＣＤ３／ＣＤ２８結合剤のうちのいずれか）と、多鎖キメラポリペプチド（例えば、本明細書に記載の例示的な多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれか）であって、（ａ）（ｉ）第１の標的結合ドメイン、（ｉｉ）可溶性組織因子ドメイン、および（ｉｉｉ）一対の親和性ドメインの第１のドメインを含む、第１のキメラポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）一対の親和性ドメインの第２のドメインおよび（ｉｉ）第２の標的結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドとを含み、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第１のドメインと第２のドメインとの結合を介して会合する、多鎖キメラポリペプチドと、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、本明細書に記載の例示的なｍＴＯＲ阻害剤のうちのいずれか）とを含む、キットも本明細書に提供される。これらのキットのいくつかの実施形態は、多鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物（例えば、本明細書に記載の例示的なＩｇＧ１抗体構築物のうちのいずれか）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（例えば、本明細書に記載の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズのうちのいずれか）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ２８結合剤は、第１の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第２の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチド（例えば、本明細書に記載のかかる単鎖キメラポリペプチドの例のうちのいずれか）であり、追加の単鎖キメラポリペプチドの第１の標的結合ドメインがＣＤ３に結合し、追加の単鎖キメラポリペプチドの第２の標的結合ドメインがＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態では、キットは、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧ１抗体構築物（例えば、本明細書に記載の例示的なＩｇＧ１抗体構築物のうちのいずれか）をさらに含む。
【0319】
核酸／ベクター
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかをコードする核酸も本明細書に提供される。本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかを含むベクターも本明細書に提供される。
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかをコードする核酸も本明細書に提供される。本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかを含むベクターも本明細書に提供される。
【0320】
本明細書に記載のベクターのうちのいずれかは、発現ベクターであり得る。例えば、発現ベクターは、単鎖キメラポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含み得る。
【0321】
ベクターの非限定的な例には、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、およびウイルスベクター（例えば、任意のアデノウイルスベクター（例えば、ｐＳＶまたはｐＣＭＶベクター）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター）、ならびに任意のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクターが挙げられる。ベクターは、例えば、発現のために十分なシス作用エレメントを含み得、発現のための他の要素は、宿主哺乳類細胞によって、またはインビトロ発現系において供給され得る。当業者であれば、本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかの作製に好適なベクターおよび哺乳類細胞を選択することができるであろう。
【0322】
細胞
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかをコードする本明細書に記載の核酸のうちのいずれかを含む細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な細胞のうちのいずれか）も本明細書に提供される。
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかをコードする本明細書に記載の核酸のうちのいずれかを含む細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な細胞のうちのいずれか）も本明細書に提供される。
【0323】
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかをコードする本明細書に記載のベクターのうちのいずれかを含む細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な細胞のうちのいずれか）も本明細書に提供される。
【0324】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞であり得る。本明細書で使用される場合、「真核細胞」という用語は、別個の膜結合核を有する細胞を指す。かかる細胞には、例えば、哺乳類（例えば、齧歯類、非ヒト霊長類、またはヒト）細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または植物細胞が含まれ得る。いくつかの実施形態では、真核細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、哺乳類細胞、鳥類細胞、植物細胞、または昆虫細胞などの高等真核生物である。哺乳類細胞の非限定的な例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびヒト胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）が挙げられる。
【0325】
核酸および発現ベクターを細胞（例えば、真核細胞）に導入する方法は、当該技術分野で既知である。核酸を細胞に導入するために使用され得る方法の非限定的な例には、リポフェクション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマーベースのトランスフェクション、カチオン性ポリマートランスフェクション、細胞圧搾、ソノポレーション、光学トランスフェクション、インパレフェクション、流体力学的送達、マグネトフェクション、ウイルス形質導入（例えば、アデノウイルスおよびレンチウイルス形質導入）、およびナノ粒子トランスフェクションが挙げられる。
【0326】
単鎖または多鎖キメラポリペプチドを産生する方法
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかを産生する方法であって、単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドの産生をもたらすのに十分な条件下で本明細書に記載の細胞のうちのいずれかを培養培地中で培養する工程と、単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドを細胞および／または培養培地から回収する工程とを含む、方法も本明細書に提供される。
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかを産生する方法であって、単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドの産生をもたらすのに十分な条件下で本明細書に記載の細胞のうちのいずれかを培養培地中で培養する工程と、単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドを細胞および／または培養培地から回収する工程とを含む、方法も本明細書に提供される。
【0327】
培養培地または細胞（例えば、真核生物細胞）からの単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドの回収は、当該技術分野で周知の技法（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ポリエチレングリコール沈殿、イオン交換クロマトグラフィー（アニオンまたはカチオン）、疎水性相互作用に基づくクロマトグラフィー、金属アフィニティークロマトグラフィー、リガンドアフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー）を使用して行うことができる。
【0328】
細胞を培養する方法は、当該技術分野で周知である。細胞は、増殖、分化、および成長を好む条件下で、インビトロで維持され得る。簡潔には、細胞は、細胞（例えば、任意の細胞）を、細胞の生存および成長を支持するために必要な成長因子および栄養補助剤を含む細胞培養培地と接触させることによって培養され得る。
【0329】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって産生される単鎖キメラポリペプチド（例えば、本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれか）または多鎖キメラポリペプチド（例えば、本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれか）も本明細書に提供される。
【0330】
治療方法
治療を必要とする対象（例えば、本明細書に記載の例示的な対象のうちのいずれか）を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して生成されたＴｒｅｇ細胞の集団、または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して生成されたＴｒｅｇ細胞もしくはＴｒｅｇ細胞の集団を含む組成物（例えば、医薬組成物）のうちのいずれかの治療有効量を投与する工程を含む、方法も本明細書に提供される。
治療を必要とする対象（例えば、本明細書に記載の例示的な対象のうちのいずれか）を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して生成されたＴｒｅｇ細胞の集団、または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して生成されたＴｒｅｇ細胞もしくはＴｒｅｇ細胞の集団を含む組成物（例えば、医薬組成物）のうちのいずれかの治療有効量を投与する工程を含む、方法も本明細書に提供される。
【0331】
これらの方法のいくつかの実施形態では、対象は、加齢性疾患または炎症性疾患を有すると特定または診断されている。いくつかの実施形態では、加齢性疾患は、アルツハイマー病、動脈瘤、嚢胞性線維症、膵炎における線維症、緑内障、高血圧症、特発性肺線維症、炎症性腸疾患、椎間板変性、黄斑変性、骨関節炎、２型真性糖尿病、脂肪萎縮、リポジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、白内障、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症、腎移植不全、肝線維症、骨量喪失、心筋梗塞、サルコペニア、創傷治癒、脱毛症、心筋細胞肥大、骨関節炎、パーキンソン病、加齢性肺組織弾性喪失、黄斑変性、悪液質、糸球体硬化症、肝硬変、ＮＡＦＬＤ、骨粗しょう症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、多発性硬化症、神経変性、発作、認知症、血管疾患、易感染性、慢性炎症、および腎機能障害の群から選択される。
【0332】
いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病性腎症、ＣＮＳ損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、乾癬、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および気分障害の群から選択される。
【0333】
いくつかの実施形態では、これらの方法により、（例えば、治療前の対象におけるがんの１つ以上の症状の数、重症度、または頻度と比較して）対象におけるがんの１つ以上の症状の数、重症度、または頻度の減少がもたらされ得る。
【0334】
いくつかの例では、本方法により、例えば、治療前の対象における老化細胞の数と比較して、減少（例えば、約１％の減少～約９９％の減少、約１％の減少～約９５％の減少、約１％の減少～約９０％の減少、約１％の減少～約８５％の減少、約１％の減少～約８０％の減少、約１％の減少～約７５％の減少、約１％～約７０％の減少、約１％の減少～約６５％の減少、約１％の減少～約６０％の減少、約１％の減少～約５５％の減少、約１％の減少～約５０％の減少、約１％の減少～約４５％の減少、約１％の減少～約４０％の減少、約１％の減少～約３５％の減少、約１％の減少～約３０％の減少、約１％の減少～約２５％の減少、約１％の減少～約２０％の減少、約１％の減少～約１５％の減少、約１％の減少～約１０％の減少、約１％の減少～約５％の減少、約５％の減少～約９９％の減少、約５％の減少～約９５％の減少、約５％の減少～約９０％の減少、約５％の減少～約８５％の減少、約５％の減少～約８０％の減少、約５％の減少～約７５％の減少、約５％～約７０％の減少、約５％の減少～約６５％の減少、約５％の減少～約６０％の減少、約５％の減少～約５５％の減少、約５％の減少～約５０％の減少、約５％の減少～約４５％の減少、約５％の減少～約４０％の減少、約５％の減少～約３５％の減少、約５％の減少～約３０％の減少、約５％の減少～約２５％の減少、約５％の減少～約２０％の減少、約５％の減少～約１５％の減少、約５％の減少～約１０％の減少、約１０％の減少～約９９％の減少、約１０％の減少～約９５％の減少、約１０％の減少～約９０％の減少、約１０％の減少～約８５％の減少、約１０％の減少～約８０％の減少、約１０％の減少～約７５％の減少、約１０％～約７０％の減少、約１０％の減少～約６５％の減少、約１０％の減少～約６０％の減少、約１０％の減少～約５５％の減少、約１０％の減少～約５０％の減少、約１０％の減少～約４５％の減少、約１０％の減少～約４０％の減少、約１０％の減少～約３５％の減少、約１０％の減少～約３０％の減少、約１０％の減少～約２５％の減少、約１０％の減少～約２０％の減少、約１０％の減少～約１５％の減少、約１５％の減少～約９９％の減少、約１５％の減少～約９５％の減少、約１５％の減少～約９０％の減少、約１５％の減少～約８５％の減少、約１５％の減少～約８０％の減少、約１５％の減少～約７５％の減少、約１５％～約７０％の減少、約１５％の減少～約６５％の減少、約１５％の減少～約６０％の減少、約１５％の減少～約５５％の減少、約１５％の減少～約５０％の減少、約１５％の減少～約４５％の減少、約１５％の減少～約４０％の減少、約１５％の減少～約３５％の減少、約１５％の減少～約３０％の減少、約１５％の減少～約２５％の減少、約１５％の減少～約２０％の減少、約２０％の減少～約９９％の減少、約２０％の減少～約９５％の減少、約２０％の減少～約９０％の減少、約２０％の減少～約８５％の減少、約２０％の減少～約８０％の減少、約２０％の減少～約７５％の減少、約２０％～約７０％の減少、約２０％の減少～約６５％の減少、約２０％の減少～約６０％の減少、約２０％の減少～約５５％の減少、約２０％の減少～約５０％の減少、約２０％の減少～約４５％の減少、約２０％の減少～約４０％の減少、約２０％の減少～約３５％の減少、約２０％の減少～約３０％の減少、約２０％の減少～約２５％の減少、約２５％の減少～約９９％の減少、約２５％の減少～約９５％の減少、約２５％の減少～約９０％の減少、約２５％の減少～約８５％の減少、約２５％の減少～約８０％の減少、約２５％の減少～約７５％の減少、約２５％～約７０％の減少、約２５％の減少～約６５％の減少、約２５％の減少～約６０％の減少、約２５％の減少～約５５％の減少、約２５％の減少～約５０％の減少、約２５％の減少～約４５％の減少、約２５％の減少～約４０％の減少、約２５％の減少～約３５％の減少、約２５％の減少～約３０％の減少、約３０％の減少～約９９％の減少、約３０％の減少～約９５％の減少、約３０％の減少～約９０％の減少、約３０％の減少～約８５％の減少、約３０％の減少～約８０％の減少、約３０％の減少～約７５％の減少、約３０％～約７０％の減少、約３０％の減少～約６５％の減少、約３０％の減少～約６０％の減少、約３０％の減少～約５５％の減少、約３０％の減少～約５０％の減少、約３０％の減少～約４５％の減少、約３０％の減少～約４０％の減少、約３０％の減少～約３５％の減少、約３５％の減少～約９９％の減少、約３５％の減少～約９５％の減少、約３５％の減少～約９０％の減少、約３５％の減少～約８５％の減少、約３５％の減少～約８０％の減少、約３５％の減少～約７５％の減少、約３５％～約７０％の減少、約３５％の減少～約６５％の減少、約３５％の減少～約６０％の減少、約３５％の減少～約５５％の減少、約３５％の減少～約５０％の減少、約３５％の減少～約４５％の減少、約３５％の減少～約４０％の減少、約４０％の減少～約９９％の減少、約４０％の減少～約９５％の減少、約４０％の減少～約９０％の減少、約４０％の減少～約８５％の減少、約４０％の減少～約８０％の減少、約４０％の減少～約７５％の減少、約４０％～約７０％の減少、約４０％の減少～約６５％の減少、約４０％の減少～約６０％の減少、約４０％の減少～約５５％の減少、約４０％の減少～約５０％の減少、約４０％の減少～約４５％の減少、約４５％の減少～約９９％の減少、約４５％の減少～約９５％の減少、約４５％の減少～約９０％の減少、約４５％の減少～約８５％の減少、約４５％の減少～約８０％の減少、約４５％の減少～約７５％の減少、約４５％～約７０％の減少、約４５％の減少～約６５％の減少、約４５％の減少～約６０％の減少、約４５％の減少～約５５％の減少、約４５％の減少～約５０％の減少、約５０％の減少～約９９％の減少、約５０％の減少～約９５％の減少、約５０％の減少～約９０％の減少、約５０％の減少～約８５％の減少、約５０％の減少～約８０％の減少、約５０％の減少～約７５％の減少、約５０％～約７０％の減少、約５０％の減少～約６５％の減少、約５０％の減少～約６０％の減少、約５０％の減少～約５５％の減少、約５５％の減少～約９９％の減少、約５５％の減少～約９５％の減少、約５５％の減少～約９０％の減少、約５５％の減少～約８５％の減少、約５５％の減少～約８０％の減少、約５５％の減少～約７５％の減少、約５５％～約７０％の減少、約５５％の減少～約６５％の減少、約５５％の減少～約６０％の減少、約６０％の減少～約９９％の減少、約６０％の減少～約９５％の減少、約６０％の減少～約９０％の減少、約６０％の減少～約８５％の減少、約６０％の減少～約８０％の減少、約６０％の減少～約７５％の減少、約６０％～約７０％の減少、約６０％の減少～約６５％の減少、約６５％の減少～約９９％の減少、約６５％の減少～約９５％の減少、約６５％の減少～約９０％の減少、約６５％の減少～約８５％の減少、約６５％の減少～約８０％の減少、約６５％の減少～約７５％の減少、約６５％～約７０％の減少、約７０％の減少～約９９％の減少、約７０％の減少～約９５％の減少、約７０％の減少～約９０％の減少、約７０％の減少～約８５％の減少、約７０％の減少～約８０％の減少、約７０％の減少～約７５％の減少、約７５％の減少～約９９％の減少、約７５％減少～約９５％の減少、約７５％の減少～約９０％の減少、約７５％の減少～約８５％の減少、約７５％の減少～約８０％の減少、約８０％の減少～約９９％の減少、約８０％の減少～約９５％の減少、約８０％の減少～約９０％の減少、約８０％の減少～約８５％の減少、約８５％の減少～約９９％の減少、約８５％の減少～約９５％の減少、約８５％の減少～約９０％の減少、約９０％の減少～約９９％の減少、約９０％の減少～約９５％の減少、または約９５％の減少～約９９％の減少）（例えば、対象における加齢性疾患または炎症性疾患に関与および／または関係する１つ以上の特定の組織中の老化細胞の数の減少）がもたらされ得る。
【0335】
「対象」という用語は、任意の哺乳類を指す。いくつかの実施形態では、対象または「治療を必要とする対象」は、イヌ科動物（例えば、イヌ）、ネコ科動物（例えば、ネコ）、ウマ科動物（例えば、ウマ）、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、霊長類、例えば、サル（ｓｉｍｉａｎ）（例えば、サル（ｍｏｎｋｅｙ）（例えば、マーモセット、ヒヒ）、もしくは類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、またはテナガザル）、もしくはヒト、または齧歯類（例えば、マウス、テンジクネズミ、ハムスター、またはラット）であり得る。いくつかの実施形態では、対象または「治療を必要とする対象」は、非ヒト哺乳類であり得、特にヒトにおける治療効果を実証するためにモデルとして従来使用されている哺乳類（例えば、マウス、ラパイン、ブタ、イヌ、または霊長類動物）が用いられ得る。
【0336】
老化細胞
老化は、表現型の変化、アポトーシスへの耐性、および損傷を感知するシグナル伝達経路の活性化を伴う不可逆的な成長停止の一形態である。細胞老化は、増殖する能力を失った培養ヒト線維芽細胞で最初に説明され、約５０回の集団倍加（ヘイフリック限界と称される）後に永久停止に達した。老化は、酸化的ストレスおよび遺伝毒性ストレス、ＤＮＡ損傷、テロメア摩滅、発がん性活性化、ミトコンドリア機能障害、または化学療法剤を含む、広範囲の内因性および外因性傷害によって誘導され得るストレス応答とみなされる。
老化は、表現型の変化、アポトーシスへの耐性、および損傷を感知するシグナル伝達経路の活性化を伴う不可逆的な成長停止の一形態である。細胞老化は、増殖する能力を失った培養ヒト線維芽細胞で最初に説明され、約５０回の集団倍加（ヘイフリック限界と称される）後に永久停止に達した。老化は、酸化的ストレスおよび遺伝毒性ストレス、ＤＮＡ損傷、テロメア摩滅、発がん性活性化、ミトコンドリア機能障害、または化学療法剤を含む、広範囲の内因性および外因性傷害によって誘導され得るストレス応答とみなされる。
【0337】
老化細胞は、代謝的に活性を維持し、それらの分泌表現型を介して組織の止血、疾患、加齢に影響を及ぼし得る。老化は、生理学的プロセスとみなされており、創傷治癒、組織の恒常性、再生、および線維症の調節を促進する上で重要である。例えば、老化細胞の一過性の誘導は、治癒中に観察され、創傷の消散に寄与する。恐らく、老化の最も重要な役割の１つは、腫瘍抑制におけるその役割である。しかしながら、老化細胞の蓄積は、加齢および加齢関連疾患および状態も促進する。老化の表現型は、慢性炎症反応も引き起こし、その結果、慢性炎症状態を増強して、腫瘍の成長を促進する可能性がある。老化と加齢との間の関連性は、当初、老化細胞が加齢組織に蓄積するという観察に基づいていた。トランスジェニックモデルの使用により、多くの加齢関連病状において老化細胞を体系的に検出することが可能になった。老化細胞を選択的に排除するための戦略は、老化細胞が実際に加齢および関連病状において因果的役割を果たすことができることを実証している。
【0338】
老化細胞は、形態、クロマチン構成、遺伝子発現、および代謝の変化を含む重要な特有の特性を示す。細胞老化に関連するいくつかの生化学的および機能的特性、例えば、（ｉ）サイクリン依存性キナーゼの阻害剤であるｐ１６およびｐ２１の発現の増加、（ｉｉ）リソソーム活性のマーカーである老化関連β－ガラクトシダーゼの存在、（ｉｉｉ）老化関連ヘテロクロマチン病巣の出現およびラミンＢ１レベルのダウンレギュレーション、（ｉｖ）抗アポトーシスＢＣＬファミリータンパク質の発現の増加によって引き起こされるアポトーシスに対する耐性、および（ｖ）ＣＤ２６（ＤＰＰ４）、ＣＤ３６（スカベンジャー受容体）、フォークヘッドボックス４（ＦＯＸＯ４）、および分泌キャリア膜タンパク質４（ＳＣＡＭＰ４）のアップレギュレーションが存在する。老化細胞は、炎症特性、いわゆる老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）も発現する。ＳＡＳＰを介して、老化細胞は、細胞自律的様式で作動して老化を強化し（オートクリン効果）、微小環境と通信して修飾する（パラクリン効果）、広範囲の炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－８）、成長因子（ＴＧＦ－β）、ケモカイン（ＣＣＬ－２）、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９）を産生する。ＳＡＳＰ因子は、老化細胞の免疫介在性クリアランスである老化監視をトリガーすることによって腫瘍抑制に寄与することができる。しかしながら、慢性炎症も腫瘍形成の既知の要因であり、累積証拠は、慢性ＳＡＳＰががんおよび加齢関連疾患を後押しする可能性もあることを示す。
【0339】
老化細胞の分泌プロファイルは、状況依存的である。例えば、ヒト線維芽細胞における様々なミトコンドリア機能障害によって誘導されるミトコンドリア機能障害関連老化（ＭｉＤＡＳ）は、ＩＬ－１依存性炎症性因子が不足したＳＡＳＰの出現をもたらした。ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比の減少は、ｐ５３の活性化によりＭｉＤＡＳを誘導したＡＭＰＫシグナル伝達を活性化した。結果として、ｐ５３は炎症促進性ＳＡＳＰの重要な誘導因子であるＮＦ－κＢシグナル伝達を阻害した。対照的に、ヒト細胞における持続的なＤＮＡ損傷によって引き起こされた細胞老化は、炎症性ＳＡＳＰを誘導し、これは、運動失調－毛細血管拡張症変異（ＡＴＭ）キナーゼの活性化に依存したが、ｐ５３の活性化には依存しなかった。具体的には、ＩＬ－６およびＩＬ－８の発現レベルおよび分泌レベルが増加した。異所性発現ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｐ２１ＣＩＰ１によって引き起こされる細胞老化が、炎症性ＳＡＳＰなしでヒト線維芽細胞における老化表現型を誘導することも実証されており、成長停止自体はＳＡＳＰを刺激しなかったことを示している。
【0340】
老化の最も明確な特徴の１つは、安定した成長停止である。これは、２つの重要な経路であるｐ１６／Ｒｂおよびｐ５３／ｐ２１によって達成され、これらはいずれも腫瘍抑制の中心である。ＤＮＡ損傷は、（１）クロマチンにおけるγＨ２Ａｘ（ヒストンコーディング遺伝子）および５３ＢＰ１（ＤＮＡ損傷応答に関与）の高沈着（これは最終的にｐ５３活性化をもたらすキナーゼカスケードの活性化につながる）、および（２）ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＡＲＦ（いずれもＣＤＫＮ２Ａによってコードされる）ならびにＰ１５ＩＮＫ４ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂによってコードされる）の活性化（ｐ５３はサイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ｐ２１）の転写を誘導し、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｐ１５ＩＮＫ４ｂの両方とともに、細胞周期進行のために遺伝子を遮断する（ＣＤＫ４およびＣＤＫ６））をもたらす。これは、最終的に網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）の低リン酸化およびＧ１期での細胞周期停止につながる。
【0341】
老化細胞を選択的に死滅させることにより、正常な加齢との関連でマウスの健康スパンが有意に改善され、加齢性疾患またはがん療法の結果が改善されることが示されている（Ｏｖａｄｙａ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１２８（４）：１２４７－１２５４，２０１８）。自然界では、老化細胞は、通常、自然免疫細胞によって除去される。老化の誘導は、損傷／変化した細胞の潜在的な増殖および形質転換を阻止するのみならず、主にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＩＬ－１５およびＣＣＬ２等）およびマクロファージ（ＣＦＳ－１およびＣＣＬ２等）の化学誘引物質として機能するＳＡＳＰ因子の産生により組織修復も支持する。これらの自然免疫細胞は、ストレスを受けた細胞を排除するための免疫監視メカニズムを媒介する。老化細胞は、通常、ストレス誘導性リガンドのファミリーに属するＮＫ細胞活性化受容体ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ１リガンドを上方調節し、これは、感染性疾患および悪性腫瘍に対する最前線の免疫防御の重要な要素である。受容体が活性化されると、ＮＫ細胞は、それらの細胞溶解機構を介して老化細胞の死を特異的に誘導することができる。老化細胞の免疫監視におけるＮＫ細胞の役割は、肝線維症（Ｓａｇｉｖ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３２（１５）：１９７１－１９７７，２０１３）、肝細胞がん（Ｉａｎｎｅｌｌｏ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１０（１０）：２０５７－２０６９，２０１３）、多発性骨髄腫（Ｓｏｒｉａｎｉ，Ｂｌｏｏｄ １１３（１５）：３５０３－３５１１，２００９）、およびメバロン酸経路の機能傷害によってストレスを受けた神経膠腫細胞（Ｃｉａｇｌｉａ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １４２（１）：１７６－１９０，２０１８）において指摘されている。子宮内膜細胞は、急性細胞老化を受け、脱落膜細胞に分化しない。分化した脱落膜細胞は、ＩＬ－１５を分泌し、それにより、子宮ＮＫ細胞を動員して、未分化老化細胞を標的として排除し、子宮内膜の再構築および若返りを助ける（Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，Ｅｌｉｆｅ ６：ｅ３１２７４，２０１７）。同様のメカニズムを用いて、肝線維症の間、ｐ５３を発現する老化肝衛星細胞は、常在性Ｋｕｐｆｅｒマクロファージおよび新たに浸潤したマクロファージの極性を、老化細胞除去活性を呈する炎症促進性Ｍ１表現型に向かって歪めた。Ｆ４／８０＋マクロファージが、分娩後の子宮機能を維持するためにマウス子宮老化細胞のクリアランスに重要な役割を果たすことが示されている。
【0342】
老化細胞は、主に、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫ細胞で発現）、ケモカイン、および他のＳＡＳＰ因子に対するリガンドをアップレギュレートすることによってＮＫ細胞を動員する。肝線維症のインビボモデルは、活性化されたＮＫ細胞による老化細胞の効果的なクリアランスを示している（Ｋｒｉｚｈａｎｏｖｓｋｙ，Ｃｅｌｌ １３４（４）：６５７－６６７，２００８）。研究では、肝線維症（Ｋｒｉｚｈａｎｏｖｓｋｙ，Ｃｅｌｌ １３４（４）：６５７－６６７，２００８）、変形性関節症（Ｘｕ，Ｊ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ Ａ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ７２（６）：７８０－７８５，２０１７）、およびパーキンソン病（Ｃｈｉｎｔａ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２２（４）：９３０－９４０，２０１８）を含む老化を研究するための様々なモデルが説明されている。老化細胞を研究するための動物モデルは、Ｋｒｉｚｈａｎｏｖｓｋｙ，Ｃｅｌｌ １３４（４）：６５７－６６７，２００８、Ｂａｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ４７９（７３７２）：２３２－２３６，２０１１、Ｆａｒｒ，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３（９）：１０７２－１０７９，２０１７、Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５９２（１２）：２０８３－２０９７，２０１８、Ｘｕ，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４（８）：１２４６－１２５６，２０１８）で説明されている。
【0343】
追加の治療薬
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、１つ以上の追加の治療薬の治療有効量を対象（例えば、本明細書に記載の対象のうちのいずれか）に投与することをさらに含み得る。１つ以上の追加の治療薬は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって生成されたＴｒｅｇ細胞、または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたＴｒｅｇ細胞の集団を含む組成物（例えば、医薬組成物）のうちのいずれかと実質的に同時に対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療薬は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたＴｒｅｇ細胞、または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたＴｒｅｇ細胞の集団を含む組成物（例えば、医薬組成物）の投与前に対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療薬は、対象に、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたＴｒｅｇ細胞、または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたＴｒｅｇ細胞の集団を含む組成物（例えば、医薬組成物）の投与後に対象に投与することができる。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、１つ以上の追加の治療薬の治療有効量を対象（例えば、本明細書に記載の対象のうちのいずれか）に投与することをさらに含み得る。１つ以上の追加の治療薬は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって生成されたＴｒｅｇ細胞、または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたＴｒｅｇ細胞の集団を含む組成物（例えば、医薬組成物）のうちのいずれかと実質的に同時に対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療薬は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたＴｒｅｇ細胞、または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたＴｒｅｇ細胞の集団を含む組成物（例えば、医薬組成物）の投与前に対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療薬は、対象に、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたＴｒｅｇ細胞、または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたＴｒｅｇ細胞の集団を含む組成物（例えば、医薬組成物）の投与後に対象に投与することができる。
【0344】
追加の治療薬の非限定的な例には、抗がん剤、活性化受容体アゴニスト、免疫チェックポイント阻害剤、ＨＬＡ特異的阻害受容体を遮断するための薬剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）３阻害剤、および抗体が挙げられる。
【0345】
抗がん剤の非限定的な例には、代謝拮抗薬（例えば、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、メトトレキサート、６－チオグアニン、クラドリビン、ネララビン、ペントスタチン、またはペメトレキセド）、植物アルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、カンプトセシン、９－メトキシカンプトセシン、コロナリジン、タキソール、ナウクレアオラル（ｎａｕｃｌｅａｏｒａｌ）、ジプレニル化インドールアルカロイド、モンタミン、シシュキニイン、プロトベルベリン、ベルベリン、サンギナリン、ケレリトリン、ケリドニン、リリオデニン、クリボリン、β－カルボリン、アントフィン、チロホリン、クリプトレピン、ネオクリプトレピン、コリノリン、サンパンギン、カルバゾール、クリナミン、モンタニン、エリプチシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、イリノテカン、トポテカン、またはアクリドンアルカロイド）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン－３－ガレート、マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、オプロゾミブ（ＯＮＸ－０９１２）、デランゾミブ（ＣＥＰ－１８７７０）、エポキソミシン、ＭＧ１３２、ベータ－ヒドロキシベータ－メチルブチラート、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、またはイキサゾミブ）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、アクチノマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、またはブレオマイシン）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、ボリノスタット、パノビノスタット、ギビノスタット、アベキシノスタット、デプシペプチド、エンチノスタット、フェニルブチラート、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ダシノスタット、モセチノスタット、プラシノスタット、ニコチンアミド、カンビノール、テノビン１、テノビン６、シルチノール、リコリノスタット、テフィノスタット、ケベトリン、キシノスタット、レスミノスタット、タセジナリン、チダミド、またはセリシスタット）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、アキシチニブ、ダサチニブ、エンコラフィニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、およびスニチニブ）、および化学療法剤（例えば、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ドキシフルリジン、エポチロン、ヒドロキシウレア、イマチニブ、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ベムラフェニブ、およびレナリドミド）が挙げられる。化学療法剤の追加の例には、アルキル化剤、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、アルトレタミン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、カルムスチン、ルムスチン、ストレプトゾシン、カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチンが挙げられる。
【実施例】
【0346】
本発明は、以下の実施例にさらに記載されており、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定しない。
【0347】
実施例１．αＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／αＣＤ２８ｓｃＦｖの産生
αＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／αＣＤ２８ｓｃＦｖの核酸配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
αＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／αＣＤ２８ｓｃＦｖの核酸配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
【0348】
αＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／αＣＤ２８ｓｃＦｖをコードする核酸（配列番号１０）
（シグナルペプチド）
ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＡＴＴＣＣ
（αＣＤ３軽鎖可変領域）
ＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＣＣＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＴＴＣＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＧＴ
（リンカー）
ＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣ
（αＣＤ３重鎖可変領域）
ＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＣＴＣＧＴＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＡＴＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＴＡＡＡＧＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＡＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＧＧＴＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＡＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣ
（ヒト組織因子２１９形態）
ＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＡＡＣＣＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＡＧＴＧＴＧＡＴＴＴＡＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＡＡＡＣＣＴＡＴＣＴＧＧＣＴＣＧＧＧＴＣＴＴＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＴＣＴＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＴＡＴＴＴＡＧＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＣＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＡＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＴＡＣＣＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＴＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＡＧ
（αＣＤ２８軽鎖可変領域）
ＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＣＣＣＧＡＡＣＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＣＧＧＴＧＣＴＴＣＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＴＡＴＧＴＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＣＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＡＣＧＡＣＴＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＡＡＧＧＧＡＡＡＧＧＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＣＴＣＣＧＡＣＡＡＡＡＧＣＴＣＣＡＴＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＴＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＴＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＴＧＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＣＡＡＣＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
（リンカー）
ＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣ
（αＣＤ２８軽鎖可変領域）
ＧＡＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＴＣＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＴＡＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＴＣＡＣＡＡＴＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＴＴＣＣＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＧＴＧＣＡＴＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣＴＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＴＡＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＴＴＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＧＧ
（シグナルペプチド）
ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＡＴＴＣＣ
（αＣＤ３軽鎖可変領域）
ＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＣＣＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＴＴＣＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＧＴ
（リンカー）
ＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣ
（αＣＤ３重鎖可変領域）
ＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＣＴＣＧＴＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＡＴＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＴＡＡＡＧＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＡＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＧＧＴＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＡＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣ
（ヒト組織因子２１９形態）
ＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＡＡＣＣＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＡＧＴＧＴＧＡＴＴＴＡＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＡＡＡＣＣＴＡＴＣＴＧＧＣＴＣＧＧＧＴＣＴＴＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＴＣＴＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＴＡＴＴＴＡＧＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＣＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＡＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＴＡＣＣＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＴＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＡＧ
（αＣＤ２８軽鎖可変領域）
ＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＣＣＣＧＡＡＣＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＣＧＧＴＧＣＴＴＣＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＴＡＴＧＴＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＣＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＡＣＧＡＣＴＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＡＡＧＧＧＡＡＡＧＧＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＣＴＣＣＧＡＣＡＡＡＡＧＣＴＣＣＡＴＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＴＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＴＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＴＧＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＣＡＡＣＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
（リンカー）
ＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣ
（αＣＤ２８軽鎖可変領域）
ＧＡＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＴＣＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＴＡＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＴＣＡＣＡＡＴＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＴＴＣＣＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＧＴＧＣＡＴＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣＴＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＴＡＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＴＴＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＧＧ
【0349】
αＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／αＣＤ２８ｓｃＦｖ（配列番号８）
（シグナルペプチド）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ
（αＣＤ３軽鎖可変領域）
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲ
（リンカー）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
（αＣＤ３重鎖可変領域）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
（ヒト組織因子２１９）
ＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＫＴＩＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＤＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＲＲＮＮＴＦＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥ
（αＣＤ２８軽鎖可変領域）
ＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＱＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＮＰＹＮＤＹＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＩＴＡＹＭＥＦＳＳＬＴＳＥＤＳＡＬＹＹＣＡＲＷＧＤＧＮＹＷＧＲＧＴＴＬＴＶＳＳ
（リンカー）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
（αＣＤ２８重鎖可変領域）
ＤＩＥＭＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＦＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＣＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＰＲＦＳＧＳＧＳＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＦＣＨＱＹＨＲＳＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＴＫＲ
（シグナルペプチド）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ
（αＣＤ３軽鎖可変領域）
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲ
（リンカー）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
（αＣＤ３重鎖可変領域）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
（ヒト組織因子２１９）
ＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＫＴＩＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＤＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＲＲＮＮＴＦＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥ
（αＣＤ２８軽鎖可変領域）
ＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＱＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＮＰＹＮＤＹＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＩＴＡＹＭＥＦＳＳＬＴＳＥＤＳＡＬＹＹＣＡＲＷＧＤＧＮＹＷＧＲＧＴＴＬＴＶＳＳ
（リンカー）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
（αＣＤ２８重鎖可変領域）
ＤＩＥＭＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＦＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＣＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＰＲＦＳＧＳＧＳＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＦＣＨＱＹＨＲＳＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＴＫＲ
【0350】
αＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／αＣＤ２８ｓｃＦｖをコードする核酸を、以前に記載されたように（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：４５７－７２，２００５）改変レトロウイルス発現ベクターにクローニングした。αＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／αＣＤ２８ｓｃＦｖをコードする発現ベクターを、ＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクトした。ＣＨＯ－Ｋ１細胞での発現ベクターの発現により、可溶性αＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／αＣＤ２８ｓｃＦｖ単鎖キメラポリペプチド（３ｔ２８と称する）の分泌が可能になり、これを抗ＴＦ抗体アフィニティーおよび他のクロマトグラフィー法によって精製することができる。
【0351】
抗組織因子抗体アフィニティーカラムを使用して、αＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／αＣＤ２８ｓｃＦｖ単鎖キメラポリペプチドを精製した。抗組織因子抗体アフィニティーカラムを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔシステムに接続した。２ｍＬ／分の溶出ステップを除くすべてのステップで４ｍＬ／分の流速を使用した。
【0352】
αＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／αＣＤ２８ｓｃＦｖ単鎖キメラポリペプチドを含む細胞培養収集物を、１Ｍトリス塩基でｐＨ７．４に調整し、５カラム体積のＰＢＳで平衡化した抗ＴＦ抗体アフィニティーカラム（上述）にロードした。試料をロードした後、カラムを５カラム体積のＰＢＳで洗浄し、その後、６カラム体積の０．１Ｍ酢酸（ｐＨ２．９）で溶出した。Ａ２８０溶出ピークを収集し、次いで、１Ｍトリス塩基を添加することによってｐＨ７．５～８．０に中和した。その後、中和した試料を、分子量カットオフ３０ｋＤａでＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターを使用してＰＢＳに緩衝液交換した。
【0353】
各溶出後、抗組織因子抗体アフィニティーカラムを、６カラム体積の０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５を使用してストリッピングした。その後、カラムを、１０カラム体積のＰＢＳ、０．０５％ＮａＮ３を使用して中和し、２～８℃で保管した。
【0354】
実施例２．ＩＬ－２／ＴＦ／ＩＬ－２の産生
ＩＬ－２／ＴＦ／ＩＬ－２の核酸配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
ＩＬ－２／ＴＦ／ＩＬ－２の核酸配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
【0355】
ＩＬ－２／ＴＦ／ＩＬ－２をコードする核酸（配列番号１２）
（シグナルペプチド）
ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＣ
（第１のＩＬ－２断片）
ＧＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＴＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣＡＧＴＧＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＡＡＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣ
（ヒト組織因子２１９形態）
ＡＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＧＴＣＧＣＴＧＣＣＴＡＴＡＡＣＣＴＣＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＣＣＡＴＣＣＴＣＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣＧＴＴＡＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＡＡＴＧＴＴＴＣＴＡＴＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＡＧＴＧＣＧＡＴＣＴＣＡＣＣＧＡＴＧＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＴＡＣＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＧＴＴＴＡＧＣＴＡＣＣＣＣＧＣＣＧＧＣＡＡＴＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＣＴＴＴＡＴＡＣＧＡＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＡＴＴＴＡＣＣＣＣＴＴＡＣＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＧＡＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＧＧＡＣＴＴＴＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＴＴＴＡＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＧＧＡＴＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＣＡＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＧＴＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＴＡＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＡＧ
（第２のＩＬ－２断片）
ＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＴＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＡＡＣＴ
（シグナルペプチド）
ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＣ
（第１のＩＬ－２断片）
ＧＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＴＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣＡＧＴＧＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＡＡＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣ
（ヒト組織因子２１９形態）
ＡＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＧＴＣＧＣＴＧＣＣＴＡＴＡＡＣＣＴＣＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＣＣＡＴＣＣＴＣＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣＧＴＴＡＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＡＡＴＧＴＴＴＣＴＡＴＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＡＧＴＧＣＧＡＴＣＴＣＡＣＣＧＡＴＧＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＴＡＣＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＧＴＴＴＡＧＣＴＡＣＣＣＣＧＣＣＧＧＣＡＡＴＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＣＴＴＴＡＴＡＣＧＡＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＡＴＴＴＡＣＣＣＣＴＴＡＣＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＧＡＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＧＧＡＣＴＴＴＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＴＴＴＡＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＧＧＡＴＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＣＡＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＧＴＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＴＡＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＡＧ
（第２のＩＬ－２断片）
ＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＴＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＡＡＣＴ
【0356】
ＩＬ－２／ＴＦ／ＩＬ－２（配列番号４）
（シグナルペプチド）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ
（ヒトＩＬ－２）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ
（ヒト組織因子２１９）
ＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＫＴＩＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＤＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＲＲＮＮＴＦＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥ
（ヒトＩＬ－２）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ
（シグナルペプチド）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ
（ヒトＩＬ－２）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ
（ヒト組織因子２１９）
ＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＫＴＩＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＤＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＲＲＮＮＴＦＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥ
（ヒトＩＬ－２）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ
【0357】
ＩＬ－２／ＴＦ／ＩＬ－２をコードする核酸を、以前に記載されたように（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：４５７－７２，２００５）改変レトロウイルス発現ベクターにクローニングした。ＩＬ－２／ＴＦ／ＩＬ－２をコードする発現ベクターを、ＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクトした。ＣＨＯ－Ｋ１細胞での発現ベクターの発現により、可溶性ＩＬ－２／ＴＦ／ＩＬ－２単鎖キメラポリペプチド（２ｔ２と称する）の分泌が可能になり、これを抗ＴＦ抗体アフィニティーおよび他のクロマトグラフィー法によって精製することができる。
【0358】
実施例３：市販の組換えヒトＩＬ－２と比較した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズおよびラパマイシンでの２ｔ２によるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の刺激
新鮮なヒト白血球（３名のドナー）を血液バンクから入手し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍＴｒｅｇ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ制御性Ｔ細胞分離キットＩＩ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で単離した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の純度は３５％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中の４８ウェル平底プレート中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。細胞を、（１）ｈＩＬ－２サイトカイン（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで刺激し、３７℃、５％ＣＯ２で２１日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２サイトカイン（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで再刺激した。７日おきに、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再刺激した。細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２サイトカイン（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）を含む新鮮な完全培地で２１日間にわたって１×１０６／ｍＬの濃度で維持した。７日目、１４日目、および２１日目に、細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（Ｆｏｘｐ３染色キットを使用した細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増大をフローサイトメトリーによって評価した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増大倍率を、トリパンブルー（０．４％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）生存率アッセイでカウントすることによって測定した。図１は、ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）で刺激した際の１００倍増加と比較した、１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）で刺激したＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の１４５倍増加を示す。
新鮮なヒト白血球（３名のドナー）を血液バンクから入手し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍＴｒｅｇ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ制御性Ｔ細胞分離キットＩＩ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で単離した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の純度は３５％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中の４８ウェル平底プレート中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。細胞を、（１）ｈＩＬ－２サイトカイン（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで刺激し、３７℃、５％ＣＯ２で２１日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２サイトカイン（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで再刺激した。７日おきに、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再刺激した。細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２サイトカイン（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）を含む新鮮な完全培地で２１日間にわたって１×１０６／ｍＬの濃度で維持した。７日目、１４日目、および２１日目に、細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（Ｆｏｘｐ３染色キットを使用した細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増大をフローサイトメトリーによって評価した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増大倍率を、トリパンブルー（０．４％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）生存率アッセイでカウントすることによって測定した。図１は、ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）で刺激した際の１００倍増加と比較した、１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）で刺激したＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の１４５倍増加を示す。
【0359】
実施例４：Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ３９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＣＤ１０３、ＣＤ６９、ＰＤ１、およびＣＤ４９ｂマーカーの検出
新鮮なヒト白血球（３名のドナー）を血液バンクから入手し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍＴｒｅｇ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ制御性Ｔ細胞分離キットＩＩ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で単離した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の純度は３５％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中の４８ウェル平底プレート中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。細胞を、（１）ｈＩＬ－２サイトカイン（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで刺激し、その後、３７℃、５％ＣＯ２で２１日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれか再刺激した。７日おきに、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再刺激した。細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）を含む新鮮な完全培地で２１日間にわたって１×１０６／ｍＬの濃度で維持した。細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（Ｆｏｘｐ３染色キットを使用した細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増大をフローサイトメトリーによって評価した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増大倍率を、トリパンブルー（０．４％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）生存率アッセイでカウントすることによって測定した。２１日目に細胞を回収し、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（Ｆｏｘｐ３染色キットを使用した細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００、Ｈｅｌｉｏｓ ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＴＬＡ－４ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ６０５、ＣＤ３９ ＡＰＣ、ＣＤ６２Ｌ ＰＥＣｙ７、ＣＤ２５ ＰＥ、ＣＤ１０３ ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５、ＣＤ６９ ＡＰＣ Ｆｉｒｅ ７５０、ＰＤ１ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ７５０、およびＣＤ４９ｂ ＡＰＣで表面染色し、Ｆｏｘｐ３－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）（細胞内染色キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞内染色した。表面染色の場合、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および０．００１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含む１×ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ））中で洗浄した（１５００ＲＰＭ、室温で５分間）。２回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー（Ｃｅｌｅｓｔａ－ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって分析した。細胞内染色の場合、細胞を固定緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、室温で２０分間固定した。固定した後、細胞を１×透過処理緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で洗浄し（１５００ＲＰＭ、室温で５分間）、Ｆｏｘｐ３－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ （Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して室温で３０分間染色した。細胞を１ｘ透過処理緩衝液で再度洗浄し、その後、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞ペレットをフローサイトメトリー（Ｃｅｌｅｓｔａ－ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）による分析のために３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。（細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞でゲーティングし、表面マーカー％データをプロットした（３名の健常ドナー））。図２Ａ～２Ｉは、（１）１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで２１日間刺激したＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞上の同等の表面マーカーを示す。
新鮮なヒト白血球（３名のドナー）を血液バンクから入手し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍＴｒｅｇ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ制御性Ｔ細胞分離キットＩＩ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で単離した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の純度は３５％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中の４８ウェル平底プレート中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。細胞を、（１）ｈＩＬ－２サイトカイン（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで刺激し、その後、３７℃、５％ＣＯ２で２１日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれか再刺激した。７日おきに、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再刺激した。細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）を含む新鮮な完全培地で２１日間にわたって１×１０６／ｍＬの濃度で維持した。細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（Ｆｏｘｐ３染色キットを使用した細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増大をフローサイトメトリーによって評価した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増大倍率を、トリパンブルー（０．４％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）生存率アッセイでカウントすることによって測定した。２１日目に細胞を回収し、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（Ｆｏｘｐ３染色キットを使用した細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００、Ｈｅｌｉｏｓ ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＴＬＡ－４ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ６０５、ＣＤ３９ ＡＰＣ、ＣＤ６２Ｌ ＰＥＣｙ７、ＣＤ２５ ＰＥ、ＣＤ１０３ ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５、ＣＤ６９ ＡＰＣ Ｆｉｒｅ ７５０、ＰＤ１ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ７５０、およびＣＤ４９ｂ ＡＰＣで表面染色し、Ｆｏｘｐ３－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）（細胞内染色キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞内染色した。表面染色の場合、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および０．００１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含む１×ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ））中で洗浄した（１５００ＲＰＭ、室温で５分間）。２回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー（Ｃｅｌｅｓｔａ－ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって分析した。細胞内染色の場合、細胞を固定緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、室温で２０分間固定した。固定した後、細胞を１×透過処理緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で洗浄し（１５００ＲＰＭ、室温で５分間）、Ｆｏｘｐ３－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ （Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して室温で３０分間染色した。細胞を１ｘ透過処理緩衝液で再度洗浄し、その後、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞ペレットをフローサイトメトリー（Ｃｅｌｅｓｔａ－ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）による分析のために３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。（細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞でゲーティングし、表面マーカー％データをプロットした（３名の健常ドナー））。図２Ａ～２Ｉは、（１）１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで２１日間刺激したＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞上の同等の表面マーカーを示す。
【0360】
実施例５：ヒト制御性Ｔ細胞の活性化は、高レベルのグルコース代謝を呈する
新鮮なヒト白血球（３名のドナー）を血液バンクから入手し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍＴｒｅｇ細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍＴｒｅｇ細胞分離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の純度は３５％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中の２４ウェル平底プレート中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。細胞を、（１）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで刺激し、その後、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞を回収し、カウントし、９６ウェルプレート中に４×１０６／ｍＬで再懸濁し、５０μＬ／ウェルを、２ｍＭのＬ－グルタミンを補充したＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ ＲＰＭＩ培地（ｐＨ７．４）中のＣｅｌｌ－ＴａｋコーティングＳｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＸＦｅ９６培養プレート中に播種した。細胞を３７℃で３０分間かけてプレートに付着させた。追加の１３０μＬのアッセイ培地をプレートの各ウェルに（バックグラウンドウェルにも）添加した。プレートを３７℃の非ＣＯ２インキュベーター内で１時間インキュベートした。キャリブレーションプレートの場合、グルコース／オリゴマイシン／２－デオキシグルコースの１０倍溶液をＳｅａｈｏｒｓｅアッセイ培地中で調製した。２０μＬ体積のオリゴマイシン／２－デオキシグルコースを、一晩キャリブレーションした細胞外フラックスプレートのポートＡ、Ｂ、およびＣに添加した。細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を、ＸＦｅ９６ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｌｕｘ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定した。完全なＥＣＡＲ分析は、非解糖酸性化（薬物なし）、解糖（１０ｍＭグルコース）、解糖能（２μＭオリゴマイシン）、および解糖予備能（１００ｍＭ ２－デオキシグルコース）の４つの段階からなり、これらをＳｅａｈｏｒｓｅ Ｘｆｅ９６ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｗａｖｅを使用して計算した。結果（図３Ａ～３Ｄ）は、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞が高レベルのグルコース代謝を呈したことを示した。
新鮮なヒト白血球（３名のドナー）を血液バンクから入手し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍＴｒｅｇ細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍＴｒｅｇ細胞分離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の純度は３５％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中の２４ウェル平底プレート中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。細胞を、（１）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで刺激し、その後、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞を回収し、カウントし、９６ウェルプレート中に４×１０６／ｍＬで再懸濁し、５０μＬ／ウェルを、２ｍＭのＬ－グルタミンを補充したＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ ＲＰＭＩ培地（ｐＨ７．４）中のＣｅｌｌ－ＴａｋコーティングＳｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＸＦｅ９６培養プレート中に播種した。細胞を３７℃で３０分間かけてプレートに付着させた。追加の１３０μＬのアッセイ培地をプレートの各ウェルに（バックグラウンドウェルにも）添加した。プレートを３７℃の非ＣＯ２インキュベーター内で１時間インキュベートした。キャリブレーションプレートの場合、グルコース／オリゴマイシン／２－デオキシグルコースの１０倍溶液をＳｅａｈｏｒｓｅアッセイ培地中で調製した。２０μＬ体積のオリゴマイシン／２－デオキシグルコースを、一晩キャリブレーションした細胞外フラックスプレートのポートＡ、Ｂ、およびＣに添加した。細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を、ＸＦｅ９６ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｌｕｘ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定した。完全なＥＣＡＲ分析は、非解糖酸性化（薬物なし）、解糖（１０ｍＭグルコース）、解糖能（２μＭオリゴマイシン）、および解糖予備能（１００ｍＭ ２－デオキシグルコース）の４つの段階からなり、これらをＳｅａｈｏｒｓｅ Ｘｆｅ９６ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｗａｖｅを使用して計算した。結果（図３Ａ～３Ｄ）は、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞が高レベルのグルコース代謝を呈したことを示した。
【0361】
実施例６：増大した制御性Ｔ細胞による自己レスポンダーＴ細胞の抑制の測定
新鮮なヒト白血球（３名のドナー）を血液バンクから入手し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ－Ｔｒｅｇ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ－制御性Ｔ細胞分離キットＩＩ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で単離した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の純度は３５％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中の２４ウェル平底プレート中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。細胞を、（１）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで刺激し、その後、３７℃、５％ＣＯ２で２１日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２サイトカイン（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで再刺激した。７日おきに、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再刺激した。細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）を含む新鮮な完全培地で２１日間にわたって１×１０６／ｍＬの濃度で維持した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増大倍率を、トリパンブルー（０．４％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）生存率アッセイでカウントすることによって測定した。２１日目に、凍結させた自己レスポンダーＴ（Ｔｒｅｓｐ）細胞を解凍し、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。増大したＴｒｅｇ細胞を回収し、カウントした。Ｔｒｅｇ細胞をレスポンダーＴ細胞と様々な比率（５：１、２：１、１：１、０．５：１のＴｒｅｇ細胞：レスポンダーＴ細胞）で培養した。細胞を、（１）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：７０のビーズ：細胞）および２ｔ２（２５ｎＭ）、または（２）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：７０のビーズ：細胞）およびＩＬ２（５０ＩＵ／ｍＬ）のいずれかで再刺激し、５日間培養した。細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および０．００１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含む１×ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ））中で洗浄した（１５００ＲＰＭ、室温で５分間）。２回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー（Ｃｅｌｅｓｔａ－ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって分析した。（ＣＦＳＥ＋増殖細胞％増加をプロットした）。図４は、ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）で刺激した細胞と比較した、１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）で刺激したＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制能を示す。
新鮮なヒト白血球（３名のドナー）を血液バンクから入手し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ－Ｔｒｅｇ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ－制御性Ｔ細胞分離キットＩＩ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で単離した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の純度は３５％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中の２４ウェル平底プレート中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。細胞を、（１）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで刺激し、その後、３７℃、５％ＣＯ２で２１日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２サイトカイン（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで再刺激した。７日おきに、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再刺激した。細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）を含む新鮮な完全培地で２１日間にわたって１×１０６／ｍＬの濃度で維持した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増大倍率を、トリパンブルー（０．４％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）生存率アッセイでカウントすることによって測定した。２１日目に、凍結させた自己レスポンダーＴ（Ｔｒｅｓｐ）細胞を解凍し、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。増大したＴｒｅｇ細胞を回収し、カウントした。Ｔｒｅｇ細胞をレスポンダーＴ細胞と様々な比率（５：１、２：１、１：１、０．５：１のＴｒｅｇ細胞：レスポンダーＴ細胞）で培養した。細胞を、（１）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：７０のビーズ：細胞）および２ｔ２（２５ｎＭ）、または（２）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：７０のビーズ：細胞）およびＩＬ２（５０ＩＵ／ｍＬ）のいずれかで再刺激し、５日間培養した。細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および０．００１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含む１×ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ））中で洗浄した（１５００ＲＰＭ、室温で５分間）。２回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー（Ｃｅｌｅｓｔａ－ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって分析した。（ＣＦＳＥ＋増殖細胞％増加をプロットした）。図４は、ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）で刺激した細胞と比較した、１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）で刺激したＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の抑制能を示す。
【0362】
実施例７：抑制アッセイによるＩＬ－１０の測定
新鮮なヒト白血球（３名のドナー）を血液バンクから入手し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍＴｒｅｇ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ制御性Ｔ細胞分離キットＩＩ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で単離した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の純度は３５％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中の２４ウェル平底プレート中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。細胞を、（１）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで刺激し、その後、３７℃および５％ＣＯ２で２１日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２サイトカイン（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで再刺激した。７日おきに、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再刺激した。細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）を含む新鮮な完全培地で２１日間にわたって１×１０６／ｍＬの濃度で維持した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増大倍率を、トリパンブルー（０．４％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）生存率アッセイでカウントすることによって測定した。２１日目に、凍結させた自己レスポンダーＴ（Ｔｒｅｓｐ）細胞を解凍し、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。増大したＴｒｅｇ細胞を回収し、カウントした。Ｔｒｅｇ細胞をレスポンダーＴ細胞と様々な比率（５：１、１：１のＴｒｅｇ細胞：レスポンダーＴ細胞）で培養した。細胞を、（１）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：７０のビーズ：細胞）および２ｔ２（２５ｎＭ）、または（２）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：７０のビーズ：細胞）およびＩＬ２（５０ＩＵ／ｍＬ）で再刺激し、５日間培養した。無細胞液体培養培地を収集し、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘマルチアナライトフローアッセイキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって製造業者の指示に従って分析した。図５は、抑制アッセイにおける無細胞液体培養培地中のＩＬ－１０を示し、ＩＬ－１０分泌がＩＬ－２増大Ｔｒｅｇ細胞と比較して２ｔ２増大Ｔｒｅｇ細胞で有意に高い（いずれもラパマイシンの存在下または不在下である）。
新鮮なヒト白血球（３名のドナー）を血液バンクから入手し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍＴｒｅｇ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ制御性Ｔ細胞分離キットＩＩ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で単離した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の純度は３５％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中の２４ウェル平底プレート中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。細胞を、（１）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで刺激し、その後、３７℃および５％ＣＯ２で２１日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２サイトカイン（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで再刺激した。７日おきに、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再刺激した。細胞を、１日おきに（１）ｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）または（２）１００ｎＭの２ｔ２およびラパマイシン（１００ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）を含む新鮮な完全培地で２１日間にわたって１×１０６／ｍＬの濃度で維持した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増大倍率を、トリパンブルー（０．４％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）生存率アッセイでカウントすることによって測定した。２１日目に、凍結させた自己レスポンダーＴ（Ｔｒｅｓｐ）細胞を解凍し、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。増大したＴｒｅｇ細胞を回収し、カウントした。Ｔｒｅｇ細胞をレスポンダーＴ細胞と様々な比率（５：１、１：１のＴｒｅｇ細胞：レスポンダーＴ細胞）で培養した。細胞を、（１）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：７０のビーズ：細胞）および２ｔ２（２５ｎＭ）、または（２）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１：７０のビーズ：細胞）およびＩＬ２（５０ＩＵ／ｍＬ）で再刺激し、５日間培養した。無細胞液体培養培地を収集し、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘマルチアナライトフローアッセイキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって製造業者の指示に従って分析した。図５は、抑制アッセイにおける無細胞液体培養培地中のＩＬ－１０を示し、ＩＬ－１０分泌がＩＬ－２増大Ｔｒｅｇ細胞と比較して２ｔ２増大Ｔｒｅｇ細胞で有意に高い（いずれもラパマイシンの存在下または不在下である）。
【0363】
実施例８．３ｔ１５＊－２８ｓ融合タンパク質複合体の生成および特徴付け
３ｔ１５＊－２８ｓの構築および産生
抗ＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／ＩＬ１５Ｄ８Ｎ変異体および抗ＣＤ２８ｓｃＦｖ／ＩＬ１５ＲαＳｕ融合タンパク質を含む融合タンパク質を生成した。抗ＣＤ３抗体（αＣＤ３）可変領域、ヒト組織因子、ＩＬ１５Ｄ８Ｎ変異体、抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ２８）可変領域、およびＩＬ１５ＲαＳｕの配列をＵｎｉＰｒｏｔウェブサイトから入手し、これらの配列のＤＮＡをＧｅｎｅｗｉｚによって合成した。具体的には、この構築物を、αＣＤ３軽鎖可変領域配列を（Ｇ４Ｓ）３リンカーによりαＣＤ３重鎖可変領域配列に連結してαＣＤ３ｓｃＦｖを形成することによって作製した。αＣＤ３ｓｃＦｖを組織因子２１９のＮ末端コード領域に連結し、その後、ＩＬ１５Ｄ８Ｎ変異体のＮ末端コード領域に連結した（図６Ａ～６Ｂ）。構築物の核酸配列およびタンパク質配列を以下に示す。
３ｔ１５＊－２８ｓの構築および産生
抗ＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／ＩＬ１５Ｄ８Ｎ変異体および抗ＣＤ２８ｓｃＦｖ／ＩＬ１５ＲαＳｕ融合タンパク質を含む融合タンパク質を生成した。抗ＣＤ３抗体（αＣＤ３）可変領域、ヒト組織因子、ＩＬ１５Ｄ８Ｎ変異体、抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ２８）可変領域、およびＩＬ１５ＲαＳｕの配列をＵｎｉＰｒｏｔウェブサイトから入手し、これらの配列のＤＮＡをＧｅｎｅｗｉｚによって合成した。具体的には、この構築物を、αＣＤ３軽鎖可変領域配列を（Ｇ４Ｓ）３リンカーによりαＣＤ３重鎖可変領域配列に連結してαＣＤ３ｓｃＦｖを形成することによって作製した。αＣＤ３ｓｃＦｖを組織因子２１９のＮ末端コード領域に連結し、その後、ＩＬ１５Ｄ８Ｎ変異体のＮ末端コード領域に連結した（図６Ａ～６Ｂ）。構築物の核酸配列およびタンパク質配列を以下に示す。
【0364】
αＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／ＩＬ１５Ｄ８Ｎ構築物の核酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号１０５）。
（シグナルペプチド）
ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＡＴＴＣＣ
（αＣＤ３軽鎖可変領域）
ＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＣＣＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＴＴＣＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＧＴ
（リンカー）
ＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣ
（αＣＤ３重鎖可変領域）
ＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＣＴＣＧＴＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＡＴＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＴＡＡＡＧＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＡＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＧＧＴＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＡＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣ
（ヒト組織因子２１９形態）
ＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＡＡＣＣＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＡＧＴＧＴＧＡＴＴＴＡＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＡＡＡＣＣＴＡＴＣＴＧＧＣＴＣＧＧＧＴＣＴＴＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＴＣＴＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＴＡＴＴＴＡＧＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＣＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＡＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＴＡＣＣＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＴＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＡＧ
（ヒトＩＬ１５Ｄ８Ｎ変異体）
ＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＡＡＧＡＴＴＴＡＡＴＴＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＡＴＡＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＴＴＴＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＡＣＣＣＣＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＴＡＴＣＴＣＴＴＴＡＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＡＴＡＡＣＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＣＣＧＧＣＴＧＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＴＴＴＧＴＧＣＡＣＡＴＴＧＴＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＡＴＣＡＡＴＡＣＣＴＣＣ
（シグナルペプチド）
ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＡＴＴＣＣ
（αＣＤ３軽鎖可変領域）
ＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＣＣＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＴＴＣＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＧＴ
（リンカー）
ＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣ
（αＣＤ３重鎖可変領域）
ＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＣＴＣＧＴＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＡＴＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＴＡＡＡＧＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＡＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＧＧＴＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＡＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣ
（ヒト組織因子２１９形態）
ＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＡＡＣＣＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＡＧＴＧＴＧＡＴＴＴＡＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＡＡＡＣＣＴＡＴＣＴＧＧＣＴＣＧＧＧＴＣＴＴＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＴＣＴＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＴＡＴＴＴＡＧＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＣＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＡＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＴＡＣＣＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＴＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＡＧ
（ヒトＩＬ１５Ｄ８Ｎ変異体）
ＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＡＡＧＡＴＴＴＡＡＴＴＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＡＴＡＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＴＴＴＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＡＣＣＣＣＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＴＡＴＣＴＣＴＴＴＡＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＡＴＡＡＣＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＣＣＧＧＣＴＧＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＴＴＴＧＴＧＣＡＣＡＴＴＧＴＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＡＴＣＡＡＴＡＣＣＴＣＣ
【0365】
αＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／ＩＬ１５Ｄ８Ｎ構築物のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号１０４）。
（シグナルペプチド）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ
（αＣＤ３軽鎖可変領域）
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲ
（リンカー）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
（αＣＤ３重鎖可変領域）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
（ヒト組織因子２１９）
ＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＫＴＩＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＤＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＲＲＮＮＴＦＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥ
（ヒトＩＬ１５Ｄ８Ｎ変異体）
ＮＷＶＮＶＩＳＮＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
（シグナルペプチド）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ
（αＣＤ３軽鎖可変領域）
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲ
（リンカー）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
（αＣＤ３重鎖可変領域）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
（ヒト組織因子２１９）
ＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹＮＬＴＷＫＳＴＮＦＫＴＩＬＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＫＳＫＣＦＹＴＴＤＴＥＣＤＬＴＤＥＩＶＫＤＶＫＱＴＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡＧＮＶＥＳＴＧＳＡＧＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱＰＴＩＱＳＦＥＱＶＧＴＫＶＮＶＴＶＥＤＥＲＴＬＶＲＲＮＮＴＦＬＳＬＲＤＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤＫＧＥＮＹＣＦＳＶＱＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭＧＱＥＫＧＥＦＲＥ
（ヒトＩＬ１５Ｄ８Ｎ変異体）
ＮＷＶＮＶＩＳＮＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
【0366】
別の構築物を、αＣＤ２８軽鎖可変領域配列を（Ｇ４Ｓ）３リンカーによりαＣＤ２８重鎖可変領域配列に連結することによって構築したαＣＤ２８ｓｃＦｖをＩＬ１５ＲαＳｕのＮ末端コード領域に連結することによって作製した。最終構築物αＣＤ２８ｓｃＦｖ／ＩＬ１５ＲαＳｕ融合タンパク質配列をＧｅｎｅｗｉｚによって合成した。構築物の核酸配列およびタンパク質配列を以下に示す。
【0367】
αＣＤ２８ｓｃＦｖ／ＩＬ１５ＲαＳｕ構築物の核酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号１０９）。
（シグナルペプチド）
ＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣ
（αＣＤ２８軽鎖可変領域）
ＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＡＣＧＴＣＡＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＴＴＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＣＴＴＴＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧＧＧＧＣＧＡＴＧＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＡＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣ
（リンカー）
ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＧＣ
（αＣＤ２８重鎖可変領域）
ＧＡＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＴＴＴＡＧＧＡＧＡＡＣＧＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＡＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＴＴＴＡＧＣＴＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＴＡＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＣＧＧ
（ヒト ＩＬ１５ＲαＳｕ）
ＡＴＴＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＣＡＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＧＴＡＴＡＴＣＴＧＴＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣＧＡＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＴＴＴＡＡＡＧＴＧＣＡＴＣＣＧＧ
（シグナルペプチド）
ＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣ
（αＣＤ２８軽鎖可変領域）
ＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＡＣＧＴＣＡＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＴＴＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＣＴＴＴＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧＧＧＧＣＧＡＴＧＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＡＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣ
（リンカー）
ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＧＣ
（αＣＤ２８重鎖可変領域）
ＧＡＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＴＴＴＡＧＧＡＧＡＡＣＧＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＡＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＴＴＴＡＧＣＴＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＴＡＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＣＧＧ
（ヒト ＩＬ１５ＲαＳｕ）
ＡＴＴＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＣＡＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＧＴＡＴＡＴＣＴＧＴＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣＧＡＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＴＴＴＡＡＡＧＴＧＣＡＴＣＣＧＧ
【0368】
αＣＤ２８ｓｃＦｖ／ＩＬ１５ＲαＳｕ構築物のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号１０８）。
（シグナルペプチド）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ
（αＣＤ２８軽鎖可変領域）
ＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＱＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＮＰＹＮＤＹＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＩＴＡＹＭＥＦＳＳＬＴＳＥＤＳＡＬＹＹＣＡＲＷＧＤＧＮＹＷＧＲＧＴＴＬＴＶＳＳ
（リンカー）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
（αＣＤ２８重鎖可変領域）
ＤＩＥＭＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＦＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＣＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＰＲＦＳＧＳＧＳＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＦＣＨＱＹＨＲＳＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＴＫＲ
（ヒトＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲ
（シグナルペプチド）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ
（αＣＤ２８軽鎖可変領域）
ＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＱＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＮＰＹＮＤＹＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＩＴＡＹＭＥＦＳＳＬＴＳＥＤＳＡＬＹＹＣＡＲＷＧＤＧＮＹＷＧＲＧＴＴＬＴＶＳＳ
（リンカー）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
（αＣＤ２８重鎖可変領域）
ＤＩＥＭＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＦＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＣＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＰＲＦＳＧＳＧＳＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＦＣＨＱＹＨＲＳＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＴＫＲ
（ヒトＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲ
【0369】
いくつかの事例では、リーダーペプチドをインタクトなポリペプチドから切断して、可溶性であり得るか、または分泌され得る成熟形態を生成する。
【0370】
αＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／ＩＬ１５Ｄ８Ｎ構築物およびαＣＤ２８ｓｃＦｖ／ＩＬ１５ＲαＳｕ構築物を、以前に記載されたように（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：４５７－７２，２００５）異なる抗生物質選択マーカーを有する修飾レトロウイルス発現ベクターにクローニングし、発現ベクターをＣＨＯ－Ｋ１細胞に同時トランスフェクトした。ＣＨＯ－Ｋ１細胞での発現ベクターの発現により、可溶性αＣＤ３ｓｃＦｖ／ＴＦ／ＩＬ１５Ｄ８Ｎ：αＣＤ２８ｓｃＦｖ／ＩＬ１５ＲαＳｕ融合タンパク質（３ｔ１５＊－２８ｓと称する）の分泌が可能になり、これを抗ＴＦ抗体アフィニティークロマトグラフィーおよび他のクロマトグラフィー法によって精製することができる。
【0371】
イムノアフィニティークロマトグラフィーによる３ｔ１５＊－２８ｓの精製
抗ＴＦ抗体アフィニティーカラムを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔシステムに接続した。流速は、２ｍＬ／分の溶出ステップを除くすべてのステップで４ｍＬ／分であった。
抗ＴＦ抗体アフィニティーカラムを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔシステムに接続した。流速は、２ｍＬ／分の溶出ステップを除くすべてのステップで４ｍＬ／分であった。
【0372】
３ｔ１５＊－２８ｓを含む細胞培養収集物を、１Ｍトリス塩基でｐＨ７．４に調整し、５カラム体積のＰＢＳで平衡化した抗ＴＦ抗体アフィニティーカラム（上述）にロードした。試料を装填した後、カラムを５カラム体積のＰＢＳで洗浄し洗浄し、続いて６カラム体積の０．１Ｍ酢酸、ｐＨ２．９で溶出した。Ａ２８０溶出ピークを収集し、その後、１Ｍトリス塩基を添加してｐＨ７．５～８．０に中和した。その後、中和した試料を、分子量カットオフ３０ＫＤａでＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターを使用してＰＢＳに緩衝液交換した。図７に示されるように、３ｔ１５＊－２８ｓの融合パートナーとしてＴＦを含む抗ＴＦ抗体アフィニティーカラムが３ｔ１５＊－２８ｓに結合することができることが明らかである。緩衝液交換したタンパク質試料を、さらなる生化学的分析および生物学的活性試験のために２～８℃で保管する。
【0373】
各溶出後、抗ＴＦ抗体アフィニティーカラムを６カラム体積の０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を使用してストリッピングした。その後、カラムを、１０カラム体積のＰＢＳ、０．０５％ＮａＮ３を使用して中和し、２～８℃で保管した。
【0374】
３ｔ１５＊－２８ｓの分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）をＡＫＴＡ Ａｖａｎｔシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）に接続した。カラムを２カラム体積のＰＢＳで平衡化した。流速は０．８ｍＬ／分であった。キャピラリーループを使用して、３ｔ１５＊－２８ｓ（１ｍｇ／ｍＬ）の試料２００μＬをカラムに注入した。その後、注入を１．２５カラム体積のＰＢＳで追跡した。ＳＥＣクロマトグラフを図８に示した。結果は、３ｔ１５＊－２８ｓの単量体形態および二量体形態、または他の異なる形態を表す可能性が高い４つのタンパク質ピークが存在することを示した。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）をＡＫＴＡ Ａｖａｎｔシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）に接続した。カラムを２カラム体積のＰＢＳで平衡化した。流速は０．８ｍＬ／分であった。キャピラリーループを使用して、３ｔ１５＊－２８ｓ（１ｍｇ／ｍＬ）の試料２００μＬをカラムに注入した。その後、注入を１．２５カラム体積のＰＢＳで追跡した。ＳＥＣクロマトグラフを図８に示した。結果は、３ｔ１５＊－２８ｓの単量体形態および二量体形態、または他の異なる形態を表す可能性が高い４つのタンパク質ピークが存在することを示した。
【0375】
３ｔ１５＊－２８ｓのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析
純度およびタンパク質分子量を決定するために、抗ＴＦ抗体アフィニティークロマトグラフィーで精製した３ｔ１５＊－２８ｓタンパク質試料を、還元条件下で標準ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（４～１２％ＮｕＰａｇｅビス－トリスゲル）電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）法によって分析した。ゲルをＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅで約３０分間染色し、その後、精製水で一晩脱染した。図９は、抗ＴＦ抗体アフィニティークロマトグラフィーで精製した３ｔ１５＊－２８ｓのＳＤＳゲルを示す。結果は、精製した３ｔ１５＊－２８ｓが、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ中で予想された分子量（７２ｋＤａ）のタンパク質バンドを含むことを示した。
純度およびタンパク質分子量を決定するために、抗ＴＦ抗体アフィニティークロマトグラフィーで精製した３ｔ１５＊－２８ｓタンパク質試料を、還元条件下で標準ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（４～１２％ＮｕＰａｇｅビス－トリスゲル）電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）法によって分析した。ゲルをＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅで約３０分間染色し、その後、精製水で一晩脱染した。図９は、抗ＴＦ抗体アフィニティークロマトグラフィーで精製した３ｔ１５＊－２８ｓのＳＤＳゲルを示す。結果は、精製した３ｔ１５＊－２８ｓが、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ中で予想された分子量（７２ｋＤａ）のタンパク質バンドを含むことを示した。
【0376】
３ｔ１５＊－２８ｓ融合タンパク質複合体の活性のインビトロ特徴付け
ＥＬＩＳＡベースの方法により、３ｔ１５＊－２８ｓ融合タンパク質複合体の形成を確認した。３ｔ１５＊－２８ｓがＣＤ２８およびＣＤ３と相互作用するかを評価するために（図１０Ａ～１０Ｂ）、５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ９．４（１００μｌ／ウェル）中１０μｇ／ｍＬのヒトＣＤ２８－Ｆｃ（カタログ番号ＣＤ８－Ｈ５２５ａ、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）または１０μｇ／ｍＬのヒトＣＤ３Ｅ／ＣＤ３Ｄヘテロ二量体－ラマＦｃ／ラマＦｃ（カタログ番号ＣＤＤ－Ｈ５２５８、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号８００４０ＬＥ ０９１０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に塗布し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ－ＰＢＳ）で１時間ブロックした。減少濃度（ブロッキング緩衝液中３～０．００２４３μｇ／ｍＬ）の３ｔ１５＊－２８ｓまたは陰性対照融合タンパク質（同じＴＦドメインを含むＨＣＷ９２１８）をプレートに添加し、プレートを２５℃で１時間インキュベートした。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄した。０．１μｇ／ｍＬの検出抗体であるビオチン化抗ＴＦ抗体（カタログ番号 ＢＡＦ２３３９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をプレートに添加し、２５℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、０．２５μｇ／ｍＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ－ストレプトアビジン（コード番号０１６－０３０－０８４、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をプレートに添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰの基質であるＡＢＴＳ（カタログ番号ＡＢＴＳ－１０００－０１、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）をプレートに添加し、２５℃で２０分間インキュベートした。プレートを、マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ Ｓｋｙ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＯＤ４０５ｎｍで読み取った。図１０Ａ～１０Ｂに示されるように、３ｔ１５＊－２８ｓはＣＤ２８およびＣＤ３と相互作用したが、対照融合タンパク質ＨＣＷ９２１８は相互作用しなかった。３ｔ１５＊－２８ｓ融合タンパク質複合体のαＣＤ３ｓｃＦｖドメインおよびαＣＤ２８ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ３およびＣＤ２８に結合することができた。それぞれ、ＣＤ２８および抗ＴＦ抗体へのαＣＤ２８ｓｃＦｖドメインおよびＴＦドメインの結合（図１０Ａ）により、精製タンパク質が３ｔ１５＊－２８ｓヘテロ二量体複合体で構成されたことが確認された。
ＥＬＩＳＡベースの方法により、３ｔ１５＊－２８ｓ融合タンパク質複合体の形成を確認した。３ｔ１５＊－２８ｓがＣＤ２８およびＣＤ３と相互作用するかを評価するために（図１０Ａ～１０Ｂ）、５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ９．４（１００μｌ／ウェル）中１０μｇ／ｍＬのヒトＣＤ２８－Ｆｃ（カタログ番号ＣＤ８－Ｈ５２５ａ、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）または１０μｇ／ｍＬのヒトＣＤ３Ｅ／ＣＤ３Ｄヘテロ二量体－ラマＦｃ／ラマＦｃ（カタログ番号ＣＤＤ－Ｈ５２５８、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号８００４０ＬＥ ０９１０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に塗布し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ－ＰＢＳ）で１時間ブロックした。減少濃度（ブロッキング緩衝液中３～０．００２４３μｇ／ｍＬ）の３ｔ１５＊－２８ｓまたは陰性対照融合タンパク質（同じＴＦドメインを含むＨＣＷ９２１８）をプレートに添加し、プレートを２５℃で１時間インキュベートした。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄した。０．１μｇ／ｍＬの検出抗体であるビオチン化抗ＴＦ抗体（カタログ番号 ＢＡＦ２３３９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をプレートに添加し、２５℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、０．２５μｇ／ｍＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ－ストレプトアビジン（コード番号０１６－０３０－０８４、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をプレートに添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰの基質であるＡＢＴＳ（カタログ番号ＡＢＴＳ－１０００－０１、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）をプレートに添加し、２５℃で２０分間インキュベートした。プレートを、マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ Ｓｋｙ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＯＤ４０５ｎｍで読み取った。図１０Ａ～１０Ｂに示されるように、３ｔ１５＊－２８ｓはＣＤ２８およびＣＤ３と相互作用したが、対照融合タンパク質ＨＣＷ９２１８は相互作用しなかった。３ｔ１５＊－２８ｓ融合タンパク質複合体のαＣＤ３ｓｃＦｖドメインおよびαＣＤ２８ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ３およびＣＤ２８に結合することができた。それぞれ、ＣＤ２８および抗ＴＦ抗体へのαＣＤ２８ｓｃＦｖドメインおよびＴＦドメインの結合（図１０Ａ）により、精製タンパク質が３ｔ１５＊－２８ｓヘテロ二量体複合体で構成されたことが確認された。
【0377】
実施例９．２ｔ２および３ｔ１５＊－２８ｓを使用したＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の増大
新鮮なヒト白血球（３名のドナー）を血液バンクから入手し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で単離した。Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の純度は３５％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、およびＦｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中の２４ウェル平底プレート中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。細胞を２ｔ２（１００ｎＭ）および３ｔ１５＊－２８ｓ（２００ｎＭ）で刺激し、３７℃、５％ＣＯ２で１１日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、１日おきに２ｔ２（１００ｎＭ）および３ｔ２８（２００ｎＭ）を含む新鮮な完全培地で１１日間にわたって１×１０６／ｍＬの濃度で維持した。その後、細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、およびＦｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の増大をフローサイトメトリーによって評価した。Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の増大倍数を、トリパンブルー（０．４％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）排除法を使用してカウントすることによって測定した。図１１は、１１日目にＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞が２．５倍増加したことを示す。
新鮮なヒト白血球（３名のドナー）を血液バンクから入手し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で単離した。Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の純度は３５％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、およびＦｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中の２４ウェル平底プレート中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。細胞を２ｔ２（１００ｎＭ）および３ｔ１５＊－２８ｓ（２００ｎＭ）で刺激し、３７℃、５％ＣＯ２で１１日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、１日おきに２ｔ２（１００ｎＭ）および３ｔ２８（２００ｎＭ）を含む新鮮な完全培地で１１日間にわたって１×１０６／ｍＬの濃度で維持した。その後、細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、およびＦｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の増大をフローサイトメトリーによって評価した。Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の増大倍数を、トリパンブルー（０．４％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）排除法を使用してカウントすることによって測定した。図１１は、１１日目にＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞が２．５倍増加したことを示す。
【0378】
実施例１０．２ｔ２および３ｔ１５＊－２８ｓ＋抗組織因子抗体を使用したヒト免疫細胞の増大
新鮮なヒト白血球（２名のドナー）を血液バンクから入手し、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）をＦｉｃｏｌｌ分離法で単離した。細胞をカウントし、ＰＢＳ中に１×１０７細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。２μＭの最終濃度のＣｅｌｌ－Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｙｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を細胞に添加し、５％ＣＯ２雰囲気下３７°Ｃで２０分間インキュベートした。細胞を、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、抗生物質（ペニシリン：１０，０００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン：１０，０００μｇ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充した新鮮な予温したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中に室温で５分間にわたって１０倍体積で再懸濁した。細胞を１２００ｒｐｍで１０分間２回洗浄し、カウントし、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、抗生物質（ペニシリン：１０，０００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン：１０，０００μｇ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中に２×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。細胞（０．１ｍＬ）を９６ウェル平底プレートに移し、抗組織因子抗体（抗ＴＦ抗体、０．０１～１００ｎＭ）の存在下または不在下で２ｔ２（１００ｎＭ）および３ｔ１５＊－２８ｓ（０．０１～１０００ｎＭ）とインキュベートした。刺激の１５分前に、３ｔ１５＊－２８ｓと抗組織因子抗体の複合体を２：１の比率で作製した。培地の半分を除去し、抗組織因子抗体の存在下または不在下で新鮮な２ｔ２（１００ｎＭ）および３ｔ１５＊－２８ｓと４８～７２時間おきに交換した。細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ３－ＰＥ、ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、フローサイトメトリーによってＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの希釈を評価した。
新鮮なヒト白血球（２名のドナー）を血液バンクから入手し、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）をＦｉｃｏｌｌ分離法で単離した。細胞をカウントし、ＰＢＳ中に１×１０７細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。２μＭの最終濃度のＣｅｌｌ－Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｙｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を細胞に添加し、５％ＣＯ２雰囲気下３７°Ｃで２０分間インキュベートした。細胞を、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、抗生物質（ペニシリン：１０，０００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン：１０，０００μｇ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充した新鮮な予温したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中に室温で５分間にわたって１０倍体積で再懸濁した。細胞を１２００ｒｐｍで１０分間２回洗浄し、カウントし、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、抗生物質（ペニシリン：１０，０００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン：１０，０００μｇ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中に２×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。細胞（０．１ｍＬ）を９６ウェル平底プレートに移し、抗組織因子抗体（抗ＴＦ抗体、０．０１～１００ｎＭ）の存在下または不在下で２ｔ２（１００ｎＭ）および３ｔ１５＊－２８ｓ（０．０１～１０００ｎＭ）とインキュベートした。刺激の１５分前に、３ｔ１５＊－２８ｓと抗組織因子抗体の複合体を２：１の比率で作製した。培地の半分を除去し、抗組織因子抗体の存在下または不在下で新鮮な２ｔ２（１００ｎＭ）および３ｔ１５＊－２８ｓと４８～７２時間おきに交換した。細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ３－ＰＥ、ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、フローサイトメトリーによってＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの希釈を評価した。
【0379】
図１２は、異なる培養条件下で６回以上の細胞分裂を経るＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントを示す。３ｔ１５＊－２８ｓ：抗ＴＦ抗体複合体＋２ｔ２とのインキュベーションにより、３ｔ１５＊－２８ｓ＋２ｔ２（抗ＴＦ抗体なし）で観察されるよりも低い３ｔ１５＊－２８ｓ濃度で細胞増殖を支持することができた。この結果は、抗組織因子抗体と３ｔ２８の複合体を使用して、ＰＢＭＣ由来の免疫細胞を最適に刺激して増殖させることができることを示唆する。
【0380】
実施例１１．抗ＣＤ３９ ＩｇＧ１ｋ試薬を使用したＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の精製
新鮮なヒト白血球を血液バンクから入手した。白血球の半分を使用して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で精製した。Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の純度は６０％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ３９－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＰＥ、Ｆｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。白血球の残りの半分を使用して、ＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞を二段階プロセスで精製した。第１のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ４＋細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で分離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮した後、ＣＤ３９＋ＣＤ４＋細胞を、新規ビオチン化抗ＣＤ３９抗体試薬（ＨＣＷ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）および磁性粒子（ＥａｓｙＳｅｐヒトビオチンポジティブセレクションキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造業者の指示に従って使用して単離した。細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ３９－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＰＥ、Ｆｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、ＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリーによって評価した（細胞をＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋でゲーティングした）。フローサイトメーターによる精製後純度分析により、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で単離した細胞の６２％と比較して、ビオチン化抗ＣＤ３９抗体を使用して精製した細胞では８４．８％のＣＤ３９＋であったことが示された。このデータは、高度に純粋で表現型的に活性な制御性Ｔ細胞を単離するための新規戦略を実証する（図１３Ａ）。これらの細胞を、上記の方法により、ｈＩＬ－２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ、ラパマイシン、２ｔ２、３ｔ１５＊、および／または３ｔ１５＊－２８ｓ：抗ＴＦ抗体複合体を含む培地中で増大させることができる。
新鮮なヒト白血球を血液バンクから入手した。白血球の半分を使用して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で精製した。Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の純度は６０％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ３９－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＰＥ、Ｆｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。白血球の残りの半分を使用して、ＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞を二段階プロセスで精製した。第１のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ４＋細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で分離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮した後、ＣＤ３９＋ＣＤ４＋細胞を、新規ビオチン化抗ＣＤ３９抗体試薬（ＨＣＷ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）および磁性粒子（ＥａｓｙＳｅｐヒトビオチンポジティブセレクションキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造業者の指示に従って使用して単離した。細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ３９－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＰＥ、Ｆｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、ＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリーによって評価した（細胞をＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋でゲーティングした）。フローサイトメーターによる精製後純度分析により、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で単離した細胞の６２％と比較して、ビオチン化抗ＣＤ３９抗体を使用して精製した細胞では８４．８％のＣＤ３９＋であったことが示された。このデータは、高度に純粋で表現型的に活性な制御性Ｔ細胞を単離するための新規戦略を実証する（図１３Ａ）。これらの細胞を、上記の方法により、ｈＩＬ－２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ、ラパマイシン、２ｔ２、３ｔ１５＊、および／または３ｔ１５＊－２８ｓ：抗ＴＦ抗体複合体を含む培地中で増大させることができる。
【0381】
第２の研究では、最初に、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞を、精製したＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞由来の２ｔ２で増大させ、その後、凍結させた。細胞を解凍し、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中２ｔ２（１００ｎＭ）を有するＴ２５フラスコ内に２×１０６／ｍＬで維持した。ＣＤ３９＋ＣＤ４＋細胞を、新規ビオチン化抗ＣＤ３９抗体試薬（ＨＣＷ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）および磁性粒子（ＥａｓｙＳｅｐヒトビオチンポジティブセレクションキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造業者の指示に従って使用して単離した。細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ３９－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＰＥ、Ｆｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、ＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリーによって評価した（細胞をＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋でゲーティングした）。フローサイトメーターによる精製後純度分析により、ビオチン化抗ＣＤ３９抗体を使用して精製した細胞が、高度に抑制性のＣＤ３９＋サブセットが９９．９％濃縮されたＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞を産出したことが示された（図１３Ｂ）。これらの細胞を、上記の方法により、ｈＩＬ－２、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ、ラパマイシン、２ｔ２、３ｔ１５＊、および／または３ｔ１５＊－２８ｓ：抗ＴＦ抗体複合体を含む培地中で増大させることができる。
【0382】
実施例１２．精製したＣＤ３９＋制御性Ｔ細胞による自己レスポンダーＴ細胞の抑制
新鮮なヒト白血球を血液バンクから入手した。白血球の半分を使用して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で精製した。Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の純度は６０％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ３９－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＰＥ、Ｆｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。白血球の残りの半分を使用して、ＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞を二段階プロセスで精製した。第１のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ４＋細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で分離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮した後、ＣＤ３９＋ＣＤ４＋細胞を、新規ビオチン化抗ＣＤ３９抗体試薬（ＨＣＷ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）および磁性粒子（ＥａｓｙＳｅｐヒトビオチンポジティブセレクションキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造業者の指示に従って使用して単離した。細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ３９－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＰＥ、Ｆｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、ＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリーによって評価した（細胞をＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋でゲーティングした）。自己レスポンダーＴ（Ｔｒｅｓｐ）細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。精製したＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞をレスポンダーＴ細胞と培養した（１：１の制御性Ｔ細胞：レスポンダーＴ細胞）。細胞を２ｔ２（１０ｎＭ）で再刺激し、５日間培養した。細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および０．００１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含む１×ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ））中で洗浄した（１５００ＲＰＭ、室温で５分間）。２回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー（Ｃｅｌｅｓｔａ－ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって分析し、分裂レスポンダーＴ細胞％をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ希釈に基づいて決定した。図１４は、精製したＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞に基づいて単離された細胞と比較して、レスポンダーＴ細胞の増殖の抑制により効果的であったことを示す。
新鮮なヒト白血球を血液バンクから入手した。白血球の半分を使用して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で精製した。Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の純度は６０％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ３９－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＰＥ、Ｆｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。白血球の残りの半分を使用して、ＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞を二段階プロセスで精製した。第１のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ４＋細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で分離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮した後、ＣＤ３９＋ＣＤ４＋細胞を、新規ビオチン化抗ＣＤ３９抗体試薬（ＨＣＷ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）および磁性粒子（ＥａｓｙＳｅｐヒトビオチンポジティブセレクションキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造業者の指示に従って使用して単離した。細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ３９－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＰＥ、Ｆｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、ＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリーによって評価した（細胞をＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋でゲーティングした）。自己レスポンダーＴ（Ｔｒｅｓｐ）細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。精製したＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞をレスポンダーＴ細胞と培養した（１：１の制御性Ｔ細胞：レスポンダーＴ細胞）。細胞を２ｔ２（１０ｎＭ）で再刺激し、５日間培養した。細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および０．００１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含む１×ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ））中で洗浄した（１５００ＲＰＭ、室温で５分間）。２回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー（Ｃｅｌｅｓｔａ－ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって分析し、分裂レスポンダーＴ細胞％をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ希釈に基づいて決定した。図１４は、精製したＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞に基づいて単離された細胞と比較して、レスポンダーＴ細胞の増殖の抑制により効果的であったことを示す。
【0383】
実施例１３．増大させてＣＤ３９＋で精製した制御性Ｔ細胞によるＴＨＰ－１単球細胞の抑制
新鮮なヒト白血球を血液バンクから入手した。ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞。Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の純度は６０％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ３９－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＰＥ、Ｆｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中の２４ウェル平底プレート中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。細胞を１００ｎＭの２ｔ２およびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で刺激し、３７℃、５％ＣＯ２で２１日間インキュベートした。増大期間中、細胞を１日おきに１００ｎＭの２ｔ２で再刺激し、細胞を７日おきにＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（１：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再刺激した。細胞を、１日おきに１００ｎＭの２ｔ２を含む新鮮な完全培地で最大２１日間にわたって１×１０６／ｍＬの濃度で維持した。
新鮮なヒト白血球を血液バンクから入手した。ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ制御性Ｔ細胞。Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の純度は６０％超であり、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ３９－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＰＥ、Ｆｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中の２４ウェル平底プレート中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。細胞を１００ｎＭの２ｔ２およびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（４：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で刺激し、３７℃、５％ＣＯ２で２１日間インキュベートした。増大期間中、細胞を１日おきに１００ｎＭの２ｔ２で再刺激し、細胞を７日おきにＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（１：１のビーズ：細胞）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再刺激した。細胞を、１日おきに１００ｎＭの２ｔ２を含む新鮮な完全培地で最大２１日間にわたって１×１０６／ｍＬの濃度で維持した。
【0384】
２１日目に、細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（Ｆｏｘｐ３染色キットを使用した細胞内染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＤ１２７－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の増大をフローサイトメトリーによって評価し、２０×１０６／ｍＬで凍結させた。先に増大させた細胞を解凍し、完全培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ））中のＴ２５フラスコ内に２×１０６／ｍＬで１時間維持し、洗浄した後、ＣＤ３９＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を単離した。ＣＤ３９＋ＣＤ４＋細胞を、新規ビオチン化抗ＣＤ３９抗体試薬（ＨＣＷ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＥａｓｙＳｅｐヒトビオチンポジティブセレクションキット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して単離した。細胞を、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ ４８８、ＣＤ３９－ＡＰＣ、ＣＤ３ ＰＥ、Ｆｏｘｐ３－ＰａｃＢｌｕｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色して、ＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリーによって評価した（細胞をＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋でゲーティングした）。フローサイトメーターによる精製後純度分析により、ビオチン化抗ＣＤ３９抗体を使用して精製した細胞が、高度に抑制性のＣＤ３９＋サブセットが９９．９％濃縮されたＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞を産出したことが示された。抑制アッセイをＴＨＰ－１（ヒト単球細胞）および精製したＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞もしくはＣＤ３９－Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞または総ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（１：１の比率）で設定した。細胞を、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）（５０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを補充）中で３日間培養した。３日目に細胞上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）によってＩＬ－１０を分析した。
【0385】
図１５は、精製したＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞が、ＣＤ３９－Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞または総ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞と比較して有意により多くのＩＬ－１０を分泌することを示す。このデータは、ＣＤ３９＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞が、ＣＤ３９－Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞または総ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞と比較してより高い抑制能力を有することを示す。
【0386】
他の実施形態
本発明が発明を実施するための形態と併せて記載されているが、前述の記載が例証することを意図しており、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内である。
本発明が発明を実施するための形態と併せて記載されているが、前述の記載が例証することを意図しており、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【手続補正書】
【提出日】2022-10-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】