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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-10
(54)【発明の名称】ミスフォールドＳＯＤ１アッセイ
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20230428BHJP
G01N 33/536 20060101ALI20230428BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20230428BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
G01N33/536 C
G01N33/536 D
G01N33/543 541A
G01N33/536 B
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022556007
(86)(22)【出願日】2021-03-18
(85)【翻訳文提出日】2022-09-15
(86)【国際出願番号】 EP2021056933
(87)【国際公開番号】W WO2021185961
(87)【国際公開日】2021-09-23
(31)【優先権主張番号】20163909.3
(32)【優先日】2020-03-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522367090
【氏名又は名称】アーエルエス ファルマ アクチェン ゲゼルシャフト
(71)【出願人】
【識別番号】521195467
【氏名又は名称】ニューリミューン エイジー
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】マイヤー マルセル
(72)【発明者】
【氏名】ザルツマン ミヒャエル
(72)【発明者】
【氏名】グリム ヤン
(57)【要約】
対象の体液、特に脳脊髄液中のミスフォールドＳＯＤ１をアッセイするための新規な高感度方法が提供される。この方法は、ＳＯＤ１の独特なエピトープ及び対応する抗ＳＯＤ１抗体を利用する新規な高感度イムノアッセイに基づく。加えて、イムノアッセイの構成要素を含むキットが提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の体液を含むサンプル中のミスフォールドＳＯＤ１をアッセイする方法であって、前記体液を、捕捉抗体としての、配列番号１１に示されるアミノ酸配列７３－ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧＤ－８４内のＳＯＤ１のエピトープに結合する第１の抗ＳＯＤ１抗体及び検出抗体としての、ヒトＳＯＤ１aa 50-150のエピトープに結合する第２の抗ＳＯＤ１抗体と接触させることを含む方法。
【請求項2】
前記体液は、脳脊髄液（ＣＳＦ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ミスフォールドＳＯＤ１の存在は、前記対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
対象におけるＡＬＳを診断する方法であって、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法の工程を含み、対照と比較した前記サンプル中のミスフォールドＳＯＤ１の存在又は増加したレベルは、前記対象におけるＡＬＳを示す、方法。
【請求項5】
ＡＬＳは、家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項6】
ＡＬＳは、孤発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項7】
前記第１の抗体は、モノクローナル抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記第２の抗体は、モノクローナル抗体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記第１の抗体は、その可変領域、すなわち結合ドメインにおいて、（ｉ）可変重鎖（ＶH）及び可変軽鎖（ＶL）の６つのＣＤＲであって、
（ａ）ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号３のアミノ酸配列又はその改変体を含み、前記改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｂ）ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号４のアミノ酸配列又はその改変体を含み、前記改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｃ）ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号５のアミノ酸配列又はその改変体を含み、前記改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｄ）ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号８のアミノ酸配列又はその改変体を含み、前記改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｅ）ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号９のアミノ酸配列又はその改変体を含み、前記改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、及び
（ｆ）ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号１０のアミノ酸配列又はその改変体を含み、前記改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含む、６つのＣＤＲ；並びに／又は
（ｉｉ）ＶＨ鎖及びＶＬ鎖であって、
（ａ）前記ＶＨ鎖は、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、及び
（ｂ）前記ＶＬ鎖は、配列番号６又は７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖
を含むことによって特徴付けられる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記第２の抗体は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列１２１－ＨＥＫＡＤＤＬＧＫＧＧＮＥＥＳ－１３５内のＳＯＤ１のエピトープに結合し、且つその可変領域、すなわち結合ドメインにおいて、（ｉ）ＶH及びＶL鎖の６つのＣＤＲであって、
（ａ）ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号１６のアミノ酸配列又はその改変体を含み、前記改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｂ）ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列又はその改変体を含み、前記改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｃ）ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列又はその改変体を含み、前記改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｄ）ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号２０のアミノ酸配列又はその改変体を含み、前記改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｅ）ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号２１のアミノ酸配列又はその改変体を含み、前記改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、及び
（ｆ）ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号２２のアミノ酸配列又はその改変体を含み、前記改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含む、６つのＣＤＲ；並びに／又は
（ｉｉ）ＶＨ鎖及びＶＬ鎖であって、
（ａ）前記ＶＨ鎖は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；及び
（ｂ）前記ＶＬ鎖は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖
を含むことによって特徴付けられる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記第２の抗ＳＯＤ１抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートされる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記検出可能な標識は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、タグ、フラグ、リガンド及び重金属からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記第２の抗ＳＯＤ１抗体は、リガンドにコンジュゲートされ、前記方法は、リガンド結合タグによる標識工程を含み、前記方法は、以下の工程：（ｉ）ウェルに前記第１の抗ＳＯＤ１抗体がスポットされているマイクロプレートを提供する工程；及び
（ｉｉ）前記体液を含む前記サンプルを前記ウェルに添加し、続いてインキュベートし、それにより、前記第１の抗ＳＯＤ１抗体による、前記体液中に存在するミスフォールドＳＯＤ１の捕捉を可能にする工程であって、好ましくは、インキュベーションは、６００ｒｐｍに設定されたプレートシェーカー上で室温において２時間にわたって行われる、工程；及び
（ｉｉｉ）リガンドにコンジュゲートされている前記第２の抗ＳＯＤ１抗体を添加し、且つインキュベートし、それにより、前記捕捉されたミスフォールドＳＯＤ１への前記第２の抗ＳＯＤ１抗体の結合を可能にする工程であって、好ましくは、インキュベーションは、６００ｒｐｍに設定されたプレートシェーカー上で室温において３０分間にわたって行われる、工程；及び
（ｉｖ）リガンド結合タグ及び検出可能な標識を含むコンジュゲートを添加し、且つインキュベートする工程であって、好ましくは、インキュベーションは、６００ｒｐｍに設定されたプレートシェーカー上で室温において３０分間にわたって行われる、工程；及び
（ｖ）発色又は化学発光基質溶液を添加する工程；及び
（ｖｉ）シグナルを画像化する工程；任意選択的に、
（ｖｉｉ）ミスフォールドＳＯＤ１のアッセイされたレベルを参照標準及び／又は対照と比較する工程であって、好ましくは、前記参照標準及び／又は前記対照は、前記サンプルと同じマイクロプレートに添加される、工程
を含み、任意選択的に、前記方法は、シングルプレックスイムノアッセイである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
（ｉ）前記マイクロプレートは、９６ウェルプレートであり、（ｉｉ）前記体液は、脳脊髄液（ＣＳＦ）であり；
（ｉｉｉ）前記リガンドは、ビオチン又はビオチン類似体若しくはその誘導体であり；
（ｉｖ）前記リガンド結合タグは、ストレプトアビジン又はその機能的類似体若しくは誘導体であり、前記検出可能な標識は、発色又は化学発光基質の変換を触媒することができる酵素であり、好ましくは、前記酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼであり；
（ｖ）前記基質は、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）又はルミノール基質であり；
（ｖｉ）画像化は、Ｃｉｒａｓｃａｎ（商標）画像化システムによって行われ；
（ｖｉｉ）洗浄工程は、少なくとも工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び／又は（ｉｖ）後に行われ；及び／又は
（ｖｉｉｉ）前記マイクロプレートは、蓋、好ましくはインキュベーション工程中に流体で満たされた流体吸収マトリックスを有する蓋で覆われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
≦２０．３２ｐｇ／ｍＬのミスフォールドＳＯＤ１の定量下限（ＬＬＯＱ）を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
単一分子アレイ（Ｓｉｍｏａ（商標））を利用し、好ましくは、
（ｉ）捕捉ビーズの表面に前記第１の抗ＳＯＤ１抗体を付着させる工程；及び
（ｉｉ）（ａ）前記体液を含む前記サンプルを添加し、且つ前記サンプルと共に前記ビーズをインキュベートし、それにより、前記第１の抗ＳＯＤ１抗体によって媒介される前記ビーズによる、前記体液中に存在するミスフォールドＳＯＤ１の捕捉を可能にする工程；及び
（ｉｉ）（ｂ）リガンドにコンジュゲートされている前記第２の抗ＳＯＤ１抗体を添加し、且つインキュベートし、それにより、前記ビーズ上の前記捕捉されたミスフォールドＳＯＤ１への前記第２の抗ＳＯＤ１抗体の結合を可能にする工程；及び
（ｉｉ）（ｃ）リガンド結合タグ及び検出可能な標識を含むコンジュゲートを添加し、且つインキュベートする工程；又は
（ＩＩ）（Ａ）前記体液を含む前記サンプルを添加し、リガンドにコンジュゲートされている前記第２の抗ＳＯＤ１抗体を添加し、且つ前記サンプル及び前記第２の抗体と共に前記ビーズをインキュベートし、それにより、前記第１の抗ＳＯＤ１抗体によって媒介される前記ビーズによる、前記体液中に存在するミスフォールドＳＯＤ１の捕捉と、前記ビーズ上の前記捕捉されたミスフォールドＳＯＤ１への前記第２の抗ＳＯＤ１抗体の結合とを可能にする工程；及び
（ＩＩ）（Ｂ）前記リガンド結合タグ及び検出可能な標識を含むコンジュゲートを添加し、且つインキュベートする工程；及び
（ｉｉｉ）発色／蛍光基質溶液中に前記ビーズを再懸濁させる工程；及び
（ｉｖ）１ウェル当たり１つ以下のビーズを保持するように構成されたフェムトリットルサイズのウェルのアレイに工程（ｉｉｉ）の前記ビーズを装填する工程；及び
（ｖ）前記フェムトリットルサイズのウェル内に前記個々のビーズを密封する工程；及び
（ｖｉ）シグナルを画像化する工程；任意選択的に、
（ｖｉｉ）ミスフォールドＳＯＤ１のアッセイされたレベルを参照標準及び／又は対照と比較する工程
を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
（ｉ）前記ビーズは、常磁性ビーズであり、且つ／又は約２．７μＭの直径を有し；（ｉｉ）（ａ）前記体液は、ＣＳＦであり、及び／又はインキュベーション時間は、３０分であり；
（ｉｉ）（ｂ）前記リガンドは、ビオチン又はビオチン類似体若しくはその誘導体であり、及び／又はインキュベーション時間は、５分であり；
（ｉｉ）（ｃ）前記リガンド結合タグは、ストレプトアビジン又はその機能的類似体若しくは誘導体であり、前記検出可能な標識は、発色／蛍光基質を変換することができる酵素であり、好ましくは、前記酵素は、β－ガラクトシダーゼであり、及び／又はインキュベーション時間は、５分であり；
（ＩＩ）（Ａ）前記体液は、ＣＳＦであり、前記リガンドは、ビオチン又はビオチン類似体若しくはその誘導体であり、及び／又はインキュベーション時間は、３５分であり；
（ｉｉ）（Ｂ）前記リガンド結合タグは、ストレプトアビジン又はその機能的類似体若しくは誘導体であり、前記検出可能な標識は、発色／蛍光基質を変換することができる酵素であり、好ましくは、前記酵素は、β－ガラクトシダーゼであり、及び／又はインキュベーション時間は、５分であり；
（ｉｉｉ）前記蛍光基質は、レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＲＧＰ）であり；
（ｖ）前記密封は、油で行われ；
（ｖｉ）前記画像化は、Ｓｉｍｏａ（商標）光学システムによって行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
ミスフォールドＳＯＤ１をアッセイするための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法における、補足抗体としての、配列番号１１に示されるアミノ酸配列７３－ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧＤ－８４内のＳＯＤ１のエピトープに結合する抗ＳＯＤ１抗体及び／又は検出抗体としての、ヒトＳＯＤ１aa 50-150のエピトープに結合する抗ＳＯＤ１抗体の使用。
【請求項19】
前記捕捉抗体は、請求項９に記載の通りに特徴付けられ、及び／又は前記検出抗体は、請求項１０に記載の通りに特徴付けられる、請求項１８に記載の使用。
【請求項20】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法に従い、ＡＬＳに罹患しているか又はＡＬＳを発症する危険性があると診断されている患者の症状の治療又は改善における使用のための治療剤であって、好ましくは、前記患者は、ｓＡＬＳに罹患しているか又はｓＡＬＳを発症する危険性があると診断されており、好ましくは、前記患者は、対照と比較した場合、検出可能な量のミスフォールドＳＯＤ１及び／又は増加したレベルのミスフォールドＳＯＤ１を有するとアッセイされている、治療剤。
【請求項21】
対象の体液を含むサンプル中のミスフォールドＳＯＤ１をアッセイするために、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法を実施するように適合されたキットであって、少なくとも、（ｉ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列７３－ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧＤ－８４内のＳＯＤ１のエピトープに結合する第１のモノクローナル抗ＳＯＤ１抗体；及び
（ｉｉ）検出抗体としての、ヒトＳＯＤ１aa 50-150のエピトープに結合する第２のモノクローナル抗ＳＯＤ１抗体を含む検出試薬であって、前記第２の抗ＳＯＤ抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートされ、好ましくは、前記検出可能な標識は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、タグ、フラグ、リガンド及び重金属からなる群から選択される、検出試薬；並びに任意選択的に、
（ｉｉｉ）検出可能標識結合タグ及び検出可能な標識を含むコンジュゲートであって、好ましくは、前記検出可能標識結合タグは、リガンド結合タグであり、前記検出可能な標識は、発色、化学発光又は蛍光基質の変換を触媒することができる酵素である、コンジュゲート；
（ｉｖ）発色、化学発光又は蛍光基質溶液；
（ｖ）ミスフォールドＳＯＤ１の較正されたイムノアッセイ標準又は対照；
（ｖｉ）マイクロプレート、緩衝液、希釈剤、基質及び／又は溶液の推奨並びに請求項１～１７のいずれか一項に記載のアッセイを実施する方法の説明書；及び／又は
（ｖｉｉ）洗浄及びアッセイ／サンプル希釈緩衝液
を含むキット。
【請求項22】
（ｉ）前記第１の抗体は、マイクロプレート、好ましくは蓋を含む９６ウェルマイクロプレートのウェルに予めスポットされ、好ましくは、前記第１の抗体は、請求項９に記載の通りに特徴付けられ；（ｉｉ）前記検出可能な標識は、リガンド、好ましくはビオチン又はビオチン類似体若しくはその誘導体であり；
（ｉｉｉ）前記リガンド結合タグは、ストレプトアビジン又はその機能的類似体若しくは誘導体であり、及び前記検出可能な標識は、発色又は化学発光基質の変換を触媒することができる酵素であり、好ましくは、前記検出可能な標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼであり；
（ｖ）前記基質溶液は、発色又は化学発光基質溶液であり、好ましくは、前記基質は、ＴＭＢ又はルミノール基質であり；及び／又は
（ｖｉ）前記標準は、２００ｎｇ／ｍＬ～３ｐｇ／ｍＬのミスフォールドＳＯＤ１の段階希釈を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項23】
（ｉ）捕捉抗体としての、請求項９に記載の通りに特徴付けられる第１のモノクローナル抗ＳＯＤ１抗体がウェルに予めスポットされているマイクロプレート、好ましくは蓋を含む９６ウェルマイクロプレート；（ｉｉ）検出抗体としての第２のビオチン化抗ＳＯＤ１抗体；
（ｉｉｉ）ストレプトアビジン－ＨＲＰ試薬；
（ｖ）ＴＭＢ又はルミノールを含む基質溶液；
（ｖｉ）ミスフォールドＳＯＤ１の較正されたイムノアッセイ標準又は対照；及び
（ｖｉｉ）洗浄及びアッセイ／サンプル希釈緩衝液
を含む、請求項２１又は２２に記載のキット。
【請求項24】
（ｉ）前記第１のモノクローナル抗ＳＯＤ１抗体は、捕捉試薬に含まれ、好ましくは、前記第１の抗体は、請求項９に記載の通りに特徴付けられ；（ｉｉ）前記検出可能な標識は、リガンド、好ましくはビオチン又はビオチン類似体若しくはその誘導体であり；
（ｉｉｉ）前記リガンド結合タグは、ストレプトアビジン又はその機能的類似体若しくは誘導体であり、及び前記検出可能な標識は、発色／蛍光基質を変換することができる酵素であり、好ましくは、前記検出可能な標識は、β－ガラクトシダーゼであり；
（ｉｖ）前記基質溶液は、発色又は蛍光基質溶液であり、好ましくは、前記基質は、レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＲＧＰ）であり；及び／又は
（ｖ）前記標準は、約１０００ｎｇ／ｍＬから８点検量線への４倍段階希釈による０．２４４ｎｇ／ｍＬまで、１０ｎｇ／ｍＬから８点検量線への２倍段階希釈による０．０２０ｎｇ／ｍＬまで、５０ｎｇ／ｍＬから１２点検量線への２倍段階希釈による０．０１２ｎｇ／ｍＬまで及び／又は約６６．６６６６７ｎｇ／ｍＬから１２点検量線への３倍段階希釈による０．００３３９ｎｇ／ｍＬまでの、ミスフォールドＳＯＤ１の段階希釈を含み、任意選択的に、
前記キットは、補足ビーズ、好ましくは２．７μＭの直径を有する常磁性ビーズをさらに含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項25】
（ｉ）捕捉抗体としての、請求項９に記載の通りに特徴付けられる第１のモノクローナル抗ＳＯＤ１抗体を含む捕捉試薬；（ｉｉ）検出抗体としての第２のビオチン化抗ＳＯＤ１抗体；
（ｉｉｉ）ストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼ（ＳβＧ）試薬；
（ｉｖ）ＲＧＰを含む基質溶液；
（ｖ）ミスフォールドＳＯＤ１の較正されたイムノアッセイ標準又は対照；
（ｖｉ）洗浄及びアッセイ／サンプル希釈緩衝液；及び
（ｖｉｉ）約２．７μＭの直径を有する常磁性捕捉ビーズ
含む、請求項２１又は２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、対象の体液、特に脳脊髄液（ＣＳＦ）中のミスフォールドＳＯＤ１（ｍＳＯＤ１）をアッセイする新規な高感度方法に関し、且つｍＳＯＤ１のための高感度イムノアッセイ及びそのようなアッセイにおける使用のためのキットを提供する。
【背景技術】
【0002】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、効果的な治療を伴わない高度に不均一な疾患である。これは、ＡＬＳの原因がほとんど不明であり、症例の約９０％が孤発性（ｓＡＬＳ）である一方、約１０％のみが家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）であるためでもある。１９９０年代以降の集中研究は、運動ニューロンの変性に関与する機構を解明することを目指してきた。これらの研究は、ＡＬＳが、いくつかの全身パラメータの組み合わせによって駆動される複雑な疾患であることを示唆している。現在まで、３０個までの遺伝子がＡＬＳの単一遺伝子性原因として記載されており、最も頻度の高いものは、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＳＯＤ１、ＦＵＳ及びＴＡＲＤＢＰ／ＴＤＰ４３であり；総説については、Ｖｉｊａｙａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０（２０１９）：４００．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｎｅｕｒ．２０１９．００４００を参照されたい。遺伝的連鎖、したがって遺伝子マーカーは、ｆＡＬＳに対する感受性の予測及び相関の決定のために実行可能であり得るが、ｓＡＬＳの評価及び薬物開発は、早期診断を促進し、標的の結合を実証し、疾患進行をモニターし、且つ／又は治療の有効性を評価するための代理エンドポイントとして役立ち得るバイオマーカーの欠如によって妨げられている。流体ベースのバイオマーカーは、これらの問題に対処する可能性がある。理想的なバイオマーカーは、ＡＬＳを対照（適切な疾患模倣物及び他の神経疾患）集団と区別するための高い特異性及び感度を示し、個々の患者内の疾患進行をモニターするべきである。ＡＬＳバイオマーカーの探索において、脳脊髄液、血清及び血漿を使用して著しい進歩がなされており、尿及び唾液バイオマーカーは、依然として開発の初期段階にある。これらのバイオマーカー候補のいくつかは、患者の層別化、疾患経過（速い進行対遅い進行）及び重症度の予測における使用を実証しているか、又は前臨床及び臨床適用において使用されている。しかしながら、ＡＬＳバイオマーカーの発見は、過去１０年間で著しい進歩を見せてきたが、バイオマーカーを検証し、それらを診療所に移すことは、依然としてより困難であり；総説Ｖｕ ａｎｄ Ｂｏｗｓｅｒ，Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １４（２０１７），１１９－１３４を参照されたい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
この技術的問題に対する解決策は、特許請求の範囲において特徴付けられ、以下の説明においてさらに開示される実施形態によって提供される。
【0004】
本発明は、概して、ＳＯＤ１の特異的エピトープに対する捕捉抗体として抗ＳＯＤ１抗体を含むイムノアッセイを用いて、対象由来の体液中のミスフォールドＳＯＤ１（ｍＳＯＤ１）の存在及びレベルをそれぞれ決定する新規な高感度方法に関する。添付の実施例及び図に例示されるように、本発明の方法によるｍＳＯＤ１の検出又は対照サンプルと比較したｍＳＯＤ１の増加したレベルのアッセイは、ＡＬＳを示す。より具体的には、本発明のアッセイは、ｓＡＬＳを有する患者を高度な確実性で同定することが可能であり、これは、これまでほとんど可能ではなかった。
【0005】
本発明は、ＳＯＤ１の特異的エピトープ及びそれに対する治療的抗ＳＯＤ１抗体が、ＡＬＳに罹患していると疑われるか又はＡＬＳを発症する危険性がある対象及びＡＬＳ患者からの体液のサンプル中のｍＳＯＤ１の検出においてそれぞれ特に診断的価値もあり、ｆＡＬＳ及びｓＡＬＳを検出及び／又は区別する可能性があるという予想外の発見に基づく。
【0006】
ヒトＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）は、３２ｋＤａのホモ二量体金属酵素であり、染色体２１上の遺伝子座を有し、主に真核細胞の細胞質ゾル、核及びペルオキシソームに局在するが、ミトコンドリア膜間腔にも局在する。それは、触媒銅イオン及び構造亜鉛イオンを結合する活性部位を含む。ＳＯＤ１の機能的役割は、スーパーオキシドラジカルの二酸素及び過酸化水素への不均化を触媒する抗酸化酵素として作用し、そのようにしてスーパーオキシドの定常状態濃度及び細胞への酸化ストレスを低下させることである（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１（１９７８），８７５－８７９）。
【0007】
ＳＯＤ１をコードする遺伝子における突然変異は、家族性筋萎縮性側索硬化症（ｆＡＬＳ）症例の約２０％を占め、孤発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）症例のごく一部を占める（Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３），５９－６２；Ｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７０（２００８），５３３－５３７；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ ３３（２０１２），ｅ１０１７－１０２３）。ＡＬＳは、随意筋、具体的には脊髄、脳幹及び運動皮質における運動ニューロンを制御する原因となるニューロンを攻撃する、急速に進行し、常に致命的な神経疾患である（Ｂｒｕｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７（２００４），７２３－７４９）。ＳＯＤ１における突然変異がどのようにＡＬＳをもたらすかのメカニズムは、完全には理解されていないが、ＳＯＤ１の突然変異誘発性ミスフォールディングが、運動ニューロンの変性を引き起こす毒性と関連する、毒性機能獲得メカニズムについての証拠がある（Ｊｕｌｉｅｎ，Ｃｅｌｌ １０４（２００１），５８１－５９１）。
【0008】
しかしながら、野生型（ｗｔ）ＳＯＤ１のミスフォールディングは、ｓＡＬＳ症例の大部分と関連するとも考えられている（Ｂｏｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １３（２０１０），１３９６－１４０３）。野生型ＳＯＤ１は、サブユニット二量体化、残基Ｃｙｓ５７及びＣｙｓ１４６間のサブユニット内ジスルフィド結合の構築並びに銅及び亜鉛の配位などの大規模な翻訳後修飾の対象である。これらのプロセスの破壊は、全てｗｔ ＳＯＤ１を凝集させることが示されており（Ｄｕｒａｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００９），１５９２３－１５９３１；Ｅｓｔｅｖｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６（１９９９），２４９８－２５００；Ｒａｋｈｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２００４），１５４９９－１５５０４；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（２００４），１５８９３－１５８９８）、したがって自然発生的ＡＬＳ形態の可能な病原性モデルを提供する。ｗｔ ＳＯＤ１の異常な変化は、アルツハイマー病（ＡＤ）及びパーキンソン病（ＰＤ）などの他の神経変性疾患においても報告されている。
【0009】
ＳＯＤ１は、潜在的なバイオマーカーとして考えられてきたが、相反する結果が報告されている。例えば、Ｊａｃｏｂｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ １２４（２００１），１４６１－１４６６は、Ｄ９０Ａ及び他のＳＯＤ１突然変異を有するＡＬＳ患者並びにそのような突然変異を有さない患者からのＣＳＦ中のＳＯＤ１の量、活性及び分子形態を決定し、それらは、３７の神経学的対照、５４の孤発性ＡＬＳ症例及び１２の家族性ＡＬＳ症例並びにＤ９０Ａ突然変異についてホモ接合性の１０症例の間でＳＯＤ１のタンパク質及び酵素活性の量における差異を見出さなかった。同様に、上記のＶｕ ａｎｄ Ｂｏｗｓｅｒ，（２０１７）に要約されるように、別の研究は、ＡＬＳを有する患者と神経疾患対照との間のＣＳＦ ＳＯＤ１レベルを測定し、群間の有意差を見出すことができず、ＳＯＤ１ ＣＳＦレベルがＡＬＳの診断バイオマーカーではないことを示した。加えて、ｍＳＯＤ１種の異なる配列セグメントと反応する抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイによるＡＬＳ患者及び対照からのＣＳＦの分析後の研究は、ＡＬＳ患者と対照との間で有意差を示さなかった（Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１１７（２０１１），９１－９９）。著者らは、ＣＮＳの間質中のｍＳＯＤ１の推定濃度が、モデル系におけるかなりの細胞毒性に必要とされる濃度よりも１０００倍低いと仮定した。したがって、Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｅｍ ｅｔ ａｌ．は、これらの結果がＡＬＳにおける細胞外ｍＳＯＤ１の直接的な細胞毒性の役割に対して反論し、したがって、ＣＳＦにおけるｍＳＯＤ１が、酵素に突然変異を有する及び有さない患者におけるＡＬＳのバイオマーカーとして使用することができないと結論付けた。
【0010】
最近、Ｔｏｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｔｏｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（２０１９）１４：４２ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０２４－０１９－０３４１－５）は、ｓＡＬＳの脳脊髄液中のミスフォールド野生型ＳＯＤ１についてのＥＬＩＳＡアッセイを記載した。しかしながら、使用された捕捉抗体、Ｇ９３Ａ突然変異を有する組換えＳＯＤ１を使用することによって生成されたモノクローナル抗体である抗体Ｃ４Ｆ６は、変性Ｇ９３Ａに対して強い免疫反応性を示すが、他のｈＳＯＤ１突然変異体に対する反応性が遥かに低く、変性ＷＴ ｈＳＯＤ１に対する反応性が非常に低いことが報告された。さらに、Ｃ４Ｆ６抗体は、Ａ４Ｖ ｆＡＬＳ症例からの脊髄組織を染色するが、ｓＡＬＳ症例では染色しないことが記載されており；Ａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１４，２：５５ Ｐａｇｅ ２ ｏｆ １３ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｔａｎｅｕｒｏｃｏｍｍｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２／１／５５による抗体Ｃ４Ｆ６の特徴付けを参照されたい。したがって、Ｔｏｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１９）に記載されている抗体Ｃ４Ｆ６及びＥＬＩＳＡアッセイが、信頼性があり、診療所への展開に適しているかどうかは、依然として示されていない。
【0011】
対照的に、本発明の範囲内で行われた偏りのない実験は、ｍＳＯＤ１に対する全て高いが、異なる結合親和性を有し、異なるエピトープをカバーする、異なる盲検化抗ｍＳＯＤ１抗体のサブセットの中で、他の候補ではなく、ＮＩ－２０４．Ｂ及びＮＩ－２０４．Ｏと称される２つの抗体のみが組織、細胞及び体液サンプル中のｍＳＯＤ１を確実に検出することが見出されたが、他の候補のいくつかが、従来のＥＬＩＳＡアッセイで決定して、変性、酸化及び組換えＳＯＤ１についてかなり低いＥＣ50値を示し、したがってｍＳＯＤ１についてのイムノアッセイでの捕捉抗体として使用するための第１の選択肢であることを明らかにした。
【0012】
抗体プローブのデコーディングは、ＮＩ－２０４．Ｂ及びＮＩ－２０４．Ｏが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列７３－ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧＤ－８４内でＳＯＤ１の類似のエピトープを共有することを明らかにした。本発明による検出のためのイムノアッセイを調査する場合、抗体ＮＩ－２０４．Ｂ及びＮＩ－２０４．Ｏがそれぞれ捕捉抗体としての役割を果たすサンドイッチＥＬＩＳＡを確立することができ、抗体ＮＩ－２０４．Ｂ及びＮＩ－２０４．Ｏについて実施例に例示されるＡＬＳ患者からのＣＳＦサンプル中のｍＳＯＤ１を確実に検出することが見出された。原則として、適切な捕捉抗体を同定するためのプレアッセイ及びその後のイムノアッセイは、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．９（２０１９），６７２４，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１９－４３１６４－ｚに記載されたｍＳＯＤ１についてのアッセイに基づき、例えば実施例に示されるＣＳＦなどの体液中のｍＳＯＤ１の検出のために追加の修正と共に「方法」セクションを参照されたい。
【0013】
特に、Ｔｏｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１９）で使用されている抗体Ｃ４Ｆ６とは対照的に、抗体ＮＩ－２０４．Ｂ及びＮＩ－２０４．Ｏによって認識されるエピトープは、必ずしも突然変異ＳＯＤ１タンパク質と関連せず、Ａ４Ｖ ｆＡＬＳ患者だけでなく、ｓＡＬＳ及びＣ９ＯＲＦ７２ヘキサヌクレオチド反復伸長又は未知の遺伝子突然変異を保有するｆＡＬＳ患者由来の脊髄組織上で認識され；Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１０，ｅａａｈ３９２４（２０１８）５を参照されたい。
【0014】
したがって、本発明のアッセイは、いずれにしても機能する場合、Ｔｏｋｕｄａ ｅｌ ａｌ．（２０１９）に記載されているＥＬＩＳＡアッセイよりも広い範囲のＡＬＳ患者に適用可能であると期待することが合理的である。
【0015】
したがって、本発明は、概して、イムノアッセイを用いてヒト対象の体液中のｍＳＯＤ１をアッセイする新規な方法に関する。特に、前記イムノアッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイであり、体液、好ましくはＣＳＦを、捕捉抗体としての第１の抗ＳＯＤ１抗体及び検出抗体としての第２の抗ＳＯＤ１抗体と接触させる。
【0016】
この革新的なアッセイは、患者の体液中の、バイオマーカーとして役立つｍＳＯＤ１をアッセイすることにより、ｆＡＬＳ及びｓＡＬＳの両方が診断できるため、特に興味深い。これは、ｆＡＬＳの発生の大部分が遺伝子マーカーによって決定され得るが、ｓＡＬＳを有する患者の同定が遥かに困難であるため、重要である。したがって、新規イムノアッセイを用いて、ＡＬＳ、特に孤発性ＡＬＳを有する患者を、抗ＳＯＤ１抗体による且つ／又はＡＬＳ及びその症状の治療にそれぞれ現在使用されている他の薬物による治療のために同定及び選択することができる。
【0017】
本発明のアッセイは、体液中、好ましくはＣＳＦ中のｍＳＯＤ１のレベルの薬力学的変化をモニターするために使用することもでき、これは、ＡＬＳを有する患者の治療又は症状の改善に有用な治療剤の用量最適化を促進し得る。候補治療薬の臨床試験において低濃度のｍＳＯＤ１の正確且つ精密な定量を可能にするのに十分な高い感度を有するアッセイは、ＡＬＳ研究努力に有益であろう。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明は、対象の体液中のｍＳＯＤ１を検出するための新規な高感度イムノアッセイに関し、このアッセイは、ｍＳＯＤ１凝集体上に配置されたエピトープを特異的に認識する抗体を使用し、このアッセイは、健康なボランティアから、ＡＬＳに罹患しているか又はＡＬＳを発症する危険性がある対象を識別することもできる。より具体的には、本発明は、特許請求の範囲で特徴付けられ、本明細書に開示され、且つ以下の実施例及び図にさらに示される実施形態に関する。
【0020】
特に明記しない限り、本明細書で使用される用語は、２０００年に改訂され、２００３年に再刷されたＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９７、ＩＳＢＮ ０ １９ ８５０６７３ ２；２００６年に出版された第２版、ＩＳＢＮ ０－１９－８５２９１７－１ ９７８－０－１９８５２９１７－０に提供される定義を付与される。
【0021】
本明細書全体で使用される、ｍＳＯＤ１を「アッセイする」という用語は、ｍＳＯＤ１の存在／量／レベル／濃度を決定又は測定することと、ｍＳＯＤ１及び関連する発現を定量することとを含む。
【0022】
さらに、特に明記しない限り、本発明を特徴付けるために本明細書で使用される用語及び表現は、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレット、特に１０～３０ページの「Ｉ．定義」のサブセクションに提供される定義を付与され、その開示内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。同じことは、抗体などについて国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットに開示されている一般的な実施形態にも当てはまる。
【0023】
当技術分野で知られているように、異なる神経変性疾患、例えばＡＬＳ、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＬＳ／パーキンソニズム－認知症複合体（ＡＬＳ－ＰＤＣ）、ダウン症候群及びパーキンソン病（ＰＤ）は、ｍＳＯＤ１の発生を示すか又はｍＳＯＤ１に関連する。したがって、ｍＳＯＤ１の存在又は上昇したレベルは、前記疾患を示し得る。さらに、上述のように、ＳＯＤ１をコードする遺伝子における突然変異は、ミスフォールディングを引き起こす可能性があり、ｆＡＬＳ症例の約２０％及びｓＡＬＳ症例のわずかな割合を占めるが、ｗｔ ＳＯＤ１のミスフォールディングもｓＡＬＳ症例と関連する。したがって、ｍＳＯＤ１の存在又は上昇したレベルは、ＡＬＳを示す。
【0024】
したがって、本発明の方法は、ＡＬＳ、ＡＤ、ＡＬＳ－ＰＤＣ、ダウン症候群又はＰＤを診断するための方法として使用することができ、この方法は、診断される対象のサンプル中のｍＳＯＤ１をアッセイすることを含み、それぞれサンプル中のｍＳＯＤ１の存在は、前記対象における上述の疾患を示し、対照と比較したサンプル中のｍＳＯＤ１の増加したレベルは、前記対象における上述の疾患を示す。好ましい実施形態では、本発明の方法で診断される疾患は、ＡＬＳである。
【0025】
ＳＯＤ１のミスフォールディングは、ｆＡＬＳを有する患者及びｓＡＬＳを有する患者において観察されており、ｍＳＯＤ１は、本発明の方法において使用される抗体によって検出され得るため、前記方法は、ｆＡＬＳ及びｓＡＬＳを有する患者を診断するために使用され得る。
【0026】
診断される対象は、疾患について無症候性又は発症前であり得る。
【0027】
本発明の方法は、患者の体液のサンプル中のｍＳＯＤ１をスクリーニングすることを含む。本発明のアッセイで分析されるサンプルは、病理学的にｍＳＯＤ１を含むことが疑われる任意の体液、例えば血液、ＣＳＦ又は尿サンプルであり得る。好ましい実施形態では、サンプルは、全血溶解物又はＣＳＦ、好ましくはＣＳＦである。
【0028】
本発明の方法は、体液を第１の抗ＳＯＤ１抗体と接触させることを含むイムノアッセイを適用し、この第１の抗ＳＯＤ１抗体は、捕捉抗体として使用される。実験の過程中、２つの抗体が本発明の方法に適していることが同定され、両方とも配列番号１１に示されるアミノ酸配列７３－ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧＤ－８４内のＳＯＤ１のエピトープに結合する。これらの２つの抗体は、ＮＩ－２０４．Ｂ及びＮＩ－２０４．Ｏと命名される。上述のように、ＮＩ－２０４．Ｂは、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの配列番号５１に示されるアミノ酸配列７３－ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧ－８３を含むＳＯＤ１のエピトープに結合する、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットに開示された抗体ＮＩ－２０４．１２Ｇ７であることが判明した。ＮＩ－２０４．Ｏは、アミノ酸配列７６－ＫＤＥＥＲＨＶＧＤ－８４（配列番号１３）を含むＳＯＤ１のエピトープに結合する。
【0029】
原則として、捕捉抗体は、エピトープ７３－ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧＤ－８４（配列番号１１）、好ましくはアミノ酸配列７３－ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧ－８３（配列番号１２）を含むエピトープ及び／又はアミノ酸配列７６－ＫＤＥＥＲＨＶＧＤ－８４（配列番号１３）を含むエピトープを認識する任意の抗体又は抗体形式であり得る。原則として、そのような抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体を産生するために一般的に使用されるマウス、ウサギ、ヤギ若しくは他の動物において又はＦｖ、Ｆａｂ若しくは完全ＩｇＧライブラリーをスクリーニングすることにより、対応する抗原に対して産生され得る。好ましくは、捕捉抗体は、モノクローナル抗体であるか又はモノクローナル抗体に由来する。
【0030】
本発明の特定の好ましい実施形態において、捕捉抗体は、ヒト抗体ＮＩ－２０４．１２Ｇ７に由来し、その可変領域、すなわち結合ドメイン中において、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの図１Ｂに示されるアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶH）及び可変軽鎖（ＶL）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことによって特徴付けられるか、又はＣＤＲの１つ以上は、そのアミノ酸配列において、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の場合には国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの図１Ｂに示されるものと１つ、２つ、３つ又はさらにはそれを超えるアミノ酸が異なり得、捕捉抗体は、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの実施例に示される抗ＳＯＤ１抗体ＮＩ－２０４．１２Ｇ７と実質的に同じ又は同一の免疫学的特徴を示す。ＣＤＲの位置は、図１Ｂに示され、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの図１の凡例で説明される。対応するヌクレオチド配列は、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの５４ページの表ＩＩに示されている。さらに又は代わりに、フレームワーク領域又は完全ＶH及び／若しくはＶL鎖は、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの図１Ｂに示されるフレームワーク領域と８０％同一であり、好ましくは国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの図１Ｂに示されるフレームワーク領域並びにＶH及び／又はＶL鎖とそれぞれ８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である。さらに、抗体ＮＩ－２０４．Ｂのクローニング及び発現は、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの８４～８８ページの「材料及び方法」のセクションに記載されているように実施されており、したがって、この方法は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0031】
特に好ましい実施形態では、捕捉抗体は、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの図１Ｂに示されるＶH及び／又はＶL鎖によって特徴付けられる。
【0032】
したがって、捕捉抗体は、好ましくは、
（ｉ）ＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む可変重鎖（ＶＨ）並びに／又はＶＬ ＣＤＲ１、２及び３を含む可変軽鎖（ＶＬ）であって、
（ａ）ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号３のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｂ）ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号４のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｃ）ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号５のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｄ）ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号８のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｅ）ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号９のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、及び
（ｆ）ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号１０のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含む、可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）；並びに／又は
（ｉｉ）ＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖であって、
（ａ）ＶＨ鎖は、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ以上のアミノ酸置換を含み；及び
（ｂ）ＶＬ鎖は、配列番号６又は７に示されるアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ以上のアミノ酸置換を含む、ＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖；
を含み、好ましくは、ＶＨ及びＶＬ鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１又は２及び６又は７と少なくとも９０％同一である。
（ｉ）ＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む可変重鎖（ＶＨ）並びに／又はＶＬ ＣＤＲ１、２及び３を含む可変軽鎖（ＶＬ）であって、
（ａ）ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号３のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｂ）ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号４のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｃ）ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号５のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｄ）ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号８のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｅ）ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号９のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、及び
（ｆ）ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号１０のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含む、可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）；並びに／又は
（ｉｉ）ＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖であって、
（ａ）ＶＨ鎖は、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ以上のアミノ酸置換を含み；及び
（ｂ）ＶＬ鎖は、配列番号６又は７に示されるアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ以上のアミノ酸置換を含む、ＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖；
を含み、好ましくは、ＶＨ及びＶＬ鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１又は２及び６又は７と少なくとも９０％同一である。
【0033】
原則として、捕捉抗体は、例えば、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、二重特異性抗体、融合抗体、標識抗体又はそれらのいずれか１つの類似体を含むエピトープを認識する任意の形式であり得る。そのような改変体を生成するための対応する方法は、当業者に知られており、例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）Ｆｉｒｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｄｗａｒｄ Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（著作権）２０１４、ＩＳＢＮ ９７８－１－９３６１１３－８１－１に記載されている。例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、組換えにより又はパパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）若しくはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成するため）などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断により産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインを含む。そのような断片は、例えば、免疫グロブリンの免疫特異的部分を放射性同位体などの試薬に結合させることを含む免疫診断手順において使用するのに十分である。好ましくは、捕捉抗体はＩｇＧ形式を有し、すなわち完全ＩｇＧ抗体である。ヒト又はマウス定常ドメインを有する完全ヒトＩｇＧ１抗体の組換え発現は、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの実施例に記載されているように実質的に行うことができる。
【0034】
典型的には、本発明の方法は、検出抗体としての第２の抗体の使用をさらに含む。この抗体は、捕捉抗体７３－ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧＤ－８４（配列番号１１）のエピトープと異なるエピトープでｍＳＯＤ１に結合する任意の抗ＳＯＤ１抗体、例えば市販の抗体、例えばポリクローナルウサギ抗ヒトＳＯＤ１（Ａｂｃａｍ ａｂ５２９５０）、ポリクローナルビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ．１１１－０６５－１４４）と組み合わせたウサギモノクローナル抗ヒトＳＯＤ１（Ａｂｃａｍ ａｂ７９３９０）、例えばＧｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１９）、前出参照又は国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットに開示されているか、若しくはＴｏｋｕｄａ ｅｌ ａｌ．（２０１９）に記載の表３に列挙されている抗ＳＯＤ１抗体であり得る。
【0035】
一実施形態では、検出抗体は、市販されており（Ａｂｃａｍ ａｂ１８５１２５）、合成ＳＯＤ１aa 50-150ペプチドに対して生成されたウサギモノクローナル抗体［ＥＰＲ１７２６］であり、ＢＳＡ及びアジドフリーである。抗体ａｂ１８５１２５は、ａｂ７９３９０の無担体バージョンであり、蛍光色素、金属同位体、オリゴヌクレオチド及び酵素を含む抗体標識における使用のために設計されている。予備的エピトープ分析により、抗体ＥＰＲ１７２６は、ＮＩ－２０４．１２Ｇ７のエピトープの直前のＮＩ－２０４．１２Ｇ７エピトープと同じループにあるエピトープ、すなわちヒトＳＯＤ１のおよそアミノ酸（６１弱）６５～７５に結合することが示唆されている。したがって、好ましくは、本発明の方法において使用するための検出抗体は、抗体ＥＰＲ１７２６のものと類似の結合特性を示す抗体、すなわちヒトＳＯＤ１のアミノ酸５０～１５０内、特にヒトＳＯＤ１のアミノ酸（６１）６５～７５に結合する均等なモノクローナル抗体である。当業者は、そのような均等な抗体に到達する方法及び手段をよく知っており；例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）及びＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（２０１４），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、前出を参照されたい。
【0036】
したがって、好ましくは、検出抗体は、第１の抗体と異なり、捕捉抗体と異なるエピトープに結合する。したがって、第２の抗体として、ｍＳＯＤ１への結合について第１の抗体と競合しない抗体が使用される。原則として、検出抗体は、ｍＳＯＤ１を認識する任意の形式であり得、第２の抗体は、モノクローナル抗体である。
【0037】
これに関連して、本発明に従って実施された実験中、ＮＩ－２０４．Ｇと命名された異なる盲検化抗ｍＳＯＤ１抗体のサブセットの１つの候補が捕捉抗体として適切ではないが、ＮＩ－２０４．Ｇが抗体ＮＩ－２０４．Ｂの存在下でｍＳＯＤ１に結合することができるため、適切な第２の抗体として、すなわち検出抗体として役立ち得ることが判明した。抗体プローブをデコードすることにより、ＮＩ－２０４．Ｇは、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの配列番号５５に示されるアミノ酸配列１２１－ＨＥＫＡＤＤＬＧＫＧＧＮＥＥＳ－１３５を含むＳＯＤ１のエピトープに結合する、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットに開示された抗体ＮＩ－２０４．１２Ｇ３に対応することが明らかになった。したがって、一実施形態では、検出抗体は、エピトープ１２１－ＨＥＫＡＤＤＬＧＫＧＧＮＥＥＳ－１３５（配列番号１４）を認識し、捕捉抗体について記載されるような任意の供給源及び抗体形式のものであり得る。好ましくは、検出抗体は、ヒト抗体ＮＩ－２０４．１２Ｇ３に由来し、その可変領域、すなわち結合領域において、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの図１Ｈに示されるアミノ酸配列を有するＶH及びＶL鎖のＣＤＲを含むことによって特徴付けられるか、又はＣＤＲの１つ以上は、そのアミノ酸配列において、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の場合には国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの図１Ｈに示されるものと１つ、２つ、３つ又はそれを超えるアミノ酸が異なり得、捕捉抗体は、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの実施例に示される抗ＳＯＤ１抗体ＮＩ－２０４．１２Ｇ３と実質的に同じ又は同一の免疫学的特徴を示す。ＣＤＲの位置は、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの図１Ｈに示され、図１の凡例で説明されている。さらに又は代わりに、フレームワーク領域又は完全ＶH及び／又はＶL鎖は、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの図１Ｈに示されるフレームワーク領域並びにＶH及び／又はＶL鎖とそれぞれ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である。
【0038】
しかしながら、上述のように、異なる抗ＳＯＤ１抗体、特にそれぞれ抗体Ａｂｃａｍ ａｂ１８５１２５、Ａｂｃａｍ ａｂ７９３９０及びＮＩ－２０４．１２Ｇ３によって認識される実質的に同じエピトープ及びアミノ酸領域、好ましくはＳＯＤ１aa 100-150内のエピトープを認識する抗体も検出抗体として有用であり得る。典型的には、本発明のアッセイに従って使用するためのそのような検出抗体は、本発明のサンドイッチＥＬＩＳＡ形式において、ＳＯＤ１の結合について抗体Ａｂｃａｍ ａｂ１８５１２５、Ａｂｃａｍ ａｂ７９３９０及び／又はＮＩ－２０４．１２Ｇ３と競合する。
【0039】
好ましくは、検出抗体は、ＩｇＧ形式を有し、すなわち完全ＩｇＧ抗体である。ヒト又はマウス定常ドメインを有する完全ヒトＩｇＧ１抗体の組換え発現は、国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットの実施例に記載されているように実質的に行うことができる。
【0040】
本発明のｍＳＯＤ１アッセイの一実施形態では、検出抗体は、
（ｉ）ＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む可変重鎖（ＶＨ）並びに／又はＶＬ ＣＤＲ１、２及び３を含む可変軽鎖（ＶＬ）であって、
（ａ）ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号１６のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｂ）ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｃ）ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｄ）ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号２０のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｅ）ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号２１のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、及び
（ｆ）ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号２２のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含む、可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）；並びに／又は
（ｉｉ）ＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖であって、
（ａ）ＶＨ鎖は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ以上のアミノ酸置換を含み；及び
（ｂ）ＶＬ鎖は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ以上のアミノ酸置換を含む、ＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖
を含み、好ましくは、ＶＨ及びＶＬ鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５及び１９と少なくとも９０％同一である。
（ｉ）ＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む可変重鎖（ＶＨ）並びに／又はＶＬ ＣＤＲ１、２及び３を含む可変軽鎖（ＶＬ）であって、
（ａ）ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号１６のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｂ）ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｃ）ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｄ）ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号２０のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｅ）ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号２１のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、及び
（ｆ）ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号２２のアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含む、可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）；並びに／又は
（ｉｉ）ＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖であって、
（ａ）ＶＨ鎖は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ以上のアミノ酸置換を含み；及び
（ｂ）ＶＬ鎖は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列又はその改変体を含み、改変体は、１つ以上のアミノ酸置換を含む、ＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖
を含み、好ましくは、ＶＨ及びＶＬ鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５及び１９と少なくとも９０％同一である。
【0041】
本発明の方法の好ましい実施形態において、第２の抗体又はその断片は、検出可能な標識（例えば、蛍光、化学発光、放射性、酵素、核磁気、重金属、タグ、フラグなど）を含み；例えば、一般的な技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１４ ｂｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ；動的細胞画像化のための蛍光標識戦略における進歩については、Ｄｅａｎ ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０（２０１４），５１２－５２３；並びに抗体－薬物コンジュゲート及び抗体模倣物のための酵素ベースの標識戦略については、Ｆａｌｃｋ ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ７（２０１８），４；ｄｏｉ：１０．３３９０／ａｎｔｉｂ７０１０００４を参照されたい。
【0042】
標識は、直接検出することができる標識、例えば蛍光標識（物理化学的レポーター）であるか、又は標識は、直接検出可能な標識を含むリガンド結合パートナーによって結合されるリガンド、例えばビオチンであり得る。
【0043】
本発明の方法の好ましい実施形態では、第２の抗体は、リガンド結合パートナー、すなわち非共有結合性タンパク質－リガンド相互作用を形成するリガンド結合タグに結合することができるリガンドにコンジュゲートされる。
【0044】
本発明によれば、リガンドは、当業者に公知の部分であり、親和性タグ、例えばＨｉｓ－タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）－タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）－タグ、キチン結合ドメイン又はチオレドキシン、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧ－ペプチド、Ａｒｇ－タグ、Ｈａｔ－タグ、ｃ－ｍｙｃ－タグ、Ｓ－タグ又はストレプトアビジン結合タグ、例えばＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－タグ（登録商標）など、及びビオチンを含む。概要は、例えば、Ｔｅｒｐｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０（２００３），５２３－５３３に提供されており、そのアミノ酸配列を含む例示的なタグは、Ｔｅｒｐｅ（２００３）の表２に列挙されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【0045】
好ましい実施形態では、リガンドは、ビオチン又はビオチン類似体若しくはその誘導体であるか又はそれらを含み、すなわち、本発明の方法で使用される第２の抗体は、ビオチン化される。抗体のビオチン化は、当技術分野で一般に公知であり、市販のキットが利用可能であり、当業者がビオチン化抗体を生成することを可能にする。
【0046】
したがって、本発明の方法は、上述のリガンドに適合するリガンド結合パートナーを用いた標識工程を含む。これらのリガンド結合パートナーも当技術分野で公知であり、例えばＴｅｒｐｅ，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６０（２００３），５２３－５３３に要約されている。
【0047】
好ましい実施形態では、リガンド結合パートナーは、それぞれのビオチン又は誘導体に結合するストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジン類似体又はアビジン類似体である。リガンド結合パートナーは、上記に特定した検出可能な標識であり得る検出可能な標識をさらに含むコンジュゲートに含まれる。好ましくは、コンジュゲートに含まれる検出可能な標識は、発色／蛍光又は化学発光標識、すなわち発色／蛍光／化学発光基質の変換を触媒することができる酵素である。好ましい実施形態では、検出可能な標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はβ－ガラクトシダーゼである。したがって、コンジュゲートは、ストレプトアビジン－ＨＲＰコンジュゲート又はストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼ（ＳβＧ）コンジュゲートである。これらの酵素は、適切な基質溶液が添加されるとシグナルを生成する。ＨＲＰの場合、発色基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）又は２，２’－アジノ－ジ－［３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸］（ＡＢＴＳ）が使用されるか、又はルミノール若しくは化学発光基質として基質を含むルミノールが使用され、β－ガラクトシダーゼの場合、レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＲＧＰ）が使用される。
【0048】
本発明の方法は、好ましくは、１つの標的のみが検出されることを意味するシングルプレックスアッセイを含む。本発明の方法において、ｍＳＯＤ１は、単一の標的として検出される。しかしながら、アッセイは、マルチプレックスアッセイとして設計することもできる。
【0049】
したがって、本発明の方法は、少なくとも以下の工程を含む：対象のサンプル中のｍＳＯＤ１を、表面に付着された第１の抗ＳＯＤ１抗体で捕捉する工程、ｍＳＯＤ１への結合を可能にする検出可能な標識を含む第２の抗ＳＯＤ１抗体を添加する工程、標識のシグナルを検出する工程及び標識のシグナルを対照と比較する工程。
【0050】
一実施形態では、本方法は、以下の工程を含み；実施例１も参照されたい：まず、上述の第１の抗ＳＯＤ１抗体をスポットしたマイクロプレートを提供する。このようなプレートは、Ａｕｓｈｏｎ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓによって製造することができ、市販されている。さらに、マイクロアレイイムノアッセイの設計は、一般に、Ｋｕｓｎｅｚｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ５（２００６），１６８１－１６９６に要約されている。好ましくは、このプレートは、９６ウェルプレートである。
【0051】
さらなる工程は、体液を含むサンプルをマイクロプレートのウェルに添加する工程を含む。体液は、上述したような任意の体液であり得るが、好ましくはＣＳＦである。体液は、さらに修飾することもでき、例えば精製して、望ましくない成分又はイムノアッセイを妨害する可能性のある成分を取り除くことができる。サンプルは、抗体－抗原複合体の形成を可能にし、すなわちサンプル中に存在する場合、ｍＳＯＤ１への第１の抗ＳＯＤ１抗体の結合を可能にする条件下においてウェル中でインキュベートされる。適切な条件の特定は、実際のアッセイと同時に又は予め陽性対照を試験して正確なパラメータを調整することによって行うことができる。陽性対照は、精製ｍＳＯＤ１又はｍＳＯＤ１関連ＡＬＳを有する患者のサンプルのいずれかであり得る。好ましい実施形態では、インキュベーションは、好ましくは、６００ｒｐｍに設定されたプレートシェーカー上で室温において２時間にわたって行われる。好ましい実施形態では、未結合成分を除去するために後にプレートを洗浄する。
【0052】
次の工程は、サンプルへの第２の抗ＳＯＤ１抗体の添加を含み、ここで、第２の抗体は、リガンドにコンジュゲートされる。第２の抗ＳＯＤ１抗体は、上記の抗体又は結合断片、好ましくはそれぞれｍＳＯＤ１の異なる結合部位及びｍＳＯＤ１の異なるエピトープに結合する抗体であり得る。上述したように、リガンドは、直接検出することができる標識、例えば蛍光標識であるか、又はリガンドは、直接検出可能な標識を含むリガンド結合パートナーによって結合される標識を含む。好ましい実施形態では、第２の抗体は、ビオチン化され、すなわちビオチン又はビオチン類似体若しくはその誘導体にコンジュゲートされる。
【0053】
混合物を、さらなる抗体－抗原複合体の形成を可能にする、すなわちサンプル中に存在する場合、ｍＳＯＤ１への第２の抗ＳＯＤ１抗体の結合を可能にする条件下においてウェル中でインキュベートする。条件は、両方の抗体、すなわち第１及び第２の抗体がｍＳＯＤ１に結合できるように選択されなければならない。上述したように、適切な条件は、陽性対照で試験することができる。好ましい実施形態では、インキュベーションは、好ましくは、６００ｒｐｍに設定されたプレートシェーカー上で室温において３０分間にわたって行われる。好ましい実施形態では、プレートは、過剰な検出抗体を除去するために後に洗浄される。
【0054】
サンプル及び第２の抗体を、第１の抗体で被覆されたマイクロプレートに同時に添加することもでき、インキュベーションを実施して、第１の抗ＳＯＤ１抗体のｍＳＯＤ１及び第２の抗ＳＯＤ１抗体のｍＳＯＤ１への結合を可能にすることができる。
【0055】
第２の抗体が検出可能な標識、例えば蛍光標識又は酵素で直接標識される場合、適切な基質溶液が添加される。
【0056】
間接標識が適用される場合、リガンド結合パートナー及び検出可能な標識を含むコンジュゲートが添加される。コンジュゲートとのサンプルのインキュベーションは、好ましくは、６００ｒｐｍに設定されたプレートシェーカー上で好ましくは室温においてさらに３０分間実施される。コンジュゲートに含まれるリガンド結合パートナーは、例えば、ストレプトアビジン若しくはアビジン又はその機能的類似体若しくは誘導体であり得る。好ましい実施形態では、リガンド結合パートナーは、ストレプトアビジン又はその機能的類似体若しくは誘導体である。コンジュゲートに含まれる検出可能な標識は、上述したような任意の検出可能な標識であり得るが、好ましくは発色／蛍光又は化学発光基質の変換を触媒することができる酵素である。より好ましくは、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。したがって、コンジュゲートは、ストレプトアビジン－ＨＲＰ試薬である。好ましくは、洗浄工程が実施され、その後、適切な基質溶液、好ましくは発色又は化学発光基質溶液が添加される。好ましい実施形態では、ＴＭＢ、ルミノール又は基質を含むルミノールが使用される。
【0057】
混合物に由来するシグナルが画像化される。原則として、特に、高感度で蛍光又は化学発光シグナルを検出及び測定することができる全ての市販の画像化システムを使用することができる。好ましくは、画像化は、Ｃｉｒａｓｃａｎ（商標）画像化システムを用いて行われる。
【0058】
各ウェルからのシグナルを検出及び測定し、対照と比較する。好ましくは、対照は、同じマイクロプレート内の別個のウェルでアッセイされる。
【0059】
対照は、参照標準、すなわちｍＳＯＤ１であり得る。代わりに又はさらに、第２の対照として、神経変性疾患を有さない対照対象のサンプルが使用され、サンプル中のｍＳＯＤ１のレベルと対照との差は、診断される対象が神経変性疾患を有することを示す。特に、前記対照サンプルと比較したサンプル中のｍＳＯＤ１の高いレベルは、疾患、特にＡＬＳを示す。好ましくは、診断される対象及び対照対象は、年齢が一致する。
【0060】
一実施形態では、標準は、２００ｎｇ／ｍＬ～３ｐｇ／ｍＬのミスフォールドＳＯＤ１の段階希釈を含む。
【0061】
一実施形態では、マイクロプレートは、蓋、好ましくはインキュベーション工程中のサンプルの蒸発を回避するために、流体で充填された流体吸収マトリックスを有する蓋で覆われる。上述の洗浄工程は、表面への第１の抗体の結合、ｍＳＯＤ１への第１及び第２の抗体の結合並びに第２の抗体へのコンジュゲートの結合を破壊しない任意の適切な緩衝液を用いて行うことができる。好ましくは、洗浄は、実施例に記載されるように、キットに提供されるＡｕｓｈｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの洗浄緩衝液を用いて実施される。上述のように、インキュベーションは、ｍＳＯＤ１への抗体の結合及び第２の抗体のリガンドへのコンジュゲートの結合を可能にするために、アッセイの異なる工程間で実施される。当然のことながら、抗体及びコンジュゲートの結合が保証される限り、異なるインキュベーション時間を選択することができる。
【0062】
別の実施形態では、本発明の方法は、デジタルＥＬＩＳＡとしても知られる単一分子アレイ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｒｒａｙｓ）（Ｓｉｍｏａ（商標））を使用する。このアプローチでは、標的タンパク質を抗体被覆常磁性ビーズ上に捕捉し、捕捉されたタンパク質を酵素標識で標識し、単一ビーズを単離し、酵素基質の存在下でフェムトリットルウェルのアレイ中に密封する。密封工程は、酵素－基質反応の蛍光生成物を約４０ｆＬの体積に閉じ込め、３０秒以内に、単一の酵素によって生成された蛍光を、白色光励起源を用いた非冷却ＣＣＤカメラ上で検出することができ；本明細書に引用した参考文献、例えばＲｉｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｄｉｇｉｔａｌ ＥＬＩＳＡ．Ｉｎ：Ｗｉｌｄ，Ｄ．（Ｅｄ．），Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ，ＥＬＩＳＡ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４ｔｈ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ及びＲｉｖｎａｋ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｆｕｌｌｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ，ｓｉｘ－ｐｌｅｘ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１５；４２４：２０を含むＱｕａｎｔｅｒｉｘ Ｗｈｉｔｅｐａｐｅｒ ６．０（２０１５）を参照されたい。例えば、捕捉ビーズ、好ましくは約２．７μＭの直径を有する常磁性ビーズであって、その表面に上記で定義した第１の抗体又はその結合断片が付着している常磁性ビーズを本発明の方法に使用することができ；実施例３を参照されたい。このようなビーズの使用により、単一分子レベルでのｍＳＯＤ１の検出が可能となる。上記で定義した体液を含むサンプルを捕捉ビーズに添加し、インキュベーションを行い、体液中に存在する場合、第１の抗ＳＯＤ１抗体によって媒介されるビーズによるｍＳＯＤ１の捕捉を可能にする。上述のように、インキュベーション条件は、変化し得、最適条件は陽性対照で試験され得る。好ましくは、インキュベーション時間は、３０分である。その後、上記で定義したリガンドにコンジュゲートされている第２の抗ＳＯＤ１抗体を添加し、インキュベーションを行い、ビーズ上の捕捉されたミスフォールドＳＯＤ１への第２の抗ＳＯＤ１抗体の結合を可能にする。好ましくは、インキュベーションは、５分間にわたって行われる。代わりに、サンプル及び第２の抗体を捕捉ビーズに添加し、インキュベーションを行い、第１の抗ＳＯＤ１抗体によって媒介されるビーズによる体液中に存在するミスフォールドＳＯＤ１の捕捉及びビーズ上の捕捉されたミスフォールドＳＯＤ１への第２の抗ＳＯＤ１抗体の結合を可能にするという点で上記の２つの工程を組み合わせることができる。インキュベーション時間は、好ましくは、両方の工程を組み合わせる場合、好ましくは３５分に増加される。第２の抗体が検出可能な標識で直接的に標識されないが、リガンドで標識される場合、リガンド結合パートナー及び検出可能な標識を含む上記で定義されたコンジュゲートが添加され、好ましくは、リガンド結合パートナーは、ストレプトアビジン又はその機能的類似体若しくは誘導体であり、検出可能な標識は、発色又は蛍光基質を発生させることができる酵素であり、好ましくは、酵素は、β－ガラクトシダーゼである。インキュベーションは、好ましくは、５分間にわたって行われる。また、上述のように、ビーズが再懸濁される、上記に定義した蛍光基質溶液が添加される。好ましくは、基質は、レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＲＧＰ）である。次の工程では、ビーズが１ウェル当たり１つ以下のビーズを保持するように構成されたマイクロプレートのフェムトリットルサイズのウェルに装填される。好ましくは、ウェルは、約４．２５μｍの幅及び約３．２５μｍの深さを有する。好ましくは油によるウェルの密封及び蛍光シグナルの画像化が行われる。原則として、高感度でシグナルを検出する全ての市販の画像化システムを使用することができる。このアッセイは、市販のＱｕａｎｔｅｒｉｘからのＳｉｍｏａ（登録商標）アッセイに基づき、したがって試薬及びＳｉｍｏａ（商標）光学システムが前記イムノアッセイに使用される。既に上述したように、洗浄工程は、アッセイの異なる工程間で実施され得る。
【0063】
したがって、本発明の方法の一実施形態では、第２の抗ＳＯＤ１抗体は、リガンドにコンジュゲートされ、方法は、リガンド結合タグを用いた標識工程を含み、好ましくは、方法は、単一分子アレイ（Ｓｉｍｏａ（商標））アッセイを使用し、任意選択的に、以下の工程の１つ以上、好ましくは全部を含む：
（ｉ）捕捉ビーズの表面に第１の抗ＳＯＤ１抗体を付着させる工程であって、好ましくは、ビーズは、常磁性ビーズであり、且つ／又は約２．７μＭの直径を有する、工程；及び
（ｉｉ）（ａ）体液、好ましくはＣＳＦを含むサンプルを添加し、且つサンプルと共にビーズをインキュベートし、それにより、第１の抗ＳＯＤ１抗体によって媒介されるビーズによる、体液中に存在するミスフォールドＳＯＤ１の捕捉を可能にする工程であって、好ましくは、インキュベーション時間は、３０分である、工程；及び
（ｉｉ）（ｂ）リガンド、好ましくはビオチン又はビオチン類似体若しくはその誘導体にコンジュゲートされている第２の抗ＳＯＤ１抗体を添加し、且つインキュベートし、それにより、ビーズ上の捕捉されたミスフォールドＳＯＤ１への第２の抗ＳＯＤ１抗体の結合を可能にする工程であって、好ましくは、インキュベーション時間は、５分である、工程；及び
（ｉｉ）（ｃ）リガンド結合タグ、好ましくはストレプトアビジン又はその機能的類似体若しくは誘導体と、検出可能な標識、好ましくは発色基質又は蛍光分子を発生させることができる酵素とを含むコンジュゲートを添加することであって、好ましくは、酵素は、β－ガラクトシダーゼ（ストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼ（ＳβＧ）コンジュゲート）である、添加することと、インキュベートすることであって、好ましくは、インキュベーション時間は、５分である、インキュベートすることとを行う工程；又は
（ＩＩ）（Ａ）体液、好ましくはＣＳＦを含むサンプルを添加し、リガンド、好ましくはビオチン又はビオチン類似体又はその誘導体にコンジュゲートされている第２の抗ＳＯＤ１抗体を添加し、且つサンプル及び第２の抗体と共にビーズのインキュベートし、それにより、第１の抗ＳＯＤ１抗体によって媒介されるビーズによる、体液中に存在するミスフォールドＳＯＤ１の捕捉と、ビーズ上の捕捉されたミスフォールドＳＯＤ１への第２の抗ＳＯＤ１抗体の結合とを可能にする工程であって、好ましくは、インキュベーション時間は、３５分である、工程；及び
（ＩＩ）（Ｂ）リガンド結合タグ、好ましくはストレプトアビジン又はその機能的類似体若しくは誘導体及び検出可能な標識、好ましくは発色基質又は蛍光分子を発生させることができる酵素を含むコンジュゲートを添加することであって、好ましくは、酵素は、β－ガラクトシダーゼ（ストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼ（ＳβＧ）コンジュゲート）である、添加することと、インキュベートすることであって、好ましくは、インキュベーション時間は、５分である、インキュベートすることとを行う工程；及び
（ｉｉｉ）蛍光基質溶液中にビーズを再懸濁させる工程であって、好ましくは、蛍光基質は、レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＲＧＰ）である、工程；及び
（ｉｖ）１ウェル当たり１つ以下のビーズを保持するように構成されたフェムトリットルサイズのウェルのアレイに工程（ｉｉｉ）のビーズを装填する工程；及び
（ｖ）フェムトリットルサイズのウェル内に個々のビーズを密封する工程であって、好ましくは、密封は、油で行われる、工程；及び
（ｖｉ）蛍光シグナルを画像化する工程であって、好ましくは、画像化は、Ｓｉｍｏａ（商標）光学システムによって行われる、工程；任意選択的に、
（ｖｉｉ）アッセイされたミスフォールドＳＯＤ１のレベルを参照標準及び／又は対照と比較する工程。
（ｉ）捕捉ビーズの表面に第１の抗ＳＯＤ１抗体を付着させる工程であって、好ましくは、ビーズは、常磁性ビーズであり、且つ／又は約２．７μＭの直径を有する、工程；及び
（ｉｉ）（ａ）体液、好ましくはＣＳＦを含むサンプルを添加し、且つサンプルと共にビーズをインキュベートし、それにより、第１の抗ＳＯＤ１抗体によって媒介されるビーズによる、体液中に存在するミスフォールドＳＯＤ１の捕捉を可能にする工程であって、好ましくは、インキュベーション時間は、３０分である、工程；及び
（ｉｉ）（ｂ）リガンド、好ましくはビオチン又はビオチン類似体若しくはその誘導体にコンジュゲートされている第２の抗ＳＯＤ１抗体を添加し、且つインキュベートし、それにより、ビーズ上の捕捉されたミスフォールドＳＯＤ１への第２の抗ＳＯＤ１抗体の結合を可能にする工程であって、好ましくは、インキュベーション時間は、５分である、工程；及び
（ｉｉ）（ｃ）リガンド結合タグ、好ましくはストレプトアビジン又はその機能的類似体若しくは誘導体と、検出可能な標識、好ましくは発色基質又は蛍光分子を発生させることができる酵素とを含むコンジュゲートを添加することであって、好ましくは、酵素は、β－ガラクトシダーゼ（ストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼ（ＳβＧ）コンジュゲート）である、添加することと、インキュベートすることであって、好ましくは、インキュベーション時間は、５分である、インキュベートすることとを行う工程；又は
（ＩＩ）（Ａ）体液、好ましくはＣＳＦを含むサンプルを添加し、リガンド、好ましくはビオチン又はビオチン類似体又はその誘導体にコンジュゲートされている第２の抗ＳＯＤ１抗体を添加し、且つサンプル及び第２の抗体と共にビーズのインキュベートし、それにより、第１の抗ＳＯＤ１抗体によって媒介されるビーズによる、体液中に存在するミスフォールドＳＯＤ１の捕捉と、ビーズ上の捕捉されたミスフォールドＳＯＤ１への第２の抗ＳＯＤ１抗体の結合とを可能にする工程であって、好ましくは、インキュベーション時間は、３５分である、工程；及び
（ＩＩ）（Ｂ）リガンド結合タグ、好ましくはストレプトアビジン又はその機能的類似体若しくは誘導体及び検出可能な標識、好ましくは発色基質又は蛍光分子を発生させることができる酵素を含むコンジュゲートを添加することであって、好ましくは、酵素は、β－ガラクトシダーゼ（ストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼ（ＳβＧ）コンジュゲート）である、添加することと、インキュベートすることであって、好ましくは、インキュベーション時間は、５分である、インキュベートすることとを行う工程；及び
（ｉｉｉ）蛍光基質溶液中にビーズを再懸濁させる工程であって、好ましくは、蛍光基質は、レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＲＧＰ）である、工程；及び
（ｉｖ）１ウェル当たり１つ以下のビーズを保持するように構成されたフェムトリットルサイズのウェルのアレイに工程（ｉｉｉ）のビーズを装填する工程；及び
（ｖ）フェムトリットルサイズのウェル内に個々のビーズを密封する工程であって、好ましくは、密封は、油で行われる、工程；及び
（ｖｉ）蛍光シグナルを画像化する工程であって、好ましくは、画像化は、Ｓｉｍｏａ（商標）光学システムによって行われる、工程；任意選択的に、
（ｖｉｉ）アッセイされたミスフォールドＳＯＤ１のレベルを参照標準及び／又は対照と比較する工程。
【0064】
工程（ｉｉ）（ａ）、（ｉｉ）（ｂ）及び（ｉｉ）（ｃ）は、「３段階アプローチ」を指し、工程（ＩＩ）（ａ）及び（ＩＩ）（ｂ）は、「２段階アプローチ」を指す。
【0065】
上述のように、対照は、参照標準、すなわちｍＳＯＤ１であり得る。代わりに又はさらに、神経変性疾患を有さない対照対象のサンプルが第２の対照として使用され、サンプル中のｍＳＯＤ１のレベルと対照との差は、診断される対象が神経変性疾患を有することを示す。特に、前記対照サンプルと比較したサンプル中のｍＳＯＤ１の高いレベルは、疾患、特にＡＬＳを示す。好ましくは、診断される対象及び対照対象は、年齢が一致する。
【0066】
一実施形態において、標準は、約１０００ｎｇ／ｍＬから８点検量線への４倍段階希釈による０．２４４ｎｇ／ｍＬまで、１０ｎｇ／ｍＬから８点検量線への２倍段階希釈による０．０２０ｎｇ／ｍＬまで、５０ｎｇ／ｍＬから１２点検量線への２倍段階希釈による０．０１２ｎｇ／ｍＬまで及び／又は約６６．６６６６７ｎｇ／ｍＬから１２点検量線への３倍段階希釈による０．００３３９ｎｇ／ｍＬまでの、ミスフォールドＳＯＤ１の段階希釈を含む。
【0067】
本発明による方法は、対象のＣＳＦ中の最小量のｍＳＯＤ１の検出を可能にする高い感度である。高い感度は、特に、第１の捕捉抗体として本発明の方法で使用される抗体に起因し得る。アッセイに応じて、ｍＳＯＤ１は、許容される精度で６～７ｐｇ／ｍＬまで検出することができる。Ａｕｓｈｏｎ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓの試薬及び機器を用いたアッセイに関して、１０．１６ｐｇ／ｍＬ～７４０４．４１ｐｇ／ｍＬのｍＳＯＤ１範囲内でより精密な結果が得られ、１：２のＭＲＤ（最小必要希釈）後に２０．３２～１４８１４．８２ｐｇ／ｍＬの報告可能な範囲をもたらした。Ｑｕａｎｔｅｒｉｘからの試薬及び機器を用いたアッセイに関して、アッセイは、２×アッセイバックグラウンド法に基づいて、６ｐｇ／ｍＬ～３２ｐｇ／ｍＬの範囲のＬＬＯＤ及び５８ｐｇ／ｍＬ～１３２ｐｇ／ｍＬの範囲のＬＬＯＱを有することが示されており、ＬＬＯＤは、実施例３に記載されるように使用される捕捉抗体に応じてそれぞれ１０．８～１３．６ｐｇ／ｍＬの範囲である。
【0068】
したがって、本発明の方法は、好ましくは、約≦２０．３２ｐｇ／ｍＬのｍＳＯＤ１についての定量下限（ＬＬＯＱ）及び約７ｐｇ／ｍＬの検出下限（ＬＬＯＤ）又は約５８ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＱ及び約６若しくは１０ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＤを有する。
【0069】
本発明の方法に従って使用され得るさらなる単一分子感知プラットフォームは、当業者に公知であり、低バックグラウンドノイズ蛍光顕微鏡法並びにプラズモン及び電気ナノトランスデューサなど開発中であり；総説については、例えば、Ｍａｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１２（２０２０），５００５－５０１４を参照されたい。
【0070】
アクセス可能な流体をアッセイする能力及び複数の研究において確認されるバイオマーカーを有することの要望を考慮すると、これは、当然のことながら、任意の所与の患者における疾患進行の全体像を得るため及び本発明のイムノアッセイをＡＬＳの他のバイオマーカー候補分子の評価と組み合わせるための有用なアプローチであろう。例えば、前出のＶｉｊａｙａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）は、その表２に列挙したものからバイオマーカー候補分子を組み合わせることを示唆している（全てニューロン生存を反映するシスタチンＣ、ｐＮＦＨ及びＮＦＬ、炎症誘発マーカーとしてのＭＣＰ１、それぞれ筋肉起源及び神経筋接合部を反映するＭｉＲ ２０６及び１３３ｂ並びに代謝異常のいくつかの指標、例えばホモシステイン、グルタミン酸塩又はコレステロール）。好ましくは、本発明のイムノアッセイは、前出のＶｕ ａｎｄ Ｂｏｗｓｅｒ（２０１７）に開示されている表１～５に列挙されているＡＬＳについての１つ以上のバイオマーカー、流体ベースのバイオマーカーの評価と組み合わされる。したがって、本発明のイムノアッセイは、診断目的及び予後又は予測用途のための異種マルチバイオマーカーパネルの開発を促進することができる。
【0071】
本発明は、本発明の方法に従ってＡＬＳに罹患しているか又はＡＬＳを発症する危険性があると診断された患者の症状の治療又は改善に使用するための治療剤も包含する。好ましい実施形態では、患者は、検出可能な量のｍＳＯＤ１を有するとアッセイされている。好ましくは、患者は、対照と比較した場合、ｍＳＯＤ１の増加したレベルを示す。対照は、好ましくは、診断される患者に年齢が一致する健康な対象であり得る。
【0072】
患者は、好ましい実施形態において、少なくとも５ｐｇ／ｍＬより高い、好ましくは６又は７ｐｇ／ｍＬより高い、より好ましくは１０ｐｇ／ｍＬより高い、より好ましくは２０ｐｇ／ｍＬより高い、最も好ましくは２０．３２ｐｇ／ｍＬ又は５８ｐｇ／ｍＬより高いｍＳＯＤ１のレベルを有する。
【0073】
一実施形態において、治療剤は、抗ＳＯＤ１抗体、好ましくは国際公開第２０１２／０８０５１８ Ａ１号パンフレットに開示された抗体、好ましくは抗体ＮＩ－２０４．１２Ｇ７又は国際公開第２０１６／１２０８１０号パンフレットに開示された抗体である。別の実施形態では、治療剤は、ＳＯＤ１のレベルを低下させる薬剤、例えばピリメタミン（Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．８１（２０１７），８３７－８４８）、遺伝子サイレンシングに使用される薬剤、例えばモルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯ）又はラパマイシンのような非特異的治療のための薬剤である。治療剤は、遺伝子治療アプローチに使用される薬剤であり得る。好ましい実施形態では、治療剤は、Ｒｉｌｕｔｅｋ（リルゾール）又はＲａｄｉｃａｖａ（エダバロン（ｅｄａｖａｒｏｎｅ））であり、これらは、両方ともＡＬＳの治療のために米国食品医薬品局によって承認されている。さらに、治療剤は、ＡＬＳの特定の症状のいくつかを目的とする薬剤、例えば鎮痛剤又は筋弛緩剤であり得る。したがって、治療剤は、好ましくは、痙攣を緩和するのに役立ち得るバクロフェン（Ｇａｂｌｏｆｅｎ、Ｋｅｍｓｔｒｏ、Ｌｉｏｒｅｓａｌ）又はジアゼパム（Ｄｉａｓｔａｔ、Ｖａｌｉｕｍ）である。嚥下困難による口腔内の唾液の貯留もＡＬＳの症状であり、本発明による治療剤である異なる薬剤で治療することができる。好ましくは、治療剤は、Ｅｌａｖｉｌ（アミトリプチリン）、トリヘキシフェニジル、Ｓｃｏｐａｄｅｒｍ（スコポラミンパッチ）又はＲｏｂｉｎｕｌ（グリコピロレート）である。
【0074】
本発明は、本発明の方法を実施するように適合されたキットも包含する。したがって、キットは、本発明の方法を実施するために必要とされる構成要素、好ましくは本発明の方法の好ましい実施形態の構成要素を含む。
【0075】
一実施形態では、キットは、好ましくは、実施例１及び２に例示されるＡｕｓｈｏｎ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＣｉｒａｐｌｅｘ（商標）Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙなどのシングルプレックスサンドイッチＥＬＩＳＡを使用する本発明の方法での使用に適しており、好ましくは上記で定義した蓋を含む、上記で定義したように第１の抗ＳＯＤ１抗体がウェルに予めスポットされているマイクロプレートを少なくとも含む。キットは、上記で定義した第２の抗ＳＯＤ１抗体を含む検出試薬をさらに含む。加えて又は代わりに、キットは、上記で定義したリガンド結合パートナー及び検出可能な標識を含むコンジュゲート、好ましくは発色若しくは化学発光基質の変換を触媒することができる酵素、適切な基質溶液、ｍＳＯＤ１の較正されたイムノアッセイ標準若しくは対照、緩衝液、希釈剤、基質及び／若しくは溶液の推奨、並びに本発明のアッセイを実施する方法の説明書、並びに／又は本発明の方法を妨害せず、抗体がそれらの活性形態を保つことを可能にする免疫ベースの診断アッセイに適切な洗浄及びアッセイ／サンプル希釈緩衝液を含む。
【0076】
別の実施形態では、キットは、好ましくは、実施例３に例示されるようなＳｉｍｏａ（商標）アッセイを使用する本発明の方法での使用に適しており、上記に定義した第１の抗ＳＯＤ１抗体を含む捕捉試薬と、上記に定義した第２の抗ＳＯＤ１抗体を含む検出試薬とを含む。任意選択的な実施形態では、キットは、ビーズ及び適切なフェムトリットルサイズのマイクロプレートを含む。加えて又は代わりに、キットは、上記で定義したリガンド結合パートナー及び検出可能な標識、好ましくは蛍光基質の変換を触媒することができる酵素を含むコンジュゲート、適切な基質溶液、ｍＳＯＤ１の較正されたイムノアッセイ標準若しくは対照、マイクロプレート、緩衝液、希釈剤、基質及び／若しくは溶液の推奨、並びに本発明のアッセイを実施する方法の説明書、並びに／又は本発明の方法を妨害せず、抗体がそれらの活性形態を保つことを可能にする免疫ベースの診断アッセイに適切な洗浄及びアッセイ／サンプル希釈緩衝液を含む。
【0077】
本明細書の本文を通していくつかの文献が引用される。引用された全ての参考文献（背景セクション及び製造業者の仕様、説明書などを含む、本出願全体を通して引用された文献参照、発行された特許、公開特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれるが；引用されたいかなる文献も本発明に関して実際に先行技術であることを認めるものではない。
【0078】
以下の特定の実施例を参照することにより、より詳細な理解を得ることができ、これらの実施例は、例示のみを目的として本明細書に提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【0079】
実施例１：ｍＳＯＤ１に特異的なイムノアッセイの確立及び検証
ＣＳＦ中のｍＳＯＤ１の定量測定のために、シングルプレックスサンドイッチＥＬＩＳＡであるＡｕｓｈｏｎ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ製のＣｉｒａｐｌｅｘ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍＳＯＤ１ １－ｐｌｅｘイムノアッセイキットを用いた。
ＣＳＦ中のｍＳＯＤ１の定量測定のために、シングルプレックスサンドイッチＥＬＩＳＡであるＡｕｓｈｏｎ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ製のＣｉｒａｐｌｅｘ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍＳＯＤ１ １－ｐｌｅｘイムノアッセイキットを用いた。
【0080】
試験の原理：
９６ウェルマイクロプレートの各ウェルは、ヒトＳＯＤ１のアミノ酸配列７３－ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧＤ－８４（配列番号１１）内のエピトープ、特にアミノ酸配列７３－ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧ－８３（配列番号１２）を含むエピトープにおいてｍＳＯＤ１を特異的に認識し、目的のサンプルからｍＳＯＤ１を捕捉するモノクローナル抗体である捕捉抗体ＮＩ－２０４．Ｂを用いて、Ａｕｓｈｏｎ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓによって予めスポットされている。結合していないタンパク質を洗い流した後、Ａｂｃａｍからａｂ１８５１２５又はａｂ７９３９０として入手可能なビオチン化ＳＯＤ１ウサギモノクローナル検出抗体ＥＰＲ１７２６を添加し、これをｍＳＯＤ１上の二次部位に結合させた（この場合、ａｂ１８５１２５を使用した）。過剰な検出抗体を除去した後、ストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ－ＨＲＰ）を添加した。ＨＲＰは、基質と反応して、Ｃｉｒａｓｃａｎ（商標）画像化システムによって検出される発光シグナルを生成する酵素である。生成されるシグナルの強度は、標準又は目的のサンプル中の各タンパク質の量に正比例する。強度は、積分密度値（ＩＤＶ）で表され、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏにエクスポートされ、ここで、重み付けされた５パラメータアルゴリズムは、対応する標準曲線から補間された結果を使用して未知のサンプルを逆計算するために使用される。
９６ウェルマイクロプレートの各ウェルは、ヒトＳＯＤ１のアミノ酸配列７３－ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧＤ－８４（配列番号１１）内のエピトープ、特にアミノ酸配列７３－ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧ－８３（配列番号１２）を含むエピトープにおいてｍＳＯＤ１を特異的に認識し、目的のサンプルからｍＳＯＤ１を捕捉するモノクローナル抗体である捕捉抗体ＮＩ－２０４．Ｂを用いて、Ａｕｓｈｏｎ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓによって予めスポットされている。結合していないタンパク質を洗い流した後、Ａｂｃａｍからａｂ１８５１２５又はａｂ７９３９０として入手可能なビオチン化ＳＯＤ１ウサギモノクローナル検出抗体ＥＰＲ１７２６を添加し、これをｍＳＯＤ１上の二次部位に結合させた（この場合、ａｂ１８５１２５を使用した）。過剰な検出抗体を除去した後、ストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ－ＨＲＰ）を添加した。ＨＲＰは、基質と反応して、Ｃｉｒａｓｃａｎ（商標）画像化システムによって検出される発光シグナルを生成する酵素である。生成されるシグナルの強度は、標準又は目的のサンプル中の各タンパク質の量に正比例する。強度は、積分密度値（ＩＤＶ）で表され、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏにエクスポートされ、ここで、重み付けされた５パラメータアルゴリズムは、対応する標準曲線から補間された結果を使用して未知のサンプルを逆計算するために使用される。
【0081】
特に、アッセイは、以下のように行った：－７０℃で保存した２０μｇ／ｍＬ ｍＳＯＤ１（安定化剤（ｓｔａｂｉｌｚｙｍｅ）／プロテアーゼ阻害剤カクテルで希釈したｍＳＯＤ１溶液）の原液を解凍した。さらに、全てのアッセイ構成要素を冷蔵庫／冷凍庫から取り出し、使用前に室温で３０～６０分間保管した。１×洗浄緩衝液は、ボトル全体（５０ｍＬ）を１２００ｍＬの脱イオン水に添加することによって調製した。
【0082】
インキュベーション工程中、９６ウェルマイクロプレートの上にＭｉｃｒｏＣｌｉｍｅ（登録商標）Ｌｉｄを配置した。使用前にそれを脱イオン（ＤＩ）水で満たした。このために、蓋を充填材料から取り外し、充填トラフ（蓋の縁の周りの溝）及び角が上を向くように配置した。シリンジ又はマルチチャネルピペットを用いて、４ｍＬのＤＩ水を、蓋の長い縁部の上部の充填トラフにゆっくりと分注した。これを、長い縁部の底部の充填トラフに繰り返し、その結果、蓋は、合計８ｍＬのＤＩ水を含有した。キムワイプを使用して、トラフから過剰な水を除去した。インキュベーション工程の準備ができたら、蓋を裏返し、９６ウェルマイクロプレートの上に置いた。
【0083】
標準はストックを解凍し、サンプル希釈剤で１：１００に希釈することによって調製した。１：１００標準をサンプル希釈剤でさらに１：３に希釈して、トップ標準を受け取った。トップ標準をさらに１：３に希釈して、合計１１の非ゼロ標準を得た。ゼロ標準は、標準希釈剤のみであった。サンプル及び対照をサンプル希釈液で３倍に希釈した。
【0084】
ｍＳＯＤ１－マイクロプレートをパウチから取り出し、Ｉｍｍｕｎｏ Ｗａｓｈ １２手動洗浄器を使用して、≧３００μＬの１×洗浄緩衝液で６回洗浄した。その後、プレートを吸収紙上で確実にパットドライした。標準５０μＬ、希釈した対照及び希釈したサンプルを複製した適切なウェルに添加し、プレートをＭｉｃｒｏＣｌｉｍｅ（登録商標）Ｌｉｄで覆い、６００ｒｐｍに設定したプレートシェーカー上で２時間室温においてインキュベートした。プレートを、Ｉｍｍｕｎｏ Ｗａｓｈ １２手動洗浄器を使用して、≧３００μＬの１×洗浄緩衝液で４回洗浄した。その後、プレートを吸収紙上で確実にパットドライした。各ウェルに、ＩｇＧスパイクしたビオチン化抗体試薬５０μＬを添加し、そのプレートをＭｉｃｒｏＣｌｉｍｅ（登録商標）Ｌｉｄで覆い、６００ｒｐｍに設定したプレートシェーカー上で３０分間室温においてインキュベートした。その後、プレートを、Ｉｍｍｕｎｏ Ｗａｓｈ １２手動洗浄機を使用して≧３００μＬの１×洗浄緩衝液で４回洗浄し、吸収紙上でパットドライした。５０μＬのストレプトアビジン－ＨＲＰ試薬を各ウェルに添加し、プレートをＭｉｃｒｏＣｌｉｍｅ（登録商標）Ｌｉｄで覆い、６００ｒｐｍに設定したプレートシェーカー上で３０分間室温においてインキュベートした。その後、プレートを、Ｉｍｍｕｎｏ Ｗａｓｈ １２手動洗浄機を使用して≧３００μＬの１×洗浄緩衝液で４回洗浄し、吸収紙上でパットドライした。
【0085】
ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）基質溶液を調製したが、使用前１５分以下であり、好ましくは最後の洗浄工程の直前であった。５０μＬの混合ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）基質溶液を各ウェルに添加し、プレートをＡｕｓｈｏｎ Ｃｉｒａｓｃａｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ上で２～４分以内に読み取り、それにより各プレートの短時間及び長時間の露光時間を記録した。Ｃｉｒａｓｏｆｔからの積分密度値（ＩＤＶ）を転送し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを介して処理し、重み付き５パラメータロジスティック曲線適合を用いて結果を定量した。
【0086】
このアッセイを使用して、ｍＳＯＤ１は、許容可能な精度で７．０１ｐｇ／ｍＬ及び６ｐｇ／ｍＬに定量化することができた。１０．１６ｐｇ／ｍＬ～７４０４．４１ｐｇ／ｍＬのｍＳＯＤ１範囲内でさらにより精密な結果を得ることができ、ＣＳＦサンプルの１：２ ＭＲＤ（最小必要希釈）後に２０．３２～１４８１４．８２ｐｇ／ｍＬの報告可能な範囲をもたらした。したがって、アッセイは、ｍＳＯＤ１の定量下限（ＬＬＯＱ）が約≦２０．３２ｐｇ／ｍＬであり、検出下限（ＬＬＯＤ）が約７ｐｇ／ｍＬである。
【0087】
実施例２：ｆＡＬＳ及びｓＡＬＳ患者からのＣＳＦサンプル中のｍＳＯＤ１の検出
上述のアッセイパラメータを用いて、ＣＳＦサンプルを分析した。特に、異なるＳＯＤ１突然変異を有する１０人のｆＡＬＳ患者、６人のｓＡＬＳ患者及び１０人の非神経学的対照（ＮＮＣ）参加者のＣＳＦサンプルをｍＳＯＤ１についてスクリーニングした。図１Ａ、Ｂ及びＣを参照されたい。これらの対照参加者は、神経学的障害を有さないが、他の疾患を有し得る。図１Ｄ及びＥに示すように、大部分のｆＡＬＳ及びｓＡＬＳ患者のＣＳＦ中にｍＳＯＤ１が検出され、すなわち、ｆＡＬＳ及びｓＡＬＳ患者のＣＳＦ中に検出されたｍＳＯＤ１の量は、対照患者のＣＳＦ中のｍＳＤＯ１の量よりも多かった。
上述のアッセイパラメータを用いて、ＣＳＦサンプルを分析した。特に、異なるＳＯＤ１突然変異を有する１０人のｆＡＬＳ患者、６人のｓＡＬＳ患者及び１０人の非神経学的対照（ＮＮＣ）参加者のＣＳＦサンプルをｍＳＯＤ１についてスクリーニングした。図１Ａ、Ｂ及びＣを参照されたい。これらの対照参加者は、神経学的障害を有さないが、他の疾患を有し得る。図１Ｄ及びＥに示すように、大部分のｆＡＬＳ及びｓＡＬＳ患者のＣＳＦ中にｍＳＯＤ１が検出され、すなわち、ｆＡＬＳ及びｓＡＬＳ患者のＣＳＦ中に検出されたｍＳＯＤ１の量は、対照患者のＣＳＦ中のｍＳＤＯ１の量よりも多かった。
【0088】
実施例３：ｍＳＯＤ１に特異的な単一分子アレイ（Ｓｉｍｏａ（商標））アッセイの確立及び検証
この実験では、対象の体液中のｍＳＯＤ１の測定は、Ｓｉｍｏａ（商標）アッセイ及び捕捉抗体として抗体ＮＩ－２０４．Ｂを使用した。上記で説明したように、３段階アプローチ（３０分捕捉、５分検出、５分酵素コンジュゲート）及びＱｕａｎｔｅｒｉｘ Ｈｏｍｅｂｒｅｗ Ｋｉｔを適用することにより、Ｓｉｍｏａ（商標）アッセイを行った。サンプル容量は、１００μｌであった。捕捉及び検出抗体並びにミスフォールドＳＯＤの抗原ストック（６６７ｇ／ｍＬ）を試薬調製前に４℃で保存した。検出抗体は、市販されている（Ａｂｃａｍ ａｂ１８５１２５）。ＣＳＦサンプルは、分析まで－８０℃に保った。
この実験では、対象の体液中のｍＳＯＤ１の測定は、Ｓｉｍｏａ（商標）アッセイ及び捕捉抗体として抗体ＮＩ－２０４．Ｂを使用した。上記で説明したように、３段階アプローチ（３０分捕捉、５分検出、５分酵素コンジュゲート）及びＱｕａｎｔｅｒｉｘ Ｈｏｍｅｂｒｅｗ Ｋｉｔを適用することにより、Ｓｉｍｏａ（商標）アッセイを行った。サンプル容量は、１００μｌであった。捕捉及び検出抗体並びにミスフォールドＳＯＤの抗原ストック（６６７ｇ／ｍＬ）を試薬調製前に４℃で保存した。検出抗体は、市販されている（Ａｂｃａｍ ａｂ１８５１２５）。ＣＳＦサンプルは、分析まで－８０℃に保った。
【0089】
まず、常磁性ビーズ（直径２．７μｍ）の表面を第１の抗ｍＳＯＤ１抗体（捕捉抗体）で被覆した。ビーズは、典型的には、約２５０，０００個の付着部位を含む。特に、捕捉抗体を標準的なＱｕａｎｔｅｒｉｘ Ｈｏｍｅｂｒｅｗアッセイプロトコルに従って処理した。捕捉抗体を、０．７ｍｇ／ｍＬの抗体濃度及び０．５ｍｇ／ｍＬのＥＤＣで標準的な２段階１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）カップリング化学を用いて磁気ビーズにコンジュゲートした。
【0090】
第２の抗ｍＳＯＤ１抗体（検出抗体）を、標準的なＱｕａｎｔｅｒｉｘ Ｈｏｍｅｂｒｅｗビオチン化プロトコルを用いて６０倍のモル過剰でビオチン化した。
【0091】
捕捉ビーズをＨｏｍｅｂｒｅｗ Ｋｉｔの標準ビーズ希釈剤で希釈し、４×１０6ビーズ／ｍＬをサンプル液に添加して、標的分子よりも多くのビーズが存在するようにした。インキュベーションを３０分間にわたって行った。それにより、サンプル中に存在するミスフォールドＳＯＤ１は、捕捉ビーズによって捕捉される。ＣＳＦサンプルをＧｅｎｅｒｉｃ Ｈｏｍｅｂｒｅｗ Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔで２倍に希釈した。次いで、ビーズを洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去し、続いて０．１μｇ／ｍＬのビオチン化検出抗体を捕捉ビーズと混合した。検出抗体の希釈には、Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｈｏｍｅｂｒｅｗ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｄｉｌｕｅｎｔを使用した。この混合物を５分間インキュベートし、ビーズ上の捕捉されたｍＳＯＤ１への検出抗体の結合を可能にした。
【0092】
第２の洗浄工程に続いて、ストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼ（ＳβＧ）のコンジュゲート（Ｈｏｍｅｂｒｅｗ ＫｉｔのＳβＧ希釈剤で希釈）３００ｐＭを捕捉ビーズと混合し、５分間インキュベートした。ＳβＧはビオチン化検出抗体に結合し、捕捉されたミスフォールドＳＯＤ１の酵素標識をもたらす。このようにして、単一のタンパク質分子を捕捉した各ビーズを酵素で標識する。分子を捕捉しないビーズは、標識を含まないままである。
【0093】
３回目の洗浄後、捕捉ビーズをレゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＲＧＰ）基質溶液に再懸濁し、Ｓｉｍｏａ Ｄｉｓｃに移した。これは、１ウェル当たり１つ以下のビーズを保持するようにサイズ設定された２１６，０００フェムトリットルサイズのウェル（幅４．２５μｍ、深さ３．２５μｍ）のアレイである。その後、ウェルを油で密封し、画像化する。
【0094】
ミスフォールドＳＯＤ１が捕捉及び標識されている場合、β－ガラクトシダーゼは、ＲＧＰ基質を加水分解して蛍光生成物にし、これが測定のためのシグナルを提供する。単一標識のミスフォールドＳＯＤ１分子は、Ｓｉｍｏａ光学システム（Ｓｉｍｏａ ＨＤ－１ Ａｎａｌｙｚｅｒ（機器ＩＤ：２７１０００００２０及び２７１００００００４ ＳＴＤ ＲＵＯ；ソフトウェアバージョン１．５））によって検出及び計数されるのに十分な蛍光シグナルを３０秒でもたらす。
【0095】
試験サンプル中のタンパク質濃度は、ビーズを含むウェルの総数に対して、ビーズ及び蛍光生成物の両方を含むウェルの数を計数することによって決定される。Ｓｉｍｏａ（商標）アッセイは、総アナログシグナルを使用することによるのではなく、濃度をデジタル的に決定することを可能にするため、単一の免疫複合体を検出するこのアプローチは、デジタルＥＬＩＳＡと呼ばれている。低いミスフォールドＳＯＤ１濃度では、正のシグナルを有するアレイ中のビーズ含有ウェルのパーセンテージは、サンプル中に存在するミスフォールドＳＯＤ１の量に比例する。より高い標的濃度では、ビーズ含有ウェルの大部分が１つ以上の標識された標的分子を有する場合、総蛍光シグナルは、サンプル中に存在するミスフォールドＳＯＤ１の量に比例する。未知のサンプル中のミスフォールドＳＯＤ１の濃度は、標準曲線から補間される。
【0096】
中間ｍＳＯＤ１ストックから作製された、１μｇ／ｍＬから開始する段階希釈による検量線を生成することにより、ｍＳＯＤ１を用いた較正を行った（６６７μｇ／ｍＬストックから６．７μｇ／ｍＬへの１００倍希釈）。希釈は、Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｈｏｍｅｂｒｅｗ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ Ｄｉｌｕｅｎｔ Ａを用いて行い、４パラメータロジスティック曲線適合データ削減方法（４ＰＬＣ、１／ｙ2加重）を用いた。このアッセイは、２×アッセイバックグラウンド法に基づいて、６ｐｇ／ｍＬ～３２ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＤ範囲（平均ＬＬＯＤ：１５．７ｐｇ／ｍＬ）及び５８ｐｇ／ｍＬ～１３２ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＱ範囲を有する。
【0097】
さらなる試験において、ヒトＳＯＤ１のアミノ酸配列７３－ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧＤ－８４（配列番号１１）内のエピトープでｍＳＯＤ１を特異的に認識する捕捉抗体としての別のモノクローナル抗体、すなわちアミノ酸配列７６－ＫＤＥＥＲＨＶＧＤ－８４（配列番号１３）を含むエピトープを認識する抗体ＮＩ－２０４．Ｏを用いて、Ｓｉｍｏａ（商標）アッセイを用いて対象の体液中のｍＳＯＤ１を測定した。Ｓｉｍｏａ（商標）アッセイは、原則として上述のように実施したが、試薬の濃度は、異なっていた。特に、常磁性ビーズへの捕捉抗体のコンジュゲーションを０．５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度で実施し；１，５００，０００捕捉ビーズ／ｍＬをサンプル溶液に添加し；検出抗体を６０倍のモル過剰でビオチン化し；０．７５μｇ／ｍＬのビオチン化検出抗体をアッセイに使用し；７５ｐＭ ＳβＧを標識に使用し；ＣＳＦサンプルをＧｅｎｅｒｉｃ Ｈｏｍｅｂｒｅｗ Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔで４倍に希釈した。このアッセイは、１０．８～１３．６ｐｇ／ｍＬのＬＬＯＤ範囲を有する。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【配列表】
【国際調査報告】